骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及びトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（ＴＧＦ−β）の発現を細胞において誘導する方法
１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質の発現を細胞において誘導する方法について記載する。本方法には、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが含まれる。１以上の骨形態形成タンパク質は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、又はこれらの組合せであり得る。トランスフォーミング増殖因子−βタンパク質は、トランスフォーミング増殖因子−β１タンパク質（ＴＧＦ−β１）であり得る。トランスフェクションは、ウイルス又は裸のＤＮＡの直接注射により、又はプラスミドのような非ウイルスベクターにより、ex vivo 又は in vivo で達成することができる。本方法を使用して、骨性細胞において骨形成を誘導して、プロテオグリカン及び／又はコラーゲンを産生することが可能な細胞（例、椎間板細胞）においてプロテオグリカン及び／又はコラーゲン産生を刺激することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、遺伝物質で細胞をトランスフェクトする方法に概して関する。より具体的には、本発明の分野は、ＬＩＭ石灰化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）タンパク質（ＬＭＰ）をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることによって、１以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及び／又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（ＴＧＦ−β）の発現を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
骨芽細胞は、多能性の間葉幹細胞より分化すると考えられている。骨芽細胞の成熟化は、石灰化して骨を形成することができる細胞外マトリックスの分泌をもたらす。この複雑なプロセスの調節は、十分には理解されていないが、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）として知られる一群のシグナル伝達糖タンパク質が関与すると考えられている。これらのタンパク質は、胚の背側−腹側パターン形成、肢芽発生、及び成体動物における骨折修復に関与することが示されている。B. L. Hogan, Genes & Develop., 10, 1580 (1996)。このトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリー分泌タンパク質の群は、多様な細胞種において、様々な分化の段階で、多様な活性を有するが、これらの近縁分子間の生理活性における違いは、明確にされていない（D. M. Kingsley, Trends Genet., 10, 16 (1994）。
【０００３】
ラット頭蓋冠の骨芽細胞分化の誘導に対するＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４の効果が検討された（Boden, et al., Endocrinology, 137, 3401 (1996)）。分化の始動にＢＭＰやグルココルチコイドを必要とする胎児ラット頭蓋冠の培養物において、グルココルチコイドは、骨芽細胞分化を高めるＢＭＰ−６ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の１０倍の誘導をもたらした（Boden, et al., Endocrinology, 138, 2920 (1997)）。
【０００４】
ＢＭＰは、in vivo での骨形成の刺激について検討されてきた。ＢＭＰや他の細胞外シグナル伝達分子で達成された初期の成功にもかかわらず、その使用には欠点がある。例えば、新しい骨の産生を高めるには、比較的多量の精製ＢＭＰが必要とされ、それによりそのような治療法の費用は増加する。さらに、ＢＭＰのような細胞外タンパク質は、宿主動物への導入後に分解を受けやすい。
【０００５】
細胞内のシグナル又は調節分子も、骨誘導経路においてある役割を担う可能性がある。１群の細胞内調節分子は、ＬＩＭドメインとして知られる特徴的な構造モチーフを保有するＬＩＭタンパク質である。ＬＩＭドメインは、２−アミノ酸スペーサーにより結合している２つの特殊なジンクフィンガーからなるシステインリッチの構造モチーフである。ＬＩＭドメインだけを有するタンパク質もあれば、多様な追加の機能性ドメインを含有するものもある。ＬＩＭタンパク質は多様な群を形成し、それには転写因子と細胞骨格タンパク質が含まれる。ＬＩＭドメインの主要な役割は、同じか又は異なるＬＩＭドメインとの二量体の形成によるか、又は別個のタンパク質を結合させることによって、タンパク質−タンパク質相互作用に仲介することであるようだ。
【０００６】
ＬＩＭホメオドメインタンパク質（ＬＩＭドメインとホメオドメイン配列の両方を有するタンパク質）において、ＬＩＭドメインは、負の調節要素として機能する。ＬＩＭホメオドメインタンパク質は、細胞系譜決定の制御と分化の調節に関与するが、ＬＩＭのみのタンパク質も同様の役割を有する可能性がある。ＬＩＭのみのタンパク質はまた、そのようなタンパク質をコードするいくつかの遺伝子が腫瘍遺伝子の染色体転座と関連しているので、細胞増殖の制御に関連しているかもしれない。
【０００７】
ヒトや他の哺乳動物腫は、骨修復及び／又は再生のプロセスを必要とする疾患又は損傷を受けやすい。例えば、骨折の治療は、天然の骨修復機序を刺激することができて、それにより骨折した骨が治癒するのに必要とされる時間を短縮する、新しい治療方式によって改善されるだろう。骨粗鬆症のような全身の骨障害のある個体は、新たな骨組織の全身的な形成を産生する治療方式から利益を受けるだろう。そのような治療方式は、この疾患の特徴である骨量の損失より生じる骨折の発症を抑えることができるだろう。
【０００８】
細胞内シグナル伝達分子を使用して新たな骨形成を誘導する治療方式を利用することは、望ましいであろう。遺伝子治療技術は、骨形成に仲介する細胞内シグナルをコードするヌクレオチド断片を骨形成前駆細胞（骨形成に関与する細胞）又は末梢血白血球へ導入することを可能にする。遺伝子治療は、いくつかの潜在的な利点を提供する：（１）標的療法タンパク質の産生に関連したコストがより低いこと；（２）細胞内シグナルの延長された発現を達成する能力により、細胞外の治療方式に比べて効果が高いこと；（３）標的細胞に対する効果が、治療タンパク質と相互作用するために利用可能な限定数の受容体によって限定されないこと；（４）トランスフェクトされた骨前駆細胞を、局在的な骨形成が必要とされる部位へ直接送達し得ること；並びに（５）治療を全身的に提供して、全身の骨形成を誘導し、骨粗鬆症や他の代謝性骨疾患への治療方式を提供し得ること。
【０００９】
ヒトや他の哺乳動物は、椎間板変性、関連した腰痛、椎間板ヘルニア、及び脊椎狭窄を受けやすい。椎間板変性は、椎間板を生物機械的な損傷及び変性により罹りやすくさせる可能性がある、プロテオグリカンマトリックスの進行性損失と関連している。故に、例えば、髄核の細胞、繊維輪の細胞、椎間板の細胞といった適正な細胞によるプロテオグリカン及び／又はコラーゲンの合成を刺激する方法を有することは、望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の要約
本発明の１つの側面によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（ＴＧＦ−β）の発現を細胞において誘導する方法が提供される。該方法には、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが含まれる。本発明の方法により、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質の発現を誘導することができる。本発明のこの側面による単離核酸は、配列番号２５の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下にハイブリダイズすることができる核酸；及び／又は配列番号２６の全長へ相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下にハイブリダイズすることができる核酸分子であり得る。細胞は、どの体細胞でもよく、限定されないが、バフィーコート細胞、幹細胞、及び椎間板細胞が含まれる。
【００１１】
本発明の第二の側面によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を過剰発現する細胞が提供される。この細胞は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質を過剰発現する細胞であり得る。この細胞は、バフィーコート細胞、椎間板細胞、間葉幹細胞、又は多能性幹細胞であってよい。上記に示すような細胞と担体材料を含んでなるインプラントも提供される。本発明によりまた提供されるのは、上記に示すような細胞又はインプラントを哺乳動物へ導入することを含んでなる、骨形成を哺乳動物において誘導する方法と、上記に示すような細胞を哺乳動物の椎間板へ挿入することを含んでなる、椎間板疾患を哺乳動物において治療する方法である。
【００１２】
本発明の追加の利点と新規な特徴は、一部は以下に続く記載において示され、そして一部は以下の検証によるか、又は本発明の実施から学ぶことによって当業者により明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
好ましい態様の詳細な説明
ＬＭＰ−１は、初期の骨芽細胞分化に関連した新規のＬＩＭドメインタンパク質である。発生中の胚の長骨の肥大性軟骨細胞に近接する間葉細胞においてＬＭＰ−１転写物がはじめて検出可能になるのは、軟骨原基の中央に骨芽細胞が出現する直前である（Boden, et al.,「ＬＩＭドメインタンパク質、ＬＭＰ−１は、骨形成に及ぼすＢＭＰ−６の効果に仲介する（LMP-1, A LIM-Domain Protein, Mediates BMP-6 Effects on Bone Formation）」Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) を参照のこと）。ＬＭＰ−１タンパク質は、その多くが様々な細胞種において増殖と分化に関与しているＬＩＭドメインタンパク質の異質ファミリーのメンバーである。しかしながら、ＬＩＭ−ドメインタンパク質の作用の正確な機序は、ほとんど理解されていない。Kong, et al.,「筋ＬＩＭタンパク質は、ＭｙｏＤの活性を亢進することによって筋発生を促進する（Muscle LIM Protein Promotes Myogenesis by Enhancing the Activity of MyoD）」Mol. Cell. Biol., 17, 4750-4760 (1997)；Sadler et al.,「ＺｙｘｉｎとｃＣＲＰ：細胞骨格と結合した２つの相互作用性ＬＩＭドメインタンパク質（Zyxin and cCRP: The Interactive LIM Domain Proteins Associated with the Cytoskeleton）」J. Cell Bio., 119, 1573-1587 (1992)；Salgia et al.,「ヒトパキシリン、Ｐ２１０（ＢＣＣＲ／ＡＢＬ）によりリン酸化されるフォーカルアドヒージョンタンパク質の分子クローニング（Molecular Cloning of Human Paxillin, a Focal Adhesion Protein Phosphorylated by P210 (BCCR/ABL)）」J. Biol. Chem., 270, 5039-5047 (1995)；及び Way, et al.,「C. Elegans における接触受容体ニューロンの分化を特定するホメオボックス含有遺伝子、Ｍｅｃ−３（Mec-3, A Homeobox-Containing Gene that Specifies the Differentiation of the Touch Receptor Neurons in C. Elegans）」Cell, 54, 5-16 (1988) を参照のこと。
【００１４】
ＬＭＰ−１はＬＩＭドメインタンパク質であるが、ＬＩＭドメインそのものは、骨芽細胞の分化には必要でないことが最近示された（Liu, et al.,「ＬＩＭドメインが骨を誘導するのに、ＬＩＭ石灰化タンパク質の過剰発現は必要でない（Overexpressed LIM Mineralization Proteins do not Require LIM Domains to Induce Bone）」J. Bone Min. Res., 17, 406-414 (2002) を参照のこと）。ＬＩＭ−１は、骨芽細胞分化を in vitro で、de novo 骨形成を in vivo で、ごく低い用量で誘導することが可能である、強力な細胞内シグナル伝達分子であると考えられている（Boden, et al., Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998)）。
【００１５】
２つの別個の実験系からの結果は、ＬＭＰ−１がいくつかのＢＭＰの発現を誘導することを示している。ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの挿入後、in vitro では早くも４８時間で、in vivo では７２時間でＢＭＰ−４とＢＭＰ−７を検出することができる。in vivo 試験は、ＬＭＰ−１を発現する移植バフィーコート細胞のほとんどが in vivo では１週間も生存しないことを示したが、骨形成細胞へ分化した宿主細胞の流入の証拠があった。種々の結果は、ＬＭＰ−１が膜様の骨形成を明瞭な軟骨細胞分裂間期を伴わずに誘導することも示しているが、これはＢＭＰの多くで共通している。
【００１６】
発明者は、ＡｄＬＭＰ−１で処理した細胞がＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２と、より少ない程度で、ＢＭＰ−６及びＴＧＦ−β１のタンパク質を in vitro で産生することも示した。ＢＭＰ−４とＢＭＰ−７は、ＬＭＰ−１により誘導される追加分泌の骨誘導因子である。発明者が実施したアンチセンスオリゴヌクレオチド実験は、細胞内ＬＭＰ−１がその骨誘導効果を他の細胞に及ぼすのにＢＭＰ−４とＢＭＰ−７が必要であることを示している。
【００１７】
以下に記載するＡ５４９実験は、ＢＭＰがアデノウイルスそのものによっては誘導されなかったこと、そして非処理細胞でもＢＭＰが発現されなかったことを示している。これらの実験はまた、骨芽細胞分化に関連しない２つのタンパク質（即ち、ＩＩ型コラーゲンとＭｙｏＤ）がＬＭＰ−１によって誘導されなかったことも示している。
【００１８】
Ａ５４９肺癌細胞を選んだのは、Ａ５４９細胞が、骨芽細胞と違って、ＢＭＰの基底発現を有さないからである。
通常の静脈血由来のバフィーコート細胞の ex vivo 遺伝子治療への使用は、比較的新しい。Viggeswarapu, et al.,「ＬＩＭ石灰化タンパク質−１のアデノウイルス送達は、in vitro 及び in vivo で新骨形成を誘導する（Adenoviral Delivery of LIM Mineralization Protein-1 Induces New-Bone Formation in vitro and in vivo）」J. Bone Joint Surg. Am., 83-A, 364-376 (2001) を参照のこと。ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡでトランスフェクトされたバフィーコート細胞がどのくらい長い間 in vivo で生存して、ＢＭＰの合成、分泌、及び活性を高めるかを決定するために、ＣＤ−４５抗原が使用された（Kurtin, et al.,「白血球共通抗原−モノクローナル抗体を使用するパラフィン切片における造血性及び非造血性新生物間の診断識別因子：免疫学的試験及び超構造定位法との相関性（Leukocyte Common Antigen--A Diagnostic Discriminant Between Hematopoietic and Nonhematopoietic Neoplasms in Paraffin Sections using Monoclonal Antibodies: Correlation with Immunologic Studies and Ultrastructural Localization）」Hum Pathol., 16, 353-365 (1985)；及び Pulido et al.,「４つの異なるＣＤ４５抗原特異性の比較生化学及び組織分布試験（Comparative Biochemical and Tissue Distribution Study of Four Distinct CD45 Antigen Specificities）」J. Immunol., 140, 3851-3857 (1988) を参照のこと）。抗ＣＤ−４５一次抗体と特異的に反応する細胞の数は累進的に減少し、移植後１０日までに最小になった。抗ＣＤ−４５染色の消失、７日目でインプラントの中央で細胞が脱落していること、そして骨形成の求心性パターンは、いずれも、移植した細胞（ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを発現するものが含まれる）が長い時間の間生存しないことを示唆し、ＬＭＰ発現細胞が分泌因子（これが後続的に宿主の前駆細胞を動員して、成熟骨芽細胞へのその分化を変調させる）の誘導を介して骨形成プロセスに間接的に参画する可能性があることを示唆した。証拠の示すところでは、ＬＭＰ−１は、いくつかの骨誘導タンパク質（ＢＭＰ）の分泌が含まれるイベントのカスケードを開始させる。故に、ＬＭＰ−１は、多くの細胞において発現されることなく有意な効果を及ぼして、in vivo で長い時間存続することができるので、理想的な治療候補物質である。
【００１９】
発明者は、異所的に移植した末梢血バフィーコート細胞へのＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの ex vivo 遺伝子導入による骨誘導を実証した。故に、本発明は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸での非骨性細胞のトランスフェクションに関する。発明者は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸での椎間板細胞のような非骨性細胞のトランスフェクションが、プロテオグリカン、コラーゲン、そして他の椎間板成分及び組織の合成の増加をもたらし得ることを発見した。故に、発明者は、プロテオグリカン、コラーゲン、又は他の椎間板成分の損失と関連した椎間板疾患を治療する方法を提供する。
【００２０】
発明者は、かつて、被刺激ラット頭蓋冠の骨芽細胞培養物よりＬＩＭ石灰化タンパク質（ＬＭＰ）ｃＤＮＡ配列（１０−４／ＲＬＭＰ）を単離した（配列番号１、配列番号２）（米国特許第６，３００，１２７号）。この遺伝子をクローニングし、配列決定し、骨石灰化の効力を in vitro で高めるその能力をアッセイした。このタンパク質、ＲＬＭＰは、骨マトリックスの石灰化と、並びに細胞の骨芽細胞系譜への分化に影響を及ぼすことが見出された。骨石灰化タンパク質（ＢＭＰ）のような他の既知のサイトカインとは異なり、ＲＬＭＰは、分泌タンパク質ではなく、むしろ細胞内のシグナル伝達分子である。故に、より少ない量のタンパク質で、細胞内シグナル伝達増幅と in vivo 適用へのより大きな特異性をもたらすことができる。好適な臨床適用には、骨折、骨欠損、骨移植における骨修復の亢進と、骨粗鬆症を表出する患者における正常なホメオスタシスが含まれる。
【００２１】
ヒトＬＭＰ−１（ＨＬＭＰ−１）と命名される対応のヒトタンパク質のアミノ酸配列もクローニングされ、配列決定され、演繹されている（米国特許第６，３００，１２７号）。実証されたヒトタンパク質は、骨石灰化の効力を in vitro と in vivo で高めた。
【００２２】
ＨＬＭＰ−１ｓと呼ばれる、ＨＬＭＰ−１の末端切断（短い）バージョンも、発明者により特性決定された（米国特許第６，３００，１２７号を参照のこと）。このタンパク質は、終止コドンを産生する点突然変異の結果であり、末端切断タンパク質をもたらす。ＨＬＭＰ−１ｓは、細胞培養と in vivo において発現されるとき、完全に機能的である。
【００２３】
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ解析を使用して、２つの可変スプライス変異体（ＨＬＭＰ−２及びＨＬＭＰ−３）を同定した（米国特許出願０９／９５９，５７８号、２０００年４月２８日出願）。これらタンパク質のヌクレオチド配列は、ＨＬＭＰ−１配列の３２５〜４４４塩基対領域においてＨＬＭＰ−１と異なる。ＨＬＭＰ−２配列は、この領域に１１９塩基対の欠失と１７塩基対の挿入を有する。ＨＬＭＰ−１と比べて、ＨＬＭＰ−３をコードするヌクレオチド配列には欠失がないが、それはＨＬＭＰ−２と同じ１７塩基対の挿入を有し、これらの塩基対は、ＨＬＭＰ−１配列の塩基対４４４に対応する位置に挿入されている。
【００２４】
ＬＭＰは、いくつかの生物学的プロセスを調節してそれに影響を及ぼすので、ＬＭＰの様々なスプライス変異体は、哺乳動物において、様々な組織の増殖、分化、及び／又は再生といった異なる生物学的機能を有すると予測される。例えば、ある形態のＬＭＰは、骨だけでなく、筋肉、腱、靭帯、脊髄、末梢神経、及び軟骨においても発現されている。
【００２５】
本発明は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸配列を提供すること；プロテオグリカンを産生することが可能な哺乳動物細胞へその単離核酸配列をトランスフェクトすること；そして、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現させて、それによりプロテオグリカン合成を刺激することによって、哺乳動物細胞においてプロテオグリカン又はコラーゲン、あるいはその両方の合成を刺激する方法を提供する。哺乳動物細胞は、椎間板細胞、繊維輪の細胞、又は髄核の細胞のような、非骨性細胞でよい。トランスフェクションは、ウイルス又は、例えばプラスミドのような裸のＤＮＡの直接注射により、ex vivo 又は in vivo のいずれで起きてもよい。ある態様において、ウイルスは、組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１である。
【００２６】
本発明の別の態様は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする単離核酸配列を含んでなる非骨性哺乳動物細胞を含む。非骨性哺乳動物細胞は、幹細胞（例、多能性幹細胞又は間葉幹細胞）でも、椎間板細胞、好ましくは、髄核の細胞又は繊維輪の細胞でもよい。
【００２７】
異なる側面において、本発明は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする単離核酸配列を非骨性哺乳動物細胞において発現させる方法へ向けられ、該方法は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸を提供すること；前記単離核酸配列を非骨性哺乳動物細胞へトランスフェクトすること；そして、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を発現させることを含んでなる。非骨性哺乳動物細胞は、幹細胞でも、椎間板細胞（例えば、髄核又は繊維輪の細胞）でもよい。トランスフェクションは、ウイルス、又は例えばプラスミドのような裸のＤＮＡの直接注射により ex vivo 又は in vivo のいずれで起きてもよい。ウイルスは、組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１であり得る。
【００２８】
なお別の態様において、本発明は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸を提供すること；プロテオグリカンを産生することが可能な哺乳動物細胞へその単離核酸配列をトランスフェクトすること；そして、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現させることによってプロテオグリカン合成をその細胞において刺激することにより、椎間板変性を逆転させるか又は阻害することによって、椎間板変性を逆転、遅延、又は減速させることにより椎間板疾患を治療する方法へ向けられる。椎間板疾患は、腰痛、椎間板ヘルニア、又は脊椎狭窄をもたらす可能性があるので、該方法はこれらの症状を軽減することができる。哺乳動物細胞は、幹細胞又は椎間板細胞（例えば、繊維輪の細胞、又は髄核の細胞）のような非骨性細胞でよい。
【００２９】
トランスフェクションは、ウイルス、又は例えばプラスミドのような裸のＤＮＡの直接注射により ex vivo 又は in vivo のいずれで起きてもよい。ある態様において、ウイルスは、組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１である。
【００３０】
本発明は、本明細書においてＬＩＭ石灰化タンパク質、又はＬＭＰと表記される新規の哺乳動物ＬＩＭタンパク質に関する。本発明は、より特別には、ＨＬＭＰ又はＨＬＭＰ−１として知られるヒトＬＭＰ、又は、ＨＬＭＰ−２又はＨＬＭＰ−３として知られている、ヒトＬＭＰの可変スプライス変異体に関する。発明者は、これらのタンパク質が in vitro で増殖させた哺乳動物細胞において骨石灰化を亢進させることを発見した。哺乳動物において産生されるとき、ＬＭＰは、in vivo でも骨形成を誘導する。
【００３１】
ＬＩＭ石灰化タンパク質（例、ＬＭＰ又はＨＬＭＰ）をコードする核酸での骨髄細胞、骨形成前駆細胞、末梢血細胞、及び幹細胞（例、多能性幹細胞又は間葉幹細胞）の ex vivo トランスフェクションに続く、トランスフェクト細胞のドナーへの再移植は、多様な骨関連障害又は損傷を治療するのに適している。例えば、この方法を使用して、長骨骨折修復を高め、分節欠損部分に骨を産生し、骨移植代替物を骨折部分に提供し、腫瘍再構成又は脊椎融合を促進し、股関節、脊椎、又は手根部の骨粗鬆症のような、脆いか骨粗鬆症の骨への局所治療（注射による）を提供することができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸でのトランスフェクションはまた、トランスフェクトされた骨髄細胞を皮下注射して、骨折した長骨の修復を加速させること；長骨骨折の結合又は再結合の遅延、又は脊椎融合の偽関節症の治療、及び股関節又は膝関節の無血管壊死において新骨形成を誘導することに有用である。
【００３２】
遺伝子治療の ex vivo 法だけでなく、ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる組換えＤＮＡベクターのトランスフェクションは、in vivo で達成することもできる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードするＤＮＡ断片を、例えばアデノウイルスベクターのような適切なウイルスベクターへ挿入するとき、このウイルス構築体は、軟骨内の骨形成が望まれる部位へ直接注射することができる。直接の経皮注射を使用してＬＭＰ又はＨＬＭＰ配列を導入することによって、骨髄細胞を入手する（ex vivo でトランスフェクトする）ため、又は新しい骨が必要とされる部位で患者へそれらを再移植するための外科的介入なしに、骨形成の刺激を達成することができる。Alden, et al. (Neurosurgical Focus (1998)) は、アデノウイルスベクターへクローニングしたＢＭＰ−２ ｃＤＮＡを使用する遺伝子治療の直接注射法の有用性を実証した。
【００３３】
ＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる裸の、又は被包化されていない組換えプラスミドを適切な身体部位へ直接注射することによって in vivo 遺伝子治療を行うことも可能である。本発明のこの態様において、トランスフェクションが起こるのは、裸のプラスミドＤＮＡが標的細胞により取り込まれるか又は内部化されるときである。ウイルス構築体を使用する in vivo 遺伝子治療の場合のように、裸のＤＮＡの直接注射は、外科的介入をほとんど又はまったく必要としないという利点を提供する。内皮細胞マイトジェンＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）をコードする裸のＤＮＡを使用する直接的な遺伝子治療が、Baumgartner (Circulation, 97, 12, 1114-1123 (1998) によりヒト患者において成功裡に実証されている。
【００３４】
椎間板への適用では、椎間板より細胞を採取すること、ＬＭＰをコードする核酸でこの細胞を in vitro でトランスフェクトすること、そしてこの細胞を椎間板へ導入することによって、ex vivo トランスフェクションを達成することができる。この細胞は、例えば、脊椎に適した外科的技術のような、当業者に知られたどの手段によっても椎間板から採取して、それへ戻し導入してよい。１つの態様において、細胞は、注射により椎間板へ導入する。
【００３５】
また、本発明によれば、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸で幹細胞（例えば、多能性幹細胞又は間葉幹細胞）を ex vivo でトランスフェクトして、例えば、注射により椎間板へ導入することができる。
【００３６】
ex vivo でトランスフェクトした細胞は、担体と組み合わせて椎間板インプラントを形成させてもよい。次いで、トランスフェクトされた細胞を含んでなる担体を、被検者の椎間板へ移植することができる。好適な担体材料については既に記載されている（例えば、Helm et al.,「骨移植片は、脊椎関節固定術の促進の代用となる（Bone Graft Substitutes for the Promotion of Spinal Arthrodesis）」Neurosurg Focus, 10(4) (2001) を参照のこと）。担体は、好ましくは、脱塩骨マトリックス（ＤＭＢ）のような生体適合性の有孔マトリックス、生体適合性の合成高分子マトリックス、又はタンパク質マトリックスを含む。好適なタンパク質には、例えば、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質が含まれる。ＬＭＰで ex vivo トランスフェクトされた細胞は、移植に先立って担体へ（即ち、有孔マトリックスの空孔の中へ）取り込ませることができる。
【００３７】
同様に、細胞を in vivo でトランスフェクトする椎間板への適用では、当業者に知られた好適な方法を使用して、ＤＮＡを椎間板へ導入してよい。１つの態様において、核酸は、椎間板スペースへ直接注射する。
【００３８】
アデノウイルスは、被感染細胞のゲノムへ取り込まれないので、アデノウイルスベクターを使用してＬＭＰを骨形成細胞へ送達するときには、ＬＭＰの一過性発現が達成される。しかしながら、一過性発現は、本発明の目的を達成するのに十分である。しかしながら、標的細胞のゲノムへ取り込まれるベクターの使用により、ＬＭＰの安定発現を達成することができる。例えば、レトロウイルスベクターは、この目的に適している。
【００３９】
ＬＭＰの安定発現は、骨粗鬆症及び骨形成不全症のような、様々な全身性の骨関連障害を治療するのに特に有用である。本発明のこの態様では、ウイルスベクターへの取込みのために調節可能プロモーターをＬＭＰのポリヌクレオチド配列と組み合わせてよい。このようなプロモーターは、例えば、テトラサイクリンのような外因性の誘導剤への曝露により制御される配列を含む場合がある。
【００４０】
このアプローチを使用して、有効量の外因性誘導剤を投与することによって、全身の新骨形成の刺激を達成する。望ましい骨量が達成されたならば、外因性誘導剤の投与を中止してよい。この方法は、例えば、骨粗鬆症の結果としての骨損失に換わるために、必要に応じて繰り返してよい。
【００４１】
ＨＬＭＰに特異的な抗体は、患者の細胞の骨誘導又は骨形成ポテンシャルをアッセイする方法における使用に特に適していて、骨修復が遅いか又は妨げられるリスク状態の患者を同定する手段を提供する。また、ＨＬＭＰ特異抗体は、例えば、骨粗鬆症のような骨変性疾患のリスク因子を同定するマーカーアッセイにおける使用に適している。
【００４２】
よく知られた慣用法に従って、本発明の遺伝子治療ベクターは、ＬＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の、クローニング又は発現ベクターを含んでなる核酸配列への連結により製造する。好ましいベクターは、ＬＭＰのＤＮＡ配列をクローニングして、発現させる手段を提供する。これらの組換えベクターを構築して解析するのに必要とされる方法は、分子生物学の当業者によく知られていて、例えば、Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manial）」第２版、コールドスプリングハーバープレス（1988）、Davis, et al.,「分子生物学の基本方法（Basic Methods in Molecular Biology）」、エルセヴィエ（1986）、及び Ausubel, et al.,「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ウィリー・インターサイエンス（1988）に記載されている。
【００４３】
ＬＭＰ ｃＤＮＡ配列を増幅させる手段を提供するポリメラーゼ連鎖反応は、米国特許第４，８００，１５９号（Mullis, et al.）に記載されている。ＤＮＡ増幅用のキットは市販されていて、限定量の試料よりｃＤＮＡ配列の多数のコピーを製造するのに必要な酵素及び関連試薬を含む。
【００４４】
ＬＩＭ石灰化タンパク質発現ベクターは、骨形成活性を有するＬＩＭ石灰化タンパク質の発現の鋳型を提供する、どのポリヌクレオチド配列を含んでもよい。保守的なアミノ酸置換や、アミノ末端メチオニン残基の出現のような他の修飾も、これらの置換及び修飾が当業者の技量内にあるので、本発明の範囲内にある。
【００４５】
選択される宿主発現系に関連したリボソーム結合部位をキメラＬＭＰコード配列の５’末端へ連結して合成遺伝子を形成して、これを発現ベクターへ挿入することができる。調節可能プロモーター、例えば、大腸菌ｌａｃプロモーターも、キメラコード配列の発現用に提供してよい。他の好適な調節可能プロモーターには、例えば、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７、及びラムダプロモーターが含まれる。
【００４６】
ＬＭＰをコードするＤＮＡは、安定した形質転換体を形成するために、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、又はプロトプラスト融合のような、当業者に知られたどの手段によってレシピエント細胞へトランスフェクトしてもよい。リン酸カルシウム沈殿は、Graham, et al.(Virology, 52, 456 (1973)) の方法によって実施することができる。簡潔に言えば、１００ｍｍディッシュにプレート培養した０．５ｘ１０６個の細胞につき、４０〜５０マイクログラムのＤＮＡのアリコートをサケ精子又はウシ胸腺のＤＮＡを担体として使用する。このＤＮＡを０．５ｍｌの２Ｘ Ｈｅｐｅｓ溶液（２８０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，及び１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．０）と混合して、これへ等量の２ｘＣａＣｌ２（２５０ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０）を加える。３０〜４０分後に現れる、白い粒状の沈殿を細胞に滴下して均等に分配して、これを３７℃で４〜１６時間インキュベートする。培地を除去し、この細胞をＰＢＳ中１５％グリセロールへ３分間曝露する。グリセロールを除去した後で、１０％胎児ウシ血清を含有するダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）で細胞に給餌する。
【００４７】
ＤＮＡは、Kimura et al. (Virology, 49: 394 (1972)) 及び Sompayrac et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7575 (1981)) のＤＥＡＥ−デキストラン法、Potter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161 (1984)) のエレクトロポレーション法、又は Sandri-Goddin, et al.(Molec. Cell. Biol., 1, 743 (1981)) に記載されるプロトプラスト融合法を使用してトランスフェクトしてもよい。
【００４８】
本発明にはまた、本発明のＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸配列又はそれへの相補配列のいずれにも標準条件下でハイブリダイズする核酸分子が含まれる。「標準ハイブリダイゼーション条件」は、プローブのサイズ、核酸試薬のバックグラウンド及び濃度、並びにハイブリダイゼーションの種類に応じて変動するものである。例えば、in situでは、サザンブロット、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット）を使用することができる。「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定は、当業者の技術レベル内にある。そのような条件は、例えば、米国特許第５，５８０，７７５号（Fremeau, et al.）において、Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975) により、Alwine, et al., Meth. Enzymol., 68: 220 (1979)、及び Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manial）」第２版、コールドスプリングハーバープレス、7.19-7.50（1989）により記載されている。
【００４９】
標準ハイブリダイゼーション条件の１つの好ましいセットは、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ（１５０ｎＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ７．４］，１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５Ｘデンハルト溶液（１００ｍｌの水につき、２０ｍｇ Ｆｏｃｏｌｌ，２０ｍｇ ポリビニルピロリドン、及び２０ｍｇ ＢＳＡ）、１０％硫酸デキストラン、１％ ＳＤＳ、及び１００マイクログラム／ｍｌのサケ精子ＤＮＡにおいて４２℃で２時間のプレハイブリダイゼーションを提供する。３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブを加え、ハイブリダイゼーションを１４時間進行させる。その後、このブロットを２Ｘ ＳＳＰＥ，０．１％ ＳＤＳ（２２℃で２０分間）と０．１Ｘ ＳＳＰＥ，０．１％ ＳＤＳ（６５℃で１時間）で２回洗浄する。次いで、ブロットを乾燥させ、増感スクリーンの存在下にｘ線フィルムへ５日間曝露する。
【００５０】
「高ストリンジェント条件」下で、プローブは、その標的配列へ、この２つの配列が実質的に同一であれば、ハイブリダイズする。標準ハイブリダイゼーション条件と同じように、高ストリンジェント条件は、当業者の特定のハイブリダイゼーション目的に従って決定される。
【００５１】
本発明のひとつの側面によれば、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離核酸分子が提供される。本発明による核酸分子は、配列番号２５の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下でハイブリダイズする分子、配列番号２６の全長へ相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする分子、又はその両方へハイブリダイズする分子であり得る。より具体的には、本発明による単離核酸分子は、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−２、又はＨＬＭＰ−３をコードする場合がある。
【００５２】
本発明の別の側面には、上記核酸配列によりコードされるタンパク質が含まれる。なお別の態様において、本発明は、抗ＬＭＰ抗体に基づいて、このようなタンパク質を同定することに関する。この態様では、細胞を溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりタンパク質を分離することによって、ウェスタンブロット分析用にタンパク試料を調製する。タンパク質は、Ausubel, et al.,「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（1987）により記載されるエレクトロブロッティングによりニトロセルロースへ移す。即製の無脂肪乾燥ミルク（１００ｍｌ ＰＢＳ中１ｇｍ）でフィルターを封鎖した後で、このフィルターへ抗ＬＭＰ抗体を加え、室温で１時間インキュベートする。フィルターをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で徹底的に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−抗体コンジュゲートとともに室温で１時間インキュベートする。このフィルターを再びＰＢＳで徹底的に洗浄し、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を加えることによって抗原バンドを同定する。
【００５３】
単一特異性抗体は、本発明における第一選択の試薬であり、ＬＭＰの発現に関連した特定の特徴を患者の細胞について解析するために特別に使用する。本明細書に使用する「単一特異性抗体」は、ＬＭＰについて均質な結合特性のある１以上の抗体分子種と定義される。本明細書に使用する「均質結合」は、上記に記載するように、ＬＭＰと関連するような、特異抗原又はエピトープへ結合する、抗体種の能力に関連する。ＬＭＰへの単一特異性抗体は、ＬＭＰに対して反応性の抗体を含有する哺乳動物の抗血清より精製するか、又は、Kohler, et al.(Nature, 256, 495-497 (1975) により記載される技術を使用して、ＬＭＰと反応性のモノクローナル抗体として調製する。ＬＭＰ特異抗体は、免疫アジュバントを含むか又は含まない適正濃度のＬＭＰで、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、又はウマのような動物を免疫化することによって産生する。初回の免疫化に先立って、免疫前血清を採取する。約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＬＭＰと、所望されるならば、受容される免疫アジュバントを各動物に与える。受容されるアジュバントには、限定されないが、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvum を含有する油中水型エマルジョン、及びｔＲＮＡのアジュバントが含まれる。初回の免疫化は、好ましくは、フロイント完全アジュバント中のＬＭＰを皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、又はその両方で多数の部位に注射することからなる。各動物を一定間隔で、好ましくは週ごとに出血させ、抗体力価を定量する。動物は、初回免疫後に追加免疫注射を受けても受けなくてもよい。追加免疫注射を受ける動物には、一般に、フロイント不完全アジュバント中の等量の抗原を同じ経路で投与する。追加免疫注射は、最高力価が得られるまで、約３週の間隔で与える。それぞれの追加免疫化から約７日後、又は単回免疫化から約１週後に、動物を出血させ、血清を採取し、アリコートを約−２０℃で保存する。
【００５４】
ＬＭＰと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスをＬＭＰで免疫化することによって調製する。上記に記載したように約０．５ｍｌの受容されるアジュバントに取り込んだ等量の緩衝液又は生理食塩水中約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰで、ＩＰ又はＳＣ経路によりこのマウスを免疫化する。フロイント完全アジュバントが好ましい。このマウスは、０日目に初回免疫化を受け、約３〜３０週の間安静にさせる。免疫化マウスに、リン酸緩衝化生理食塩水のような緩衝溶液中約０．１〜約１０ｍｇのＬＭＰの１以上の追加免疫を静脈内（ＩＶ）経路により与える。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ましくは脾臓のリンパ球を、免疫化マウスより脾臓を取り出すことにより、当該技術分野で知られた標準手順によって入手する。この脾臓リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と、安定したハイブリドーマの形成を可能にする条件下に混合することによって、ハイブリドーマ細胞を産生する。融合パートナーには、限定されないが、マウス骨髄腫のＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４、及びＳｐ２／０を含めてよく、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞を約１０００の分子量のポリエチレングリコールにおいて、約３０％〜約５０％の濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で知られた手順により、補充ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）でのヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリン（ＨＡＴ）における増殖により選択する。約１４、１８、及び２１日目に増殖陽性ウェルより上清液を採取し、ＬＭＰを抗原として使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。また、オクタロニー沈降アッセイにおいてこの培養液を検査して、ｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェル由来のハイブリドーマ細胞を、MacPherson,（「軟寒天技術：組織培養の方法及び応用（Soft Agar Techniques: Tissue Culture Methods and Applications）」Kruse and Paterson（監修）、アカデミック・プレス（1974）又は Harlow, et al.,「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」コールドスプリングハーバーラボラトリー（1988）により記載される軟寒天技術のような技術によってクローニングする。
【００５５】
モノクローナル抗体は、プリスタンで抗原刺激したＢａｌｂ／ｃマウスに、抗原刺激（priming）から約４日後に、約２ｘ１０６〜約６ｘ１０６のハイブリドーマ細胞のほぼ０．５ｍｌを各マウスに in vivo 注射して産生してもよい。細胞移入後ほぼ８〜１２日目に腹水を採取し、当該技術分野で知られた技術によりモノクローナル抗体を精製する。
【００５６】
抗ＬＭＰ ｍＡｂのin vitro 産生は、約２％の胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭにおいてハイブリドーマ細胞系を増殖させることによって行って、十分量の特異ｍＡｂを入手する。このｍＡｂを当該技術分野で知られた技術により精製する。
【００５７】
腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価は、様々な血清学又は免疫学アッセイによって定量するが、これには、限定されないが、沈降法、受身凝集反応、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）技術、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術が含まれる。同様のアッセイを使用して、体液又は組織及び細胞抽出物中のＬＭＰの存在を検出する。
【００５８】
モノクローナル抗体を産生するための上記の方法を利用して、ＬＭＰ、全長の新生ＬＭＰポリペプチド、又はこれらの変異体又は対立遺伝子体（alleles）に特異的な抗体を産生することができる。
【００５９】
別の態様において、本発明は、ＨＬＭＰ−１の可変スプライス変異体へ向けられる。ヒト心臓ｃＤＮＡのＰＣＲ解析により、ＨＬＭＰ−１配列の塩基対３２５と４４４の間の領域でＨＬＭＰ−１と異なる、２つのＨＬＭＰ可変スプライス変異体（ＨＬＭＰ−２及びＨＬＭＰ−３と命名する）のｍＲＮＡが明らかになった。ＨＬＭＰ−２配列は、この領域に、１１９塩基対の欠失と１７塩基対の挿入を有する。これらの変化はリーディングフレームを保存し、４２３アミノ酸のタンパク質を生じ、これは、ＨＬＭＰ−１に比べて、全体で３４アミノ酸の損失を有する（４０のアミノ酸が欠失して、６つの挿入アミノ酸が加わる）。ＨＬＭＰ−２は、ＨＬＭＰ−１に存在するｃ末端ＬＩＭドメインを含有する。
【００６０】
ＨＬＭＰ−１と比べて、ＨＬＭＰ−３には欠失がないが、同じ１７塩基対の挿入を４４４位に有する。この挿入はリーディングフレームを移動させ、塩基対４５９〜４６１で終止コドンを引き起こす。結果として、ＨＬＭＰ−３は、１５３アミノ酸のタンパク質をコードする。このタンパク質は、ＨＬＭＰ−１及びＨＬＭＰ−２に存在するｃ末端ＬＩＭドメインを欠く。ＨＬＭＰ−２及びＨＬＭＰ−３によりコードされるタンパク質の予測サイズをウェスタンブロット分析により確認した。
【００６１】
この３つのスプライス変異体の組織分布のＰＣＲ分析により、これらが差示的に発現されて、特定のアイソフォームが異なる組織で優勢であることが明らかになった。ＨＬＭＰ−１は、白血球、脾臓、肺、胎盤、及び胎児肝臓において発現される優勢型であるようだ。ＨＬＭＰ−２は、骨格筋、骨髄、及び心臓組織において優勢なアイソフォームであるらしい。しかしながら、ＨＬＭＰ−３は、検査したどの組織でも優勢なアイソフォームではなかった。
【００６２】
二次ラット骨芽細胞培養物におけるＨＬＭＰ−３の過剰発現は、グルココルチコイド（２７２±７）とＨＬＭＰ−１（２３２±２００）で見られる効果に似た、骨結節形成（２８７±５６）を誘導した。ＨＬＭＰ−３はＣ末端ＬＩＭドメインを欠くので、この領域は、骨誘導活性に必要とされない。
【００６３】
しかしながら、ＨＬＭＰ−２の過剰発現は、骨結節形成を誘導しなかった（１１±３）。これらのデータは、欠失される１１９塩基対によりコードされるアミノ酸が骨誘導に必要であることを示す。このデータはまた、ＨＬＭＰスプライス変異体の分布が組織特異的な機能に重要であり得ることを示す。驚くべきことに、発明者は、二次ラット骨芽細胞培養物において、ＨＬＭＰ−２がステロイド誘導性の骨芽細胞形成を阻害することを示した。故に、ＨＬＭＰ−２は、骨形成が望まれない臨床状況において治療有用性を有するかもしれない。
【００６４】
１９９７年７月２２日に、ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰ（これは、インサート１０−４クローン／ＲＬＭＰのある、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ２である）と表記したベクター中の１０−４／ＲＬＭＰの試料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（２０８５２ メリーランド州ロックヴィル、パークローンドライブ、１２３０１）に寄託した。この寄託物の培養受入れ番号は、２０９１５３である。１９９８年３月１９日に、インサートＨＬＭＰ−１のある、ベクターｐＨｉｓ−Ａの試料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。この寄託物の培養受入れ番号は、２０９６９８である。２０００年４月１４日に、プラスミドｐＨＡｈＬＭＰ−２（ヒト心筋ｃＤＮＡよりＨＬＭＰ−２で誘導したｃＤＮＡインサートのあるベクターｐＨｉｓＡ）及びｐＨＡｈＬＭＰ−３（ヒト心筋ｃＤＮＡよりＨＬＭＰ−３で誘導したｃＤＮＡインサートのあるベクターｐＨｉｓＡ）の試料をブタペスト条約の条件の下でＡＴＣＣ（アメリカ、２０１１０−２２０９ バージニア州マナッサス、ユニバーシティＢｌｖｄ．１０８０１）に寄託した。これらの寄託物の受入れ番号は、それぞれＰＴＡ−１６９８とＰＴＡ−１６９９である。これらの寄託物は、ブダペスト条約により要求されるように、ＡＴＣＣにおいて少なくとも３０年間維持されて、それらを開示する特許の許諾に基づいて、公共へ利用可能になる。寄託物が利用可能であることは、政府決定により許諾される特許権の侵害において、本発明を実施する許可を構成与件しないと理解されるべきである。
【００６５】
本発明の核酸、タンパク質、又は抗体を評価するときには、酵素アッセイ、タンパク精製、そして他の慣用の生化学の手法を利用する。ＤＮＡ及びＲＮＡは、それぞれサザンブロッティング及びノーザンブロッティングの技術により分析する。典型的には、分析する試料をゲル電気泳動法によりサイズ分画する。次いで、ゲル中のＤＮＡ又はＲＮＡをニトロセルロース又はナイロンの膜へ移す。次いで、ゲル中の試料パターンの複製物であるブロットをプローブとハイブリダイズさせた。典型的には、プローブは、好ましくは３２Ｐで放射標識するが、当業者に知られた他のシグナル産生分子でプローブを標識してもよい。次いで、オートラジオグラフィーのような検出システムにより、目的の特定バンドを視覚化することができる。
【００６６】
本発明の好ましい態様を例示する目的のために、以下の非限定的な実施例を含める。これらの結果は、本発明のＬＩＭ石灰化タンパク質と、これらのタンパク質をコードする単離核酸分子を使用して骨形成を誘導するか又は亢進させることの実施可能性を実証する。
【実施例】
【００６７】
実施例１：頭蓋冠細胞の培養
ラット骨芽細胞（「ＲＯＢ」）としても知られるラット頭蓋冠細胞を、Boden, et al., (Endocrinology, 137, 8, 3401-3407 (1996)) により既に記載されたように、分娩前２０日のラットより入手した。一次培養物を集密状態にまで増殖させ（７日）、トリプシン処理し、一次継代培養細胞として６ウェルプレートへ移した（１ｘ１０５細胞／３５ｍｍウェル）。０日目で集密していた継代培養細胞を、さらに７日間増殖させた。０日目に開始して、培地を交換し、処理薬（Ｔｒｍ及び／又はＢＭＰ）を３又は４日ごとに層流フード下で適用した。標準の培養プロトコールは以下の通りであった：１〜７日目、ＭＥＭ，１０％ ＦＢＳ，５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸、±刺激；８〜１４日目、ＢＧＪｂ培地、１０％ ＦＢＳ，５ｍＭ β−ＧｌｙＰ（石灰化を可能にするための無機リン酸の供給源として）。１４日目に、骨結節形成及びオステオカルシン分泌のエンドポイント分析を実施した。この系において、試験したすべてのＢＭＰについての用量応答曲線に対して中間範囲の効果を実証したパイロット実験に基づいて、ＢＭＰの用量を５０ｎｇ／ｍｌと選択した。
【００６８】
実施例２：アンチセンス処理と細胞培養
膜様の骨形成時におけるＬＭＰ−１の潜在的な機能上の役割を探究するために、我々は、ＬＭＰ−１ ｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、グルココルチコイドにより始動される分化を受けている二次骨芽細胞培養物を処理した。ＲＬＭＰ発現の阻害は、推定の翻訳開始部位が含まれる２５塩基対配列（配列番号４２）に対応する高特異性のアンチセンスオリゴヌクレオチド（既知のラット配列に対して有意な相同性がない）を用いて達成した。対照培養物にはオリゴヌクレオチドも与えなかったか、又はそれらにはセンスオリゴヌクレオチドを与えた。リポフェクタミンの存在下（プレインキュベーション）及び非存在下で実験を行なった。簡潔に言えば、２２μｇのセンス又はアンチセンスＲＬＭＰオリゴヌクレオチドを、ＭＥＭにおいて室温で４５分間インキュベートした。そのインキュベーションに続き、さらにＭＥＭ又はプレインキュベートしたリポフェクタミン／ＭＥＭ（７％ ｖ／ｖ；室温で４５分間インキュベートした）のいずれかを加え、０．２μＭのオリゴヌクレオチド濃度を達成した。生じる混合物を室温で１５分間インキュベートした。次いで、ＭＥＭ／アスコルビン酸塩／±Ｔｒｍとオリゴヌクレオチド混合物を混合して、０．１μＭの最終オリゴヌクレオチド濃度を達成した。
【００６９】
適正なオリゴヌクレオチドの存在又は非存在下に細胞を培地（±刺激）とともにインキュベートした。はじめにリポフェクタミンとインキュベートした培養物は、４時間のインキュベーション（３７℃；５％ ＣＯ２）の後で、リポフェクタミンもオリゴヌクレオチドも含有しない培地で再給餌した。培養物を２４時間ごとに給餌することによって、オリゴヌクレオチドレベルを維持した。
【００７０】
ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ−６オリゴヌクレオチドで見られる効果と同様に、石灰化した結節形成とオステオカルシンを用量依存的なやり方で阻害した。ＢＭＰ−６アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害がＢＭＰ−６の添加で逆転されるのに対し、この骨芽細胞分化におけるＬＭＰ−１アンチセンスの遮断は、外因性ＢＭＰ−６の添加によりレスキューすることができず、骨芽細胞の分化経路において、ＬＭＰ−１がＢＭＰ−６に対して上流位置にあることが確かめられた。ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、一次ラット骨芽細胞培養物において自発的な骨芽細胞分化を阻害した。
【００７１】
実施例３：石灰化骨結節形成の定量
実施例１及び２に従って調製したＲＯＢの培養物を、７０％エタノール中で一晩固定して、ホン・コッサ銀染色で染色した。半自動コンピュータ化ビデオ画像解析システムを使用して、各ウェル中の結節数及び結節面積を定量した（Boden, et al., Endocrinology, 137, 8, 3401-3407 (1996)）。次いで、これらの数値を使用して、結節あたりの面積の数値を計算した。この自動化法をマニュアル計数技術に対して検証すると、０．９２の相関係数（ｐ＜０．０００００１）を示した。すべてのデータは、各条件で５又は６のウェルより計算する、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表す。各実験は、様々な頭蓋冠調製物由来の細胞を使用して、少なくとも２回繰り返した。
【００７２】
実施例４：オステオカルシン分泌の定量
Nanes, et al. (Endocrinology, 127: 588 (1990)) に記載のように、ラットオステオカルシンのＣ末端ノナペプチドに対して発明者が産生した単一特異性ポリクローナル抗体（Ｐａｂ）での競合ラジオイムノアッセイを使用して、培養基中のオステオカルシンレベルを測定した。簡潔に言えば、１マイクログラムのノナペプチドをラクトペルオキシダーゼ法により１ｍＣｉの１２５Ｉ−Ｎａでヨウ素化した。２００ｇｌのアッセイ緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００１％チメロサール、０．０２５％ ＢＳＡ）を含有する試験管に、細胞培養物より採取した培地、又はオステオカルシニン標準品（０〜１２，０００フェムトモル）をアッセイ緩衝液中１００ｇｌ／管で入れた。次いで、Ｐａｂ（１：４０，０００；１００マイクロリットル）に続き、ヨウ素化ペプチド（１２，０００ｃｐｍ；１００マイクロリットル）を加えた。非特異結合を試験する試料も同様に調製したが、抗体を含めなかった。
【００７３】
７００マイクロリットルのヤギ抗ウサギＩｇＧの添加に続く、４℃で１８時間のインキュベーションによって、結合ＰＡｂと非結合（フリー）ＰＡｂを分離した。すべての試料を１２００ｒｐｍで４５分間遠心分離した後、上清をデカントし、沈殿をγ−計数管で計数した。オステオカルシン値をフェムトモル／１００マイクロリットルで報告してから、この値を１００で割ることによって、培地１ｍｌあたりのピコモル数（３日目の産生）へ変換した。数値は、各条件につき５〜６ウェルの同一３検体定量の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。各実験は、異なる頭蓋冠調製物由来の細胞を使用して、少なくとも２回で確認した。
【００７４】
実施例５：Ｔｒｍ及びＲＬＭＰの in vitro 石灰化に及ぼす効果
非刺激細胞培養系における骨結節の産生全体に対しては、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれも明瞭な効果がほとんどなかった。しかしながら、ＲＯＢをＴｒｍで刺激するとき、ＲＬＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結節の石灰化を＞９５％阻害した。このオリゴヌクレオチド処理培養物へ外因性ＢＭＰ−６を加えても、ＲＬＭＰ−アンチセンス−処理結節の石灰化をレスキューしなかった。
【００７５】
オステオカルシンは、長いこと、骨石灰化と同義とされていて、オステオカルシンレベルが結節の産生及び石灰化と関連づけられてきた。ＲＬＭＰ−アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オステオカルシン産生を有意に減少させるが、アンチセンス処理培養物における結節数は有意に変化していない。この事例では、外因性ＢＭＰ−６の添加だけが、ＲＬＭＰ−アンチセンス−処理培養物におけるオステオカルシン産生を１０〜１５％レスキューした。このことは、ＲＬＭＰの作用がＢＭＰより下流にあって、より特異的であることを示唆する。
【００７６】
実施例６：ＲＮＡの採取及び精製
４Ｍイソチオシアン酸グアニジン（ＧＩＴ）溶液を使用して、ＲＯＢ（実施例１及び２に従って、６ウェル培養皿において調製した）の同一２検体ウェルより細胞ＲＮＡを採取して、統計上の同一３検体を得た。簡潔に言えば、培養上清をウェルより吸引し、次いでこれに同一２検体ウェル採取につき０．６ｍｌのＧＩＴ溶液を載せた。ＧＩＴ溶液を加えた後で、プレートを５〜１０秒間揺り動かした。試料は−７０℃に保存して、７日以内にさらに処理した。
【００７７】
Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manial）」７．１９章、第２版、コールドスプリングハーバープレス（1989）による標準法のわずかな変更により、ＲＮＡを精製した。簡潔に言えば、融解した試料に６０マイクロリットルの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０マイクロリットルのフェノール（水飽和）、及び１５０マイクロリットルのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を加えた。激しく撹拌した後で、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分；４℃）、水相を新鮮な試験管へ移し、６００マイクロリットルのイソプロパノールを加え、ＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。
【００７８】
この一晩のインキュベーションに続き、試料を遠心分離して（１００００ｘｇ；２０分）、上清を穏やかに吸引した。ペレットを４００マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０マイクロリットルの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）と１．０ｍｌの無水エタノールの添加後、−２０℃で一晩沈殿させた。細胞ＲＮＡを回収するために、試料を遠心分離して（１００００ｘｇ；２０分）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間空気乾燥させ、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。分光光度測定法により定量される光学密度よりＲＮＡ濃度を算出した。
【００７９】
実施例７：逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応
加熱した全ＲＮＡ（全量１０．５マイクロリットルのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５マイクログラム、６５℃で５分間）を、４マイクロリットルの５Ｘ ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２マイクロリットルのｄＮＴＰ、２マイクロリットルのｄＴ１７プライマー（１０ピコモル／ｍｌ）、０．５マイクロリットルのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）、及び１マイクロリットルのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／マイクロリットル）を含有する試験管へ加えた。３７℃で１時間、次いで９５℃で５分間試料をインキュベートして、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活性化した。次いで、８０マイクロリットルの水の添加により試料を希釈した。
【００８０】
逆転写した試料（５マイクロリットル）を、標準法（全量５０マイクロリットル）を使用するポリメラーゼ連鎖反応へ処した。簡潔に言えば、水と適正量のＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）及び／又はＢＭＰ用のフォワード（forward）及びリバース（reverse）プライマー、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、及びＴａｑポリメラーゼを含有する試験管へ加えた。他に断らなければ、プライマーは、２２サイクル（９４℃，３０”；５８℃，３０”；７２℃，２０”）で確実に作動するように標準化した。
【００８１】
実施例８：ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）及びＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ解析によるＲＴ−ＰＣＲ産物の定量
ＲＴ−ＰＣＲ産物に５マイクロリットル／試験管のローディング色素を加え、混合し、６５℃で１０分間加熱し、遠心分離した。各反応物より１０マイクロリットルの試料を標準条件下でＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド：ビス；１５Ｖ／ウェル；一定の電流）へ処した。次いで、ゲルをゲル保存緩衝液（１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、７％（ｖ／ｖ）酢酸、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、４３％脱イオン水）において３０分間インキュベートし、真空（８０℃）で１〜２時間乾燥させ、電子増強リン光造影システムで６〜２４時間発色させた。可視化バンドを解析した。バンドあたりのカウント数をグラフにプロットした。
【００８２】
実施例９：差示ディスプレイＰＣＲ
グルココルチコイド（Ｔｒｍ，１ｎＭ）で刺激した細胞よりＲＮＡを抽出した。加熱してＤＮアーゼ処理した全ＲＮＡ（全量１０．５マイクロリットルのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５マイクログラム、６５℃で５分間）を実施例７に記載のように逆転写したが、ＭＭＬＶ−ＲＴプライマーとしては、Ｈ−Ｔ１１Ｍ（配列番号４）を使用した。生じるｃＤＮＡを上記のようにＰＣＲ増幅したが、様々な市販のプライマーセット（例えば、Ｈ−Ｔ１１Ｇ（配列番号４）、及びＨ−ＡＰ−１０（配列番号５）；ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社、テネシー州ナッシュビル）を用いた。放射標識されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定ゲル上でのゲル電気泳動により分画した。電気泳動の後で、生じるゲルを真空で乾燥させ、オートラジオグラフを一晩露出した。差示的に発現されたｃＤＮＡを表すバンドをゲルから切り出し、Conner, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 278 (1983)) に記載される方法を使用してＰＣＲにより再増幅させた。ＰＣＲ再増幅の産物をベクターＰＣＲ−１１（ＴＡクローニングキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）へクローニングした。
【００８３】
実施例１０：ＵＭＲ１０６ラット骨肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＵＭＲ１０６ライブラリー（２．５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を寒天プレート（ＬＢ寒天ボトム）上に５ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌでプレートし、このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。フィルター膜をプレート上に２分間載せた。このフィルターを、取り出してすぐに変性させ、濯ぎ、乾燥させて、ＵＶで架橋連結させた。次いで、このフィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液（２ＸＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］，５％ホルムアルデヒド、１％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ）において４２℃で２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションミックス／フィルター全体へ２６０塩基対の放射標識プローブ（配列番号３；ランダムプライミングによる３２Ｐ標識化）を加え、４２℃で１８時間のハイブリダイゼーションを続けた。この膜を室温で１回（１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳで１０分）、５５℃で３回（０．１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳで１５分）洗浄した。
【００８４】
この膜を洗浄後、それらを上記のようにオートラジオグラフィーにより解析した。陽性クローンをプラーク精製した。この手順を第二のフィルターで４分間繰り返して、偽陽性クローンを最少にした。プラーク精製したクローンをラムダＳＫ（−）ファージミドとしてレスキューした。クローニングしたｃＤＮＡを以下に記載のように配列決定した。
【００８５】
実施例１１：クローンの配列決定
クローニングしたｃＤＮＡインサートを標準法により配列決定した。簡潔に言えば、適正濃度の終止混合物、鋳型、及び反応混合物を適正なサイクル処理プロトコール（９５℃，３０秒；６８℃，３０秒；７２℃，６０秒；ｘ２５）へ処した。停止混合物を加えて、配列決定反応を終止させた。９２℃で３分間加熱後、試料を変性６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル（２９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上へロードした。試料を６０ボルト、定電流で約４時間電気泳動した。電気泳動後、ゲルを真空で乾燥させて、オートラジオグラフ処理した。
【００８６】
このオートラジオグラフをマニュアルで解析した。生じる配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＩＨ，メリーランド州ベセスダ；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により維持されているデータベースに対して、デフォルト変数で設定したＢＬＡＳＴＩＮプログラムを使用してスクリーニングした。この配列データに基づいて、新しい配列決定プライマーを製造し、この方法を繰り返して、遺伝子全体を配列決定した。両方の配向で少なくとも３回すべての配列を確認した。
【００８７】
ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（バージョン１６．０）を使用して、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列も解析した。ヌクレオチド配列についての相同性百分率値を、以下の変数を使用するプログラムＮＡＬＩＧＮにより計算した：非適合ヌクレオチドの重み、１０；非適合ギャップの重み、１０；考慮するヌクレオチドの最大数、５０；及び、考慮するヌクレオチドの最小数、５０。
【００８８】
アミノ酸配列については、ＰＡＬＩＧＮを使用して相同性百分率値を計算した。オープンギャップコストとユニットギャップコストについて、ともに１０の数値を選択した。
実施例１２：ＲＬＭＰ ｃＤＮＡのクローニング
実施例９に記載する差示ディスプレイＰＣＲ増幅産物は、ほぼ２６０塩基対のメジャーバンドを含んでいた。この配列を使用して、ラット骨肉腫（ＵＭＲ １０６）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを入れ子プライマー解析へ処して、全長ｃＤＮＡを増幅するのに必要なプライマー配列（配列番号１１、１２、２９、３０及び３１）を得た。さらなる試験用に選択したこれら陽性クローンの１つをクローン１０−４と命名した。
【００８９】
入れ子プライマー解析により決定した、クローン１０−４中の全長ｃＤＮＡの配列解析は、クローン１０−４が差示ディスプレイＰＣＲにより同定される、元の２６０塩基対の断片を含有することを示した。クローン１０−４（１６９６塩基対；配列番号２）は、４５７のアミノ酸（配列番号１）を有するタンパク質をコードする１３７１塩基対のオープンリーディングフレームを含有する。終止コドン、ＴＧＡは、ヌクレオチド１４４４−１４４６に出現する。ヌクレオチド１６７５〜１６８０と隣接のポリ（Ａ）＋テールにあるポリアデニル化シグナルが３’非コード領域に存在した。配列番号１のアミノ酸位置１１３〜１１６及び２５７〜２５９に、２つの潜在的なＮ−グリコシル化部位、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ及びＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒがそれぞれあった。アミノ酸位置１９１及び３４９に２つの潜在的なｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、Ｓｅｒ及びＴｈｒがそれぞれ見出された。アミノ酸位置３、１１５、１６６、２１９、４４２に５つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位、Ｓｅｒ又はＴｈｒがあった。アミノ酸位置２７２〜２７９に、１つの潜在的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ−ループ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを決定した。
【００９０】
さらに、アミノ酸位置３４１〜３９１及び４００〜４５１に、２つの高度に保存された推定ＬＩＭドメインを見出した。この新たに同定されたラットｃＤＮＡクローン中の推定ＬＩＭドメインは、他の既知のＬＩＭタンパク質のＬＩＭドメインとかなりの相同性を示した。しかしながら、他のラットＬＩＭタンパク質との全体的な相同性は、２５％未満であった。ＲＬＭＰ（１０−４とも表記される）は、ヒトの不明（enigma）タンパク質に７８．５％のアミノ酸相同性を有する（米国特許第５，５０４，１９２号を参照のこと）が、最も近縁のラット相同体、ＣＬＰ−３６及びＲＩＴ−１８には、それぞれ２４．５％及び２２．７％のアミノ酸相同性しか有さない。
【００９１】
実施例１３：ＲＬＭＰ発現のノーザンブロット分析
実施例１及び２に従って調製した、ＲＯＢ由来の３０マイクログラムの全ＲＮＡを１％アガロース平板ゲルにおけるホルムアルデヒドゲル電気泳動によりサイズ分画し、ナイロン膜へ浸透圧でトランスブロットした。このブロットを、ランダムプライミングにより３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した全長１０−４ ｃＤＮＡの６００塩基対ＥｃｏＲＩ断片でプローブした。
【００９２】
ノーザンブロット分析は、ＲＬＭＰプローブとハイブリダイズする１．７ｋｂのｍＲＮＡ種を示した。ＲＬＭＰ ｍＲＮＡは、ＢＭＰ−６への曝露後２４時間のＲＯＢにおいてほぼ３．７倍アップレギュレートされていた。ＢＭＰ−２又はＢＭＰ−４で刺激したＲＯＢでは、２４時間後にＲＭＬＰ発現のアップレギュレーションは認められなかった。
【００９３】
実施例１４：統計学的手法
それぞれ報告される結節／オステオカルシンの結果について、代表的な実験からの５〜６ウェルのデータを使用して、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を計算した。各変数について最大値に正規化したデータでグラフを示して、結節数、石灰化面積、及びオステオカルシンの同時グラフ化を可能にすることができる。
【００９４】
それぞれ報告されるＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、又はウェスタンブロット分析について、代表的な実験の同一３検体試料からのデータを使用して、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を決定した。グラフは、０日目又は陰性対照のいずれかに正規化して示しても、対照値を超える増加倍率として表してもよい。
【００９５】
Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後多重比較補正の片側分散分析を適宜使用して、統計学的有意差を評価した（D. V. Huntsberger,「分散分析、統計分散の要素（The Analysis of Variance, Elements of Stastical Variance）」P. Billingsley（監修）Ａｌｌｙｎ ＆ Ｂａｃｏｎ社、マサチューセッツ州ボストン、298-330（1977）及び SigmaStat, Jandel Scientific, カリフォルニア州コルテ・マデラ）。有意差のα水準は、ｐ＜０．０５と定義した。
【００９６】
実施例１５：ウェスタンブロット分析によるラットＬＩＭ石灰化タンパク質の検出
England, et al. (Biochim. Biophys. Acta, 623, 171 (1980)) 及び Timmer, et al.,(J. Biol. Chem., 268, 24863 (1993)) の方法に従って、ポリクローナル抗体を調製した。
【００９７】
ヒーラ細胞をｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞より、Hair, et al. (Leukemia Research, 20, 1 (1996)) の方法に従って、タンパク質を採取した。ネイティブＲＬＭＰのウェスタンブロット分析を Towbin, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350 (1979)) に記載されるように実施した。
【００９８】
実施例１６：ラットＬＭＰユニーク（ＲＬＭＰＵ）由来ヒトＰＣＲ産物の合成
ラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの配列に基づいて、フォワード及びリバースのＰＣＲプライマー（配列番号１５及び１６）を合成し、ユニークな２２３塩基対配列をラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡよりＰＣＲ増幅した。同じＰＣＲプライマーで、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞のｃＤＮＡより類似のＰＣＲ産物を単離した。
【００９９】
Ｔ−７５フラスコにおいて増殖させたＭＧ６３骨肉腫細胞よりＲＮＡを採取した。培養上清を吸引により除去し、フラスコに３．０ｍｌのＧＩＴ溶液を同一２検体で載せて、５〜１０秒間渦状に振り、生じる溶液を１．５ｍｌエッペンドルフ管へ移した（０．６ｍｌ／管で６つの管）。標準法（Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manial）」７章１９頁、コールドスプリングハーバープレス（1989）及びBoden, et al., Endocrinology, 138, 2820-2828 (1997) のわずかな変更によってＲＮＡを精製した。簡潔に言えば、０．６ｍｌの試料に６０マイクロリットルの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０マイクロリットルの水飽和フェノール、及び１５０マイクロリットルのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を加えた。これらの試薬の添加後、試料を激しく撹拌し、遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分；４℃）、水相を新鮮な管へ移した。イソプロパノール（６００マイクロリットル）を加え、ＲＮＡを一晩−２０℃で沈殿させた。この試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分）、上清を穏やかに吸引した。ペレットを４００マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁させ、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０マイクロリットルの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）と１．０ｍｌの無水エタノールにおいて−２０℃で一晩沈殿させた。沈殿後、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間空気乾燥させ、２０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁させた。ＲＮＡ濃度を光学密度より導いた。
【０１００】
全ＲＮＡ（全量１０．５マイクロリットルのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５マイクログラム）を６５℃で５分間加熱してから、４マイクロリットルの５Ｘ ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２マイクロリットルのｄＮＴＰ、２マイクロリットルのｄＴ１７プライマー（１０ピコモル／ｍｌ）、０．５マイクロリットルのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）、及び１マイクロリットルのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／マイクロリットル）を含有する試験管へ加えた。この反応物を３７℃で１時間インキュベートした。その後、９５℃で５分間加熱することによって、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活性化した。８０マイクロリットルの水の添加により試料を希釈した。
【０１０１】
転写する試料（５マイクロリットル）を、Boden, et al., (Endocrinology, 138, 2820-2828 (1997)) 及び Ausubel, et al.,（ポリメラーゼ連鎖反応による希少ＤＮＡの定量（Quantitation of Rare DNAs by the Polymerase Chain Reaction）「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」１５章３１−１、ウィリー・アンド・サンズ、ニュージャージー州トレントン（1990）に記載されるような標準法（全量５０マイクロリットル）を使用するポリメラーゼ連鎖反応へ処した。簡潔に言えば、水と適正量のＰＣＲ緩衝液（２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、フォワード及びリバースプライマー（ＲＬＭＰＵでは；配列番号１５及び１６））、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを加えた。プライマーは、放射活性バンド検出用の２２サイクルとスクリーニングプローブとして使用のＰＣＲ産物の増幅用の３３サイクルで確実に作動するように設計した（９４℃，３０秒；５８℃，３０秒；７２℃，２０秒）。
【０１０２】
アガロースゲル精製したＭＧ６３骨肉腫由来ＰＣＲ産物の配列決定により、ＲＬＭＰＵ ＰＣＲ産物に９５％より多く相同な配列を得た。この配列をＨＬＭＰユニーク領域（ＨＬＭＰＵ；配列番号６）と命名する。
【０１０３】
実施例１７：逆転写酵素由来ＭＧ６３ ｃＤＮＡのスクリーニング
実施例７に記載のような特定プライマー（配列番号１６及び１７）を使用して、ＰＣＲでスクリーニングを実施した。７１７塩基対のＭＧ６３ ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製して、所与のプライマー（配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２７、及び２８）で配列決定した。両方向に少なくとも２回で配列を確定した。このＭＧ６３配列を互いに対して、次いで全長ラットＬＭＰ ｃＤＮＡ配列に対して並置して、部分的なヒトＬＭＰ ｃＤＮＡ配列（配列番号７）を得た。
【０１０４】
実施例１８：ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ノーザンブロット実験に基づいて、ヒト心臓筋肉が含まれる、いくつかの異なる組織によって異なるレベルでＬＭＰ−１が発現されることが判明した。故に、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーを試験した。このライブラリーを寒天プレート（ＬＢ寒天ボトム）上に５ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌでプレートし、プレートを３７℃で一晩増殖させた。フィルター膜をプレート上に２分間載せた。その後で、このフィルターを変性させ、濯ぎ、乾燥させて、ＵＶで架橋連結させ、プレハイブリダイゼーション緩衝液（２ＸＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］；５％ホルムアルデヒド、１％ ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ）において４２℃で２時間インキュベートした。放射標識化、ＬＭＰユニークの２２３塩基対プローブ（３２Ｐ、ランダムプライマー標識化；配列番号６）を加え、４２℃で１８時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続き、この膜を室温で１回（１０分、１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ）、５５℃で３回（１５分、０．１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ）洗浄した。製造業者のプロトコール（ストラタジーン、カリフォルニア州ラホヤ）に従って、オートラジオグラフィーにより同定した、二重陽性のプラーク精製した心臓ライブラリークローンをラムダファージミドとしてレスキューした。
【０１０５】
陽性クローンの制限消化物より、様々なサイズのｃＤＮＡインサートを生じた。長さが６００塩基対より大きいインサートを配列決定による初回スクリーニング用に選択した。これらのインサートを、実施例１１に記載されるような標準法によって配列決定した。
【０１０６】
１つのクローン、７番はまた、配列番号１１〜１４、１６、及び２７に対応するプライマーを使用する自動化配列解析へ処した。これらの方法により得られた配列は、定常的に９７〜１００％相同であった。クローン７（心臓ライブラリー由来の部分ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ；配列番号８）は、翻訳領域において、ラットＬＭＰ ｃＤＮＡ配列に８７％より多く相同である配列を含有した。
【０１０７】
実施例１９：全長ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの決定
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ配列とヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列の重複領域を使用して、これら２つの配列を並置して、１６４４塩基対の完全なヒトｃＤＮＡ配列を導いた。ＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージのプログラム）を使用して、この２つの配列を並置した。この２つの配列の重複領域は、ＭＧ６３ ｃＤＮＡ（配列番号７）中のヌクレオチド６７２での単一ヌクレオチド置換を除いて完全な相同性を有するほぼ３６０塩基対を構成し、クローン７は、対応するヌクレオチド５１６で「Ｇ」の代わりに「Ａ」を有した（配列番号８）。
【０１０８】
ＭＧ６３骨肉腫ｃＤＮＡクローンの「Ｇ」置換を使用して、ＳＥＱＩＮ（ＰＣＧＥＮＥの別のサブプログラム）を使用して、この２つの並置配列を結びつけた。生じる配列を配列番号９に示す。この新規のヒト由来配列のラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡとの並置をＮＡＬＩＧＮで達成した。この全長ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ配列（配列番号９）は、ラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ配列の翻訳部分に対して８７．３％相同である。
【０１０９】
実施例２０：ヒトＬＭＰ−１のアミノ酸配列の決定
ヒトＬＭＰ−１の推定アミノ酸配列をＰＣＧＥＮＥサブプログラムのＴＲＡＮＳＬで決定した。配列番号９中のオープンリーディングフレームは、４５７のアミノ酸（配列番号１０）を含んでなるタンパク質をコードする。ＰＣＧＥＮＥサブプログラムのＰａｌｉｇｎを使用して、ヒトＬＭＰ−１アミノ酸配列がラットＬＭＰ−１アミノ酸配列に対して９４．１％相同であることを見出した。
【０１１０】
実施例２１：ヒトＬＭＰ ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の決定
ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）プロトコールを使用して、ＭＧ６３の全ＲＮＡの入れ子ＲＴ−ＰＣＲによって、ＭＧ６３の５’ｃＤＮＡを増幅した。この方法には、３’末端に２つの縮重ヌクレオチド位置があるロックドッキング（lock-docking）オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用する第一鎖ｃＤＮＡ合成が含まれた（Chenchik, et al., CLONTECHniques, X:5 (1995）；Borson et al., PC Methods Applic., 2, 144 (1993))。第二鎖合成は、Gubler, et al. (Gene, 2, 263 (1983)) の方法に従って、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮアーゼＨ、及び大腸菌ＤＮＡリガーゼのカクテルで実施した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでの平滑末端の創出後、二本鎖ｃＤＮＡを断片（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’）（配列番号１９）へ連結した。ＲＡＣＥに先立って、アダプター連結ｃＤＮＡをＭａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ反応に適した濃度へ希釈した（１：５０）。次いで、アダプター連結二本鎖ｃＤＮＡを特異的にクローニングされるように用意した。
【０１１１】
センスプライマーとしてのアダプター特異的オリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（ＡＰＩ）（配列番号２０）と実施例１６に記載したユニーク領域（ＨＬＭＰＵ）由来の遺伝子特異プライマー（ＧＳＰ）を用いて、第一ラウンドのＰＣＲを実施した。入れ子プライマーのＧＳＰ１−ＨＬＭＰＵ（アンチセンス／リバースプライマー）（配列番号２３）及びＧＳＰ２−ＨＬＭＰＵＦ（配列番号２４）（実施例１６を参照のこと；センス／フォワードプライマー）を使用して、第二ラウンドのＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、抗体仲介性であるが他の点では標準のホットスタート（hot-start）プロトコールを利用する市販キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲコアキット；ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州パロアルト）を使用して実施した。ＭＧ６３ ｃＤＮＡのＰＣＲ条件には、初回のホットスタート変性（９４℃，６０秒）に続く、９４℃，３０秒；６０℃，３０秒；６８℃，４分；３０サイクルが含まれた。入れ子ＰＣＲ産物がほぼ２３０塩基対であるのに対し、第一ラウンドＰＣＲ産物は、ほぼ７５０塩基対の長さであった。この第一ラウンドＰＣＲ産物を線状化ｐＣＲ２．１ベクター（３．９Ｋｂ）中へクローニングした。Ｍ１３フォワード及びリバースプライマー（配列番号１１；配列番号１２）を使用して、このインサートを両方向で配列決定した。
【０１１２】
実施例２２：５’ＵＴＲ付き全長ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの決定
重複しているＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ ５’−ＵＴＲ配列（配列番号２１）、ＭＧ６３ ７１７塩基対配列（実施例１７；配列番号８）、及びヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列（実施例１８）を並置して、１７０４塩基対の新規ヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２２）を導いた。この並置は、ＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥとＯｍｉｇａ １．０の両方；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）で達成した。重複配列は、全７１７塩基対領域（実施例１７）のほとんどを１００％相同性で構成した。並列配置の結合は、ＳＥＱＩＮで達成した。
【０１１３】
実施例２３：ＬＩＭタンパク質発現ベクターの構築
実施例１７及び１８に記載される配列で、ｐＨＩＳ−５ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの構築を行った。７１７塩基対クローン（実施例１７；配列番号７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。小断片（約２５０塩基対）をゲル精製した。クローン７（実施例１８；配列番号８）をＣｌａＩ及びＸｂａＩで消化して、１４００塩基対断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対の制限断片を連結させて、約１６５０塩基対の断片を形成した。
【０１１４】
クローン７における単一ヌクレオチド置換（７１７塩基対ＰＣＲ配列と元のラット配列に関して）により、翻訳される塩基対６７２のところに終止コドンが生じた。この終止コドンのために、ＬＭＰ−１ｓという名称の末端切断（短い）タンパク質がコードされた。これは、発現ベクター（配列番号３２）において使用される構築体であった。配列番号３２の５’ＲＡＣＥ配列（配列番号２１）との並置により、５’ＵＴＲ付きの全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３３）を創出した。次いで、ＬＭＰ−１ｓのアミノ酸配列（配列番号３４）を２２３アミノ酸のタンパク質として演繹して、ウェスタンブロットにより（実施例１５におけるように）、約２３．７ｋＤの予測分子量で泳動することを確かめた。
【０１１５】
このｐＨｉｓ−ＡＴＧベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。このベクターを回収してから、６５０塩基対の制限断片を線状化ｐＨｉｓ−ＡＴＧ中へ連結した。この連結産物をクローニングして、増幅した。ｐＨｉｓ−ＡＴＧ−ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（インサートＨＬＭＰ−１ｓ付きｐＨＩＳ−Ａとも表記される）を標準法により精製した。
【０１１６】
実施例２４：ＬＭＰ発現ベクターでの骨結節形成及び石灰化のin vitro 誘導
実施例１に従って、ラット頭蓋冠細胞を単離し、二次培養において増殖させた。培養物は、実施例１に記載されるように、非刺激であるか、又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激した。実施例２５に従って、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）トランスフェクションプロトコールの変法を使用して、各ベクターの３マイクログラム／ウェルを二次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養物へトランスフェクトした。
【０１１７】
実施例３に記載されるように、ホン・コッサ染色により石灰化結節を視覚化した。ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現だけで、骨結節形成（約２０３結節／ウェル）を in vitro で誘導した。結節のレベルは、ＧＣ陽性対照（約４１２結節／ウェル）により誘導されるもののほぼ５０％であった。他の陽性対照には、ｐＨｉｓ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（約１５２結節／ウェル）とｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ発現ベクター（約２０６結節／ウェル）が含まれ、一方、陰性対照には、ｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖ発現ベクター（約２結節／ウェル）と非処理（ＮＴ）プレート（約４結節／ウェル）が含まれた。これらのデータは、このヒトｃＤＮＡがラットｃＤＮＡと少なくとも同じくらい骨誘導性であったことを証明する。この効果は、ＧＣ刺激で観察されるものより小さかったが、最も可能性があるのは、発現ベクターの最適下限用量のためであろう。
【０１１８】
実施例２５：in vitro 及び in vivo でのＬＭＰ誘導性の細胞分化
クローン１０−４（実施例１２を参照のこと）中のラットＬＭＰ ｃＤＮＡをＮｏｔＩ及びＡｐａＩでの３７℃で一晩の二重消化により、このベクターより切り出した。ベクターのｐＣＭＶ２ ＭＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）を同じ制限酵素で消化した。クローン１０−４及びｐＣＭＶ２由来の線状ｃＤＮＡ断片をともにゲル精製し、抽出し、Ｔ４リガーゼで連結した。この連結ＤＮＡをゲル精製し、抽出し、増幅用の大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換するのに使用した。陽性の寒天コロニーを選択し、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化し、この制限消化物をゲル電気泳動法により検証した。陽性クローンよりストック培養物を調製した。
【０１１９】
使用する制限酵素がＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩであること以外は類似の形式で、リバースベクターを調製した。これらの制限酵素を使用したので、クローン１０−４由来のＬＭＰ ｃＤＮＡ断片は、ｐＲｃ／ＣＭＶ２中へ逆の（即ち、翻訳不能な）配向で挿入された。この産生した組換えベクターをｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと命名した。
【０１２０】
適正量のｐＣＭＶ１０−４（６０ｎＭの最終濃度［３マイクログラム］が最適である；この実験には、０〜６００ｎＭ／ウェル［０〜３０マイクログラム／ウェル］の範囲の最終濃度が好ましい）を最少イーグル培地（ＭＥＭ）に再懸濁させて４５０マイクロリットルの最終容量として、１０秒間激しく撹拌した。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを加え（７．５マイクロリットル／ｍｌの最終濃度）、この溶液を１０秒間激しく撹拌してから、室温で１０分間インキュベートした。このインキュベーションに続き、１０％ ＦＢＳを補充したＭＥＭ（１ｍｌ／ウェル；６ｍｌ／プレート）を加え、ピペット操作により混合した。
【０１２１】
次いで、生じる溶液を洗浄済みＲＯＢ培養物上へ速やかにピペット操作した（１ｍｌ／ウェル）。５％ ＣＯ２を含有する加湿気体において、この培養物を３７℃で２時間インキュベートした。その後、この細胞を無菌ＰＢＳで１回穏やかに洗浄し、適正な通常のインキュベーション培地を加えた。
【０１２２】
結果は、ｐＣＭＶ１０−４で誘導したすべてのラット細胞培養物における有意な骨結節形成を証明した。例えば、ｐＣＭＶ１０−４でトランスフェクトされた細胞は、４２９結節／ウェルを産生した。Ｔｒｍへ曝露した陽性対照培養物は、４６０結節／ウェルを産生した。対照的に、処理を受けなかった陰性対照は、１結節／ウェルを産生した。同様に、培養物をｐＣＭＶ１０−４（リバース）でトランスフェクトしたとき、結節は観察されなかった。
【０１２３】
in vivo での de novo 骨形成を実証するために、４〜５週齢の正常ラット（ｒｎｕ／＋；劣性無胸腺状態について異種接合）の後肢より骨髄を吸引した。この吸引した骨髄細胞をαＭＥＭに洗浄し、遠心分離し、ペレットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中０．８３％ ＮＨ４Ｃｌに再懸濁させることによって、ＲＢＣを溶解した。残る骨髄細胞をＭＥＭで３回洗浄し、３ｘ１０６細胞につき９マイクログラムのｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ（正又は負の配向）で２時間トランスフェクトした。次いで、このトランスフェクトした細胞をＭＥＭで２回洗浄し、３ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。
【０１２４】
この細胞懸濁液（１００マイクロリットル）を無菌ピペットより無菌の２ｘ５ｍｍ Ｉ型ウシコラーゲンディスク（Ｓｕｌｚｅｒ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，コロラド州フィートリッジ）へ塗布した。このディスクを４〜５週齢の無胸腺ラット（ｒｎｕ／ｒｎｕ）の頭蓋、胸部、腹部、又は脊柱に外科的に皮下移植した。この動物を３〜４週目に犠牲にし、この時点でディスク又は外科領域を切り出し、７０％エタノールに固定した。この固定化標本をＸ線撮影法により解析し、Ｇｏｌｄｎｅｒ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色した５マイクロメートル厚の切片について、非脱灰化の組織学的検査を実施した。コラーゲンディスクの代わりに、徐活力化（グアニジン抽出）、ミネラル除去した骨マトリックス（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州シューズベリ）を使用する実験も実施した。
【０１２５】
Ｘ線撮影は、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされた骨髄細胞を含有する元のコラーゲンディスクの形態に一致する、高レベルの石灰化骨形成を明らかにした。陰性対照（翻訳タンパク質をコードしないＬＭＰ−１ｓ ｃＤＮＡの負配向バージョンでトランスフェクトした細胞）においては、石灰化骨形成を観察せず、担体の吸収は、十分進行しているように見えた。
【０１２６】
組織学は、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされたインプラント中の骨芽細胞に沿って並ぶ新たな骨小柱を明らかにした。陰性対照の担体の部分的な再吸収部位には、骨を認めなかった。
【０１２７】
１８セット（９つの陰性対照ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−ＲＥＶと９つの実験ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ）のインプラントを無胸腺ラットの腰椎及び胸椎の間で交替する部位へ加えた、さらなる実験のＸ線撮影は、０／９の陰性対照インプラントが脊椎の間の骨形成（脊椎融合）を明示することを証明した。ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ処理インプラントの９つすべては、脊椎の間にしっかりとした骨融合を明示した。
【０１２８】
実施例２６：実施例２及び３で実証した配列からのｐＨＩＳ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの合成
７１７塩基対クローン（実施例１７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶ（ニューイングランドバイオロジカルズ、シティ、マサチューセッツ州）で消化した。小断片（約２５０塩基対）をゲル精製した。クローン番号７（実施例１８）をＣｌａＩ及びＸｂａＩで消化した。その消化物より１４００塩基対の断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対のｃＤＮＡ断片を標準法により連結して、約１６５０塩基対の断片を形成した。ｐＨｉｓ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。この線状化ベクターを回収し、キメラの１６５０塩基対ｃＤＮＡ断片へ連結した。この連結産物をクローニングして、標準法により増幅し、このｐｈｉｓ−Ａ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（インサートＨＬＭＰ−１ｓ付きベクターｐＨｉｓ−Ａとも表記される）を先に記載のようにＡＴＣＣに寄託した。
【０１２９】
実施例２７：ｐＨｉｓ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−Ｉｓ発現ベクターでの骨結節形成及び石灰化の in vitro 誘導
実施例１に従って、ラット頭蓋冠細胞を単離し、二次培養において増殖させた。培養物は、実施例１に従って、非刺激であるか、又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激した。この培養物を、実施例２５に記載されるように、３マイクログラムの組換えｐＨｉｓ−ＡベクターＤＮＡ／ウェルでトランスフェクトした。実施例３に従って、ホン・コッサ染色により石灰化結節を視覚化した。
【０１３０】
ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現だけで（即ち、ＧＣ刺激なしに）、有意な骨結節形成（約２０３結節／ウェル）を in vitro で誘導した。これは、ＧＣ陽性対照（約４１２結節／ウェル）に曝露された細胞により産生される結節の量のほぼ５０％である。ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（約１５２結節／ウェル）とｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ（約２０６結節／ウェル）でトランスフェクトした培養物でも同様の結果を得た。対照的に、陰性対照のｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖは（約２結節／ウェル）を生じ、非処理プレートでは、約４結節／ウェルを認めた。これらのデータは、このヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡがこのモデル系においてラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡと少なくとも同じくらい骨誘導性であったことを証明する。この実験における効果は、ＧＣ刺激で観察されるものより小さかったが、ある場合、この効果は匹敵していた。
【０１３１】
実施例２８：ＬＭＰは、可溶性骨誘導因子の分泌を誘導する
実施例２４に記載されるようなラット頭蓋冠骨芽細胞培養物におけるＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１の過剰発現は、陰性対照において観察されるものより有意に大きい結節形成をもたらした。ＬＩＭ石灰化タンパク質の作用機序を検討するために、条件付け培地を異なる時点で採取し、１０倍へ濃縮し、無菌濾過し、新鮮な血清を含有する培地においてその元の濃度へ希釈し、非トランスフェクト細胞へ４日間適用した。
【０１３２】
ＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトした細胞より４日目に採取した条件付け培地は、トランスフェクトした細胞中のＲＬＭＰ−１の直接的な過剰発現とほぼ同じくらい結節形成を誘導するのに有効であった。負配向のＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１でトランスフェクトした細胞からの条件付け培地は、結節形成に対して明らかな効果を及ぼさなかった。ＬＭＰ−１でトランスフェクトした培養物より４日目以前に採取した条件付け培地も結節形成を誘導しなかった。これらのデータは、ＬＭＰ−１の発現が可溶性因子の合成及び／又は分泌を引き起こし、これがトランスフェクション後４日目までは有効量で培養基に出現しなかったことを示唆する。
【０１３３】
ｒＬＭＰ−１の過剰発現が骨誘導因子の培地への分泌をもたらしたので、ウェスタンブロット分析を使用して、ＬＭＰ−１タンパク質が培地に存在しているかどうかを決定した。ＬＭＰ−１（ＱＤＰＤＥＥ）に特異的な抗体を使用してＲＬＭＰ−１タンパク質の存在を評価して、慣用の手段により検出した。ＬＭＰ−１タンパク質は、培養物の細胞層にのみ見出されて、培地には検出されなかった。
【０１３４】
標準の２５％及び１００％硫酸アンモニウムでのカットに続くＤＥ−５２陰イオン交換バッチクロマトグラフィー（１００ｍＭ又は５００ｍＭ ＮａＣｌ）によって、この可溶性骨誘導因子の部分精製を達成した。高硫酸アンモニウム、高ＮａＣｌの分画中に全活性を観察した。このような局在性は、単一の因子が培地を条件付ける原因であることの可能性と一致している。
【０１３５】
実施例２９：低用量アデノウイルスにより仲介される腰椎融合での遺伝子治療
本試験は、正常、即ち免疫適格性のウサギにおける脊椎融合を促進する、ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ（配列番号２）のアデノウイルス送達の最適量を決定した。
【０１３６】
Ａｄｅｎｏ−ＱｕｅｓｔＴＭＫｉｔ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、モントリオール）を使用して、ＣＭＶプロモーターにより推進されるＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ（配列番号２）を用いて、複製欠損性ヒト組換えアデノウイルスを構築した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する市販（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、モントリオール）の組換えアデノウイルスを対照として使用した。
【０１３７】
はじめに、０．０２５、０．２５、２．５、又は２５のプラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス／細胞の感染多重度（「ＭＯＩ」）での６０分の形質導入を使用して、ラット頭蓋冠骨芽細胞培養物において骨分化を誘導するのに最適のアデノウイルス送達ＬＭＰ−１（「ＡｄＶ−ＬＭＰ−１」）濃度を決定するために、in vitro 用量応答実験を実施した。陽性対照培養物は、１０９Ｍグルココルチコイド（「ＧＣ」）への曝露から７日目までに分化した。陰性対照培養物は非処理のままとした。１４日目に、石灰化した骨結節の数を培養物のホン・コッサ染色後に計数し、培地中へ分泌されたオステオカルシンのレベル（ピコモル／ｍＬ）をラジオイムノアッセイにより測定した（平均±ＳＥＭ）。
【０１３８】
この実験の結果を以下の表１に示す。非処理の陰性対照培養物には、自発的な結節はほとんど形成されなかった。このデータは、０．２５ｐｆｕ／細胞に等しいＭＯＩが骨結節を骨誘導するのに最も有効であり、陽性対照（ＧＣ）に匹敵するレベルに達することを示す。より低いかより高い用量のアデノウイルスは、それより有効でない。
【０１３９】
表１
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
次いで、in vivo 実験を実施して、最適 in vitro 用量が、骨格成熟したニュージーランド白色ウサギにおいて横突起間の突起の脊椎融合を促進することが可能であるかどうかを判定した。９匹のウサギを麻酔して、１８ゲージ針を使用して、顆間窩を介して遠位大腿骨より３ｃｃの骨髄を吸引した。次いで、バフィーコートを単離し、ＡｄＶ−ＬＭＰ−１で１０分の形質導入を実施して、この細胞を移植用手術室へ戻した。横突起の骨皮質剥離と、ＡｄＶ−ＬＭＰ−１（ＭＯＩ＝０．４）又はＡｄＶ−βＧａｌ（ＭＯＩ＝０．４）のいずれか一方で形質導入した８００万〜１５００万個の自己有核バフィーコート細胞を含有する担体（ウサギの徐活力化した骨マトリックス又はコラーゲンスポンジのいずれか一方）の挿入により、単一レベルの後外側方腰椎関節固定術を実施した。５週後にウサギを安楽死させ、手触診、単純Ｘ線、ＣＴスキャン、及び非脱灰組織学により脊椎融合を評価した。
【０１４２】
ＡｄＶ−ＬＭＰ−１を受けた脊椎融合部位は、９匹のウサギ全部で、確実で連続した脊椎融合の塊を誘導した。対照的に、ＡｄＶ−βＧａｌ、又は低用量のＡｄＶ−ＬＭＰ−１（ＭＯＩ＝０．０４）を受けた部位は、ほとんど、又はまったく骨を作らず、担体単独に匹敵する割合（＜４０％）で脊椎融合をもたらした。これらの結果は、手触診、ＣＴスキャン、及び組織学による評価と一致していた。しかしながら、単純Ｘ線撮影法は、存在する骨の量を、特に対照部位において過大評価する場合があった。試験した担体材料のいずれでもＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ送達と骨誘導は成功した。アデノウイルスベクターに対する全身性又は局所性の免疫応答の証拠はなかった。
【０１４３】
上記のデータは、これまでに検証されたウサギ脊椎融合モデルに一致した骨誘導を実証する。自己骨髄細胞を手術中 ex vivo 遺伝子導入（１０分）で使用するプロトコールは、一晩の形質導入や数週間の培養における細胞膨張を必要とする他の方法よりも臨床的に実行可能な手順である。さらに、組換えアデノウイルスの最も有効な量（ＭＯＩ＝０．２５）でも、他の遺伝子治療応用に報告されている用量（ＭＯＩ＝４０〜５００）より実質的に低かった。このことは、ＬＭＰ−１が細胞内シグナル伝達分子であり、強力なシグナル増幅カスケードを有する可能性があるという事実によるものであると発明者は考える。さらに、細胞培養において骨を誘導したのと同じ濃度のＡｄＶ−ＬＭＰ−１が in vivo でも有効であったという観察事実も、他の増殖因子の用量では、細胞培養から動物実験へ翻案されるときに増加が通常は求められることに照らせば、驚くべきことであった。以上をまとめると、上記の観察事実は、アデノウイルスを使用してＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを送達する局所の遺伝子治療が可能であり、低用量が必要とされることで、アデノウイルスベクターに対する免疫応答という負の効果を最小化する可能性があることを示している。
【０１４４】
実施例３０：ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡで造骨する遺伝子治療への末梢静脈血の有核細胞（バフィーコート）の使用
４匹のウサギにおいて、我々は上記（実施例２９）のように脊椎融合手術を実施したが、但し、形質導入される細胞は、骨髄ではなくて、静脈血由来のバフィーコートであった。これらの細胞をＡｄＬＭＰ又はｐＨＩＳ−ＬＭＰプラスミドでトランスフェクトして、骨髄細胞を使用したときと同等の成功した結果を得た。通常の静脈血細胞を遺伝子送達に使用するというこの発見は、遺伝子治療を臨床的により実行可能にする。なぜなら、全身麻酔下での痛ましい骨髄採取を回避して、１ミリリットルにつき２倍多い細胞の出発材料が得られるからである。
【０１４５】
実施例３１：ヒトＬＭＰ−１スプライス変異体の単離
イントロン／エクソンｍＲＮＡ転写物のスプライス変異体は、シグナル伝達及び細胞／組織発生において比較的一般的な調節機序である。様々な遺伝子のスプライス変異体は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ、及びタンパク質−基質の相互作用を改変することが示されてきた。スプライス変異体はまた、遺伝子発現の組織特異性を制御して、様々な形態（それ故に、機能）が様々な組織において発現されることを可能にする。スプライス変異体は、細胞における一般的な調節現象である。ＬＭＰスプライス変異体は、神経再生、筋肉再生、又は他の組織の発生のように、他の組織において諸効果をもたらす可能性があるかもしれない、
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーについてＨＬＭＰ−１配列のスプライス変異体をスクリーニングするために、配列番号２２の部分に対応する１対のＰＣＲプライマーを調製した。標準技術を使用して合成したフォワードのＰＣＲプライマーは、配列番号２２のヌクレオチド３５〜５４に対応する。これは、以下の配列を有する：
５’ＧＡＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣ３’ （配列番号３５）
配列番号２２のヌクレオチド８２０〜８３９の逆相補体である、リバースのＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する：
５’ＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧＴ３’ （配列番号３６）
このフォワード及びリバースのプライマーを使用して、９４℃３０秒間、６４℃３０秒間、及び７２℃１分、３０回繰り返しのサイクル処理プロトコールに続き、７２℃で１０分インキュベーションを使用する標準技術によって、ヒト心臓ｃＤＮＡ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，カタログ番号７４０４−１）についてＨＬＭＰ−１に類似の配列をスクリーニングした。増幅ｃＤＮＡ配列をゲル精製して、配列決定のためにＥｍｏｒｙ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙへ提出した。標準技術を使用してこのクローンを配列決定して、配列をＰＣＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ；プログラムＳＥＱＵＩＮ及びＮＡＬＩＧＮ）で検証して、配列番号２２に対する相同性を決定した。次いで、配列番号２２に比較して推定される可変スプライス部位のある２つの相同ヌクレオチド配列を、ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓのＴＲＡＮＳＬプログラムで、そのそれぞれのタンパク産物へ翻訳した。
【０１４６】
これらの２つの新規ヒトｃＤＮＡ配列の１つ（配列番号３７）は、１４５６塩基対を含む：
【０１４７】
【化１】
【０１４８】
１１９塩基対断片の欠失（Ｘ間）と１７塩基対断片（下線部分）の追加により引き起こされるリーディングフレームシフトにより、以下の導出アミノ酸配列（配列番号３８）を有する末端切断遺伝子産物を生じる：
【０１４９】
【化２】
【０１５０】
【化３】
【０１５１】
この４２３アミノ酸のタンパク質は、上記に図示したヌクレオチド変化によるものである、強調した領域中の配列（アミノ酸９４〜９９）以外は、配列番号１０に示すタンパク質に対して１００％相同性を示す。
【０１５２】
第二の新規ヒト心臓ｃＤＮＡ配列（配列番号３９）は、１５７５塩基対を含む：
【０１５３】
【化４】
【０１５４】
１７塩基対断片（太字、イタリック、及び下線の部分）の追加により引き起こされるリーディングフレームシフトにより、位置５６５〜５６７（下線部）に初期翻訳終止コドンを生じる。
【０１５５】
導出アミノ酸配列（配列番号４０）は、１５３アミノ酸からなる：
【０１５６】
【化５】
【０１５７】
このタンパク質は、配列番号１０に対する１００％相同性をアミノ酸９４まで示すが、ここでこのヌクレオチド配列に図示される１７塩基対断片の追加によりフレームシフトが生じる。アミノ酸９４〜１５３では、このタンパク質は、配列番号１０に相同ではない。配列番号１０のアミノ酸１５４〜１５７は、ヌクレオチド配列に図示される初期の終止コドンにより、存在していない。
【０１５８】
実施例３２：ゲノムＨＬＭＰ−１ヌクレオチド配列
出願人は、ＨＬＭＰ−１発現に関連した推定調節要素が含まれる、ＨＬＭＰ−１をコードするゲノムＤＮＡ配列を同定した。全体のゲノム配列を配列番号４１に示す。この配列は、ＡＣ０２３７８８（クローンＲＰ１１−５６４Ｇ９）（ゲノム配列決定センター、ワシントン医科大学校、ミズーリ州セントルイス）より導いた。
【０１５９】
ＨＬＭＰ−１の推定プロモーター領域は、配列番号４１中のヌクレオチド２，６６０−８，７３３に及ぶ。この領域は、他のものの中でも、少なくとも１０の潜在的なグルココルチコイド応答要素（「ＧＲＥ」）（ヌクレオチド６１４８−６１５３、６２２６−６２３１、６２４７−６２５２、６３３６−６３４１、６５１０−６５１５、６５５２−６５５７、６７２７−６７３２、６７５２−６７５７、７７３８−７７４３、及び８２５５−８２６０）、ショウジョウバエの decapentaplegic（「ＳＭＡＤ」）結合部位に対する１２の潜在的なＳｍａ−２相同体（ヌクレオチド３５６９−３５７５、４５５２−４５５８、４５８２−４５８８、５２２６−５２３２、６２２８−６２３４、６６４９−６６５５、６７２５−６７３１、６９３０−６９３６、７３７９−７３８４、７７３８−７７４２、８０７３−８０７９、及び８３７８−８３８４）、及び３つのＴＡＴＡボックス（ヌクレオチド５９１０−５９１３、６９３２−６９３５、及び７３８０−７３８３）を含む。この３つのＴＡＴＡボックス、ＧＲＥの全部、及びＳＭＡＤ結合要素（「ＳＢＥ」）の８つは、配列番号４１中のヌクレオチド５，８４１−８，７３３に及ぶ領域に集まっている。これらの調節要素は、例えば、骨形成のプロセスに関与するタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列の発現を調節するために使用することができる。このことは、骨形成及び修復に関連する治療因子又は遺伝子、並びに組織分化及び発生に関連した因子又は遺伝子の全身投与を可能にするだろう。
【０１６０】
推定調節要素に加えて、ＨＬＭＰ−１をコードするヌクレオチド配列に対応する１３のエクソンを同定した。これらのエクソンは、配列番号４１中の以下のヌクレオチドに及ぶ。
【０１６１】
【化６】
【０１６２】
ＨＬＭＰ−２には、ヌクレオチド１４８８７−１４９０４に及ぶ、別のエクソン（エクソン５Ａ）がある。
実施例３３：椎間板細胞におけるＨＬＭＰ−１の発現
ＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）は、骨性及び非骨性の組織において細胞分化を指令することができる細胞内タンパク質である。本実施例は、椎間板細胞においてヒトＬＭＰ−１（ＨＬＭＰ−１）を発現することがプロテオグリカン合成を高めて、より軟骨細胞の表現型を促進することを実証する。さらに、細胞の遺伝子発現に及ぼすＨＬＭＰ−１発現の効果を、アグリカン及びＢＭＰ−２遺伝子発現を測定することによって実証した。スプリーグ−ドーリーラットより、穏やかな酵素消化によって腰椎間板細胞を採取し、１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２において単層で培養した。次いで，これらの細胞を約２００，０００細胞／ウェルで６つのウェルプレートへ分けて、約３００，０００細胞／ウェルに細胞が達するまで、約６日間培養した。培養基を１％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２へ変更して、これを０日目とみなした。
【０１６３】
サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターへ機能可能的に連結したＨＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを含んでなる複製欠損５型アデノウイルスについては、例えば、米国特許第６，３００，１２７号にすでに記載されている。この陰性対照アデノウイルスは、ＨＬＭＰ−１ ｃＤＮＡがＬａｃＺ ｃＤＮＡにより置換されること以外は、同一であった。陽性対照として、１００ナノグラム／ミリリットルの濃度のＢＭＰ−２の継続存在下に非感染培養物をインキュベートした。
【０１６４】
０日目に、１％ ＦＢＳを含有する３００マイクロリットルの培地において、培養物を３７℃で３０分間アデノウイルスに感染させた。グリーン蛍光タンパク質（「ＧＦＲ」）遺伝子を含有するアデノウイルス（「ＡｄＧＦＰ」）で処理した細胞の蛍光標示式細胞分取器（「ＦＡＣＳ」）分析を実施して、トランス遺伝子の発現に最適な用量範囲を決定した。この細胞を、ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを含有するアデノウイルス（ＡｄＨＬＭＰ−１）（０、１００、３００、１０００、又は３０００のＭＯＩで）、又はＬａｃＺマーカー遺伝子を含有するアデノウイルス（ＡｄＬａｃＺ、１０００のＭＯＩ）（陰性対照）で処理した。感染後３日目と６日目に培養基を変えた。
【０１６５】
プロテオグリカン産生は、ジメチルメチレンブルー（「ＤＭＭＢ」）熱量測定アッセイを使用して、培養基（０、３、及び６日目）に存在する硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）を測定することによって評価した。
【０１６６】
アグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの定量では、細胞を６日目に採取して、Ｔｒｉｚｏｌ技術によりｍＲＮＡを抽出した。逆転写酵素を使用してｍＲＮＡをｃＤＮＡへ変換し、リアルタイムＰＣＲに使用して、それによりアグリカン及びＢＭＰ−２メッセージの相対産生量を決定した。アグリカン及びＢＭＰ−２用のリアルタイムプライマーは、先の実験において設計して、試験した。Ｃｙｂｅｒｇｒｅｅｎ技術を使用した。標準曲線を使用して、ｍＲＮＡ産生量を定量した。
【０１６７】
トランスフェクトした細胞について、光学顕微鏡で細胞の形態を報告した。細胞は、ＡｄＨＬＭＰ−１（ＭＯＩ １０００）処理ではより球状になったが、ＡｄＬａｃＺ処理ではそうならなかった。ＡｄＬａｃＺ感染は、細胞形態を有意に変化させなかった。
【０１６８】
ＡＤＧＦＰにより１０００のＭＯＩで感染させたラット椎間板細胞のＦＡＣＳ分析は、最高の百分率（４５％）の細胞が感染したことを示した。
ｓＧＡＧ産生とＡｄｈＬＭＰ−１ ＭＯＩの間には、用量依存性の増加があった。これらのデータを図１に見るが、これは、単層培養のラット椎間板細胞における、異なるＭＯＩでのＨＬＭＰ−１過剰発現後のｓＧＡＧの産生を示す。この結果は、０日目の非処理細胞へ正規化した。誤差のバーは、平均の標準誤差を表す。図１に示すように、３日目に観察されるｓＧＡＧ産生は相対的に少なく、トランスフェクションと細胞のＧＡＧ産生の間にラグタイムがあることを示す。ＡｄＬａｃＺでの処理は、ｓＧＡＧ産生を有意に変化させなかった。図１にまた見られるように、ＡｄｈＬＭＰ−１の最適用量は、１０００のＭＯＩでのものであり、６日目に非処理対照に対して２６０％のｓＧＡＧ産生の亢進をもたらした。これより高いか又は低いＡｄｈＬＭＰ−１の用量は、減少した応答をもたらす。
【０１６９】
ＡｄｈＬＭＰ−１投与量（ＭＯＩ）のｓＧＡＧ産生に及ぼす効果をさらに図２に例示する。図２は、異なるＭＯＩのＡｄｈＬＭＰ−１での処理後６日目のラット椎間板細胞のｓＧＡＧレベルを示すチャートである。図２よりわかるように、ＡｄｈＬＭＰ−１の最適用量は、１０００のＭＯＩであった。
【０１７０】
アグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの産生を図３に見る。この図は、ＨＬＭＰ−１の過剰発現後のアグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの増加を実証する。６日目のラット椎間板細胞より抽出したｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを実施して、２５０のＭＯＩのＡＤｈＬＭＰ−１で処理した細胞と無処理（「ＮＴ」）細胞を比較した。図３のデータは、非処理試料に対する増加百分率として表される。図３に例示するように、ＡｄｈＬＭＰ−１処理に続いて、アグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの有意な増加を認めた。ＢＭＰ−２発現の増加は、ＢＭＰ−２が、プロテオグリカン合成のＨＬＭＰ−１刺激に仲介する下流の遺伝子であることを示唆する。
【０１７１】
上記のデータは、椎間板細胞のプロテオグリカン合成を高めるのにＡｄｈＬＭＰ−１でのトランスフェクションが有効であることを実証する。最高のトランス遺伝子発現をもたらすウイルスの用量（ＭＯＩ １０００）はまた、ｓＧＡＧの最高の誘導をもたらし、ＨＬＭＰ−１発現とｓＧＡＧ誘導の間の相関性を示唆する。これらのデータは、ＨＬＭＰ−１遺伝子治療が椎間板におけるプロテオグリカン合成を高める方法であること、そしてＨＬＭＰ−１が椎間板疾患を治療するための薬剤であることを示す。
【０１７２】
図４Ａは、異なるＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１での感染後１２時間のＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現を示すチャートである。図４Ａでは、異なる用量（ＭＯＩ）のＡｄ−ｈＬＭＰ−１ウイルスで外因性ＬＭＰ−１発現を誘導し、リアルタイムＰＣＲで定量した。このデータは、比較目的のために、Ａｄ−ＬＭＰ−１ ＭＯＩ ５からのＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルへ正規化している。陰性対照群、無処理（「ＮＴ」）、又はＡｄ−ＬａｃＺ処理（「ＬａｃＺ」）ではＨＬＭＰ−１が検出されなかった。用量依存的な形式のＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルは、２５及び５０のＭＯＩでほぼ８倍のプラトーに達した。
【０１７３】
図４Ｂは、感染後３〜６日目の培地におけるｓＧＡＧの産生を示すチャートである。ＤＭＭＢアッセイを使用して、感染後３〜６日の全ｓＧＡＧ産生を定量した。図４Ｂのデータは、対照（即ち、無処理）群へ正規化している。図４Ｂよりわかるように、ｓＧＡＧには用量依存性の増加があり、２５及び５０のＭＯＩで、対照に優る約３倍増のピークに達した。陰性対照、２５のＭＯＩでのＡｄ−ＬａｃＺは、ｓＧＡＧの増加をもたらさない。図４Ｂにおいて、それぞれの結果は、３つの試料のＳＤを付した平均値として表される。
【０１７４】
図５は、ｓＧＡＧの産生の経時変化を示すチャートである。図５からわかるように、２５及び５０のＭＯＩでは、３日目にｓＧＡＧ産生が有意に増加した。６日目に、ＡｄＬＭＰ−１に応答したｓＧＡＧ産生の用量依存性の増加があった。ｓＧＡＧ増加のプラトーレベルは、２５のＭＯＩで達成された。図５からまたわかるように、ＡｄＬａｃＺ（「ＬａｃＺ」）での処理は、ｓＧＡＧ産生を有意に変化させなかった。それぞれの結果を６〜９の試料についてのＳＤを付した平均値として表す。図５において、「＊＊」は、Ｐ値が非処理対照に対して＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１７５】
図６Ａ及び６Ｂは、ラット繊維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対する遺伝子応答をアグリカン及びＢＭＰ−２についてそれぞれ示すチャートである。２５のＭＯＩのＡｄ−ＬＭＰ−１（「ＬＭＰ−１」）での感染後３日目に、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。図６Ａ及び６Ｂからわかるように、アグリカン及びＢＭＰ−２の遺伝子発現は、非処理対照（「ＮＴ」）に比較して、Ａｄ−ＬＭＰ−１での感染後に有意に増加した。さらに、２５のＭＯＩのＡｄＬａｃＺ（「ＬａｃＺ」）での処理は、非処理対照に比較して、アグリカン又はＢＭＰ−２の遺伝子発現をいずれも有意に変化させなかった。図６Ａ及び６Ｂにおいて、それぞれの結果は、６つの試料についてのＳＤを付した平均値として表す。図６Ａ及び６Ｂにおいて、「＊＊」は、Ｐ値がＰ＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１７６】
図７は、２５のＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１で感染後のラット繊維輪細胞におけるＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルの時間経過を示すグラフである。このデータは、１８Ｓと過剰発現ＬＭＰ−１プライマーの複製計数を使用する標準化の後で、５のＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１に優る増加倍率として表す。図７からわかるように、ＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡは、感染後早くも１２時間で有意にアップレギュレートされた。さらに、１日目と３日目の間には、発現レベルの顕著な増加があった。図７のそれぞれの結果は、６つの試料についてのＳＤを付した平均値として表す。
【０１７７】
図８は、ＨＬＭＰ−１過剰発現に応答したＢＭＰ及びアグリカンのｍＲＮＡレベルの変化を示すチャートである。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、及びアグリカンのｍＲＮＡレベルは、２５のＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１での感染後の異なる時点でのリアルタイムＰＣＲで決定した。図８からわかるように、ＢＭＰ−２ ｍＲＮＡは、ＡｄＬＭＰ−１での感染後早くも１２時間で有意にアップレギュレートされた。一方、アグリカン ｍＲＮＡは、感染後３日目までアップレギュレートされなかった。それぞれの結果は、６つの試料についてのＳＤを付した平均値として表す。図８において、「＊＊」は、非処理対照に対するＡｄＬＭＰ−１での感染についてＰ値が＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１７８】
図９は、ＨＬＭＰ−１発現に応答したｓＧＡＧ産生亢進の時間経過を示すグラフである。図９のデータでは、ラット繊維輪細胞を２５のＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１で感染した。感染後３日ごとに培地を変えて、ＤＭＭＢアッセイでｓＧＡＧを検定した。このデータは、ｓＧＡＧ産生が６日目にプラトーに達し、９日目でも実質的に維持されることを示す。
【０１７９】
図１０は、ｓＧＡＧ産生におけるＬＭＰ−１仲介性の増加に対するノギン（ＢＭＰアンタゴニスト）の効果を示すチャートである。図１０に見られるように、ラットの繊維輪細胞を２５のＭＯＩのＡｄ−ＬＭＰ−１で感染すると、産生されるｓＧＡＧが３日目と６日目の間で３倍増加した。この増加は、３２００ｎｇ／ｍｌ及び８００ｎｇ／ｍｌの濃度のノギン（ＢＭＰアンタゴニスト）の添加により阻止された。しかしながら、図１０に示すように、ノギンは、非感染細胞におけるｓＧＡＧ産生を有意に改変しなかった。図１０にまた見られるように、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２での刺激は、ＢＭＰ−２の添加後３日目と６日目の間でｓＧＡＧ産生の３倍増加をもたらした。８００ｎｇ／ｍｌのノギンは、この増加も阻止した。
【０１８０】
図１１は、単層培養６日後の培地における、ＬＭＰ−１のｓＧＡＧに対する効果を示すチャートである。このデータ点は、非処理細胞に優る増加倍率として表す。図１１に示すように、ＣＭＶプロモーターの付いたＬＭＰ−１も、ＡＡＶベクターにより送達されるとき、単層のラット椎間板細胞によりグリコサミノグリカン合成を刺激するのに有効である。
【０１８１】
表２：ＳＹＢＲグリーンのＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ用のプライマー配列
【０１８２】
【表２】
【０１８３】
表２中のＧＡＰＤＨは、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼを意味する。
表３：ＴａｑＭａｎ（登録商標）のリアルタイムＰＣＲ用のプライマー及びプローブ配列
【０１８４】
【表３】
【０１８５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）リボソームＲＮＡ制御試薬（パート番号４３０８３２９、アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ、アメリカ）を１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブに使用した。
【０１８６】
骨形成の機序−多重ＢＭＰの誘導の証拠
動物及び in vitro 試験により、比較的低い用量のアデノウイルス又はプラスミドベクターを使用するＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）ｃＤＮＡの ex vivo 遺伝子移入での衝撃的で一貫した骨形成効果が実証されている（Boden, et al.,「Ｖｏｌｖｏ基礎科学賞：新規骨誘導タンパク質（ＬＭＰ−１）をコードするｃＤＮＡを用いた局所遺伝子治療による腰椎融合（Volvo Award in Basic Sciences: Lumbar Spine Fusion by Local Gene Thrapy with a cDNA Encoding a Novel Osteoinductive Protein (LMP-1)）」Spine, 23, 2486-2492 (1998)）。しかしながら、ＬＭＰ−１の作用機序、形質導入された細胞がどのくらい長く生存するのかということ、あるいは、どの骨誘導増殖因子及び細胞が新しい骨及び骨芽細胞の分化の誘導に参画するのかということについて、ほとんどわかっていない（Boden, et al.,「ＬＩＭドメインタンパク質、ＬＭＰ−１は、骨形成に及ぼすＢＭＰ−６の効果に仲介する（LMP-1, A LIM-Domain Protein, Mediates BMP-6 Effects on Bone Formation）」Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) 及び Boden, et al., Spine, 23, 2486-2492 (1998) を参照のこと）。さらに、骨形成の in vivo 機序（即ち、軟骨内か膜性か）も決定されていない。ＬＭＰ−１作用の機序を理解することは、臨床現場におけるＬＭＰ−１誘導性の骨形成の最適制御と、さらに、骨芽細胞分化に関与する細胞内シグナル伝達経路の理解に有用であろう。
【０１８７】
ＬＭＰ−１は、異種ＬＩＭドメインタンパク質ファミリーのメンバーであり、骨芽細胞分化と直接関連づけられた最初のメンバーである（Kong, et al.,「筋ＬＩＭタンパク質は、ＭｙｏＤの活性を亢進することによって筋発生を促進する（Muscle LIM Protein Promotes Myogenesis by Enhancing the Activity of MyoD）」Mol. Cell. Biol., 17, 4750-4760 (1997)）。ＬＭＰ−１は、グルココルチコイドにより刺激されたラット頭蓋冠の骨芽細胞由来のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）において同定され、その後、骨肉腫の相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーより単離された（Boden, et al., Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998)）。細胞表面受容体を介して作用する細胞外タンパク質であるＢＭＰと異なり、ＬＭＰ−１は、骨芽細胞分化に直接関与する細胞内シグナル伝達分子であると考えられている（Boden, et al., Spine, 20, 2626-2632 (1995)；Cook et al.,「非ヒト霊長動物における分節欠損の治癒に及ぼす組換えヒト骨形態形成タンパク質−1の効果（Effect of Recombinant Human Osteogenic Protein-1 on Healing of Segmental Defects in Non-Human Primates）」J. Bone Joint Surg., 77-A, 734-750 (1995)；Schimandle, et al.,「組換えヒト骨形態形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）を用いた実験脊椎融合（Experimental Spinal Fusion with Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2)）」Spine, 20, 1326-1337 (1995)）。従って、ＬＭＰ−１の治療使用は、そのｃＤＮＡの遺伝子移入を伴う場合がある。骨発生とのその関連性と抑制及び過剰発現実験の結果に基づいて、ＬＭＰは、その骨誘導活性を伝える可溶性因子の分泌を誘導し、骨芽細胞の in vitro 及び in vivo での分化及び成熟化に不可欠のレギュレーターであると考えられる。
【０１８８】
以下に記載するのは、１）ＬＭＰ−１により誘導される分泌される骨誘導因子の候補物を同定する；２）ＬＭＰ−１により誘導される骨形成の組織学的順序及び種類を記載する；及び３）ＬＭＰ−１を過剰発現する移植細胞が in vivo でどのくらい長く生存するかを決定するために実施する試験である。
【０１８９】
この試験では、ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞を使用して、ＬＭＰ−１過剰発現が骨形態形成タンパク質の発現を in vitro で誘導するかどうかを決定した。ＬＭＰ−１又はＬａｃＺ ｃＤＮＡを含有する組換え複製欠損ヒトアデノウイルス５型で培養Ａ５４９細胞を感染させた。４８時間後に免疫組織化学を使用して、細胞を分析した。最後に、上記２つのウイルスの１つを感染させたヒトバフィーコート細胞をロードしたコラーゲンディスクからなる皮下インプラントを１６匹の無胸腺ラットへ与えた。ラットを一定間隔で安楽死させ、外植片を組織学及び免疫組織化学により分析した。
【０１９０】
材料と方法
フェーズ１：ＬＭＰ−１で誘導される骨誘導因子の in vitro 検出
上記のように、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター付きのヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを移入ベクターへクローニングして、引き続き、組換え複製欠損（Ｅ１、Ｅ３欠失）アデノウイルスへ移入した。
【０１９１】
ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）は、ヒト５型アデノウイルスによるその高感染性で知られている。これらの細胞を２ウェルチャンバスライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，イリノイ州ナパーヴィル）に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度でまき、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補充したＦ１２ Ｋａｉｇｈｎ培地（ギブコＢＲＬ）において繁殖させ、加湿５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。
【０１９２】
Ａ５４９細胞を、１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で、チャンバ上に３７℃で３０分間感染させた。１０％ ＦＢＳ入りの培地を加え、この細胞を３７℃で４８時間増殖させた。この細胞に、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Boden, et al., Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) 及び Boden, et al., Spine, 23, 2486-2492 (1998)）によりそれぞれ推進されるＡｄＬＭＰ−１（活性ＬＭＰ）又はＡｄＬａｃＺ（Ａｄβｇａｌ−アデノウイルス対照）のいずれかを感染させた。追加の陰性対照として、いくつかの細胞は、アデノウイルスで感染させなかった（無処理対照）。４８時間後、チャンバスライド上の細胞を５０％アセトン／５０％メタノールにおいて２分間固定してから、ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＭｙｏＤ、及びＩＩ型コラーゲンに特異的な抗体を使用して、免疫組織化学（以下に記載する）により分析した。
【０１９３】
フェーズ２：骨形成の in vivo での組織学的順序
実験プロトコールは、施設内動物ケア及び使用委員会とヒト研究委員会により、検討されて承認された。ウサギ又はヒトの末梢血（３ｍＬ）を静脈穿刺により入手して、１２００ｘｇで１０分間の簡略な遠心分離によりバフィーコート細胞を単離した。この細胞を計数し、１ｘ１０６の細胞を４．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで、３７℃で１０分間、アデノウイルス（ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄＬａｃＺ）に感染させた。感染後、この細胞を８０μＬの最終容量に再懸濁させて、７ｍｍＸ７ｍｍＸ３ｍｍのコラーゲンディスク（ウシＩ型コラーゲン）へ適用した。
【０１９４】
４〜５週齢である１６匹の無胸腺ラットを入手し（Ｈａｒｌａｎ，インディアナ州インディアナポリス）、無菌条件に収容した。１〜２％イソフルランの吸入によりラットに麻酔をした。無胸腺ラットの胸部に４つの１０ｍｍ皮膚切開を行い、鈍的剥離によりポケットを作り、細胞を含有するコラーゲンディスクを各ポケットへ移植した。インプラントは、ＡｄＬＭＰ−１（２／ラット）又はＡｄＬａｃＺ（２／ラット）のいずれかを感染させたバフィーコート細胞をロードしたコラーゲンディスクより構成された。この皮膚を再吸収可能縫合で閉じた。各動物を移植後１、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日目に犠牲にし、組織学と免疫組織化学により外植片を分析した。
【０１９５】
標本は、１０％中性緩衝化ホルマリンにおいて２４時間固定した。この標本を非脱灰又は脱灰切片化のために調製した。非脱灰切片用の標本は、格付け強度のエタノールにより脱水して、パラフィンに埋め込んだ。移植後２１及び２８日目の標本は、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液で３〜５日間脱灰した。脱灰化の後で、格付け強度のエタノールにより標本を脱水して、パラフィンに埋め込んだ。標本をミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊｕｎｇ ＧｍｂＨ，ハイデルベルグ、ドイツ）で５マイクロメートルの厚さに切断した。切片をヘマトキシリン及びエオシン染色、Ｇｏｌｄｎｅｒの三色染色、並びに、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＣＤ−４５、及びＩ型コラーゲンに特異的な抗体を使用する免疫組織化学試験へ処した。
【０１９６】
一次抗体の調製
抗ＬＭＰ−１抗体：抗ＬＭＰ−１抗体は、ヒトＬＭＰ−１の内部領域内にマッピングされる、アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体であり、ウサギ及びヒト起源のＬＭＰ−１と反応する。この抗体をＬＭＰ−１タンパク質の同定に１：５００又は１：１０００の希釈で使用した。
【０１９７】
抗ＢＭＰ−２、抗ＢＭＰ−４、抗ＢＭＰ−６、抗ＢＭＰ−７、及び抗ＴＧＦ−β１抗体：ポリクローナルのヤギ抗ＢＭＰ−２、抗ＢＭＰ−４、抗ＢＭＰ−６、抗ＢＭＰ−７、及び抗ＴＧＦ−β１抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）は、マウス、ラット、及びヒトのＢＭＰと交差反応する。抗ＢＭＰ−２、抗ＢＭＰ−４、及び抗ＢＭＰ−６抗体は、ヒト起源のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−６のアミノ末端でマッピングされるエピトープに対して産生した。抗ＢＭＰ−７抗体は、ヒトＢＭＰ−７の内部領域内にマッピングされる、アフィニティー精製されたヤギのポリクローナル抗体であった。抗ＴＧＦ−β１抗体は、ヒトＴＧＦ−β１の前駆体型のカルボキシ末端にマッピングされる、アフィニティー精製されたヤギのポリクローナル抗体であった。これらの抗体は、１：１００及び１：５００又は１：１０００の希釈で使用した。
【０１９８】
抗ＣＤ４５抗体：モノクローナルマウス抗ヒト白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ−４５抗体（精製ＩｇＧ１，κ；ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）は、異なるエピトープに対して向けられた２つの抗体、ＰＤ７／２６及び２Ｂ１１からなる。ＰＤ７／２６は、Ｔ細胞増殖因子で維持された、ヒト末梢血リンパ球より導いた。２Ｂ１１は、Ｔ細胞リンパ腫又は白血病より単離した新生物細胞より導いた。いずれの抗体も、免疫蛍光法により試験するとき、９４〜９６％の範囲でリンパ球及び単球へ結合した。今回の試験では、この抗体をヒト白血球の同定のために１：１００の希釈で使用した。
【０１９９】
抗Ｉ型コラーゲン抗体：モノクローナル抗Ｉ型コラーゲン抗体（マウスＩｇＧ１アイソタイプ；シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）は、マウス骨髄腫細胞と、ウシ皮膚Ｉ型コラーゲンで免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞の融合によって産生したＩ型コラーゲンハイブリドーマより導いた。この抗体は、ヒト、ウシ、ウサギ、シカ、ブタ、及びラットのＩ型コラーゲンと反応し、１：１００の希釈で使用した。
【０２００】
抗ＩＩ型コラーゲン抗体：ポリクローナルウサギ抗ＩＩ型コラーゲン抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）は、ヒトＩＩ型コラーゲンのα１鎖のアミノ末端に対応するエピトープに対して産生した。この抗体は、マウス、ラット、及びヒト起源のＩＩ型コラーゲンα１鎖と反応し、１：１０００の希釈で使用した。
【０２０１】
抗ＭｙｏＤ抗体：ポリクローナルウサギ抗ＭｙｏＤ抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）は、マウス起源の全長ＭｙｏＤタンパク質を表すアミノ酸１〜３１８に対応するエピトープに対して産生した。この抗体は、マウス、ラット、及びヒト起源のＭｙｏＤと反応し（そして、ミオゲニン、Ｍｙｆ−５、又はＭｙｆ−６とは反応しない）、１：１０００の希釈で使用した。
【０２０２】
免疫組織化学染色
標識化ストレプタビジン−ビオチン法（ＬＳＡＢ法）を使用して、染色手順を実施した。ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＣＤ４５、ＭｙｏＤ、Ｉ型コラーゲン、及びＩＩ型コラーゲンに対する抗体での免疫染色に、キット（ユニバーサルＬＳＡＢキット、ペルオキシダーゼ；ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）を使用した。一次抗体を産生した動物によって、適正なビオチニル化二次抗体を使用した。０．３％過酸化水素を含有するメタノールで内因性ペルオキシダーゼを阻止した。５％正常ウサギ血清又は５％正常ヤギ血清のいずれかと１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）とともに標本を室温で１５分間インキュベートして非特異結合を回避してから、適正濃度の一次抗体とともに加湿チャンバに４℃で一晩置いた。ＰＢＳで３回、５分間の洗浄後、加湿チャンバにおいて室温で１０分間、ビオチニル化二次抗体及びストレプタビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とのインキュベーションに続き、３，３’−ジアミノベンチジンテトラクロリド（ＤＡＢ；ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）を使用して発色させた。最後に、この切片をヘマトキシリンにより対比染色した。陰性対照として、それぞれの一次抗体を、標本とのインキュベーションに先立って、対応する阻止ペプチド（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）とともに室温で３時間インキュベートした。ある実験では、一次抗体単独、又は二次抗体単独を追加の陰性対照として使用した。
【０２０３】
結果
フェーズ１：ＬＭＰ−１で誘導される骨誘導因子の in vitro 検出
図１２Ａ〜１２Ｄに示すように、ＡｄＬＭＰ−１で感染したＡ５４９細胞は、ＬＭＰ−１タンパク質の強い細胞内染色を示した。図１２Ａ〜１２Ｄは、ＡｄＬＭＰ−１（図１２Ａ）、Ａｄβｇａｌ（図１２Ｃ）での感染後４８時間のＡ５４９細胞、又は非処理細胞（図１２Ｄ）中のＬＭＰ−１タンパク質についての免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。図１２Ａ、１２Ｃ及び１２Ｄより見られるように、ＡｄＬＭＰ−１で感染した細胞には、どの対照にも見られない（図１２Ｃ及び１２Ｄ）、特異的な細胞内反応が見られた（図１２Ａ）。一次抗体の阻止ペプチドへのプレ曝露が陽性の細胞内染色を消失させた（図１２Ｂ）ので、非特異反応の可能性は棄却された。図１２Ａ〜１２Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０４】
図１３Ａ〜１３Ｆに示すように、ＡｄＬＭＰ−１処理細胞では、特に細胞質において、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−７の強い染色を観察した。図１３Ａ〜１３Ｆは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１３Ｄ、１３Ｅ、及び１３Ｆ）での感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞（それぞれ、図１３Ｄ、１３Ｅ、及び１３Ｆ）に存在しない、ＢＭＰ−２（図１３Ａ）、ＢＭＰ−４（図１３Ｂ）、及びＢＭＰ−７（図１３Ｃ）に特異的な細胞内染色があった。図１３〜１３Ｆの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０５】
図３Ａ〜３Ｄに示すように、ＡｄＬＭＰ−１で処理した細胞はまた、抗ＢＭＰ−６及び抗ＴＧＦ−β１抗体で陽性に染色した。図１４Ａ〜１４Ｄは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１４Ａ及び１４Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１４Ｃ及び１４Ｄ）のいずれかでの感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞（それぞれ、図１４Ｃ及び１４Ｄ）に存在しない、ＢＭＰ−６（図１４Ａ）及びＴＧＦβ−１（図１４Ｂ）に特異的な細胞内染色があった。しかしながら、これらの反応は、他のＢＭＰで見られるものよりやや強くなかった。Ａｄβｇａｌ感染と非処理対照の両方で、細胞は、ＬＭＰ−１、ＢＭＰのすべて、又はＴＧＦ−β１に特異的な反応をしなかった。各抗体の阻止ペプチドにより、この反応が特異的であることを確かめた。抗ＩＩ型コラーゲン抗体や抗Ｍｙｏ抗体との特異反応もなかった（データ示さず）。図１４Ａ〜１４Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０６】
フェーズ２：骨形成の in vivo での組織学的順序。組織学的検査−免疫組織化学染色
白血球の免疫定位。図１５Ａ〜１５Ｄに示すように、移植後１及び３日目に、ＡｄＬＭＰ−１（活性）及びＡｄβｇａｌ（対照）で処理したインプラントの両方の内部のバフィーコート調製物に抗ＣＤ４５抗体により染色される細胞が多量に存在した。
【０２０７】
図１５Ａ〜１５Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１５Ａ及び１５Ｃ）又は５日目（図１５Ｂ及び１５Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１５Ａ及び１５Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１５Ｃ及び１５Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞中の白血球表面マーカーＣＤ４５の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＣＤ４５抗原に特異的な染色のある細胞の数は、両方の処理群において速やかに減少した。この観察事実は、移植したヒト細胞がさほど長くは生存せず、骨形成は宿主細胞の流入に依存した可能性があることを示唆する。特異的な抗ヒトＣＤ４５反応で染色する細胞の数は、３日目以降、特にインプラントの中心で減少した。それでも５日目にはインプラントの周辺で陽性染色を観察したが、移植から１０日後、抗ＣＤ４５で染色する細胞はほとんどなかった。減少する染色のパターンは、活性インプラントと対照インプラントで同じであった。図１５Ａ〜１５Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０８】
ＢＭＰの免疫定位。ＡｄＬＭＰ−１処理インプラントでは、移植後３及び５日目に、免疫組織化学により、細胞内のコラーゲン線維で強いＢＭＰ−４（図１６Ａ〜１６Ｄ）及びＢＭＰ−７（図１７Ａ〜１７Ｄ）の染色が明らかにされた。
【０２０９】
図１６Ａ〜１６Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１６Ａ及び１６Ｃ）又は５日目（図１６Ｂ及び１６Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１６Ａ及び１６Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１６Ｃ及び１６Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−４の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞には存在しない、ＢＭＰ−４に特異的な細胞内染色があった。図１６Ａ〜１６Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２１０】
図１７Ａ〜１７Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１７Ａ及び１７Ｃ）又は５日目（図１７Ｂ及び１７Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１７Ａ及び１７Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１７Ｃ及び１７Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞には存在しない、ＢＭＰ−７に特異的な細胞内染色があった。図１７Ａ〜１７Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２１１】
図１６Ａ〜１６Ｄ及び１７Ａ〜１７Ｄよりわかるように、Ａｄβｇａｌ（対照）インプラントの細胞には、ＢＭＰ−４又はＢＭＰ−７に特異的な染色がなかった。さらに、ＡｄＬＭＰ−１インプラントには、１０日以降のどの時点でも、抗ＢＭＰ−４及び抗ＢＭＰ−７抗体での強い染色が見られた。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７の強い染色は２つの一時的なフェーズで観察された；第一フェーズは、早期の日（即ち、移植後３及び５日目）のバフィーコート細胞の限定数であり、そして第二フェーズは、１０日目以降に、マトリックスにより囲まれる骨芽細胞様の細胞において見られ、これは、図１８に示すように、移植されたバフィーコート細胞ではなく、応答している細胞である可能性がきわめて高い。
【０２１２】
図１８は、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１４日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の高出力顕微鏡写真である。より早期の時点と比較して、より豊富なＢＭＰ−７の染色があり、これは今のところ、新しい骨マトリックスの形成のごく近傍にある細胞の大部分と関連づけられている。図１８の顕微鏡写真は、Ｘ６６の原寸大で撮影した。
【０２１３】
Ｉ型コラーゲンの免疫定位。ＡｄＬＭＰ−１インプラントでは、移植後７、１０、１４、２１、及び２８日目に、抗Ｉ型コラーゲン抗体の強い染色が観察された。早期の時点では、骨芽細胞様細胞の付近とその細胞そのものの周辺で特異的な反応が見られた。Ａｄβｇａｌで処理した対照インプラントには、Ｉ型コラーゲンの染色がほとんどなかった。
【０２１４】
ヘマトキシリン及びエオシン染色と、Ｇｏｌｄｎｅｒの三色染色
ウサギ又はヒトのいずれかのバフィーコート細胞を使用しても、結果は同じであった。重複を避けるために、以下の記載と対応する例示は、ヒトのドナー細胞についてのものである。図１９Ａ〜１９Ｄに示すように、移植後１及び３日目に、Ａｄ−ＮＭＰインプラントは、インプラントの周縁で細胞数を増やしていた。
【０２１５】
図１９Ａ〜１９Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目（図１９Ａ及び１９Ｃ）又は３日目（図１９Ｂ及び１９Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１９Ａ及び１９Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１９Ｃ及び１９Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。インプラントの周辺の細胞の密度は、いずれの時点でもＡｄＬＭＰ−１インプラントにおいてより高く、宿主細胞の遊走を示唆した。図１９Ａ〜１９Ｄは、Ｇｏｌｄｎｅｒ三色法を使用して、Ｘ３３の原寸大で撮影した。
【０２１６】
Ａｄβｇａｌ対照では、同じ時点（即ち、移植後１及び３日）で、周辺にはより少ない細胞しかなかった。これらの観察事実は、図２０Ａ及び２０Ｂに示すように、ＬＭＰ−１を発現する細胞のあるインプラントへ宿主細胞が遊走したことを示唆する。これらの細胞は、単球及び多形核球の混合物であった。図２０Ａ及び２０Ｂは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄβｇａｌで感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。図２０Ａに示すように、Ａｄβｇａｌで感染した細胞を含有するコラーゲン（Ｃ）インプラントの周辺には相対的にごくわずかの細胞（矢印）しかなかった。このインプラントの中心には、バフィーコート細胞と赤血球ゴーストを認めることができた。図２０Ｂに示すように、有核細胞のコラーゲン（Ｃ）インプラントの周辺での密度はＡｄＬＭＰ−１インプラントにおいてより高く、周囲の柔組織からの宿主細胞の遊走を示唆した。この細胞には、単球、多形核細胞、及び組織球に見える細胞が含まれた。図２０Ａ及び２０Ｂの顕微鏡写真は、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して、Ｘ１００（図２０Ａ）とＸ１６０（図２０Ｂ）の原寸大で撮影した。
【０２１７】
図２１Ａ〜２１Ｊは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図２１Ａ〜２１Ｅ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図２１Ｆ〜２１Ｊ）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。膜性の骨形成の進行は、７日目までに見られる石灰化マトリックスで明白であった（図２１Ｃ）。Ａｄβｇａｌで感染させた細胞を含有するインプラントには、骨形成が見られなかった（図２１Ｆ〜２１Ｊ）。図２１Ａ〜２１Ｊの顕微鏡写真は、Ｇｏｌｄｎｅｒ三色法を使用して、Ｘ３３の原寸大で撮影した。
【０２１８】
図２１Ａ〜２１Ｅに示すように、コラーゲン繊維と関連したバフィーコート細胞は経時的により少なくなり、Ａｄβｇａｌ処理インプラントの中心で生存している細胞の数は、移植後５日目までに減少した（図２１Ｃ）。
【０２１９】
図２２Ａ〜２２Ｃは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。図２２Ａからわかるように、移植後７日目には、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの周辺のコラーゲン繊維（Ｃ）の間にある骨芽細胞様細胞（矢印）に隣接して新たな石灰化骨マトリックス（Ｂ）が見られた。骨芽細胞様細胞を囲むマトリックス（矢先）の、典型的な類骨縫合を伴わず、特定の配向もない、速やかな石灰化があった。図２２Ｂからわかるように、ＡｄＬＭＰ−１インプラント全体に位置する空間には成熟した新骨が形成されて、コラーゲン骨格のほとんどは、２８日目までに再吸収された。破骨細胞（ＯＣ）が一次無層骨（Ｂ）を再建しているのが見られる一方で、骨芽細胞（矢先）が骨様の新形成骨の表面を被覆しているのが見られた。最後に、図２２Ｃからわかるように、骨髄基質（Ｓ）と血管（Ｖ）が含まれる骨（Ｂ）の内部では、造血性の骨髄組織が形成されているのが見られた。図２２Ａ〜２２Ｃの顕微鏡写真は、Ｇｏｌｄｎｅｒ三色法を使用して、Ｘ１６０の原寸大で撮影した。
【０２２０】
図２２Ａからわかるように、移植後７日目には、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの周辺のコラーゲン繊維の間にある骨芽細胞様細胞に隣接して新たな骨マトリックスが見られた。典型的な類骨縫合を伴わず、特定の配向もない、周囲マトリックスの速やかな石灰化があった。組織化された骨配向の不足は、これらが有意にロードされたわけではない皮下インプラントであるという事実に照らせば、驚くことではなかった。移植後１０日目のＡｄＬＭＰ−１インプラントには、より多量の骨芽細胞様細胞が観察され、コラーゲン繊維間の空所へ増殖していた。移植後１４日目までに、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの中心領域は骨芽細胞様の細胞に占められた。対照的に、Ａｄβｇａｌ処理インプラントには、コラーゲンの空所に線維芽細胞様の細胞が充満していた。移植後２１日で、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの中心領域のほとんど又はすべてにおいて、新骨マトリックスが石灰化されて、形成された。移植後２８日では、ＡｄＬＭＰ−１インプラントのほとんどの中心領域に位置する空間に成熟した新骨が形成されていた。破骨細胞が一次無層骨を再建しているのが見られる一方で、骨芽細胞が骨様の新形成骨の表面を被覆しているのが見られた（図２２Ｂ）。この骨の内部では、造血性の骨髄組織も形成されているのが見られた（図２２Ｃ）。Ａｄβｇａｌ処理対照では、移植されたコラーゲンが２８日までにほとんど再吸収されて、繊維組織で置き換えられた。
【０２２１】
上記に示したように、Ａ５４９細胞での in vitro 実験は、ＡｄＬＭＰ−１被感染細胞が上昇レベルのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及びＴＧＦ−β１タンパク質を発現することを示した。ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞も、無胸腺ラットへの異所性移植後７２時間で増加レベルのＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７タンパク質を明示して、in vitro の仮説を確認した。
【０２２２】
上記の試験の結果に基づいて、それ故に、いくつかのＢＭＰの合成と、分化して直接の膜性骨形成に参画する宿主細胞の動員にＬＭＰ−１の骨誘導特性が関与することが示された。従って、ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡでの遺伝子治療は、新骨形成を誘導するために、多量の単一ＢＭＰの移植に代わる手段を提供する可能性がある。
【０２２３】
本発明によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（ＴＧＦ−β）の発現を細胞において誘導する方法が提供される。該方法には、
プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが含まれる。本発明によれば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質の発現を含めることができる。単離核酸は、配列番号２５の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下でハイブリダイズすることができる核酸；及び／又は配列番号２６の全長に相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子であり得る。細胞は、バフィーコート細胞、幹細胞（例えば、間葉幹細胞又は多能性幹細胞）、又は椎間板細胞（例えば、髄核の細胞、又は繊維輪の細胞）であり得る。細胞は、ex vivo 又は、in vivo でトランスフェクトすることができる。例えば、細胞は、哺乳動物の椎間板への核酸の直接注射により in vivo でトランスフェクトしてよい。
【０２２４】
上記ヌクレオチド配列によりコードされるＬＩＭ石灰化タンパク質は、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、又はＨＬＭＰ−３であり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターであり得る。本発明の１つの態様によれば、ＬＩＭ石灰化タンパク質は、ＬＭＰ−１タンパク質である。核酸は、ベクター（例えば、プラスミドのような発現ベクター）中にあってよい。ベクターは、アデノウイルス又はレトロウイルスのようなウイルスでもよい。本発明により使用することができる例示のアデノウイルスは、ＡｄＬＭＰ−１である。
【０２２５】
本発明の第二の側面によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を過剰発現する細胞が提供される。この細胞は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質を過剰発現する細胞であり得る。細胞は、バフィーコート細胞、椎間板細胞、間葉幹細胞、又は多能性幹細胞であり得る。上記に示すような細胞と担体材料を含んでなるインプラントも提供される。本発明によりまた提供されるのは、上記に示すような細胞又はインプラントを哺乳動物へ導入することを含んでなる、哺乳動物において骨形成を誘導する方法と、上記に示すような細胞を哺乳動物の椎間板へ導入することを含んでなる、哺乳動物において椎間板疾患を治療する方法である。
【０２２６】
本発明の文脈において、骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質の過剰発現は、その特定の細胞において通常存在するより高いレベルでそのタンパク質を発現する細胞に関連する（例えば、このタンパク質の発現は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸でトランスフェクトされなかった細胞におけるレベルより高いレベルにある）。細胞は、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を通常発現する細胞であり得る。細胞は、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を通常は発現しない細胞であってもよい。
【０２２７】
上記の詳述は、本発明の原理を教示し、実施例を例示の目的で提供するが、当業者には、本開示を読むことより、本発明の真の範囲より逸脱することなく、形態及び細部において様々な変更をなし得ると理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】図１は、示した感染多重度（ＭＯＩ）でトランスフェクトしたラット椎間板細胞におけるＨＬＭＰ−１の発現後の硫酸化グリコサミノグリカンの産生を例示するグラフである。
【図２】図２は、異なるＭＯＩのＡｄＨＬＭＰ−１での感染後６日目のラット椎間板細胞の用量応答を示すチャートである。
【図３】図３は、２５０ビリオン／細胞のＭＯＩでのトランスフェクション後６日目の、ＡｄＨＬＭＰ−１トランスフェクトされたラット椎間板細胞によるアグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの発現を示すチャートである。
【図４】図４Ａは、異なるＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１での感染後１２時間のＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現を示すチャートである。図４Ｂは、感染後３〜６日目の培地におけるｓＧＡＧの産生を示すチャートである。
【図５】図５は、ｓＧＡＧの産生の経時変化を示すチャートである。
【図６】図６Ａは、ラット繊維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対するアグリカンについての遺伝子応答を示すチャートである。図６Ｂは、ラット繊維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対するＢＭＰ−２についての遺伝子応答を示すチャートである。
【図７】図７は、２５のＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１で感染後のラット繊維輪細胞におけるＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルの時間経過を示すグラフである。
【図８】図８は、ＨＬＭＰ−１過剰発現に応答したＢＭＰ及びアグリカンのｍＲＮＡレベルの変化を示すグラフである。
【図９】図９は、ＨＬＭＰ−１発現に応答したｓＧＡＧ産生亢進の時間経過を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｓＧＡＧ産生のＬＭＰ−１仲介性の増加がノギン（ｎｏｇｇｉｎ）により阻止されることを示すチャートである。
【図１１】図１１は、単層培養６日後の培地における、ＬＭＰ−１のｓＧＡＧに対する効果を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、Ａ５４９細胞中のＬＭＰ−１タンパク質についての免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｆは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）のいずれかで感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１５Ａ及び１５Ｃ）又は５日目（図１５Ｂ及び１５Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞中の白血球表面マーカーＣＤ４５の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１６Ａ及び１６Ｃ）又は５日目（図１６Ｂ及び１６Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−４の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１７Ａ及び１７Ｃ）又は５日目（図１７Ｂ及び１７Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１４日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の高出力顕微鏡写真である。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目（図１９Ａ及び１９Ｃ）又は３日目（図１９Ｂ及び１９Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄβｇａｌで感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄβｇａｌで感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｊは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図２１Ａ〜２１Ｅ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図２１Ｆ〜２１Ｊ）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、遺伝物質で細胞をトランスフェクトする方法に概して関する。より具体的には、本発明の分野は、ＬＩＭ石灰化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）タンパク質（ＬＭＰ）をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることによって、１以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及び／又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（ＴＧＦ−β）の発現を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
骨芽細胞は、多能性の間葉幹細胞より分化すると考えられている。骨芽細胞の成熟化は、石灰化して骨を形成することができる細胞外マトリックスの分泌をもたらす。この複雑なプロセスの調節は、十分には理解されていないが、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）として知られる一群のシグナル伝達糖タンパク質が関与すると考えられている。これらのタンパク質は、胚の背側−腹側パターン形成、肢芽発生、及び成体動物における骨折修復に関与することが示されている。B. L. Hogan, Genes & Develop., 10, 1580 (1996)。このトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリー分泌タンパク質の群は、多様な細胞種において、様々な分化の段階で、多様な活性を有するが、これらの近縁分子間の生理活性における違いは、明確にされていない（D. M. Kingsley, Trends Genet., 10, 16 (1994）。
【０００３】
ラット頭蓋冠の骨芽細胞分化の誘導に対するＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４の効果が検討された（Boden, et al., Endocrinology, 137, 3401 (1996)）。分化の始動にＢＭＰやグルココルチコイドを必要とする胎児ラット頭蓋冠の培養物において、グルココルチコイドは、骨芽細胞分化を高めるＢＭＰ−６ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の１０倍の誘導をもたらした（Boden, et al., Endocrinology, 138, 2920 (1997)）。
【０００４】
ＢＭＰは、in vivo での骨形成の刺激について検討されてきた。ＢＭＰや他の細胞外シグナル伝達分子で達成された初期の成功にもかかわらず、その使用には欠点がある。例えば、新しい骨の産生を高めるには、比較的多量の精製ＢＭＰが必要とされ、それによりそのような治療法の費用は増加する。さらに、ＢＭＰのような細胞外タンパク質は、宿主動物への導入後に分解を受けやすい。
【０００５】
細胞内のシグナル又は調節分子も、骨誘導経路においてある役割を担う可能性がある。１群の細胞内調節分子は、ＬＩＭドメインとして知られる特徴的な構造モチーフを保有するＬＩＭタンパク質である。ＬＩＭドメインは、２−アミノ酸スペーサーにより結合している２つの特殊なジンクフィンガーからなるシステインリッチの構造モチーフである。ＬＩＭドメインだけを有するタンパク質もあれば、多様な追加の機能性ドメインを含有するものもある。ＬＩＭタンパク質は多様な群を形成し、それには転写因子と細胞骨格タンパク質が含まれる。ＬＩＭドメインの主要な役割は、同じか又は異なるＬＩＭドメインとの二量体の形成によるか、又は別個のタンパク質を結合させることによって、タンパク質−タンパク質相互作用に仲介することであるようだ。
【０００６】
ＬＩＭホメオドメインタンパク質（ＬＩＭドメインとホメオドメイン配列の両方を有するタンパク質）において、ＬＩＭドメインは、負の調節要素として機能する。ＬＩＭホメオドメインタンパク質は、細胞系譜決定の制御と分化の調節に関与するが、ＬＩＭのみのタンパク質も同様の役割を有する可能性がある。ＬＩＭのみのタンパク質はまた、そのようなタンパク質をコードするいくつかの遺伝子が腫瘍遺伝子の染色体転座と関連しているので、細胞増殖の制御に関連しているかもしれない。
【０００７】
ヒトや他の哺乳動物腫は、骨修復及び／又は再生のプロセスを必要とする疾患又は損傷を受けやすい。例えば、骨折の治療は、天然の骨修復機序を刺激することができて、それにより骨折した骨が治癒するのに必要とされる時間を短縮する、新しい治療方式によって改善されるだろう。骨粗鬆症のような全身の骨障害のある個体は、新たな骨組織の全身的な形成を産生する治療方式から利益を受けるだろう。そのような治療方式は、この疾患の特徴である骨量の損失より生じる骨折の発症を抑えることができるだろう。
【０００８】
細胞内シグナル伝達分子を使用して新たな骨形成を誘導する治療方式を利用することは、望ましいであろう。遺伝子治療技術は、骨形成に仲介する細胞内シグナルをコードするヌクレオチド断片を骨形成前駆細胞（骨形成に関与する細胞）又は末梢血白血球へ導入することを可能にする。遺伝子治療は、いくつかの潜在的な利点を提供する：（１）標的療法タンパク質の産生に関連したコストがより低いこと；（２）細胞内シグナルの延長された発現を達成する能力により、細胞外の治療方式に比べて効果が高いこと；（３）標的細胞に対する効果が、治療タンパク質と相互作用するために利用可能な限定数の受容体によって限定されないこと；（４）トランスフェクトされた骨前駆細胞を、局在的な骨形成が必要とされる部位へ直接送達し得ること；並びに（５）治療を全身的に提供して、全身の骨形成を誘導し、骨粗鬆症や他の代謝性骨疾患への治療方式を提供し得ること。
【０００９】
ヒトや他の哺乳動物は、椎間板変性、関連した腰痛、椎間板ヘルニア、及び脊椎狭窄を受けやすい。椎間板変性は、椎間板を生物機械的な損傷及び変性により罹りやすくさせる可能性がある、プロテオグリカンマトリックスの進行性損失と関連している。故に、例えば、髄核の細胞、繊維輪の細胞、椎間板の細胞といった適正な細胞によるプロテオグリカン及び／又はコラーゲンの合成を刺激する方法を有することは、望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の要約
本発明の１つの側面によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（ＴＧＦ−β）の発現を細胞において誘導する方法が提供される。該方法には、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが含まれる。本発明の方法により、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質の発現を誘導することができる。本発明のこの側面による単離核酸は、配列番号２５の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下にハイブリダイズすることができる核酸；及び／又は配列番号２６の全長へ相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下にハイブリダイズすることができる核酸分子であり得る。細胞は、どの体細胞でもよく、限定されないが、バフィーコート細胞、幹細胞、及び椎間板細胞が含まれる。
【００１１】
本発明の第二の側面によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を過剰発現する細胞が提供される。この細胞は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質を過剰発現する細胞であり得る。この細胞は、バフィーコート細胞、椎間板細胞、間葉幹細胞、又は多能性幹細胞であってよい。上記に示すような細胞と担体材料を含んでなるインプラントも提供される。本発明によりまた提供されるのは、上記に示すような細胞又はインプラントを哺乳動物へ導入することを含んでなる、骨形成を哺乳動物において誘導する方法と、上記に示すような細胞を哺乳動物の椎間板へ挿入することを含んでなる、椎間板疾患を哺乳動物において治療する方法である。
【００１２】
本発明の追加の利点と新規な特徴は、一部は以下に続く記載において示され、そして一部は以下の検証によるか、又は本発明の実施から学ぶことによって当業者により明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
好ましい態様の詳細な説明
ＬＭＰ−１は、初期の骨芽細胞分化に関連した新規のＬＩＭドメインタンパク質である。発生中の胚の長骨の肥大性軟骨細胞に近接する間葉細胞においてＬＭＰ−１転写物がはじめて検出可能になるのは、軟骨原基の中央に骨芽細胞が出現する直前である（Boden, et al.,「ＬＩＭドメインタンパク質、ＬＭＰ−１は、骨形成に及ぼすＢＭＰ−６の効果に仲介する（LMP-1, A LIM-Domain Protein, Mediates BMP-6 Effects on Bone Formation）」Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) を参照のこと）。ＬＭＰ−１タンパク質は、その多くが様々な細胞種において増殖と分化に関与しているＬＩＭドメインタンパク質の異質ファミリーのメンバーである。しかしながら、ＬＩＭ−ドメインタンパク質の作用の正確な機序は、ほとんど理解されていない。Kong, et al.,「筋ＬＩＭタンパク質は、ＭｙｏＤの活性を亢進することによって筋発生を促進する（Muscle LIM Protein Promotes Myogenesis by Enhancing the Activity of MyoD）」Mol. Cell. Biol., 17, 4750-4760 (1997)；Sadler et al.,「ＺｙｘｉｎとｃＣＲＰ：細胞骨格と結合した２つの相互作用性ＬＩＭドメインタンパク質（Zyxin and cCRP: The Interactive LIM Domain Proteins Associated with the Cytoskeleton）」J. Cell Bio., 119, 1573-1587 (1992)；Salgia et al.,「ヒトパキシリン、Ｐ２１０（ＢＣＣＲ／ＡＢＬ）によりリン酸化されるフォーカルアドヒージョンタンパク質の分子クローニング（Molecular Cloning of Human Paxillin, a Focal Adhesion Protein Phosphorylated by P210 (BCCR/ABL)）」J. Biol. Chem., 270, 5039-5047 (1995)；及び Way, et al.,「C. Elegans における接触受容体ニューロンの分化を特定するホメオボックス含有遺伝子、Ｍｅｃ−３（Mec-3, A Homeobox-Containing Gene that Specifies the Differentiation of the Touch Receptor Neurons in C. Elegans）」Cell, 54, 5-16 (1988) を参照のこと。
【００１４】
ＬＭＰ−１はＬＩＭドメインタンパク質であるが、ＬＩＭドメインそのものは、骨芽細胞の分化には必要でないことが最近示された（Liu, et al.,「ＬＩＭドメインが骨を誘導するのに、ＬＩＭ石灰化タンパク質の過剰発現は必要でない（Overexpressed LIM Mineralization Proteins do not Require LIM Domains to Induce Bone）」J. Bone Min. Res., 17, 406-414 (2002) を参照のこと）。ＬＩＭ−１は、骨芽細胞分化を in vitro で、de novo 骨形成を in vivo で、ごく低い用量で誘導することが可能である、強力な細胞内シグナル伝達分子であると考えられている（Boden, et al., Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998)）。
【００１５】
２つの別個の実験系からの結果は、ＬＭＰ−１がいくつかのＢＭＰの発現を誘導することを示している。ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの挿入後、in vitro では早くも４８時間で、in vivo では７２時間でＢＭＰ−４とＢＭＰ−７を検出することができる。in vivo 試験は、ＬＭＰ−１を発現する移植バフィーコート細胞のほとんどが in vivo では１週間も生存しないことを示したが、骨形成細胞へ分化した宿主細胞の流入の証拠があった。種々の結果は、ＬＭＰ−１が膜様の骨形成を明瞭な軟骨細胞分裂間期を伴わずに誘導することも示しているが、これはＢＭＰの多くで共通している。
【００１６】
発明者は、ＡｄＬＭＰ−１で処理した細胞がＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２と、より少ない程度で、ＢＭＰ−６及びＴＧＦ−β１のタンパク質を in vitro で産生することも示した。ＢＭＰ−４とＢＭＰ−７は、ＬＭＰ−１により誘導される追加分泌の骨誘導因子である。発明者が実施したアンチセンスオリゴヌクレオチド実験は、細胞内ＬＭＰ−１がその骨誘導効果を他の細胞に及ぼすのにＢＭＰ−４とＢＭＰ−７が必要であることを示している。
【００１７】
以下に記載するＡ５４９実験は、ＢＭＰがアデノウイルスそのものによっては誘導されなかったこと、そして非処理細胞でもＢＭＰが発現されなかったことを示している。これらの実験はまた、骨芽細胞分化に関連しない２つのタンパク質（即ち、ＩＩ型コラーゲンとＭｙｏＤ）がＬＭＰ−１によって誘導されなかったことも示している。
【００１８】
Ａ５４９肺癌細胞を選んだのは、Ａ５４９細胞が、骨芽細胞と違って、ＢＭＰの基底発現を有さないからである。
通常の静脈血由来のバフィーコート細胞の ex vivo 遺伝子治療への使用は、比較的新しい。Viggeswarapu, et al.,「ＬＩＭ石灰化タンパク質−１のアデノウイルス送達は、in vitro 及び in vivo で新骨形成を誘導する（Adenoviral Delivery of LIM Mineralization Protein-1 Induces New-Bone Formation in vitro and in vivo）」J. Bone Joint Surg. Am., 83-A, 364-376 (2001) を参照のこと。ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡでトランスフェクトされたバフィーコート細胞がどのくらい長い間 in vivo で生存して、ＢＭＰの合成、分泌、及び活性を高めるかを決定するために、ＣＤ−４５抗原が使用された（Kurtin, et al.,「白血球共通抗原−モノクローナル抗体を使用するパラフィン切片における造血性及び非造血性新生物間の診断識別因子：免疫学的試験及び超構造定位法との相関性（Leukocyte Common Antigen--A Diagnostic Discriminant Between Hematopoietic and Nonhematopoietic Neoplasms in Paraffin Sections using Monoclonal Antibodies: Correlation with Immunologic Studies and Ultrastructural Localization）」Hum Pathol., 16, 353-365 (1985)；及び Pulido et al.,「４つの異なるＣＤ４５抗原特異性の比較生化学及び組織分布試験（Comparative Biochemical and Tissue Distribution Study of Four Distinct CD45 Antigen Specificities）」J. Immunol., 140, 3851-3857 (1988) を参照のこと）。抗ＣＤ−４５一次抗体と特異的に反応する細胞の数は累進的に減少し、移植後１０日までに最小になった。抗ＣＤ−４５染色の消失、７日目でインプラントの中央で細胞が脱落していること、そして骨形成の求心性パターンは、いずれも、移植した細胞（ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを発現するものが含まれる）が長い時間の間生存しないことを示唆し、ＬＭＰ発現細胞が分泌因子（これが後続的に宿主の前駆細胞を動員して、成熟骨芽細胞へのその分化を変調させる）の誘導を介して骨形成プロセスに間接的に参画する可能性があることを示唆した。証拠の示すところでは、ＬＭＰ−１は、いくつかの骨誘導タンパク質（ＢＭＰ）の分泌が含まれるイベントのカスケードを開始させる。故に、ＬＭＰ−１は、多くの細胞において発現されることなく有意な効果を及ぼして、in vivo で長い時間存続することができるので、理想的な治療候補物質である。
【００１９】
発明者は、異所的に移植した末梢血バフィーコート細胞へのＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの ex vivo 遺伝子導入による骨誘導を実証した。故に、本発明は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸での非骨性細胞のトランスフェクションに関する。発明者は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸での椎間板細胞のような非骨性細胞のトランスフェクションが、プロテオグリカン、コラーゲン、そして他の椎間板成分及び組織の合成の増加をもたらし得ることを発見した。故に、発明者は、プロテオグリカン、コラーゲン、又は他の椎間板成分の損失と関連した椎間板疾患を治療する方法を提供する。
【００２０】
発明者は、かつて、被刺激ラット頭蓋冠の骨芽細胞培養物よりＬＩＭ石灰化タンパク質（ＬＭＰ）ｃＤＮＡ配列（１０−４／ＲＬＭＰ）を単離した（配列番号１、配列番号２）（米国特許第６，３００，１２７号）。この遺伝子をクローニングし、配列決定し、骨石灰化の効力を in vitro で高めるその能力をアッセイした。このタンパク質、ＲＬＭＰは、骨マトリックスの石灰化と、並びに細胞の骨芽細胞系譜への分化に影響を及ぼすことが見出された。骨石灰化タンパク質（ＢＭＰ）のような他の既知のサイトカインとは異なり、ＲＬＭＰは、分泌タンパク質ではなく、むしろ細胞内のシグナル伝達分子である。故に、より少ない量のタンパク質で、細胞内シグナル伝達増幅と in vivo 適用へのより大きな特異性をもたらすことができる。好適な臨床適用には、骨折、骨欠損、骨移植における骨修復の亢進と、骨粗鬆症を表出する患者における正常なホメオスタシスが含まれる。
【００２１】
ヒトＬＭＰ−１（ＨＬＭＰ−１）と命名される対応のヒトタンパク質のアミノ酸配列もクローニングされ、配列決定され、演繹されている（米国特許第６，３００，１２７号）。実証されたヒトタンパク質は、骨石灰化の効力を in vitro と in vivo で高めた。
【００２２】
ＨＬＭＰ−１ｓと呼ばれる、ＨＬＭＰ−１の末端切断（短い）バージョンも、発明者により特性決定された（米国特許第６，３００，１２７号を参照のこと）。このタンパク質は、終止コドンを産生する点突然変異の結果であり、末端切断タンパク質をもたらす。ＨＬＭＰ−１ｓは、細胞培養と in vivo において発現されるとき、完全に機能的である。
【００２３】
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ解析を使用して、２つの可変スプライス変異体（ＨＬＭＰ−２及びＨＬＭＰ−３）を同定した（米国特許出願０９／９５９，５７８号、２０００年４月２８日出願）。これらタンパク質のヌクレオチド配列は、ＨＬＭＰ−１配列の３２５〜４４４塩基対領域においてＨＬＭＰ−１と異なる。ＨＬＭＰ−２配列は、この領域に１１９塩基対の欠失と１７塩基対の挿入を有する。ＨＬＭＰ−１と比べて、ＨＬＭＰ−３をコードするヌクレオチド配列には欠失がないが、それはＨＬＭＰ−２と同じ１７塩基対の挿入を有し、これらの塩基対は、ＨＬＭＰ−１配列の塩基対４４４に対応する位置に挿入されている。
【００２４】
ＬＭＰは、いくつかの生物学的プロセスを調節してそれに影響を及ぼすので、ＬＭＰの様々なスプライス変異体は、哺乳動物において、様々な組織の増殖、分化、及び／又は再生といった異なる生物学的機能を有すると予測される。例えば、ある形態のＬＭＰは、骨だけでなく、筋肉、腱、靭帯、脊髄、末梢神経、及び軟骨においても発現されている。
【００２５】
本発明は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸配列を提供すること；プロテオグリカンを産生することが可能な哺乳動物細胞へその単離核酸配列をトランスフェクトすること；そして、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現させて、それによりプロテオグリカン合成を刺激することによって、哺乳動物細胞においてプロテオグリカン又はコラーゲン、あるいはその両方の合成を刺激する方法を提供する。哺乳動物細胞は、椎間板細胞、繊維輪の細胞、又は髄核の細胞のような、非骨性細胞でよい。トランスフェクションは、ウイルス又は、例えばプラスミドのような裸のＤＮＡの直接注射により、ex vivo 又は in vivo のいずれで起きてもよい。ある態様において、ウイルスは、組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１である。
【００２６】
本発明の別の態様は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする単離核酸配列を含んでなる非骨性哺乳動物細胞を含む。非骨性哺乳動物細胞は、幹細胞（例、多能性幹細胞又は間葉幹細胞）でも、椎間板細胞、好ましくは、髄核の細胞又は繊維輪の細胞でもよい。
【００２７】
異なる側面において、本発明は、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする単離核酸配列を非骨性哺乳動物細胞において発現させる方法へ向けられ、該方法は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸を提供すること；前記単離核酸配列を非骨性哺乳動物細胞へトランスフェクトすること；そして、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を発現させることを含んでなる。非骨性哺乳動物細胞は、幹細胞でも、椎間板細胞（例えば、髄核又は繊維輪の細胞）でもよい。トランスフェクションは、ウイルス、又は例えばプラスミドのような裸のＤＮＡの直接注射により ex vivo 又は in vivo のいずれで起きてもよい。ウイルスは、組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１であり得る。
【００２８】
なお別の態様において、本発明は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸を提供すること；プロテオグリカンを産生することが可能な哺乳動物細胞へその単離核酸配列をトランスフェクトすること；そして、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現させることによってプロテオグリカン合成をその細胞において刺激することにより、椎間板変性を逆転させるか又は阻害することによって、椎間板変性を逆転、遅延、又は減速させることにより椎間板疾患を治療する方法へ向けられる。椎間板疾患は、腰痛、椎間板ヘルニア、又は脊椎狭窄をもたらす可能性があるので、該方法はこれらの症状を軽減することができる。哺乳動物細胞は、幹細胞又は椎間板細胞（例えば、繊維輪の細胞、又は髄核の細胞）のような非骨性細胞でよい。
【００２９】
トランスフェクションは、ウイルス、又は例えばプラスミドのような裸のＤＮＡの直接注射により ex vivo 又は in vivo のいずれで起きてもよい。ある態様において、ウイルスは、組換えアデノウイルス、好ましくはＡｄＨＬＭＰ−１である。
【００３０】
本発明は、本明細書においてＬＩＭ石灰化タンパク質、又はＬＭＰと表記される新規の哺乳動物ＬＩＭタンパク質に関する。本発明は、より特別には、ＨＬＭＰ又はＨＬＭＰ−１として知られるヒトＬＭＰ、又は、ＨＬＭＰ−２又はＨＬＭＰ−３として知られている、ヒトＬＭＰの可変スプライス変異体に関する。発明者は、これらのタンパク質が in vitro で増殖させた哺乳動物細胞において骨石灰化を亢進させることを発見した。哺乳動物において産生されるとき、ＬＭＰは、in vivo でも骨形成を誘導する。
【００３１】
ＬＩＭ石灰化タンパク質（例、ＬＭＰ又はＨＬＭＰ）をコードする核酸での骨髄細胞、骨形成前駆細胞、末梢血細胞、及び幹細胞（例、多能性幹細胞又は間葉幹細胞）の ex vivo トランスフェクションに続く、トランスフェクト細胞のドナーへの再移植は、多様な骨関連障害又は損傷を治療するのに適している。例えば、この方法を使用して、長骨骨折修復を高め、分節欠損部分に骨を産生し、骨移植代替物を骨折部分に提供し、腫瘍再構成又は脊椎融合を促進し、股関節、脊椎、又は手根部の骨粗鬆症のような、脆いか骨粗鬆症の骨への局所治療（注射による）を提供することができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸でのトランスフェクションはまた、トランスフェクトされた骨髄細胞を皮下注射して、骨折した長骨の修復を加速させること；長骨骨折の結合又は再結合の遅延、又は脊椎融合の偽関節症の治療、及び股関節又は膝関節の無血管壊死において新骨形成を誘導することに有用である。
【００３２】
遺伝子治療の ex vivo 法だけでなく、ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる組換えＤＮＡベクターのトランスフェクションは、in vivo で達成することもできる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードするＤＮＡ断片を、例えばアデノウイルスベクターのような適切なウイルスベクターへ挿入するとき、このウイルス構築体は、軟骨内の骨形成が望まれる部位へ直接注射することができる。直接の経皮注射を使用してＬＭＰ又はＨＬＭＰ配列を導入することによって、骨髄細胞を入手する（ex vivo でトランスフェクトする）ため、又は新しい骨が必要とされる部位で患者へそれらを再移植するための外科的介入なしに、骨形成の刺激を達成することができる。Alden, et al. (Neurosurgical Focus (1998)) は、アデノウイルスベクターへクローニングしたＢＭＰ−２ ｃＤＮＡを使用する遺伝子治療の直接注射法の有用性を実証した。
【００３３】
ＨＬＭＰをコードする核酸配列を含んでなる裸の、又は被包化されていない組換えプラスミドを適切な身体部位へ直接注射することによって in vivo 遺伝子治療を行うことも可能である。本発明のこの態様において、トランスフェクションが起こるのは、裸のプラスミドＤＮＡが標的細胞により取り込まれるか又は内部化されるときである。ウイルス構築体を使用する in vivo 遺伝子治療の場合のように、裸のＤＮＡの直接注射は、外科的介入をほとんど又はまったく必要としないという利点を提供する。内皮細胞マイトジェンＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）をコードする裸のＤＮＡを使用する直接的な遺伝子治療が、Baumgartner (Circulation, 97, 12, 1114-1123 (1998) によりヒト患者において成功裡に実証されている。
【００３４】
椎間板への適用では、椎間板より細胞を採取すること、ＬＭＰをコードする核酸でこの細胞を in vitro でトランスフェクトすること、そしてこの細胞を椎間板へ導入することによって、ex vivo トランスフェクションを達成することができる。この細胞は、例えば、脊椎に適した外科的技術のような、当業者に知られたどの手段によっても椎間板から採取して、それへ戻し導入してよい。１つの態様において、細胞は、注射により椎間板へ導入する。
【００３５】
また、本発明によれば、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸で幹細胞（例えば、多能性幹細胞又は間葉幹細胞）を ex vivo でトランスフェクトして、例えば、注射により椎間板へ導入することができる。
【００３６】
ex vivo でトランスフェクトした細胞は、担体と組み合わせて椎間板インプラントを形成させてもよい。次いで、トランスフェクトされた細胞を含んでなる担体を、被検者の椎間板へ移植することができる。好適な担体材料については既に記載されている（例えば、Helm et al.,「骨移植片は、脊椎関節固定術の促進の代用となる（Bone Graft Substitutes for the Promotion of Spinal Arthrodesis）」Neurosurg Focus, 10(4) (2001) を参照のこと）。担体は、好ましくは、脱塩骨マトリックス（ＤＭＢ）のような生体適合性の有孔マトリックス、生体適合性の合成高分子マトリックス、又はタンパク質マトリックスを含む。好適なタンパク質には、例えば、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質が含まれる。ＬＭＰで ex vivo トランスフェクトされた細胞は、移植に先立って担体へ（即ち、有孔マトリックスの空孔の中へ）取り込ませることができる。
【００３７】
同様に、細胞を in vivo でトランスフェクトする椎間板への適用では、当業者に知られた好適な方法を使用して、ＤＮＡを椎間板へ導入してよい。１つの態様において、核酸は、椎間板スペースへ直接注射する。
【００３８】
アデノウイルスは、被感染細胞のゲノムへ取り込まれないので、アデノウイルスベクターを使用してＬＭＰを骨形成細胞へ送達するときには、ＬＭＰの一過性発現が達成される。しかしながら、一過性発現は、本発明の目的を達成するのに十分である。しかしながら、標的細胞のゲノムへ取り込まれるベクターの使用により、ＬＭＰの安定発現を達成することができる。例えば、レトロウイルスベクターは、この目的に適している。
【００３９】
ＬＭＰの安定発現は、骨粗鬆症及び骨形成不全症のような、様々な全身性の骨関連障害を治療するのに特に有用である。本発明のこの態様では、ウイルスベクターへの取込みのために調節可能プロモーターをＬＭＰのポリヌクレオチド配列と組み合わせてよい。このようなプロモーターは、例えば、テトラサイクリンのような外因性の誘導剤への曝露により制御される配列を含む場合がある。
【００４０】
このアプローチを使用して、有効量の外因性誘導剤を投与することによって、全身の新骨形成の刺激を達成する。望ましい骨量が達成されたならば、外因性誘導剤の投与を中止してよい。この方法は、例えば、骨粗鬆症の結果としての骨損失に換わるために、必要に応じて繰り返してよい。
【００４１】
ＨＬＭＰに特異的な抗体は、患者の細胞の骨誘導又は骨形成ポテンシャルをアッセイする方法における使用に特に適していて、骨修復が遅いか又は妨げられるリスク状態の患者を同定する手段を提供する。また、ＨＬＭＰ特異抗体は、例えば、骨粗鬆症のような骨変性疾患のリスク因子を同定するマーカーアッセイにおける使用に適している。
【００４２】
よく知られた慣用法に従って、本発明の遺伝子治療ベクターは、ＬＭＰをコードするポリヌクレオチド配列の、クローニング又は発現ベクターを含んでなる核酸配列への連結により製造する。好ましいベクターは、ＬＭＰのＤＮＡ配列をクローニングして、発現させる手段を提供する。これらの組換えベクターを構築して解析するのに必要とされる方法は、分子生物学の当業者によく知られていて、例えば、Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manial）」第２版、コールドスプリングハーバープレス（1988）、Davis, et al.,「分子生物学の基本方法（Basic Methods in Molecular Biology）」、エルセヴィエ（1986）、及び Ausubel, et al.,「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ウィリー・インターサイエンス（1988）に記載されている。
【００４３】
ＬＭＰ ｃＤＮＡ配列を増幅させる手段を提供するポリメラーゼ連鎖反応は、米国特許第４，８００，１５９号（Mullis, et al.）に記載されている。ＤＮＡ増幅用のキットは市販されていて、限定量の試料よりｃＤＮＡ配列の多数のコピーを製造するのに必要な酵素及び関連試薬を含む。
【００４４】
ＬＩＭ石灰化タンパク質発現ベクターは、骨形成活性を有するＬＩＭ石灰化タンパク質の発現の鋳型を提供する、どのポリヌクレオチド配列を含んでもよい。保守的なアミノ酸置換や、アミノ末端メチオニン残基の出現のような他の修飾も、これらの置換及び修飾が当業者の技量内にあるので、本発明の範囲内にある。
【００４５】
選択される宿主発現系に関連したリボソーム結合部位をキメラＬＭＰコード配列の５’末端へ連結して合成遺伝子を形成して、これを発現ベクターへ挿入することができる。調節可能プロモーター、例えば、大腸菌ｌａｃプロモーターも、キメラコード配列の発現用に提供してよい。他の好適な調節可能プロモーターには、例えば、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７、及びラムダプロモーターが含まれる。
【００４６】
ＬＭＰをコードするＤＮＡは、安定した形質転換体を形成するために、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、又はプロトプラスト融合のような、当業者に知られたどの手段によってレシピエント細胞へトランスフェクトしてもよい。リン酸カルシウム沈殿は、Graham, et al.(Virology, 52, 456 (1973)) の方法によって実施することができる。簡潔に言えば、１００ｍｍディッシュにプレート培養した０．５ｘ１０６個の細胞につき、４０〜５０マイクログラムのＤＮＡのアリコートをサケ精子又はウシ胸腺のＤＮＡを担体として使用する。このＤＮＡを０．５ｍｌの２Ｘ Ｈｅｐｅｓ溶液（２８０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，及び１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．０）と混合して、これへ等量の２ｘＣａＣｌ２（２５０ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．０）を加える。３０〜４０分後に現れる、白い粒状の沈殿を細胞に滴下して均等に分配して、これを３７℃で４〜１６時間インキュベートする。培地を除去し、この細胞をＰＢＳ中１５％グリセロールへ３分間曝露する。グリセロールを除去した後で、１０％胎児ウシ血清を含有するダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）で細胞に給餌する。
【００４７】
ＤＮＡは、Kimura et al. (Virology, 49: 394 (1972)) 及び Sompayrac et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7575 (1981)) のＤＥＡＥ−デキストラン法、Potter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161 (1984)) のエレクトロポレーション法、又は Sandri-Goddin, et al.(Molec. Cell. Biol., 1, 743 (1981)) に記載されるプロトプラスト融合法を使用してトランスフェクトしてもよい。
【００４８】
本発明にはまた、本発明のＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸配列又はそれへの相補配列のいずれにも標準条件下でハイブリダイズする核酸分子が含まれる。「標準ハイブリダイゼーション条件」は、プローブのサイズ、核酸試薬のバックグラウンド及び濃度、並びにハイブリダイゼーションの種類に応じて変動するものである。例えば、in situでは、サザンブロット、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット）を使用することができる。「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定は、当業者の技術レベル内にある。そのような条件は、例えば、米国特許第５，５８０，７７５号（Fremeau, et al.）において、Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975) により、Alwine, et al., Meth. Enzymol., 68: 220 (1979)、及び Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manial）」第２版、コールドスプリングハーバープレス、7.19-7.50（1989）により記載されている。
【００４９】
標準ハイブリダイゼーション条件の１つの好ましいセットは、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ（１５０ｎＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ７．４］，１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５Ｘデンハルト溶液（１００ｍｌの水につき、２０ｍｇ Ｆｏｃｏｌｌ，２０ｍｇ ポリビニルピロリドン、及び２０ｍｇ ＢＳＡ）、１０％硫酸デキストラン、１％ ＳＤＳ、及び１００マイクログラム／ｍｌのサケ精子ＤＮＡにおいて４２℃で２時間のプレハイブリダイゼーションを提供する。３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブを加え、ハイブリダイゼーションを１４時間進行させる。その後、このブロットを２Ｘ ＳＳＰＥ，０．１％ ＳＤＳ（２２℃で２０分間）と０．１Ｘ ＳＳＰＥ，０．１％ ＳＤＳ（６５℃で１時間）で２回洗浄する。次いで、ブロットを乾燥させ、増感スクリーンの存在下にｘ線フィルムへ５日間曝露する。
【００５０】
「高ストリンジェント条件」下で、プローブは、その標的配列へ、この２つの配列が実質的に同一であれば、ハイブリダイズする。標準ハイブリダイゼーション条件と同じように、高ストリンジェント条件は、当業者の特定のハイブリダイゼーション目的に従って決定される。
【００５１】
本発明のひとつの側面によれば、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードする核酸配列を含んでなる単離核酸分子が提供される。本発明による核酸分子は、配列番号２５の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下でハイブリダイズする分子、配列番号２６の全長へ相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする分子、又はその両方へハイブリダイズする分子であり得る。より具体的には、本発明による単離核酸分子は、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−２、又はＨＬＭＰ−３をコードする場合がある。
【００５２】
本発明の別の側面には、上記核酸配列によりコードされるタンパク質が含まれる。なお別の態様において、本発明は、抗ＬＭＰ抗体に基づいて、このようなタンパク質を同定することに関する。この態様では、細胞を溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりタンパク質を分離することによって、ウェスタンブロット分析用にタンパク試料を調製する。タンパク質は、Ausubel, et al.,「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（1987）により記載されるエレクトロブロッティングによりニトロセルロースへ移す。即製の無脂肪乾燥ミルク（１００ｍｌ ＰＢＳ中１ｇｍ）でフィルターを封鎖した後で、このフィルターへ抗ＬＭＰ抗体を加え、室温で１時間インキュベートする。フィルターをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で徹底的に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−抗体コンジュゲートとともに室温で１時間インキュベートする。このフィルターを再びＰＢＳで徹底的に洗浄し、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）を加えることによって抗原バンドを同定する。
【００５３】
単一特異性抗体は、本発明における第一選択の試薬であり、ＬＭＰの発現に関連した特定の特徴を患者の細胞について解析するために特別に使用する。本明細書に使用する「単一特異性抗体」は、ＬＭＰについて均質な結合特性のある１以上の抗体分子種と定義される。本明細書に使用する「均質結合」は、上記に記載するように、ＬＭＰと関連するような、特異抗原又はエピトープへ結合する、抗体種の能力に関連する。ＬＭＰへの単一特異性抗体は、ＬＭＰに対して反応性の抗体を含有する哺乳動物の抗血清より精製するか、又は、Kohler, et al.(Nature, 256, 495-497 (1975) により記載される技術を使用して、ＬＭＰと反応性のモノクローナル抗体として調製する。ＬＭＰ特異抗体は、免疫アジュバントを含むか又は含まない適正濃度のＬＭＰで、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、又はウマのような動物を免疫化することによって産生する。初回の免疫化に先立って、免疫前血清を採取する。約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇのＬＭＰと、所望されるならば、受容される免疫アジュバントを各動物に与える。受容されるアジュバントには、限定されないが、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈降物、Corynebacterium parvum を含有する油中水型エマルジョン、及びｔＲＮＡのアジュバントが含まれる。初回の免疫化は、好ましくは、フロイント完全アジュバント中のＬＭＰを皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、又はその両方で多数の部位に注射することからなる。各動物を一定間隔で、好ましくは週ごとに出血させ、抗体力価を定量する。動物は、初回免疫後に追加免疫注射を受けても受けなくてもよい。追加免疫注射を受ける動物には、一般に、フロイント不完全アジュバント中の等量の抗原を同じ経路で投与する。追加免疫注射は、最高力価が得られるまで、約３週の間隔で与える。それぞれの追加免疫化から約７日後、又は単回免疫化から約１週後に、動物を出血させ、血清を採取し、アリコートを約−２０℃で保存する。
【００５４】
ＬＭＰと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスをＬＭＰで免疫化することによって調製する。上記に記載したように約０．５ｍｌの受容されるアジュバントに取り込んだ等量の緩衝液又は生理食塩水中約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰで、ＩＰ又はＳＣ経路によりこのマウスを免疫化する。フロイント完全アジュバントが好ましい。このマウスは、０日目に初回免疫化を受け、約３〜３０週の間安静にさせる。免疫化マウスに、リン酸緩衝化生理食塩水のような緩衝溶液中約０．１〜約１０ｍｇのＬＭＰの１以上の追加免疫を静脈内（ＩＶ）経路により与える。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ましくは脾臓のリンパ球を、免疫化マウスより脾臓を取り出すことにより、当該技術分野で知られた標準手順によって入手する。この脾臓リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と、安定したハイブリドーマの形成を可能にする条件下に混合することによって、ハイブリドーマ細胞を産生する。融合パートナーには、限定されないが、マウス骨髄腫のＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４、及びＳｐ２／０を含めてよく、Ｓｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞を約１０００の分子量のポリエチレングリコールにおいて、約３０％〜約５０％の濃度で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で知られた手順により、補充ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）でのヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリン（ＨＡＴ）における増殖により選択する。約１４、１８、及び２１日目に増殖陽性ウェルより上清液を採取し、ＬＭＰを抗原として使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。また、オクタロニー沈降アッセイにおいてこの培養液を検査して、ｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェル由来のハイブリドーマ細胞を、MacPherson,（「軟寒天技術：組織培養の方法及び応用（Soft Agar Techniques: Tissue Culture Methods and Applications）」Kruse and Paterson（監修）、アカデミック・プレス（1974）又は Harlow, et al.,「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」コールドスプリングハーバーラボラトリー（1988）により記載される軟寒天技術のような技術によってクローニングする。
【００５５】
モノクローナル抗体は、プリスタンで抗原刺激したＢａｌｂ／ｃマウスに、抗原刺激（priming）から約４日後に、約２ｘ１０６〜約６ｘ１０６のハイブリドーマ細胞のほぼ０．５ｍｌを各マウスに in vivo 注射して産生してもよい。細胞移入後ほぼ８〜１２日目に腹水を採取し、当該技術分野で知られた技術によりモノクローナル抗体を精製する。
【００５６】
抗ＬＭＰ ｍＡｂのin vitro 産生は、約２％の胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭにおいてハイブリドーマ細胞系を増殖させることによって行って、十分量の特異ｍＡｂを入手する。このｍＡｂを当該技術分野で知られた技術により精製する。
【００５７】
腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価は、様々な血清学又は免疫学アッセイによって定量するが、これには、限定されないが、沈降法、受身凝集反応、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）技術、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術が含まれる。同様のアッセイを使用して、体液又は組織及び細胞抽出物中のＬＭＰの存在を検出する。
【００５８】
モノクローナル抗体を産生するための上記の方法を利用して、ＬＭＰ、全長の新生ＬＭＰポリペプチド、又はこれらの変異体又は対立遺伝子体（alleles）に特異的な抗体を産生することができる。
【００５９】
別の態様において、本発明は、ＨＬＭＰ−１の可変スプライス変異体へ向けられる。ヒト心臓ｃＤＮＡのＰＣＲ解析により、ＨＬＭＰ−１配列の塩基対３２５と４４４の間の領域でＨＬＭＰ−１と異なる、２つのＨＬＭＰ可変スプライス変異体（ＨＬＭＰ−２及びＨＬＭＰ−３と命名する）のｍＲＮＡが明らかになった。ＨＬＭＰ−２配列は、この領域に、１１９塩基対の欠失と１７塩基対の挿入を有する。これらの変化はリーディングフレームを保存し、４２３アミノ酸のタンパク質を生じ、これは、ＨＬＭＰ−１に比べて、全体で３４アミノ酸の損失を有する（４０のアミノ酸が欠失して、６つの挿入アミノ酸が加わる）。ＨＬＭＰ−２は、ＨＬＭＰ−１に存在するｃ末端ＬＩＭドメインを含有する。
【００６０】
ＨＬＭＰ−１と比べて、ＨＬＭＰ−３には欠失がないが、同じ１７塩基対の挿入を４４４位に有する。この挿入はリーディングフレームを移動させ、塩基対４５９〜４６１で終止コドンを引き起こす。結果として、ＨＬＭＰ−３は、１５３アミノ酸のタンパク質をコードする。このタンパク質は、ＨＬＭＰ−１及びＨＬＭＰ−２に存在するｃ末端ＬＩＭドメインを欠く。ＨＬＭＰ−２及びＨＬＭＰ−３によりコードされるタンパク質の予測サイズをウェスタンブロット分析により確認した。
【００６１】
この３つのスプライス変異体の組織分布のＰＣＲ分析により、これらが差示的に発現されて、特定のアイソフォームが異なる組織で優勢であることが明らかになった。ＨＬＭＰ−１は、白血球、脾臓、肺、胎盤、及び胎児肝臓において発現される優勢型であるようだ。ＨＬＭＰ−２は、骨格筋、骨髄、及び心臓組織において優勢なアイソフォームであるらしい。しかしながら、ＨＬＭＰ−３は、検査したどの組織でも優勢なアイソフォームではなかった。
【００６２】
二次ラット骨芽細胞培養物におけるＨＬＭＰ−３の過剰発現は、グルココルチコイド（２７２±７）とＨＬＭＰ−１（２３２±２００）で見られる効果に似た、骨結節形成（２８７±５６）を誘導した。ＨＬＭＰ−３はＣ末端ＬＩＭドメインを欠くので、この領域は、骨誘導活性に必要とされない。
【００６３】
しかしながら、ＨＬＭＰ−２の過剰発現は、骨結節形成を誘導しなかった（１１±３）。これらのデータは、欠失される１１９塩基対によりコードされるアミノ酸が骨誘導に必要であることを示す。このデータはまた、ＨＬＭＰスプライス変異体の分布が組織特異的な機能に重要であり得ることを示す。驚くべきことに、発明者は、二次ラット骨芽細胞培養物において、ＨＬＭＰ−２がステロイド誘導性の骨芽細胞形成を阻害することを示した。故に、ＨＬＭＰ−２は、骨形成が望まれない臨床状況において治療有用性を有するかもしれない。
【００６４】
１９９７年７月２２日に、ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰ（これは、インサート１０−４クローン／ＲＬＭＰのある、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ２である）と表記したベクター中の１０−４／ＲＬＭＰの試料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（２０８５２ メリーランド州ロックヴィル、パークローンドライブ、１２３０１）に寄託した。この寄託物の培養受入れ番号は、２０９１５３である。１９９８年３月１９日に、インサートＨＬＭＰ−１のある、ベクターｐＨｉｓ−Ａの試料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。この寄託物の培養受入れ番号は、２０９６９８である。２０００年４月１４日に、プラスミドｐＨＡｈＬＭＰ−２（ヒト心筋ｃＤＮＡよりＨＬＭＰ−２で誘導したｃＤＮＡインサートのあるベクターｐＨｉｓＡ）及びｐＨＡｈＬＭＰ−３（ヒト心筋ｃＤＮＡよりＨＬＭＰ−３で誘導したｃＤＮＡインサートのあるベクターｐＨｉｓＡ）の試料をブタペスト条約の条件の下でＡＴＣＣ（アメリカ、２０１１０−２２０９ バージニア州マナッサス、ユニバーシティＢｌｖｄ．１０８０１）に寄託した。これらの寄託物の受入れ番号は、それぞれＰＴＡ−１６９８とＰＴＡ−１６９９である。これらの寄託物は、ブダペスト条約により要求されるように、ＡＴＣＣにおいて少なくとも３０年間維持されて、それらを開示する特許の許諾に基づいて、公共へ利用可能になる。寄託物が利用可能であることは、政府決定により許諾される特許権の侵害において、本発明を実施する許可を構成与件しないと理解されるべきである。
【００６５】
本発明の核酸、タンパク質、又は抗体を評価するときには、酵素アッセイ、タンパク精製、そして他の慣用の生化学の手法を利用する。ＤＮＡ及びＲＮＡは、それぞれサザンブロッティング及びノーザンブロッティングの技術により分析する。典型的には、分析する試料をゲル電気泳動法によりサイズ分画する。次いで、ゲル中のＤＮＡ又はＲＮＡをニトロセルロース又はナイロンの膜へ移す。次いで、ゲル中の試料パターンの複製物であるブロットをプローブとハイブリダイズさせた。典型的には、プローブは、好ましくは３２Ｐで放射標識するが、当業者に知られた他のシグナル産生分子でプローブを標識してもよい。次いで、オートラジオグラフィーのような検出システムにより、目的の特定バンドを視覚化することができる。
【００６６】
本発明の好ましい態様を例示する目的のために、以下の非限定的な実施例を含める。これらの結果は、本発明のＬＩＭ石灰化タンパク質と、これらのタンパク質をコードする単離核酸分子を使用して骨形成を誘導するか又は亢進させることの実施可能性を実証する。
【実施例】
【００６７】
実施例１：頭蓋冠細胞の培養
ラット骨芽細胞（「ＲＯＢ」）としても知られるラット頭蓋冠細胞を、Boden, et al., (Endocrinology, 137, 8, 3401-3407 (1996)) により既に記載されたように、分娩前２０日のラットより入手した。一次培養物を集密状態にまで増殖させ（７日）、トリプシン処理し、一次継代培養細胞として６ウェルプレートへ移した（１ｘ１０５細胞／３５ｍｍウェル）。０日目で集密していた継代培養細胞を、さらに７日間増殖させた。０日目に開始して、培地を交換し、処理薬（Ｔｒｍ及び／又はＢＭＰ）を３又は４日ごとに層流フード下で適用した。標準の培養プロトコールは以下の通りであった：１〜７日目、ＭＥＭ，１０％ ＦＢＳ，５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸、±刺激；８〜１４日目、ＢＧＪｂ培地、１０％ ＦＢＳ，５ｍＭ β−ＧｌｙＰ（石灰化を可能にするための無機リン酸の供給源として）。１４日目に、骨結節形成及びオステオカルシン分泌のエンドポイント分析を実施した。この系において、試験したすべてのＢＭＰについての用量応答曲線に対して中間範囲の効果を実証したパイロット実験に基づいて、ＢＭＰの用量を５０ｎｇ／ｍｌと選択した。
【００６８】
実施例２：アンチセンス処理と細胞培養
膜様の骨形成時におけるＬＭＰ−１の潜在的な機能上の役割を探究するために、我々は、ＬＭＰ−１ ｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、グルココルチコイドにより始動される分化を受けている二次骨芽細胞培養物を処理した。ＲＬＭＰ発現の阻害は、推定の翻訳開始部位が含まれる２５塩基対配列（配列番号４２）に対応する高特異性のアンチセンスオリゴヌクレオチド（既知のラット配列に対して有意な相同性がない）を用いて達成した。対照培養物にはオリゴヌクレオチドも与えなかったか、又はそれらにはセンスオリゴヌクレオチドを与えた。リポフェクタミンの存在下（プレインキュベーション）及び非存在下で実験を行なった。簡潔に言えば、２２μｇのセンス又はアンチセンスＲＬＭＰオリゴヌクレオチドを、ＭＥＭにおいて室温で４５分間インキュベートした。そのインキュベーションに続き、さらにＭＥＭ又はプレインキュベートしたリポフェクタミン／ＭＥＭ（７％ ｖ／ｖ；室温で４５分間インキュベートした）のいずれかを加え、０．２μＭのオリゴヌクレオチド濃度を達成した。生じる混合物を室温で１５分間インキュベートした。次いで、ＭＥＭ／アスコルビン酸塩／±Ｔｒｍとオリゴヌクレオチド混合物を混合して、０．１μＭの最終オリゴヌクレオチド濃度を達成した。
【００６９】
適正なオリゴヌクレオチドの存在又は非存在下に細胞を培地（±刺激）とともにインキュベートした。はじめにリポフェクタミンとインキュベートした培養物は、４時間のインキュベーション（３７℃；５％ ＣＯ２）の後で、リポフェクタミンもオリゴヌクレオチドも含有しない培地で再給餌した。培養物を２４時間ごとに給餌することによって、オリゴヌクレオチドレベルを維持した。
【００７０】
ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ−６オリゴヌクレオチドで見られる効果と同様に、石灰化した結節形成とオステオカルシンを用量依存的なやり方で阻害した。ＢＭＰ−６アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害がＢＭＰ−６の添加で逆転されるのに対し、この骨芽細胞分化におけるＬＭＰ−１アンチセンスの遮断は、外因性ＢＭＰ−６の添加によりレスキューすることができず、骨芽細胞の分化経路において、ＬＭＰ−１がＢＭＰ−６に対して上流位置にあることが確かめられた。ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、一次ラット骨芽細胞培養物において自発的な骨芽細胞分化を阻害した。
【００７１】
実施例３：石灰化骨結節形成の定量
実施例１及び２に従って調製したＲＯＢの培養物を、７０％エタノール中で一晩固定して、ホン・コッサ銀染色で染色した。半自動コンピュータ化ビデオ画像解析システムを使用して、各ウェル中の結節数及び結節面積を定量した（Boden, et al., Endocrinology, 137, 8, 3401-3407 (1996)）。次いで、これらの数値を使用して、結節あたりの面積の数値を計算した。この自動化法をマニュアル計数技術に対して検証すると、０．９２の相関係数（ｐ＜０．０００００１）を示した。すべてのデータは、各条件で５又は６のウェルより計算する、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表す。各実験は、様々な頭蓋冠調製物由来の細胞を使用して、少なくとも２回繰り返した。
【００７２】
実施例４：オステオカルシン分泌の定量
Nanes, et al. (Endocrinology, 127: 588 (1990)) に記載のように、ラットオステオカルシンのＣ末端ノナペプチドに対して発明者が産生した単一特異性ポリクローナル抗体（Ｐａｂ）での競合ラジオイムノアッセイを使用して、培養基中のオステオカルシンレベルを測定した。簡潔に言えば、１マイクログラムのノナペプチドをラクトペルオキシダーゼ法により１ｍＣｉの１２５Ｉ−Ｎａでヨウ素化した。２００ｇｌのアッセイ緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００１％チメロサール、０．０２５％ ＢＳＡ）を含有する試験管に、細胞培養物より採取した培地、又はオステオカルシニン標準品（０〜１２，０００フェムトモル）をアッセイ緩衝液中１００ｇｌ／管で入れた。次いで、Ｐａｂ（１：４０，０００；１００マイクロリットル）に続き、ヨウ素化ペプチド（１２，０００ｃｐｍ；１００マイクロリットル）を加えた。非特異結合を試験する試料も同様に調製したが、抗体を含めなかった。
【００７３】
７００マイクロリットルのヤギ抗ウサギＩｇＧの添加に続く、４℃で１８時間のインキュベーションによって、結合ＰＡｂと非結合（フリー）ＰＡｂを分離した。すべての試料を１２００ｒｐｍで４５分間遠心分離した後、上清をデカントし、沈殿をγ−計数管で計数した。オステオカルシン値をフェムトモル／１００マイクロリットルで報告してから、この値を１００で割ることによって、培地１ｍｌあたりのピコモル数（３日目の産生）へ変換した。数値は、各条件につき５〜６ウェルの同一３検体定量の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。各実験は、異なる頭蓋冠調製物由来の細胞を使用して、少なくとも２回で確認した。
【００７４】
実施例５：Ｔｒｍ及びＲＬＭＰの in vitro 石灰化に及ぼす効果
非刺激細胞培養系における骨結節の産生全体に対しては、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれも明瞭な効果がほとんどなかった。しかしながら、ＲＯＢをＴｒｍで刺激するとき、ＲＬＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、結節の石灰化を＞９５％阻害した。このオリゴヌクレオチド処理培養物へ外因性ＢＭＰ−６を加えても、ＲＬＭＰ−アンチセンス−処理結節の石灰化をレスキューしなかった。
【００７５】
オステオカルシンは、長いこと、骨石灰化と同義とされていて、オステオカルシンレベルが結節の産生及び石灰化と関連づけられてきた。ＲＬＭＰ−アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オステオカルシン産生を有意に減少させるが、アンチセンス処理培養物における結節数は有意に変化していない。この事例では、外因性ＢＭＰ−６の添加だけが、ＲＬＭＰ−アンチセンス−処理培養物におけるオステオカルシン産生を１０〜１５％レスキューした。このことは、ＲＬＭＰの作用がＢＭＰより下流にあって、より特異的であることを示唆する。
【００７６】
実施例６：ＲＮＡの採取及び精製
４Ｍイソチオシアン酸グアニジン（ＧＩＴ）溶液を使用して、ＲＯＢ（実施例１及び２に従って、６ウェル培養皿において調製した）の同一２検体ウェルより細胞ＲＮＡを採取して、統計上の同一３検体を得た。簡潔に言えば、培養上清をウェルより吸引し、次いでこれに同一２検体ウェル採取につき０．６ｍｌのＧＩＴ溶液を載せた。ＧＩＴ溶液を加えた後で、プレートを５〜１０秒間揺り動かした。試料は−７０℃に保存して、７日以内にさらに処理した。
【００７７】
Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manial）」７．１９章、第２版、コールドスプリングハーバープレス（1989）による標準法のわずかな変更により、ＲＮＡを精製した。簡潔に言えば、融解した試料に６０マイクロリットルの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０マイクロリットルのフェノール（水飽和）、及び１５０マイクロリットルのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を加えた。激しく撹拌した後で、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分；４℃）、水相を新鮮な試験管へ移し、６００マイクロリットルのイソプロパノールを加え、ＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。
【００７８】
この一晩のインキュベーションに続き、試料を遠心分離して（１００００ｘｇ；２０分）、上清を穏やかに吸引した。ペレットを４００マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０マイクロリットルの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）と１．０ｍｌの無水エタノールの添加後、−２０℃で一晩沈殿させた。細胞ＲＮＡを回収するために、試料を遠心分離して（１００００ｘｇ；２０分）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間空気乾燥させ、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。分光光度測定法により定量される光学密度よりＲＮＡ濃度を算出した。
【００７９】
実施例７：逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応
加熱した全ＲＮＡ（全量１０．５マイクロリットルのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５マイクログラム、６５℃で５分間）を、４マイクロリットルの５Ｘ ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２マイクロリットルのｄＮＴＰ、２マイクロリットルのｄＴ１７プライマー（１０ピコモル／ｍｌ）、０．５マイクロリットルのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）、及び１マイクロリットルのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／マイクロリットル）を含有する試験管へ加えた。３７℃で１時間、次いで９５℃で５分間試料をインキュベートして、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活性化した。次いで、８０マイクロリットルの水の添加により試料を希釈した。
【００８０】
逆転写した試料（５マイクロリットル）を、標準法（全量５０マイクロリットル）を使用するポリメラーゼ連鎖反応へ処した。簡潔に言えば、水と適正量のＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）及び／又はＢＭＰ用のフォワード（forward）及びリバース（reverse）プライマー、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、及びＴａｑポリメラーゼを含有する試験管へ加えた。他に断らなければ、プライマーは、２２サイクル（９４℃，３０”；５８℃，３０”；７２℃，２０”）で確実に作動するように標準化した。
【００８１】
実施例８：ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）及びＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ解析によるＲＴ−ＰＣＲ産物の定量
ＲＴ−ＰＣＲ産物に５マイクロリットル／試験管のローディング色素を加え、混合し、６５℃で１０分間加熱し、遠心分離した。各反応物より１０マイクロリットルの試料を標準条件下でＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド：ビス；１５Ｖ／ウェル；一定の電流）へ処した。次いで、ゲルをゲル保存緩衝液（１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、７％（ｖ／ｖ）酢酸、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、４３％脱イオン水）において３０分間インキュベートし、真空（８０℃）で１〜２時間乾燥させ、電子増強リン光造影システムで６〜２４時間発色させた。可視化バンドを解析した。バンドあたりのカウント数をグラフにプロットした。
【００８２】
実施例９：差示ディスプレイＰＣＲ
グルココルチコイド（Ｔｒｍ，１ｎＭ）で刺激した細胞よりＲＮＡを抽出した。加熱してＤＮアーゼ処理した全ＲＮＡ（全量１０．５マイクロリットルのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５マイクログラム、６５℃で５分間）を実施例７に記載のように逆転写したが、ＭＭＬＶ−ＲＴプライマーとしては、Ｈ−Ｔ１１Ｍ（配列番号４）を使用した。生じるｃＤＮＡを上記のようにＰＣＲ増幅したが、様々な市販のプライマーセット（例えば、Ｈ−Ｔ１１Ｇ（配列番号４）、及びＨ−ＡＰ−１０（配列番号５）；ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社、テネシー州ナッシュビル）を用いた。放射標識されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定ゲル上でのゲル電気泳動により分画した。電気泳動の後で、生じるゲルを真空で乾燥させ、オートラジオグラフを一晩露出した。差示的に発現されたｃＤＮＡを表すバンドをゲルから切り出し、Conner, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 278 (1983)) に記載される方法を使用してＰＣＲにより再増幅させた。ＰＣＲ再増幅の産物をベクターＰＣＲ−１１（ＴＡクローニングキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）へクローニングした。
【００８３】
実施例１０：ＵＭＲ１０６ラット骨肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＵＭＲ１０６ライブラリー（２．５ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を寒天プレート（ＬＢ寒天ボトム）上に５ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌでプレートし、このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。フィルター膜をプレート上に２分間載せた。このフィルターを、取り出してすぐに変性させ、濯ぎ、乾燥させて、ＵＶで架橋連結させた。次いで、このフィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液（２ＸＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］，５％ホルムアルデヒド、１％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ）において４２℃で２時間インキュベートした。ハイブリダイゼーションミックス／フィルター全体へ２６０塩基対の放射標識プローブ（配列番号３；ランダムプライミングによる３２Ｐ標識化）を加え、４２℃で１８時間のハイブリダイゼーションを続けた。この膜を室温で１回（１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳで１０分）、５５℃で３回（０．１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳで１５分）洗浄した。
【００８４】
この膜を洗浄後、それらを上記のようにオートラジオグラフィーにより解析した。陽性クローンをプラーク精製した。この手順を第二のフィルターで４分間繰り返して、偽陽性クローンを最少にした。プラーク精製したクローンをラムダＳＫ（−）ファージミドとしてレスキューした。クローニングしたｃＤＮＡを以下に記載のように配列決定した。
【００８５】
実施例１１：クローンの配列決定
クローニングしたｃＤＮＡインサートを標準法により配列決定した。簡潔に言えば、適正濃度の終止混合物、鋳型、及び反応混合物を適正なサイクル処理プロトコール（９５℃，３０秒；６８℃，３０秒；７２℃，６０秒；ｘ２５）へ処した。停止混合物を加えて、配列決定反応を終止させた。９２℃で３分間加熱後、試料を変性６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル（２９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上へロードした。試料を６０ボルト、定電流で約４時間電気泳動した。電気泳動後、ゲルを真空で乾燥させて、オートラジオグラフ処理した。
【００８６】
このオートラジオグラフをマニュアルで解析した。生じる配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＩＨ，メリーランド州ベセスダ；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により維持されているデータベースに対して、デフォルト変数で設定したＢＬＡＳＴＩＮプログラムを使用してスクリーニングした。この配列データに基づいて、新しい配列決定プライマーを製造し、この方法を繰り返して、遺伝子全体を配列決定した。両方の配向で少なくとも３回すべての配列を確認した。
【００８７】
ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（バージョン１６．０）を使用して、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列も解析した。ヌクレオチド配列についての相同性百分率値を、以下の変数を使用するプログラムＮＡＬＩＧＮにより計算した：非適合ヌクレオチドの重み、１０；非適合ギャップの重み、１０；考慮するヌクレオチドの最大数、５０；及び、考慮するヌクレオチドの最小数、５０。
【００８８】
アミノ酸配列については、ＰＡＬＩＧＮを使用して相同性百分率値を計算した。オープンギャップコストとユニットギャップコストについて、ともに１０の数値を選択した。
実施例１２：ＲＬＭＰ ｃＤＮＡのクローニング
実施例９に記載する差示ディスプレイＰＣＲ増幅産物は、ほぼ２６０塩基対のメジャーバンドを含んでいた。この配列を使用して、ラット骨肉腫（ＵＭＲ １０６）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを入れ子プライマー解析へ処して、全長ｃＤＮＡを増幅するのに必要なプライマー配列（配列番号１１、１２、２９、３０及び３１）を得た。さらなる試験用に選択したこれら陽性クローンの１つをクローン１０−４と命名した。
【００８９】
入れ子プライマー解析により決定した、クローン１０−４中の全長ｃＤＮＡの配列解析は、クローン１０−４が差示ディスプレイＰＣＲにより同定される、元の２６０塩基対の断片を含有することを示した。クローン１０−４（１６９６塩基対；配列番号２）は、４５７のアミノ酸（配列番号１）を有するタンパク質をコードする１３７１塩基対のオープンリーディングフレームを含有する。終止コドン、ＴＧＡは、ヌクレオチド１４４４−１４４６に出現する。ヌクレオチド１６７５〜１６８０と隣接のポリ（Ａ）＋テールにあるポリアデニル化シグナルが３’非コード領域に存在した。配列番号１のアミノ酸位置１１３〜１１６及び２５７〜２５９に、２つの潜在的なＮ−グリコシル化部位、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ及びＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒがそれぞれあった。アミノ酸位置１９１及び３４９に２つの潜在的なｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、Ｓｅｒ及びＴｈｒがそれぞれ見出された。アミノ酸位置３、１１５、１６６、２１９、４４２に５つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位、Ｓｅｒ又はＴｈｒがあった。アミノ酸位置２７２〜２７９に、１つの潜在的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ−ループ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒを決定した。
【００９０】
さらに、アミノ酸位置３４１〜３９１及び４００〜４５１に、２つの高度に保存された推定ＬＩＭドメインを見出した。この新たに同定されたラットｃＤＮＡクローン中の推定ＬＩＭドメインは、他の既知のＬＩＭタンパク質のＬＩＭドメインとかなりの相同性を示した。しかしながら、他のラットＬＩＭタンパク質との全体的な相同性は、２５％未満であった。ＲＬＭＰ（１０−４とも表記される）は、ヒトの不明（enigma）タンパク質に７８．５％のアミノ酸相同性を有する（米国特許第５，５０４，１９２号を参照のこと）が、最も近縁のラット相同体、ＣＬＰ−３６及びＲＩＴ−１８には、それぞれ２４．５％及び２２．７％のアミノ酸相同性しか有さない。
【００９１】
実施例１３：ＲＬＭＰ発現のノーザンブロット分析
実施例１及び２に従って調製した、ＲＯＢ由来の３０マイクログラムの全ＲＮＡを１％アガロース平板ゲルにおけるホルムアルデヒドゲル電気泳動によりサイズ分画し、ナイロン膜へ浸透圧でトランスブロットした。このブロットを、ランダムプライミングにより３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した全長１０−４ ｃＤＮＡの６００塩基対ＥｃｏＲＩ断片でプローブした。
【００９２】
ノーザンブロット分析は、ＲＬＭＰプローブとハイブリダイズする１．７ｋｂのｍＲＮＡ種を示した。ＲＬＭＰ ｍＲＮＡは、ＢＭＰ−６への曝露後２４時間のＲＯＢにおいてほぼ３．７倍アップレギュレートされていた。ＢＭＰ−２又はＢＭＰ−４で刺激したＲＯＢでは、２４時間後にＲＭＬＰ発現のアップレギュレーションは認められなかった。
【００９３】
実施例１４：統計学的手法
それぞれ報告される結節／オステオカルシンの結果について、代表的な実験からの５〜６ウェルのデータを使用して、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を計算した。各変数について最大値に正規化したデータでグラフを示して、結節数、石灰化面積、及びオステオカルシンの同時グラフ化を可能にすることができる。
【００９４】
それぞれ報告されるＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、又はウェスタンブロット分析について、代表的な実験の同一３検体試料からのデータを使用して、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を決定した。グラフは、０日目又は陰性対照のいずれかに正規化して示しても、対照値を超える増加倍率として表してもよい。
【００９５】
Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後多重比較補正の片側分散分析を適宜使用して、統計学的有意差を評価した（D. V. Huntsberger,「分散分析、統計分散の要素（The Analysis of Variance, Elements of Stastical Variance）」P. Billingsley（監修）Ａｌｌｙｎ ＆ Ｂａｃｏｎ社、マサチューセッツ州ボストン、298-330（1977）及び SigmaStat, Jandel Scientific, カリフォルニア州コルテ・マデラ）。有意差のα水準は、ｐ＜０．０５と定義した。
【００９６】
実施例１５：ウェスタンブロット分析によるラットＬＩＭ石灰化タンパク質の検出
England, et al. (Biochim. Biophys. Acta, 623, 171 (1980)) 及び Timmer, et al.,(J. Biol. Chem., 268, 24863 (1993)) の方法に従って、ポリクローナル抗体を調製した。
【００９７】
ヒーラ細胞をｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞より、Hair, et al. (Leukemia Research, 20, 1 (1996)) の方法に従って、タンパク質を採取した。ネイティブＲＬＭＰのウェスタンブロット分析を Towbin, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350 (1979)) に記載されるように実施した。
【００９８】
実施例１６：ラットＬＭＰユニーク（ＲＬＭＰＵ）由来ヒトＰＣＲ産物の合成
ラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの配列に基づいて、フォワード及びリバースのＰＣＲプライマー（配列番号１５及び１６）を合成し、ユニークな２２３塩基対配列をラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡよりＰＣＲ増幅した。同じＰＣＲプライマーで、ヒトＭＧ６３骨肉腫細胞のｃＤＮＡより類似のＰＣＲ産物を単離した。
【００９９】
Ｔ−７５フラスコにおいて増殖させたＭＧ６３骨肉腫細胞よりＲＮＡを採取した。培養上清を吸引により除去し、フラスコに３．０ｍｌのＧＩＴ溶液を同一２検体で載せて、５〜１０秒間渦状に振り、生じる溶液を１．５ｍｌエッペンドルフ管へ移した（０．６ｍｌ／管で６つの管）。標準法（Sambrook, et al.,「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manial）」７章１９頁、コールドスプリングハーバープレス（1989）及びBoden, et al., Endocrinology, 138, 2820-2828 (1997) のわずかな変更によってＲＮＡを精製した。簡潔に言えば、０．６ｍｌの試料に６０マイクロリットルの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０マイクロリットルの水飽和フェノール、及び１５０マイクロリットルのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を加えた。これらの試薬の添加後、試料を激しく撹拌し、遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分；４℃）、水相を新鮮な管へ移した。イソプロパノール（６００マイクロリットル）を加え、ＲＮＡを一晩−２０℃で沈殿させた。この試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分）、上清を穏やかに吸引した。ペレットを４００マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁させ、フェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０マイクロリットルの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）と１．０ｍｌの無水エタノールにおいて−２０℃で一晩沈殿させた。沈殿後、試料を遠心分離し（１００００ｘｇ；２０分）、７０％エタノールで１回洗浄し、５〜１０分間空気乾燥させ、２０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水に再懸濁させた。ＲＮＡ濃度を光学密度より導いた。
【０１００】
全ＲＮＡ（全量１０．５マイクロリットルのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ中５マイクログラム）を６５℃で５分間加熱してから、４マイクロリットルの５Ｘ ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２マイクロリットルのｄＮＴＰ、２マイクロリットルのｄＴ１７プライマー（１０ピコモル／ｍｌ）、０．５マイクロリットルのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）、及び１マイクロリットルのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／マイクロリットル）を含有する試験管へ加えた。この反応物を３７℃で１時間インキュベートした。その後、９５℃で５分間加熱することによって、ＭＭＬＶ−ＲＴを不活性化した。８０マイクロリットルの水の添加により試料を希釈した。
【０１０１】
転写する試料（５マイクロリットル）を、Boden, et al., (Endocrinology, 138, 2820-2828 (1997)) 及び Ausubel, et al.,（ポリメラーゼ連鎖反応による希少ＤＮＡの定量（Quantitation of Rare DNAs by the Polymerase Chain Reaction）「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」１５章３１−１、ウィリー・アンド・サンズ、ニュージャージー州トレントン（1990）に記載されるような標準法（全量５０マイクロリットル）を使用するポリメラーゼ連鎖反応へ処した。簡潔に言えば、水と適正量のＰＣＲ緩衝液（２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、フォワード及びリバースプライマー（ＲＬＭＰＵでは；配列番号１５及び１６））、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを加えた。プライマーは、放射活性バンド検出用の２２サイクルとスクリーニングプローブとして使用のＰＣＲ産物の増幅用の３３サイクルで確実に作動するように設計した（９４℃，３０秒；５８℃，３０秒；７２℃，２０秒）。
【０１０２】
アガロースゲル精製したＭＧ６３骨肉腫由来ＰＣＲ産物の配列決定により、ＲＬＭＰＵ ＰＣＲ産物に９５％より多く相同な配列を得た。この配列をＨＬＭＰユニーク領域（ＨＬＭＰＵ；配列番号６）と命名する。
【０１０３】
実施例１７：逆転写酵素由来ＭＧ６３ ｃＤＮＡのスクリーニング
実施例７に記載のような特定プライマー（配列番号１６及び１７）を使用して、ＰＣＲでスクリーニングを実施した。７１７塩基対のＭＧ６３ ＰＣＲ産物をアガロースゲル精製して、所与のプライマー（配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２７、及び２８）で配列決定した。両方向に少なくとも２回で配列を確定した。このＭＧ６３配列を互いに対して、次いで全長ラットＬＭＰ ｃＤＮＡ配列に対して並置して、部分的なヒトＬＭＰ ｃＤＮＡ配列（配列番号７）を得た。
【０１０４】
実施例１８：ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ノーザンブロット実験に基づいて、ヒト心臓筋肉が含まれる、いくつかの異なる組織によって異なるレベルでＬＭＰ−１が発現されることが判明した。故に、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーを試験した。このライブラリーを寒天プレート（ＬＢ寒天ボトム）上に５ｘ１０４ｐｆｕ／ｍｌでプレートし、プレートを３７℃で一晩増殖させた。フィルター膜をプレート上に２分間載せた。その後で、このフィルターを変性させ、濯ぎ、乾燥させて、ＵＶで架橋連結させ、プレハイブリダイゼーション緩衝液（２ＸＰＩＰＥＳ［ｐＨ６．５］；５％ホルムアルデヒド、１％ ＳＤＳ、１００ｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ）において４２℃で２時間インキュベートした。放射標識化、ＬＭＰユニークの２２３塩基対プローブ（３２Ｐ、ランダムプライマー標識化；配列番号６）を加え、４２℃で１８時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続き、この膜を室温で１回（１０分、１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ）、５５℃で３回（１５分、０．１ｘＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ）洗浄した。製造業者のプロトコール（ストラタジーン、カリフォルニア州ラホヤ）に従って、オートラジオグラフィーにより同定した、二重陽性のプラーク精製した心臓ライブラリークローンをラムダファージミドとしてレスキューした。
【０１０５】
陽性クローンの制限消化物より、様々なサイズのｃＤＮＡインサートを生じた。長さが６００塩基対より大きいインサートを配列決定による初回スクリーニング用に選択した。これらのインサートを、実施例１１に記載されるような標準法によって配列決定した。
【０１０６】
１つのクローン、７番はまた、配列番号１１〜１４、１６、及び２７に対応するプライマーを使用する自動化配列解析へ処した。これらの方法により得られた配列は、定常的に９７〜１００％相同であった。クローン７（心臓ライブラリー由来の部分ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ；配列番号８）は、翻訳領域において、ラットＬＭＰ ｃＤＮＡ配列に８７％より多く相同である配列を含有した。
【０１０７】
実施例１９：全長ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの決定
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ配列とヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列の重複領域を使用して、これら２つの配列を並置して、１６４４塩基対の完全なヒトｃＤＮＡ配列を導いた。ＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥソフトウェアパッケージのプログラム）を使用して、この２つの配列を並置した。この２つの配列の重複領域は、ＭＧ６３ ｃＤＮＡ（配列番号７）中のヌクレオチド６７２での単一ヌクレオチド置換を除いて完全な相同性を有するほぼ３６０塩基対を構成し、クローン７は、対応するヌクレオチド５１６で「Ｇ」の代わりに「Ａ」を有した（配列番号８）。
【０１０８】
ＭＧ６３骨肉腫ｃＤＮＡクローンの「Ｇ」置換を使用して、ＳＥＱＩＮ（ＰＣＧＥＮＥの別のサブプログラム）を使用して、この２つの並置配列を結びつけた。生じる配列を配列番号９に示す。この新規のヒト由来配列のラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡとの並置をＮＡＬＩＧＮで達成した。この全長ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ配列（配列番号９）は、ラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ配列の翻訳部分に対して８７．３％相同である。
【０１０９】
実施例２０：ヒトＬＭＰ−１のアミノ酸配列の決定
ヒトＬＭＰ−１の推定アミノ酸配列をＰＣＧＥＮＥサブプログラムのＴＲＡＮＳＬで決定した。配列番号９中のオープンリーディングフレームは、４５７のアミノ酸（配列番号１０）を含んでなるタンパク質をコードする。ＰＣＧＥＮＥサブプログラムのＰａｌｉｇｎを使用して、ヒトＬＭＰ−１アミノ酸配列がラットＬＭＰ−１アミノ酸配列に対して９４．１％相同であることを見出した。
【０１１０】
実施例２１：ヒトＬＭＰ ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の決定
ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）プロトコールを使用して、ＭＧ６３の全ＲＮＡの入れ子ＲＴ−ＰＣＲによって、ＭＧ６３の５’ｃＤＮＡを増幅した。この方法には、３’末端に２つの縮重ヌクレオチド位置があるロックドッキング（lock-docking）オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用する第一鎖ｃＤＮＡ合成が含まれた（Chenchik, et al., CLONTECHniques, X:5 (1995）；Borson et al., PC Methods Applic., 2, 144 (1993))。第二鎖合成は、Gubler, et al. (Gene, 2, 263 (1983)) の方法に従って、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮアーゼＨ、及び大腸菌ＤＮＡリガーゼのカクテルで実施した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでの平滑末端の創出後、二本鎖ｃＤＮＡを断片（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’）（配列番号１９）へ連結した。ＲＡＣＥに先立って、アダプター連結ｃＤＮＡをＭａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ反応に適した濃度へ希釈した（１：５０）。次いで、アダプター連結二本鎖ｃＤＮＡを特異的にクローニングされるように用意した。
【０１１１】
センスプライマーとしてのアダプター特異的オリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（ＡＰＩ）（配列番号２０）と実施例１６に記載したユニーク領域（ＨＬＭＰＵ）由来の遺伝子特異プライマー（ＧＳＰ）を用いて、第一ラウンドのＰＣＲを実施した。入れ子プライマーのＧＳＰ１−ＨＬＭＰＵ（アンチセンス／リバースプライマー）（配列番号２３）及びＧＳＰ２−ＨＬＭＰＵＦ（配列番号２４）（実施例１６を参照のこと；センス／フォワードプライマー）を使用して、第二ラウンドのＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、抗体仲介性であるが他の点では標準のホットスタート（hot-start）プロトコールを利用する市販キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲコアキット；ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州パロアルト）を使用して実施した。ＭＧ６３ ｃＤＮＡのＰＣＲ条件には、初回のホットスタート変性（９４℃，６０秒）に続く、９４℃，３０秒；６０℃，３０秒；６８℃，４分；３０サイクルが含まれた。入れ子ＰＣＲ産物がほぼ２３０塩基対であるのに対し、第一ラウンドＰＣＲ産物は、ほぼ７５０塩基対の長さであった。この第一ラウンドＰＣＲ産物を線状化ｐＣＲ２．１ベクター（３．９Ｋｂ）中へクローニングした。Ｍ１３フォワード及びリバースプライマー（配列番号１１；配列番号１２）を使用して、このインサートを両方向で配列決定した。
【０１１２】
実施例２２：５’ＵＴＲ付き全長ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡの決定
重複しているＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ ５’−ＵＴＲ配列（配列番号２１）、ＭＧ６３ ７１７塩基対配列（実施例１７；配列番号８）、及びヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列（実施例１８）を並置して、１７０４塩基対の新規ヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２２）を導いた。この並置は、ＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥとＯｍｉｇａ １．０の両方；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）で達成した。重複配列は、全７１７塩基対領域（実施例１７）のほとんどを１００％相同性で構成した。並列配置の結合は、ＳＥＱＩＮで達成した。
【０１１３】
実施例２３：ＬＩＭタンパク質発現ベクターの構築
実施例１７及び１８に記載される配列で、ｐＨＩＳ−５ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの構築を行った。７１７塩基対クローン（実施例１７；配列番号７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。小断片（約２５０塩基対）をゲル精製した。クローン７（実施例１８；配列番号８）をＣｌａＩ及びＸｂａＩで消化して、１４００塩基対断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対の制限断片を連結させて、約１６５０塩基対の断片を形成した。
【０１１４】
クローン７における単一ヌクレオチド置換（７１７塩基対ＰＣＲ配列と元のラット配列に関して）により、翻訳される塩基対６７２のところに終止コドンが生じた。この終止コドンのために、ＬＭＰ−１ｓという名称の末端切断（短い）タンパク質がコードされた。これは、発現ベクター（配列番号３２）において使用される構築体であった。配列番号３２の５’ＲＡＣＥ配列（配列番号２１）との並置により、５’ＵＴＲ付きの全長ｃＤＮＡ配列（配列番号３３）を創出した。次いで、ＬＭＰ−１ｓのアミノ酸配列（配列番号３４）を２２３アミノ酸のタンパク質として演繹して、ウェスタンブロットにより（実施例１５におけるように）、約２３．７ｋＤの予測分子量で泳動することを確かめた。
【０１１５】
このｐＨｉｓ−ＡＴＧベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。このベクターを回収してから、６５０塩基対の制限断片を線状化ｐＨｉｓ−ＡＴＧ中へ連結した。この連結産物をクローニングして、増幅した。ｐＨｉｓ−ＡＴＧ−ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（インサートＨＬＭＰ−１ｓ付きｐＨＩＳ−Ａとも表記される）を標準法により精製した。
【０１１６】
実施例２４：ＬＭＰ発現ベクターでの骨結節形成及び石灰化のin vitro 誘導
実施例１に従って、ラット頭蓋冠細胞を単離し、二次培養において増殖させた。培養物は、実施例１に記載されるように、非刺激であるか、又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激した。実施例２５に従って、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）トランスフェクションプロトコールの変法を使用して、各ベクターの３マイクログラム／ウェルを二次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養物へトランスフェクトした。
【０１１７】
実施例３に記載されるように、ホン・コッサ染色により石灰化結節を視覚化した。ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現だけで、骨結節形成（約２０３結節／ウェル）を in vitro で誘導した。結節のレベルは、ＧＣ陽性対照（約４１２結節／ウェル）により誘導されるもののほぼ５０％であった。他の陽性対照には、ｐＨｉｓ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（約１５２結節／ウェル）とｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ発現ベクター（約２０６結節／ウェル）が含まれ、一方、陰性対照には、ｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖ発現ベクター（約２結節／ウェル）と非処理（ＮＴ）プレート（約４結節／ウェル）が含まれた。これらのデータは、このヒトｃＤＮＡがラットｃＤＮＡと少なくとも同じくらい骨誘導性であったことを証明する。この効果は、ＧＣ刺激で観察されるものより小さかったが、最も可能性があるのは、発現ベクターの最適下限用量のためであろう。
【０１１８】
実施例２５：in vitro 及び in vivo でのＬＭＰ誘導性の細胞分化
クローン１０−４（実施例１２を参照のこと）中のラットＬＭＰ ｃＤＮＡをＮｏｔＩ及びＡｐａＩでの３７℃で一晩の二重消化により、このベクターより切り出した。ベクターのｐＣＭＶ２ ＭＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）を同じ制限酵素で消化した。クローン１０−４及びｐＣＭＶ２由来の線状ｃＤＮＡ断片をともにゲル精製し、抽出し、Ｔ４リガーゼで連結した。この連結ＤＮＡをゲル精製し、抽出し、増幅用の大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換するのに使用した。陽性の寒天コロニーを選択し、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化し、この制限消化物をゲル電気泳動法により検証した。陽性クローンよりストック培養物を調製した。
【０１１９】
使用する制限酵素がＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩであること以外は類似の形式で、リバースベクターを調製した。これらの制限酵素を使用したので、クローン１０−４由来のＬＭＰ ｃＤＮＡ断片は、ｐＲｃ／ＣＭＶ２中へ逆の（即ち、翻訳不能な）配向で挿入された。この産生した組換えベクターをｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと命名した。
【０１２０】
適正量のｐＣＭＶ１０−４（６０ｎＭの最終濃度［３マイクログラム］が最適である；この実験には、０〜６００ｎＭ／ウェル［０〜３０マイクログラム／ウェル］の範囲の最終濃度が好ましい）を最少イーグル培地（ＭＥＭ）に再懸濁させて４５０マイクロリットルの最終容量として、１０秒間激しく撹拌した。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを加え（７．５マイクロリットル／ｍｌの最終濃度）、この溶液を１０秒間激しく撹拌してから、室温で１０分間インキュベートした。このインキュベーションに続き、１０％ ＦＢＳを補充したＭＥＭ（１ｍｌ／ウェル；６ｍｌ／プレート）を加え、ピペット操作により混合した。
【０１２１】
次いで、生じる溶液を洗浄済みＲＯＢ培養物上へ速やかにピペット操作した（１ｍｌ／ウェル）。５％ ＣＯ２を含有する加湿気体において、この培養物を３７℃で２時間インキュベートした。その後、この細胞を無菌ＰＢＳで１回穏やかに洗浄し、適正な通常のインキュベーション培地を加えた。
【０１２２】
結果は、ｐＣＭＶ１０−４で誘導したすべてのラット細胞培養物における有意な骨結節形成を証明した。例えば、ｐＣＭＶ１０−４でトランスフェクトされた細胞は、４２９結節／ウェルを産生した。Ｔｒｍへ曝露した陽性対照培養物は、４６０結節／ウェルを産生した。対照的に、処理を受けなかった陰性対照は、１結節／ウェルを産生した。同様に、培養物をｐＣＭＶ１０−４（リバース）でトランスフェクトしたとき、結節は観察されなかった。
【０１２３】
in vivo での de novo 骨形成を実証するために、４〜５週齢の正常ラット（ｒｎｕ／＋；劣性無胸腺状態について異種接合）の後肢より骨髄を吸引した。この吸引した骨髄細胞をαＭＥＭに洗浄し、遠心分離し、ペレットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中０．８３％ ＮＨ４Ｃｌに再懸濁させることによって、ＲＢＣを溶解した。残る骨髄細胞をＭＥＭで３回洗浄し、３ｘ１０６細胞につき９マイクログラムのｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ（正又は負の配向）で２時間トランスフェクトした。次いで、このトランスフェクトした細胞をＭＥＭで２回洗浄し、３ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。
【０１２４】
この細胞懸濁液（１００マイクロリットル）を無菌ピペットより無菌の２ｘ５ｍｍ Ｉ型ウシコラーゲンディスク（Ｓｕｌｚｅｒ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，コロラド州フィートリッジ）へ塗布した。このディスクを４〜５週齢の無胸腺ラット（ｒｎｕ／ｒｎｕ）の頭蓋、胸部、腹部、又は脊柱に外科的に皮下移植した。この動物を３〜４週目に犠牲にし、この時点でディスク又は外科領域を切り出し、７０％エタノールに固定した。この固定化標本をＸ線撮影法により解析し、Ｇｏｌｄｎｅｒ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色した５マイクロメートル厚の切片について、非脱灰化の組織学的検査を実施した。コラーゲンディスクの代わりに、徐活力化（グアニジン抽出）、ミネラル除去した骨マトリックス（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州シューズベリ）を使用する実験も実施した。
【０１２５】
Ｘ線撮影は、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされた骨髄細胞を含有する元のコラーゲンディスクの形態に一致する、高レベルの石灰化骨形成を明らかにした。陰性対照（翻訳タンパク質をコードしないＬＭＰ−１ｓ ｃＤＮＡの負配向バージョンでトランスフェクトした細胞）においては、石灰化骨形成を観察せず、担体の吸収は、十分進行しているように見えた。
【０１２６】
組織学は、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされたインプラント中の骨芽細胞に沿って並ぶ新たな骨小柱を明らかにした。陰性対照の担体の部分的な再吸収部位には、骨を認めなかった。
【０１２７】
１８セット（９つの陰性対照ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−ＲＥＶと９つの実験ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ）のインプラントを無胸腺ラットの腰椎及び胸椎の間で交替する部位へ加えた、さらなる実験のＸ線撮影は、０／９の陰性対照インプラントが脊椎の間の骨形成（脊椎融合）を明示することを証明した。ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ処理インプラントの９つすべては、脊椎の間にしっかりとした骨融合を明示した。
【０１２８】
実施例２６：実施例２及び３で実証した配列からのｐＨＩＳ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの合成
７１７塩基対クローン（実施例１７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶ（ニューイングランドバイオロジカルズ、シティ、マサチューセッツ州）で消化した。小断片（約２５０塩基対）をゲル精製した。クローン番号７（実施例１８）をＣｌａＩ及びＸｂａＩで消化した。その消化物より１４００塩基対の断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対のｃＤＮＡ断片を標準法により連結して、約１６５０塩基対の断片を形成した。ｐＨｉｓ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。この線状化ベクターを回収し、キメラの１６５０塩基対ｃＤＮＡ断片へ連結した。この連結産物をクローニングして、標準法により増幅し、このｐｈｉｓ−Ａ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（インサートＨＬＭＰ−１ｓ付きベクターｐＨｉｓ−Ａとも表記される）を先に記載のようにＡＴＣＣに寄託した。
【０１２９】
実施例２７：ｐＨｉｓ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−Ｉｓ発現ベクターでの骨結節形成及び石灰化の in vitro 誘導
実施例１に従って、ラット頭蓋冠細胞を単離し、二次培養において増殖させた。培養物は、実施例１に従って、非刺激であるか、又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激した。この培養物を、実施例２５に記載されるように、３マイクログラムの組換えｐＨｉｓ−ＡベクターＤＮＡ／ウェルでトランスフェクトした。実施例３に従って、ホン・コッサ染色により石灰化結節を視覚化した。
【０１３０】
ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現だけで（即ち、ＧＣ刺激なしに）、有意な骨結節形成（約２０３結節／ウェル）を in vitro で誘導した。これは、ＧＣ陽性対照（約４１２結節／ウェル）に曝露された細胞により産生される結節の量のほぼ５０％である。ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（約１５２結節／ウェル）とｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ（約２０６結節／ウェル）でトランスフェクトした培養物でも同様の結果を得た。対照的に、陰性対照のｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖは（約２結節／ウェル）を生じ、非処理プレートでは、約４結節／ウェルを認めた。これらのデータは、このヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡがこのモデル系においてラットＬＭＰ−１ ｃＤＮＡと少なくとも同じくらい骨誘導性であったことを証明する。この実験における効果は、ＧＣ刺激で観察されるものより小さかったが、ある場合、この効果は匹敵していた。
【０１３１】
実施例２８：ＬＭＰは、可溶性骨誘導因子の分泌を誘導する
実施例２４に記載されるようなラット頭蓋冠骨芽細胞培養物におけるＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１の過剰発現は、陰性対照において観察されるものより有意に大きい結節形成をもたらした。ＬＩＭ石灰化タンパク質の作用機序を検討するために、条件付け培地を異なる時点で採取し、１０倍へ濃縮し、無菌濾過し、新鮮な血清を含有する培地においてその元の濃度へ希釈し、非トランスフェクト細胞へ４日間適用した。
【０１３２】
ＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトした細胞より４日目に採取した条件付け培地は、トランスフェクトした細胞中のＲＬＭＰ−１の直接的な過剰発現とほぼ同じくらい結節形成を誘導するのに有効であった。負配向のＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１でトランスフェクトした細胞からの条件付け培地は、結節形成に対して明らかな効果を及ぼさなかった。ＬＭＰ−１でトランスフェクトした培養物より４日目以前に採取した条件付け培地も結節形成を誘導しなかった。これらのデータは、ＬＭＰ−１の発現が可溶性因子の合成及び／又は分泌を引き起こし、これがトランスフェクション後４日目までは有効量で培養基に出現しなかったことを示唆する。
【０１３３】
ｒＬＭＰ−１の過剰発現が骨誘導因子の培地への分泌をもたらしたので、ウェスタンブロット分析を使用して、ＬＭＰ−１タンパク質が培地に存在しているかどうかを決定した。ＬＭＰ−１（ＱＤＰＤＥＥ）に特異的な抗体を使用してＲＬＭＰ−１タンパク質の存在を評価して、慣用の手段により検出した。ＬＭＰ−１タンパク質は、培養物の細胞層にのみ見出されて、培地には検出されなかった。
【０１３４】
標準の２５％及び１００％硫酸アンモニウムでのカットに続くＤＥ−５２陰イオン交換バッチクロマトグラフィー（１００ｍＭ又は５００ｍＭ ＮａＣｌ）によって、この可溶性骨誘導因子の部分精製を達成した。高硫酸アンモニウム、高ＮａＣｌの分画中に全活性を観察した。このような局在性は、単一の因子が培地を条件付ける原因であることの可能性と一致している。
【０１３５】
実施例２９：低用量アデノウイルスにより仲介される腰椎融合での遺伝子治療
本試験は、正常、即ち免疫適格性のウサギにおける脊椎融合を促進する、ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ（配列番号２）のアデノウイルス送達の最適量を決定した。
【０１３６】
Ａｄｅｎｏ−ＱｕｅｓｔＴＭＫｉｔ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、モントリオール）を使用して、ＣＭＶプロモーターにより推進されるＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ（配列番号２）を用いて、複製欠損性ヒト組換えアデノウイルスを構築した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する市販（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、モントリオール）の組換えアデノウイルスを対照として使用した。
【０１３７】
はじめに、０．０２５、０．２５、２．５、又は２５のプラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス／細胞の感染多重度（「ＭＯＩ」）での６０分の形質導入を使用して、ラット頭蓋冠骨芽細胞培養物において骨分化を誘導するのに最適のアデノウイルス送達ＬＭＰ−１（「ＡｄＶ−ＬＭＰ−１」）濃度を決定するために、in vitro 用量応答実験を実施した。陽性対照培養物は、１０９Ｍグルココルチコイド（「ＧＣ」）への曝露から７日目までに分化した。陰性対照培養物は非処理のままとした。１４日目に、石灰化した骨結節の数を培養物のホン・コッサ染色後に計数し、培地中へ分泌されたオステオカルシンのレベル（ピコモル／ｍＬ）をラジオイムノアッセイにより測定した（平均±ＳＥＭ）。
【０１３８】
この実験の結果を以下の表１に示す。非処理の陰性対照培養物には、自発的な結節はほとんど形成されなかった。このデータは、０．２５ｐｆｕ／細胞に等しいＭＯＩが骨結節を骨誘導するのに最も有効であり、陽性対照（ＧＣ）に匹敵するレベルに達することを示す。より低いかより高い用量のアデノウイルスは、それより有効でない。
【０１３９】
表１
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
次いで、in vivo 実験を実施して、最適 in vitro 用量が、骨格成熟したニュージーランド白色ウサギにおいて横突起間の突起の脊椎融合を促進することが可能であるかどうかを判定した。９匹のウサギを麻酔して、１８ゲージ針を使用して、顆間窩を介して遠位大腿骨より３ｃｃの骨髄を吸引した。次いで、バフィーコートを単離し、ＡｄＶ−ＬＭＰ−１で１０分の形質導入を実施して、この細胞を移植用手術室へ戻した。横突起の骨皮質剥離と、ＡｄＶ−ＬＭＰ−１（ＭＯＩ＝０．４）又はＡｄＶ−βＧａｌ（ＭＯＩ＝０．４）のいずれか一方で形質導入した８００万〜１５００万個の自己有核バフィーコート細胞を含有する担体（ウサギの徐活力化した骨マトリックス又はコラーゲンスポンジのいずれか一方）の挿入により、単一レベルの後外側方腰椎関節固定術を実施した。５週後にウサギを安楽死させ、手触診、単純Ｘ線、ＣＴスキャン、及び非脱灰組織学により脊椎融合を評価した。
【０１４２】
ＡｄＶ−ＬＭＰ−１を受けた脊椎融合部位は、９匹のウサギ全部で、確実で連続した脊椎融合の塊を誘導した。対照的に、ＡｄＶ−βＧａｌ、又は低用量のＡｄＶ−ＬＭＰ−１（ＭＯＩ＝０．０４）を受けた部位は、ほとんど、又はまったく骨を作らず、担体単独に匹敵する割合（＜４０％）で脊椎融合をもたらした。これらの結果は、手触診、ＣＴスキャン、及び組織学による評価と一致していた。しかしながら、単純Ｘ線撮影法は、存在する骨の量を、特に対照部位において過大評価する場合があった。試験した担体材料のいずれでもＬＭＰ−１ ｃＤＮＡ送達と骨誘導は成功した。アデノウイルスベクターに対する全身性又は局所性の免疫応答の証拠はなかった。
【０１４３】
上記のデータは、これまでに検証されたウサギ脊椎融合モデルに一致した骨誘導を実証する。自己骨髄細胞を手術中 ex vivo 遺伝子導入（１０分）で使用するプロトコールは、一晩の形質導入や数週間の培養における細胞膨張を必要とする他の方法よりも臨床的に実行可能な手順である。さらに、組換えアデノウイルスの最も有効な量（ＭＯＩ＝０．２５）でも、他の遺伝子治療応用に報告されている用量（ＭＯＩ＝４０〜５００）より実質的に低かった。このことは、ＬＭＰ−１が細胞内シグナル伝達分子であり、強力なシグナル増幅カスケードを有する可能性があるという事実によるものであると発明者は考える。さらに、細胞培養において骨を誘導したのと同じ濃度のＡｄＶ−ＬＭＰ−１が in vivo でも有効であったという観察事実も、他の増殖因子の用量では、細胞培養から動物実験へ翻案されるときに増加が通常は求められることに照らせば、驚くべきことであった。以上をまとめると、上記の観察事実は、アデノウイルスを使用してＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを送達する局所の遺伝子治療が可能であり、低用量が必要とされることで、アデノウイルスベクターに対する免疫応答という負の効果を最小化する可能性があることを示している。
【０１４４】
実施例３０：ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡで造骨する遺伝子治療への末梢静脈血の有核細胞（バフィーコート）の使用
４匹のウサギにおいて、我々は上記（実施例２９）のように脊椎融合手術を実施したが、但し、形質導入される細胞は、骨髄ではなくて、静脈血由来のバフィーコートであった。これらの細胞をＡｄＬＭＰ又はｐＨＩＳ−ＬＭＰプラスミドでトランスフェクトして、骨髄細胞を使用したときと同等の成功した結果を得た。通常の静脈血細胞を遺伝子送達に使用するというこの発見は、遺伝子治療を臨床的により実行可能にする。なぜなら、全身麻酔下での痛ましい骨髄採取を回避して、１ミリリットルにつき２倍多い細胞の出発材料が得られるからである。
【０１４５】
実施例３１：ヒトＬＭＰ−１スプライス変異体の単離
イントロン／エクソンｍＲＮＡ転写物のスプライス変異体は、シグナル伝達及び細胞／組織発生において比較的一般的な調節機序である。様々な遺伝子のスプライス変異体は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ、及びタンパク質−基質の相互作用を改変することが示されてきた。スプライス変異体はまた、遺伝子発現の組織特異性を制御して、様々な形態（それ故に、機能）が様々な組織において発現されることを可能にする。スプライス変異体は、細胞における一般的な調節現象である。ＬＭＰスプライス変異体は、神経再生、筋肉再生、又は他の組織の発生のように、他の組織において諸効果をもたらす可能性があるかもしれない、
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーについてＨＬＭＰ−１配列のスプライス変異体をスクリーニングするために、配列番号２２の部分に対応する１対のＰＣＲプライマーを調製した。標準技術を使用して合成したフォワードのＰＣＲプライマーは、配列番号２２のヌクレオチド３５〜５４に対応する。これは、以下の配列を有する：
５’ＧＡＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣ３’ （配列番号３５）
配列番号２２のヌクレオチド８２０〜８３９の逆相補体である、リバースのＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する：
５’ＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＧＧＴ３’ （配列番号３６）
このフォワード及びリバースのプライマーを使用して、９４℃３０秒間、６４℃３０秒間、及び７２℃１分、３０回繰り返しのサイクル処理プロトコールに続き、７２℃で１０分インキュベーションを使用する標準技術によって、ヒト心臓ｃＤＮＡ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，カタログ番号７４０４−１）についてＨＬＭＰ−１に類似の配列をスクリーニングした。増幅ｃＤＮＡ配列をゲル精製して、配列決定のためにＥｍｏｒｙ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙへ提出した。標準技術を使用してこのクローンを配列決定して、配列をＰＣＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ；プログラムＳＥＱＵＩＮ及びＮＡＬＩＧＮ）で検証して、配列番号２２に対する相同性を決定した。次いで、配列番号２２に比較して推定される可変スプライス部位のある２つの相同ヌクレオチド配列を、ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓのＴＲＡＮＳＬプログラムで、そのそれぞれのタンパク産物へ翻訳した。
【０１４６】
これらの２つの新規ヒトｃＤＮＡ配列の１つ（配列番号３７）は、１４５６塩基対を含む：
【０１４７】
【化１】
【０１４８】
１１９塩基対断片の欠失（Ｘ間）と１７塩基対断片（下線部分）の追加により引き起こされるリーディングフレームシフトにより、以下の導出アミノ酸配列（配列番号３８）を有する末端切断遺伝子産物を生じる：
【０１４９】
【化２】
【０１５０】
【化３】
【０１５１】
この４２３アミノ酸のタンパク質は、上記に図示したヌクレオチド変化によるものである、強調した領域中の配列（アミノ酸９４〜９９）以外は、配列番号１０に示すタンパク質に対して１００％相同性を示す。
【０１５２】
第二の新規ヒト心臓ｃＤＮＡ配列（配列番号３９）は、１５７５塩基対を含む：
【０１５３】
【化４】
【０１５４】
１７塩基対断片（太字、イタリック、及び下線の部分）の追加により引き起こされるリーディングフレームシフトにより、位置５６５〜５６７（下線部）に初期翻訳終止コドンを生じる。
【０１５５】
導出アミノ酸配列（配列番号４０）は、１５３アミノ酸からなる：
【０１５６】
【化５】
【０１５７】
このタンパク質は、配列番号１０に対する１００％相同性をアミノ酸９４まで示すが、ここでこのヌクレオチド配列に図示される１７塩基対断片の追加によりフレームシフトが生じる。アミノ酸９４〜１５３では、このタンパク質は、配列番号１０に相同ではない。配列番号１０のアミノ酸１５４〜１５７は、ヌクレオチド配列に図示される初期の終止コドンにより、存在していない。
【０１５８】
実施例３２：ゲノムＨＬＭＰ−１ヌクレオチド配列
出願人は、ＨＬＭＰ−１発現に関連した推定調節要素が含まれる、ＨＬＭＰ−１をコードするゲノムＤＮＡ配列を同定した。全体のゲノム配列を配列番号４１に示す。この配列は、ＡＣ０２３７８８（クローンＲＰ１１−５６４Ｇ９）（ゲノム配列決定センター、ワシントン医科大学校、ミズーリ州セントルイス）より導いた。
【０１５９】
ＨＬＭＰ−１の推定プロモーター領域は、配列番号４１中のヌクレオチド２，６６０−８，７３３に及ぶ。この領域は、他のものの中でも、少なくとも１０の潜在的なグルココルチコイド応答要素（「ＧＲＥ」）（ヌクレオチド６１４８−６１５３、６２２６−６２３１、６２４７−６２５２、６３３６−６３４１、６５１０−６５１５、６５５２−６５５７、６７２７−６７３２、６７５２−６７５７、７７３８−７７４３、及び８２５５−８２６０）、ショウジョウバエの decapentaplegic（「ＳＭＡＤ」）結合部位に対する１２の潜在的なＳｍａ−２相同体（ヌクレオチド３５６９−３５７５、４５５２−４５５８、４５８２−４５８８、５２２６−５２３２、６２２８−６２３４、６６４９−６６５５、６７２５−６７３１、６９３０−６９３６、７３７９−７３８４、７７３８−７７４２、８０７３−８０７９、及び８３７８−８３８４）、及び３つのＴＡＴＡボックス（ヌクレオチド５９１０−５９１３、６９３２−６９３５、及び７３８０−７３８３）を含む。この３つのＴＡＴＡボックス、ＧＲＥの全部、及びＳＭＡＤ結合要素（「ＳＢＥ」）の８つは、配列番号４１中のヌクレオチド５，８４１−８，７３３に及ぶ領域に集まっている。これらの調節要素は、例えば、骨形成のプロセスに関与するタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列の発現を調節するために使用することができる。このことは、骨形成及び修復に関連する治療因子又は遺伝子、並びに組織分化及び発生に関連した因子又は遺伝子の全身投与を可能にするだろう。
【０１６０】
推定調節要素に加えて、ＨＬＭＰ−１をコードするヌクレオチド配列に対応する１３のエクソンを同定した。これらのエクソンは、配列番号４１中の以下のヌクレオチドに及ぶ。
【０１６１】
【化６】
【０１６２】
ＨＬＭＰ−２には、ヌクレオチド１４８８７−１４９０４に及ぶ、別のエクソン（エクソン５Ａ）がある。
実施例３３：椎間板細胞におけるＨＬＭＰ−１の発現
ＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）は、骨性及び非骨性の組織において細胞分化を指令することができる細胞内タンパク質である。本実施例は、椎間板細胞においてヒトＬＭＰ−１（ＨＬＭＰ−１）を発現することがプロテオグリカン合成を高めて、より軟骨細胞の表現型を促進することを実証する。さらに、細胞の遺伝子発現に及ぼすＨＬＭＰ−１発現の効果を、アグリカン及びＢＭＰ−２遺伝子発現を測定することによって実証した。スプリーグ−ドーリーラットより、穏やかな酵素消化によって腰椎間板細胞を採取し、１０％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２において単層で培養した。次いで，これらの細胞を約２００，０００細胞／ウェルで６つのウェルプレートへ分けて、約３００，０００細胞／ウェルに細胞が達するまで、約６日間培養した。培養基を１％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２へ変更して、これを０日目とみなした。
【０１６３】
サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターへ機能可能的に連結したＨＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを含んでなる複製欠損５型アデノウイルスについては、例えば、米国特許第６，３００，１２７号にすでに記載されている。この陰性対照アデノウイルスは、ＨＬＭＰ−１ ｃＤＮＡがＬａｃＺ ｃＤＮＡにより置換されること以外は、同一であった。陽性対照として、１００ナノグラム／ミリリットルの濃度のＢＭＰ−２の継続存在下に非感染培養物をインキュベートした。
【０１６４】
０日目に、１％ ＦＢＳを含有する３００マイクロリットルの培地において、培養物を３７℃で３０分間アデノウイルスに感染させた。グリーン蛍光タンパク質（「ＧＦＲ」）遺伝子を含有するアデノウイルス（「ＡｄＧＦＰ」）で処理した細胞の蛍光標示式細胞分取器（「ＦＡＣＳ」）分析を実施して、トランス遺伝子の発現に最適な用量範囲を決定した。この細胞を、ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを含有するアデノウイルス（ＡｄＨＬＭＰ−１）（０、１００、３００、１０００、又は３０００のＭＯＩで）、又はＬａｃＺマーカー遺伝子を含有するアデノウイルス（ＡｄＬａｃＺ、１０００のＭＯＩ）（陰性対照）で処理した。感染後３日目と６日目に培養基を変えた。
【０１６５】
プロテオグリカン産生は、ジメチルメチレンブルー（「ＤＭＭＢ」）熱量測定アッセイを使用して、培養基（０、３、及び６日目）に存在する硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）を測定することによって評価した。
【０１６６】
アグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの定量では、細胞を６日目に採取して、Ｔｒｉｚｏｌ技術によりｍＲＮＡを抽出した。逆転写酵素を使用してｍＲＮＡをｃＤＮＡへ変換し、リアルタイムＰＣＲに使用して、それによりアグリカン及びＢＭＰ−２メッセージの相対産生量を決定した。アグリカン及びＢＭＰ−２用のリアルタイムプライマーは、先の実験において設計して、試験した。Ｃｙｂｅｒｇｒｅｅｎ技術を使用した。標準曲線を使用して、ｍＲＮＡ産生量を定量した。
【０１６７】
トランスフェクトした細胞について、光学顕微鏡で細胞の形態を報告した。細胞は、ＡｄＨＬＭＰ−１（ＭＯＩ １０００）処理ではより球状になったが、ＡｄＬａｃＺ処理ではそうならなかった。ＡｄＬａｃＺ感染は、細胞形態を有意に変化させなかった。
【０１６８】
ＡＤＧＦＰにより１０００のＭＯＩで感染させたラット椎間板細胞のＦＡＣＳ分析は、最高の百分率（４５％）の細胞が感染したことを示した。
ｓＧＡＧ産生とＡｄｈＬＭＰ−１ ＭＯＩの間には、用量依存性の増加があった。これらのデータを図１に見るが、これは、単層培養のラット椎間板細胞における、異なるＭＯＩでのＨＬＭＰ−１過剰発現後のｓＧＡＧの産生を示す。この結果は、０日目の非処理細胞へ正規化した。誤差のバーは、平均の標準誤差を表す。図１に示すように、３日目に観察されるｓＧＡＧ産生は相対的に少なく、トランスフェクションと細胞のＧＡＧ産生の間にラグタイムがあることを示す。ＡｄＬａｃＺでの処理は、ｓＧＡＧ産生を有意に変化させなかった。図１にまた見られるように、ＡｄｈＬＭＰ−１の最適用量は、１０００のＭＯＩでのものであり、６日目に非処理対照に対して２６０％のｓＧＡＧ産生の亢進をもたらした。これより高いか又は低いＡｄｈＬＭＰ−１の用量は、減少した応答をもたらす。
【０１６９】
ＡｄｈＬＭＰ−１投与量（ＭＯＩ）のｓＧＡＧ産生に及ぼす効果をさらに図２に例示する。図２は、異なるＭＯＩのＡｄｈＬＭＰ−１での処理後６日目のラット椎間板細胞のｓＧＡＧレベルを示すチャートである。図２よりわかるように、ＡｄｈＬＭＰ−１の最適用量は、１０００のＭＯＩであった。
【０１７０】
アグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの産生を図３に見る。この図は、ＨＬＭＰ−１の過剰発現後のアグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの増加を実証する。６日目のラット椎間板細胞より抽出したｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを実施して、２５０のＭＯＩのＡＤｈＬＭＰ−１で処理した細胞と無処理（「ＮＴ」）細胞を比較した。図３のデータは、非処理試料に対する増加百分率として表される。図３に例示するように、ＡｄｈＬＭＰ−１処理に続いて、アグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの有意な増加を認めた。ＢＭＰ−２発現の増加は、ＢＭＰ−２が、プロテオグリカン合成のＨＬＭＰ−１刺激に仲介する下流の遺伝子であることを示唆する。
【０１７１】
上記のデータは、椎間板細胞のプロテオグリカン合成を高めるのにＡｄｈＬＭＰ−１でのトランスフェクションが有効であることを実証する。最高のトランス遺伝子発現をもたらすウイルスの用量（ＭＯＩ １０００）はまた、ｓＧＡＧの最高の誘導をもたらし、ＨＬＭＰ−１発現とｓＧＡＧ誘導の間の相関性を示唆する。これらのデータは、ＨＬＭＰ−１遺伝子治療が椎間板におけるプロテオグリカン合成を高める方法であること、そしてＨＬＭＰ−１が椎間板疾患を治療するための薬剤であることを示す。
【０１７２】
図４Ａは、異なるＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１での感染後１２時間のＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現を示すチャートである。図４Ａでは、異なる用量（ＭＯＩ）のＡｄ−ｈＬＭＰ−１ウイルスで外因性ＬＭＰ−１発現を誘導し、リアルタイムＰＣＲで定量した。このデータは、比較目的のために、Ａｄ−ＬＭＰ−１ ＭＯＩ ５からのＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルへ正規化している。陰性対照群、無処理（「ＮＴ」）、又はＡｄ−ＬａｃＺ処理（「ＬａｃＺ」）ではＨＬＭＰ−１が検出されなかった。用量依存的な形式のＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルは、２５及び５０のＭＯＩでほぼ８倍のプラトーに達した。
【０１７３】
図４Ｂは、感染後３〜６日目の培地におけるｓＧＡＧの産生を示すチャートである。ＤＭＭＢアッセイを使用して、感染後３〜６日の全ｓＧＡＧ産生を定量した。図４Ｂのデータは、対照（即ち、無処理）群へ正規化している。図４Ｂよりわかるように、ｓＧＡＧには用量依存性の増加があり、２５及び５０のＭＯＩで、対照に優る約３倍増のピークに達した。陰性対照、２５のＭＯＩでのＡｄ−ＬａｃＺは、ｓＧＡＧの増加をもたらさない。図４Ｂにおいて、それぞれの結果は、３つの試料のＳＤを付した平均値として表される。
【０１７４】
図５は、ｓＧＡＧの産生の経時変化を示すチャートである。図５からわかるように、２５及び５０のＭＯＩでは、３日目にｓＧＡＧ産生が有意に増加した。６日目に、ＡｄＬＭＰ−１に応答したｓＧＡＧ産生の用量依存性の増加があった。ｓＧＡＧ増加のプラトーレベルは、２５のＭＯＩで達成された。図５からまたわかるように、ＡｄＬａｃＺ（「ＬａｃＺ」）での処理は、ｓＧＡＧ産生を有意に変化させなかった。それぞれの結果を６〜９の試料についてのＳＤを付した平均値として表す。図５において、「＊＊」は、Ｐ値が非処理対照に対して＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１７５】
図６Ａ及び６Ｂは、ラット繊維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対する遺伝子応答をアグリカン及びＢＭＰ−２についてそれぞれ示すチャートである。２５のＭＯＩのＡｄ−ＬＭＰ−１（「ＬＭＰ−１」）での感染後３日目に、定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。図６Ａ及び６Ｂからわかるように、アグリカン及びＢＭＰ−２の遺伝子発現は、非処理対照（「ＮＴ」）に比較して、Ａｄ−ＬＭＰ−１での感染後に有意に増加した。さらに、２５のＭＯＩのＡｄＬａｃＺ（「ＬａｃＺ」）での処理は、非処理対照に比較して、アグリカン又はＢＭＰ−２の遺伝子発現をいずれも有意に変化させなかった。図６Ａ及び６Ｂにおいて、それぞれの結果は、６つの試料についてのＳＤを付した平均値として表す。図６Ａ及び６Ｂにおいて、「＊＊」は、Ｐ値がＰ＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１７６】
図７は、２５のＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１で感染後のラット繊維輪細胞におけるＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルの時間経過を示すグラフである。このデータは、１８Ｓと過剰発現ＬＭＰ−１プライマーの複製計数を使用する標準化の後で、５のＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１に優る増加倍率として表す。図７からわかるように、ＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡは、感染後早くも１２時間で有意にアップレギュレートされた。さらに、１日目と３日目の間には、発現レベルの顕著な増加があった。図７のそれぞれの結果は、６つの試料についてのＳＤを付した平均値として表す。
【０１７７】
図８は、ＨＬＭＰ−１過剰発現に応答したＢＭＰ及びアグリカンのｍＲＮＡレベルの変化を示すチャートである。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、及びアグリカンのｍＲＮＡレベルは、２５のＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１での感染後の異なる時点でのリアルタイムＰＣＲで決定した。図８からわかるように、ＢＭＰ−２ ｍＲＮＡは、ＡｄＬＭＰ−１での感染後早くも１２時間で有意にアップレギュレートされた。一方、アグリカン ｍＲＮＡは、感染後３日目までアップレギュレートされなかった。それぞれの結果は、６つの試料についてのＳＤを付した平均値として表す。図８において、「＊＊」は、非処理対照に対するＡｄＬＭＰ−１での感染についてＰ値が＜０．０１であるデータ点を示す。
【０１７８】
図９は、ＨＬＭＰ−１発現に応答したｓＧＡＧ産生亢進の時間経過を示すグラフである。図９のデータでは、ラット繊維輪細胞を２５のＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１で感染した。感染後３日ごとに培地を変えて、ＤＭＭＢアッセイでｓＧＡＧを検定した。このデータは、ｓＧＡＧ産生が６日目にプラトーに達し、９日目でも実質的に維持されることを示す。
【０１７９】
図１０は、ｓＧＡＧ産生におけるＬＭＰ−１仲介性の増加に対するノギン（ＢＭＰアンタゴニスト）の効果を示すチャートである。図１０に見られるように、ラットの繊維輪細胞を２５のＭＯＩのＡｄ−ＬＭＰ−１で感染すると、産生されるｓＧＡＧが３日目と６日目の間で３倍増加した。この増加は、３２００ｎｇ／ｍｌ及び８００ｎｇ／ｍｌの濃度のノギン（ＢＭＰアンタゴニスト）の添加により阻止された。しかしながら、図１０に示すように、ノギンは、非感染細胞におけるｓＧＡＧ産生を有意に改変しなかった。図１０にまた見られるように、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２での刺激は、ＢＭＰ−２の添加後３日目と６日目の間でｓＧＡＧ産生の３倍増加をもたらした。８００ｎｇ／ｍｌのノギンは、この増加も阻止した。
【０１８０】
図１１は、単層培養６日後の培地における、ＬＭＰ−１のｓＧＡＧに対する効果を示すチャートである。このデータ点は、非処理細胞に優る増加倍率として表す。図１１に示すように、ＣＭＶプロモーターの付いたＬＭＰ−１も、ＡＡＶベクターにより送達されるとき、単層のラット椎間板細胞によりグリコサミノグリカン合成を刺激するのに有効である。
【０１８１】
表２：ＳＹＢＲグリーンのＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ用のプライマー配列
【０１８２】
【表２】
【０１８３】
表２中のＧＡＰＤＨは、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼを意味する。
表３：ＴａｑＭａｎ（登録商標）のリアルタイムＰＣＲ用のプライマー及びプローブ配列
【０１８４】
【表３】
【０１８５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）リボソームＲＮＡ制御試薬（パート番号４３０８３２９、アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ、アメリカ）を１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子のフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブに使用した。
【０１８６】
骨形成の機序−多重ＢＭＰの誘導の証拠
動物及び in vitro 試験により、比較的低い用量のアデノウイルス又はプラスミドベクターを使用するＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）ｃＤＮＡの ex vivo 遺伝子移入での衝撃的で一貫した骨形成効果が実証されている（Boden, et al.,「Ｖｏｌｖｏ基礎科学賞：新規骨誘導タンパク質（ＬＭＰ−１）をコードするｃＤＮＡを用いた局所遺伝子治療による腰椎融合（Volvo Award in Basic Sciences: Lumbar Spine Fusion by Local Gene Thrapy with a cDNA Encoding a Novel Osteoinductive Protein (LMP-1)）」Spine, 23, 2486-2492 (1998)）。しかしながら、ＬＭＰ−１の作用機序、形質導入された細胞がどのくらい長く生存するのかということ、あるいは、どの骨誘導増殖因子及び細胞が新しい骨及び骨芽細胞の分化の誘導に参画するのかということについて、ほとんどわかっていない（Boden, et al.,「ＬＩＭドメインタンパク質、ＬＭＰ−１は、骨形成に及ぼすＢＭＰ−６の効果に仲介する（LMP-1, A LIM-Domain Protein, Mediates BMP-6 Effects on Bone Formation）」Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) 及び Boden, et al., Spine, 23, 2486-2492 (1998) を参照のこと）。さらに、骨形成の in vivo 機序（即ち、軟骨内か膜性か）も決定されていない。ＬＭＰ−１作用の機序を理解することは、臨床現場におけるＬＭＰ−１誘導性の骨形成の最適制御と、さらに、骨芽細胞分化に関与する細胞内シグナル伝達経路の理解に有用であろう。
【０１８７】
ＬＭＰ−１は、異種ＬＩＭドメインタンパク質ファミリーのメンバーであり、骨芽細胞分化と直接関連づけられた最初のメンバーである（Kong, et al.,「筋ＬＩＭタンパク質は、ＭｙｏＤの活性を亢進することによって筋発生を促進する（Muscle LIM Protein Promotes Myogenesis by Enhancing the Activity of MyoD）」Mol. Cell. Biol., 17, 4750-4760 (1997)）。ＬＭＰ−１は、グルココルチコイドにより刺激されたラット頭蓋冠の骨芽細胞由来のメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）において同定され、その後、骨肉腫の相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）ライブラリーより単離された（Boden, et al., Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998)）。細胞表面受容体を介して作用する細胞外タンパク質であるＢＭＰと異なり、ＬＭＰ−１は、骨芽細胞分化に直接関与する細胞内シグナル伝達分子であると考えられている（Boden, et al., Spine, 20, 2626-2632 (1995)；Cook et al.,「非ヒト霊長動物における分節欠損の治癒に及ぼす組換えヒト骨形態形成タンパク質−1の効果（Effect of Recombinant Human Osteogenic Protein-1 on Healing of Segmental Defects in Non-Human Primates）」J. Bone Joint Surg., 77-A, 734-750 (1995)；Schimandle, et al.,「組換えヒト骨形態形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）を用いた実験脊椎融合（Experimental Spinal Fusion with Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2)）」Spine, 20, 1326-1337 (1995)）。従って、ＬＭＰ−１の治療使用は、そのｃＤＮＡの遺伝子移入を伴う場合がある。骨発生とのその関連性と抑制及び過剰発現実験の結果に基づいて、ＬＭＰは、その骨誘導活性を伝える可溶性因子の分泌を誘導し、骨芽細胞の in vitro 及び in vivo での分化及び成熟化に不可欠のレギュレーターであると考えられる。
【０１８８】
以下に記載するのは、１）ＬＭＰ−１により誘導される分泌される骨誘導因子の候補物を同定する；２）ＬＭＰ−１により誘導される骨形成の組織学的順序及び種類を記載する；及び３）ＬＭＰ−１を過剰発現する移植細胞が in vivo でどのくらい長く生存するかを決定するために実施する試験である。
【０１８９】
この試験では、ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞を使用して、ＬＭＰ−１過剰発現が骨形態形成タンパク質の発現を in vitro で誘導するかどうかを決定した。ＬＭＰ−１又はＬａｃＺ ｃＤＮＡを含有する組換え複製欠損ヒトアデノウイルス５型で培養Ａ５４９細胞を感染させた。４８時間後に免疫組織化学を使用して、細胞を分析した。最後に、上記２つのウイルスの１つを感染させたヒトバフィーコート細胞をロードしたコラーゲンディスクからなる皮下インプラントを１６匹の無胸腺ラットへ与えた。ラットを一定間隔で安楽死させ、外植片を組織学及び免疫組織化学により分析した。
【０１９０】
材料と方法
フェーズ１：ＬＭＰ−１で誘導される骨誘導因子の in vitro 検出
上記のように、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター付きのヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを移入ベクターへクローニングして、引き続き、組換え複製欠損（Ｅ１、Ｅ３欠失）アデノウイルスへ移入した。
【０１９１】
ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）は、ヒト５型アデノウイルスによるその高感染性で知られている。これらの細胞を２ウェルチャンバスライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，イリノイ州ナパーヴィル）に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度でまき、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補充したＦ１２ Ｋａｉｇｈｎ培地（ギブコＢＲＬ）において繁殖させ、加湿５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で増殖させた。
【０１９２】
Ａ５４９細胞を、１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で、チャンバ上に３７℃で３０分間感染させた。１０％ ＦＢＳ入りの培地を加え、この細胞を３７℃で４８時間増殖させた。この細胞に、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Boden, et al., Endocrinology, 139, 5125-5134 (1998) 及び Boden, et al., Spine, 23, 2486-2492 (1998)）によりそれぞれ推進されるＡｄＬＭＰ−１（活性ＬＭＰ）又はＡｄＬａｃＺ（Ａｄβｇａｌ−アデノウイルス対照）のいずれかを感染させた。追加の陰性対照として、いくつかの細胞は、アデノウイルスで感染させなかった（無処理対照）。４８時間後、チャンバスライド上の細胞を５０％アセトン／５０％メタノールにおいて２分間固定してから、ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＭｙｏＤ、及びＩＩ型コラーゲンに特異的な抗体を使用して、免疫組織化学（以下に記載する）により分析した。
【０１９３】
フェーズ２：骨形成の in vivo での組織学的順序
実験プロトコールは、施設内動物ケア及び使用委員会とヒト研究委員会により、検討されて承認された。ウサギ又はヒトの末梢血（３ｍＬ）を静脈穿刺により入手して、１２００ｘｇで１０分間の簡略な遠心分離によりバフィーコート細胞を単離した。この細胞を計数し、１ｘ１０６の細胞を４．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで、３７℃で１０分間、アデノウイルス（ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄＬａｃＺ）に感染させた。感染後、この細胞を８０μＬの最終容量に再懸濁させて、７ｍｍＸ７ｍｍＸ３ｍｍのコラーゲンディスク（ウシＩ型コラーゲン）へ適用した。
【０１９４】
４〜５週齢である１６匹の無胸腺ラットを入手し（Ｈａｒｌａｎ，インディアナ州インディアナポリス）、無菌条件に収容した。１〜２％イソフルランの吸入によりラットに麻酔をした。無胸腺ラットの胸部に４つの１０ｍｍ皮膚切開を行い、鈍的剥離によりポケットを作り、細胞を含有するコラーゲンディスクを各ポケットへ移植した。インプラントは、ＡｄＬＭＰ−１（２／ラット）又はＡｄＬａｃＺ（２／ラット）のいずれかを感染させたバフィーコート細胞をロードしたコラーゲンディスクより構成された。この皮膚を再吸収可能縫合で閉じた。各動物を移植後１、３、５、７、１０、１４、２１及び２８日目に犠牲にし、組織学と免疫組織化学により外植片を分析した。
【０１９５】
標本は、１０％中性緩衝化ホルマリンにおいて２４時間固定した。この標本を非脱灰又は脱灰切片化のために調製した。非脱灰切片用の標本は、格付け強度のエタノールにより脱水して、パラフィンに埋め込んだ。移植後２１及び２８日目の標本は、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液で３〜５日間脱灰した。脱灰化の後で、格付け強度のエタノールにより標本を脱水して、パラフィンに埋め込んだ。標本をミクロトーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊｕｎｇ ＧｍｂＨ，ハイデルベルグ、ドイツ）で５マイクロメートルの厚さに切断した。切片をヘマトキシリン及びエオシン染色、Ｇｏｌｄｎｅｒの三色染色、並びに、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＣＤ−４５、及びＩ型コラーゲンに特異的な抗体を使用する免疫組織化学試験へ処した。
【０１９６】
一次抗体の調製
抗ＬＭＰ−１抗体：抗ＬＭＰ−１抗体は、ヒトＬＭＰ−１の内部領域内にマッピングされる、アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体であり、ウサギ及びヒト起源のＬＭＰ−１と反応する。この抗体をＬＭＰ−１タンパク質の同定に１：５００又は１：１０００の希釈で使用した。
【０１９７】
抗ＢＭＰ−２、抗ＢＭＰ−４、抗ＢＭＰ−６、抗ＢＭＰ−７、及び抗ＴＧＦ−β１抗体：ポリクローナルのヤギ抗ＢＭＰ−２、抗ＢＭＰ−４、抗ＢＭＰ−６、抗ＢＭＰ−７、及び抗ＴＧＦ−β１抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）は、マウス、ラット、及びヒトのＢＭＰと交差反応する。抗ＢＭＰ−２、抗ＢＭＰ−４、及び抗ＢＭＰ−６抗体は、ヒト起源のＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−６のアミノ末端でマッピングされるエピトープに対して産生した。抗ＢＭＰ−７抗体は、ヒトＢＭＰ−７の内部領域内にマッピングされる、アフィニティー精製されたヤギのポリクローナル抗体であった。抗ＴＧＦ−β１抗体は、ヒトＴＧＦ−β１の前駆体型のカルボキシ末端にマッピングされる、アフィニティー精製されたヤギのポリクローナル抗体であった。これらの抗体は、１：１００及び１：５００又は１：１０００の希釈で使用した。
【０１９８】
抗ＣＤ４５抗体：モノクローナルマウス抗ヒト白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ＣＤ−４５抗体（精製ＩｇＧ１，κ；ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）は、異なるエピトープに対して向けられた２つの抗体、ＰＤ７／２６及び２Ｂ１１からなる。ＰＤ７／２６は、Ｔ細胞増殖因子で維持された、ヒト末梢血リンパ球より導いた。２Ｂ１１は、Ｔ細胞リンパ腫又は白血病より単離した新生物細胞より導いた。いずれの抗体も、免疫蛍光法により試験するとき、９４〜９６％の範囲でリンパ球及び単球へ結合した。今回の試験では、この抗体をヒト白血球の同定のために１：１００の希釈で使用した。
【０１９９】
抗Ｉ型コラーゲン抗体：モノクローナル抗Ｉ型コラーゲン抗体（マウスＩｇＧ１アイソタイプ；シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）は、マウス骨髄腫細胞と、ウシ皮膚Ｉ型コラーゲンで免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞の融合によって産生したＩ型コラーゲンハイブリドーマより導いた。この抗体は、ヒト、ウシ、ウサギ、シカ、ブタ、及びラットのＩ型コラーゲンと反応し、１：１００の希釈で使用した。
【０２００】
抗ＩＩ型コラーゲン抗体：ポリクローナルウサギ抗ＩＩ型コラーゲン抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）は、ヒトＩＩ型コラーゲンのα１鎖のアミノ末端に対応するエピトープに対して産生した。この抗体は、マウス、ラット、及びヒト起源のＩＩ型コラーゲンα１鎖と反応し、１：１０００の希釈で使用した。
【０２０１】
抗ＭｙｏＤ抗体：ポリクローナルウサギ抗ＭｙｏＤ抗体（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）は、マウス起源の全長ＭｙｏＤタンパク質を表すアミノ酸１〜３１８に対応するエピトープに対して産生した。この抗体は、マウス、ラット、及びヒト起源のＭｙｏＤと反応し（そして、ミオゲニン、Ｍｙｆ−５、又はＭｙｆ−６とは反応しない）、１：１０００の希釈で使用した。
【０２０２】
免疫組織化学染色
標識化ストレプタビジン−ビオチン法（ＬＳＡＢ法）を使用して、染色手順を実施した。ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＣＤ４５、ＭｙｏＤ、Ｉ型コラーゲン、及びＩＩ型コラーゲンに対する抗体での免疫染色に、キット（ユニバーサルＬＳＡＢキット、ペルオキシダーゼ；ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）を使用した。一次抗体を産生した動物によって、適正なビオチニル化二次抗体を使用した。０．３％過酸化水素を含有するメタノールで内因性ペルオキシダーゼを阻止した。５％正常ウサギ血清又は５％正常ヤギ血清のいずれかと１％ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）とともに標本を室温で１５分間インキュベートして非特異結合を回避してから、適正濃度の一次抗体とともに加湿チャンバに４℃で一晩置いた。ＰＢＳで３回、５分間の洗浄後、加湿チャンバにおいて室温で１０分間、ビオチニル化二次抗体及びストレプタビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とのインキュベーションに続き、３，３’−ジアミノベンチジンテトラクロリド（ＤＡＢ；ＤＡＫＯ社、カリフォルニア州カーピンテリア）を使用して発色させた。最後に、この切片をヘマトキシリンにより対比染色した。陰性対照として、それぞれの一次抗体を、標本とのインキュベーションに先立って、対応する阻止ペプチド（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）とともに室温で３時間インキュベートした。ある実験では、一次抗体単独、又は二次抗体単独を追加の陰性対照として使用した。
【０２０３】
結果
フェーズ１：ＬＭＰ−１で誘導される骨誘導因子の in vitro 検出
図１２Ａ〜１２Ｄに示すように、ＡｄＬＭＰ−１で感染したＡ５４９細胞は、ＬＭＰ−１タンパク質の強い細胞内染色を示した。図１２Ａ〜１２Ｄは、ＡｄＬＭＰ−１（図１２Ａ）、Ａｄβｇａｌ（図１２Ｃ）での感染後４８時間のＡ５４９細胞、又は非処理細胞（図１２Ｄ）中のＬＭＰ−１タンパク質についての免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。図１２Ａ、１２Ｃ及び１２Ｄより見られるように、ＡｄＬＭＰ−１で感染した細胞には、どの対照にも見られない（図１２Ｃ及び１２Ｄ）、特異的な細胞内反応が見られた（図１２Ａ）。一次抗体の阻止ペプチドへのプレ曝露が陽性の細胞内染色を消失させた（図１２Ｂ）ので、非特異反応の可能性は棄却された。図１２Ａ〜１２Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０４】
図１３Ａ〜１３Ｆに示すように、ＡｄＬＭＰ−１処理細胞では、特に細胞質において、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、及びＢＭＰ−７の強い染色を観察した。図１３Ａ〜１３Ｆは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１３Ａ、１３Ｂ及び１３Ｃ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１３Ｄ、１３Ｅ、及び１３Ｆ）での感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞（それぞれ、図１３Ｄ、１３Ｅ、及び１３Ｆ）に存在しない、ＢＭＰ−２（図１３Ａ）、ＢＭＰ−４（図１３Ｂ）、及びＢＭＰ−７（図１３Ｃ）に特異的な細胞内染色があった。図１３〜１３Ｆの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０５】
図３Ａ〜３Ｄに示すように、ＡｄＬＭＰ−１で処理した細胞はまた、抗ＢＭＰ−６及び抗ＴＧＦ−β１抗体で陽性に染色した。図１４Ａ〜１４Ｄは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１４Ａ及び１４Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１４Ｃ及び１４Ｄ）のいずれかでの感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞（それぞれ、図１４Ｃ及び１４Ｄ）に存在しない、ＢＭＰ−６（図１４Ａ）及びＴＧＦβ−１（図１４Ｂ）に特異的な細胞内染色があった。しかしながら、これらの反応は、他のＢＭＰで見られるものよりやや強くなかった。Ａｄβｇａｌ感染と非処理対照の両方で、細胞は、ＬＭＰ−１、ＢＭＰのすべて、又はＴＧＦ−β１に特異的な反応をしなかった。各抗体の阻止ペプチドにより、この反応が特異的であることを確かめた。抗ＩＩ型コラーゲン抗体や抗Ｍｙｏ抗体との特異反応もなかった（データ示さず）。図１４Ａ〜１４Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０６】
フェーズ２：骨形成の in vivo での組織学的順序。組織学的検査−免疫組織化学染色
白血球の免疫定位。図１５Ａ〜１５Ｄに示すように、移植後１及び３日目に、ＡｄＬＭＰ−１（活性）及びＡｄβｇａｌ（対照）で処理したインプラントの両方の内部のバフィーコート調製物に抗ＣＤ４５抗体により染色される細胞が多量に存在した。
【０２０７】
図１５Ａ〜１５Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１５Ａ及び１５Ｃ）又は５日目（図１５Ｂ及び１５Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１５Ａ及び１５Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１５Ｃ及び１５Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞中の白血球表面マーカーＣＤ４５の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＣＤ４５抗原に特異的な染色のある細胞の数は、両方の処理群において速やかに減少した。この観察事実は、移植したヒト細胞がさほど長くは生存せず、骨形成は宿主細胞の流入に依存した可能性があることを示唆する。特異的な抗ヒトＣＤ４５反応で染色する細胞の数は、３日目以降、特にインプラントの中心で減少した。それでも５日目にはインプラントの周辺で陽性染色を観察したが、移植から１０日後、抗ＣＤ４５で染色する細胞はほとんどなかった。減少する染色のパターンは、活性インプラントと対照インプラントで同じであった。図１５Ａ〜１５Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２０８】
ＢＭＰの免疫定位。ＡｄＬＭＰ−１処理インプラントでは、移植後３及び５日目に、免疫組織化学により、細胞内のコラーゲン線維で強いＢＭＰ−４（図１６Ａ〜１６Ｄ）及びＢＭＰ−７（図１７Ａ〜１７Ｄ）の染色が明らかにされた。
【０２０９】
図１６Ａ〜１６Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１６Ａ及び１６Ｃ）又は５日目（図１６Ｂ及び１６Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１６Ａ及び１６Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１６Ｃ及び１６Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−４の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞には存在しない、ＢＭＰ−４に特異的な細胞内染色があった。図１６Ａ〜１６Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２１０】
図１７Ａ〜１７Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１７Ａ及び１７Ｃ）又は５日目（図１７Ｂ及び１７Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１７Ａ及び１７Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１７Ｃ及び１７Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。ＡｄＬＭＰ−１処理細胞には、Ａｄβｇａｌ処理細胞には存在しない、ＢＭＰ−７に特異的な細胞内染色があった。図１７Ａ〜１７Ｄの顕微鏡写真は、Ｘ１３２の原寸大で撮影した。
【０２１１】
図１６Ａ〜１６Ｄ及び１７Ａ〜１７Ｄよりわかるように、Ａｄβｇａｌ（対照）インプラントの細胞には、ＢＭＰ−４又はＢＭＰ−７に特異的な染色がなかった。さらに、ＡｄＬＭＰ−１インプラントには、１０日以降のどの時点でも、抗ＢＭＰ−４及び抗ＢＭＰ−７抗体での強い染色が見られた。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７の強い染色は２つの一時的なフェーズで観察された；第一フェーズは、早期の日（即ち、移植後３及び５日目）のバフィーコート細胞の限定数であり、そして第二フェーズは、１０日目以降に、マトリックスにより囲まれる骨芽細胞様の細胞において見られ、これは、図１８に示すように、移植されたバフィーコート細胞ではなく、応答している細胞である可能性がきわめて高い。
【０２１２】
図１８は、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１４日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の高出力顕微鏡写真である。より早期の時点と比較して、より豊富なＢＭＰ−７の染色があり、これは今のところ、新しい骨マトリックスの形成のごく近傍にある細胞の大部分と関連づけられている。図１８の顕微鏡写真は、Ｘ６６の原寸大で撮影した。
【０２１３】
Ｉ型コラーゲンの免疫定位。ＡｄＬＭＰ−１インプラントでは、移植後７、１０、１４、２１、及び２８日目に、抗Ｉ型コラーゲン抗体の強い染色が観察された。早期の時点では、骨芽細胞様細胞の付近とその細胞そのものの周辺で特異的な反応が見られた。Ａｄβｇａｌで処理した対照インプラントには、Ｉ型コラーゲンの染色がほとんどなかった。
【０２１４】
ヘマトキシリン及びエオシン染色と、Ｇｏｌｄｎｅｒの三色染色
ウサギ又はヒトのいずれかのバフィーコート細胞を使用しても、結果は同じであった。重複を避けるために、以下の記載と対応する例示は、ヒトのドナー細胞についてのものである。図１９Ａ〜１９Ｄに示すように、移植後１及び３日目に、Ａｄ−ＮＭＰインプラントは、インプラントの周縁で細胞数を増やしていた。
【０２１５】
図１９Ａ〜１９Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目（図１９Ａ及び１９Ｃ）又は３日目（図１９Ｂ及び１９Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図１９Ａ及び１９Ｂ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図１９Ｃ及び１９Ｄ）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。インプラントの周辺の細胞の密度は、いずれの時点でもＡｄＬＭＰ−１インプラントにおいてより高く、宿主細胞の遊走を示唆した。図１９Ａ〜１９Ｄは、Ｇｏｌｄｎｅｒ三色法を使用して、Ｘ３３の原寸大で撮影した。
【０２１６】
Ａｄβｇａｌ対照では、同じ時点（即ち、移植後１及び３日）で、周辺にはより少ない細胞しかなかった。これらの観察事実は、図２０Ａ及び２０Ｂに示すように、ＬＭＰ−１を発現する細胞のあるインプラントへ宿主細胞が遊走したことを示唆する。これらの細胞は、単球及び多形核球の混合物であった。図２０Ａ及び２０Ｂは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄβｇａｌで感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。図２０Ａに示すように、Ａｄβｇａｌで感染した細胞を含有するコラーゲン（Ｃ）インプラントの周辺には相対的にごくわずかの細胞（矢印）しかなかった。このインプラントの中心には、バフィーコート細胞と赤血球ゴーストを認めることができた。図２０Ｂに示すように、有核細胞のコラーゲン（Ｃ）インプラントの周辺での密度はＡｄＬＭＰ−１インプラントにおいてより高く、周囲の柔組織からの宿主細胞の遊走を示唆した。この細胞には、単球、多形核細胞、及び組織球に見える細胞が含まれた。図２０Ａ及び２０Ｂの顕微鏡写真は、ヘマトキシリン及びエオシンを使用して、Ｘ１００（図２０Ａ）とＸ１６０（図２０Ｂ）の原寸大で撮影した。
【０２１７】
図２１Ａ〜２１Ｊは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図２１Ａ〜２１Ｅ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図２１Ｆ〜２１Ｊ）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。膜性の骨形成の進行は、７日目までに見られる石灰化マトリックスで明白であった（図２１Ｃ）。Ａｄβｇａｌで感染させた細胞を含有するインプラントには、骨形成が見られなかった（図２１Ｆ〜２１Ｊ）。図２１Ａ〜２１Ｊの顕微鏡写真は、Ｇｏｌｄｎｅｒ三色法を使用して、Ｘ３３の原寸大で撮影した。
【０２１８】
図２１Ａ〜２１Ｅに示すように、コラーゲン繊維と関連したバフィーコート細胞は経時的により少なくなり、Ａｄβｇａｌ処理インプラントの中心で生存している細胞の数は、移植後５日目までに減少した（図２１Ｃ）。
【０２１９】
図２２Ａ〜２２Ｃは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。図２２Ａからわかるように、移植後７日目には、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの周辺のコラーゲン繊維（Ｃ）の間にある骨芽細胞様細胞（矢印）に隣接して新たな石灰化骨マトリックス（Ｂ）が見られた。骨芽細胞様細胞を囲むマトリックス（矢先）の、典型的な類骨縫合を伴わず、特定の配向もない、速やかな石灰化があった。図２２Ｂからわかるように、ＡｄＬＭＰ−１インプラント全体に位置する空間には成熟した新骨が形成されて、コラーゲン骨格のほとんどは、２８日目までに再吸収された。破骨細胞（ＯＣ）が一次無層骨（Ｂ）を再建しているのが見られる一方で、骨芽細胞（矢先）が骨様の新形成骨の表面を被覆しているのが見られた。最後に、図２２Ｃからわかるように、骨髄基質（Ｓ）と血管（Ｖ）が含まれる骨（Ｂ）の内部では、造血性の骨髄組織が形成されているのが見られた。図２２Ａ〜２２Ｃの顕微鏡写真は、Ｇｏｌｄｎｅｒ三色法を使用して、Ｘ１６０の原寸大で撮影した。
【０２２０】
図２２Ａからわかるように、移植後７日目には、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの周辺のコラーゲン繊維の間にある骨芽細胞様細胞に隣接して新たな骨マトリックスが見られた。典型的な類骨縫合を伴わず、特定の配向もない、周囲マトリックスの速やかな石灰化があった。組織化された骨配向の不足は、これらが有意にロードされたわけではない皮下インプラントであるという事実に照らせば、驚くことではなかった。移植後１０日目のＡｄＬＭＰ−１インプラントには、より多量の骨芽細胞様細胞が観察され、コラーゲン繊維間の空所へ増殖していた。移植後１４日目までに、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの中心領域は骨芽細胞様の細胞に占められた。対照的に、Ａｄβｇａｌ処理インプラントには、コラーゲンの空所に線維芽細胞様の細胞が充満していた。移植後２１日で、ＡｄＬＭＰ−１インプラントの中心領域のほとんど又はすべてにおいて、新骨マトリックスが石灰化されて、形成された。移植後２８日では、ＡｄＬＭＰ−１インプラントのほとんどの中心領域に位置する空間に成熟した新骨が形成されていた。破骨細胞が一次無層骨を再建しているのが見られる一方で、骨芽細胞が骨様の新形成骨の表面を被覆しているのが見られた（図２２Ｂ）。この骨の内部では、造血性の骨髄組織も形成されているのが見られた（図２２Ｃ）。Ａｄβｇａｌ処理対照では、移植されたコラーゲンが２８日までにほとんど再吸収されて、繊維組織で置き換えられた。
【０２２１】
上記に示したように、Ａ５４９細胞での in vitro 実験は、ＡｄＬＭＰ−１被感染細胞が上昇レベルのＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及びＴＧＦ−β１タンパク質を発現することを示した。ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞も、無胸腺ラットへの異所性移植後７２時間で増加レベルのＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７タンパク質を明示して、in vitro の仮説を確認した。
【０２２２】
上記の試験の結果に基づいて、それ故に、いくつかのＢＭＰの合成と、分化して直接の膜性骨形成に参画する宿主細胞の動員にＬＭＰ−１の骨誘導特性が関与することが示された。従って、ＬＭＰ−１ ｃＤＮＡでの遺伝子治療は、新骨形成を誘導するために、多量の単一ＢＭＰの移植に代わる手段を提供する可能性がある。
【０２２３】
本発明によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質（ＴＧＦ−β）の発現を細胞において誘導する方法が提供される。該方法には、
プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが含まれる。本発明によれば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質の発現を含めることができる。単離核酸は、配列番号２５の全長へ相補的な核酸分子へ標準条件下でハイブリダイズすることができる核酸；及び／又は配列番号２６の全長に相補的な核酸分子へ高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子であり得る。細胞は、バフィーコート細胞、幹細胞（例えば、間葉幹細胞又は多能性幹細胞）、又は椎間板細胞（例えば、髄核の細胞、又は繊維輪の細胞）であり得る。細胞は、ex vivo 又は、in vivo でトランスフェクトすることができる。例えば、細胞は、哺乳動物の椎間板への核酸の直接注射により in vivo でトランスフェクトしてよい。
【０２２４】
上記ヌクレオチド配列によりコードされるＬＩＭ石灰化タンパク質は、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、又はＨＬＭＰ−３であり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターであり得る。本発明の１つの態様によれば、ＬＩＭ石灰化タンパク質は、ＬＭＰ−１タンパク質である。核酸は、ベクター（例えば、プラスミドのような発現ベクター）中にあってよい。ベクターは、アデノウイルス又はレトロウイルスのようなウイルスでもよい。本発明により使用することができる例示のアデノウイルスは、ＡｄＬＭＰ−１である。
【０２２５】
本発明の第二の側面によれば、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を過剰発現する細胞が提供される。この細胞は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質を過剰発現する細胞であり得る。細胞は、バフィーコート細胞、椎間板細胞、間葉幹細胞、又は多能性幹細胞であり得る。上記に示すような細胞と担体材料を含んでなるインプラントも提供される。本発明によりまた提供されるのは、上記に示すような細胞又はインプラントを哺乳動物へ導入することを含んでなる、哺乳動物において骨形成を誘導する方法と、上記に示すような細胞を哺乳動物の椎間板へ導入することを含んでなる、哺乳動物において椎間板疾患を治療する方法である。
【０２２６】
本発明の文脈において、骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質の過剰発現は、その特定の細胞において通常存在するより高いレベルでそのタンパク質を発現する細胞に関連する（例えば、このタンパク質の発現は、プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸でトランスフェクトされなかった細胞におけるレベルより高いレベルにある）。細胞は、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を通常発現する細胞であり得る。細胞は、１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質を通常は発現しない細胞であってもよい。
【０２２７】
上記の詳述は、本発明の原理を教示し、実施例を例示の目的で提供するが、当業者には、本開示を読むことより、本発明の真の範囲より逸脱することなく、形態及び細部において様々な変更をなし得ると理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】図１は、示した感染多重度（ＭＯＩ）でトランスフェクトしたラット椎間板細胞におけるＨＬＭＰ−１の発現後の硫酸化グリコサミノグリカンの産生を例示するグラフである。
【図２】図２は、異なるＭＯＩのＡｄＨＬＭＰ−１での感染後６日目のラット椎間板細胞の用量応答を示すチャートである。
【図３】図３は、２５０ビリオン／細胞のＭＯＩでのトランスフェクション後６日目の、ＡｄＨＬＭＰ−１トランスフェクトされたラット椎間板細胞によるアグリカン及びＢＭＰ−２ ｍＲＮＡの発現を示すチャートである。
【図４】図４Ａは、異なるＭＯＩのＡｄ−ｈＬＭＰ−１での感染後１２時間のＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現を示すチャートである。図４Ｂは、感染後３〜６日目の培地におけるｓＧＡＧの産生を示すチャートである。
【図５】図５は、ｓＧＡＧの産生の経時変化を示すチャートである。
【図６】図６Ａは、ラット繊維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対するアグリカンについての遺伝子応答を示すチャートである。図６Ｂは、ラット繊維輪細胞におけるＬＭＰ−１過剰発現に対するＢＭＰ−２についての遺伝子応答を示すチャートである。
【図７】図７は、２５のＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１で感染後のラット繊維輪細胞におけるＨＬＭＰ−１ ｍＲＮＡレベルの時間経過を示すグラフである。
【図８】図８は、ＨＬＭＰ−１過剰発現に応答したＢＭＰ及びアグリカンのｍＲＮＡレベルの変化を示すグラフである。
【図９】図９は、ＨＬＭＰ−１発現に応答したｓＧＡＧ産生亢進の時間経過を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｓＧＡＧ産生のＬＭＰ−１仲介性の増加がノギン（ｎｏｇｇｉｎ）により阻止されることを示すチャートである。
【図１１】図１１は、単層培養６日後の培地における、ＬＭＰ−１のｓＧＡＧに対する効果を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、Ａ５４９細胞中のＬＭＰ−１タンパク質についての免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｆは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）のいずれかで感染後４８時間のＡ５４９細胞の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１５Ａ及び１５Ｃ）又は５日目（図１５Ｂ及び１５Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞中の白血球表面マーカーＣＤ４５の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１６Ａ及び１６Ｃ）又は５日目（図１６Ｂ及び１６Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−４の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後３日目（図１７Ａ及び１７Ｃ）又は５日目（図１７Ｂ及び１７Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１４日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞中のＢＭＰ−７の免疫組織化学染色の高出力顕微鏡写真である。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目（図１９Ａ及び１９Ｃ）又は３日目（図１９Ｂ及び１９Ｄ）に切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル）又はＡｄβｇａｌ（下パネル）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄβｇａｌで感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植後１日目に切除した、ＡｄＬＭＰ−１又はＡｄβｇａｌで感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｊは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１（上パネル−図２１Ａ〜２１Ｅ）又はＡｄβｇａｌ（下パネル−図２１Ｆ〜２１Ｊ）で感染したヒトバフィーコート細胞の顕微鏡写真である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、無胸腺ラットの胸部へのコラーゲンマトリックスの皮下移植に続く様々な時点で切除した、ＡｄＬＭＰ−１で感染したヒトバフィーコート細胞の高出力顕微鏡写真である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質の発現を細胞において誘導する方法であって：
プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
ＬＩＭ石灰化タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質の発現を誘導する、請求項１の方法。
【請求項４】
ＬＩＭ石灰化タンパク質が、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、ＨＬＭＰ−３、又はこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＬＩＭ石灰化タンパク質がＨＬＭＰ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、幹細胞、椎間板細胞、髄核の細胞、繊維輪の細胞、及びバフィーコート細胞からなる群の間より選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、ＨＬＭＰ−３、又はこれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコードする単離核酸を含んでなる組換えアデノウイルスベクターでの細胞の感染を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
骨形態形成タンパク質がＢＭＰ−４である、請求項１の方法。
【請求項９】
骨形態形成タンパク質がＢＭＰ−７である、請求項１の方法。
【請求項１０】
トランスフェクトされる細胞が椎間インプラントを含む、請求項１の方法。
【請求項１】
１以上の骨形態形成タンパク質又はトランスフォーミング増殖因子−βタンパク質の発現を細胞において誘導する方法であって：
プロモーターへ機能可能的に連結したＬＩＭ石灰化（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離核酸で細胞をトランスフェクトすることを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
ＬＩＭ石灰化タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、及びこれらの組合せからなる群より選択される１以上のタンパク質の発現を誘導する、請求項１の方法。
【請求項４】
ＬＩＭ石灰化タンパク質が、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、ＨＬＭＰ−３、又はこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＬＩＭ石灰化タンパク質がＨＬＭＰ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、幹細胞、椎間板細胞、髄核の細胞、繊維輪の細胞、及びバフィーコート細胞からなる群の間より選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
単離核酸で細胞をトランスフェクトすることが、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、ＨＬＭＰ−３、又はこれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコードする単離核酸を含んでなる組換えアデノウイルスベクターでの細胞の感染を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
骨形態形成タンパク質がＢＭＰ−４である、請求項１の方法。
【請求項９】
骨形態形成タンパク質がＢＭＰ−７である、請求項１の方法。
【請求項１０】
トランスフェクトされる細胞が椎間インプラントを含む、請求項１の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２１】
【公表番号】特表２００６−５１９６２２（Ｐ２００６−５１９６２２Ａ）
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９２４５（Ｐ２００６−５０９２４５）
【出願日】平成１６年３月７日（２００４．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７６１６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３９９６
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５０４２２８０４７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月７日（２００４．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７６１６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３９９６
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５０４２２８０４７）
【Ｆターム（参考）】
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