Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株および塩酸バンコマイシン調製プロセス
【課題】不純物含有量が低く、かつバンコマイシン収率が高いＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ株、ならびにこの株を使用する塩酸バンコマイシン発酵プロセスおよび精製プロセスを提供する。
【解決手段】Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を選択培地において、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを使用して、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する。当該変異株を培養させて醗酵させる工程、濾過、精製、結晶化する工程を包含する、塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセス。
【解決手段】Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を選択培地において、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを使用して、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する。当該変異株を培養させて醗酵させる工程、濾過、精製、結晶化する工程を包含する、塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）、この変異株を使用して塩酸バンコマイシンを産生するための発酵プロセスおよび精製プロセスに関する。より具体的には、本発明は、ｉ）炭素源としてのデキストリン、窒素源としてのダイズ粉末またはジャガイモタンパク質、および他のミネラルを含む培地において、発酵条件を制御することによってこの変異株を使用してバンコマイシンを高い収率および生産能力で調製するための発酵プロセス、およびｉｉ）カラムシステムと、塩酸バンコマイシンを結晶化するためのプロセスとから構成される、精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（先行技術の説明）
バンコマイシンは、微生物の細胞壁の合成を阻害する糖ペプチド抗生物質のうちの１つである。さらに、バンコマイシンは、グラム陽性細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（これらは、抗生物質のペニシリンおよびセファロスポリンに対して耐性であるグラム陽性細菌である））に対して強力な抑制効果を示す。また、バンコマイシンは、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）（これは、手術後の患者、老齢患者、および免疫が弱い患者にとっては致死性である）に由来する疾患に対して、高い処置効果を有することが公知である。米国特許第３，０６７，０９９号において、バンコマイシンを発酵および産生するためのプロセスが、開示されている。しかし、この特許化されたプロセスは、０．２ｍｇ／ｍＬという非常に低い株収率および生産能力を示した。さらに、その生産コストもまた、非常に高かった。
【０００３】
上記の問題を解決するために、高いバンコマイシン収率を有する多数の株が、単離および開発された。特許文献１において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ変異株（受託番号ＫＦＣＣ−１０７４５）が、高い株収率でバンコマイシンを産生すると開示されている。一方、特許文献２において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＦＣＣ−１０７４４）が、高い株収率でバンコマイシンを産生すると開示されている。さらに、特許文献１において、１．０〜２．０ ｗ／ｖ％のグルテンまたはダイズケーキを窒素源として含む培養培地を使用してバンコマイシンを高収率で産生するための発酵プロセスが、開示されている。
【０００４】
上記特許において開示されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ株は、バンコマイシンを産生することについて６．１ｍｇ／ｍＬという高い株収率を示したが、バンコマイシンを商業化するための多数のハンディキャップ（例えば、高い毒性および高い不純物含有量、ならびに高い生産コスト）が存在する。
【特許文献１】韓国特許公開公報第９３−１３０９０号
【特許文献２】韓国特許公開公報第９３−１３０９１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、不純物含有量が低く、かつバンコマイシン収率が高いＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ株、ならびにこの株を使用する塩酸バンコマイシン発酵プロセスおよび精製プロセスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は、非常に高いバンコマイシン生産能力および低い不純物含有量という特徴を有する新規なＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ変異株を単離した。本発明は、この単離された変異株を、炭素源としてのデキストリンと、窒素源としてのマメ粉末またはジャガイモタンパク質と、他の微量元素とを含む培地において使用して、その培地組成および発酵条件を調整することよってバンコマイシンを産生するための発酵プロセスを開発した。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の目的は、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を使用して塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスを提供することである。このプロセスは、
ｉ）選択培地においてＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用してＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を変異させて、上記株から、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する工程；
ｉｉ）上記単離されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）をシード培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）する工程；
ｉｉｉ）１２〜１８（ｗ／ｖ）％のデキストリン、２．２〜３．８（ｗ／ｖ）％のマメ粉末、１．９〜２．９（ｗ／ｖ）％のジャガイモタンパク質、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウムおよび少量のミネラルからなる発酵培地において、上記Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を培養させて発酵させる工程；
ｉｖ）培養ブロス中でマイクロフィルターを使用して、菌糸を除去することによって、バンコマイシンを濾過する工程；
ｖ）得られたバンコマイシンを、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂および吸収剤樹脂が詰まったカラムシステムを使用して精製する工程；ならびに
ｖｉ）上記精製された塩酸バンコマイシンを塩化アンモニウムおよびエタノールで結晶化する工程；
を包含する。
【０００９】
さらに、上記発酵培地は、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのカルシウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのピリドキシン、１〜１００ｍｇ／Ｌのメラニン生合成インヒビターをさらに含み、上記メラニン生合成インヒビターは、アルブチン、ヒドロキノンおよびトリシクラゾールから選択される。
【００１０】
さらに、上記カラムシステムを使用して精製する工程は、
ｉ）疎水性吸収剤樹脂が詰まった吸着カラムに上記ブロスを通す工程であって、バンコマイシンは上記カラム中に残り、不純物は通過し、バンコマイシンは５〜１５％のエタノールによって溶出される、工程；
ｉｉ）工程（ｉ）において得られた溶出物を、強酸カチオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は上記カラム中に残る、工程；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた溶液を、弱塩基アニオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は上記カラム中に残る、工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られた溶液を、活性炭で処理して着色料および不純物を除去する工程；
ｖ）上記脱色された溶液を、活性化アルミナ樹脂で処理し、バンコマイシンを３５〜６０％のイソプロパノールで溶出させる工程；および
ｖｉ）塩酸バンコマイシンを結晶化する工程；
を包含する。
【００１１】
（摘要）
本発明は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を使用して塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、
ｉ）選択培地においてＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用してＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を変異させて、上記株から、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する工程；
ｉｉ）上記単離されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）をシード培養する工程；
ｉｉｉ）１２〜１８（ｗ／ｖ）％のデキストリン、２．２〜３．８（ｗ／ｖ）％のマメ粉末、１．９〜２．９（ｗ／ｖ）％のジャガイモタンパク質、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウムおよび少量のミネラルからなる発酵培地において、上記Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を培養させて発酵させる工程；
ｉｖ）培養ブロス中でマイクロフィルターを使用して、菌糸を除去することによって、バンコマイシンを濾過する工程；
ｖ）得られたバンコマイシンを、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂および吸収剤樹脂が詰まったカラムシステムを使用して精製する工程；ならびに
ｖｉ）上記精製された塩酸バンコマイシンを塩化アンモニウムおよびエタノールで結晶化する工程；
を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
上記Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）は、以下の３工程のプロセスによって単離された。
【００１３】
変異株の単離の第１段階は、高いバンコマイシン耐性を有する株を選択することである。Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を、親株として使用する。この親株を、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用して変異した後、この変異させた株を、０．１〜５０ｇ／Ｌのバンコマイシンを含む選択培地中で２８〜３２℃にて４日間培養した。この選択培地において高い増殖を示す上記の変異させた株を選択して単離した。選択培地の他の組成が、表１に示される。
【００１４】
【表１】
変異株の単離の第２段階は、上記の第１段階において選択された変異株から、高いバンコマイシン生産能力を有する株を選択することである。上記の変異させた株を、バンコマイシンを含まない選択培地を含む寒天プレート表面上で４日間培養した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ−６６３３培養物を、その寒天プレート表面に重層し、その後、それを３０℃にて２４時間インキュベートした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して高い増殖抑制効果を示す変異させた株を、選択して単離した。培地の他の組成は、表１に示されるものと同じである。
【００１５】
変異株の単離の第３段階は、得られた変異株を、２５０〜２８０ ｎｍのＵＶで処理することである。その後、高いバンコマイシン生産能力および低い不純物含有量という特徴を有する変異株を、選択して最終株として単離した。
【００１６】
その単離したＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を、２００７年１月１２日付けで、ブダペスト条約の下で、受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐとして、コリアン カルチャー センター オブ マイクロオーガニズムズ（韓国微生物保存センター）（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＫＣＣＭ）（住所：大韓民国，１２０−０９１ ソウル，ソデムン−ク，ホンジェ１−ドン，ユリムビルディング，３６１−２２１（３６１−２２１、Ｙｕｒｉｍ Ｂ／Ｄ Ｈｏｎｇｊｅ−１−ｄｏｎｇ、Ｓｅｏｄａｅｍｕｎ−ｇｕ、Ｓｅｏｕｌ １２０−０９１、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ））に寄託した。この変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）の主要な特徴は、高いバンコマイシン生産能力、バンコマイシン自体に対する高い耐性、および低い不純物含有量である。従って、この変異株の培養物は、高いバンコマイシン生産能力、バンコマイシン含有培地における良好な増殖、および低い不純物（特に、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいてバンコマイシンピークの直前に出現する不純物）生産能力を示す。
【００１７】
単離した変異株の培養・分析の方法が、以下に記載され得る。
【００１８】
上記変異株を、５０ｍｌエルレンマイアーフラスコ、ペトリ皿、または７Ｌジャーファーメンターを使用して、２３〜３７℃、ｐＨ５．５〜８．０および２００−７００ｒｐｍにて、上記培地において培養した。バンコマイシンの濃度は、米国薬局方２８に基づいてＨＰＬＣ分析によって決定した。微生物の増殖は、１０ｍＬの培養ブロスを４５０ｇにて１０分間遠心分離した後のＰＭＶ（充填菌糸体積（ｐａｃｋｅｄ ｍｙｃｅｌｉａ ｖｏｌｕｍｅ））によって測定した。溶存酸素濃度は、Ｉｎｇｏｌｄ Ｃｏ．（Ｓｗｉｓｓ）によって製造された電極（ポーラログラフィー型）を使用して測定した。
【００１９】
表２は、親株（ＡＴＣＣ−１９７９５）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＦＣＣ−１０９９０）およびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）の間のバンコマイシン耐性を示す。
【００２０】
【表２】
さらに、表３は、親株（ＡＴＣＣ−１９７９５）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＦＣＣ−１０９９０）およびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）の間の形態学的特徴、生理学的特徴および生化学的特徴を示す。
【００２１】
【表３】
単離された変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）および親株は、３４℃、７００ｒｐｍで１２０時間にわたって、４Ｌの生産培地を含む７Ｌジャーファーメンター中で培養した。菌糸を除去した後、バンコマイシンの量、成長（ＰＭＶ）、バンコマイシンの純度，および不純物の含有量を、米国薬局方２８に基づいて、ＨＰＬＣ分析によって決定した。
【００２２】
表４は、生産培地の組成を示す。
【００２３】
【表４】
表５は、親株および本発明の変異株の培養混合物の成長（ＰＭＶ）、バンコマイシン生産能力、バンコマイシンの純度，および不純物含有量を示す。
【００２４】
【表５】
１：主要不純物は、ＨＰＬＣクロマトグラム上のバンコマイシンのピーク直前の保持時間５．９５分におけるピークを意味する。
【００２５】
表２および表３に示されるように、本発明の変異株は、バンコマイシン自体に対する耐性、至適培養温度および至適ｐＨに関して他の株の特徴とは異なる特徴を有する。
【００２６】
さらに、上記変異株は、表５、図１，および図２に示されるように、遙かに高い生産能力でバンコマイシンを生産し、かつ親株よりも遙かに低い主要不純物（５．９５分）を生産する。
【００２７】
本発明は、以下の実施例によって例示され得る。しかし、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されないものとする。
【実施例】
【００２８】
（実施例１） ７Ｌジャーファーメンターにおけるバンコマイシン生産
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）によるバンコマイシンの生産を、７Ｌジャーファーメンター中で測定した。
【００２９】
（シード培養）
単離された変異株を、５０ｍＬの第１シード培地を含む５００ｍＬのエルレンマイアーフラスコ中、３０℃および２５０ｒｐｍにおいて２４時間にわたって培養した。次いで、０．１ｍＬのシード培養物を、１００ｍＬの第２シード培地を含む５００ｍＬのエルレンマイアーフラスコに移し、３０℃および２５０ｒｐｍにおいて６０時間にわたってインキュベートした。
【００３０】
表６は、第１シード培養物の組成を示す。
【００３１】
【表６】
表７は、第２シード培地の組成を示す。
【００３２】
【表７】
（主要培養）
主要培養を、５〜２０％のデキストリンを含む４Ｌの生産培地（表４）を充填した７Ｌ−ジャーファーメンター中で行った。第２シード培養物（２００ｍｌ）を、７Ｌジャーファーメンターに移した。培養中の温度、曝気速度，およびｐＨを、それぞれ、３４℃、１ｖｖｍ、および７．５に維持した。溶存酸素濃度を、７００〜９００ｒｐｍの範囲で攪拌しながら２０％より高く維持した。バンコマイシン生産に対するデキストリンの初期濃度の効果を評価するために、種々の濃度のデキストリン（５〜２０％）を使用した。バンコマイシン生産は、１５％のデキストリン濃度において最高であった；従って、この値は、バンコマイシン生産のためのデキストリンの至適濃度を表す。
【００３３】
表８は、デキストリン濃度の変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３４】
【表８】
（実施例２） ｐＨの変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、ｐＨの変化に従って測定した。実施例１の１５％のデキストリンを含む同じ発酵培地および方法を採用した。ｐＨのみを、５．５〜８．０まで変化させた。表１０は、ｐＨの変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３５】
【表９】
（実施例３） 温度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、温度変化に従って測定した。実施例２の同じ発酵培地および方法を採用した。ｐＨを７．５に調節した。温度を、２３℃〜３７℃まで変化させた。
【００３６】
表１０は、温度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３７】
【表１０】
（実施例４） 窒素源（ダイズ粉）の濃度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、窒素源（ダイズ粉）の濃度変化に従って測定した。ダイズ粉および温度を除いて、実施例３の同じ発酵培地および方法を採用した。温度は、３２℃に調節し、ダイズ粉を１．０％〜３．５％まで変化させた。３％のダイズ粉を含む培地が至適であることが示されている。
【００３８】
表１１は、ダイズ粉の濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３９】
【表１１】
（実施例５） 窒素源（ジャガイモタンパク質）の濃度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、窒素源（ジャガイモタンパク質）の濃度変化に従って測定した。デキストリン（１５％）、ダイズ粉（３．０％）、ジャガイモタンパク質（１．０〜３．５％）およびＮａＣｌ（０．１２％）を含む発酵培地ならびに実施例４の方法を採用した。２．４％のジャガイモタンパク質を含む培地が至適であることが示されている。
【００４０】
表１２は、ジャガイモタンパク質の濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４１】
【表１２】
（実施例６） ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの濃度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの濃度変化に従って測定した。デキストリン（１５％）、ダイズ粉（３％）、ジャガイモタンパク質（２．４％）、およびＮａＣｌ（０．１２％）を含む発酵培地ならびに実施例５の同じ方法を採用した。４０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが至適であることが示された。
【００４２】
表１３は、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４３】
【表１３】
（実施例７） ピリドキシンの変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、ピリドキシンの濃度変化に従って測定した。実施例６の４０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを補充した同じ発酵培地および方法を採用した。５０ｍｇ／Ｌのピリドキシンが至適であることが示された。
【００４４】
表１４は、ピリドキシンの濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４５】
【表１４】
（実施例８） メラニン生合成インヒビターの添加によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、メラニンインヒビターの添加に従って測定した。実施例６の４０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび５０ｍｇ／Ｌのピリドキシンを補充した同じ発酵培地ならびに方法を採用した。メラニン生合成インヒビターを、アルブチン、ヒドロキノンおよびトリシクラゾールから選択した。５０ｍｇ／Ｌのメラニン生合成インヒビターの添加は、メラニン生合成インヒビターなしのコントロールの生成能力と比較して、よりよい生産能力を示す。
【００４６】
表１５は、メラニン生合成インヒビターの添加によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４７】
【表１５】
（実施例９） バンコマイシンの精製
濃度１４ｇ／Ｌのバンコマイシンを含む３００Ｌファーメンターから得た２００Ｌの発酵ブロスを、２００Ｌの蒸留水と混合し、２Ｎ塩酸を添加することによって、ｐＨを２〜３に調節した。４００Ｌの希釈発酵ブロスを、マイクロ濾過システム（ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて濾過した。濾液が得られたらすぐに、２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを７〜８に調節した。
【００４８】
濾液を、４０Ｌの疎水性吸収剤樹脂（ＨＰ２０、Ｄｉａｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）を含むカラムに通した。次いで、疎水性吸収剤樹脂に吸着したバンコマイシンを、４０Ｌ／時間の流速で、５〜１５％ エタノールで溶出した。最終的に、バンコマイシンを含む溶出液を、６０Ｌ／時間の流速で連続して２０Ｌの強カチオン交換樹脂（ＳＫ１Ｂ、Ｄｉａｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）および２０Ｌの弱アニオン交換樹脂（ＷＡ３０、Ｄｉａｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）に通過させる。そのカラムを、濾液を載せたときと同じ順番で、２００Ｌの蒸留水で洗浄した。バンコマイシンを含む画分をあわせ、均質化し、ナノ濾過システムを用いて１００ｇ／Ｌに濃縮した。
【００４９】
濃縮液（１４Ｌ）を、等容積のイソプロピルアルコールと混合し、次いで、２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを４〜５にあわせた。活性炭（８４０ｇ）をその混合物に添加し、１時間にわたってゆっくりと攪拌し、次いで、珪藻土フィルターのフィルターで濾過した。
【００５０】
その濾液を、酸性形態に調節した９Ｌの活性化アルミナ（Ｗａｋｏ、Ｊａｐａｎ）を詰めたカラムに９Ｌ／時間の流速で通過させた。濾液を載せ終わった後、５０％ イソプロピルアルコールを、同じ流速でカラムに流した。カラムの出口から出てきた溶液を分画し、ＨＰＬＣによって分析して、バンコマイシンの純度を調べた。バンコマイシンの少なくとも９３％のクロマトグラフィー純度を有する画分をあわせ、均質化し、ナノ濾過システムによって１５０ｇ／Ｌにまで濃縮した。
【００５１】
９３％のクロマトグラフィー純度を上回る少なくとも１５０ｇ／Ｌのバンコマイシンを含む濃縮液を、２Ｎ塩酸でｐＨ２〜３に調節し、次いで、その濃縮液の導電性を、医薬品等級の塩化アンモニウムの飽和水溶液を添加することによって１５〜２０ｍｓ／ｃｍに高めた。次に、その濃縮液を、０．２μｍポアを有するフィルターに通して、エンドトキシンを除去し、無菌性を確認し、次いで、２０〜３０℃で１２時間にわたって放置した。
【００５２】
次に、冷無水エタノールを、塩酸バンコマイシンが結晶化するまでその濾液に滴下し、そのスラリーを、１２時間にわたって冷蔵庫中に放置して結晶化を促進し、そしてそのスラリーを濾過した。その濾過した沈殿物を、４０℃において減圧乾燥機中で乾燥させた。その乾燥した塩酸バンコマイシンは、重量８４０ｇであり、白色で、少なくとも９５％のクロマトグラフィー純度および米国薬局方２８に基づく分析によって１０５０Ｕの抗微生物活性を有する、よく可溶性の（ｆｒｅｅｌｙ ｓｏｌｕｂｌｅ）粉末であった。分析結果を、図３および図４に図示する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従う方法を使用した、上記変異株の培養混合物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。６．４８９分における主要ピークは、バンコマイシンピークを示す。そのバンコマイシンピークの面積は、バンコマイシン含有量が、バンコマイシン培養混合物全体のうちの７６．４４７％であることを示す。
【図２】図２は、上記親株の培養混合物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。６．４６６分における主要ピークは、バンコマイシンピークを示す。そのバンコマイシンピークの面積は、バンコマイシン含有量が、バンコマイシン培養混合物全体のうちの５２．０８０％であることを示す。
【図３】図３は、本発明の実施例９における方法を使用して精製された塩酸バンコマイシンのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図４】図４は、米国薬局方において引用される標準バンコマイシン（カタログ番号ＵＳＰ １７０９００７）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）、この変異株を使用して塩酸バンコマイシンを産生するための発酵プロセスおよび精製プロセスに関する。より具体的には、本発明は、ｉ）炭素源としてのデキストリン、窒素源としてのダイズ粉末またはジャガイモタンパク質、および他のミネラルを含む培地において、発酵条件を制御することによってこの変異株を使用してバンコマイシンを高い収率および生産能力で調製するための発酵プロセス、およびｉｉ）カラムシステムと、塩酸バンコマイシンを結晶化するためのプロセスとから構成される、精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（先行技術の説明）
バンコマイシンは、微生物の細胞壁の合成を阻害する糖ペプチド抗生物質のうちの１つである。さらに、バンコマイシンは、グラム陽性細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（これらは、抗生物質のペニシリンおよびセファロスポリンに対して耐性であるグラム陽性細菌である））に対して強力な抑制効果を示す。また、バンコマイシンは、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）（これは、手術後の患者、老齢患者、および免疫が弱い患者にとっては致死性である）に由来する疾患に対して、高い処置効果を有することが公知である。米国特許第３，０６７，０９９号において、バンコマイシンを発酵および産生するためのプロセスが、開示されている。しかし、この特許化されたプロセスは、０．２ｍｇ／ｍＬという非常に低い株収率および生産能力を示した。さらに、その生産コストもまた、非常に高かった。
【０００３】
上記の問題を解決するために、高いバンコマイシン収率を有する多数の株が、単離および開発された。特許文献１において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ変異株（受託番号ＫＦＣＣ−１０７４５）が、高い株収率でバンコマイシンを産生すると開示されている。一方、特許文献２において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＦＣＣ−１０７４４）が、高い株収率でバンコマイシンを産生すると開示されている。さらに、特許文献１において、１．０〜２．０ ｗ／ｖ％のグルテンまたはダイズケーキを窒素源として含む培養培地を使用してバンコマイシンを高収率で産生するための発酵プロセスが、開示されている。
【０００４】
上記特許において開示されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ株は、バンコマイシンを産生することについて６．１ｍｇ／ｍＬという高い株収率を示したが、バンコマイシンを商業化するための多数のハンディキャップ（例えば、高い毒性および高い不純物含有量、ならびに高い生産コスト）が存在する。
【特許文献１】韓国特許公開公報第９３−１３０９０号
【特許文献２】韓国特許公開公報第９３−１３０９１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、不純物含有量が低く、かつバンコマイシン収率が高いＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ株、ならびにこの株を使用する塩酸バンコマイシン発酵プロセスおよび精製プロセスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は、非常に高いバンコマイシン生産能力および低い不純物含有量という特徴を有する新規なＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ変異株を単離した。本発明は、この単離された変異株を、炭素源としてのデキストリンと、窒素源としてのマメ粉末またはジャガイモタンパク質と、他の微量元素とを含む培地において使用して、その培地組成および発酵条件を調整することよってバンコマイシンを産生するための発酵プロセスを開発した。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の目的は、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を使用して塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスを提供することである。このプロセスは、
ｉ）選択培地においてＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用してＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を変異させて、上記株から、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する工程；
ｉｉ）上記単離されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）をシード培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）する工程；
ｉｉｉ）１２〜１８（ｗ／ｖ）％のデキストリン、２．２〜３．８（ｗ／ｖ）％のマメ粉末、１．９〜２．９（ｗ／ｖ）％のジャガイモタンパク質、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウムおよび少量のミネラルからなる発酵培地において、上記Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を培養させて発酵させる工程；
ｉｖ）培養ブロス中でマイクロフィルターを使用して、菌糸を除去することによって、バンコマイシンを濾過する工程；
ｖ）得られたバンコマイシンを、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂および吸収剤樹脂が詰まったカラムシステムを使用して精製する工程；ならびに
ｖｉ）上記精製された塩酸バンコマイシンを塩化アンモニウムおよびエタノールで結晶化する工程；
を包含する。
【０００９】
さらに、上記発酵培地は、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのカルシウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのピリドキシン、１〜１００ｍｇ／Ｌのメラニン生合成インヒビターをさらに含み、上記メラニン生合成インヒビターは、アルブチン、ヒドロキノンおよびトリシクラゾールから選択される。
【００１０】
さらに、上記カラムシステムを使用して精製する工程は、
ｉ）疎水性吸収剤樹脂が詰まった吸着カラムに上記ブロスを通す工程であって、バンコマイシンは上記カラム中に残り、不純物は通過し、バンコマイシンは５〜１５％のエタノールによって溶出される、工程；
ｉｉ）工程（ｉ）において得られた溶出物を、強酸カチオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は上記カラム中に残る、工程；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた溶液を、弱塩基アニオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は上記カラム中に残る、工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られた溶液を、活性炭で処理して着色料および不純物を除去する工程；
ｖ）上記脱色された溶液を、活性化アルミナ樹脂で処理し、バンコマイシンを３５〜６０％のイソプロパノールで溶出させる工程；および
ｖｉ）塩酸バンコマイシンを結晶化する工程；
を包含する。
【００１１】
（摘要）
本発明は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を使用して塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、
ｉ）選択培地においてＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用してＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を変異させて、上記株から、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する工程；
ｉｉ）上記単離されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）をシード培養する工程；
ｉｉｉ）１２〜１８（ｗ／ｖ）％のデキストリン、２．２〜３．８（ｗ／ｖ）％のマメ粉末、１．９〜２．９（ｗ／ｖ）％のジャガイモタンパク質、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウムおよび少量のミネラルからなる発酵培地において、上記Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を培養させて発酵させる工程；
ｉｖ）培養ブロス中でマイクロフィルターを使用して、菌糸を除去することによって、バンコマイシンを濾過する工程；
ｖ）得られたバンコマイシンを、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂および吸収剤樹脂が詰まったカラムシステムを使用して精製する工程；ならびに
ｖｉ）上記精製された塩酸バンコマイシンを塩化アンモニウムおよびエタノールで結晶化する工程；
を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
上記Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）は、以下の３工程のプロセスによって単離された。
【００１３】
変異株の単離の第１段階は、高いバンコマイシン耐性を有する株を選択することである。Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を、親株として使用する。この親株を、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用して変異した後、この変異させた株を、０．１〜５０ｇ／Ｌのバンコマイシンを含む選択培地中で２８〜３２℃にて４日間培養した。この選択培地において高い増殖を示す上記の変異させた株を選択して単離した。選択培地の他の組成が、表１に示される。
【００１４】
【表１】
変異株の単離の第２段階は、上記の第１段階において選択された変異株から、高いバンコマイシン生産能力を有する株を選択することである。上記の変異させた株を、バンコマイシンを含まない選択培地を含む寒天プレート表面上で４日間培養した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ−６６３３培養物を、その寒天プレート表面に重層し、その後、それを３０℃にて２４時間インキュベートした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して高い増殖抑制効果を示す変異させた株を、選択して単離した。培地の他の組成は、表１に示されるものと同じである。
【００１５】
変異株の単離の第３段階は、得られた変異株を、２５０〜２８０ ｎｍのＵＶで処理することである。その後、高いバンコマイシン生産能力および低い不純物含有量という特徴を有する変異株を、選択して最終株として単離した。
【００１６】
その単離したＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を、２００７年１月１２日付けで、ブダペスト条約の下で、受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐとして、コリアン カルチャー センター オブ マイクロオーガニズムズ（韓国微生物保存センター）（Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＫＣＣＭ）（住所：大韓民国，１２０−０９１ ソウル，ソデムン−ク，ホンジェ１−ドン，ユリムビルディング，３６１−２２１（３６１−２２１、Ｙｕｒｉｍ Ｂ／Ｄ Ｈｏｎｇｊｅ−１−ｄｏｎｇ、Ｓｅｏｄａｅｍｕｎ−ｇｕ、Ｓｅｏｕｌ １２０−０９１、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ））に寄託した。この変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）の主要な特徴は、高いバンコマイシン生産能力、バンコマイシン自体に対する高い耐性、および低い不純物含有量である。従って、この変異株の培養物は、高いバンコマイシン生産能力、バンコマイシン含有培地における良好な増殖、および低い不純物（特に、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいてバンコマイシンピークの直前に出現する不純物）生産能力を示す。
【００１７】
単離した変異株の培養・分析の方法が、以下に記載され得る。
【００１８】
上記変異株を、５０ｍｌエルレンマイアーフラスコ、ペトリ皿、または７Ｌジャーファーメンターを使用して、２３〜３７℃、ｐＨ５．５〜８．０および２００−７００ｒｐｍにて、上記培地において培養した。バンコマイシンの濃度は、米国薬局方２８に基づいてＨＰＬＣ分析によって決定した。微生物の増殖は、１０ｍＬの培養ブロスを４５０ｇにて１０分間遠心分離した後のＰＭＶ（充填菌糸体積（ｐａｃｋｅｄ ｍｙｃｅｌｉａ ｖｏｌｕｍｅ））によって測定した。溶存酸素濃度は、Ｉｎｇｏｌｄ Ｃｏ．（Ｓｗｉｓｓ）によって製造された電極（ポーラログラフィー型）を使用して測定した。
【００１９】
表２は、親株（ＡＴＣＣ−１９７９５）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＦＣＣ−１０９９０）およびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）の間のバンコマイシン耐性を示す。
【００２０】
【表２】
さらに、表３は、親株（ＡＴＣＣ−１９７９５）、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＦＣＣ−１０９９０）およびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）の間の形態学的特徴、生理学的特徴および生化学的特徴を示す。
【００２１】
【表３】
単離された変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）および親株は、３４℃、７００ｒｐｍで１２０時間にわたって、４Ｌの生産培地を含む７Ｌジャーファーメンター中で培養した。菌糸を除去した後、バンコマイシンの量、成長（ＰＭＶ）、バンコマイシンの純度，および不純物の含有量を、米国薬局方２８に基づいて、ＨＰＬＣ分析によって決定した。
【００２２】
表４は、生産培地の組成を示す。
【００２３】
【表４】
表５は、親株および本発明の変異株の培養混合物の成長（ＰＭＶ）、バンコマイシン生産能力、バンコマイシンの純度，および不純物含有量を示す。
【００２４】
【表５】
１：主要不純物は、ＨＰＬＣクロマトグラム上のバンコマイシンのピーク直前の保持時間５．９５分におけるピークを意味する。
【００２５】
表２および表３に示されるように、本発明の変異株は、バンコマイシン自体に対する耐性、至適培養温度および至適ｐＨに関して他の株の特徴とは異なる特徴を有する。
【００２６】
さらに、上記変異株は、表５、図１，および図２に示されるように、遙かに高い生産能力でバンコマイシンを生産し、かつ親株よりも遙かに低い主要不純物（５．９５分）を生産する。
【００２７】
本発明は、以下の実施例によって例示され得る。しかし、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されないものとする。
【実施例】
【００２８】
（実施例１） ７Ｌジャーファーメンターにおけるバンコマイシン生産
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）によるバンコマイシンの生産を、７Ｌジャーファーメンター中で測定した。
【００２９】
（シード培養）
単離された変異株を、５０ｍＬの第１シード培地を含む５００ｍＬのエルレンマイアーフラスコ中、３０℃および２５０ｒｐｍにおいて２４時間にわたって培養した。次いで、０．１ｍＬのシード培養物を、１００ｍＬの第２シード培地を含む５００ｍＬのエルレンマイアーフラスコに移し、３０℃および２５０ｒｐｍにおいて６０時間にわたってインキュベートした。
【００３０】
表６は、第１シード培養物の組成を示す。
【００３１】
【表６】
表７は、第２シード培地の組成を示す。
【００３２】
【表７】
（主要培養）
主要培養を、５〜２０％のデキストリンを含む４Ｌの生産培地（表４）を充填した７Ｌ−ジャーファーメンター中で行った。第２シード培養物（２００ｍｌ）を、７Ｌジャーファーメンターに移した。培養中の温度、曝気速度，およびｐＨを、それぞれ、３４℃、１ｖｖｍ、および７．５に維持した。溶存酸素濃度を、７００〜９００ｒｐｍの範囲で攪拌しながら２０％より高く維持した。バンコマイシン生産に対するデキストリンの初期濃度の効果を評価するために、種々の濃度のデキストリン（５〜２０％）を使用した。バンコマイシン生産は、１５％のデキストリン濃度において最高であった；従って、この値は、バンコマイシン生産のためのデキストリンの至適濃度を表す。
【００３３】
表８は、デキストリン濃度の変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３４】
【表８】
（実施例２） ｐＨの変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、ｐＨの変化に従って測定した。実施例１の１５％のデキストリンを含む同じ発酵培地および方法を採用した。ｐＨのみを、５．５〜８．０まで変化させた。表１０は、ｐＨの変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３５】
【表９】
（実施例３） 温度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、温度変化に従って測定した。実施例２の同じ発酵培地および方法を採用した。ｐＨを７．５に調節した。温度を、２３℃〜３７℃まで変化させた。
【００３６】
表１０は、温度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３７】
【表１０】
（実施例４） 窒素源（ダイズ粉）の濃度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、窒素源（ダイズ粉）の濃度変化に従って測定した。ダイズ粉および温度を除いて、実施例３の同じ発酵培地および方法を採用した。温度は、３２℃に調節し、ダイズ粉を１．０％〜３．５％まで変化させた。３％のダイズ粉を含む培地が至適であることが示されている。
【００３８】
表１１は、ダイズ粉の濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００３９】
【表１１】
（実施例５） 窒素源（ジャガイモタンパク質）の濃度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、窒素源（ジャガイモタンパク質）の濃度変化に従って測定した。デキストリン（１５％）、ダイズ粉（３．０％）、ジャガイモタンパク質（１．０〜３．５％）およびＮａＣｌ（０．１２％）を含む発酵培地ならびに実施例４の方法を採用した。２．４％のジャガイモタンパク質を含む培地が至適であることが示されている。
【００４０】
表１２は、ジャガイモタンパク質の濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４１】
【表１２】
（実施例６） ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの濃度変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの濃度変化に従って測定した。デキストリン（１５％）、ダイズ粉（３％）、ジャガイモタンパク質（２．４％）、およびＮａＣｌ（０．１２％）を含む発酵培地ならびに実施例５の同じ方法を採用した。４０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが至適であることが示された。
【００４２】
表１３は、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４３】
【表１３】
（実施例７） ピリドキシンの変化によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、ピリドキシンの濃度変化に従って測定した。実施例６の４０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを補充した同じ発酵培地および方法を採用した。５０ｍｇ／Ｌのピリドキシンが至適であることが示された。
【００４４】
表１４は、ピリドキシンの濃度変化によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４５】
【表１４】
（実施例８） メラニン生合成インヒビターの添加によるバンコマイシン生産
バンコマイシン生産を、メラニンインヒビターの添加に従って測定した。実施例６の４０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび５０ｍｇ／Ｌのピリドキシンを補充した同じ発酵培地ならびに方法を採用した。メラニン生合成インヒビターを、アルブチン、ヒドロキノンおよびトリシクラゾールから選択した。５０ｍｇ／Ｌのメラニン生合成インヒビターの添加は、メラニン生合成インヒビターなしのコントロールの生成能力と比較して、よりよい生産能力を示す。
【００４６】
表１５は、メラニン生合成インヒビターの添加によるバンコマイシンの生産能力を示す。
【００４７】
【表１５】
（実施例９） バンコマイシンの精製
濃度１４ｇ／Ｌのバンコマイシンを含む３００Ｌファーメンターから得た２００Ｌの発酵ブロスを、２００Ｌの蒸留水と混合し、２Ｎ塩酸を添加することによって、ｐＨを２〜３に調節した。４００Ｌの希釈発酵ブロスを、マイクロ濾過システム（ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて濾過した。濾液が得られたらすぐに、２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを７〜８に調節した。
【００４８】
濾液を、４０Ｌの疎水性吸収剤樹脂（ＨＰ２０、Ｄｉａｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）を含むカラムに通した。次いで、疎水性吸収剤樹脂に吸着したバンコマイシンを、４０Ｌ／時間の流速で、５〜１５％ エタノールで溶出した。最終的に、バンコマイシンを含む溶出液を、６０Ｌ／時間の流速で連続して２０Ｌの強カチオン交換樹脂（ＳＫ１Ｂ、Ｄｉａｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）および２０Ｌの弱アニオン交換樹脂（ＷＡ３０、Ｄｉａｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）に通過させる。そのカラムを、濾液を載せたときと同じ順番で、２００Ｌの蒸留水で洗浄した。バンコマイシンを含む画分をあわせ、均質化し、ナノ濾過システムを用いて１００ｇ／Ｌに濃縮した。
【００４９】
濃縮液（１４Ｌ）を、等容積のイソプロピルアルコールと混合し、次いで、２Ｎ水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨを４〜５にあわせた。活性炭（８４０ｇ）をその混合物に添加し、１時間にわたってゆっくりと攪拌し、次いで、珪藻土フィルターのフィルターで濾過した。
【００５０】
その濾液を、酸性形態に調節した９Ｌの活性化アルミナ（Ｗａｋｏ、Ｊａｐａｎ）を詰めたカラムに９Ｌ／時間の流速で通過させた。濾液を載せ終わった後、５０％ イソプロピルアルコールを、同じ流速でカラムに流した。カラムの出口から出てきた溶液を分画し、ＨＰＬＣによって分析して、バンコマイシンの純度を調べた。バンコマイシンの少なくとも９３％のクロマトグラフィー純度を有する画分をあわせ、均質化し、ナノ濾過システムによって１５０ｇ／Ｌにまで濃縮した。
【００５１】
９３％のクロマトグラフィー純度を上回る少なくとも１５０ｇ／Ｌのバンコマイシンを含む濃縮液を、２Ｎ塩酸でｐＨ２〜３に調節し、次いで、その濃縮液の導電性を、医薬品等級の塩化アンモニウムの飽和水溶液を添加することによって１５〜２０ｍｓ／ｃｍに高めた。次に、その濃縮液を、０．２μｍポアを有するフィルターに通して、エンドトキシンを除去し、無菌性を確認し、次いで、２０〜３０℃で１２時間にわたって放置した。
【００５２】
次に、冷無水エタノールを、塩酸バンコマイシンが結晶化するまでその濾液に滴下し、そのスラリーを、１２時間にわたって冷蔵庫中に放置して結晶化を促進し、そしてそのスラリーを濾過した。その濾過した沈殿物を、４０℃において減圧乾燥機中で乾燥させた。その乾燥した塩酸バンコマイシンは、重量８４０ｇであり、白色で、少なくとも９５％のクロマトグラフィー純度および米国薬局方２８に基づく分析によって１０５０Ｕの抗微生物活性を有する、よく可溶性の（ｆｒｅｅｌｙ ｓｏｌｕｂｌｅ）粉末であった。分析結果を、図３および図４に図示する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従う方法を使用した、上記変異株の培養混合物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。６．４８９分における主要ピークは、バンコマイシンピークを示す。そのバンコマイシンピークの面積は、バンコマイシン含有量が、バンコマイシン培養混合物全体のうちの７６．４４７％であることを示す。
【図２】図２は、上記親株の培養混合物のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。６．４６６分における主要ピークは、バンコマイシンピークを示す。そのバンコマイシンピークの面積は、バンコマイシン含有量が、バンコマイシン培養混合物全体のうちの５２．０８０％であることを示す。
【図３】図３は、本発明の実施例９における方法を使用して精製された塩酸バンコマイシンのＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図４】図４は、米国薬局方において引用される標準バンコマイシン（カタログ番号ＵＳＰ １７０９００７）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）。
【請求項２】
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を使用して塩酸バンコマイシンを産生するためのプロセスであって、
ｉ）選択培地においてＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用してＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を変異させて、該株から、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する工程；
ｉｉ）該単離されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）をシード培養する工程；
ｉｉｉ）１２〜１８（ｗ／ｖ）％のデキストリン、２．２〜３．８（ｗ／ｖ）％のマメ粉末、１．９〜２．９（ｗ／ｖ）％のジャガイモタンパク質、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウムおよび少量のミネラルからなる発酵培地において、該Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を培養させて発酵させる工程；
ｉｖ）培養ブロス中でマイクロフィルターを使用して、菌糸を除去することによって、バンコマイシンを濾過する工程；
ｖ）得られたバンコマイシンを、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂および吸収剤樹脂が詰まったカラムシステムを使用して精製する工程；ならびに
ｖｉ）該精製された塩酸バンコマイシンを塩化アンモニウムおよびエタノールで結晶化する工程；
を包含する、プロセス。
【請求項３】
請求項２に記載の塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスであって、前記発酵培地は、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのカルシウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのピリドキシン、１〜１００ｍｇ／Ｌのメラニン生合成インヒビターをさらに含み、該メラニン生合成インヒビターは、アルブチン、ヒドロキノンおよびトリシクラゾールから選択される、プロセス。
【請求項４】
請求項２に記載の塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスであって、前記カラムシステムを使用して精製する工程は、
ｉ）疎水性吸収剤樹脂が詰まった吸着カラムに前記ブロスを通す工程であって、バンコマイシンは前記カラム中に残り、不純物は通過し、バンコマイシンは５〜１５％のエタノールによって溶出される、工程；
ｉｉ）工程（ｉ）において得られた溶出物を、強酸カチオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は該カラム中に残る、工程；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた溶液を、弱塩基アニオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は該カラム中に残る、工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られた溶液を、活性炭で処理して着色料および不純物を除去する工程；
ｖ）該脱色された溶液を、活性化アルミナ樹脂で処理し、バンコマイシンを３５〜６０％のイソプロパノールで溶出させる工程；および
ｖｉ）塩酸バンコマイシンを結晶化する工程；
を包含する、プロセス。
【請求項１】
バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）。
【請求項２】
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を使用して塩酸バンコマイシンを産生するためのプロセスであって、
ｉ）選択培地においてＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用してＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの親株（受託番号ＡＴＣＣ−１９７９５）を変異させて、該株から、バンコマイシンを産生するためのＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）を単離する工程；
ｉｉ）該単離されたＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株（受託番号ＫＣＣＭ−１０８３６Ｐ）をシード培養する工程；
ｉｉｉ）１２〜１８（ｗ／ｖ）％のデキストリン、２．２〜３．８（ｗ／ｖ）％のマメ粉末、１．９〜２．９（ｗ／ｖ）％のジャガイモタンパク質、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウムおよび少量のミネラルからなる発酵培地において、該Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ変異株を培養させて発酵させる工程；
ｉｖ）培養ブロス中でマイクロフィルターを使用して、菌糸を除去することによって、バンコマイシンを濾過する工程；
ｖ）得られたバンコマイシンを、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂および吸収剤樹脂が詰まったカラムシステムを使用して精製する工程；ならびに
ｖｉ）該精製された塩酸バンコマイシンを塩化アンモニウムおよびエタノールで結晶化する工程；
を包含する、プロセス。
【請求項３】
請求項２に記載の塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスであって、前記発酵培地は、０．１０〜０．１４（ｗ／ｖ）％の塩化ナトリウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのカルシウム、１〜１００ｍｇ／Ｌのピリドキシン、１〜１００ｍｇ／Ｌのメラニン生合成インヒビターをさらに含み、該メラニン生合成インヒビターは、アルブチン、ヒドロキノンおよびトリシクラゾールから選択される、プロセス。
【請求項４】
請求項２に記載の塩酸バンコマイシンを調製するためのプロセスであって、前記カラムシステムを使用して精製する工程は、
ｉ）疎水性吸収剤樹脂が詰まった吸着カラムに前記ブロスを通す工程であって、バンコマイシンは前記カラム中に残り、不純物は通過し、バンコマイシンは５〜１５％のエタノールによって溶出される、工程；
ｉｉ）工程（ｉ）において得られた溶出物を、強酸カチオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は該カラム中に残る、工程；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた溶液を、弱塩基アニオン交換樹脂が詰まったカラムに通す工程であって、バンコマイシンを含む溶液は通過し、不純物は該カラム中に残る、工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において得られた溶液を、活性炭で処理して着色料および不純物を除去する工程；
ｖ）該脱色された溶液を、活性化アルミナ樹脂で処理し、バンコマイシンを３５〜６０％のイソプロパノールで溶出させる工程；および
ｖｉ）塩酸バンコマイシンを結晶化する工程；
を包含する、プロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１９４０２７（Ｐ２００８−１９４０２７Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１６４４９（Ｐ２００７−２１６４４９）
【出願日】平成１９年８月２２日（２００７．８．２２）
【出願人】（５０７２８３２２９）バイオエヌジーン カンパニー， リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２２日（２００７．８．２２）
【出願人】（５０７２８３２２９）バイオエヌジーン カンパニー， リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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