Ｃ型肝炎ウイルスの免疫測定方法及びそれに用いる試薬キット
【課題】
本発明は、ＨＣＶを高感度に検出できる、免疫複合体転移測定法、及びそれに用いる試薬キットを提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明の第１の局面の免疫測定方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない。
本発明は、ＨＣＶを高感度に検出できる、免疫複合体転移測定法、及びそれに用いる試薬キットを提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明の第１の局面の免疫測定方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法、及びそれに用いる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる伝染性の疾病である。Ｃ型肝炎は予防法が確立されていないばかりか、感染者（キャリア）の多くは１０〜３０年で肝硬変や肝癌へ移行することが推定されており、ＨＣＶへの感染の早期発見と早期治療は非常に重要である。
【０００３】
Ｃ型肝炎の原因となるＨＣＶは、直径約６０ｎｍのＲＮＡウイルスで、エンベロープをもつ。ＨＣＶ ＲＮＡは一本鎖プラス鎖で、約９５００塩基配列よりなっている。遺伝子構造はフラビウィルスに類似しており、５’末端と３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）があり、この間に約３０００アミノ酸をコードする翻訳領域が存在する。翻訳領域は、５’側より、構造タンパクをコードするコア領域、エンベロープ領域１、エンベロープ領域２があり、これに続いて非構造領域が存在する。
【０００４】
ＨＣＶ検査としては、コア領域がコードするＨＣＶコア蛋白を抗原として用いた抗体測定法が知られている。しかしながら、上記抗体測定法によるＨＣＶ検査では、ＨＣＶに感染し、抗体が産生されるまでＣ型肝炎を検出することができない。そのため、ＨＣＶの早期発見が困難である。また抗体検査は、原理上、感染後治癒した者か、あるいは活動性の感染者かを判別することが出来ないことが問題である。
【０００５】
ここで、そのような問題を解決するＨＣＶ検査として、ＨＣＶ抗原を直接検出する方法がある。このような方法としては、ＨＣＶのコア抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、血清中のコア抗原を検出する方法が知られている（特許文献１、特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、ＨＣＶ感染患者内ではウイルス粒子自体が極めて少ないため、上記の測定法よりもさらに高感度なＨＣＶの検出法が望まれている。
【０００７】
ここで、抗原を高感度に検出するための方法として、免疫複合体転移測定法が知られている（特許文献３、特許文献４）。この免疫複合体転移測定法は、測定対象物質を含む免疫複合体を、２種類以上の固相間で移動させたのち、固相上の免疫複合体を測定することを特徴とする方法である。測定対象物質を含む免疫複合体を、２種類以上の固相間で移動させることで、夾雑物質が除かれ、検出系における非特異的信号を減少させることができる。その結果、免疫複合体転移測定法を用いることで、測定対象物質を高感度に検出することができる。
しかしながら、Ｃ型肝炎の原因となるＨＣＶは、ＲＮＡウイルス種であり、高度の変異を起こすことが知られている。たとえば、配列番号２に示されるＨＣＶジェノタイプ１ｂのコア領域蛋白質の４９番目のアミノ酸に変異があった場合、上記公知の抗体を用いた上記免疫複合体転移測定法でＨＣＶを測定しても、高感度に検出できない場合があった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３１７６５７０号
【特許文献２】特許第３６２３１６２号
【特許文献３】特開平１−２５４８６８
【特許文献４】特開平２−２８５５８
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Journal 0f Clinical Microbiology, Sept. 2000, p.3450-3452
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、ＨＣＶを高感度に検出できる、免疫複合体転移測定法、及びそれに用いる試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の局面の免疫測定方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない。
本発明の第２の局面のＨＣＶの免疫測定試薬キットは、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体を含む第１試薬と、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体を含む第２試薬と、第１固相と、第１抗体及び第１固相と結合する第２抗体を含む第３試薬と、第１抗体と結合する物質が固定化された第２固相と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含ない。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の免疫測定方法及び試薬キットを用いれば、ＨＣＶを高感度に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列番号２に示される４９番目のアミノ酸が異なるＨＣＶコア蛋白（ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ及びＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７）に対する、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体（ＨＣＦ４−８０１及びＨＥ２５）の反応性を示す図である。
【図２】ＨＣＶの各ジェノタイプについて、ＨＣＶ−ＲＮＡ量と発光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施形態における免疫測定方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない。
【００１５】
ここで、本実施形態における標識抗体は、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体である。本実施形態における、好ましい標識抗体の結合部位としては、配列番号２に示される２１番目〜３０番目又は４１番目〜４８番目のアミノ酸配列が挙げられる。
【００１６】
また、本実施形態における第１抗体は、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体である。好ましい第１抗体の結合部位としては、配列番号２に示される２１番目〜３０番目又は４１番目〜４８番目のアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、例えば、標識抗体として、結合部位が配列番号２に示される２１番目〜３０番目のアミノ酸配列である抗体を用いた場合、第１抗体としては、結合部位が配列番号２に示される４１番目〜４８番目のアミノ酸配列である抗体を用いることができる。また、標識抗体として、結合部位が配列番号２に示される４１番目〜４８番目のアミノ酸配列である抗体を用いた場合、第１抗体としては、結合部位が配列番号２に示される２１番目〜３０番目のアミノ酸配列である抗体を用いることができる。本実施形態においては、標識抗体として、結合部位が配列番号２に示される２１番目〜３０番目のアミノ酸配列である抗体を用い、第１抗体として、結合部位が配列番号２に示される４１番目〜４８番目のアミノ酸配列である抗体を用いることが好ましい。
【００１７】
本実施形態における免疫測定方法は、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する（以下、形成工程という場合がある）。
【００１８】
標識抗体は、免疫測定方法で一般的に用いられる公知の標識物質により標識されている。標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐなどが挙げられる。本実施形態における標識物質としては、酵素が好ましい。
【００１９】
標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質は、標識物質として用いる酵素に応じて、適宜公知の基質を選択すればよい。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合の基質としてはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標登録）、（４−クロロ−３−（メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（商標登録）（３−（４−メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発光基質；４−メチルウムベリフェニル・ホスフェート（４ＭＵＰ）などの蛍光基質；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。
【００２０】
なお、標識抗体は、当該分野において公知の方法で作成することができる。例えば、抗体のチオール（−ＳＨ）を用いて上記の標識物質を抗体と結合させる方法が知られている。より具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、抗体と反応させることにより、抗体を標識物質で標識できる。
【００２１】
第１固相は、従来の免疫測定方法で用いられる通常の第１固相であれば特に制限されない。第１固相の材料としては、例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーンなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。また、第１固相の形状も、免疫測定方法に用いられる通常の第１固相の形状であれば特に限定されない。例えば、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、ナノ粒子などが挙げられる。
【００２２】
本実施形態における第１固相としては、粒子が好ましい。ここで、粒子は、免疫測定法で用いられる公知の粒子であれば、特に制限されない。具体的な粒子としては、例えば、磁性粒子、ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。本実施形態における粒子としては、磁性粒子が好ましい。ここで、磁性粒子としては、磁性を有する材料を基材として含み、通常の免疫測定に用いられる粒子であれば、特に限定されない。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材としてＦｅ２Ｏ３および／またはＦｅ３Ｏ４、コバルト、ニッケル、フィライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。
【００２３】
ここで、標識抗体とＨＣＶコア蛋白とは、抗原抗体反応により結合し、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白複合体を形成する。さらに、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白複合体とは、抗原抗体反応により結合し、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を形成する。なお、第１抗体とＨＣＶコア蛋白とが抗原抗体反応により結合し、ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を形成し、ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と標識抗体とが抗原抗体反応により結合し、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を形成してもよい。
【００２４】
また、本実施形態における形成工程では、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を第１固相に結合させることで、標識抗体とＨＣＶコア蛋白と第１抗体とを含む複合体を、第１固相上に形成させる。
【００２５】
ここで、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合は、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相とを結合でき、かつ後述する転移工程で解離可能な結合であればよく、特に限定されない。例えば、第１固相と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体とが、物理的吸着により結合することができる。また、粒子と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体とが、イオン結合により結合することができる。また、第１抗体に第１固相結合部位を結合させ、第１固相に第１固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化することでも、第１固相と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体とを結合させることが出来る。本実施形態における標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合は、第１固相結合部位と結合物質による結合が好ましい。
【００２６】
第１固相結合部位と結合物質の組み合わせとしては、第１固相結合部位と結合物質が特異的に結合可能で、かつ所定の条件で解離可能な物質の組み合わせであれば特に限定されない。このような物質の組み合わせとして、例えばリガンドとレセプター、レクチンと糖鎖、ビオチンとアビジン、ＤＮＡハイブリット、及び抗原と抗体（第２抗体）などが挙げられる。本実施形態における上記物質の組み合わせとしては、抗原と抗体（第２抗体）が好ましい。
【００２７】
ここで、抗原と抗体（第２抗体）の組み合わせとしては、ハプテンと抗ハプテン抗体、デスチオビオチンと抗ビオチン抗体、及びＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体などが挙げられる。本実施形態における、抗原と抗体（第２抗体）の組み合わせとしては、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体が好ましい。
【００２８】
本実施形態における免疫測定方法は、第１固相上に形成された複合体（標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体）を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する（以下、転移工程という場合がある。）
【００２９】
標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を、第１固相から遊離する方法は、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合の種類により適宜選択すればよく、特に制限されない。例えば、上記結合が物理的吸着による結合ならば、界面活性剤を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がイオン結合ならば、イオンを含む溶液を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合が第１固相結合部位と結合物質による結合ならば、第１固相結合部位と結合物質の組み合わせにより適宜選択すればよく、特に制限されない。例えば、上記結合がリガンド−レセプターによる結合ならば、リガンドまたはリガンド類似体を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がレクチン−糖鎖による結合ならば、糖質を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がビオチン−アビジンによる結合ならば、ビオチンを用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がＤＮＡハイブリットによる結合ならば、温度を上昇させることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がハプテン−抗ハプテン抗体による結合ならば、ハプテンあるいはハプテン誘導体を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がデスチオビオチン−抗ビオチン抗体による結合ならば、ビオチンを用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体による結合ならば、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。
【００３０】
次に、遊離した標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第２固相とを結合させる。
【００３１】
第２固相は、従来の免疫測定方法で用いられる通常の第２固相であれば特に制限されない。第２固相の材料としては、例えば、第１固相と同様の材料を用いることが出来る。また、第２固相の形状も、第１固相の形状と同様の形状を用いることが出来る。本実施形態における第２固相としては、マイクロタイタープレートが好ましい。
【００３２】
ここで、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第２固相との結合は、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合と異なる結合であれば、特に制限されない。例えば、上記複合体と第１固相との結合が、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体結合である場合、上記複合体と第２固相との結合としては、ハプテン−抗ハプテン抗体結合、ＤＮＡハイブリット結合、イオン結合、ビオチン−アビジン結合などが挙げられる。上記複合体と第１固相との結合が、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体結合である場合、本実施形態における、上記複合体と第２固相との結合としては、ビオチン−アビジン結合が好ましい。
【００３３】
本実施形態における免疫測定方法は、第２固相に転移された複合体の標識を測定する（以下、測定工程という場合がある）。ここで、測定工程は、上述の標識抗体に用いた標識物質の種類に応じて、適宜適切な測定方法で行えばよく、特に限定されない。例えば、該標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることにより発生する光、色などを適切な装置を用いて測定することにより行うことができる。該装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。また、標識物質が放射性同位体である場合、シンチレーションカウンターなどの従来公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００３４】
本実施形態における免疫測定方法は、第１固相が粒子である場合、ＨＣＶを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、アルカリ性物質を含有する試薬で処理された試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、複合体が形成された粒子を洗浄する洗浄工程と、をさらに含み、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも１つが還元剤を含有することができる。
【００３５】
第１処理工程は、ＨＣＶを含む疑いのある試料と、アルカリ性物質を含有する試薬を混合する処理であれば、特に限定されない。第１処理工程を行うことにより、ＨＣＶからＨＣＶコア蛋白を遊離することができる。ここで、第１処理工程における、処理時間や処理温度は、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第１処理工程における処理時間や処理温度としては、例えば、第１処理工程において、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の濃度が２〜４％で、尿素の濃度が２〜４Ｍで、水酸化ナトリウムの濃度が０．１〜０．４Ｎの試薬を用いる場合、２０〜３０℃の処理温度で６〜１０分の処理時間で第１処理工程を行うことができる。
【００３６】
ここで、ＨＣＶを含む疑いのある試料は、生体試料又は生体試料から調製された試料が好ましい。生体試料及び生体試料から調製された試料としては、例えば、尿、糞便、全血、血漿、血清、胆汁、胃腸分泌物、リンパ液、精液、骨髄液、唾液、母乳、組織抽出液、組織ホモジネート、細胞抽出液、細胞ホモジネートなどが挙げられる。
【００３７】
本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらに非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。ここで、非イオン性界面活性剤は、公知のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができる非イオン性界面活性剤であれば、特に限定されない。本実施形態における非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好ましい。具体的なポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Triton X-100、Triton X-114及びNP-40等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween-20及びTween-80等）、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij35及びBrij45等）などが挙げられる。本実施形態におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３８】
第１処理工程における、非イオン性界面活性剤の濃度は、使用する非イオン性界面活性剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを用いる場合、第１処理工程における、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの濃度は２〜４％が好ましい。
【００３９】
また、本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらにカオトロピック剤を含有することが好ましい。ここで、カオトロピック剤は、蛋白質の分子構造を不安定化する性質を持つ物質であり、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、サルチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド及びホルムアルデヒドなどが挙げられる。本実施形態におけるカオトロピック剤としては、尿素が好ましい。
【００４０】
第１処理工程における、カオトロピック剤の濃度は、使用するカオトロピック剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、カオトロピック剤として尿素を用いる場合、第１処理工程における、尿素の濃度は２〜４Ｍが好ましい。
【００４１】
アルカリ性物質は、上述のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができるアルカリ性物質であれば、特に限定されない。ここで、アルカリ性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化マグネシウムなどが挙げられる。本実施形態におけるアルカリ物質としては、水酸化ナトリウムが好ましい。
【００４２】
第１処理工程における、アルカリ性物質の濃度は、使用するアルカリ性物質の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、アルカリ性物質として、水酸化ナトリウムを用いる場合、第１処理工程における水酸化ナトリウムの濃度は、０．１５〜０．５Ｎが好ましい。
【００４３】
なお、本実施形態における、アルカリ性物質を含有する試薬は、非イオン性界面活性剤とカオトロピック剤とを含有する試薬、及びそれぞれの成分を二つ以上の試薬に分けて含有する試薬キットが含まれる。ここで、試薬キットとしては、例えば、非イオン性界面活性剤及びカオトロピック剤を含有する第１試薬と、アルカリ性物質を含有する第２試薬とを備えた試薬キットなどが挙げられる。
【００４４】
第２処理工程では、第１処理工程で得られた試料と、酸性物質を含有する試薬とを混合し、第１処理工程で得られた試料のアルカリを中和する。第２処理工程で得られる試料のｐＨは、形成工程に影響を及ぼさないｐＨであることが好ましい。より具体的な第２処理工程で得られる試料のｐＨとしては、ｐＨ６．５〜８が好ましい。ここで、具体的な第２処理工程における処理時間や処理温度としては、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第２処理工程における処理時間や処理温度としては、２０〜３０℃の処理温度で３〜１５分である。
【００４５】
酸性物質は、特に限定されないが、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸、硫酸などが挙げられる。本実施形態における酸性物質としてはクエン酸が好ましい。ここで、第２処理工程で用いられる酸性物質を含有する試薬における、酸性物質の濃度は、使用する酸性物質や上述の第１処理工程で使用されたアルカリ性物質などに応じて、適宜調整すればよく、特に制限されない。上記酸性物質の濃度としては、例えば、酸性物質がクエン酸の場合、０．１〜０．３Ｍが好ましい。
【００４６】
ＨＣＶを含む疑いのある試料は、上述の第１処理工程及び第２処理工程により希釈される。ここで、第１処理工程及び第２処理工程後における、ＨＣＶを含む疑いのある試料の希釈は、ＨＣＶを含む疑いのある試料の種類に応じて、適宜調整すれば良い。例えば、上記試料が血清の場合、免疫測定に対する血清成分等の影響を抑制し、且つ、ＨＣＶコア蛋白を検出可能な濃度にする観点から、第１処理工程及び第２処理工程後における、血清の希釈は、３〜５倍が好ましい。
【００４７】
洗浄工程では、液体中に分散していた粒子を集め、液体を除去し、その後、洗浄液を添加して再び粒子を液体中に分散させる。この洗浄工程を行うことにより、識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体の形成に使用されなかった標識抗体、非イオン性界面活性剤、及びカオトロピック剤などの測定工程において不要又は悪影響を及ぼす成分を除去することができる。
【００４８】
洗浄工程における、液体中に分散していた粒子を集める方法は、粒子を用いた免疫測定法において公知であり、使用する粒子に応じて適宜設定することができる。例えば、粒子として磁性粒子を用いた場合、磁気分離により、液体中に分散していた粒子を集めることができる。より具体的には、まず、第２処理工程で得られた試料が入った容器の壁面に磁石を近づけ、磁石を用いて試料中の粒子を容器の壁面に固定する。そして、粒子を容器の壁面に固定した状態で液体を吸引除去する。粒子として磁性粒子を用いた場合、以上のようにすることで、液体中に分散していた粒子を集めることができる。また、粒子としてゼラチン粒子またはラテックス粒子を用いた場合、遠心分離により、液体中に分散していた粒子を集めることができる。より具体的には、まず、第２処理工程で得られた試料を遠心分離することで、遠心力により粒子を沈殿させる。そして、粒子を沈殿させた状態で液体を吸引除去する。粒子としてゼラチン粒子またはラテックス粒子を用いた場合、以上のようにすることで、液体中に分散していた粒子を集めることができる。
【００４９】
さらに、洗浄工程では、洗浄液を添加して粒子を懸濁し、再び粒子を液体中に分散させる。ここで、洗浄液としては、粒子上に形成された複合体に影響を及ぼさない緩衝液が好ましい。また、洗浄液は、界面活性剤を含有する緩衝液が特に好ましい。より具体的な洗浄液としては、たとえば、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）及びＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）などが挙げられる。なお、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）などの、市販の洗浄液を用いることもできる。
【００５０】
また、洗浄工程を行う回数は、粒子上に形成された複合体に影響を及ぼさない回数であれば特に制限されない。洗浄工程を繰り返すことで測定工程において不要又は悪影響を及ぼす成分を、さらに除去することができる。
【００５１】
本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、還元剤を含むことができる。第１固相が粒子である場合、上記試薬の少なくとも一つが還元剤を含むことが好ましい。第１固相が粒子である場合、上記試薬の少なくとも一つが還元剤を含むことで、洗浄工程において、集めた粒子を再び液体中に分散する際に、粒子が凝集することを防止することが出来る。
【００５２】
ここで、還元剤は、形成工程に影響を及ぼさない還元剤であれば、特に限定されない。本実施形態における還元剤としては、特に、蛋白質のジスルフィド結合を解離させるものが好ましい。より具体的な還元剤としては、例えば、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウムまたはホスフィンなどが挙げられる。本実施形態における還元剤としては、特にメルカプトエチルアミン、ジチオトレイトールおよびシステイン塩酸塩が好ましい。
【００５３】
上記試薬に含有される還元剤の濃度は、使用する還元剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、還元剤としてメルカプトエチルアミンを用いる場合、メルカプトエチルアミンの濃度は、１０〜６０ｍＭが好ましい。
【００５４】
本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、さらに無機塩類を含有することが好ましい。上記試薬の少なくとも一つが、さらに無機塩類を含有することにより、洗浄工程において、粒子の凝集をさらに抑制することができる。ここで、無機塩類は、形成工程に影響を及ぼさない無機塩類であれば、特に限定されない。本実施形態における無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムまたは硫酸ナトリウムなどが挙げられる。本実施形態における無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび硫酸ナトリウムが好ましい。
【００５５】
上記試薬に含有される無機塩類の濃度は、使用する無機塩類の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、無機塩類として塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウムの濃度は、０．１〜１．０Ｍが好ましい。
【００５６】
なお、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体は、それ自体公知の方法を用いて作製したハイブリドーマから得ることができる。
すなわち、所望により適切なアジュバントと混合したＨＣＶコア蛋白質で適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、該動物の脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。通常、抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、同種の動物に由来する。
細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるＰＥＧ法などにより行うことができる。細胞融合後、ＨＡＴ培地などの選択培地でハイブリドーマを選択し、ハイブリドーマのＨＣＶコア蛋白質を認識する抗体を産生する能力について、常法（例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ））に従ってスクリーニングを行う。次いで、適切な抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
上記のようにしてハイブリドーマが得られれば、その後、ハイブリドーマが産生する抗体のエピトープ解析を行う。こうすることで、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体を得ることが出来る。
【００５７】
より具体的なＨＣＶコア蛋白と結合する抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を以下に示す。
＜免疫抗原ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製＞
（Ａ）発現プラスミドの構築
配列番号１に示すＨＣＶコア領域の１−１６０番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んで以下のプラスミドを得る。
ｐＵＣ・pR-160：配列番号１に示されるＨＣＶコア領域蛋白質（pR-160）のプラスミド
【００５８】
配列番号１
MSTNPKPQRKTKRNANRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKDRRSTGKSWGKPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPTWGLTDPRHRSRNLGKVIDTITCGFADLMGYIPVVGAPVGGVARALAHGVRVLED
【００５９】
ｐＵＣ・pR-160のＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なう。約４８０ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、pR-160をコードするＤＮＡ断片をアガロースより精製する。
【００６０】
次に、発現ベクターｐＱＥ−３０(ＱＩＡＧＥＮ社製)を制限酵素反応液２０μｌ〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行う。約３０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡをアガロースより精製する。
【００６１】
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．1(タカラバイオ社製)を用いて、得られたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡ１μｇとpR-160をコードするＤＮＡ断片約0.3 pmolとを連結する反応を行う。
【００６２】
pR-160をコードするＤＮＡ断片の連結反応で得られた反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ−１０９株(タカラバイオ社製）株を形質転換する。形質転換に用いる感受性大腸菌株はE. coli JM109 Competent Cells(タカラバイオ社製)を使用する。形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト、１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温する。プレート上に生じた菌のコロニーを白金耳で１杯取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト）に移し、一晩３７℃で培養する。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ社製)を使用して、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションを行う。
【００６３】
得られる連結処理ＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ，１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なって、約４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片が生じるｐＱＥ−３０pR-160発現プラスミドを選別する。
【００６４】
（Ｂ）ｐＱＥ−３０pR-160でコードされるＨＣＶコア由来ポリペプチド（pR-160）の発現および精製
ｐＱＥ−３０pR-160発現プラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのLB培地に接種し、１晩３７℃で培養する。この培養液全量を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌのLB培地に植え継ぎ、３７℃で培養する。ＯＤ６００が０．５〜０．７の時に終濃度１ｍｍｏｌ／ｍＬになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトシドを加え、さらに１晩３７℃で培養する。この培養液を遠心分離して菌体を集める。
【００６５】
次に菌体ペレットの界面活性剤処理の操作を行う。
湿重量約１ｇの菌体に２ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）（室温）を加え、泡立てないように懸濁する。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら１０−２０分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。遠心後の不溶性の細胞残渣に１．８ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（室温）を加え、泡立てないように再懸濁する。懸濁液にリゾチウムを終濃度２００μg／ｍＬになるように加える。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら５分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
【００６６】
次に、不溶性画分の可溶化及び精製を行った。遠心後に得られた不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝８．０）1 ｍＬを加え、再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除く。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝９．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１０．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１１．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝１２．０） 1 ｍＬを加え、ＨＣＶ由来ポリペプチド（pR-160）を可溶化抽出する。
ニッケルチャージアガロースゲルを用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーでポリペプチドの精製を行い、可溶化した抽出物から、pR-160を得る。
【００６７】
＜ハイブリドーマの作製＞
（Ａ）マウスの免疫
pR-160抗原１００μｇから１０００μｇを含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１００μＬにフロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）１００μｌを混合して乳化させ、ＦＣＡ pR-160抗原溶液２００μｌを作製する。また、ＦＣＡではなくフロインドの不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いること以外は上記の手順と同様にして、ＦＩＡ pR-160抗原溶液２００μＬを作製する。
【００６８】
ＦＣＡ pR-160抗原溶液２００μｌを７〜８週齢の雌 Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与することにより初回免疫する。初回免疫後、２〜３週間毎にＦＩＡ pR-160抗原溶液２００μＬを用いて追加免疫を行う。脾細胞分離の１０日前及び３日前に、pR-160抗原２００μｌを静脈投与する。最後の投与から３日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製する。
【００６９】
（Ｂ）ハイブリドーマの培養
ハイブリドーマを２．５×１０6細胞/mlとなるようにＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング社製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０5細胞/ウェルとなるように分注する。培養用プレートを３７℃、８％ＣＯ2の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始する。１０日間以上培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行う。
【００７０】
（Ｃ）ハイブリドーマのスクリーニング
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ3を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．５）に、pR-160抗原の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようpR-160抗原を添加し、固定用pR-160抗原溶液を調製する。この固定用pR-160抗原溶液１００μｌをイムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに分注する（以下、抗原固定プレートとする）。４℃で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、緩衝液Ａとする）で３回洗浄する。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに１ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、緩衝液Ｂとする）３００μｌを添加して、２〜８℃で４時間以上静置保存する。抗原固定プレートは使用時まで２〜８℃で保存する。
【００７１】
抗原固定プレート中の緩衝液Ｂを除去する。除去後、緩衝液Ｂを抗原固定プレートの各ウェルに７５μｌずつ添加する。さらに、上述のハイブリドーマの培養における培養上清を、培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μｌずつ添加する。緩衝液Ｂ及び培養上清添加後、室温で一時間攪拌する。攪拌後、緩衝液Ａで抗原固定プレートの各ウェルの洗浄を３回行う。洗浄後、緩衝液Ｂで１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で３０分間反応させる。反応後、緩衝液Ａで抗原固定プレートの各ウェルの洗浄を３回行う。洗浄後、ＰＯＤに対する基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置する。ついで、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を含む反応停止液を抗原固定プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定する。
【００７２】
上記のようにして得ることが出来る配列番号１に示すＨＣＶコア蛋白と結合する抗体を産生するハイブリドーマをＨＣＦ４−８０１及びＨＥ２５と命名した。
ＨＣＦ４−８０１は受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４４で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４４で受託された。以下、該ハイブリドーマから産生される抗体をＨＣＦ４−８０１抗体と呼称する。
ＨＥ２５は受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４３で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４３で受託された。以下、該ハイブリドーマから産生される抗体をＨＥ２５抗体と呼称する。
【実施例】
【００７３】
実施例１
＜ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製＞
（Ａ）発現プラスミドの構築
配列番号２、３、又は４に示すＨＣＶコア領域の１−１６０番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んで以下のプラスミドを得た。
ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂ：配列番号２に示されるＨＣＶジェノタイプ１ｂのコア領域蛋白質（ＨＣＶ−Ｊ１ｂ）のプラスミド
ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ：配列番号３に示される４９番目のアミノ酸であるスレオニンがプロリンに変異したＨＣＶジェノタイプ１ｂのコア領域蛋白質（ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ）のプラスミド
ｐＵＣ・ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７：配列番号４に示されるＨＣＶジェノタイプ３ｂＮＥ１３７株のコア領域蛋白質（ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７）のプラスミド
【００７４】
配列番号２
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLED
配列番号３
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRAPRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLED
配列番号４
MSTLPKPQRQTKRNTYRRPQNVKFPGGGQIVGGVYVLPRRGPRLGVRAVRKTSERSQPRGRRQPIPKARSREGRSWAQPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPSWGPNDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLIGAPVGGVARALAHGVRALED
【００７５】
ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂのＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なった。約４８０ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、ＨＣＶ−Ｊ１ｂをコードするＤＮＡ断片をアガロースより精製した。
【００７６】
次に、発現ベクターｐＱＥ−３０(ＱＩＡＧＥＮ社製)を制限酵素反応液２０μｌ〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なった。約３０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡをアガロースより精製した。
【００７７】
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．1(タカラバイオ社製)を用いて、得られたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡ１μｇとＨＣＶ−Ｊ１ｂをコードするＤＮＡ断片約0.3pmolとを連結する反応を行なった。
【００７８】
ＨＣＶ−Ｊ１ｂをコードするＤＮＡ断片の連結反応で得られた反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ−１０９株(タカラバイオ社製）株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株はE. coli JM109 Competent Cells(タカラバイオ社製)を使用した。形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト、１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーをで１杯取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト）に移し、一晩３７℃で培養した。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ社製)を使用して、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションを行なった。
【００７９】
得られた連結処理ＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ，１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なって、約４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片が生じるｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂ発現プラスミドを選別した。
【００８０】
なお、ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂを用いてｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂ発現プラスミドを選別した手順と同様にして、ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐを用いてｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ発現プラスミドを選別し、ｐＵＣ・ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７を用いてｐＱＥ−３０ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７発現プラスミドを選別した。
【００８１】
（Ｂ）ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂでコードされるＨＣＶコア由来ポリペプチド（ＨＣＶ−Ｊ１ｂ）の発現および精製
ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂ発現プラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのLB培地に接種し、１晩３７℃で培養する。この培養液全量を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌのLB培地に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００が０．５〜０．７の時に終濃度１ｍｍｏｌ／ｍＬになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトシドを加え、さらに１晩３７℃で培養した。この培養液を遠心分離して菌体を集めた。
【００８２】
次に菌体ペレットの界面活性剤処理の操作を行った。
湿重量約１ｇの菌体に２ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）（室温）を加え、泡立てないように懸濁する。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら１０−２０分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。遠心後の不溶性の細胞残渣に１．８ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（室温）を加え、泡立てないように再懸濁する。懸濁液にリゾチウムを終濃度２００μg／ｍＬになるように加える。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら５分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
【００８３】
次に、不溶性画分の可溶化及び精製を行った。遠心後に得られた不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝８．０）1 ｍＬを加え、再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除く。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝９．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１０．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１１．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝１２．０） 1 ｍＬを加え、ＨＣＶ由来ポリペプチド（ＨＣＶ−Ｊ１ｂ）を可溶化抽出した。
ニッケルチャージアガロースゲルを用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーでポリペプチドの精製を行い、可溶化した抽出物から、ＨＣＶ−Ｊ１ｂを得た。
【００８４】
なお、ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂを用いてＨＣＶ−Ｊ１ｂを得た手順と同様にして、ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ発現プラスミドを用いてＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐを得て、ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７発現プラスミドを用いてＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７を得た。
【００８５】
実施例２
＜エピトープ解析＞
実施例１で得たＨＣＶ−Ｊ１ｂ及びＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐと表１に示される合成ペプチドCDP-2、CDP-2-1、CDP-3、及びCDP-3-1とを使用して、抗ＨＣＶコア蛋白質モノクローナル抗体であるＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体のエピトープを解析した。なお、CDP-2、CDP-2-1、CDP-3、及びCDP-3-1は、それぞれ、Keyhole Limpet Hemocyaninをコンジュゲートした合成ペプチドであり、オペロンバイオテクノロジー株式会社に調製を外部委託し、調製された。
【００８６】
表１：ＨＣＶコア由来のペプチドのアミノ酸配列表
【００８７】
（Ａ）CDP-2とＨＣＦ４−８０１抗体との反応性の確認
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ3を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．５）に、CDP-2の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようCDP-2を添加し、固定用CDP-2溶液を調製した。この固定用CDP-2溶液１００μｌをイムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）のウェルに分注した（以下、抗原固定プレートとする）。４℃で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、緩衝液Ａとする）で３回洗浄した。洗浄後、ペプチド固定プレートのウェルに１ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、緩衝液Ｂとする）３００μｌを添加して、２〜８℃で４時間以上静置保存した。抗原固定プレートは使用時まで２〜８℃で保存した。
【００８８】
CDP-2固定プレート中の緩衝液Ｂを除去した。除去後、緩衝液Ｂを抗原固定プレートのウェルに７５μｌずつ添加した。さらに、ＨＣＦ４−８０１ハイブリドーマの培養における培養上清を、培養用プレートのウェルから取り出し、抗原固定プレートのウェルに２５μｌ添加した。緩衝液Ｂ及び培養上清添加後、室温で一時間攪拌した。攪拌後、緩衝液Ａで抗原固定プレートのウェルの洗浄を３回行った。洗浄後、緩衝液Ｂで１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートのウェルに１００μｌ添加し、室温で３０分間反応させた。反応後、緩衝液Ａで抗原固定プレートのウェルの洗浄を３回行った。洗浄後、ＰＯＤに対する基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む基質液を１００μＬ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を含む反応停止液を抗原固定プレートのウェルに１００μＬ加えた後、ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が０．１５以上であれば反応性ありとみなし、０．１５未満であれば反応性なしとみなした。
【００８９】
（Ｂ）CDP-2とＨＥ２５抗体との反応性の確認
CDP-2とＨＣＦ４−８０１抗体との反応性の確認と同様にして行った。
【００９０】
なお、実施例２（Ａ）及び実施例２（Ｂ）と同様にして、CDP-2-1、CDP-3、CDP-3-1、ＨＣＶ−Ｊ１ｂ及びＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐについても、ＨＣＦ４−８０１抗体との反応性の確認及びＨＥ２５抗体との反応性の確認を行った。その結果を表２に示す。
【００９１】
表２：ＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体と各合成ポリペプチドとの反応性の有無
○：反応性あり、×反応性なし
【００９２】
表２から、ＨＣＦ４−８０１抗体は配列番号２に示すＨＣＶコア領域の２１〜３０番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体であることが分かった。
ＨＥ２５抗体はCDP-2、及びCDP-3-1との反応性から配列番号２に示すＨＣＶコア領域の４１〜５０番目のアミノ酸配列にエピトープがあることが分かる。さらに、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐとの反応性があるため、配列番号２に示すＨＣＶコア領域の４９番目のアミノ酸を含まないエピトープであることが分かる。以上の結果から、ＨＥ２５抗体は配列番号２に示すＨＣＶコア領域の４１〜４８番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体であることが分かった。
【００９３】
実施例３
＜抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体のジェノタイプ反応性＞
実施例１で得られたＨＣＶコア領域由来のポリペプチドを用いて、以下の実験を行った。
本例で使用する試薬は以下に示す。
【００９４】
標識抗体試薬：
標識抗体として、ＡＬＰで標識された抗ＨＣＶ抗体（ＡＬＰ標識ＨＣＦ４−８０１）を用いた。具体的な標識抗体試薬の作製は、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したALPを混合して、反応させることで標識抗体を調製する。この方法で調製したALP標識抗体は、希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２）で80倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【００９５】
第１抗体試薬：
第１抗体として、ビオチン及びＤＮＰで修飾された抗体（Ｂｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＥ２５）を用いた。具体的な第１抗体試薬の作製は、ビオチン化試薬（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents:ピアス社）をBSAに添加して、次いでDNP標識試薬（DNP-X acid SE:ABD Bioquest社）を添加することでBiotin/DNP標識したBSAを調製する。次に、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したBiotin/DNP標識したBSAを混合して、反応させることで第１抗体を調製する。この方法で調製した第１抗体を５０倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【００９６】
磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ ＰＥＧ−ＮＨ２；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。5μｌの該磁性粒子を、995μｌの希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３）で200倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
【００９７】
固相：
固相としては、ストレプトアビジンを固定化したプレート（ストレプトアビジンプレート）を用いた。ストレプトアビジンプレートは、C8 WHITE MAXISORPプレート(Nunc社製)に対して、ストレプトアビジン（和光純薬）10μg/mlの溶液100μlを室温で感作させ作製した。
【００９８】
遊離剤：
第１抗体及び第２抗体の結合を解離する物質として、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いた。ＤＮＰ−Ｌｙｓ（東京化成社製）が３．０ｍＭとなるように、希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、０．５ｗｔ％ カゼインナトリウム）で希釈し、遊離剤とした。
【００９９】
実施例１で調製したリコンビナントＨＣＶコア抗原を、濃度が１００ｐｇ/ｍＬとなるように希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３）で希釈し、抗原サンプルとした。
【０１００】
リコンビナントＨＣＶコア抗原を含むサンプルを用いて、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体のジェノタイプ反応性を調べた。
【０１０１】
＜形成工程＞
１００ｐｇ/ｍＬのリコンビナントＨＣＶコア抗原を含む１２５μｌの試料と、５０μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で５分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜洗浄工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行い、上清を除去し、反応キュベットに３８０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＩＳＣＬ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ；シスメックス社製）を添加し、再び磁気分離を行う洗浄を行った。上記洗浄を２回繰り返した後、さらに１９０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を１回行うことで、洗浄工程を実施した。
＜転移工程＞
洗浄工程で得られた試料を含む反応キュベットに、５０μｌの遊離剤を添加し、室温で４分間インキュベートした。次に、磁気分離を行い、上清を固相に移し、室温で２０分間インキュベートした。次に、上清を除去し、３００μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、再び上清を除去する洗浄を行った。上記の洗浄は５回繰り返し行うことで、転移工程を実施した。
＜測定工程＞
転移工程で得られた試料を含む固相に、２５μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ４試薬（シスメックス社製）と２５μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ５試薬を添加し、４２℃で５分間インキュベートした。次に、FLUOstar OPTIMA（BMG LABTECH社製）を用いて測光（３ｓｅｃ ａｔ ｇａｉｎ ４０９５）を行い、発光強度（Ｃｏｕｎｔｓ）を測定することで測定工程を実施した。
【０１０２】
その結果を図１に示す。図１には、ネガティブコントロール（ＮＣ）の反応性、ＨＣＶ−Ｊ１ｂの反応性、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐの反応性、及びＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７の反応性を示している。各反応性は、ＨＣＶ−Ｊ１ｂの発光強度を１００として、ネガティブコントロール（ＮＣ）の発光強度、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐの発光強度、及びＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７の発光強度を算出することで得た。
【０１０３】
図１から明らかなように、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体であるＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体を用いた測定においては、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐに対して、ＨＣＶ−Ｊ１ｂと同等レベルで検出でき、ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７に対しては、ＨＣＶ−Ｊ１ｂ以上に高感度に検出できた。このことから、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を結合部位に含まない２種類の抗体を用いることで、ＨＣＶ−１ｂ変異体及びＨＣＶ−３ｂのＨＣＶコア蛋白を高感度に検出できることが示唆された。
【０１０４】
実施例４
＜抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体のジェノタイプ反応性＞
ＨＣＶ陽性患者から得られた、ＨＣＶのジェノタイプ及びＨＣＶ−ＲＮＡ量が既知であるＨＣＶ陽性血清４３−４８を用いて、以下の実験を行った。
【０１０５】
本例で使用する試薬は以下に示す。
【０１０６】
第１処理試薬：
カオトロピック剤として尿素を６Ｍ、界面活性剤としてＢｒｉｊ３５（シグマ社製）を４％、及びアルカリ性物質として水酸化ナトリウムを０．４５Ｎ含む水溶液を、第１処理試薬とした。
【０１０７】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２処理試薬Ａ〜Ｃの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ａ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
（第２処理試薬Ｂ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
（第２処理試薬Ｃ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
ＮａＣｌ ０．６ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｂには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｃには、還元剤としてメルカプトエチルアミン、及び無機塩類としてＮａＣｌが含まれている。
【０１０８】
標識抗体試薬：
実施例３で使用した標識抗体試薬と同様のALP標識抗体20μｌを、980μｌの希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２）で80倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【０１０９】
第１抗体試薬：
実施例３と同様の第１抗体試薬25 μｌを、475 μｌの希釈液で２０倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【０１１０】
磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０；インビトロジェン社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。100μｌの該磁性粒子を、900μｌの希釈液で10倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
【０１１１】
固相：
実施例３と同様のストレプトアビジンプレートを使用した。
【０１１２】
遊離剤：
第１抗体及び第２抗体の結合を解離する物質として、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いた。ＤＮＰ−Ｌｙｓ（東京化成社製）が０．２ｍＭとなるように、希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３）で希釈し、遊離剤とした。
【０１１３】
ＨＣＶ陽性血清：
ＨＣＶ陽性血清として、以下の表３に示すＷｏｒｌｄＷｉｄｅ HCV Performance Panel（ＳｅｒａＣａｒｅ社製）を用いた。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
表３に示すＨＣＶ陽性血清４３〜４８に含まれる、ＨＣＶコア蛋白の検出を以下のように実施した。
【０１１６】
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陽性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬を添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、１２０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜洗浄工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行い、上清を除去し、反応キュベットに３８０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＩＳＣＬ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ；シスメックス社製）を添加し、再び磁気分離を行う洗浄を行った。上記洗浄を２回繰り返した後、さらに１９０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を１回行うことで、洗浄工程を実施した。
＜転移工程＞
洗浄工程で得られた試料を含む反応キュベットに、４０μｌの遊離剤を添加し、室温で４分間インキュベートした。次に、磁気分離を行い、上清を固相に移し、室温で２０分間インキュベートした。次に、上清を除去し、３００μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、再び上清を除去する洗浄を行った。上記の洗浄は５回繰り返し行うことで、転移工程を実施した。
＜測定工程＞
転移工程で得られた試料を含む固相に、２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ４試薬（シスメックス社製）と２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ５試薬を添加し、４２℃で４分間インキュベートした。次に、FLUOstar OPTIMA（BMG LABTECH社製）を用いて測光（３ｓｅｃ ａｔ ｇａｉｎ ４０９５）を行い、発光強度（Ｃｏｕｎｔｓ）を測定することで測定工程を実施した。
【０１１７】
その結果を図２に示す。図２には、ＨＣＶ−ＲＮＡ量と発光強度との関係を示している。図２から明らかなように、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体であるＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体を用いた測定を行うと、ＨＣＶ−ＲＮＡ量と発光強度との相関において、乖離するジェノタイプが見られなかった。このことから、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を結合部位に含まない２種類の抗体を用いることで、ＨＣＶの各ジェノタイプのコア蛋白を同程度に検出できることが示唆された。
【０１１８】
実施例５
＜還元剤による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
本例で使用する試薬は以下に示す。
【０１１９】
第１処理試薬：
カオトロピック剤として尿素を６Ｍ、界面活性剤としてＢｒｉｊ３５（シグマ社製）を４％、及びアルカリ性物質として水酸化ナトリウムを０．４５Ｎ含む水溶液を、第１処理試薬とした。
【０１２０】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２処理試薬Ａ〜Ｃの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ａ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
（第２処理試薬Ｂ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
（第２処理試薬Ｃ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
ＮａＣｌ ０．６ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｂには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｃには、還元剤としてメルカプトエチルアミン、及び無機塩類としてＮａＣｌが含まれている。
【０１２１】
標識抗体試薬：
標識抗体として、ＡＬＰで標識された抗ＨＣＶ抗体（ＡＬＰ標識ＨＣＦ３−８０７）を用いた。ここで、ＨＣＦ３−８０７としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４２で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４２で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。具体的な標識抗体試薬の作製は、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したALPを混合して、反応させることで標識抗体を調製する。この方法で調製したALP標識抗体20μｌを、980μｌの希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２）で50倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【０１２２】
第１抗体試薬：
第１抗体として、ビオチン及びＤＮＰで修飾された抗体（Ｂｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＣＦ４−１０４）を用いた。ここで、ＨＣＦ４−１０４としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４１で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４１で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。具体的な第１抗体試薬の作製は、ビオチン化試薬（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents:ピアス社）をBSAに添加して、次いでDNP標識試薬（DNP-X acid SE:ABD Bioquest社）を添加することでBiotin/DNP標識したBSAを調製する。次に、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したBiotin/DNP標識したBSAを混合して、反応させることで第１抗体を調製する。この方法で調製した5 μｌの第１抗体を、495 μｌの希釈液で１００倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【０１２３】
磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０；インビトロジェン社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。100μｌの該磁性粒子を、900μｌの希釈液で10倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
【０１２４】
還元剤による、磁性粒子の凝集の抑制効果を、以下の通り確認した。
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陰性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬Ａ〜Ｃをそれぞれ添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、８０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜洗浄工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行った。磁気分離した磁性粒子に、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）を３００μｌ添加し、ボルテックスミキサーを用いて分散させることで、洗浄工程を実施した。その後、反応キュベットを静置し、粒子の凝集を評価した。
【０１２５】
ここで、粒子の凝集の評価は、目視により観察し、凝集の程度を次の３段階に分けて評価した。
＋＋：凝集が認められる。
＋：やや凝集が認められる。
−：凝集が認められない。
第２処理工程において、第２処理試薬Ａ〜Ｃを用いた試料における、反応キュベット内の凝集の評価を表４に示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
表４から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む、第２処理試薬Ｂ又は第２処理試薬Ｃを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が確認が認められなかった。このことから、第２処理試薬に還元剤を添加することで、洗浄工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。
【０１２８】
実施例６
＜還元剤の種類及びＨＣＶの存在による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、還元剤の種類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｄ〜Ｆを調製した。また、試料として使用する血清中のＨＣＶの存在の有無が凝集に影響するかを調べるため、本例では、ＨＣＶ陰性血清に代えて、ＨＣＶ陽性血清を用いた。
【０１２９】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｄ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｅ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
ジチオトレイトール ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｆ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
システイン塩酸塩 ９０ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｅには、還元剤としてジチオトレイトールが含まれている。また、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてシステイン塩酸塩が含まれている。
【０１３０】
上述した第２処理試薬Ｄ〜Ｆ、及びＨＣＶ陽性血清を用いること以外は、実施例５と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表５に示す。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
表５から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む第２処理試薬Ｄでは、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、実施例５と同様に磁性粒子の凝集が認められなかった。また、ジチオトレイトールを含む第２処理試薬Ｅ、およびシステイン塩酸塩を含む第２処理試薬Ｆを用いて処理した試料でも、第２処理試薬Ｄと同様に、磁性粒子の凝集が認められなかった。このことから、還元剤の種類を問わず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、洗浄工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。また、血清中のＨＣＶの存在の有無にかかわらず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、洗浄工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。
【０１３３】
実施例７
＜無機塩類による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤及び無機塩類を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、無機塩類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｇ〜Ｉを調製した。
【０１３４】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｇ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化ナトリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｈ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化カリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｉ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
硫酸ナトリウム ０．６Ｍ
ここで、第２処理試薬Ｇには、無機塩類として塩化ナトリウムが含まれている。また、第２処理試薬Ｈには、無機塩類として塩化カリウムが含まれている。さらにまた、第２処理試薬Ｉには、無機塩類として硫酸ナトリウムが含まれている。
【０１３５】
上述した第２処理試薬Ｇ〜Ｉを用いること以外は、実施例５と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表６に示す。
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
表６から明らかなように、第２処理工程において、無機塩類を含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、塩化ナトリウムを含む第２処理試薬Ｇ、塩化カリウムを含む第２処理試薬Ｈ、及び硫酸ナトリウムを含む第２処理試薬Ｉでは、磁性粒子の凝集がやや認められたものの、第２処理試薬Ａに比べ、磁性粒子の凝集の抑制効果が認められた。このことから、還元剤の磁性粒子の凝集の抑制効果より低いが、無機塩類にも磁性粒子の凝集の抑制効果があることが示された。従って、還元剤及び無機塩類の添加により、より効果的に磁性粒子の凝集が抑制できることが示唆された。
【０１３８】
実施例８
＜還元剤を含む前処理液を用いた免疫複合体転移測定法によるＨＣＶの有無の判定＞
ＨＣＶ陽性患者から得られた、ＨＣＶ陽性血清1〜４２を用いて、以下の実験を行った。
【０１３９】
本例で使用する試薬は以下に示す。
【０１４０】
第１処理試薬：
実施例５と同様の試薬を使用した。
【０１４１】
第２処理試薬：
実施例５の第２処理試薬Ｃと同様の試薬を使用した。
【０１４２】
標識抗体試薬：
実施例５と同様の操作により調製したＡＬＰ標識ＨＣＦ３−８０７ 10μｌを、590μｌの標識抗体用希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＺｎＣｌ２ ０．１ｍＭ）で60倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【０１４３】
第１抗体試薬：
実施例５と同様の操作により調製した5μｌのＢｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＣＦ４−１０４を、495 μｌの希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％）で１００倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【０１４４】
磁性粒子試薬：
実施例５と同様の操作により調製した抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子を使用した。
【０１４５】
固相：
固相としては、ストレプトアビジンを固定化したプレート（ストレプトアビジンプレート）を用いた。ストレプトアビジンプレートは、C8 WHITE MAXISORPプレート(Nunc社製)に対して、ストレプトアビジン（和光純薬）10μg/mlの溶液100μlを室温で感作させ作製した。
【０１４６】
遊離剤：
第１抗体及び第２抗体の結合を解離する物質として、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いた。ＤＮＰ−Lysine（東京化成社製）が０．２ｍＭとなるように、希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．６Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％）で希釈し、遊離剤とした。
【０１４７】
ＨＣＶ陽性血清１〜４２に含まれる、ＨＣＶコア蛋白の有無の判定を以下のように実施した。
【０１４８】
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陽性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬を添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、８０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜分離工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行い、上清を除去し、反応キュベットに３８０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＩＳＣＬ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ；シスメックス社製）を添加し、再び磁気分離を行う洗浄を行った。上記洗浄を２回繰り返した後、さらに１９０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を１回行うことで、分離工程を実施した。
＜転移工程＞
分離工程で得られた試料を含む反応キュベットに、４０μｌの遊離剤を添加し、室温で４分間インキュベートした。次に、磁気分離を行い、上清を固相に移し、室温で２０分間インキュベートした。次に、上清を除去し、３００μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、再び上清を除去する洗浄を行った。上記の洗浄は５回繰り返し行うことで、転移工程を実施した。
＜測定工程＞
転移工程で得られた試料を含む固相に、２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ４試薬（シスメックス社製）と２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ５試薬を添加し、４２℃で４分間インキュベートした。次に、FLUOstar OPTIMA（BMG LABTECH社製）を用いて測光（３ｓｅｃ ａｔ ｇａｉｎ ４０９５）を行い、発光強度（Ｃｏｕｎｔｓ）を測定することで測定工程を実施した。
＜判定工程＞
測定工程で得られた発光強度の値（測定値）に基づき、試料中に含まれるＨＣＶコア蛋白の有無を判定した。具体的には、各試料の測定値が閾値以上の場合は、試料中にＨＣＶが有ると判定し、測定値が閾値未満の場合は、試料中にＨＣＶが無いと判定した。なお、１０３のＨＣＶ陰性血清に対し、上述の第１処理工程から測定工程までの操作を行って得られた測定値の平均値を算出し、平均値の標準偏差に１５を掛けた値を平均値に加算した数値を閾値とした。ここで、測定値の平均値は２０５４．６、標準偏差は１２５．３、及び閾値は３９３４．４であった。
【０１４９】
比較例１
＜従来技術によるＨＣＶの有無の判定＞
従来技術としてルミスポット栄研ＨＣＶ抗原（栄研化学製・登録商標）を用いたＨＣＶの有無の判定を行った。上記のＨＣＶ陽性血清１〜４２を、ルミスポット栄研ＨＣＶコア抗原の添付文書に記載されたプロトコールに従って処理し、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＬＳ−２０００（栄研化学製・登録商標）を用いて、各ＨＣＶ陽性血清中のＨＣＶ抗原を検出し、ＨＣＶの有無を判定した。なお、ルミスポット栄研ＨＣＶ抗原によるＨＣＶ抗原の検出限界、すなわちＨＣＶの有無の判定の閾値は0.4ｐｇ／ｍｌである。
【０１５０】
ＨＣＶ陽性血清１〜４２を用いた、比較例１及び実施例８による測定結果及び判定結果を表７に示す。
【０１５１】
なお、表７で用いられている記号は、以下の内容を表す。
○：試料中にＨＣＶは有ると判定
×：試料中にＨＣＶは無いと判定
−：検出限界未満
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
表７から明らかなように、比較例１では、ＨＣＶ陽性血清のうち１１試料（ＨＣＶ陽性血清２、３、７、８、及び１０〜１６）について、ＨＣＶが有ると判定できなかった。それに対し、実施例８では、そのうち５試料(ＨＣＶ陽性血清２，３，８，１０及び１５)で、試料中にＨＣＶが有ると判定できた。また、実施例８では、比較例１でＨＣＶが有ると判定できた３１試料の全てについて、ＨＣＶが有ると判定することができた。従って、実施例８は、比較例１よりも、より正確にＨＣＶの有無を判定できることが示された。このことから、還元剤を含む前処理液を用いた免疫複合体転移測定法により、より正確に試料中のＣ型肝炎ウイルスの有無を判定することが示唆された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法、及びそれに用いる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる伝染性の疾病である。Ｃ型肝炎は予防法が確立されていないばかりか、感染者（キャリア）の多くは１０〜３０年で肝硬変や肝癌へ移行することが推定されており、ＨＣＶへの感染の早期発見と早期治療は非常に重要である。
【０００３】
Ｃ型肝炎の原因となるＨＣＶは、直径約６０ｎｍのＲＮＡウイルスで、エンベロープをもつ。ＨＣＶ ＲＮＡは一本鎖プラス鎖で、約９５００塩基配列よりなっている。遺伝子構造はフラビウィルスに類似しており、５’末端と３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）があり、この間に約３０００アミノ酸をコードする翻訳領域が存在する。翻訳領域は、５’側より、構造タンパクをコードするコア領域、エンベロープ領域１、エンベロープ領域２があり、これに続いて非構造領域が存在する。
【０００４】
ＨＣＶ検査としては、コア領域がコードするＨＣＶコア蛋白を抗原として用いた抗体測定法が知られている。しかしながら、上記抗体測定法によるＨＣＶ検査では、ＨＣＶに感染し、抗体が産生されるまでＣ型肝炎を検出することができない。そのため、ＨＣＶの早期発見が困難である。また抗体検査は、原理上、感染後治癒した者か、あるいは活動性の感染者かを判別することが出来ないことが問題である。
【０００５】
ここで、そのような問題を解決するＨＣＶ検査として、ＨＣＶ抗原を直接検出する方法がある。このような方法としては、ＨＣＶのコア抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、血清中のコア抗原を検出する方法が知られている（特許文献１、特許文献２）。
【０００６】
しかしながら、ＨＣＶ感染患者内ではウイルス粒子自体が極めて少ないため、上記の測定法よりもさらに高感度なＨＣＶの検出法が望まれている。
【０００７】
ここで、抗原を高感度に検出するための方法として、免疫複合体転移測定法が知られている（特許文献３、特許文献４）。この免疫複合体転移測定法は、測定対象物質を含む免疫複合体を、２種類以上の固相間で移動させたのち、固相上の免疫複合体を測定することを特徴とする方法である。測定対象物質を含む免疫複合体を、２種類以上の固相間で移動させることで、夾雑物質が除かれ、検出系における非特異的信号を減少させることができる。その結果、免疫複合体転移測定法を用いることで、測定対象物質を高感度に検出することができる。
しかしながら、Ｃ型肝炎の原因となるＨＣＶは、ＲＮＡウイルス種であり、高度の変異を起こすことが知られている。たとえば、配列番号２に示されるＨＣＶジェノタイプ１ｂのコア領域蛋白質の４９番目のアミノ酸に変異があった場合、上記公知の抗体を用いた上記免疫複合体転移測定法でＨＣＶを測定しても、高感度に検出できない場合があった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３１７６５７０号
【特許文献２】特許第３６２３１６２号
【特許文献３】特開平１−２５４８６８
【特許文献４】特開平２−２８５５８
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Journal 0f Clinical Microbiology, Sept. 2000, p.3450-3452
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、ＨＣＶを高感度に検出できる、免疫複合体転移測定法、及びそれに用いる試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の局面の免疫測定方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない。
本発明の第２の局面のＨＣＶの免疫測定試薬キットは、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体を含む第１試薬と、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体を含む第２試薬と、第１固相と、第１抗体及び第１固相と結合する第２抗体を含む第３試薬と、第１抗体と結合する物質が固定化された第２固相と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含ない。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の免疫測定方法及び試薬キットを用いれば、ＨＣＶを高感度に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配列番号２に示される４９番目のアミノ酸が異なるＨＣＶコア蛋白（ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ及びＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７）に対する、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体（ＨＣＦ４−８０１及びＨＥ２５）の反応性を示す図である。
【図２】ＨＣＶの各ジェノタイプについて、ＨＣＶ−ＲＮＡ量と発光強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施形態における免疫測定方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない。
【００１５】
ここで、本実施形態における標識抗体は、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体である。本実施形態における、好ましい標識抗体の結合部位としては、配列番号２に示される２１番目〜３０番目又は４１番目〜４８番目のアミノ酸配列が挙げられる。
【００１６】
また、本実施形態における第１抗体は、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体である。好ましい第１抗体の結合部位としては、配列番号２に示される２１番目〜３０番目又は４１番目〜４８番目のアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、例えば、標識抗体として、結合部位が配列番号２に示される２１番目〜３０番目のアミノ酸配列である抗体を用いた場合、第１抗体としては、結合部位が配列番号２に示される４１番目〜４８番目のアミノ酸配列である抗体を用いることができる。また、標識抗体として、結合部位が配列番号２に示される４１番目〜４８番目のアミノ酸配列である抗体を用いた場合、第１抗体としては、結合部位が配列番号２に示される２１番目〜３０番目のアミノ酸配列である抗体を用いることができる。本実施形態においては、標識抗体として、結合部位が配列番号２に示される２１番目〜３０番目のアミノ酸配列である抗体を用い、第１抗体として、結合部位が配列番号２に示される４１番目〜４８番目のアミノ酸配列である抗体を用いることが好ましい。
【００１７】
本実施形態における免疫測定方法は、ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する（以下、形成工程という場合がある）。
【００１８】
標識抗体は、免疫測定方法で一般的に用いられる公知の標識物質により標識されている。標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐなどが挙げられる。本実施形態における標識物質としては、酵素が好ましい。
【００１９】
標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質は、標識物質として用いる酵素に応じて、適宜公知の基質を選択すればよい。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合の基質としてはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標登録）、（４−クロロ−３−（メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（商標登録）（３−（４−メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発光基質；４−メチルウムベリフェニル・ホスフェート（４ＭＵＰ）などの蛍光基質；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。
【００２０】
なお、標識抗体は、当該分野において公知の方法で作成することができる。例えば、抗体のチオール（−ＳＨ）を用いて上記の標識物質を抗体と結合させる方法が知られている。より具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、抗体と反応させることにより、抗体を標識物質で標識できる。
【００２１】
第１固相は、従来の免疫測定方法で用いられる通常の第１固相であれば特に制限されない。第１固相の材料としては、例えば、ラテックス、ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーンなどのポリマー材料；アガロース；ゼラチン；赤血球；シリカゲル、ガラス、不活性アルミナ、磁性体などの無機材料などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を組み合わせてもよい。また、第１固相の形状も、免疫測定方法に用いられる通常の第１固相の形状であれば特に限定されない。例えば、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、粒子、ナノ粒子などが挙げられる。
【００２２】
本実施形態における第１固相としては、粒子が好ましい。ここで、粒子は、免疫測定法で用いられる公知の粒子であれば、特に制限されない。具体的な粒子としては、例えば、磁性粒子、ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられる。本実施形態における粒子としては、磁性粒子が好ましい。ここで、磁性粒子としては、磁性を有する材料を基材として含み、通常の免疫測定に用いられる粒子であれば、特に限定されない。このような磁性粒子は当該技術において公知であり、基材としてＦｅ２Ｏ３および／またはＦｅ３Ｏ４、コバルト、ニッケル、フィライト、マグネタイトなどを用いたものが知られている。
【００２３】
ここで、標識抗体とＨＣＶコア蛋白とは、抗原抗体反応により結合し、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白複合体を形成する。さらに、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白複合体とは、抗原抗体反応により結合し、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を形成する。なお、第１抗体とＨＣＶコア蛋白とが抗原抗体反応により結合し、ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を形成し、ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と標識抗体とが抗原抗体反応により結合し、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を形成してもよい。
【００２４】
また、本実施形態における形成工程では、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を第１固相に結合させることで、標識抗体とＨＣＶコア蛋白と第１抗体とを含む複合体を、第１固相上に形成させる。
【００２５】
ここで、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合は、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相とを結合でき、かつ後述する転移工程で解離可能な結合であればよく、特に限定されない。例えば、第１固相と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体とが、物理的吸着により結合することができる。また、粒子と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体とが、イオン結合により結合することができる。また、第１抗体に第１固相結合部位を結合させ、第１固相に第１固相結合部位に結合可能な結合物質を固定化することでも、第１固相と標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体とを結合させることが出来る。本実施形態における標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合は、第１固相結合部位と結合物質による結合が好ましい。
【００２６】
第１固相結合部位と結合物質の組み合わせとしては、第１固相結合部位と結合物質が特異的に結合可能で、かつ所定の条件で解離可能な物質の組み合わせであれば特に限定されない。このような物質の組み合わせとして、例えばリガンドとレセプター、レクチンと糖鎖、ビオチンとアビジン、ＤＮＡハイブリット、及び抗原と抗体（第２抗体）などが挙げられる。本実施形態における上記物質の組み合わせとしては、抗原と抗体（第２抗体）が好ましい。
【００２７】
ここで、抗原と抗体（第２抗体）の組み合わせとしては、ハプテンと抗ハプテン抗体、デスチオビオチンと抗ビオチン抗体、及びＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体などが挙げられる。本実施形態における、抗原と抗体（第２抗体）の組み合わせとしては、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体が好ましい。
【００２８】
本実施形態における免疫測定方法は、第１固相上に形成された複合体（標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体）を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する（以下、転移工程という場合がある。）
【００２９】
標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を、第１固相から遊離する方法は、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合の種類により適宜選択すればよく、特に制限されない。例えば、上記結合が物理的吸着による結合ならば、界面活性剤を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がイオン結合ならば、イオンを含む溶液を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合が第１固相結合部位と結合物質による結合ならば、第１固相結合部位と結合物質の組み合わせにより適宜選択すればよく、特に制限されない。例えば、上記結合がリガンド−レセプターによる結合ならば、リガンドまたはリガンド類似体を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がレクチン−糖鎖による結合ならば、糖質を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がビオチン−アビジンによる結合ならば、ビオチンを用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がＤＮＡハイブリットによる結合ならば、温度を上昇させることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がハプテン−抗ハプテン抗体による結合ならば、ハプテンあるいはハプテン誘導体を用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がデスチオビオチン−抗ビオチン抗体による結合ならば、ビオチンを用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。また、上記結合がＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体による結合ならば、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いることで標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体を遊離できる。
【００３０】
次に、遊離した標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第２固相とを結合させる。
【００３１】
第２固相は、従来の免疫測定方法で用いられる通常の第２固相であれば特に制限されない。第２固相の材料としては、例えば、第１固相と同様の材料を用いることが出来る。また、第２固相の形状も、第１固相の形状と同様の形状を用いることが出来る。本実施形態における第２固相としては、マイクロタイタープレートが好ましい。
【００３２】
ここで、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第２固相との結合は、標識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体と第１固相との結合と異なる結合であれば、特に制限されない。例えば、上記複合体と第１固相との結合が、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体結合である場合、上記複合体と第２固相との結合としては、ハプテン−抗ハプテン抗体結合、ＤＮＡハイブリット結合、イオン結合、ビオチン−アビジン結合などが挙げられる。上記複合体と第１固相との結合が、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体結合である場合、本実施形態における、上記複合体と第２固相との結合としては、ビオチン−アビジン結合が好ましい。
【００３３】
本実施形態における免疫測定方法は、第２固相に転移された複合体の標識を測定する（以下、測定工程という場合がある）。ここで、測定工程は、上述の標識抗体に用いた標識物質の種類に応じて、適宜適切な測定方法で行えばよく、特に限定されない。例えば、該標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることにより発生する光、色などを適切な装置を用いて測定することにより行うことができる。該装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。また、標識物質が放射性同位体である場合、シンチレーションカウンターなどの従来公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００３４】
本実施形態における免疫測定方法は、第１固相が粒子である場合、ＨＣＶを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、アルカリ性物質を含有する試薬で処理された試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、複合体が形成された粒子を洗浄する洗浄工程と、をさらに含み、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも１つが還元剤を含有することができる。
【００３５】
第１処理工程は、ＨＣＶを含む疑いのある試料と、アルカリ性物質を含有する試薬を混合する処理であれば、特に限定されない。第１処理工程を行うことにより、ＨＣＶからＨＣＶコア蛋白を遊離することができる。ここで、第１処理工程における、処理時間や処理温度は、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第１処理工程における処理時間や処理温度としては、例えば、第１処理工程において、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の濃度が２〜４％で、尿素の濃度が２〜４Ｍで、水酸化ナトリウムの濃度が０．１〜０．４Ｎの試薬を用いる場合、２０〜３０℃の処理温度で６〜１０分の処理時間で第１処理工程を行うことができる。
【００３６】
ここで、ＨＣＶを含む疑いのある試料は、生体試料又は生体試料から調製された試料が好ましい。生体試料及び生体試料から調製された試料としては、例えば、尿、糞便、全血、血漿、血清、胆汁、胃腸分泌物、リンパ液、精液、骨髄液、唾液、母乳、組織抽出液、組織ホモジネート、細胞抽出液、細胞ホモジネートなどが挙げられる。
【００３７】
本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらに非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。ここで、非イオン性界面活性剤は、公知のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができる非イオン性界面活性剤であれば、特に限定されない。本実施形態における非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好ましい。具体的なポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Triton X-100、Triton X-114及びNP-40等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween-20及びTween-80等）、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij35及びBrij45等）などが挙げられる。本実施形態におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３８】
第１処理工程における、非イオン性界面活性剤の濃度は、使用する非イオン性界面活性剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを用いる場合、第１処理工程における、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの濃度は２〜４％が好ましい。
【００３９】
また、本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらにカオトロピック剤を含有することが好ましい。ここで、カオトロピック剤は、蛋白質の分子構造を不安定化する性質を持つ物質であり、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、サルチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド及びホルムアルデヒドなどが挙げられる。本実施形態におけるカオトロピック剤としては、尿素が好ましい。
【００４０】
第１処理工程における、カオトロピック剤の濃度は、使用するカオトロピック剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、カオトロピック剤として尿素を用いる場合、第１処理工程における、尿素の濃度は２〜４Ｍが好ましい。
【００４１】
アルカリ性物質は、上述のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができるアルカリ性物質であれば、特に限定されない。ここで、アルカリ性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化マグネシウムなどが挙げられる。本実施形態におけるアルカリ物質としては、水酸化ナトリウムが好ましい。
【００４２】
第１処理工程における、アルカリ性物質の濃度は、使用するアルカリ性物質の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、アルカリ性物質として、水酸化ナトリウムを用いる場合、第１処理工程における水酸化ナトリウムの濃度は、０．１５〜０．５Ｎが好ましい。
【００４３】
なお、本実施形態における、アルカリ性物質を含有する試薬は、非イオン性界面活性剤とカオトロピック剤とを含有する試薬、及びそれぞれの成分を二つ以上の試薬に分けて含有する試薬キットが含まれる。ここで、試薬キットとしては、例えば、非イオン性界面活性剤及びカオトロピック剤を含有する第１試薬と、アルカリ性物質を含有する第２試薬とを備えた試薬キットなどが挙げられる。
【００４４】
第２処理工程では、第１処理工程で得られた試料と、酸性物質を含有する試薬とを混合し、第１処理工程で得られた試料のアルカリを中和する。第２処理工程で得られる試料のｐＨは、形成工程に影響を及ぼさないｐＨであることが好ましい。より具体的な第２処理工程で得られる試料のｐＨとしては、ｐＨ６．５〜８が好ましい。ここで、具体的な第２処理工程における処理時間や処理温度としては、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第２処理工程における処理時間や処理温度としては、２０〜３０℃の処理温度で３〜１５分である。
【００４５】
酸性物質は、特に限定されないが、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸、硫酸などが挙げられる。本実施形態における酸性物質としてはクエン酸が好ましい。ここで、第２処理工程で用いられる酸性物質を含有する試薬における、酸性物質の濃度は、使用する酸性物質や上述の第１処理工程で使用されたアルカリ性物質などに応じて、適宜調整すればよく、特に制限されない。上記酸性物質の濃度としては、例えば、酸性物質がクエン酸の場合、０．１〜０．３Ｍが好ましい。
【００４６】
ＨＣＶを含む疑いのある試料は、上述の第１処理工程及び第２処理工程により希釈される。ここで、第１処理工程及び第２処理工程後における、ＨＣＶを含む疑いのある試料の希釈は、ＨＣＶを含む疑いのある試料の種類に応じて、適宜調整すれば良い。例えば、上記試料が血清の場合、免疫測定に対する血清成分等の影響を抑制し、且つ、ＨＣＶコア蛋白を検出可能な濃度にする観点から、第１処理工程及び第２処理工程後における、血清の希釈は、３〜５倍が好ましい。
【００４７】
洗浄工程では、液体中に分散していた粒子を集め、液体を除去し、その後、洗浄液を添加して再び粒子を液体中に分散させる。この洗浄工程を行うことにより、識抗体−ＨＣＶコア蛋白−第１抗体複合体の形成に使用されなかった標識抗体、非イオン性界面活性剤、及びカオトロピック剤などの測定工程において不要又は悪影響を及ぼす成分を除去することができる。
【００４８】
洗浄工程における、液体中に分散していた粒子を集める方法は、粒子を用いた免疫測定法において公知であり、使用する粒子に応じて適宜設定することができる。例えば、粒子として磁性粒子を用いた場合、磁気分離により、液体中に分散していた粒子を集めることができる。より具体的には、まず、第２処理工程で得られた試料が入った容器の壁面に磁石を近づけ、磁石を用いて試料中の粒子を容器の壁面に固定する。そして、粒子を容器の壁面に固定した状態で液体を吸引除去する。粒子として磁性粒子を用いた場合、以上のようにすることで、液体中に分散していた粒子を集めることができる。また、粒子としてゼラチン粒子またはラテックス粒子を用いた場合、遠心分離により、液体中に分散していた粒子を集めることができる。より具体的には、まず、第２処理工程で得られた試料を遠心分離することで、遠心力により粒子を沈殿させる。そして、粒子を沈殿させた状態で液体を吸引除去する。粒子としてゼラチン粒子またはラテックス粒子を用いた場合、以上のようにすることで、液体中に分散していた粒子を集めることができる。
【００４９】
さらに、洗浄工程では、洗浄液を添加して粒子を懸濁し、再び粒子を液体中に分散させる。ここで、洗浄液としては、粒子上に形成された複合体に影響を及ぼさない緩衝液が好ましい。また、洗浄液は、界面活性剤を含有する緩衝液が特に好ましい。より具体的な洗浄液としては、たとえば、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）及びＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）などが挙げられる。なお、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）などの、市販の洗浄液を用いることもできる。
【００５０】
また、洗浄工程を行う回数は、粒子上に形成された複合体に影響を及ぼさない回数であれば特に制限されない。洗浄工程を繰り返すことで測定工程において不要又は悪影響を及ぼす成分を、さらに除去することができる。
【００５１】
本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、還元剤を含むことができる。第１固相が粒子である場合、上記試薬の少なくとも一つが還元剤を含むことが好ましい。第１固相が粒子である場合、上記試薬の少なくとも一つが還元剤を含むことで、洗浄工程において、集めた粒子を再び液体中に分散する際に、粒子が凝集することを防止することが出来る。
【００５２】
ここで、還元剤は、形成工程に影響を及ぼさない還元剤であれば、特に限定されない。本実施形態における還元剤としては、特に、蛋白質のジスルフィド結合を解離させるものが好ましい。より具体的な還元剤としては、例えば、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウムまたはホスフィンなどが挙げられる。本実施形態における還元剤としては、特にメルカプトエチルアミン、ジチオトレイトールおよびシステイン塩酸塩が好ましい。
【００５３】
上記試薬に含有される還元剤の濃度は、使用する還元剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、還元剤としてメルカプトエチルアミンを用いる場合、メルカプトエチルアミンの濃度は、１０〜６０ｍＭが好ましい。
【００５４】
本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、さらに無機塩類を含有することが好ましい。上記試薬の少なくとも一つが、さらに無機塩類を含有することにより、洗浄工程において、粒子の凝集をさらに抑制することができる。ここで、無機塩類は、形成工程に影響を及ぼさない無機塩類であれば、特に限定されない。本実施形態における無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムまたは硫酸ナトリウムなどが挙げられる。本実施形態における無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび硫酸ナトリウムが好ましい。
【００５５】
上記試薬に含有される無機塩類の濃度は、使用する無機塩類の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、無機塩類として塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウムの濃度は、０．１〜１．０Ｍが好ましい。
【００５６】
なお、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体は、それ自体公知の方法を用いて作製したハイブリドーマから得ることができる。
すなわち、所望により適切なアジュバントと混合したＨＣＶコア蛋白質で適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、該動物の脾臓細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。通常、抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、同種の動物に由来する。
細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるＰＥＧ法などにより行うことができる。細胞融合後、ＨＡＴ培地などの選択培地でハイブリドーマを選択し、ハイブリドーマのＨＣＶコア蛋白質を認識する抗体を産生する能力について、常法（例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ））に従ってスクリーニングを行う。次いで、適切な抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
上記のようにしてハイブリドーマが得られれば、その後、ハイブリドーマが産生する抗体のエピトープ解析を行う。こうすることで、ＨＣＶコア蛋白と結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない抗体を得ることが出来る。
【００５７】
より具体的なＨＣＶコア蛋白と結合する抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を以下に示す。
＜免疫抗原ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製＞
（Ａ）発現プラスミドの構築
配列番号１に示すＨＣＶコア領域の１−１６０番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んで以下のプラスミドを得る。
ｐＵＣ・pR-160：配列番号１に示されるＨＣＶコア領域蛋白質（pR-160）のプラスミド
【００５８】
配列番号１
MSTNPKPQRKTKRNANRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKDRRSTGKSWGKPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPTWGLTDPRHRSRNLGKVIDTITCGFADLMGYIPVVGAPVGGVARALAHGVRVLED
【００５９】
ｐＵＣ・pR-160のＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なう。約４８０ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、pR-160をコードするＤＮＡ断片をアガロースより精製する。
【００６０】
次に、発現ベクターｐＱＥ−３０(ＱＩＡＧＥＮ社製)を制限酵素反応液２０μｌ〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行う。約３０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡをアガロースより精製する。
【００６１】
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．1(タカラバイオ社製)を用いて、得られたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡ１μｇとpR-160をコードするＤＮＡ断片約0.3 pmolとを連結する反応を行う。
【００６２】
pR-160をコードするＤＮＡ断片の連結反応で得られた反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ−１０９株(タカラバイオ社製）株を形質転換する。形質転換に用いる感受性大腸菌株はE. coli JM109 Competent Cells(タカラバイオ社製)を使用する。形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト、１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温する。プレート上に生じた菌のコロニーを白金耳で１杯取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト）に移し、一晩３７℃で培養する。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ社製)を使用して、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションを行う。
【００６３】
得られる連結処理ＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ，１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なって、約４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片が生じるｐＱＥ−３０pR-160発現プラスミドを選別する。
【００６４】
（Ｂ）ｐＱＥ−３０pR-160でコードされるＨＣＶコア由来ポリペプチド（pR-160）の発現および精製
ｐＱＥ−３０pR-160発現プラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのLB培地に接種し、１晩３７℃で培養する。この培養液全量を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌのLB培地に植え継ぎ、３７℃で培養する。ＯＤ６００が０．５〜０．７の時に終濃度１ｍｍｏｌ／ｍＬになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトシドを加え、さらに１晩３７℃で培養する。この培養液を遠心分離して菌体を集める。
【００６５】
次に菌体ペレットの界面活性剤処理の操作を行う。
湿重量約１ｇの菌体に２ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）（室温）を加え、泡立てないように懸濁する。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら１０−２０分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。遠心後の不溶性の細胞残渣に１．８ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（室温）を加え、泡立てないように再懸濁する。懸濁液にリゾチウムを終濃度２００μg／ｍＬになるように加える。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら５分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
【００６６】
次に、不溶性画分の可溶化及び精製を行った。遠心後に得られた不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝８．０）1 ｍＬを加え、再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除く。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝９．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１０．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１１．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝１２．０） 1 ｍＬを加え、ＨＣＶ由来ポリペプチド（pR-160）を可溶化抽出する。
ニッケルチャージアガロースゲルを用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーでポリペプチドの精製を行い、可溶化した抽出物から、pR-160を得る。
【００６７】
＜ハイブリドーマの作製＞
（Ａ）マウスの免疫
pR-160抗原１００μｇから１０００μｇを含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１００μＬにフロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）１００μｌを混合して乳化させ、ＦＣＡ pR-160抗原溶液２００μｌを作製する。また、ＦＣＡではなくフロインドの不完全アジュバント（ＦＩＡ）を用いること以外は上記の手順と同様にして、ＦＩＡ pR-160抗原溶液２００μＬを作製する。
【００６８】
ＦＣＡ pR-160抗原溶液２００μｌを７〜８週齢の雌 Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与することにより初回免疫する。初回免疫後、２〜３週間毎にＦＩＡ pR-160抗原溶液２００μＬを用いて追加免疫を行う。脾細胞分離の１０日前及び３日前に、pR-160抗原２００μｌを静脈投与する。最後の投与から３日後に脾細胞を分離し、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３マウス骨髄腫細胞とＰＥＧ法により融合させ、ハイブリドーマを作製する。
【００６９】
（Ｂ）ハイブリドーマの培養
ハイブリドーマを２．５×１０6細胞/mlとなるようにＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴プレート（コーニング社製；以下、培養用プレートとする）の各ウェルに２．５×１０5細胞/ウェルとなるように分注する。培養用プレートを３７℃、８％ＣＯ2の恒温槽内に静置し、ハイブリドーマの培養を開始する。１０日間以上培養してハイブリドーマのコロニーを出現させたところで、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行う。
【００７０】
（Ｃ）ハイブリドーマのスクリーニング
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ3を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．５）に、pR-160抗原の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようpR-160抗原を添加し、固定用pR-160抗原溶液を調製する。この固定用pR-160抗原溶液１００μｌをイムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに分注する（以下、抗原固定プレートとする）。４℃で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、緩衝液Ａとする）で３回洗浄する。洗浄後、抗原固定プレートの各ウェルに１ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、緩衝液Ｂとする）３００μｌを添加して、２〜８℃で４時間以上静置保存する。抗原固定プレートは使用時まで２〜８℃で保存する。
【００７１】
抗原固定プレート中の緩衝液Ｂを除去する。除去後、緩衝液Ｂを抗原固定プレートの各ウェルに７５μｌずつ添加する。さらに、上述のハイブリドーマの培養における培養上清を、培養用プレートの各ウェルから取り出し、抗原固定プレートの各ウェルに２５μｌずつ添加する。緩衝液Ｂ及び培養上清添加後、室温で一時間攪拌する。攪拌後、緩衝液Ａで抗原固定プレートの各ウェルの洗浄を３回行う。洗浄後、緩衝液Ｂで１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートの各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で３０分間反応させる。反応後、緩衝液Ａで抗原固定プレートの各ウェルの洗浄を３回行う。洗浄後、ＰＯＤに対する基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む基質液を１００μＬずつ加え、室温で１０分間静置する。ついで、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を含む反応停止液を抗原固定プレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた後、各ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定する。
【００７２】
上記のようにして得ることが出来る配列番号１に示すＨＣＶコア蛋白と結合する抗体を産生するハイブリドーマをＨＣＦ４−８０１及びＨＥ２５と命名した。
ＨＣＦ４−８０１は受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４４で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４４で受託された。以下、該ハイブリドーマから産生される抗体をＨＣＦ４−８０１抗体と呼称する。
ＨＥ２５は受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４３で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４３で受託された。以下、該ハイブリドーマから産生される抗体をＨＥ２５抗体と呼称する。
【実施例】
【００７３】
実施例１
＜ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製＞
（Ａ）発現プラスミドの構築
配列番号２、３、又は４に示すＨＣＶコア領域の１−１６０番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んで以下のプラスミドを得た。
ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂ：配列番号２に示されるＨＣＶジェノタイプ１ｂのコア領域蛋白質（ＨＣＶ−Ｊ１ｂ）のプラスミド
ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ：配列番号３に示される４９番目のアミノ酸であるスレオニンがプロリンに変異したＨＣＶジェノタイプ１ｂのコア領域蛋白質（ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ）のプラスミド
ｐＵＣ・ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７：配列番号４に示されるＨＣＶジェノタイプ３ｂＮＥ１３７株のコア領域蛋白質（ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７）のプラスミド
【００７４】
配列番号２
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLED
配列番号３
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRAPRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLED
配列番号４
MSTLPKPQRQTKRNTYRRPQNVKFPGGGQIVGGVYVLPRRGPRLGVRAVRKTSERSQPRGRRQPIPKARSREGRSWAQPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPSWGPNDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLIGAPVGGVARALAHGVRALED
【００７５】
ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂのＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なった。約４８０ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、ＨＣＶ−Ｊ１ｂをコードするＤＮＡ断片をアガロースより精製した。
【００７６】
次に、発現ベクターｐＱＥ−３０(ＱＩＡＧＥＮ社製)を制限酵素反応液２０μｌ〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なった。約３０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む部位を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いて、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡをアガロースより精製した。
【００７７】
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．1(タカラバイオ社製)を用いて、得られたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII処理ベクターＤＮＡ１μｇとＨＣＶ−Ｊ１ｂをコードするＤＮＡ断片約0.3pmolとを連結する反応を行なった。
【００７８】
ＨＣＶ−Ｊ１ｂをコードするＤＮＡ断片の連結反応で得られた反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ−１０９株(タカラバイオ社製）株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株はE. coli JM109 Competent Cells(タカラバイオ社製)を使用した。形質転換大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト、１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーをで１杯取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、１．０％ＮａＣｌ，０．５%イーストエクストラクト）に移し、一晩３７℃で培養した。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ社製)を使用して、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションを行なった。
【００７９】
得られた連結処理ＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＫＣｌ，１５単位のＢａｍ Ｈ１および１５単位のＨｉｎｄ III酵素〕中で３７℃１時間消化し、その後１．０％アガロースゲル電気泳動を行なって、約４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII断片が生じるｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂ発現プラスミドを選別した。
【００８０】
なお、ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂを用いてｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂ発現プラスミドを選別した手順と同様にして、ｐＵＣ・ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐを用いてｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ発現プラスミドを選別し、ｐＵＣ・ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７を用いてｐＱＥ−３０ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７発現プラスミドを選別した。
【００８１】
（Ｂ）ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂでコードされるＨＣＶコア由来ポリペプチド（ＨＣＶ−Ｊ１ｂ）の発現および精製
ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂ発現プラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのLB培地に接種し、１晩３７℃で培養する。この培養液全量を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌのLB培地に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００が０．５〜０．７の時に終濃度１ｍｍｏｌ／ｍＬになるようにイソプロピル−β−D−チオガラクトシドを加え、さらに１晩３７℃で培養した。この培養液を遠心分離して菌体を集めた。
【００８２】
次に菌体ペレットの界面活性剤処理の操作を行った。
湿重量約１ｇの菌体に２ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）（室温）を加え、泡立てないように懸濁する。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら１０−２０分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。遠心後の不溶性の細胞残渣に１．８ｍLのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ（室温）を加え、泡立てないように再懸濁する。懸濁液にリゾチウムを終濃度２００μg／ｍＬになるように加える。回転式振とう器を用いて、低速でゆるやかに振とうしながら５分間インキュベートする。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
【００８３】
次に、不溶性画分の可溶化及び精製を行った。遠心後に得られた不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝８．０）1 ｍＬを加え、再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除く。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝９．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１０．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ；（ｐＨ＝１１．０） 1 ｍＬを加え再懸濁する。７５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清をのぞく。
遠心後の不溶性画分に８Ｍ ウレア、 ０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ;（ｐＨ＝１２．０） 1 ｍＬを加え、ＨＣＶ由来ポリペプチド（ＨＣＶ−Ｊ１ｂ）を可溶化抽出した。
ニッケルチャージアガロースゲルを用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーでポリペプチドの精製を行い、可溶化した抽出物から、ＨＣＶ−Ｊ１ｂを得た。
【００８４】
なお、ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂを用いてＨＣＶ−Ｊ１ｂを得た手順と同様にして、ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐ発現プラスミドを用いてＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐを得て、ｐＱＥ−３０ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７発現プラスミドを用いてＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７を得た。
【００８５】
実施例２
＜エピトープ解析＞
実施例１で得たＨＣＶ−Ｊ１ｂ及びＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐと表１に示される合成ペプチドCDP-2、CDP-2-1、CDP-3、及びCDP-3-1とを使用して、抗ＨＣＶコア蛋白質モノクローナル抗体であるＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体のエピトープを解析した。なお、CDP-2、CDP-2-1、CDP-3、及びCDP-3-1は、それぞれ、Keyhole Limpet Hemocyaninをコンジュゲートした合成ペプチドであり、オペロンバイオテクノロジー株式会社に調製を外部委託し、調製された。
【００８６】
表１：ＨＣＶコア由来のペプチドのアミノ酸配列表
【００８７】
（Ａ）CDP-2とＨＣＦ４−８０１抗体との反応性の確認
０．１ｗ／ｖ％ＮａＮ3を含む０．１Ｍ リン酸緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．５）に、CDP-2の濃度が０．５μｇ／ｍｌとなるようCDP-2を添加し、固定用CDP-2溶液を調製した。この固定用CDP-2溶液１００μｌをイムノモジュール（ＮＵＮＣ社製）のウェルに分注した（以下、抗原固定プレートとする）。４℃で一晩静置した後、０．０５％の濃度でＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液（以下、緩衝液Ａとする）で３回洗浄した。洗浄後、ペプチド固定プレートのウェルに１ｗ／ｖ％の濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、緩衝液Ｂとする）３００μｌを添加して、２〜８℃で４時間以上静置保存した。抗原固定プレートは使用時まで２〜８℃で保存した。
【００８８】
CDP-2固定プレート中の緩衝液Ｂを除去した。除去後、緩衝液Ｂを抗原固定プレートのウェルに７５μｌずつ添加した。さらに、ＨＣＦ４−８０１ハイブリドーマの培養における培養上清を、培養用プレートのウェルから取り出し、抗原固定プレートのウェルに２５μｌ添加した。緩衝液Ｂ及び培養上清添加後、室温で一時間攪拌した。攪拌後、緩衝液Ａで抗原固定プレートのウェルの洗浄を３回行った。洗浄後、緩衝液Ｂで１００００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製；Code No. P0447）を抗原固定プレートのウェルに１００μｌ添加し、室温で３０分間反応させた。反応後、緩衝液Ａで抗原固定プレートのウェルの洗浄を３回行った。洗浄後、ＰＯＤに対する基質であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む基質液を１００μＬ加え、室温で１０分間静置した。ついで、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を含む反応停止液を抗原固定プレートのウェルに１００μＬ加えた後、ウェル中の反応液について、マイクロプレートリーダ（Molecular Devices社製）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が０．１５以上であれば反応性ありとみなし、０．１５未満であれば反応性なしとみなした。
【００８９】
（Ｂ）CDP-2とＨＥ２５抗体との反応性の確認
CDP-2とＨＣＦ４−８０１抗体との反応性の確認と同様にして行った。
【００９０】
なお、実施例２（Ａ）及び実施例２（Ｂ）と同様にして、CDP-2-1、CDP-3、CDP-3-1、ＨＣＶ−Ｊ１ｂ及びＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐについても、ＨＣＦ４−８０１抗体との反応性の確認及びＨＥ２５抗体との反応性の確認を行った。その結果を表２に示す。
【００９１】
表２：ＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体と各合成ポリペプチドとの反応性の有無
○：反応性あり、×反応性なし
【００９２】
表２から、ＨＣＦ４−８０１抗体は配列番号２に示すＨＣＶコア領域の２１〜３０番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体であることが分かった。
ＨＥ２５抗体はCDP-2、及びCDP-3-1との反応性から配列番号２に示すＨＣＶコア領域の４１〜５０番目のアミノ酸配列にエピトープがあることが分かる。さらに、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐとの反応性があるため、配列番号２に示すＨＣＶコア領域の４９番目のアミノ酸を含まないエピトープであることが分かる。以上の結果から、ＨＥ２５抗体は配列番号２に示すＨＣＶコア領域の４１〜４８番目のアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体であることが分かった。
【００９３】
実施例３
＜抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体のジェノタイプ反応性＞
実施例１で得られたＨＣＶコア領域由来のポリペプチドを用いて、以下の実験を行った。
本例で使用する試薬は以下に示す。
【００９４】
標識抗体試薬：
標識抗体として、ＡＬＰで標識された抗ＨＣＶ抗体（ＡＬＰ標識ＨＣＦ４−８０１）を用いた。具体的な標識抗体試薬の作製は、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したALPを混合して、反応させることで標識抗体を調製する。この方法で調製したALP標識抗体は、希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２）で80倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【００９５】
第１抗体試薬：
第１抗体として、ビオチン及びＤＮＰで修飾された抗体（Ｂｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＥ２５）を用いた。具体的な第１抗体試薬の作製は、ビオチン化試薬（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents:ピアス社）をBSAに添加して、次いでDNP標識試薬（DNP-X acid SE:ABD Bioquest社）を添加することでBiotin/DNP標識したBSAを調製する。次に、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したBiotin/DNP標識したBSAを混合して、反応させることで第１抗体を調製する。この方法で調製した第１抗体を５０倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【００９６】
磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ ＰＥＧ−ＮＨ２；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。5μｌの該磁性粒子を、995μｌの希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３）で200倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
【００９７】
固相：
固相としては、ストレプトアビジンを固定化したプレート（ストレプトアビジンプレート）を用いた。ストレプトアビジンプレートは、C8 WHITE MAXISORPプレート(Nunc社製)に対して、ストレプトアビジン（和光純薬）10μg/mlの溶液100μlを室温で感作させ作製した。
【００９８】
遊離剤：
第１抗体及び第２抗体の結合を解離する物質として、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いた。ＤＮＰ−Ｌｙｓ（東京化成社製）が３．０ｍＭとなるように、希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、０．５ｗｔ％ カゼインナトリウム）で希釈し、遊離剤とした。
【００９９】
実施例１で調製したリコンビナントＨＣＶコア抗原を、濃度が１００ｐｇ/ｍＬとなるように希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３）で希釈し、抗原サンプルとした。
【０１００】
リコンビナントＨＣＶコア抗原を含むサンプルを用いて、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体のジェノタイプ反応性を調べた。
【０１０１】
＜形成工程＞
１００ｐｇ/ｍＬのリコンビナントＨＣＶコア抗原を含む１２５μｌの試料と、５０μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で５分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜洗浄工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行い、上清を除去し、反応キュベットに３８０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＩＳＣＬ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ；シスメックス社製）を添加し、再び磁気分離を行う洗浄を行った。上記洗浄を２回繰り返した後、さらに１９０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を１回行うことで、洗浄工程を実施した。
＜転移工程＞
洗浄工程で得られた試料を含む反応キュベットに、５０μｌの遊離剤を添加し、室温で４分間インキュベートした。次に、磁気分離を行い、上清を固相に移し、室温で２０分間インキュベートした。次に、上清を除去し、３００μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、再び上清を除去する洗浄を行った。上記の洗浄は５回繰り返し行うことで、転移工程を実施した。
＜測定工程＞
転移工程で得られた試料を含む固相に、２５μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ４試薬（シスメックス社製）と２５μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ５試薬を添加し、４２℃で５分間インキュベートした。次に、FLUOstar OPTIMA（BMG LABTECH社製）を用いて測光（３ｓｅｃ ａｔ ｇａｉｎ ４０９５）を行い、発光強度（Ｃｏｕｎｔｓ）を測定することで測定工程を実施した。
【０１０２】
その結果を図１に示す。図１には、ネガティブコントロール（ＮＣ）の反応性、ＨＣＶ−Ｊ１ｂの反応性、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐの反応性、及びＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７の反応性を示している。各反応性は、ＨＣＶ−Ｊ１ｂの発光強度を１００として、ネガティブコントロール（ＮＣ）の発光強度、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐの発光強度、及びＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７の発光強度を算出することで得た。
【０１０３】
図１から明らかなように、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体であるＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体を用いた測定においては、ＨＣＶ−Ｊ１ｂＴ４９Ｐに対して、ＨＣＶ−Ｊ１ｂと同等レベルで検出でき、ＨＣＶ−３ｂＮＥ１３７に対しては、ＨＣＶ−Ｊ１ｂ以上に高感度に検出できた。このことから、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を結合部位に含まない２種類の抗体を用いることで、ＨＣＶ−１ｂ変異体及びＨＣＶ−３ｂのＨＣＶコア蛋白を高感度に検出できることが示唆された。
【０１０４】
実施例４
＜抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体のジェノタイプ反応性＞
ＨＣＶ陽性患者から得られた、ＨＣＶのジェノタイプ及びＨＣＶ−ＲＮＡ量が既知であるＨＣＶ陽性血清４３−４８を用いて、以下の実験を行った。
【０１０５】
本例で使用する試薬は以下に示す。
【０１０６】
第１処理試薬：
カオトロピック剤として尿素を６Ｍ、界面活性剤としてＢｒｉｊ３５（シグマ社製）を４％、及びアルカリ性物質として水酸化ナトリウムを０．４５Ｎ含む水溶液を、第１処理試薬とした。
【０１０７】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２処理試薬Ａ〜Ｃの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ａ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
（第２処理試薬Ｂ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
（第２処理試薬Ｃ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
ＮａＣｌ ０．６ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｂには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｃには、還元剤としてメルカプトエチルアミン、及び無機塩類としてＮａＣｌが含まれている。
【０１０８】
標識抗体試薬：
実施例３で使用した標識抗体試薬と同様のALP標識抗体20μｌを、980μｌの希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２）で80倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【０１０９】
第１抗体試薬：
実施例３と同様の第１抗体試薬25 μｌを、475 μｌの希釈液で２０倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【０１１０】
磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０；インビトロジェン社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。100μｌの該磁性粒子を、900μｌの希釈液で10倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
【０１１１】
固相：
実施例３と同様のストレプトアビジンプレートを使用した。
【０１１２】
遊離剤：
第１抗体及び第２抗体の結合を解離する物質として、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いた。ＤＮＰ−Ｌｙｓ（東京化成社製）が０．２ｍＭとなるように、希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３）で希釈し、遊離剤とした。
【０１１３】
ＨＣＶ陽性血清：
ＨＣＶ陽性血清として、以下の表３に示すＷｏｒｌｄＷｉｄｅ HCV Performance Panel（ＳｅｒａＣａｒｅ社製）を用いた。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
表３に示すＨＣＶ陽性血清４３〜４８に含まれる、ＨＣＶコア蛋白の検出を以下のように実施した。
【０１１６】
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陽性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬を添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、１２０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜洗浄工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行い、上清を除去し、反応キュベットに３８０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＩＳＣＬ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ；シスメックス社製）を添加し、再び磁気分離を行う洗浄を行った。上記洗浄を２回繰り返した後、さらに１９０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を１回行うことで、洗浄工程を実施した。
＜転移工程＞
洗浄工程で得られた試料を含む反応キュベットに、４０μｌの遊離剤を添加し、室温で４分間インキュベートした。次に、磁気分離を行い、上清を固相に移し、室温で２０分間インキュベートした。次に、上清を除去し、３００μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、再び上清を除去する洗浄を行った。上記の洗浄は５回繰り返し行うことで、転移工程を実施した。
＜測定工程＞
転移工程で得られた試料を含む固相に、２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ４試薬（シスメックス社製）と２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ５試薬を添加し、４２℃で４分間インキュベートした。次に、FLUOstar OPTIMA（BMG LABTECH社製）を用いて測光（３ｓｅｃ ａｔ ｇａｉｎ ４０９５）を行い、発光強度（Ｃｏｕｎｔｓ）を測定することで測定工程を実施した。
【０１１７】
その結果を図２に示す。図２には、ＨＣＶ−ＲＮＡ量と発光強度との関係を示している。図２から明らかなように、抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体であるＨＣＦ４−８０１抗体及びＨＥ２５抗体を用いた測定を行うと、ＨＣＶ−ＲＮＡ量と発光強度との相関において、乖離するジェノタイプが見られなかった。このことから、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を結合部位に含まない２種類の抗体を用いることで、ＨＣＶの各ジェノタイプのコア蛋白を同程度に検出できることが示唆された。
【０１１８】
実施例５
＜還元剤による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
本例で使用する試薬は以下に示す。
【０１１９】
第１処理試薬：
カオトロピック剤として尿素を６Ｍ、界面活性剤としてＢｒｉｊ３５（シグマ社製）を４％、及びアルカリ性物質として水酸化ナトリウムを０．４５Ｎ含む水溶液を、第１処理試薬とした。
【０１２０】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２処理試薬Ａ〜Ｃの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ａ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
（第２処理試薬Ｂ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
（第２処理試薬Ｃ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
ＮａＣｌ ０．６ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｂには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｃには、還元剤としてメルカプトエチルアミン、及び無機塩類としてＮａＣｌが含まれている。
【０１２１】
標識抗体試薬：
標識抗体として、ＡＬＰで標識された抗ＨＣＶ抗体（ＡＬＰ標識ＨＣＦ３−８０７）を用いた。ここで、ＨＣＦ３−８０７としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４２で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４２で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。具体的な標識抗体試薬の作製は、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したALPを混合して、反応させることで標識抗体を調製する。この方法で調製したALP標識抗体20μｌを、980μｌの希釈液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．２５％ ＢＳＡ、０．０２％ ＮａＮ３、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ２）で50倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【０１２２】
第１抗体試薬：
第１抗体として、ビオチン及びＤＮＰで修飾された抗体（Ｂｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＣＦ４−１０４）を用いた。ここで、ＨＣＦ４−１０４としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４１で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４１で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。具体的な第１抗体試薬の作製は、ビオチン化試薬（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents:ピアス社）をBSAに添加して、次いでDNP標識試薬（DNP-X acid SE:ABD Bioquest社）を添加することでBiotin/DNP標識したBSAを調製する。次に、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したBiotin/DNP標識したBSAを混合して、反応させることで第１抗体を調製する。この方法で調製した5 μｌの第１抗体を、495 μｌの希釈液で１００倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【０１２３】
磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０；インビトロジェン社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８４５で受託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。100μｌの該磁性粒子を、900μｌの希釈液で10倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
【０１２４】
還元剤による、磁性粒子の凝集の抑制効果を、以下の通り確認した。
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陰性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬Ａ〜Ｃをそれぞれ添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、８０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜洗浄工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行った。磁気分離した磁性粒子に、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）を３００μｌ添加し、ボルテックスミキサーを用いて分散させることで、洗浄工程を実施した。その後、反応キュベットを静置し、粒子の凝集を評価した。
【０１２５】
ここで、粒子の凝集の評価は、目視により観察し、凝集の程度を次の３段階に分けて評価した。
＋＋：凝集が認められる。
＋：やや凝集が認められる。
−：凝集が認められない。
第２処理工程において、第２処理試薬Ａ〜Ｃを用いた試料における、反応キュベット内の凝集の評価を表４に示す。
【０１２６】
【表４】
【０１２７】
表４から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む、第２処理試薬Ｂ又は第２処理試薬Ｃを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が確認が認められなかった。このことから、第２処理試薬に還元剤を添加することで、洗浄工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。
【０１２８】
実施例６
＜還元剤の種類及びＨＣＶの存在による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、還元剤の種類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｄ〜Ｆを調製した。また、試料として使用する血清中のＨＣＶの存在の有無が凝集に影響するかを調べるため、本例では、ＨＣＶ陰性血清に代えて、ＨＣＶ陽性血清を用いた。
【０１２９】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｄ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｅ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
ジチオトレイトール ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｆ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
システイン塩酸塩 ９０ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｅには、還元剤としてジチオトレイトールが含まれている。また、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてシステイン塩酸塩が含まれている。
【０１３０】
上述した第２処理試薬Ｄ〜Ｆ、及びＨＣＶ陽性血清を用いること以外は、実施例５と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表５に示す。
【０１３１】
【表５】
【０１３２】
表５から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む第２処理試薬Ｄでは、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、実施例５と同様に磁性粒子の凝集が認められなかった。また、ジチオトレイトールを含む第２処理試薬Ｅ、およびシステイン塩酸塩を含む第２処理試薬Ｆを用いて処理した試料でも、第２処理試薬Ｄと同様に、磁性粒子の凝集が認められなかった。このことから、還元剤の種類を問わず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、洗浄工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。また、血清中のＨＣＶの存在の有無にかかわらず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、洗浄工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。
【０１３３】
実施例７
＜無機塩類による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤及び無機塩類を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、無機塩類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｇ〜Ｉを調製した。
【０１３４】
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｇ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化ナトリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｈ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化カリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｉ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
硫酸ナトリウム ０．６Ｍ
ここで、第２処理試薬Ｇには、無機塩類として塩化ナトリウムが含まれている。また、第２処理試薬Ｈには、無機塩類として塩化カリウムが含まれている。さらにまた、第２処理試薬Ｉには、無機塩類として硫酸ナトリウムが含まれている。
【０１３５】
上述した第２処理試薬Ｇ〜Ｉを用いること以外は、実施例５と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表６に示す。
【０１３６】
【表６】
【０１３７】
表６から明らかなように、第２処理工程において、無機塩類を含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、塩化ナトリウムを含む第２処理試薬Ｇ、塩化カリウムを含む第２処理試薬Ｈ、及び硫酸ナトリウムを含む第２処理試薬Ｉでは、磁性粒子の凝集がやや認められたものの、第２処理試薬Ａに比べ、磁性粒子の凝集の抑制効果が認められた。このことから、還元剤の磁性粒子の凝集の抑制効果より低いが、無機塩類にも磁性粒子の凝集の抑制効果があることが示された。従って、還元剤及び無機塩類の添加により、より効果的に磁性粒子の凝集が抑制できることが示唆された。
【０１３８】
実施例８
＜還元剤を含む前処理液を用いた免疫複合体転移測定法によるＨＣＶの有無の判定＞
ＨＣＶ陽性患者から得られた、ＨＣＶ陽性血清1〜４２を用いて、以下の実験を行った。
【０１３９】
本例で使用する試薬は以下に示す。
【０１４０】
第１処理試薬：
実施例５と同様の試薬を使用した。
【０１４１】
第２処理試薬：
実施例５の第２処理試薬Ｃと同様の試薬を使用した。
【０１４２】
標識抗体試薬：
実施例５と同様の操作により調製したＡＬＰ標識ＨＣＦ３−８０７ 10μｌを、590μｌの標識抗体用希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＺｎＣｌ２ ０．１ｍＭ）で60倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
【０１４３】
第１抗体試薬：
実施例５と同様の操作により調製した5μｌのＢｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＣＦ４−１０４を、495 μｌの希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％）で１００倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
【０１４４】
磁性粒子試薬：
実施例５と同様の操作により調製した抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子を使用した。
【０１４５】
固相：
固相としては、ストレプトアビジンを固定化したプレート（ストレプトアビジンプレート）を用いた。ストレプトアビジンプレートは、C8 WHITE MAXISORPプレート(Nunc社製)に対して、ストレプトアビジン（和光純薬）10μg/mlの溶液100μlを室温で感作させ作製した。
【０１４６】
遊離剤：
第１抗体及び第２抗体の結合を解離する物質として、ＤＮＰ−Ｌｙｓを用いた。ＤＮＰ−Lysine（東京化成社製）が０．２ｍＭとなるように、希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．６Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％）で希釈し、遊離剤とした。
【０１４７】
ＨＣＶ陽性血清１〜４２に含まれる、ＨＣＶコア蛋白の有無の判定を以下のように実施した。
【０１４８】
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陽性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬を添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、８０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜分離工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行い、上清を除去し、反応キュベットに３８０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＩＳＣＬ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ；シスメックス社製）を添加し、再び磁気分離を行う洗浄を行った。上記洗浄を２回繰り返した後、さらに１９０μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒによる洗浄を１回行うことで、分離工程を実施した。
＜転移工程＞
分離工程で得られた試料を含む反応キュベットに、４０μｌの遊離剤を添加し、室温で４分間インキュベートした。次に、磁気分離を行い、上清を固相に移し、室温で２０分間インキュベートした。次に、上清を除去し、３００μｌのｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、再び上清を除去する洗浄を行った。上記の洗浄は５回繰り返し行うことで、転移工程を実施した。
＜測定工程＞
転移工程で得られた試料を含む固相に、２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ４試薬（シスメックス社製）と２０μｌのＨＩＳＣＬ Ｒ５試薬を添加し、４２℃で４分間インキュベートした。次に、FLUOstar OPTIMA（BMG LABTECH社製）を用いて測光（３ｓｅｃ ａｔ ｇａｉｎ ４０９５）を行い、発光強度（Ｃｏｕｎｔｓ）を測定することで測定工程を実施した。
＜判定工程＞
測定工程で得られた発光強度の値（測定値）に基づき、試料中に含まれるＨＣＶコア蛋白の有無を判定した。具体的には、各試料の測定値が閾値以上の場合は、試料中にＨＣＶが有ると判定し、測定値が閾値未満の場合は、試料中にＨＣＶが無いと判定した。なお、１０３のＨＣＶ陰性血清に対し、上述の第１処理工程から測定工程までの操作を行って得られた測定値の平均値を算出し、平均値の標準偏差に１５を掛けた値を平均値に加算した数値を閾値とした。ここで、測定値の平均値は２０５４．６、標準偏差は１２５．３、及び閾値は３９３４．４であった。
【０１４９】
比較例１
＜従来技術によるＨＣＶの有無の判定＞
従来技術としてルミスポット栄研ＨＣＶ抗原（栄研化学製・登録商標）を用いたＨＣＶの有無の判定を行った。上記のＨＣＶ陽性血清１〜４２を、ルミスポット栄研ＨＣＶコア抗原の添付文書に記載されたプロトコールに従って処理し、全自動化学発光酵素免疫測定装置ＬＳ−２０００（栄研化学製・登録商標）を用いて、各ＨＣＶ陽性血清中のＨＣＶ抗原を検出し、ＨＣＶの有無を判定した。なお、ルミスポット栄研ＨＣＶ抗原によるＨＣＶ抗原の検出限界、すなわちＨＣＶの有無の判定の閾値は0.4ｐｇ／ｍｌである。
【０１５０】
ＨＣＶ陽性血清１〜４２を用いた、比較例１及び実施例８による測定結果及び判定結果を表７に示す。
【０１５１】
なお、表７で用いられている記号は、以下の内容を表す。
○：試料中にＨＣＶは有ると判定
×：試料中にＨＣＶは無いと判定
−：検出限界未満
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
表７から明らかなように、比較例１では、ＨＣＶ陽性血清のうち１１試料（ＨＣＶ陽性血清２、３、７、８、及び１０〜１６）について、ＨＣＶが有ると判定できなかった。それに対し、実施例８では、そのうち５試料(ＨＣＶ陽性血清２，３，８，１０及び１５)で、試料中にＨＣＶが有ると判定できた。また、実施例８では、比較例１でＨＣＶが有ると判定できた３１試料の全てについて、ＨＣＶが有ると判定することができた。従って、実施例８は、比較例１よりも、より正確にＨＣＶの有無を判定できることが示された。このことから、還元剤を含む前処理液を用いた免疫複合体転移測定法により、より正確に試料中のＣ型肝炎ウイルスの有無を判定することが示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、
ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、
第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、
第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、
標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない、
免疫測定方法。
【請求項２】
標識抗体及び第１抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の２１−３０番目のアミノ酸配列又は４１−４８番目のアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識抗体及び第１抗体に用いられる抗体が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８４４及びＮＩＴＥ Ｐ−８４３から選択されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標識抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の２１−３０番目のアミノ酸配列であり、第１抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４１−４８番目のアミノ酸配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標識抗体が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８４４のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であり、第１抗体に用いられる抗体がＮＩＴＥ Ｐ−８４３のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
形成工程が、標識抗体、ＨＣＶコア蛋白、第１抗体、及び第１抗体と結合する第２抗体を固定した第１固相を接触させることで、標識抗体、ＨＣＶコア蛋白、第１抗体及び第２抗体からなる複合体を、第１固相上に形成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第２固相が、第１抗体と結合する物質が固定化された固相であり、
転移工程が、第１固相上に形成された複合体における、第１抗体及び第２抗体の結合を解離することで、遊離した標識抗体、ＨＣＶコア蛋白及び第１抗体からなる複合体を、第１固相から第２固相に転移する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１固相が粒子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＨＣＶを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、
アルカリ性物質を含有する試薬で処理された試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、
複合体が形成された粒子を洗浄する洗浄工程と、をさらに含み、
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも１つが還元剤を含有する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
還元剤が、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択され
る少なくとも１つである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１処理工程で用いられる試薬が、非イオン性界面活性剤を含有する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１処理工程で用いられる試薬が、カオトロピック剤を含有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
カオトロピック剤が、尿素、グアニジン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド及びホルムアミドから選択される少なくとも１つである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アルカリ性物質が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化マグネシウムから選択される少なくとも１つである請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
酸性物質が、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸及び硫酸から選択される少なくとも１つである請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
無機塩類が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも１つである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
粒子が、磁性粒子である請求項８〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体を含む第１試薬と、
ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体を含む第２試薬と、
第１固相と、
第１抗体及び第１固相と結合する第２抗体を含む第３試薬と、
第１抗体と結合する物質が固定化された第２固相と、を含み、
標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含ない、
ＨＣＶの免疫測定試薬キット。
【請求項２１】
標識抗体及び第１抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の２１−３０番目のアミノ酸配列又は４１−４８番目のアミノ酸配列である、
請求項２０に記載の試薬キット。
【請求項２２】
標識抗体及び第１抗体に用いられる抗体が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８４４及びＮＩＴＥ Ｐ−８４３から選択されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である、
請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項２３】
第１固相が粒子を含む第４試薬である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項２４】
アルカリ性物質を含む第５試薬と、
酸性物質を含む第６試薬と、をさらに含み、
第５試薬及び第６試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する、
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の免疫測定方法であって、
ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体、ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体及びＨＣＶコア蛋白を含む複合体を、第１の固相上に形成する工程と、
第１固相上に形成された複合体を、第１固相から遊離し、第１固相とは異なる第２の固相に転移する工程と、
第２固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、を含み、
標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含まない、
免疫測定方法。
【請求項２】
標識抗体及び第１抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の２１−３０番目のアミノ酸配列又は４１−４８番目のアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識抗体及び第１抗体に用いられる抗体が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８４４及びＮＩＴＥ Ｐ−８４３から選択されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標識抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の２１−３０番目のアミノ酸配列であり、第１抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４１−４８番目のアミノ酸配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標識抗体が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８４４のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体であり、第１抗体に用いられる抗体がＮＩＴＥ Ｐ−８４３のハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
形成工程が、標識抗体、ＨＣＶコア蛋白、第１抗体、及び第１抗体と結合する第２抗体を固定した第１固相を接触させることで、標識抗体、ＨＣＶコア蛋白、第１抗体及び第２抗体からなる複合体を、第１固相上に形成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第２固相が、第１抗体と結合する物質が固定化された固相であり、
転移工程が、第１固相上に形成された複合体における、第１抗体及び第２抗体の結合を解離することで、遊離した標識抗体、ＨＣＶコア蛋白及び第１抗体からなる複合体を、第１固相から第２固相に転移する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第１固相が粒子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＨＣＶを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、
アルカリ性物質を含有する試薬で処理された試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、
複合体が形成された粒子を洗浄する洗浄工程と、をさらに含み、
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも１つが還元剤を含有する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
還元剤が、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択され
る少なくとも１つである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第１処理工程で用いられる試薬が、非イオン性界面活性剤を含有する、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第１処理工程で用いられる試薬が、カオトロピック剤を含有する、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
カオトロピック剤が、尿素、グアニジン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド及びホルムアミドから選択される少なくとも１つである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アルカリ性物質が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化マグネシウムから選択される少なくとも１つである請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
酸性物質が、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸及び硫酸から選択される少なくとも１つである請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
無機塩類が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも１つである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
粒子が、磁性粒子である請求項８〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＣＶコア蛋白に結合する標識抗体を含む第１試薬と、
ＨＣＶコア蛋白に結合する第１抗体を含む第２試薬と、
第１固相と、
第１抗体及び第１固相と結合する第２抗体を含む第３試薬と、
第１抗体と結合する物質が固定化された第２固相と、を含み、
標識抗体及び第１抗体は、それぞれＨＣＶコア蛋白の異なる部位に結合し、且つ結合する部位に、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の４９番目のアミノ酸を含ない、
ＨＣＶの免疫測定試薬キット。
【請求項２１】
標識抗体及び第１抗体の結合する部位が、配列番号２に示されるＨＣＶコア蛋白の２１−３０番目のアミノ酸配列又は４１−４８番目のアミノ酸配列である、
請求項２０に記載の試薬キット。
【請求項２２】
標識抗体及び第１抗体に用いられる抗体が、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８４４及びＮＩＴＥ Ｐ−８４３から選択されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体である、
請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項２３】
第１固相が粒子を含む第４試薬である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項２４】
アルカリ性物質を含む第５試薬と、
酸性物質を含む第６試薬と、をさらに含み、
第５試薬及び第６試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する、
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の試薬キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１７９８６５（Ｐ２０１１−１７９８６５Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４２２１７（Ｐ２０１０−４２２１７）
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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