食品中の大豆検出キット
【課題】 食品、特に加工食品中の大豆成分を検出するキットを提供する。
【解決手段】 本発明の大豆検出キットは、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる。また、抽出液はイオン性界面活性剤を含有する液が好ましく、更に還元剤を含有することが好ましく。本発明のキットによれば、他の豆類との交叉反応性がなく、加熱処理などの加工処理がなされた加工食品の中の大豆成分をも簡便且つ確実に検出することができるという利点を有する。
【解決手段】 本発明の大豆検出キットは、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる。また、抽出液はイオン性界面活性剤を含有する液が好ましく、更に還元剤を含有することが好ましく。本発明のキットによれば、他の豆類との交叉反応性がなく、加熱処理などの加工処理がなされた加工食品の中の大豆成分をも簡便且つ確実に検出することができるという利点を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食品中の大豆の検出キットに関する。より詳細には、食品、特に加工食品に含まれている大豆（大豆成分）を検出する際に使用される大豆検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食物アレルギーを発症する人が幼児を中心に増加している。食物アレルギーは、皮膚の痒みや腹痛など多様な症状を生じ、重篤な場合は死に至ることもあるため、国としての対応が望まれていた。このため、厚労省は、アレルギーを発症する人の数や、症状が重い食物５品目を特定原材料として、原材料表示の義務化を実施した。この表示の義務化となった食物は、卵、小麦、乳、ソバ及び落花生である。
また、合わせて表示を推奨する食物として２０品目の原材料が決められた。この２０品目の一つとして、患者数の多い大豆も指定され、表示が適正であるかを確認するため、食品中の大豆成分を検出するキットの作製が望まれていた。
このような状況から、既に食品に含有されている大豆蛋白質を検出する検出キットは販売されていたものの、その検出能力は低い。例えば、食物アレルゲンの検出キットの能力を測る方法として知られている添加回収試験の結果は、どの製品も低く、食物アレルゲンの検出キットとして必要な、加工食品中に含有される数ナノグラムの大豆成分を検出することは困難であった。
一方、大豆のアレルゲンを除去することにより、低アレルゲン化した大豆も提案されているが、製造方法が煩雑であり、また高価となることから繁用されるには至っていない（特許文献１、２など参照）。
【特許文献１】特開平７−２３６４２７公報
【特許文献２】特開平１１−１７８５１２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような問題から、本発明者らは、食品中の大豆成分を高精度で検出できる免疫学的測定法の検討を行った。
まず、測定対象とする大豆蛋白質（抗原蛋白質）について、その条件として、他の豆類との交叉性がなく且つ大豆での含有量が一定以上の蛋白質とした。これらの条件は、他の豆類との交叉性がないことは当然必要なことであるが、交叉性がなくとも、大豆に微量に含有される蛋白質を測定対象とすると、大豆の存在の有無を判断する上で信頼性に欠けることに基づく。実際、大豆の他の蛋白が存在するにもかかわらず、微量蛋白質（抗原蛋白質）を対象にすると陰性の結果が出る可能性が高いと考えられる。上記の基準を満たす抗原を探したところ、大豆蛋白質の一種であるGly m Bd 30Kが好適であり、当該蛋白質に対する抗体を作成し、免疫学的測定法により食品中の大豆成分を検出したところ、高感度で検出でき且つ交叉性を示さないことを確認した。なお、Gly m Bd 30Kは大豆アレルゲンとして既に知られている蛋白質である。
【０００４】
また、加工食品は、その製造過程や保存過程において、混捏、成形、加圧、加熱、乾燥、酵素処理、冷凍、解凍などの処理を受ける。その結果、食品中の蛋白質は、化学的又は物理的に変性していることがある。抗体として、モノクローナル抗体を使用した場合、当該モノクローナル抗体が認識するエピトープが、上記のような加工工程などにより変性を受けることがあり、抗原−抗体複合体を形成し得ない場合や微量の複合体形成しか起こり得ない場合が生じる。その結果、モノクローナル抗体を使用すると、加工食品中の大豆成分を検出し得ない又は検出感度が著しく低下する場合が生じる。そのような問題から、本発明者はポリクローナル抗体を使用することを想起した。即ち、ポリクローナル抗体を使用すると、例えエピトープの一部が変性したとしても、他のエピトープを介して抗原―抗体複合体が形成されるので、検出感度の低下を防止することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明は、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる食品中の大豆検出キットであり、当該抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体は、未変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体と、加熱変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体の混合物が好ましい。
また、抽出液はイオン性界面活性剤を含有する液が好ましく、特に１．５％〜２．５％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有水溶液が好ましい。更に、当該抽出液は、還元剤を含有することが好ましく、還元剤としては２−メルカプトエタノールが好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の食品中の大豆検出キットによれば、食品中の大豆成分を確実且つ高精度で検出することができる。特に、食品が加熱などの製造工程を経て製造され、食品中の大豆成分が変性を受けているような場合であっても、食品中の大豆成分を検出することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の食品中の大豆検出キットは、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる。
上記のGly m Bd 30Kは、大豆アレルゲンとして既に知られている蛋白質である。
しかしながら、本蛋白質のポリクローナル抗体の調製に際しては格別の注意を払う必要がある。
即ち、一般に、モノクローナル抗体を取る場合であれば、ある程度の純度の対象蛋白質が少量あればよい。つまり、純度が低くとも、免疫後、モノクローナル抗体の産生細胞を選択するときに、目的の蛋白に対する抗体を産生する細胞を選択すればよい。それに対し、ポリクローナル抗体の作製においては、混在する蛋白質が非特異的なポリクローナル抗体産生につながるために、多量に純度の高い蛋白質を必要とする。また、通常、食物アレルゲンに対する検査キットに使用する抗体には、生の食品蛋白質を免疫することで獲得した抗体と、この生の抗原を加熱変性させた抗原を免疫することで獲得した抗体を混合したものを用いてキットを作製しなければならない。これは、食品には、生のものだけでなく、加熱した加工食品があるため、この加熱した加工食品中の加熱により変性した抗原を測定するには、あらかじめ、加熱により変性した抗原を免疫して獲得した抗体を用いる必要があるからである。
【０００８】
特に、本蛋白質については、ポリマーを形成し易いため、加熱時に、より凝集して、他の蛋白質より抗原性がより低くなる。大豆蛋白質は、加工食品等において、広く結着剤として使われており、本蛋白質を含め、自他の蛋白質等との結着性が高い蛋白質が存在している。言い換えれば、加熱により凝集しやすい蛋白質が存在している。通常の大量精製の方法で精製を行った場合、Gly m Bd 30Kには当該蛋白質以外の蛋白質が５〜１０％程度混入している。上記の加熱による抗原性の低下のため、この程度の混入でも、加熱した抗原を免疫して得た抗体には、混入蛋白質に対する抗体、つまり交叉性を示すポリクローナル抗体がより多くでき、測定系の障害となった。そこで、加熱しても、Gly m Bd 30Kが凝集しないように、界面活性剤、還元剤存在下で通常より強く加熱変性させる。ここで、通常より強く加熱変性させているのは、抗原性を上げるため、動物に免疫後に、再びポリマーを形成しないようにより強く変性させるためである。
【０００９】
係る通常より強い変性条件について検討したところ、還元剤としては1〜3%程度の２−メルカプトエタノール、及び界面活性剤としては1〜20%程度のＳＤＳ存在下であればよいことが明らかとなった。また、処理条件としては、80〜100℃程度、10分〜10時間程度であればよく、好ましくは、90〜100℃程度、20分〜2時間程度であればよく、より好ましくは、95〜100℃程度、30分〜1時間程度であればよいことが判明した。更に、分子量による混入蛋白質との分離を行うため、ゲル濾過による精製を行い、純度を９７％以上、好ましくは、９８％以上、より好ましくは、９９％以上に高めたものを加熱変性抗原として準備する必要があることも明らかとなった。そして、係る加熱変性抗原を免疫して得た抗体と未変性抗原を免役して得た抗体とを、１：３〜３：１、好ましくはほぼ同等の蛋白質量で混合したものをキットの抗体として用いることが好ましいことが判明した。
【００１０】
なお、Gly m Bd 30Kの還元剤、界面活性剤及び加熱変性条件の違いによる抗原性の比較は以下の表１の通りである。
【００１１】
【表１】
【００１２】
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体は、常法に準じて、Gly m Bd 30Kで免疫した動物の抗血清から調製することができ、係るポリクローナル抗体の調製方法は当業者に周知であり、免疫時の加熱変性抗原の処理方法や純度以外は、通常の方法を用いることが出来る。
例えば、Gly m Bd 30Kを適当なアジュバントとともに動物（例えば、馬、牛、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マウス等）に投与して免疫し、適当な間隔及び回数で（例えば１〜２週間おきに４〜６回程度）で投与を繰り返し、最終免疫後に採血し、抗血清を分離することにより得ることができる。かくして得られた抗血清は、Gly m Bd 30Kを固定化したアフィニティーカラムで精製することにより精製抗Gly
m Bd 30Kポリクローナル抗体を得ることができる。
【００１３】
また、本発明の抗体としては、上記のポリクローナル抗体を酵素処理して得られた抗体フラグメントであってもよい。当該抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメンなどが例示される。酵素処理は常法に準じて行なうことができ、この際に使用される酵素としては、ブロメライン、パパイン、トリプシン、ペプシンなどの慣用のプロテアーゼが使用される。
【００１４】
本発明の大豆検出キットには抽出液が含まれる。当該抽出液は、食品中の大豆成分を抽出し得る液であれば特に限定されないが、通常、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などが使用される。
【００１５】
当該抽出液は、食品中の大豆成分を確実に抽出し得るように、イオン性界面活性剤を含有するのが好ましい。係るイオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸カリウム等のアルキル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩などの陰イオン性界面活性剤、塩化ヘキサデシルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムなどの陽イオン性界面活性剤が例示され、これらの界面活性剤は２種以上を併用してもよい。より好ましいイオン性界面活性剤としてＳＤＳが使用される。
イオン性界面活性剤の濃度としては、０．５〜３．５％（ｗ／ｖ、以下同様）、好ましくは１．０〜３．０％、より好ましくは１．５〜２．５％程度に調整される。イオン性界面活性剤濃度が０．５％未満では抽出効率が劣るおそれがあり、また３．５％を超えても抽出効率が低下するおそれがある。
【００１６】
更に、本発明で使用される抽出液は、還元剤を含有していてもよい。還元剤を含有させることにより、大豆成分が難溶性物質に変性していたり、食品中の各種成分とＳ−Ｓ結合を介して結合していても、食品中の大豆成分を抽出することが可能となる。
還元剤としては、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールが例示されるが、２−メルカプトエタノールが好適に使用される。還元剤の濃度としては、０．５〜５％程度、好ましくは１〜２％程度に調整される。０．５％未満では抽出効率が劣ることがあり、また５％までで十分に効果を奏するので、それ以上の濃度は特に必要とされない。
【００１７】
本発明の大豆検出キットを使用した測定方法としては、慣用の免疫学的測定方法のいずれにも適用させることができ、係る方法としては、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、免疫比濁法などが例示され、簡便且つ高精度であることから酵素免疫測定法が好ましい。これらの方法は既に周知であり、常法に準じて行うことができる。
また、本発明の大豆検出キットには、測定方法に応じて、他の構成要素が含まれていてもよい。係る構成要素としては、例えば、希釈液、測定溶液、基質液、反応停止液、反応容器などが例示され、係る構成要素は、従来の検出キットに準じて、適宜作製することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
なお、本発明で使用される抗原であるGly m Bd 30kは公知物質であり、抗未変性抗原抗体を作製するための未変性抗原は、文献記載の方法などで調製することができる(例えば、J. Biol Chem. 265, 13843-13848, 1990参照)。一方、本検査キットを組み立てる上で、抗未変性抗原抗体と同じく必要な、抗加熱変性抗原抗体を作製するための加熱変性抗原は、未変性抗原を更に、還元剤である2%２−メルカプトエタノール、及び界面活性剤である1%ＳＤＳ存在下で、100℃、３０分間、強力に加熱処理した後、更にSuperdex 75を用いたゲル濾過により精製を行い、99%の純度のものを加熱変性抗原として使用した。
【００１９】
また、抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体は、下記の方法で調製した。
未変性（又は加熱変性）Gly m Bd 30k抗原を1mg/2mL（ＰＢＳ）に調製し、アジュバンドと混合し、免疫抗原とした。日本白色種の雄のウサギ1羽（１１週齢：体重２．７Ｋｇ）に免疫抗原(2mL)を背部皮下に注射して免疫し、２週間間隔で同用量の免疫抗原を計６回投与して免疫を行った。６回免疫後、心臓より全採血し抗血清を得た。得られた抗血清は、CNBr活性化セファロースにGly m Bd 30kを結合させた担体を使用したカラムクロマトグラフィーに付し、担体に結合した抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体を溶出液(0.1Mグリシン−塩酸、pH2.7)で溶出し、精製抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体を得た。
【００２０】
なお、以下の実施例で使用した抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体は、未変性Gly m Bd 30k抗原由来抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体（即ち、未変性Gly m Bd 30k抗原を免疫して得られたポリクローナル抗体）と加熱変性Gly m Bd 30k抗原由来抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体（即ち、加熱変性Gly m Bd 30k抗原を免疫した得られたポリクローナル抗体）の等量混合物である。
【００２１】
実施例１（抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体と他の豆類への交差反応性の試験）
（１）使用抗体
前記の抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体の他、大豆に含有されている蛋白質である７Ｓ、１１Ｓ及び大豆の全抽出蛋白質を用いて、前記と同様な方法で、それぞれ抗７Ｓポリクローナル抗体、抗１１Ｓポリクローナル抗体及び抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体を作製した。更に、これらのポリクローナル抗体を常法に準じてビオチン化し、それぞれのビオチン標識抗体を作製し、以下の試験に使用した。
【００２２】
（２）豆類抽出液の調製
豆類として大豆、小豆、えんどう豆、そら豆、いんげん豆を検体とした。
各検体をフードミルサーで均一化し、50mL容チューブに１ｇを秤量した。各チューブに0.5% SDS、2%２−メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCL緩衝液（pH 7.5）19mLを加えて攪拌し、振とう機にのせて100rpmで16時間抽出後、3000×ｇで20分間遠心分離した。上清をろ紙でろ過し、ろ液を豆類抽出液とした。
【００２３】
（３）マイクロタイタープレートへの抗体のコーティングとブロッキング
0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 8.5）を用いて4μg/mLに希釈した抗Gly m Bd
30Kポリクローナル抗体溶液100μLをELISAプレート(Nunc社)に分注し、4℃で一晩コーティングした。洗浄液（0.15M NaCl、0.05%Tween20を含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）250μLで2回洗浄後、ブロッキング液（1％ BSA、5％ Sucrose、0.1％ NaN3 を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)）200μLを加えて4℃で一晩ブロッキングした。抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体に代えて、それぞれ抗７Ｓポリクローナル抗体、抗１１Ｓポリクローナル抗体及び抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体を使用し、同様な操作でマイクロタイタープレートへの抗体のコーティングを行った。
【００２４】
（４）豆類抽出液の測定
上記の豆類抽出液を希釈用緩衝液（0.1%BSA、0.1%Tween20、0.15M
NaCl、0.025% BRONIDOXを含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）で希釈し、測定溶液とした。
各ウェル中のブロッキング液を除去し、前記で調製した測定溶液 100μLをプレートに加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLを加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン結合物 100μLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 100μLを加えて遮光下で25℃、20分間反応させた。0.5N 硫酸
100μLを加えて反応を停止させた後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（主波長450nm、副波長 620nm）で測定し、交叉性を試験した。
【００２５】
また、ビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体に代えて、それぞれビオチン標識抗７Ｓポリクローナル抗体、ビオチン標識抗１１Ｓポリクローナル抗体及びビオチン標識抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体を使用し、同様な操作で測定を行った。
その結果を表２に示す。表２に示すとおり、抗７Ｓポリクローナル抗体、抗１１Ｓポリクローナル抗体及び抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体は測定したすべての豆類に対して交差反応を示したが、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体は交差反応が認められなかった。従って、抗Gly
m Bd 30Kポリクローナル抗体は交叉性のない抗体であり、抗体として優れていることが判明した。
【００２６】
（５）豆類抽出液の電気泳動とブロッティング
上記豆類抽出液にサンプルバッファー（2% SDS、2%２−メルカプトエタノール、20% サッカロース、0.2% BPBを含む0.1M Tris-HCL緩衝液(pH8.8)）を等量加えて攪拌し、100℃で5分間加熱処理して試料溶液とした。SDS-PAGE用ミニゲルを泳動装置にセットし、泳動バッファー（192mMグリシン、0.1% SDSを含む25mM Tris-HCL緩衝液(pH7.4)）を満たして、分子量マーカー、上記試料溶液及び標準溶液を5μLずつアプライ後、ゲル1枚につき20mAの定電流で泳動した。ろ紙、PVDF膜をブロッティングバッファー（192mM グリシン、5% MeOHを含む25mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)）に浸漬させた後、転写装置にろ紙、PVDF膜、泳動後のゲル、ろ紙の順に重層し、転写膜の面積１ｃｍ２あたり2mAで1時間ブロッティングした。
【００２７】
（６）各種ポリクローナル抗体を用いた免疫染色
ブロッティング後のPVDF膜をブロッキング液（0.5M NaCl、0.05% Tween20、0.1% BSAを含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)）に浸して25℃で30分間ブロッキングした。洗浄液（0.5M NaCl、0.05% Tween20を含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)）で5回洗浄後、希釈した各種ポリクローナル抗体溶液15mLを加え、25℃で1時間振とうした。洗浄液で5回洗浄後、希釈したHRP標識抗ウサギIgG溶液 15mLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 15mLを加えて発色させ、明瞭なバンドを検出後、精製水を加えて反応を停止させ、交叉性を調べた。
その結果を表２に示す。表２に示すとおり、抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体は測定したすべての豆類に対して交差反応を示したが、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体、抗7Sポリクローナル抗体及び抗11Sポリクローナル抗体は交差反応が認められなかった。
【００２８】
【表２】
【００２９】
実施例２（各キット抗体による添加大豆蛋白質回収率の比較）
（１）測定抗体
添加大豆蛋白質回収試験を、本発明に係るキット（本発明キット）と市販大豆検出キット（Ａ社キット及びＢ社キット）を用いて比較した。
本発明キットの抗体としては、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び常法に準じて調製したビオチン標識抗体を使用した。また、比較対象である市販キットについては、各々キット添付の抗体を使用した。
【００３０】
（２）モデル食品
蛋白質濃度 10μg/gを含むように大豆粉末を添加したモデル加工食品（白がゆ）を作製した。白がゆは、加熱処理を行わなかったものと、100℃で30分間加熱処理後、流水で冷やしたものを各々モデル加工食品として使用した。
【００３１】
（３）抽出液
本発明品の抽出液としては、2%２−メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCL緩衝液（pH 7.5）にSDSを0.5%の濃度を加えた抽出液を調製し使用した。市販のキットについては、各キットに添付の抽出液を使用した。
【００３２】
（４）モデル加工食品の抽出
上記に示した２種類のモデル加工食品をフードミルサーで均一化し、50mL容チューブに１ｇずつ秤量した。各チューブに上記の抽出液 19mLを加えて攪拌し、振とう機にのせて100rpmで16時間抽出後、3000×ｇで20分間遠心分離した。上清をろ紙でろ過し、ろ液をモデル加工食品抽出液とした。
【００３３】
（５）マイクロタイタープレートへの抗体のコーティングとブロッキング
0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 8.5）を用いて4μg/mLに希釈した上記抗Gly m
Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLをELISAプレート(Nunc社)に分注し、4℃で一晩コーティングした。洗浄液（0.15M NaCl、0.05% Tween20を含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)） 250μLで2回洗浄後、ブロッキング液（1％ BSA、5％ サッカロース、0.1％ NaN3
を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)）200μLを加えて4℃で一晩ブロッキングした。
【００３４】
（６）モデル加工食品抽出液の測定
上記のモデル加工食品抽出液を希釈用緩衝液（0.1% BSA、0.1% Tween20、0.15M NaCl、0.025% BRONIDOXを含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）で２０倍に希釈し、測定溶液とした。各ウェル中のブロッキング液を除去し、調製した測定溶液 100μL及び検量線作成用に標準大豆試料を0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50ng/mLに希釈した大豆標準溶液をプレートに加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLを加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したHRP標識ストレプトアビジン結合物 100μLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 100μLを加えて遮光下で25℃、20分間反応させた。0.5N 硫酸
100μLを加えて反応を停止させた後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（主波長450nm、副波長 620nm）で測定した。得られた測定値に希釈倍率 400倍を乗算し、添加大豆蛋白質量(10μg)で割った数値を回収率（％）とした。
その結果を表３に示す。表３に示されるように、本発明キットのみ回収率が実用性を有していた。
【００３５】
【表３】
【００３６】
実施例３（抽出液中のSDS濃度と大豆抗原抽出率の関係）
（１）抗体
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び常法に準じて調製したビオチン標識抗体を以下の試験に使用した。
【００３７】
（２）モデル食品
蛋白質濃度 10μg/gを含むように大豆粉末を添加した3種類のモデル加工食品（白がゆ、豚肉団子、牛肉レトルト）を作製した。白がゆは100℃で30分間、豚肉団子は80℃で20分間、牛肉レトルトは121℃で1分間加熱処理後、流水で冷やしてモデル加工食品とした。
【００３８】
（３）抽出液
2%２−メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCL緩衝液（pH 7.5）にSDSを0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%の濃度で加えた10種類の抽出液を調製した。
【００３９】
（４）モデル加工食品の抽出
上記に示した３種類のモデル加工食品をフードミルサーで均一化し、50mL容チューブに１ｇずつ秤量した。各チューブに上記の抽出液 19mLを加えて攪拌し、振とう機にのせて100rpmで16時間抽出後、3000×ｇで20分間遠心分離した。上清をろ紙でろ過し、ろ液をモデル加工食品抽出液とした。この操作を10種類の抽出液について行った。
【００４０】
（５）マイクロタイタープレートへの抗体のコーティングとブロッキング
0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 8.5）を用いて4μg/mLに希釈した上記抗Gly m
Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLをELISAプレート(Nunc社)に分注し、4℃で一晩コーティングした。洗浄液（0.15M NaCl、0.05% Tween20を含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)） 250μLで2回洗浄後、ブロッキング液（1％ BSA、5％ サッカロース、0.1％ NaN3
を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)）200μLを加えて4℃で一晩ブロッキングした。
【００４１】
（６）モデル加工食品抽出液の測定
上記のモデル加工食品抽出液を希釈用緩衝液（0.1%BSA、0.1%Tween20、0.15M
NaCl、0.025% BRONIDOXを含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）で２０倍に希釈し、測定溶液とした。各ウェル中のブロッキング液を除去し、調製した測定溶液 100μL及び検量線作成用に標準大豆試料を0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50ng/mLに希釈した大豆標準溶液をプレートに加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLを加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したHRP標識ストレプトアビジン結合物 100μLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 100μLを加えて遮光下で25℃、20分間反応させた。0.5N 硫酸
100μLを加えて反応を停止させた後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（主波長450nm、副波長 620nm）で測定した。得られた測定値に希釈倍率 400倍を乗算し、添加大豆蛋白質量(10μg)で割った数値を回収率（％）とした。
その結果を表４に示す。表４に示されるように、0.5〜3.5％、好ましくは1.5〜2.5％のSDSを含有する抽出液が高い回収率を示した。食肉加工品の場合には、加熱により、大豆蛋白質が肉蛋白質と結合していると考えられ、1.5%〜2.5%のSDSを含有する抽出液を使用することが好適であることが判明した。
【００４２】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食品中の大豆の検出キットに関する。より詳細には、食品、特に加工食品に含まれている大豆（大豆成分）を検出する際に使用される大豆検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食物アレルギーを発症する人が幼児を中心に増加している。食物アレルギーは、皮膚の痒みや腹痛など多様な症状を生じ、重篤な場合は死に至ることもあるため、国としての対応が望まれていた。このため、厚労省は、アレルギーを発症する人の数や、症状が重い食物５品目を特定原材料として、原材料表示の義務化を実施した。この表示の義務化となった食物は、卵、小麦、乳、ソバ及び落花生である。
また、合わせて表示を推奨する食物として２０品目の原材料が決められた。この２０品目の一つとして、患者数の多い大豆も指定され、表示が適正であるかを確認するため、食品中の大豆成分を検出するキットの作製が望まれていた。
このような状況から、既に食品に含有されている大豆蛋白質を検出する検出キットは販売されていたものの、その検出能力は低い。例えば、食物アレルゲンの検出キットの能力を測る方法として知られている添加回収試験の結果は、どの製品も低く、食物アレルゲンの検出キットとして必要な、加工食品中に含有される数ナノグラムの大豆成分を検出することは困難であった。
一方、大豆のアレルゲンを除去することにより、低アレルゲン化した大豆も提案されているが、製造方法が煩雑であり、また高価となることから繁用されるには至っていない（特許文献１、２など参照）。
【特許文献１】特開平７−２３６４２７公報
【特許文献２】特開平１１−１７８５１２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような問題から、本発明者らは、食品中の大豆成分を高精度で検出できる免疫学的測定法の検討を行った。
まず、測定対象とする大豆蛋白質（抗原蛋白質）について、その条件として、他の豆類との交叉性がなく且つ大豆での含有量が一定以上の蛋白質とした。これらの条件は、他の豆類との交叉性がないことは当然必要なことであるが、交叉性がなくとも、大豆に微量に含有される蛋白質を測定対象とすると、大豆の存在の有無を判断する上で信頼性に欠けることに基づく。実際、大豆の他の蛋白が存在するにもかかわらず、微量蛋白質（抗原蛋白質）を対象にすると陰性の結果が出る可能性が高いと考えられる。上記の基準を満たす抗原を探したところ、大豆蛋白質の一種であるGly m Bd 30Kが好適であり、当該蛋白質に対する抗体を作成し、免疫学的測定法により食品中の大豆成分を検出したところ、高感度で検出でき且つ交叉性を示さないことを確認した。なお、Gly m Bd 30Kは大豆アレルゲンとして既に知られている蛋白質である。
【０００４】
また、加工食品は、その製造過程や保存過程において、混捏、成形、加圧、加熱、乾燥、酵素処理、冷凍、解凍などの処理を受ける。その結果、食品中の蛋白質は、化学的又は物理的に変性していることがある。抗体として、モノクローナル抗体を使用した場合、当該モノクローナル抗体が認識するエピトープが、上記のような加工工程などにより変性を受けることがあり、抗原−抗体複合体を形成し得ない場合や微量の複合体形成しか起こり得ない場合が生じる。その結果、モノクローナル抗体を使用すると、加工食品中の大豆成分を検出し得ない又は検出感度が著しく低下する場合が生じる。そのような問題から、本発明者はポリクローナル抗体を使用することを想起した。即ち、ポリクローナル抗体を使用すると、例えエピトープの一部が変性したとしても、他のエピトープを介して抗原―抗体複合体が形成されるので、検出感度の低下を防止することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、本発明は、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる食品中の大豆検出キットであり、当該抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体は、未変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体と、加熱変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体の混合物が好ましい。
また、抽出液はイオン性界面活性剤を含有する液が好ましく、特に１．５％〜２．５％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有水溶液が好ましい。更に、当該抽出液は、還元剤を含有することが好ましく、還元剤としては２−メルカプトエタノールが好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の食品中の大豆検出キットによれば、食品中の大豆成分を確実且つ高精度で検出することができる。特に、食品が加熱などの製造工程を経て製造され、食品中の大豆成分が変性を受けているような場合であっても、食品中の大豆成分を検出することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の食品中の大豆検出キットは、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる。
上記のGly m Bd 30Kは、大豆アレルゲンとして既に知られている蛋白質である。
しかしながら、本蛋白質のポリクローナル抗体の調製に際しては格別の注意を払う必要がある。
即ち、一般に、モノクローナル抗体を取る場合であれば、ある程度の純度の対象蛋白質が少量あればよい。つまり、純度が低くとも、免疫後、モノクローナル抗体の産生細胞を選択するときに、目的の蛋白に対する抗体を産生する細胞を選択すればよい。それに対し、ポリクローナル抗体の作製においては、混在する蛋白質が非特異的なポリクローナル抗体産生につながるために、多量に純度の高い蛋白質を必要とする。また、通常、食物アレルゲンに対する検査キットに使用する抗体には、生の食品蛋白質を免疫することで獲得した抗体と、この生の抗原を加熱変性させた抗原を免疫することで獲得した抗体を混合したものを用いてキットを作製しなければならない。これは、食品には、生のものだけでなく、加熱した加工食品があるため、この加熱した加工食品中の加熱により変性した抗原を測定するには、あらかじめ、加熱により変性した抗原を免疫して獲得した抗体を用いる必要があるからである。
【０００８】
特に、本蛋白質については、ポリマーを形成し易いため、加熱時に、より凝集して、他の蛋白質より抗原性がより低くなる。大豆蛋白質は、加工食品等において、広く結着剤として使われており、本蛋白質を含め、自他の蛋白質等との結着性が高い蛋白質が存在している。言い換えれば、加熱により凝集しやすい蛋白質が存在している。通常の大量精製の方法で精製を行った場合、Gly m Bd 30Kには当該蛋白質以外の蛋白質が５〜１０％程度混入している。上記の加熱による抗原性の低下のため、この程度の混入でも、加熱した抗原を免疫して得た抗体には、混入蛋白質に対する抗体、つまり交叉性を示すポリクローナル抗体がより多くでき、測定系の障害となった。そこで、加熱しても、Gly m Bd 30Kが凝集しないように、界面活性剤、還元剤存在下で通常より強く加熱変性させる。ここで、通常より強く加熱変性させているのは、抗原性を上げるため、動物に免疫後に、再びポリマーを形成しないようにより強く変性させるためである。
【０００９】
係る通常より強い変性条件について検討したところ、還元剤としては1〜3%程度の２−メルカプトエタノール、及び界面活性剤としては1〜20%程度のＳＤＳ存在下であればよいことが明らかとなった。また、処理条件としては、80〜100℃程度、10分〜10時間程度であればよく、好ましくは、90〜100℃程度、20分〜2時間程度であればよく、より好ましくは、95〜100℃程度、30分〜1時間程度であればよいことが判明した。更に、分子量による混入蛋白質との分離を行うため、ゲル濾過による精製を行い、純度を９７％以上、好ましくは、９８％以上、より好ましくは、９９％以上に高めたものを加熱変性抗原として準備する必要があることも明らかとなった。そして、係る加熱変性抗原を免疫して得た抗体と未変性抗原を免役して得た抗体とを、１：３〜３：１、好ましくはほぼ同等の蛋白質量で混合したものをキットの抗体として用いることが好ましいことが判明した。
【００１０】
なお、Gly m Bd 30Kの還元剤、界面活性剤及び加熱変性条件の違いによる抗原性の比較は以下の表１の通りである。
【００１１】
【表１】
【００１２】
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体は、常法に準じて、Gly m Bd 30Kで免疫した動物の抗血清から調製することができ、係るポリクローナル抗体の調製方法は当業者に周知であり、免疫時の加熱変性抗原の処理方法や純度以外は、通常の方法を用いることが出来る。
例えば、Gly m Bd 30Kを適当なアジュバントとともに動物（例えば、馬、牛、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マウス等）に投与して免疫し、適当な間隔及び回数で（例えば１〜２週間おきに４〜６回程度）で投与を繰り返し、最終免疫後に採血し、抗血清を分離することにより得ることができる。かくして得られた抗血清は、Gly m Bd 30Kを固定化したアフィニティーカラムで精製することにより精製抗Gly
m Bd 30Kポリクローナル抗体を得ることができる。
【００１３】
また、本発明の抗体としては、上記のポリクローナル抗体を酵素処理して得られた抗体フラグメントであってもよい。当該抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメンなどが例示される。酵素処理は常法に準じて行なうことができ、この際に使用される酵素としては、ブロメライン、パパイン、トリプシン、ペプシンなどの慣用のプロテアーゼが使用される。
【００１４】
本発明の大豆検出キットには抽出液が含まれる。当該抽出液は、食品中の大豆成分を抽出し得る液であれば特に限定されないが、通常、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などが使用される。
【００１５】
当該抽出液は、食品中の大豆成分を確実に抽出し得るように、イオン性界面活性剤を含有するのが好ましい。係るイオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸カリウム等のアルキル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩などの陰イオン性界面活性剤、塩化ヘキサデシルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムなどの陽イオン性界面活性剤が例示され、これらの界面活性剤は２種以上を併用してもよい。より好ましいイオン性界面活性剤としてＳＤＳが使用される。
イオン性界面活性剤の濃度としては、０．５〜３．５％（ｗ／ｖ、以下同様）、好ましくは１．０〜３．０％、より好ましくは１．５〜２．５％程度に調整される。イオン性界面活性剤濃度が０．５％未満では抽出効率が劣るおそれがあり、また３．５％を超えても抽出効率が低下するおそれがある。
【００１６】
更に、本発明で使用される抽出液は、還元剤を含有していてもよい。還元剤を含有させることにより、大豆成分が難溶性物質に変性していたり、食品中の各種成分とＳ−Ｓ結合を介して結合していても、食品中の大豆成分を抽出することが可能となる。
還元剤としては、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールが例示されるが、２−メルカプトエタノールが好適に使用される。還元剤の濃度としては、０．５〜５％程度、好ましくは１〜２％程度に調整される。０．５％未満では抽出効率が劣ることがあり、また５％までで十分に効果を奏するので、それ以上の濃度は特に必要とされない。
【００１７】
本発明の大豆検出キットを使用した測定方法としては、慣用の免疫学的測定方法のいずれにも適用させることができ、係る方法としては、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、免疫比濁法などが例示され、簡便且つ高精度であることから酵素免疫測定法が好ましい。これらの方法は既に周知であり、常法に準じて行うことができる。
また、本発明の大豆検出キットには、測定方法に応じて、他の構成要素が含まれていてもよい。係る構成要素としては、例えば、希釈液、測定溶液、基質液、反応停止液、反応容器などが例示され、係る構成要素は、従来の検出キットに準じて、適宜作製することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
なお、本発明で使用される抗原であるGly m Bd 30kは公知物質であり、抗未変性抗原抗体を作製するための未変性抗原は、文献記載の方法などで調製することができる(例えば、J. Biol Chem. 265, 13843-13848, 1990参照)。一方、本検査キットを組み立てる上で、抗未変性抗原抗体と同じく必要な、抗加熱変性抗原抗体を作製するための加熱変性抗原は、未変性抗原を更に、還元剤である2%２−メルカプトエタノール、及び界面活性剤である1%ＳＤＳ存在下で、100℃、３０分間、強力に加熱処理した後、更にSuperdex 75を用いたゲル濾過により精製を行い、99%の純度のものを加熱変性抗原として使用した。
【００１９】
また、抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体は、下記の方法で調製した。
未変性（又は加熱変性）Gly m Bd 30k抗原を1mg/2mL（ＰＢＳ）に調製し、アジュバンドと混合し、免疫抗原とした。日本白色種の雄のウサギ1羽（１１週齢：体重２．７Ｋｇ）に免疫抗原(2mL)を背部皮下に注射して免疫し、２週間間隔で同用量の免疫抗原を計６回投与して免疫を行った。６回免疫後、心臓より全採血し抗血清を得た。得られた抗血清は、CNBr活性化セファロースにGly m Bd 30kを結合させた担体を使用したカラムクロマトグラフィーに付し、担体に結合した抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体を溶出液(0.1Mグリシン−塩酸、pH2.7)で溶出し、精製抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体を得た。
【００２０】
なお、以下の実施例で使用した抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体は、未変性Gly m Bd 30k抗原由来抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体（即ち、未変性Gly m Bd 30k抗原を免疫して得られたポリクローナル抗体）と加熱変性Gly m Bd 30k抗原由来抗Gly m Bd 30kポリクローナル抗体（即ち、加熱変性Gly m Bd 30k抗原を免疫した得られたポリクローナル抗体）の等量混合物である。
【００２１】
実施例１（抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体と他の豆類への交差反応性の試験）
（１）使用抗体
前記の抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体の他、大豆に含有されている蛋白質である７Ｓ、１１Ｓ及び大豆の全抽出蛋白質を用いて、前記と同様な方法で、それぞれ抗７Ｓポリクローナル抗体、抗１１Ｓポリクローナル抗体及び抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体を作製した。更に、これらのポリクローナル抗体を常法に準じてビオチン化し、それぞれのビオチン標識抗体を作製し、以下の試験に使用した。
【００２２】
（２）豆類抽出液の調製
豆類として大豆、小豆、えんどう豆、そら豆、いんげん豆を検体とした。
各検体をフードミルサーで均一化し、50mL容チューブに１ｇを秤量した。各チューブに0.5% SDS、2%２−メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCL緩衝液（pH 7.5）19mLを加えて攪拌し、振とう機にのせて100rpmで16時間抽出後、3000×ｇで20分間遠心分離した。上清をろ紙でろ過し、ろ液を豆類抽出液とした。
【００２３】
（３）マイクロタイタープレートへの抗体のコーティングとブロッキング
0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 8.5）を用いて4μg/mLに希釈した抗Gly m Bd
30Kポリクローナル抗体溶液100μLをELISAプレート(Nunc社)に分注し、4℃で一晩コーティングした。洗浄液（0.15M NaCl、0.05%Tween20を含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）250μLで2回洗浄後、ブロッキング液（1％ BSA、5％ Sucrose、0.1％ NaN3 を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)）200μLを加えて4℃で一晩ブロッキングした。抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体に代えて、それぞれ抗７Ｓポリクローナル抗体、抗１１Ｓポリクローナル抗体及び抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体を使用し、同様な操作でマイクロタイタープレートへの抗体のコーティングを行った。
【００２４】
（４）豆類抽出液の測定
上記の豆類抽出液を希釈用緩衝液（0.1%BSA、0.1%Tween20、0.15M
NaCl、0.025% BRONIDOXを含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）で希釈し、測定溶液とした。
各ウェル中のブロッキング液を除去し、前記で調製した測定溶液 100μLをプレートに加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLを加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン結合物 100μLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 100μLを加えて遮光下で25℃、20分間反応させた。0.5N 硫酸
100μLを加えて反応を停止させた後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（主波長450nm、副波長 620nm）で測定し、交叉性を試験した。
【００２５】
また、ビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体に代えて、それぞれビオチン標識抗７Ｓポリクローナル抗体、ビオチン標識抗１１Ｓポリクローナル抗体及びビオチン標識抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体を使用し、同様な操作で測定を行った。
その結果を表２に示す。表２に示すとおり、抗７Ｓポリクローナル抗体、抗１１Ｓポリクローナル抗体及び抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体は測定したすべての豆類に対して交差反応を示したが、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体は交差反応が認められなかった。従って、抗Gly
m Bd 30Kポリクローナル抗体は交叉性のない抗体であり、抗体として優れていることが判明した。
【００２６】
（５）豆類抽出液の電気泳動とブロッティング
上記豆類抽出液にサンプルバッファー（2% SDS、2%２−メルカプトエタノール、20% サッカロース、0.2% BPBを含む0.1M Tris-HCL緩衝液(pH8.8)）を等量加えて攪拌し、100℃で5分間加熱処理して試料溶液とした。SDS-PAGE用ミニゲルを泳動装置にセットし、泳動バッファー（192mMグリシン、0.1% SDSを含む25mM Tris-HCL緩衝液(pH7.4)）を満たして、分子量マーカー、上記試料溶液及び標準溶液を5μLずつアプライ後、ゲル1枚につき20mAの定電流で泳動した。ろ紙、PVDF膜をブロッティングバッファー（192mM グリシン、5% MeOHを含む25mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)）に浸漬させた後、転写装置にろ紙、PVDF膜、泳動後のゲル、ろ紙の順に重層し、転写膜の面積１ｃｍ２あたり2mAで1時間ブロッティングした。
【００２７】
（６）各種ポリクローナル抗体を用いた免疫染色
ブロッティング後のPVDF膜をブロッキング液（0.5M NaCl、0.05% Tween20、0.1% BSAを含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.2)）に浸して25℃で30分間ブロッキングした。洗浄液（0.5M NaCl、0.05% Tween20を含む20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)）で5回洗浄後、希釈した各種ポリクローナル抗体溶液15mLを加え、25℃で1時間振とうした。洗浄液で5回洗浄後、希釈したHRP標識抗ウサギIgG溶液 15mLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 15mLを加えて発色させ、明瞭なバンドを検出後、精製水を加えて反応を停止させ、交叉性を調べた。
その結果を表２に示す。表２に示すとおり、抗全大豆蛋白質ポリクローナル抗体は測定したすべての豆類に対して交差反応を示したが、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体、抗7Sポリクローナル抗体及び抗11Sポリクローナル抗体は交差反応が認められなかった。
【００２８】
【表２】
【００２９】
実施例２（各キット抗体による添加大豆蛋白質回収率の比較）
（１）測定抗体
添加大豆蛋白質回収試験を、本発明に係るキット（本発明キット）と市販大豆検出キット（Ａ社キット及びＢ社キット）を用いて比較した。
本発明キットの抗体としては、抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び常法に準じて調製したビオチン標識抗体を使用した。また、比較対象である市販キットについては、各々キット添付の抗体を使用した。
【００３０】
（２）モデル食品
蛋白質濃度 10μg/gを含むように大豆粉末を添加したモデル加工食品（白がゆ）を作製した。白がゆは、加熱処理を行わなかったものと、100℃で30分間加熱処理後、流水で冷やしたものを各々モデル加工食品として使用した。
【００３１】
（３）抽出液
本発明品の抽出液としては、2%２−メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCL緩衝液（pH 7.5）にSDSを0.5%の濃度を加えた抽出液を調製し使用した。市販のキットについては、各キットに添付の抽出液を使用した。
【００３２】
（４）モデル加工食品の抽出
上記に示した２種類のモデル加工食品をフードミルサーで均一化し、50mL容チューブに１ｇずつ秤量した。各チューブに上記の抽出液 19mLを加えて攪拌し、振とう機にのせて100rpmで16時間抽出後、3000×ｇで20分間遠心分離した。上清をろ紙でろ過し、ろ液をモデル加工食品抽出液とした。
【００３３】
（５）マイクロタイタープレートへの抗体のコーティングとブロッキング
0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 8.5）を用いて4μg/mLに希釈した上記抗Gly m
Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLをELISAプレート(Nunc社)に分注し、4℃で一晩コーティングした。洗浄液（0.15M NaCl、0.05% Tween20を含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)） 250μLで2回洗浄後、ブロッキング液（1％ BSA、5％ サッカロース、0.1％ NaN3
を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)）200μLを加えて4℃で一晩ブロッキングした。
【００３４】
（６）モデル加工食品抽出液の測定
上記のモデル加工食品抽出液を希釈用緩衝液（0.1% BSA、0.1% Tween20、0.15M NaCl、0.025% BRONIDOXを含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）で２０倍に希釈し、測定溶液とした。各ウェル中のブロッキング液を除去し、調製した測定溶液 100μL及び検量線作成用に標準大豆試料を0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50ng/mLに希釈した大豆標準溶液をプレートに加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLを加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したHRP標識ストレプトアビジン結合物 100μLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 100μLを加えて遮光下で25℃、20分間反応させた。0.5N 硫酸
100μLを加えて反応を停止させた後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（主波長450nm、副波長 620nm）で測定した。得られた測定値に希釈倍率 400倍を乗算し、添加大豆蛋白質量(10μg)で割った数値を回収率（％）とした。
その結果を表３に示す。表３に示されるように、本発明キットのみ回収率が実用性を有していた。
【００３５】
【表３】
【００３６】
実施例３（抽出液中のSDS濃度と大豆抗原抽出率の関係）
（１）抗体
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び常法に準じて調製したビオチン標識抗体を以下の試験に使用した。
【００３７】
（２）モデル食品
蛋白質濃度 10μg/gを含むように大豆粉末を添加した3種類のモデル加工食品（白がゆ、豚肉団子、牛肉レトルト）を作製した。白がゆは100℃で30分間、豚肉団子は80℃で20分間、牛肉レトルトは121℃で1分間加熱処理後、流水で冷やしてモデル加工食品とした。
【００３８】
（３）抽出液
2%２−メルカプトエタノールを含む20mM Tris-HCL緩衝液（pH 7.5）にSDSを0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%の濃度で加えた10種類の抽出液を調製した。
【００３９】
（４）モデル加工食品の抽出
上記に示した３種類のモデル加工食品をフードミルサーで均一化し、50mL容チューブに１ｇずつ秤量した。各チューブに上記の抽出液 19mLを加えて攪拌し、振とう機にのせて100rpmで16時間抽出後、3000×ｇで20分間遠心分離した。上清をろ紙でろ過し、ろ液をモデル加工食品抽出液とした。この操作を10種類の抽出液について行った。
【００４０】
（５）マイクロタイタープレートへの抗体のコーティングとブロッキング
0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液（pH 8.5）を用いて4μg/mLに希釈した上記抗Gly m
Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLをELISAプレート(Nunc社)に分注し、4℃で一晩コーティングした。洗浄液（0.15M NaCl、0.05% Tween20を含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)） 250μLで2回洗浄後、ブロッキング液（1％ BSA、5％ サッカロース、0.1％ NaN3
を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)）200μLを加えて4℃で一晩ブロッキングした。
【００４１】
（６）モデル加工食品抽出液の測定
上記のモデル加工食品抽出液を希釈用緩衝液（0.1%BSA、0.1%Tween20、0.15M
NaCl、0.025% BRONIDOXを含む0.01M リン酸緩衝液(pH7.2)）で２０倍に希釈し、測定溶液とした。各ウェル中のブロッキング液を除去し、調製した測定溶液 100μL及び検量線作成用に標準大豆試料を0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50ng/mLに希釈した大豆標準溶液をプレートに加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したビオチン標識抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体溶液 100μLを加え、25℃で1時間放置した。洗浄液で5回洗浄後、希釈したHRP標識ストレプトアビジン結合物 100μLを加え、25℃で30分間放置した。洗浄液で5回洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン 100μLを加えて遮光下で25℃、20分間反応させた。0.5N 硫酸
100μLを加えて反応を停止させた後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（主波長450nm、副波長 620nm）で測定した。得られた測定値に希釈倍率 400倍を乗算し、添加大豆蛋白質量(10μg)で割った数値を回収率（％）とした。
その結果を表４に示す。表４に示されるように、0.5〜3.5％、好ましくは1.5〜2.5％のSDSを含有する抽出液が高い回収率を示した。食肉加工品の場合には、加熱により、大豆蛋白質が肉蛋白質と結合していると考えられ、1.5%〜2.5%のSDSを含有する抽出液を使用することが好適であることが判明した。
【００４２】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる食品中の大豆検出キット。
【請求項２】
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体が、未変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体と、加熱変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体の混合物である請求項１記載の検査キット。
【請求項３】
抽出液が、イオン性界面活性剤を含有する液である請求項１又は２記載の検出キット。
【請求項４】
抽出液が、１．５％〜２．５％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム含有水溶液である請求項１〜３の何れかに記載の検出キット。
【請求項５】
抽出液が還元剤を含む請求項１〜４の何れかに記載の検出キット。
【請求項６】
還元剤が、２−メルカプトエタノールである請求項５記載の検出キット。
【請求項１】
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体及び抽出液からなる食品中の大豆検出キット。
【請求項２】
抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体が、未変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体と、加熱変性Gly m Bd 30K抗原由来抗Gly m Bd 30Kポリクローナル抗体の混合物である請求項１記載の検査キット。
【請求項３】
抽出液が、イオン性界面活性剤を含有する液である請求項１又は２記載の検出キット。
【請求項４】
抽出液が、１．５％〜２．５％(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム含有水溶液である請求項１〜３の何れかに記載の検出キット。
【請求項５】
抽出液が還元剤を含む請求項１〜４の何れかに記載の検出キット。
【請求項６】
還元剤が、２−メルカプトエタノールである請求項５記載の検出キット。
【公開番号】特開２００８−７６３１５（Ｐ２００８−７６３１５Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５８１３０（Ｐ２００６−２５８１３０）
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
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