２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを用いたアルツハイマー病の予防と／またおよび／または治療においての役割への適用
本発明は２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムがアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いる薬を調製する時の使用を公開した。また、本発明は予防や治療に実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、および薬学で認めるオプションのキャリアおよび／またはアクセサリを含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いる医薬組成物を公開した。および必要がある患者に治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムや請求項８に記載の医薬組成物を使用することを含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムがアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いる薬を調製する時の役割に関する。上記アルツハイマー病は、初老期認知症・脳血管性認知症またはこの両方とも持つ混合症状から選択される。上記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選択される。また、本発明は、アルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用い、予防や治療に実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、および薬学で認めるオプションのキャリアおよび／またはアクセサリを含む医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放出または徐放性製剤から選ばれる。また、本発明は必要がある患者に治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムや請求項４に記載の医薬組成物を使用を含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療の方法に関する。患者への投与経路は非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これに限定されない。上記器官から選んで、経由して患者に投薬する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、初老期認知症（アルツハイマー病、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）と血管性認知症（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ， ＶＤ）の二種類および両方の混合症状に分けられる。ＡＤは年齢に関わる進行性認知障害と記憶障害を主としての中枢神経系の変性疾患である。主な臨床症状は記憶（特に最近の記憶）減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調である。最も特徴的な２つの病理学での変化は脳細胞外アミロイドペプチド沈着と神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴ）である。本疾患は６０歳以上の人間に多発で、わが国は６５歳以上の老人の有病率は４％前後、全世界では約５０００万の高齢者がそれぞれ程度のアルツハイマー病にかかっている。ＶＤは脳血管病によって脳機能障害で発生した病気である。欧米には、ＶＤ患者はアルツハイマー病患者総数の１０〜２０％を占め、アジアでは、中国と日本の発生率はさらぶ高い。わが国は高齢化時代に入っているので、アルツハイマー病の患者は年々増加している。脳への血液供給が長期に不足が続けることも脳血管性認知症になる重要な原因である。アルツハイマー病患者は本人が苦しく感じるだけではなく、家庭にも社会にも重い負担になるが、今のところ効果的な治療薬がまだできていないので、有効な薬を見つけ、ＡＤとＶＤの発生・進行を遅延・制御することは極めて重要になる。
【０００３】
本請求項で用いた２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ２−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）−ｂｅｎｚｏａｔｅ，ｄｌ−ＰＨＰＢ）は化学合成の新規物質で、核磁気共鳴、ＭＳおよび赤外線などのスペクトル分析によって、単一の化合物であることを証明し、高性能液相の分析によっては、化学の純度は９８％以上であることを証明した。その調製工程は特許「２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムおよびその作り方と役割」、公報１３８２６８２。その化学一般式は次式で表される。
【０００４】
【化１】
【０００５】
今までｄｌ−ＰＨＰＢでアルツハイマー病を治療したという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許公報第１３８２６８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムがアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いる薬を調製する時の役割に関する。
【０００８】
本発明で記載のアルツハイマー病は、初老期認知症・血管性認知症またはこの両方の混合症状から選択される。上記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選択される。
【０００９】
本発明で記載の予防とは、アルツハイマー病が発生する前に、特にアルツハイマー病初期の前で記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調などの症状を抑える。記載の緩和とは、アルツハイマー病中に、またはアルツハイマー病が出た後、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調などの症状を改善する。記載の治療とは、アルツハイマー病中に、またはアルツハイマー病が出た後、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調などの症状を臨床上の改善を図る。
【００１０】
また、本発明は２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムが脳組織の酸化ストレス損傷の軽減、コリン作動性神経機能の向上、ニューロンの保護および／または脳源性神経成長因子含有量の向上に用いる薬を調製する時の役割に関わる。記載の脳組織の酸化ストレス損傷の軽減とは、脳組織代償性が異常増加の酸化防止酵素の活性を抑えることで、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる。記載の酸化防止酵素とは、スーパーオキシドジスムターゼで、脂質過酸化産物とはマロンアルデヒドである。コリン作動性神経機能の改善は、アセチルコリン合成酵素の活性を上げることで、アセチルコリン加水分解酵素の活性を下げる。
【００１１】
本発明の中のｄｌ−ＰＨＰＢは２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを指す。本発明では、記載の哺乳動物は人間が好ましい。
【００１２】
アルツハイマー病患者として、主要な表現は認知障害、特に最近の記憶と空間知覚のプログレッシブ減退である。高齢者と関わる認知症はいろいろな原因で引き起こされ、例えば脳血管性（脳虚血）、β−アミロイドペプチド沈着相関の変化およびその他老年と関わる未知の原因がある。上記要因に対して、本発明は下記の認定されたモデル三種類を取り入れた。２−ＶＯラットが臨床的な脳への血液供給不足で起こった脳血管性認知症が模擬できる；ラットの側脳室にＡβ（２５−３５）を注射したことで起こった学習・記憶障害は観測薬物が初老期認知症（アルツハイマー病、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）に治療作用のモデルであることはすでに認定されている；ＳＡＭＰ８は学習・記憶障害が現れるだけでなく、ＡＤの一部の病理学の特徴も有し、すばやく自然な疾患モデルであり、人間の老衰や認知症の臨床特徴と類似しており、理想的なＡＤの代替モデルである。本研究は国際で認定された方法で、すなわちＭｏｒｒｉｓ水迷路実験、水迷路実験およびステップダウンのテストでラット・マウスの学習・記憶能力を測定し、三種類の動物モデルでｄｌ−ＰＨＰＢが脳血管性認知症、β−アミロイドペプチド（Ａβ）誘導への認知障害およびすばやく老衰に伴って出た学習・記憶衰退の役割を観察した。
【００１３】
要するに、本発明は、この３つのモデルでｄｌ−ＰＨＰＢが認知症動物の学習記憶に対する改善効果を観察して、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳虚血ラット、Ａβ認知傷害ラットと加速老衰マウスの学習・記憶能力を顕著に改善できることを発見した。また、本発明はそれ以上の作用メカニズムの可能性に対しても研究してみた。ｄｌ−ＰＨＰＢは、慢性脳虚血原因の脳組織形態異常の改善、アストロサイト活性化の減少とニューロン保護作用の再生ができる；上記三種類モデルの動物脳組織代償性増加のＳＯＤ活性の下降、ＭＤＡレベルアップ、酸化損害の減少およびニューロン保護もできる；上記三種類モデル動物の脳内ＣｈＡＴ活性を強め、脳内アセチルコリン合成を増加させて、動物の学習・記憶能力を強化することができる；慢性脳虚血後脳組織神経営養因子（ＢＤＮＦ）の含有量を増加させることができるということは脳組織の保護と認知症抵抗のメカニズムの１つであることを発見した。上記のことは、ｄｌ−ＰＨＰＢは多原因の学習・記憶障害症を改善でき、アルツハイマー病に対して著しい治療作用があり、老衰原因の学習・記憶衰退に対しても改善ができるということは十分に説明された。
【００１４】
具体的には、本発明は、慢性脳虚血モデルに対する研究を通して、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血液供給不足ラットの最近記憶と空間識失調を改善することができる。ＶＤは脳血管病が原因の脳機能障害でかかった認知症であり、ほとんどの脳動脈梗塞あるいはラクナ脳梗塞あるいは脳低循環に関連付けられている。脳低循環程度は認知症の重さにと関連している。慢性進行性脳供血不足は酸素とグルコースおよび他の必要代謝物の利用率を低下させた結果は、酸化損傷を引き起こし、ミトコンドリア機能と神経細胞の生物合成も損害され、シナプス伝達をブロックされ、最後に神経病理学的異常、すなわち神経変性の変更になってしまう。ＶＤ患者の症状は主に最近の記憶と空間感の進行性低下および認知障害である。
【００１５】
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路実験は動物の空間学習と最近の記憶能力を検出する典型的な実験である。本発明は、大鼠の両側頚動脈（２−ＶＯ）を永久的に結紮することで継続性脳低循環のモデルを作り、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路法でｄｌ−ＰＨＰＢの動物最近記憶と空間識失調に対する影響を検測してみた。この実験を通して、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳低循環ラットの学習・記憶を改善できることを発見した。ラットが慢性脳虚血にかかった１ヶ月後に、本発明の発明者は二項の実験を行った。１つはナビゲーションテスト実験、もう１つは空間探査実験。
【００１６】
ナビゲーションテストで、ラットがプラットフォーム見つける時間（潜伏期間）、サーチ策略および水泳スピードの三項指標を観察した。ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳低循環ラットの学習記憶能力の減退に対しては顕著な改善効果を持っている。潜伏期間から見ると、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラットの空間学習と最近記憶障害に明らかな改善効果を持っている。プラットフォーム探査策略から分析すると、ｄｌ−ＰＨＰＢ群はリニア式とトレンドスタイル式策略を使う回数は明らかに増えたことは、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳低循環ラットが空間位置への記憶能力を向上できることが示された。実験中に、各群ラットの水泳スピードに明らかな変化がなく、群の間にも明らかな差異がないことは、当該実験方法は体力が妨害にならないことから、よりよいラットの学習記憶能力を測定できる。ｄｌ−ＰＨＰＢはアルツハイマー病、特に脳血管性認知症の空間学習と最近記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療ができることが示された。
【００１７】
ナビゲーションテストが終わってから、プラットフォーム探査実験を行い、安全島をはずして、ラットが目標象限での活動時間と第一回目標を通る時間を記録することで、ラットが安全島に対する空間記憶ができたかどうかおよび記憶の強度を測定する。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群で、ラットが目標象限での活動時間は溶媒対照群よりは明らかに長い。第一回目標を通る時間から見ると、ｄｌ−ＰＨＰＢ群も溶媒対照群より明らかに短い。これはｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラットの空間学習記憶賞がいいを改善できることが示された。ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に脳血管性認知症の空間学習記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療ができることが示された。
【００１８】
本発明のｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に脳血管性認知症に対する予防・緩和および／または治療の機能を述べるために、本発明は生化学の方法でｄｌ−ＰＨＰＢが酸化損傷への相関指数と、コリン作動性神経システムへの影響を測定し、特にｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性・ＭＤＡ含有量とアセチルコリンのシンターゼ（ＣｈＡＴ）活性への影響を測定した。
【００１９】
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つで、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。ラットが慢性脳虚血の一ヵ月後、皮質のＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量が溶媒対照群より顕著に低いことは、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラット脳組織代償性が異常に増加した酸化防止酵素の活性を修正すると、脂質過酸化産物を低減し、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復が示された。
【００２０】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。ラットが永久に頚部両側の総動脈を結紮した一ヵ月後、海馬ＣｈＡＴ活性が顕著に下降した。投薬２１日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢが低循環ラット海馬のＣｈＡＴ活性を顕著に向上し、コリン作動性神経機能を改善できる。
【００２１】
脳低循環で起こった行動変化と共に、脳グリア細胞が活性化し、白質と灰白質も変化するので、本発明の機能をさらに述べるため、本発明は病理学および免疫組織化学の方法で、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織形態の変化への影響を観察した。ＨＥとＫｌｕｅｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色（後者はニューロン髄鞘の病理学的変化を反映する）によって、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、アストロサイト活性化の兆候）と脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ、認知機能とニューロンの生存と関わり、虚血に敏感である）を指標とする。
【００２２】
ＨＥ染色は異なる色で細胞質と細胞核を表示するので、細胞の姿をはっきり見える。本研究の溶媒対照群が皮質ニューロンが収縮、深い色素と細胞核が明らかでない現象を見え、海馬のＣＡ１、ＣＡ３エリアも類似な変化が出た。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環で起こった皮質・海馬ニューロン損傷に保護や治療作用を持っていることが表明した。
【００２３】
Ｋ−Ｂ染色はニューロン髄鞘が完備であるかどうかを反映でき、さらに神経繊維の形態学の変化を反映できる。本実験では、溶媒対照群ラット脳梁と視神経管が明らかな空胞変性および神経繊維障害が出たことが発見した。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は脳梁の病理変化に対する改善が顕著で、空胞変性が減少し、神経繊維の配置も少し回復していた。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は視神経管の病理変化へも改善がある。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環で起こった脳梁と視神経管の損傷に明らかな保護作用を持っていることが表明した。
【００２４】
本発明ではｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織ＧＦＡＰ陽性アストロサイトへの影響を研究した。脳低循環で起こった組織学異常は空間学習記憶損傷の基礎になるかもしれない。その内、白質がもっとも早く損傷され、それと共に反応性アストロサイトの増加とミクログリアの活性化が出る。グリア酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫組織化学染色は活性化したアストロサイトにマック付けに使用する。本発明は皮質・海馬・脳梁と視神経管四箇所を選び観察対象にした。皮質にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術よりさらに勢いがあり、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群は投与２１日後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は明らかに溶媒対照群より少ない。海馬にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より明らかに多い各投与群の当該指標値も溶媒対照群よりも明らかに低い。脳梁にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より顕著な差がないが、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群の当該指標値は溶媒対照群より低い。視神経管にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より明らかに多い。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与２１日後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は溶媒対照群より明らかに少ない。上記のことでは、特に海馬、視神経管と皮質で、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラット脳組織損傷と、活性化したアストロサイト量を明らかに減少させることができる。
【００２５】
本発明はさらにｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織ＢＤＮＦ分布面積と含有量への影響を研究した。脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）はニューロンの生存と発育を維持し、正常な動物の脳組織に存在する。虚血の早期で高く表示できるが、虚血２４時間以降は通常下降して表示する。ＢＤＮＦ免疫組織化学染色密度から見れば、溶媒対照群と偽手術と比べると、皮質でも海馬でも、ＢＤＮＦとも顕著に減少し、投与群と溶媒対照群と比べると、皮質ではｄｌ−ＰＨＰＢがＢＤＮＦの表示を増加できる。海馬のＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３エリアで、ｄｌ−ＰＨＰＢがＢＤＮＦの表示を明らかに増加できる。染色密度とＢＤＮＦの含有量と正比例する。以上のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳虚血脳組織のＢＤＮＦの含有量を増加できる。
【００２６】
本発明はβ−アミロイドペプチド認知症モデルの研究を通し、ｄｌ−ＰＨＰＢがβ−アミロイドペプチド２５−３５）で起こったラット記憶と空間識失調障害を明らかに改善できる。
【００２７】
ＡＤは高齢者の認知機能プログレッシブ減退の一番重要な原因で、その主要な病理変化はβ−アミロイドペプチド（β−ａｍｙｌｏｉｄ，Ａβ）沈着を核心とするシミと神経原線維変化を形成する。Ａβは３９〜４３のアミノ酸で成り立ち、β前駆体蛋白質の分解産物である。Ａβ沈着の範囲は神経損傷や認知機能損傷と密接に関連している。Ａβ（２５−３５）はＡβの毒性断片で、Ａβ（１−４０）やＡβ（１−４２）と類似しているが、より強く速い毒性を持っている。過去の言及によっては、一回性脳室にＡβ（２５−３５）を注射（ｉ．ｃ．ｖ．）すると、ラットの学習と記憶の損傷を起こし、ＡＤ患者のような症状が出る。脳室にＡβ（２５−３５）の注射はＡＤを模擬できるので、本実験はラットｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）をモデルにする。
【００２８】
本発明はＭｏｒｒｉｓ水迷路でｄｌ−ＰＨＰＢが動物の最近記憶と空間位置記憶の能力への影響を測定した。結果として、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラットの学習記憶の改善に効果がある。ナビゲーションテストで、ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存的にＡβ（２５−３５）誘導した認知症ラットの潜伏期間を短縮できることは、ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的に認知症ラットの学習記憶能力を改善できることを証明できる。四日間の訓練で、各群のラットの水泳スピードに差がないことはｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）が動物の体力に影響がないということである。水迷路実験は動物の学習記憶能力を確かに反映できることは、ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に初老期認知症の最近記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療の効果があることを証明した。
【００２９】
プラットフォーム探査テストで、ｄｌ−ＰＨＰＢ群がターゲット象限での活動タイミングの百分比は溶媒対照群より明らかに長い。一回目プラットフォームを通過する時間について、ｄｌ−ＰＨＰＢ群も短縮の勢いが見える。ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的に認知症ラットの空間位置学習記憶を増加可能であることは、ｄｌ−ＰＨＰＢはアルツハイマー病、特に初老期認知症の空間位置学習記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療の効果があることを証明した。
【００３０】
本発明のｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に初老期認知症に対する予防・緩和および／または治療の機能を述べるために、生物化学方法で酸化ストレス損傷およびコリン作動性神経機能障害の影響をそれぞれ測定し、特にｄｌ−ＰＨＰＢが認知症ラット脳組織ＳＯＤ活性・ＭＤＡ含有量とＣｈＡＴ活性に対する影響を測定した。
【００３１】
本発明では、ｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）が１４日後、ＳＯＤの活性代償性が向上し、経口でｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後は、皮質内ＳＯＤ活性がそれぞれ顕著に下降したことは、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に皮質内ＳＯＤ活性を下降できることを証明した。
【００３２】
皮質で、溶媒対照群のＭＤＡ含有量が顕著に向上した。連続で経口してｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後、皮質内ＭＤＡ含有量が下降し、溶媒対照群と比べ顕著な差が出、ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的にＡβ（２５−３５）で起こったラット皮質内ＭＤＡ含有量の増加を下げられる。
【００３３】
ラットｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）後、皮質内ＣｈＡＴ活性が顕著な変化がなかったが、経口でｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後で、溶媒対照群と比べると、３９ｍｇ／ｋｇがＣｈＡＴ活性を顕著に上げられる（Ｐ＜０．０５）、１２９ｍｇ／ｋｇも当該酵素の活性を上げる傾向が強い。これがＡβ（２５−３５）は皮質内ＣｈＡＴ活性の下降をさせなかったが、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラットのＣｈＡＴ活性を増加する可能性があることを証明した。
【００３４】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存的に初老期認知症患者の皮質のＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量を下げられることは、当該薬物は初老期認知症患者の皮質代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直し、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる。さらに、ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症患者の皮質内ＣｈＡＴ活性を向上し、コリン作動性神経機能を改善することができる可能性も高い。
【００３５】
本発明は加速老化マウスのモデルに対する研究によっては、ｄｌ−ＰＨＰＢは加速老化マウスの学習記憶障害への改善効果を発見した。加速老化マウス（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ，ＳＡＭ）は２つの亜系、すなわちＰ系とＲ系に分けられる。前者は加速老化マウス（ＳＡＭ／ｐｒｏｎｅ，ＳＡＭＰ）といわれ、脱毛や肌荒れと行動障害や生存期間短縮などの老衰現象に現れ、遺伝の傾向も出てくる。後者は加速老化抵抗マウス、正常な老衰過程にいる。ＳＡＭＰはすべて１２の亜系に分けられ、その内ＳＡＭＰ８は学習記憶機能が年齢に従い衰退になり、中枢神経システム、例えば皮質や海馬などの病理的な変化が主要な状態として表現される。文献の報道によると、ＳＡＭＰ８は加齢中に脳内に大量のＡβが沈着し、学習記憶機能と関連する脳内神経伝達物質も相応に変化し、例えば皮質や海馬のアセチルコリンレベルが下降、オピオイドペプチド、γ−アミノ酪酸レベルが向上、５−ＨＴが先に向上しそれで下降するなど。脳内脂質過酸化物の含有量も増加し、酸化−酸化防止システムが障害になって、酸化ストレス損傷が出る。それと共に顕著なミトコンドリア機能障害も出る。つまり、ＳＡＭＰ８は自然な老衰過程中緩慢に出てくる認知症を模擬できるので、老衰と学習記憶機能および学習記憶機能障害発生原因を研究するためのより動物モデルである。
【００３６】
本発明はステップダウンテストでＳＡＭＰ８の受動回避反応能力を、水迷路で最近記憶と空間学習記憶能力を測定する。その結果から、ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８の学習記憶障害への改善効果と、アルツハイマー病への治療と知力衰退への延長効果を発見した。
【００３７】
本発明では、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群ＳＡＭＰ８が受けた電気ショック回数は対照群より明らかに少ない、第一回でステップから飛び下りる潜伏期間は対照群より明らかに長い。尚且つ用量依存関係もある。これはｄｌ−ＰＨＰＢの長期間投与がＳＡＭＰ８マウスの受動回避反応能力を向上でき、哺乳動物の学習能力と記憶保持能力を改善できることを証明した。ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に混合型認知症患者の学習能力と記憶保持能力を改善できることを証明した。
【００３８】
水迷路実験は動物の最近記憶と空間学習記憶能力の測定に常用する。動物がブラインドサイドに入る回数とステップを見つける潜伏期間でその学習記憶能力を反映できる。本発明では、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群がブラインドサイドに入る回数は対照群より明らかに少ない、潜伏期間も対照群より明らかに短い。ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８の最近記憶と空間学習記憶障害を改善でき、なお一定の用量依存性もある。ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に混合型認知症患者の最近記憶と空間学習記憶障害の症状を予防、緩和および／または治療することができることを証明した。
【００３９】
本発明のｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に混合型認知症病を予防、緩和および／または治療する機能を述べるために、生物化学方法でその脳組織と学習記憶および老衰と関連する生物化学指標を測定し、特にｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性・ＭＤＡ含有量・ＣｈＡＴ活性とＡＣｈＥ活性に対する影響を測定した。
【００４０】
本発明では、ＳＡＭＰ８マウスは連続して経口ｄｌ−ＰＨＰＢ投与３５日後は、海馬ＳＯＤ活性を明らかに下降し、対照群より顕著な差が出た。投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群の海馬のＭＤＡ含有量は対照群と比べ、下降する勢いが明らかである。ｄｌ−ＰＨＰＢが海馬のＭＤＡ含有量を下降する可能性があることを証明した。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の海馬組織代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直すことができ、脂質過酸化産物を下げる可能性があり、さらに脳組織正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させ、酸化ストレス損傷を軽減させることが示された。
【００４１】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、ＡＣｈＥはアセチルコリンの加水分解酵素として、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。
【００４２】
連続で投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群ＳＡＭＰ８マウス海馬のＣｈＡＴ活性が増加し、対照群と比べ、顕著な統計学差異があり、なお一定の用量依存性がある。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群海馬のＡＣｈＥ活性は対照群より勢いがないことが明らかである。これはｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８マウス海馬ＡＣｈＥ活性を下降させる可能性があることが示された。
【００４３】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に混合型認知症患者の海馬組織のＣｈＡＴ活性を向上でき、その海馬ＡＣｈＥ活性にもある程度の下降ができる。ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の海馬アセチルコリン含有量の増加によって、コリン作動性神経機能を改善できる可能性があることが示された。
【００４４】
つまり、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血管性認知症に対して予防、緩和および／または治療効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢが脳血管性認知症患者の最近記憶と空間位置記憶障害を顕著に改善できる。ｄｌ−ＰＨＰＢが脳血管性認知症患者の脳組織代償性増加のＳＯＤ活性と脂質過酸化産物ＭＤＡレベルを顕著に下降できることは、酸化ストレスが神経細胞に対して損傷を顕著に抑えることを証明した。ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血管認知症患者の脳組織のＣｈＡＴ活性を向上でき、脳内のアセチルコリンレベルを向上させる可能性が高いので、学習記憶の改善に効く。白質がまばらや空泡形成やグリア細胞増加やニューロン形態異常も含み、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血管性認知症患者の脳組織の病理的な変化を改善でき、さらに虚血で起こった脳組織脳源性神経成長因子の現象を改善する。
【００４５】
ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症に対しては予防、緩和および／または治療効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症患者の学習と記憶障害に顕著な改善効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症患者の代償性増加の脳組織ＳＯＤ活性とＭＤＡレベル増加を下降でき、酸化損傷を軽減でき、ニューロンを保護する。ｄｌ−ＰＨＰＢはコリン作動性神経伝達物質アセチルコリン合成酵素ＣｈＡＴの活性を上げられ、コリン作動性神経機能の改善によって、初老期認知症患者の学習記憶障害を改善する可能性は高い。
【００４６】
ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症に対しては予防、緩和および／または治療効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の最近記憶および空間位置記憶障害を顕著に改善できる。ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の海馬Ｓ０Ｄ活性を下降でき、さらに海馬ＭＤＡレベルを下降することは、それは酸化損傷を軽減でき、ニューロンを保護できることを証明した。ｄｌ−ＰＨＰＢは海馬コリン作動性神経伝達物質アセチルコリン合成酵素ＣｈＡＴの活性を上げられ、さらにその加水分解酵素ＡＣｈＥの活性を下げる。コリン作動性神経機能の改善によって、混合型認知症患者の学習記憶障害を改善する可能性は高いことが示された。
【００４７】
つまり、ｄｌ−ＰＨＰＢはアルツハイマー病の治療に効果を持って、加速老衰に伴う認知衰退を軽減できる。その作動原理は脳組織の酸化ストレス損傷の軽減と、コリン作動性神経機能の向上と、脳組織脳源性神経成長因子含有量の向上などを含む。
【００４８】
もう１つ、本発明は、アルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用い、予防や治療に実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、および薬学で認めるオプションのキャリアおよび／またはアクセサリを含む医薬組成物に関する。本発明では、使用ルートによって、記載の医薬組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放性または徐放性製剤から選ばれる。
【００４９】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は、既知の方法で調製しても良い。下記のなんかのルートで受験者に使用する。非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これに限定されない。
【００５０】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは既知の調製方法を通して作成する。
【００５１】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物のオプションはいずれの通常の方法で一種や多種の薬学で認めるキャリアおよび／または賦形剤で調製する。したがって、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムとそれの溶媒は特別な調合をしても良い、例えば吸入や吹き込み（口や鼻を介して）、または経口、舌下腺、非経口または直腸投与。
【００５２】
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放性または徐放性製剤などの形を使ってもよい。これらの製剤は治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、純化形式は好ましい、および適当のキャリアを含み、患者に適用する投与形式を提供する。製剤は投与方式に適用すべきである。
【００５３】
本発明では、記載の純化形式２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムとは、ほとんど純化の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを指す。特に純度は８０％より大きい、好ましいのは８５％より大きい、さらに好ましいのは９０％より大きい、特に好ましいのは９８％より大きな２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムである。具体的にいうと、記載の純化形式は２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの純度範囲は例えば９５％−９９％である。
【００５４】
非経口投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は注射で例えばボーラスで非経口投与のため調合できる。注射用の製剤は単位製剤でオプションの防腐剤入れのアンプルや複数回投与用容器に保存してもよい。非経口製剤はガラスやプラスチックで作ったアンプルや、使い捨ての注射器やマルチ瓶に保存してもよい。製剤は、例えば油性や水性のキャリアにおいている懸濁液、溶液、エマルジョンの形式で、さらに例えば、懸濁剤や安定剤および／または分散剤のアクセサリを含んでもよい。
【００５５】
例えば、非経口製剤は無毒非経口で好ましいシンナーや溶剤の中の無菌注射溶液または懸濁液であってもよい（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）。好ましいキャリアと使える溶剤は水、リンガーおよび等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、通常は無菌非発揮油を溶剤や懸濁培地としている。そのため、合成したグリセロールエステルおよびジアシルグリセロールを含み、軽度の非揮発性油をいずれも使ってもよい。また、非経口製剤の中にオレイン酸などの脂肪酸を使ってもよい。
【００５６】
その他、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は粉末式に調合してもよい。使用前に適合なキャリアで、例えば滅菌水で再建する。例えば、非経口投与に適合する２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は、体積毎に０．１％〜９０％重量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを含む無菌等張塩溶液を含んでもよい。例えば、溶液は約５％〜約２０％含有、より好ましいのは約５％〜約１７％、さらに好ましいのは約８％〜約１４％、特に好ましいのは約１０％の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム。注射部の痛みを軽減するため、溶液や粉末製剤は可溶化剤と局所麻酔薬、例えばリドカイン、を含んでもよい。その他の非経口化合物投与方法は本分野で既知され、尚且つ本発明範囲内である。
【００５７】
経口投与
経口投与に対し、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は錠剤やカプセルの形で、通常の方法で、薬学で認める賦形剤、例えば粘着剤や充填剤、潤滑剤、崩壊剤を使って調製する。
【００５８】
Ａ． 粘着剤
粘着剤はコーンスターチ、ジャガイモ澱粉、またはその他のでん粉、ゼラチン、天然および合成ゴム、例えばアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、ウェストレンゲ粉、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、第２２０８、２９０６、２９１０）、微結晶性セルロースおよびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。適合な微結晶性セルロースの形は、例えばＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３とＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０５で販売の材料（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｉｓｃｏｓｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｖｉｃｅｌ Ｓａｌｅｓ， Ｍａｒｃｕｓ Ｈｏｏｋ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに由来）。適合な粘着剤の例はＦＭＣ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎがＡＶＩＣＥＬ ＲＣ−５８１で販売している微結晶性セルロースとナトリウムカルボキシメチルセルロースの混合物である。
【００５９】
Ｂ． 充填剤
充填剤はタルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒または粉末）、ラクトース、微結晶性セルロース、粉末セルロース、グルカン結合剤（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、澱粉、アルファ化デンプンおよびその混合物を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
Ｃ． 潤滑剤
潤滑剤はステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽鉱物油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクのエステル、硬化植物油（たとえば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油、大豆油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、エチルラウリン酸エチル、寒天およびその混合物を含むが、これらに限定されない。その他の潤滑剤は、例えば、固体シリカ（ＡＥＲＯＳＩＬ ２００， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡのＷ．Ｒ． Ｇｒａｃｅ Ｃｏ．生産）、合成シリカ縮合エアロゾル（Ｄｅａｕｓｓａ Ｃｏ． ｏｆ Ｐｌａｎｏ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ販売）、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのＣａｂｏｔ Ｃｏ．から販売されている発熱シリカ製品）とそれらの混合物を含む。
【００６１】
Ｄ． 崩壊剤
崩壊剤は寒天−寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスポビドン、ｐｏｌａｃｒｉｌｉｎカリウム、ナトリウム澱粉グリコール酸、ジャガイモやタピオカでんぷん、他の澱粉、アルファ化デンプン、他の澱粉、粘土、他の藻類、他のセルロース、ガムおよびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
錠剤やカプセルは本分野の公知のいずれの方法でコーティングする。もし本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は粘着剤や充填剤を使うと、約５０％〜約９９％重量の化合物に調合する。一方、約０．５％〜約１５％重量の崩壊剤、特に約１％〜約５％重量の崩壊剤が、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムとあわせて使用できる。潤滑剤はいずれの材料でもよい、用量は通常２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの約１％重量未満にする。固体経口製剤調製の技術や薬学で認める添加物はＭａｒｓｈａｌｌ，Ｓｏｌｉｄ Ｏｒａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（ＢａｎｋｅｒとＲｈｏｄｅｓ，Ｅｄｓ．），７：３５９−４２７（１９７９）に載っている。その他の不典型の製剤は本分野で公知するものである。
【００６３】
経口の液体製剤は溶液やシロップまたは懸濁液の形を使う。または、液体製剤は固体製品の形にしてもよく、使用する前に水や適合なキャリアで再建する。これらの液体製剤は通常の方法で薬学で認める添加物、例えば懸濁液（ソルビトールシロップ、セルロースの誘導体または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）、非水性担体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）、および／または防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル対ヒドロキシ酸またはソルビン酸）で調製する。これらの製剤は適当の緩衝塩や調味料や着色剤や香味剤や甘味料を含んでもよい。経口の製剤は化合物の制御放出の実現するように調合してもよい。経口製剤は１０％〜９５％の化合物は好ましい。また、本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は、通常方法で舌下腺投与用のタブレットやトローチを調合してもよい。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物のその他の経口投与方法は本分野で公知でありるもので、さらに本発明の範囲内である。
【００６４】
制御放性投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの活性の延長と投与頻度減少のため、制御放性（徐放性）製剤を調合する。制御放性製剤は発効タイミングやその他の特徴への影響に使ってもよい、例えば血液化合物のレベル、副作用の発生に支障する。
【００６５】
制御放性製剤は最初から必要効果の一定量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを放出させ、徐々に連続で残りの２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの量を放出させることで、長時間で治療効果を維持する。体内で不変に近い化合物状態を保持するため、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムが一定のスピードで製剤から放出させ、体内から代謝および／または分泌した２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを代わる。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの制御放出は多種の誘導要素、例えば、ＰＨ変化や、温度変化、酵素、水またはその他の生理条件や分子で刺激される。
【００６６】
制御放出システムは、特定の臓器や腫瘍へインスリンや化学療法剤の転送と類似している方式で化合物の転送に使う、例えば注射ポンプを含む。このようなシステムを使うと、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは通常分解可能・生体適合の高分子インプラントとあわせて使用する。選択される位置にコントロールされた時間内で２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを放出する。高分子インプラントはポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニルおよびその共重合体と組合を含む。また、制御放出システムは治療目標の付近においってもよいので、全身用量の一部しか使わない。
【００６７】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは、本分野で公知でありた他の制御放出方法や投与装置を使ってもよい。例えば、ＨＰＭＣ、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透膜、浸透システム、多層コーティング、粒子、リポソーム、微小球など、または上記組合が、異なる比例で必要な放出スペクトルを提供する。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの他の制御放出投与方法は本分野で公知であり、なお本発明の範囲内である。
【００６８】
吸入投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは吸入で直接肺へ使用できる。吸入投与に対しては、いろいろ装置で便利に２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを肺に輸送できる。例えば、計量吸入器（”ＭＤＩ”）、使われる缶は低沸点推進剤が付き、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適合な気体で、直接肺に化合物を輸送できる。ＭＤＩ装置は数多くの仕入先からもらえる、例えば３Ｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ、Ｆｏｒｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＰｌｏｕｇｈとＶｅｃｔｕｒａ。
【００６９】
また、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）装置を使って肺へ化合物を使用してもよい。ＤＰＩ装置は通常一種の機構を使い、例えば、爆発の気体が容器内で雲の形の乾燥粉末を生じ、患者に吸入される。ＤＰＩ装置も本分野で公知であり、多くの仕入先から購買できる、例えばＦｉｓｏｎｓ、Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＱｄｏｓｅおよびＶｅｃｔｕｒａ。通用しているのは多用量ＤＰＩ（“ＭＤＤＰＩ”）システム、一個以上で治療用量を使っても許される。ＭＤＤＰＩ装置は例のＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ、ＩＶＡＸ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ、ＳｋｙｅＰｈａｒｍａおよびＶｅｃｔｕｒａのような会社から入手できる。例えば、吸入器と吹き込み器のゼラチンカプセルとカートリッジは、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムと当該システムに適用する粉末マトリックス、例えば乳糖やでんぷんを含有する粉末混合物に調製できる。
【００７０】
肺へ化合物を使用するもう１つのタイプの装置はＡｒａｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが提供したスプレー装置。スプレー装置システムはごく小さなノズルで液体化合物を噴霧化して、直接肺に吸入される。例えば、噴霧器装置で肺に化合物を使用する。噴霧器は超音波を使えば、液体化合物製剤からエアロゾルを生じ、吸入しやすい細かい顆粒にする。噴霧器の製品はＳｈｅｆｆｉｅｌｄ／Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｌｔｄ．、ＡｖｅｎｔｉｓとＢａｔｅｌｌｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより提供する装置を含む。
【００７１】
もう１つの実験で、電流体力学（“ＥＨＤ”）エアロゾル装置で肺に化合物を使用する。ＥＨＤエアロゾル装置は電気で液体化合物の溶液や懸濁液を噴霧する。ＥＨＤエアロゾル装置で肺に当該化合物を使用する時に、化合物製剤の電気化学性質は重要なデータとして最適化しなければならない。この最適化は本分野通常操作で行われる。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの他の肺に投与方法は本分野で公知であり、なお且つ本発明の範囲内である。
【００７２】
噴霧器や液体噴霧装置とＥＨＤエアロゾル装置に適用する液体２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム製剤は、通常２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムと薬学で認めるキャリアを含む。代表的な案で、薬学で認める液は、例えばアルコール、水、ポリエチレングリコールまたはパーフルオロカーボン。また別の物質をオプションして化合物溶液や懸濁液のエアロゾル性質を変更できる。例えば、この物質は液体で、たとえばアルコール、グリコール、ポリエチレングリコールまたは脂肪酸。エアロゾル装置に適用する液体化合物溶液や懸濁液を調製する他の方法は本分野で公知でありる。
【００７３】
貯蔵式投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは貯蔵式製剤に調製してもよい。このような長時間作用型製剤は注入（皮下または筋肉内）や筋肉注射で投与する。そのため、化合物は好適なポリマーまたは疎水性材料、例えば、好ましい油やイオン交換樹脂中のエマルジョン、または難溶性の誘導体としても難溶性の塩類と一斉に調製する。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの他の貯蔵式投与方法は本分野で公知であり、なお且つ本発明の範囲内である。
【００７４】
局所投与
局所投与に対しては、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムはキャリアと組み合って、実効線量を輸送する。必要な活性によって、実効線量は、例えば１．０μＭ〜１．０ｍＭ。本発明の一方では、局所投与の医薬組成物は皮膚にも使える。キャリアとしては、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、発泡、エアゾール、坐剤、パッドまたはスティックゲルを含むが、これらに限定されない。
【００７５】
局所製剤は眼科で認める賦形剤、例えばバッファ生理食塩水、鉱物油、植物油例えばコーン油やピーナッツ油、ワセリン、Ｍｉｇｌｙｏｌ １８２、アルコール溶液またはリポソームやリポソームのような製品の中に、実効線量の化合物を含んでもよい。これらの化合物はどれも防腐剤、酸化防止剤、抗生物質、免疫抑制剤とその他の悪い影響がない生物学や薬学で有効な製剤を含んでもよい。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムのその他の局所投与方法は本分野で公知であり、なお且つ本発明の範囲内である。
【００７６】
その他の投与システム
その他の投与システムは本分野で公知であり、本発明の化合物の使用に使えるものである。尚且つ、その他の投与システムと連合や／または変更で、本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの投与を最適化できる。
【００７７】
また、本発明は必要がある患者に治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムやそれを含む医薬組成物を含み、アルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療の方法に関する。投与ルートは非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これに限定されない。
【００７８】
本発明で、治療実効線量２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは０．５−２００ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれも良い。好ましいのは１−１５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましいのは２−１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましいのは３−５０ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは４−３５ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは５−２０ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれも良い。
【００７９】
治療実効線量の確認原則
本発明で記載の「治療実効線量」とは、受験者の病気や病症の性質や重大度によって、特定の受験者に使用する時に、必要の治療効果を持っている線量、例えば、目標病気や病症を治療、予防、抑制または少なくとも一部防止や一部予防への必要量。
【００８０】
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの毒性と治療効果は細胞培養物や動物実験中に、ＬＤ５０（５０％致死用量群）とＥＤ５０（５０％有効用量群）測定のスタンダード薬学方法で確定できる。毒性と治療効果との用量比例は治療指数として、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で表示される。
【００８１】
細胞培養実験と動物研究中にできたデータは、人間やその他の哺乳動物向け調製する時の用量範囲として使える。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの用量は、ＥＤ５０の循環血漿やその他の体液濃度の範囲内を含み、ごく少ない毒性や毒性なしのは好ましい。
【００８２】
当該用量は使用する製剤や投与ルーとによって、この範囲内で変化する可能性がある。本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムに対しては、治療実効線量は最初から動物実験で推定できる。動物モデルで用量を設計して、ＩＣ５０も含む測定した循環血漿濃度範囲に入る。これらの情報で人間やその他の哺乳動物に有効用量を精確に確定できる。血漿の中の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムのレベルは高性能液相分析で測定する。
【００８３】
薬学で認めるキャリアと組み合って生じた単一剤形の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの用量は、治療宿主と投与パターンによって異なる。当業者は、各製剤の個別用量の中に含んだ２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの単位含有量本体は実効線量になる必要がないことは事前に理解するであろう。個別用量の数個使用で需要な実効線量にいたるからだ。用量の選択は使用する製剤と、治療する病気と当業者の判断によって決める。
【００８４】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムで病気や病症を治療する用量の案はを多種の要素を考えてから選択する。それは患者のタイプ、年齢、体重、性別、飲食と医学状況、投与ルート、薬理学の考慮要素、例えば活性、有効性、使用する化合物の具体の薬物代謝動力学と毒理学分布を含んで考え、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム投与システムを使うかどうかを決める。そのため、実際に使用する用量案は受験者の間でも大違いがある。
【００８５】
専門用語と略称
ｄｌ−ＰＨＰＢ、ＰＨＰＢは２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを指す。
【００８６】
ＳＯＤはスーパーオキシドジスムターゼを指す。
【００８７】
ＭＤＡはマロンアルデヒドを指す。
【００８８】
ＣｈＡＴはコリンアセチルトランスフェラーゼを指す。
【００８９】
ＡｃｈＥはアセチルコリンエステラーゼを指す。
【００９０】
ＡＴＰａｓｅはアデノシントリホスファターゼを指す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストで逃避潜時期間に対する影響。すべてのデータは平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１７−２０）。＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術（ｓｈａｍ）と比較する；＊Ｐ＜０．０５は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２】永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストで典型なサーチ策略。Ａ：エッジ式；Ｂ：ランダム式；Ｃ：トレンドスタイル式；Ｄ：リニア式。
【図３】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路プラットフォーム探査テストでターゲット象限活動タイミングと一回目プラットフォーム通る時間に対する影響。図Ａはターゲット象限活動タイミングの変化を表示する、図Ｂは一回目プラットフォーム通る時間の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１７−２０）。＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図４】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳組織生物化学に対する影響。図Ａは皮質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性の変化を表示する、図Ｂは皮質マロンアルデヒド（ＭＤＡ）含有量の変化を表示する。図Ｃは海馬コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝５−８）。
【００９２】
＃＃＃Ｐ＜０．００１は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図５】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳皮質ニューロン形態に対する影響（ＨＥ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図６】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳海馬ＣＡ１エリアニューロン形態に対する影響（ＨＥ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図７】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳海馬ＣＡ３エリアニューロン形態に対する影響（ＨＥ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図８】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳梁形態に対する影響（Ｋ−Ｂ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図９】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの視神経管形態に対する影響（Ｋ−Ｂ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図１０】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳海馬ＧＦＡＰ陽性アストロサイト数量に対する影響。（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群；Ｃ：ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群；Ｄ：ＰＨＰＢ１３ｍｇ／ｋｇ群；Ｅ： ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群；Ｆ：ＰＨＰＢ１２９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１１】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの視神経管ＧＦＡＰ陽性アストロサイト数量に対する影響。（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群；Ｃ：ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群；Ｄ：ＰＨＰＢ１３ｍｇ／ｋｇ群；Ｅ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群；Ｆ： ＰＨＰＢ１２９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１２】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳組織ＧＦＡＰ陽性アストロサイト数量に対する影響。図Ａは皮質を表示する、図Ｂは海馬を表示する、図Ｃは脳梁を表示する、図Ｄは視神経管を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝４）。＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図１３】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット皮質の脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。２００倍。
【図１４】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット海馬のＣＡ１エリアの脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群。Ｃ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１５】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット海馬のＣＡ２エリアの脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群。Ｃ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１６】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット海馬のＣＡ３エリアの脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群。Ｃ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１７】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット脳組織脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）含有量に対する影響。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝４）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図１８】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＡβ（２５−３５） 誘導した認知症ラットが水迷路ナビゲーションテストでの潜伏期間に対する影響。すべてのデータは平均±標準誤差で表示する（ｎ＝７−９）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図１９】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＡβ（２５−３５） 誘導した認知症ラットが水迷路プラットフォーム探査テストで空間位置記憶障害対する影響。図Ａはターゲット象限活動タイミング百分比の変化を表示する、図Ｂは一回目プラットフォーム通る時間の変化を表示する。すべてのデータは平均±標準誤差で表示する（ｎ＝７−９）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）と比較する；＊Ｐ＜０．０５は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２０】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＡβ（２５−３５） 誘導した認知症ラットの脳組織生物化学に対する影響。図Ａは皮質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性の変化を表示する、図Ｂは皮質マロンアルデヒド（ＭＤＡ）含有量の変化を表示する。図Ｃは皮質コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝７−９）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２１】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスがステップダウンテストで受けた電気ショック回数と電気ショック潜伏期間に対する影響。図Ａは電気ショック回数の変化を表示する、図Ｂは電気ショック潜伏期間の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（Ｄｕｎｎｅｔｔ検査）。
【図２２】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスが水迷路実験でブラインドサイドに入る回数とステップを見つける潜伏期間に対する影響。図Ａはブラインドサイドに入るミスの回数の変化を表示する。図Ｂは潜伏期間の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（Ｄｕｎｎｅｔｔ検査）。
【図２３】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスの脳組織スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性とマロンアルデヒド（ＭＤＡ）含有量に対する影響。図Ａは海馬ＳＯＤ活性の変化を表示する、図Ｂは海馬ＭＤＡ含有量の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２４】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスの脳組織コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）と、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）および皮質ミトコンドリア・アデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性に対する影響。図Ａは海馬ＣｈＡＴ活性の変化を表示する、図Ｂは海馬ＡｃｈＥ 活性の変化を表示する、図Ｃは皮質ミトコンドリアＡＴＰａｓｅ活性の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２５】実施例１の実験プロセス。
【図２６】実施例２の実験プロセス。
【図２７】実施例３の実験プロセス。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
実施例
下記の実施例は具体的本発明の応用を示すが、本実施例は本発明の使用範囲には限らない。
【００９４】
実施例１
慢性脳虚血モデル研究：ｄｌ−ＰＨＰＢが供血不足のラットの最近記憶と空間識失調を改善できる
材料と方法
１、製剤と薬品
ｄｌ−ＰＨＰＢは本所合成室より提供し、化学純度は９８．５％（ＨＰＬＣ法で測定）、蒸留水で調製した。ピラセタム錠、天津金世製薬有限公司生産。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）キット、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）キット、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）キット、クマシーブリリアントブルータンパク質測定キットとも南京建成生物工程研究所より購入した。ニュートラルレッド、固体ブルーはＳｉｇｍａ会社から購入。炭酸リチウムは北京化学製剤会社生産。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は北京中山生物技術有限公司から購入。グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）ポリクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ会社から購入。脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）ポリクローナル抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ会社から購入。二次抗体、ビオチン化抗マウス ／ウサギＩｇＧ；三次抗体、ホースラディッシュ酵素標記のストレプトアビジンアビジン、ＤＡＢカラーキット；抗体希釈液とも北京中杉金橋生物技術有限公司から購入。
【００９５】
２、器具
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路オートモニターは中国医学化学院薬物研究所より開発したものである。ＭＱＸ ２００タイプのマイクロプレートリーダーはアメリカＢｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの製品。ＩＲ２１３５タイプのパラフィンマイクロトームはドイツＬｅｉｃａ会社の製品、６２０−Ｅタイプの恒温冷凍マイクロトームはイギリスＳｈａｎｄｏｎ会社の製品、Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ ８０ｉ自動顕微撮影システムは日本Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎの製品である。
【００９６】
３、２−ＶＯモデル設立
永久にラットの頚部両側の総動脈の結紮で、連続の脳低循環モデルを作る。１０％の抱水クロラールで腹部注射（ｉ．ｐ．）でラットを麻酔にして、仰臥位で手術台に固定し、体温を３６．５±０．５℃に維持させる。ヨードフォアで手術部位を消毒して、正中頸部に沿って皮膚および皮下組織を縦方向で切開し、左右の頸動脈を引き離し、５−０の手術シルクで結紮する。切り口を縫合し、動物をかごに入れる。手術後三日間は連続で毎日ｉ．ｐ．ペニシリン２０万単位／匹を注入する。
【００９７】
４、グループ分けと実験設計
ラットをランダムに６群に分け、群ごとに２０匹にする。（１）偽手術群：頚部両側の総動脈の結紮をしない以外に、ほかの操作は低循環群と同じ；（２）溶媒対照群：経口で蒸留水；（３）ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群；（４）ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇ群；（５）ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群；（６）ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群。手術後十日間で薬物や溶剤を投与する。毎日一回、２１日間続く。２５−３０日目に、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路法でラットの空間学習記憶能力を測定する。行動的な実験は全部で投与後４０分で行われる。動物は３０日目で殺して、脳組織生物化学測定および病理学検査を行う。群の間で実験の結果を比較する。（実験のプロセスは図２５を参考）
５、水迷路実験
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路は金属製の円筒形タンク（６０ｃｍ高さ、径１２０ｃｍ）とオートショー、モニター、記録装置および安全島（径１０ｃｍのプラットフォーム）からなる。事前にタンクの壁とプラットフォームを黒いテープで真っ黒にして、水の色が黒く見えるようにし、水面はプラットフォームより１５ｍｍ高くして、これで動物が聴覚、視覚、嗅覚でプラットフォームに登ることができなくなるので、動物が空間位置に対する記憶能力を測定できる。水温は２５士１℃に保持して、タンクを４個の象限（東北、東南、西北、西南）に分ける。プラットフォームは西北象限のセンターに置く。毎匹ラットの水泳活動をモニターで観測し、記録できるので、コンピューターとリンクして分析する。ナビゲーションテストは五日間連続でやる。それぞれのラットは毎日東南と西南象限のセンターから、頭を壁に向かって水に入れて、２回のプラットフォーム探しの訓練をやらせる。２回の訓練の間に１０分間を間隔にする。プラットフォームを見つけるタイミング（潜伏期間）、サーチ策略と水泳スピードこの三項目を記録し、毎日の２次実験結果を平均にする（サーチ策略除外）。もしラットは６０秒以内にプラットフォームを見つけなかったら、潜伏期間を６０秒とする。６０秒以内にプラットフォームを見つけるかどうかに関わらず、ラットをプラットフォームに１０秒に逗留させる。一回目の実験が始まる前にラットをプラットフォームにおいて、順応させる。訓練の進行につれて、各群ラットが安全島を見つける潜伏期期間が短縮していく。実験の結果は水泳のスピードでラットが実験中の体力の変化を反映できる。その他の２項目指標はラットが空間位置に対する学習記憶能力を反映する。最後の訓練が終わってから、空間探査実験を実施する。プラットフォームをはずして、ラットにプラットフォーム探しに６０秒水泳させて、各象限でかかる時間および第一回目標を通る時間を記録する。もしラットが元のプラットフォームある象限に止まる時間が長くて、第一回目標を通る時間が短ければ、ラットがすでにこの空間目標に記憶が残っていることを証明した。
【００９８】
サーチ策略を４類に分け：（１）エッジ式、ラットがずっとタンクのエッジを沿い、探す動機がない；（２）ランダム式、ラットが安全島を探すときに明確な方向がない；（３）トレンドスタイル式、ラットがすでに安全島の大よその位置がわかり、安全島を見つける前にカーブが４回未満；（４）リニア式、ラットがすでに安全島の位置を覚えて、直接安全島に向く。
【００９９】
６、ＳＯＤ、ＭＤＡとＣｈＡＴの検査測定
行動学実験が終わってから、ラットの頭部を切断し、氷浴中に皮質および海馬を分離して、濾紙で乾燥させ、重量を測る。重量体積比１：９の通り、４℃予冷の生理食塩水をいれ、内接式パルプリファイナーで１０％の組織ホモジネートを調製し、低温低速遠心１０分間して、上清を取り、沈殿物を廃棄する。
【０１００】
クマシーブリリアントブルータンパク質およびＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴの測定は全部で南京建成生物工程研究所のキット説明書で行う。
【０１０１】
７、病理学と免疫組織化学検査測定
毎群はランダムで４匹の動物を選び、行動学実験後１０％抱水クロラールで麻酔して、皮膚、胸腔を切って、心臓を充分露出させ、心膜を開き、７番の注入針で動脈方向に心尖に差し込んで、生理食塩水を注入すると同時に、右心耳から右心房を切って、１５−２０分（２００−３００ｍｌ）を注入し、流出液が清くなるまで、それで予冷の４％パラホルムアルデヒド−３％ショ糖に換え、定着剤を１５−２０分（１５０−２００ｍｌ）を徐々に速度をゆるめながら、動物が全身硬直し肝臓が白くなるまで引き続き注入する。それから頭を取り、ナイフで前部の終脳と後部の小脳を切って、４％パラホルムアルデヒド−３％ショ糖を入れてから、定着剤で４８時間続けて固定する。標本が完全に沈下した後、新鮮な定着剤に変更して、４℃で冷蔵する。片側の脳半球はパラフィン切片、固定、埋め込みを行い、海馬の位置に冠状切片（厚さ５μｍ）をして、ＨＥとＫＢ染色に使う。もう片側の脳半球は恒温冷凍マイクロトームで冷凍切片をして、切片位置と方式は前と同じ、ＯＣＴ埋め込み、厚さは４０μｍ、動物毎匹に４枚を切って、ＧＦＡＰとＢＤＮＦ免疫組織化学染色に使う。
【０１０２】
８、統計分析
すべての結果は平均±標準誤差で表示する。水迷路ナビゲーションテストで各指標の差異比較は繰り返し測定の双方向分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。水迷路空間探査実験、生物化学測定各項指標および免疫組織化学の半定量分析は全部単方向分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。群間の差異はｐｏｓｔ ｈｏｃ ＬＳＤ（水迷路ナビゲーションテストのサーチ策略の比較はＲｉｄｉｔ分析を採用する）を採用する。Ｐ＜０．０５の場合は顕著な差異であると判断する。
【０１０３】
結果
１、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳低循環ラットの学習記憶に対する改善効果
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路実験は動物の空間学習と最近記憶能力を測定する経典実験である。本研究では、ラットが慢性脳虚血後の１ヶ月当たりに行う。実験は２つに分け、１つはナビゲーションテスト、もう１つは空間探査実験を行う。ナビゲーションテストで、ラットがプラットフォームを見つける時間（潜伏期間）と、サーチ策略と水泳スピードを含む３項の指標を観察した。潜伏期間から見ると、訓練回数の増加につれて、各群ラットの潜伏期間とも徐々に短縮していくにつれ、各群のラットはプラットフォームの位置に対する記憶が精確になることが示された。翌日から、溶媒対照群ラットの潜伏期間は偽手術群より顕著に長くなり、その間の差も拡大していく（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）ことは、慢性脳低循環はラットの学習記憶能力に顕著な損害を掛けた。しかし、それはモデルの成功とも証明した。前の三日間で、各投与群の潜伏期間は溶媒対照群と比べ、顕著な短縮がないが、四日目から、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群はピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間は溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より顕著に短くなる。五日目で、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群と１２９ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間も溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より短いのは、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇ、ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇとも慢性脳低循環ラットの学習記憶能力の減退に顕著な改善効果を持っているが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇが顕著な治療効果を持っていない（図１）ことを証明した。そのため、潜伏期間から見ると、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇ、ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇとも脳低循環ラットの空間学習記憶障害を顕著に改善できる。
【０１０４】
ラットがプラットフォーム探す策略から分析すると、訓練回数の増加につれて、動物はエッジ式やランダム式策略の回数も減少していき、トレンドスタイル式とリニア式策略の回数が増加していく。ｌｅｖｅｌ ｄａｔａ ｏｒｄｅｒｉｎｇで分析すると、最後の日で測定するときに、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは溶媒対照群と比べ、顕著な差異（Ｐ＜０．０１）が出てくる、すなわち前者はリニア式やトレンドスタイル式策略の回数は後者より多い、その他の各薬や各用量はリニア式やトレンドスタイル式策略の回数は溶媒対照群より多くが、統計学上無意味である。ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは低循環ラットが空間位置の記憶能力を向上できることを証明した（図１、表１と２）。
【０１０５】
それと同時に、ナビゲーションテストで、実験がラットの体力に影響がないかを判断するため、ラットの水泳スピードを測定した。結果によって、実験の過程中に、各群ラットの水泳スピードがほとんど変化がないことと、群の間に差異もない（データ未提出）ことを発見した。これは、一方で、本モデルのやり方はラットの活動能力に影響がなく、もう一方で、水迷路実験はラットの活動能力にも影響がないということを証明した。そのため、この実験方法は体力が妨害にならないため、よりよいラットの学習記憶能力を測定できる。
【０１０６】
ナビゲーションテストが終わってから、プラットフォーム探査実験を行い、安全島（プラットフォーム）をはずして、ラットが目標象限での活動時間と第一回目標を通る時間を記録することで、ラットが安全島に対する空間記憶ができたかどうかおよび記憶の強度を測定する。結果によっては、偽手術群のラットは目標象限での活動時間は溶媒対照群（Ｐ＜０．０１）より長い、ｄｌ−ＰＨＰＢ１２９ｍｇ／ｋｇ以外に、各投与群のラットは目標象限での活動時間も溶媒対照群より長い、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群のラット（Ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。一回目に目標を通る時間から見ると、偽手術群は溶媒対照群（Ｐ＜０．０１）より短い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群も溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より短い。これはｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラットの空間学習記憶障害を改善できる、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは一番顕著である（図３Ｂ）。
【０１０７】
結論として、水迷路ナビゲーションテストの２つの主要指標（潜伏期間とサーチ策略）およびプラットフォーム探査実験の目標象限の時間から見れば、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３、３９、１２９ｍｇ／ｋｇこの３つの用量は慢性脳低循環ラットの空間学習と最近記憶障害を改善できる。効果強度はｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは一番強い、次がｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇ群が一番弱い。それと同時にｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇは五倍用量のピラセタムと比べ、顕著な差もない。
【０１０８】
表１． ｄｌ−ＰＨＰＢが永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストでサーチ策略に対する影響
【０１０９】
表２． ｄｌ−ＰＨＰＢが永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストでサーチ策略に対する影響
【０１１０】
表１と２は、経口ｄｌ−ＰＨＰＢが永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストでサーチ策略に対する影響。データはサーチ策略の回数で表示する（ｎ＝１７−２０）。＃Ｐ＜０．０５， ＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術と比較、＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群と比較（Ｒｉｄｉｔ分析）。Ｍ：エッジ式；Ｒ：ランダム式；Ｔ：トレンドスタイル式；Ｌ：リニア式。
【０１１１】
２．ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性、ＭＤＡ含有量とＣｈＡＴ活性に対する影響
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つであり、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。ラットが慢性脳虚血の一ヵ月後、皮質のＳＯＤ活性が向上し、溶媒対照群ＳＯＤ活性は７７．３９±８．７０Ｕ／ｍｇタンパク質で、偽手術群より３５．０３±５．２０Ｕ／ｍｇタンパク質高い（Ｐ＜０．００１）。投与治療２１日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３と３９ｍｇ／ｋｇ群のＳＯＤ活性は５３．９２±４．３２、４８．８６±８．９７Ｕ／ｍｇタンパク質であり、溶媒対照群より低い（Ｐ＜０．０５）。ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群が５１．８３±８．８８Ｕ／ｍｇタンパク質で、溶媒対照群よりも低い（Ｐ＜０．０５）。だが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇが当該酵素の活性への影響は顕著な意味がない（図４Ａ）。海馬では、慢性脳虚血はＳＯＤ活性の下降や向上には影響がなく、各薬や各用量も当該酵素の活性に顕著な影響がない（データ未提出）。
【０１１２】
ラットが慢性脳低循環後の一ヶ月、皮質内ＭＤＡ含有量が顕著に向上した（偽手術群は０．６９±０．０６ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、溶媒対照群は１．３１±０．２２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、Ｐ＜０．００１）。投与三週後、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３、３９、１２９ｍｇ／ｋｇ群のＭＤＡ含有量はそれぞれ０．６０±０．０６、０．７７±０．１０、０．６７±０．０７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質で、溶媒対照群より顕著に低い（Ｐ＜０．０１あるいはＰ＜０．００１）。ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇは顕著な影響がない（図４Ｂ）。海馬では、慢性脳虚血はＭＤＡ含有量の変化がなく、各薬や各用量もそれに顕著な影響がない（データ未提出）。
【０１１３】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。ラットが永久に頚部両側の総動脈を結紮した一ヵ月後、海馬ＣｈＡＴ活性が顕著に下降した。偽手術群より２４％下降した。投薬２１日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇが低循環ラット海馬のＣｈＡＴ活性（Ｐ＜０．０５）を顕著に向上し、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇとピラセタム６００ｍｇ／ｋｇも向上の。しかしｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇが顕著な効果がない（図４Ｃ）。皮質では、慢性脳虚血はＣｈＡＴ活性への影響がなく、各薬や各用量もそれに対する影響は、溶媒対照群と比べ、顕著な差がない（データ未提出）。
【０１１４】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳低循環ラット皮質のＳＯＤ活性を下げることができる。皮質のＭＤＡ含有量の向上にもよい下降効果を持っている。これらの効果はｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇがもっと強い。当該薬は慢性脳低循環ラットの脳組織代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直せると、脂質過酸化産物を下げることと、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復されることが示された。また、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇは慢性脳低循環ラットの海馬のＣｈＡＴ活性を向上し、コリン作動性神経機能を改善する可能性が高い。
【０１１５】
３、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織病理に対する影響
（１）ＨＥ染色
ＨＥ染色は異なる色で細胞質と細胞核を表示するので、細胞の姿をはっきり見える。本研究の溶媒対照群が皮質ニューロンが収縮、深い色素と細胞核が明らかでない現象を見え、海馬のＣＡ１、ＣＡ３エリアも類似な変化が出たが、程度は軽い、海馬ＣＡ２エリアは顕著な変化がない。ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは皮質、海馬ＣＡ１、ＣＡ３エリアのニューロン形態異常を顕著に改善でき、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇは皮質と海馬ＣＡ１エリアのニューロン形態異常を改善でき、ｄｌ−ＰＨＰＢ１３ｍｇ／ｋｇは皮質のニューロン形態異常を軽微に改善できる（図５−７）。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環で起こった皮質・海馬ニューロン損傷に保護や治療作用を持っていることが表明した。
【０１１６】
（２）Ｋ−Ｂ染色
Ｋ−Ｂ染色はニューロン髄鞘が完備であるかどうかを反映でき、さらに神経繊維の形態学の変化を反映できる。本実験では、溶剤対照群のラット脳梁と視神経管が明らかな空胞変性および神経繊維障害が出たことが発見した。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は脳梁の病理変化に対する改善が顕著で、空胞変性が減少し、神経繊維の配置も少し回復していた。その内、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果は一番強い、次がｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇが一番弱い（図８）。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は視神経管の病理変化へも改善があるその内、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果はもっと強い（図９）。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環で起こった脳梁と視神経管の損傷に明らかな保護作用を持っていることが表明した。
【０１１７】
４、ｄｌ−ＰＨＰＢが低循環ラット脳組織ＧＦＡＰ陽性アストロサイトに対する影響
脳低循環で起こった組織学異常は空間学習記憶損傷の基礎になるかもしれない。その内、白質が一番早く損傷され、それと共に反応性アストロサイトの増加とミクログリアの活性化が出る。グリア酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫組織化学染色は活性化したアストロサイトの標識化に使用する。毎枚切片から選んだ同じエリアを２−３枚の写真を取って、写真の一定視野の中のアストロサイトの数を記録して、その平均値を当エリアの値として計算する。皮質・海馬・脳梁と視神経管四箇所を選び観察対象にした。皮質にて、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数（１６．９±６．９）は偽手術（９．９±２．０）より多いが、標準誤差が大きすぎるので統計学上の意味がなくなる。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与の三群およびピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群は投与２１日後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は明らかに溶剤対照群より少ない、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群の効果は一番顕著である（Ｐ＜０．０１）（図１２Ａ）。海馬にて、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数（２６．８±５．５）は偽手術群（１２．０±３．０，Ｐ＜０．０１）より明らかに多い。各投与群の当該指標値も溶剤対照群（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）より明らかに低い、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇ群はもっと顕著である（図１０と１２Ｂ）。脳梁にて、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より顕著な差がないが、ｄｌ−ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群の当該指標値は溶剤対照群（Ｐ＜０．０５）より低い（図１２Ｃ）。視神経管にで、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数（４．４±０．７）は偽手術群（０．８±０．３，Ｐ＜０．０１）より明らかに多い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇおよびピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群が動物２１日間投与した後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は溶剤対照群（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）（図１１と１２Ｄ）より明らかに少ない。上記のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラット脳組織損傷と、活性化したアストロサイト量を明らかに軽減、減少できる。特に海馬、視神経管と皮質で、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果が一番強いことが多くて、次はｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇは一番弱い。
【０１１８】
５、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織ＢＤＮＦの分布面積と含有量に対する影響
脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）はニューロンの生存と発育を維持し、正常な動物の脳組織に存在する。虚血の早期で高く表示できるが、虚血２４時間以降は通常下降すると表示する。ＢＤＮＦ免疫組織化学染色面積から見れば、皮質と海馬にて、溶剤対照群と偽手術群と顕著な差がなく、投与群と溶剤対照群とも顕著な差がない（データ未提出）。だが、染色密度から見れば、溶剤対照群と偽手術群と比べると、皮質でも海馬でも、ＢＤＮＦとも顕著に減少し、投与群と溶剤対照群と比べると、皮質ではｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量ともＢＤＮＦの表示を増加できる。その内、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果が一番強い、次はｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇは一番弱い（図１３と１７）。海馬のＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３エリアで、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇがＢＤＮＦの表示（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）を明らかに増加できるが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇがＢＤＮＦ増加の勢いしかないので、統計学上の意味がない（図１４−１７）。染色密度とＢＤＮＦの含有量とは正比例するが、染色面積はある程度で染色の深さを考慮しないので、染色密度は染色面積よりＢＤＮＦの含有量をもっと精確的に反映できる。以上のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳虚血脳組織のＢＤＮＦの含有量を増加できることを証明した。
【０１１９】
実施例２、β−アミロイドペプチド認知症モデルでの研究：ｄｌ−ＰＨＰＢがβ−アミロイドペプチド（２５−３５）で起こったラット記憶と空間識失調を改善できる
材料と方法
１、製剤と薬品
ｄｌ−ＰＨＰＢは本所合成室より提供し、ＰＢＳで調合する。Ａβ（２５−３５）はＳｉｇｍａ会社から購入。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）キット、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）キット、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）キット、クマシーブリリアントブルータンパク質測定キットとも南京建成生物工程研究所より購入した。
【０１２０】
２、器具
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路オートモニターとマイクロプレートリーダーは同上。
【０１２１】
３、モデル設立
雄Ｗｉｓｔａｒラット、１０ヶ月、体重は６００ｇあたり、かごに２匹、室温は２３±１℃に維持し、自由に飲食させる。ナトリウムペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ）でラットを麻酔して、腹ばいで定位装置に固定し、頭のてっぺんの皮膚を切って、頭頂骨を露出させ、ＰａｘｉｏｎｓとＷａｔｓｏｎラット脳立体定位マップによって、歯科ドリルで前の泉門後ろの１．２ｍｍ、中間線右１．５ｍｍのところで頭蓋骨と硬膜をあけ、微量注射器で垂直で４．０ｍｍの深さを差込、１５ｎｍｏｌ（容積が５μｌ）集合態のＡβ（２５−３５）をゆっくり注入する。対照群は５μｌの溶剤ＰＢＳしか注入しない。手術後は毎日腹腔にペニシリン２０万単位を四日間連続で注射する。
【０１２２】
４、群分けと実験設計
ラットをランダムに４群に分け、群ごとに１０匹にする。偽手術群：脳室に溶剤ＰＢＳしか注入しない。モデル群、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇ群：脳室にＡβ（２５−３５）＋溶剤を注入する。手術後の第一日から薬を投与する（偽手術とモデル群は蒸留水を飲ませる）。水迷路ナビゲーションテストは手術後の第９−１２日に行い、１３日目からプラットフォーム探査実験を行い。動物が１４日目に投与４０分間後殺し、頭部を切断し生物化学測定を行う。行動学実験は全部で実験前の４０分で投与する。（実験のプロセスは図２６に参考してください）
５、水迷路実験
ｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）後の第９−１２日に水迷路ナビゲーションテストを行い、方法は前と同じ。１３日目にプラットフォーム探査実験を行い、プラットフォームをおろし、ラットにプラットフォーム探しに自由に３０秒水泳させて、各象限でかかる時間および第一回目標を通る時間を記録して、目標象限で活動時間の百分比を計算する。もしラットが目標象限で活動時間の百分比が大きければ、第一回目標を通る時間が短ければ、ラットがすでにこの空間目標に記憶が残っていることを証明した。
【０１２３】
６、ＳＯＤ、ＭＤＡとＣｈＡＴの検査測定
方法は同上。
【０１２４】
７、統計分析
すべての結果は平均±標準誤差で表示する。水迷路ナビゲーションテストで各群の潜伏期間の差異比較は繰り返し測定の双方向分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。群間の差異はｐｏｓｔ ｈｏｃ ＬＳＤ検査を採用する。水迷路プラットフォーム探査実験、生物化学測定は単方向分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。Ｐ＜０．０５の場合は顕著な差異であると判断する。
【０１２５】
結果
１、ｄｌ−ＰＨＰＢが認知症ラットの学習記憶に対する改善効果
ナビゲーションテストで、四日間の訓練で、各群の潜伏期間が徐々に短縮していくことは、ラットがプラットフォームの位置に対する記憶が強くなることを証明した。１日目は、各群の間に顕著な差異がないが、溶媒対照群の潜伏期間は偽手術群より長い。２日目、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間は溶媒対照群より短い。３−４日目は、溶媒対照群の潜伏期間は偽手術群（Ｐ＜０．０５）より顕著に長い、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群は溶媒対照群（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）より明らかに短い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間も溶媒対照群より短い。これは二週間の治療によって、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的にＡβ（２５−３５）で誘導した認知症ラットの潜伏期間を短縮できることを証明した。すなわち、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に認知症ラットの学習記憶能力を改善できる（図１８）。４日間の訓練で、各群のラットの水泳スピードが顕著な差異がない（データなし）ことはｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）が動物の体力に影響がないから、水迷路実験は動物の学習記憶能力を真実に反映できることを証明した。
【０１２６】
プラットフォーム探査実験で、溶媒対照群の目標象限活動時間百分比（２１．６±１．６％）は偽手術群（３２．８±４．０％，Ｐ＜０．０５）より少ないが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群（３０．２±２．５％）が溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より明らかに長い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群（２４．６±３．０％）も溶媒対照群より長い（図１９Ａ）。ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に認知症ラットが目標象限での活動時間の百分比を増加できることを証明した。第一回目標を通る時間から見ると、溶媒対照群が偽手術群より長くなる。溶媒対照群と比べ、ｄｌ−ＰＨＰＢが第一回目標を通る時間を短縮する。実感の例数を増加すると、顕著な意味を見える可能性がある（図１９Ｂ）。
【０１２７】
つまり、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的にＡβ（２５−３５）で誘導した認知症ラットの最近記憶と空間位置学習記憶障害を改善できる。
【０１２８】
２、ｄｌ−ＰＨＰＢが認知症ラット脳組織ＳＯＤ活性、ＭＤＡ含有量とＣｈＡＴ活性に対する影響
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つであり、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。実験中、偽手術群の皮質のＳＯＤ活性が２１６．９±１４．５Ｕ／ｍｇタンパク質、ｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）後１４日間、ＳＯＤ活性代償性が３２％向上し、２８６．８±１８．３Ｕ／ｍｇタンパク質に達し、顕著な差（Ｐ＜０．０５）がある。経口でｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇ投与二週間後、皮質内ＳＯＤ活性がそれぞれ２３８．２±３２．７と１８５．２±２１．６Ｕ／ｍｇタンパク質に下降し、後者は溶媒対照群と比べ顕著な差も出る（Ｐ＜０．０１）。これはｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的に皮質内ＳＯＤ活性を下げれる（図２０Ａ）ことが示された。海馬では、Ａβ（２５−３５）がＳＯＤ活性の顕著な変化が起こさなく、ｄｌ−ＰＨＰＢも ＳＯＤ活性の顕著な変化が起こさない。
【０１２９】
皮質で、溶媒対照群のＭＤＡ含有量（５．４３±０．５５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）が偽手術群（３．６９±０．５２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）より顕著に高い（Ｐ＜０．０５）。連続で経口してｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇ投与二週間後、皮質内ＭＤＡ含有量がそれぞれ３．６２±０．２１と３．２８±０．２５ｎｍｏｌ／ｍｇまで下降し、溶媒対照群と比べ顕著な差（Ｐ＜０．０５とＰ＜０．０１）が出た。これはｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的にＡβ（２５−３５）で誘導したラット皮質内ＭＤＡ含有量の増加を下げれる（図２０Ｂ）。
【０１３０】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。ラットｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）後、皮質内ＣｈＡＴ活性が顕著な変化がなかったが、経口でｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後で、溶媒対照群と比べると、３９ｍｇ／ｋｇがＣｈＡＴ活性を顕著に増加し（Ｐ＜０．０５）、１２９ｍｇ／ｋｇも当該酵素の活性を上げる傾向が強い。これがＡβ（２５−３５）は皮質内ＣｈＡＴ活性の下降させなかったが、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラットのＣｈＡＴ活性を増加する可能性があることを証明した（図２０Ｃ）。
【０１３１】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存的にＡβ（２５−３５）で誘導したラット皮質のＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量を下げられることは、当該薬物はＡβ（２５−３５）で誘導したラット皮質代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直し、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる。さらに、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラット皮質内ＣｈＡＴ活性を向上し、コリン作動性神経機能を改善することができる可能性も高い。しかし、正常なラット皮質内ＣｈＡＴ活性に影響がないかまだ研究中である。
【０１３２】
実施例３ 加速老化マウスのモデルに対する研究：ｄｌ−ＰＨＰＢは加速老化マウスの学習記憶障害に対する改善効果
材料と方法
１、製剤と薬品
ｄｌ−ＰＨＰＢは本所合成室より提供し、化学純度は９８．５％（ＨＰＬＣ法で測定）、蒸留水で調製した。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）キット、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）キット、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）キット、アデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）キット、クマシーブリリアントブルータンパク質測定キットとも南京建成生物工程研究所より購入した。
【０１３３】
２、器具
ＳＴＴ−２タイプのジャンプ装置と水迷路は中国医学化学院薬物研究所より開発。ＭＱＸ ２００タイプのマイクロプレートリーダーはアメリカＢｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの製品。
【０１３４】
３、動物
１０ヶ月ＳＡＭＰ８、雄、ＳＰＦレベル、北京維通利華実験動物技術有限公司より購入。
【０１３５】
４、グループ分けと実験設計
動物が一週間適応後、行動学実験を行い、実験結果で平均に三群に分け：対照群、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０ｍｇ／ｋｇとｄｌ−ＰＨＰＢ１６０ｍｇ／ｋｇ群（それぞれラットの３９と１２９ｍｇ／ｋｇに相当する）、毎日１回、３５日に連続で蒸留水や薬物を投与する。投与後の第３１−３５日にステップダウンテストと水迷路実験を行い、３６日目に群ごとにランダムで８−１０匹の動物を取り、頭を切って、皮質と海馬を分離して、指標が包括ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴ、ＡＣｈＥ、ミトコンドリアＡＴＰａｓｅを含む生物化学測定をやる。（実験のプロセスは図２７参照）
５、ステップダウンテスト
ジャンプ装置は矩形の電気ショック装置で、五軒に分け、底に３６ボルトのＡＣを鉄柵が付き、底の角に電気絶縁の径３ｃｍの円形ゴムプラットフォームが置いているので、動物がそれに上って電気ショックから逃げれる。回りはプラスチックシートで、実験者向けの面は透明で、その他は黒くて不透明で、天井は動物を取ったり置いたり用に開ける。
【０１３６】
マウスをジャンプ装置の一軒に置き、３分間適応後、電源を入れ、マウスに電気ショックをかけ、５分間を観察して、電気ショック受けた回数を記録する。２４時間後、電源を入れて、マウスをプラットフォームに置き、第一回プラットフォームから飛び下りる潜伏期間および三分間に受けた電気ショックの回数を記録する。これでマウスの受動回避反応能力を判断する。
【０１３７】
６、水迷路実験
水迷路装置は黒い不透明の矩形プラスチックボックス（８０ｃｍ×５０ｃｍ×２０ｃｍ）で、その中にブラインドサイド４個と終点ステップ１個があり、マウスはそのステップで水面に出られる。またもう一枚の１５ｃｍ×２０ｃｍサイズの黒いプラスチックシートがあり、異なる位置に置き、異なる出発点とする。異なる出発点には含むブラインドサイド数も異なる。実験の際、深さが１２ｃｍ、水温が２５±１℃の水を入れる。マウスを異なる出発点において、異なるブラインドサイド数の折れ曲がったコースで終点に行き、水面に出る。マウスがブラインドサイドに入る回数と終点に着くにかかる時間でその最近記憶と学習記憶能力を判断する。
【０１３８】
毎回実験するときに、マウスを終点のステップに置いて５秒適応させる。それで頭を出発点のブラインドサイド壁に向かって、水に入れる。それがブラインドサイドに入る回数とステップを見つける時間、すなわち逃避潜時期間を記録する。時間を３分間に限定して、もし３分間内にステップを見つけなかったら、実験者で終点までガイドして、潜伏期間を３分間にする。４回訓練して、それぞれ２、３、４、４個ブラインドサイドを含むコースで行う。一回テストして、同様にマウスがブラインドサイドに入る回数とステップを見つける時間を記録する。
【０１３９】
７、脳組織ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴ、ＡＣｈＥとＡＴＰａｓｅの測定
皮質と海馬のＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴとＡＣｈＥの測定方法は同上。また別に一部の皮質組織を取って、組織ホモジネートを調製する。勾配遠心法でミトコンドリアを抽出し、超音波法で粉砕して、そのＡＴＰａｓｅ活性を測定する。測定方法はキット説明書に従って行う。
【０１４０】
８、統計分析
すべての結果は平均±標準誤差で表示する。水迷路実験指標の差異は繰り返し測定の双方向分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。その他の各指標の差異は単方向分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。群の間の差異はｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ またはＬＳＤ検査を採用する。
【０１４１】
結 果
１、ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８の学習記憶障害に対する改善効果
ステップダウンテストは動物の受動回避反応能力を測定する経典な実験の１つである。動物が受けた電気ショックの回数と潜伏期間で動物の受動回避反応能力を判断する。第一日の訓練中に、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇ群が受けた電気ショック回数（５．８±０．５，４．９±０．５）は対照群ＳＡＭＰ８（８．３±０．６）より明らかに少ない。Ｄｕｎｎｅｔｔ検査で、顕著な差（Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．００１）があり、さらに一定の用量依存性もある。第二日の測定で、２つの投与群ＳＡＭＰ８が受けた電気ショック回数（３．４±０．３，２．１±０．３）も対照群（４．６±０．３）（Ｐ＜０．０５和Ｐ＜０．０１）より明らかに少ない。尚且つ２つの投与群は第一回ステップから飛び下りる潜伏期間（５．５±０．８，１０．２±２．４）も対照群（０．７±０．２） （Ｐ＜０．０１）より明らかに長くて、用量依存関係もある。以上のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇの長期投与ともＳＡＭＰ８マウスの受動回避反応能力を向上でき、用量依存関係もあり、すなわちｄｌ−ＰＨＰＢがその学習能力と記憶保持能力を顕著に改善できることが示された。
【０１４２】
水迷路実験は動物の最近記憶と空間学習記憶能力の測定に常用する。動物がブラインドサイドに入る回数とステップを見つける潜伏期間でその学習記憶能力を反映できる。本発明では、第一、二回で使うブラインドサイドの数はそれぞれ２個と３個、第三ないし第五回は４個になる。前の三回の訓練で、投与群ＳＡＭＰ８はブラインドサイドに入る回数は対照群と比べ、顕著な差がない。第三ないし第五回のテストで、投与群の動物がブラインドサイドに入る回数とも減少になることは動物がステップに対する記憶が強くなることが示されたが、対照群がブラインドサイドに入る回数の変化がない。２つの投与群が第四回のテストでブラインドサイドに入る回数は対照群より少なくなる。第五回のテストで、２つの投与群のミス回数（それぞれ３．１±０．９和２．７±０．３）は、対照群（６．１±１．１）（Ｐ＜０．０５）より明らかに少ない。第一、二回の訓練で、各群の動物がステップを見つける潜伏期間の差異がない。第三回の訓練で、２つの投与群の潜伏期間が対照群より短くなる。その以降は、訓練回数の増加につれて、各群がステップを見つける潜伏期間が徐々に短縮していく。第四回の訓練で、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間は対照群より短くなる勢いがあり、ｄｌ−ＰＨＰＢ １６０ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間が対照群（Ｐ＜０．０５）より明らかに短い。最後のテストで、２つの投与群の潜伏期間とも対照群（Ｐ＜０．０１）より明らかに短い。それはｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８の最近記憶と空間学習記憶障害を改善できることが示された。
【０１４３】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇともＳＡＭＰ８マウス学習記憶能力を改善でき、なお一定の用量依存性もある。
【０１４４】
２、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量に対する影響
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つで、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。実験中に、対照群の海馬組織ＳＯＤの活性は２７９．４±６５．７Ｕ／ｍｇタンパク質、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇを連続で３５日間投与した後、ＳＯＤ活性はそれぞれ１５６．２±７．８および１５８．７±１１．４Ｕ／ｍｇタンパク質まで下降し、対照群と顕著な差（Ｐ＜０．０５）がある。ｄｌ−ＰＨＰＢは海馬ＳＯＤの活性を下げることができることが示された。皮質では、ｄｌ−ＰＨＰＢ２つの用量ともＳＯＤ活性の顕著な変化を起こさなかった（データなし）。
【０１４５】
投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ５０と１６０ｍｇ／ｋｇ群の海馬のＭＤＡ含有量はそれぞれ１．２３±０．０５と１．２６±０．０９ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、対照群（１．９０±０．５０ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）と比べ、それぞれ３５．３％と３３．７％下降したので，下降する勢いが明らかだが、統計学上は意味がない（図２３Ｂ）。ｄｌ−ＰＨＰＢが海馬のＭＤＡ含有量を下降する可能性があることを証明した。皮質では、各群のＭＤＡ含有量は顕著な差がない（データなし）。
【０１４６】
上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウス海馬組織代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直すことができ、脂質過酸化産物を下げる可能性があり、さらに脳組織正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させ、酸化ストレス損傷を軽減させることが示された。
【０１４７】
３、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＣｈＡＴとＡＣｈＥ活性および皮質ミトコンドリアＡＴＰ酵素活性に対する影響
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、ＡＣｈＥはアセチルコリンの加水分解酵素として，それらの活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。連続で投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ５０と１６０ｍｇ／ｋｇ群ＳＡＭＰ８マウス海馬のＣｈＡＴ活性が対照群と比べ、それぞれ４０％と６１％が増加し、顕著な統計学差異があり、なお一定の用量依存性がある（図２４Ａ）。皮質では、２つの投与群のＣｈＡＴ活性は対照群と比べ、顕著な差がない（データなし）。２つの投与群の海馬のＡＣｈＥ活性（０．６３２±０．０３６和０．５９７±０．０３０Ｕ／ｍｇタンパク質）は対照群（０．８５０±０．１９５Ｕ／ｍｇタンパク質）より明らかに低い。ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８マウス海馬ＡＣｈＥ活性を下降させる可能性があることが示された（図２４Ｂ）。皮質では、各投与群のＡＣｈＥ活性が顕著な差がない（データなし）。
【０１４８】
ミトコンドリアＡＴＰａｓｅはミトコンドリア生産機能の重要な指標の１つである。本研究では、ｄｌ−ＰＨＰＢ １６０ｍｇ／ｋｇ群ＳＡＭＰ８マウスのＡＴＰａｓｅ活性（９．８２±０．５１Ｕ／ｍｇタンパク質）は対照群（８．５８±０．２１Ｕ／ｍｇタンパク質）（Ｐ＜０．０５）より高い。ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０ｍｇ／ｋｇ群（８．７９±０．３３Ｕ／ｍｇタンパク質）は対照群と顕著な差がない。多い用量群の増加範囲は１４％しかないことを考慮したうえ、ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８マウス皮質ミトコンドリアＡＴＰａｓｅの活性に影響がないことを推定した（図２４Ｃ）。
【０１４９】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的にＳＡＭＰ８マウス海馬組織のＣｈＡＴ活性を向上でき、その海馬ＡＣｈＥ活性にもある程度の下降ができる。ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症マウスの海馬アセチルコリン含有量の増加によって、コリン作動性神経機能を改善できる可能性があることが示された。また、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症マウスの皮質ミトコンドリアＡＴＰａｓｅの活性に対する影響はごく小さい。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムがアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いる薬を調製する時の役割に関する。上記アルツハイマー病は、初老期認知症・脳血管性認知症またはこの両方とも持つ混合症状から選択される。上記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選択される。また、本発明は、アルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用い、予防や治療に実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、および薬学で認めるオプションのキャリアおよび／またはアクセサリを含む医薬組成物に関する。上記医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放出または徐放性製剤から選ばれる。また、本発明は必要がある患者に治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムや請求項４に記載の医薬組成物を使用を含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療の方法に関する。患者への投与経路は非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これに限定されない。上記器官から選んで、経由して患者に投薬する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、初老期認知症（アルツハイマー病、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）と血管性認知症（ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｍｅｎｔｉａ， ＶＤ）の二種類および両方の混合症状に分けられる。ＡＤは年齢に関わる進行性認知障害と記憶障害を主としての中枢神経系の変性疾患である。主な臨床症状は記憶（特に最近の記憶）減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調である。最も特徴的な２つの病理学での変化は脳細胞外アミロイドペプチド沈着と神経原線維変化（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴ）である。本疾患は６０歳以上の人間に多発で、わが国は６５歳以上の老人の有病率は４％前後、全世界では約５０００万の高齢者がそれぞれ程度のアルツハイマー病にかかっている。ＶＤは脳血管病によって脳機能障害で発生した病気である。欧米には、ＶＤ患者はアルツハイマー病患者総数の１０〜２０％を占め、アジアでは、中国と日本の発生率はさらぶ高い。わが国は高齢化時代に入っているので、アルツハイマー病の患者は年々増加している。脳への血液供給が長期に不足が続けることも脳血管性認知症になる重要な原因である。アルツハイマー病患者は本人が苦しく感じるだけではなく、家庭にも社会にも重い負担になるが、今のところ効果的な治療薬がまだできていないので、有効な薬を見つけ、ＡＤとＶＤの発生・進行を遅延・制御することは極めて重要になる。
【０００３】
本請求項で用いた２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ２−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）−ｂｅｎｚｏａｔｅ，ｄｌ−ＰＨＰＢ）は化学合成の新規物質で、核磁気共鳴、ＭＳおよび赤外線などのスペクトル分析によって、単一の化合物であることを証明し、高性能液相の分析によっては、化学の純度は９８％以上であることを証明した。その調製工程は特許「２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムおよびその作り方と役割」、公報１３８２６８２。その化学一般式は次式で表される。
【０００４】
【化１】
【０００５】
今までｄｌ−ＰＨＰＢでアルツハイマー病を治療したという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】中国特許公報第１３８２６８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムがアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いる薬を調製する時の役割に関する。
【０００８】
本発明で記載のアルツハイマー病は、初老期認知症・血管性認知症またはこの両方の混合症状から選択される。上記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選択される。
【０００９】
本発明で記載の予防とは、アルツハイマー病が発生する前に、特にアルツハイマー病初期の前で記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調などの症状を抑える。記載の緩和とは、アルツハイマー病中に、またはアルツハイマー病が出た後、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調などの症状を改善する。記載の治療とは、アルツハイマー病中に、またはアルツハイマー病が出た後、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調などの症状を臨床上の改善を図る。
【００１０】
また、本発明は２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムが脳組織の酸化ストレス損傷の軽減、コリン作動性神経機能の向上、ニューロンの保護および／または脳源性神経成長因子含有量の向上に用いる薬を調製する時の役割に関わる。記載の脳組織の酸化ストレス損傷の軽減とは、脳組織代償性が異常増加の酸化防止酵素の活性を抑えることで、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる。記載の酸化防止酵素とは、スーパーオキシドジスムターゼで、脂質過酸化産物とはマロンアルデヒドである。コリン作動性神経機能の改善は、アセチルコリン合成酵素の活性を上げることで、アセチルコリン加水分解酵素の活性を下げる。
【００１１】
本発明の中のｄｌ−ＰＨＰＢは２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを指す。本発明では、記載の哺乳動物は人間が好ましい。
【００１２】
アルツハイマー病患者として、主要な表現は認知障害、特に最近の記憶と空間知覚のプログレッシブ減退である。高齢者と関わる認知症はいろいろな原因で引き起こされ、例えば脳血管性（脳虚血）、β−アミロイドペプチド沈着相関の変化およびその他老年と関わる未知の原因がある。上記要因に対して、本発明は下記の認定されたモデル三種類を取り入れた。２−ＶＯラットが臨床的な脳への血液供給不足で起こった脳血管性認知症が模擬できる；ラットの側脳室にＡβ（２５−３５）を注射したことで起こった学習・記憶障害は観測薬物が初老期認知症（アルツハイマー病、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）に治療作用のモデルであることはすでに認定されている；ＳＡＭＰ８は学習・記憶障害が現れるだけでなく、ＡＤの一部の病理学の特徴も有し、すばやく自然な疾患モデルであり、人間の老衰や認知症の臨床特徴と類似しており、理想的なＡＤの代替モデルである。本研究は国際で認定された方法で、すなわちＭｏｒｒｉｓ水迷路実験、水迷路実験およびステップダウンのテストでラット・マウスの学習・記憶能力を測定し、三種類の動物モデルでｄｌ−ＰＨＰＢが脳血管性認知症、β−アミロイドペプチド（Ａβ）誘導への認知障害およびすばやく老衰に伴って出た学習・記憶衰退の役割を観察した。
【００１３】
要するに、本発明は、この３つのモデルでｄｌ−ＰＨＰＢが認知症動物の学習記憶に対する改善効果を観察して、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳虚血ラット、Ａβ認知傷害ラットと加速老衰マウスの学習・記憶能力を顕著に改善できることを発見した。また、本発明はそれ以上の作用メカニズムの可能性に対しても研究してみた。ｄｌ−ＰＨＰＢは、慢性脳虚血原因の脳組織形態異常の改善、アストロサイト活性化の減少とニューロン保護作用の再生ができる；上記三種類モデルの動物脳組織代償性増加のＳＯＤ活性の下降、ＭＤＡレベルアップ、酸化損害の減少およびニューロン保護もできる；上記三種類モデル動物の脳内ＣｈＡＴ活性を強め、脳内アセチルコリン合成を増加させて、動物の学習・記憶能力を強化することができる；慢性脳虚血後脳組織神経営養因子（ＢＤＮＦ）の含有量を増加させることができるということは脳組織の保護と認知症抵抗のメカニズムの１つであることを発見した。上記のことは、ｄｌ−ＰＨＰＢは多原因の学習・記憶障害症を改善でき、アルツハイマー病に対して著しい治療作用があり、老衰原因の学習・記憶衰退に対しても改善ができるということは十分に説明された。
【００１４】
具体的には、本発明は、慢性脳虚血モデルに対する研究を通して、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血液供給不足ラットの最近記憶と空間識失調を改善することができる。ＶＤは脳血管病が原因の脳機能障害でかかった認知症であり、ほとんどの脳動脈梗塞あるいはラクナ脳梗塞あるいは脳低循環に関連付けられている。脳低循環程度は認知症の重さにと関連している。慢性進行性脳供血不足は酸素とグルコースおよび他の必要代謝物の利用率を低下させた結果は、酸化損傷を引き起こし、ミトコンドリア機能と神経細胞の生物合成も損害され、シナプス伝達をブロックされ、最後に神経病理学的異常、すなわち神経変性の変更になってしまう。ＶＤ患者の症状は主に最近の記憶と空間感の進行性低下および認知障害である。
【００１５】
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路実験は動物の空間学習と最近の記憶能力を検出する典型的な実験である。本発明は、大鼠の両側頚動脈（２−ＶＯ）を永久的に結紮することで継続性脳低循環のモデルを作り、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路法でｄｌ−ＰＨＰＢの動物最近記憶と空間識失調に対する影響を検測してみた。この実験を通して、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳低循環ラットの学習・記憶を改善できることを発見した。ラットが慢性脳虚血にかかった１ヶ月後に、本発明の発明者は二項の実験を行った。１つはナビゲーションテスト実験、もう１つは空間探査実験。
【００１６】
ナビゲーションテストで、ラットがプラットフォーム見つける時間（潜伏期間）、サーチ策略および水泳スピードの三項指標を観察した。ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳低循環ラットの学習記憶能力の減退に対しては顕著な改善効果を持っている。潜伏期間から見ると、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラットの空間学習と最近記憶障害に明らかな改善効果を持っている。プラットフォーム探査策略から分析すると、ｄｌ−ＰＨＰＢ群はリニア式とトレンドスタイル式策略を使う回数は明らかに増えたことは、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳低循環ラットが空間位置への記憶能力を向上できることが示された。実験中に、各群ラットの水泳スピードに明らかな変化がなく、群の間にも明らかな差異がないことは、当該実験方法は体力が妨害にならないことから、よりよいラットの学習記憶能力を測定できる。ｄｌ−ＰＨＰＢはアルツハイマー病、特に脳血管性認知症の空間学習と最近記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療ができることが示された。
【００１７】
ナビゲーションテストが終わってから、プラットフォーム探査実験を行い、安全島をはずして、ラットが目標象限での活動時間と第一回目標を通る時間を記録することで、ラットが安全島に対する空間記憶ができたかどうかおよび記憶の強度を測定する。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群で、ラットが目標象限での活動時間は溶媒対照群よりは明らかに長い。第一回目標を通る時間から見ると、ｄｌ−ＰＨＰＢ群も溶媒対照群より明らかに短い。これはｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラットの空間学習記憶賞がいいを改善できることが示された。ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に脳血管性認知症の空間学習記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療ができることが示された。
【００１８】
本発明のｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に脳血管性認知症に対する予防・緩和および／または治療の機能を述べるために、本発明は生化学の方法でｄｌ−ＰＨＰＢが酸化損傷への相関指数と、コリン作動性神経システムへの影響を測定し、特にｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性・ＭＤＡ含有量とアセチルコリンのシンターゼ（ＣｈＡＴ）活性への影響を測定した。
【００１９】
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つで、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。ラットが慢性脳虚血の一ヵ月後、皮質のＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量が溶媒対照群より顕著に低いことは、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラット脳組織代償性が異常に増加した酸化防止酵素の活性を修正すると、脂質過酸化産物を低減し、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復が示された。
【００２０】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。ラットが永久に頚部両側の総動脈を結紮した一ヵ月後、海馬ＣｈＡＴ活性が顕著に下降した。投薬２１日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢが低循環ラット海馬のＣｈＡＴ活性を顕著に向上し、コリン作動性神経機能を改善できる。
【００２１】
脳低循環で起こった行動変化と共に、脳グリア細胞が活性化し、白質と灰白質も変化するので、本発明の機能をさらに述べるため、本発明は病理学および免疫組織化学の方法で、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織形態の変化への影響を観察した。ＨＥとＫｌｕｅｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色（後者はニューロン髄鞘の病理学的変化を反映する）によって、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、アストロサイト活性化の兆候）と脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ、認知機能とニューロンの生存と関わり、虚血に敏感である）を指標とする。
【００２２】
ＨＥ染色は異なる色で細胞質と細胞核を表示するので、細胞の姿をはっきり見える。本研究の溶媒対照群が皮質ニューロンが収縮、深い色素と細胞核が明らかでない現象を見え、海馬のＣＡ１、ＣＡ３エリアも類似な変化が出た。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環で起こった皮質・海馬ニューロン損傷に保護や治療作用を持っていることが表明した。
【００２３】
Ｋ−Ｂ染色はニューロン髄鞘が完備であるかどうかを反映でき、さらに神経繊維の形態学の変化を反映できる。本実験では、溶媒対照群ラット脳梁と視神経管が明らかな空胞変性および神経繊維障害が出たことが発見した。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は脳梁の病理変化に対する改善が顕著で、空胞変性が減少し、神経繊維の配置も少し回復していた。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は視神経管の病理変化へも改善がある。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環で起こった脳梁と視神経管の損傷に明らかな保護作用を持っていることが表明した。
【００２４】
本発明ではｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織ＧＦＡＰ陽性アストロサイトへの影響を研究した。脳低循環で起こった組織学異常は空間学習記憶損傷の基礎になるかもしれない。その内、白質がもっとも早く損傷され、それと共に反応性アストロサイトの増加とミクログリアの活性化が出る。グリア酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫組織化学染色は活性化したアストロサイトにマック付けに使用する。本発明は皮質・海馬・脳梁と視神経管四箇所を選び観察対象にした。皮質にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術よりさらに勢いがあり、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群は投与２１日後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は明らかに溶媒対照群より少ない。海馬にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より明らかに多い各投与群の当該指標値も溶媒対照群よりも明らかに低い。脳梁にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より顕著な差がないが、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群の当該指標値は溶媒対照群より低い。視神経管にて、溶媒対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より明らかに多い。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与２１日後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は溶媒対照群より明らかに少ない。上記のことでは、特に海馬、視神経管と皮質で、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラット脳組織損傷と、活性化したアストロサイト量を明らかに減少させることができる。
【００２５】
本発明はさらにｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織ＢＤＮＦ分布面積と含有量への影響を研究した。脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）はニューロンの生存と発育を維持し、正常な動物の脳組織に存在する。虚血の早期で高く表示できるが、虚血２４時間以降は通常下降して表示する。ＢＤＮＦ免疫組織化学染色密度から見れば、溶媒対照群と偽手術と比べると、皮質でも海馬でも、ＢＤＮＦとも顕著に減少し、投与群と溶媒対照群と比べると、皮質ではｄｌ−ＰＨＰＢがＢＤＮＦの表示を増加できる。海馬のＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３エリアで、ｄｌ−ＰＨＰＢがＢＤＮＦの表示を明らかに増加できる。染色密度とＢＤＮＦの含有量と正比例する。以上のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳虚血脳組織のＢＤＮＦの含有量を増加できる。
【００２６】
本発明はβ−アミロイドペプチド認知症モデルの研究を通し、ｄｌ−ＰＨＰＢがβ−アミロイドペプチド２５−３５）で起こったラット記憶と空間識失調障害を明らかに改善できる。
【００２７】
ＡＤは高齢者の認知機能プログレッシブ減退の一番重要な原因で、その主要な病理変化はβ−アミロイドペプチド（β−ａｍｙｌｏｉｄ，Ａβ）沈着を核心とするシミと神経原線維変化を形成する。Ａβは３９〜４３のアミノ酸で成り立ち、β前駆体蛋白質の分解産物である。Ａβ沈着の範囲は神経損傷や認知機能損傷と密接に関連している。Ａβ（２５−３５）はＡβの毒性断片で、Ａβ（１−４０）やＡβ（１−４２）と類似しているが、より強く速い毒性を持っている。過去の言及によっては、一回性脳室にＡβ（２５−３５）を注射（ｉ．ｃ．ｖ．）すると、ラットの学習と記憶の損傷を起こし、ＡＤ患者のような症状が出る。脳室にＡβ（２５−３５）の注射はＡＤを模擬できるので、本実験はラットｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）をモデルにする。
【００２８】
本発明はＭｏｒｒｉｓ水迷路でｄｌ−ＰＨＰＢが動物の最近記憶と空間位置記憶の能力への影響を測定した。結果として、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラットの学習記憶の改善に効果がある。ナビゲーションテストで、ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存的にＡβ（２５−３５）誘導した認知症ラットの潜伏期間を短縮できることは、ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的に認知症ラットの学習記憶能力を改善できることを証明できる。四日間の訓練で、各群のラットの水泳スピードに差がないことはｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）が動物の体力に影響がないということである。水迷路実験は動物の学習記憶能力を確かに反映できることは、ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に初老期認知症の最近記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療の効果があることを証明した。
【００２９】
プラットフォーム探査テストで、ｄｌ−ＰＨＰＢ群がターゲット象限での活動タイミングの百分比は溶媒対照群より明らかに長い。一回目プラットフォームを通過する時間について、ｄｌ−ＰＨＰＢ群も短縮の勢いが見える。ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的に認知症ラットの空間位置学習記憶を増加可能であることは、ｄｌ−ＰＨＰＢはアルツハイマー病、特に初老期認知症の空間位置学習記憶障害の症状に対する予防・緩和および／または治療の効果があることを証明した。
【００３０】
本発明のｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に初老期認知症に対する予防・緩和および／または治療の機能を述べるために、生物化学方法で酸化ストレス損傷およびコリン作動性神経機能障害の影響をそれぞれ測定し、特にｄｌ−ＰＨＰＢが認知症ラット脳組織ＳＯＤ活性・ＭＤＡ含有量とＣｈＡＴ活性に対する影響を測定した。
【００３１】
本発明では、ｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）が１４日後、ＳＯＤの活性代償性が向上し、経口でｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後は、皮質内ＳＯＤ活性がそれぞれ顕著に下降したことは、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に皮質内ＳＯＤ活性を下降できることを証明した。
【００３２】
皮質で、溶媒対照群のＭＤＡ含有量が顕著に向上した。連続で経口してｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後、皮質内ＭＤＡ含有量が下降し、溶媒対照群と比べ顕著な差が出、ｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的にＡβ（２５−３５）で起こったラット皮質内ＭＤＡ含有量の増加を下げられる。
【００３３】
ラットｉ．ｃ．ｖ．Ａβ（２５−３５）後、皮質内ＣｈＡＴ活性が顕著な変化がなかったが、経口でｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後で、溶媒対照群と比べると、３９ｍｇ／ｋｇがＣｈＡＴ活性を顕著に上げられる（Ｐ＜０．０５）、１２９ｍｇ／ｋｇも当該酵素の活性を上げる傾向が強い。これがＡβ（２５−３５）は皮質内ＣｈＡＴ活性の下降をさせなかったが、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラットのＣｈＡＴ活性を増加する可能性があることを証明した。
【００３４】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存的に初老期認知症患者の皮質のＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量を下げられることは、当該薬物は初老期認知症患者の皮質代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直し、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる。さらに、ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症患者の皮質内ＣｈＡＴ活性を向上し、コリン作動性神経機能を改善することができる可能性も高い。
【００３５】
本発明は加速老化マウスのモデルに対する研究によっては、ｄｌ−ＰＨＰＢは加速老化マウスの学習記憶障害への改善効果を発見した。加速老化マウス（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ，ＳＡＭ）は２つの亜系、すなわちＰ系とＲ系に分けられる。前者は加速老化マウス（ＳＡＭ／ｐｒｏｎｅ，ＳＡＭＰ）といわれ、脱毛や肌荒れと行動障害や生存期間短縮などの老衰現象に現れ、遺伝の傾向も出てくる。後者は加速老化抵抗マウス、正常な老衰過程にいる。ＳＡＭＰはすべて１２の亜系に分けられ、その内ＳＡＭＰ８は学習記憶機能が年齢に従い衰退になり、中枢神経システム、例えば皮質や海馬などの病理的な変化が主要な状態として表現される。文献の報道によると、ＳＡＭＰ８は加齢中に脳内に大量のＡβが沈着し、学習記憶機能と関連する脳内神経伝達物質も相応に変化し、例えば皮質や海馬のアセチルコリンレベルが下降、オピオイドペプチド、γ−アミノ酪酸レベルが向上、５−ＨＴが先に向上しそれで下降するなど。脳内脂質過酸化物の含有量も増加し、酸化−酸化防止システムが障害になって、酸化ストレス損傷が出る。それと共に顕著なミトコンドリア機能障害も出る。つまり、ＳＡＭＰ８は自然な老衰過程中緩慢に出てくる認知症を模擬できるので、老衰と学習記憶機能および学習記憶機能障害発生原因を研究するためのより動物モデルである。
【００３６】
本発明はステップダウンテストでＳＡＭＰ８の受動回避反応能力を、水迷路で最近記憶と空間学習記憶能力を測定する。その結果から、ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８の学習記憶障害への改善効果と、アルツハイマー病への治療と知力衰退への延長効果を発見した。
【００３７】
本発明では、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群ＳＡＭＰ８が受けた電気ショック回数は対照群より明らかに少ない、第一回でステップから飛び下りる潜伏期間は対照群より明らかに長い。尚且つ用量依存関係もある。これはｄｌ−ＰＨＰＢの長期間投与がＳＡＭＰ８マウスの受動回避反応能力を向上でき、哺乳動物の学習能力と記憶保持能力を改善できることを証明した。ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に混合型認知症患者の学習能力と記憶保持能力を改善できることを証明した。
【００３８】
水迷路実験は動物の最近記憶と空間学習記憶能力の測定に常用する。動物がブラインドサイドに入る回数とステップを見つける潜伏期間でその学習記憶能力を反映できる。本発明では、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群がブラインドサイドに入る回数は対照群より明らかに少ない、潜伏期間も対照群より明らかに短い。ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８の最近記憶と空間学習記憶障害を改善でき、なお一定の用量依存性もある。ｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に混合型認知症患者の最近記憶と空間学習記憶障害の症状を予防、緩和および／または治療することができることを証明した。
【００３９】
本発明のｄｌ−ＰＨＰＢがアルツハイマー病、特に混合型認知症病を予防、緩和および／または治療する機能を述べるために、生物化学方法でその脳組織と学習記憶および老衰と関連する生物化学指標を測定し、特にｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性・ＭＤＡ含有量・ＣｈＡＴ活性とＡＣｈＥ活性に対する影響を測定した。
【００４０】
本発明では、ＳＡＭＰ８マウスは連続して経口ｄｌ−ＰＨＰＢ投与３５日後は、海馬ＳＯＤ活性を明らかに下降し、対照群より顕著な差が出た。投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群の海馬のＭＤＡ含有量は対照群と比べ、下降する勢いが明らかである。ｄｌ−ＰＨＰＢが海馬のＭＤＡ含有量を下降する可能性があることを証明した。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の海馬組織代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直すことができ、脂質過酸化産物を下げる可能性があり、さらに脳組織正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させ、酸化ストレス損傷を軽減させることが示された。
【００４１】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、ＡＣｈＥはアセチルコリンの加水分解酵素として、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。
【００４２】
連続で投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群ＳＡＭＰ８マウス海馬のＣｈＡＴ活性が増加し、対照群と比べ、顕著な統計学差異があり、なお一定の用量依存性がある。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与群海馬のＡＣｈＥ活性は対照群より勢いがないことが明らかである。これはｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８マウス海馬ＡＣｈＥ活性を下降させる可能性があることが示された。
【００４３】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に混合型認知症患者の海馬組織のＣｈＡＴ活性を向上でき、その海馬ＡＣｈＥ活性にもある程度の下降ができる。ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の海馬アセチルコリン含有量の増加によって、コリン作動性神経機能を改善できる可能性があることが示された。
【００４４】
つまり、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血管性認知症に対して予防、緩和および／または治療効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢが脳血管性認知症患者の最近記憶と空間位置記憶障害を顕著に改善できる。ｄｌ−ＰＨＰＢが脳血管性認知症患者の脳組織代償性増加のＳＯＤ活性と脂質過酸化産物ＭＤＡレベルを顕著に下降できることは、酸化ストレスが神経細胞に対して損傷を顕著に抑えることを証明した。ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血管認知症患者の脳組織のＣｈＡＴ活性を向上でき、脳内のアセチルコリンレベルを向上させる可能性が高いので、学習記憶の改善に効く。白質がまばらや空泡形成やグリア細胞増加やニューロン形態異常も含み、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳血管性認知症患者の脳組織の病理的な変化を改善でき、さらに虚血で起こった脳組織脳源性神経成長因子の現象を改善する。
【００４５】
ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症に対しては予防、緩和および／または治療効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症患者の学習と記憶障害に顕著な改善効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢは初老期認知症患者の代償性増加の脳組織ＳＯＤ活性とＭＤＡレベル増加を下降でき、酸化損傷を軽減でき、ニューロンを保護する。ｄｌ−ＰＨＰＢはコリン作動性神経伝達物質アセチルコリン合成酵素ＣｈＡＴの活性を上げられ、コリン作動性神経機能の改善によって、初老期認知症患者の学習記憶障害を改善する可能性は高い。
【００４６】
ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症に対しては予防、緩和および／または治療効果を持っている。ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の最近記憶および空間位置記憶障害を顕著に改善できる。ｄｌ−ＰＨＰＢは混合型認知症患者の海馬Ｓ０Ｄ活性を下降でき、さらに海馬ＭＤＡレベルを下降することは、それは酸化損傷を軽減でき、ニューロンを保護できることを証明した。ｄｌ−ＰＨＰＢは海馬コリン作動性神経伝達物質アセチルコリン合成酵素ＣｈＡＴの活性を上げられ、さらにその加水分解酵素ＡＣｈＥの活性を下げる。コリン作動性神経機能の改善によって、混合型認知症患者の学習記憶障害を改善する可能性は高いことが示された。
【００４７】
つまり、ｄｌ−ＰＨＰＢはアルツハイマー病の治療に効果を持って、加速老衰に伴う認知衰退を軽減できる。その作動原理は脳組織の酸化ストレス損傷の軽減と、コリン作動性神経機能の向上と、脳組織脳源性神経成長因子含有量の向上などを含む。
【００４８】
もう１つ、本発明は、アルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用い、予防や治療に実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、および薬学で認めるオプションのキャリアおよび／またはアクセサリを含む医薬組成物に関する。本発明では、使用ルートによって、記載の医薬組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放性または徐放性製剤から選ばれる。
【００４９】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は、既知の方法で調製しても良い。下記のなんかのルートで受験者に使用する。非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これに限定されない。
【００５０】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは既知の調製方法を通して作成する。
【００５１】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物のオプションはいずれの通常の方法で一種や多種の薬学で認めるキャリアおよび／または賦形剤で調製する。したがって、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムとそれの溶媒は特別な調合をしても良い、例えば吸入や吹き込み（口や鼻を介して）、または経口、舌下腺、非経口または直腸投与。
【００５２】
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放性または徐放性製剤などの形を使ってもよい。これらの製剤は治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、純化形式は好ましい、および適当のキャリアを含み、患者に適用する投与形式を提供する。製剤は投与方式に適用すべきである。
【００５３】
本発明では、記載の純化形式２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムとは、ほとんど純化の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを指す。特に純度は８０％より大きい、好ましいのは８５％より大きい、さらに好ましいのは９０％より大きい、特に好ましいのは９８％より大きな２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムである。具体的にいうと、記載の純化形式は２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの純度範囲は例えば９５％−９９％である。
【００５４】
非経口投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は注射で例えばボーラスで非経口投与のため調合できる。注射用の製剤は単位製剤でオプションの防腐剤入れのアンプルや複数回投与用容器に保存してもよい。非経口製剤はガラスやプラスチックで作ったアンプルや、使い捨ての注射器やマルチ瓶に保存してもよい。製剤は、例えば油性や水性のキャリアにおいている懸濁液、溶液、エマルジョンの形式で、さらに例えば、懸濁剤や安定剤および／または分散剤のアクセサリを含んでもよい。
【００５５】
例えば、非経口製剤は無毒非経口で好ましいシンナーや溶剤の中の無菌注射溶液または懸濁液であってもよい（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）。好ましいキャリアと使える溶剤は水、リンガーおよび等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、通常は無菌非発揮油を溶剤や懸濁培地としている。そのため、合成したグリセロールエステルおよびジアシルグリセロールを含み、軽度の非揮発性油をいずれも使ってもよい。また、非経口製剤の中にオレイン酸などの脂肪酸を使ってもよい。
【００５６】
その他、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は粉末式に調合してもよい。使用前に適合なキャリアで、例えば滅菌水で再建する。例えば、非経口投与に適合する２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は、体積毎に０．１％〜９０％重量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを含む無菌等張塩溶液を含んでもよい。例えば、溶液は約５％〜約２０％含有、より好ましいのは約５％〜約１７％、さらに好ましいのは約８％〜約１４％、特に好ましいのは約１０％の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム。注射部の痛みを軽減するため、溶液や粉末製剤は可溶化剤と局所麻酔薬、例えばリドカイン、を含んでもよい。その他の非経口化合物投与方法は本分野で既知され、尚且つ本発明範囲内である。
【００５７】
経口投与
経口投与に対し、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は錠剤やカプセルの形で、通常の方法で、薬学で認める賦形剤、例えば粘着剤や充填剤、潤滑剤、崩壊剤を使って調製する。
【００５８】
Ａ． 粘着剤
粘着剤はコーンスターチ、ジャガイモ澱粉、またはその他のでん粉、ゼラチン、天然および合成ゴム、例えばアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、ウェストレンゲ粉、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、第２２０８、２９０６、２９１０）、微結晶性セルロースおよびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。適合な微結晶性セルロースの形は、例えばＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３とＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０５で販売の材料（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｉｓｃｏｓｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｖｉｃｅｌ Ｓａｌｅｓ， Ｍａｒｃｕｓ Ｈｏｏｋ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに由来）。適合な粘着剤の例はＦＭＣ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎがＡＶＩＣＥＬ ＲＣ−５８１で販売している微結晶性セルロースとナトリウムカルボキシメチルセルロースの混合物である。
【００５９】
Ｂ． 充填剤
充填剤はタルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒または粉末）、ラクトース、微結晶性セルロース、粉末セルロース、グルカン結合剤（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、澱粉、アルファ化デンプンおよびその混合物を含むが、これらに限定されない。
【００６０】
Ｃ． 潤滑剤
潤滑剤はステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽鉱物油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクのエステル、硬化植物油（たとえば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油、大豆油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、エチルラウリン酸エチル、寒天およびその混合物を含むが、これらに限定されない。その他の潤滑剤は、例えば、固体シリカ（ＡＥＲＯＳＩＬ ２００， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡのＷ．Ｒ． Ｇｒａｃｅ Ｃｏ．生産）、合成シリカ縮合エアロゾル（Ｄｅａｕｓｓａ Ｃｏ． ｏｆ Ｐｌａｎｏ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ販売）、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのＣａｂｏｔ Ｃｏ．から販売されている発熱シリカ製品）とそれらの混合物を含む。
【００６１】
Ｄ． 崩壊剤
崩壊剤は寒天−寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスポビドン、ｐｏｌａｃｒｉｌｉｎカリウム、ナトリウム澱粉グリコール酸、ジャガイモやタピオカでんぷん、他の澱粉、アルファ化デンプン、他の澱粉、粘土、他の藻類、他のセルロース、ガムおよびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
錠剤やカプセルは本分野の公知のいずれの方法でコーティングする。もし本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は粘着剤や充填剤を使うと、約５０％〜約９９％重量の化合物に調合する。一方、約０．５％〜約１５％重量の崩壊剤、特に約１％〜約５％重量の崩壊剤が、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムとあわせて使用できる。潤滑剤はいずれの材料でもよい、用量は通常２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの約１％重量未満にする。固体経口製剤調製の技術や薬学で認める添加物はＭａｒｓｈａｌｌ，Ｓｏｌｉｄ Ｏｒａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（ＢａｎｋｅｒとＲｈｏｄｅｓ，Ｅｄｓ．），７：３５９−４２７（１９７９）に載っている。その他の不典型の製剤は本分野で公知するものである。
【００６３】
経口の液体製剤は溶液やシロップまたは懸濁液の形を使う。または、液体製剤は固体製品の形にしてもよく、使用する前に水や適合なキャリアで再建する。これらの液体製剤は通常の方法で薬学で認める添加物、例えば懸濁液（ソルビトールシロップ、セルロースの誘導体または水素化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）、非水性担体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）、および／または防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル対ヒドロキシ酸またはソルビン酸）で調製する。これらの製剤は適当の緩衝塩や調味料や着色剤や香味剤や甘味料を含んでもよい。経口の製剤は化合物の制御放出の実現するように調合してもよい。経口製剤は１０％〜９５％の化合物は好ましい。また、本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物は、通常方法で舌下腺投与用のタブレットやトローチを調合してもよい。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム医薬組成物のその他の経口投与方法は本分野で公知でありるもので、さらに本発明の範囲内である。
【００６４】
制御放性投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの活性の延長と投与頻度減少のため、制御放性（徐放性）製剤を調合する。制御放性製剤は発効タイミングやその他の特徴への影響に使ってもよい、例えば血液化合物のレベル、副作用の発生に支障する。
【００６５】
制御放性製剤は最初から必要効果の一定量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを放出させ、徐々に連続で残りの２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの量を放出させることで、長時間で治療効果を維持する。体内で不変に近い化合物状態を保持するため、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムが一定のスピードで製剤から放出させ、体内から代謝および／または分泌した２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを代わる。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの制御放出は多種の誘導要素、例えば、ＰＨ変化や、温度変化、酵素、水またはその他の生理条件や分子で刺激される。
【００６６】
制御放出システムは、特定の臓器や腫瘍へインスリンや化学療法剤の転送と類似している方式で化合物の転送に使う、例えば注射ポンプを含む。このようなシステムを使うと、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは通常分解可能・生体適合の高分子インプラントとあわせて使用する。選択される位置にコントロールされた時間内で２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを放出する。高分子インプラントはポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニルおよびその共重合体と組合を含む。また、制御放出システムは治療目標の付近においってもよいので、全身用量の一部しか使わない。
【００６７】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは、本分野で公知でありた他の制御放出方法や投与装置を使ってもよい。例えば、ＨＰＭＣ、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透膜、浸透システム、多層コーティング、粒子、リポソーム、微小球など、または上記組合が、異なる比例で必要な放出スペクトルを提供する。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの他の制御放出投与方法は本分野で公知であり、なお本発明の範囲内である。
【００６８】
吸入投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは吸入で直接肺へ使用できる。吸入投与に対しては、いろいろ装置で便利に２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを肺に輸送できる。例えば、計量吸入器（”ＭＤＩ”）、使われる缶は低沸点推進剤が付き、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適合な気体で、直接肺に化合物を輸送できる。ＭＤＩ装置は数多くの仕入先からもらえる、例えば３Ｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ、Ｆｏｒｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＰｌｏｕｇｈとＶｅｃｔｕｒａ。
【００６９】
また、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）装置を使って肺へ化合物を使用してもよい。ＤＰＩ装置は通常一種の機構を使い、例えば、爆発の気体が容器内で雲の形の乾燥粉末を生じ、患者に吸入される。ＤＰＩ装置も本分野で公知であり、多くの仕入先から購買できる、例えばＦｉｓｏｎｓ、Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＱｄｏｓｅおよびＶｅｃｔｕｒａ。通用しているのは多用量ＤＰＩ（“ＭＤＤＰＩ”）システム、一個以上で治療用量を使っても許される。ＭＤＤＰＩ装置は例のＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅ、ＩＶＡＸ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ、ＳｋｙｅＰｈａｒｍａおよびＶｅｃｔｕｒａのような会社から入手できる。例えば、吸入器と吹き込み器のゼラチンカプセルとカートリッジは、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムと当該システムに適用する粉末マトリックス、例えば乳糖やでんぷんを含有する粉末混合物に調製できる。
【００７０】
肺へ化合物を使用するもう１つのタイプの装置はＡｒａｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが提供したスプレー装置。スプレー装置システムはごく小さなノズルで液体化合物を噴霧化して、直接肺に吸入される。例えば、噴霧器装置で肺に化合物を使用する。噴霧器は超音波を使えば、液体化合物製剤からエアロゾルを生じ、吸入しやすい細かい顆粒にする。噴霧器の製品はＳｈｅｆｆｉｅｌｄ／Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｌｔｄ．、ＡｖｅｎｔｉｓとＢａｔｅｌｌｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより提供する装置を含む。
【００７１】
もう１つの実験で、電流体力学（“ＥＨＤ”）エアロゾル装置で肺に化合物を使用する。ＥＨＤエアロゾル装置は電気で液体化合物の溶液や懸濁液を噴霧する。ＥＨＤエアロゾル装置で肺に当該化合物を使用する時に、化合物製剤の電気化学性質は重要なデータとして最適化しなければならない。この最適化は本分野通常操作で行われる。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの他の肺に投与方法は本分野で公知であり、なお且つ本発明の範囲内である。
【００７２】
噴霧器や液体噴霧装置とＥＨＤエアロゾル装置に適用する液体２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム製剤は、通常２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムと薬学で認めるキャリアを含む。代表的な案で、薬学で認める液は、例えばアルコール、水、ポリエチレングリコールまたはパーフルオロカーボン。また別の物質をオプションして化合物溶液や懸濁液のエアロゾル性質を変更できる。例えば、この物質は液体で、たとえばアルコール、グリコール、ポリエチレングリコールまたは脂肪酸。エアロゾル装置に適用する液体化合物溶液や懸濁液を調製する他の方法は本分野で公知でありる。
【００７３】
貯蔵式投与
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは貯蔵式製剤に調製してもよい。このような長時間作用型製剤は注入（皮下または筋肉内）や筋肉注射で投与する。そのため、化合物は好適なポリマーまたは疎水性材料、例えば、好ましい油やイオン交換樹脂中のエマルジョン、または難溶性の誘導体としても難溶性の塩類と一斉に調製する。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの他の貯蔵式投与方法は本分野で公知であり、なお且つ本発明の範囲内である。
【００７４】
局所投与
局所投与に対しては、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムはキャリアと組み合って、実効線量を輸送する。必要な活性によって、実効線量は、例えば１．０μＭ〜１．０ｍＭ。本発明の一方では、局所投与の医薬組成物は皮膚にも使える。キャリアとしては、軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、発泡、エアゾール、坐剤、パッドまたはスティックゲルを含むが、これらに限定されない。
【００７５】
局所製剤は眼科で認める賦形剤、例えばバッファ生理食塩水、鉱物油、植物油例えばコーン油やピーナッツ油、ワセリン、Ｍｉｇｌｙｏｌ １８２、アルコール溶液またはリポソームやリポソームのような製品の中に、実効線量の化合物を含んでもよい。これらの化合物はどれも防腐剤、酸化防止剤、抗生物質、免疫抑制剤とその他の悪い影響がない生物学や薬学で有効な製剤を含んでもよい。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムのその他の局所投与方法は本分野で公知であり、なお且つ本発明の範囲内である。
【００７６】
その他の投与システム
その他の投与システムは本分野で公知であり、本発明の化合物の使用に使えるものである。尚且つ、その他の投与システムと連合や／または変更で、本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの投与を最適化できる。
【００７７】
また、本発明は必要がある患者に治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムやそれを含む医薬組成物を含み、アルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療の方法に関する。投与ルートは非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これに限定されない。
【００７８】
本発明で、治療実効線量２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは０．５−２００ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれも良い。好ましいのは１−１５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましいのは２−１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましいのは３−５０ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは４−３５ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは５−２０ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれも良い。
【００７９】
治療実効線量の確認原則
本発明で記載の「治療実効線量」とは、受験者の病気や病症の性質や重大度によって、特定の受験者に使用する時に、必要の治療効果を持っている線量、例えば、目標病気や病症を治療、予防、抑制または少なくとも一部防止や一部予防への必要量。
【００８０】
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの毒性と治療効果は細胞培養物や動物実験中に、ＬＤ５０（５０％致死用量群）とＥＤ５０（５０％有効用量群）測定のスタンダード薬学方法で確定できる。毒性と治療効果との用量比例は治療指数として、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で表示される。
【００８１】
細胞培養実験と動物研究中にできたデータは、人間やその他の哺乳動物向け調製する時の用量範囲として使える。２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの用量は、ＥＤ５０の循環血漿やその他の体液濃度の範囲内を含み、ごく少ない毒性や毒性なしのは好ましい。
【００８２】
当該用量は使用する製剤や投与ルーとによって、この範囲内で変化する可能性がある。本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムに対しては、治療実効線量は最初から動物実験で推定できる。動物モデルで用量を設計して、ＩＣ５０も含む測定した循環血漿濃度範囲に入る。これらの情報で人間やその他の哺乳動物に有効用量を精確に確定できる。血漿の中の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムのレベルは高性能液相分析で測定する。
【００８３】
薬学で認めるキャリアと組み合って生じた単一剤形の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの用量は、治療宿主と投与パターンによって異なる。当業者は、各製剤の個別用量の中に含んだ２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの単位含有量本体は実効線量になる必要がないことは事前に理解するであろう。個別用量の数個使用で需要な実効線量にいたるからだ。用量の選択は使用する製剤と、治療する病気と当業者の判断によって決める。
【００８４】
本発明の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムで病気や病症を治療する用量の案はを多種の要素を考えてから選択する。それは患者のタイプ、年齢、体重、性別、飲食と医学状況、投与ルート、薬理学の考慮要素、例えば活性、有効性、使用する化合物の具体の薬物代謝動力学と毒理学分布を含んで考え、２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム投与システムを使うかどうかを決める。そのため、実際に使用する用量案は受験者の間でも大違いがある。
【００８５】
専門用語と略称
ｄｌ−ＰＨＰＢ、ＰＨＰＢは２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムを指す。
【００８６】
ＳＯＤはスーパーオキシドジスムターゼを指す。
【００８７】
ＭＤＡはマロンアルデヒドを指す。
【００８８】
ＣｈＡＴはコリンアセチルトランスフェラーゼを指す。
【００８９】
ＡｃｈＥはアセチルコリンエステラーゼを指す。
【００９０】
ＡＴＰａｓｅはアデノシントリホスファターゼを指す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストで逃避潜時期間に対する影響。すべてのデータは平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１７−２０）。＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術（ｓｈａｍ）と比較する；＊Ｐ＜０．０５は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２】永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストで典型なサーチ策略。Ａ：エッジ式；Ｂ：ランダム式；Ｃ：トレンドスタイル式；Ｄ：リニア式。
【図３】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路プラットフォーム探査テストでターゲット象限活動タイミングと一回目プラットフォーム通る時間に対する影響。図Ａはターゲット象限活動タイミングの変化を表示する、図Ｂは一回目プラットフォーム通る時間の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１７−２０）。＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図４】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳組織生物化学に対する影響。図Ａは皮質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性の変化を表示する、図Ｂは皮質マロンアルデヒド（ＭＤＡ）含有量の変化を表示する。図Ｃは海馬コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝５−８）。
【００９２】
＃＃＃Ｐ＜０．００１は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図５】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳皮質ニューロン形態に対する影響（ＨＥ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図６】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳海馬ＣＡ１エリアニューロン形態に対する影響（ＨＥ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図７】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳海馬ＣＡ３エリアニューロン形態に対する影響（ＨＥ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図８】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳梁形態に対する影響（Ｋ−Ｂ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図９】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの視神経管形態に対する影響（Ｋ−Ｂ染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。４００倍。
【図１０】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳海馬ＧＦＡＰ陽性アストロサイト数量に対する影響。（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群；Ｃ：ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群；Ｄ：ＰＨＰＢ１３ｍｇ／ｋｇ群；Ｅ： ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群；Ｆ：ＰＨＰＢ１２９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１１】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの視神経管ＧＦＡＰ陽性アストロサイト数量に対する影響。（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群；Ｃ：ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群；Ｄ：ＰＨＰＢ１３ｍｇ／ｋｇ群；Ｅ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群；Ｆ： ＰＨＰＢ１２９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１２】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットの脳組織ＧＦＡＰ陽性アストロサイト数量に対する影響。図Ａは皮質を表示する、図Ｂは海馬を表示する、図Ｃは脳梁を表示する、図Ｄは視神経管を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝４）。＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図１３】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット皮質の脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ｓｈａｍ：偽手術群；Ｖｅｈｉｃｌｅ：溶媒対照群。２００倍。
【図１４】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット海馬のＣＡ１エリアの脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群。Ｃ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１５】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット海馬のＣＡ２エリアの脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群。Ｃ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１６】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット海馬のＣＡ３エリアの脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）分布と含有量に対する影響（免疫組織化学染色）。Ａ：偽手術群；Ｂ：溶媒対照群。Ｃ：ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群。２００倍。
【図１７】経口ｄｌ−ＰＨＰＢは永久に頚部両側の総動脈を結紮したラット脳組織脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）含有量に対する影響。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝４）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図１８】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＡβ（２５−３５） 誘導した認知症ラットが水迷路ナビゲーションテストでの潜伏期間に対する影響。すべてのデータは平均±標準誤差で表示する（ｎ＝７−９）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図１９】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＡβ（２５−３５） 誘導した認知症ラットが水迷路プラットフォーム探査テストで空間位置記憶障害対する影響。図Ａはターゲット象限活動タイミング百分比の変化を表示する、図Ｂは一回目プラットフォーム通る時間の変化を表示する。すべてのデータは平均±標準誤差で表示する（ｎ＝７−９）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）と比較する；＊Ｐ＜０．０５は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２０】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＡβ（２５−３５） 誘導した認知症ラットの脳組織生物化学に対する影響。図Ａは皮質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性の変化を表示する、図Ｂは皮質マロンアルデヒド（ＭＤＡ）含有量の変化を表示する。図Ｃは皮質コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）活性の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝７−９）。＃Ｐ＜０．０５は偽手術（ｓｈａｍ）群と比較する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２１】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスがステップダウンテストで受けた電気ショック回数と電気ショック潜伏期間に対する影響。図Ａは電気ショック回数の変化を表示する、図Ｂは電気ショック潜伏期間の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（Ｄｕｎｎｅｔｔ検査）。
【図２２】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスが水迷路実験でブラインドサイドに入る回数とステップを見つける潜伏期間に対する影響。図Ａはブラインドサイドに入るミスの回数の変化を表示する。図Ｂは潜伏期間の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（Ｄｕｎｎｅｔｔ検査）。
【図２３】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスの脳組織スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性とマロンアルデヒド（ＭＤＡ）含有量に対する影響。図Ａは海馬ＳＯＤ活性の変化を表示する、図Ｂは海馬ＭＤＡ含有量の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２４】経口ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウスの脳組織コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）と、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）および皮質ミトコンドリア・アデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）活性に対する影響。図Ａは海馬ＣｈＡＴ活性の変化を表示する、図Ｂは海馬ＡｃｈＥ 活性の変化を表示する、図Ｃは皮質ミトコンドリアＡＴＰａｓｅ活性の変化を表示する。すべての数値は平均±標準誤差で表示する（ｎ＝１１−１４）。＊Ｐ＜０．０５は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する（ＬＳＤ検査）。
【図２５】実施例１の実験プロセス。
【図２６】実施例２の実験プロセス。
【図２７】実施例３の実験プロセス。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
実施例
下記の実施例は具体的本発明の応用を示すが、本実施例は本発明の使用範囲には限らない。
【００９４】
実施例１
慢性脳虚血モデル研究：ｄｌ−ＰＨＰＢが供血不足のラットの最近記憶と空間識失調を改善できる
材料と方法
１、製剤と薬品
ｄｌ−ＰＨＰＢは本所合成室より提供し、化学純度は９８．５％（ＨＰＬＣ法で測定）、蒸留水で調製した。ピラセタム錠、天津金世製薬有限公司生産。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）キット、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）キット、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）キット、クマシーブリリアントブルータンパク質測定キットとも南京建成生物工程研究所より購入した。ニュートラルレッド、固体ブルーはＳｉｇｍａ会社から購入。炭酸リチウムは北京化学製剤会社生産。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は北京中山生物技術有限公司から購入。グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）ポリクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎ会社から購入。脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）ポリクローナル抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ会社から購入。二次抗体、ビオチン化抗マウス ／ウサギＩｇＧ；三次抗体、ホースラディッシュ酵素標記のストレプトアビジンアビジン、ＤＡＢカラーキット；抗体希釈液とも北京中杉金橋生物技術有限公司から購入。
【００９５】
２、器具
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路オートモニターは中国医学化学院薬物研究所より開発したものである。ＭＱＸ ２００タイプのマイクロプレートリーダーはアメリカＢｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの製品。ＩＲ２１３５タイプのパラフィンマイクロトームはドイツＬｅｉｃａ会社の製品、６２０−Ｅタイプの恒温冷凍マイクロトームはイギリスＳｈａｎｄｏｎ会社の製品、Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ ８０ｉ自動顕微撮影システムは日本Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎの製品である。
【００９６】
３、２−ＶＯモデル設立
永久にラットの頚部両側の総動脈の結紮で、連続の脳低循環モデルを作る。１０％の抱水クロラールで腹部注射（ｉ．ｐ．）でラットを麻酔にして、仰臥位で手術台に固定し、体温を３６．５±０．５℃に維持させる。ヨードフォアで手術部位を消毒して、正中頸部に沿って皮膚および皮下組織を縦方向で切開し、左右の頸動脈を引き離し、５−０の手術シルクで結紮する。切り口を縫合し、動物をかごに入れる。手術後三日間は連続で毎日ｉ．ｐ．ペニシリン２０万単位／匹を注入する。
【００９７】
４、グループ分けと実験設計
ラットをランダムに６群に分け、群ごとに２０匹にする。（１）偽手術群：頚部両側の総動脈の結紮をしない以外に、ほかの操作は低循環群と同じ；（２）溶媒対照群：経口で蒸留水；（３）ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群；（４）ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇ群；（５）ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群；（６）ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群。手術後十日間で薬物や溶剤を投与する。毎日一回、２１日間続く。２５−３０日目に、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路法でラットの空間学習記憶能力を測定する。行動的な実験は全部で投与後４０分で行われる。動物は３０日目で殺して、脳組織生物化学測定および病理学検査を行う。群の間で実験の結果を比較する。（実験のプロセスは図２５を参考）
５、水迷路実験
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路は金属製の円筒形タンク（６０ｃｍ高さ、径１２０ｃｍ）とオートショー、モニター、記録装置および安全島（径１０ｃｍのプラットフォーム）からなる。事前にタンクの壁とプラットフォームを黒いテープで真っ黒にして、水の色が黒く見えるようにし、水面はプラットフォームより１５ｍｍ高くして、これで動物が聴覚、視覚、嗅覚でプラットフォームに登ることができなくなるので、動物が空間位置に対する記憶能力を測定できる。水温は２５士１℃に保持して、タンクを４個の象限（東北、東南、西北、西南）に分ける。プラットフォームは西北象限のセンターに置く。毎匹ラットの水泳活動をモニターで観測し、記録できるので、コンピューターとリンクして分析する。ナビゲーションテストは五日間連続でやる。それぞれのラットは毎日東南と西南象限のセンターから、頭を壁に向かって水に入れて、２回のプラットフォーム探しの訓練をやらせる。２回の訓練の間に１０分間を間隔にする。プラットフォームを見つけるタイミング（潜伏期間）、サーチ策略と水泳スピードこの三項目を記録し、毎日の２次実験結果を平均にする（サーチ策略除外）。もしラットは６０秒以内にプラットフォームを見つけなかったら、潜伏期間を６０秒とする。６０秒以内にプラットフォームを見つけるかどうかに関わらず、ラットをプラットフォームに１０秒に逗留させる。一回目の実験が始まる前にラットをプラットフォームにおいて、順応させる。訓練の進行につれて、各群ラットが安全島を見つける潜伏期期間が短縮していく。実験の結果は水泳のスピードでラットが実験中の体力の変化を反映できる。その他の２項目指標はラットが空間位置に対する学習記憶能力を反映する。最後の訓練が終わってから、空間探査実験を実施する。プラットフォームをはずして、ラットにプラットフォーム探しに６０秒水泳させて、各象限でかかる時間および第一回目標を通る時間を記録する。もしラットが元のプラットフォームある象限に止まる時間が長くて、第一回目標を通る時間が短ければ、ラットがすでにこの空間目標に記憶が残っていることを証明した。
【００９８】
サーチ策略を４類に分け：（１）エッジ式、ラットがずっとタンクのエッジを沿い、探す動機がない；（２）ランダム式、ラットが安全島を探すときに明確な方向がない；（３）トレンドスタイル式、ラットがすでに安全島の大よその位置がわかり、安全島を見つける前にカーブが４回未満；（４）リニア式、ラットがすでに安全島の位置を覚えて、直接安全島に向く。
【００９９】
６、ＳＯＤ、ＭＤＡとＣｈＡＴの検査測定
行動学実験が終わってから、ラットの頭部を切断し、氷浴中に皮質および海馬を分離して、濾紙で乾燥させ、重量を測る。重量体積比１：９の通り、４℃予冷の生理食塩水をいれ、内接式パルプリファイナーで１０％の組織ホモジネートを調製し、低温低速遠心１０分間して、上清を取り、沈殿物を廃棄する。
【０１００】
クマシーブリリアントブルータンパク質およびＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴの測定は全部で南京建成生物工程研究所のキット説明書で行う。
【０１０１】
７、病理学と免疫組織化学検査測定
毎群はランダムで４匹の動物を選び、行動学実験後１０％抱水クロラールで麻酔して、皮膚、胸腔を切って、心臓を充分露出させ、心膜を開き、７番の注入針で動脈方向に心尖に差し込んで、生理食塩水を注入すると同時に、右心耳から右心房を切って、１５−２０分（２００−３００ｍｌ）を注入し、流出液が清くなるまで、それで予冷の４％パラホルムアルデヒド−３％ショ糖に換え、定着剤を１５−２０分（１５０−２００ｍｌ）を徐々に速度をゆるめながら、動物が全身硬直し肝臓が白くなるまで引き続き注入する。それから頭を取り、ナイフで前部の終脳と後部の小脳を切って、４％パラホルムアルデヒド−３％ショ糖を入れてから、定着剤で４８時間続けて固定する。標本が完全に沈下した後、新鮮な定着剤に変更して、４℃で冷蔵する。片側の脳半球はパラフィン切片、固定、埋め込みを行い、海馬の位置に冠状切片（厚さ５μｍ）をして、ＨＥとＫＢ染色に使う。もう片側の脳半球は恒温冷凍マイクロトームで冷凍切片をして、切片位置と方式は前と同じ、ＯＣＴ埋め込み、厚さは４０μｍ、動物毎匹に４枚を切って、ＧＦＡＰとＢＤＮＦ免疫組織化学染色に使う。
【０１０２】
８、統計分析
すべての結果は平均±標準誤差で表示する。水迷路ナビゲーションテストで各指標の差異比較は繰り返し測定の双方向分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。水迷路空間探査実験、生物化学測定各項指標および免疫組織化学の半定量分析は全部単方向分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。群間の差異はｐｏｓｔ ｈｏｃ ＬＳＤ（水迷路ナビゲーションテストのサーチ策略の比較はＲｉｄｉｔ分析を採用する）を採用する。Ｐ＜０．０５の場合は顕著な差異であると判断する。
【０１０３】
結果
１、ｄｌ−ＰＨＰＢは脳低循環ラットの学習記憶に対する改善効果
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路実験は動物の空間学習と最近記憶能力を測定する経典実験である。本研究では、ラットが慢性脳虚血後の１ヶ月当たりに行う。実験は２つに分け、１つはナビゲーションテスト、もう１つは空間探査実験を行う。ナビゲーションテストで、ラットがプラットフォームを見つける時間（潜伏期間）と、サーチ策略と水泳スピードを含む３項の指標を観察した。潜伏期間から見ると、訓練回数の増加につれて、各群ラットの潜伏期間とも徐々に短縮していくにつれ、各群のラットはプラットフォームの位置に対する記憶が精確になることが示された。翌日から、溶媒対照群ラットの潜伏期間は偽手術群より顕著に長くなり、その間の差も拡大していく（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）ことは、慢性脳低循環はラットの学習記憶能力に顕著な損害を掛けた。しかし、それはモデルの成功とも証明した。前の三日間で、各投与群の潜伏期間は溶媒対照群と比べ、顕著な短縮がないが、四日目から、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群はピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間は溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より顕著に短くなる。五日目で、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群と１２９ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間も溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より短いのは、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇ、ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇとも慢性脳低循環ラットの学習記憶能力の減退に顕著な改善効果を持っているが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇが顕著な治療効果を持っていない（図１）ことを証明した。そのため、潜伏期間から見ると、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇ、ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇとも脳低循環ラットの空間学習記憶障害を顕著に改善できる。
【０１０４】
ラットがプラットフォーム探す策略から分析すると、訓練回数の増加につれて、動物はエッジ式やランダム式策略の回数も減少していき、トレンドスタイル式とリニア式策略の回数が増加していく。ｌｅｖｅｌ ｄａｔａ ｏｒｄｅｒｉｎｇで分析すると、最後の日で測定するときに、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは溶媒対照群と比べ、顕著な差異（Ｐ＜０．０１）が出てくる、すなわち前者はリニア式やトレンドスタイル式策略の回数は後者より多い、その他の各薬や各用量はリニア式やトレンドスタイル式策略の回数は溶媒対照群より多くが、統計学上無意味である。ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは低循環ラットが空間位置の記憶能力を向上できることを証明した（図１、表１と２）。
【０１０５】
それと同時に、ナビゲーションテストで、実験がラットの体力に影響がないかを判断するため、ラットの水泳スピードを測定した。結果によって、実験の過程中に、各群ラットの水泳スピードがほとんど変化がないことと、群の間に差異もない（データ未提出）ことを発見した。これは、一方で、本モデルのやり方はラットの活動能力に影響がなく、もう一方で、水迷路実験はラットの活動能力にも影響がないということを証明した。そのため、この実験方法は体力が妨害にならないため、よりよいラットの学習記憶能力を測定できる。
【０１０６】
ナビゲーションテストが終わってから、プラットフォーム探査実験を行い、安全島（プラットフォーム）をはずして、ラットが目標象限での活動時間と第一回目標を通る時間を記録することで、ラットが安全島に対する空間記憶ができたかどうかおよび記憶の強度を測定する。結果によっては、偽手術群のラットは目標象限での活動時間は溶媒対照群（Ｐ＜０．０１）より長い、ｄｌ−ＰＨＰＢ１２９ｍｇ／ｋｇ以外に、各投与群のラットは目標象限での活動時間も溶媒対照群より長い、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群のラット（Ｐ＜０．００１）（図３Ａ）。一回目に目標を通る時間から見ると、偽手術群は溶媒対照群（Ｐ＜０．０１）より短い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群も溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より短い。これはｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラットの空間学習記憶障害を改善できる、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは一番顕著である（図３Ｂ）。
【０１０７】
結論として、水迷路ナビゲーションテストの２つの主要指標（潜伏期間とサーチ策略）およびプラットフォーム探査実験の目標象限の時間から見れば、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３、３９、１２９ｍｇ／ｋｇこの３つの用量は慢性脳低循環ラットの空間学習と最近記憶障害を改善できる。効果強度はｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは一番強い、次がｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇ群が一番弱い。それと同時にｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇは五倍用量のピラセタムと比べ、顕著な差もない。
【０１０８】
表１． ｄｌ−ＰＨＰＢが永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストでサーチ策略に対する影響
【０１０９】
表２． ｄｌ−ＰＨＰＢが永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストでサーチ策略に対する影響
【０１１０】
表１と２は、経口ｄｌ−ＰＨＰＢが永久に頚部両側の総動脈を結紮したラットが水迷路ナビゲーションテストでサーチ策略に対する影響。データはサーチ策略の回数で表示する（ｎ＝１７−２０）。＃Ｐ＜０．０５， ＃＃Ｐ＜０．０１は偽手術と比較、＊＊Ｐ＜０．０１は溶媒対照群と比較（Ｒｉｄｉｔ分析）。Ｍ：エッジ式；Ｒ：ランダム式；Ｔ：トレンドスタイル式；Ｌ：リニア式。
【０１１１】
２．ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性、ＭＤＡ含有量とＣｈＡＴ活性に対する影響
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つであり、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。ラットが慢性脳虚血の一ヵ月後、皮質のＳＯＤ活性が向上し、溶媒対照群ＳＯＤ活性は７７．３９±８．７０Ｕ／ｍｇタンパク質で、偽手術群より３５．０３±５．２０Ｕ／ｍｇタンパク質高い（Ｐ＜０．００１）。投与治療２１日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３と３９ｍｇ／ｋｇ群のＳＯＤ活性は５３．９２±４．３２、４８．８６±８．９７Ｕ／ｍｇタンパク質であり、溶媒対照群より低い（Ｐ＜０．０５）。ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群が５１．８３±８．８８Ｕ／ｍｇタンパク質で、溶媒対照群よりも低い（Ｐ＜０．０５）。だが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇが当該酵素の活性への影響は顕著な意味がない（図４Ａ）。海馬では、慢性脳虚血はＳＯＤ活性の下降や向上には影響がなく、各薬や各用量も当該酵素の活性に顕著な影響がない（データ未提出）。
【０１１２】
ラットが慢性脳低循環後の一ヶ月、皮質内ＭＤＡ含有量が顕著に向上した（偽手術群は０．６９±０．０６ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、溶媒対照群は１．３１±０．２２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、Ｐ＜０．００１）。投与三週後、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３、３９、１２９ｍｇ／ｋｇ群のＭＤＡ含有量はそれぞれ０．６０±０．０６、０．７７±０．１０、０．６７±０．０７ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質で、溶媒対照群より顕著に低い（Ｐ＜０．０１あるいはＰ＜０．００１）。ピラセタム６００ｍｇ／ｋｇは顕著な影響がない（図４Ｂ）。海馬では、慢性脳虚血はＭＤＡ含有量の変化がなく、各薬や各用量もそれに顕著な影響がない（データ未提出）。
【０１１３】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。ラットが永久に頚部両側の総動脈を結紮した一ヵ月後、海馬ＣｈＡＴ活性が顕著に下降した。偽手術群より２４％下降した。投薬２１日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇが低循環ラット海馬のＣｈＡＴ活性（Ｐ＜０．０５）を顕著に向上し、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇとピラセタム６００ｍｇ／ｋｇも向上の。しかしｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇが顕著な効果がない（図４Ｃ）。皮質では、慢性脳虚血はＣｈＡＴ活性への影響がなく、各薬や各用量もそれに対する影響は、溶媒対照群と比べ、顕著な差がない（データ未提出）。
【０１１４】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳低循環ラット皮質のＳＯＤ活性を下げることができる。皮質のＭＤＡ含有量の向上にもよい下降効果を持っている。これらの効果はｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇがもっと強い。当該薬は慢性脳低循環ラットの脳組織代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直せると、脂質過酸化産物を下げることと、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復されることが示された。また、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇは慢性脳低循環ラットの海馬のＣｈＡＴ活性を向上し、コリン作動性神経機能を改善する可能性が高い。
【０１１５】
３、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織病理に対する影響
（１）ＨＥ染色
ＨＥ染色は異なる色で細胞質と細胞核を表示するので、細胞の姿をはっきり見える。本研究の溶媒対照群が皮質ニューロンが収縮、深い色素と細胞核が明らかでない現象を見え、海馬のＣＡ１、ＣＡ３エリアも類似な変化が出たが、程度は軽い、海馬ＣＡ２エリアは顕著な変化がない。ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇは皮質、海馬ＣＡ１、ＣＡ３エリアのニューロン形態異常を顕著に改善でき、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇは皮質と海馬ＣＡ１エリアのニューロン形態異常を改善でき、ｄｌ−ＰＨＰＢ１３ｍｇ／ｋｇは皮質のニューロン形態異常を軽微に改善できる（図５−７）。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環で起こった皮質・海馬ニューロン損傷に保護や治療作用を持っていることが表明した。
【０１１６】
（２）Ｋ−Ｂ染色
Ｋ−Ｂ染色はニューロン髄鞘が完備であるかどうかを反映でき、さらに神経繊維の形態学の変化を反映できる。本実験では、溶剤対照群のラット脳梁と視神経管が明らかな空胞変性および神経繊維障害が出たことが発見した。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は脳梁の病理変化に対する改善が顕著で、空胞変性が減少し、神経繊維の配置も少し回復していた。その内、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果は一番強い、次がｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇが一番弱い（図８）。ｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量は視神経管の病理変化へも改善があるその内、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果はもっと強い（図９）。上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環で起こった脳梁と視神経管の損傷に明らかな保護作用を持っていることが表明した。
【０１１７】
４、ｄｌ−ＰＨＰＢが低循環ラット脳組織ＧＦＡＰ陽性アストロサイトに対する影響
脳低循環で起こった組織学異常は空間学習記憶損傷の基礎になるかもしれない。その内、白質が一番早く損傷され、それと共に反応性アストロサイトの増加とミクログリアの活性化が出る。グリア酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）免疫組織化学染色は活性化したアストロサイトの標識化に使用する。毎枚切片から選んだ同じエリアを２−３枚の写真を取って、写真の一定視野の中のアストロサイトの数を記録して、その平均値を当エリアの値として計算する。皮質・海馬・脳梁と視神経管四箇所を選び観察対象にした。皮質にて、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数（１６．９±６．９）は偽手術（９．９±２．０）より多いが、標準誤差が大きすぎるので統計学上の意味がなくなる。ｄｌ−ＰＨＰＢ投与の三群およびピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群は投与２１日後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は明らかに溶剤対照群より少ない、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群の効果は一番顕著である（Ｐ＜０．０１）（図１２Ａ）。海馬にて、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数（２６．８±５．５）は偽手術群（１２．０±３．０，Ｐ＜０．０１）より明らかに多い。各投与群の当該指標値も溶剤対照群（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）より明らかに低い、特にｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇ群はもっと顕著である（図１０と１２Ｂ）。脳梁にて、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数は偽手術より顕著な差がないが、ｄｌ−ＰＨＰＢ３９ｍｇ／ｋｇ群の当該指標値は溶剤対照群（Ｐ＜０．０５）より低い（図１２Ｃ）。視神経管にで、溶剤対照群のＧＦＡＰ陽性細胞数（４．４±０．７）は偽手術群（０．８±０．３，Ｐ＜０．０１）より明らかに多い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９、１２９ｍｇ／ｋｇおよびピラセタム６００ｍｇ／ｋｇ群が動物２１日間投与した後、ＧＦＡＰ陽性細胞数は溶剤対照群（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）（図１１と１２Ｄ）より明らかに少ない。上記のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢが慢性脳低循環ラット脳組織損傷と、活性化したアストロサイト量を明らかに軽減、減少できる。特に海馬、視神経管と皮質で、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果が一番強いことが多くて、次はｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇは一番弱い。
【０１１８】
５、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳低循環ラット脳組織ＢＤＮＦの分布面積と含有量に対する影響
脳源性神経成長因子（ＢＤＮＦ）はニューロンの生存と発育を維持し、正常な動物の脳組織に存在する。虚血の早期で高く表示できるが、虚血２４時間以降は通常下降すると表示する。ＢＤＮＦ免疫組織化学染色面積から見れば、皮質と海馬にて、溶剤対照群と偽手術群と顕著な差がなく、投与群と溶剤対照群とも顕著な差がない（データ未提出）。だが、染色密度から見れば、溶剤対照群と偽手術群と比べると、皮質でも海馬でも、ＢＤＮＦとも顕著に減少し、投与群と溶剤対照群と比べると、皮質ではｄｌ−ＰＨＰＢ３つの用量ともＢＤＮＦの表示を増加できる。その内、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇの効果が一番強い、次はｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ、ｄｌ−ＰＨＰＢ １３ｍｇ／ｋｇは一番弱い（図１３と１７）。海馬のＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３エリアで、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇがＢＤＮＦの表示（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）を明らかに増加できるが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇがＢＤＮＦ増加の勢いしかないので、統計学上の意味がない（図１４−１７）。染色密度とＢＤＮＦの含有量とは正比例するが、染色面積はある程度で染色の深さを考慮しないので、染色密度は染色面積よりＢＤＮＦの含有量をもっと精確的に反映できる。以上のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢは慢性脳虚血脳組織のＢＤＮＦの含有量を増加できることを証明した。
【０１１９】
実施例２、β−アミロイドペプチド認知症モデルでの研究：ｄｌ−ＰＨＰＢがβ−アミロイドペプチド（２５−３５）で起こったラット記憶と空間識失調を改善できる
材料と方法
１、製剤と薬品
ｄｌ−ＰＨＰＢは本所合成室より提供し、ＰＢＳで調合する。Ａβ（２５−３５）はＳｉｇｍａ会社から購入。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）キット、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）キット、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）キット、クマシーブリリアントブルータンパク質測定キットとも南京建成生物工程研究所より購入した。
【０１２０】
２、器具
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路オートモニターとマイクロプレートリーダーは同上。
【０１２１】
３、モデル設立
雄Ｗｉｓｔａｒラット、１０ヶ月、体重は６００ｇあたり、かごに２匹、室温は２３±１℃に維持し、自由に飲食させる。ナトリウムペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ）でラットを麻酔して、腹ばいで定位装置に固定し、頭のてっぺんの皮膚を切って、頭頂骨を露出させ、ＰａｘｉｏｎｓとＷａｔｓｏｎラット脳立体定位マップによって、歯科ドリルで前の泉門後ろの１．２ｍｍ、中間線右１．５ｍｍのところで頭蓋骨と硬膜をあけ、微量注射器で垂直で４．０ｍｍの深さを差込、１５ｎｍｏｌ（容積が５μｌ）集合態のＡβ（２５−３５）をゆっくり注入する。対照群は５μｌの溶剤ＰＢＳしか注入しない。手術後は毎日腹腔にペニシリン２０万単位を四日間連続で注射する。
【０１２２】
４、群分けと実験設計
ラットをランダムに４群に分け、群ごとに１０匹にする。偽手術群：脳室に溶剤ＰＢＳしか注入しない。モデル群、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇ群：脳室にＡβ（２５−３５）＋溶剤を注入する。手術後の第一日から薬を投与する（偽手術とモデル群は蒸留水を飲ませる）。水迷路ナビゲーションテストは手術後の第９−１２日に行い、１３日目からプラットフォーム探査実験を行い。動物が１４日目に投与４０分間後殺し、頭部を切断し生物化学測定を行う。行動学実験は全部で実験前の４０分で投与する。（実験のプロセスは図２６に参考してください）
５、水迷路実験
ｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）後の第９−１２日に水迷路ナビゲーションテストを行い、方法は前と同じ。１３日目にプラットフォーム探査実験を行い、プラットフォームをおろし、ラットにプラットフォーム探しに自由に３０秒水泳させて、各象限でかかる時間および第一回目標を通る時間を記録して、目標象限で活動時間の百分比を計算する。もしラットが目標象限で活動時間の百分比が大きければ、第一回目標を通る時間が短ければ、ラットがすでにこの空間目標に記憶が残っていることを証明した。
【０１２３】
６、ＳＯＤ、ＭＤＡとＣｈＡＴの検査測定
方法は同上。
【０１２４】
７、統計分析
すべての結果は平均±標準誤差で表示する。水迷路ナビゲーションテストで各群の潜伏期間の差異比較は繰り返し測定の双方向分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。群間の差異はｐｏｓｔ ｈｏｃ ＬＳＤ検査を採用する。水迷路プラットフォーム探査実験、生物化学測定は単方向分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。Ｐ＜０．０５の場合は顕著な差異であると判断する。
【０１２５】
結果
１、ｄｌ−ＰＨＰＢが認知症ラットの学習記憶に対する改善効果
ナビゲーションテストで、四日間の訓練で、各群の潜伏期間が徐々に短縮していくことは、ラットがプラットフォームの位置に対する記憶が強くなることを証明した。１日目は、各群の間に顕著な差異がないが、溶媒対照群の潜伏期間は偽手術群より長い。２日目、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間は溶媒対照群より短い。３−４日目は、溶媒対照群の潜伏期間は偽手術群（Ｐ＜０．０５）より顕著に長い、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群は溶媒対照群（Ｐ＜０．０５あるいはＰ＜０．０１）より明らかに短い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間も溶媒対照群より短い。これは二週間の治療によって、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的にＡβ（２５−３５）で誘導した認知症ラットの潜伏期間を短縮できることを証明した。すなわち、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に認知症ラットの学習記憶能力を改善できる（図１８）。４日間の訓練で、各群のラットの水泳スピードが顕著な差異がない（データなし）ことはｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）が動物の体力に影響がないから、水迷路実験は動物の学習記憶能力を真実に反映できることを証明した。
【０１２６】
プラットフォーム探査実験で、溶媒対照群の目標象限活動時間百分比（２１．６±１．６％）は偽手術群（３２．８±４．０％，Ｐ＜０．０５）より少ないが、ｄｌ−ＰＨＰＢ １２９ｍｇ／ｋｇ群（３０．２±２．５％）が溶媒対照群（Ｐ＜０．０５）より明らかに長い、ｄｌ−ＰＨＰＢ ３９ｍｇ／ｋｇ群（２４．６±３．０％）も溶媒対照群より長い（図１９Ａ）。ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的に認知症ラットが目標象限での活動時間の百分比を増加できることを証明した。第一回目標を通る時間から見ると、溶媒対照群が偽手術群より長くなる。溶媒対照群と比べ、ｄｌ−ＰＨＰＢが第一回目標を通る時間を短縮する。実感の例数を増加すると、顕著な意味を見える可能性がある（図１９Ｂ）。
【０１２７】
つまり、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的にＡβ（２５−３５）で誘導した認知症ラットの最近記憶と空間位置学習記憶障害を改善できる。
【０１２８】
２、ｄｌ−ＰＨＰＢが認知症ラット脳組織ＳＯＤ活性、ＭＤＡ含有量とＣｈＡＴ活性に対する影響
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つであり、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。実験中、偽手術群の皮質のＳＯＤ活性が２１６．９±１４．５Ｕ／ｍｇタンパク質、ｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）後１４日間、ＳＯＤ活性代償性が３２％向上し、２８６．８±１８．３Ｕ／ｍｇタンパク質に達し、顕著な差（Ｐ＜０．０５）がある。経口でｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇ投与二週間後、皮質内ＳＯＤ活性がそれぞれ２３８．２±３２．７と１８５．２±２１．６Ｕ／ｍｇタンパク質に下降し、後者は溶媒対照群と比べ顕著な差も出る（Ｐ＜０．０１）。これはｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的に皮質内ＳＯＤ活性を下げれる（図２０Ａ）ことが示された。海馬では、Ａβ（２５−３５）がＳＯＤ活性の顕著な変化が起こさなく、ｄｌ−ＰＨＰＢも ＳＯＤ活性の顕著な変化が起こさない。
【０１２９】
皮質で、溶媒対照群のＭＤＡ含有量（５．４３±０．５５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）が偽手術群（３．６９±０．５２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）より顕著に高い（Ｐ＜０．０５）。連続で経口してｄｌ−ＰＨＰＢ ３９と１２９ｍｇ／ｋｇ投与二週間後、皮質内ＭＤＡ含有量がそれぞれ３．６２±０．２１と３．２８±０．２５ｎｍｏｌ／ｍｇまで下降し、溶媒対照群と比べ顕著な差（Ｐ＜０．０５とＰ＜０．０１）が出た。これはｄｌ−ＰＨＰＢが用量依存性的にＡβ（２５−３５）で誘導したラット皮質内ＭＤＡ含有量の増加を下げれる（図２０Ｂ）。
【０１３０】
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、その活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。ラットｉ．ｃ．ｖ． Ａβ（２５−３５）後、皮質内ＣｈＡＴ活性が顕著な変化がなかったが、経口でｄｌ−ＰＨＰＢ投与二週間後で、溶媒対照群と比べると、３９ｍｇ／ｋｇがＣｈＡＴ活性を顕著に増加し（Ｐ＜０．０５）、１２９ｍｇ／ｋｇも当該酵素の活性を上げる傾向が強い。これがＡβ（２５−３５）は皮質内ＣｈＡＴ活性の下降させなかったが、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラットのＣｈＡＴ活性を増加する可能性があることを証明した（図２０Ｃ）。
【０１３１】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存的にＡβ（２５−３５）で誘導したラット皮質のＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量を下げられることは、当該薬物はＡβ（２５−３５）で誘導したラット皮質代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直し、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる。さらに、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症ラット皮質内ＣｈＡＴ活性を向上し、コリン作動性神経機能を改善することができる可能性も高い。しかし、正常なラット皮質内ＣｈＡＴ活性に影響がないかまだ研究中である。
【０１３２】
実施例３ 加速老化マウスのモデルに対する研究：ｄｌ−ＰＨＰＢは加速老化マウスの学習記憶障害に対する改善効果
材料と方法
１、製剤と薬品
ｄｌ−ＰＨＰＢは本所合成室より提供し、化学純度は９８．５％（ＨＰＬＣ法で測定）、蒸留水で調製した。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）キット、マロンアルデヒド（ＭＤＡ）キット、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）キット、アデノシントリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）キット、クマシーブリリアントブルータンパク質測定キットとも南京建成生物工程研究所より購入した。
【０１３３】
２、器具
ＳＴＴ−２タイプのジャンプ装置と水迷路は中国医学化学院薬物研究所より開発。ＭＱＸ ２００タイプのマイクロプレートリーダーはアメリカＢｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの製品。
【０１３４】
３、動物
１０ヶ月ＳＡＭＰ８、雄、ＳＰＦレベル、北京維通利華実験動物技術有限公司より購入。
【０１３５】
４、グループ分けと実験設計
動物が一週間適応後、行動学実験を行い、実験結果で平均に三群に分け：対照群、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０ｍｇ／ｋｇとｄｌ−ＰＨＰＢ１６０ｍｇ／ｋｇ群（それぞれラットの３９と１２９ｍｇ／ｋｇに相当する）、毎日１回、３５日に連続で蒸留水や薬物を投与する。投与後の第３１−３５日にステップダウンテストと水迷路実験を行い、３６日目に群ごとにランダムで８−１０匹の動物を取り、頭を切って、皮質と海馬を分離して、指標が包括ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴ、ＡＣｈＥ、ミトコンドリアＡＴＰａｓｅを含む生物化学測定をやる。（実験のプロセスは図２７参照）
５、ステップダウンテスト
ジャンプ装置は矩形の電気ショック装置で、五軒に分け、底に３６ボルトのＡＣを鉄柵が付き、底の角に電気絶縁の径３ｃｍの円形ゴムプラットフォームが置いているので、動物がそれに上って電気ショックから逃げれる。回りはプラスチックシートで、実験者向けの面は透明で、その他は黒くて不透明で、天井は動物を取ったり置いたり用に開ける。
【０１３６】
マウスをジャンプ装置の一軒に置き、３分間適応後、電源を入れ、マウスに電気ショックをかけ、５分間を観察して、電気ショック受けた回数を記録する。２４時間後、電源を入れて、マウスをプラットフォームに置き、第一回プラットフォームから飛び下りる潜伏期間および三分間に受けた電気ショックの回数を記録する。これでマウスの受動回避反応能力を判断する。
【０１３７】
６、水迷路実験
水迷路装置は黒い不透明の矩形プラスチックボックス（８０ｃｍ×５０ｃｍ×２０ｃｍ）で、その中にブラインドサイド４個と終点ステップ１個があり、マウスはそのステップで水面に出られる。またもう一枚の１５ｃｍ×２０ｃｍサイズの黒いプラスチックシートがあり、異なる位置に置き、異なる出発点とする。異なる出発点には含むブラインドサイド数も異なる。実験の際、深さが１２ｃｍ、水温が２５±１℃の水を入れる。マウスを異なる出発点において、異なるブラインドサイド数の折れ曲がったコースで終点に行き、水面に出る。マウスがブラインドサイドに入る回数と終点に着くにかかる時間でその最近記憶と学習記憶能力を判断する。
【０１３８】
毎回実験するときに、マウスを終点のステップに置いて５秒適応させる。それで頭を出発点のブラインドサイド壁に向かって、水に入れる。それがブラインドサイドに入る回数とステップを見つける時間、すなわち逃避潜時期間を記録する。時間を３分間に限定して、もし３分間内にステップを見つけなかったら、実験者で終点までガイドして、潜伏期間を３分間にする。４回訓練して、それぞれ２、３、４、４個ブラインドサイドを含むコースで行う。一回テストして、同様にマウスがブラインドサイドに入る回数とステップを見つける時間を記録する。
【０１３９】
７、脳組織ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴ、ＡＣｈＥとＡＴＰａｓｅの測定
皮質と海馬のＳＯＤ、ＭＤＡ、ＣｈＡＴとＡＣｈＥの測定方法は同上。また別に一部の皮質組織を取って、組織ホモジネートを調製する。勾配遠心法でミトコンドリアを抽出し、超音波法で粉砕して、そのＡＴＰａｓｅ活性を測定する。測定方法はキット説明書に従って行う。
【０１４０】
８、統計分析
すべての結果は平均±標準誤差で表示する。水迷路実験指標の差異は繰り返し測定の双方向分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。その他の各指標の差異は単方向分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を採用する。群の間の差異はｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ またはＬＳＤ検査を採用する。
【０１４１】
結 果
１、ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８の学習記憶障害に対する改善効果
ステップダウンテストは動物の受動回避反応能力を測定する経典な実験の１つである。動物が受けた電気ショックの回数と潜伏期間で動物の受動回避反応能力を判断する。第一日の訓練中に、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇ群が受けた電気ショック回数（５．８±０．５，４．９±０．５）は対照群ＳＡＭＰ８（８．３±０．６）より明らかに少ない。Ｄｕｎｎｅｔｔ検査で、顕著な差（Ｐ＜０．０１和Ｐ＜０．００１）があり、さらに一定の用量依存性もある。第二日の測定で、２つの投与群ＳＡＭＰ８が受けた電気ショック回数（３．４±０．３，２．１±０．３）も対照群（４．６±０．３）（Ｐ＜０．０５和Ｐ＜０．０１）より明らかに少ない。尚且つ２つの投与群は第一回ステップから飛び下りる潜伏期間（５．５±０．８，１０．２±２．４）も対照群（０．７±０．２） （Ｐ＜０．０１）より明らかに長くて、用量依存関係もある。以上のことでは、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇの長期投与ともＳＡＭＰ８マウスの受動回避反応能力を向上でき、用量依存関係もあり、すなわちｄｌ−ＰＨＰＢがその学習能力と記憶保持能力を顕著に改善できることが示された。
【０１４２】
水迷路実験は動物の最近記憶と空間学習記憶能力の測定に常用する。動物がブラインドサイドに入る回数とステップを見つける潜伏期間でその学習記憶能力を反映できる。本発明では、第一、二回で使うブラインドサイドの数はそれぞれ２個と３個、第三ないし第五回は４個になる。前の三回の訓練で、投与群ＳＡＭＰ８はブラインドサイドに入る回数は対照群と比べ、顕著な差がない。第三ないし第五回のテストで、投与群の動物がブラインドサイドに入る回数とも減少になることは動物がステップに対する記憶が強くなることが示されたが、対照群がブラインドサイドに入る回数の変化がない。２つの投与群が第四回のテストでブラインドサイドに入る回数は対照群より少なくなる。第五回のテストで、２つの投与群のミス回数（それぞれ３．１±０．９和２．７±０．３）は、対照群（６．１±１．１）（Ｐ＜０．０５）より明らかに少ない。第一、二回の訓練で、各群の動物がステップを見つける潜伏期間の差異がない。第三回の訓練で、２つの投与群の潜伏期間が対照群より短くなる。その以降は、訓練回数の増加につれて、各群がステップを見つける潜伏期間が徐々に短縮していく。第四回の訓練で、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間は対照群より短くなる勢いがあり、ｄｌ−ＰＨＰＢ １６０ｍｇ／ｋｇ群の潜伏期間が対照群（Ｐ＜０．０５）より明らかに短い。最後のテストで、２つの投与群の潜伏期間とも対照群（Ｐ＜０．０１）より明らかに短い。それはｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８の最近記憶と空間学習記憶障害を改善できることが示された。
【０１４３】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇともＳＡＭＰ８マウス学習記憶能力を改善でき、なお一定の用量依存性もある。
【０１４４】
２、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＳＯＤ活性とＭＤＡ含有量に対する影響
ＳＯＤは体内の主要な酸化防止酵素の１つで、有効に酸素フリーラジカルを取り除き、過酸化の損害を軽減する。ＭＤＡは主要な過酸化産物の１つである。ＳＯＤの活性は脳組織の酸化抵抗レベルを反映し、ＭＤＡは脳組織の脂質過酸化の状況を反映できる。実験中に、対照群の海馬組織ＳＯＤの活性は２７９．４±６５．７Ｕ／ｍｇタンパク質、ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０と１６０ｍｇ／ｋｇを連続で３５日間投与した後、ＳＯＤ活性はそれぞれ１５６．２±７．８および１５８．７±１１．４Ｕ／ｍｇタンパク質まで下降し、対照群と顕著な差（Ｐ＜０．０５）がある。ｄｌ−ＰＨＰＢは海馬ＳＯＤの活性を下げることができることが示された。皮質では、ｄｌ−ＰＨＰＢ２つの用量ともＳＯＤ活性の顕著な変化を起こさなかった（データなし）。
【０１４５】
投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ５０と１６０ｍｇ／ｋｇ群の海馬のＭＤＡ含有量はそれぞれ１．２３±０．０５と１．２６±０．０９ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質、対照群（１．９０±０．５０ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）と比べ、それぞれ３５．３％と３３．７％下降したので，下降する勢いが明らかだが、統計学上は意味がない（図２３Ｂ）。ｄｌ−ＰＨＰＢが海馬のＭＤＡ含有量を下降する可能性があることを証明した。皮質では、各群のＭＤＡ含有量は顕著な差がない（データなし）。
【０１４６】
上記のことで、ｄｌ−ＰＨＰＢはＳＡＭＰ８マウス海馬組織代償性異常増加の酸化防止酵素の活性を直すことができ、脂質過酸化産物を下げる可能性があり、さらに脳組織正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させ、酸化ストレス損傷を軽減させることが示された。
【０１４７】
３、ｄｌ−ＰＨＰＢが脳組織ＣｈＡＴとＡＣｈＥ活性および皮質ミトコンドリアＡＴＰ酵素活性に対する影響
アセチルコリンは中枢神経系における主要な神経伝達物質の１つで、コリン作動性神経のシグナリングを仲介し、学習・記憶と密接に関連している。ＣｈＡＴはアセチルコリンのシンターゼとして、ＡＣｈＥはアセチルコリンの加水分解酵素として，それらの活性は間接的に脳内のアセチルコリンの含有量と、コリン作動性神経機能の状況を反映できる。連続で投与３５日後は、ｄｌ−ＰＨＰＢ５０と１６０ｍｇ／ｋｇ群ＳＡＭＰ８マウス海馬のＣｈＡＴ活性が対照群と比べ、それぞれ４０％と６１％が増加し、顕著な統計学差異があり、なお一定の用量依存性がある（図２４Ａ）。皮質では、２つの投与群のＣｈＡＴ活性は対照群と比べ、顕著な差がない（データなし）。２つの投与群の海馬のＡＣｈＥ活性（０．６３２±０．０３６和０．５９７±０．０３０Ｕ／ｍｇタンパク質）は対照群（０．８５０±０．１９５Ｕ／ｍｇタンパク質）より明らかに低い。ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８マウス海馬ＡＣｈＥ活性を下降させる可能性があることが示された（図２４Ｂ）。皮質では、各投与群のＡＣｈＥ活性が顕著な差がない（データなし）。
【０１４８】
ミトコンドリアＡＴＰａｓｅはミトコンドリア生産機能の重要な指標の１つである。本研究では、ｄｌ−ＰＨＰＢ １６０ｍｇ／ｋｇ群ＳＡＭＰ８マウスのＡＴＰａｓｅ活性（９．８２±０．５１Ｕ／ｍｇタンパク質）は対照群（８．５８±０．２１Ｕ／ｍｇタンパク質）（Ｐ＜０．０５）より高い。ｄｌ−ＰＨＰＢ ５０ｍｇ／ｋｇ群（８．７９±０．３３Ｕ／ｍｇタンパク質）は対照群と顕著な差がない。多い用量群の増加範囲は１４％しかないことを考慮したうえ、ｄｌ−ＰＨＰＢがＳＡＭＰ８マウス皮質ミトコンドリアＡＴＰａｓｅの活性に影響がないことを推定した（図２４Ｃ）。
【０１４９】
結論として、ｄｌ−ＰＨＰＢは用量依存性的にＳＡＭＰ８マウス海馬組織のＣｈＡＴ活性を向上でき、その海馬ＡＣｈＥ活性にもある程度の下降ができる。ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症マウスの海馬アセチルコリン含有量の増加によって、コリン作動性神経機能を改善できる可能性があることが示された。また、ｄｌ−ＰＨＰＢは認知症マウスの皮質ミトコンドリアＡＴＰａｓｅの活性に対する影響はごく小さい。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病やその症状の予防・緩和および／または治療に用いる２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの使用。
【請求項２】
前記アルツハイマー病は、初老期認知症と脳血管性認知症または両方の混合症状である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選ばれる請求項１に記載の使用。
【請求項４】
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムが脳組織の酸化ストレス損傷の軽減、コリン作動性神経機能の向上、ニューロンの保護および／または脳源性神経成長因子含有量の向上に用いる薬を調製する時の使用。
【請求項５】
前記脳組織の酸化ストレス損傷の軽減とは、脳組織代償性が異常増加の酸化防止酵素の活性を抑えることで、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記酸化防止酵素とは、スーパーオキシドジスムターゼで、脂質過酸化産物とはマロンアルデヒドである請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記コリン作動性神経機能の改善は、アセチルコリン合成酵素の活性を上げることで、アセチルコリン加水分解酵素の活性を下げる請求項４に記載の使用。
【請求項８】
予防や治療に実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、および薬学で認めるオプションのキャリアおよび／またはアクセサリを含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
前記アルツハイマー病は、初老期認知症と脳血管性認知症または両方の混合症状である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選ばれる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、使用ルートよって溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放性または徐放性製剤から選ばれる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
必要がある患者に治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムや請求項８に記載の医薬組成物を使用することを含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療の方法。
【請求項１３】
前記アルツハイマー病は、初老期認知症と脳血管性認知症または両方の混合症状である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選ばれる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者に使用するルートは非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これらに限定されない請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは、０．５−２００ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれの量。好ましいのは１−１５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましいのは２−１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましいのは３−５０ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは４−３５ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは５−２０ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれかの量である請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
アルツハイマー病やその症状の予防・緩和および／または治療に用いる２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムの使用。
【請求項２】
前記アルツハイマー病は、初老期認知症と脳血管性認知症または両方の混合症状である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選ばれる請求項１に記載の使用。
【請求項４】
２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムが脳組織の酸化ストレス損傷の軽減、コリン作動性神経機能の向上、ニューロンの保護および／または脳源性神経成長因子含有量の向上に用いる薬を調製する時の使用。
【請求項５】
前記脳組織の酸化ストレス損傷の軽減とは、脳組織代償性が異常増加の酸化防止酵素の活性を抑えることで、脂質過酸化産物を減少させ、脳組織の正常な酸化−酸化防止の動的なバランスを回復させる請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記酸化防止酵素とは、スーパーオキシドジスムターゼで、脂質過酸化産物とはマロンアルデヒドである請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記コリン作動性神経機能の改善は、アセチルコリン合成酵素の活性を上げることで、アセチルコリン加水分解酵素の活性を下げる請求項４に記載の使用。
【請求項８】
予防や治療に実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウム、および薬学で認めるオプションのキャリアおよび／またはアクセサリを含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療に用いることを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
前記アルツハイマー病は、初老期認知症と脳血管性認知症または両方の混合症状である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選ばれる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、使用ルートよって溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、粉末、制御放性または徐放性製剤から選ばれる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
必要がある患者に治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムや請求項８に記載の医薬組成物を使用することを含むアルツハイマー病や症状の予防・緩和および／または治療の方法。
【請求項１３】
前記アルツハイマー病は、初老期認知症と脳血管性認知症または両方の混合症状である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルツハイマー病や症状は、記憶減退・認知機能低下・精神遅滞や空間識失調から選ばれる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者に使用するルートは非経口、経口、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、鼻腔を含むが、これらに限定されない請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療実効線量の２−（α−ヒドロキシ−ペンチル）安息香酸カリウムは、０．５−２００ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれの量。好ましいのは１−１５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましいのは２−１００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましいのは３−５０ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは４−３５ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましいのは５−２０ｍｇ／ｋｇ体重の間のいずれかの量である請求項１２に記載の方法。
【図４】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２７】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２７】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２０１１−５２７２９０（Ｐ２０１１−５２７２９０Ａ）
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１６９４３（Ｐ２０１１−５１６９４３）
【出願日】平成２０年７月８日（２００８．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０７１５８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００３２８７
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００８２３０）インスティトゥート オブ マタリア メディカ，チャイニーズ アカデミー オブ メディカル サイエンシズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月８日（２００８．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０７１５８８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００３２８７
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００８２３０）インスティトゥート オブ マタリア メディカ，チャイニーズ アカデミー オブ メディカル サイエンシズ (1)
【Ｆターム（参考）】
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