ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）をベースとする眼科用製剤およびそれらの使用
本発明は、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）をベースとする点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。前記製剤は、視覚能力の低下を予防するためおよび正常な視覚機能を回復させるために、無傷の眼表面に局所的に投与でき、網膜、視神経、外側膝状体および視覚皮質の神経変性障害の予防および治療において有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と粘度調整剤、好ましくは、ＴＳ−多糖類またはＴＳＰとしても知られている、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカンとを含有する、点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。
【０００２】
前記製剤は、神経変性網膜障害、特に、網膜色素変性症、緑内障(先天性緑内障、小児緑内障、若年緑内障、成人緑内障、原発性開放隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、続発性緑内障、医原性緑内障および急性緑内障を含む)、加齢黄斑変性症などの加齢に関連した網膜症、血管性および増殖性の網膜障害、網膜剥離、未熟児網膜症(ＲＯＰ)および糖尿病網膜症の予防および治療において有用である。これらの障害はすべて失明につながる。
【背景技術】
【０００３】
従来技術
ニューロトロフィンは、神経細胞によって合成されるタンパク質であり、神経系に存在する多様な細胞の生存および正常な栄養を調節する。
【０００４】
最もよく知られているのは、２０世紀中頃にR. Levi-MontalciniおよびS. Cohenによって発見された、神経成長因子(ＮＧＦ)である。
【０００５】
タンパク質構造がＮＧＦのものと構造的類似性を示す他の因子が、その後発見された。したがって、本発明者らは、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５およびＮＴ−６ならびにＮＧＦが属する種類のＮＧＦ因子(ニューロトロフィン)についてこれから検討する(最初の３つは、哺乳類の神経系において主に発現されるのに対して、ＮＴ−６は、硬骨魚において同定された、哺乳類の脳内にはない新種のニューロトロフィンである)。
【０００６】
ニューロトロフィンを含む神経栄養因子は、それらを合成する神経細胞によって放出され、膜上の特異受容体に結合する。
【０００７】
これらの多様なニューロトロフィンは、構造的に類似しているにもかかわらず、異なる受容体を通して、結果として異なる作用機序を通して作用する。
【０００８】
神経栄養因子の、その特異受容体（ＮＧＦに対するＴｒｋＡ；ＢＤＮＦおよび部分的にはＮＴ−４に対するＴｒｋＢ；ＮＴ−３に対するＴｒｋＣ）に対する結合により、事象が次々起こり、神経細胞による特異応答が誘発される。
【０００９】
異なるニューロトロフィン受容体は、異なる領域でおよび異なる細胞中の同一領域内で発現され、特定の細胞内シグナル伝達経路を活性化する。したがって、論理的には、必ずしもすべての領域または神経細胞が４つのニューロトロフィンのそれぞれに応答できるわけではないことになる。その限定要因は、所与のニューロトロフィンの特異受容体の細胞分布である。
【００１０】
ニューロトロフィンの原型であるＮＧＦを合成および放出できる網膜細胞の分布、ならびにＮＧＦ受容体(ＴｒｋＡ)を発現する網膜細胞の分布は、きわめて限定されていると思われ、実際に、神経節細胞および星状膠細胞のサブグループに限定されている（Ｇａｒｃｉａら、２００３)。
【００１１】
ＥＰ１１６１２５６Ｂ１には、強膜、毛様体、水晶体、網膜、視神経、硝子体液および／または脈絡膜に影響を及ぼす障害の治療および／または予防を目的として無傷の眼表面に投与するための、２００から５００μｇ／ｍｌのＮＧＦを含有する眼科用製剤が記載されている。
【００１２】
Ｌａｍｂｉａｓｅらによって報告されているように、これらの製剤は、ＮＧＦの網膜内レベルを上昇させるが、ＮＧＦが網膜に対する神経保護効果を果たせないことは実証できる。
【００１３】
これは、Ｓｈｉら（２００７）によって近年報告された知見と一致する。ＮＧＦは、網膜内の２つの型の受容体、ＴｒｋＡおよびＰ７５に結合できる。ＴｒｋＡおよびＰ７５は、神経細胞の栄養および生存に対して逆の効果を及ぼす。したがって、外因性ＮＧＦは網膜に到達すると、網膜細胞に対して２つの対立した効果を誘発し、それらの効果は互いに相殺する傾向がある。
【００１４】
そうでない場合には、ＢＤＮＦは、その受容体ＴｒｋＢと共に、哺乳類の網膜内で大量に発現される。網膜は、層状に配置された多数の型の細胞からなる。特に、ＢＤＮＦは、網膜の内層に存在する、ドーパミン作動性細胞などのいくつかの神経節細胞およびアマクリン細胞によって合成される（Ｈｅｒｚｏｇら、１９９４;ＰｅｒｅｚおよびＣａｍｉｎｏｓ、１９９５；Ｈａｌｌｂｏｏｋら、１９９６；Ｈｅｒｚｏｇおよびｖｏｎ Ｂａｒｔｈｅｌｄ、１９９８；ＫａｒｌｓｓｏｎおよびＨａｌｌｂｏｏｋ、１９９８；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９９；ＰｏｌｌｏｃｋおよびＦｒｏｓｔ、２００３；Ｓｅｋｉら、２００３；ＣｈｙｔｒｏｖａおよびＪｏｈｎｓｏｎ、２００４）。
【００１５】
ＢＤＮＦ受容体は、ＴｒｋＢと呼ばれ、神経節細胞、アマクリン細胞およびミュラーグリア細胞を含む多数の型の網膜細胞において発現される（Ｊｅｌｓｍａら、１９９３;ＣｅｌｌｅｒｉｎｏおよびＫｏｈｌｅｒ、１９９７;Ｄｉ ポーロら、２０００）。
【００１６】
ＷＯ９７/４５１３５(特許文献１)は、水溶液または凍結乾燥物(Lyophilisate)の形態のＢＤＮＦの安定な医薬組成物に関する。その文献において、特に、従来技術に関する節において、ＢＤＮＦは、網膜色素変性症を含む多様な障害の治療において有用なものとしてあげられている。特に挙げられている唯一の投与形態は、注射用製剤である。
【００１７】
ＪＰ２００３０４８８５１は、結膜上に点眼剤の形態で投与するための、ＢＤＮＦをベースとする眼科用製剤に関する。開示されている製剤は、多様な粘度調整剤を含有し、ＢＤＮＦを網膜に運搬するのに同様に有効であると記載されている。
【００１８】
前記文献において報告されている活性の証拠は疑わしい。なぜならば、ＢＤＮＦについて示されている濃度範囲はきわめて広く、１×１０−２μｇ／μｌと１０μｇ／μｌとの間の濃度範囲に相当する、０．００１〜１重量／体積％であるが［請求項３、特許の範囲；該発明の詳細な説明の［０００６]、段落３による］、報告されている例では、使用されている濃度は４×１０−２μｇ／μｌに相当する０．００４％（重量／体積％）であり、すなわち、ＢＤＮＦの網膜内レベルを高めかつ光に対する長期曝露によって誘発される網膜の変化を予防できる有効濃度、１５μｇ／μｌ以上（本発明と一致する１５〜２００μｇ／μｌの範囲内である）よりもかなり低いからである。ＪＰ２００３０４８８５１においては、適用が、１日３回（１０μｌ／適用、０．００４％重量／体積）５日間繰り返され、１．２μｇ／日の用量および６μｇの総用量に相当したことに留意するべきである。日用量および総用量を考慮に入れたとしても、それらは、神経保護効果を発揮するには低すぎる。実際には、光損傷を受けた網膜において神経保護効果を得るためには、本発明と一致して、１５０μｇの最小総用量を局所的に投与しなければならない。もう１つの実験モデル、すなわち、緑内障を発症するマウスで得られた新しいデータにより、使用された３つのＢＤＮＦ濃度（１、５および１５μｇ／μｌ）のうちで最高濃度のもの（１５μｇ／μｌ）のみが有効であることが確認されている。
【００１９】
さらに、ＪＰ２００３０４８８５１は、網膜の厚さを測定するように設計された組織学的技術（ヘマトキシリン−エオシンによる網膜切片の染色）によって検証された網膜保護効果に言及しているが、本発明において報告しているような、フラッシュ網膜電図記録によって測定される網膜機能の回復の実証は伴っていない。あらゆる治療の神経保護効力を網膜レベルで実証するためには、組織学的／形態学的技術で得られる結果のみでは不十分であることはよく知られており、網膜機能の回復の証拠も必要とされる。したがって、ＪＰ２００３０４８８５１において、例中で報告されている濃度、およびより一般的には好ましい範囲の濃度の、外部から投与されたＢＤＮＦの眼科用組成物は、網膜機能を回復させることができる神経保護効果を発揮するのに十分な量で、眼表面から内部組織に移行できないと結論づけることができる。
【００２０】
ＷＯ２００６/０４６５８４（特許文献２）は、網膜色素変性症などの視覚細胞の病変を伴う障害の治療に有用な、架橋ゼラチンヒドロゲルを含浸させたＨＧＦ、ＢＤＮＦまたはＰＥＤＦを含有する徐放性組成物に関する。特定の例において、これらの組成物は、０．００１〜１０００μｇの間のＢＤＮＦの用量を含有するマイクロスフェアの形態を取り、眼内注射または網膜下インプラントによって投与できる。
【００２１】
ＥＰ０９５８８３１には、ＢＤＮＦを含む因子の群から選択される神経栄養因子を含有する眼科用組成物が記載されている。前記組成物は、例えば眼軟膏剤もしくは点眼液剤の形態で、外部から適用でき、またはコンタクトレンズとして配合することもできる。
【００２２】
ＥＰ０９５８８３１に開示されている神経栄養因子の濃度は、０．０００１から０．５％（重量／体積）まで、すなわち、１×１０−３から５μｇ／ｌまでの範囲である。したがって、報告されている濃度範囲は、きわめて広範囲にわたる。ＥＰ０９５８８３１は、この濃度範囲において同様に有効であろう、ＢＤＮＦを含む多様な神経栄養因子に関するものなので、一般性が高い。神経栄養因子は、異なる脳領域および個々の神経細胞においてそれらの生物学的効果を決定する受容体の密度および分布が異なるために、同一の濃度範囲であっても等しく有効ではないことが知られている。
【００２３】
さらに、ＥＰ９５８８３１は、局所使用のための有効なＢＤＮＦ濃度の範囲に関してきわめて曖昧で、不明確である。3頁44行目（段落００２２および００３３、請求項１９および２０を参照されたい）において２つの濃度範囲が示されており、これらは一致しておらず（範囲Ａ最大、０．０００１と０．５％（Ｗ／Ｖ）との間（１０−３と５μｇ／μｌの間の濃度範囲に等しい）、および範囲Ｂ、１０−３と２×１０５μｇ／ｌとの間）、これらの２つの濃度範囲は明らかに一致していない。しかし、本発明によれば、ＢＤＮＦの有効濃度は、１５μｇ／μｌ以上（範囲１５〜２００μｇ／μｌ）、すなわち、ＥＰ９５８８３１において報告されている範囲Ａ、すなわち、最大濃度範囲よりも高い。ＥＰ９５８８３１中の例は、０．０２、０．０４および１０μｇ／ｌのＢＤＮＦ濃度を特徴とする眼科用組成物に関する。この濃度は、本発明により、網膜内のＢＤＮＦレベルの上昇ならびに光損傷および緑内障損傷の双方の予防に有効であると判明した最も低い濃度、すなわち、１５μｇ／μｌよりもはるかに低い（１×１０６倍低い）。
【００２４】
したがって、外部から投与される、ＥＰ９５８８３１において報告されている濃度のＢＤＮＦの眼科用組成物は、ＢＤＮＦの網膜内レベルを上昇させかつ結果として治療効果を果たすのに十分な量では、眼表面から内部組織に移行できないと結論づけることができる。
【００２５】
ＮＴ−４は、ＴｒｋＢに結合する他のニューロトロフィンであり、網膜内で低いレベルで発現され、アマクリン細胞のサブグループ、すなわち、ドーパミンを合成するもののみに作用する（Ｃａｌａｍｕｓａら、２００７）。
【００２６】
ＢＤＮＦまたはその受容体の欠如は、網膜機能における重篤な変化を引き起こす。例えば、ＴｒｋＢ受容体を欠いているマウス（ノックアウトマウス）は、光に対する網膜応答の完全な消失（フラッシュ網膜電図におけるｂ波の完全な欠如）を特徴とする（Ｒｏｈｒｅｒら、１９９９）。
【００２７】
ＬａＶａｉｌのグループは、ＢＤＮＦの眼内注射により、光損傷によって誘発される光受容体の形態学的変性が効果的に予防されるが、ＮＧＦの眼内注射では効果的に予防されないことを実証している。
【００２８】
ＢＤＮＦの眼内注射は他の神経栄養因子との併用で、視神経の病変に起因する網膜神経節細胞の損傷を低減させたが、ＢＤＮＦが単独で、すなわち、他の神経栄養因子とは独立に、神経保護効果を果たせるかどうかはまだ明らかではない（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００３;Ｙａｔａら、２００７）。
【００２９】
ＦＧＦ２のような他の神経栄養因子は、光損傷によって引き起こされる形態学的変化を予防するのに同様に有効であることが判明しているが、ＢＤＮＦとは異なり、それらの投与は、炎症反応に関連する因子を活性化するという望ましくない効果を有する（ＬａＶａｉｌら、１９８７）。
【００３０】
もう１つの神経栄養因子、ＣＮＴＦも、光損傷に起因する形態学的変性を予防する（ＬａＶａｉｌら、１９７８）。残念ながら、近年の実験により、ＣＮＴＦをベースとする治療は、光に対する網膜応答を変化させ、したがって、その可能な治療的使用に一連の制約を課していることが実証されている（ＭｃＧｉｌｌら、２００７）。
【００３１】
これらの結果は、網膜障害モデルにおける神経保護の目的では、神経活性分子の形態学的効果を評価するだけでは不十分であり、とりわけ、それらの分子が網膜機能に対する保護効果を発揮するかどうかを評価し、それらが視覚刺激に対する網膜細胞の応答を確実に損なわないようにするのが不可欠であることを示している。例えば眼球の穿孔、感染または出血を引き起こすリスクのために長期の慢性治療には適さない、眼内、網膜下または眼球後注射などのきわめて侵襲的な投与方法を避けて、網膜にＢＤＮＦを運搬するための非侵襲的な方法によって投与することができる新しいＢＤＮＦ製剤を見つけることが現在必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】国際公開第９７／４５１３５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０４６５８４号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本特許は、１５と２００μｇ／μｌとの間の濃度範囲でＢＤＮＦを含有する多様な製剤での局所結膜適用を提案する。総ＢＤＮＦ用量は、治療する眼の大きさに応じて、投与あたり５０と４０００μｇとの間であり、ヒトを含む、関与する動物種によって異なるであろう。
【００３４】
この製剤は、粘度調整剤を含有することが好ましいであろう。前記粘度調整剤は好ましくは、５０００００と８０００００Ｄａとの間の分子量および以下の構造式を有する、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカン（ＴＳ−多糖類またはＴＳＰ）である：
【００３５】
【化１】
【００３６】
本発明者らは、前記製剤が、投与あたりの指示濃度および用量で、網膜内ＢＤＮＦレベルを有意に上昇させて、ｉ）光に対する長期曝露によって誘発される網膜の変化およびｉｉ）緑内障における網膜の変化を予防することを実証する。
【００３７】
ＴＳＰは眼表面の局所治療用の薬理学的活性分子を運搬することができることが以前に実証されている（Ｕｃｃｅｌｌｏ−Ｂａｒｒｅｔｔａ Ｇら、２００８；Ｇｈｅｌａｒｄｉ Ｅら、２００４；Ｂｕｒｇａｌａｓｓｉ Ｓら、２０００；Ｇｈｅｌａｒｄｉ Ｅら２０００）。眼表面での製剤の保持時間を長くすることによって、活性分子の吸収の増加することが観察されている。ＴＳＰのこの特性は、すべて小分子である、抗生物質(ルフロキサシン、ゲンタマイシンおよびオフロキサシン)、抗ヒスタミン薬(ケトチフェン)および抗高血圧薬(チモロール)との併用で記載されている。
【００３８】
ＢＤＮＦのような組換えタンパク質を含有する薬理学的製剤の場合には、その活性成分は、タンパク質、すなわち、翻訳後修飾と、それが活性な３次元構造に至るまでのその空間的屈曲の調節とを受ける高分子量を有する分子である。タンパク質の生物活性は、それらの３次元構造に密接に依存する。これは、特異受容体とそれらを認識する酵素との相互作用、および結果として、標的細胞の生化学的過程に介入する能力が、それらの３次元構造に依存しているからである。このタンパク質の立体構造は、組換えタンパク質の存在環境によってかなり改変されることがある。したがって、組換えタンパク質を含有する製剤は、該タンパク質をその活性な立体構造で溶液中に確実に維持し、その安定性を保証しなければならない。
【００３９】
本発明は、ＴＳＰが、製剤中のＢＤＮＦの安定性を保証し、表面での製剤の長い滞留時間によってその眼内吸収を増加させ、とりわけ、ＢＤＮＦをその生物学的に活性な立体構造に維持することを実証する。
【００４０】
本発明の概要
少なくとも１５μｇ／μｌの濃度のＢＤＮＦを含有する眼科用製剤は、光に対する長期曝露によって誘発される網膜の変化、および緑内障モデルにおける眼圧上昇と関連する網膜の変化を予防することを今回発見した。
【００４１】
したがって、本発明は、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)を含有する点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。その好ましい態様によれば、本発明が関係する組成物は、ＴＳＰとして知られる、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカンを含有する。
【００４２】
本発明はまた、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害の予防および／または治療するための点眼剤の形態の薬剤の調製にＢＤＮＦを使用することに関する。
【００４３】
本発明はさらに、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害の予防および／または治療に使用するための、ＢＤＮＦを含有する点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】生理食塩水溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）におけるＢＤＮＦレベルの測定。ＢＤＮＦレベルをｙ軸に示す。ＢＤＮＦレベルは、ＢＤＮＦで処置した眼および生理食塩水溶液で処置した対照眼において測定した。＊はこれらの差の有意性を示している。
【図２】カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）におけるＢＤＮＦレベルの測定。表記法および記号については、図１を参照されたい。
【図３】ＴＳＰを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）におけるＢＤＮＦレベルの測定。表記法および記号については、図１を参照されたい。
【図４】ＢＤＮＦの保有およびその網膜内濃度（ｐｇ／タンパク質のｍｇ、ｘ軸を参照されたい）の増加における、ＴＳＰ、生理食塩水溶液（ＮａＣｌ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ナトリウムの効力の比較。ＴＳＰ中（＊）のＢＤＮＦを用いた局所処置後のＢＤＮＦの網膜内レベルは、生理食塩水溶液中およびカルボキシメチルセルロースナトリウム中のＢＤＮＦを用いた局所処置後のＢＤＮＦレベルと比較して、有意に増加した。このデータは、図１、２および３中のパネルＡから得たものである。
【図５】ＴＳＰを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜、視神経および硝子体液におけるＢＤＮＦレベルの動態。ＢＤＮＦレベルは、処置後の最初の６時間（＊）では有意に高く維持されている。
【図６】ＴＳＰ中のＢＤＮＦの局所適用は、光損傷によって誘発される、網膜フラッシュ応答（フラッシュＥＲＧ）の変化を低減させる。異なる輝度（ｃｄ／ｍ２、ｘ軸を参照されたい）のフラッシュによって誘発され、ＢＤＮＦで処置した眼（黒色記号）またはＴＳＰのみで処置した対照眼（光損傷を受けた対照、白色記号）によって記録される、網膜電図のｂ波の振幅（μＶ、ｙ軸を参照されたい）を測定した。＊はこれらの差異が有意であることを示している。
【図７】ＴＳＰ中のＢＤＮＦでの局所処置は、光損傷後に残存する光受容体の数を増加させる。光受容体は、網膜断面においてヨウ化プロピジウムで標識する。使用する方法（光受容細胞体の列数の計測（図７Ｂ）または外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さの測定（図７Ｃ））にかかわらず、中心部および周辺部の網膜に存在する光受容体は、ＢＤＮＦで処置した眼において、担体で処置した眼（対照）よりも有意に（＊）多い。
【図８】生理食塩水溶液（ＮａＣｌ）中のＢＤＮＦの局所適用は、光損傷によって誘発される、光に対する網膜応答における障害を低減する。表記法および記号の説明については、図６を参照されたい。
【図９】生理食塩水溶液中のＢＤＮＦでの局所処置は、光損傷後の光受容体の残存を増加させる。表記法および記号については、図７を参照されたい。
【図１０】カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用、および光損傷によって誘発される光応答の低下。表記法および記号については、図６を参照されたい。
【図１１】ＢＤＮＦで処置した眼および担体で処置した眼（対照）に対する光損傷後の光受容体残存に対する、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦでの局所処置の効果。表記法および記号については、図７を参照されたい。
【図１２】試験的マウス緑内障モデル、ＤＢＡ／２Ｊマウス対正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ）、における眼圧（ＩＯＰ、ｍｍＨｇ）の上昇。ＤＢＡ／２ＪにおけるＩＯＰの上昇は、月齢６．５カ月から有意（＊）である。
【図１３】正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ、暗色の棒）および緑内障発症マウス（ＤＢＡ／２Ｊ）において、視覚的パターン（パターンＥＲＧ、Ｐ−ＥＲＧ；空間周波数＝０．２Ｃ／ｄｅｇ、コントラスト９０％からなる刺激）に対する網膜の応答を記録した。異なる濃度（１、５および１５μｇ／μｌ）のＢＤＮＦで２週間処置した眼を刺激することによって、および、対照眼（ＣＴＲＬ）とみなす、担体で処置した眼を刺激することによって、Ｐ−ＥＲＧの応答の振幅（μＶ、ｙ軸を参照されたい）を測定した。＊はこれらの差の有意性を示している。Ｐ−ＥＲＧは、ＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて月齢７カ月で、すなわち、眼圧（ＩＯＰ）の上昇後に記録した。
【図１４】転写因子（Ｂｒｎ３ｂ）に結合する蛍光抗体で標識した、緑内障発症ＤＢＡ／２Ｊマウス（月齢７カ月）の網膜神経節細胞（全載標本）。Ａ．左手のカラムは、中心部網膜（上段）および周辺部網膜（下段）における、ＴＳＰ中のＢＤＮＦでの２週間の局所処置の効果を示している。ＢＤＮＦでの処置後（左手のカラム）、標識細胞は、担体のみで処置した対照眼（ＣＴＲＬ）の網膜（右手のカラム）よりも多かった。Ｂ．緑内障発症マウス（ＤＢＡ／２Ｊ；ＢＤＮＦで処置した眼；担体で処置した眼、ＣＴＲＬ）および正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ）における、Ｂｒｎ３ｂで標識した神経節細胞（細胞個数／ｍｍ２で測定した密度、ｙ軸上に示す）に対する、ＢＤＮＦでの局所処置の効果の定量。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明の詳細な説明
驚くべきことに、無傷の眼表面に、特に、結膜嚢内に、局所的に適用される、外因性の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を投与することにより、ＢＤＮＦは、機能的レベルおよび形態学的レベルの双方で網膜細胞に対する神経保護効果を果たし、したがって、神経変性網膜障害の予防および／または治療を可能にすることが判明した。
【００４６】
ＢＤＮＦは、光受容体に対してだけでなく、神経節細胞、すなわち、（ｉ）視覚中枢に線維を送っている網膜の最内層の細胞、（ｉｉ）視神経線維の細胞、および（ｉｉｉ）例えば外側膝状体などの、網膜外の視覚中枢の細胞に対しても、神経保護効力が実証されている。
【００４７】
本発明は、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）を含有する眼科用製剤に関する。
【００４８】
前記眼科用製剤が含有するＢＤＮＦの濃度は、下限値の１５μｇ／μｌと２００μｇ／μｌとの間、好ましくは２０と１００μｇ／μｌとの間、さらに好ましくは３０と５０μｇ／μｌとの間の範囲であることができる。生物利用可能な総用量は、投与する眼科用製剤の体積および、ヒトを含む、治療する眼を所有している種に応じて、１投与あたり５０と４０００μｇとの間であることができる。
【００４９】
ＢＤＮＦは、単独でまたは、β−遮断薬、プロスタグランジンおよび炭酸脱水酵素阻害薬などの他の活性成分と組み合わせて投与することができる。
【００５０】
製剤は、点眼剤の形態で作製し、活性成分と相溶性でありかつ眼に許容される、薬学的に許容される担体中に、活性成分ＢＤＮＦ、または複数の活性成分を含む液剤、懸濁剤、ゲル剤または眼科用軟膏剤であってよい。
【００５１】
薬学的に許容される担体は、好ましくは０．９％の塩化ナトリウムを含有する、生理食塩水溶液であってよい。
【００５２】
少なくとも１種の薬学的に許容される担体、好ましくは、より急速に結膜から洗い流される生理食塩水溶液中での投与よりも、粘度により眼表面でのＢＤＮＦ滞留時間を長くできるようにする、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカン（ＴＳＰ）を製剤中に使用する場合には、改良ＢＤＮＦの吸収レベルを増大できることも判明した。
【００５３】
ＴＳＰ濃度は、好ましくは０．０５から２％(重量／体積−ｗ／ｖ)まで、さらにより好ましくは０．２５から０．５％(ｗ／ｖ)まで変化できる。
【００５４】
ＴＰＳは、透明で、粘弾性で、無菌であり、角膜保護に使用される。ＴＳＰはさらに、眼表面に持続性の薄膜を形成し、これが角膜および結膜を潤滑および湿潤させる。
【００５５】
さらなる好ましい一態様によると、粘性化された(Viscosified)溶液は、ヒアルロン酸、さらに好ましくは、ＴＳＰと組み合わされたヒアルロン酸を含有する。
【００５６】
ヒアルロン酸濃度は、好ましくは０．０５％から０．８％％(ｗ／ｖ)まで、さらに好ましくは０．２から０．４％(ｗ／ｖ)まで変化できる。
【００５７】
好ましい一実施形態によると、製剤は、０．９％ＮａＣｌを含有する生理食塩水溶液中に１５μｇ／μｌの濃度でＢＤＮＦを含むことができる。
【００５８】
さらなる好ましい一実施形態によると、製剤は、ＴＳＰを含む生理食塩水溶液、好ましくは０．２５％溶液中に１５μｇ／μｌの濃度でＢＤＮＦを含有できる。
【００５９】
この点眼製剤は、無傷の眼表面に局所的に直接、すなわち、非侵襲的な方法で投与でき、眼内、網膜下および眼球後の注射などの侵襲的方法の使用を回避できる。特に、この製剤は、結膜嚢内に投与できる。この製剤は、眼帯としても、またはコンタクトレンズ中にも、配合できる。
【００６０】
網膜は、部分的に隔離した中枢神経系の一部である。血液−網膜関門を含む多様な型の関門が存在し、それらは、大きな分子などの化合物が網膜に非特異的に拡散するのを防ぐ。局所的に適用された薬理活性化合物の眼内の透過は、角膜および結膜に位置する関門により、全身性吸収により、およびこれらの組織に存在する酵素によって生じる代謝性分解により、調節される。一度滴下されると、これらの薬理活性化合物は、下層にある組織を網膜まで透過するために、血液−網膜関門を含む、複雑な系の血液関門を越えて行かなければならない。
【００６１】
さらに、網膜は、視神経線維の起点となる神経節細胞を通して、外側膝状体の背側部(ｄＬＧＮ)などの視覚中枢に視神経を介して連結されている。
【００６２】
実験部分で実証するように、ＢＤＮＦは、本発明に従って局所投与する場合、網膜まで運搬でき、機能的および形態学的の双方の観点から神経保護効果を果たすレベルまでその網膜内濃度を上昇させる。
【００６３】
驚くべきことに、実験的証拠によって実証されるように、神経節細胞は、ＢＤＮＦを順行輸送でき、その結果、ＢＤＮＦが、神経節細胞の変性のみでなく視神経線維の変性、および外側膝状体などの網膜外視覚中枢への障害の拡大を予防および治療できることも判明した。
【００６４】
本発明はまた、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害、特に、失明につながる、変性性の網膜症（網膜色素変性症および緑内障など）、加齢に関連した網膜症（加齢黄斑変性症など）、血管性および増殖性の網膜障害、網膜剥離および未熟児網膜症(ＲＯＰ)ならびに糖尿病網膜症の予防および／または治療を目的として、無傷の眼表面に局所投与するための点眼剤の形態の眼科用薬剤を調製するためにＢＤＮＦを使用することに関する。本発明による製剤は、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害、特に、例えば、網膜色素変性症および緑内障（先天性緑内障、小児緑内障、若年緑内障、成人緑内障、原発性開放隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、急性緑内障、医原性緑内障および続発性緑内障を含む）の予防および／または治療に有用である。
【００６５】
緑内障は、適切に治療しないと、神経節細胞の損失および視神経線維の進行性萎縮によって失明につながる、眼に影響を及ぼす一連の進行性障害のうちの１つである。
【００６６】
緑内障は、直接に（力学的に）、または網膜内層に供給する網膜血管の虚血の誘発によって間接的に、神経節細胞および視神経線維を損傷する可能性がある、眼圧（ＩＯＰ）の上昇を特徴とする。進行期において、緑内障は、網膜だけでなく、外側膝状体などの視覚中枢にも影響を及ぼす可能性があり、ついには視覚皮質が影響を受ける。
【００６７】
有効濃度のＢＤＮＦでの治療は、光に対する長期曝露（光損傷）によって誘発される光受容体変性を予防および低減するのみでなく、光に対する網膜応答を保つことも判明した。さらに、実験的緑内障モデルの使用により、ＢＤＮＦの局所適用が、動物緑内障モデルにおいて眼圧（ＩＯＰ）の上昇によって生じる網膜神経節細胞の変性を予防することが実証されている。いずれの動物モデルにおいても、ＢＤＮＦは、視覚刺激に対する網膜応答を変化させなかった。
【００６８】
以下に示す例は、本発明をさらに例示するものである。
【実施例】
【００６９】
製剤の例
・製剤１−生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する１０μｌの生理食塩水溶液に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する；
・製剤２−カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．４％カルボキシメチルセルロースナトリウムからなる溶液に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７０】
・製剤３−ＴＳＰを含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．５％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７１】
・製剤４−ヒアルロン酸（０．２％）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．４％ヒアルロン酸に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７２】
・製剤５−ヒアルロン酸（０．４％）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．８％ヒアルロン酸に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７３】
・製剤６−ヒアルロン酸およびＴＳＰ（Ｉ）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液ならびに５μｌの０．４％ヒアルロン酸および０．４％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７４】
・製剤７−ヒアルロン酸およびＴＳＰ（ＩＩ）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液ならびに５μｌの０．８％ヒアルロン酸および０．４％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７５】
・製剤８−ヒアルロン酸およびＴＳＰ（ＩＩ）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液ならびに５μｌの０．４％ヒアルロン酸および０．６％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７６】
バイオアッセイ
２．１ 例−ＢＤＮＦに基づく製剤での眼の６時間局所処置後の硝子体液、網膜および視神経におけるＢＤＮＦレベルの測定。
【００７７】
・前述の、ＢＤＮＦを含有する製剤１、２および３を使用した：
この試験は、アルビノラット（Ｗｉｓｔａｒラット、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）について行った。カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む生理食塩水溶液中、またはＴＳＰを含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦを、局所適用により、一方の眼の結膜嚢内に滴下すると共に、対照として使用する他方の眼は、ＢＤＮＦを含ませて運ぶために使用する溶液（「プラセボ」）で処置した。
【００７８】
・網膜、硝子体液および視神経におけるＢＤＮＦレベルの測定
これらの動物を、適用の６時間後、腹腔内ウレタン注射（２０％）での深麻酔導入後に死滅させた。次いで、眼を摘出し、ＢＤＮＦで処置した眼および担体溶液のみで処置した他方の眼（対照眼）の双方の硝子体液、網膜ホモジェネートおよび視神経ホモジェネート中のＢＤＮＦレベルを測定した。この測定は、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ；ＢＤＮＦ Ｅｍａｘイムノアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって行った。外部から局所適用によって導入されたＢＤＮＦが、網膜細胞によって、特に、その線維で視神経を形成する網膜神経節細胞によって、吸収および運搬されるかどうかを確認するために、視神経におけるＢＤＮＦの量も測定した。
【００７９】
図１中のチャートに示した結果は、生理食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）中のＢＤＮＦの局所適用で得られたものであり、網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）における平均ＢＤＮＦ濃度値（ｐｇ／タンパク質のｍｇとして表す）で表している。
【００８０】
この統計解析は、ＢＤＮＦで処置した眼を対照眼と比較して、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。すべての場合において、処置した眼と対照眼との間の差は、統計的に有意であった（＊、ｐ＜０．０５）。
【００８１】
図２中のチャートに示した結果は、カルボキシメチルセルロースナトリウム（０．２％）を含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用に関するものであるのに対し、図３中のチャートに示している結果は、ＴＳＰ（０．２５％）を含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用で得られたものである。いずれの場合も、その統計解析は、ＢＤＮＦで処置した眼を対照眼と比較して、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。すべての場合において、処置した眼と対照眼との間の差は、統計的に有意であった（＊、ｐ＜０．０５）。
【００８２】
図４は、使用した各種の溶液／担体について、網膜におけるＢＤＮＦの比較レベルを示している。この解析により、異なる溶液／担体の効力を同一のＢＤＮＦ濃度（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）で比較することが容易になる。ＴＳＰ中のＢＤＮＦでの局所処置は、使用した他の２種の製剤、すなわち、生理食塩水溶液中のＢＤＮＦおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦよりも有意に高いＢＤＮＦの網膜内レベルを生じた（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定＊、ｐ＜０．０５）。カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦでの局所処置は、網膜内ＢＤＮＦレベルを上昇させるのに最も有効性の低いことが判明した。
【００８３】
２．２ 例−ＴＳＰ中のＢＤＮＦを用いた眼の局所処置後の異なる時間における、網膜、硝子体液および視神経におけるＢＤＮＦレベルの測定
単回局所適用後に、網膜、硝子体液および視神経においてＢＤＮＦが高く維持される範囲を調べた。この試験は、網膜、視神経および硝子体液へのＢＤＮＦの強膜を横切る通過を促進するのに最も有効であると判明した、ＴＳＰを含有する担体を用いて行った。次いで、ＴＳＰを使用して、眼の局所処置後の網膜、硝子体液および視神経におけるＢＤＮＦレベルの動態を試験した。各試験群においてＮ＝５の眼を処置した。ＢＤＮＦを含有するＴＳＰの０．２５％溶液（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）の適用後に異なる時間間隔で網膜、視神経および硝子体液中のＢＤＮＦ濃度を測定した。対照眼は、０．２５％ＴＳＰを含有する担体溶液のみで処置した。この実験は、単回局所適用後のＢＤＮＦレベルの時間傾向を確認するために行った。このチャートは、適用の６、１２および２４時間後の網膜、視神経および硝子体液中の平均ＢＤＮＦ値（ｙ軸；ｐｇ／ｍｌ）を示している。図５は、網膜内のＢＤＮＦレベルが、統計的に高く維持され、１２〜２４時間においてベースラインレベルに戻ることを示している。この統計解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。Ａ＊では、対照眼と比較してｐ＜０．０１。この実験の結果は、特にＴＳＰをベースとする人工涙液で運ばれるＢＤＮＦでの長期処置において、網膜内で高いＢＤＮＦレベルを維持するのには、１２時間毎に１回の局所適用で十分であることを示唆している。
【００８４】
２．３ 例−ＢＤＮＦをベースとする製剤の局所適用の神経保護効果
結膜嚢内の局所適用による処置後のＢＤＮＦの神経保護効果を確認するために、動物モデルにおいて、光損傷によって網膜変性症が誘発される試験的モデルを使用した。このモデルは、強い光源に対する長期曝露によって誘発される網膜光受容体の変性を研究するために広く使用されている（Ｌａ Ｖａｉｌら、１９８７；Ｒｅｘら、２００３）。光受容体の死は、アポトーシスによって生じ、また、視色素ロドプシンによる光子の過度の吸収によって引き起こされ、最終的に色素沈着した上皮細胞に関与する、色素再生サイクルの変化を導く。試験した実験動物モデルは、光に対するその光受容体の顕著な感受性を考慮して、アルビノラット（Ｓｕｒａｃｅら、２００５）であった。使用した実験プロトコルは、最初にＬａＶａｉｌのグループによって提案されたもの（ＬａＶａｉｌら、１９８７）から変更（Ｒｅｘら、２００３）および拡張した。
【００８５】
ＢＤＮＦをベースとする以下の製剤を使用した：
ａ）０．２５％ＴＳＰ溶液中のＢＤＮＦ（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）
ｂ）生理食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）中のＢＤＮＦ（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）
ｃ）カルボキシメチルセルロースナトリウムの０．２％溶液中のＢＤＮＦ（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）。
【００８６】
ラットの眼を前記製剤で処置し、それらのラットに光損傷を受けさせた。対照眼は、担体溶液のみで処置した。各試験群においてＮ＝４の眼を処置した。特に、６時間の処置後（ＢＤＮＦで処置した眼および担体溶液のみで処置した対照眼）、これらのラットに、光に対する長期曝露を４８時間受けさせた（動物光損傷モデル、光源強度１０００ｌｕｘ）。光に対するこの長期曝露は、アルビノラットの網膜内の多数の光受容体の変性を誘発する。ＢＤＮＦによって行われる神経保護は、光受容体の残存を評価するように設計された形態学的方法によって、および光に対する網膜応答を記録すること（フラッシュ網膜電図［ＥＲＧ］、これは、網膜障害を患う患者における外側の網膜の機能的状態を評価するのに広く使用される）による機能的方法によって検証した。ラットでは、明順応条件下でＥＲＧ応答の基礎を形成している錐体の数が少ないこと、およびアルビノラットでは、明順応条件におけるＥＲＧの振幅が減少していることを考慮して、ラットの網膜を主に構成している桿体の応答を表すフラッシュＥＲＧのみを暗順応適応条件下で記録した。この（暗順応の）フラッシュＥＲＧを、光損傷期間の終了の７日後に記録した。
【００８７】
−製剤ａ）
図６は、暗順応適応条件下での輝度によるフラッシュＥＲＧのｂ波の振幅を示している。図６中のチャートで明らかに示されるように、局所的に適用されたＴＳＰ中のＢＤＮＦは、フラッシュへの網膜応答（フラッシュＥＲＧ）に対する光損傷の影響を有意に低減する。実際に、ＢＤＮＦで処置した眼の振幅（μＶで表される平均振幅値）は、対照眼のものを有意に超える（＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ））。
【００８８】
−製剤ｂ）
図８は、暗順応適応条件下での輝度によるｂ波の振幅を示している。これらの結果は、生理食塩水溶液中のＢＤＮＦも、光損傷によって誘発される、光に対する網膜応答（フラッシュＥＲＧ）の変化を低減できることを示している。ＢＤＮＦで処置したラットの光損傷を受けた眼におけるｂ波の振幅は、対照眼について記録されたものを超える。生理食塩水中のＢＤＮＦで処置した眼の振幅（μＶで表される平均振幅値）は、対照眼のものを有意に超える（＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ））。
【００８９】
−製剤ｃ）
図１０は、暗順応の条件下での輝度によるｂ波の振幅を示している。この図より、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦで処置した眼の振幅（μＶで表される平均振幅値）は、最も高い輝度値でのみ対照眼のものを有意に超える（＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ））ことが示される。結論として、光に対する網膜応答の機能的回復の観点から、カルボキシメチルセルロースナトリウムは、光に対する網膜応答の障害の予防において、ＴＳＰおよび生理食塩水溶液よりも有効性が低いことが判明した。
【００９０】
続いて、網膜の光受容体の変性に対する、前記ＢＤＮＦをベースとする製剤での局所処置の効果を、フラッシュＥＲＧを記録した眼の網膜において評価した。
【００９１】
光受容体変性に対する、ＢＤＮＦでの局所処置の効果を、光損傷後に残存した光受容体の列数を計測することおよび光受容細胞体を含む網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを測定することによって定量した。これらの測定を行うために、光受容体核をヨウ化プロピジウムで標識した。
【００９２】
−製剤ａ）
図７に、得られた結果を示している。図７Ａは、（０．２５％ＴＳＰ中の）ＢＤＮＦで処置した眼および対照眼の網膜断面を示している。これらの測定を行うために、光受容体核をヨウ化プロピジウムで標識した。使用する方法（光受容細胞体の列数（図７Ｂ）または外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さ（図７Ｃ）の計測）にかかわらず、中心部および周辺部の網膜に存在する光受容体は、ＢＤＮＦで処置した眼において、担体で処置した眼（対照）よりも有意に（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定＊、ｐ＜０．００１）多い。
【００９３】
その後、ＴＳＰ中のＢＤＮＦは、結膜嚢内に局所的に適用されたときに、網膜を光損傷から保護することも実証された。
【００９４】
−製剤ｂ）
図９（Ａ）は、（生理食塩水溶液、０．９％ＮａＣｌ中の）ＢＤＮＦで処置した右眼および生理食塩水溶液のみで処置した左（対照）眼の網膜断面を示している。光受容体変性に対する、ＢＤＮＦでの局所処置の効果を、光損傷後に残存した光受容体の細胞体の列数を計測すること（図９Ｂ）または光受容細胞体を含む網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを測定すること（図９Ｃ）によって定量した。処置した眼の網膜と対照眼の網膜との間の差（光受容体の列数またはＯＮＬの厚さの計数）は、中心部および周辺部の網膜の双方において有意であることが判明した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定＊、ｐ＜０．００１）。
【００９５】
生理食塩水中のＢＤＮＦでの局所処置は、眼において光損傷後に残存する光受容体の数を対照眼と比較して増加させる。
【００９６】
−製剤ｃ）
最後に、光受容体変性に対する、ＢＤＮＦ（カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中の）での局所処置の効果を、光損傷後に残存した光受容体の細胞体の列数（図１１Ｂ）および光受容細胞体を含む網膜の外顆粒層（Outer Nuclear retina）（ＯＮＬ）の厚さ（図１１Ｃ）を測定することによって定量した。
【００９７】
得られた結果を考慮して、光損傷後の光受容体変性の機能的回復および予防の観点から、ＴＳＰ中および生理食塩水溶液中のＢＤＮＦでの局所処置は、光損傷に対して神経保護効果を及ぼすが、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦでの処置は、同一のＢＤＮＦ濃度での有効性がより低いと結論づけることができる。
【００９８】
ＢＤＮＦでの処置は、網膜における機能的変化を誘発せず、視覚刺激物質に対するその応答が損なわれることも実証された。
【００９９】
２．４ 例。試験的緑内障モデルにおいてＢＤＮＦの反復局所適用によって誘発される神経保護効果
緑内障は、多様な原因を有する網膜の変性性障害であり、様々な型がある（これは、年齢に基づいて、先天性緑内障、小児緑内障、若年緑内障または成人緑内障として；また、疾病原因に基づいて原発性緑内障：原発性開放隅角緑内障または原発性閉塞隅角緑内障；および、医原性緑内障を含む、他の障害によって誘発される続発性緑内障として、分類される）。最も一般的な形態の緑内障、すなわち、原発性開放隅角緑内障(ＰＯＡＧ)は、眼圧上昇を特徴とする。眼圧上昇により、視神経の萎縮に関連した神経節細胞の機能障害およびその後の変性が引き起こされ、症状は緩やかな視力の喪失であり、失明に至る。上昇した眼圧(ＩＯＰ)が、篩板内の視神経線維に機械的な障害ならびに視神経乳頭および網膜内層の虚血性変化を誘発するというのが一般的な仮説であるが、視神経の萎縮と共に神経節細胞の機能障害および変性を引き起こす機序は、まだ完全には明らかになっていない。近年、薬理学的治療は、ＩＯＰを低減することを目的としてきたが、かなりの数の患者が現在の薬理学的治療に対して抵抗性であり、視覚機能の進行性の不可逆的喪失に苦しんでいる。現在、視覚能力低下の予防および正常視力の回復を目的として網膜神経節細胞および視神経線維の神経保護を達成するように設計された薬剤はない。本特許において、本発明者らは、進行性の機能障害とそれに続く神経節細胞の変性および死に対抗するように安定な方法で網膜内ＢＤＮＦレベルを上昇させるための、結膜嚢におけるＢＤＮＦによる局所治療の使用を提案する。この提案は、ＴｒｋＢと称するＢＤＮＦ受容体が神経節細胞内で発現されるという実証（Ｊｅｌｓｍａら、１９９３）に部分的に基づいている。本発明者らは、仮説を検証するために、突発性緑内障の最も一般的な実験モデルである、ＤＢＡ／２Ｊと称される二重変異マウス（Ｊｏｈｎら、１９９８;Ｃｈａｎｇら、１９９９）を使用した。ＤＢＡ／２Ｊマウスは、２つの別個の遺伝子のホモ接合性変異を示す。１つ目は、メラノソームタンパク質をコードするチロシン関連タンパク質（Ｔｙｒｐ１−／−）であり、２つ目は、膜糖タンパク質（Ｇｐｎｍｂ−／−）である。このマウスは、構造化された視覚刺激に対する網膜応答の進行性の喪失を伴う進行性の眼圧上昇を特徴とし、これは、内側の網膜／神経節細胞に依存している。ヒトおよび動物モデルにおいて、この網膜応答は、パターン網膜電図（Ｐ−ＥＲＧ）と称される（Ｄｏｍｅｎｉｃｉら、１９９１；ＶｅｎｔｕｒａおよびＰｏｒｃｉａｔｔｉ、２００６；Ｆａｌｓｉｎｉら、２００８）。神経節細胞の機能障害に続いて、視神経線維の進行性の萎縮を伴う前記細胞の変性が起こる（Ｖｅｎｔｕｒａら、２００６）。図１２に示されるように、このマウス緑内障モデル（ＤＢＡ／２Ｊ）において、ＩＯＰは出生５カ月後に上昇し始める。６．５カ月で、ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｎ＝１０）におけるＩＯＰは、すでに、正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ；Ｎ＝５）および月齢５カ月のＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｎ＝９）において測定されたものよりも有意に高いと思われる（ｔ検定；＊ｐ＜０．０５）。図１３中のチャートは、構造化された視覚刺激（刺激として使用した視覚的パターンは、空間周波数＝０．２Ｃ／ｄｅｇおよび９０％コントラストでの輝度のプロファイルであった）に対する内網膜／神経節細胞の応答の振幅（Ｐ−ＥＲＧ）を、増幅器およびオンライン分析用のコンピュータに連結された角膜電極で記録されたものを示している。図１３に示しているように、このＰ−ＥＲＧは、月齢７カ月のＤＢＡ／２Ｊマウス（ＣＴＲＬ、Ｎ＝４）においてすでに変化している（Ｐ−ＥＲＧ振幅における有意な減少；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。月齢６．５カ月から、すなわち、ＩＯＰが安定に上昇したときから（図１２）、一方の眼にはＴＳＰ中のＢＤＮＦ（４８時間毎に１回の処置）および他方（対照眼）には担体の２週間の反復局所適用処置を行った。３つの異なるＢＤＮＦ濃度：１、５および１５μｇ／μｌを使用した（１群Ｎ＝４のＤＢＡ／２Ｊマウス）。ヒストグラムに示されるように、ＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて、１５μｇ／μｌの濃度のＢＤＮＦ（０．２５％ＴＳＰを含有する１０μｌの溶液中１５０μｇ、眼科用製剤ａ）での局所処置は、Ｐ−ＥＲＧの変化を予防した（処置した眼のデータを対照眼と比較されたい；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊ｐ＜０．０５）が、１および５μｇ／μｌの濃度では予防しなかった。Ｐ−ＥＲＧの変化が、免疫組織化学的方法で標識した神経節細胞の変化と対応するかどうかを確認するために、本発明者らは、神経節細胞において発現される転写因子、Ｂｒｎ３ｂを使用した。この因子に関する変異体マウス（Ｂｒｎ３ｂ−／−）は、神経節細胞の変化を伴う（Ｂａｄｅａら、２００９）。図１４Ａは、神経節細胞を蛍光抗体で緑に標識して、共焦点顕微鏡法によって解析した、網膜標本の拡大を示している。ＤＢＡ／２Ｊマウスの眼において、標識神経節細胞の数は、中心部および周辺部の網膜の双方で、明らかにより少ない。図１４Ｂは、密度（細胞個数／ｍｍ２）の観点からの、標識された細胞の定量を示している。ＴＳＰ中の１５μｇ／μｌの濃度のＢＤＮＦでの２週間の処置は、担体溶液のみで処置した対照眼と比較して、Ｂｒｎ３ｂで標識される細胞の減少を防止した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。
【０１００】
報告したデータから、ＢＤＮＦでの反復局所処置は、神経節細胞の機能的変化を予防し、実験緑内障モデルにおいて網膜の視覚能力を回復させるという結論が導かれる。神経節細胞の機能に対する保護効果を発揮できるＢＤＮＦの最小有効濃度は、１５μｇ／μｌである。
【０１０１】
参考文献一覧
【０１０２】
【表１−１】
【０１０３】
【表１−２】
【０１０４】
【表１−３】
【０１０５】
【表１−４】
【０１０６】
【表１−５】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と粘度調整剤、好ましくは、ＴＳ−多糖類またはＴＳＰとしても知られている、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカンとを含有する、点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。
【０００２】
前記製剤は、神経変性網膜障害、特に、網膜色素変性症、緑内障(先天性緑内障、小児緑内障、若年緑内障、成人緑内障、原発性開放隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、続発性緑内障、医原性緑内障および急性緑内障を含む)、加齢黄斑変性症などの加齢に関連した網膜症、血管性および増殖性の網膜障害、網膜剥離、未熟児網膜症(ＲＯＰ)および糖尿病網膜症の予防および治療において有用である。これらの障害はすべて失明につながる。
【背景技術】
【０００３】
従来技術
ニューロトロフィンは、神経細胞によって合成されるタンパク質であり、神経系に存在する多様な細胞の生存および正常な栄養を調節する。
【０００４】
最もよく知られているのは、２０世紀中頃にR. Levi-MontalciniおよびS. Cohenによって発見された、神経成長因子(ＮＧＦ)である。
【０００５】
タンパク質構造がＮＧＦのものと構造的類似性を示す他の因子が、その後発見された。したがって、本発明者らは、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５およびＮＴ−６ならびにＮＧＦが属する種類のＮＧＦ因子(ニューロトロフィン)についてこれから検討する(最初の３つは、哺乳類の神経系において主に発現されるのに対して、ＮＴ−６は、硬骨魚において同定された、哺乳類の脳内にはない新種のニューロトロフィンである)。
【０００６】
ニューロトロフィンを含む神経栄養因子は、それらを合成する神経細胞によって放出され、膜上の特異受容体に結合する。
【０００７】
これらの多様なニューロトロフィンは、構造的に類似しているにもかかわらず、異なる受容体を通して、結果として異なる作用機序を通して作用する。
【０００８】
神経栄養因子の、その特異受容体（ＮＧＦに対するＴｒｋＡ；ＢＤＮＦおよび部分的にはＮＴ−４に対するＴｒｋＢ；ＮＴ−３に対するＴｒｋＣ）に対する結合により、事象が次々起こり、神経細胞による特異応答が誘発される。
【０００９】
異なるニューロトロフィン受容体は、異なる領域でおよび異なる細胞中の同一領域内で発現され、特定の細胞内シグナル伝達経路を活性化する。したがって、論理的には、必ずしもすべての領域または神経細胞が４つのニューロトロフィンのそれぞれに応答できるわけではないことになる。その限定要因は、所与のニューロトロフィンの特異受容体の細胞分布である。
【００１０】
ニューロトロフィンの原型であるＮＧＦを合成および放出できる網膜細胞の分布、ならびにＮＧＦ受容体(ＴｒｋＡ)を発現する網膜細胞の分布は、きわめて限定されていると思われ、実際に、神経節細胞および星状膠細胞のサブグループに限定されている（Ｇａｒｃｉａら、２００３)。
【００１１】
ＥＰ１１６１２５６Ｂ１には、強膜、毛様体、水晶体、網膜、視神経、硝子体液および／または脈絡膜に影響を及ぼす障害の治療および／または予防を目的として無傷の眼表面に投与するための、２００から５００μｇ／ｍｌのＮＧＦを含有する眼科用製剤が記載されている。
【００１２】
Ｌａｍｂｉａｓｅらによって報告されているように、これらの製剤は、ＮＧＦの網膜内レベルを上昇させるが、ＮＧＦが網膜に対する神経保護効果を果たせないことは実証できる。
【００１３】
これは、Ｓｈｉら（２００７）によって近年報告された知見と一致する。ＮＧＦは、網膜内の２つの型の受容体、ＴｒｋＡおよびＰ７５に結合できる。ＴｒｋＡおよびＰ７５は、神経細胞の栄養および生存に対して逆の効果を及ぼす。したがって、外因性ＮＧＦは網膜に到達すると、網膜細胞に対して２つの対立した効果を誘発し、それらの効果は互いに相殺する傾向がある。
【００１４】
そうでない場合には、ＢＤＮＦは、その受容体ＴｒｋＢと共に、哺乳類の網膜内で大量に発現される。網膜は、層状に配置された多数の型の細胞からなる。特に、ＢＤＮＦは、網膜の内層に存在する、ドーパミン作動性細胞などのいくつかの神経節細胞およびアマクリン細胞によって合成される（Ｈｅｒｚｏｇら、１９９４;ＰｅｒｅｚおよびＣａｍｉｎｏｓ、１９９５；Ｈａｌｌｂｏｏｋら、１９９６；Ｈｅｒｚｏｇおよびｖｏｎ Ｂａｒｔｈｅｌｄ、１９９８；ＫａｒｌｓｓｏｎおよびＨａｌｌｂｏｏｋ、１９９８；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９９；ＰｏｌｌｏｃｋおよびＦｒｏｓｔ、２００３；Ｓｅｋｉら、２００３；ＣｈｙｔｒｏｖａおよびＪｏｈｎｓｏｎ、２００４）。
【００１５】
ＢＤＮＦ受容体は、ＴｒｋＢと呼ばれ、神経節細胞、アマクリン細胞およびミュラーグリア細胞を含む多数の型の網膜細胞において発現される（Ｊｅｌｓｍａら、１９９３;ＣｅｌｌｅｒｉｎｏおよびＫｏｈｌｅｒ、１９９７;Ｄｉ ポーロら、２０００）。
【００１６】
ＷＯ９７/４５１３５(特許文献１)は、水溶液または凍結乾燥物(Lyophilisate)の形態のＢＤＮＦの安定な医薬組成物に関する。その文献において、特に、従来技術に関する節において、ＢＤＮＦは、網膜色素変性症を含む多様な障害の治療において有用なものとしてあげられている。特に挙げられている唯一の投与形態は、注射用製剤である。
【００１７】
ＪＰ２００３０４８８５１は、結膜上に点眼剤の形態で投与するための、ＢＤＮＦをベースとする眼科用製剤に関する。開示されている製剤は、多様な粘度調整剤を含有し、ＢＤＮＦを網膜に運搬するのに同様に有効であると記載されている。
【００１８】
前記文献において報告されている活性の証拠は疑わしい。なぜならば、ＢＤＮＦについて示されている濃度範囲はきわめて広く、１×１０−２μｇ／μｌと１０μｇ／μｌとの間の濃度範囲に相当する、０．００１〜１重量／体積％であるが［請求項３、特許の範囲；該発明の詳細な説明の［０００６]、段落３による］、報告されている例では、使用されている濃度は４×１０−２μｇ／μｌに相当する０．００４％（重量／体積％）であり、すなわち、ＢＤＮＦの網膜内レベルを高めかつ光に対する長期曝露によって誘発される網膜の変化を予防できる有効濃度、１５μｇ／μｌ以上（本発明と一致する１５〜２００μｇ／μｌの範囲内である）よりもかなり低いからである。ＪＰ２００３０４８８５１においては、適用が、１日３回（１０μｌ／適用、０．００４％重量／体積）５日間繰り返され、１．２μｇ／日の用量および６μｇの総用量に相当したことに留意するべきである。日用量および総用量を考慮に入れたとしても、それらは、神経保護効果を発揮するには低すぎる。実際には、光損傷を受けた網膜において神経保護効果を得るためには、本発明と一致して、１５０μｇの最小総用量を局所的に投与しなければならない。もう１つの実験モデル、すなわち、緑内障を発症するマウスで得られた新しいデータにより、使用された３つのＢＤＮＦ濃度（１、５および１５μｇ／μｌ）のうちで最高濃度のもの（１５μｇ／μｌ）のみが有効であることが確認されている。
【００１９】
さらに、ＪＰ２００３０４８８５１は、網膜の厚さを測定するように設計された組織学的技術（ヘマトキシリン−エオシンによる網膜切片の染色）によって検証された網膜保護効果に言及しているが、本発明において報告しているような、フラッシュ網膜電図記録によって測定される網膜機能の回復の実証は伴っていない。あらゆる治療の神経保護効力を網膜レベルで実証するためには、組織学的／形態学的技術で得られる結果のみでは不十分であることはよく知られており、網膜機能の回復の証拠も必要とされる。したがって、ＪＰ２００３０４８８５１において、例中で報告されている濃度、およびより一般的には好ましい範囲の濃度の、外部から投与されたＢＤＮＦの眼科用組成物は、網膜機能を回復させることができる神経保護効果を発揮するのに十分な量で、眼表面から内部組織に移行できないと結論づけることができる。
【００２０】
ＷＯ２００６/０４６５８４（特許文献２）は、網膜色素変性症などの視覚細胞の病変を伴う障害の治療に有用な、架橋ゼラチンヒドロゲルを含浸させたＨＧＦ、ＢＤＮＦまたはＰＥＤＦを含有する徐放性組成物に関する。特定の例において、これらの組成物は、０．００１〜１０００μｇの間のＢＤＮＦの用量を含有するマイクロスフェアの形態を取り、眼内注射または網膜下インプラントによって投与できる。
【００２１】
ＥＰ０９５８８３１には、ＢＤＮＦを含む因子の群から選択される神経栄養因子を含有する眼科用組成物が記載されている。前記組成物は、例えば眼軟膏剤もしくは点眼液剤の形態で、外部から適用でき、またはコンタクトレンズとして配合することもできる。
【００２２】
ＥＰ０９５８８３１に開示されている神経栄養因子の濃度は、０．０００１から０．５％（重量／体積）まで、すなわち、１×１０−３から５μｇ／ｌまでの範囲である。したがって、報告されている濃度範囲は、きわめて広範囲にわたる。ＥＰ０９５８８３１は、この濃度範囲において同様に有効であろう、ＢＤＮＦを含む多様な神経栄養因子に関するものなので、一般性が高い。神経栄養因子は、異なる脳領域および個々の神経細胞においてそれらの生物学的効果を決定する受容体の密度および分布が異なるために、同一の濃度範囲であっても等しく有効ではないことが知られている。
【００２３】
さらに、ＥＰ９５８８３１は、局所使用のための有効なＢＤＮＦ濃度の範囲に関してきわめて曖昧で、不明確である。3頁44行目（段落００２２および００３３、請求項１９および２０を参照されたい）において２つの濃度範囲が示されており、これらは一致しておらず（範囲Ａ最大、０．０００１と０．５％（Ｗ／Ｖ）との間（１０−３と５μｇ／μｌの間の濃度範囲に等しい）、および範囲Ｂ、１０−３と２×１０５μｇ／ｌとの間）、これらの２つの濃度範囲は明らかに一致していない。しかし、本発明によれば、ＢＤＮＦの有効濃度は、１５μｇ／μｌ以上（範囲１５〜２００μｇ／μｌ）、すなわち、ＥＰ９５８８３１において報告されている範囲Ａ、すなわち、最大濃度範囲よりも高い。ＥＰ９５８８３１中の例は、０．０２、０．０４および１０μｇ／ｌのＢＤＮＦ濃度を特徴とする眼科用組成物に関する。この濃度は、本発明により、網膜内のＢＤＮＦレベルの上昇ならびに光損傷および緑内障損傷の双方の予防に有効であると判明した最も低い濃度、すなわち、１５μｇ／μｌよりもはるかに低い（１×１０６倍低い）。
【００２４】
したがって、外部から投与される、ＥＰ９５８８３１において報告されている濃度のＢＤＮＦの眼科用組成物は、ＢＤＮＦの網膜内レベルを上昇させかつ結果として治療効果を果たすのに十分な量では、眼表面から内部組織に移行できないと結論づけることができる。
【００２５】
ＮＴ−４は、ＴｒｋＢに結合する他のニューロトロフィンであり、網膜内で低いレベルで発現され、アマクリン細胞のサブグループ、すなわち、ドーパミンを合成するもののみに作用する（Ｃａｌａｍｕｓａら、２００７）。
【００２６】
ＢＤＮＦまたはその受容体の欠如は、網膜機能における重篤な変化を引き起こす。例えば、ＴｒｋＢ受容体を欠いているマウス（ノックアウトマウス）は、光に対する網膜応答の完全な消失（フラッシュ網膜電図におけるｂ波の完全な欠如）を特徴とする（Ｒｏｈｒｅｒら、１９９９）。
【００２７】
ＬａＶａｉｌのグループは、ＢＤＮＦの眼内注射により、光損傷によって誘発される光受容体の形態学的変性が効果的に予防されるが、ＮＧＦの眼内注射では効果的に予防されないことを実証している。
【００２８】
ＢＤＮＦの眼内注射は他の神経栄養因子との併用で、視神経の病変に起因する網膜神経節細胞の損傷を低減させたが、ＢＤＮＦが単独で、すなわち、他の神経栄養因子とは独立に、神経保護効果を果たせるかどうかはまだ明らかではない（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００３;Ｙａｔａら、２００７）。
【００２９】
ＦＧＦ２のような他の神経栄養因子は、光損傷によって引き起こされる形態学的変化を予防するのに同様に有効であることが判明しているが、ＢＤＮＦとは異なり、それらの投与は、炎症反応に関連する因子を活性化するという望ましくない効果を有する（ＬａＶａｉｌら、１９８７）。
【００３０】
もう１つの神経栄養因子、ＣＮＴＦも、光損傷に起因する形態学的変性を予防する（ＬａＶａｉｌら、１９７８）。残念ながら、近年の実験により、ＣＮＴＦをベースとする治療は、光に対する網膜応答を変化させ、したがって、その可能な治療的使用に一連の制約を課していることが実証されている（ＭｃＧｉｌｌら、２００７）。
【００３１】
これらの結果は、網膜障害モデルにおける神経保護の目的では、神経活性分子の形態学的効果を評価するだけでは不十分であり、とりわけ、それらの分子が網膜機能に対する保護効果を発揮するかどうかを評価し、それらが視覚刺激に対する網膜細胞の応答を確実に損なわないようにするのが不可欠であることを示している。例えば眼球の穿孔、感染または出血を引き起こすリスクのために長期の慢性治療には適さない、眼内、網膜下または眼球後注射などのきわめて侵襲的な投与方法を避けて、網膜にＢＤＮＦを運搬するための非侵襲的な方法によって投与することができる新しいＢＤＮＦ製剤を見つけることが現在必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】国際公開第９７／４５１３５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００６／０４６５８４号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本特許は、１５と２００μｇ／μｌとの間の濃度範囲でＢＤＮＦを含有する多様な製剤での局所結膜適用を提案する。総ＢＤＮＦ用量は、治療する眼の大きさに応じて、投与あたり５０と４０００μｇとの間であり、ヒトを含む、関与する動物種によって異なるであろう。
【００３４】
この製剤は、粘度調整剤を含有することが好ましいであろう。前記粘度調整剤は好ましくは、５０００００と８０００００Ｄａとの間の分子量および以下の構造式を有する、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカン（ＴＳ−多糖類またはＴＳＰ）である：
【００３５】
【化１】
【００３６】
本発明者らは、前記製剤が、投与あたりの指示濃度および用量で、網膜内ＢＤＮＦレベルを有意に上昇させて、ｉ）光に対する長期曝露によって誘発される網膜の変化およびｉｉ）緑内障における網膜の変化を予防することを実証する。
【００３７】
ＴＳＰは眼表面の局所治療用の薬理学的活性分子を運搬することができることが以前に実証されている（Ｕｃｃｅｌｌｏ−Ｂａｒｒｅｔｔａ Ｇら、２００８；Ｇｈｅｌａｒｄｉ Ｅら、２００４；Ｂｕｒｇａｌａｓｓｉ Ｓら、２０００；Ｇｈｅｌａｒｄｉ Ｅら２０００）。眼表面での製剤の保持時間を長くすることによって、活性分子の吸収の増加することが観察されている。ＴＳＰのこの特性は、すべて小分子である、抗生物質(ルフロキサシン、ゲンタマイシンおよびオフロキサシン)、抗ヒスタミン薬(ケトチフェン)および抗高血圧薬(チモロール)との併用で記載されている。
【００３８】
ＢＤＮＦのような組換えタンパク質を含有する薬理学的製剤の場合には、その活性成分は、タンパク質、すなわち、翻訳後修飾と、それが活性な３次元構造に至るまでのその空間的屈曲の調節とを受ける高分子量を有する分子である。タンパク質の生物活性は、それらの３次元構造に密接に依存する。これは、特異受容体とそれらを認識する酵素との相互作用、および結果として、標的細胞の生化学的過程に介入する能力が、それらの３次元構造に依存しているからである。このタンパク質の立体構造は、組換えタンパク質の存在環境によってかなり改変されることがある。したがって、組換えタンパク質を含有する製剤は、該タンパク質をその活性な立体構造で溶液中に確実に維持し、その安定性を保証しなければならない。
【００３９】
本発明は、ＴＳＰが、製剤中のＢＤＮＦの安定性を保証し、表面での製剤の長い滞留時間によってその眼内吸収を増加させ、とりわけ、ＢＤＮＦをその生物学的に活性な立体構造に維持することを実証する。
【００４０】
本発明の概要
少なくとも１５μｇ／μｌの濃度のＢＤＮＦを含有する眼科用製剤は、光に対する長期曝露によって誘発される網膜の変化、および緑内障モデルにおける眼圧上昇と関連する網膜の変化を予防することを今回発見した。
【００４１】
したがって、本発明は、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)を含有する点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。その好ましい態様によれば、本発明が関係する組成物は、ＴＳＰとして知られる、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカンを含有する。
【００４２】
本発明はまた、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害の予防および／または治療するための点眼剤の形態の薬剤の調製にＢＤＮＦを使用することに関する。
【００４３】
本発明はさらに、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害の予防および／または治療に使用するための、ＢＤＮＦを含有する点眼剤の形態の眼科用製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】生理食塩水溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）におけるＢＤＮＦレベルの測定。ＢＤＮＦレベルをｙ軸に示す。ＢＤＮＦレベルは、ＢＤＮＦで処置した眼および生理食塩水溶液で処置した対照眼において測定した。＊はこれらの差の有意性を示している。
【図２】カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）におけるＢＤＮＦレベルの測定。表記法および記号については、図１を参照されたい。
【図３】ＴＳＰを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）におけるＢＤＮＦレベルの測定。表記法および記号については、図１を参照されたい。
【図４】ＢＤＮＦの保有およびその網膜内濃度（ｐｇ／タンパク質のｍｇ、ｘ軸を参照されたい）の増加における、ＴＳＰ、生理食塩水溶液（ＮａＣｌ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ナトリウムの効力の比較。ＴＳＰ中（＊）のＢＤＮＦを用いた局所処置後のＢＤＮＦの網膜内レベルは、生理食塩水溶液中およびカルボキシメチルセルロースナトリウム中のＢＤＮＦを用いた局所処置後のＢＤＮＦレベルと比較して、有意に増加した。このデータは、図１、２および３中のパネルＡから得たものである。
【図５】ＴＳＰを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用後の網膜、視神経および硝子体液におけるＢＤＮＦレベルの動態。ＢＤＮＦレベルは、処置後の最初の６時間（＊）では有意に高く維持されている。
【図６】ＴＳＰ中のＢＤＮＦの局所適用は、光損傷によって誘発される、網膜フラッシュ応答（フラッシュＥＲＧ）の変化を低減させる。異なる輝度（ｃｄ／ｍ２、ｘ軸を参照されたい）のフラッシュによって誘発され、ＢＤＮＦで処置した眼（黒色記号）またはＴＳＰのみで処置した対照眼（光損傷を受けた対照、白色記号）によって記録される、網膜電図のｂ波の振幅（μＶ、ｙ軸を参照されたい）を測定した。＊はこれらの差異が有意であることを示している。
【図７】ＴＳＰ中のＢＤＮＦでの局所処置は、光損傷後に残存する光受容体の数を増加させる。光受容体は、網膜断面においてヨウ化プロピジウムで標識する。使用する方法（光受容細胞体の列数の計測（図７Ｂ）または外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さの測定（図７Ｃ））にかかわらず、中心部および周辺部の網膜に存在する光受容体は、ＢＤＮＦで処置した眼において、担体で処置した眼（対照）よりも有意に（＊）多い。
【図８】生理食塩水溶液（ＮａＣｌ）中のＢＤＮＦの局所適用は、光損傷によって誘発される、光に対する網膜応答における障害を低減する。表記法および記号の説明については、図６を参照されたい。
【図９】生理食塩水溶液中のＢＤＮＦでの局所処置は、光損傷後の光受容体の残存を増加させる。表記法および記号については、図７を参照されたい。
【図１０】カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用、および光損傷によって誘発される光応答の低下。表記法および記号については、図６を参照されたい。
【図１１】ＢＤＮＦで処置した眼および担体で処置した眼（対照）に対する光損傷後の光受容体残存に対する、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦでの局所処置の効果。表記法および記号については、図７を参照されたい。
【図１２】試験的マウス緑内障モデル、ＤＢＡ／２Ｊマウス対正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ）、における眼圧（ＩＯＰ、ｍｍＨｇ）の上昇。ＤＢＡ／２ＪにおけるＩＯＰの上昇は、月齢６．５カ月から有意（＊）である。
【図１３】正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ、暗色の棒）および緑内障発症マウス（ＤＢＡ／２Ｊ）において、視覚的パターン（パターンＥＲＧ、Ｐ−ＥＲＧ；空間周波数＝０．２Ｃ／ｄｅｇ、コントラスト９０％からなる刺激）に対する網膜の応答を記録した。異なる濃度（１、５および１５μｇ／μｌ）のＢＤＮＦで２週間処置した眼を刺激することによって、および、対照眼（ＣＴＲＬ）とみなす、担体で処置した眼を刺激することによって、Ｐ−ＥＲＧの応答の振幅（μＶ、ｙ軸を参照されたい）を測定した。＊はこれらの差の有意性を示している。Ｐ−ＥＲＧは、ＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて月齢７カ月で、すなわち、眼圧（ＩＯＰ）の上昇後に記録した。
【図１４】転写因子（Ｂｒｎ３ｂ）に結合する蛍光抗体で標識した、緑内障発症ＤＢＡ／２Ｊマウス（月齢７カ月）の網膜神経節細胞（全載標本）。Ａ．左手のカラムは、中心部網膜（上段）および周辺部網膜（下段）における、ＴＳＰ中のＢＤＮＦでの２週間の局所処置の効果を示している。ＢＤＮＦでの処置後（左手のカラム）、標識細胞は、担体のみで処置した対照眼（ＣＴＲＬ）の網膜（右手のカラム）よりも多かった。Ｂ．緑内障発症マウス（ＤＢＡ／２Ｊ；ＢＤＮＦで処置した眼；担体で処置した眼、ＣＴＲＬ）および正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ）における、Ｂｒｎ３ｂで標識した神経節細胞（細胞個数／ｍｍ２で測定した密度、ｙ軸上に示す）に対する、ＢＤＮＦでの局所処置の効果の定量。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明の詳細な説明
驚くべきことに、無傷の眼表面に、特に、結膜嚢内に、局所的に適用される、外因性の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を投与することにより、ＢＤＮＦは、機能的レベルおよび形態学的レベルの双方で網膜細胞に対する神経保護効果を果たし、したがって、神経変性網膜障害の予防および／または治療を可能にすることが判明した。
【００４６】
ＢＤＮＦは、光受容体に対してだけでなく、神経節細胞、すなわち、（ｉ）視覚中枢に線維を送っている網膜の最内層の細胞、（ｉｉ）視神経線維の細胞、および（ｉｉｉ）例えば外側膝状体などの、網膜外の視覚中枢の細胞に対しても、神経保護効力が実証されている。
【００４７】
本発明は、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）を含有する眼科用製剤に関する。
【００４８】
前記眼科用製剤が含有するＢＤＮＦの濃度は、下限値の１５μｇ／μｌと２００μｇ／μｌとの間、好ましくは２０と１００μｇ／μｌとの間、さらに好ましくは３０と５０μｇ／μｌとの間の範囲であることができる。生物利用可能な総用量は、投与する眼科用製剤の体積および、ヒトを含む、治療する眼を所有している種に応じて、１投与あたり５０と４０００μｇとの間であることができる。
【００４９】
ＢＤＮＦは、単独でまたは、β−遮断薬、プロスタグランジンおよび炭酸脱水酵素阻害薬などの他の活性成分と組み合わせて投与することができる。
【００５０】
製剤は、点眼剤の形態で作製し、活性成分と相溶性でありかつ眼に許容される、薬学的に許容される担体中に、活性成分ＢＤＮＦ、または複数の活性成分を含む液剤、懸濁剤、ゲル剤または眼科用軟膏剤であってよい。
【００５１】
薬学的に許容される担体は、好ましくは０．９％の塩化ナトリウムを含有する、生理食塩水溶液であってよい。
【００５２】
少なくとも１種の薬学的に許容される担体、好ましくは、より急速に結膜から洗い流される生理食塩水溶液中での投与よりも、粘度により眼表面でのＢＤＮＦ滞留時間を長くできるようにする、タマリンド種子から抽出されたガラクトキシログルカン（ＴＳＰ）を製剤中に使用する場合には、改良ＢＤＮＦの吸収レベルを増大できることも判明した。
【００５３】
ＴＳＰ濃度は、好ましくは０．０５から２％(重量／体積−ｗ／ｖ)まで、さらにより好ましくは０．２５から０．５％(ｗ／ｖ)まで変化できる。
【００５４】
ＴＰＳは、透明で、粘弾性で、無菌であり、角膜保護に使用される。ＴＳＰはさらに、眼表面に持続性の薄膜を形成し、これが角膜および結膜を潤滑および湿潤させる。
【００５５】
さらなる好ましい一態様によると、粘性化された(Viscosified)溶液は、ヒアルロン酸、さらに好ましくは、ＴＳＰと組み合わされたヒアルロン酸を含有する。
【００５６】
ヒアルロン酸濃度は、好ましくは０．０５％から０．８％％(ｗ／ｖ)まで、さらに好ましくは０．２から０．４％(ｗ／ｖ)まで変化できる。
【００５７】
好ましい一実施形態によると、製剤は、０．９％ＮａＣｌを含有する生理食塩水溶液中に１５μｇ／μｌの濃度でＢＤＮＦを含むことができる。
【００５８】
さらなる好ましい一実施形態によると、製剤は、ＴＳＰを含む生理食塩水溶液、好ましくは０．２５％溶液中に１５μｇ／μｌの濃度でＢＤＮＦを含有できる。
【００５９】
この点眼製剤は、無傷の眼表面に局所的に直接、すなわち、非侵襲的な方法で投与でき、眼内、網膜下および眼球後の注射などの侵襲的方法の使用を回避できる。特に、この製剤は、結膜嚢内に投与できる。この製剤は、眼帯としても、またはコンタクトレンズ中にも、配合できる。
【００６０】
網膜は、部分的に隔離した中枢神経系の一部である。血液−網膜関門を含む多様な型の関門が存在し、それらは、大きな分子などの化合物が網膜に非特異的に拡散するのを防ぐ。局所的に適用された薬理活性化合物の眼内の透過は、角膜および結膜に位置する関門により、全身性吸収により、およびこれらの組織に存在する酵素によって生じる代謝性分解により、調節される。一度滴下されると、これらの薬理活性化合物は、下層にある組織を網膜まで透過するために、血液−網膜関門を含む、複雑な系の血液関門を越えて行かなければならない。
【００６１】
さらに、網膜は、視神経線維の起点となる神経節細胞を通して、外側膝状体の背側部(ｄＬＧＮ)などの視覚中枢に視神経を介して連結されている。
【００６２】
実験部分で実証するように、ＢＤＮＦは、本発明に従って局所投与する場合、網膜まで運搬でき、機能的および形態学的の双方の観点から神経保護効果を果たすレベルまでその網膜内濃度を上昇させる。
【００６３】
驚くべきことに、実験的証拠によって実証されるように、神経節細胞は、ＢＤＮＦを順行輸送でき、その結果、ＢＤＮＦが、神経節細胞の変性のみでなく視神経線維の変性、および外側膝状体などの網膜外視覚中枢への障害の拡大を予防および治療できることも判明した。
【００６４】
本発明はまた、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害、特に、失明につながる、変性性の網膜症（網膜色素変性症および緑内障など）、加齢に関連した網膜症（加齢黄斑変性症など）、血管性および増殖性の網膜障害、網膜剥離および未熟児網膜症(ＲＯＰ)ならびに糖尿病網膜症の予防および／または治療を目的として、無傷の眼表面に局所投与するための点眼剤の形態の眼科用薬剤を調製するためにＢＤＮＦを使用することに関する。本発明による製剤は、網膜、視神経および外側膝状体の神経変性障害、特に、例えば、網膜色素変性症および緑内障（先天性緑内障、小児緑内障、若年緑内障、成人緑内障、原発性開放隅角緑内障、原発性閉塞隅角緑内障、急性緑内障、医原性緑内障および続発性緑内障を含む）の予防および／または治療に有用である。
【００６５】
緑内障は、適切に治療しないと、神経節細胞の損失および視神経線維の進行性萎縮によって失明につながる、眼に影響を及ぼす一連の進行性障害のうちの１つである。
【００６６】
緑内障は、直接に（力学的に）、または網膜内層に供給する網膜血管の虚血の誘発によって間接的に、神経節細胞および視神経線維を損傷する可能性がある、眼圧（ＩＯＰ）の上昇を特徴とする。進行期において、緑内障は、網膜だけでなく、外側膝状体などの視覚中枢にも影響を及ぼす可能性があり、ついには視覚皮質が影響を受ける。
【００６７】
有効濃度のＢＤＮＦでの治療は、光に対する長期曝露（光損傷）によって誘発される光受容体変性を予防および低減するのみでなく、光に対する網膜応答を保つことも判明した。さらに、実験的緑内障モデルの使用により、ＢＤＮＦの局所適用が、動物緑内障モデルにおいて眼圧（ＩＯＰ）の上昇によって生じる網膜神経節細胞の変性を予防することが実証されている。いずれの動物モデルにおいても、ＢＤＮＦは、視覚刺激に対する網膜応答を変化させなかった。
【００６８】
以下に示す例は、本発明をさらに例示するものである。
【実施例】
【００６９】
製剤の例
・製剤１−生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する１０μｌの生理食塩水溶液に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する；
・製剤２−カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．４％カルボキシメチルセルロースナトリウムからなる溶液に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７０】
・製剤３−ＴＳＰを含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．５％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７１】
・製剤４−ヒアルロン酸（０．２％）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．４％ヒアルロン酸に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７２】
・製剤５−ヒアルロン酸（０．４％）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液および５μｌの０．８％ヒアルロン酸に、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７３】
・製剤６−ヒアルロン酸およびＴＳＰ（Ｉ）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液ならびに５μｌの０．４％ヒアルロン酸および０．４％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７４】
・製剤７−ヒアルロン酸およびＴＳＰ（ＩＩ）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液ならびに５μｌの０．８％ヒアルロン酸および０．４％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７５】
・製剤８−ヒアルロン酸およびＴＳＰ（ＩＩ）を含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦ：０．９％ＮａＣｌを含有する５μｌの生理食塩水溶液ならびに５μｌの０．４％ヒアルロン酸および０．６％ＴＳＰに、１５０μｇのＢＤＮＦを溶解する。
【００７６】
バイオアッセイ
２．１ 例−ＢＤＮＦに基づく製剤での眼の６時間局所処置後の硝子体液、網膜および視神経におけるＢＤＮＦレベルの測定。
【００７７】
・前述の、ＢＤＮＦを含有する製剤１、２および３を使用した：
この試験は、アルビノラット（Ｗｉｓｔａｒラット、Ｈａｒｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）について行った。カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む生理食塩水溶液中、またはＴＳＰを含む生理食塩水溶液中のＢＤＮＦを、局所適用により、一方の眼の結膜嚢内に滴下すると共に、対照として使用する他方の眼は、ＢＤＮＦを含ませて運ぶために使用する溶液（「プラセボ」）で処置した。
【００７８】
・網膜、硝子体液および視神経におけるＢＤＮＦレベルの測定
これらの動物を、適用の６時間後、腹腔内ウレタン注射（２０％）での深麻酔導入後に死滅させた。次いで、眼を摘出し、ＢＤＮＦで処置した眼および担体溶液のみで処置した他方の眼（対照眼）の双方の硝子体液、網膜ホモジェネートおよび視神経ホモジェネート中のＢＤＮＦレベルを測定した。この測定は、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ；ＢＤＮＦ Ｅｍａｘイムノアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）によって行った。外部から局所適用によって導入されたＢＤＮＦが、網膜細胞によって、特に、その線維で視神経を形成する網膜神経節細胞によって、吸収および運搬されるかどうかを確認するために、視神経におけるＢＤＮＦの量も測定した。
【００７９】
図１中のチャートに示した結果は、生理食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）中のＢＤＮＦの局所適用で得られたものであり、網膜（Ａ）、視神経（Ｂ）および硝子体液（Ｃ）における平均ＢＤＮＦ濃度値（ｐｇ／タンパク質のｍｇとして表す）で表している。
【００８０】
この統計解析は、ＢＤＮＦで処置した眼を対照眼と比較して、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。すべての場合において、処置した眼と対照眼との間の差は、統計的に有意であった（＊、ｐ＜０．０５）。
【００８１】
図２中のチャートに示した結果は、カルボキシメチルセルロースナトリウム（０．２％）を含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用に関するものであるのに対し、図３中のチャートに示している結果は、ＴＳＰ（０．２５％）を含む溶液中のＢＤＮＦの局所適用で得られたものである。いずれの場合も、その統計解析は、ＢＤＮＦで処置した眼を対照眼と比較して、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。すべての場合において、処置した眼と対照眼との間の差は、統計的に有意であった（＊、ｐ＜０．０５）。
【００８２】
図４は、使用した各種の溶液／担体について、網膜におけるＢＤＮＦの比較レベルを示している。この解析により、異なる溶液／担体の効力を同一のＢＤＮＦ濃度（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）で比較することが容易になる。ＴＳＰ中のＢＤＮＦでの局所処置は、使用した他の２種の製剤、すなわち、生理食塩水溶液中のＢＤＮＦおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦよりも有意に高いＢＤＮＦの網膜内レベルを生じた（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定＊、ｐ＜０．０５）。カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦでの局所処置は、網膜内ＢＤＮＦレベルを上昇させるのに最も有効性の低いことが判明した。
【００８３】
２．２ 例−ＴＳＰ中のＢＤＮＦを用いた眼の局所処置後の異なる時間における、網膜、硝子体液および視神経におけるＢＤＮＦレベルの測定
単回局所適用後に、網膜、硝子体液および視神経においてＢＤＮＦが高く維持される範囲を調べた。この試験は、網膜、視神経および硝子体液へのＢＤＮＦの強膜を横切る通過を促進するのに最も有効であると判明した、ＴＳＰを含有する担体を用いて行った。次いで、ＴＳＰを使用して、眼の局所処置後の網膜、硝子体液および視神経におけるＢＤＮＦレベルの動態を試験した。各試験群においてＮ＝５の眼を処置した。ＢＤＮＦを含有するＴＳＰの０．２５％溶液（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）の適用後に異なる時間間隔で網膜、視神経および硝子体液中のＢＤＮＦ濃度を測定した。対照眼は、０．２５％ＴＳＰを含有する担体溶液のみで処置した。この実験は、単回局所適用後のＢＤＮＦレベルの時間傾向を確認するために行った。このチャートは、適用の６、１２および２４時間後の網膜、視神経および硝子体液中の平均ＢＤＮＦ値（ｙ軸；ｐｇ／ｍｌ）を示している。図５は、網膜内のＢＤＮＦレベルが、統計的に高く維持され、１２〜２４時間においてベースラインレベルに戻ることを示している。この統計解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。Ａ＊では、対照眼と比較してｐ＜０．０１。この実験の結果は、特にＴＳＰをベースとする人工涙液で運ばれるＢＤＮＦでの長期処置において、網膜内で高いＢＤＮＦレベルを維持するのには、１２時間毎に１回の局所適用で十分であることを示唆している。
【００８４】
２．３ 例−ＢＤＮＦをベースとする製剤の局所適用の神経保護効果
結膜嚢内の局所適用による処置後のＢＤＮＦの神経保護効果を確認するために、動物モデルにおいて、光損傷によって網膜変性症が誘発される試験的モデルを使用した。このモデルは、強い光源に対する長期曝露によって誘発される網膜光受容体の変性を研究するために広く使用されている（Ｌａ Ｖａｉｌら、１９８７；Ｒｅｘら、２００３）。光受容体の死は、アポトーシスによって生じ、また、視色素ロドプシンによる光子の過度の吸収によって引き起こされ、最終的に色素沈着した上皮細胞に関与する、色素再生サイクルの変化を導く。試験した実験動物モデルは、光に対するその光受容体の顕著な感受性を考慮して、アルビノラット（Ｓｕｒａｃｅら、２００５）であった。使用した実験プロトコルは、最初にＬａＶａｉｌのグループによって提案されたもの（ＬａＶａｉｌら、１９８７）から変更（Ｒｅｘら、２００３）および拡張した。
【００８５】
ＢＤＮＦをベースとする以下の製剤を使用した：
ａ）０．２５％ＴＳＰ溶液中のＢＤＮＦ（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）
ｂ）生理食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）中のＢＤＮＦ（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）
ｃ）カルボキシメチルセルロースナトリウムの０．２％溶液中のＢＤＮＦ（１５０μｇのＢＤＮＦを含有する１０μｌの溶液）。
【００８６】
ラットの眼を前記製剤で処置し、それらのラットに光損傷を受けさせた。対照眼は、担体溶液のみで処置した。各試験群においてＮ＝４の眼を処置した。特に、６時間の処置後（ＢＤＮＦで処置した眼および担体溶液のみで処置した対照眼）、これらのラットに、光に対する長期曝露を４８時間受けさせた（動物光損傷モデル、光源強度１０００ｌｕｘ）。光に対するこの長期曝露は、アルビノラットの網膜内の多数の光受容体の変性を誘発する。ＢＤＮＦによって行われる神経保護は、光受容体の残存を評価するように設計された形態学的方法によって、および光に対する網膜応答を記録すること（フラッシュ網膜電図［ＥＲＧ］、これは、網膜障害を患う患者における外側の網膜の機能的状態を評価するのに広く使用される）による機能的方法によって検証した。ラットでは、明順応条件下でＥＲＧ応答の基礎を形成している錐体の数が少ないこと、およびアルビノラットでは、明順応条件におけるＥＲＧの振幅が減少していることを考慮して、ラットの網膜を主に構成している桿体の応答を表すフラッシュＥＲＧのみを暗順応適応条件下で記録した。この（暗順応の）フラッシュＥＲＧを、光損傷期間の終了の７日後に記録した。
【００８７】
−製剤ａ）
図６は、暗順応適応条件下での輝度によるフラッシュＥＲＧのｂ波の振幅を示している。図６中のチャートで明らかに示されるように、局所的に適用されたＴＳＰ中のＢＤＮＦは、フラッシュへの網膜応答（フラッシュＥＲＧ）に対する光損傷の影響を有意に低減する。実際に、ＢＤＮＦで処置した眼の振幅（μＶで表される平均振幅値）は、対照眼のものを有意に超える（＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ））。
【００８８】
−製剤ｂ）
図８は、暗順応適応条件下での輝度によるｂ波の振幅を示している。これらの結果は、生理食塩水溶液中のＢＤＮＦも、光損傷によって誘発される、光に対する網膜応答（フラッシュＥＲＧ）の変化を低減できることを示している。ＢＤＮＦで処置したラットの光損傷を受けた眼におけるｂ波の振幅は、対照眼について記録されたものを超える。生理食塩水中のＢＤＮＦで処置した眼の振幅（μＶで表される平均振幅値）は、対照眼のものを有意に超える（＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ））。
【００８９】
−製剤ｃ）
図１０は、暗順応の条件下での輝度によるｂ波の振幅を示している。この図より、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦで処置した眼の振幅（μＶで表される平均振幅値）は、最も高い輝度値でのみ対照眼のものを有意に超える（＊、ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ））ことが示される。結論として、光に対する網膜応答の機能的回復の観点から、カルボキシメチルセルロースナトリウムは、光に対する網膜応答の障害の予防において、ＴＳＰおよび生理食塩水溶液よりも有効性が低いことが判明した。
【００９０】
続いて、網膜の光受容体の変性に対する、前記ＢＤＮＦをベースとする製剤での局所処置の効果を、フラッシュＥＲＧを記録した眼の網膜において評価した。
【００９１】
光受容体変性に対する、ＢＤＮＦでの局所処置の効果を、光損傷後に残存した光受容体の列数を計測することおよび光受容細胞体を含む網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを測定することによって定量した。これらの測定を行うために、光受容体核をヨウ化プロピジウムで標識した。
【００９２】
−製剤ａ）
図７に、得られた結果を示している。図７Ａは、（０．２５％ＴＳＰ中の）ＢＤＮＦで処置した眼および対照眼の網膜断面を示している。これらの測定を行うために、光受容体核をヨウ化プロピジウムで標識した。使用する方法（光受容細胞体の列数（図７Ｂ）または外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さ（図７Ｃ）の計測）にかかわらず、中心部および周辺部の網膜に存在する光受容体は、ＢＤＮＦで処置した眼において、担体で処置した眼（対照）よりも有意に（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定＊、ｐ＜０．００１）多い。
【００９３】
その後、ＴＳＰ中のＢＤＮＦは、結膜嚢内に局所的に適用されたときに、網膜を光損傷から保護することも実証された。
【００９４】
−製剤ｂ）
図９（Ａ）は、（生理食塩水溶液、０．９％ＮａＣｌ中の）ＢＤＮＦで処置した右眼および生理食塩水溶液のみで処置した左（対照）眼の網膜断面を示している。光受容体変性に対する、ＢＤＮＦでの局所処置の効果を、光損傷後に残存した光受容体の細胞体の列数を計測すること（図９Ｂ）または光受容細胞体を含む網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さを測定すること（図９Ｃ）によって定量した。処置した眼の網膜と対照眼の網膜との間の差（光受容体の列数またはＯＮＬの厚さの計数）は、中心部および周辺部の網膜の双方において有意であることが判明した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定＊、ｐ＜０．００１）。
【００９５】
生理食塩水中のＢＤＮＦでの局所処置は、眼において光損傷後に残存する光受容体の数を対照眼と比較して増加させる。
【００９６】
−製剤ｃ）
最後に、光受容体変性に対する、ＢＤＮＦ（カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中の）での局所処置の効果を、光損傷後に残存した光受容体の細胞体の列数（図１１Ｂ）および光受容細胞体を含む網膜の外顆粒層（Outer Nuclear retina）（ＯＮＬ）の厚さ（図１１Ｃ）を測定することによって定量した。
【００９７】
得られた結果を考慮して、光損傷後の光受容体変性の機能的回復および予防の観点から、ＴＳＰ中および生理食塩水溶液中のＢＤＮＦでの局所処置は、光損傷に対して神経保護効果を及ぼすが、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む溶液中のＢＤＮＦでの処置は、同一のＢＤＮＦ濃度での有効性がより低いと結論づけることができる。
【００９８】
ＢＤＮＦでの処置は、網膜における機能的変化を誘発せず、視覚刺激物質に対するその応答が損なわれることも実証された。
【００９９】
２．４ 例。試験的緑内障モデルにおいてＢＤＮＦの反復局所適用によって誘発される神経保護効果
緑内障は、多様な原因を有する網膜の変性性障害であり、様々な型がある（これは、年齢に基づいて、先天性緑内障、小児緑内障、若年緑内障または成人緑内障として；また、疾病原因に基づいて原発性緑内障：原発性開放隅角緑内障または原発性閉塞隅角緑内障；および、医原性緑内障を含む、他の障害によって誘発される続発性緑内障として、分類される）。最も一般的な形態の緑内障、すなわち、原発性開放隅角緑内障(ＰＯＡＧ)は、眼圧上昇を特徴とする。眼圧上昇により、視神経の萎縮に関連した神経節細胞の機能障害およびその後の変性が引き起こされ、症状は緩やかな視力の喪失であり、失明に至る。上昇した眼圧(ＩＯＰ)が、篩板内の視神経線維に機械的な障害ならびに視神経乳頭および網膜内層の虚血性変化を誘発するというのが一般的な仮説であるが、視神経の萎縮と共に神経節細胞の機能障害および変性を引き起こす機序は、まだ完全には明らかになっていない。近年、薬理学的治療は、ＩＯＰを低減することを目的としてきたが、かなりの数の患者が現在の薬理学的治療に対して抵抗性であり、視覚機能の進行性の不可逆的喪失に苦しんでいる。現在、視覚能力低下の予防および正常視力の回復を目的として網膜神経節細胞および視神経線維の神経保護を達成するように設計された薬剤はない。本特許において、本発明者らは、進行性の機能障害とそれに続く神経節細胞の変性および死に対抗するように安定な方法で網膜内ＢＤＮＦレベルを上昇させるための、結膜嚢におけるＢＤＮＦによる局所治療の使用を提案する。この提案は、ＴｒｋＢと称するＢＤＮＦ受容体が神経節細胞内で発現されるという実証（Ｊｅｌｓｍａら、１９９３）に部分的に基づいている。本発明者らは、仮説を検証するために、突発性緑内障の最も一般的な実験モデルである、ＤＢＡ／２Ｊと称される二重変異マウス（Ｊｏｈｎら、１９９８;Ｃｈａｎｇら、１９９９）を使用した。ＤＢＡ／２Ｊマウスは、２つの別個の遺伝子のホモ接合性変異を示す。１つ目は、メラノソームタンパク質をコードするチロシン関連タンパク質（Ｔｙｒｐ１−／−）であり、２つ目は、膜糖タンパク質（Ｇｐｎｍｂ−／−）である。このマウスは、構造化された視覚刺激に対する網膜応答の進行性の喪失を伴う進行性の眼圧上昇を特徴とし、これは、内側の網膜／神経節細胞に依存している。ヒトおよび動物モデルにおいて、この網膜応答は、パターン網膜電図（Ｐ−ＥＲＧ）と称される（Ｄｏｍｅｎｉｃｉら、１９９１；ＶｅｎｔｕｒａおよびＰｏｒｃｉａｔｔｉ、２００６；Ｆａｌｓｉｎｉら、２００８）。神経節細胞の機能障害に続いて、視神経線維の進行性の萎縮を伴う前記細胞の変性が起こる（Ｖｅｎｔｕｒａら、２００６）。図１２に示されるように、このマウス緑内障モデル（ＤＢＡ／２Ｊ）において、ＩＯＰは出生５カ月後に上昇し始める。６．５カ月で、ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｎ＝１０）におけるＩＯＰは、すでに、正常マウス（Ｃ５７ｂｌ／６Ｊ；Ｎ＝５）および月齢５カ月のＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｎ＝９）において測定されたものよりも有意に高いと思われる（ｔ検定；＊ｐ＜０．０５）。図１３中のチャートは、構造化された視覚刺激（刺激として使用した視覚的パターンは、空間周波数＝０．２Ｃ／ｄｅｇおよび９０％コントラストでの輝度のプロファイルであった）に対する内網膜／神経節細胞の応答の振幅（Ｐ−ＥＲＧ）を、増幅器およびオンライン分析用のコンピュータに連結された角膜電極で記録されたものを示している。図１３に示しているように、このＰ−ＥＲＧは、月齢７カ月のＤＢＡ／２Ｊマウス（ＣＴＲＬ、Ｎ＝４）においてすでに変化している（Ｐ−ＥＲＧ振幅における有意な減少；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。月齢６．５カ月から、すなわち、ＩＯＰが安定に上昇したときから（図１２）、一方の眼にはＴＳＰ中のＢＤＮＦ（４８時間毎に１回の処置）および他方（対照眼）には担体の２週間の反復局所適用処置を行った。３つの異なるＢＤＮＦ濃度：１、５および１５μｇ／μｌを使用した（１群Ｎ＝４のＤＢＡ／２Ｊマウス）。ヒストグラムに示されるように、ＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて、１５μｇ／μｌの濃度のＢＤＮＦ（０．２５％ＴＳＰを含有する１０μｌの溶液中１５０μｇ、眼科用製剤ａ）での局所処置は、Ｐ−ＥＲＧの変化を予防した（処置した眼のデータを対照眼と比較されたい；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊ｐ＜０．０５）が、１および５μｇ／μｌの濃度では予防しなかった。Ｐ−ＥＲＧの変化が、免疫組織化学的方法で標識した神経節細胞の変化と対応するかどうかを確認するために、本発明者らは、神経節細胞において発現される転写因子、Ｂｒｎ３ｂを使用した。この因子に関する変異体マウス（Ｂｒｎ３ｂ−／−）は、神経節細胞の変化を伴う（Ｂａｄｅａら、２００９）。図１４Ａは、神経節細胞を蛍光抗体で緑に標識して、共焦点顕微鏡法によって解析した、網膜標本の拡大を示している。ＤＢＡ／２Ｊマウスの眼において、標識神経節細胞の数は、中心部および周辺部の網膜の双方で、明らかにより少ない。図１４Ｂは、密度（細胞個数／ｍｍ２）の観点からの、標識された細胞の定量を示している。ＴＳＰ中の１５μｇ／μｌの濃度のＢＤＮＦでの２週間の処置は、担体溶液のみで処置した対照眼と比較して、Ｂｒｎ３ｂで標識される細胞の減少を防止した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。
【０１００】
報告したデータから、ＢＤＮＦでの反復局所処置は、神経節細胞の機能的変化を予防し、実験緑内障モデルにおいて網膜の視覚能力を回復させるという結論が導かれる。神経節細胞の機能に対する保護効果を発揮できるＢＤＮＦの最小有効濃度は、１５μｇ／μｌである。
【０１０１】
参考文献一覧
【０１０２】
【表１−１】
【０１０３】
【表１−２】
【０１０４】
【表１−３】
【０１０５】
【表１−４】
【０１０６】
【表１−５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を少なくとも１５μｇ／μｌの濃度で含む、点眼剤の形態の眼科用製剤。
【請求項２】
ＢＤＮＦが１５から２００μｇ／μｌまでの範囲である、請求項１に記載の眼科用製剤。
【請求項３】
薬学的に許容される担体として生理食塩水溶液をさらに含む、請求項１または２に記載の眼科用製剤。
【請求項４】
生理食塩水が０．９％の塩化ナトリウムをさらに含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項５】
薬学的に許容されるさらなる担体として、粘性化された溶液をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項６】
粘性化された溶液が、タマリンド種子から抽出された多糖類（ＴＳＰ）を含む溶液である、請求項５に記載の眼科用製剤。
【請求項７】
ＴＳＰ濃度が０．０５から２％ｗ／ｖの範囲である、請求項６に記載の眼科用製剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項９】
粘性化された溶液が、ＴＳＰおよびヒアルロン酸を含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項１０】
網膜、視神経および外側膝状体の神経変性疾患の予防および／または治療に使用するための、ＢＤＮＦを含む点眼剤の形態の眼科用製剤。
【請求項１１】
網膜色素変性症の予防および／または治療に使用するための、請求項１０に記載の眼科用製剤。
【請求項１２】
慢性単性緑内障の予防および／または治療に使用するための、請求項１０に記載の眼科用製剤。
【請求項１】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を少なくとも１５μｇ／μｌの濃度で含む、点眼剤の形態の眼科用製剤。
【請求項２】
ＢＤＮＦが１５から２００μｇ／μｌまでの範囲である、請求項１に記載の眼科用製剤。
【請求項３】
薬学的に許容される担体として生理食塩水溶液をさらに含む、請求項１または２に記載の眼科用製剤。
【請求項４】
生理食塩水が０．９％の塩化ナトリウムをさらに含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項５】
薬学的に許容されるさらなる担体として、粘性化された溶液をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項６】
粘性化された溶液が、タマリンド種子から抽出された多糖類（ＴＳＰ）を含む溶液である、請求項５に記載の眼科用製剤。
【請求項７】
ＴＳＰ濃度が０．０５から２％ｗ／ｖの範囲である、請求項６に記載の眼科用製剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項９】
粘性化された溶液が、ＴＳＰおよびヒアルロン酸を含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【請求項１０】
網膜、視神経および外側膝状体の神経変性疾患の予防および／または治療に使用するための、ＢＤＮＦを含む点眼剤の形態の眼科用製剤。
【請求項１１】
網膜色素変性症の予防および／または治療に使用するための、請求項１０に記載の眼科用製剤。
【請求項１２】
慢性単性緑内障の予防および／または治療に使用するための、請求項１０に記載の眼科用製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５１０８４４（Ｐ２０１３−５１０８４４Ａ）
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３８４３４（Ｐ２０１２−５３８４３４）
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００３２２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５８４４９
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５１２１２７２７９）エイチエムエフアールエイ ハンガリー リミテッド ライアビリティー カンパニー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＭＦＲＡ ＨＵＮＧＡＲＹ ＬＩＭＩＴＥＤ ＬＩＡＢＩＬＩＴＹ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００３２２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５８４４９
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５１２１２７２７９）エイチエムエフアールエイ ハンガリー リミテッド ライアビリティー カンパニー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＭＦＲＡ ＨＵＮＧＡＲＹ ＬＩＭＩＴＥＤ ＬＩＡＢＩＬＩＴＹ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]