３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを調製する方法
フェノチアジン又はフェノキサジンを含む第１反応体を準備し、第１溶媒を準備し、第２反応体を準備し、第２溶媒を準備することを含む、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する方法。第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加え、第１と第２反応体を結合し、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にメディエーターを形成する方法に関する。より詳細には、本発明は、一般に分析対象物に関する情報を決定するのを助けるように適合させた電気化学試験センサーに使用されるメディエーターを形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液中の分析対象物の定量法は、特定の生理学的な体調（身体状態）の診断及び維持において著しく重要である。例えば乳酸塩、コレステロール及びビリルビンを、特定の個人においてモニターするべきである。特に、糖尿病の個人は、食事によるグルコース摂取を調節するために体液におけるグルコースレベルを頻繁に検査することが重要である。そのような試験の結果を、あるとすれば、インスリン又は他の薬剤を投与する必要性の決定に使用することができる。一つの種類の血中グルコース試験系において、試験センサーを血液試料の試験に使用する。
【０００３】
試験センサーは、例えば血中グルコースと反応するバイオセンシング又は試薬物質を含有する。一つの種類の電気化学試験センサーは、基部又は基体及び蓋を含む多層試験センサーである。別の種類の電気化学試験センサーは、基部、スペーサー及び蓋を含む。現在の電気化学試験センサーは、少なくとも２つの電極を電極パターンの形態で含む。電圧がこれらの電極にわたって印加され、電流が作用電極において測定される。電流測定値は、作用電極の大きさに正比例している。
【０００４】
電気化学試験センサーは、目的の分析対象物に関わる酵素触媒化学反応に基づいている。グルコースのモニタリングの場合では、関連する化学反応は、グルコースをグルコノラクトン又はその対応する酸に酸化することである。この酸化は、多様な酵素によって触媒され、それらの幾つかは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（ＮＡＤ（Ｐ））のような補酵素を使用することができ、一方、他のものは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）又はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）のような補酵素を使用することができる。
【０００５】
試験センサーの適用において、グルコースの酸化の際に生成されるレドックス等価物は電極の表面に運ばれ、それによって電気信号が生成される。電気信号の大きさは、グルコース濃度と相関関係にある。酵素の化学反応部位から電極の表面へのレドックス等価物の移動は、電子移動メディエーターを使用して達成される。
【０００６】
例えばフェリシアニドのようなメディエーターの多くは、グルコース試験センサーにおいて配合されたときに信号対雑音比が低くなるような、高いバックグラウンド電流を有する。典型的には、低い信号対雑音比は、特にグルコースレベルが低く、高いヘマトクリット試料レベルでは極めて不正確なアッセイをもたらす。より迅速な試料試験（例えば、１０秒未満の試験時間）では、試験を実施するのに当てられた時間で高いバックグラウンド電流を取り除くことは困難でありうる。より迅速な試料試験時間のため、試料が適用されたときに活性成分が素早く相互反応して、素早い反応を与えることが必要となる。
【０００７】
したがって、低いバックグラウンド電流を有し、同時に、安定性を含むメディエーターの他の望ましい特性を依然として有するメディエーターを形成することが望ましい。
【発明の概要】
【０００８】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する方法には、フェノチアジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する。第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒が準備される。第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす。過硫酸ナトリウムを加えた後、反応溶液を更に処理して３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含めて、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する。
【０００９】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する方法には、フェノキサジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する。第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する。第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす。過硫酸ナトリウムを加えた後、反応溶液を更に処理して３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含めて、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する。
【００１０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成し、安定化する方法には、フェノチアジン又はフェノキサジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノチアジン又はフェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する。第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する。第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する。カップリング剤を反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす。カップリング剤を加えた後、反応溶液を更に処理して３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含めて、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する。
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、約５〜約８のｐＨで安定化する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】一つの実施態様による試験センサーである。
【図１Ｂ】図１Ａの試験センサーの側面図である。
【図２】多様なロットの本発明と比較例のメディエーターに対するバックグラウンド電流のプロットである。
【図３Ａ】幾つかの中和又は緩衝方法及び中和又は緩衝のない幾つかの方法を使用したバックグラウンド電流のプロットである。
【図３Ｂ】ベースラインと図３Ａにおいて測定したバックグラウンド電流とのバックグラウンド電流の変化のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一つの方法において、本発明は、低バックグラウンド電流の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを生成する改善された方法に関する。別の方法において、本発明は、低バックグラウンド電流の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを安定化する改善された方法に関する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、電気化学試験センサーにとって有用なメディエーターであり、一つの例では、ＮＡＤＨの電気化学的再生（酸化）において有用である。
【００１３】
本発明において形成されるメディエーターには、下記の式：
【００１４】
【化１】
【００１５】
を有するフェノチアジン及び下記の式：
【００１６】
【化２】
【００１７】
を有するフェノキサジンが含まれ、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても又は異なっていてもよく、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。これらの異性体が形成されうることも考慮される。
【００１８】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、電気化学試験センサーと使用するために適合される。電気化学試験センサーは、流体試料を受け、計器又は計測器の使用により分析されるように適合される。試験センサーは、分析対象物濃度のような分析対象物に関連する情報を決定するのを助ける。測定されうる分析対象物には、グルコース、コレステロール、脂質プロフィール、マイクロアルブミン、尿素、クレアチニン、クレアチン、フルクトース、乳酸塩又はビリルビンが含まれる。他の分析対象物の濃度を決定できることが考慮される。分析対象物は、例えば、全血試料、血清試料、血漿試料、ＩＳＦ（間質液）及び尿のような他の体液、並びに非体液であることができる。
【００１９】
本明細書に記載されている試験センサーは、電気化学試験センサーである。電気化学試験センサーにより使用される計測器は、検量情報を検出するための光学的側面及び電気化学的側面を有して、分析対象物に関連する情報（例えば、流体試料の分析対象物濃度）を決定することができる。電気化学試験センサーの一つの非限定例が図１Ａに示されている。図１Ａは、基部１１、毛管路、並びに複数の電極１６及び１８を含む試験センサー１０を表す。領域１２は、毛管路を画定する（例えば、基部１１を覆って蓋を被せた後）区域を示す。複数の電極には、対電極１６及び作用（測定）電極１８が含まれる。電気化学試験センサーは、作用電極、対電極、トリガー電極又はヘマトクリット電極のような、少なくとも３つの電極を含有することもできる。本発明の実施態様の電気化学試験センサーに用いられる作用電極は、炭素、白金、パラジウム、金、ルテニウム、ロジウム及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない適切な電極によって変更することができる。
【００２０】
電極１６、１８は、例示の実施態様において試験センサー接点１４ａ、ｂと示されている大型の区域で終止している複数の導電性リード線１５ａ、ｂに結合している。毛管路は一般に流体受容区域１９に配置されている。本発明のメディエーターを用いることができる他の電気化学試験センサーが考慮される。
【００２１】
流体受容区域１９は、流体試料（例えば、血液）中の目的の分析対象物（例えば、グルコース）を、電極パターンの構成要素により、生成される電流として電気化学的に測定可能な化学種に変換する、少なくとも１つの試薬を含む。試薬は、典型的には、分析対象物及び電子受容体と反応して、電極により検出されうる電気化学的に測定可能な種を生成する分析対象物に特異的な酵素を含む。試薬は、分析対象物と電極との間の電子の移動を助けるメディエーターを含む。試薬は、酵素をメディエーターと一緒に保持する結合剤、他の不活性成分又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００２２】
流体試料（例えば、血液）を流体受容区域１９に適用することができる。流体試料は少なくとも１つの試薬と反応する。試薬と反応し複数の電極と連結した後、流体試料は、分析対象物濃度の決定を助ける電気信号を生成する。導電性リード線１５ａ、ｂは、試験センサー１０の第２反対端４２に向かって電気信号を運び、そこで試験センサー接点１４ａ、ｂは、電気信号を計測器に転送する。
【００２３】
図１Ｂを参照すると、図１Ａの試験センサー１０の側面図が示されている。図１Ｂに示されているように、図１Ｂの試験センサー１０は、蓋２０及びスペーサー２２を更に含む。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２は、ポリマー材料のような多様な材料から作製することができる。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を作製するのに使用できるポリマー物質の非限定例には、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリイミド及びこれらの組み合わせが挙げられる。基部１１、蓋２０及び／又はスペーサー２２を形成するのに他の材料が使用できることが
考慮される。
【００２４】
図１Ａ、１Ｂの試験センサー１０を形成するために、基部１１、スペーサー２２及び蓋２０を例えば接着剤又はヒートシールにより取り付ける。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を接着させると、流体受容区域１９が形成される。流体受容区域１９は、流体試料を試験センサー１０に導入する流路を提供する。流体受容区域１９は、試験センサー１０の第１末端又は試験端４０において形成される。本発明の実施態様の試験センサーを、スペーサーなしで基部及び蓋により形成することができ、流体受容区域は基部及び／又は蓋に直接形成される。
【００２５】
スペーサーなしで形成できる電気化学試験センサーも考慮される。例えば、電気化学試験センサーは、基部及び蓋が互いに取り付けられたときに経路（例えば、毛管路）が形成されるように、基部及び蓋を含むことができる。
【００２６】
基部、スペーサー及び蓋を、ポリマー材料のような多様な材料から作製することができる。基部、スペーサー及び蓋を作製するのに使用できるポリマー物質の非限定例には、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリイミド及びこれらの組み合わせが挙げられる。基部、スペーサー及び蓋を他の物質により別々に作製できることが考慮される。電極パターンを、金、白金、ロジウム、パラジウム、ルテニウム、炭素又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない多様な導電性材料から作製することができる。
【００２７】
別の実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを光学試験センサーに使用することができる。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、そのような系において安定したメディエーターである。
【００２８】
一つの方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが形成され、フェノチアジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒が準備される。第２反応体は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために準備される。第２試薬が所望の可溶性を有する第２溶媒が準備される。第１反応体と第１溶媒を一緒に合わせて、第１反応体溶液を形成する。第２反応体と第２溶媒を一緒に合わせて、第２反応体溶液を形成する。第１及び第２反応体溶液を一緒に合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムの溶液を調製し、反応体溶液に加える。過硫酸ナトリウムの溶液は、典型的には、第２溶媒（第２反応体溶液を形成するのに使用したものと同じ溶媒）を使用して形成される。過硫酸ナトリウムは、第１と第２の反応体の結合を引き起こし、形成された生成物を有する反応溶液をもたらす。
【００２９】
この方法において、更なる処理を反応溶液に実行して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する。一つの実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、塩の形態である。別の実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、酸の形態である。幾つかの３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、塩又は酸の形態でなくてもよい。
【００３０】
第２試薬は、所望の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するように選択される。例えば、第２試薬は、アニリン２，５−ジスルホン酸であることができる。アニリン２，５−ジスルホン酸が使用される場合、形成される特定の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。
【００３１】
他の第２試薬を使用して異なる３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成できることが考慮される。例えば、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する第２試薬は、以下から選択することができる：４−ジエチルアミノアニリン；４−クロロアニリン；４−エチルアニリン；４−トリフルオロメチルアニリン；４−アミノ安息香酸メチル；４−ニトロアニリン；４−メトキシアニリン；４−（４’−アミノフェニル）酪酸；４−アミノベンジルアミン；４−（２’−アミノエチル）アニリン；５−アミノ−１，３−ベンゼンジカルボン酸；４−アミノ安息香酸；２，５−（４’−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール；４−〔２’−（２’−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシアニリン及び２，５−ジスルホアニリン。他の第２試薬を使用して他の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成できることが考慮される。
【００３２】
第１溶媒は、第１反応体と適合性があるように選択される。第１反応体が一般に第１溶媒に高い可溶性を有することが望ましい。一つの方法において、第１溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。第１溶媒は、フェノチアジンが一般に高い可溶性を有するので、望ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。第１溶媒は、また、概ね又は実質的に均質の溶液を形成するように、望ましくは第２溶媒と混和性である。
【００３３】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の代わりに、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、１，４−ジオキサン及びスルホランのような他の第１溶媒を使用できることが考慮される。他の第１溶媒を使用できることも考慮される。
【００３４】
第２溶媒は、第２反応体と適合性があるように選択される。第２反応体が一般に第２溶媒に高い可溶性を有することが望ましい。一つの方法において、第２溶媒は水である。別の方法において、第２溶媒は、水と水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の組み合わせである。より塩基性になることで少なくとも一部の第２反応体の可溶性が改善されるので、水酸化ナトリウムが望ましい。他の塩基性溶液を第２溶媒と共に加えて、第２試薬の可溶性の改善を達成することが考慮される。水の代わりに他の第２溶媒を使用できることが考慮される。
【００３５】
過硫酸ナトリウムは、第１と第２反応体の結合を促進する。過硫酸ナトリウムは、望ましくない副産物の形成を回避すると考えられるので、望ましいカップリング剤である。過硫酸ナトリウムをカップリング剤として使用することは、一定の低バックグラウンド電流を得ることを助け、このことは、一般に低量の望ましくない副産物が形成され、溶液中に残留することを意味する。加えて、過硫酸ナトリウムの使用は、有機物質の沈殿を促進して、反応から望ましい３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを容易に単離することを助ける。
【００３６】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するため、カップリング剤が、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を含む反応体溶液に添加された後、更なる処理を実行する。第１溶媒（例えば、テトラヒドロフラン）を、溶液から除去又は抽出することができる。第１溶媒を、例えば、酢酸エチルにより除去することができる。酢酸エチルは、第１溶媒の抽出を助け、反応溶液から他の望ましくない残留有機物質（例えば、水溶性有機物質）の除去を助けることもできる。
【００３７】
例えばジエチルエーテル、クロロホルム及びジクロロメタンのような他の化合物を使用して、第１溶媒を除去することが考慮される。
【００３８】
第２溶媒（例えば、水）は、冷却及び濾過により生成物から除去される。第２溶媒を除去することは、分解の防止又は抑制の助けにもなる。分解を防止又は抑制することによって、バックグラウンド電流は、典型的にはより望ましいより低いレベルになる。例えば冷却及び濾過により除去されなかった残留第２溶媒（例えば、残留水）は、幾つかの方法によって生成物から除去することができる。例えば、残留第２溶媒は、（ａ）真空炉による乾燥、（ｂ）生成物への化合物の添加又は（ｃ）生成物の溶液の凍結乾燥により除去することができる。
【００３９】
一つの方法において、アセトニトリルを残留第２溶媒に加えて、溶液からの残留第２溶媒の除去を助ける。例えばアセトン及びトルエンのような他の化合物を使用して、残留第２溶媒を除去できることが考慮される。
【００４０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのに他の処理を実行できることが考慮される。例えば、第２溶媒の除去の前の処理行為は、水中でのメディエーターを再構成し、冷却し、次に室温での濾過により過剰量の塩の一部を除去することを含むことができる。他の処理行為を実行できることも考慮される。
【００４１】
別の方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが形成され、フェノキサジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒が準備される。第２反応体は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために準備される。第２試薬が所望の可溶性を有する第２溶媒が準備される。第１反応体と第１溶媒を一緒に合わせて、第１反応体溶液を形成する。第２反応体と第２溶媒を一緒に合わせて、第２反応体溶液を形成する。第１及び第２反応体溶液を一緒に合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムの溶液を調製し、反応体溶液に加える。過硫酸ナトリウムの溶液は、典型的には、第２溶媒（第２反応体溶液を形成するのに使用したものと同じ溶媒）を使用して形成される。過硫酸ナトリウムは、第１と第２の反応体の結合を引き起こし、形成された生成物を有する反応溶液をもたらす。
【００４２】
この方法において、更なる処理を反応溶液に実行して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する。一つの実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、塩の形態である。別の実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、酸の形態である。幾つかの３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、塩又は酸の形態ではなくてもよい。
【００４３】
この方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する場合、同一又は同様の第２試薬、第１溶媒、第２溶媒を、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターの形成方法に関して上記に記載されたように使用することができる。加えて、少なくとも第１及び第２溶媒を実質的に除去することによって３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する処理は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターに関して上記に記載されたものと同様又は同一の方法で実施することができる。
【００４４】
多くの異なる３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、本発明の方法を使用して形成できることが考慮される。調製され、ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出されたフェノチアジンの一つの望ましい例は、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。調製され、ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出された別の望ましい例は、３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。
【００４５】
これらのうち、調製され、ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出されたフェノチアジン及びフェノキサジンは、３−（４’−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ニトロ−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−アセチル−３−（４’−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−トリフルオロメチル−３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−（２”−（５”−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾイル）フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−エチルフェニル）アミノ−３−（４’−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕−エトキシフェニル）アミノ−３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンボロン酸；３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−カルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（３’，５−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン；３−（２’，５’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸及び３−（３’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸である。
【００４６】
調製され、適切な特性を有することが見出されたフェノチアジン及びフェノキサジンを、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ、フラビン−ヘキソースオキシダーゼ及びＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼのようなフラビンタンパク質と共に使用できることが考慮される。フェノチアジン及びフェノキサジンを調製して、例えばＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼのようなキノタンパク質と共に使用することができ、適切な特性を有することも考慮される。
【００４７】
別の方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターの安定化は、中和又は緩衝によって改善することもできる。中和又は緩衝行為は、メディエーターの安定化を助け、それによって、遭遇する保存状態に対して強靱になる。中和又は緩衝行為は、更なる処理を実行してメディエーターを単離する前又は後に実行できることが考慮される。例えば、中和又は緩衝行為は、メディエーターを乾燥して粉末形態にする前に実行することができる。別の例では、中和又は緩衝行為は、メディエーターを乾燥して粉末形態にした後で実行することができる。
【００４８】
中和又は緩衝剤は、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸カリウム及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない物質から選択することができる。他の物質を中和又は緩衝剤として使用できることが考慮される。
【００４９】
中和又は緩衝剤をメディエーター溶液に加えた後、ｐＨは一般に約５〜約８である。より典型的には、中和又は緩衝剤をメディエーター溶液に加えた後、ｐＨは、約５．５〜約７、さらにより望ましくは約６〜約７である。
【００５０】
実施例
実施例１
３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターの調製
フェノチアジン（１．５３mol、１．１当量、３０６ｇ）を６．０Lのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に撹拌しながら溶解し、次に０℃に冷却した。アニリン２，５−ジスルホン酸（１．３８mol、３５０ｇ）を７．０Lの水に溶解し、１Mの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（１２８ml）を、撹拌しながら加えた。アニリン２，５−ジスルホン酸溶液をフェノチアジン溶液に約２時間かけてゆっくりと加えて、白色で曇った懸濁液を得た。フェノチアジン／アニリン懸濁液は、約０℃〜４℃の温度であった。過硫酸ナトリウム（５．５２mol、４当量、１３１４ｇ）を４．０Lの水に溶解して、過硫酸ナトリウム溶液を形成した。
【００５１】
過硫酸ナトリウム溶液を約０℃〜３℃の温度でフェノチアジン／アニリン懸濁液に３時間かけて滴加し、極暗色の溶液をもたらした。極暗色溶液を、氷浴を使用して冷却状態を保ち、一晩撹拌した。次に内容物をBuchiロータリーエバポレーターに移し、テトラヒドロフランを３５℃未満の温度で約２時間かけて除去した。蒸発行為の後、残留溶液を２５Lの分離器に移し、酢酸エチルで溶媒相洗浄（backwash）した。残留溶液を、毎回２Lの酢酸エチルを使用して、３回溶媒相洗浄した、反応流体を、アセトン／ＣＯ２浴中で撹拌しながら、−３℃に冷却した。沈殿固体を、同日に、２つの２４cmのブフナー漏斗の２枚のクロスを介して濾過した。沈殿固体を漏斗に一晩放置して乾燥し、次に２Lのアセトニトリルを含有するフラスコに移し、室温で約１時間撹拌した。次に、残留水を除去するため、試料を濾過し、更なるアセトニトリルで洗浄した。メディエーターを、真空炉により３５℃で乾燥して、恒量にした。
この方法を使用して形成したメディエーターは、３−（２’，５’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェナチアジンジスルホン酸又は３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンであった。メディエーターを下記に示す。
【００５２】
【化３】
【００５３】
実施例２
本発明及び比較の方法のバックグラウンド電流
２つの異なる方法により調製した３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターのバックグラウンド電流を比較した。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する本発明の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用し、上記の実施例１に記載された方法と実質的に同一であった。このメディエーターを本発明のメディエーターと呼ぶ。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する比較の方法は、カップリング剤として過硫酸アンモニウムを使用した。比較の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用することを除けば本発明の方法と実質的に同一であった。このメディエーターを比較のメディエーターと呼ぶ。
【００５４】
本発明及び比較のメディエーターをそれぞれ別々に緩衝溶液に加えた。緩衝溶液はそれぞれ１００mMのリン酸ナトリウムを含んだ。本発明及び比較のメディエーターを緩衝溶液に加えた後、両方の溶液のｐＨを７．２に調整した。次に本発明及び比較のメディエーターの溶液を個別に炭素電極に設置した。３秒後、２５０mVの電位を炭素電極に５秒間適用し、次に、それぞれのメディエーターのバックグラウンド電流を読み取った。
【００５５】
図２を参照すると、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターのバックグラウンド電流（nA）を、本発明及び比較の方法により形成された異なるロットのメディエーターについてプロットした。具体的には、５つの異なる比較のメディエーター（比較のメディエーター１〜５と呼ぶ）及び４つの異なる本発明のメディエーター（本発明のメディエーター１〜４と呼ぶ）を異なるロットから試験した。
【００５６】
図２に示されているように、極めて高いバックグラウンド電流を有した３つのロットの比較のメディエーターが存在した。それぞれ２６８７、１１５８及び１９７１nAのバックグラウンド電流を有する図２の比較のメディエーター１、４及び５を参照すること。比較のメディエーター２は、７５nAのバックグラウンド電流を有し、一方、比較のメディエーター３は、２２１nAのバックグラウンド電流を有した。全ての本発明のメディエーター１〜４は、約１００nM未満の望ましいバックグラウンド電流を有した。具体的には、本発明のメディエーター１〜４は、それぞれ８８、９３、１０６及び９９nAのバックグラウンド電流を有した。
【００５７】
実施例３
異なる方法を使用した３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンの安定性の比較
２つの異なる方法により調製した３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンの安定性を比較した。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する本発明の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用し、上記の実施例１に記載された方法と実質的に同一であった。このメディエーターを本発明のメディエーターと呼ぶ。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する比較の方法は、カップリング剤として過硫酸アンモニウムを使用した。比較の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用することを除けば本発明の方法と実質的に同一であった。このメディエーターを比較のメディエーターと呼ぶ。
【００５８】
本発明及び比較のメディエーターの安定性を比較した。本発明と比較の両方の方法によるメディエーターをそれぞれの試薬混合物に配合した。試薬混合物は、リン酸緩衝液、Ｆａｄ−ＧＤＨ、セルロースポリマー及び界面活性剤を更に含んだ。試薬混合物を金電極に設置して、グルコース試験センサーを形成した。本発明及び比較のメディエーターを有する試験センサー試料を−２０℃の温度に２週間暴露した。また、本発明及び比較の方法の同じロットからのメディエーターを配合した試験センサー試料を、５０℃の温度に２週間暴露した。
【００５９】
試薬混合物は、暴露された本発明のメディエーター又は比較のメディエーターを含んだ。電極の反応は、４つの異なる濃度（０mg/dl、５０mg/dl、１００mg/dl及び４００mg/dl）の全血グルコース試料を使用して、Yellow Springs Glucose Analyzer（YSI, Inc., Yellow Springs, Ohio）により２５０mVの印加電位で測定した。YSIグルコース測定値を参照し、それぞれの試薬の傾き及び切片を使用して、電気反応をグルコース濃度に変換した。グルコース濃度を試験し、−２０℃及び５０℃の温度で暴露した本発明又は比較のメディエーターを含む試薬を比較し、偏差又は偏りがあるかを見るために比較した。例えば、５０mg/dLのグルコースを使用して、本発明のメディエーターを含む試薬を、−２０℃及び５０℃の温度で比較して、読み取り値に差異があるかを見た。これらの読み取り値の間の偏り％を決定した。
【００６０】
偏り％をそれぞれの異なるグルコース濃度について示し、本発明及び比較のメディエーターを以下の表１に示す。
【００６１】
表１
本発明の方法 比較の方法
０mg/dL −０．７％ ７．１％
５０mg/dl −１．８％ ５．９％
１００mg/dl ０．２％ ４．９％
４００mg/dl ２．４％ −８．２％
【００６２】
このように、表１に示されているように、本発明の方法を使用して形成された３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンは、５０℃で２週間暴露された後、比較の方法を使用して形成された３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンよりも顕著に卓越した安定性を有した。本発明の方法は卓越した安定性を有し、それは、測定されたグルコース濃度が、低い偏り％により示されているように、５０℃の温度への暴露の後であまり変動しなかったからである。一方、比較の方法は安定性がかなり低く、それは、測定されたグルコース濃度が、高い偏り％により示されているように、５０℃の温度への暴露の後で本発明の方法よりもかなり変動したからである。
【００６３】
実施例４
３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンに対する中和又は緩衝の安定性に関する効果
実施例４のそれぞれの中和又は緩衝試験において、同じ３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを使用した。同じメディエーターを、中和又は緩衝試験を含まない試験にも使用した。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用して形成し、上記の実施例１に記載された方法と実質的に同一であった。
【００６４】
実施例４は、異なる中和又は緩衝剤を使用して３つの方法を試験し、これらを、中和又は緩衝剤を含まない２つの方法と比較した。図３Ａ、３Ｂを参照すると、メディエーター１及び２を形成する方法は、中和又は緩衝行為を含まなかった。メディエーター１を形成する方法は、真空炉によるメディエーターの乾燥を含んだ。メディエーター２を形成する方法は、ｐＨ２．４で制御された凍結乾燥を含んだ。
【００６５】
メディエーター３〜５を形成する方法は、それぞれ中和又は緩衝行為を含んだ。中和又は緩衝行為は、それぞれ６．１のｐＨをもたらした。具体的には、メディエーター３は２０mMのリン酸ナトリウムを使用した。この溶液は、５ｇの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを取り、それを、７．２のｐＨを有する２０mMのリン酸ナトリウム緩衝液に溶解することによって形成した。ｐＨは、１MのＮａＯＨで６．１に調整した。リン酸ナトリウム緩衝液の使用は、一般にｐＨ調整と呼ばれる。
【００６６】
メディエーター４は、１Mの水酸化ナトリウムを使用した。この溶液は、５ｇの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを取り、それを、１００mLの冷水に溶解することによって形成した。１Mの水酸化ナトリウム溶液を、６．１のｐＨ測定値が得られるまで、撹拌しながら滴加した。この方法における水酸化ナトリウムの使用は溶液を中和し、したがって、中和剤と呼ぶ。
【００６７】
メディエーター５は、１Mの重炭酸ナトリウムを使用した。この溶液は、５ｇの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを取り、それを、１００mLの冷水に溶解することによって形成した。１Mの重炭酸ナトリウム溶液を、６．１のｐＨ測定値が得られるまで、撹拌しながら滴加した。この方法における重炭酸ナトリウムの使用は溶液を中和し、したがって、中和剤と呼ぶ。
【００６８】
次にメディエーター３〜５をそれぞれイソプロパノール／ドライアイス浴で凍結し、VirTis（登録商標）Model No. 4KBTXL benchtop 4K Freeze Dryer model（Gardiner, N.Y.）を使用して凍結乾燥し、乾燥粉末にした。
【００６９】
乾燥粉末形態のメディエーター１〜５に、多様な保存条件下で２週間ストレスをかけた。具体的には、温度が−４０℃〜５０℃に変動する９つの異なる条件を試験した。温度条件に暴露する前に、乾燥試料をガラスバイアルに入れ、キャップで密閉してから保存した。２つの試験を−４０℃及び３０℃で実施し、「使用」構成要素を加えた。具体的には、「使用」構成要素は、メディエーター１〜５を、キャップを密閉する前に３０分間周囲温度に暴露し、１週間後にキャップを開けた後に更に３０分間周囲温度に再び暴露することを含んだ。この「使用」暴露は、−４０℃及び３０℃それぞれの温度のみで実施した。「初期」試験は、保存条件なしで試験を実施した。
【００７０】
メディエーター試料は、それぞれ、バックグラウンド電流スクリーニングアッセイを使用してバックグラウンド電流について試験した。メディエーター試料は、実施例１のとおりに調製し、実施例２に記載されたように１００mMのリン酸ナトリウムを使用してｐＨを７．２に調整した。これらのメディエーター試料を炭素電極に加えた。３秒後、２５０mVの電位を５秒間印加し、次にバックグラウンド電流を測定した。
【００７１】
図３Ａに示されているように、この時間高温に暴露されたとき、バックグラウンド電流（nA）は中和又は緩衝行為を含むメディエーターにおいてかなり低かった。２５℃を超える温度でのバックグラウンド電流をメディエーター１〜５で比較すること。これは、最高暴露温度５０℃の場合に特にそうである。
【００７２】
図３Ｂは、異なる暴露の前に測定したベースラインからの、図３Ａの測定バックグラウンド電流のバックグラウンド電流の変化（％）を表す。同様に、この時間高温に暴露されたとき、バックグラウンド電流（％）は中和又は緩衝行為を含むメディエーターにおいてかなり低かった。２５℃を超える温度でのバックグラウンド電流の変化（％）をメディエーター１〜５で比較すること。これは、最高暴露温度５０℃の場合に特にそうである。
【００７３】
方法Ａ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノチアジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【００７４】
方法Ｂ
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、方法Ａの代替的方法。
【００７５】
方法Ｃ
第２溶媒が、水を含む、方法Ａの代替的方法。
【００７６】
方法Ｄ
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、方法Ｃの代替的方法。
【００７７】
方法Ｅ
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、方法Ａの代替的方法。
【００７８】
方法Ｆ
更なる処理が、アセトニトリルの添加により第２溶媒を概ね除去することを含む、方法Ａの代替的方法。
【００７９】
方法Ｇ
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、方法Ａの代替的方法。
【００８０】
方法Ｈ
第２反応体が、アニリン２，５−ジスルホン酸を含む、方法Ａの代替的方法。
【００８１】
方法Ｉ
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離することを含む、方法Ａの代替的方法。
【００８２】
方法Ｊ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、塩の形態である、方法Ａの代替的方法。
【００８３】
方法Ｋ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、酸の形態である、方法Ａの代替的方法。
【００８４】
方法Ｌ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【００８５】
方法Ｍ
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、方法Ｌの代替的方法。
【００８６】
方法Ｎ
第２溶媒が、水を含む、方法Ｌの代替的方法。
【００８７】
方法Ｏ
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、方法Ｎの代替的方法。
【００８８】
方法Ｐ
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、方法Ｌの代替的方法。
【００８９】
方法Ｑ
更なる処理が、アセトニトリルの添加により残留第２溶媒を概ね除去することを含む、方法Ｌの代替的方法。
【００９０】
方法Ｒ
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、方法Ｌの代替的方法。
【００９１】
方法Ｓ
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離することを含む、方法Ｌの代替的方法。
【００９２】
方法Ｔ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、塩の形態である、方法Ｌの代替的方法。
【００９３】
方法Ｕ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、酸の形態である、方法Ｌの代替的方法。
【００９４】
方法Ｖ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成し、安定化する方法であって、
フェノチアジン又はフェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジン又はフェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
カップリング剤を反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；
カップリング剤を加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為；並びに
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、約５〜約８のｐＨで安定化する行為
を含む方法。
【００９５】
方法Ｗ
ｐＨが、約５．５〜約７である、方法Ｖの代替的方法。
【００９６】
方法Ｘ
ｐＨが、約６〜約７である、方法Ｗの代替的方法。
【００９７】
方法Ｙ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターの安定化が、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸カリウム又はこれらの組み合わせを添加することを含む、方法Ｗの代替的方法。
【００９８】
本発明は１つ以上の特定の実施態様を参照して記載されてきたが、当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく多くの変更を行えることを認識する。これらの実施態様及びその明白な変形は、それぞれ、本発明の精神及び範囲内であることが考慮される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にメディエーターを形成する方法に関する。より詳細には、本発明は、一般に分析対象物に関する情報を決定するのを助けるように適合させた電気化学試験センサーに使用されるメディエーターを形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液中の分析対象物の定量法は、特定の生理学的な体調（身体状態）の診断及び維持において著しく重要である。例えば乳酸塩、コレステロール及びビリルビンを、特定の個人においてモニターするべきである。特に、糖尿病の個人は、食事によるグルコース摂取を調節するために体液におけるグルコースレベルを頻繁に検査することが重要である。そのような試験の結果を、あるとすれば、インスリン又は他の薬剤を投与する必要性の決定に使用することができる。一つの種類の血中グルコース試験系において、試験センサーを血液試料の試験に使用する。
【０００３】
試験センサーは、例えば血中グルコースと反応するバイオセンシング又は試薬物質を含有する。一つの種類の電気化学試験センサーは、基部又は基体及び蓋を含む多層試験センサーである。別の種類の電気化学試験センサーは、基部、スペーサー及び蓋を含む。現在の電気化学試験センサーは、少なくとも２つの電極を電極パターンの形態で含む。電圧がこれらの電極にわたって印加され、電流が作用電極において測定される。電流測定値は、作用電極の大きさに正比例している。
【０００４】
電気化学試験センサーは、目的の分析対象物に関わる酵素触媒化学反応に基づいている。グルコースのモニタリングの場合では、関連する化学反応は、グルコースをグルコノラクトン又はその対応する酸に酸化することである。この酸化は、多様な酵素によって触媒され、それらの幾つかは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（ＮＡＤ（Ｐ））のような補酵素を使用することができ、一方、他のものは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）又はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）のような補酵素を使用することができる。
【０００５】
試験センサーの適用において、グルコースの酸化の際に生成されるレドックス等価物は電極の表面に運ばれ、それによって電気信号が生成される。電気信号の大きさは、グルコース濃度と相関関係にある。酵素の化学反応部位から電極の表面へのレドックス等価物の移動は、電子移動メディエーターを使用して達成される。
【０００６】
例えばフェリシアニドのようなメディエーターの多くは、グルコース試験センサーにおいて配合されたときに信号対雑音比が低くなるような、高いバックグラウンド電流を有する。典型的には、低い信号対雑音比は、特にグルコースレベルが低く、高いヘマトクリット試料レベルでは極めて不正確なアッセイをもたらす。より迅速な試料試験（例えば、１０秒未満の試験時間）では、試験を実施するのに当てられた時間で高いバックグラウンド電流を取り除くことは困難でありうる。より迅速な試料試験時間のため、試料が適用されたときに活性成分が素早く相互反応して、素早い反応を与えることが必要となる。
【０００７】
したがって、低いバックグラウンド電流を有し、同時に、安定性を含むメディエーターの他の望ましい特性を依然として有するメディエーターを形成することが望ましい。
【発明の概要】
【０００８】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する方法には、フェノチアジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する。第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒が準備される。第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす。過硫酸ナトリウムを加えた後、反応溶液を更に処理して３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含めて、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する。
【０００９】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する方法には、フェノキサジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する。第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する。第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす。過硫酸ナトリウムを加えた後、反応溶液を更に処理して３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含めて、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する。
【００１０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成し、安定化する方法には、フェノチアジン又はフェノキサジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノチアジン又はフェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する。第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する。第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する。カップリング剤を反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす。カップリング剤を加えた後、反応溶液を更に処理して３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含めて、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する。
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、約５〜約８のｐＨで安定化する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】一つの実施態様による試験センサーである。
【図１Ｂ】図１Ａの試験センサーの側面図である。
【図２】多様なロットの本発明と比較例のメディエーターに対するバックグラウンド電流のプロットである。
【図３Ａ】幾つかの中和又は緩衝方法及び中和又は緩衝のない幾つかの方法を使用したバックグラウンド電流のプロットである。
【図３Ｂ】ベースラインと図３Ａにおいて測定したバックグラウンド電流とのバックグラウンド電流の変化のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一つの方法において、本発明は、低バックグラウンド電流の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを生成する改善された方法に関する。別の方法において、本発明は、低バックグラウンド電流の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを安定化する改善された方法に関する。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、電気化学試験センサーにとって有用なメディエーターであり、一つの例では、ＮＡＤＨの電気化学的再生（酸化）において有用である。
【００１３】
本発明において形成されるメディエーターには、下記の式：
【００１４】
【化１】
【００１５】
を有するフェノチアジン及び下記の式：
【００１６】
【化２】
【００１７】
を有するフェノキサジンが含まれ、
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても又は異なっていてもよく、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。これらの異性体が形成されうることも考慮される。
【００１８】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、電気化学試験センサーと使用するために適合される。電気化学試験センサーは、流体試料を受け、計器又は計測器の使用により分析されるように適合される。試験センサーは、分析対象物濃度のような分析対象物に関連する情報を決定するのを助ける。測定されうる分析対象物には、グルコース、コレステロール、脂質プロフィール、マイクロアルブミン、尿素、クレアチニン、クレアチン、フルクトース、乳酸塩又はビリルビンが含まれる。他の分析対象物の濃度を決定できることが考慮される。分析対象物は、例えば、全血試料、血清試料、血漿試料、ＩＳＦ（間質液）及び尿のような他の体液、並びに非体液であることができる。
【００１９】
本明細書に記載されている試験センサーは、電気化学試験センサーである。電気化学試験センサーにより使用される計測器は、検量情報を検出するための光学的側面及び電気化学的側面を有して、分析対象物に関連する情報（例えば、流体試料の分析対象物濃度）を決定することができる。電気化学試験センサーの一つの非限定例が図１Ａに示されている。図１Ａは、基部１１、毛管路、並びに複数の電極１６及び１８を含む試験センサー１０を表す。領域１２は、毛管路を画定する（例えば、基部１１を覆って蓋を被せた後）区域を示す。複数の電極には、対電極１６及び作用（測定）電極１８が含まれる。電気化学試験センサーは、作用電極、対電極、トリガー電極又はヘマトクリット電極のような、少なくとも３つの電極を含有することもできる。本発明の実施態様の電気化学試験センサーに用いられる作用電極は、炭素、白金、パラジウム、金、ルテニウム、ロジウム及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない適切な電極によって変更することができる。
【００２０】
電極１６、１８は、例示の実施態様において試験センサー接点１４ａ、ｂと示されている大型の区域で終止している複数の導電性リード線１５ａ、ｂに結合している。毛管路は一般に流体受容区域１９に配置されている。本発明のメディエーターを用いることができる他の電気化学試験センサーが考慮される。
【００２１】
流体受容区域１９は、流体試料（例えば、血液）中の目的の分析対象物（例えば、グルコース）を、電極パターンの構成要素により、生成される電流として電気化学的に測定可能な化学種に変換する、少なくとも１つの試薬を含む。試薬は、典型的には、分析対象物及び電子受容体と反応して、電極により検出されうる電気化学的に測定可能な種を生成する分析対象物に特異的な酵素を含む。試薬は、分析対象物と電極との間の電子の移動を助けるメディエーターを含む。試薬は、酵素をメディエーターと一緒に保持する結合剤、他の不活性成分又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００２２】
流体試料（例えば、血液）を流体受容区域１９に適用することができる。流体試料は少なくとも１つの試薬と反応する。試薬と反応し複数の電極と連結した後、流体試料は、分析対象物濃度の決定を助ける電気信号を生成する。導電性リード線１５ａ、ｂは、試験センサー１０の第２反対端４２に向かって電気信号を運び、そこで試験センサー接点１４ａ、ｂは、電気信号を計測器に転送する。
【００２３】
図１Ｂを参照すると、図１Ａの試験センサー１０の側面図が示されている。図１Ｂに示されているように、図１Ｂの試験センサー１０は、蓋２０及びスペーサー２２を更に含む。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２は、ポリマー材料のような多様な材料から作製することができる。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を作製するのに使用できるポリマー物質の非限定例には、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリイミド及びこれらの組み合わせが挙げられる。基部１１、蓋２０及び／又はスペーサー２２を形成するのに他の材料が使用できることが
考慮される。
【００２４】
図１Ａ、１Ｂの試験センサー１０を形成するために、基部１１、スペーサー２２及び蓋２０を例えば接着剤又はヒートシールにより取り付ける。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を接着させると、流体受容区域１９が形成される。流体受容区域１９は、流体試料を試験センサー１０に導入する流路を提供する。流体受容区域１９は、試験センサー１０の第１末端又は試験端４０において形成される。本発明の実施態様の試験センサーを、スペーサーなしで基部及び蓋により形成することができ、流体受容区域は基部及び／又は蓋に直接形成される。
【００２５】
スペーサーなしで形成できる電気化学試験センサーも考慮される。例えば、電気化学試験センサーは、基部及び蓋が互いに取り付けられたときに経路（例えば、毛管路）が形成されるように、基部及び蓋を含むことができる。
【００２６】
基部、スペーサー及び蓋を、ポリマー材料のような多様な材料から作製することができる。基部、スペーサー及び蓋を作製するのに使用できるポリマー物質の非限定例には、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリイミド及びこれらの組み合わせが挙げられる。基部、スペーサー及び蓋を他の物質により別々に作製できることが考慮される。電極パターンを、金、白金、ロジウム、パラジウム、ルテニウム、炭素又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない多様な導電性材料から作製することができる。
【００２７】
別の実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを光学試験センサーに使用することができる。３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、そのような系において安定したメディエーターである。
【００２８】
一つの方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが形成され、フェノチアジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒が準備される。第２反応体は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために準備される。第２試薬が所望の可溶性を有する第２溶媒が準備される。第１反応体と第１溶媒を一緒に合わせて、第１反応体溶液を形成する。第２反応体と第２溶媒を一緒に合わせて、第２反応体溶液を形成する。第１及び第２反応体溶液を一緒に合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムの溶液を調製し、反応体溶液に加える。過硫酸ナトリウムの溶液は、典型的には、第２溶媒（第２反応体溶液を形成するのに使用したものと同じ溶媒）を使用して形成される。過硫酸ナトリウムは、第１と第２の反応体の結合を引き起こし、形成された生成物を有する反応溶液をもたらす。
【００２９】
この方法において、更なる処理を反応溶液に実行して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する。一つの実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、塩の形態である。別の実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、酸の形態である。幾つかの３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、塩又は酸の形態でなくてもよい。
【００３０】
第２試薬は、所望の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するように選択される。例えば、第２試薬は、アニリン２，５−ジスルホン酸であることができる。アニリン２，５−ジスルホン酸が使用される場合、形成される特定の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。
【００３１】
他の第２試薬を使用して異なる３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成できることが考慮される。例えば、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する第２試薬は、以下から選択することができる：４−ジエチルアミノアニリン；４−クロロアニリン；４−エチルアニリン；４−トリフルオロメチルアニリン；４−アミノ安息香酸メチル；４−ニトロアニリン；４−メトキシアニリン；４−（４’−アミノフェニル）酪酸；４−アミノベンジルアミン；４−（２’−アミノエチル）アニリン；５−アミノ−１，３−ベンゼンジカルボン酸；４−アミノ安息香酸；２，５−（４’−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール；４−〔２’−（２’−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシアニリン及び２，５−ジスルホアニリン。他の第２試薬を使用して他の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成できることが考慮される。
【００３２】
第１溶媒は、第１反応体と適合性があるように選択される。第１反応体が一般に第１溶媒に高い可溶性を有することが望ましい。一つの方法において、第１溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。第１溶媒は、フェノチアジンが一般に高い可溶性を有するので、望ましくはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）である。第１溶媒は、また、概ね又は実質的に均質の溶液を形成するように、望ましくは第２溶媒と混和性である。
【００３３】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の代わりに、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、１，４−ジオキサン及びスルホランのような他の第１溶媒を使用できることが考慮される。他の第１溶媒を使用できることも考慮される。
【００３４】
第２溶媒は、第２反応体と適合性があるように選択される。第２反応体が一般に第２溶媒に高い可溶性を有することが望ましい。一つの方法において、第２溶媒は水である。別の方法において、第２溶媒は、水と水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の組み合わせである。より塩基性になることで少なくとも一部の第２反応体の可溶性が改善されるので、水酸化ナトリウムが望ましい。他の塩基性溶液を第２溶媒と共に加えて、第２試薬の可溶性の改善を達成することが考慮される。水の代わりに他の第２溶媒を使用できることが考慮される。
【００３５】
過硫酸ナトリウムは、第１と第２反応体の結合を促進する。過硫酸ナトリウムは、望ましくない副産物の形成を回避すると考えられるので、望ましいカップリング剤である。過硫酸ナトリウムをカップリング剤として使用することは、一定の低バックグラウンド電流を得ることを助け、このことは、一般に低量の望ましくない副産物が形成され、溶液中に残留することを意味する。加えて、過硫酸ナトリウムの使用は、有機物質の沈殿を促進して、反応から望ましい３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを容易に単離することを助ける。
【００３６】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するため、カップリング剤が、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を含む反応体溶液に添加された後、更なる処理を実行する。第１溶媒（例えば、テトラヒドロフラン）を、溶液から除去又は抽出することができる。第１溶媒を、例えば、酢酸エチルにより除去することができる。酢酸エチルは、第１溶媒の抽出を助け、反応溶液から他の望ましくない残留有機物質（例えば、水溶性有機物質）の除去を助けることもできる。
【００３７】
例えばジエチルエーテル、クロロホルム及びジクロロメタンのような他の化合物を使用して、第１溶媒を除去することが考慮される。
【００３８】
第２溶媒（例えば、水）は、冷却及び濾過により生成物から除去される。第２溶媒を除去することは、分解の防止又は抑制の助けにもなる。分解を防止又は抑制することによって、バックグラウンド電流は、典型的にはより望ましいより低いレベルになる。例えば冷却及び濾過により除去されなかった残留第２溶媒（例えば、残留水）は、幾つかの方法によって生成物から除去することができる。例えば、残留第２溶媒は、（ａ）真空炉による乾燥、（ｂ）生成物への化合物の添加又は（ｃ）生成物の溶液の凍結乾燥により除去することができる。
【００３９】
一つの方法において、アセトニトリルを残留第２溶媒に加えて、溶液からの残留第２溶媒の除去を助ける。例えばアセトン及びトルエンのような他の化合物を使用して、残留第２溶媒を除去できることが考慮される。
【００４０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのに他の処理を実行できることが考慮される。例えば、第２溶媒の除去の前の処理行為は、水中でのメディエーターを再構成し、冷却し、次に室温での濾過により過剰量の塩の一部を除去することを含むことができる。他の処理行為を実行できることも考慮される。
【００４１】
別の方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが形成され、フェノキサジンを含む第１反応体を準備することが含まれる。フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒が準備される。第２反応体は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために準備される。第２試薬が所望の可溶性を有する第２溶媒が準備される。第１反応体と第１溶媒を一緒に合わせて、第１反応体溶液を形成する。第２反応体と第２溶媒を一緒に合わせて、第２反応体溶液を形成する。第１及び第２反応体溶液を一緒に合わせて、反応体溶液を形成する。過硫酸ナトリウムの溶液を調製し、反応体溶液に加える。過硫酸ナトリウムの溶液は、典型的には、第２溶媒（第２反応体溶液を形成するのに使用したものと同じ溶媒）を使用して形成される。過硫酸ナトリウムは、第１と第２の反応体の結合を引き起こし、形成された生成物を有する反応溶液をもたらす。
【００４２】
この方法において、更なる処理を反応溶液に実行して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する。一つの実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、塩の形態である。別の実施態様において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、酸の形態である。幾つかの３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターは、塩又は酸の形態ではなくてもよい。
【００４３】
この方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する場合、同一又は同様の第２試薬、第１溶媒、第２溶媒を、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターの形成方法に関して上記に記載されたように使用することができる。加えて、少なくとも第１及び第２溶媒を実質的に除去することによって３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する処理は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターに関して上記に記載されたものと同様又は同一の方法で実施することができる。
【００４４】
多くの異なる３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、本発明の方法を使用して形成できることが考慮される。調製され、ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出されたフェノチアジンの一つの望ましい例は、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。調製され、ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出された別の望ましい例は、３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。
【００４５】
これらのうち、調製され、ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出されたフェノチアジン及びフェノキサジンは、３−（４’−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ニトロ−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−アセチル−３−（４’−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−トリフルオロメチル−３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−（２”−（５”−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾイル）フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−エチルフェニル）アミノ−３−（４’−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕−エトキシフェニル）アミノ−３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンボロン酸；３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−カルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（３’，５−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン；３−（２’，５’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸及び３−（３’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸である。
【００４６】
調製され、適切な特性を有することが見出されたフェノチアジン及びフェノキサジンを、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ、フラビン−ヘキソースオキシダーゼ及びＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼのようなフラビンタンパク質と共に使用できることが考慮される。フェノチアジン及びフェノキサジンを調製して、例えばＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼのようなキノタンパク質と共に使用することができ、適切な特性を有することも考慮される。
【００４７】
別の方法において、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターの安定化は、中和又は緩衝によって改善することもできる。中和又は緩衝行為は、メディエーターの安定化を助け、それによって、遭遇する保存状態に対して強靱になる。中和又は緩衝行為は、更なる処理を実行してメディエーターを単離する前又は後に実行できることが考慮される。例えば、中和又は緩衝行為は、メディエーターを乾燥して粉末形態にする前に実行することができる。別の例では、中和又は緩衝行為は、メディエーターを乾燥して粉末形態にした後で実行することができる。
【００４８】
中和又は緩衝剤は、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸カリウム及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない物質から選択することができる。他の物質を中和又は緩衝剤として使用できることが考慮される。
【００４９】
中和又は緩衝剤をメディエーター溶液に加えた後、ｐＨは一般に約５〜約８である。より典型的には、中和又は緩衝剤をメディエーター溶液に加えた後、ｐＨは、約５．５〜約７、さらにより望ましくは約６〜約７である。
【００５０】
実施例
実施例１
３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターの調製
フェノチアジン（１．５３mol、１．１当量、３０６ｇ）を６．０Lのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に撹拌しながら溶解し、次に０℃に冷却した。アニリン２，５−ジスルホン酸（１．３８mol、３５０ｇ）を７．０Lの水に溶解し、１Mの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（１２８ml）を、撹拌しながら加えた。アニリン２，５−ジスルホン酸溶液をフェノチアジン溶液に約２時間かけてゆっくりと加えて、白色で曇った懸濁液を得た。フェノチアジン／アニリン懸濁液は、約０℃〜４℃の温度であった。過硫酸ナトリウム（５．５２mol、４当量、１３１４ｇ）を４．０Lの水に溶解して、過硫酸ナトリウム溶液を形成した。
【００５１】
過硫酸ナトリウム溶液を約０℃〜３℃の温度でフェノチアジン／アニリン懸濁液に３時間かけて滴加し、極暗色の溶液をもたらした。極暗色溶液を、氷浴を使用して冷却状態を保ち、一晩撹拌した。次に内容物をBuchiロータリーエバポレーターに移し、テトラヒドロフランを３５℃未満の温度で約２時間かけて除去した。蒸発行為の後、残留溶液を２５Lの分離器に移し、酢酸エチルで溶媒相洗浄（backwash）した。残留溶液を、毎回２Lの酢酸エチルを使用して、３回溶媒相洗浄した、反応流体を、アセトン／ＣＯ２浴中で撹拌しながら、−３℃に冷却した。沈殿固体を、同日に、２つの２４cmのブフナー漏斗の２枚のクロスを介して濾過した。沈殿固体を漏斗に一晩放置して乾燥し、次に２Lのアセトニトリルを含有するフラスコに移し、室温で約１時間撹拌した。次に、残留水を除去するため、試料を濾過し、更なるアセトニトリルで洗浄した。メディエーターを、真空炉により３５℃で乾燥して、恒量にした。
この方法を使用して形成したメディエーターは、３−（２’，５’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェナチアジンジスルホン酸又は３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンであった。メディエーターを下記に示す。
【００５２】
【化３】
【００５３】
実施例２
本発明及び比較の方法のバックグラウンド電流
２つの異なる方法により調製した３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターのバックグラウンド電流を比較した。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する本発明の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用し、上記の実施例１に記載された方法と実質的に同一であった。このメディエーターを本発明のメディエーターと呼ぶ。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する比較の方法は、カップリング剤として過硫酸アンモニウムを使用した。比較の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用することを除けば本発明の方法と実質的に同一であった。このメディエーターを比較のメディエーターと呼ぶ。
【００５４】
本発明及び比較のメディエーターをそれぞれ別々に緩衝溶液に加えた。緩衝溶液はそれぞれ１００mMのリン酸ナトリウムを含んだ。本発明及び比較のメディエーターを緩衝溶液に加えた後、両方の溶液のｐＨを７．２に調整した。次に本発明及び比較のメディエーターの溶液を個別に炭素電極に設置した。３秒後、２５０mVの電位を炭素電極に５秒間適用し、次に、それぞれのメディエーターのバックグラウンド電流を読み取った。
【００５５】
図２を参照すると、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターのバックグラウンド電流（nA）を、本発明及び比較の方法により形成された異なるロットのメディエーターについてプロットした。具体的には、５つの異なる比較のメディエーター（比較のメディエーター１〜５と呼ぶ）及び４つの異なる本発明のメディエーター（本発明のメディエーター１〜４と呼ぶ）を異なるロットから試験した。
【００５６】
図２に示されているように、極めて高いバックグラウンド電流を有した３つのロットの比較のメディエーターが存在した。それぞれ２６８７、１１５８及び１９７１nAのバックグラウンド電流を有する図２の比較のメディエーター１、４及び５を参照すること。比較のメディエーター２は、７５nAのバックグラウンド電流を有し、一方、比較のメディエーター３は、２２１nAのバックグラウンド電流を有した。全ての本発明のメディエーター１〜４は、約１００nM未満の望ましいバックグラウンド電流を有した。具体的には、本発明のメディエーター１〜４は、それぞれ８８、９３、１０６及び９９nAのバックグラウンド電流を有した。
【００５７】
実施例３
異なる方法を使用した３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンの安定性の比較
２つの異なる方法により調製した３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンの安定性を比較した。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する本発明の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用し、上記の実施例１に記載された方法と実質的に同一であった。このメディエーターを本発明のメディエーターと呼ぶ。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する比較の方法は、カップリング剤として過硫酸アンモニウムを使用した。比較の方法は、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用することを除けば本発明の方法と実質的に同一であった。このメディエーターを比較のメディエーターと呼ぶ。
【００５８】
本発明及び比較のメディエーターの安定性を比較した。本発明と比較の両方の方法によるメディエーターをそれぞれの試薬混合物に配合した。試薬混合物は、リン酸緩衝液、Ｆａｄ−ＧＤＨ、セルロースポリマー及び界面活性剤を更に含んだ。試薬混合物を金電極に設置して、グルコース試験センサーを形成した。本発明及び比較のメディエーターを有する試験センサー試料を−２０℃の温度に２週間暴露した。また、本発明及び比較の方法の同じロットからのメディエーターを配合した試験センサー試料を、５０℃の温度に２週間暴露した。
【００５９】
試薬混合物は、暴露された本発明のメディエーター又は比較のメディエーターを含んだ。電極の反応は、４つの異なる濃度（０mg/dl、５０mg/dl、１００mg/dl及び４００mg/dl）の全血グルコース試料を使用して、Yellow Springs Glucose Analyzer（YSI, Inc., Yellow Springs, Ohio）により２５０mVの印加電位で測定した。YSIグルコース測定値を参照し、それぞれの試薬の傾き及び切片を使用して、電気反応をグルコース濃度に変換した。グルコース濃度を試験し、−２０℃及び５０℃の温度で暴露した本発明又は比較のメディエーターを含む試薬を比較し、偏差又は偏りがあるかを見るために比較した。例えば、５０mg/dLのグルコースを使用して、本発明のメディエーターを含む試薬を、−２０℃及び５０℃の温度で比較して、読み取り値に差異があるかを見た。これらの読み取り値の間の偏り％を決定した。
【００６０】
偏り％をそれぞれの異なるグルコース濃度について示し、本発明及び比較のメディエーターを以下の表１に示す。
【００６１】
表１
本発明の方法 比較の方法
０mg/dL −０．７％ ７．１％
５０mg/dl −１．８％ ５．９％
１００mg/dl ０．２％ ４．９％
４００mg/dl ２．４％ −８．２％
【００６２】
このように、表１に示されているように、本発明の方法を使用して形成された３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンは、５０℃で２週間暴露された後、比較の方法を使用して形成された３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンよりも顕著に卓越した安定性を有した。本発明の方法は卓越した安定性を有し、それは、測定されたグルコース濃度が、低い偏り％により示されているように、５０℃の温度への暴露の後であまり変動しなかったからである。一方、比較の方法は安定性がかなり低く、それは、測定されたグルコース濃度が、高い偏り％により示されているように、５０℃の温度への暴露の後で本発明の方法よりもかなり変動したからである。
【００６３】
実施例４
３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンに対する中和又は緩衝の安定性に関する効果
実施例４のそれぞれの中和又は緩衝試験において、同じ３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを使用した。同じメディエーターを、中和又は緩衝試験を含まない試験にも使用した。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、カップリング剤として過硫酸ナトリウムを使用して形成し、上記の実施例１に記載された方法と実質的に同一であった。
【００６４】
実施例４は、異なる中和又は緩衝剤を使用して３つの方法を試験し、これらを、中和又は緩衝剤を含まない２つの方法と比較した。図３Ａ、３Ｂを参照すると、メディエーター１及び２を形成する方法は、中和又は緩衝行為を含まなかった。メディエーター１を形成する方法は、真空炉によるメディエーターの乾燥を含んだ。メディエーター２を形成する方法は、ｐＨ２．４で制御された凍結乾燥を含んだ。
【００６５】
メディエーター３〜５を形成する方法は、それぞれ中和又は緩衝行為を含んだ。中和又は緩衝行為は、それぞれ６．１のｐＨをもたらした。具体的には、メディエーター３は２０mMのリン酸ナトリウムを使用した。この溶液は、５ｇの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを取り、それを、７．２のｐＨを有する２０mMのリン酸ナトリウム緩衝液に溶解することによって形成した。ｐＨは、１MのＮａＯＨで６．１に調整した。リン酸ナトリウム緩衝液の使用は、一般にｐＨ調整と呼ばれる。
【００６６】
メディエーター４は、１Mの水酸化ナトリウムを使用した。この溶液は、５ｇの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを取り、それを、１００mLの冷水に溶解することによって形成した。１Mの水酸化ナトリウム溶液を、６．１のｐＨ測定値が得られるまで、撹拌しながら滴加した。この方法における水酸化ナトリウムの使用は溶液を中和し、したがって、中和剤と呼ぶ。
【００６７】
メディエーター５は、１Mの重炭酸ナトリウムを使用した。この溶液は、５ｇの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを取り、それを、１００mLの冷水に溶解することによって形成した。１Mの重炭酸ナトリウム溶液を、６．１のｐＨ測定値が得られるまで、撹拌しながら滴加した。この方法における重炭酸ナトリウムの使用は溶液を中和し、したがって、中和剤と呼ぶ。
【００６８】
次にメディエーター３〜５をそれぞれイソプロパノール／ドライアイス浴で凍結し、VirTis（登録商標）Model No. 4KBTXL benchtop 4K Freeze Dryer model（Gardiner, N.Y.）を使用して凍結乾燥し、乾燥粉末にした。
【００６９】
乾燥粉末形態のメディエーター１〜５に、多様な保存条件下で２週間ストレスをかけた。具体的には、温度が−４０℃〜５０℃に変動する９つの異なる条件を試験した。温度条件に暴露する前に、乾燥試料をガラスバイアルに入れ、キャップで密閉してから保存した。２つの試験を−４０℃及び３０℃で実施し、「使用」構成要素を加えた。具体的には、「使用」構成要素は、メディエーター１〜５を、キャップを密閉する前に３０分間周囲温度に暴露し、１週間後にキャップを開けた後に更に３０分間周囲温度に再び暴露することを含んだ。この「使用」暴露は、−４０℃及び３０℃それぞれの温度のみで実施した。「初期」試験は、保存条件なしで試験を実施した。
【００７０】
メディエーター試料は、それぞれ、バックグラウンド電流スクリーニングアッセイを使用してバックグラウンド電流について試験した。メディエーター試料は、実施例１のとおりに調製し、実施例２に記載されたように１００mMのリン酸ナトリウムを使用してｐＨを７．２に調整した。これらのメディエーター試料を炭素電極に加えた。３秒後、２５０mVの電位を５秒間印加し、次にバックグラウンド電流を測定した。
【００７１】
図３Ａに示されているように、この時間高温に暴露されたとき、バックグラウンド電流（nA）は中和又は緩衝行為を含むメディエーターにおいてかなり低かった。２５℃を超える温度でのバックグラウンド電流をメディエーター１〜５で比較すること。これは、最高暴露温度５０℃の場合に特にそうである。
【００７２】
図３Ｂは、異なる暴露の前に測定したベースラインからの、図３Ａの測定バックグラウンド電流のバックグラウンド電流の変化（％）を表す。同様に、この時間高温に暴露されたとき、バックグラウンド電流（％）は中和又は緩衝行為を含むメディエーターにおいてかなり低かった。２５℃を超える温度でのバックグラウンド電流の変化（％）をメディエーター１〜５で比較すること。これは、最高暴露温度５０℃の場合に特にそうである。
【００７３】
方法Ａ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノチアジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【００７４】
方法Ｂ
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、方法Ａの代替的方法。
【００７５】
方法Ｃ
第２溶媒が、水を含む、方法Ａの代替的方法。
【００７６】
方法Ｄ
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、方法Ｃの代替的方法。
【００７７】
方法Ｅ
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、方法Ａの代替的方法。
【００７８】
方法Ｆ
更なる処理が、アセトニトリルの添加により第２溶媒を概ね除去することを含む、方法Ａの代替的方法。
【００７９】
方法Ｇ
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、方法Ａの代替的方法。
【００８０】
方法Ｈ
第２反応体が、アニリン２，５−ジスルホン酸を含む、方法Ａの代替的方法。
【００８１】
方法Ｉ
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離することを含む、方法Ａの代替的方法。
【００８２】
方法Ｊ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、塩の形態である、方法Ａの代替的方法。
【００８３】
方法Ｋ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、酸の形態である、方法Ａの代替的方法。
【００８４】
方法Ｌ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【００８５】
方法Ｍ
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、方法Ｌの代替的方法。
【００８６】
方法Ｎ
第２溶媒が、水を含む、方法Ｌの代替的方法。
【００８７】
方法Ｏ
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、方法Ｎの代替的方法。
【００８８】
方法Ｐ
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、方法Ｌの代替的方法。
【００８９】
方法Ｑ
更なる処理が、アセトニトリルの添加により残留第２溶媒を概ね除去することを含む、方法Ｌの代替的方法。
【００９０】
方法Ｒ
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、方法Ｌの代替的方法。
【００９１】
方法Ｓ
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離することを含む、方法Ｌの代替的方法。
【００９２】
方法Ｔ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、塩の形態である、方法Ｌの代替的方法。
【００９３】
方法Ｕ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、酸の形態である、方法Ｌの代替的方法。
【００９４】
方法Ｖ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成し、安定化する方法であって、
フェノチアジン又はフェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジン又はフェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
カップリング剤を反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；
カップリング剤を加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為；並びに
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、約５〜約８のｐＨで安定化する行為
を含む方法。
【００９５】
方法Ｗ
ｐＨが、約５．５〜約７である、方法Ｖの代替的方法。
【００９６】
方法Ｘ
ｐＨが、約６〜約７である、方法Ｗの代替的方法。
【００９７】
方法Ｙ
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターの安定化が、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸カリウム又はこれらの組み合わせを添加することを含む、方法Ｗの代替的方法。
【００９８】
本発明は１つ以上の特定の実施態様を参照して記載されてきたが、当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく多くの変更を行えることを認識する。これらの実施態様及びその明白な変形は、それぞれ、本発明の精神及び範囲内であることが考慮される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノチアジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【請求項２】
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第２溶媒が、水を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
更なる処理が、アセトニトリルの添加により第２溶媒を概ね除去することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第２反応体が、アニリン２，５−ジスルホン酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、塩の形態である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、酸の形態である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【請求項１３】
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
第２溶媒が、水を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
更なる処理が、アセトニトリルの添加により残留第２溶媒を概ね除去することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、塩の形態である、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、酸の形態である、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成し、安定化する方法であって、
フェノチアジン又はフェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジン又はフェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
カップリング剤を反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；
カップリング剤を加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為；並びに
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、約５〜約８のｐＨで安定化する行為
を含む方法。
【請求項２３】
ｐＨが、約５．５〜約７である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ｐＨが、約６〜約７である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターの安定化が、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸カリウム又はこれらの組み合わせを添加することを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項１】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノチアジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【請求項２】
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第２溶媒が、水を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
更なる処理が、アセトニトリルの添加により第２溶媒を概ね除去することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第２反応体が、アニリン２，５−ジスルホン酸を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを単離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、塩の形態である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターが、酸の形態である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成する方法であって、
フェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
過硫酸ナトリウムを反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；並びに
過硫酸ナトリウムを加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為
を含む方法。
【請求項１３】
第１溶媒が、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
第２溶媒が、水を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
第２溶媒が、水酸化ナトリウムを更に含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を一緒に組み合わせて反応体溶液を形成する前に、第１反応体と第１溶媒とを組み合わせて第１反応体溶液を形成する行為及び第２反応体と第２溶媒とを組み合わせて第２反応体溶液を形成する行為を含む、第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を組み合わせる、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
更なる処理が、アセトニトリルの添加により残留第２溶媒を概ね除去することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
更なる処理が、酢酸エチルの添加により第１溶媒を概ね除去することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
更なる処理が、少なくとも第１溶媒及び第２溶媒を第２溶液から実質的に除去して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離することを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、塩の形態である、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターが、酸の形態である、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成し、安定化する方法であって、
フェノチアジン又はフェノキサジンを含む第１反応体を準備する行為；
フェノチアジン又はフェノキサジンが所望の可溶性を有する第１溶媒を準備する行為；
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを形成するのを助けるために、第２反応体を準備する行為；
第２反応体が所望の可溶性を有する第２溶媒を準備する行為；
第１反応体、第１溶媒、第２反応体及び第２溶媒を合わせて、反応体溶液を形成する行為；
カップリング剤を反応体溶液に加えて、第１と第２の反応体を結合させ、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液をもたらす行為；
カップリング剤を加えた後、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを含む反応溶液を更に処理して、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを単離する行為；並びに
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターを、約５〜約８のｐＨで安定化する行為
を含む方法。
【請求項２３】
ｐＨが、約５．５〜約７である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ｐＨが、約６〜約７である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター又は３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジンメディエーターの安定化が、水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、リン酸カリウム、重炭酸カリウム又はこれらの組み合わせを添加することを含む、請求項２３記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５０７８０９（Ｐ２０１１−５０７８０９Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８０７２（Ｐ２０１０−５３８０７２）
【出願日】平成２０年１２月８日（２００８．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８５８１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６２６８
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７０２１７５７）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (33)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月８日（２００８．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８５８１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６２６８
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７０２１７５７）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (33)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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