２−ケトグルコン酸レダクターゼの生産方法
【課題】微生物の細胞を形質転換し、該形質転換細胞に２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼを大量生産させる方法を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列を含み、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチドに、他の特定のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により増幅させたポリヌクレオチドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターのＸｂａＩ、ＳａｌＩサイト導入して作製したプラスミド、または、さらに該プラスミドに、さらに別の特定のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により変異を導入したプラスミドを大腸菌に導入し、該大腸菌を培養して培養物中に産生されたタンパク質を回収することからなる２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼの生産方法。
【解決手段】特定の塩基配列を含み、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチドに、他の特定のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により増幅させたポリヌクレオチドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターのＸｂａＩ、ＳａｌＩサイト導入して作製したプラスミド、または、さらに該プラスミドに、さらに別の特定のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により変異を導入したプラスミドを大腸菌に導入し、該大腸菌を培養して培養物中に産生されたタンパク質を回収することからなる２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２ＫＧＡ）からＤ−グルコン酸への変換を触媒する酵素である２−ケトグルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）を大量に生産する微生物を作成する方法に関し、詳しくは、２ＫＧＲをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを用いて作製したプラスミド、該プラスミドを導入して得られた形質転換宿主細胞、および該形質転換宿主細胞である微生物を用いて、該酵素を大量生産させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２ＫＧＲの基質となる２ＫＧＡは、種々の工業的な用途に用いられており、２ＫＧＡの含量を把握することは、工業的製品の品質を評価する上で重要となっている。２ＫＧＡは、Ｌ−アスコルビン酸（ＡＳＡ、ビタミンＣ）の原料となるほか、Ｕ．Ｓｔｏｔｔｍｅｉｓｔｅｒらは、２ＫＧＡが立体選択的、あるいは部分選択的に有機合成が可能な材料であるとして、具体的な化合物の製造ルートを明らかにしている（非特許文献１）。すなわち、２ＫＧＡは、メチル化後に、α、β型のピラノースやフラクトースなどの糖類や、６員環アミノ酸を合成することが可能であり、また、２ＫＧＡは、カルボヒドラジンとの反応により、水溶性の側鎖を有するトリアジノンの合成や、ニトロフェニルヒドラゾンとの反応から、１，２，４−ベンゾトリアジンやベンズイミダゾールの合成も可能である。さらに２ＫＧＡから合成した、ニトロフェニルグリコサイドは、１原子を２環が共有して結合するスピロ化合物、例えばスピロ（１，４−ベンゾチアジン−２，２−ピラン）、スピロ（１，４−ベンゾキサジン−２，２−ピラン）、スピロ（ピロド（３，２−ｂ）（１，４−オキサジン−２，２−ピラン））の原料にもなっている。
【０００３】
２ＫＧＡの定量に用いられる、効率が良く、特異性が高い酵素である２ＫＧＲは、微生物の発酵生産により得られ、使用される微生物としては、主にグルコノバクター・リクエファシエンス ＩＦＯ １２３８８、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８、アセトバクター・ランセンス ＩＦＯ １２３８８やアセトバクター・アセンダンス ＩＦＯ ３２９９などがある（非特許文献２）。しかしながら、２ＫＧＲ生産量は表１に示したように、効率の良い充分な生産量とは言えない。
【０００４】
【表１】
【０００５】
一方、遺伝子がすでに見出され、グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈのゲノム（非特許文献３）の中にＧＯＸ２１８７として同定されている５−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（５ＫＧＲ）では、エシュリッヒ・コリで、５ＫＧＲを過剰発現するよう形質転換が試みられている（非特許文献４）。
【非特許文献１】Ｓｔｏｔｔｏｍｅｉｓｔｅｒ，Ｕ．，Ａｕｒｉｃｈ，Ａ．，Ｗｉｌｄｅ，Ｈ．，Ａｎｄｅｒｓｃｈ，Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，ｓ．，Ｓｉｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：６５１−６６４，２００５
【非特許文献２】Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．８９：２０３−２１０，１９８２
【非特許文献３】Ｐｒｕｓｔ，Ｃ．，Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｍ．，Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ，Ｈ．，Ｗｉｅｚｅｒ，Ａ．，Ｆｒｉｃｋｅ，Ｗ．Ｆ．，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ａ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．ａｎｄ Ｄｅｐｐｅｎｍｅｉｅｒ，Ｕ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（２）：１９５−２００，２００５
【非特許文献４】ＫＬＡＳＥＮ，Ｒ．，ＢＲＩＮＧＥＲ−ＭＥＹＥＲ，Ｓ．，ａｎｄ ＳＡＨＭ，Ｈ．Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．１７７（１０）：２６３７−２６４３，１９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の技術においては、産業上利用価値の高い２ＫＧＡを測定するための酵素である２ＫＧＲを効率よく供給する優れた方法がなかった。本発明は、微生物の細胞を形質転換し、該形質転換細胞に２ＫＧＲを大量生産させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、部分的に精製された酵素のＮ末端アミノ酸配列から、２ＫＧＲの遺伝子をＧＯＸ０４１７として同定し、ＧＯＸ０４１７を含むいくつかのプラスミドを作製し、それらのプラスミドを導入した細胞が、２ＫＧＲを大量に発現することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）を提供する。
【０００９】
（１）配列番号１で示される塩基配列を含み、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【００１０】
（２）配列番号１で示される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された配列であって、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【００１１】
（３）上記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドがコードする２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質を、微生物に生産させる方法において、該ポリヌクレオチドに、（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により増幅させたポリヌクレオチドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターのＸｂａＩ、ＳａｌＩサイト導入して作製したプラスミド、または、該プラスミドに、（ｂ）記載のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により変異を導入したプラスミド。
（ａ）配列番号３と配列番号４からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
（ｂ）配列番号５と配列番号６からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
【００１２】
（４）上記（３）に記載のプラスミドを含む、形質転換宿主細胞。
【００１３】
（５）宿主細胞が大腸菌である、上記（４）に記載の形質転換宿主細胞。
【００１４】
（６）２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質を生産させる方法であって、上記（４）または（５）に記載の形質転換宿主細胞を培養し、該培養物中に産生されたタンパク質を回収することを含む、前記生産方法。
【００１５】
（７）２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、上記（６）に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、２ＫＧＲはエシュリッヒ・コリで大量に発現することが可能となり、２ＫＧＡの定量に必要な２ＫＧＲを効率よく生産させることが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
２ＫＧＲは、グルコノバクター属菌（例えば、グルコノバクター・リクエファシエンス ＩＦＯ １２３８８、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８、アセトバクター・ランセンス ＩＦＯ １２３８８）を、適切な培地で培養し、その細胞抽出液を精製して粗精製物を得ることができる。２ＫＧＲのアミノ酸配列の特定は、以下のような方法で可能である。すなわち、２ＫＧＲの粗精製物を、電気泳動で分画して、膜転写を行い、タンパク質部分を切り出して、市販のアミノ酸配列測定機、例えば、プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ ＰＰＳＱ−２１（島津製作所製）を使用して、２ＫＧＲのＮ末端アミノ酸からの配列を解析することができる。
【００１８】
解析の結果から、２ＫＧＲは、ＮＣＢＩのアクセッションナンバーＮＣ０００６６７７のグルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈゲノムの中のＧＯＸ０４１７座位がコードする配列（配列番号２）を有することがわかった。
【００１９】
ＧＯＸ０４１７座位の塩基配列は、配列番号１に示すポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであり、配列番号１で示される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された配列も含まれる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、上記のもののほか、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているポリヌクレオチドであっても、本発明の２ＫＧＲと実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードしているものは、本発明に含まれる。
【００２１】
本発明は、２ＫＧＲ活性を有するタンパク質を微生物で大量に生産させるために、微生物細胞の形質転換を行うものである。形質転換のために、宿主である微生物細胞に導入する方法は、通常当業者が行う方法に準じて行うことができる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを増幅させる手段として、グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈやグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８のゲノムＤＮＡを鋳型として、定法に従いＰＣＲを行なう。プライマー対は、本発明のポリヌクレオチドを増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよく、例えば、ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＧ（配列番号３）とＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＡＴＡ（配列番号４）の配列を有するオリゴヌクレオチド対を用いることができる。酵素の特定、ＤＮＡの結合やＤＮＡの変異など一般的な分子生物学的手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ，ｖｏｌ．１−３．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（２００１））に述べられているように行う。ＰＣＲ反応は、例えばｍＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）やＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）のような市販の装置で行うことができる。
【００２２】
本発明のプラスミドは、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中で２ＫＧＲを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができ、市販されているベクターのタイプとしては、Ｍ１３系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＨＳＧ系、ｐＥＴ系、ｐＧＥＭ−Ｔ等があり、宿主細胞および目的物の生産に適したベクターを選ぶことが好ましい。
【００２３】
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリンやカナマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組み換えベクターは、宿主細胞である微生物中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター、またはその他の制御配列である、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むことが望ましい。さらに高い発現レベルを得るために、一度行って得られたＰＣＲ産物を、さらに別のベクター、例えばｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター （Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＸｂａＩ、ＳａｌＩサイトにクローニングすることもできる。
【００２４】
本発明の形質転換体は、宿主を本発明の組み換えプラスミドで形質転換することにより得られる。宿主としては、２ＫＧＲを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、エシュリッヒ・コリＤＨ５α、エシュリッヒ・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）等のエシュリッヒ・コリ属菌やバチルス属菌などの細菌、サッカロミセス属菌やチゴサッカロミセス属菌等の酵母、アスペルギルス属菌等の糸状菌等が挙げられる。形質転換の手法は、宿主により適した方法で行なうことができるが、細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ．１９４：１８２−１８７，１９９０）等を用いることができる。
【００２５】
本発明の２ＫＧＲの製造法は、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞である菌体を培養し、得られる培養菌体あるいは培養液から２ＫＧＲを回収することにより行うことができる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組み換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選べばよい。例えば、宿主がエシュリッヒ・コリＢＬ２１であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより本発明の２ＫＧＲを効率よく生産させることができる。
【００２６】
形質転換した微生物細胞で生産した２ＫＧＲの分離・精製法は、通常細胞からの２ＫＧＲの分離・精製法と同様に行うことができる。２ＫＧＲが菌体内、または菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を破砕した後、遠心分離、硫安分画、ＤＥＡＥセルロースカラム、セラミック ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＭ−セルロースカラム、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００カラム等の各種クロマトグラフィーを行ない、２ＫＧＲを回収することができる。また、培養液中に２ＫＧＲが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去したのち、菌体処理液と同様に、硫安分画や、各種クロマトグラフィー等を用いて２ＫＧＲを回収することができる。上記の方法により、純度の高い２ＫＧＲを得ることができる。
【００２７】
本発明の２ＫＧＲの活性測定は、ＮＡＤＰＨの存在下、２ＫＧＡが還元されて、Ｄ−グルコン酸とＮＡＤＰが生成される方法で行う。３４０ｎｍにおける吸光度の減少から活性が測定される。２ＫＧＲの酵素単位は、１マイクロモルのＮＡＤＰＨを１分間に酸化する量を１単位（Ｕ）とすることであり、１ｍｇタンパク質あたりの活性単位を比活性して表している。
【実施例１】
【００２８】
＜２−ケトグルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）遺伝子のクローニング＞
【００２９】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８の培養
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８（グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈと分類学上同等）を、ＣａＣＯ３を補充したポテト培地（グリセロール２０ｇ、グルコース５ｇ、イーストエキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、ポテトエキス液１００ｍｌを水に溶解し１ｌとした。）で、３０℃２４時間培養した。細菌の成長は赤色フィルターを備えたクレット比色計（Ｋｌｅｔｔ Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ社製）で測定した。
【００３０】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８からの２ＫＧＲの精製
すべての精製工程は４℃で行った。２ＫＧＲは、２４時間ポテト培地で培養したグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８細胞から精製した。１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ＡｃＢ）ｐＨ５．０に再けん濁したあと、フレンチプレス細胞破砕機（アミンコ社製）を２回通過させ、細胞の残渣を９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去した。細胞膜画分はさらに４００００ｒｐｍで９０分超遠心分離して除去した。得られた溶液画分に、最終濃度が３０％になるように硫酸アンモニウムを加え、一夜放置した。
タンパク質の沈殿物は、４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。さらに、溶液画分には、最終濃度が８０％になるように硫酸アンモニウムを加え、一夜放置した。沈殿したタンパク質を、４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して集めた。タンパク質は、１ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのｐＨ６．０リン酸バッファー（バッファーＡ）に溶解し、少なくとも３時間ずつ２回透析した。
酵素溶液は、さらに、バッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムで、ＮａＣｌの０から０．３Ｍの濃度勾配のクロマトを行った。活性画分を集め、同じ条件で透析を行った。透析したものは、さらに、バッファーＡで平衡化したセラミック ハイドロキシアパタイトカラムでクロマトを行った。活性画分は、カラムを通過した画分に見られた。５ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含むｐＨ５．０の１０ｍＭＡｃＢ（バッファーＢ）で一夜透析した。沈殿物は９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去し、上清は、バッファーＢで平衡化したＣＭ−セルロースカラムでクロマトを行った。そこで活性画分はＮａＣｌの０から０．３Ｍの濃度勾配のクロマトで溶出した。活性画分を集め、５ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含むｐＨ６．０の１０ｍＭリン酸バッファー（バッファーＣ）で透析した。沈殿物を遠心分離で除去し、酵素溶液は、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００カラムで、４０ｍｌ／ｈｒのクロマトを行った。その結果、総タンパク量８３４０ｍｇの細胞抽出液から比活性１４ユニット・ｍｇ−１の２ＫＧＲ粗精製物１６ｍｇを得た。
【００３１】
２ＫＧＲの活性測定
２ＫＧＲの活性は、ＮＡＤＰＨ由来の波長３４０ｎｍの吸光度の減少を２５℃で測定した。反応液１ｍｌに１０ｍＭ の２ＫＧＡ（シグマ社製）、１００マイクロモルのＮＡＤＰＨ、５０ｍＭリン酸バッファーを加え、ｐＨ６．０とした。酵素１単位（Ｕ）は、この条件下で１分間に２ＫＧＡの１マイクロモルを触媒する酵素量とした。
【００３２】
Ｎ末端アミノ酸配列のエレクトロブロッティング法
２ＫＧＲ粗精製物３０μｇを使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。ｐＨ１１．０のＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸バッファー中、１００ｍＡで４時間通電して、Ｎ−ポリビニリデン ジフルオライド膜上に転写した。膜は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０で着色し、５０％メタノールで洗った。現れたバンド部分を切り出し、プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ ＰＰＳＱ−２１（島津製作所社製）を使ってＮ末端アミノ酸からの配列を解析した。３３ｋＤａのタンパク質はＮ末端のアミノ酸配列がＳＳＸＰＤＩＬＡＩＤであり、グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈゲノムの中のＧＯＸ０４１７座位がコードする配列ＭＳＳＫＰＤＩＬＴＩＤとほとんど一致した。
【００３３】
ＰＣＲによる２ＫＧＲ遺伝子の増幅とプラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７の作製
グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈゲノム配列を基にして、ＧＯＸ０４１７座位を含む遺伝子断片を増幅できるように２つのプライマー、２ＫＧＲ−１−Ｘｂａ（配列番号３：ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＧ）と２ＫＧＲ−２−Ｓａｌ（配列番号４：ＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＡＴＡ）、を設計した。ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）やＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、反応液２５μｌ中ＰｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使ったＰＣＲで増幅した。この場合、鋳型ＤＮＡとして、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８のゲノムＤＮＡを使用した。１０６６ｂｐｓのＰＣＲ産物が得られ、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングした。核酸配列は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し確認した。このプラスミドｐＧＥＭ−ＧＯＸ０４１７を導入したエシュリッヒ・コリＤＨ５αで、２ＫＧＲ活性は、グルコノバクター菌株の培養液中より２０倍量を観察した。さらに、高い発現レベルを得るために、１０６６ｂｐｓのＰＣＲ産物をｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＸｂａＩ、ＳａｌＩサイトにクローニングしプラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７を作製した。ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７は、ｐＧＥＭ−ＧＯＸ０４１７を導入したエシュリッヒ・コリＤＨ５αと比較して、２ＫＧＲ活性はわずかに増加することが分かった。このように、遺伝子ＧＯＸ０４１７は、２ＫＧＲに関する遺伝子として認められた。
【実施例２】
【００３４】
＜遺伝子ＧＯＸ０４１７発現プラスミドの改変＞
【００３５】
プラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６の作製
ＧＯＸ０４１７の発現レベルを改善するために、ＧＯＸ０４１７のスタートコドンの７塩基上流のリボソーム結合配列ＡＡＴＧＧＡをＧＡＡＧＧＡへ変異させた。すなわち、エシュリッヒ・コリＤＨ５αで調製したプラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７を鋳型として、ＰＣＲ反応液には、ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７を１０ｎｇ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ｂｕｆｆｅｒ、各々２００ｎＭのプライマーＦ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７（配列番号５：ＣＴＡＧＣＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＣ）とプライマーＲ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７（配列番号６：ＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＣＴＣＡＡＧＣＴＡＧ）、２５０マイクロモルｄＮＴＰと２．５ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼを加え、全量を５０μｌとした。プライマーＦ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７とプライマー Ｒ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７は、ＧＯＸ０４１７遺伝子のリボソーム結合配列（ＡＡＴＧＧＡ）をＧＡＡＧＧＡへ変異させるように作製した。ＰＣＲの温度サイクルは、以下のように行った。９５℃で３０秒を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で６分３０秒を１６サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は３７℃に保った。このＰＣＲ反応液に２０ユニットの制限酵素ＤｐｎＩを添加し３７℃で１時間反応させ、メチル化されていた鋳型のプラスミドを分解し、新しくＰＣＲで増幅されたメチル化されていないプラスミドのみ残るようにした。この変異したプラスミドは、エシュリッヒ・コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅの形質転換体から得られ、プラスミドの部分変異は、ＤＮＡ配列で確認した。ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６と名づけられたプラスミド（図１）は、エシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、発現を確認した。その発現レベルは、ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７で変換したエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）のものより２倍増加した。ＧＯＸ０４１７の発現は、ＩＰＴＧで５時間もしくはそれ以上誘導することで得られた。細胞抽出物を遠心分離した際の残渣である沈殿区分にも見られた（図２）。発現量は、３０℃よりも３７℃の方が高かった。
【実施例３】
【００３６】
＜エシュリッヒ・コリでの２ＫＧＲの大量発現と精製＞
ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７Ｍ６を用いたエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃でクレット比色計での値が１００（６００ｎｍの吸光度で０．８程度）に到達するまで培養した。そのあと、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように加え、成長が３５０Ｋｌｅｔｔに到達するまで培養した。細胞を集め２回洗浄した。溶液は、実施例１のグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８から２ＫＧＲを精製した方法と同様の方法で、ｐＨ７．０の５ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸バッファーで平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムを用いたクロマトを行った。活性画分をまとめて集め、上記のバッファーで透析し精製２ＫＧＲを得た（図３）。精製の概要は表１に示した。この結果から、２ＫＧＲはエシュリッヒ・コリで過剰発現することが分かり、培養溶液から１回のカラムクロマトで大容量を容易に調製できた。
【００３７】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のプラスミドを導入した形質転換宿主細胞である微生物を用いることにより、２ＫＧＲの大量生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】２ＫＧＲ産生のため構築したプラスミドを示す図である。
【図２】プラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６を導入したエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）で２ＫＧＲを産生させ、分離した細胞抽出液（Ａ）と沈殿物（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図３】プラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６を導入したエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）で２ＫＧＲを産生させ、各精製段階において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２ＫＧＡ）からＤ−グルコン酸への変換を触媒する酵素である２−ケトグルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）を大量に生産する微生物を作成する方法に関し、詳しくは、２ＫＧＲをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを用いて作製したプラスミド、該プラスミドを導入して得られた形質転換宿主細胞、および該形質転換宿主細胞である微生物を用いて、該酵素を大量生産させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２ＫＧＲの基質となる２ＫＧＡは、種々の工業的な用途に用いられており、２ＫＧＡの含量を把握することは、工業的製品の品質を評価する上で重要となっている。２ＫＧＡは、Ｌ−アスコルビン酸（ＡＳＡ、ビタミンＣ）の原料となるほか、Ｕ．Ｓｔｏｔｔｍｅｉｓｔｅｒらは、２ＫＧＡが立体選択的、あるいは部分選択的に有機合成が可能な材料であるとして、具体的な化合物の製造ルートを明らかにしている（非特許文献１）。すなわち、２ＫＧＡは、メチル化後に、α、β型のピラノースやフラクトースなどの糖類や、６員環アミノ酸を合成することが可能であり、また、２ＫＧＡは、カルボヒドラジンとの反応により、水溶性の側鎖を有するトリアジノンの合成や、ニトロフェニルヒドラゾンとの反応から、１，２，４−ベンゾトリアジンやベンズイミダゾールの合成も可能である。さらに２ＫＧＡから合成した、ニトロフェニルグリコサイドは、１原子を２環が共有して結合するスピロ化合物、例えばスピロ（１，４−ベンゾチアジン−２，２−ピラン）、スピロ（１，４−ベンゾキサジン−２，２−ピラン）、スピロ（ピロド（３，２−ｂ）（１，４−オキサジン−２，２−ピラン））の原料にもなっている。
【０００３】
２ＫＧＡの定量に用いられる、効率が良く、特異性が高い酵素である２ＫＧＲは、微生物の発酵生産により得られ、使用される微生物としては、主にグルコノバクター・リクエファシエンス ＩＦＯ １２３８８、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８、アセトバクター・ランセンス ＩＦＯ １２３８８やアセトバクター・アセンダンス ＩＦＯ ３２９９などがある（非特許文献２）。しかしながら、２ＫＧＲ生産量は表１に示したように、効率の良い充分な生産量とは言えない。
【０００４】
【表１】
【０００５】
一方、遺伝子がすでに見出され、グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈのゲノム（非特許文献３）の中にＧＯＸ２１８７として同定されている５−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（５ＫＧＲ）では、エシュリッヒ・コリで、５ＫＧＲを過剰発現するよう形質転換が試みられている（非特許文献４）。
【非特許文献１】Ｓｔｏｔｔｏｍｅｉｓｔｅｒ，Ｕ．，Ａｕｒｉｃｈ，Ａ．，Ｗｉｌｄｅ，Ｈ．，Ａｎｄｅｒｓｃｈ，Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，ｓ．，Ｓｉｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：６５１−６６４，２００５
【非特許文献２】Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．８９：２０３−２１０，１９８２
【非特許文献３】Ｐｒｕｓｔ，Ｃ．，Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｍ．，Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ，Ｈ．，Ｗｉｅｚｅｒ，Ａ．，Ｆｒｉｃｋｅ，Ｗ．Ｆ．，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ａ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．ａｎｄ Ｄｅｐｐｅｎｍｅｉｅｒ，Ｕ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（２）：１９５−２００，２００５
【非特許文献４】ＫＬＡＳＥＮ，Ｒ．，ＢＲＩＮＧＥＲ−ＭＥＹＥＲ，Ｓ．，ａｎｄ ＳＡＨＭ，Ｈ．Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．１７７（１０）：２６３７−２６４３，１９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の技術においては、産業上利用価値の高い２ＫＧＡを測定するための酵素である２ＫＧＲを効率よく供給する優れた方法がなかった。本発明は、微生物の細胞を形質転換し、該形質転換細胞に２ＫＧＲを大量生産させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、部分的に精製された酵素のＮ末端アミノ酸配列から、２ＫＧＲの遺伝子をＧＯＸ０４１７として同定し、ＧＯＸ０４１７を含むいくつかのプラスミドを作製し、それらのプラスミドを導入した細胞が、２ＫＧＲを大量に発現することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）を提供する。
【０００９】
（１）配列番号１で示される塩基配列を含み、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【００１０】
（２）配列番号１で示される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された配列であって、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【００１１】
（３）上記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドがコードする２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質を、微生物に生産させる方法において、該ポリヌクレオチドに、（ａ）に記載のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により増幅させたポリヌクレオチドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターのＸｂａＩ、ＳａｌＩサイト導入して作製したプラスミド、または、該プラスミドに、（ｂ）記載のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により変異を導入したプラスミド。
（ａ）配列番号３と配列番号４からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
（ｂ）配列番号５と配列番号６からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
【００１２】
（４）上記（３）に記載のプラスミドを含む、形質転換宿主細胞。
【００１３】
（５）宿主細胞が大腸菌である、上記（４）に記載の形質転換宿主細胞。
【００１４】
（６）２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質を生産させる方法であって、上記（４）または（５）に記載の形質転換宿主細胞を培養し、該培養物中に産生されたタンパク質を回収することを含む、前記生産方法。
【００１５】
（７）２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、上記（６）に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、２ＫＧＲはエシュリッヒ・コリで大量に発現することが可能となり、２ＫＧＡの定量に必要な２ＫＧＲを効率よく生産させることが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
２ＫＧＲは、グルコノバクター属菌（例えば、グルコノバクター・リクエファシエンス ＩＦＯ １２３８８、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８、アセトバクター・ランセンス ＩＦＯ １２３８８）を、適切な培地で培養し、その細胞抽出液を精製して粗精製物を得ることができる。２ＫＧＲのアミノ酸配列の特定は、以下のような方法で可能である。すなわち、２ＫＧＲの粗精製物を、電気泳動で分画して、膜転写を行い、タンパク質部分を切り出して、市販のアミノ酸配列測定機、例えば、プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ ＰＰＳＱ−２１（島津製作所製）を使用して、２ＫＧＲのＮ末端アミノ酸からの配列を解析することができる。
【００１８】
解析の結果から、２ＫＧＲは、ＮＣＢＩのアクセッションナンバーＮＣ０００６６７７のグルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈゲノムの中のＧＯＸ０４１７座位がコードする配列（配列番号２）を有することがわかった。
【００１９】
ＧＯＸ０４１７座位の塩基配列は、配列番号１に示すポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその相補配列からなるポリヌクレオチドであり、配列番号１で示される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された配列も含まれる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、上記のもののほか、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているポリヌクレオチドであっても、本発明の２ＫＧＲと実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードしているものは、本発明に含まれる。
【００２１】
本発明は、２ＫＧＲ活性を有するタンパク質を微生物で大量に生産させるために、微生物細胞の形質転換を行うものである。形質転換のために、宿主である微生物細胞に導入する方法は、通常当業者が行う方法に準じて行うことができる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを増幅させる手段として、グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈやグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８のゲノムＤＮＡを鋳型として、定法に従いＰＣＲを行なう。プライマー対は、本発明のポリヌクレオチドを増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよく、例えば、ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＧ（配列番号３）とＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＡＴＡ（配列番号４）の配列を有するオリゴヌクレオチド対を用いることができる。酵素の特定、ＤＮＡの結合やＤＮＡの変異など一般的な分子生物学的手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ，ｖｏｌ．１−３．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（２００１））に述べられているように行う。ＰＣＲ反応は、例えばｍＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）やＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）のような市販の装置で行うことができる。
【００２２】
本発明のプラスミドは、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中で２ＫＧＲを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができ、市販されているベクターのタイプとしては、Ｍ１３系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＨＳＧ系、ｐＥＴ系、ｐＧＥＭ−Ｔ等があり、宿主細胞および目的物の生産に適したベクターを選ぶことが好ましい。
【００２３】
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリンやカナマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組み換えベクターは、宿主細胞である微生物中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター、またはその他の制御配列である、例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等を含むことが望ましい。さらに高い発現レベルを得るために、一度行って得られたＰＣＲ産物を、さらに別のベクター、例えばｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター （Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＸｂａＩ、ＳａｌＩサイトにクローニングすることもできる。
【００２４】
本発明の形質転換体は、宿主を本発明の組み換えプラスミドで形質転換することにより得られる。宿主としては、２ＫＧＲを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、エシュリッヒ・コリＤＨ５α、エシュリッヒ・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）等のエシュリッヒ・コリ属菌やバチルス属菌などの細菌、サッカロミセス属菌やチゴサッカロミセス属菌等の酵母、アスペルギルス属菌等の糸状菌等が挙げられる。形質転換の手法は、宿主により適した方法で行なうことができるが、細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ．１９４：１８２−１８７，１９９０）等を用いることができる。
【００２５】
本発明の２ＫＧＲの製造法は、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞である菌体を培養し、得られる培養菌体あるいは培養液から２ＫＧＲを回収することにより行うことができる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組み換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選べばよい。例えば、宿主がエシュリッヒ・コリＢＬ２１であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより本発明の２ＫＧＲを効率よく生産させることができる。
【００２６】
形質転換した微生物細胞で生産した２ＫＧＲの分離・精製法は、通常細胞からの２ＫＧＲの分離・精製法と同様に行うことができる。２ＫＧＲが菌体内、または菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を破砕した後、遠心分離、硫安分画、ＤＥＡＥセルロースカラム、セラミック ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＭ−セルロースカラム、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００カラム等の各種クロマトグラフィーを行ない、２ＫＧＲを回収することができる。また、培養液中に２ＫＧＲが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去したのち、菌体処理液と同様に、硫安分画や、各種クロマトグラフィー等を用いて２ＫＧＲを回収することができる。上記の方法により、純度の高い２ＫＧＲを得ることができる。
【００２７】
本発明の２ＫＧＲの活性測定は、ＮＡＤＰＨの存在下、２ＫＧＡが還元されて、Ｄ−グルコン酸とＮＡＤＰが生成される方法で行う。３４０ｎｍにおける吸光度の減少から活性が測定される。２ＫＧＲの酵素単位は、１マイクロモルのＮＡＤＰＨを１分間に酸化する量を１単位（Ｕ）とすることであり、１ｍｇタンパク質あたりの活性単位を比活性して表している。
【実施例１】
【００２８】
＜２−ケトグルコン酸レダクターゼ（２ＫＧＲ）遺伝子のクローニング＞
【００２９】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８の培養
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８（グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈと分類学上同等）を、ＣａＣＯ３を補充したポテト培地（グリセロール２０ｇ、グルコース５ｇ、イーストエキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、ポテトエキス液１００ｍｌを水に溶解し１ｌとした。）で、３０℃２４時間培養した。細菌の成長は赤色フィルターを備えたクレット比色計（Ｋｌｅｔｔ Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ社製）で測定した。
【００３０】
グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８からの２ＫＧＲの精製
すべての精製工程は４℃で行った。２ＫＧＲは、２４時間ポテト培地で培養したグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８細胞から精製した。１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ＡｃＢ）ｐＨ５．０に再けん濁したあと、フレンチプレス細胞破砕機（アミンコ社製）を２回通過させ、細胞の残渣を９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去した。細胞膜画分はさらに４００００ｒｐｍで９０分超遠心分離して除去した。得られた溶液画分に、最終濃度が３０％になるように硫酸アンモニウムを加え、一夜放置した。
タンパク質の沈殿物は、４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して除去した。さらに、溶液画分には、最終濃度が８０％になるように硫酸アンモニウムを加え、一夜放置した。沈殿したタンパク質を、４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して集めた。タンパク質は、１ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含む１０ｍＭのｐＨ６．０リン酸バッファー（バッファーＡ）に溶解し、少なくとも３時間ずつ２回透析した。
酵素溶液は、さらに、バッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラムで、ＮａＣｌの０から０．３Ｍの濃度勾配のクロマトを行った。活性画分を集め、同じ条件で透析を行った。透析したものは、さらに、バッファーＡで平衡化したセラミック ハイドロキシアパタイトカラムでクロマトを行った。活性画分は、カラムを通過した画分に見られた。５ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含むｐＨ５．０の１０ｍＭＡｃＢ（バッファーＢ）で一夜透析した。沈殿物は９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して除去し、上清は、バッファーＢで平衡化したＣＭ−セルロースカラムでクロマトを行った。そこで活性画分はＮａＣｌの０から０．３Ｍの濃度勾配のクロマトで溶出した。活性画分を集め、５ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含むｐＨ６．０の１０ｍＭリン酸バッファー（バッファーＣ）で透析した。沈殿物を遠心分離で除去し、酵素溶液は、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００カラムで、４０ｍｌ／ｈｒのクロマトを行った。その結果、総タンパク量８３４０ｍｇの細胞抽出液から比活性１４ユニット・ｍｇ−１の２ＫＧＲ粗精製物１６ｍｇを得た。
【００３１】
２ＫＧＲの活性測定
２ＫＧＲの活性は、ＮＡＤＰＨ由来の波長３４０ｎｍの吸光度の減少を２５℃で測定した。反応液１ｍｌに１０ｍＭ の２ＫＧＡ（シグマ社製）、１００マイクロモルのＮＡＤＰＨ、５０ｍＭリン酸バッファーを加え、ｐＨ６．０とした。酵素１単位（Ｕ）は、この条件下で１分間に２ＫＧＡの１マイクロモルを触媒する酵素量とした。
【００３２】
Ｎ末端アミノ酸配列のエレクトロブロッティング法
２ＫＧＲ粗精製物３０μｇを使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。ｐＨ１１．０のＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸バッファー中、１００ｍＡで４時間通電して、Ｎ−ポリビニリデン ジフルオライド膜上に転写した。膜は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０で着色し、５０％メタノールで洗った。現れたバンド部分を切り出し、プロテインシークエンサーＭｏｄｅｌ ＰＰＳＱ−２１（島津製作所社製）を使ってＮ末端アミノ酸からの配列を解析した。３３ｋＤａのタンパク質はＮ末端のアミノ酸配列がＳＳＸＰＤＩＬＡＩＤであり、グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈゲノムの中のＧＯＸ０４１７座位がコードする配列ＭＳＳＫＰＤＩＬＴＩＤとほとんど一致した。
【００３３】
ＰＣＲによる２ＫＧＲ遺伝子の増幅とプラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７の作製
グルコノバクター・オキシダンス ＡＴＣＣ ６２１Ｈゲノム配列を基にして、ＧＯＸ０４１７座位を含む遺伝子断片を増幅できるように２つのプライマー、２ＫＧＲ−１−Ｘｂａ（配列番号３：ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＧ）と２ＫＧＲ−２−Ｓａｌ（配列番号４：ＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＡＴＡ）、を設計した。ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）やＭｙＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、反応液２５μｌ中ＰｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ ｂｅａｄｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使ったＰＣＲで増幅した。この場合、鋳型ＤＮＡとして、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ １２５２８のゲノムＤＮＡを使用した。１０６６ｂｐｓのＰＣＲ産物が得られ、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングした。核酸配列は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し確認した。このプラスミドｐＧＥＭ−ＧＯＸ０４１７を導入したエシュリッヒ・コリＤＨ５αで、２ＫＧＲ活性は、グルコノバクター菌株の培養液中より２０倍量を観察した。さらに、高い発現レベルを得るために、１０６６ｂｐｓのＰＣＲ産物をｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＸｂａＩ、ＳａｌＩサイトにクローニングしプラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７を作製した。ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７は、ｐＧＥＭ−ＧＯＸ０４１７を導入したエシュリッヒ・コリＤＨ５αと比較して、２ＫＧＲ活性はわずかに増加することが分かった。このように、遺伝子ＧＯＸ０４１７は、２ＫＧＲに関する遺伝子として認められた。
【実施例２】
【００３４】
＜遺伝子ＧＯＸ０４１７発現プラスミドの改変＞
【００３５】
プラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６の作製
ＧＯＸ０４１７の発現レベルを改善するために、ＧＯＸ０４１７のスタートコドンの７塩基上流のリボソーム結合配列ＡＡＴＧＧＡをＧＡＡＧＧＡへ変異させた。すなわち、エシュリッヒ・コリＤＨ５αで調製したプラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７を鋳型として、ＰＣＲ反応液には、ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７を１０ｎｇ、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ｂｕｆｆｅｒ、各々２００ｎＭのプライマーＦ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７（配列番号５：ＣＴＡＧＣＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＣ）とプライマーＲ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７（配列番号６：ＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＣＴＣＡＡＧＣＴＡＧ）、２５０マイクロモルｄＮＴＰと２．５ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼを加え、全量を５０μｌとした。プライマーＦ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７とプライマー Ｒ−ＲＢＳ−ＧＯＸ０４１７は、ＧＯＸ０４１７遺伝子のリボソーム結合配列（ＡＡＴＧＧＡ）をＧＡＡＧＧＡへ変異させるように作製した。ＰＣＲの温度サイクルは、以下のように行った。９５℃で３０秒を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で６分３０秒を１６サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は３７℃に保った。このＰＣＲ反応液に２０ユニットの制限酵素ＤｐｎＩを添加し３７℃で１時間反応させ、メチル化されていた鋳型のプラスミドを分解し、新しくＰＣＲで増幅されたメチル化されていないプラスミドのみ残るようにした。この変異したプラスミドは、エシュリッヒ・コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅの形質転換体から得られ、プラスミドの部分変異は、ＤＮＡ配列で確認した。ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６と名づけられたプラスミド（図１）は、エシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、発現を確認した。その発現レベルは、ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７で変換したエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）のものより２倍増加した。ＧＯＸ０４１７の発現は、ＩＰＴＧで５時間もしくはそれ以上誘導することで得られた。細胞抽出物を遠心分離した際の残渣である沈殿区分にも見られた（図２）。発現量は、３０℃よりも３７℃の方が高かった。
【実施例３】
【００３６】
＜エシュリッヒ・コリでの２ＫＧＲの大量発現と精製＞
ｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７Ｍ６を用いたエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃でクレット比色計での値が１００（６００ｎｍの吸光度で０．８程度）に到達するまで培養した。そのあと、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように加え、成長が３５０Ｋｌｅｔｔに到達するまで培養した。細胞を集め２回洗浄した。溶液は、実施例１のグルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８から２ＫＧＲを精製した方法と同様の方法で、ｐＨ７．０の５ｍＭのβ―メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸バッファーで平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムを用いたクロマトを行った。活性画分をまとめて集め、上記のバッファーで透析し精製２ＫＧＲを得た（図３）。精製の概要は表１に示した。この結果から、２ＫＧＲはエシュリッヒ・コリで過剰発現することが分かり、培養溶液から１回のカラムクロマトで大容量を容易に調製できた。
【００３７】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のプラスミドを導入した形質転換宿主細胞である微生物を用いることにより、２ＫＧＲの大量生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】２ＫＧＲ産生のため構築したプラスミドを示す図である。
【図２】プラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６を導入したエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）で２ＫＧＲを産生させ、分離した細胞抽出液（Ａ）と沈殿物（Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図３】プラスミドｐＥＴ−ＧＯＸ０４１７ Ｍ６を導入したエシュリッヒ・コリＢＬ２１（ＤＥ３）で２ＫＧＲを産生させ、各精製段階において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を含み、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された配列であって、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドがコードする２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質を、微生物に生産させる方法において、該ポリヌクレオチドに、（ａ）記載のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により増幅させたポリヌクレオチドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターのＸｂａＩ、ＳａｌＩサイト導入して作製したプラスミド、または、該プラスミドに、（b）記載のポリヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により変異を導入したプラスミド。
（ａ）配列番号３と配列番号４からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
（ｂ）配列番号５と配列番号６からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
【請求項４】
請求項３に記載のプラスミドを含む、形質転換宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項６】
２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質を生産させる方法であって、請求項４または５に記載の形質転換宿主細胞を培養し、該培養物中に産生されたタンパク質を回収することを含む、前記生産方法。
【請求項７】
２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項６に記載の生産方法。
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を含み、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列において、１若しくは複数の塩基が挿入、付加、欠失若しくは置換された配列であって、かつ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその相補配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドがコードする２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質を、微生物に生産させる方法において、該ポリヌクレオチドに、（ａ）記載のオリゴヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により増幅させたポリヌクレオチドを、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターのＸｂａＩ、ＳａｌＩサイト導入して作製したプラスミド、または、該プラスミドに、（b）記載のポリヌクレオチドを結合させ、ＰＣＲ反応により変異を導入したプラスミド。
（ａ）配列番号３と配列番号４からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
（ｂ）配列番号５と配列番号６からなるオリゴヌクレオチドプライマー対
【請求項４】
請求項３に記載のプラスミドを含む、形質転換宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項６】
２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質を生産させる方法であって、請求項４または５に記載の形質転換宿主細胞を培養し、該培養物中に産生されたタンパク質を回収することを含む、前記生産方法。
【請求項７】
２−ケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項６に記載の生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２１２０３９（Ｐ２００８−２１２０３９Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７１６（Ｐ２００７−５２７１６）
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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