２２位水酸化酵素
【課題】ソヤサポゲノールＢはその生合成前駆体であるβ−アミリンがメバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンが閉環することにより生合成され、さらに、二段階の水酸化反応を経て生合成される。しかしながら、この反応に関与する２２位の水酸化酵素の遺伝子は未だ解明されていない。
【解決手段】オレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素の遺伝子を特定し、特定の遺伝子を組み合わせて共発現させることにより、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化させることを見出した。更に、２２位の水酸化酵素の遺伝子を２４位の水酸化酵素の遺伝子と合わせて共発現させることにより、ソヤサポゲノールＢを大量に効率よく生産することを見出した。
【解決手段】オレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素の遺伝子を特定し、特定の遺伝子を組み合わせて共発現させることにより、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化させることを見出した。更に、２２位の水酸化酵素の遺伝子を２４位の水酸化酵素の遺伝子と合わせて共発現させることにより、ソヤサポゲノールＢを大量に効率よく生産することを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソヤサポゲノールＢの生合成に関与する植物由来の酵素及びその遺伝子並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリテルペンサポニンは様々な薬用・食用植物に含まれる化合物群であり、ステロイドもしくはトリテルペノイドに、エーテルもしくはエステル結合によって糖が付加した構造を持つ、代表的な二次代謝産物である。トリテルペンサポニンの生合成は、メバロン酸由来のＣ３０イソプレノイドである２，３−オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）を共通の前駆体とする閉環反応、骨格酸化反応、糖転移反応からなり、各反応の過程でその構造多様性が広がるといわれている。
【０００３】
トリテルペンサポニン生合成の最初の段階である閉環反応を触媒する酵素は、ステロイド代謝経路で詳細に検討されている２，３−オキシドスクアレン−ラノステロール閉環酵素との類似性（非特許文献１）や近年の分子生物学の発展などにより、多種の酵素がクローニングされている（非特許文献２及び３）。
【０００４】
トリテルペンの構造多様性は続く酸化反応によりさらに複雑なものとなる。しかし、酸化酵素活性の検出が難しいため、その詳細についてはほとんど解明されていない。植物体や培養細胞を用いたインビトロ（in vitro）酵素反応実験や投与実験においてトリテルペンや類似体である二次代謝型ステロイドに対する酸化酵素活性を検出した例は数例に過ぎない（非特許文献４及び５）。
Ｐ４５０をはじめとする多くの酸化酵素は、ＮＡＤＰＨやＦＭＮなどほかの因子を要求する膜結合型の酵素であり、安定性が低く、酵素タンパク質の精製が難しい。それゆえ、植物体や培養細胞レベルでの活性をまず検出し、酵素の精製を行い、その情報をもとに生合成遺伝子を同定するという、従来の手法でのトリテルペン酸化酵素のクローニングは、困難を極める。
【０００５】
マメ科のダイズ（Glycine max）はトリテルペンサポニンである多種のソヤサポニン類を産生する（非特許文献６及び７）。これらのアグリコン部の構造をもとに、主に２つのグループ、ＡとＢに分類される。その一方であるグループＢサポニンのアグリコン部はソヤサポゲノールＢ［soyasapogenol B (olean-12-ene-3β,22β, 24-triol)］であり、β−アミリン［β-amyrin (olean-12-ene-3β-ol)］の２２位及び２４位の水酸化体である。すなわち、ダイズにはβ−アミリンを水酸化する酵素が存在すると考えられる。ソヤサポゲノールＢはβ−アミリンから２段階の水酸化で生合成されると考えられている。さらに糖転移反応により、最終的にソヤサポニン（例えば、soyasaponin I）が生成する。
β−アミリンの２４位の水酸化に関しては、本発明者らが、機能ゲノム学的な手法を用いて、ダイズからβ−アミリン及びソフォラジオール［sophoradiol (olean-12-ene-3β,22β-diol)］の２４位を水酸化する酵素ＣＹＰ９３Ｅ１を同定している（非特許文献８及び特許文献１）。
【０００６】
【化１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／０８０５７２号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】E. J. Corey, S. P. T. Matsuda, B. Bartel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 2211-2215
【非特許文献２】E. J. Corey, S. P. T. Matsuda, B. Bartel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11628-11632
【非特許文献３】J. B. R. Herrera et al., Phytochem. (1998) 49, 1905-1911
【非特許文献４】H. Hayashi et al., Phytochem. (1993) 34, 1303-1307
【非特許文献５】M. Peterson, H. U. Seitz, FEBS Lett. (2006) 1985, 188, 11-14
【非特許文献６】S. Kudou et al., Biosci. Biotech. Biochem. (1993) 57, 546-550
【非特許文献７】M. Shiraiwa et al., Agric. Biol. Chem. (1991) 55, 315-322
【非特許文献８】M. Shibuya, M. Hoshino, Y. Katsube, H. Hayashi, T. Kushiro, Y. Ebizuka, FEBS J. (2006) 273, 948-959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ソヤサポゲノールＢの生合成前駆体であるβ−アミリンは、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンが閉環することにより生合成され、さらに、二段階の水酸化反応を経てソヤサポゲノールＢが生合成される。しかしながら、この反応に関与するオレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素の遺伝子は未だ解明されていない。そのため、オレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素を遺伝子工学的に利用することは不可能となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、オレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素の遺伝子を特定し、この遺伝子がオレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化させることを見出した。更に、２２位の水酸化酵素の遺伝子を２４位の水酸化酵素の遺伝子と合わせて共発現させることにより、ソヤサポゲノールＢを大量に効率よく生産することを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のものを提供するものである。
１．オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２．上記１記載のポリヌクレオチドであって、
以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチドであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
３．上記１又は２記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
４．上記３記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換細胞。
５．形質転換細胞が酵母である、上記４記載の形質転換細胞。
６．下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチド、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
７．上記１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した２つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソフォラジオールを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソフォラジオールの製造方法。
８．上記７に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、上記７に記載の方法。
９．前記宿主細胞が酵母である、上記７又は８に記載の方法。
１０．上記１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターと、オレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した３つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソヤサポゲノールＢを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソヤサポゲノールＢの製造方法。
１１．上記１０に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、上記１０に記載の方法。
１２．前記宿主細胞が酵母である、上記１０又は１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素の遺伝子を明らかにすることができた。また、遺伝子工学的手法を用いて、特定の２２位水酸化酵素の遺伝子と特定のシトクロムＰ４５０の遺伝子を組み合わせて共発現させることにより、２２位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを直接培養により大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例２で実施したダイズＣＹＰ７２Ａ６１全長配列の決定方法の概略を示す説明図である。
【図２】図２は、実施例９で作製した形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を作製するときに用いた各プラスミドの構造を示す模式図である。
【図３】図３は、実施例７で実施した、酵母ＩＮＶＳｃ１株においてＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲを共発現させた形質転換体からの抽出物のトータルイオンクロマトグラムを表したものである。Ａ：オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールアセチル化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS-GmCPR菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図４】図４は、図５における保持時間９．０５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ａ：オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールアセチル化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS-GmCPR菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図５】図５は、実施例９で実施した、酵母ＧＩＬ７４７株においてＰＳＹ、ＧｍＣＰＲ、ＣＹＰ７２Ａ６１を共発現させた形質転換体からの抽出物のトータルイオンクロマトグラムを表したものである。Ａ：ソフォラジオールＴＭＳ化体標品、Ｂ：GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｃ：GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図６】図６は、図５における保持時間９．０５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ａ：ソフォラジオールＴＭＳ化体標品、Ｂ：GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61抽出物である。
【図７】図７は、実施例１１で実施した、酵母ＩＮＶＳｃ１株においてＧｍＣＰＲ及びＣＹＰ７２Ａ６１を共発現させた形質転換体からの抽出物のｍ／ｚ＝３０６のクロマトグラムを表したものである。Ａ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図８】図８は、図７における保持時間９．８５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ａ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図９】図９は、実施例１２で作製した形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61の作製に用いた各プラスミドの構造を示す模式図である。
【図１０】図１０は、実施例１２で実施した、酵母ＧＩＬ７４７株においてＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲ、ＣＹＰ７２Ａ６１の共発現させた形質転換体からの抽出物のトータルイオンクロマトグラムを表したものである。Ａ：ソフォラジオールＴＭＳ化体標品、Ｂ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｃ：GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｄ:GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図１１】図１１は、図１０における保持時間９．８５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ｂ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｃ：GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明におけるオレアナン型トリテルペンとしては、例えば、β−アミリン、ソフォラジオール、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオール、ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢなどが知られているが、本発明におけるオレアナン型トリテルペンは、上記の物質に限定されるものではない。
２２位が水酸化されるオレアナン型トリテルペンとしては、β−アミリン、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールなどが挙げられるが、本発明の方法により２２位が水酸化される物質であれば、これらの物質に限定されるものではない。
【００１５】
ダイズ由来のＥＳＴ及び機能未解明の塩基配列が報告されているシトクロムＰ４５０クローン５種［TIGR (The Institute for Genomic Research) Accession Number: TC204312, TC225935, TC218097, TC224852, TC209136］を選択した。この中で、ＣＹＰ７２Ａ６１（GenBank Accession Number: DQ335793, TIGR Accession Number: TC204312）に高い相同性を示した配列番号１のポリヌクレオチドが２２位の水酸化活性を有していた。しかし、他の４種の塩基配列については、２２位の水酸化活性が認められなかった。
【００１６】
本発明において、配列番号１のポリヌクレオチド又はその均等体の転写・翻訳産物を利用して２２位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを製造することができる。なお、均等体とは、配列番号１で表される塩基配列でコードされるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列）からなるポリペプチドの有する機能（特には、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性）と同一機能を有し、配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列をいう。
【００１７】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、配列番号１のポリヌクレオチドを有するＤＮＡの一部又は全部あるいはその相補鎖をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法によりポリヌクレオチドを確認することをいう。ハイブリダイズを使用する手法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などが挙げられる。具体的には、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、５５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０からなる）を用いる場合が一例として挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor laboratory, 1989などに記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００１８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、特にはＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。同一性とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。具体的には、ＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information）を用いて計算したときに、配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、具体的には、配列番号１の塩基配列において、１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加され、かつ、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されるヌクレオチドの個数は、上記の活性を有するポリペプチドをコードする数であれば、特に限定されない。
【００２０】
シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１のポリヌクレオチドに対する変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異も含む。人為的に変異させる手段としては、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１のポリヌクレオチドを用いて、ランダム変異、あるいは部位特異的突然変異を導入し、遺伝子工学的に、１若しくは複数のヌクレオチド残基が欠失、置換、挿入、若しくは付加の少なくとも１つがなされているポリヌクレオチドを得る方法が挙げられる。こうして得られた変異ポリヌクレオチドを利用することにより、本酵素の活性の至適温度、熱安定性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、基質特異性等の性質が異なったポリペプチドを得ることが可能となる。
【００２１】
本発明において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜１０個、更により好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２である。
本発明のポリペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００２２】
ここで、「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００２３】
２２位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを産生し得る、微生物、植物又は動物に対して、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１の塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部、全部又はその相補鎖をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法（例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法など）または、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１の塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部、全部又はその相補鎖をプライマーとして、ＰＣＲを行う手法等によって、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることもできる。
また、上記のポリヌクレオチドは、塩基配列の情報を基にして、化学合成によって得ることもできる。その方法は、Gene, 60, 1, 115-127,1987の記載を参照して行うことができる。
【００２４】
本発明の遺伝子又は組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。
また、本発明において、オレアナン型トリテルペンの２４位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、あるいはβ―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入することもできる。前者の例としては、国際公開第WO2005/080572号パンフレット記載のオレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素遺伝子pESC-CYP93E1、後者の例としては、β−アミリン合成酵素遺伝子ＰＳＹ（Accession No.AB034802、Eur.J.Biochem.,267,p.3543-3460,2000）が挙げられる。
宿主細胞としては、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、種類は特に限定されず、微生物、酵母、糸状菌、植物、動物などを用いることができる。例えば、微生物としては、バチルス属やストレプトマイセス属などのグラム陽性菌、大腸菌などのグラム陰性菌などが挙げられる。
【００２５】
酵母としては、例えば、ヘム合成能及び脂質酸合成能が欠損しているＧＩＬ７４７株を用いることができる。このＧＩＬ７４７株はＧＬ７株（E.G.Gollub et al., J. Biol. Chem., 252, 2846-2854 (1977)）とＷ３０３株（Genetics 142(3):749-59）を掛け合せた菌株であり、本発明で用いることのできるその他の酵母としては、ラノステロール合成酵素ＥＲＧ７が欠損しているＧＩＬ７７株（Kushiro,T. et al., Eur. J. Biochem., 256, 238-2448(1998)）を用いることができる。また、ＩＮＶＳｃ１株（Invitogen社製）、ＩＮＶＳｃ２株（Invitogen社製）なども用いることができる。
【００２６】
糸状菌としては、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、フザリウム属、トリコデルマ属などを用いることができる。植物としては、ダイズなどを用いることができる。また、動物としては、カイコなどを用いることができる。哺乳類細胞としては、ＨＦＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞などを用いることができる。
【００２７】
宿主細胞の培地、培養条件は、公知の方法により適宜選択して用いることができる。微生物を宿主細胞として用いる場合、得られた形質転換体を培養する培地は、当該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００２８】
炭素源としては、ポテトデキストロース、グルコース、スクロース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機塩、若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキスなどを用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸マグネシウムなどを用いることができる。
【００２９】
微生物の形質転換では、プロトプラスト法、コンピテント細胞を用いる方法などを用いることができる。酵母を宿主細胞として組み換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法などを挙げることができる。宿主細胞がカイコの場合、例えば、バキュロウイルス発現系を用いた公知の方法（Appl.Microbiol.Biotechol.,62,1-20,2003）により、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【００３０】
また、植物細胞を宿主細胞として形質転換体を作製する場合、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド又はバイナリープラスミド系、アグロバクテリウム・リゾジェネスのＲｉプラスミド、ポリエチレングリコールを用いる直接的な遺伝子伝達またはエレクトロポレーション法が有効である（Methods in Molecular Biology, 267, Recombinant Gene Expression, 329-350,2004）。
【００３１】
本発明の遺伝子は適当なベクターに挿入して用いることができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されない。例えば、自立的に複製するベクター（例えば、プラスミドなど）でもよいし、あるいは宿主細胞に導入された際に宿主のゲノムに組み込みことが可能であり、また、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。その中でもベクターとしては、発現ベクターを用いるのが好ましい。
【００３２】
発現ベクターとしては、本発明のポリヌクレオチドを転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
宿主細胞が微生物である場合、発現ベクターとしては、例えば、pBuescript（Stratagene社製）、pUC（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）などが挙げられる。
そして、プロモーターとしては、大腸菌、糸状菌などの宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ptrp）、ｌａｃプロモーター（Plac）などの大腸菌やファージなどに由来するプロモーター、タカアミラーゼ遺伝子プロモーター、ＴＥＦ１遺伝子プロモーターなどの麹菌などに由来するプロモーターなどを挙げることができる。また、人為的に設計や改変を行なったプロモーターなども用いることができる。
【００３３】
宿主細胞が酵母である場合、発現ベクターとしては、例えば、pAUR101（タカラバイオ社製）、pAUR112（タカラバイオ社製）、pI-RED1（東洋紡績社製）、pYES2（Invitogen社製）、pESC-URA（Stratagene社製）、pESC-HIS（Stratagene社製）、pESC-LES（Stratagene社製）などが挙げられる。
このときのプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。例えば、解糖系酵素遺伝子プロモーター、Ｇａｌプロモーターなどのプロモーターなどを用いることができる。
【００３４】
本発明の組み換えベクターはさらに形質転換体を選択するための選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーとしては、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などを適宜用いることができ、例えば、宿主が細菌である場合にはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等、宿主が酵母である場合にはトリプトファン合成遺伝子（例えばＴＲＰ１）、ウラシル合成遺伝子（例えばＵＲＡ３）、ロイシン合成遺伝子（例えばＬＥＵ２）等、宿主がカビである場合にはハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）等を用いることができる。
【００３５】
組み換えベクターの導入方法としては、上記の宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法（Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol. 153, 163 (1983)）などが挙げられる。
【００３６】
本発明の形質転換体は、色々な態様があるが、例えば、酵母ＧＩＬ７４７株を用い、これに２種類のプラスミドpESC-URA-PSY及びpESC-HIS-CYP72A61を組み込んで作製することができる。この形質転換体によれば、ソフォラジオールを製造することができる。この場合、更にダイズ由来のＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（GmCPR）遺伝子（Accession No. AY170374）をプラスミドpESC-LEU-GmCPRとして加えることにより、共発現系でＰ４５０の活性が更に増大させることができる。このGmCPRを加えた形質転換体酵母をGIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61と命名し、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11138として寄託されている。
【００３７】
本発明の形質転換体を用いてソヤサポゲノールＢを製造する場合、例えば、酵母ＩＮＶＳｃ１株を用い、これにプラスミドpESC-HIS-CYP72A61及びpESC-LEU-GmCPRを組み込み、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールを添加することでソヤサポゲノールＢを製造することができる。また、例えば、酵母ＧＩＬ７４７株を用い、これに３種類のプラスミドpESC-URA-PSY-CYP93E1、pESC-LEU-GmCPR、pESC-HIS-CYP72A61を組み込むことで製造することができる。すなわち、本発明の２２位水酸化酵素の遺伝子と共に２４位水酸化酵素の遺伝子を組み込むことにより、一工程でβ−アミリンからソヤサポゲノールＢを製造することができる。なお、上記形質転換体酵母をGIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61と命名し、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11139として寄託されている。
【００３８】
オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールは、酵母ＧＩＬ７７株にプラスミドpESC-PSY-CYP93E1を組み込んだ形質転換体酵母により製造することができる。なお、上記形質転換体酵母をGIL77/pESC-PSY-CYP93E1と命名し、平成16年2月6日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM P-19675として寄託され、平成17年1月6日に国際寄託（受託番号FERM BP-10201）へ移管されている。
【００３９】
本発明のポリペプチドを形質転換体の培養物から単離精製するには、公知の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、緩衝液に懸濁して、ホモジナイザー、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕後、遠心分離して無細胞抽出液を得る。さらに、該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法で用いられる手法により精製したポリペプチドを得ることもできる。
緩衝液には、ポリペプチドの失活を防ぐため、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを添加することができる。さらに、比活性を高めるために、ポリペプチドを精製することも有効である。
精製方法としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等が挙げられ、これらは単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。
【００４０】
また、本発明のポリペプチドが細胞内に不溶状態で発現した場合は、上記と同様に細胞を破砕後、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法によりポリペプチドを回収することができる。さらに、得られたポリペプチドの不溶体を変性剤で可溶化し、希薄溶液に希釈あるいは透析した後、上記と同様の単離精製法により精製ポリペプチドを得ることができる。
【００４１】
本発明のポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその誘導体を回収することができる。そして、培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製ポリペプチドを得ることができる。
【００４２】
得られたポリペプチドを含む緩衝液に、基質となるオレアナン型トリテルペン並びに補酵素を添加して、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃でインキュベートする。補酵素としては、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨが利用でき、グルコース−６−リン酸とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いたＮＡＤＰＨ再構成系を併用できる。また、形質転換細胞が産生するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０リダクターゼ以外のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０リダクターゼの遺伝子を外部から組み込んで水酸化反応を起こさせることもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
《実施例１》ダイズ種子からのｃＤＮＡの調製
ダイズ（Glycine max）種子（青大豆、虎屋産業株式会社）を湿らせた脱脂綿上に蒔き、２５℃、暗所条件下で５日間育成した。得られた芽生え５．３ｇを回収し、液体窒素で凍結し、乳鉢を用いて細かくすり潰した。これをｐＨ９．０の１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液４．５ｍＬへ懸濁し、さらに５ｍＬのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール２５：２４：１の溶液（ｐＨ９．０の１ｍｏｌ／Ｌの１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液を加え、飽和させたものである。以下、ＰＣＩという）及び０．５ｍＬの１０％ＳＤＳ水溶液を加え、氷上でよく混合した。これを１ｍＬずつ分注し、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を回収した。更に、この溶液に４００μＬのＰＣＩを加えてよく混合し、前記同一条件で上層を回収した。これらの上層を合わせて２４０μＬずつ分注し、それぞれに３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液２４μＬ及びエタノール８００μＬを加え、−８０℃で１時間冷却し、エタノール沈殿を行った。これを４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を廃棄して、沈殿を合計８００μＬの滅菌水に溶解してひとつにまとめた。更にそれを４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収し、３５０μＬずつ２本のチューブに分注した。それぞれに３５０μＬの４ｍｏｌ／Ｌ塩化リチウム水溶液を加えて混合し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を廃棄した。それぞれに１８０μＬの７０％エタノール水溶液を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を廃棄した。真空乾燥後、それぞれに５０μＬの滅菌水を加えて沈殿を溶解し、全ＲＮＡ（各０．７８μｇ／μＬ、１．１７μｇ／μＬ）を得た。
【００４５】
この全ＲＮＡ５μｇに１μＬのオリゴｄＴプライマー（RACE32）を加え、Super Script（商標）III逆転写酵素（Invitrogen社製）を用い、添付されているマニュアルに従って逆転写反応を行った。得られた産物に滅菌水８０μＬを加えて希釈し、ＰＣＲ用のダイズのｃＤＮＡテンプレートを調製した。
【００４６】
RACE32：
5’- gac tcg agt cga cat cga t14 -3’ （配列番号３）
【００４７】
《実施例２》ＣＹＰ７２Ａ６１全長配列の決定
ダイズＥＳＴデータベース（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）上のダイズＣＹＰ７２Ａ６１は、Ｎ末端部分を１５０アミノ酸残基程度欠けた部分長ＴＣ（Tentative Consensus）配列ＴＣ２０４３１２であった。なお、現在はＴＣ３４３１２８へ引き継がれている。
この部分長ＴＣ配列ＴＣ２０４３１２は、ＧｅｎＢａｎｋ上にあるMedicago truncatula（マメ科）のＣＹＰ７２Ａ６１（ＭｔＣＹＰ７２Ａ６１：Accession No. DQ335793）と８３％の高い相同性を示した。
このＭｔＣＹＰ７２Ａ６１配列をもとにプライマーを設計し、ＴＣ２０４３１２の上流配列を確認した。このＭｔＣＹＰ７２Ａ６１配列と４９％の相同性を有するArabidopsis thaliana（アブラナ科）のＣＹＰ７２Ａ５（ＡＢＣＹＰ７２Ａ５）の配列を比較したところ、Ｎ末端から５０ｂｐほどのところに、保存されたトリプトファンを含む配列が存在した。そのトリプトファンを指定するコドンは１つであったため、この部分に相当するＭｔＣＹＰ７２Ａ６１塩基配列をもとにしてセンスプライマー（Mt72A61-S）を設計した。また、アンチセンスプライマー（GmTC204312-1st）はＴＣ２０４３１２配列のＣ末端から１１００ｂｐほど上流の配列をもとに設計した。この２つのプライマーと実施例１で調製したｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲ法により断片の増幅を行った。
【００４８】
ここで得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡ分子量マーカーKb ladder（タカラバイオ社製）により、目的断片付近（３５０〜４５０ｂｐ）を切り出し、MonoFas（商標）DNA精製Kit Ｉ（GL Sciences社製）で精製し、１０μＬの滅菌水で溶出した。この溶出物の１μＬをテンプレートとしてセンスプライマー（Mt72A61-S）とアンチセンスプライマー（GmTC204312-2nd）を用いてＰＣＲを行った。その反応後、反応液をSuprec 02（商標）filter（タカラバイオ社製）に移し、プライマーを除去した後、エタノール沈殿を行い、２０μＬの滅菌水に溶解した。DNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて、この断片とpT7bule T-vector（Novagen社製）のライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp, X-gal, IPTG）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーのうち白色のコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーを選抜した。選抜したコロニーをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit（GE Healthcare社製）を用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製した。このプラスミドについて、インサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）によりＴＣ２０４３１２のＮ末上流の配列の一部を確認した。
【００４９】
更に上流の配列を決定するために、５’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA End）を行った。実施例１で調製したダイズＲＮＡを鋳型とし、ＲＡＣＥ３２プライマーの代わりにＴＣ２０４３１２のＣ末端配列をもとに設計したアンチセンスプライマー（GmTC204312-ClaI-C）を用いてSuper Script（商標）III（Invitrogen社製）のマニュアルに従って、逆転写反応を行い、５’−ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡテンプレートを調製した。これを鋳型とし、ＲＡＣＥ３２プライマーと、先のＰＣＲで得た配列をもとに設計したアンチセンスプライマー（GmTC204312-3rd）を用いてＰＣＲを行った。
【００５０】
得られた断片を精製後、その一部をテンプレートとしてセンスプライマー（RACE17）とアンチセンスプライマー（GmTC204312-4th）を用いたＰＣＲを行った。その反応後、反応液をSuprec 02（商標）filter（タカラバイオ株式会社製）に移し、プライマーを除去した後、エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。DNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて、この断片とpT7blue T-vector（Novagen社製）のライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp, X-gal, IPTG）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーのうち白色のコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーを選抜し、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit（GE Healthcare社製）を用いて、大腸菌培養液からプラスミドを精製した。これらについて、インサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により確認し、ＣＹＰ７２Ａ６１の全長配列（塩基配列が配列番号１、アミノ酸配列が配列番号２である）を決定した。本実施例の手順の概略を図１に示す。
【００５１】
Mt72A61−S：
5’- gtg ttg ata tgg tgg att tgg -3’ （配列番号４）
GmTC204312−1st：
5’- ctg tgt tta gcc cac ttg tcg cca tc -3’ （配列番号５）
GmTC204312-2nd：
5’- ctt gaa aag tgg act agt gtc ggg c -3’ （配列番号６）
GmTC204312-3rd：
5’- tcc aat caa agg gcg gta gg -3’ （配列番号７）
GmTC204312-ClaI-C：
5’- ggt agc tac tag agt ttg cgt aaa atg aga tga gcc -3’ （配列番号８）
RACE17：
5’- gac tcg agt cga cat cg -3’ （配列番号９）
GmTC204312-4th：
5’- ttg aga cgc ctc tct atc ctc -3’ （配列番号１０）
【００５２】
《実施例３》ダイズ由来ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（ＧｍＣＰＲ）遺伝子のクローニング
Siminszkyらの報告（B. Siminszky et al., Pest. Biochem. Physiol. (2003) 77, 35-43）をもとに、ＧｅｎＢａｎｋより、ダイズ由来のＧｍＣＰＲ（Accession No. AY170374）配列情報を得た。これをもとに、開始コドン上流にＢａｍＨＩサイトを付加したＮ末端プライマー（GMR-BamHI-S）及び終止コドン下流にＳａｌＩサイトを付加したＣ末端プライマー（GMR-SalI-A）を設計し、実施例１で調製したＰＣＲ用のダイズｃＤＮＡテンプレートからＰＣＲにより断片の増幅を行った。その結果、目的とする約２ｋｂｐの増幅断片が得られていることを電気泳動で確認した。
【００５３】
GMR-BamHI-S：
5’- gtt tgt gga tcc acc atg gct tcg aat tcc -3’ （配列番号１１）
（下線部はBamHI認識部位である）
GMR-SalI-A：
5’- taa tca gtc gac tta cca gac atc tct aag -3’ （配列番号１２）
（下線部はSalI認識部位である）
【００５４】
《実施例４》発現プラスミドpESC-HIS-GmCPRの構築
実施例３の残りの反応液全量についてSuprec 02（商標） filterを用いてプライマーを除去し、その液量と等量のＰＣＩを加えて撹拌後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を回収した。これをエタノール沈殿に供して増幅断片を回収し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで消化を行った後、エタノール沈殿によりＧｍＣＰＲ断片を回収し、挿入した。同様に酵母発現用ベクターpESC-HIS（Stranagene社製）をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで酵素消化後、エタノール沈殿により回収し、これをアルカリホスファターゼ（Shrimp由来）（タカラバイオ社製）を用いて末端を脱リン酸化後、エタノール沈殿により回収した。これらをDNA Ligation Kit Ver.2.1を用いてライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーの選抜を行い、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kitを用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製し、プラスミド溶液の一部をＮｈｅＩで消化して、得られたプラスミドが目的のものであることを確認した。これらについて、インサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により、pESC-HIS-GmCPRと確認した。
【００５５】
《実施例５》発現プラスミドpESC-LEU-GmCPRの構築
実施例４のpESC-HIS-GmCPRプラスミド溶液を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで消化し、この全量をGel Indicator（商標） DX（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて染色したアガロースゲルSeakem（商標） ME agarose（Cambrex社製）で電気泳動し、ＧｍＣＰＲに相当する約２ｋｂｐの断片を切り出し、MonoFas（商標） DNA精製Kit I（GL Sciences社製）で精製した。一方、発現用ベクターpESC-LEU（Stranagene社製）はＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで消化後、エタノール沈殿により回収した。これをアルカリホスファターゼ（Shrimp由来）（タカラバイオ社製）を用いて末端を脱リン酸化後、エタノール沈殿により回収した。
【００５６】
これと精製したＧｍＣＰＲ断片をDNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーの選抜を行い、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit（GE Healthcare社製）を用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製し、プラスミド溶液の一部を制限酵素ＣｌａＩで消化した。このプラスミドのインサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により、pESC-LEU-GmCPRと確認した（図２）。
【００５７】
《実施例６》発現プラスミドpESC-URA-PSY-CYP93E1の構築
ガラクトース誘導性発現ベクターpESC-URA（Stranagene社製）のマルチクローニングサイト２にエンドウ（Pisum sativum）由来のβ−アミリン合成酵素遺伝子ＰＳＹ（Accession No.AB034802、Eur.J.Biochem.,267,p.3543-3460,2000）を組み込んだ発現プラスミドpESC-URA-PSY（図２）を大腸菌ＤＨ５αへ導入し、プラスミドを増幅して調製した。このプラスミドのマルチクローニングサイト１にpESC-CYP93E1を組み込んでpESC-URA-PSY-CYP93E1を調製した。なお、pESC-CYP93E1は国際公開第WO2005/080572号パンフレット記載の方法により調製したものを用いた。
【００５８】
《実施例７》酵母ＩＮＶＳｃ１株におけるpESC-URA-PSY-CYP93E1、pESC-HIS-GmCPR共発現
実施例３で得られたＧｍＣＰＲを共発現系に加えた場合と加えない場合とを比較して、ＣＹＰ９３Ｅ１のβ−アミリン水酸化活性の増大の有無を確認した。宿主細胞にはウラシル（ＵＲＡ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）、ロイシン（ＬＥＵ）、トリプトファン（ＴＲＰ）の４つの選択マーカーをもつ酵母ＩＮＶＳｃ１株（Invitrogen）を用いた。
Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）（ZYMO RESEARCH社製）により、ウラシル、ヒスチジンを除いた、グルコースを炭素源とする合成完全（ＳＣ−Ｕ−Ｈ）寒天培地で３０℃、２日間培養し、ＩＮＶＳｃ１株をpESC-URA-PSY-CYP93E1とpESC-HIS-GmCPRの２種のプラスミドで形質転換して、形質転換酵母INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS-GmCPRを得た。なお、ＳＣ−Ｕ培地の調製は、Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course manual, Cold Spring Harbar Laboratory Press, 1990の記載に基づいて行った。
【００５９】
この培地上のコロニーを２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｈ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振倒培養した。そして、この培地からグルコースを除いたＳＣ−Ｕ−Ｈ−Ｇｌｕ液体培地へ置換し、２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）及びヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）を加えて、さらに３０℃で２日間振倒培養した。この培養液を１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに２０％水酸化カリウム水溶液（５０％エタノール含有）を加えて５分間煮沸した。その後、ヘキサン２ｍＬを用いて脂溶性物質を抽出した。他方、pESC-HIS-GmCPRの代わりに空ベクターpESC-HISを用いた形質転換体を同様に作製し、脂溶性物質を得た。
【００６０】
これらの抽出物に１００μＬの無水酢酸及び２０μＬのピリジンを加え、室温で１２時間反応させ、アセチル化した。１００μＬのメタノール及び２００μＬの滅菌水を加えて反応を停止し、脂溶性物質をヘキサン２ｍＬで２回抽出した。その脂溶性物質を２００μＬのアセトンに溶解し、その１μＬをＧＣ−ＭＳで分析した。その結果、トータルイオンクロマトグラム上で、ＧｍＣＰＲを組み込んだ形質転換体（図３−Ｂ）はＧｍＣＰＲを組み込まない形質転換体（図３−Ｃ）よりも、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールの生成量が明らかに増大した。よって、ＧｍＣＰＲを共発現系に加えることでＰ４５０の活性を増大させることが確認できた（図３、図４）。
【００６１】
《実施例８》発現プラスミドpESC-HIS-CYP72A61の構築
実施例２で得られた配列情報をもとに、開始コドン上流にＣｌａＩサイトを付加したＮ末端センスプライマー（CYP72A61-ClaI-S）及び終止コドン下流にＳａｃＩサイトを付加したアンチセンスプライマー（CYP72A61-SacI-R）を設計し、実施例１で作製したダイズｃＤＮＡテンプレートからＰＣＲにより断片の増幅を行った。
CYP72A61-ClaI-S：
5’- gaa ttc atc gat gct tat gtc tgg cac ag -3’ （配列番号１３）
（下線部はClaI認識部位である）
CYP72A61-SacI-R：
5’- gaa ttc gag ctc aga gtt tgc gta aaa tg -3’ （配列番号１４）
（下線部はSacI認識部位である）
【００６２】
目的とする約１６００ｂｐの断片が得られていることを電気泳動により確認した後、残りの反応液全量についてSuprec 02（商標） filter（タカラバイオ社製）を用いてプライマーを除去し、その液量と等量のＰＣＩを加えて撹拌後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を回収した。これをエタノール沈殿に供して増幅断片を回収し、ＣｌａＩ、ＳａｃＩで酵素消化を行った後、エタノール沈殿により断片を回収し、ＤＮＡインサートとした。
【００６３】
同様にpESC-HISをＣｌａＩ、ＳａｃＩで酵素消化後、エタノール沈殿により回収し、これをアルカリホスファターゼ（Shrimp由来）（タカラバイオ社製）を用いて末端を脱リン酸化後、エタノール沈殿により回収した。これらをDNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーの選抜を行い、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit(GE Healthcare社製)を用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製し、プラスミド溶液の一部をＮｈｅＩで消化した。このプラスミドのインサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により、pESC-HIS-CYP72A61と確認した（図２）。
【００６４】
《実施例９》形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61の調製及び抽出物の同定
ＹＰＤ（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、２％グルコース）＋ＨＥＴ［ヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）、エルゴステロール（終濃度２０μｇ／ｍＬ）、ｔｗｅｅｎ８０（終濃度３８ｍｇ／ｍＬ）］寒天培地上のＧＩＬ７４７株のコロニーを１０ｍＬのＹＰＤ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで ２日間振倒培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標） (ZYMO RESEARCH社製)を用いて、ＧＩＬ７４７のコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。なお、前記ＧＩＬ７４７株は、東京大学大学院薬学研究系研究科天然物化学研究室において分譲可能な状態で保管されている。
【００６５】
このＧＩＬ７４７コンピテントセルを用いて、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）のプロトコルに従い、ＧＩＬ７４７株にpESC-URA-PSYを導入し、ＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、２日間培養した。このプレート上のコロニーを、１０ｍＬのＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２日間振倒培養し、同様の方法によりGIL747/pESC-URA-PSYコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。
さらに、このGIL747/pESC-URA-PSYコンピテントセルを用いて、先と同様に、GIL747/pESC-URA-PSYに実施例５で調製したpESC-LEU-GmCPR及び実施例８で調製したpESC-HIS-CYP72A61を導入し、ＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、３日間培養し、GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を調製した。
【００６６】
この寒天培地上のコロニーを２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ液体培地へ植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで５日間振倒培養した。この液体培地から２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ−Ｇｌｕ液体培地へ置換し、２ｍＬの２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）を加え、さらに２４時間振倒培養した。この液体培地を１０ｍＬのｐＨ７．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−カリウム緩衝液へ置換し、１００μＬのヘム溶液（終濃度１３μｇ／ｍＬ）、１ｍＬの３０％グルコース水溶液（終濃度３％）を加え、さらに２日間振倒培養した。このとき、酸素供給が反応律速とならないよう、綿栓を用いた。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに１ｍＬの２０％水酸化カリウム（５０％エタノール）溶液を加えて５分間煮沸した。脂溶性物質を２ｍＬのヘキサンで２回抽出し、濃縮した。一方、対照として、pESC-HIS-CYP72A61の代わりにpESC-HISを用いた形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HISを同様の方法により作製し、脂溶性物質を得た。
【００６７】
これらの脂溶性物質に５０μＬのＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミドを加え、８０℃のヒートブロック上で１時間反応させ、トリメチルシリル（ＴＭＳ）化した。これを濃縮し、２００μＬのアセトンに溶解し、１μＬをＧＣ−ＭＳで分析した。
【００６８】
その結果、トータルイオンクロマトグラム上で、対照（図５−Ｃ）には観測されないピークが、保持時間９．０５分に観測された（図５−Ｂ）。このピークの保持時間及びＭＳ開裂パターンは、ソフォラジオール標品のＴＭＳ化体（図５、図６−Ａ）のものと一致した（図５、図６）。下記のＥＩ−ＭＳ開裂様式に示すように、ｍ／ｚ＝３０６のフラグメントは、逆Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に起因するオレアン−１２−エン骨格に特徴的なものであり、ｍ／ｚ＝２９１のフラグメントは、ｍ／ｚ＝３０６のフラグメントからいずれかのメチル基が脱離したものであると考えられる。以上の結果から、ＣＹＰ７２Ａ６１をβ−アミリン−２２位水酸化酵素と同定した。
【００６９】
【化２】
【００７０】
《実施例１０》GIL77/pESC-PSY-CYP93E1の２Ｌ大量培養による基質オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールの製造
酵母ＧＩＬ７７株にpESC-PSY-CYP93E1を導入し、ＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ寒天培地上で３０℃、２日間培養し、形質転換酵母GIL77/pESC-URA-PSY-CYP93E1を作製した。この寒天培地上のコロニーをＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃で２日間ほど培養した。炭素源として、ラフィノースを用いて作製したＳＣＲ−Ｕ＋ＨＥＴ培地２Ｌにこの培養液を加え、３０℃、１６０ｒｐｍで２日間ほど培養した後、２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）を加えてさらに３０℃で２４時間培養した。この培地をｐＨ７．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−カリウム緩衝液へ交換し、炭素源としてのグルコース（終濃度３％）及びヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）を加え、３０℃で２４間培養した。遠心分離により菌体を回収し、２００ｍＬの水酸化ナトリウム（５０％メタノール）溶液を加えて１時間３０分加熱還流した。２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝３：１溶媒を用いて脂溶性成分を抽出した。これを１Ｎ塩酸、飽和炭酸ナトリウム、飽和食塩水で洗浄した。この抽出操作を３回行い、有機層をあわせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた抽出物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ ＦＣ−４０シリカゲル）で分析した。ベンゼン：酢酸エチル＝９：１から４：１まで、溶媒組成を変化させて溶出し、４ｍｇの脂溶性物質を得た。これをＮＭＲ測定用重クロロホルムに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。その測定値を文献値（FEBS Journal, (2006)273, 948-959）と比較して、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールであることを確認した。文献値（FEBS Journal, (2006)273, 948-959）との化学シフト値の比較 (CDCl3, 1H : 500MHz, 13C : 125MHz) を以下に示す。
【００７１】
【化３】
オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオール
【００７２】
【表１】
【００７３】
【表２】
【００７４】
《実施例１１》形質転換体INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を用いた酵素活性試験及びソヤサポゲノールＢの生成
ＳＣ−Ｌ−Ｈ寒天培地上のＩＮＶＳｃ１コロニーをＳＣ−Ｌ−Ｈ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２日間振倒培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）を用いて、ＩＮＶＳｃ１のコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。
このＩＮＶＳｃ１コンピテントセルを用いて、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）のプロトコルに従い、酵母ＩＮＶＳｃ１株に実施例５で調製したpESC-LEU-GmCPR及び実施例８で調製したpESC-HIS-CYP72A61を導入して、形質転換し、ＳＣ−Ｌ−Ｈ寒天培地で３０℃、２日間培養し、形質転換酵母INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を作製した。
【００７５】
プレート上のコロニーを、２０ｍＬのＳＣ−Ｌ−Ｈ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２日間振倒培養した。この液体培地を、１０ｍＬのＳＣ−Ｌ−Ｈ−Ｇｌｕの液体培地へ置換し、１ｍＬの２０％ガラクトース（終濃度２％）及び実施例１０で調製した２５μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌオレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールエタノール溶液（終濃度５μｇ／ｍＬ）を加え、さらに３０℃で４日間培養した。この培養液を１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに２０％水酸化カリウム（５０％エタノール）溶液を加えて５分間煮沸した。そして、２ｍＬのヘキサンで２回抽出し、脂溶性成分を得た。
対照として、pESC-HIS-CYP72A61の代わりに空ベクターpESC-HISを用いた形質転換体を同様に作製し、脂溶性成分を得た。
【００７６】
これらの抽出物をアセトンに溶解し、Silica gel 60 F254 with concentrating zone（MERCK社製）を用いて、薄層クロマトグラフィー（Thin LayerChromatography; TLC）を行った。展開溶媒には、ベンゼン９０ｍＬと酢酸エチル１０ｍＬを混合したものを用いた。展開したＴＬＣプレートをＵＶ照射してエルゴステロールのスポットを確認し、これより下の、エルゴステロールを含まない高極性部分を、スパーテルでかきとった。これを酢酸エチル３ｍＬで抽出し、精製した。
【００７７】
これらの抽出物にＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミドを加え、８０℃のヒートブロック上で１時間反応させ、ＴＭＳ化した。これを濃縮し、２０μＬのアセトンに溶解し、１μＬをＧＣ−ＭＳ分析を行った。その結果、保持時間９．８５分に対照（図７−Ｃ）では観測されない、オレアン−１２−エン骨格の開裂で生じる特徴的なｍ／ｚ＝３０６のピークが観測された（図７−Ｂ）。このピークの保持時間及びＭＳ開裂パターンは、ソヤサポゲノールＢ標品のＴＭＳ化体（図７−Ａ）と一致した。
【００７８】
《実施例１２》ＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲ、ＣＹＰ７２Ａ６１の４遺伝子の共発現によるソヤサポゲノールＢの製造
実施例９で作製したＧＩＬ７４７のコンピテントセルを用いて、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）のプロトコルに従い、ＧＩＬ７４７株にpESC-URA-PSY-CYP93E1及びpESC-LEU-GmCPR（図９）を導入し、ＳＣ−Ｕ−Ｌ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、３日間培養した。プレート上のコロニーを１０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで３日間振倒培養し、同様の方法によりGIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPRコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。
得られたコンピテントセルに、上記と同様の方法でpESC-HIS-CYP72A61（図９）を導入し、ＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、３日間培養し、形質転換体酵母GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を調製した。
【００７９】
この寒天培地上のコロニーを２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ液体培地へ植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで４日間振倒培養した。この培地を２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ−Ｇｌｕ液体培地へ置換し、２ｍＬの２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）を加え、さらに３０℃で２４時間培養した。この培地をｐＨ７．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−カリウム緩衝液１０ｍＬと置換し、１ｍＬの３０％グルコース水溶液（終濃度３％）と、１００μｍのヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）を加え、さらに３０℃で２日間培養した。このとき、酸素供給が律速とならないよう、綿栓を用いた。この培養液を１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに２０％水酸化カリウム水溶液（５０％エタノール含有）１ｍＬを加えて５分間煮沸した。これをヘキサン２ｍＬで２回抽出し、脂溶性成分を得た。
対照として、pESC-HIS-CYP72A61の代わりに空ベクターpESC-HISを用いた形質転換体を上記と同様の方法により作製し、脂溶性成分を得た。
【００８０】
これらの抽出物にそれぞれ５０μＬのＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミドを加え、８０℃のヒートブロック上で１時間反応させ、ＴＭＳ化した。それを濃縮し、２００ Ｌのアセトンに溶解し、その１μＬをＧＣ−ＭＳにより分析した。その結果、トータルイオンクロマトグラム上で、保持時間９．８５分に対照（図１０−Ｄ）では観測されなかったピークを新たに観測した（図１０−Ｃ）。この保持時間およびＭＳ開裂パターンがソヤサポゲノールＢ標品のＴＭＳ化体（図１０、図１１−Ｂ）のものと一致した。
以上の結果から、ＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲ、及びＣＹＰ７２Ａ６１の４種の遺伝子を酵母発現系で共発現させることにより、ソヤサポゲノールＢが生産されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する酵素を遺伝子工学的に使用することを可能する。これにより、当該水酸化酵素遺伝子を組み込んだ細胞を用いて宿主細胞を利用した水酸化酵素の生産、植物トリテルペンの微生物による生産などの工業化への利用を可能にする。また、２４位の水酸化酵素の遺伝子と合わせて組み込むことにより、ソヤサポゲノールＢなどのトリテルペンの生産を効率よく、大量に生産させることができる。
【受託番号】
【００８２】
形質転換体酵母GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61は、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11138として寄託されている。
形質転換体酵母GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61は、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11139として寄託されている。 形質転換体酵母をGIL77/pESC-PSY-CYP93E1は、平成16年2月6日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM P-19675として寄託され、平成17年1月6日に国際寄託（受託番号FERM BP-10201）へ移管されている。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。
配列番号３〜１４の各配列で表される塩基配列は、プライマー配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソヤサポゲノールＢの生合成に関与する植物由来の酵素及びその遺伝子並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリテルペンサポニンは様々な薬用・食用植物に含まれる化合物群であり、ステロイドもしくはトリテルペノイドに、エーテルもしくはエステル結合によって糖が付加した構造を持つ、代表的な二次代謝産物である。トリテルペンサポニンの生合成は、メバロン酸由来のＣ３０イソプレノイドである２，３−オキシドスクアレン（2,3-oxidosqualene）を共通の前駆体とする閉環反応、骨格酸化反応、糖転移反応からなり、各反応の過程でその構造多様性が広がるといわれている。
【０００３】
トリテルペンサポニン生合成の最初の段階である閉環反応を触媒する酵素は、ステロイド代謝経路で詳細に検討されている２，３−オキシドスクアレン−ラノステロール閉環酵素との類似性（非特許文献１）や近年の分子生物学の発展などにより、多種の酵素がクローニングされている（非特許文献２及び３）。
【０００４】
トリテルペンの構造多様性は続く酸化反応によりさらに複雑なものとなる。しかし、酸化酵素活性の検出が難しいため、その詳細についてはほとんど解明されていない。植物体や培養細胞を用いたインビトロ（in vitro）酵素反応実験や投与実験においてトリテルペンや類似体である二次代謝型ステロイドに対する酸化酵素活性を検出した例は数例に過ぎない（非特許文献４及び５）。
Ｐ４５０をはじめとする多くの酸化酵素は、ＮＡＤＰＨやＦＭＮなどほかの因子を要求する膜結合型の酵素であり、安定性が低く、酵素タンパク質の精製が難しい。それゆえ、植物体や培養細胞レベルでの活性をまず検出し、酵素の精製を行い、その情報をもとに生合成遺伝子を同定するという、従来の手法でのトリテルペン酸化酵素のクローニングは、困難を極める。
【０００５】
マメ科のダイズ（Glycine max）はトリテルペンサポニンである多種のソヤサポニン類を産生する（非特許文献６及び７）。これらのアグリコン部の構造をもとに、主に２つのグループ、ＡとＢに分類される。その一方であるグループＢサポニンのアグリコン部はソヤサポゲノールＢ［soyasapogenol B (olean-12-ene-3β,22β, 24-triol)］であり、β−アミリン［β-amyrin (olean-12-ene-3β-ol)］の２２位及び２４位の水酸化体である。すなわち、ダイズにはβ−アミリンを水酸化する酵素が存在すると考えられる。ソヤサポゲノールＢはβ−アミリンから２段階の水酸化で生合成されると考えられている。さらに糖転移反応により、最終的にソヤサポニン（例えば、soyasaponin I）が生成する。
β−アミリンの２４位の水酸化に関しては、本発明者らが、機能ゲノム学的な手法を用いて、ダイズからβ−アミリン及びソフォラジオール［sophoradiol (olean-12-ene-3β,22β-diol)］の２４位を水酸化する酵素ＣＹＰ９３Ｅ１を同定している（非特許文献８及び特許文献１）。
【０００６】
【化１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／０８０５７２号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】E. J. Corey, S. P. T. Matsuda, B. Bartel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 2211-2215
【非特許文献２】E. J. Corey, S. P. T. Matsuda, B. Bartel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11628-11632
【非特許文献３】J. B. R. Herrera et al., Phytochem. (1998) 49, 1905-1911
【非特許文献４】H. Hayashi et al., Phytochem. (1993) 34, 1303-1307
【非特許文献５】M. Peterson, H. U. Seitz, FEBS Lett. (2006) 1985, 188, 11-14
【非特許文献６】S. Kudou et al., Biosci. Biotech. Biochem. (1993) 57, 546-550
【非特許文献７】M. Shiraiwa et al., Agric. Biol. Chem. (1991) 55, 315-322
【非特許文献８】M. Shibuya, M. Hoshino, Y. Katsube, H. Hayashi, T. Kushiro, Y. Ebizuka, FEBS J. (2006) 273, 948-959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ソヤサポゲノールＢの生合成前駆体であるβ−アミリンは、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンが閉環することにより生合成され、さらに、二段階の水酸化反応を経てソヤサポゲノールＢが生合成される。しかしながら、この反応に関与するオレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素の遺伝子は未だ解明されていない。そのため、オレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素を遺伝子工学的に利用することは不可能となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した結果、オレアナン型トリテルペンの２２位の水酸化酵素の遺伝子を特定し、この遺伝子がオレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化させることを見出した。更に、２２位の水酸化酵素の遺伝子を２４位の水酸化酵素の遺伝子と合わせて共発現させることにより、ソヤサポゲノールＢを大量に効率よく生産することを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のものを提供するものである。
１．オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
２．上記１記載のポリヌクレオチドであって、
以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチドであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
３．上記１又は２記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
４．上記３記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換細胞。
５．形質転換細胞が酵母である、上記４記載の形質転換細胞。
６．下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチド、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチド、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含む（好ましくは、からなる）ポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
７．上記１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した２つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソフォラジオールを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソフォラジオールの製造方法。
８．上記７に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、上記７に記載の方法。
９．前記宿主細胞が酵母である、上記７又は８に記載の方法。
１０．上記１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターと、オレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した３つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソヤサポゲノールＢを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソヤサポゲノールＢの製造方法。
１１．上記１０に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、上記１０に記載の方法。
１２．前記宿主細胞が酵母である、上記１０又は１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素の遺伝子を明らかにすることができた。また、遺伝子工学的手法を用いて、特定の２２位水酸化酵素の遺伝子と特定のシトクロムＰ４５０の遺伝子を組み合わせて共発現させることにより、２２位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを直接培養により大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例２で実施したダイズＣＹＰ７２Ａ６１全長配列の決定方法の概略を示す説明図である。
【図２】図２は、実施例９で作製した形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を作製するときに用いた各プラスミドの構造を示す模式図である。
【図３】図３は、実施例７で実施した、酵母ＩＮＶＳｃ１株においてＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲを共発現させた形質転換体からの抽出物のトータルイオンクロマトグラムを表したものである。Ａ：オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールアセチル化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS-GmCPR菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図４】図４は、図５における保持時間９．０５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ａ：オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールアセチル化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS-GmCPR菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図５】図５は、実施例９で実施した、酵母ＧＩＬ７４７株においてＰＳＹ、ＧｍＣＰＲ、ＣＹＰ７２Ａ６１を共発現させた形質転換体からの抽出物のトータルイオンクロマトグラムを表したものである。Ａ：ソフォラジオールＴＭＳ化体標品、Ｂ：GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｃ：GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図６】図６は、図５における保持時間９．０５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ａ：ソフォラジオールＴＭＳ化体標品、Ｂ：GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61抽出物である。
【図７】図７は、実施例１１で実施した、酵母ＩＮＶＳｃ１株においてＧｍＣＰＲ及びＣＹＰ７２Ａ６１を共発現させた形質転換体からの抽出物のｍ／ｚ＝３０６のクロマトグラムを表したものである。Ａ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図８】図８は、図７における保持時間９．８５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ａ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｂ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｃ：INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図９】図９は、実施例１２で作製した形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61の作製に用いた各プラスミドの構造を示す模式図である。
【図１０】図１０は、実施例１２で実施した、酵母ＧＩＬ７４７株においてＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲ、ＣＹＰ７２Ａ６１の共発現させた形質転換体からの抽出物のトータルイオンクロマトグラムを表したものである。Ａ：ソフォラジオールＴＭＳ化体標品、Ｂ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｃ：GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物、Ｄ:GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS菌体抽出物である。
【図１１】図１１は、図１０における保持時間９．８５分ピークのＭＳ開裂パターンを表したものである。Ｂ：ソヤサポゲノールＢ ＴＭＳ化体標品、Ｃ：GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61菌体抽出物である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明におけるオレアナン型トリテルペンとしては、例えば、β−アミリン、ソフォラジオール、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオール、ソヤサポゲノールＡ、ソヤサポゲノールＢなどが知られているが、本発明におけるオレアナン型トリテルペンは、上記の物質に限定されるものではない。
２２位が水酸化されるオレアナン型トリテルペンとしては、β−アミリン、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールなどが挙げられるが、本発明の方法により２２位が水酸化される物質であれば、これらの物質に限定されるものではない。
【００１５】
ダイズ由来のＥＳＴ及び機能未解明の塩基配列が報告されているシトクロムＰ４５０クローン５種［TIGR (The Institute for Genomic Research) Accession Number: TC204312, TC225935, TC218097, TC224852, TC209136］を選択した。この中で、ＣＹＰ７２Ａ６１（GenBank Accession Number: DQ335793, TIGR Accession Number: TC204312）に高い相同性を示した配列番号１のポリヌクレオチドが２２位の水酸化活性を有していた。しかし、他の４種の塩基配列については、２２位の水酸化活性が認められなかった。
【００１６】
本発明において、配列番号１のポリヌクレオチド又はその均等体の転写・翻訳産物を利用して２２位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを製造することができる。なお、均等体とは、配列番号１で表される塩基配列でコードされるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列）からなるポリペプチドの有する機能（特には、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性）と同一機能を有し、配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列をいう。
【００１７】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、配列番号１のポリヌクレオチドを有するＤＮＡの一部又は全部あるいはその相補鎖をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法によりポリヌクレオチドを確認することをいう。ハイブリダイズを使用する手法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などが挙げられる。具体的には、０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、５５℃でハイブリダイゼーションを行なった後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０からなる）を用いる場合が一例として挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor laboratory, 1989などに記載されている方法に準じて行なうことができる。
【００１８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、特にはＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。同一性とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。具体的には、ＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information）を用いて計算したときに、配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつオレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、具体的には、配列番号１の塩基配列において、１若しくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加され、かつ、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されるヌクレオチドの個数は、上記の活性を有するポリペプチドをコードする数であれば、特に限定されない。
【００２０】
シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１のポリヌクレオチドに対する変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異も含む。人為的に変異させる手段としては、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１のポリヌクレオチドを用いて、ランダム変異、あるいは部位特異的突然変異を導入し、遺伝子工学的に、１若しくは複数のヌクレオチド残基が欠失、置換、挿入、若しくは付加の少なくとも１つがなされているポリヌクレオチドを得る方法が挙げられる。こうして得られた変異ポリヌクレオチドを利用することにより、本酵素の活性の至適温度、熱安定性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、基質特異性等の性質が異なったポリペプチドを得ることが可能となる。
【００２１】
本発明において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜１０個、更により好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２である。
本発明のポリペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００２２】
ここで、「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００２３】
２２位が水酸化されたオレアナン型トリテルペンを産生し得る、微生物、植物又は動物に対して、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１の塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部、全部又はその相補鎖をプローブとして、ハイブリダイズを使用する手法（例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法など）または、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１の塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部、全部又はその相補鎖をプライマーとして、ＰＣＲを行う手法等によって、シトクロムＰ４５０遺伝子ＣＹＰ７２Ａ６１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることもできる。
また、上記のポリヌクレオチドは、塩基配列の情報を基にして、化学合成によって得ることもできる。その方法は、Gene, 60, 1, 115-127,1987の記載を参照して行うことができる。
【００２４】
本発明の遺伝子又は組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。
また、本発明において、オレアナン型トリテルペンの２４位を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、あるいはβ―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入することもできる。前者の例としては、国際公開第WO2005/080572号パンフレット記載のオレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素遺伝子pESC-CYP93E1、後者の例としては、β−アミリン合成酵素遺伝子ＰＳＹ（Accession No.AB034802、Eur.J.Biochem.,267,p.3543-3460,2000）が挙げられる。
宿主細胞としては、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、種類は特に限定されず、微生物、酵母、糸状菌、植物、動物などを用いることができる。例えば、微生物としては、バチルス属やストレプトマイセス属などのグラム陽性菌、大腸菌などのグラム陰性菌などが挙げられる。
【００２５】
酵母としては、例えば、ヘム合成能及び脂質酸合成能が欠損しているＧＩＬ７４７株を用いることができる。このＧＩＬ７４７株はＧＬ７株（E.G.Gollub et al., J. Biol. Chem., 252, 2846-2854 (1977)）とＷ３０３株（Genetics 142(3):749-59）を掛け合せた菌株であり、本発明で用いることのできるその他の酵母としては、ラノステロール合成酵素ＥＲＧ７が欠損しているＧＩＬ７７株（Kushiro,T. et al., Eur. J. Biochem., 256, 238-2448(1998)）を用いることができる。また、ＩＮＶＳｃ１株（Invitogen社製）、ＩＮＶＳｃ２株（Invitogen社製）なども用いることができる。
【００２６】
糸状菌としては、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、フザリウム属、トリコデルマ属などを用いることができる。植物としては、ダイズなどを用いることができる。また、動物としては、カイコなどを用いることができる。哺乳類細胞としては、ＨＦＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞などを用いることができる。
【００２７】
宿主細胞の培地、培養条件は、公知の方法により適宜選択して用いることができる。微生物を宿主細胞として用いる場合、得られた形質転換体を培養する培地は、当該微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００２８】
炭素源としては、ポテトデキストロース、グルコース、スクロース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機塩、若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の窒素化合物、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキスなどを用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸マグネシウムなどを用いることができる。
【００２９】
微生物の形質転換では、プロトプラスト法、コンピテント細胞を用いる方法などを用いることができる。酵母を宿主細胞として組み換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法などを挙げることができる。宿主細胞がカイコの場合、例えば、バキュロウイルス発現系を用いた公知の方法（Appl.Microbiol.Biotechol.,62,1-20,2003）により、本発明のポリペプチドを発現させることができる。
【００３０】
また、植物細胞を宿主細胞として形質転換体を作製する場合、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド又はバイナリープラスミド系、アグロバクテリウム・リゾジェネスのＲｉプラスミド、ポリエチレングリコールを用いる直接的な遺伝子伝達またはエレクトロポレーション法が有効である（Methods in Molecular Biology, 267, Recombinant Gene Expression, 329-350,2004）。
【００３１】
本発明の遺伝子は適当なベクターに挿入して用いることができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されない。例えば、自立的に複製するベクター（例えば、プラスミドなど）でもよいし、あるいは宿主細胞に導入された際に宿主のゲノムに組み込みことが可能であり、また、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。その中でもベクターとしては、発現ベクターを用いるのが好ましい。
【００３２】
発現ベクターとしては、本発明のポリヌクレオチドを転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
宿主細胞が微生物である場合、発現ベクターとしては、例えば、pBuescript（Stratagene社製）、pUC（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）などが挙げられる。
そして、プロモーターとしては、大腸菌、糸状菌などの宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されない。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ptrp）、ｌａｃプロモーター（Plac）などの大腸菌やファージなどに由来するプロモーター、タカアミラーゼ遺伝子プロモーター、ＴＥＦ１遺伝子プロモーターなどの麹菌などに由来するプロモーターなどを挙げることができる。また、人為的に設計や改変を行なったプロモーターなども用いることができる。
【００３３】
宿主細胞が酵母である場合、発現ベクターとしては、例えば、pAUR101（タカラバイオ社製）、pAUR112（タカラバイオ社製）、pI-RED1（東洋紡績社製）、pYES2（Invitogen社製）、pESC-URA（Stratagene社製）、pESC-HIS（Stratagene社製）、pESC-LES（Stratagene社製）などが挙げられる。
このときのプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。例えば、解糖系酵素遺伝子プロモーター、Ｇａｌプロモーターなどのプロモーターなどを用いることができる。
【００３４】
本発明の組み換えベクターはさらに形質転換体を選択するための選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーとしては、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などを適宜用いることができ、例えば、宿主が細菌である場合にはアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等、宿主が酵母である場合にはトリプトファン合成遺伝子（例えばＴＲＰ１）、ウラシル合成遺伝子（例えばＵＲＡ３）、ロイシン合成遺伝子（例えばＬＥＵ２）等、宿主がカビである場合にはハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）等を用いることができる。
【００３５】
組み換えベクターの導入方法としては、上記の宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法（Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol. 153, 163 (1983)）などが挙げられる。
【００３６】
本発明の形質転換体は、色々な態様があるが、例えば、酵母ＧＩＬ７４７株を用い、これに２種類のプラスミドpESC-URA-PSY及びpESC-HIS-CYP72A61を組み込んで作製することができる。この形質転換体によれば、ソフォラジオールを製造することができる。この場合、更にダイズ由来のＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（GmCPR）遺伝子（Accession No. AY170374）をプラスミドpESC-LEU-GmCPRとして加えることにより、共発現系でＰ４５０の活性が更に増大させることができる。このGmCPRを加えた形質転換体酵母をGIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61と命名し、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11138として寄託されている。
【００３７】
本発明の形質転換体を用いてソヤサポゲノールＢを製造する場合、例えば、酵母ＩＮＶＳｃ１株を用い、これにプラスミドpESC-HIS-CYP72A61及びpESC-LEU-GmCPRを組み込み、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールを添加することでソヤサポゲノールＢを製造することができる。また、例えば、酵母ＧＩＬ７４７株を用い、これに３種類のプラスミドpESC-URA-PSY-CYP93E1、pESC-LEU-GmCPR、pESC-HIS-CYP72A61を組み込むことで製造することができる。すなわち、本発明の２２位水酸化酵素の遺伝子と共に２４位水酸化酵素の遺伝子を組み込むことにより、一工程でβ−アミリンからソヤサポゲノールＢを製造することができる。なお、上記形質転換体酵母をGIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61と命名し、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11139として寄託されている。
【００３８】
オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールは、酵母ＧＩＬ７７株にプラスミドpESC-PSY-CYP93E1を組み込んだ形質転換体酵母により製造することができる。なお、上記形質転換体酵母をGIL77/pESC-PSY-CYP93E1と命名し、平成16年2月6日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM P-19675として寄託され、平成17年1月6日に国際寄託（受託番号FERM BP-10201）へ移管されている。
【００３９】
本発明のポリペプチドを形質転換体の培養物から単離精製するには、公知の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、緩衝液に懸濁して、ホモジナイザー、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕後、遠心分離して無細胞抽出液を得る。さらに、該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法で用いられる手法により精製したポリペプチドを得ることもできる。
緩衝液には、ポリペプチドの失活を防ぐため、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを添加することができる。さらに、比活性を高めるために、ポリペプチドを精製することも有効である。
精製方法としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等が挙げられ、これらは単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。
【００４０】
また、本発明のポリペプチドが細胞内に不溶状態で発現した場合は、上記と同様に細胞を破砕後、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法によりポリペプチドを回収することができる。さらに、得られたポリペプチドの不溶体を変性剤で可溶化し、希薄溶液に希釈あるいは透析した後、上記と同様の単離精製法により精製ポリペプチドを得ることができる。
【００４１】
本発明のポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその誘導体を回収することができる。そして、培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製ポリペプチドを得ることができる。
【００４２】
得られたポリペプチドを含む緩衝液に、基質となるオレアナン型トリテルペン並びに補酵素を添加して、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃でインキュベートする。補酵素としては、ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨが利用でき、グルコース−６−リン酸とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いたＮＡＤＰＨ再構成系を併用できる。また、形質転換細胞が産生するＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０リダクターゼ以外のＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０リダクターゼの遺伝子を外部から組み込んで水酸化反応を起こさせることもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４４】
《実施例１》ダイズ種子からのｃＤＮＡの調製
ダイズ（Glycine max）種子（青大豆、虎屋産業株式会社）を湿らせた脱脂綿上に蒔き、２５℃、暗所条件下で５日間育成した。得られた芽生え５．３ｇを回収し、液体窒素で凍結し、乳鉢を用いて細かくすり潰した。これをｐＨ９．０の１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液４．５ｍＬへ懸濁し、さらに５ｍＬのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール２５：２４：１の溶液（ｐＨ９．０の１ｍｏｌ／Ｌの１ｍｏｌ／Ｌ トリス−塩酸緩衝液を加え、飽和させたものである。以下、ＰＣＩという）及び０．５ｍＬの１０％ＳＤＳ水溶液を加え、氷上でよく混合した。これを１ｍＬずつ分注し、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を回収した。更に、この溶液に４００μＬのＰＣＩを加えてよく混合し、前記同一条件で上層を回収した。これらの上層を合わせて２４０μＬずつ分注し、それぞれに３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム水溶液２４μＬ及びエタノール８００μＬを加え、−８０℃で１時間冷却し、エタノール沈殿を行った。これを４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を廃棄して、沈殿を合計８００μＬの滅菌水に溶解してひとつにまとめた。更にそれを４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収し、３５０μＬずつ２本のチューブに分注した。それぞれに３５０μＬの４ｍｏｌ／Ｌ塩化リチウム水溶液を加えて混合し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を廃棄した。それぞれに１８０μＬの７０％エタノール水溶液を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を廃棄した。真空乾燥後、それぞれに５０μＬの滅菌水を加えて沈殿を溶解し、全ＲＮＡ（各０．７８μｇ／μＬ、１．１７μｇ／μＬ）を得た。
【００４５】
この全ＲＮＡ５μｇに１μＬのオリゴｄＴプライマー（RACE32）を加え、Super Script（商標）III逆転写酵素（Invitrogen社製）を用い、添付されているマニュアルに従って逆転写反応を行った。得られた産物に滅菌水８０μＬを加えて希釈し、ＰＣＲ用のダイズのｃＤＮＡテンプレートを調製した。
【００４６】
RACE32：
5’- gac tcg agt cga cat cga t14 -3’ （配列番号３）
【００４７】
《実施例２》ＣＹＰ７２Ａ６１全長配列の決定
ダイズＥＳＴデータベース（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）上のダイズＣＹＰ７２Ａ６１は、Ｎ末端部分を１５０アミノ酸残基程度欠けた部分長ＴＣ（Tentative Consensus）配列ＴＣ２０４３１２であった。なお、現在はＴＣ３４３１２８へ引き継がれている。
この部分長ＴＣ配列ＴＣ２０４３１２は、ＧｅｎＢａｎｋ上にあるMedicago truncatula（マメ科）のＣＹＰ７２Ａ６１（ＭｔＣＹＰ７２Ａ６１：Accession No. DQ335793）と８３％の高い相同性を示した。
このＭｔＣＹＰ７２Ａ６１配列をもとにプライマーを設計し、ＴＣ２０４３１２の上流配列を確認した。このＭｔＣＹＰ７２Ａ６１配列と４９％の相同性を有するArabidopsis thaliana（アブラナ科）のＣＹＰ７２Ａ５（ＡＢＣＹＰ７２Ａ５）の配列を比較したところ、Ｎ末端から５０ｂｐほどのところに、保存されたトリプトファンを含む配列が存在した。そのトリプトファンを指定するコドンは１つであったため、この部分に相当するＭｔＣＹＰ７２Ａ６１塩基配列をもとにしてセンスプライマー（Mt72A61-S）を設計した。また、アンチセンスプライマー（GmTC204312-1st）はＴＣ２０４３１２配列のＣ末端から１１００ｂｐほど上流の配列をもとに設計した。この２つのプライマーと実施例１で調製したｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲ法により断片の増幅を行った。
【００４８】
ここで得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡ分子量マーカーKb ladder（タカラバイオ社製）により、目的断片付近（３５０〜４５０ｂｐ）を切り出し、MonoFas（商標）DNA精製Kit Ｉ（GL Sciences社製）で精製し、１０μＬの滅菌水で溶出した。この溶出物の１μＬをテンプレートとしてセンスプライマー（Mt72A61-S）とアンチセンスプライマー（GmTC204312-2nd）を用いてＰＣＲを行った。その反応後、反応液をSuprec 02（商標）filter（タカラバイオ社製）に移し、プライマーを除去した後、エタノール沈殿を行い、２０μＬの滅菌水に溶解した。DNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて、この断片とpT7bule T-vector（Novagen社製）のライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp, X-gal, IPTG）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーのうち白色のコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーを選抜した。選抜したコロニーをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit（GE Healthcare社製）を用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製した。このプラスミドについて、インサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）によりＴＣ２０４３１２のＮ末上流の配列の一部を確認した。
【００４９】
更に上流の配列を決定するために、５’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA End）を行った。実施例１で調製したダイズＲＮＡを鋳型とし、ＲＡＣＥ３２プライマーの代わりにＴＣ２０４３１２のＣ末端配列をもとに設計したアンチセンスプライマー（GmTC204312-ClaI-C）を用いてSuper Script（商標）III（Invitrogen社製）のマニュアルに従って、逆転写反応を行い、５’−ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡテンプレートを調製した。これを鋳型とし、ＲＡＣＥ３２プライマーと、先のＰＣＲで得た配列をもとに設計したアンチセンスプライマー（GmTC204312-3rd）を用いてＰＣＲを行った。
【００５０】
得られた断片を精製後、その一部をテンプレートとしてセンスプライマー（RACE17）とアンチセンスプライマー（GmTC204312-4th）を用いたＰＣＲを行った。その反応後、反応液をSuprec 02（商標）filter（タカラバイオ株式会社製）に移し、プライマーを除去した後、エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。DNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて、この断片とpT7blue T-vector（Novagen社製）のライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp, X-gal, IPTG）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーのうち白色のコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーを選抜し、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit（GE Healthcare社製）を用いて、大腸菌培養液からプラスミドを精製した。これらについて、インサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により確認し、ＣＹＰ７２Ａ６１の全長配列（塩基配列が配列番号１、アミノ酸配列が配列番号２である）を決定した。本実施例の手順の概略を図１に示す。
【００５１】
Mt72A61−S：
5’- gtg ttg ata tgg tgg att tgg -3’ （配列番号４）
GmTC204312−1st：
5’- ctg tgt tta gcc cac ttg tcg cca tc -3’ （配列番号５）
GmTC204312-2nd：
5’- ctt gaa aag tgg act agt gtc ggg c -3’ （配列番号６）
GmTC204312-3rd：
5’- tcc aat caa agg gcg gta gg -3’ （配列番号７）
GmTC204312-ClaI-C：
5’- ggt agc tac tag agt ttg cgt aaa atg aga tga gcc -3’ （配列番号８）
RACE17：
5’- gac tcg agt cga cat cg -3’ （配列番号９）
GmTC204312-4th：
5’- ttg aga cgc ctc tct atc ctc -3’ （配列番号１０）
【００５２】
《実施例３》ダイズ由来ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（ＧｍＣＰＲ）遺伝子のクローニング
Siminszkyらの報告（B. Siminszky et al., Pest. Biochem. Physiol. (2003) 77, 35-43）をもとに、ＧｅｎＢａｎｋより、ダイズ由来のＧｍＣＰＲ（Accession No. AY170374）配列情報を得た。これをもとに、開始コドン上流にＢａｍＨＩサイトを付加したＮ末端プライマー（GMR-BamHI-S）及び終止コドン下流にＳａｌＩサイトを付加したＣ末端プライマー（GMR-SalI-A）を設計し、実施例１で調製したＰＣＲ用のダイズｃＤＮＡテンプレートからＰＣＲにより断片の増幅を行った。その結果、目的とする約２ｋｂｐの増幅断片が得られていることを電気泳動で確認した。
【００５３】
GMR-BamHI-S：
5’- gtt tgt gga tcc acc atg gct tcg aat tcc -3’ （配列番号１１）
（下線部はBamHI認識部位である）
GMR-SalI-A：
5’- taa tca gtc gac tta cca gac atc tct aag -3’ （配列番号１２）
（下線部はSalI認識部位である）
【００５４】
《実施例４》発現プラスミドpESC-HIS-GmCPRの構築
実施例３の残りの反応液全量についてSuprec 02（商標） filterを用いてプライマーを除去し、その液量と等量のＰＣＩを加えて撹拌後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を回収した。これをエタノール沈殿に供して増幅断片を回収し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで消化を行った後、エタノール沈殿によりＧｍＣＰＲ断片を回収し、挿入した。同様に酵母発現用ベクターpESC-HIS（Stranagene社製）をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで酵素消化後、エタノール沈殿により回収し、これをアルカリホスファターゼ（Shrimp由来）（タカラバイオ社製）を用いて末端を脱リン酸化後、エタノール沈殿により回収した。これらをDNA Ligation Kit Ver.2.1を用いてライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーの選抜を行い、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kitを用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製し、プラスミド溶液の一部をＮｈｅＩで消化して、得られたプラスミドが目的のものであることを確認した。これらについて、インサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により、pESC-HIS-GmCPRと確認した。
【００５５】
《実施例５》発現プラスミドpESC-LEU-GmCPRの構築
実施例４のpESC-HIS-GmCPRプラスミド溶液を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで消化し、この全量をGel Indicator（商標） DX（BioDynamics Laboratory 社製）を用いて染色したアガロースゲルSeakem（商標） ME agarose（Cambrex社製）で電気泳動し、ＧｍＣＰＲに相当する約２ｋｂｐの断片を切り出し、MonoFas（商標） DNA精製Kit I（GL Sciences社製）で精製した。一方、発現用ベクターpESC-LEU（Stranagene社製）はＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで消化後、エタノール沈殿により回収した。これをアルカリホスファターゼ（Shrimp由来）（タカラバイオ社製）を用いて末端を脱リン酸化後、エタノール沈殿により回収した。
【００５６】
これと精製したＧｍＣＰＲ断片をDNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーの選抜を行い、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit（GE Healthcare社製）を用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製し、プラスミド溶液の一部を制限酵素ＣｌａＩで消化した。このプラスミドのインサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により、pESC-LEU-GmCPRと確認した（図２）。
【００５７】
《実施例６》発現プラスミドpESC-URA-PSY-CYP93E1の構築
ガラクトース誘導性発現ベクターpESC-URA（Stranagene社製）のマルチクローニングサイト２にエンドウ（Pisum sativum）由来のβ−アミリン合成酵素遺伝子ＰＳＹ（Accession No.AB034802、Eur.J.Biochem.,267,p.3543-3460,2000）を組み込んだ発現プラスミドpESC-URA-PSY（図２）を大腸菌ＤＨ５αへ導入し、プラスミドを増幅して調製した。このプラスミドのマルチクローニングサイト１にpESC-CYP93E1を組み込んでpESC-URA-PSY-CYP93E1を調製した。なお、pESC-CYP93E1は国際公開第WO2005/080572号パンフレット記載の方法により調製したものを用いた。
【００５８】
《実施例７》酵母ＩＮＶＳｃ１株におけるpESC-URA-PSY-CYP93E1、pESC-HIS-GmCPR共発現
実施例３で得られたＧｍＣＰＲを共発現系に加えた場合と加えない場合とを比較して、ＣＹＰ９３Ｅ１のβ−アミリン水酸化活性の増大の有無を確認した。宿主細胞にはウラシル（ＵＲＡ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）、ロイシン（ＬＥＵ）、トリプトファン（ＴＲＰ）の４つの選択マーカーをもつ酵母ＩＮＶＳｃ１株（Invitrogen）を用いた。
Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）（ZYMO RESEARCH社製）により、ウラシル、ヒスチジンを除いた、グルコースを炭素源とする合成完全（ＳＣ−Ｕ−Ｈ）寒天培地で３０℃、２日間培養し、ＩＮＶＳｃ１株をpESC-URA-PSY-CYP93E1とpESC-HIS-GmCPRの２種のプラスミドで形質転換して、形質転換酵母INVSc1/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-HIS-GmCPRを得た。なお、ＳＣ−Ｕ培地の調製は、Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course manual, Cold Spring Harbar Laboratory Press, 1990の記載に基づいて行った。
【００５９】
この培地上のコロニーを２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｈ液体培地に植菌し、３０℃で２日間振倒培養した。そして、この培地からグルコースを除いたＳＣ−Ｕ−Ｈ−Ｇｌｕ液体培地へ置換し、２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）及びヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）を加えて、さらに３０℃で２日間振倒培養した。この培養液を１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに２０％水酸化カリウム水溶液（５０％エタノール含有）を加えて５分間煮沸した。その後、ヘキサン２ｍＬを用いて脂溶性物質を抽出した。他方、pESC-HIS-GmCPRの代わりに空ベクターpESC-HISを用いた形質転換体を同様に作製し、脂溶性物質を得た。
【００６０】
これらの抽出物に１００μＬの無水酢酸及び２０μＬのピリジンを加え、室温で１２時間反応させ、アセチル化した。１００μＬのメタノール及び２００μＬの滅菌水を加えて反応を停止し、脂溶性物質をヘキサン２ｍＬで２回抽出した。その脂溶性物質を２００μＬのアセトンに溶解し、その１μＬをＧＣ−ＭＳで分析した。その結果、トータルイオンクロマトグラム上で、ＧｍＣＰＲを組み込んだ形質転換体（図３−Ｂ）はＧｍＣＰＲを組み込まない形質転換体（図３−Ｃ）よりも、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールの生成量が明らかに増大した。よって、ＧｍＣＰＲを共発現系に加えることでＰ４５０の活性を増大させることが確認できた（図３、図４）。
【００６１】
《実施例８》発現プラスミドpESC-HIS-CYP72A61の構築
実施例２で得られた配列情報をもとに、開始コドン上流にＣｌａＩサイトを付加したＮ末端センスプライマー（CYP72A61-ClaI-S）及び終止コドン下流にＳａｃＩサイトを付加したアンチセンスプライマー（CYP72A61-SacI-R）を設計し、実施例１で作製したダイズｃＤＮＡテンプレートからＰＣＲにより断片の増幅を行った。
CYP72A61-ClaI-S：
5’- gaa ttc atc gat gct tat gtc tgg cac ag -3’ （配列番号１３）
（下線部はClaI認識部位である）
CYP72A61-SacI-R：
5’- gaa ttc gag ctc aga gtt tgc gta aaa tg -3’ （配列番号１４）
（下線部はSacI認識部位である）
【００６２】
目的とする約１６００ｂｐの断片が得られていることを電気泳動により確認した後、残りの反応液全量についてSuprec 02（商標） filter（タカラバイオ社製）を用いてプライマーを除去し、その液量と等量のＰＣＩを加えて撹拌後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層を回収した。これをエタノール沈殿に供して増幅断片を回収し、ＣｌａＩ、ＳａｃＩで酵素消化を行った後、エタノール沈殿により断片を回収し、ＤＮＡインサートとした。
【００６３】
同様にpESC-HISをＣｌａＩ、ＳａｃＩで酵素消化後、エタノール沈殿により回収し、これをアルカリホスファターゼ（Shrimp由来）（タカラバイオ社製）を用いて末端を脱リン酸化後、エタノール沈殿により回収した。これらをDNA Ligation Kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ（+amp）プレートで３７℃、１６時間培養した。生じたコロニーについて、コロニーＰＣＲで確認してコロニーの選抜を行い、これらをＬＢ（+amp）培地で３７℃、１６時間培養した。GFX Micro Plasmid Prep kit(GE Healthcare社製)を用いて大腸菌培養液からプラスミドを精製し、プラスミド溶液の一部をＮｈｅＩで消化した。このプラスミドのインサートの核酸配列をキャピラリーＤＮＡシーケンサーABI PRISM（商標）3100（Applied Biosystem社製）により、pESC-HIS-CYP72A61と確認した（図２）。
【００６４】
《実施例９》形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61の調製及び抽出物の同定
ＹＰＤ（１％イーストエキストラクト、２％ペプトン、２％グルコース）＋ＨＥＴ［ヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）、エルゴステロール（終濃度２０μｇ／ｍＬ）、ｔｗｅｅｎ８０（終濃度３８ｍｇ／ｍＬ）］寒天培地上のＧＩＬ７４７株のコロニーを１０ｍＬのＹＰＤ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで ２日間振倒培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標） (ZYMO RESEARCH社製)を用いて、ＧＩＬ７４７のコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。なお、前記ＧＩＬ７４７株は、東京大学大学院薬学研究系研究科天然物化学研究室において分譲可能な状態で保管されている。
【００６５】
このＧＩＬ７４７コンピテントセルを用いて、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）のプロトコルに従い、ＧＩＬ７４７株にpESC-URA-PSYを導入し、ＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、２日間培養した。このプレート上のコロニーを、１０ｍＬのＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２日間振倒培養し、同様の方法によりGIL747/pESC-URA-PSYコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。
さらに、このGIL747/pESC-URA-PSYコンピテントセルを用いて、先と同様に、GIL747/pESC-URA-PSYに実施例５で調製したpESC-LEU-GmCPR及び実施例８で調製したpESC-HIS-CYP72A61を導入し、ＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、３日間培養し、GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を調製した。
【００６６】
この寒天培地上のコロニーを２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ液体培地へ植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで５日間振倒培養した。この液体培地から２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ−Ｇｌｕ液体培地へ置換し、２ｍＬの２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）を加え、さらに２４時間振倒培養した。この液体培地を１０ｍＬのｐＨ７．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−カリウム緩衝液へ置換し、１００μＬのヘム溶液（終濃度１３μｇ／ｍＬ）、１ｍＬの３０％グルコース水溶液（終濃度３％）を加え、さらに２日間振倒培養した。このとき、酸素供給が反応律速とならないよう、綿栓を用いた。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに１ｍＬの２０％水酸化カリウム（５０％エタノール）溶液を加えて５分間煮沸した。脂溶性物質を２ｍＬのヘキサンで２回抽出し、濃縮した。一方、対照として、pESC-HIS-CYP72A61の代わりにpESC-HISを用いた形質転換体GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HISを同様の方法により作製し、脂溶性物質を得た。
【００６７】
これらの脂溶性物質に５０μＬのＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミドを加え、８０℃のヒートブロック上で１時間反応させ、トリメチルシリル（ＴＭＳ）化した。これを濃縮し、２００μＬのアセトンに溶解し、１μＬをＧＣ−ＭＳで分析した。
【００６８】
その結果、トータルイオンクロマトグラム上で、対照（図５−Ｃ）には観測されないピークが、保持時間９．０５分に観測された（図５−Ｂ）。このピークの保持時間及びＭＳ開裂パターンは、ソフォラジオール標品のＴＭＳ化体（図５、図６−Ａ）のものと一致した（図５、図６）。下記のＥＩ−ＭＳ開裂様式に示すように、ｍ／ｚ＝３０６のフラグメントは、逆Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に起因するオレアン−１２−エン骨格に特徴的なものであり、ｍ／ｚ＝２９１のフラグメントは、ｍ／ｚ＝３０６のフラグメントからいずれかのメチル基が脱離したものであると考えられる。以上の結果から、ＣＹＰ７２Ａ６１をβ−アミリン−２２位水酸化酵素と同定した。
【００６９】
【化２】
【００７０】
《実施例１０》GIL77/pESC-PSY-CYP93E1の２Ｌ大量培養による基質オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールの製造
酵母ＧＩＬ７７株にpESC-PSY-CYP93E1を導入し、ＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ寒天培地上で３０℃、２日間培養し、形質転換酵母GIL77/pESC-URA-PSY-CYP93E1を作製した。この寒天培地上のコロニーをＳＣ−Ｕ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃で２日間ほど培養した。炭素源として、ラフィノースを用いて作製したＳＣＲ−Ｕ＋ＨＥＴ培地２Ｌにこの培養液を加え、３０℃、１６０ｒｐｍで２日間ほど培養した後、２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）を加えてさらに３０℃で２４時間培養した。この培地をｐＨ７．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−カリウム緩衝液へ交換し、炭素源としてのグルコース（終濃度３％）及びヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）を加え、３０℃で２４間培養した。遠心分離により菌体を回収し、２００ｍＬの水酸化ナトリウム（５０％メタノール）溶液を加えて１時間３０分加熱還流した。２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝３：１溶媒を用いて脂溶性成分を抽出した。これを１Ｎ塩酸、飽和炭酸ナトリウム、飽和食塩水で洗浄した。この抽出操作を３回行い、有機層をあわせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。得られた抽出物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｗａｋｏ ＦＣ−４０シリカゲル）で分析した。ベンゼン：酢酸エチル＝９：１から４：１まで、溶媒組成を変化させて溶出し、４ｍｇの脂溶性物質を得た。これをＮＭＲ測定用重クロロホルムに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。その測定値を文献値（FEBS Journal, (2006)273, 948-959）と比較して、オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールであることを確認した。文献値（FEBS Journal, (2006)273, 948-959）との化学シフト値の比較 (CDCl3, 1H : 500MHz, 13C : 125MHz) を以下に示す。
【００７１】
【化３】
オレアン−１２−エン−３β，２４−ジオール
【００７２】
【表１】
【００７３】
【表２】
【００７４】
《実施例１１》形質転換体INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を用いた酵素活性試験及びソヤサポゲノールＢの生成
ＳＣ−Ｌ−Ｈ寒天培地上のＩＮＶＳｃ１コロニーをＳＣ−Ｌ−Ｈ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２日間振倒培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）を用いて、ＩＮＶＳｃ１のコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。
このＩＮＶＳｃ１コンピテントセルを用いて、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）のプロトコルに従い、酵母ＩＮＶＳｃ１株に実施例５で調製したpESC-LEU-GmCPR及び実施例８で調製したpESC-HIS-CYP72A61を導入して、形質転換し、ＳＣ−Ｌ−Ｈ寒天培地で３０℃、２日間培養し、形質転換酵母INVSc1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を作製した。
【００７５】
プレート上のコロニーを、２０ｍＬのＳＣ−Ｌ−Ｈ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２日間振倒培養した。この液体培地を、１０ｍＬのＳＣ−Ｌ−Ｈ−Ｇｌｕの液体培地へ置換し、１ｍＬの２０％ガラクトース（終濃度２％）及び実施例１０で調製した２５μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌオレアン−１２−エン−３β，２４−ジオールエタノール溶液（終濃度５μｇ／ｍＬ）を加え、さらに３０℃で４日間培養した。この培養液を１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに２０％水酸化カリウム（５０％エタノール）溶液を加えて５分間煮沸した。そして、２ｍＬのヘキサンで２回抽出し、脂溶性成分を得た。
対照として、pESC-HIS-CYP72A61の代わりに空ベクターpESC-HISを用いた形質転換体を同様に作製し、脂溶性成分を得た。
【００７６】
これらの抽出物をアセトンに溶解し、Silica gel 60 F254 with concentrating zone（MERCK社製）を用いて、薄層クロマトグラフィー（Thin LayerChromatography; TLC）を行った。展開溶媒には、ベンゼン９０ｍＬと酢酸エチル１０ｍＬを混合したものを用いた。展開したＴＬＣプレートをＵＶ照射してエルゴステロールのスポットを確認し、これより下の、エルゴステロールを含まない高極性部分を、スパーテルでかきとった。これを酢酸エチル３ｍＬで抽出し、精製した。
【００７７】
これらの抽出物にＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミドを加え、８０℃のヒートブロック上で１時間反応させ、ＴＭＳ化した。これを濃縮し、２０μＬのアセトンに溶解し、１μＬをＧＣ−ＭＳ分析を行った。その結果、保持時間９．８５分に対照（図７−Ｃ）では観測されない、オレアン−１２−エン骨格の開裂で生じる特徴的なｍ／ｚ＝３０６のピークが観測された（図７−Ｂ）。このピークの保持時間及びＭＳ開裂パターンは、ソヤサポゲノールＢ標品のＴＭＳ化体（図７−Ａ）と一致した。
【００７８】
《実施例１２》ＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲ、ＣＹＰ７２Ａ６１の４遺伝子の共発現によるソヤサポゲノールＢの製造
実施例９で作製したＧＩＬ７４７のコンピテントセルを用いて、Frozen-EZ Yeast Transformation II（商標）のプロトコルに従い、ＧＩＬ７４７株にpESC-URA-PSY-CYP93E1及びpESC-LEU-GmCPR（図９）を導入し、ＳＣ−Ｕ−Ｌ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、３日間培養した。プレート上のコロニーを１０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ＋ＨＥＴ液体培地に植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで３日間振倒培養し、同様の方法によりGIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPRコンピテントセルを調製し、−８０℃で保存した。
得られたコンピテントセルに、上記と同様の方法でpESC-HIS-CYP72A61（図９）を導入し、ＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ寒天培地で３０℃、３日間培養し、形質転換体酵母GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61を調製した。
【００７９】
この寒天培地上のコロニーを２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ液体培地へ植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで４日間振倒培養した。この培地を２０ｍＬのＳＣ−Ｕ−Ｌ−Ｈ＋ＨＥＴ−Ｇｌｕ液体培地へ置換し、２ｍＬの２０％ガラクトース水溶液（終濃度２％）を加え、さらに３０℃で２４時間培養した。この培地をｐＨ７．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−カリウム緩衝液１０ｍＬと置換し、１ｍＬの３０％グルコース水溶液（終濃度３％）と、１００μｍのヘミン（終濃度１３μｇ／ｍＬ）を加え、さらに３０℃で２日間培養した。このとき、酸素供給が律速とならないよう、綿栓を用いた。この培養液を１７００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を回収した。これに２０％水酸化カリウム水溶液（５０％エタノール含有）１ｍＬを加えて５分間煮沸した。これをヘキサン２ｍＬで２回抽出し、脂溶性成分を得た。
対照として、pESC-HIS-CYP72A61の代わりに空ベクターpESC-HISを用いた形質転換体を上記と同様の方法により作製し、脂溶性成分を得た。
【００８０】
これらの抽出物にそれぞれ５０μＬのＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミドを加え、８０℃のヒートブロック上で１時間反応させ、ＴＭＳ化した。それを濃縮し、２００ Ｌのアセトンに溶解し、その１μＬをＧＣ−ＭＳにより分析した。その結果、トータルイオンクロマトグラム上で、保持時間９．８５分に対照（図１０−Ｄ）では観測されなかったピークを新たに観測した（図１０−Ｃ）。この保持時間およびＭＳ開裂パターンがソヤサポゲノールＢ標品のＴＭＳ化体（図１０、図１１−Ｂ）のものと一致した。
以上の結果から、ＰＳＹ、ＣＹＰ９３Ｅ１、ＧｍＣＰＲ、及びＣＹＰ７２Ａ６１の４種の遺伝子を酵母発現系で共発現させることにより、ソヤサポゲノールＢが生産されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明により、オレアナン型トリテルペンの２２位を水酸化する酵素を遺伝子工学的に使用することを可能する。これにより、当該水酸化酵素遺伝子を組み込んだ細胞を用いて宿主細胞を利用した水酸化酵素の生産、植物トリテルペンの微生物による生産などの工業化への利用を可能にする。また、２４位の水酸化酵素の遺伝子と合わせて組み込むことにより、ソヤサポゲノールＢなどのトリテルペンの生産を効率よく、大量に生産させることができる。
【受託番号】
【００８２】
形質転換体酵母GIL747/pESC-URA-PSY/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61は、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11138として寄託されている。
形質転換体酵母GIL747/pESC-URA-PSY-CYP93E1/pESC-LEU-GmCPR/pESC-HIS-CYP72A61は、平成21年6月30日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM BP-11139として寄託されている。 形質転換体酵母をGIL77/pESC-PSY-CYP93E1は、平成16年2月6日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に受託番号FERM P-19675として寄託され、平成17年1月6日に国際寄託（受託番号FERM BP-10201）へ移管されている。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。
配列番号３〜１４の各配列で表される塩基配列は、プライマー配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドであって、
以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換細胞。
【請求項５】
形質転換細胞が酵母である、請求項４記載の形質転換細胞。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した２つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソフォラジオールを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソフォラジオールの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が酵母である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターと、オレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した３つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソヤサポゲノールＢを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソヤサポゲノールＢの製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が酵母である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１】
オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドであって、
以下（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、オレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換細胞。
【請求項５】
形質転換細胞が酵母である、請求項４記載の形質転換細胞。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、且つオレアナン型トリテルペンの２２位水酸化酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した２つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソフォラジオールを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソフォラジオールの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が酵母である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターと、β―アミリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターと、オレアナン型トリテルペンの２４位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターとを用意する工程、
前記用意した３つの組換えベクターを同一の宿主細胞内で発現させる工程、
前記発現させた宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞またはその培養上清からソヤサポゲノールＢを精製する工程
を含むことを特徴とする、ソヤサポゲノールＢの製造方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の同一の宿主細胞内において、更に、シトクロムＰ４５０還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えベクターを発現させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が酵母である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−２４５３４（Ｐ２０１１−２４５３４Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７５８８０（Ｐ２００９−１７５８８０）
【出願日】平成２１年７月２８日（２００９．７．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年２月２日、ｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２９／ｗｅｂ／
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２８日（２００９．７．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年２月２日、ｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２９／ｗｅｂ／
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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