非天然アミノ酸のインビボ組込み用直交翻訳成分
本発明は大腸菌等の真正細菌宿主細胞又は酵母細胞等の真核宿主で産生された蛋白質に非天然アミノ酸を組込むことができるｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの直交対に関する。本発明は限定されないが、例えば、新規直交シンテターゼ、新規シンテターゼの同定及び作製方法、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法、並びに翻訳系を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項８】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
【請求項９】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１０】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記系が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む宿主細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記宿主細胞が真正細菌細胞と酵母細胞から選択される請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞である請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１４に記載の翻訳系。
【請求項１６】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１７】
選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を翻訳系で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を提供する段階と；
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１８】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
翻訳系を提供する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
翻訳系を提供する前記段階が大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
翻訳系を提供する前記段階が野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
更に前記蛋白質が第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸を含み、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含む翻訳系を提供し、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）３−ニトロ−Ｌ−チロシンとｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
【請求項３８】
前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項３９】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項３７に記載の翻訳。
【請求項４０】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号７−１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４１】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４２】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４３】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４４】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項４３に記載の翻訳系。
【請求項４５】
前記系が宿主細胞を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４６】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である請求項４５に記載の翻訳系。
【請求項４７】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞である請求項４６に記載の翻訳系。
【請求項４８】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項４５に記載の翻訳系。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項４８に記載の翻訳系。
【請求項５０】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項４５に記載の翻訳系。
【請求項５１】
特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を宿主細胞で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）３−ニトロ−Ｌ−チロシンとｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む前記宿主細胞で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む宿主細胞を提供する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項５２】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
翻訳系を提供する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号７−１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
更に前記蛋白質が第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸を含み、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含む翻訳系を提供し、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６９】
配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含むポリペプチドを含む組成物であって、前記保存変異体ポリペプチドが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と、配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７及び５９−６３から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物。
【請求項７０】
請求項６９に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７１】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１及び５８から選択される請求項７０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
前記組成物がポリペプチドを含む細胞である請求項６９に記載の組成物。
【請求項７３】
配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項７４】
請求項７３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７５】
請求項７３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７６】
請求項７３に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞。
【請求項１】
（ａ）ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから構成される群から選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
前記第１のＯ−ＲＳが大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項８】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項１に記載の翻訳系。
【請求項９】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１０】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記系が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む宿主細胞を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記宿主細胞が真正細菌細胞と酵母細胞から選択される請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞である請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１４に記載の翻訳系。
【請求項１６】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１７】
選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を翻訳系で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を提供する段階と；
（ｂ）前記セレクターコドンに応答して前記蛋白質の翻訳中に前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１８】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
翻訳系を提供する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
翻訳系を提供する前記段階が大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
翻訳系を提供する前記段階が野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
更に前記蛋白質が第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸を含み、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含む翻訳系を提供し、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）３−ニトロ−Ｌ−チロシンとｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
【請求項３８】
前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項３９】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項３７に記載の翻訳。
【請求項４０】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号７−１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含む請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４１】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４２】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４３】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、前記核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、前記セレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４４】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項４３に記載の翻訳系。
【請求項４５】
前記系が宿主細胞を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む請求項３７に記載の翻訳系。
【請求項４６】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である請求項４５に記載の翻訳系。
【請求項４７】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞である請求項４６に記載の翻訳系。
【請求項４８】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項４５に記載の翻訳系。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項４８に記載の翻訳系。
【請求項５０】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項４５に記載の翻訳系。
【請求項５１】
特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を宿主細胞で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）３−ニトロ−Ｌ−チロシンとｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む前記宿主細胞で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む宿主細胞を提供する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項５２】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
翻訳系を提供する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号７−１０に記載のアミノ酸配列及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
更に前記蛋白質が第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸を含み、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含む翻訳系を提供し、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６９】
配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７、５９−６３に記載のアミノ酸配列、又はその保存変異体を含むポリペプチドを含む組成物であって、前記保存変異体ポリペプチドが、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、前記非天然アミノ酸と、配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５４、５７及び５９−６３から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物。
【請求項７０】
請求項６９に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７１】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１及び５８から選択される請求項７０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
前記組成物がポリペプチドを含む細胞である請求項６９に記載の組成物。
【請求項７３】
配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１又は５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項７４】
請求項７３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７５】
請求項７３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７６】
請求項７３に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２００８−５１７６３１（Ｐ２００８−５１７６３１Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３９２２８（Ｐ２００７−５３９２２８）
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９２１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１０１８２
【国際公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３９２１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１０１８２
【国際公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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