黄色ブドウ球菌に対する感染防御免疫応答を誘導するためのポリペプチド
本発明は、配列番号１に対して構造的に近縁であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および、このようなポリペプチドの使用を特徴とする。配列番号１は全長型Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの誘導体である。天然に存在するこの全長型ポリペプチドは本明細書中では全長の「ＯＲＦ０８２６」として示される。配列番号１のこの誘導体はアラニンの付加を最初のメチオニンの後に含有する。配列番号１のＨｉｓタグ誘導体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫応答を生じさせることが見出された。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願明細書中を通して引用される参考文献は、特許請求されている発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【０００２】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、広範囲の様々な疾患および状態の原因である病原体である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる疾患および状態の例には、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、フルンケル、カルブンケル、膿痂疹、水疱性膿痂疹、蜂巣炎、ボトリオミセス症、毒素性ショック症候群、熱傷様皮膚症候群、中枢神経系の感染症、感染性および炎症性の眼疾患、骨髄炎、ならびに、関節および骨の他の感染症、ならびに、気道感染症が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＣｒｏｓｓｌｅｙおよびＡｒｃｈｅｒ（編）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．、１９９７）。
【０００３】
免疫学的方法を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症およびＳ．ａｕｒｅｕｓの拡大を食い止めるために用いることができる。免疫学的方法には、受動免疫法および能動免疫法が含まれる。受動免疫法では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを標的とする免疫グロブリンが用いられる。能動免疫法では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答が誘導される。
【０００４】
可能性のあるＳ．ａｕｒｅｕｓワクチンはＳ．ａｕｒｅｕｓの多糖およびポリペプチドを標的とする。標的化を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの好適な多糖またはポリペプチドをワクチン成分として使用して達成することができる。可能なワクチン成分として用いることができる多糖の例には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型およびＳ．ａｕｒｅｕｓ８型の莢膜多糖が含まれる（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ他、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４６：４９１−４９６、２００２）。可能なワクチン成分として用いることができるポリペプチドの例には、コラーゲンアドへジン、フィブリノーゲン結合タンパク質およびクランピング因子が含まれる（Ｍａｍｏ他、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１０：４７−５４、１９９４；Ｎｉｌｓｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：２６４０−２６４９、１９９８；Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１８４：１５７２−１５８０、２００１）。
【０００５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのポリペプチドの配列に関する情報が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのゲノムを配列決定することから得られている（Ｋｕｒｏｄａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５７：１２２５−１２４０、２００１；Ｂａｂａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５９：１８１９−１８２７、２０００；Ｋｕｎｓｃｈ他、欧州特許出願公開ＥＰ０７８６５１９（１９９７年７月３０日公開））。ある程度ではあるが、バイオインフォマティクスが、ゲノム配列決定から得られたポリペプチド配列を特徴づけようとして用いられている（Ｋｕｎｓｃｈ他、欧州特許出願公開ＥＰ０７８６５１９（１９９７年７月３０日公開））。
【０００６】
ディスプレー技術を伴う技術などの様々な技術および感染患者からの血清を、可能性のある抗原をコードする遺伝子を特定しようとすることにおいて使用することができる（Ｆｏｓｔｅｒ他、国際特許出願公開ＷＯ０１／９８４９９（２００１年１２月２７日公開）；Ｍｅｉｎｋｅ他、国際特許出願公開ＷＯ０２／０５９１４８（２００２年８月１日公開）；Ｅｔｚ他、ＰＮＡＳ、９９：６５７３−６５７８、２００２）。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、配列番号１に対して構造的に近縁であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および、このようなポリペプチドの使用を特徴とする。配列番号１は全長型Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの誘導体である。天然に存在するこの全長型ポリペプチドは本明細書中では全長の「ＯＲＦ０８２６」として示される。配列番号１のこの誘導体はアラニンの付加を最初のメチオニンの後に含有する。配列番号１のＨｉｓタグ誘導体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫応答を生じさせることが見出された。
【０００８】
「感染防御」免疫または「感染防御」免疫応答に対する言及は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する検出可能なレベルの感染防御を示す。このような感染防御レベルは、動物モデルを使用して評価することができ、例えば、本明細書中に記載される動物モデルなどを使用して評価することができる。
【０００９】
従って、本発明の第１の態様では、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原であって、ポリペプチドが、配列番号３、配列番号４または配列番号５ではないポリペプチド免疫原が記載される。免疫原に対する言及は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供することができることを示す。
【００１０】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むということに対する言及は、配列番号１に関連づけられる領域が存在すること、および、さらなるポリペプチド領域が存在してもよいことを示す。配列番号３、配列番号４または配列番号５のポリペプチドは８５％の同一性に含まれるが、本発明の第１の態様から除外される。
【００１１】
参照配列に対するパーセント同一性（これはまた、参照配列に対してパーセント同一であるとして示される）は、ポリペプチド配列を参照配列に関してアラインメントし、対応する領域における同一アミノ酸の数を求めることによって決定される。この数が、参照配列（例えば、配列番号１）におけるアミノ酸の総数によって除され、次いで、１００が乗じられ、最も近い整数に丸められる。
【００１２】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドと、このポリペプチドにカルボキシル末端またはアミノ末端において共有結合的に結合した１つ以上のさらなる領域または成分とを含む免疫原が記載され、この場合、それぞれの領域または成分が独立して、下記の性質：
免疫応答を強化すること、精製を容易にすること、または、ポリペプチドの安定性を促進すること
の少なくとも１つを有する領域または成分から選択される。
【００１３】
「さらなる領域または成分」に対する言及は、ＯＲＦ０８２６の領域とは異なる領域または成分を示す。さらなる領域または成分は、例えば、さらなるポリペプチド領域またはペプチド以外の領域が可能である。
【００１４】
本発明の別の態様では、患者においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫応答を誘導することができる組成物が記載される。本発明の組成物は、医薬的に許容されるキャリアと、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドの免疫学的効果的な量とを含む。
【００１５】
免疫学的効果的な量は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する感染防御免疫を提供するために十分な量である。この量は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の可能性または重篤度を著しく防止するために十分でなければならない。
【００１６】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する感染防御免疫を提供するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む核酸が記載される。組換え遺伝子は、ポリペプチドをコードする組換え核酸を、適切な転写およびプロセシングのための調節エレメント（これには、翻訳エレメントおよび翻訳後エレメントを含むことができる）と一緒に含有する。組換え遺伝子は宿主ゲノムから独立して存在することができるか、または、宿主ゲノムの一部であることが可能である。
【００１７】
組換え核酸は、この配列および／または形態によって自然界に存在しない核酸である。組換え核酸の例には、精製された核酸、自然界に見出されるのと異なる核酸を提供する一緒に組み合わされた２つ以上の核酸領域、および、天然において互いに会合する１つ以上の核酸領域（例えば、上流または下流の領域）の非存在が含まれる。
【００１８】
本発明の別の態様では、組換え細胞が記載される。本発明の細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
【００１９】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドを作製する方法が記載される。本発明の方法は、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を成長させること、および、このポリペプチドを精製することを伴う。
【００２０】
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を宿主において成長させる工程と、このポリペプチドを精製する工程とを含むプロセスによって作製された、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドが記載される。種々の宿主細胞を用いることができる。
【００２１】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する患者における感染防御免疫応答を誘導する方法が記載される。本発明の方法は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドの免疫学的効果的な量、または、このような感染防御ポリペプチドを含有する免疫原の免疫学的効果的な量を患者に投与する工程を含む。
【００２２】
特定の用語が相互に排他的でない限り、「または」に対する言及はいずれかの可能性または両方の可能性を示す。場合により、「および／または」などの表現が、いずれかの可能性または両方の可能性を強調するために使用される。
【００２３】
「含む」などの開いた用語に対する言及はさらなる要素または工程を可能にする。場合により、「１つ以上の」などの表現が、さらなる要素または工程の可能性を強調するために、開いた用語とともに、または、開いた用語を伴うことなく使用される。
【００２４】
明示的に言及されない限り、「ａ」または「ａｎ」などの用語に対する言及は１つに限定されない。例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」は「ｃｅｌｌｓ（細胞）」を除外しない。場合により、１つまたは複数などの表現が、複数の存在が可能であることを強調するために使用される。
【００２５】
本発明の他の特徴および利点が、種々の実施例を含めて、本明細書中に提供されるさらなる記載から明らかである。提供された実施例は、本発明を実施する際に有用である種々の構成成分および方法論を例示する。実施例により、特許請求されている発明は限定されない。本開示に基づいて、当業者は、本発明を実施するために有用である他の構成成分および方法論を特定することができ、また、用いることができる。
【００２６】
図１は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を例示する。全配列は配列番号２である。太字で示される部分は配列番号１である。下線領域は、配列番号１に付加されたＨｉｓタグ領域である。
図２は、配列番号１（ＳＥＱ１）配列番号３（ＳＥＱ３）、配列番号４（ＳＥＱ４）、配列番号５（ＳＥＱ５）、配列番号６（ＳＥＱ６）、および配列番号７（ＳＥＱ７）の間での配列比較を例示する。アミノ酸の違いが太字で示される。
図３は、配列番号２をコードする核酸配列（配列番号８）を例示する。配列番号１をコードする領域が太字で示される。Ｈｉｓタグ領域およびＧＣＣのアラニンコドンには下線が引かれている。
図４は、ＯＲＦ０８２６をコードする核酸配列（配列番号９）を例示する。
図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する別々の実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【００２７】
感染防御免疫を提供する配列番号１近縁ポリペプチドの能力が、配列番号２を使用して下記に提供される実施例において例示される。配列番号２は配列番号１のＨｉｓタグ誘導体である。Ｈｉｓタグはポリペプチドの精製および同定を容易にする。
【００２８】
配列番号１は、ＯＲＦ０８２６と称される全長型Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの誘導体である。配列番号１と構造的に近縁であるポリペプチドには、異なるＳ．ａｕｒｅｕｓ株に存在する対応した領域と、天然に存在する領域の誘導体とを含有するポリペプチドが含まれる。配列番号１のアミノ酸配列が図１に太字の領域によって例示される。図１はまた、配列番号２に存在するＨｉｓタグ領域を例示する。
【００２９】
ＯＲＦ０８２６の配列
ＯＲＦ０８２６近縁配列には、参考文献毎に異なる名称が与えられている。異なる名称のいくつかの例が、Ｋｕｒｏｄａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５７：１２２５−１２４０、２００１において（ＳＡＶ２３０４９およびＳＡ２０９７）、Ｂａｂａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５９：１８１９−１８２７、２００２において（ＭＷ２２２２）、また、Ｅｔｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（１０）：６５７３−６５７８、２００２において（ＳＡ２２９５）示される。
【００３０】
ＯＲＦ０８２６は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの分泌型抗原Ｓｓａとの大きな程度の相同性を互いに有する。Ｓｓａは、Ｌａｎｇ他、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２９：２１３−２２０、２０００に記載される。
【００３１】
ＯＲＦ０８２６近縁配列に対応するポリペプチド配列が種々の特許刊行物において提供されているようである（Ｍｅｉｎｋｅ他、国際特許出願公開ＷＯ０２／０５９１４８（２００２年８月１日公開）、および、Ｍａｓｉｇｎａｎｉ他、国際特許出願公開ＷＯ０２／０９４８６８（２００２年１１月２８日公開））。
【００３２】
図２は種々のＯＲＦ０８２６近縁配列の配列比較を提供する。配列番号３はメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓの配列であり（これは、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋに寄託された核酸配列データを検索することによって得られた）、配列番号４はＷＯ０２／０５９１４８の配列識別番号７３に対応し、配列番号５はＷＯ０２／０９４８６８の配列識別番号７８２に対応し、配列番号６および配列番号７は、天然に存在するさらなる配列である。
【００３３】
天然に存在する他のＯＲＦ０８２６配列を、既知のＯＲＦ０８２６配列と比較して、大きな程度の配列類似性または連続するアミノ酸の存在に基づいて特定することができる。連続するアミノ酸は特徴的なタグを提供する。異なる実施形態において、天然に存在するＯＲＦ０８２６配列は、配列番号１でのように、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも５０個の連続するアミノ酸を有し、および／または、配列番号１との少なくとも８５％の配列類似性または配列同一性を有する、ブドウ球菌属細菌（好ましくは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に見出される配列である。
【００３４】
配列類似性は、この分野で広く知られている種々のアルゴリズムおよび技術によって求めることができる。一般には、配列類似性は、ギャップ、付加および置換を配列の一方において考慮して、最大のアミノ酸同一性を得るために２つの配列をアラインメントする技術によって決定される。
【００３５】
配列類似性を、例えば、プログラムｌａｌｉｇｎ（これはＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ，（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１２：３３７−３５７、１９９１）によって開発された；＜＜ｓｉｍ＞＞プログラムについて）を利用する局所的アラインメントツールを使用して求めることができる。選択肢および環境変数は下記の通りである：−ｆ＃ギャップ内の最初の残基に対するペナルティー（初期値、−１４）；−ｇ＃ギャップ内のそれぞれのさらなる残基に対するペナルティー（初期値、−４）；−ｓ ｓｔｒ（ＳＭＡＴＲＩＸ）代わりのスコア化行列ファイルのファイル名。タンパク質配列については、ＰＡＭ２５０が配列アラインメントのための初期値−ｗ＃（ＬＩＮＬＥＮ）出力ライン長（６０）によって使用される。
【００３６】
配列番号１近縁ポリペプチド
配列番号１近縁ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有する。「ポリペプチド」に対する言及は最小または最大のサイズ制限を提供しない。
【００３７】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドは配列番号１からの約２５個までのアミノ酸変化を含有する。異なる実施形態において、配列番号１近縁ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるか、または、少なくとも９４％同一であるか、または、少なくとも９９％同一であり、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸変化によって配列番号１とは異なり、または、配列番号１のアミノ酸２から１６７から本質的にはなる。それぞれのアミノ酸変化は独立して、付加、置換または欠失のいずれかである。
【００３８】
示されたアミノ酸から「本質的にはなる」に対する言及は、参照されたアミノ酸が存在すること、および、さらなるアミノ酸が存在してもよいことを示す。このようなさらなるアミノ酸はカルボキシル末端またはアミノ末端において存在し得る。異なる実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のさらなるアミノ酸が存在する。好ましいさらなるアミノ酸はアミノ末端のメチオニンである。
【００３９】
様々な変化を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を誘導することができる誘導体を得るために配列番号１に対して行うことができる。変化を、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を誘導する能力を保持する誘導体を得るために、または、感染防御免疫を提供することに加えて、特定の目的を達成することができる領域をもまた有する誘導体を得るために行うことができる。
【００４０】
図２に提供される配列比較は、配列番号１に対する可能性のある変化の設計を導くことを助けるために使用することができる。加えて、様々な変化を、他のＯＲＦ０８２６配列を考慮に入れて、また、アミノ酸の公知の性質を考慮に入れて行うことができる。
【００４１】
一般には、種々のアミノ酸を置換して、活性を保持することにおいて、類似する性質を有するアミノ酸を交換することが好ましい。アミノ酸置換のために考慮に入れることができる要因には、アミノ酸のサイズ、電荷、極性および疎水性が含まれる。アミノ酸の性質に対する種々のアミノ酸Ｒ基の影響はこの分野では広く知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２）、付録１Ｃを参照のこと）。
【００４２】
アミノ酸を交換して、活性を維持することにおいて、代替アミノ酸は１つ以上の類似する性質（例えば、ほぼ同じ電荷および／またはサイズおよび／または極性および／または疎水性など）を有しなければならない。例えば、バリンをロイシンの代わりに使用すること、アルギニンをリシンの代わりに使用すること、および、アスパラギンをグルタミンの代わりに使用することは、ポリペプチドが機能することにおいて変化を引き起こさないための良好な候補である。
【００４３】
特定の目的を達成するための変化には、ポリペプチドの産生または効力、または、コードされた核酸のクローニングを容易にするために設計される変化が含まれる。ポリペプチドの産生を、組換え発現のために好適な開始コドン（例えば、メチオニンに対するコドン）の使用によって容易にすることができる。このようなメチオニンは後で、細胞のプロセシングのときに除かれる場合がある。クローニングを、例えば、アミノ酸の付加または変化が付随し得る制限部位の導入によって容易にすることができる。
【００４４】
免疫応答を誘導するポリペプチドの効力をエピトープ増強によって高めることができる。エピトープ増強を、種々の技術を使用して、例えば、ＭＨＣ分子に対するペプチド親和性を改善するためのアンカー残基の変化を伴う技術、および、Ｔ細胞受容体に対するペプチド−ＭＨＣ複合体の親和性を増大させる技術などを使用して行うことができる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ、１：２０９−２１９、２００１）。
【００４５】
好ましくは、ポリペプチドは精製ポリペプチドである。「精製ポリペプチド」は、このポリペプチドが天然において会合する１つ以上の他のポリペプチドを有しない環境で存在し、および／または、存在する総タンパク質の少なくとも約１０％によって表される。異なる実施形態において、精製ポリペプチドは、サンプルまたは調製物における総タンパク質の少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９５％を表す。
【００４６】
１つの実施形態において、ポリペプチドは「実質的に精製される」。実質的に精製されたポリペプチドは、このポリペプチドが天然において会合する他のポリペプチドのすべてまたはこのほとんどを有しない環境で存在する。例えば、実質的に精製されたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、他のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのすべてまたはこのほとんどを有しない環境で存在する。環境は、例えば、サンプルまたは調製物であり得る。
【００４７】
「精製された（される）」または「実質的に精製された（される）」に対する言及は、ポリペプチドが何らかの精製を受けることを必要とせず、例えば、精製されていない化学合成されたポリペプチドを包含し得る。
【００４８】
ポリペプチドの安定性を、ポリペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端を修飾することによって高めることができる。可能な修飾の例には、アミノ末端感染防御基（例えば、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニルなど）、および、カルボキシル末端感染防御基（例えば、アミド、メチルアミドおよびエチルアミドなど）が含まれる。
【００４９】
本発明の実施形態において、ポリペプチド免疫原は、カルボキシル末端またはアミノ末端においてポリペプチドに共有結合的に結合した１つ以上のさらなる領域または成分を含有する免疫原の一部であり、この場合、それぞれの領域または成分は独立して、下記の性質：
免疫応答を強化すること、精製を容易にすること、または、ポリペプチドの安定性を促進すること
の少なくとも１つを有する領域または成分から選択される。ポリペプチドの安定性を、例えば、アミノ末端またはカルボキシル末端に存在させることができる基（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して高めることができる。
【００５０】
ポリペプチドの精製を、精製を容易にするために所与の基をカルボキシル末端またはアミノ末端に付加することによって高めることができる。精製を容易にするために使用することができる基の例には、親和性タグを提供するポリペプチドが含まれる。親和性タグの例には、６個のヒスチジンのタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオンおよびマルトース結合タンパク質が含まれる。
【００５１】
免疫応答を誘導するポリペプチドの能力を、免疫応答を一般に高める基を使用して高めることができる。ポリペプチドに対する免疫応答を高めるためにポリペプチドに結合することができる基の例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）が含まれる（Ｂｕｃｈａｎ他、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３７：５４５−５５２）。
【００５２】
ポリペプチドの製造
ポリペプチドは、化学合成を伴う技術、および、ポリペプチドを産生する細胞からの精製を伴う技術をはじめとする標準的な技術を使用して製造することができる。ポリペプチドを化学合成するための様々な技術がこの分野では広く知られている（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｄｅｃｋｅｒ、１９９０）を参照のこと）。組換えポリペプチドの製造および精製のための様々な技術もまたこの分野では広く知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２を参照のこと）。
【００５３】
ポリペプチドを細胞から得ることは、ポリペプチドを産生させるための組換え核酸技術を使用して容易になる。ポリペプチドを産生させるための組換え核酸技術は、ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を細胞に導入すること、または、ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を作製すること、および、ポリペプチドを発現させることを伴う。
【００５４】
組換え遺伝子は、ポリペプチドをコードする核酸を、ポリペプチド発現のための調節エレメントと一緒に含有する。組換え遺伝子は細胞のゲノムに存在させることができるか、または、発現ベクターの一部であることが可能である。
【００５５】
組換え遺伝子の一部として存在させることができる調節エレメントには、ポリペプチドをコードする配列と天然において会合する調節エレメント、および、ポリペプチドをコードする配列と天然では会合しない外因性の調節エレメントが含まれる。外因性の調節エレメント（例えば、外因性のプロモーターなど）が、組換え遺伝子を特定の宿主において発現させるために、または、発現レベルを増大させるために有用であり得る。一般に、組換え遺伝子において存在する調節エレメントには、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および、必要な場合には存在するオペレーターが含まれる。真核生物細胞におけるプロセシングのための好ましいエレメントの１つがポリアデニル化シグナルである。
【００５６】
細胞における組換え遺伝子の発現は発現ベクターの使用によって容易になる。好ましくは、発現ベクターはまた、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞における自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、および、高コピー数のための潜在的能力を含有する。発現ベクターの例には、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドおよびウイルスが含まれる。
【００５７】
遺伝暗号の縮重性のために、非常に多数の異なるコード核酸配列を、特定のポリペプチドをコードするために使用することができる。遺伝暗号の縮重性は、ほとんどすべてのアミノ酸が、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち、「コドン」によってコードされるために生じる。アミノ酸は下記のようなコドンによってコードされる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラジン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００５８】
配列番号１近縁ポリペプチドの組換え核酸発現のための好適な細胞は原核生物および真核生物である。原核生物細胞の例には、大腸菌、ブドウ球菌属のメンバー（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー（例えば、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなど）、ラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー（例えば、Ｌ．ｌａｃｔｉｓなど）、および、バチルス（Ｂａｃｉｌｕｓ）属のメンバー（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）が含まれる。真核生物細胞の例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメンバー（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のメンバー（例えば、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓまたはＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、および、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ）など）が含まれる。
【００５９】
組換え遺伝子の作製、細胞内への導入および組換え遺伝子発現のための様々な技術がこの分野では広く知られている。このような技術の様々な例が、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２）、および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）などの参考文献に提供される。
【００６０】
所望される場合、特定の宿主における発現をコドン最適化によって高めることができる。コドン最適化では、より好ましいコドンの使用が含まれる。種々の宿主におけるコドン最適化のための様々な技術がこの分野では広く知られている。
【００６１】
配列番号１近縁ポリペプチドは翻訳後修飾（例えば、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化またはアセチル化）を含有することができる。ポリペプチドの「ポリペプチド」配列または「アミノ酸」配列に対する言及は、宿主細胞（例えば、酵母宿主など）に由来する翻訳後修飾の構造を有する１つ以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを包含する。
【００６２】
翻訳後修飾を化学的に、または、好適な宿主を使用することによって生じさせることができる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、末端から２番目のアミノ酸の性質により、Ｎ末端のメチオニンが除去されるかどうかが決定されるようである。さらに、末端から２番目のアミノ酸の性質によりまた、Ｎ末端のアミノ酸がＮα−アセチル化されるかが決定される（Ｈｕａｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６：８２４２−８２４６、１９８７）。別の例には、タンパク質がＮ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化によって修飾される場合、分泌リーダーの存在による分泌のために標的化されるポリペプチド（例えば、シグナルペプチド）が含まれる（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６：９１５−９４４、１９８７）。
【００６３】
アジュバント
アジュバントは、免疫応答を生じさせる際に免疫原を助けることができる物質である。アジュバントは、種々の機構によって、例えば、下記の１つ以上によって機能することができる：抗原の生物学的または免疫学的な半減期を増大すること；抗原提示細胞への抗原送達を改善すること；抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび提示を改善すること；および、免疫調節性サイトカインの産生を誘導すること（Ｖｏｇｅｌ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３０（増刊３）：Ｓ２６６−２７０、２０００）。
【００６４】
様々な異なるタイプのアジュバントを、免疫応答の生成を助けるために用いることができる。具体的なアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムの他の塩、リン酸カルシウム、ＤＮＡ ＣｐＧモチーフ、モノホスホリル脂質Ａ、コレラ毒素、大腸菌の熱不安定毒素、百日咳毒素、ムラミルジペプチド、フロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激複合体、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニン、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチドアナログ、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２が含まれる（Ｖｏｇｅｌ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３０（増刊３）：Ｓ２６６−２７０、２０００；Ｋｌｅｉｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８９：３１１−３２１、２０００）。
【００６５】
感染防御免疫を誘導するための患者
「患者」は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが感染することができる哺乳動物を示す。患者は予防的または治療的に処置することができる。予防的処置は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の可能性またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の重篤度を低下させるために、十分な感染防御免疫をもたらす。治療的処置を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の重篤度を軽減するために行うことができる。
【００６６】
予防的処置を、本明細書中に記載される免疫原を含有するワクチンを使用して行うことができる。このような処置は、好ましくは、ヒトに対して行われる。ワクチンを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の危険性が増大している一般集団またはこのような人々に投与することができる。
【００６７】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の危険性が増大している人々には、医療従事者、入院患者、免疫系が低下した患者、手術を受けている患者、異物の身体インプラント（例えば、カテーテルまたは血管デバイスなど）を受け入れている患者、低下した免疫を生じさせる治療法に直面している患者、および、火傷または創傷による傷害の増大した危険性を有する職業従事者が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＣｒｏｓｓｌｅｙおよびＡｒｖｈｅｒ（編）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．、１９９７）。
【００６８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓが感染し得る非ヒト患者には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコおよびマウスが含まれる。非ヒト患者の処置は、ペットおよび家畜を感染防御することにおいて、また、特定の処置の効力を評価することにおいて有用である。
【００６９】
混合ワクチン
配列番号１近縁ポリペプチドは、免疫応答を誘導するために、単独で、または、他の免疫原との組合せで使用することができる。存在させることができるさらなる免疫原には、下記が含まれる：１つ以上のさらなるＳ．ａｕｒｅｕｓ免疫原、例えば、本発明の背景（上掲）において示された免疫原；１つ以上の他のブドウ球菌属生物（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉまたはＳ．ｌｕｎｇｕｎｅｎｓｉｓなど）を標的化する１つ以上の免疫原；および、他の感染性生物を標的化する１つ以上の免疫原。
【００７０】
動物モデルシステム
動物モデルシステムが、ブドウ球菌属に対する感染防御免疫応答を生じさせる免疫原の効力を評価するために使用された。感染防御動物モデルを設定する際に遭遇した２つの障害が、（１）先天性免疫を乗り越えるために必要とされる非常に大きな抗原投与用量、および（２）早すぎて、感染防御応答を検出することができない死亡率であった。具体的には、細菌抗原投与後、マウスは２４時間以内に感染により死亡した。このことは、感染を解消するための特異的な免疫応答のための十分な時間を与えなかった。用量を低下させた場合、コントロールマウスおよび免疫化マウスはともに感染に耐えて生存した。
【００７１】
これらの障害は、定常期の細胞から調製され、適切に力価測定され、静脈内投与されたブドウ球菌を伴う遅い速度論の致死性モデルを使用することによって検討された。この遅い死亡速度論は、細菌感染を克服するための特異的な免疫防御のための十分な時間を与えている（例えば、２４時間でなく、１０日間）。
【００７２】
定常期のブドウ球菌細胞を、固体培地で成長させた細胞から得ることができる。定常期のブドウ球菌細胞はまた、液体から得ることができる。しかしながら、固体培地で成長させた細胞を用いた結果の方が再現性が良かった。細胞は、好都合には、固体培地で一晩成長させることができる。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを、倍加時間が約２０分から３０分である条件のもとで約１８時間から約２４時間まで成長させることができる。
【００７３】
ブドウ球菌を、ブドウ球菌の能力を維持するための標準的な技術を使用して固体培地または液体培地から単離することができる。単離されたブドウ球菌は、例えば、グリセロールを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水における洗浄された高密度懸濁物（＞１０９コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍＬ）として−７０℃で保存することができる。
【００７４】
ブドウ球菌の抗原投与は、１日目または２日目から開始して約７日から１０日の期間にわたって動物モデルにおいて約８０％から９０％の死亡をもたらす効力を有しなければならない。力価測定実験を、保存されたブドウ球菌接種物の効力をモニターするために、動物モデルを使用して行うことができる。力価測定実験を接種実験の約１週間前から２週間前に行うことができる。
【００７５】
力価測定実験のための最初の効力は以前の実験に基づくことができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび動物モデル系統Ｂｅｃｋｅｒについては、好適な効力が一般には、５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌから８ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌの範囲に見出された。
【００７６】
投与
免疫原は、この分野で広く知られている技術と一緒に、本明細書中に提供される指針を使用して配合することができ、および、患者に投与することができる。医薬品投与のための様々な指針が、一般には、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（編：ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９９）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版、編：Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００）、および、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（第２版、編：ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９０）に提供される（これらはそれぞれが参照により本明細書中に組み込まれる）。
【００７７】
医薬的に許容されるキャリアは免疫原の保存および患者への投与を容易にする。医薬的に許容されるキャリアは種々の成分（例えば、緩衝剤、無菌の注射用水、規定生理的食塩水またはリン酸塩緩衝化生理的食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートなど）を含有することができる。
【００７８】
免疫原は、種々の経路によって、例えば、皮下経路、筋肉内経路または粘膜経路などによって投与することができる。皮下投与および筋肉内投与を、例えば、ニードルまたはジェット式注射器を使用して行うことができる。
【００７９】
好適な投薬法が、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路、所望される効果；ならびに、用いられる具体的な化合物をはじめとする、この分野で広く知られている要因を考慮に入れて決定される。免疫原は多回用量ワクチン形式で使用することができる。１回の用量は１．０μｇから１．０ｍｇの総ポリペプチドの範囲からなることが予想され、本発明の種々の実施形態では、この範囲は０．０１ｍｇから１．０ｍｇおよび０．１ｍｇから１．０ｍｇである。
【００８０】
投薬時期は、この分野で広く知られている様々な要因に依存する。最初の投与の後、１回以上の追加免疫投薬を、抗体力価を維持または増強するためにこの後に施すことができる。投薬法の一例が、１日目、１ヶ月、４ヶ月または６ヶ月または１２ヶ月のいずれかでの３回目の投薬、および、必要とされる場合にはさらに経過した時間でのさらなる追加免疫投薬である。
【００８１】
抗体の生成
配列番号１近縁ポリペプチドは、このポリペプチドまたはＳ．ａｕｒｅｕｓに結合する抗体および抗体フラグメントを生じさせるために使用することができる。このような抗体および抗体フラグメントは、ポリペプチドの精製、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの同定、または、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する治療的処置または予防的処置における使用を含む種々の使用法を有する。
【００８２】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルが可能である。抗体を作製および使用するための様々な技術がこの分野で広く知られている。このような技術の様々な例が、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２）、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）、および、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７、１９７５に記載される。
【実施例】
【００８３】
本発明の種々の特徴をさらに例示する実施例が下記に提供される。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を例示する。これらの実施例は、特許請求されている発明を限定しない。
【００８４】
実施例１：感染防御免疫
本実施例は、配列番号１近縁ポリペプチドが感染防御免疫を動物モデルにおいてもたらすことができることを例示する。配列番号２（配列番号１のＨｉｓタグ誘導体）を、感染防御免疫をもたらすために使用した。
【００８５】
配列番号２のクローニングおよび発現
タンパク質を、ベクターによりコードされる末端のＨｉｓ残基を伴ってｐＥＴ３０ベクターから発現させるために設計した。加えて、アラニン残基をメチオニン開始因子の後においてタンパク質に付加した。設計されたＤＮＡ配列は成熟型ＯＲＦ０８２６の２１１アミノ酸の変化型をコードする。
【００８６】
ＯＲＦ０８２６のＤＮＡ配列（配列番号９）を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウエアを使用して翻訳し、得られた１６７アミノ酸の配列（配列番号４）を分析した。ＰＣＲプライマーを、最初のリシン残基から始まり、停止コドンの前で、末端のイソロイシン残基で終わる遺伝子を増幅するために設計した。順方向ＰＣＲプライマーは、発現ベクターへのクローニングを容易にするためのさらなるＮｃｏＩ制限部位を有した。順方向ＰＣＲプライマーはまた、読み枠を一致させたタンパク質の発現を確実にするためにアラニンのコドンが続くメチオニンのコドンを含んでいた。逆方向ＰＣＲプライマーは、発現ベクターへのクローニングを容易にするためのＸｈｏＩ制限部位と、停止コドンとを含んでいた。
【００８７】
ＰＣＲ増幅された配列をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩにより消化し、次いで、ＰＣＲプライマーに組み込まれていたＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位を使用してｐＥＴ３０ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結し、熱ショックによって大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。コロニーを選択し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢにおいて成長させ、ＤＮＡミニ調製物を作製し（Ｐｒｏｍｅｇａ）、挿入物の完全性を制限消化およびＰＣＲによって決定した。所望の配列からのＤＮＡ変化を含有しないクローンを選択した。
【００８８】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、カナマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ平板において成長させた。液体ＬＢ（カナマイシン）培養物を、ＬＢ（カナマイシン）平板からの単一コロニーを接種することによって準備し、Ａ６００が０．６から１．０の間になるまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベーションし、次いで、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度に加え、続いて、さらに３時間インキュベーションすることによって誘導した。培養物を４℃で５分間の５０００ｘｇでの遠心分離によって集めた。細胞を５００μｌの溶解緩衝液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ、プロテアーゼ阻害剤を含む、Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁した。等体積の負荷緩衝液（β−メルカプトエタノールが５％の最終体積に補充されたもの）を加え、サンプルを７０℃で５分間加熱した。抽出物をＮｏｖｅｘ４−２０％トリス−グリシンゲルで泳動し、タンパク質についてアッセイし（クーマシーブルー染色し）、ニトロセルロースにブロットし、抗ＨＩＳ６抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いてプローブした。
【００８９】
配列番号２の精製
凍結された組換え大腸菌細胞のペースト（１７．３グラム）を解凍し、１００ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２０℃）＋２ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ−８０、０．１５ＭのＮａＣｌ、１００ｕＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２５，０００ユニット）、１ｍｌのプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ−８８４９）および１００ｍｇのリゾチーム）に再懸濁した。溶解物を、ミクロフリュイダイザーを約１４，０００ｐｓｉ（約９６ＭＰａ）で用いて調製した。溶解物を４℃で２０分間の１１，０００ｘｇでの遠心分離によって清澄化した。ペレットをＴＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）により２回洗浄し、８Ｍ尿素／ＴＢＳに再懸濁して、タンパク質をペレットから可溶化した。尿素可溶性タンパク質の溶液をＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、＃３０２５０）と混合し、室温で１時間撹拌した。
【００９０】
尿素可溶性タンパク質の溶液におけるクロマトグラフィー樹脂のスラリーをクロマトグラフィーカラムに注ぎ、非結合画分を重力によってカラム出口から集めた。樹脂をＴＢＳにより洗浄し、カラムを溶出緩衝液（０．３Ｍのイミダゾール、０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．１％のＴｗｅｅｎ−８０）により溶出した。タンパク質生成物を含有する画分をクーマシー染色によるＳＤＳ／ＰＡＧＥによって特定し、プールした。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムからのプール画分をＺｅｔａ Ｐｌｕｓ（登録商標）ＢｉｏＣａｐ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ、＃ＢＣ００３０Ａ９０ＳＰ）によりろ過した。ろ液を１０，０００のＭＷＣＯのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）において透析緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−８０）に対して透析した。透析された生成物をろ過滅菌した。ろ過滅菌した生成物をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で吸着させた。ろ過滅菌した生成物の残りを−７０℃での長期間の保存のために液体窒素で素早く凍結した。
【００９１】
Ｓ．ｓｕｒｅｕｓ抗原投与物の調製
Ｓ．ｓｕｒｅｕｓをＴＳＡ平板において３７℃で一晩成長させた。細菌を、５ｍｌのＰＢＳを平板に加え、細菌を滅菌スプレッダーにより穏やかに再懸濁することによってＴＳＡ平板から洗い出した。細菌懸濁物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心分離機（ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを１６％グリセロールに再懸濁し、小分け物を−７０℃で凍結保存した。
【００９２】
使用前に、接種物を解凍し、適切に希釈し、感染のために使用した。各ストック物を少なくとも３回力価測定して、実験未使用マウスにおいて遅い死亡速度論を誘導する適切な用量を決定した。細菌接種物の効力（８０％から９０％の致死性）を絶えずモニターして、モデルの再現性を保証した。それぞれの抗原投与実験の１０日前に、１０匹のコントロール動物の一群（これはアジュバント単独により免疫化された）に抗原投与し、動物をモニターした。
【００９３】
配列番号２ポリペプチドについての感染防御研究
３つの異なる感染防御研究を、（１）２５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス、（２）２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス、および（３）２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して行った。マウスをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（４５０μｇ／投薬）での配列番号２ポリペプチド（２０μｇ／投薬）の３回の投薬により免疫化した。ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）はＫｌｅｉｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８９、３１１−３２１、２０００に記載される。投薬を、０日目、７日目および２１日目に２回の５０μｌの注射として筋肉内に施した。マウスを２８日目に採血し、この血清を、配列番号２を認識する抗体に対する反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【００９４】
実験の３５日目に、マウスにＳ．ａｕｒｅｕｓ（１０８ＣＦＵ／ｍｌ）による抗原投与を行い、ＡＨＰにより単に免疫化されていた同じ数のマウスからなるコントロール群に対する評価を行った。マウスを生存についてモニターした。
【００９５】
結果が、図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃに示される。第１の実験（図５Ａ）では、２５匹中３匹がＡＨＰコントロール群において生存したことと比較して、２５匹中９匹の免疫化マウスが生存した。第２の実験（図５Ｂ）では、２０匹の免疫化マウスおよび２０匹のコントロールマウスを使用したが、コントロールと比較して、増大した感染防御が観測されなかった。第３の実験（図５Ｃ）では、ＡＨＰコントロール群における３０匹中６匹と比較して、２０匹中８匹の免疫化マウスが生存した。
【００９６】
第２の実験は、コントロールのＡＨＰ群において生存するマウスの数が多いこと（１３匹のマウス）のためにヌル実験と見なされた。ヌル実験が、抗原投与のために使用された細菌の量および性状に依存するこのモデルを管理することにおける困難さのために時々認められる。
【００９７】
他の実施形態が下記の請求項に含まれる。いくつかの実施形態が示され、また、記載されているが、様々な改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を例示する。全配列は配列番号２である。太字で示される部分は配列番号１である。下線領域は、配列番号１に付加されたＨｉｓタグ領域である。
【図２】配列番号１（ＳＥＱ１）配列番号３（ＳＥＱ３）、配列番号４（ＳＥＱ４）、配列番号５（ＳＥＱ５）、配列番号６（ＳＥＱ６）、および配列番号７（ＳＥＱ７）の間での配列比較を例示する。アミノ酸の違いが太字で示される。
【図３】配列番号２をコードする核酸配列（配列番号８）を例示する。配列番号１をコードする領域が太字で示される。Ｈｉｓタグ領域およびＧＣＣのアラニンコドンには下線が引かれている。
【図４】ＯＲＦ０８２６をコードする核酸配列（配列番号９）を例示する。
【図５Ａ】配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【図５Ｂ】配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【図５Ｃ】配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【背景技術】
【０００１】
本出願明細書中を通して引用される参考文献は、特許請求されている発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【０００２】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は、広範囲の様々な疾患および状態の原因である病原体である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる疾患および状態の例には、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、フルンケル、カルブンケル、膿痂疹、水疱性膿痂疹、蜂巣炎、ボトリオミセス症、毒素性ショック症候群、熱傷様皮膚症候群、中枢神経系の感染症、感染性および炎症性の眼疾患、骨髄炎、ならびに、関節および骨の他の感染症、ならびに、気道感染症が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＣｒｏｓｓｌｅｙおよびＡｒｃｈｅｒ（編）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．、１９９７）。
【０００３】
免疫学的方法を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症およびＳ．ａｕｒｅｕｓの拡大を食い止めるために用いることができる。免疫学的方法には、受動免疫法および能動免疫法が含まれる。受動免疫法では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを標的とする免疫グロブリンが用いられる。能動免疫法では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答が誘導される。
【０００４】
可能性のあるＳ．ａｕｒｅｕｓワクチンはＳ．ａｕｒｅｕｓの多糖およびポリペプチドを標的とする。標的化を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの好適な多糖またはポリペプチドをワクチン成分として使用して達成することができる。可能なワクチン成分として用いることができる多糖の例には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型およびＳ．ａｕｒｅｕｓ８型の莢膜多糖が含まれる（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ他、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４６：４９１−４９６、２００２）。可能なワクチン成分として用いることができるポリペプチドの例には、コラーゲンアドへジン、フィブリノーゲン結合タンパク質およびクランピング因子が含まれる（Ｍａｍｏ他、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１０：４７−５４、１９９４；Ｎｉｌｓｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：２６４０−２６４９、１９９８；Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１８４：１５７２−１５８０、２００１）。
【０００５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのポリペプチドの配列に関する情報が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのゲノムを配列決定することから得られている（Ｋｕｒｏｄａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５７：１２２５−１２４０、２００１；Ｂａｂａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５９：１８１９−１８２７、２０００；Ｋｕｎｓｃｈ他、欧州特許出願公開ＥＰ０７８６５１９（１９９７年７月３０日公開））。ある程度ではあるが、バイオインフォマティクスが、ゲノム配列決定から得られたポリペプチド配列を特徴づけようとして用いられている（Ｋｕｎｓｃｈ他、欧州特許出願公開ＥＰ０７８６５１９（１９９７年７月３０日公開））。
【０００６】
ディスプレー技術を伴う技術などの様々な技術および感染患者からの血清を、可能性のある抗原をコードする遺伝子を特定しようとすることにおいて使用することができる（Ｆｏｓｔｅｒ他、国際特許出願公開ＷＯ０１／９８４９９（２００１年１２月２７日公開）；Ｍｅｉｎｋｅ他、国際特許出願公開ＷＯ０２／０５９１４８（２００２年８月１日公開）；Ｅｔｚ他、ＰＮＡＳ、９９：６５７３−６５７８、２００２）。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、配列番号１に対して構造的に近縁であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および、このようなポリペプチドの使用を特徴とする。配列番号１は全長型Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの誘導体である。天然に存在するこの全長型ポリペプチドは本明細書中では全長の「ＯＲＦ０８２６」として示される。配列番号１のこの誘導体はアラニンの付加を最初のメチオニンの後に含有する。配列番号１のＨｉｓタグ誘導体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫応答を生じさせることが見出された。
【０００８】
「感染防御」免疫または「感染防御」免疫応答に対する言及は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する検出可能なレベルの感染防御を示す。このような感染防御レベルは、動物モデルを使用して評価することができ、例えば、本明細書中に記載される動物モデルなどを使用して評価することができる。
【０００９】
従って、本発明の第１の態様では、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原であって、ポリペプチドが、配列番号３、配列番号４または配列番号５ではないポリペプチド免疫原が記載される。免疫原に対する言及は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供することができることを示す。
【００１０】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むということに対する言及は、配列番号１に関連づけられる領域が存在すること、および、さらなるポリペプチド領域が存在してもよいことを示す。配列番号３、配列番号４または配列番号５のポリペプチドは８５％の同一性に含まれるが、本発明の第１の態様から除外される。
【００１１】
参照配列に対するパーセント同一性（これはまた、参照配列に対してパーセント同一であるとして示される）は、ポリペプチド配列を参照配列に関してアラインメントし、対応する領域における同一アミノ酸の数を求めることによって決定される。この数が、参照配列（例えば、配列番号１）におけるアミノ酸の総数によって除され、次いで、１００が乗じられ、最も近い整数に丸められる。
【００１２】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドと、このポリペプチドにカルボキシル末端またはアミノ末端において共有結合的に結合した１つ以上のさらなる領域または成分とを含む免疫原が記載され、この場合、それぞれの領域または成分が独立して、下記の性質：
免疫応答を強化すること、精製を容易にすること、または、ポリペプチドの安定性を促進すること
の少なくとも１つを有する領域または成分から選択される。
【００１３】
「さらなる領域または成分」に対する言及は、ＯＲＦ０８２６の領域とは異なる領域または成分を示す。さらなる領域または成分は、例えば、さらなるポリペプチド領域またはペプチド以外の領域が可能である。
【００１４】
本発明の別の態様では、患者においてＳ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫応答を誘導することができる組成物が記載される。本発明の組成物は、医薬的に許容されるキャリアと、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドの免疫学的効果的な量とを含む。
【００１５】
免疫学的効果的な量は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する感染防御免疫を提供するために十分な量である。この量は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の可能性または重篤度を著しく防止するために十分でなければならない。
【００１６】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する感染防御免疫を提供するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む核酸が記載される。組換え遺伝子は、ポリペプチドをコードする組換え核酸を、適切な転写およびプロセシングのための調節エレメント（これには、翻訳エレメントおよび翻訳後エレメントを含むことができる）と一緒に含有する。組換え遺伝子は宿主ゲノムから独立して存在することができるか、または、宿主ゲノムの一部であることが可能である。
【００１７】
組換え核酸は、この配列および／または形態によって自然界に存在しない核酸である。組換え核酸の例には、精製された核酸、自然界に見出されるのと異なる核酸を提供する一緒に組み合わされた２つ以上の核酸領域、および、天然において互いに会合する１つ以上の核酸領域（例えば、上流または下流の領域）の非存在が含まれる。
【００１８】
本発明の別の態様では、組換え細胞が記載される。本発明の細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
【００１９】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドを作製する方法が記載される。本発明の方法は、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を成長させること、および、このポリペプチドを精製することを伴う。
【００２０】
本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を宿主において成長させる工程と、このポリペプチドを精製する工程とを含むプロセスによって作製された、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドが記載される。種々の宿主細胞を用いることができる。
【００２１】
本発明の別の態様では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する患者における感染防御免疫応答を誘導する方法が記載される。本発明の方法は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供するポリペプチドの免疫学的効果的な量、または、このような感染防御ポリペプチドを含有する免疫原の免疫学的効果的な量を患者に投与する工程を含む。
【００２２】
特定の用語が相互に排他的でない限り、「または」に対する言及はいずれかの可能性または両方の可能性を示す。場合により、「および／または」などの表現が、いずれかの可能性または両方の可能性を強調するために使用される。
【００２３】
「含む」などの開いた用語に対する言及はさらなる要素または工程を可能にする。場合により、「１つ以上の」などの表現が、さらなる要素または工程の可能性を強調するために、開いた用語とともに、または、開いた用語を伴うことなく使用される。
【００２４】
明示的に言及されない限り、「ａ」または「ａｎ」などの用語に対する言及は１つに限定されない。例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」は「ｃｅｌｌｓ（細胞）」を除外しない。場合により、１つまたは複数などの表現が、複数の存在が可能であることを強調するために使用される。
【００２５】
本発明の他の特徴および利点が、種々の実施例を含めて、本明細書中に提供されるさらなる記載から明らかである。提供された実施例は、本発明を実施する際に有用である種々の構成成分および方法論を例示する。実施例により、特許請求されている発明は限定されない。本開示に基づいて、当業者は、本発明を実施するために有用である他の構成成分および方法論を特定することができ、また、用いることができる。
【００２６】
図１は、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を例示する。全配列は配列番号２である。太字で示される部分は配列番号１である。下線領域は、配列番号１に付加されたＨｉｓタグ領域である。
図２は、配列番号１（ＳＥＱ１）配列番号３（ＳＥＱ３）、配列番号４（ＳＥＱ４）、配列番号５（ＳＥＱ５）、配列番号６（ＳＥＱ６）、および配列番号７（ＳＥＱ７）の間での配列比較を例示する。アミノ酸の違いが太字で示される。
図３は、配列番号２をコードする核酸配列（配列番号８）を例示する。配列番号１をコードする領域が太字で示される。Ｈｉｓタグ領域およびＧＣＣのアラニンコドンには下線が引かれている。
図４は、ＯＲＦ０８２６をコードする核酸配列（配列番号９）を例示する。
図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する別々の実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【００２７】
感染防御免疫を提供する配列番号１近縁ポリペプチドの能力が、配列番号２を使用して下記に提供される実施例において例示される。配列番号２は配列番号１のＨｉｓタグ誘導体である。Ｈｉｓタグはポリペプチドの精製および同定を容易にする。
【００２８】
配列番号１は、ＯＲＦ０８２６と称される全長型Ｓ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドの誘導体である。配列番号１と構造的に近縁であるポリペプチドには、異なるＳ．ａｕｒｅｕｓ株に存在する対応した領域と、天然に存在する領域の誘導体とを含有するポリペプチドが含まれる。配列番号１のアミノ酸配列が図１に太字の領域によって例示される。図１はまた、配列番号２に存在するＨｉｓタグ領域を例示する。
【００２９】
ＯＲＦ０８２６の配列
ＯＲＦ０８２６近縁配列には、参考文献毎に異なる名称が与えられている。異なる名称のいくつかの例が、Ｋｕｒｏｄａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５７：１２２５−１２４０、２００１において（ＳＡＶ２３０４９およびＳＡ２０９７）、Ｂａｂａ他、Ｌａｎｃｅｔ、３５９：１８１９−１８２７、２００２において（ＭＷ２２２２）、また、Ｅｔｚ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９（１０）：６５７３−６５７８、２００２において（ＳＡ２２９５）示される。
【００３０】
ＯＲＦ０８２６は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの分泌型抗原Ｓｓａとの大きな程度の相同性を互いに有する。Ｓｓａは、Ｌａｎｇ他、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２９：２１３−２２０、２０００に記載される。
【００３１】
ＯＲＦ０８２６近縁配列に対応するポリペプチド配列が種々の特許刊行物において提供されているようである（Ｍｅｉｎｋｅ他、国際特許出願公開ＷＯ０２／０５９１４８（２００２年８月１日公開）、および、Ｍａｓｉｇｎａｎｉ他、国際特許出願公開ＷＯ０２／０９４８６８（２００２年１１月２８日公開））。
【００３２】
図２は種々のＯＲＦ０８２６近縁配列の配列比較を提供する。配列番号３はメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓの配列であり（これは、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋに寄託された核酸配列データを検索することによって得られた）、配列番号４はＷＯ０２／０５９１４８の配列識別番号７３に対応し、配列番号５はＷＯ０２／０９４８６８の配列識別番号７８２に対応し、配列番号６および配列番号７は、天然に存在するさらなる配列である。
【００３３】
天然に存在する他のＯＲＦ０８２６配列を、既知のＯＲＦ０８２６配列と比較して、大きな程度の配列類似性または連続するアミノ酸の存在に基づいて特定することができる。連続するアミノ酸は特徴的なタグを提供する。異なる実施形態において、天然に存在するＯＲＦ０８２６配列は、配列番号１でのように、少なくとも２０個、または少なくとも３０個、または少なくとも５０個の連続するアミノ酸を有し、および／または、配列番号１との少なくとも８５％の配列類似性または配列同一性を有する、ブドウ球菌属細菌（好ましくは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に見出される配列である。
【００３４】
配列類似性は、この分野で広く知られている種々のアルゴリズムおよび技術によって求めることができる。一般には、配列類似性は、ギャップ、付加および置換を配列の一方において考慮して、最大のアミノ酸同一性を得るために２つの配列をアラインメントする技術によって決定される。
【００３５】
配列類似性を、例えば、プログラムｌａｌｉｇｎ（これはＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ，（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１２：３３７−３５７、１９９１）によって開発された；＜＜ｓｉｍ＞＞プログラムについて）を利用する局所的アラインメントツールを使用して求めることができる。選択肢および環境変数は下記の通りである：−ｆ＃ギャップ内の最初の残基に対するペナルティー（初期値、−１４）；−ｇ＃ギャップ内のそれぞれのさらなる残基に対するペナルティー（初期値、−４）；−ｓ ｓｔｒ（ＳＭＡＴＲＩＸ）代わりのスコア化行列ファイルのファイル名。タンパク質配列については、ＰＡＭ２５０が配列アラインメントのための初期値−ｗ＃（ＬＩＮＬＥＮ）出力ライン長（６０）によって使用される。
【００３６】
配列番号１近縁ポリペプチド
配列番号１近縁ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有する。「ポリペプチド」に対する言及は最小または最大のサイズ制限を提供しない。
【００３７】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドは配列番号１からの約２５個までのアミノ酸変化を含有する。異なる実施形態において、配列番号１近縁ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるか、または、少なくとも９４％同一であるか、または、少なくとも９９％同一であり、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸変化によって配列番号１とは異なり、または、配列番号１のアミノ酸２から１６７から本質的にはなる。それぞれのアミノ酸変化は独立して、付加、置換または欠失のいずれかである。
【００３８】
示されたアミノ酸から「本質的にはなる」に対する言及は、参照されたアミノ酸が存在すること、および、さらなるアミノ酸が存在してもよいことを示す。このようなさらなるアミノ酸はカルボキシル末端またはアミノ末端において存在し得る。異なる実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のさらなるアミノ酸が存在する。好ましいさらなるアミノ酸はアミノ末端のメチオニンである。
【００３９】
様々な変化を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を誘導することができる誘導体を得るために配列番号１に対して行うことができる。変化を、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を誘導する能力を保持する誘導体を得るために、または、感染防御免疫を提供することに加えて、特定の目的を達成することができる領域をもまた有する誘導体を得るために行うことができる。
【００４０】
図２に提供される配列比較は、配列番号１に対する可能性のある変化の設計を導くことを助けるために使用することができる。加えて、様々な変化を、他のＯＲＦ０８２６配列を考慮に入れて、また、アミノ酸の公知の性質を考慮に入れて行うことができる。
【００４１】
一般には、種々のアミノ酸を置換して、活性を保持することにおいて、類似する性質を有するアミノ酸を交換することが好ましい。アミノ酸置換のために考慮に入れることができる要因には、アミノ酸のサイズ、電荷、極性および疎水性が含まれる。アミノ酸の性質に対する種々のアミノ酸Ｒ基の影響はこの分野では広く知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２）、付録１Ｃを参照のこと）。
【００４２】
アミノ酸を交換して、活性を維持することにおいて、代替アミノ酸は１つ以上の類似する性質（例えば、ほぼ同じ電荷および／またはサイズおよび／または極性および／または疎水性など）を有しなければならない。例えば、バリンをロイシンの代わりに使用すること、アルギニンをリシンの代わりに使用すること、および、アスパラギンをグルタミンの代わりに使用することは、ポリペプチドが機能することにおいて変化を引き起こさないための良好な候補である。
【００４３】
特定の目的を達成するための変化には、ポリペプチドの産生または効力、または、コードされた核酸のクローニングを容易にするために設計される変化が含まれる。ポリペプチドの産生を、組換え発現のために好適な開始コドン（例えば、メチオニンに対するコドン）の使用によって容易にすることができる。このようなメチオニンは後で、細胞のプロセシングのときに除かれる場合がある。クローニングを、例えば、アミノ酸の付加または変化が付随し得る制限部位の導入によって容易にすることができる。
【００４４】
免疫応答を誘導するポリペプチドの効力をエピトープ増強によって高めることができる。エピトープ増強を、種々の技術を使用して、例えば、ＭＨＣ分子に対するペプチド親和性を改善するためのアンカー残基の変化を伴う技術、および、Ｔ細胞受容体に対するペプチド−ＭＨＣ複合体の親和性を増大させる技術などを使用して行うことができる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ、１：２０９−２１９、２００１）。
【００４５】
好ましくは、ポリペプチドは精製ポリペプチドである。「精製ポリペプチド」は、このポリペプチドが天然において会合する１つ以上の他のポリペプチドを有しない環境で存在し、および／または、存在する総タンパク質の少なくとも約１０％によって表される。異なる実施形態において、精製ポリペプチドは、サンプルまたは調製物における総タンパク質の少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９５％を表す。
【００４６】
１つの実施形態において、ポリペプチドは「実質的に精製される」。実質的に精製されたポリペプチドは、このポリペプチドが天然において会合する他のポリペプチドのすべてまたはこのほとんどを有しない環境で存在する。例えば、実質的に精製されたＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドは、他のＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドのすべてまたはこのほとんどを有しない環境で存在する。環境は、例えば、サンプルまたは調製物であり得る。
【００４７】
「精製された（される）」または「実質的に精製された（される）」に対する言及は、ポリペプチドが何らかの精製を受けることを必要とせず、例えば、精製されていない化学合成されたポリペプチドを包含し得る。
【００４８】
ポリペプチドの安定性を、ポリペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端を修飾することによって高めることができる。可能な修飾の例には、アミノ末端感染防御基（例えば、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニルなど）、および、カルボキシル末端感染防御基（例えば、アミド、メチルアミドおよびエチルアミドなど）が含まれる。
【００４９】
本発明の実施形態において、ポリペプチド免疫原は、カルボキシル末端またはアミノ末端においてポリペプチドに共有結合的に結合した１つ以上のさらなる領域または成分を含有する免疫原の一部であり、この場合、それぞれの領域または成分は独立して、下記の性質：
免疫応答を強化すること、精製を容易にすること、または、ポリペプチドの安定性を促進すること
の少なくとも１つを有する領域または成分から選択される。ポリペプチドの安定性を、例えば、アミノ末端またはカルボキシル末端に存在させることができる基（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して高めることができる。
【００５０】
ポリペプチドの精製を、精製を容易にするために所与の基をカルボキシル末端またはアミノ末端に付加することによって高めることができる。精製を容易にするために使用することができる基の例には、親和性タグを提供するポリペプチドが含まれる。親和性タグの例には、６個のヒスチジンのタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオンおよびマルトース結合タンパク質が含まれる。
【００５１】
免疫応答を誘導するポリペプチドの能力を、免疫応答を一般に高める基を使用して高めることができる。ポリペプチドに対する免疫応答を高めるためにポリペプチドに結合することができる基の例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）が含まれる（Ｂｕｃｈａｎ他、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３７：５４５−５５２）。
【００５２】
ポリペプチドの製造
ポリペプチドは、化学合成を伴う技術、および、ポリペプチドを産生する細胞からの精製を伴う技術をはじめとする標準的な技術を使用して製造することができる。ポリペプチドを化学合成するための様々な技術がこの分野では広く知られている（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｄｅｃｋｅｒ、１９９０）を参照のこと）。組換えポリペプチドの製造および精製のための様々な技術もまたこの分野では広く知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２を参照のこと）。
【００５３】
ポリペプチドを細胞から得ることは、ポリペプチドを産生させるための組換え核酸技術を使用して容易になる。ポリペプチドを産生させるための組換え核酸技術は、ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を細胞に導入すること、または、ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を作製すること、および、ポリペプチドを発現させることを伴う。
【００５４】
組換え遺伝子は、ポリペプチドをコードする核酸を、ポリペプチド発現のための調節エレメントと一緒に含有する。組換え遺伝子は細胞のゲノムに存在させることができるか、または、発現ベクターの一部であることが可能である。
【００５５】
組換え遺伝子の一部として存在させることができる調節エレメントには、ポリペプチドをコードする配列と天然において会合する調節エレメント、および、ポリペプチドをコードする配列と天然では会合しない外因性の調節エレメントが含まれる。外因性の調節エレメント（例えば、外因性のプロモーターなど）が、組換え遺伝子を特定の宿主において発現させるために、または、発現レベルを増大させるために有用であり得る。一般に、組換え遺伝子において存在する調節エレメントには、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および、必要な場合には存在するオペレーターが含まれる。真核生物細胞におけるプロセシングのための好ましいエレメントの１つがポリアデニル化シグナルである。
【００５６】
細胞における組換え遺伝子の発現は発現ベクターの使用によって容易になる。好ましくは、発現ベクターはまた、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞における自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、および、高コピー数のための潜在的能力を含有する。発現ベクターの例には、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドおよびウイルスが含まれる。
【００５７】
遺伝暗号の縮重性のために、非常に多数の異なるコード核酸配列を、特定のポリペプチドをコードするために使用することができる。遺伝暗号の縮重性は、ほとんどすべてのアミノ酸が、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち、「コドン」によってコードされるために生じる。アミノ酸は下記のようなコドンによってコードされる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラジン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００５８】
配列番号１近縁ポリペプチドの組換え核酸発現のための好適な細胞は原核生物および真核生物である。原核生物細胞の例には、大腸菌、ブドウ球菌属のメンバー（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー（例えば、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍなど）、ラクトコッカス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー（例えば、Ｌ．ｌａｃｔｉｓなど）、および、バチルス（Ｂａｃｉｌｕｓ）属のメンバー（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）が含まれる。真核生物細胞の例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメンバー（例えば、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のメンバー（例えば、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓまたはＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、および、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ）など）が含まれる。
【００５９】
組換え遺伝子の作製、細胞内への導入および組換え遺伝子発現のための様々な技術がこの分野では広く知られている。このような技術の様々な例が、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２）、および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）などの参考文献に提供される。
【００６０】
所望される場合、特定の宿主における発現をコドン最適化によって高めることができる。コドン最適化では、より好ましいコドンの使用が含まれる。種々の宿主におけるコドン最適化のための様々な技術がこの分野では広く知られている。
【００６１】
配列番号１近縁ポリペプチドは翻訳後修飾（例えば、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化またはアセチル化）を含有することができる。ポリペプチドの「ポリペプチド」配列または「アミノ酸」配列に対する言及は、宿主細胞（例えば、酵母宿主など）に由来する翻訳後修飾の構造を有する１つ以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを包含する。
【００６２】
翻訳後修飾を化学的に、または、好適な宿主を使用することによって生じさせることができる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、末端から２番目のアミノ酸の性質により、Ｎ末端のメチオニンが除去されるかどうかが決定されるようである。さらに、末端から２番目のアミノ酸の性質によりまた、Ｎ末端のアミノ酸がＮα−アセチル化されるかが決定される（Ｈｕａｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６：８２４２−８２４６、１９８７）。別の例には、タンパク質がＮ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化によって修飾される場合、分泌リーダーの存在による分泌のために標的化されるポリペプチド（例えば、シグナルペプチド）が含まれる（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６：９１５−９４４、１９８７）。
【００６３】
アジュバント
アジュバントは、免疫応答を生じさせる際に免疫原を助けることができる物質である。アジュバントは、種々の機構によって、例えば、下記の１つ以上によって機能することができる：抗原の生物学的または免疫学的な半減期を増大すること；抗原提示細胞への抗原送達を改善すること；抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび提示を改善すること；および、免疫調節性サイトカインの産生を誘導すること（Ｖｏｇｅｌ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３０（増刊３）：Ｓ２６６−２７０、２０００）。
【００６４】
様々な異なるタイプのアジュバントを、免疫応答の生成を助けるために用いることができる。具体的なアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはアルミニウムの他の塩、リン酸カルシウム、ＤＮＡ ＣｐＧモチーフ、モノホスホリル脂質Ａ、コレラ毒素、大腸菌の熱不安定毒素、百日咳毒素、ムラミルジペプチド、フロイント不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激複合体、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニン、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチドアナログ、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２が含まれる（Ｖｏｇｅｌ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３０（増刊３）：Ｓ２６６−２７０、２０００；Ｋｌｅｉｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８９：３１１−３２１、２０００）。
【００６５】
感染防御免疫を誘導するための患者
「患者」は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが感染することができる哺乳動物を示す。患者は予防的または治療的に処置することができる。予防的処置は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の可能性またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の重篤度を低下させるために、十分な感染防御免疫をもたらす。治療的処置を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の重篤度を軽減するために行うことができる。
【００６６】
予防的処置を、本明細書中に記載される免疫原を含有するワクチンを使用して行うことができる。このような処置は、好ましくは、ヒトに対して行われる。ワクチンを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の危険性が増大している一般集団またはこのような人々に投与することができる。
【００６７】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の危険性が増大している人々には、医療従事者、入院患者、免疫系が低下した患者、手術を受けている患者、異物の身体インプラント（例えば、カテーテルまたは血管デバイスなど）を受け入れている患者、低下した免疫を生じさせる治療法に直面している患者、および、火傷または創傷による傷害の増大した危険性を有する職業従事者が含まれる（Ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＣｒｏｓｓｌｅｙおよびＡｒｖｈｅｒ（編）、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｉｎｃ．、１９９７）。
【００６８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓが感染し得る非ヒト患者には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコおよびマウスが含まれる。非ヒト患者の処置は、ペットおよび家畜を感染防御することにおいて、また、特定の処置の効力を評価することにおいて有用である。
【００６９】
混合ワクチン
配列番号１近縁ポリペプチドは、免疫応答を誘導するために、単独で、または、他の免疫原との組合せで使用することができる。存在させることができるさらなる免疫原には、下記が含まれる：１つ以上のさらなるＳ．ａｕｒｅｕｓ免疫原、例えば、本発明の背景（上掲）において示された免疫原；１つ以上の他のブドウ球菌属生物（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉまたはＳ．ｌｕｎｇｕｎｅｎｓｉｓなど）を標的化する１つ以上の免疫原；および、他の感染性生物を標的化する１つ以上の免疫原。
【００７０】
動物モデルシステム
動物モデルシステムが、ブドウ球菌属に対する感染防御免疫応答を生じさせる免疫原の効力を評価するために使用された。感染防御動物モデルを設定する際に遭遇した２つの障害が、（１）先天性免疫を乗り越えるために必要とされる非常に大きな抗原投与用量、および（２）早すぎて、感染防御応答を検出することができない死亡率であった。具体的には、細菌抗原投与後、マウスは２４時間以内に感染により死亡した。このことは、感染を解消するための特異的な免疫応答のための十分な時間を与えなかった。用量を低下させた場合、コントロールマウスおよび免疫化マウスはともに感染に耐えて生存した。
【００７１】
これらの障害は、定常期の細胞から調製され、適切に力価測定され、静脈内投与されたブドウ球菌を伴う遅い速度論の致死性モデルを使用することによって検討された。この遅い死亡速度論は、細菌感染を克服するための特異的な免疫防御のための十分な時間を与えている（例えば、２４時間でなく、１０日間）。
【００７２】
定常期のブドウ球菌細胞を、固体培地で成長させた細胞から得ることができる。定常期のブドウ球菌細胞はまた、液体から得ることができる。しかしながら、固体培地で成長させた細胞を用いた結果の方が再現性が良かった。細胞は、好都合には、固体培地で一晩成長させることができる。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを、倍加時間が約２０分から３０分である条件のもとで約１８時間から約２４時間まで成長させることができる。
【００７３】
ブドウ球菌を、ブドウ球菌の能力を維持するための標準的な技術を使用して固体培地または液体培地から単離することができる。単離されたブドウ球菌は、例えば、グリセロールを含有するリン酸塩緩衝化生理的食塩水における洗浄された高密度懸濁物（＞１０９コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍＬ）として−７０℃で保存することができる。
【００７４】
ブドウ球菌の抗原投与は、１日目または２日目から開始して約７日から１０日の期間にわたって動物モデルにおいて約８０％から９０％の死亡をもたらす効力を有しなければならない。力価測定実験を、保存されたブドウ球菌接種物の効力をモニターするために、動物モデルを使用して行うことができる。力価測定実験を接種実験の約１週間前から２週間前に行うことができる。
【００７５】
力価測定実験のための最初の効力は以前の実験に基づくことができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび動物モデル系統Ｂｅｃｋｅｒについては、好適な効力が一般には、５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌから８ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌの範囲に見出された。
【００７６】
投与
免疫原は、この分野で広く知られている技術と一緒に、本明細書中に提供される指針を使用して配合することができ、および、患者に投与することができる。医薬品投与のための様々な指針が、一般には、例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（編：ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９９）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版、編：Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００）、および、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（第２版、編：ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、１９９０）に提供される（これらはそれぞれが参照により本明細書中に組み込まれる）。
【００７７】
医薬的に許容されるキャリアは免疫原の保存および患者への投与を容易にする。医薬的に許容されるキャリアは種々の成分（例えば、緩衝剤、無菌の注射用水、規定生理的食塩水またはリン酸塩緩衝化生理的食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートなど）を含有することができる。
【００７８】
免疫原は、種々の経路によって、例えば、皮下経路、筋肉内経路または粘膜経路などによって投与することができる。皮下投与および筋肉内投与を、例えば、ニードルまたはジェット式注射器を使用して行うことができる。
【００７９】
好適な投薬法が、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路、所望される効果；ならびに、用いられる具体的な化合物をはじめとする、この分野で広く知られている要因を考慮に入れて決定される。免疫原は多回用量ワクチン形式で使用することができる。１回の用量は１．０μｇから１．０ｍｇの総ポリペプチドの範囲からなることが予想され、本発明の種々の実施形態では、この範囲は０．０１ｍｇから１．０ｍｇおよび０．１ｍｇから１．０ｍｇである。
【００８０】
投薬時期は、この分野で広く知られている様々な要因に依存する。最初の投与の後、１回以上の追加免疫投薬を、抗体力価を維持または増強するためにこの後に施すことができる。投薬法の一例が、１日目、１ヶ月、４ヶ月または６ヶ月または１２ヶ月のいずれかでの３回目の投薬、および、必要とされる場合にはさらに経過した時間でのさらなる追加免疫投薬である。
【００８１】
抗体の生成
配列番号１近縁ポリペプチドは、このポリペプチドまたはＳ．ａｕｒｅｕｓに結合する抗体および抗体フラグメントを生じさせるために使用することができる。このような抗体および抗体フラグメントは、ポリペプチドの精製、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの同定、または、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する治療的処置または予防的処置における使用を含む種々の使用法を有する。
【００８２】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルが可能である。抗体を作製および使用するための様々な技術がこの分野で広く知られている。このような技術の様々な例が、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、１９８７−２００２）、Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）、および、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７、１９７５に記載される。
【実施例】
【００８３】
本発明の種々の特徴をさらに例示する実施例が下記に提供される。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法論を例示する。これらの実施例は、特許請求されている発明を限定しない。
【００８４】
実施例１：感染防御免疫
本実施例は、配列番号１近縁ポリペプチドが感染防御免疫を動物モデルにおいてもたらすことができることを例示する。配列番号２（配列番号１のＨｉｓタグ誘導体）を、感染防御免疫をもたらすために使用した。
【００８５】
配列番号２のクローニングおよび発現
タンパク質を、ベクターによりコードされる末端のＨｉｓ残基を伴ってｐＥＴ３０ベクターから発現させるために設計した。加えて、アラニン残基をメチオニン開始因子の後においてタンパク質に付加した。設計されたＤＮＡ配列は成熟型ＯＲＦ０８２６の２１１アミノ酸の変化型をコードする。
【００８６】
ＯＲＦ０８２６のＤＮＡ配列（配列番号９）を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウエアを使用して翻訳し、得られた１６７アミノ酸の配列（配列番号４）を分析した。ＰＣＲプライマーを、最初のリシン残基から始まり、停止コドンの前で、末端のイソロイシン残基で終わる遺伝子を増幅するために設計した。順方向ＰＣＲプライマーは、発現ベクターへのクローニングを容易にするためのさらなるＮｃｏＩ制限部位を有した。順方向ＰＣＲプライマーはまた、読み枠を一致させたタンパク質の発現を確実にするためにアラニンのコドンが続くメチオニンのコドンを含んでいた。逆方向ＰＣＲプライマーは、発現ベクターへのクローニングを容易にするためのＸｈｏＩ制限部位と、停止コドンとを含んでいた。
【００８７】
ＰＣＲ増幅された配列をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩにより消化し、次いで、ＰＣＲプライマーに組み込まれていたＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位を使用してｐＥＴ３０ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結し、熱ショックによって大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。コロニーを選択し、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢにおいて成長させ、ＤＮＡミニ調製物を作製し（Ｐｒｏｍｅｇａ）、挿入物の完全性を制限消化およびＰＣＲによって決定した。所望の配列からのＤＮＡ変化を含有しないクローンを選択した。
【００８８】
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、カナマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ平板において成長させた。液体ＬＢ（カナマイシン）培養物を、ＬＢ（カナマイシン）平板からの単一コロニーを接種することによって準備し、Ａ６００が０．６から１．０の間になるまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベーションし、次いで、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度に加え、続いて、さらに３時間インキュベーションすることによって誘導した。培養物を４℃で５分間の５０００ｘｇでの遠心分離によって集めた。細胞を５００μｌの溶解緩衝液（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ、プロテアーゼ阻害剤を含む、Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁した。等体積の負荷緩衝液（β−メルカプトエタノールが５％の最終体積に補充されたもの）を加え、サンプルを７０℃で５分間加熱した。抽出物をＮｏｖｅｘ４−２０％トリス−グリシンゲルで泳動し、タンパク質についてアッセイし（クーマシーブルー染色し）、ニトロセルロースにブロットし、抗ＨＩＳ６抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いてプローブした。
【００８９】
配列番号２の精製
凍結された組換え大腸菌細胞のペースト（１７．３グラム）を解凍し、１００ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２０℃）＋２ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ−８０、０．１５ＭのＮａＣｌ、１００ｕＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２５，０００ユニット）、１ｍｌのプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ−８８４９）および１００ｍｇのリゾチーム）に再懸濁した。溶解物を、ミクロフリュイダイザーを約１４，０００ｐｓｉ（約９６ＭＰａ）で用いて調製した。溶解物を４℃で２０分間の１１，０００ｘｇでの遠心分離によって清澄化した。ペレットをＴＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ／２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）により２回洗浄し、８Ｍ尿素／ＴＢＳに再懸濁して、タンパク質をペレットから可溶化した。尿素可溶性タンパク質の溶液をＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、＃３０２５０）と混合し、室温で１時間撹拌した。
【００９０】
尿素可溶性タンパク質の溶液におけるクロマトグラフィー樹脂のスラリーをクロマトグラフィーカラムに注ぎ、非結合画分を重力によってカラム出口から集めた。樹脂をＴＢＳにより洗浄し、カラムを溶出緩衝液（０．３Ｍのイミダゾール、０．１５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋０．１％のＴｗｅｅｎ−８０）により溶出した。タンパク質生成物を含有する画分をクーマシー染色によるＳＤＳ／ＰＡＧＥによって特定し、プールした。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムからのプール画分をＺｅｔａ Ｐｌｕｓ（登録商標）ＢｉｏＣａｐ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ、＃ＢＣ００３０Ａ９０ＳＰ）によりろ過した。ろ液を１０，０００のＭＷＣＯのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）において透析緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ−８０）に対して透析した。透析された生成物をろ過滅菌した。ろ過滅菌した生成物をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で吸着させた。ろ過滅菌した生成物の残りを−７０℃での長期間の保存のために液体窒素で素早く凍結した。
【００９１】
Ｓ．ｓｕｒｅｕｓ抗原投与物の調製
Ｓ．ｓｕｒｅｕｓをＴＳＡ平板において３７℃で一晩成長させた。細菌を、５ｍｌのＰＢＳを平板に加え、細菌を滅菌スプレッダーにより穏やかに再懸濁することによってＴＳＡ平板から洗い出した。細菌懸濁物を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ遠心分離機（ＤｕＰｏｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを１６％グリセロールに再懸濁し、小分け物を−７０℃で凍結保存した。
【００９２】
使用前に、接種物を解凍し、適切に希釈し、感染のために使用した。各ストック物を少なくとも３回力価測定して、実験未使用マウスにおいて遅い死亡速度論を誘導する適切な用量を決定した。細菌接種物の効力（８０％から９０％の致死性）を絶えずモニターして、モデルの再現性を保証した。それぞれの抗原投与実験の１０日前に、１０匹のコントロール動物の一群（これはアジュバント単独により免疫化された）に抗原投与し、動物をモニターした。
【００９３】
配列番号２ポリペプチドについての感染防御研究
３つの異なる感染防御研究を、（１）２５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス、（２）２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス、および（３）２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して行った。マウスをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（４５０μｇ／投薬）での配列番号２ポリペプチド（２０μｇ／投薬）の３回の投薬により免疫化した。ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）はＫｌｅｉｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８９、３１１−３２１、２０００に記載される。投薬を、０日目、７日目および２１日目に２回の５０μｌの注射として筋肉内に施した。マウスを２８日目に採血し、この血清を、配列番号２を認識する抗体に対する反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【００９４】
実験の３５日目に、マウスにＳ．ａｕｒｅｕｓ（１０８ＣＦＵ／ｍｌ）による抗原投与を行い、ＡＨＰにより単に免疫化されていた同じ数のマウスからなるコントロール群に対する評価を行った。マウスを生存についてモニターした。
【００９５】
結果が、図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃに示される。第１の実験（図５Ａ）では、２５匹中３匹がＡＨＰコントロール群において生存したことと比較して、２５匹中９匹の免疫化マウスが生存した。第２の実験（図５Ｂ）では、２０匹の免疫化マウスおよび２０匹のコントロールマウスを使用したが、コントロールと比較して、増大した感染防御が観測されなかった。第３の実験（図５Ｃ）では、ＡＨＰコントロール群における３０匹中６匹と比較して、２０匹中８匹の免疫化マウスが生存した。
【００９６】
第２の実験は、コントロールのＡＨＰ群において生存するマウスの数が多いこと（１３匹のマウス）のためにヌル実験と見なされた。ヌル実験が、抗原投与のために使用された細菌の量および性状に依存するこのモデルを管理することにおける困難さのために時々認められる。
【００９７】
他の実施形態が下記の請求項に含まれる。いくつかの実施形態が示され、また、記載されているが、様々な改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を例示する。全配列は配列番号２である。太字で示される部分は配列番号１である。下線領域は、配列番号１に付加されたＨｉｓタグ領域である。
【図２】配列番号１（ＳＥＱ１）配列番号３（ＳＥＱ３）、配列番号４（ＳＥＱ４）、配列番号５（ＳＥＱ５）、配列番号６（ＳＥＱ６）、および配列番号７（ＳＥＱ７）の間での配列比較を例示する。アミノ酸の違いが太字で示される。
【図３】配列番号２をコードする核酸配列（配列番号８）を例示する。配列番号１をコードする領域が太字で示される。Ｈｉｓタグ領域およびＧＣＣのアラニンコドンには下線が引かれている。
【図４】ＯＲＦ０８２６をコードする核酸配列（配列番号９）を例示する。
【図５Ａ】配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【図５Ｂ】配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【図５Ｃ】配列番号２のポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント（ＡＨＰ）において使用する実験からの結果を例示する。ポリペプチドは「ＳＥＱ２」として示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供する、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原であって、前記ポリペプチドが、配列番号３、配列番号４または配列番号５ではない、ポリペプチド免疫原。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が本質的には配列番号１のアミノ酸３から１６７からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸２から１６７、または、配列番号１のアミノ酸３から１６７からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列と、前記アミノ酸配列にカルボキシル末端またはアミノ末端において共有結合的に結合した１つ以上のさらなる領域または成分とを含み、それぞれの領域または成分が独立して、下記の性質：
免疫応答を強化すること、精製を容易にすること、または、ポリペプチドの安定性を促進すること
の少なくとも１つを有する領域または成分から選択される免疫原。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載される免疫の免疫学的効果的な量と、医薬的に許容されるキャリアとを含む、患者における感染防御免疫応答を誘導することができる組成物。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含む核酸。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含む組換え細胞。
【請求項１１】
感染防御免疫を提供するＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載される組換え細胞を、前記ポリペプチドが発現する条件のもとで成長させる工程；および
（ｂ）前記ポリペプチドを精製する工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
患者における感染防御免疫応答を誘導する方法であって、請求項１から５のいずれか一項に記載される免疫原の免疫学的効果的な量を前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記患者がヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者がＳ．ａｕｒｅｓｕの感染に対して予防的に処置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
患者における感染防御免疫応答を誘導する方法であって、請求項１１に記載される方法によって作製されたポリペプチドの免疫学的効果的な量を前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する感染防御免疫を提供する、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原であって、前記ポリペプチドが、配列番号３、配列番号４または配列番号５ではない、ポリペプチド免疫原。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、配列番号１に対して少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が本質的には配列番号１のアミノ酸３から１６７からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸２から１６７、または、配列番号１のアミノ酸３から１６７からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列と、前記アミノ酸配列にカルボキシル末端またはアミノ末端において共有結合的に結合した１つ以上のさらなる領域または成分とを含み、それぞれの領域または成分が独立して、下記の性質：
免疫応答を強化すること、精製を容易にすること、または、ポリペプチドの安定性を促進すること
の少なくとも１つを有する領域または成分から選択される免疫原。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載される免疫の免疫学的効果的な量と、医薬的に許容されるキャリアとを含む、患者における感染防御免疫応答を誘導することができる組成物。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含む核酸。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含む組換え細胞。
【請求項１１】
感染防御免疫を提供するＳ．ａｕｒｅｕｓポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）請求項１０に記載される組換え細胞を、前記ポリペプチドが発現する条件のもとで成長させる工程；および
（ｂ）前記ポリペプチドを精製する工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
患者における感染防御免疫応答を誘導する方法であって、請求項１から５のいずれか一項に記載される免疫原の免疫学的効果的な量を前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記患者がヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者がＳ．ａｕｒｅｓｕの感染に対して予防的に処置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
患者における感染防御免疫応答を誘導する方法であって、請求項１１に記載される方法によって作製されたポリペプチドの免疫学的効果的な量を前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【公表番号】特表２００８−５０００４３（Ｐ２００８−５０００４３Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１５２０６（Ｐ２００７−５１５２０６）
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７８３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５１１３
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７８３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１５１１３
【国際公開日】平成１７年１２月８日（２００５．１２．８）
【出願人】（３９００２３５２６）メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド (924)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＲＣＫ ＆ ＣＯＭＰＡＮＹ ＩＮＣＯＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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