高密度リポタンパク質中コレステロール測定試薬キット及び測定方法
【課題】ＨＤＬを多量に含む検体であっても正確にＨＤＬ−Ｃを測定することができる試薬キットを提供すること。
【解決手段】試料中のＨＤＬを定量するための試薬キットであって、前記ＨＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールエステルと酵素との反応を抑制する阻害剤と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有する第一試薬と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬とを含む試薬キットを提供する。
【解決手段】試料中のＨＤＬを定量するための試薬キットであって、前記ＨＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールエステルと酵素との反応を抑制する阻害剤と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有する第一試薬と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬とを含む試薬キットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診断の分野において、試料に含まれる高密度リポタンパク質中コレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃとする）を測定する試薬キット及びＨＤＬ−Ｃを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポタンパク質は、コレステロールなどの脂質とアポタンパク質との複合体の総称であり、血液などに含まれる。コレステロールは、主に脂肪酸とエステル結合したエステル型コレステロールとしてリポタンパク質中に存在する。リポタンパク質は比重の低いものから順にカイロミクロン（以下、ＣＭとする）、超低密度リポタンパク質（以下、ＶＬＤＬとする）、低密度リポタンパク質（以下、ＬＤＬとする）、高密度リポタンパク質（以下、ＨＤＬとする）などに分類されている。これらのうちＨＤＬは抗動脈硬化因子として注目されており、ＨＤＬ−Ｃの測定は各種動脈硬化症を含む循環器系疾患の重要な臨床検査項目のひとつである。
【０００３】
試料中のＨＤＬ−Ｃを定量する試薬として、例えば特許文献１記載の試薬が知られている。この試薬では、ＨＤＬからコレステロールを遊離させるために阻害法が用いられる。阻害法では、先ずＨＤＬ以外のリポタンパク質が酵素と反応するのを阻害する阻害剤を試料に添加する。次に、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する酵素の作用によりＨＤＬからコレステロールが遊離する。遊離したＨＤＬ−Ｃに酵素を反応させ、生じた反応産物を光学的に測定することによりＨＤＬ−Ｃが定量される。しかしながら、ＨＤＬを多量に含む試料を検体として用いた場合、所定の測定時間内に全てのＨＤＬに前記酵素が反応しきれず、正確にＨＤＬ−Ｃを測定できないことがある。
【０００４】
【特許文献１】特開平５−１７６７９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＨＤＬを多量に含む検体であっても正確にＨＤＬ−Ｃを測定することができる試薬キットと、ＨＤＬ−Ｃを測定する方法とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有する第一試薬と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬と、を含む試薬キットを提供する。
【０００７】
また、本発明は、試料と、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤とＨＤＬのコレステロールエステルに反応する第一酵素とを含有する第一試薬とを混合する工程と、試料と第一試薬との混合液にＨＤＬのコレステロールエステルに反応する第二酵素を含有する第二試薬を添加する工程と、を含むＨＤＬ−Ｃ測定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、ＨＤＬを多量に含む検体であっても正確にＨＤＬ−Ｃを測定することができる試薬キット及び測定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本実施形態のＨＤＬ−Ｃ測定試薬キットは、第一試薬と第二試薬とを含む。第一試薬は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質が酵素と反応するのを阻害する阻害剤と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有し、第二試薬は、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬を含有する。
【００１０】
ＨＤＬ−Ｃ測定においては、ＨＤＬからコレステロールを遊離させて後述するＵＶ法又は色素法によって測定する。このため、ＨＤＬ以外のリポタンパク質が酵素と反応し、コレステロールが遊離するのを阻害する必要がある。
【００１１】
阻害剤としては、カリクスアレン、界面活性剤、ポリアニオン、水溶性ポリマー、抗体などが挙げられる。これらの阻害剤のうち一種又は二種以上を組み合わせて用いることができる。これらの阻害剤は試料中のＨＤＬ以外のリポタンパク質と複合体又は凝集体を形成する。複合体又は凝集体を形成すると、これらに含まれる物質（例えば、エステル型コレステロールなど）への酵素反応が妨げられるため、該複合体又は凝集体中のコレステロールエステルからのコレステロールの遊離が抑制される。
【００１２】
カリクスアレンは、フェノールを基本骨格とし、フェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた環状オリゴマーである。
カリクスアレンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、カリクス（４）アレン、カリクス（６）アレン、カリクス（８）アレン、硫酸カリクス（４）アレン、硫酸カリクス（６）アレン、硫酸カリクス（８）アレン、酢酸カリクス（４）アレン、酢酸カリクス（６）アレン、酢酸カリクス（８）アレン、カルボキシカリクス（４）アレン、カルボキシカリクス（６）アレン、カルボキシカリクス（８）アレン、カリクス（４）アレンアミン、カリクス（６）アレンアミン、カリクス（８）アレンアミンなどが挙げられる。これらのカリクスアレンのうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。上述したカリクスアレンの中でも硫酸カリクスアレンが水溶性に優れ取り扱いが容易であるため、硫酸カリクスアレンを用いるのが好ましい。カリクスアレンの終濃度（第一試薬と第二試薬と検体とを混合した反応液中の濃度）は、好ましくは０．０５〜２０ｍＭ、より好ましくは０．１〜５ｍＭとなる。
【００１３】
界面活性剤は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。界面活性剤の中でもＨＬＢ値（Hydrophile-Lipophile Balance値：界面活性剤の親水性と疎水性の比率を示す値）が１６以上のものが好ましく、ＨＬＢ値が１７以上のものがより好ましい。具体的には、ポリオキシエチレンセチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＯ−５０）、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＢ−３０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＫ―２３０）、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＳ−４０）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（商品名：シグマ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９）などが挙げられる。これらの界面活性剤のうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。
【００１４】
ポリアニオンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンなどが挙げられる。これらのポリアニオンのうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。これらの阻害剤は二価カチオンと共に用いられるのが好ましい。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。
【００１５】
水溶性ポリマーは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとする）などが挙げられる。これらの水溶性ポリマーのうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。これらの水溶性ポリマーは二価カチオンと共に用いることもできる。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。
【００１６】
抗体は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。本明細書における「抗体」とは、抗体のフラグメント及びその誘導体をも含む。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。
【００１７】
本実施形態の試薬キットに用いられる抗体の具体例として、抗アポリポタンパク抗体類（例えば、抗アポリポタンパクＢ抗体、抗アポリポタンパクＣ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体など）、抗リポタンパク抗体類（例えば、抗βリポタンパク抗体など）などが挙げられる。これらの抗体のうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。
【００１８】
上述の阻害剤のうち、本実施形態ではＨＤＬ以外のリポタンパク質と結合して複合体を形成するカリクスアレンを用いることが好ましい。
【００１９】
第一試薬中の阻害剤の濃度が高すぎると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質だけでなく、ＨＤＬにも阻害剤が結合して酵素とＨＤＬとの反応が阻害されるため、阻害剤の濃度は酵素とＨＤＬとの反応を阻害しない程度の濃度であることが好ましい。また、第一試薬中の阻害剤の濃度が低すぎると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質を充分に阻害することができず、ＨＤＬだけでなく、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と酵素とが反応してしまうため、阻害剤の濃度はＨＤＬ以外のリポタンパク質を充分に阻害できる程度の濃度であることが好ましい。
【００２０】
本実施形態の第一試薬は、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する酵素（第一酵素）を含有し、第二試薬も第一酵素と同様の活性を有する酵素（ＨＤＬノコレステロールエステルと反応する酵素：第二酵素）を含む。第一酵素と第二酵素とは同種の酵素であってもよいし、異なる種類の酵素であってもよい。第一酵素及び第二酵素としては、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する酵素であれば何れも用いることができる。また、ＨＤＬからだけでなく、ＨＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールエステルと反応する活性を有していてもよい。第一酵素及び第二酵素の具体例としては、コレステロールエステラーゼ（以下、ＣＥとする）、リパーゼ、リポプロテインリパーゼなどが挙げられる。これらの酵素はＰＥＧ等を結合させて化学修飾したもの又は化学修飾していないものを用いることができる。これらの酵素の由来は、細菌由来、原生生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、これらの酵素は遺伝子操作によって得られたものであってもよい。
【００２１】
阻害法においては、先ず阻害剤を含む第一試薬と試料とを混合してＨＤＬ以外のリポタンパク質と阻害剤とを結合させる。次にリポタンパク質のコレステロールエステルと反応する酵素を含む第二試薬を添加してＨＤＬのみを酵素反応に導く。このため、従来は第一試薬にコレステロールエステルと反応する酵素が含まれていると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質とこの酵素とが反応してしまい、正確にＨＤＬ−Ｃを測定できないと考えられていた。しかしながら、本実施形態の第一試薬と試料とを混合すると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質に阻害剤が結合すると共に、第一酵素の作用によりＨＤＬからコレステロールが遊離する。第一酵素がＨＤＬ以外のリポタンパク質に作用しないのは、これらのリポタンパク質に第一酵素が作用する前に阻害剤が結合するためであると考えられる。第一試薬添加時から、ＨＤＬからのコレステロールの遊離を開始させることにより、ＨＤＬが多量に含まれる検体でも、所定の測定時間内に検体中の全てのＨＤＬからコレステロールを遊離させることができると考えられる。このため、本実施形態の試薬キットを用いると正確に検体中のＨＤＬ−Ｃ測定を行うことができる。
【００２２】
この試薬キットを用いて測定したＨＤＬ−Ｃ測定値は、沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値と非常によく相関する。沈殿法では、先ず検体にＰＥＧなどのポリアニオン及び二価カチオンを添加して疎水性の高いＶＬＤＬやＬＤＬなどを沈殿させて遠心分離を行い、上清に残ったＨＤＬを採取する。次に自動分析装置を用いてこのＨＤＬにコレステロール測定用試薬（例えば、Ｔ−ＣＨＯ試薬・ＫＬ「コクサイ」）などを添加しＨＤＬ−Ｃを測定する。沈殿法は、ＨＤＬ−Ｃを非常に正確に測定できるが、コレステロール測定の前にＨＤＬとＨＤＬ以外のリポタンパク質とを分画する必要がある。本実施形態の試薬キットを用いると測定前の分画が不要であるため、沈殿法に比べ測定操作が簡便である。
【００２３】
ＨＤＬ−Ｃ測定に供される試料としては、血液、血漿、血清、尿、髄液、唾液、精液など、生体から採取した試料を用いることができる。
遊離したコレステロールを測定する方法としては、公知のＨＤＬ−Ｃ測定法の何れを用いてもよい。例えば、ＵＶ法や色素法などによって測定することができる。以下、ＵＶ法及び色素法について説明する。
【００２４】
ＵＶ法とは、ＨＤＬから遊離したコレステロールを酸化型補酵素の存在下でコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＤＨとする）を作用させることによってコレステノンを生成させ、同時に生ずる還元型補酵素の吸光度を測定する方法である。下記の化学反応式に示すように、ＣＤＨの作用によって生成するＨＤＬ−Ｃの物質量（モル）と、当該反応の際に生ずる還元型補酵素の物質量（モル）とは化学量論的に等しい為、還元型補酵素の濃度を測定することによってＨＤＬ−Ｃの濃度を求めることができる。
【００２５】
【化１】
【００２６】
ＵＶ法で用いられるＣＤＨは、ＰＥＧ等を結合させて化学修飾した酵素又は化学修飾していない酵素を用いることができる。ＣＤＨの由来は、微生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、遺伝子操作によって得られたＣＤＨを用いてもよい。ＣＤＨは、第一試薬及び第二試薬の何れに含有させてもよいし、両方の試薬に含有させてもよい。
【００２７】
酸化型補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤとする）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ＮＡＤＰとする）を用いることができる。ＮＡＤとしては、例えば、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、βＮＡＤとする）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ｔ−ＮＡＤとする）等が挙げられる。ＮＡＤＰとしては、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、βＮＡＤＰとする）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ｔ−ＮＡＤＰとする）などが挙げられる。補酵素は、第一試薬及び第二試薬の何れに含有させてもよいし、両方の試薬に含有させてもよい。これらの補酵素のうち一種又は二種以上を用いることができる。
【００２８】
コレステロールが存在するとＣＤＨの作用で酸化型補酵素は還元型（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨなど）に変換される。βＮＡＤＨやβＮＡＤＰＨは３４０ｎｍの吸光度で測定でき、ｔ−ＮＡＤＨやｔ−ＮＡＤＰＨは４０５ｎｍの吸光度で測定できる。
【００２９】
次に色素法について説明する。
色素法においては、先ずＨＤＬから遊離したコレステロールをコレステロールオキシダーゼ（以下、ＣＯＤとする）の作用によってコレステノンを生成させる。この際同時に生ずる過酸化水素と色原体とからペルオキシダーゼ（以下、ＰＯとする）を作用させて、キノン系色素を生成させる。生成したキノン系色素の発色を４５０ｎｍ以上（色原体の種類に依存する）の吸光度で測定して過酸化水素の濃度を求め、これをＨＤＬ−Ｃの濃度に換算する。
【００３０】
ＣＯＤ及びＰＯはＰＥＧ等を結合させて化学修飾したもの又は化学修飾していないものを用いることができる。これらの酵素の由来は、細菌由来、原生生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、これらの酵素は遺伝子操作によって得られたものであってもよい。
【００３１】
色原体としては過酸化水素と反応して呈色するものであれば何れも用いることができる。例えば、４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡとする）等のカップラとデベロッパ（カップラと酸化縮合して色素を生ずる物質）との組み合わせが用いられる。例えば４−ＡＡとフェノール系化合物，ナフトール系化合物又はアニリン系化合物との組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組合せなどや、例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。デベロッパとしてのフェノール系化合物の具体例としては、例えばフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１ −ナフトール−２−カルボン酸等が挙げられ、また、アニリン系化合物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニル−エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）などが挙げられる。カップラとデベロッパとの組合せを用いる場合、カップラの使用量は、用いるカップラの種類や組み合わせるデベロッパの種類などにより異なるため一概には言えないが、終濃度として、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭであり、カップラとして４−ＡＡを使用する場合の使用量は、終濃度として、好ましくは０．０１〜５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜５ｍＭである。また、デベロッパの使用量は、用いるデベロッパの種類や組み合わせるカップラの種類等により異なるため一概には言えないが、終濃度として、好ましくは０．０１〜５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜５ｍＭである。トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例としては、例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、１０−〔３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノカルボニル〕−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンなどが挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラアミノベンジジンなどが挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチルアミノフェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾールなどが挙げられる。これら色原体の使用量は、通常この分野で用いられる濃度である。
【００３２】
色素法を用いてＨＤＬ−Ｃ測定を行う場合、ＣＯＤ、ＰＯ及び色原体は第一試薬及び第二試薬の何れに含有させてもよい。
【００３３】
第一試薬及び第二試薬には緩衝剤が含まれることが好ましい。緩衝剤の種類は特に限定されない。第一試薬のｐＨは６〜１０であることが好ましく、６．５〜７．５であることがより好ましい。第二試薬のｐＨは６〜１０であることが好ましく、８〜９であることがより好ましい。
【００３４】
上記の試薬には、酵素を安定化させる物質（酵素安定化物質）を含有させることが好ましい。酵素安定化物質として、アルカリ土類金属塩、グリシン系化合物、コール酸、配糖体、クリスタリン、これらの誘導体等が挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を用いることができる。
【００３５】
アルカリ土類金属塩は、上述の第一酵素及び／又は第二酵素を安定化させる作用を有するものであれば特に限定されない。例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、ラジウム塩、ベリリウム塩、ストロンチウム塩及びバリウム塩を用いることができる。試薬には、これらのアルカリ土類金属の乳酸塩、酢酸塩、硝酸塩、硫酸塩などを添加することができる。これらのうち、一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００３６】
グリシン系化合物は下記化学式（１）で示される。
Ｒ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ）ｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ （１）
（式中Ｒは水素又は／及び置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、又は置換基を有してもよいカルボニル基を示し、ｎは０又は１を示す）
ここで、Ｒは置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、置換基を有してもよいカルボニル基、アルキル基としてはメチル基、エチル基などを挙げることができ、フェニル基としてはヒドロキシフェニル基などを挙げることができる。また、置換基としてはヒドロキシメチル基、水酸基、アミノ基、カルボニル基、ニトロ基、メトキシ基、チオール基などを挙げることができる。試薬にグリシン系化合物を添加する場合、上記のうちの一種又は二種以上を試薬に添加することができる。また、上記化学式（１）に示すグリシン系化合物として、グリシン、グリシルグリシン、トリシンを用いるのが好ましい。試薬中のグリシン系化合物の濃度は０．０１〜２Ｍが好ましく、より好ましくは０．１〜１．５Ｍである。
【００３７】
コール酸及びその誘導体としては、例えばコール酸の塩類（例えば、ナトリウム塩など）、デオキシコール酸又はその塩類、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ）などが挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００３８】
配糖体及びその誘導体としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドなどが挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００３９】
クリスタリン及びその誘導体としては、例えば、α−クリスタリン、β−クリスタリン、γ−クリスタリン、δ−クリスタリンなどが挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００４０】
以下、実施例によりより具体的に説明する。以下の実施例におけるＨＤＬ−Ｃ測定は、上述のＵＶ法により行った。
【００４１】
（実施例）
下記の組成を含む第一試薬Ａ及び第二試薬を調製した。
第一試薬Ａ（ｐＨ７．３）
ＰＩＰＥＳ １０ｍＭ
二塩化ヒドラジニウム １００ｍＭ
硫酸カリクス（８）アレン １．５ｍＭ
βＮＡＤ ５．５ｍＭ
第二試薬（ｐＨ８．７）
ＴＡＰＳ ０．２ｍＭ
コール酸ナトリウム ０．１％
乳酸カルシウム ０．５ｍＭ
ドデシルマルトース ４．０ｍＭ
グリシン ０．４Ｍ
ＣＥ １４ＫＵ
ＣＤＨ ２４ＫＵ
【００４２】
さらに第一試薬Ａに様々な濃度のＣＥを添加して第一試薬Ｂ〜Ｈを調製した。第一試薬ＢへのＣＥ添加濃度は０．２５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＣへのＣＥ添加濃度は０．５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＤへのＣＥ添加濃度は０．７５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＥへのＣＥ添加濃度は１ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＦへのＣＥ添加濃度は１．２５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＧへのＣＥ添加濃度は１．５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＨへのＣＥ添加濃度は２ＫＵ／Ｌであった。
【００４３】
検体として１１人の生体から採取した血清検体１〜１１を用意した。
【００４４】
日立７１８０Ｓ形自動分析装置を用いて、検体４μＬと第一試薬１８０μＬと第二試薬６０μＬとを混合して測定用試料を作成し、各検体のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。測定中の温度は、反応開始から測定終了まで３７℃に保たれるように設定された。
【００４５】
対照として、上記実施例で用いた検体１〜１１に含まれるＨＤＬ−Ｃを、上述した沈殿法を用いて測定した。ＰＧポール（シスメックス製）を用いて検体中のＨＤＬ以外のリポタンパク質を沈殿させ、遠心分離を行ってＨＤＬを含む上清を採取した。自動分析装置でこの上清とＴ−ＣＨＯ試薬・ＫＬ「コクサイ」（何れもシスメックス製）とを混合し、各検体のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。
【００４６】
測定結果を下記表１に示す。また、実施例で算出したＨＤＬ−Ｃ測定値と比較例で算出したＨＤＬ−Ｃ測定値との相関グラフ及び直線の式（y = ax +b）を図１〜８に示す。図１〜８は、ぞれぞれ第一試薬Ａ〜Ｈを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図及び相関式である。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１及び図１〜８より、第一試薬にＣＥを添加すると、グラフの傾きが１に近似し、切片が０に近似した。即ち、第一試薬にＣＥを含有させた場合は、グラフの式がy=xに近づき、ＰＥＧ法とよく相関することが判った。以上より、ＣＥを含有する第一試薬を含む試薬キットを用いると、正確に検体中のＨＤＬ−Ｃを測定できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】第一試薬Ａを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図２】第一試薬Ｂを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図３】第一試薬Ｃを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図４】第一試薬Ｄを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図５】第一試薬Ｅを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図６】第一試薬Ｆを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図７】第一試薬Ｇを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図８】第一試薬Ｈを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診断の分野において、試料に含まれる高密度リポタンパク質中コレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃとする）を測定する試薬キット及びＨＤＬ−Ｃを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポタンパク質は、コレステロールなどの脂質とアポタンパク質との複合体の総称であり、血液などに含まれる。コレステロールは、主に脂肪酸とエステル結合したエステル型コレステロールとしてリポタンパク質中に存在する。リポタンパク質は比重の低いものから順にカイロミクロン（以下、ＣＭとする）、超低密度リポタンパク質（以下、ＶＬＤＬとする）、低密度リポタンパク質（以下、ＬＤＬとする）、高密度リポタンパク質（以下、ＨＤＬとする）などに分類されている。これらのうちＨＤＬは抗動脈硬化因子として注目されており、ＨＤＬ−Ｃの測定は各種動脈硬化症を含む循環器系疾患の重要な臨床検査項目のひとつである。
【０００３】
試料中のＨＤＬ−Ｃを定量する試薬として、例えば特許文献１記載の試薬が知られている。この試薬では、ＨＤＬからコレステロールを遊離させるために阻害法が用いられる。阻害法では、先ずＨＤＬ以外のリポタンパク質が酵素と反応するのを阻害する阻害剤を試料に添加する。次に、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する酵素の作用によりＨＤＬからコレステロールが遊離する。遊離したＨＤＬ−Ｃに酵素を反応させ、生じた反応産物を光学的に測定することによりＨＤＬ−Ｃが定量される。しかしながら、ＨＤＬを多量に含む試料を検体として用いた場合、所定の測定時間内に全てのＨＤＬに前記酵素が反応しきれず、正確にＨＤＬ−Ｃを測定できないことがある。
【０００４】
【特許文献１】特開平５−１７６７９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＨＤＬを多量に含む検体であっても正確にＨＤＬ−Ｃを測定することができる試薬キットと、ＨＤＬ−Ｃを測定する方法とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有する第一試薬と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬と、を含む試薬キットを提供する。
【０００７】
また、本発明は、試料と、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤とＨＤＬのコレステロールエステルに反応する第一酵素とを含有する第一試薬とを混合する工程と、試料と第一試薬との混合液にＨＤＬのコレステロールエステルに反応する第二酵素を含有する第二試薬を添加する工程と、を含むＨＤＬ−Ｃ測定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、ＨＤＬを多量に含む検体であっても正確にＨＤＬ−Ｃを測定することができる試薬キット及び測定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本実施形態のＨＤＬ−Ｃ測定試薬キットは、第一試薬と第二試薬とを含む。第一試薬は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質が酵素と反応するのを阻害する阻害剤と、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有し、第二試薬は、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬を含有する。
【００１０】
ＨＤＬ−Ｃ測定においては、ＨＤＬからコレステロールを遊離させて後述するＵＶ法又は色素法によって測定する。このため、ＨＤＬ以外のリポタンパク質が酵素と反応し、コレステロールが遊離するのを阻害する必要がある。
【００１１】
阻害剤としては、カリクスアレン、界面活性剤、ポリアニオン、水溶性ポリマー、抗体などが挙げられる。これらの阻害剤のうち一種又は二種以上を組み合わせて用いることができる。これらの阻害剤は試料中のＨＤＬ以外のリポタンパク質と複合体又は凝集体を形成する。複合体又は凝集体を形成すると、これらに含まれる物質（例えば、エステル型コレステロールなど）への酵素反応が妨げられるため、該複合体又は凝集体中のコレステロールエステルからのコレステロールの遊離が抑制される。
【００１２】
カリクスアレンは、フェノールを基本骨格とし、フェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた環状オリゴマーである。
カリクスアレンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、カリクス（４）アレン、カリクス（６）アレン、カリクス（８）アレン、硫酸カリクス（４）アレン、硫酸カリクス（６）アレン、硫酸カリクス（８）アレン、酢酸カリクス（４）アレン、酢酸カリクス（６）アレン、酢酸カリクス（８）アレン、カルボキシカリクス（４）アレン、カルボキシカリクス（６）アレン、カルボキシカリクス（８）アレン、カリクス（４）アレンアミン、カリクス（６）アレンアミン、カリクス（８）アレンアミンなどが挙げられる。これらのカリクスアレンのうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。上述したカリクスアレンの中でも硫酸カリクスアレンが水溶性に優れ取り扱いが容易であるため、硫酸カリクスアレンを用いるのが好ましい。カリクスアレンの終濃度（第一試薬と第二試薬と検体とを混合した反応液中の濃度）は、好ましくは０．０５〜２０ｍＭ、より好ましくは０．１〜５ｍＭとなる。
【００１３】
界面活性剤は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。界面活性剤の中でもＨＬＢ値（Hydrophile-Lipophile Balance値：界面活性剤の親水性と疎水性の比率を示す値）が１６以上のものが好ましく、ＨＬＢ値が１７以上のものがより好ましい。具体的には、ポリオキシエチレンセチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＯ−５０）、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：日光ケミカルズ（株）：ＢＢ−３０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＫ―２３０）、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＳ−４０）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類（商品名：シグマ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９）などが挙げられる。これらの界面活性剤のうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。
【００１４】
ポリアニオンは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、デキストラン硫酸、リンタングステン酸、ヘパリンなどが挙げられる。これらのポリアニオンのうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。これらの阻害剤は二価カチオンと共に用いられるのが好ましい。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。
【００１５】
水溶性ポリマーは、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであれば何れも用いることができる。具体的には、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとする）などが挙げられる。これらの水溶性ポリマーのうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。これらの水溶性ポリマーは二価カチオンと共に用いることもできる。二価カチオンとしてはマグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオンなどが挙げられる。
【００１６】
抗体は、ＨＤＬ以外のリポタンパク質からのコレステロールの遊離を抑制するものであればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。本明細書における「抗体」とは、抗体のフラグメント及びその誘導体をも含む。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。
【００１７】
本実施形態の試薬キットに用いられる抗体の具体例として、抗アポリポタンパク抗体類（例えば、抗アポリポタンパクＢ抗体、抗アポリポタンパクＣ抗体、抗アポリポタンパクＥ抗体など）、抗リポタンパク抗体類（例えば、抗βリポタンパク抗体など）などが挙げられる。これらの抗体のうち一種又は二種以上を阻害剤として用いることができる。
【００１８】
上述の阻害剤のうち、本実施形態ではＨＤＬ以外のリポタンパク質と結合して複合体を形成するカリクスアレンを用いることが好ましい。
【００１９】
第一試薬中の阻害剤の濃度が高すぎると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質だけでなく、ＨＤＬにも阻害剤が結合して酵素とＨＤＬとの反応が阻害されるため、阻害剤の濃度は酵素とＨＤＬとの反応を阻害しない程度の濃度であることが好ましい。また、第一試薬中の阻害剤の濃度が低すぎると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質を充分に阻害することができず、ＨＤＬだけでなく、ＨＤＬ以外のリポタンパク質と酵素とが反応してしまうため、阻害剤の濃度はＨＤＬ以外のリポタンパク質を充分に阻害できる程度の濃度であることが好ましい。
【００２０】
本実施形態の第一試薬は、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する酵素（第一酵素）を含有し、第二試薬も第一酵素と同様の活性を有する酵素（ＨＤＬノコレステロールエステルと反応する酵素：第二酵素）を含む。第一酵素と第二酵素とは同種の酵素であってもよいし、異なる種類の酵素であってもよい。第一酵素及び第二酵素としては、ＨＤＬのコレステロールエステルと反応する酵素であれば何れも用いることができる。また、ＨＤＬからだけでなく、ＨＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールエステルと反応する活性を有していてもよい。第一酵素及び第二酵素の具体例としては、コレステロールエステラーゼ（以下、ＣＥとする）、リパーゼ、リポプロテインリパーゼなどが挙げられる。これらの酵素はＰＥＧ等を結合させて化学修飾したもの又は化学修飾していないものを用いることができる。これらの酵素の由来は、細菌由来、原生生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、これらの酵素は遺伝子操作によって得られたものであってもよい。
【００２１】
阻害法においては、先ず阻害剤を含む第一試薬と試料とを混合してＨＤＬ以外のリポタンパク質と阻害剤とを結合させる。次にリポタンパク質のコレステロールエステルと反応する酵素を含む第二試薬を添加してＨＤＬのみを酵素反応に導く。このため、従来は第一試薬にコレステロールエステルと反応する酵素が含まれていると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質とこの酵素とが反応してしまい、正確にＨＤＬ−Ｃを測定できないと考えられていた。しかしながら、本実施形態の第一試薬と試料とを混合すると、ＨＤＬ以外のリポタンパク質に阻害剤が結合すると共に、第一酵素の作用によりＨＤＬからコレステロールが遊離する。第一酵素がＨＤＬ以外のリポタンパク質に作用しないのは、これらのリポタンパク質に第一酵素が作用する前に阻害剤が結合するためであると考えられる。第一試薬添加時から、ＨＤＬからのコレステロールの遊離を開始させることにより、ＨＤＬが多量に含まれる検体でも、所定の測定時間内に検体中の全てのＨＤＬからコレステロールを遊離させることができると考えられる。このため、本実施形態の試薬キットを用いると正確に検体中のＨＤＬ−Ｃ測定を行うことができる。
【００２２】
この試薬キットを用いて測定したＨＤＬ−Ｃ測定値は、沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値と非常によく相関する。沈殿法では、先ず検体にＰＥＧなどのポリアニオン及び二価カチオンを添加して疎水性の高いＶＬＤＬやＬＤＬなどを沈殿させて遠心分離を行い、上清に残ったＨＤＬを採取する。次に自動分析装置を用いてこのＨＤＬにコレステロール測定用試薬（例えば、Ｔ−ＣＨＯ試薬・ＫＬ「コクサイ」）などを添加しＨＤＬ−Ｃを測定する。沈殿法は、ＨＤＬ−Ｃを非常に正確に測定できるが、コレステロール測定の前にＨＤＬとＨＤＬ以外のリポタンパク質とを分画する必要がある。本実施形態の試薬キットを用いると測定前の分画が不要であるため、沈殿法に比べ測定操作が簡便である。
【００２３】
ＨＤＬ−Ｃ測定に供される試料としては、血液、血漿、血清、尿、髄液、唾液、精液など、生体から採取した試料を用いることができる。
遊離したコレステロールを測定する方法としては、公知のＨＤＬ−Ｃ測定法の何れを用いてもよい。例えば、ＵＶ法や色素法などによって測定することができる。以下、ＵＶ法及び色素法について説明する。
【００２４】
ＵＶ法とは、ＨＤＬから遊離したコレステロールを酸化型補酵素の存在下でコレステロールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＤＨとする）を作用させることによってコレステノンを生成させ、同時に生ずる還元型補酵素の吸光度を測定する方法である。下記の化学反応式に示すように、ＣＤＨの作用によって生成するＨＤＬ−Ｃの物質量（モル）と、当該反応の際に生ずる還元型補酵素の物質量（モル）とは化学量論的に等しい為、還元型補酵素の濃度を測定することによってＨＤＬ−Ｃの濃度を求めることができる。
【００２５】
【化１】
【００２６】
ＵＶ法で用いられるＣＤＨは、ＰＥＧ等を結合させて化学修飾した酵素又は化学修飾していない酵素を用いることができる。ＣＤＨの由来は、微生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、遺伝子操作によって得られたＣＤＨを用いてもよい。ＣＤＨは、第一試薬及び第二試薬の何れに含有させてもよいし、両方の試薬に含有させてもよい。
【００２７】
酸化型補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤとする）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ＮＡＤＰとする）を用いることができる。ＮＡＤとしては、例えば、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、βＮＡＤとする）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ｔ−ＮＡＤとする）等が挙げられる。ＮＡＤＰとしては、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、βＮＡＤＰとする）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ｔ−ＮＡＤＰとする）などが挙げられる。補酵素は、第一試薬及び第二試薬の何れに含有させてもよいし、両方の試薬に含有させてもよい。これらの補酵素のうち一種又は二種以上を用いることができる。
【００２８】
コレステロールが存在するとＣＤＨの作用で酸化型補酵素は還元型（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨなど）に変換される。βＮＡＤＨやβＮＡＤＰＨは３４０ｎｍの吸光度で測定でき、ｔ−ＮＡＤＨやｔ−ＮＡＤＰＨは４０５ｎｍの吸光度で測定できる。
【００２９】
次に色素法について説明する。
色素法においては、先ずＨＤＬから遊離したコレステロールをコレステロールオキシダーゼ（以下、ＣＯＤとする）の作用によってコレステノンを生成させる。この際同時に生ずる過酸化水素と色原体とからペルオキシダーゼ（以下、ＰＯとする）を作用させて、キノン系色素を生成させる。生成したキノン系色素の発色を４５０ｎｍ以上（色原体の種類に依存する）の吸光度で測定して過酸化水素の濃度を求め、これをＨＤＬ−Ｃの濃度に換算する。
【００３０】
ＣＯＤ及びＰＯはＰＥＧ等を結合させて化学修飾したもの又は化学修飾していないものを用いることができる。これらの酵素の由来は、細菌由来、原生生物由来、動物由来、植物由来、真菌由来のものなど、特に限定されない。また、これらの酵素は遺伝子操作によって得られたものであってもよい。
【００３１】
色原体としては過酸化水素と反応して呈色するものであれば何れも用いることができる。例えば、４−アミノアンチピリン（以下、４−ＡＡとする）等のカップラとデベロッパ（カップラと酸化縮合して色素を生ずる物質）との組み合わせが用いられる。例えば４−ＡＡとフェノール系化合物，ナフトール系化合物又はアニリン系化合物との組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組合せなどや、例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。デベロッパとしてのフェノール系化合物の具体例としては、例えばフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１ −ナフトール−２−カルボン酸等が挙げられ、また、アニリン系化合物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニル−エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）などが挙げられる。カップラとデベロッパとの組合せを用いる場合、カップラの使用量は、用いるカップラの種類や組み合わせるデベロッパの種類などにより異なるため一概には言えないが、終濃度として、好ましくは０．０１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．１〜１０ｍＭであり、カップラとして４−ＡＡを使用する場合の使用量は、終濃度として、好ましくは０．０１〜５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜５ｍＭである。また、デベロッパの使用量は、用いるデベロッパの種類や組み合わせるカップラの種類等により異なるため一概には言えないが、終濃度として、好ましくは０．０１〜５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜５ｍＭである。トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例としては、例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、１０−〔３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノカルボニル〕−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンなどが挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラアミノベンジジンなどが挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチルアミノフェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾールなどが挙げられる。これら色原体の使用量は、通常この分野で用いられる濃度である。
【００３２】
色素法を用いてＨＤＬ−Ｃ測定を行う場合、ＣＯＤ、ＰＯ及び色原体は第一試薬及び第二試薬の何れに含有させてもよい。
【００３３】
第一試薬及び第二試薬には緩衝剤が含まれることが好ましい。緩衝剤の種類は特に限定されない。第一試薬のｐＨは６〜１０であることが好ましく、６．５〜７．５であることがより好ましい。第二試薬のｐＨは６〜１０であることが好ましく、８〜９であることがより好ましい。
【００３４】
上記の試薬には、酵素を安定化させる物質（酵素安定化物質）を含有させることが好ましい。酵素安定化物質として、アルカリ土類金属塩、グリシン系化合物、コール酸、配糖体、クリスタリン、これらの誘導体等が挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を用いることができる。
【００３５】
アルカリ土類金属塩は、上述の第一酵素及び／又は第二酵素を安定化させる作用を有するものであれば特に限定されない。例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、ラジウム塩、ベリリウム塩、ストロンチウム塩及びバリウム塩を用いることができる。試薬には、これらのアルカリ土類金属の乳酸塩、酢酸塩、硝酸塩、硫酸塩などを添加することができる。これらのうち、一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００３６】
グリシン系化合物は下記化学式（１）で示される。
Ｒ−（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ）ｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ （１）
（式中Ｒは水素又は／及び置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、又は置換基を有してもよいカルボニル基を示し、ｎは０又は１を示す）
ここで、Ｒは置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、置換基を有してもよいカルボニル基、アルキル基としてはメチル基、エチル基などを挙げることができ、フェニル基としてはヒドロキシフェニル基などを挙げることができる。また、置換基としてはヒドロキシメチル基、水酸基、アミノ基、カルボニル基、ニトロ基、メトキシ基、チオール基などを挙げることができる。試薬にグリシン系化合物を添加する場合、上記のうちの一種又は二種以上を試薬に添加することができる。また、上記化学式（１）に示すグリシン系化合物として、グリシン、グリシルグリシン、トリシンを用いるのが好ましい。試薬中のグリシン系化合物の濃度は０．０１〜２Ｍが好ましく、より好ましくは０．１〜１．５Ｍである。
【００３７】
コール酸及びその誘導体としては、例えばコール酸の塩類（例えば、ナトリウム塩など）、デオキシコール酸又はその塩類、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ）などが挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００３８】
配糖体及びその誘導体としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドなどが挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００３９】
クリスタリン及びその誘導体としては、例えば、α−クリスタリン、β−クリスタリン、γ−クリスタリン、δ−クリスタリンなどが挙げられる。これらのうち一種又は二種以上を試薬に添加することができる。
【００４０】
以下、実施例によりより具体的に説明する。以下の実施例におけるＨＤＬ−Ｃ測定は、上述のＵＶ法により行った。
【００４１】
（実施例）
下記の組成を含む第一試薬Ａ及び第二試薬を調製した。
第一試薬Ａ（ｐＨ７．３）
ＰＩＰＥＳ １０ｍＭ
二塩化ヒドラジニウム １００ｍＭ
硫酸カリクス（８）アレン １．５ｍＭ
βＮＡＤ ５．５ｍＭ
第二試薬（ｐＨ８．７）
ＴＡＰＳ ０．２ｍＭ
コール酸ナトリウム ０．１％
乳酸カルシウム ０．５ｍＭ
ドデシルマルトース ４．０ｍＭ
グリシン ０．４Ｍ
ＣＥ １４ＫＵ
ＣＤＨ ２４ＫＵ
【００４２】
さらに第一試薬Ａに様々な濃度のＣＥを添加して第一試薬Ｂ〜Ｈを調製した。第一試薬ＢへのＣＥ添加濃度は０．２５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＣへのＣＥ添加濃度は０．５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＤへのＣＥ添加濃度は０．７５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＥへのＣＥ添加濃度は１ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＦへのＣＥ添加濃度は１．２５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＧへのＣＥ添加濃度は１．５ＫＵ／Ｌ、第一試薬ＨへのＣＥ添加濃度は２ＫＵ／Ｌであった。
【００４３】
検体として１１人の生体から採取した血清検体１〜１１を用意した。
【００４４】
日立７１８０Ｓ形自動分析装置を用いて、検体４μＬと第一試薬１８０μＬと第二試薬６０μＬとを混合して測定用試料を作成し、各検体のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。測定中の温度は、反応開始から測定終了まで３７℃に保たれるように設定された。
【００４５】
対照として、上記実施例で用いた検体１〜１１に含まれるＨＤＬ−Ｃを、上述した沈殿法を用いて測定した。ＰＧポール（シスメックス製）を用いて検体中のＨＤＬ以外のリポタンパク質を沈殿させ、遠心分離を行ってＨＤＬを含む上清を採取した。自動分析装置でこの上清とＴ−ＣＨＯ試薬・ＫＬ「コクサイ」（何れもシスメックス製）とを混合し、各検体のＨＤＬ−Ｃ濃度を測定した。
【００４６】
測定結果を下記表１に示す。また、実施例で算出したＨＤＬ−Ｃ測定値と比較例で算出したＨＤＬ−Ｃ測定値との相関グラフ及び直線の式（y = ax +b）を図１〜８に示す。図１〜８は、ぞれぞれ第一試薬Ａ〜Ｈを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図及び相関式である。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１及び図１〜８より、第一試薬にＣＥを添加すると、グラフの傾きが１に近似し、切片が０に近似した。即ち、第一試薬にＣＥを含有させた場合は、グラフの式がy=xに近づき、ＰＥＧ法とよく相関することが判った。以上より、ＣＥを含有する第一試薬を含む試薬キットを用いると、正確に検体中のＨＤＬ−Ｃを測定できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】第一試薬Ａを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図２】第一試薬Ｂを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図３】第一試薬Ｃを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図４】第一試薬Ｄを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図５】第一試薬Ｅを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図６】第一試薬Ｆを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図７】第一試薬Ｇを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【図８】第一試薬Ｈを用いた場合のＨＤＬ−Ｃ測定値と沈殿法によるＨＤＬ−Ｃ測定値との相関図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の高密度リポタンパク質中コレステロールを定量するための試薬キットであって、
高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤と、高密度リポタンパク質のコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有する第一試薬と、
高密度リポタンパク質のコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬と、を含む試薬キット。
【請求項２】
前記第一酵素がコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素である、請求項１記載の試薬キット。
【請求項３】
前記第二酵素がコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素である、請求項１又は２記載の試薬キット。
【請求項４】
ＮＡＤ又はＮＡＤＰが、前記第一試薬及び前記第二試薬からなる群より選択される少なくとも１つの試薬に含有されている、請求項１〜３の何れかに記載の試薬キット。
【請求項５】
コレステロール脱水素酵素が、前記第一試薬及び前記第二試薬からなる群より選択される少なくとも１つの試薬に含有されている、請求項１〜４の何れかに記載の試薬キット。
【請求項６】
前記阻害剤が、カリクスアレン、界面活性剤、ポリアニオン、水溶性ポリマー及び抗体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜５の何れかに記載の試薬キット。
【請求項７】
試料と、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤と高密度リポタンパク質のコレステロールエステルに反応する第一酵素とを含有する第一試薬とを混合する工程と、
前記試料と前記第一試薬との混合液に高密度リポタンパク質のコレステロールエステルに反応する第二酵素を含有する第二試薬を添加する工程と、
を含む高密度リポタンパク質中コレステロール測定方法。
【請求項１】
試料中の高密度リポタンパク質中コレステロールを定量するための試薬キットであって、
高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤と、高密度リポタンパク質のコレステロールエステルと反応する第一酵素とを含有する第一試薬と、
高密度リポタンパク質のコレステロールエステルと反応する第二酵素を含有する第二試薬と、を含む試薬キット。
【請求項２】
前記第一酵素がコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素である、請求項１記載の試薬キット。
【請求項３】
前記第二酵素がコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ及びリパーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素である、請求項１又は２記載の試薬キット。
【請求項４】
ＮＡＤ又はＮＡＤＰが、前記第一試薬及び前記第二試薬からなる群より選択される少なくとも１つの試薬に含有されている、請求項１〜３の何れかに記載の試薬キット。
【請求項５】
コレステロール脱水素酵素が、前記第一試薬及び前記第二試薬からなる群より選択される少なくとも１つの試薬に含有されている、請求項１〜４の何れかに記載の試薬キット。
【請求項６】
前記阻害剤が、カリクスアレン、界面活性剤、ポリアニオン、水溶性ポリマー及び抗体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜５の何れかに記載の試薬キット。
【請求項７】
試料と、高密度リポタンパク質以外のリポタンパク質と酵素との反応を抑制する阻害剤と高密度リポタンパク質のコレステロールエステルに反応する第一酵素とを含有する第一試薬とを混合する工程と、
前記試料と前記第一試薬との混合液に高密度リポタンパク質のコレステロールエステルに反応する第二酵素を含有する第二試薬を添加する工程と、
を含む高密度リポタンパク質中コレステロール測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−１９５４４３（Ｐ２００７−１９５４４３Ａ）
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６９７２（Ｐ２００６−１６９７２）
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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