顕微鏡装置
【課題】顕微鏡装置を用いて短時間で３次元的に分解能に優れた画像を取得することを目的とする。
【解決手段】本発明の顕微鏡装置１は、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌを発振する光源２と、レーザ光Ｌのうち試料Ｓの焦点の範囲内のレーザ光Ｌを通過させるピンホール２２Ｐと、ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌに対して試料Ｓの平面方向に干渉縞を形成する空間変調を行う空間変調部１０と、空間変調部１９により空間変調されたレーザ光Ｌを試料Ｓに焦点を結ばせる顕微鏡光学系１１と、試料Ｓからの戻り光を観察するカメラ１３と、を備えている。レーザ光Ｌの光路にピンホール２２Ｐと空間変調部１０とを配置していることで、光軸方向および平面方向の３次元に高い分解能で試料Ｓの画像を生成することができる。
【解決手段】本発明の顕微鏡装置１は、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌを発振する光源２と、レーザ光Ｌのうち試料Ｓの焦点の範囲内のレーザ光Ｌを通過させるピンホール２２Ｐと、ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌに対して試料Ｓの平面方向に干渉縞を形成する空間変調を行う空間変調部１０と、空間変調部１９により空間変調されたレーザ光Ｌを試料Ｓに焦点を結ばせる顕微鏡光学系１１と、試料Ｓからの戻り光を観察するカメラ１３と、を備えている。レーザ光Ｌの光路にピンホール２２Ｐと空間変調部１０とを配置していることで、光軸方向および平面方向の３次元に高い分解能で試料Ｓの画像を生成することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察対象にレーザ光を照射して、観察対象からの戻り光を検出して観察を行う顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対してレーザ光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。この種の顕微鏡装置の１つに、構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy）がある。構造化照明顕微鏡は、回折格子を用いて形成した干渉縞を干渉させることにより、レイリーの限界空間周波数を超えた超解像画像を生成する。
【０００３】
構造化照明顕微鏡としては非特許文献１に開示されている技術がある。この技術について図６を用いて説明する。図６は構造化顕微鏡（以下、顕微鏡装置１００）を示している。顕微鏡装置１００はファイバ１０１とコリメートレンズ１０２と偏光子１０３と回折格子１０４と第１結像レンズ１０５とダイクロイックミラー１０６と対物レンズ１０７と第２結像レンズ１０８とＣＣＤ１０９とを備えて構成している。
【０００４】
ファイバ１０１は図示しないレーザ光源と接続され、導光されたレーザ光Ｌを出射する。ファイバ１０１から出射したレーザ光Ｌはコリメートレンズ１０２に入射する。コリメートレンズ１０２はファイバ１０１の出射端の焦点位置に設けられており、発散光としてのレーザ光Ｌを平行光に変換する。
【０００５】
このレーザ光Ｌは偏光子１０３に入射する。偏光子１０３はレーザ光Ｌを一定の偏光方向（直線偏光）の光に変換する。偏光変換されたレーザ光Ｌは回折格子１０４に入射する。回折格子１０４はレーザ光Ｌを０次光（非回折光）と±１次光（回折光）とに回折する。回折角度は回折格子１０４の係数によって定まる。
【０００６】
回折されたレーザ光Ｌは結像レンズ１０５に入射し、結像レンズ１０５を出射したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー１０６に入射する。ダイクロイックミラー１０６はレーザ光Ｌの波長を透過し、観察対象である試料Ｓが蛍光した波長を反射する光学素子である。従って、レーザ光Ｌはダイクロイックミラー１０６を透過する。
【０００７】
対物レンズ１０７に入射したレーザ光Ｌは試料Ｓで焦点を結ぶ。レーザ光Ｌは回折光であり、試料Ｓの面上で合波および干渉して周期的な強度変調を有する構造照明となる。レーザ光Ｌが照射されることで、試料Ｓに導入した蛍光色素や蛍光タンパク等が蛍光して、戻り光Ｒとなる。
【０００８】
戻り光Ｒは対物レンズ１０７を経て、ダイクロイックミラー１０６に入射する。戻り光Ｒはダイクロイックミラー１０６で反射して、第２結像レンズ１０８に入射する。第２結像レンズ１０８によりＣＣＤ１０９に戻り光Ｒが集光する。
【０００９】
試料Ｓには回折された構造照明が照射される。そして、試料Ｓの構造と照明構造との相互作用により、ＣＣＤ１０９に結像される戻り光Ｒの像はモアレ画像となる。回折格子１０４には図示しない移動および回転させる機構（移動回転機構）が取り付けられており、レーザ光Ｌが回折された方向に１／５周期ずつ５回の平行移動を行う。そして、１回の平行移動ごとに回折格子１０４を１２０度ずつ合計３回の回転を行う。つまり、合計１５回の移動および回転が行われる。
【００１０】
この移動および回転が行われるごとにモアレ画像を取得する。よって、合計９枚のモアレ画像が取得される。取得した９枚のモアレ画像に対してフーリエ変換等を用いて画像処理を行うことで、「レイリーの限界空間周波数」を超える空間周波数成分を再生する。そして、この空間周波数成分を付加して画像を再構成する。再構成された画像は「レイリーの限界空間周波数」を超えた空間周波数を持つ超解像画像として生成される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】"Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination" Mats G.I. Gustafsson, et.al, Biophysical Journal vol 94 pp.4957-4970(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一般的な構造化照明顕微鏡は「Wide-Field照明方式」と呼ばれる方式であり、試料Ｓの面全体を同時に照明する方式の１つである。つまり、試料Ｓ２の所定の断層の超解像化を図るものであり、所定の面内の画像を超解像にする技術である。従って、光軸方向に分解能をもたない。
【００１３】
非特許文献１にも開示されているように、光軸方向に分解能を得るためには、試料Ｓの着目した断面について、１５枚のモアレ画像を用いて複雑なアルゴリズムを適用した画像処理を行う必要がある。
【００１４】
そこで、本発明は、顕微鏡装置を用いて複雑なアルゴリズムを適用した画像処理を行うことなく３次元的に分解能に優れた画像を取得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、観察対象に照射されるレーザ光を発振する光源と、前記レーザ光のうち前記観察対象の焦点の範囲内のレーザ光を通過させるピンホールと、このピンホールを通過したレーザ光に対して前記観察対象の前記平面方向に干渉縞を形成する空間変調を行う空間変調部と、この空間変調部により空間変調されたレーザ光を前記観察対象に焦点を結ばせる顕微鏡光学系と、前記観察対象からの戻り光を観察する観察部と、を備えたことを特徴とする。
【００１６】
この顕微鏡装置によれば、レーザ光がピンホールを通過することにより、光軸方向の分解能が得られる。また、このレーザ光を空間変調部で空間変調しているため、平面方向の分解能を高くすることができる。これにより、レーザ光の光路に光軸方向および平面方向に分解能を高くする手段を配置しているため、３次元的に高い解像度の画像を少ない画像取得回数、つまり短時間で得ることができる。
【００１７】
また、前記走査手段は、前記ピンホールを複数配列したピンホールディスクと、前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記レーザ光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、を備えたことを特徴とする。
【００１８】
ピンホールディスクとレンズディスクとを一体的に回転させることで、高速にレーザ光を走査させることができ、画像を短時間で取得することができるようになる。ピンホールディスクにピンホールを配列することで、光軸方向に分解能が高い共焦点画像を高速に生成することができるようになる。
【００１９】
また、前記光源から発振した前記レーザ光の１方向の偏光方向に変換する偏光調整素子と、前記レーザ光の偏光方向を透過し、この偏光方向に直交する偏光方向の光を反射する偏光ビームスプリッタと、前記レーザ光を反射する前記観察対象と前記偏光ビームスプリッタとの間に設けられるλ／４波長板と、を備えたことを特徴とする。
【００２０】
観察対象が試料のように蛍光を放出する素材ではなく、ＩＣチップや光ディスク等の反射体の場合には、偏光調整素子と偏光ビームスプリッタとλ／４波長板とを設けることで、３次元的に高い分解能で観察を行うことができるようになる。
【００２１】
また、前記顕微鏡光学系を収納する筐体と、前記空間変調部を移動および回転する移動回転機構と、前記筐体と前記移動回転機構との間に設けられ、前記レーザ光をリレーするリレー光学系と、を備えたことを特徴とする。
【００２２】
移動回転機構と顕微鏡光学系を収納する筐体との間隔が近接していると、移動回転機構の移動動作および回転動作により筐体と干渉することがある。このため、リレー光学系を設けることで、移動回転機構と筐体との間隔を離間させて、干渉をなくすことができる。
【００２３】
また、前記顕微鏡光学系に設けた対物レンズの開口数に同期した周期の干渉縞となるように前記観察対象の画像の倍率を変更するズームレンズを備えたことを特徴とする。
【００２４】
顕微鏡の対物レンズの開口数と空間変調部により形成される干渉縞の周期とを同期させるために、ズームレンズにより倍率を変化させている。これにより、開口数と干渉縞とを同期させることができ、正確な超解像画像を得ることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、光源から発振したレーザ光が観察対象に至るまでの光路にピンホールと空間変調部とを設けており、光軸方向および平面方向に高い分解能の画像を得ることができる。ピンホールを通過した光に空間変調を行っているため、少ない回数で短時間に３次元的に高分解能の画像を得ることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施形態の顕微鏡装置の構成図である。
【図２】第１変形例の顕微鏡装置の構成図である。
【図３】第２変形例の顕微鏡装置の概念図である。
【図４】第３変形例の顕微鏡装置の構成図である。
【図５】第４変形例の顕微鏡装置の構成図である。
【図６】従来の顕微鏡装置の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。図１は本実施形態の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１の観察対象は蛍光タンパクや蛍光色素等を導入した試料Ｓになり、試料Ｓを照明することにより蛍光を生じる。後述するように、観察対象は試料Ｓには限定されず、例えば反射体のようなものであってもよい。
【００２８】
顕微鏡装置１は構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy）である。この顕微鏡装置１は、光源２と集光レンズ３とファイバ入射端４とファイバ５とファイバ出射端６とコリメートレンズ７と走査部８とテレセントリック光学系９と空間変調部１０と顕微鏡光学系１１と撮像レンズ１２とカメラ１３とを備えて構成している。
【００２９】
光源２はレーザ光Ｌを発振するレーザ光源である。レーザ光Ｌは試料Ｓに照射される光であり、試料Ｓに導入した蛍光タンパクや蛍光色素等が反応する波長を有している。なお、レーザ光Ｌではなくランプ光を用いてもよく、この場合には光源２はランプを適用する。光源２から発振されたレーザ光Ｌは集光レンズ３によりファイバ入射端４に集光する。
【００３０】
ファイバ入射端４はファイバ５の入射端になっている。ファイバ５はレーザ光Ｌを導光する。ファイバ５の出射端にはファイバ出射端６が設けられており、導光されたレーザ光Ｌが発散光として射出する。発散光となったレーザ光Ｌはコリメートレンズ７に入射する。コリメートレンズ７により発散光となっているレーザ光Ｌは平行光に変換される。このために、コリメートレンズ７の焦点位置にファイバ出射端６を配置している。コリメートレンズ７により平行光になったレーザ光Ｌは走査部８に入射する。
【００３１】
走査部８はレーザ光Ｌを平面方向に走査する走査手段であり、レンズディスク２１とピンホールディスク２２と連結ドラム２３とダイクロイックミラー２４とを有して構成している。レンズディスク２１は複数のレンズ（マイクロレンズ）２１Ｒを配列した円盤状のディスクである。レンズディスク２１には複数のレンズ２１Ｒが螺旋状に多条に配列されている。各レンズ２１Ｒはレーザ光Ｌを集光させる機能を有している。
【００３２】
ピンホールディスク２２は複数のピンホール２２Ｐを配列した円盤状のディスクである。ピンホールディスク２２にはレンズディスク２１に形成されている各レンズＲと同じパターンでピンホール２２Ｐを配列している。つまり、多条の螺旋状のパターンで配列している。且つ、ピンホール２２Ｐはレンズ２１Ｒの集光位置に形成されている。ピンホール２２Ｐはレーザ光Ｌおよび後述する戻り光Ｒが通過する微小開口部であり、試料Ｓの焦点の範囲内の光のみが通過するようになっている。これにより、光軸方向に分解能の高い共焦点顕微鏡として顕微鏡装置１を用いることができる。
【００３３】
レンズディスク２１とピンホールディスク２２とは連結ドラム２３に一体的に取り付けられている。連結ドラム２３は図示しないモータに接続されており、モータの回転力が連結ドラム２３に付与される。これにより、レンズディスク２１とピンホールディスク２２とは一体的に回転を行う。
【００３４】
レンズディスク２１とピンホールディスク２２との間、つまりレンズ２１Ｒとピンホール２２Ｐとの間にダイクロイックミラー２４を配置している。ダイクロイックミラー２４は所定の波長域の光を透過し、所定の波長域の光を反射する。ここでは、レーザ光Ｌの波長の光を透過させ、後述する戻り光Ｒの波長の光を反射する特性を有しているものとする。よって、レンズＲを通過したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー２４を透過して、ピンホール２２Ｐに入射する。
【００３５】
走査部８を通過したレーザ光Ｌは試料Ｓの焦点の範囲内のみの光となって、テレセントリック光学系９に入射する。テレセントリック光学系９は第１リレーレンズ２５と第２リレーレンズ２６とを有している。第１リレーレンズ２５はレンズＲの焦点位置に設けられており、レンズＲにより発散光となったレーザ光Ｌが第１リレーレンズ２５に入射する。
【００３６】
第１リレーレンズ２５は発散光となっているレーザ光Ｌを平行光に変換して、第２リレーレンズ２６に出射する。第２リレーレンズ２６は平行光となっているレーザ光Ｌを集光させる。第１リレーレンズ２５と第２リレーレンズ２６との間の間隔は、両者のレンズの焦点距離の合計になる。
【００３７】
第２リレーレンズ２６により集光されるレーザ光Ｌの位置に空間変調部１０を配置している。空間変調部１０はレーザ光Ｌに対して空間変調（強度変調または位相変調）を行う。この空間変調を行うことで、レーザ光Ｌに明暗の干渉縞を発生させる。空間変調部１０としては例えば回折格子を適用することができる。この空間変調部１０には回転移動機構２７が取り付けられており、回転移動機構２７により空間変調部１０を回転および移動させることができる。
【００３８】
空間変調部１０としては、例えば透過率を周期的に高低に変化させるパターンを形成し、或いはガラス素材の厚みを周期的に変化させるパターンを形成してもよい。いずれにしても、空間変調部１０は所定の平面形状を有しており、明暗の干渉縞を発生させるパターンを形成している。この空間変調部１０には走査部８により走査されたレーザ光Ｌが入射する。このとき、空間変調部１０の所定範囲をレーザ光Ｌが走査されるが、レーザ光Ｌの走査範囲の全範囲をカバーするような平面を空間変調部１０に持たせるようにする。
【００３９】
空間変調部１０により空間変調がされたレーザ光Ｌは顕微鏡光学系１１に入射する。顕微鏡光学系１１は結像レンズ２８と対物レンズ２９とを有している。結像レンズ２８は発散光となっているレーザ光Ｌを所定傾きの平行光に変換する。結像レンズ２８により平行光となったレーザ光Ｌは対物レンズ２９により試料Ｓに焦点を結ぶ。従って、対物レンズ２９の焦点位置に試料Ｓを配置している。
【００４０】
試料Ｓは図示しないディッシュ等に搭載されており、レーザ光Ｌが試料Ｓで焦点を結ぶことにより、蛍光する。この蛍光が戻り光Ｒとなって、レーザ光Ｌと同じ光路を戻っていく。試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌは空間変調部１０により空間変調がされており、試料Ｓにおいて周期的な強度変調を有する構造照明として照射される。
【００４１】
試料Ｓはレーザ光Ｌを吸収することにより、蛍光を戻り光Ｒとして放出する。この戻り光Ｒは対物レンズ２９により捕捉されて、結像レンズ２８を介して、空間変調部１０に入射して空間変調の作用を受ける。そして、テレセントリック光学系９を通過して、ピンホールディスク２２のピンホール２２Ｐからダイクロイックミラー２４に入射する。つまり、戻り光Ｒはレーザ光Ｌと同じ光路を辿ってダイクロイックミラー２４まで導かれる。
【００４２】
ダイクロイックミラー２４は戻り光Ｒを反射する光学特性を有しているため、戻り光Ｒを側方に反射する。そして、撮像レンズ１２により観察部としてのカメラ１３の撮像面に集光する。なお、ピンホールディスク２２の表面とカメラ１３の撮像面とは共役面となる関係になっている。
【００４３】
以上が構成である。次に、動作について説明する。光源２からレーザ光Ｌを発振する。このレーザ光Ｌはファイバ入射端４からファイバ５を導光され、ファイバ出射端６から出射する。そして、コリメートレンズ７により平行光に変換されて、走査部８に入射する。
【００４４】
走査部８は連結ドラム２３に回転力を付与することで、レンズディスク２１とピンホールディスク２２とが一体的に回転する。レンズ２１Ｒとピンホール２２Ｐとは多条の螺旋状のパターンで配列されており、且つ両者は対応した位置関係になっている。よって、レンズディスク２１とピンホールディスク２２とが一体的に回転することにより、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌの位置が高速に変化する。これにより、試料Ｓの平面方向（光軸に直交する方向）にレーザ光Ｌを走査することができる。
【００４５】
ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみが通過している。つまり、カメラ１３に集光した戻り光Ｒの像に基づく画像は共焦点画像になる。従って、レーザ光Ｌの光軸方向に高い分解能の画像を得ることができるようになる。ピンホールディスク２２が回転して、レーザ光Ｌは走査されることになるが、いずれにしてもピンホール２２Ｐを通過するため、カメラ１３が受光される像に基づく画像は必ず光軸方向に高い分解能の共焦点画像になる。
【００４６】
このピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは、テレセントリック光学系９を介して空間変調部１０に入射する。つまり、光軸方向に高い分解能を持つ共焦点画像を生成するレーザ光Ｌが空間変調部１０に入射する。空間変調部１０は明暗の干渉縞を発生し、顕微鏡光学系１１の対物レンズ２９により試料Ｓに焦点を結ぶ。これにより、明暗の干渉縞を持つレーザ光Ｌが試料Ｓの焦点において合波および干渉されて、周期的な強度変調を有する構造照明となる。
【００４７】
試料Ｓはレーザ光Ｌにより蛍光して戻り光Ｒを発生するが、この戻り光Ｒの像の周波数と構造照明の像の周波数とが重畳することにより、カメラ１３で取得される画像はモアレ画像となる。このとき、このモアレ画像はピンホール２２Ｐを通過した共焦点画像を生成するためのレーザ光Ｌを用いた画像になっており、つまり光軸方向に高い分解能を有している。
【００４８】
従って、カメラ１３ではモアレ画像が取得される。このモアレ画像は、空間変調部１０が１つの状態のときに得られる画像である。空間変調部１０には回転移動機構２７が取り付けられている。従って、空間変調部１０は回転および移動が可能になっている。空間変調部１０を回転または移動を行うことにより、レーザ光Ｌに発生する干渉縞の位置および方向が変化する。
【００４９】
１枚のモアレ画像が取得された後に、回転移動機構２７は１２０度だけ空間変調部１０を回転する。これにより、干渉縞の方向を１２０度回転させることができる。この状態で、レーザ光Ｌを用いてモアレ画像を取得する。そして、干渉縞の方向をさらに１２０度回転させて、モアレ画像を取得する。これにより、３枚のモアレ画像（それぞれ１２０度ずつ干渉縞を回転させたときの画像）が得られる。
【００５０】
その後、回転移動機構２７は空間変調部１０を１２０度回転させて、最初の角度に戻す。そして、干渉縞の縞方向に１／５周期だけ空間変調部１０を移動させる。これにより、干渉縞の位置（位相）を１／５周期ずらすことができる。この状態で、モアレ画像を取得する。
【００５１】
この後に、回転移動機構２７が空間変調部１０を１２０度ずつ回転させて、それぞれのモアレ画像を取得する。さらに、回転移動機構２７は空間変調部１０を１／５周期だけずらして、１２０度ずつ回転させて、それぞれのモアレ画像を取得する。以上の動作を５回繰り返すことで、合計１５枚のモアレ画像が取得される。なお、１回の移動ごとに３回の回転を行うのではなく、１回の回転ごとに５回の移動を行うようにしてもよい。
【００５２】
カメラ１３には図示しない画像処理手段が接続されており、取得した１５枚のモアレ画像が出力される。そして、当該画像処理手段は１５枚のモアレ画像に対してフーリエ変換を行って、画像処理を行う。これにより、試料Ｓの平面方向の分解能を高くすることができる。つまり、１５枚のモアレ画像に対して画像処理を行うことで、「レイリーの限界空間周波数」を超えた平面方向に極めて高い分解能を有する超解像画像を生成することができる。
【００５３】
１５枚のモアレ画像は、ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを用いており、つまり１５枚のモアレ画像は共焦点画像になっている。従って、光軸方向に高い分解能を有する画像になっている。そして、１５枚のモアレ画像を重畳する画像処理を行うことで、平面方向においても高い分解能を有する画像になっている。つまり、３次元的に高い分解能の画像を得ることができる。
【００５４】
ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを空間変調部１０に入射させている。つまり、レーザ光Ｌの光路に対して光軸方向に高い分解能を得るためのピンホール２２Ｐおよび平面方向に高い分解能を得るための空間変調部１０を配置している。従って、各モアレ画像は光軸方向に高い分解能の共焦点画像となっており、９枚のモアレ画像を処理するだけで平面方向だけでなく光軸方向にも高い分解能の画像を得ることができる。
【００５５】
本実施形態では、ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを空間変調部１０に入射させていることで、着目した平面の上下の平面の画像を得ることなく、光軸方向に高い分解能の画像を得ることができる。これにより、複雑なアルゴリズムを適用した画像処理を行うことなく３次元的に分解能の高い画像を取得することができる。
【００５６】
本実施形態では、レーザ光Ｌを試料Ｓの平面方向に走査させる手段として走査部８を用いているが、試料Ｓの平面方向に走査させることができれば任意の手段を用いてもよい。例えば、ガルバノミラーを用いて平面方向にレーザ光Ｌを走査させるようにしてもよい。ただし、空間変調部１０はガルバノミラーにより走査された後のレーザ光Ｌが入射する位置に配置する。
【００５７】
次に、第１変形例について説明する。図２は第１変形例の顕微鏡装置１を示している。図１で示した顕微鏡装置１とは異なり、コリメートレンズ７と走査部８との間に偏光調整素子３１を設けている。また、ダイクロイックミラー２４に代えて偏光ビームスプリッタ３２を設けており、テレセントリック光学系９の第１リレーレンズ２５と第２リレーレンズ２６との間にλ／４波長板３３を追加している。その他の構成は図１の顕微鏡装置１と同じである。
【００５８】
また、この第１変形例では、観察対象は蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料Ｓではなく、反射体Ｓ１であるものとする。この反射体Ｓ１としては、例えばＩＣチップの表面や光ディスク等を適用することができ、レーザ光Ｌを高い反射率で反射する素材であれば、任意の素材を観察対象とすることができる。
【００５９】
偏光調整素子３１はレーザ光Ｌの偏光方向を１つの偏光方向（直線偏光）となるように調整する。例えば、λ／２波長板や偏光板等のように１つの偏光面を振動する光に変換する。このときのレーザ光Ｌの偏光方向は偏光ビームスプリッタ３２の透過率が最大となる偏光方向と一致させる。
【００６０】
偏光ビームスプリッタ３２は所定の偏光方向の光を透過し、この偏光方向に直交する偏光方向の光を反射する光学素子である。偏光ビームスプリッタ３２は偏光調整素子３１により調整された偏光方向のレーザ光Ｌを透過し、直交する方向の偏光方向（戻り光Ｒ）を反射する。
【００６１】
λ／４波長板３３は直線偏光を円偏光に変換する光学素子である。λ／４波長板３３は第１リレーレンズ２５の焦点位置に配置される。λ／４波長板３３はレーザ光Ｌの偏光面を４５度回転させる機能を有している。これにより、λ／４波長板３３を透過したレーザ光Ｌは直線偏光から円偏光になる。
【００６２】
この円偏光となったレーザ光Ｌは顕微鏡光学系１１により反射体Ｓ１に入射する。反射体Ｓ１はレーザ光Ｌを反射する。これにより、戻り光Ｒが発生する。この戻り光Ｒは顕微鏡光学系１１を通って、再びλ／４波長板３３に入射する。これにより、戻り光Ｒは円偏光から直線偏光に変換される。このとき、戻り光Ｒの偏光面は再び４５度回転する。これにより、λ／４波長板３３を透過した戻り光Ｒは円偏光から直線偏光になる。且つ、もともとのレーザ光Ｌから見ると、偏光面が９０度回転した状態になる。
【００６３】
この戻り光Ｒは偏光ビームスプリッタ３２に入射する。戻り光Ｒはレーザ光Ｌのときから偏光面が９０度回転しており、つまり偏光方向が直交している。このため、偏光ビームスプリッタ３２で戻り光Ｒが反射する。そして、カメラ１３に戻り光Ｒが集光することで、画像が得られる。このとき、レーザ光Ｌはピンホール２２Ｐを通過しており、空間変調部１０の作用を受けていることから、生成される画像は３次元的に高い分解能を持つ画像になっている。
【００６４】
従って、この第１変形例では、試料Ｓのように蛍光する素材を観察対象とするのではなく、反射体Ｓ１を観察対象としている。偏光調整素子３１、偏光ビームスプリッタ３２、λ／４波長板３３を設けるだけで、ＩＣチップや光ディスク等の反射体Ｓ１を観察対象とすることができる。
【００６５】
次に、第２変形例について説明する。第２変形例では、図３に示すように多段レンズ系４１と筐体４２とを備えている。多段レンズ系４１はテレセントリック光学系９と空間変調部１０とリレー光学系４３とを備えている。筐体４２は内部に顕微鏡光学系１１を収納しているケースである。
【００６６】
多段レンズ系４１のリレー光学系４３はテレセントリック光学系９と同じ構成となっている。つまり、第１リレーレンズ４４と第２リレーレンズ４５とを備えている。空間変調部１０により空間変調の作用を受けたレーザ光Ｌは第１リレーレンズ４４により平行光にされて、第２リレーレンズ４５により集光する光に変換される。
【００６７】
従って、レーザ光Ｌに対して格別の作用を及ぼすことはないが、空間変調部１０と筐体４２との間に所定の間隔を設けるようにしている。つまり、空間変調部１０と筐体４２との間にリレー光学系４３を設けることで、空間変調部１０と筐体４２との間は離間する。
【００６８】
空間変調部１０には回転移動機構２７が取り付けられており、空間変調部１０を移動および回転させる。このときに、空間変調部１０と筐体４２との間が近接していると、回転移動機構２７が空間変調部１０を移動または回転させるときに筐体４２と物理的に干渉する。そこで、単に２枚のレンズを配置したリレー光学系４３を介在させることで、回転移動機構２７と筐体４２との間で干渉を生じることがなくなる。
【００６９】
この点から、リレー光学系４３は１つだけを設けてもよいが、複数のリレー光学系４３を設けるようにしてもよい。ただし、リレー光学系４３の個数を増やすと、その分だけレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの光路長が長くなり、光量損失等の問題を生じる。そこで、リレー光学系４３は１つだけを設けることが望ましい。
【００７０】
次に、第３変形例について説明する。この第３変形例では、図４に示すように、リレー光学系４３にズームレンズ４６を追加している。このズームレンズ４６は光軸方向に移動可能になっており、カメラ１３に撮像される画像の倍率を調整する。その他の点は、前述した第２変形例と同じである。
【００７１】
顕微鏡光学系１１の対物レンズ２９は所定の開口数（ＮＡ）を有している。一方、空間変調部１０はレーザ光Ｌに明暗の干渉縞を発生させる。この干渉縞は周期的な明暗のパターンになっている。この明暗の干渉縞の周期によって試料Ｓで相互に干渉を生じるが、対物レンズ２９の開口数により干渉の効果が変化する。
【００７２】
干渉縞の周期が対物レンズ２９の開口数と同期していれば、干渉縞を相互に高く干渉させることができ、モアレ画像の周期を短くすることができる。一方、干渉縞の周期が対物レンズ２９の開口数と同期していなければ、干渉縞を相互に高く干渉させることができず、所望のモアレ画像を取得できない。
【００７３】
そこで、対物レンズ２９の開口数に同期した干渉縞の周期とするために、ズームレンズ４６を設けている。ズームレンズ４６は空間変調部１０の後段側に設けられており、空間変調がされたレーザ光Ｌに作用して、拡大率を変化させる。これにより、試料Ｓに照射される構造照明の周波数を任意に調整することができる。
【００７４】
ズームレンズ４６は光軸方向に移動可能になっており、対物レンズ２９の開口数に同期した干渉縞の周期となるように倍率を変更する（ズームレンズ４６の位置を変化させる）。これにより、対物レンズ２９の開口数と干渉縞の周期とが同期することで、試料Ｓにおいて大きく干渉させることができ、短い周期のモアレ画像を得ることができる。つまり、超解像画像を得ることができる。
【００７５】
次に、第４変形例について説明する。図５は第４変形例を示している。図５の光路分離光学系５０はピンホールディスク２２と顕微鏡光学系１１との間に設けられている。つまり、図３の第２変形例で説明した多段レンズ系４１と同じ位置に設けられている。
【００７６】
光路分離光学系５０は第１リレーレンズ５１と第１ダイクロイックミラー５２と第２リレーレンズ５３と第３リレーレンズ５４と第１反射ミラー５５と第２ダイクロイックミラー５６と第４リレーレンズ５７と第５リレーレンズ５８と光路長調整素子５９と第６リレーレンズ６０と第２反射ミラー６１とを備えて構成している。
【００７７】
第１リレーレンズ５１はピンホールディスク２２のピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを平行光に変換する。第１リレーレンズ５１により平行光となったレーザ光Ｌは第１ダイクロイックミラー５２に入射する。第１ダイクロイックミラー５２はレーザ光Ｌの波長の光を透過させ、戻り光Ｒの波長の光を反射させる特性を有している。よって、レーザ光Ｌは第１ダイクロイックミラー５２を透過する。
【００７８】
透過したレーザ光Ｌは第２リレーレンズ５３により空間変調部１０に集光し、空間変調部１０の空間変調の作用を受けて、第３リレーレンズ５４に入射する。第３リレーレンズ５４によりレーザ光Ｌは平行光になって、第１反射ミラー５５で反射する。反射したレーザ光Ｌは第２ダイクロイックミラー５６に入射する。
【００７９】
第２ダイクロイックミラー５６はレーザ光Ｌを反射させ、戻り光Ｒを透過させる特性を有している。よって、レーザ光Ｌは反射して、第４リレーレンズ５７に入射する。第４リレーレンズ５７を透過したレーザ光Ｌは発散光となって顕微鏡光学系１１に入射する。試料Ｓからは戻り光Ｒが発生し、顕微鏡光学系１１から第４リレーレンズ５７に入射する。
【００８０】
第４リレーレンズ５７により戻り光Ｒは平行光になって、第２ダイクロイックミラー５６に入射する。第２ダイクロイックミラー５６では戻り光Ｒは透過する。そして、第５リレーレンズ５８により戻り光Ｒは光路長調整素子５９に集光する。光路長調整素子５９は光路長を調整する光学ウィンドウであり、空間変調部１０と同じ光路長を戻り光Ｒに与える。
【００８１】
第６リレーレンズ６０は光路長調整素子５９により光路長が調整された戻り光Ｒを平行光にして、平行光となった戻り光Ｒが第２反射ミラー６１で反射する。反射した戻り光Ｒは第１ダイクロイックミラー５２に入射する。第１ダイクロイックミラー５２では戻り光Ｒは反射するため、反射した戻り光Ｒがピンホールディスク２２のピンホール２２Ｐに向かう。
【００８２】
前述してきた例では、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとの両者が空間変調部１０の空間変調作用を受けている。従って、戻り光Ｒが空間変調を受けたときに試料Ｓの超解像画像を生成できるように画像処理を行う必要がある。この画像処理を行うシステムをカメラ１３に接続される画像処理部に持たせる。
【００８３】
一方、レーザ光Ｌのみに空間変調部１０を作用させることを前提としたシステムにおいては、戻り光Ｒが空間変調を受けた場合に、正確な画像処理を行うことができなくなる。そこで、第１ダイクロイックミラー５２および第２ダイクロイックミラー５６でレーザ光Ｌと戻り光Ｒとを分離、合成することで、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとの光路を部分的に分離することができる。そして、レーザ光Ｌのみの光路に空間変調部１０を配置することで、レーザ光Ｌに対してのみ空間変調を作用させることができるようになる。
【符号の説明】
【００８４】
１ 顕微鏡装置
２ 光源
８ 走査部
９ テレセントリック光学系
１０ 空間変調部
１１ 顕微鏡光学系
１２ 撮像レンズ
１３ カメラ
２１ レンズディスク
２１Ｒ レンズ
２２ ピンホールディスク
２２Ｐ ピンホール
２４ ダイクロイックミラー
２７ 回転移動機構
３１ 偏光調整素子
３２ 偏光ビームスプリッタ
３３ λ／４波長板
４１ 多段レンズ系
４２ 筐体
４３ リレー光学系
４６ ズームレンズ
５０ 光路分離光学系
５２ 第１ダイクロイックミラー
５６ 第２ダイクロイックミラー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察対象にレーザ光を照射して、観察対象からの戻り光を検出して観察を行う顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対してレーザ光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。この種の顕微鏡装置の１つに、構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy）がある。構造化照明顕微鏡は、回折格子を用いて形成した干渉縞を干渉させることにより、レイリーの限界空間周波数を超えた超解像画像を生成する。
【０００３】
構造化照明顕微鏡としては非特許文献１に開示されている技術がある。この技術について図６を用いて説明する。図６は構造化顕微鏡（以下、顕微鏡装置１００）を示している。顕微鏡装置１００はファイバ１０１とコリメートレンズ１０２と偏光子１０３と回折格子１０４と第１結像レンズ１０５とダイクロイックミラー１０６と対物レンズ１０７と第２結像レンズ１０８とＣＣＤ１０９とを備えて構成している。
【０００４】
ファイバ１０１は図示しないレーザ光源と接続され、導光されたレーザ光Ｌを出射する。ファイバ１０１から出射したレーザ光Ｌはコリメートレンズ１０２に入射する。コリメートレンズ１０２はファイバ１０１の出射端の焦点位置に設けられており、発散光としてのレーザ光Ｌを平行光に変換する。
【０００５】
このレーザ光Ｌは偏光子１０３に入射する。偏光子１０３はレーザ光Ｌを一定の偏光方向（直線偏光）の光に変換する。偏光変換されたレーザ光Ｌは回折格子１０４に入射する。回折格子１０４はレーザ光Ｌを０次光（非回折光）と±１次光（回折光）とに回折する。回折角度は回折格子１０４の係数によって定まる。
【０００６】
回折されたレーザ光Ｌは結像レンズ１０５に入射し、結像レンズ１０５を出射したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー１０６に入射する。ダイクロイックミラー１０６はレーザ光Ｌの波長を透過し、観察対象である試料Ｓが蛍光した波長を反射する光学素子である。従って、レーザ光Ｌはダイクロイックミラー１０６を透過する。
【０００７】
対物レンズ１０７に入射したレーザ光Ｌは試料Ｓで焦点を結ぶ。レーザ光Ｌは回折光であり、試料Ｓの面上で合波および干渉して周期的な強度変調を有する構造照明となる。レーザ光Ｌが照射されることで、試料Ｓに導入した蛍光色素や蛍光タンパク等が蛍光して、戻り光Ｒとなる。
【０００８】
戻り光Ｒは対物レンズ１０７を経て、ダイクロイックミラー１０６に入射する。戻り光Ｒはダイクロイックミラー１０６で反射して、第２結像レンズ１０８に入射する。第２結像レンズ１０８によりＣＣＤ１０９に戻り光Ｒが集光する。
【０００９】
試料Ｓには回折された構造照明が照射される。そして、試料Ｓの構造と照明構造との相互作用により、ＣＣＤ１０９に結像される戻り光Ｒの像はモアレ画像となる。回折格子１０４には図示しない移動および回転させる機構（移動回転機構）が取り付けられており、レーザ光Ｌが回折された方向に１／５周期ずつ５回の平行移動を行う。そして、１回の平行移動ごとに回折格子１０４を１２０度ずつ合計３回の回転を行う。つまり、合計１５回の移動および回転が行われる。
【００１０】
この移動および回転が行われるごとにモアレ画像を取得する。よって、合計９枚のモアレ画像が取得される。取得した９枚のモアレ画像に対してフーリエ変換等を用いて画像処理を行うことで、「レイリーの限界空間周波数」を超える空間周波数成分を再生する。そして、この空間周波数成分を付加して画像を再構成する。再構成された画像は「レイリーの限界空間周波数」を超えた空間周波数を持つ超解像画像として生成される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】"Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination" Mats G.I. Gustafsson, et.al, Biophysical Journal vol 94 pp.4957-4970(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一般的な構造化照明顕微鏡は「Wide-Field照明方式」と呼ばれる方式であり、試料Ｓの面全体を同時に照明する方式の１つである。つまり、試料Ｓ２の所定の断層の超解像化を図るものであり、所定の面内の画像を超解像にする技術である。従って、光軸方向に分解能をもたない。
【００１３】
非特許文献１にも開示されているように、光軸方向に分解能を得るためには、試料Ｓの着目した断面について、１５枚のモアレ画像を用いて複雑なアルゴリズムを適用した画像処理を行う必要がある。
【００１４】
そこで、本発明は、顕微鏡装置を用いて複雑なアルゴリズムを適用した画像処理を行うことなく３次元的に分解能に優れた画像を取得することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、観察対象に照射されるレーザ光を発振する光源と、前記レーザ光のうち前記観察対象の焦点の範囲内のレーザ光を通過させるピンホールと、このピンホールを通過したレーザ光に対して前記観察対象の前記平面方向に干渉縞を形成する空間変調を行う空間変調部と、この空間変調部により空間変調されたレーザ光を前記観察対象に焦点を結ばせる顕微鏡光学系と、前記観察対象からの戻り光を観察する観察部と、を備えたことを特徴とする。
【００１６】
この顕微鏡装置によれば、レーザ光がピンホールを通過することにより、光軸方向の分解能が得られる。また、このレーザ光を空間変調部で空間変調しているため、平面方向の分解能を高くすることができる。これにより、レーザ光の光路に光軸方向および平面方向に分解能を高くする手段を配置しているため、３次元的に高い解像度の画像を少ない画像取得回数、つまり短時間で得ることができる。
【００１７】
また、前記走査手段は、前記ピンホールを複数配列したピンホールディスクと、前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記レーザ光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、を備えたことを特徴とする。
【００１８】
ピンホールディスクとレンズディスクとを一体的に回転させることで、高速にレーザ光を走査させることができ、画像を短時間で取得することができるようになる。ピンホールディスクにピンホールを配列することで、光軸方向に分解能が高い共焦点画像を高速に生成することができるようになる。
【００１９】
また、前記光源から発振した前記レーザ光の１方向の偏光方向に変換する偏光調整素子と、前記レーザ光の偏光方向を透過し、この偏光方向に直交する偏光方向の光を反射する偏光ビームスプリッタと、前記レーザ光を反射する前記観察対象と前記偏光ビームスプリッタとの間に設けられるλ／４波長板と、を備えたことを特徴とする。
【００２０】
観察対象が試料のように蛍光を放出する素材ではなく、ＩＣチップや光ディスク等の反射体の場合には、偏光調整素子と偏光ビームスプリッタとλ／４波長板とを設けることで、３次元的に高い分解能で観察を行うことができるようになる。
【００２１】
また、前記顕微鏡光学系を収納する筐体と、前記空間変調部を移動および回転する移動回転機構と、前記筐体と前記移動回転機構との間に設けられ、前記レーザ光をリレーするリレー光学系と、を備えたことを特徴とする。
【００２２】
移動回転機構と顕微鏡光学系を収納する筐体との間隔が近接していると、移動回転機構の移動動作および回転動作により筐体と干渉することがある。このため、リレー光学系を設けることで、移動回転機構と筐体との間隔を離間させて、干渉をなくすことができる。
【００２３】
また、前記顕微鏡光学系に設けた対物レンズの開口数に同期した周期の干渉縞となるように前記観察対象の画像の倍率を変更するズームレンズを備えたことを特徴とする。
【００２４】
顕微鏡の対物レンズの開口数と空間変調部により形成される干渉縞の周期とを同期させるために、ズームレンズにより倍率を変化させている。これにより、開口数と干渉縞とを同期させることができ、正確な超解像画像を得ることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、光源から発振したレーザ光が観察対象に至るまでの光路にピンホールと空間変調部とを設けており、光軸方向および平面方向に高い分解能の画像を得ることができる。ピンホールを通過した光に空間変調を行っているため、少ない回数で短時間に３次元的に高分解能の画像を得ることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施形態の顕微鏡装置の構成図である。
【図２】第１変形例の顕微鏡装置の構成図である。
【図３】第２変形例の顕微鏡装置の概念図である。
【図４】第３変形例の顕微鏡装置の構成図である。
【図５】第４変形例の顕微鏡装置の構成図である。
【図６】従来の顕微鏡装置の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。図１は本実施形態の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１の観察対象は蛍光タンパクや蛍光色素等を導入した試料Ｓになり、試料Ｓを照明することにより蛍光を生じる。後述するように、観察対象は試料Ｓには限定されず、例えば反射体のようなものであってもよい。
【００２８】
顕微鏡装置１は構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy）である。この顕微鏡装置１は、光源２と集光レンズ３とファイバ入射端４とファイバ５とファイバ出射端６とコリメートレンズ７と走査部８とテレセントリック光学系９と空間変調部１０と顕微鏡光学系１１と撮像レンズ１２とカメラ１３とを備えて構成している。
【００２９】
光源２はレーザ光Ｌを発振するレーザ光源である。レーザ光Ｌは試料Ｓに照射される光であり、試料Ｓに導入した蛍光タンパクや蛍光色素等が反応する波長を有している。なお、レーザ光Ｌではなくランプ光を用いてもよく、この場合には光源２はランプを適用する。光源２から発振されたレーザ光Ｌは集光レンズ３によりファイバ入射端４に集光する。
【００３０】
ファイバ入射端４はファイバ５の入射端になっている。ファイバ５はレーザ光Ｌを導光する。ファイバ５の出射端にはファイバ出射端６が設けられており、導光されたレーザ光Ｌが発散光として射出する。発散光となったレーザ光Ｌはコリメートレンズ７に入射する。コリメートレンズ７により発散光となっているレーザ光Ｌは平行光に変換される。このために、コリメートレンズ７の焦点位置にファイバ出射端６を配置している。コリメートレンズ７により平行光になったレーザ光Ｌは走査部８に入射する。
【００３１】
走査部８はレーザ光Ｌを平面方向に走査する走査手段であり、レンズディスク２１とピンホールディスク２２と連結ドラム２３とダイクロイックミラー２４とを有して構成している。レンズディスク２１は複数のレンズ（マイクロレンズ）２１Ｒを配列した円盤状のディスクである。レンズディスク２１には複数のレンズ２１Ｒが螺旋状に多条に配列されている。各レンズ２１Ｒはレーザ光Ｌを集光させる機能を有している。
【００３２】
ピンホールディスク２２は複数のピンホール２２Ｐを配列した円盤状のディスクである。ピンホールディスク２２にはレンズディスク２１に形成されている各レンズＲと同じパターンでピンホール２２Ｐを配列している。つまり、多条の螺旋状のパターンで配列している。且つ、ピンホール２２Ｐはレンズ２１Ｒの集光位置に形成されている。ピンホール２２Ｐはレーザ光Ｌおよび後述する戻り光Ｒが通過する微小開口部であり、試料Ｓの焦点の範囲内の光のみが通過するようになっている。これにより、光軸方向に分解能の高い共焦点顕微鏡として顕微鏡装置１を用いることができる。
【００３３】
レンズディスク２１とピンホールディスク２２とは連結ドラム２３に一体的に取り付けられている。連結ドラム２３は図示しないモータに接続されており、モータの回転力が連結ドラム２３に付与される。これにより、レンズディスク２１とピンホールディスク２２とは一体的に回転を行う。
【００３４】
レンズディスク２１とピンホールディスク２２との間、つまりレンズ２１Ｒとピンホール２２Ｐとの間にダイクロイックミラー２４を配置している。ダイクロイックミラー２４は所定の波長域の光を透過し、所定の波長域の光を反射する。ここでは、レーザ光Ｌの波長の光を透過させ、後述する戻り光Ｒの波長の光を反射する特性を有しているものとする。よって、レンズＲを通過したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー２４を透過して、ピンホール２２Ｐに入射する。
【００３５】
走査部８を通過したレーザ光Ｌは試料Ｓの焦点の範囲内のみの光となって、テレセントリック光学系９に入射する。テレセントリック光学系９は第１リレーレンズ２５と第２リレーレンズ２６とを有している。第１リレーレンズ２５はレンズＲの焦点位置に設けられており、レンズＲにより発散光となったレーザ光Ｌが第１リレーレンズ２５に入射する。
【００３６】
第１リレーレンズ２５は発散光となっているレーザ光Ｌを平行光に変換して、第２リレーレンズ２６に出射する。第２リレーレンズ２６は平行光となっているレーザ光Ｌを集光させる。第１リレーレンズ２５と第２リレーレンズ２６との間の間隔は、両者のレンズの焦点距離の合計になる。
【００３７】
第２リレーレンズ２６により集光されるレーザ光Ｌの位置に空間変調部１０を配置している。空間変調部１０はレーザ光Ｌに対して空間変調（強度変調または位相変調）を行う。この空間変調を行うことで、レーザ光Ｌに明暗の干渉縞を発生させる。空間変調部１０としては例えば回折格子を適用することができる。この空間変調部１０には回転移動機構２７が取り付けられており、回転移動機構２７により空間変調部１０を回転および移動させることができる。
【００３８】
空間変調部１０としては、例えば透過率を周期的に高低に変化させるパターンを形成し、或いはガラス素材の厚みを周期的に変化させるパターンを形成してもよい。いずれにしても、空間変調部１０は所定の平面形状を有しており、明暗の干渉縞を発生させるパターンを形成している。この空間変調部１０には走査部８により走査されたレーザ光Ｌが入射する。このとき、空間変調部１０の所定範囲をレーザ光Ｌが走査されるが、レーザ光Ｌの走査範囲の全範囲をカバーするような平面を空間変調部１０に持たせるようにする。
【００３９】
空間変調部１０により空間変調がされたレーザ光Ｌは顕微鏡光学系１１に入射する。顕微鏡光学系１１は結像レンズ２８と対物レンズ２９とを有している。結像レンズ２８は発散光となっているレーザ光Ｌを所定傾きの平行光に変換する。結像レンズ２８により平行光となったレーザ光Ｌは対物レンズ２９により試料Ｓに焦点を結ぶ。従って、対物レンズ２９の焦点位置に試料Ｓを配置している。
【００４０】
試料Ｓは図示しないディッシュ等に搭載されており、レーザ光Ｌが試料Ｓで焦点を結ぶことにより、蛍光する。この蛍光が戻り光Ｒとなって、レーザ光Ｌと同じ光路を戻っていく。試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌは空間変調部１０により空間変調がされており、試料Ｓにおいて周期的な強度変調を有する構造照明として照射される。
【００４１】
試料Ｓはレーザ光Ｌを吸収することにより、蛍光を戻り光Ｒとして放出する。この戻り光Ｒは対物レンズ２９により捕捉されて、結像レンズ２８を介して、空間変調部１０に入射して空間変調の作用を受ける。そして、テレセントリック光学系９を通過して、ピンホールディスク２２のピンホール２２Ｐからダイクロイックミラー２４に入射する。つまり、戻り光Ｒはレーザ光Ｌと同じ光路を辿ってダイクロイックミラー２４まで導かれる。
【００４２】
ダイクロイックミラー２４は戻り光Ｒを反射する光学特性を有しているため、戻り光Ｒを側方に反射する。そして、撮像レンズ１２により観察部としてのカメラ１３の撮像面に集光する。なお、ピンホールディスク２２の表面とカメラ１３の撮像面とは共役面となる関係になっている。
【００４３】
以上が構成である。次に、動作について説明する。光源２からレーザ光Ｌを発振する。このレーザ光Ｌはファイバ入射端４からファイバ５を導光され、ファイバ出射端６から出射する。そして、コリメートレンズ７により平行光に変換されて、走査部８に入射する。
【００４４】
走査部８は連結ドラム２３に回転力を付与することで、レンズディスク２１とピンホールディスク２２とが一体的に回転する。レンズ２１Ｒとピンホール２２Ｐとは多条の螺旋状のパターンで配列されており、且つ両者は対応した位置関係になっている。よって、レンズディスク２１とピンホールディスク２２とが一体的に回転することにより、試料Ｓに照射されるレーザ光Ｌの位置が高速に変化する。これにより、試料Ｓの平面方向（光軸に直交する方向）にレーザ光Ｌを走査することができる。
【００４５】
ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは試料Ｓの焦点の範囲内の光のみが通過している。つまり、カメラ１３に集光した戻り光Ｒの像に基づく画像は共焦点画像になる。従って、レーザ光Ｌの光軸方向に高い分解能の画像を得ることができるようになる。ピンホールディスク２２が回転して、レーザ光Ｌは走査されることになるが、いずれにしてもピンホール２２Ｐを通過するため、カメラ１３が受光される像に基づく画像は必ず光軸方向に高い分解能の共焦点画像になる。
【００４６】
このピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌは、テレセントリック光学系９を介して空間変調部１０に入射する。つまり、光軸方向に高い分解能を持つ共焦点画像を生成するレーザ光Ｌが空間変調部１０に入射する。空間変調部１０は明暗の干渉縞を発生し、顕微鏡光学系１１の対物レンズ２９により試料Ｓに焦点を結ぶ。これにより、明暗の干渉縞を持つレーザ光Ｌが試料Ｓの焦点において合波および干渉されて、周期的な強度変調を有する構造照明となる。
【００４７】
試料Ｓはレーザ光Ｌにより蛍光して戻り光Ｒを発生するが、この戻り光Ｒの像の周波数と構造照明の像の周波数とが重畳することにより、カメラ１３で取得される画像はモアレ画像となる。このとき、このモアレ画像はピンホール２２Ｐを通過した共焦点画像を生成するためのレーザ光Ｌを用いた画像になっており、つまり光軸方向に高い分解能を有している。
【００４８】
従って、カメラ１３ではモアレ画像が取得される。このモアレ画像は、空間変調部１０が１つの状態のときに得られる画像である。空間変調部１０には回転移動機構２７が取り付けられている。従って、空間変調部１０は回転および移動が可能になっている。空間変調部１０を回転または移動を行うことにより、レーザ光Ｌに発生する干渉縞の位置および方向が変化する。
【００４９】
１枚のモアレ画像が取得された後に、回転移動機構２７は１２０度だけ空間変調部１０を回転する。これにより、干渉縞の方向を１２０度回転させることができる。この状態で、レーザ光Ｌを用いてモアレ画像を取得する。そして、干渉縞の方向をさらに１２０度回転させて、モアレ画像を取得する。これにより、３枚のモアレ画像（それぞれ１２０度ずつ干渉縞を回転させたときの画像）が得られる。
【００５０】
その後、回転移動機構２７は空間変調部１０を１２０度回転させて、最初の角度に戻す。そして、干渉縞の縞方向に１／５周期だけ空間変調部１０を移動させる。これにより、干渉縞の位置（位相）を１／５周期ずらすことができる。この状態で、モアレ画像を取得する。
【００５１】
この後に、回転移動機構２７が空間変調部１０を１２０度ずつ回転させて、それぞれのモアレ画像を取得する。さらに、回転移動機構２７は空間変調部１０を１／５周期だけずらして、１２０度ずつ回転させて、それぞれのモアレ画像を取得する。以上の動作を５回繰り返すことで、合計１５枚のモアレ画像が取得される。なお、１回の移動ごとに３回の回転を行うのではなく、１回の回転ごとに５回の移動を行うようにしてもよい。
【００５２】
カメラ１３には図示しない画像処理手段が接続されており、取得した１５枚のモアレ画像が出力される。そして、当該画像処理手段は１５枚のモアレ画像に対してフーリエ変換を行って、画像処理を行う。これにより、試料Ｓの平面方向の分解能を高くすることができる。つまり、１５枚のモアレ画像に対して画像処理を行うことで、「レイリーの限界空間周波数」を超えた平面方向に極めて高い分解能を有する超解像画像を生成することができる。
【００５３】
１５枚のモアレ画像は、ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを用いており、つまり１５枚のモアレ画像は共焦点画像になっている。従って、光軸方向に高い分解能を有する画像になっている。そして、１５枚のモアレ画像を重畳する画像処理を行うことで、平面方向においても高い分解能を有する画像になっている。つまり、３次元的に高い分解能の画像を得ることができる。
【００５４】
ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを空間変調部１０に入射させている。つまり、レーザ光Ｌの光路に対して光軸方向に高い分解能を得るためのピンホール２２Ｐおよび平面方向に高い分解能を得るための空間変調部１０を配置している。従って、各モアレ画像は光軸方向に高い分解能の共焦点画像となっており、９枚のモアレ画像を処理するだけで平面方向だけでなく光軸方向にも高い分解能の画像を得ることができる。
【００５５】
本実施形態では、ピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを空間変調部１０に入射させていることで、着目した平面の上下の平面の画像を得ることなく、光軸方向に高い分解能の画像を得ることができる。これにより、複雑なアルゴリズムを適用した画像処理を行うことなく３次元的に分解能の高い画像を取得することができる。
【００５６】
本実施形態では、レーザ光Ｌを試料Ｓの平面方向に走査させる手段として走査部８を用いているが、試料Ｓの平面方向に走査させることができれば任意の手段を用いてもよい。例えば、ガルバノミラーを用いて平面方向にレーザ光Ｌを走査させるようにしてもよい。ただし、空間変調部１０はガルバノミラーにより走査された後のレーザ光Ｌが入射する位置に配置する。
【００５７】
次に、第１変形例について説明する。図２は第１変形例の顕微鏡装置１を示している。図１で示した顕微鏡装置１とは異なり、コリメートレンズ７と走査部８との間に偏光調整素子３１を設けている。また、ダイクロイックミラー２４に代えて偏光ビームスプリッタ３２を設けており、テレセントリック光学系９の第１リレーレンズ２５と第２リレーレンズ２６との間にλ／４波長板３３を追加している。その他の構成は図１の顕微鏡装置１と同じである。
【００５８】
また、この第１変形例では、観察対象は蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料Ｓではなく、反射体Ｓ１であるものとする。この反射体Ｓ１としては、例えばＩＣチップの表面や光ディスク等を適用することができ、レーザ光Ｌを高い反射率で反射する素材であれば、任意の素材を観察対象とすることができる。
【００５９】
偏光調整素子３１はレーザ光Ｌの偏光方向を１つの偏光方向（直線偏光）となるように調整する。例えば、λ／２波長板や偏光板等のように１つの偏光面を振動する光に変換する。このときのレーザ光Ｌの偏光方向は偏光ビームスプリッタ３２の透過率が最大となる偏光方向と一致させる。
【００６０】
偏光ビームスプリッタ３２は所定の偏光方向の光を透過し、この偏光方向に直交する偏光方向の光を反射する光学素子である。偏光ビームスプリッタ３２は偏光調整素子３１により調整された偏光方向のレーザ光Ｌを透過し、直交する方向の偏光方向（戻り光Ｒ）を反射する。
【００６１】
λ／４波長板３３は直線偏光を円偏光に変換する光学素子である。λ／４波長板３３は第１リレーレンズ２５の焦点位置に配置される。λ／４波長板３３はレーザ光Ｌの偏光面を４５度回転させる機能を有している。これにより、λ／４波長板３３を透過したレーザ光Ｌは直線偏光から円偏光になる。
【００６２】
この円偏光となったレーザ光Ｌは顕微鏡光学系１１により反射体Ｓ１に入射する。反射体Ｓ１はレーザ光Ｌを反射する。これにより、戻り光Ｒが発生する。この戻り光Ｒは顕微鏡光学系１１を通って、再びλ／４波長板３３に入射する。これにより、戻り光Ｒは円偏光から直線偏光に変換される。このとき、戻り光Ｒの偏光面は再び４５度回転する。これにより、λ／４波長板３３を透過した戻り光Ｒは円偏光から直線偏光になる。且つ、もともとのレーザ光Ｌから見ると、偏光面が９０度回転した状態になる。
【００６３】
この戻り光Ｒは偏光ビームスプリッタ３２に入射する。戻り光Ｒはレーザ光Ｌのときから偏光面が９０度回転しており、つまり偏光方向が直交している。このため、偏光ビームスプリッタ３２で戻り光Ｒが反射する。そして、カメラ１３に戻り光Ｒが集光することで、画像が得られる。このとき、レーザ光Ｌはピンホール２２Ｐを通過しており、空間変調部１０の作用を受けていることから、生成される画像は３次元的に高い分解能を持つ画像になっている。
【００６４】
従って、この第１変形例では、試料Ｓのように蛍光する素材を観察対象とするのではなく、反射体Ｓ１を観察対象としている。偏光調整素子３１、偏光ビームスプリッタ３２、λ／４波長板３３を設けるだけで、ＩＣチップや光ディスク等の反射体Ｓ１を観察対象とすることができる。
【００６５】
次に、第２変形例について説明する。第２変形例では、図３に示すように多段レンズ系４１と筐体４２とを備えている。多段レンズ系４１はテレセントリック光学系９と空間変調部１０とリレー光学系４３とを備えている。筐体４２は内部に顕微鏡光学系１１を収納しているケースである。
【００６６】
多段レンズ系４１のリレー光学系４３はテレセントリック光学系９と同じ構成となっている。つまり、第１リレーレンズ４４と第２リレーレンズ４５とを備えている。空間変調部１０により空間変調の作用を受けたレーザ光Ｌは第１リレーレンズ４４により平行光にされて、第２リレーレンズ４５により集光する光に変換される。
【００６７】
従って、レーザ光Ｌに対して格別の作用を及ぼすことはないが、空間変調部１０と筐体４２との間に所定の間隔を設けるようにしている。つまり、空間変調部１０と筐体４２との間にリレー光学系４３を設けることで、空間変調部１０と筐体４２との間は離間する。
【００６８】
空間変調部１０には回転移動機構２７が取り付けられており、空間変調部１０を移動および回転させる。このときに、空間変調部１０と筐体４２との間が近接していると、回転移動機構２７が空間変調部１０を移動または回転させるときに筐体４２と物理的に干渉する。そこで、単に２枚のレンズを配置したリレー光学系４３を介在させることで、回転移動機構２７と筐体４２との間で干渉を生じることがなくなる。
【００６９】
この点から、リレー光学系４３は１つだけを設けてもよいが、複数のリレー光学系４３を設けるようにしてもよい。ただし、リレー光学系４３の個数を増やすと、その分だけレーザ光Ｌおよび戻り光Ｒの光路長が長くなり、光量損失等の問題を生じる。そこで、リレー光学系４３は１つだけを設けることが望ましい。
【００７０】
次に、第３変形例について説明する。この第３変形例では、図４に示すように、リレー光学系４３にズームレンズ４６を追加している。このズームレンズ４６は光軸方向に移動可能になっており、カメラ１３に撮像される画像の倍率を調整する。その他の点は、前述した第２変形例と同じである。
【００７１】
顕微鏡光学系１１の対物レンズ２９は所定の開口数（ＮＡ）を有している。一方、空間変調部１０はレーザ光Ｌに明暗の干渉縞を発生させる。この干渉縞は周期的な明暗のパターンになっている。この明暗の干渉縞の周期によって試料Ｓで相互に干渉を生じるが、対物レンズ２９の開口数により干渉の効果が変化する。
【００７２】
干渉縞の周期が対物レンズ２９の開口数と同期していれば、干渉縞を相互に高く干渉させることができ、モアレ画像の周期を短くすることができる。一方、干渉縞の周期が対物レンズ２９の開口数と同期していなければ、干渉縞を相互に高く干渉させることができず、所望のモアレ画像を取得できない。
【００７３】
そこで、対物レンズ２９の開口数に同期した干渉縞の周期とするために、ズームレンズ４６を設けている。ズームレンズ４６は空間変調部１０の後段側に設けられており、空間変調がされたレーザ光Ｌに作用して、拡大率を変化させる。これにより、試料Ｓに照射される構造照明の周波数を任意に調整することができる。
【００７４】
ズームレンズ４６は光軸方向に移動可能になっており、対物レンズ２９の開口数に同期した干渉縞の周期となるように倍率を変更する（ズームレンズ４６の位置を変化させる）。これにより、対物レンズ２９の開口数と干渉縞の周期とが同期することで、試料Ｓにおいて大きく干渉させることができ、短い周期のモアレ画像を得ることができる。つまり、超解像画像を得ることができる。
【００７５】
次に、第４変形例について説明する。図５は第４変形例を示している。図５の光路分離光学系５０はピンホールディスク２２と顕微鏡光学系１１との間に設けられている。つまり、図３の第２変形例で説明した多段レンズ系４１と同じ位置に設けられている。
【００７６】
光路分離光学系５０は第１リレーレンズ５１と第１ダイクロイックミラー５２と第２リレーレンズ５３と第３リレーレンズ５４と第１反射ミラー５５と第２ダイクロイックミラー５６と第４リレーレンズ５７と第５リレーレンズ５８と光路長調整素子５９と第６リレーレンズ６０と第２反射ミラー６１とを備えて構成している。
【００７７】
第１リレーレンズ５１はピンホールディスク２２のピンホール２２Ｐを通過したレーザ光Ｌを平行光に変換する。第１リレーレンズ５１により平行光となったレーザ光Ｌは第１ダイクロイックミラー５２に入射する。第１ダイクロイックミラー５２はレーザ光Ｌの波長の光を透過させ、戻り光Ｒの波長の光を反射させる特性を有している。よって、レーザ光Ｌは第１ダイクロイックミラー５２を透過する。
【００７８】
透過したレーザ光Ｌは第２リレーレンズ５３により空間変調部１０に集光し、空間変調部１０の空間変調の作用を受けて、第３リレーレンズ５４に入射する。第３リレーレンズ５４によりレーザ光Ｌは平行光になって、第１反射ミラー５５で反射する。反射したレーザ光Ｌは第２ダイクロイックミラー５６に入射する。
【００７９】
第２ダイクロイックミラー５６はレーザ光Ｌを反射させ、戻り光Ｒを透過させる特性を有している。よって、レーザ光Ｌは反射して、第４リレーレンズ５７に入射する。第４リレーレンズ５７を透過したレーザ光Ｌは発散光となって顕微鏡光学系１１に入射する。試料Ｓからは戻り光Ｒが発生し、顕微鏡光学系１１から第４リレーレンズ５７に入射する。
【００８０】
第４リレーレンズ５７により戻り光Ｒは平行光になって、第２ダイクロイックミラー５６に入射する。第２ダイクロイックミラー５６では戻り光Ｒは透過する。そして、第５リレーレンズ５８により戻り光Ｒは光路長調整素子５９に集光する。光路長調整素子５９は光路長を調整する光学ウィンドウであり、空間変調部１０と同じ光路長を戻り光Ｒに与える。
【００８１】
第６リレーレンズ６０は光路長調整素子５９により光路長が調整された戻り光Ｒを平行光にして、平行光となった戻り光Ｒが第２反射ミラー６１で反射する。反射した戻り光Ｒは第１ダイクロイックミラー５２に入射する。第１ダイクロイックミラー５２では戻り光Ｒは反射するため、反射した戻り光Ｒがピンホールディスク２２のピンホール２２Ｐに向かう。
【００８２】
前述してきた例では、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとの両者が空間変調部１０の空間変調作用を受けている。従って、戻り光Ｒが空間変調を受けたときに試料Ｓの超解像画像を生成できるように画像処理を行う必要がある。この画像処理を行うシステムをカメラ１３に接続される画像処理部に持たせる。
【００８３】
一方、レーザ光Ｌのみに空間変調部１０を作用させることを前提としたシステムにおいては、戻り光Ｒが空間変調を受けた場合に、正確な画像処理を行うことができなくなる。そこで、第１ダイクロイックミラー５２および第２ダイクロイックミラー５６でレーザ光Ｌと戻り光Ｒとを分離、合成することで、レーザ光Ｌと戻り光Ｒとの光路を部分的に分離することができる。そして、レーザ光Ｌのみの光路に空間変調部１０を配置することで、レーザ光Ｌに対してのみ空間変調を作用させることができるようになる。
【符号の説明】
【００８４】
１ 顕微鏡装置
２ 光源
８ 走査部
９ テレセントリック光学系
１０ 空間変調部
１１ 顕微鏡光学系
１２ 撮像レンズ
１３ カメラ
２１ レンズディスク
２１Ｒ レンズ
２２ ピンホールディスク
２２Ｐ ピンホール
２４ ダイクロイックミラー
２７ 回転移動機構
３１ 偏光調整素子
３２ 偏光ビームスプリッタ
３３ λ／４波長板
４１ 多段レンズ系
４２ 筐体
４３ リレー光学系
４６ ズームレンズ
５０ 光路分離光学系
５２ 第１ダイクロイックミラー
５６ 第２ダイクロイックミラー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象に照射されるレーザ光を発振する光源と、
前記レーザ光のうち前記観察対象の焦点の範囲内のレーザ光を通過させるピンホールと、
このピンホールを通過したレーザ光に対して前記観察対象の前記平面方向に干渉縞を形成する空間変調を行う空間変調部と、
この空間変調部により空間変調されたレーザ光を前記観察対象に焦点を結ばせる顕微鏡光学系と、
前記観察対象からの戻り光を観察する観察部と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記ピンホールを複数配列したピンホールディスクと、
前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記レーザ光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、
前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、
を備えたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記光源から発振した前記レーザ光の１方向の偏光方向に変換する偏光調整素子と、
前記レーザ光の偏光方向を透過し、この偏光方向に直交する偏光方向の光を反射する偏光ビームスプリッタと、
前記レーザ光を反射する前記観察対象と前記偏光ビームスプリッタとの間に設けられるλ／４波長板と、
を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記顕微鏡光学系を収納する筐体と、
前記空間変調部を移動および回転する移動回転機構と、
前記筐体と前記移動回転機構との間に設けられ、前記レーザ光をリレーするリレー光学系と、
を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記顕微鏡光学系に設けた対物レンズの開口数に同期した周期の干渉縞となるように前記観察対象の画像の倍率を変更するズームレンズを備えたこと
を特徴とする請求項４記載の顕微鏡装置。
【請求項１】
観察対象に照射されるレーザ光を発振する光源と、
前記レーザ光のうち前記観察対象の焦点の範囲内のレーザ光を通過させるピンホールと、
このピンホールを通過したレーザ光に対して前記観察対象の前記平面方向に干渉縞を形成する空間変調を行う空間変調部と、
この空間変調部により空間変調されたレーザ光を前記観察対象に焦点を結ばせる顕微鏡光学系と、
前記観察対象からの戻り光を観察する観察部と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記ピンホールを複数配列したピンホールディスクと、
前記ピンホールと同じパターンで配列され、前記ピンホールに前記レーザ光を集光させる複数のレンズを配列したレンズディスクと、
前記ピンホールディスクと前記レンズディスクとを一体的に回転させる回転部と、
を備えたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記光源から発振した前記レーザ光の１方向の偏光方向に変換する偏光調整素子と、
前記レーザ光の偏光方向を透過し、この偏光方向に直交する偏光方向の光を反射する偏光ビームスプリッタと、
前記レーザ光を反射する前記観察対象と前記偏光ビームスプリッタとの間に設けられるλ／４波長板と、
を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記顕微鏡光学系を収納する筐体と、
前記空間変調部を移動および回転する移動回転機構と、
前記筐体と前記移動回転機構との間に設けられ、前記レーザ光をリレーするリレー光学系と、
を備えたことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記顕微鏡光学系に設けた対物レンズの開口数に同期した周期の干渉縞となるように前記観察対象の画像の倍率を変更するズームレンズを備えたこと
を特徴とする請求項４記載の顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−１１７２８（Ｐ２０１３−１１７２８Ａ）
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４４１８７（Ｐ２０１１−１４４１８７）
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
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