５−フルオロウラシルの酵素的製造法
【課題】 温和な条件で効率的に５−フルオロウラシルを製造するための方法を提供すること。
【解決手段】 以下の工程を含有することを特徴とする５−フルオロウラシルの製造方法。
（１）５−フルオロシトシンに酵素を作用させ、５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させる工程；
（２）工程（１）において生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させる工程；および、
（３）工程（２）において生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させる工程。
【解決手段】 以下の工程を含有することを特徴とする５−フルオロウラシルの製造方法。
（１）５−フルオロシトシンに酵素を作用させ、５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させる工程；
（２）工程（１）において生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させる工程；および、
（３）工程（２）において生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−フルオロウラシルの酵素的製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−フルオロウラシルは、臨床の現場で使用されている抗癌剤の１つであり、胃癌、肝癌、結腸・直腸癌、乳癌、膵癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌等の悪性腫瘍へ適用されている。５−フルオロウラシルの製造法としては、化学合成的手法による製造法や酵素を用いた製造法（酵素的製造法）が知られている。酵素的製造法としては、シトシンをウラシルとアンモニアに加水分解する活性を有するシトシンデアミナーゼを用いた方法が知られており、例えば、Escherichia coli等の微生物菌体から抽出したシトシンデアミナーゼを用いて５−フルオロシトシンから５−フルオロウラシルを製造する方法（特許文献１参照）やパン酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来の熱安定性シトシンデアミナーゼを用いて５−フルオロシトシンから５−フルオロウラシルを製造する方法（特許文献２参照）等が報告されている。
【０００３】
一方、クレアチニンデイミナーゼ（クレアチニンイミノヒドロラーゼ）が、クレアチニンをＮ−メチルヒダントインとアンモニアに加水分解するだけでなく、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルとアンモニアに加水分解することを利用した血中の５−フルオロシトシンの測定法が報告されている（非特許文献１参照）。また、血中の５−フルオロシトシン測定法として、血中の５−フルオロシトシンにクレアチニンデイミナーゼを作用させて５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させた後、生成したアンモニアと、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤＨとにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸およびＮＡＤ+を生成させ、この反応において消費されるＮＡＤＨを測定する方法が報告されている（非特許文献２参照）。
【０００４】
また、クレアチニンデイミナーゼ等によるアンモニア生成反応を利用した検体中の物質の測定において、検体に元から存在するアンモニアの消去方法として、アンモニアと、２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させると共に、生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させて、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させることにより、効率的にアンモニアを消去する方法が報告されている（特許文献３および４参照）。
【０００５】
化学的手法による５−フルオロウラシルの製造法については、多数の方法が報告されているが、過酷な製造条件を用いる場合が多いため、温和な条件での５−フルオロウラシルの製造法が望まれている。
【特許文献１】特開昭５９−０５５１９６号公報
【特許文献２】特開平４−１３１０８４号公報
【特許文献３】特開平９−０００２９５号公報
【特許文献４】特開平１１−３４６７８１号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology），（米国），１９８４年，第２０巻，第５号，ｐ．９９６−９９７
【非特許文献２】クリニカル ケミストリー（Clinical Chemistry），（米国），１９８８年，第３４巻，第１号，ｐ．５９−６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、温和な条件で効率的に５−フルオロウラシルを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、温和な条件で効率的に５−フルオロウラシルを製造する方法を鋭意検討した結果、５−フルオロシトシンにクレアチニンデイミナーゼ等を作用させ、５−フルオロウラシルとアンモニアを生成させる、５−フルオロウラシルを酵素的に製造する方法において、生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させてアンモニアを消去し、さらに生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させることにより、効率的に５−フルオロウラシルを製造することができる、という知見を見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［４］に関する。
［１］以下の工程を含有することを特徴とする５−フルオロウラシルの製造方法。
（１）５−フルオロシトシンに酵素を作用させ、５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させる工程；
（２）工程（１）において生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させる工程；および、
（３）工程（２）において生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させる工程。
［２］さらに（４）生成した５−フルオロウラシルを単離する工程を含有することを特徴とする［１］に記載の製造方法。
［３］還元型補酵素および酸化型補酵素が、それぞれＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ+である［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］５−フルオロシトシンに作用させる酵素がクレアチニンデイミナーゼまたはシトシンデアミナーゼである［１］〜［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、温和な条件で効率的に５−フルオロウラシルを製造する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）製造法の原理
本発明の製造法の原理を図１に示す。本発明の製造法は、５−フルオロシトシンを酵素的に５−フルオロウラシルに変換する工程と、当該工程で生成するアンモニアの消去工程を含有するため、生成するアンモニアは速やかに消去されると共に、アンモニア消去工程で使用される２−オキソグルタル酸濃度は、２−オキソグルタル酸の再生工程を含有するため、一定濃度に保つことができるという特徴を有する。
【００１０】
５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する工程において、５−フルオロシトシンは水の存在下でシトシンデアミナーゼ、クレアチニンデイミナーゼ等の酵素の作用により加水分解されて、５−フルオロウラシルおよびアンモニアに変換される。この反応において５−フルオロウラシルと共に生成するアンモニアを下記のアンモニア消去工程によって消去することにより、５−フルオロウラシルおよびアンモニアが生成する方向の反応速度が増加し、効率的に５−フルオロウラシルを生成することができる。
【００１１】
アンモニア消去工程において、まず、還元型補酵素の存在下、グルタミン酸脱水素酵素により、上記の工程で５−フルオロウラシルと共に生成したアンモニアは２−オキソグルタル酸と反応して消去され、グルタミン酸が生成し、還元型補酵素は酸化型補酵素に変換される。さらに、２−オキソグルタル酸の再生工程において、上記のアンモニア消去反応で生成した酸化型補酵素の存在下、イソクエン酸脱水素酵素により、イソクエン酸が２−オキソグルタル酸と二酸化炭素に変換されると共に、酸化型補酵素が還元型補酵素に変換され、２−オキソグルタル酸および還元型補酵素が再生される。２−オキソグルタル酸の再生工程により、上記のアンモニア消去工程において、２−オキソグルタル酸および還元型補酵素が再生されて供給されるため、アンモニアと２−オキソグルタル酸からグルタミン酸が生成する方向の反応速度が増加し、効率的にアンモニアを消去することができる。その結果、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する工程において、さらに５−フルオロウラシルおよびアンモニアが生成する方向の反応速度が増加し、効率的に５−フルオロウラシルを生成することができる。
【００１２】
（２）５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する酵素
本発明において使用される、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する酵素としては、５−フルオロシトシンと水から５−フルオロウラシルとアンモニアを生成する反応を触媒する酵素であれば制限はなく、例えばクレアチニンデイミナーゼ（EC 3.5.4.21）およびシトシンデアミナーゼ（EC 3.5.4.1）等があげられる。
【００１３】
クレアチニンデイミナーゼとしては、クレアチニンと水からＮ−メチルヒダントインとアンモニアを生成する反応を触媒する酵素（EC 3.5.4.21）であれば制限はなく、例えば、Clostridium paraputrificum（J. Bacteriol., 75, 633-639, 1958）、Corynebacterium lilium、Corynebacterium glutamicum等のCorynebacterium属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium divaricatum等のBrevibacterium属細菌（特開昭５２−３４９７６）、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas cruciviae等のPseudomonas属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）Arthrobacter ureafaciens、Arthrobacter histidinolovorans等のArthrobacter属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）、Flavobacterium filamentosum（J. Biol. Chem., 260, 3915-3922, 1985）、Bacillus sp. CNI-1365（特開昭６１−２１９３８３号公報）、好気性微生物ATCC31546（特開昭５６−７２６９２号公報）等の細菌由来のクレアチニンデイミナーゼ等があげられ、これらの微生物の菌体から調製したり遺伝子組換え法（特開平７−１４３８８１号公報）により製造することができる。また、ロシュ・ダイアグノスティクス社、シグマ−アルドリッチ社等から市販されているものを使用することもできる。
【００１４】
シトシンデアミナーゼとしてはシトシンと水からウラシルとアンモニアを生成する反応を触媒する酵素（EC 3.5.4.1）であれば制限はなく、Salmonella typhimurium（Biochem. Biophys. Acta., 719, 251-258, 1982）、Escherichia coli（Agric. Biol. Chem., 50, 1721-1730, 1986; 特開昭５７−６３０８９; 特開昭５９−５５１９６号公報）等の細菌、Saccharomyces cerevisiae（Methods Enzymol., 51, 394-401, 1978; 特開昭５９−１３１０８４号公報）等の酵母由来のシトシンデアミナーゼ等があげられ、これらの微生物の菌体から調製することができる。
【００１５】
（３）グルタミン酸脱水素酵素
本発明において使用されるグルタミン酸脱水素酵素としては、還元型補酵素、アンモニアおよび２−オキソグルタル酸からＬ−グルタミン酸と酸化型補酵素とを生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限はなく、例えば、還元型補酵素としてＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの両方を取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.3)、還元型補酵素としてＮＡＤＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.2)、還元型補酵素としてＮＡＤＰＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.4)があげられる。還元型補酵素としてＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの両方を取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.3)としては、例えばウシ肝等の動物組織、カビ、テトラヒメナ、Mycoplasmalaidowii、Bacillus subtilis等の細菌等由来のグルタミン酸脱水素酵素があげられる。還元型補酵素としてＮＡＤＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.2)としては、例えばBacillus acidocaldarius（特開平６−３８７４４号公報）、Pseudomonas sp. 433-3（特開平７−２７４９５６号公報）、Pyrococcus sp. KOD1（特開２０００−４１６８０号公報）、高等植物由来のグルタミン酸脱水素酵素等があげられる。還元型補酵素としてＮＡＤＰＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.4)としては、例えばNitrosomonas europae、Escherichia coli、Thiobacillus novellus、Brevibacterium flavum、Bacillus licheniformis、Corynebacterium glutamicum, Proteus inconstans（特開昭５４−１２６７８９号公報）、Thermococcus litoralis（特開平６−３２７４７１号公報）、Pyrococcus furiosus等の細菌、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、Neurospora crassa、Fusarium oxysporum、Coprinus macrorhizus（特開昭６２−１０７７８４号公報）等のカビ、クロレラ由来のグルタミン酸脱水素酵素等があげられる。グルタミン酸脱水素酵素は、上記の微生物の菌体や動物組織から調製することができる。
【００１６】
（４）還元型補酵素および酸化型補酵素
本発明において使用される還元性補酵素としては、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨ、ＡＤＡＤＰＨ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート）等が挙げられるが、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが好ましく、ＮＡＤＰＨがより好ましい。本発明において還元型補酵素から生成する酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、チオＮＡＤ+、チオＮＡＤＰ+、ＡＤＡＤＰ+等が挙げられるが、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+が好ましく、ＮＡＤＰ+がより好ましい。
【００１７】
（５）イソクエン酸脱水素酵素
本発明において使用されるイソクエン酸脱水素酵素としては、酸化型補酵素およびイソクエン酸から２−オキソグルタル酸、二酸化炭素および還元型補酵素を生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限はなく、酸化型補酵素としてＮＡＤＰ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.42）や酸化型補酵素としてＮＡＤ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.41）があげられる。酸化型補酵素としてＮＡＤＰ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素としては、例えばSaccharomyces cervisiae、Candida utilis等の酵母、Aspergillus niger（Biochem. J., 236, 549-557, 1986）等の糸状菌、Mycobacterium tuberculosis、Azotobacter vinelandii、Bacillus stearothermophillus（J. Biol. Chem., 245, 3186-3194, 1970）、Thermusflavus AT-62（J. Biochem., 77, 233-240, 1975）、Thermus aquaticus（特開平１１−３４６７８１号公報）、Escherichia coli（Biochim. Biophys. Acta., 481 340-347, 1977）、Escherichia freundi、Sulfolobus acidocaldarius（特開平９−９２５号公報）、Corynebacterium melassecola（特開昭６２−１６６８９０号公報）、Vibrio sp. ABE-1（J. Biochem., 86, 377-384, 1979）等の細菌、Trypanosoma cruzi、カイコ、ウシ角膜上皮、ウシ心筋、ウシ肝、ブタ心筋等の種々の動物組織、植物組織由来のイソクエン酸脱水素酵素等があげられる。酸化型補酵素としてＮＡＤ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素としては、例えばウシ心筋（Biochemistry, 17, 5339-5346, 1978）、ブタ心筋（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 75, 252-255, 1978）等の種々の動物組織、Saccharomyces cerevisiae（J. Biol. Chem., 238, 2875-2881, 1963）等の酵母、Acetobacter peroxydans（J. Biol. Chem., 238, 2875-2881, 1963）、Deinococcus radiodurans（特開２００５−３４０６５号公報）、Aspergillus niger、Neurospora crassa（Biochemistry, 18, 3616-3622, 1978）、Cristhidia fasciculata、エンドウ豆ミトコンドリア由来のイソクエン酸脱水素酵素等があげられる。イソクエン酸脱水素酵素は、上記の微生物の菌体や動物組織から調製することができる。
【００１８】
（６）反応条件
本発明における５−フルオロウラシルの製造における反応条件としては、５−フルオロウラシルを温和な条件で、かつ、効率的に製造し得る条件であれば特に制限はない。イソクエン酸脱水素酵素の反応には、通常は金属イオンが必要なため、マンガンイオンまたはマグネシウムイオン等の金属イオンを存在させることが好ましい。反応液中のｐＨとしては、例えばｐＨ４〜１１，好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９である。反応温度としては、例えば酵素が機能するに適した温度であれば特に制限はなく、例えばは０〜５０℃であり、好ましくは１０〜４５℃であり、より好ましくは２５〜４０℃である。反応時間としては、例えば酵素反応が終了する時間であれば特に制限はなく、例えばは３０分間〜１０時間であり、好ましくは１時間〜５時間であり、より好ましくは１．５時間〜２．５時間である。５−フルオロシトシン、２−オキソグルタル酸、イソクエン酸の濃度は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。クレアチニンデイミナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素の濃度は、０．１〜１０００ｋＵ／Ｌが好ましく、より好ましくは１〜１００ｋＵ／Ｌである。還元型補酵素の濃度は、１μｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
（７）５−フルオロウラシルの単離
反応液中に生成した５−フルオロウラシルは、反応終了後の反応液を減圧下で濃縮乾固させ、得られた乾固物を少量の希塩酸およびメタノールで洗浄して未反応の５−フルオロシトシンを除去した後、乾固物を再度に水に溶解させ、水溶液から再結晶させることにより単離することができる。また、再結晶の代わりにイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によっても単離することができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、以下の実施例においては、次の酵素、試薬を使用した。
５−フルオロシトシン（東京化成工業株式会社製）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬工業株式会社製、以下トリス）、塩化マグネシウム・６水和物（和光純薬工業株式会社製）、２−オキソグルタル酸（協和発酵工業株式会社製）、イソクエン酸（和光純薬工業株式会社製）、ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（オリエンタル酵母工業株式会社製）、クレアチニンデイミナーゼ（Corynebacterium lilium由来；ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、グルタミン酸脱水素酵素（酵母由来；オリエンタル酵母工業株式会社製）、イソクエン酸脱水素酵素（酵母由来；オリエンタル酵母工業株式会社製）。
【実施例】
【００２１】
５−フルオロウラシルの製造
（１）製造用溶液の調製
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（６．０６ｇ：５０．０ｍｍｏｌ、和光純薬工業株式会社製）を蒸留水（７００ｍＬ）に溶解し、２ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いてｐＨ８．０に調整し、トリス緩衝液を調製した。次いで、当該トリス緩衝液を攪拌しながら、塩化マグネシウム・６水和物（０．０４ｇ：０．２０ｍｍｏｌ、和光純薬工業株式会社製）、２−オキソグルタル酸（１．６０ｇ：１１．０ｍｍｏｌ、）、イソクエン酸（１．８０ｇ：９．４ｍｍｏｌ）および５−フルオロシトシン（２．００ｇ：１５．５ｍｍｏｌ）を順にトリス緩衝液に添加した。この時、溶液のｐＨが４．９となったので、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（６．３０ｇ：５２．０ｍｍｏｌ）を混合液に添加し、ｐＨを８．０に調整した。このｐＨ８．０の水溶液に、ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（４００ｍｇ：０．４８０ｍｍｏｌ）、グルタミン酸脱水素酵素（３０．８９ｋＵ）、イソクエン酸脱水素酵素（３．００ｋＵ）およびクレアチニンデイミナーゼ（２０．００ｋＵ）を順に添加し、最後に蒸留水を加えて合計で１Ｌの製造用溶液を調製した。
【００２２】
（２）反応の追跡
上記（１）で調製した製造用溶液を３７℃で１５０分間攪拌した。反応途中、３０分間毎に、一部の反応液を取り出して、２通りの方法により反応を追跡した。１つは、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＴＬＣ）による追跡方法であり、もう１つは、特定の波長での吸光度を測定することによる追跡である。
【００２３】
シリカゲル薄層クロマトグラフィーによる反応の追跡は、次のようにして行った。まず、ＴＬＣ用のサンプルを調製すべく、反応開始３０分間毎に一部の反応液を採取し、この採取した一部の反応液をセントリコン３０（アミコン社製）を用いて限外ろ過し、得られたろ液を蒸留水で１００倍希釈した。サンプルとしてこの希釈反応溶液を、展開溶媒として酢酸エチル：アセトン：水（７：４：１）の混液を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより反応を追跡した。検出には、紫外線ランプ（波長：２５４ｎｍ）を用いた。その結果、１５０分後の反応液では、５−フルオロシトシンが消失し、５−フルオロウラシルのみが生成していることを確認した。従って、シリカゲル薄層クロマトグラフィーから、１５０分間の反応により、５−フルオロシトシンが完全に消費されたことを確認した。
【００２４】
一方、特定の波長での吸光度測定による反応の追跡は、次のようにして行った。前記の方法により調製した希釈反応溶液の２７５ｎｍおよび２６５ｎｍでの吸光度を分光光度計（日立２２８型）により測定した。ここで、２７５ｎｍおよび２６５ｎｍは、それぞれ、５−フルオロシトシンおよび５−フルオロウラシルに特異的な吸収波長である。反応を追跡した結果、２７５ｎｍでの吸光度は減少したのに対して、２６５ｎｍでの吸光度は増加した。
【００２５】
反応１５０分後、セントリコン３０を用いた限外ろ過により分子量３０，０００以上の物質を取り除いた。得られたろ液を蒸留水で１００倍希釈し、当該希釈溶液（希釈反応溶液）の２６５ｎｍでの吸光度を、分光光度計を用いて測定した。ブランク、すなわちフルオロシトシンを添加せずに調製した製造用溶液を、同様に１００倍希釈して２６５ｎｍでの吸光度を測定した。希釈反応溶液の吸光度からブランクの吸光度を差し引いた吸光度は０．９４９であった。
【００２６】
さらに、市販の５−フルオロウラシル２ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調製した５−フルオロウラシルの標準液（１５．３７ｍｍｏｌ／Ｌ）を１００倍希釈して得られた希釈溶液（希釈標準液）の２６５ｎｍでの吸光度は０．９３３であった。上記の通り、反応前の製造用溶液は１５．５ｍｍｏｌ／Ｌの５−フルオロシトシンを含んでおり、１５０分間反応後の反応液の１００倍希釈液の２６５ｎｍでの吸光度は０．９４９であり、希釈標準液の２６５ｎｍでの吸光度とほぼ同じ値であったことから、１５０分間の反応により、５−フルオロシトシンはほぼ完全に５−フルオロウラシルに変換されたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により、抗癌剤として有用な５−フルオロウラシルを温和な条件で効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の５−フルオロウラシルの製造法の反応原理を表す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−フルオロウラシルの酵素的製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−フルオロウラシルは、臨床の現場で使用されている抗癌剤の１つであり、胃癌、肝癌、結腸・直腸癌、乳癌、膵癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌等の悪性腫瘍へ適用されている。５−フルオロウラシルの製造法としては、化学合成的手法による製造法や酵素を用いた製造法（酵素的製造法）が知られている。酵素的製造法としては、シトシンをウラシルとアンモニアに加水分解する活性を有するシトシンデアミナーゼを用いた方法が知られており、例えば、Escherichia coli等の微生物菌体から抽出したシトシンデアミナーゼを用いて５−フルオロシトシンから５−フルオロウラシルを製造する方法（特許文献１参照）やパン酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来の熱安定性シトシンデアミナーゼを用いて５−フルオロシトシンから５−フルオロウラシルを製造する方法（特許文献２参照）等が報告されている。
【０００３】
一方、クレアチニンデイミナーゼ（クレアチニンイミノヒドロラーゼ）が、クレアチニンをＮ−メチルヒダントインとアンモニアに加水分解するだけでなく、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルとアンモニアに加水分解することを利用した血中の５−フルオロシトシンの測定法が報告されている（非特許文献１参照）。また、血中の５−フルオロシトシン測定法として、血中の５−フルオロシトシンにクレアチニンデイミナーゼを作用させて５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させた後、生成したアンモニアと、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤＨとにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸およびＮＡＤ+を生成させ、この反応において消費されるＮＡＤＨを測定する方法が報告されている（非特許文献２参照）。
【０００４】
また、クレアチニンデイミナーゼ等によるアンモニア生成反応を利用した検体中の物質の測定において、検体に元から存在するアンモニアの消去方法として、アンモニアと、２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させると共に、生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させて、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させることにより、効率的にアンモニアを消去する方法が報告されている（特許文献３および４参照）。
【０００５】
化学的手法による５−フルオロウラシルの製造法については、多数の方法が報告されているが、過酷な製造条件を用いる場合が多いため、温和な条件での５−フルオロウラシルの製造法が望まれている。
【特許文献１】特開昭５９−０５５１９６号公報
【特許文献２】特開平４−１３１０８４号公報
【特許文献３】特開平９−０００２９５号公報
【特許文献４】特開平１１−３４６７８１号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology），（米国），１９８４年，第２０巻，第５号，ｐ．９９６−９９７
【非特許文献２】クリニカル ケミストリー（Clinical Chemistry），（米国），１９８８年，第３４巻，第１号，ｐ．５９−６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、温和な条件で効率的に５−フルオロウラシルを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、温和な条件で効率的に５−フルオロウラシルを製造する方法を鋭意検討した結果、５−フルオロシトシンにクレアチニンデイミナーゼ等を作用させ、５−フルオロウラシルとアンモニアを生成させる、５−フルオロウラシルを酵素的に製造する方法において、生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させてアンモニアを消去し、さらに生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させることにより、効率的に５−フルオロウラシルを製造することができる、という知見を見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［４］に関する。
［１］以下の工程を含有することを特徴とする５−フルオロウラシルの製造方法。
（１）５−フルオロシトシンに酵素を作用させ、５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させる工程；
（２）工程（１）において生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させる工程；および、
（３）工程（２）において生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させる工程。
［２］さらに（４）生成した５−フルオロウラシルを単離する工程を含有することを特徴とする［１］に記載の製造方法。
［３］還元型補酵素および酸化型補酵素が、それぞれＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ+である［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］５−フルオロシトシンに作用させる酵素がクレアチニンデイミナーゼまたはシトシンデアミナーゼである［１］〜［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、温和な条件で効率的に５−フルオロウラシルを製造する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）製造法の原理
本発明の製造法の原理を図１に示す。本発明の製造法は、５−フルオロシトシンを酵素的に５−フルオロウラシルに変換する工程と、当該工程で生成するアンモニアの消去工程を含有するため、生成するアンモニアは速やかに消去されると共に、アンモニア消去工程で使用される２−オキソグルタル酸濃度は、２−オキソグルタル酸の再生工程を含有するため、一定濃度に保つことができるという特徴を有する。
【００１０】
５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する工程において、５−フルオロシトシンは水の存在下でシトシンデアミナーゼ、クレアチニンデイミナーゼ等の酵素の作用により加水分解されて、５−フルオロウラシルおよびアンモニアに変換される。この反応において５−フルオロウラシルと共に生成するアンモニアを下記のアンモニア消去工程によって消去することにより、５−フルオロウラシルおよびアンモニアが生成する方向の反応速度が増加し、効率的に５−フルオロウラシルを生成することができる。
【００１１】
アンモニア消去工程において、まず、還元型補酵素の存在下、グルタミン酸脱水素酵素により、上記の工程で５−フルオロウラシルと共に生成したアンモニアは２−オキソグルタル酸と反応して消去され、グルタミン酸が生成し、還元型補酵素は酸化型補酵素に変換される。さらに、２−オキソグルタル酸の再生工程において、上記のアンモニア消去反応で生成した酸化型補酵素の存在下、イソクエン酸脱水素酵素により、イソクエン酸が２−オキソグルタル酸と二酸化炭素に変換されると共に、酸化型補酵素が還元型補酵素に変換され、２−オキソグルタル酸および還元型補酵素が再生される。２−オキソグルタル酸の再生工程により、上記のアンモニア消去工程において、２−オキソグルタル酸および還元型補酵素が再生されて供給されるため、アンモニアと２−オキソグルタル酸からグルタミン酸が生成する方向の反応速度が増加し、効率的にアンモニアを消去することができる。その結果、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する工程において、さらに５−フルオロウラシルおよびアンモニアが生成する方向の反応速度が増加し、効率的に５−フルオロウラシルを生成することができる。
【００１２】
（２）５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する酵素
本発明において使用される、５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換する酵素としては、５−フルオロシトシンと水から５−フルオロウラシルとアンモニアを生成する反応を触媒する酵素であれば制限はなく、例えばクレアチニンデイミナーゼ（EC 3.5.4.21）およびシトシンデアミナーゼ（EC 3.5.4.1）等があげられる。
【００１３】
クレアチニンデイミナーゼとしては、クレアチニンと水からＮ−メチルヒダントインとアンモニアを生成する反応を触媒する酵素（EC 3.5.4.21）であれば制限はなく、例えば、Clostridium paraputrificum（J. Bacteriol., 75, 633-639, 1958）、Corynebacterium lilium、Corynebacterium glutamicum等のCorynebacterium属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium divaricatum等のBrevibacterium属細菌（特開昭５２−３４９７６）、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas cruciviae等のPseudomonas属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）Arthrobacter ureafaciens、Arthrobacter histidinolovorans等のArthrobacter属細菌（特開昭５２−３４９７６号公報）、Flavobacterium filamentosum（J. Biol. Chem., 260, 3915-3922, 1985）、Bacillus sp. CNI-1365（特開昭６１−２１９３８３号公報）、好気性微生物ATCC31546（特開昭５６−７２６９２号公報）等の細菌由来のクレアチニンデイミナーゼ等があげられ、これらの微生物の菌体から調製したり遺伝子組換え法（特開平７−１４３８８１号公報）により製造することができる。また、ロシュ・ダイアグノスティクス社、シグマ−アルドリッチ社等から市販されているものを使用することもできる。
【００１４】
シトシンデアミナーゼとしてはシトシンと水からウラシルとアンモニアを生成する反応を触媒する酵素（EC 3.5.4.1）であれば制限はなく、Salmonella typhimurium（Biochem. Biophys. Acta., 719, 251-258, 1982）、Escherichia coli（Agric. Biol. Chem., 50, 1721-1730, 1986; 特開昭５７−６３０８９; 特開昭５９−５５１９６号公報）等の細菌、Saccharomyces cerevisiae（Methods Enzymol., 51, 394-401, 1978; 特開昭５９−１３１０８４号公報）等の酵母由来のシトシンデアミナーゼ等があげられ、これらの微生物の菌体から調製することができる。
【００１５】
（３）グルタミン酸脱水素酵素
本発明において使用されるグルタミン酸脱水素酵素としては、還元型補酵素、アンモニアおよび２−オキソグルタル酸からＬ−グルタミン酸と酸化型補酵素とを生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限はなく、例えば、還元型補酵素としてＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの両方を取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.3)、還元型補酵素としてＮＡＤＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.2)、還元型補酵素としてＮＡＤＰＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.4)があげられる。還元型補酵素としてＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの両方を取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.3)としては、例えばウシ肝等の動物組織、カビ、テトラヒメナ、Mycoplasmalaidowii、Bacillus subtilis等の細菌等由来のグルタミン酸脱水素酵素があげられる。還元型補酵素としてＮＡＤＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.2)としては、例えばBacillus acidocaldarius（特開平６−３８７４４号公報）、Pseudomonas sp. 433-3（特開平７−２７４９５６号公報）、Pyrococcus sp. KOD1（特開２０００−４１６８０号公報）、高等植物由来のグルタミン酸脱水素酵素等があげられる。還元型補酵素としてＮＡＤＰＨのみを取り得るグルタミン酸脱水素酵素(EC 1.4.1.4)としては、例えばNitrosomonas europae、Escherichia coli、Thiobacillus novellus、Brevibacterium flavum、Bacillus licheniformis、Corynebacterium glutamicum, Proteus inconstans（特開昭５４−１２６７８９号公報）、Thermococcus litoralis（特開平６−３２７４７１号公報）、Pyrococcus furiosus等の細菌、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、Neurospora crassa、Fusarium oxysporum、Coprinus macrorhizus（特開昭６２−１０７７８４号公報）等のカビ、クロレラ由来のグルタミン酸脱水素酵素等があげられる。グルタミン酸脱水素酵素は、上記の微生物の菌体や動物組織から調製することができる。
【００１６】
（４）還元型補酵素および酸化型補酵素
本発明において使用される還元性補酵素としては、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨ、ＡＤＡＤＰＨ（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート）等が挙げられるが、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが好ましく、ＮＡＤＰＨがより好ましい。本発明において還元型補酵素から生成する酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+、チオＮＡＤ+、チオＮＡＤＰ+、ＡＤＡＤＰ+等が挙げられるが、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+が好ましく、ＮＡＤＰ+がより好ましい。
【００１７】
（５）イソクエン酸脱水素酵素
本発明において使用されるイソクエン酸脱水素酵素としては、酸化型補酵素およびイソクエン酸から２−オキソグルタル酸、二酸化炭素および還元型補酵素を生成する反応を触媒する酵素であれば特に制限はなく、酸化型補酵素としてＮＡＤＰ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.42）や酸化型補酵素としてＮＡＤ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.41）があげられる。酸化型補酵素としてＮＡＤＰ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素としては、例えばSaccharomyces cervisiae、Candida utilis等の酵母、Aspergillus niger（Biochem. J., 236, 549-557, 1986）等の糸状菌、Mycobacterium tuberculosis、Azotobacter vinelandii、Bacillus stearothermophillus（J. Biol. Chem., 245, 3186-3194, 1970）、Thermusflavus AT-62（J. Biochem., 77, 233-240, 1975）、Thermus aquaticus（特開平１１−３４６７８１号公報）、Escherichia coli（Biochim. Biophys. Acta., 481 340-347, 1977）、Escherichia freundi、Sulfolobus acidocaldarius（特開平９−９２５号公報）、Corynebacterium melassecola（特開昭６２−１６６８９０号公報）、Vibrio sp. ABE-1（J. Biochem., 86, 377-384, 1979）等の細菌、Trypanosoma cruzi、カイコ、ウシ角膜上皮、ウシ心筋、ウシ肝、ブタ心筋等の種々の動物組織、植物組織由来のイソクエン酸脱水素酵素等があげられる。酸化型補酵素としてＮＡＤ+を利用するイソクエン酸脱水素酵素としては、例えばウシ心筋（Biochemistry, 17, 5339-5346, 1978）、ブタ心筋（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 75, 252-255, 1978）等の種々の動物組織、Saccharomyces cerevisiae（J. Biol. Chem., 238, 2875-2881, 1963）等の酵母、Acetobacter peroxydans（J. Biol. Chem., 238, 2875-2881, 1963）、Deinococcus radiodurans（特開２００５−３４０６５号公報）、Aspergillus niger、Neurospora crassa（Biochemistry, 18, 3616-3622, 1978）、Cristhidia fasciculata、エンドウ豆ミトコンドリア由来のイソクエン酸脱水素酵素等があげられる。イソクエン酸脱水素酵素は、上記の微生物の菌体や動物組織から調製することができる。
【００１８】
（６）反応条件
本発明における５−フルオロウラシルの製造における反応条件としては、５−フルオロウラシルを温和な条件で、かつ、効率的に製造し得る条件であれば特に制限はない。イソクエン酸脱水素酵素の反応には、通常は金属イオンが必要なため、マンガンイオンまたはマグネシウムイオン等の金属イオンを存在させることが好ましい。反応液中のｐＨとしては、例えばｐＨ４〜１１，好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６〜９である。反応温度としては、例えば酵素が機能するに適した温度であれば特に制限はなく、例えばは０〜５０℃であり、好ましくは１０〜４５℃であり、より好ましくは２５〜４０℃である。反応時間としては、例えば酵素反応が終了する時間であれば特に制限はなく、例えばは３０分間〜１０時間であり、好ましくは１時間〜５時間であり、より好ましくは１．５時間〜２．５時間である。５−フルオロシトシン、２−オキソグルタル酸、イソクエン酸の濃度は、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。クレアチニンデイミナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素の濃度は、０．１〜１０００ｋＵ／Ｌが好ましく、より好ましくは１〜１００ｋＵ／Ｌである。還元型補酵素の濃度は、１μｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
（７）５−フルオロウラシルの単離
反応液中に生成した５−フルオロウラシルは、反応終了後の反応液を減圧下で濃縮乾固させ、得られた乾固物を少量の希塩酸およびメタノールで洗浄して未反応の５−フルオロシトシンを除去した後、乾固物を再度に水に溶解させ、水溶液から再結晶させることにより単離することができる。また、再結晶の代わりにイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によっても単離することができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、以下の実施例においては、次の酵素、試薬を使用した。
５−フルオロシトシン（東京化成工業株式会社製）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（和光純薬工業株式会社製、以下トリス）、塩化マグネシウム・６水和物（和光純薬工業株式会社製）、２−オキソグルタル酸（協和発酵工業株式会社製）、イソクエン酸（和光純薬工業株式会社製）、ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（オリエンタル酵母工業株式会社製）、クレアチニンデイミナーゼ（Corynebacterium lilium由来；ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、グルタミン酸脱水素酵素（酵母由来；オリエンタル酵母工業株式会社製）、イソクエン酸脱水素酵素（酵母由来；オリエンタル酵母工業株式会社製）。
【実施例】
【００２１】
５−フルオロウラシルの製造
（１）製造用溶液の調製
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（６．０６ｇ：５０．０ｍｍｏｌ、和光純薬工業株式会社製）を蒸留水（７００ｍＬ）に溶解し、２ｍｏｌ／Ｌの塩酸を用いてｐＨ８．０に調整し、トリス緩衝液を調製した。次いで、当該トリス緩衝液を攪拌しながら、塩化マグネシウム・６水和物（０．０４ｇ：０．２０ｍｍｏｌ、和光純薬工業株式会社製）、２−オキソグルタル酸（１．６０ｇ：１１．０ｍｍｏｌ、）、イソクエン酸（１．８０ｇ：９．４ｍｍｏｌ）および５−フルオロシトシン（２．００ｇ：１５．５ｍｍｏｌ）を順にトリス緩衝液に添加した。この時、溶液のｐＨが４．９となったので、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（６．３０ｇ：５２．０ｍｍｏｌ）を混合液に添加し、ｐＨを８．０に調整した。このｐＨ８．０の水溶液に、ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（４００ｍｇ：０．４８０ｍｍｏｌ）、グルタミン酸脱水素酵素（３０．８９ｋＵ）、イソクエン酸脱水素酵素（３．００ｋＵ）およびクレアチニンデイミナーゼ（２０．００ｋＵ）を順に添加し、最後に蒸留水を加えて合計で１Ｌの製造用溶液を調製した。
【００２２】
（２）反応の追跡
上記（１）で調製した製造用溶液を３７℃で１５０分間攪拌した。反応途中、３０分間毎に、一部の反応液を取り出して、２通りの方法により反応を追跡した。１つは、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＴＬＣ）による追跡方法であり、もう１つは、特定の波長での吸光度を測定することによる追跡である。
【００２３】
シリカゲル薄層クロマトグラフィーによる反応の追跡は、次のようにして行った。まず、ＴＬＣ用のサンプルを調製すべく、反応開始３０分間毎に一部の反応液を採取し、この採取した一部の反応液をセントリコン３０（アミコン社製）を用いて限外ろ過し、得られたろ液を蒸留水で１００倍希釈した。サンプルとしてこの希釈反応溶液を、展開溶媒として酢酸エチル：アセトン：水（７：４：１）の混液を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより反応を追跡した。検出には、紫外線ランプ（波長：２５４ｎｍ）を用いた。その結果、１５０分後の反応液では、５−フルオロシトシンが消失し、５−フルオロウラシルのみが生成していることを確認した。従って、シリカゲル薄層クロマトグラフィーから、１５０分間の反応により、５−フルオロシトシンが完全に消費されたことを確認した。
【００２４】
一方、特定の波長での吸光度測定による反応の追跡は、次のようにして行った。前記の方法により調製した希釈反応溶液の２７５ｎｍおよび２６５ｎｍでの吸光度を分光光度計（日立２２８型）により測定した。ここで、２７５ｎｍおよび２６５ｎｍは、それぞれ、５−フルオロシトシンおよび５−フルオロウラシルに特異的な吸収波長である。反応を追跡した結果、２７５ｎｍでの吸光度は減少したのに対して、２６５ｎｍでの吸光度は増加した。
【００２５】
反応１５０分後、セントリコン３０を用いた限外ろ過により分子量３０，０００以上の物質を取り除いた。得られたろ液を蒸留水で１００倍希釈し、当該希釈溶液（希釈反応溶液）の２６５ｎｍでの吸光度を、分光光度計を用いて測定した。ブランク、すなわちフルオロシトシンを添加せずに調製した製造用溶液を、同様に１００倍希釈して２６５ｎｍでの吸光度を測定した。希釈反応溶液の吸光度からブランクの吸光度を差し引いた吸光度は０．９４９であった。
【００２６】
さらに、市販の５−フルオロウラシル２ｇを蒸留水１Ｌに溶解して調製した５−フルオロウラシルの標準液（１５．３７ｍｍｏｌ／Ｌ）を１００倍希釈して得られた希釈溶液（希釈標準液）の２６５ｎｍでの吸光度は０．９３３であった。上記の通り、反応前の製造用溶液は１５．５ｍｍｏｌ／Ｌの５−フルオロシトシンを含んでおり、１５０分間反応後の反応液の１００倍希釈液の２６５ｎｍでの吸光度は０．９４９であり、希釈標準液の２６５ｎｍでの吸光度とほぼ同じ値であったことから、１５０分間の反応により、５−フルオロシトシンはほぼ完全に５−フルオロウラシルに変換されたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により、抗癌剤として有用な５−フルオロウラシルを温和な条件で効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の５−フルオロウラシルの製造法の反応原理を表す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含有することを特徴とする５−フルオロウラシルの製造方法。
（１）５−フルオロシトシンに酵素を作用させ、５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させる工程；
（２）工程（１）において生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させる工程；および、
（３）工程（２）において生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させる工程。
【請求項２】
さらに（４）生成した５−フルオロウラシルを単離する工程を含有することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
還元型補酵素および酸化型補酵素が、それぞれＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ+である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
５−フルオロシトシンに作用させる酵素がクレアチニンデイミナーゼまたはシトシンデアミナーゼである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１】
以下の工程を含有することを特徴とする５−フルオロウラシルの製造方法。
（１）５−フルオロシトシンに酵素を作用させ、５−フルオロウラシルおよびアンモニアを生成させる工程；
（２）工程（１）において生成したアンモニアと２−オキソグルタル酸および還元型補酵素とにグルタミン酸脱水素酵素を作用させ、グルタミン酸および酸化型補酵素を生成させる工程；および、
（３）工程（２）において生成した酸化型補酵素とイソクエン酸とにイソクエン酸脱水素酵素を作用させ、還元型補酵素および２−オキソグルタル酸を再生させる工程。
【請求項２】
さらに（４）生成した５−フルオロウラシルを単離する工程を含有することを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
還元型補酵素および酸化型補酵素が、それぞれＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰ+である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
５−フルオロシトシンに作用させる酵素がクレアチニンデイミナーゼまたはシトシンデアミナーゼである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−４３９７９（Ｐ２００７−４３９７９Ａ）
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３２７９２（Ｐ２００５−２３２７９２）
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
【Ｆターム（参考）】
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