Ｃ型肝炎ウイルスの検出及び定量方法
【課題】生体サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の検出及び定量方法及び試薬と、前記方法を実施するためのキットを提供する。
【解決手段】ＨＣＶゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、ＨＣＶ核酸配列を含む既知量の内部対照オリゴヌクレオチドと；内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第１の標識プローブと；ＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第２の標識プローブを添加し、これを競合的に同時増幅し、プローブとアプリコンにハイブリッドを形成し、ハイブリッドを検出することによりＣ型肝炎ウイルスを定量する方法。
【解決手段】ＨＣＶゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、ＨＣＶ核酸配列を含む既知量の内部対照オリゴヌクレオチドと；内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第１の標識プローブと；ＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第２の標識プローブを添加し、これを競合的に同時増幅し、プローブとアプリコンにハイブリッドを形成し、ハイブリッドを検出することによりＣ型肝炎ウイルスを定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の検出及び定量方法及び試薬と、前記方法を実施するためのキットに関する。
【０００２】
本明細書に引用する文献については、明細書の末尾に参考文献の項目で包括目録を添付する。本明細書に引用する全文献は参考資料として本明細書に組込む。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は約９，４００ヌクレオチドのゲノムを含む１本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｃｌａｒｋ（１９９７）参照。ＨＣＶは輸血後非Ａ、非Ｂ肝炎の主要な病因物質として世界中で同定されている。Ｒｏｓｅｎ ＆ Ｇｒｅｔｃｈ（１９９９）参照。ＨＣＶ感染個体の約８５％が慢性肝炎を発症し、慢性感染個体の約２０％が肝硬変を発症している。Ｒｏｓｅｎ ＆ Ｇｒｅｔｃｈ（１９９９）。肝硬変患者における肝細胞癌の発生率は年間約１％〜４％である。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ（１９９９）参照。
【０００４】
抗ＨＣＶ抗体の検出用血清試験が開発されている。Ｃｌａｒｋ（１９９７）参照。しかし、終息した感染を活動中の感染から区別することができないので、抗ＨＣＶの存在がＨＣＶウイルス血症の直接指標となる訳ではない。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性が活動中のＨＣＶ感染の代用指標として使用されているが、ＡＬＴ活性もＨＣＶウイルス血症の直接指標にはならない。例えば、米国特許第５，２７９，９４４号参照。
【０００５】
ＨＣＶ ＲＮＡの検出及び定量用核酸試験はＨＣＶウイルス血症の直接指標となるので、血液安全性を改善し、治療中の患者をモニターするために益々重要になっている。ＨＣＶの定性試験は輸血後ＨＣＶ感染症例数を低下させるのに役立っている。これらの定性試験の典型例はＮａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の製品であるＵｌｔｒａＱｕａｌ（登録商標）ＨＣＶ−ＲＴ−ＰＣＲアッセイである。この試験はヒト血漿プールにおけるＨＣＶの存在の定性試験として米国食品医薬品局により認可されている。１９９６年６月１８日発行米国特許第５，５２７，６６９号も参照。
【０００６】
同様に、ＨＣＶ ＲＮＡの定量試験もインターフェロン単独療法及びインターフェロン／リバビリン併用療法等の治療に対する抗ウイルス応答の効力を把握するのに役立っている。ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎら（１９９８）及びＤａｖｉｓら（１９９８）参照。抗ウイルス剤の投与前、投与中及び投与後にＨＣＶウイルス負荷試験が実施されている。投与前の基線測定時における低レベルのウイルス血症がインターフェロン療法に対する高応答に有意に相関したことから、このような療法に対する個々の患者の応答を予測するためにＨＣＶウイルス負荷が使用された。Ｉｚｏｐｅｔら（１９９８）；Ｋａｋｕｍｕら（１９９７）；及びＴｏｙｏｄａら（１９９６）参照。ＨＣＶウイルス負荷試験により治療をモニターすると、医師は治療に応答する患者と応答しない患者を区別することができ、治療期間を決定し、個々の患者に治療を調整することができる。Ｉｚｏｐｅｔら（１９９８）；Ｋａｋｕｍｕら（１９９７）；Ｙａｍａｋａｗａら（１９９８）；及びＴｏｎｇら（１９９７）参照。治療の終了後にＨＣＶ ＲＮＡレベルを使用して再発を予測し、長期応答者を確認している。Ｐａｗｌｏｔｓｋｙら（１９９６）及びＣｈｅｍｅｌｌｏら（１９９６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，２７９，９４４号
【特許文献２】米国特許第５，５２７，６６９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋｅ（１９９７）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２３９７−２４１０
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎ ＆ Ｇｒｅｔｃｈ（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ５：３９３−９９
【非特許文献３】Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ（１９９９）、ｐａｔｏｌ．３０：９５６−６１
【非特許文献４】ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｇｏｒｄｏｎ， ＆ Ｓｔｕａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１４８５−９２
【非特許文献５】Ｄａｖｉｓ，Ｅｓｔｅｂａｎ Ｍｕｒ， ＆ Ｒｕｓｔｇｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１４９３−９９
【非特許文献６】Ｉｚｏｐｅｔ，Ｐａｙｅｎ， ＆ Ａｌｒｉｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５４：８６−９１
【非特許文献７】Ｋａｋｕｍｕ，Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ， ＆ Ｏｋｕｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１２：４６８−７２
【非特許文献８】Ｔｏｙｏｄａ，Ｎａｋａｎｏ， ＆ Ｋｕｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４８：３５４−５９
【非特許文献９】Ｙａｍａｋａｗａ，Ｓａｔａ， ＆ Ｓｕｚｕｋｉ（１９９８）、Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．４５：１３３−３６
【非特許文献１０】Ｔｏｎｇ，Ｂｌａｔｔ， ＆ ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）、Ｈｅｐａｔｏｌ．２６：１６４０−４５
【非特許文献１１】Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，Ｒｏｕｄｏｔ−Ｔｈｏｒａｖａｌ， ＆ Ｂａｓｔｉｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７４：１−７
【非特許文献１２】Ｃｈｅｍｅｌｌｏ，Ｃａｖａｌｅｔｔｏ， ＆ Ｃａｓａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２４：１０５８−６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は生体サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の改善定量方法、試薬及びキットを提供する。本方法は適切な任意核酸増幅法、好ましくは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と得られたアンプリコンの示差標識及び捕獲を併用して生体サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡの量を定量的に測定する。本方法はサンプル中にＨＣＶ ＲＮＡが存在する場合にこれと同時増幅される内部対照ＨＣＶ ＲＮＡ転写産物を使用する。内部対照とサンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡは競合的に同時増幅される。従って、内部対照の増幅量とＨＣＶ ＲＮＡの増幅量を比較することにより、試験サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を正確且つ精密に計算することができる。また、本方法は内部対照に基づいて校正するので、校正曲線を予め作成し、アッセイキットに同梱することができるため、使用者が実施しなければならない校正実験数を減らすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
好適方法は一般に次のように実施される。まず当分野で現在公知であるか又は将来開発される任意手段により生体検体からＲＮＡを抽出する。好適態様では、市販キット「ＱＩ ａｍｐ（登録商標）ウイルス核酸抽出キット（Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）」（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を使用してＲＮＡを抽出する。“ＱＩ ａｍｐ７Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｊａｎｕａｒｙ １９９９参照。好ましくはプロテイナーゼＫの存在下にイソチオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）等のカオトロープでビリオンを溶解させ、ウイルスＲＮＡを放出させると同時にサンプル中に存在している可能性のあるＲＮアーゼによる分解から保護する。
【００１１】
カオトロープをサンプルに添加すると同時に、既知量の内部対照ＨＣＶ ＲＮＡ転写産物もサンプルに添加する。内部対照は内部対照の示差検出を可能にする修飾プローブ結合領域以外はＨＣＶ ＲＮＡと同一配列である。内部対照は（ユニークなプローブ結合領域以外は）ＨＣＶ ＲＮＡと同一であるので、内部対照は野生型ＨＣＶ ＲＮＡと同一のプライマー結合部位をもつ。
【００１２】
次に、現在公知であるか又は将来開発される適切な手段により（例えばエタノールを添加することにより）ＲＮＡ（即ちサンプル中に存在する場合にはＨＣＶ ＲＮＡと内部対照の両者）を沈殿させることが好ましい。次にＲＮＡをシリカメンブレン等のメンブレンに接着させる。接着したＲＮＡを次に洗浄して非ＲＮＡ成分を除去する。例えば、メンブレンに接着したＲＮＡを高濃度塩洗浄液で洗浄後に低濃度塩洗浄液で洗浄し、非ＲＮＡ汚染物質をメンブレンから除去することができる。次にＲＮＡをメンブレンから溶出させる。本方法では、内部対照核酸をサンプル中に存在するＨＣＶ核酸と同時抽出する点に注目すべきである。要約すると、内部対照を方法全体に介在させ、ＨＣＶ ＲＮＡと厳密に同一操作を行う。このため、本方法により得られる結果の精度が増す。
【００１３】
単離したＲＮＡ（ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照）を次に好ましくは本明細書に記載する新規プライマーを使用して慣用ＲＴ−ＰＣＲプロトコールにより同時増幅する。ＲＴ−ＰＣＲで使用する慣用増幅試薬に加え、ＨＣＶアンプリコンに特異的な第１のプローブと内部対照アンプリコンに特異的な第２のプローブの２種の別個の標識オリゴヌクレオチドプローブ（プライマーではない）も反応に加える。第２のプローブは内部対照上のユニークなプローブ結合領域を介して内部対照アンプリコンと結合する。従って、まず逆転写酵素（好ましくはｒＴｔｈ）の作用によりＲＮＡをＲＮＡ−ＤＮＡヘテロデュプレクスに変換する（即ちｃＤＮＡ鎖を生産する）。次にｃＤＮＡを慣用ＰＣＲにより増幅し、２本鎖ＤＮＡアンプリコンを得る。ｃＤＮＡを生産する逆転写反応は後続増幅反応で使用するポリメラーゼとは異なる転写酵素を使用して触媒してもよい。しかし、好適態様では、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼｒＴｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離）を使用する。この酵素は逆転写反応と後続増幅反応の両者を触媒することができる。
【００１４】
内部対照とプライマーの濃度は２種のターゲット配列（サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡと内部対照）がプライマーを競合するように最適化させる。従って、この競合は試験サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を測定する基礎である。サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡの濃度が高いほどＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンを生産するのに多量のプライマーが使用される。同時に、これに対応して内部対照から生産されるアンプリコンの数は減少する。従って、患者に由来するアンプリコンと内部対照アンプリコンの比から患者に由来するＨＣＶと内部対照の初期比を決定することができる。従って、本発明は特に患者に由来するサンプル等のサンプル中のＨＣＶ核酸の量の定量方法を提供する。
【００１５】
上述のように、ＲＴ−ＰＣＲで使用される慣用増幅試薬に加え、ＨＣＶアンプリコンに特異的な第１のプローブと内部対照アンプリコンに特異的な第２のプローブの２種のオリゴヌクレオチドプローブも反応に添加する。これらのプローブは相互に検出及び区別できるように示差的に標識する。最終加熱冷却段階によりこれらのプローブを夫々のアンプリコンにハイブリダイズさせる。次に（当分野で現在公知であるか又は将来開発される任意手段により）プローブを検出し、夫々のプローブ上の夫々のラベルにより発生されたシグナルに基づいてＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンと内部対照アンプリコンの量を計算する。詳細な説明の欄に詳細に記載するように、好適態様では、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製品である「ＬＣｘ」（登録商標）自動分析器を使用して微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）フォーマットでプローブ−アンプリコンデュプレクスを検出する。
【００１６】
本発明の好適態様では、ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照の両者を増幅するために使用するプライマーの一方又は両方に捕獲部分、好ましくはカルバゾールに由来するハプテンを含むように修飾する。本発明で使用するのに適した数種のカルバゾール及びジベンゾフランハプテンを記載した米国特許第５，４６４，７４６号参照。好適態様では、リバースプライマーのみに捕獲部分を加えるように修飾する。
【００１７】
第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブ（即ち夫々ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンと内部対照アンプリコンにハイブリダイズするように設計されたプローブ）を相互に区別できるようにする別個のラベルで標識する。好適態様では、プローブの一方をアダマンタンで標識し、他方のプローブをダンシルで標識する。（これらはラベルの例に過ぎない。本発明で使用することができる適切なラベルのより詳細なリストについては「略語と定義」の欄を参照されたい）。
【００１８】
ＲＴ−ＰＣＲと最終加熱冷却段階で第１及び第２のプローブを夫々のアンプリコンにハイブリダイズさせた後、アンプリコン中に存在する捕獲部分を認識する捕獲試薬（例えば抗体）で被覆した微粒子と増幅産物のアリコートを接触させる。例えば、リバースプライマー上の捕獲部分がカルバゾールである場合には、プライマー上のカルバゾール部分を特異的に認識してこれと結合する抗カルバゾール捕獲試薬（好ましくは抗カルバゾール抗体）で微粒子を被覆する。こうして、微粒子は増幅産物と遊離リバースプライマーに存在する捕獲部分を認識し、これと結合する。こうして、アンプリコン（及び未反応プライマー）は微粒子に固相化し、（第１又は第２のプローブを含むものとハイブリダイズしたアンプリコンのみに存在する）ラベルは自由に反応する。
【００１９】
好適態様では、次に「ＬＣｘ」（登録商標）分析器を使用して微粒子をグラスファイバーマトリックスに接着させる（不可逆的が好ましいが、不可逆的結合が不要な場合もある）。結合した微粒子を次に第１及び第２のプローブ上の異なるラベルを検出するのに適した試薬と共にインキュベートする。これはサンドイッチ型イムノアッセイにより実施することが好ましい。例えば、ＨＣＶ ＲＮＡプローブをアダマンタンで標識し、内部対照プローブをダンシルで標識する場合には、（例えば）抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲートと抗ダンシル抗体／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートを含む反応混合物と共に微粒子複合体をインキュベートする。アルカリホスファターゼコンジュゲートは（ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコン上の）アダマンタンで標識したプローブと特異的に結合し、β−ガラクトシダーゼコンジュゲートは（内部対照上の）ダンシルで標識したプローブと特異的に結合する。アルカリホスファターゼ基質ＭＵＰを反応に添加するとＭＵＰが開裂し、蛍光シグナルが発生するので、測定及び保存する。シグナルの測定後、グラスファイバーマトリックスを洗浄し、β−ガラクトシダーゼ基質ＡＵＧを添加する。β−ガラクトシダーゼコンジュゲートはＡＵＧを開裂し、第１の蛍光シグナルとは異なる第２の蛍光シグナルを発生する。この第２のシグナルも測定及び保存する。各シグナルの量はＲＴ−ＰＣＲプロトコール中にＨＣＶ ＲＮＡと内部対照から競合的に生産されるアンプリコンの夫々の量に比例する。次に、試験サンプルから発生されたシグナルを標準校正曲線と比較することによりサンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を決定することができる。校正曲線は本方法を使用して一連の校正サンプルを分析し、２種のラベルにより発生されるシグナル出力の関数としてＨＣＶ濃度を表す曲線を作成することにより作成される。一連のサンプル内の各校正サンプルは固定既知量の内部対照を含む。適切な任意量の内部対照を使用することができる。例えば、校正サンプル当たり１０００、５００、又は場合により５０コピー程度の少数の内部対照を多数の態様で使用することができる。同様に、校正サンプル当たり３，０００、１０，０００、又は場合により３０，０００コピーといった多数の内部対照も使用できる。従って、サンプルは各試験に含まれる患者又はサンプルに由来するＨＣＶ ＲＮＡの量が異なる。方法のダイナミック検出レンジ全体をカバーするように十分なサンプルを試験する。例えば、比：｛ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンのカウント率（即ちカウント／秒／秒（「ｃ／ｓ／ｓ」））と内部対照アンプリコンのカウント率（ｃ／ｓ／ｓ）の比｝の対数を求め、実験値を校正曲線上の対応値と比較することによりウイルスＲＮＡのコピー数を計算することができる。こうして、試験サンプルからのシグナル出力を試験サンプル中に存在するＨＣＶの濃度値に変換する。
【００２０】
まとめると、本発明の最適方法は、ＨＣＶゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、（ｉ）ＨＣＶ核酸の転写産物を含む既知量の内部対照と；（ｉｉ）内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第２の標識プローブと；（ｉｉｉ）ＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第１の標識プローブを添加する段階を含む。次に、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用して内部対照転写産物とＨＣＶゲノム核酸が試験サンプル中に存在する場合にはこれを競合的に同時増幅することにより、内部対照転写産物のアンプリコンとＨＣＶゲノム核酸が試験サンプル中に存在する場合にはそのアンプリコンを生産する。次に、第１の標識プローブを内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンにハイブリダイズさせると共に第２の標識プローブをＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンにハイブリダイズさせる条件下で試験サンプルをインキュベートすることにより、ハイブリッドを形成する。次に、第１の標識プローブと内部対照転写産物のアンプリコンの間で形成されたハイブリッドと、第２の標識プローブとＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンの間で形成されたハイブリッドを検出する。これらの結果を校正曲線と比較すると、試験サンプル中に存在するＨＣＶゲノム核酸の量を定量することができる。
【００２１】
本発明はＨＣＶ負荷を測定する現行手段に勝る多数の利点がある。例えば、現在市販されているＨＣＶアッセイはダイナミックレンジと感度に制限がある。これに対して、本発明は遺伝子型に依存せず、１０５〜１０６以上のダイナミックレンジにわたってＨＣＶ ＲＮＡレベルを測定することが可能なＨＣＶ ＲＮＡの検出定量法に関する。本方法は１００コピー／ｍｌ未満までのＨＣＶレベルを正確に測定することができる。
【００２２】
上記利点は本明細書に記載するユニークなＲＴ−ＰＣＲプライマーによる所が大きい。これらのプライマーは従来技術のプライマーに比較してＨＣＶ ＲＮＡに対する特異性と親和性が非常に高い。本明細書に開示するこれらのプライマーはＨＣＶ遺伝子型１〜６の全てを遺伝子型による変動なしにより安定的に定量する。
【００２３】
本方法は更にフォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーの親和性と特異性が高いため、高濃度の競合内部対照を利用できる。即ち、サンプル容量に応じて、本方法は反応当たり約１０，０００コピーの内部対照を利用する場合であっても、約２００コピー／ｍｌのＨＣＶ ＲＮＡを含むサンプルを高い信頼性で検出する。各反応は比較的高濃度のターゲット配列を含む（即ち、ＨＣＶ ＲＮＡを含まないサンプルでも好適態様では約１０，０００コピーの内部対照を含む）ので、増幅と検出がより安定し、従って、最終結果は他のＨＣＶ検出フォーマットよりも高精度になる。
【００２４】
本発明の方法は、逆転写、増幅及びオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応が単一反応容器で実施されるという利点もある。反応容器を手で開く必要なしに検出を自動的に実施することができる。ターゲット配列と産物配列の操作が１段階添加まで減るので、試験サンプルの汚染の可能性が最小限になる。
【００２５】
更に、後述するように、本方法はプライマーの特異性と内部対照配列の添加により予め校正することができる。従って、個々の任意試験から発生されるシグナルを予め作成した校正曲線に比較評価し、ＨＣＶ負荷値を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
略語と定義
「増幅試薬」とは選択したＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ増幅法を実施するために使用される各種緩衝液、酵素、プライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸、及びオリゴヌクレオチドの総称である。
【００２７】
「増幅する」又は「増幅」とは特定オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを使用する適切な任意核酸増幅法を意味する。当分野で公知の適切な技術としては、ＮＡＳＢＡ、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等が挙げられる。但し、これらの用語は特定ターゲット配列を増幅するように設計されたＰＣＲの結果としてのターゲット配列の任意の本質的に量的及び対数的な増加を意味することが好ましい。
【００２８】
「アンプリコン」とは増幅産物を意味する。
【００２９】
「アニール」とはオリゴヌクレオチドとターゲット配列の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、逆転写酵素もしくはＤＮＡポリメラーゼに所望のプライミングを達成するため又はハイブリダイゼーションシグナルを検出するためにハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げることにより導入される可能性がある多少のミスマッチも含む。
【００３０】
「ＡＵＧ」とは基質７−β−ガラクトピラノシルオキシ−クマリン−４−酢酸−（２−ヒドロキシエチルアミド）を意味する。この基質はβ−ガラクトシダーゼコンジュゲートにより開裂され、蛍光シグナルを発生する。
【００３１】
「捕獲試薬／捕獲部分」とは相互に特異的に認識し、結合する化合物又は部分の任意組み合わせを意味する。本発明の範囲に含まれる捕獲試薬／捕獲部分組み合わせの典型例としてはハプテンとハプテンに特異的反応性の抗体（例えばカルバゾールと抗カルバゾール抗体）が挙げられる。例えば、ビオチンとアビジンや、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の周知捕獲反応も明白に該当する。本明細書で使用する「ハプテン」なる用語は抗体と結合することができるが、キャリヤー蛋白質と結合しない限り、抗体形成を誘導することができない部分抗原又は非蛋白質結合メンバーを意味する。ハプテンの例としてはビオチン、アビジン、アダマンタン及びカルバゾールが挙げられる。
【００３２】
「ラベル」とは検出可能な性質又は特性をもつ分子又は部分を意味する。ラベルは例えば放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等のように直接検出可能なものでもよいし、例えば特異的結合メンバーのように間接検出可能なものでもよい。上記例は明白に「ラベル」の定義に含まれる。当然のことながら、直接検出可能なラベルがラベルを検出できるようにするために例えば基質、トリガー試薬、光等の付加成分を必要とする場合もある。間接検出可能なラベルを使用する場合には、「コンジュゲート」と併用するのが一般的である。コンジュゲートは一般に直接検出可能なラベルに付着又は結合されている特異的結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は当分野で周知であり、例えば特異的結合メンバーの特異的結合性又はラベルの検出能を損なわない任意化学的手段及び／又は物理的手段が挙げられる。本明細書で使用する「特異的結合メンバー」とは結合対、即ち一方の分子が例えば化学的又は物理的手段により他方の分子と特異的に結合する２個の異なる分子のメンバーを意味する。抗原と抗体に特異的な結合対以外に他の特異的結合対としては限定されないが、アビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子又は基質と酵素等が挙げられる。
【００３３】
ハプテンをオリゴヌクレオチドプローブに添加する方法は多数のものが文献から公知である。このようなコンジュゲートに関する文献としてはＧｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）が挙げられる。米国特許第５，４６４，７４６号；５，４２４，４１４号；及び４，９４８，８８２号に記載されているようにラベル、ハプテン等をオリゴヌクレオチドに添加することもできる。
【００３４】
「ＭＥＩＡ」とは微粒子酵素免疫測定法を意味する。例えば、Ｆｉｏｒｅら（１９８８）、米国特許第５，３５８，６９１号（ＭＥＩＡプロトコールを実施するための自動装置について記載）及び５，５０７，４１０号（自動ＭＥＩＡ装置用カートリッジフィーダーについて記載）参照。ＭＥＩＡフォーマットでは、不活性微粒子（通常はラテックスビーズ）を所与分析物（この場合にはＲＴ−ＰＣＲ反応からのプローブ標識アンプリコン）に特異的な捕獲抗体と共有結合する。所与分析物を含む疑いのあるサンプルと接触させた後に、微粒子を次に例えばアルカリホスファターゼ−抗体コンジュゲート又はβ−ガラクトシダーゼ−抗体コンジュゲートと接触させる。未吸着材料を各段階で毛管作用と緩衝液洗浄により除去する。未結合コンジュゲートの除去後に、酵素基質（例えばＭＵＰ及び／又はＡＵＧ）を順次添加し、基質添加後毎に蛍光増加率を測定する。本発明では、ＭＥＩＡフォーマットが好ましい。ＭＥＩＡはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製品である「ＬＣｘ」（登録商標）分析器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）等の自動装置を使用して実施することが好ましい。自動装置を使用すると、手動操作による試験サンプルの汚染の可能性が少なくなる。固相微粒子は磁性でも非磁性でもよい。例えば、公開ＥＰＯ出願第ＥＰ ０ ４２５ ６３３号及びＥＰ ０ ４２４ ６３４号参照。
【００３５】
「ＭＵＰ」とは基質４−メチルウンベリフェリルリン酸を意味する。この基質はアルカリホスファターゼコンジュゲートにより開裂され、蛍光シグナルを発生する。
【００３６】
「核酸」とは１本鎖又は２本鎖形のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、特に限定しない限り、天然ヌクレオチドと同一又は同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知類似体も含む。
【００３７】
「オリゴヌクレオチド」とは、プライマー、プローブ、検出すべき核酸フラグメント、及び核酸対照等の２個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子を意味する。オリゴヌクレオチドの厳密なサイズは多数の因子とオリゴヌクレオチドの最終機能又は用途によって異なる。オリゴヌクレオチドは当分野で現在公知又は将来開発される適切な任意方法により作製することができ、例えば周知慣用ヌクレオチドホスホロアミダイト化学や、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＤｕＰｏｎｔ，（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）；又はＭｉｌｌｉｇｅｎ，（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から市販されている装置の使用が挙げられる。
【００３８】
「ＰＣＲ」とはポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００３９】
「プライマー」とは核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下、即ち適当な緩衝液中で適切な温度にて４種の異なるヌクレオシド三リン酸と重合剤（即ちＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下にＤＮＡ合成の開始点として作用することが可能な天然又は合成オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。プライマーの適切な長さはプライマーの所期用途によって異なるが、一般に１５〜３０ヌクレオチドであり、８ヌクレオチド程度でもよいし、５０又は１００ヌクレオチドでもよい。短いプライマー分子は一般に鋳型と共に十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために低温が必要である。プライマーは鋳型の厳密な配列を示す必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。
【００４０】
「プローブ」とは配列特異的なストリンジェント条件下で指定ターゲット配列とハイブリダイズすることが可能な天然又は合成オリゴヌクレオチドを意味する。プローブは鋳型の厳密な配列を示す必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。プローブの適切な長さはプローブの所期用途によって異なり、８ヌクレオチド程度でもよいし、５０又は１００ヌクレオチドでもよいが、一般には１５〜３０ヌクレオチドである。
【００４１】
「ＲＴ−ＰＣＲ」とは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００４２】
「逆転写酵素」とはリボ核酸鋳型に相補的なプライマー伸長産物を形成するためにデオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。この酵素はＲＮＡ鋳型にアニールされるプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終了するまでＲＮＡ鋳型の５’末端に向かって進行する。ＲＮＡターゲット配列を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適切な重合剤の例はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（好適例）である。組換えＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ）はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号Ｎ８０８−００９８，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されている。
【００４３】
「ストリンジェント条件」とは配列依存的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅条件を意味し、状況によって異なる。一般に、ストリンジェント条件は規定イオン強度及びｐＨで特定配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低温に選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）ターゲット配列の５０％が完全一致プローブとハイブリダイズする温度である。一般に、ＰＣＲ増幅のストリンジェント条件は緩衝液が５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ，及び１．５ｍＭｍｇＣｌ２を含有するような条件である。このような緩衝液は室温でｐＨ約８．３であるが、ｐＨは７２℃で約７．２まで低下する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ １４参照。
【００４４】
「ターゲット配列」又は「ターゲット領域」とは同義語であり、検出及び／又は増幅されるか、あるいは本明細書に記載するプライマー又はプローブの１種とストリンジェント条件下でアニールする核酸配列（１本鎖又は２本鎖）を意味する。ターゲット配列は多型とすることができる。
【００４５】
「試験サンプル」とはターゲット配列を含む疑いのあるものを意味する。試験サンプルは無制限任意生物源に由来するものとすることができる。試験サンプルは（ｉ）資源から得られたまま直接使用してもよいし；（ｉｉ）試験サンプルの特性を改変するように前処理後に使用してもよい。即ち、試験サンプルは使用前に例えば細胞及び／又はビリオンの破砕、固体試験サンプルから液体の調製、粘性液体の希釈、液体濾過、液体蒸留、液体濃縮、妨害成分の不活化、試薬添加、核酸精製等により前処理することができる。
【００４６】
「熱安定性ポリメラーゼ」とは熱に比較的安定であり、ターゲット配列の核酸鎖の１つと相補的なプライマー伸長産物を形成するためにヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。この酵素は鋳型にアニールされるプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終了するまで鋳型の５’末端に向かって進行する。精製熱安定性ポリメラーゼ酵素は米国特許第４，８８９，８１８号及び５，０７９，３５２号により詳細に記載されている。この用語は逆転写酵素活性をもつポリメラーゼも含む。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓやＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ等の製造業者から多数の熱安定性ポリメラーゼが市販されている。
【００４７】
「転写産物」とはＲＮＡポリメラーゼ、一般にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの産物を意味する。
【００４８】
説明：
一般に、ゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、同時又は後続段階として配列特異的オリゴヌクレオチドでＨＣＶ ｃＤＮＡアンプリコンの存在をプローブすることにより、（限定しないが）血清又は血漿等の生体サンプル中のＨＣＶゲノムＲＮＡを検出することができる。
【００４９】
更に、内部対照を使用し、サンプル中に存在するサンプル由来ＨＣＶ ＲＮＡと厳密に同一の実験室操作（例えば、ＲＮＡ精製、逆転写、増幅、支持体固相化等）を内部対照に実施することにより、本発明の方法は信頼性の高い結果が得られる。要約すると、内部対照とサンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの両者を同一反応容器で同時分析する。従って、サンプル調製効率の僅かな変動も容易に補償することができる。
【００５０】
方法の好適態様の基本段階は発明の開示の欄に記載した通りである。以下、方法の各段階を順に説明し、各段階で使用することができる種々の好適及び代替試薬について記載する。
【００５１】
検体調製：
検体調製の目的は検体を非感染性にし、検体から潜在的増幅阻害剤を除去し、ターゲットＲＮＡ分子を濃縮して増幅できるようにすることである。本発明ではこれらの目的を達成する任意手段を使用することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応用核酸製造方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。このようなＲＮＡ製造方法は当分野で周知であるので、これ以上詳細に記載しない。
【００５２】
好適アプローチでは、検体を蛋白質消化によりプロセシングした後にこの目的に特別に設計された市販カラムを使用して試験サンプル中に存在する他の成分から核酸を分離することにより上記目的を達成する。好適市販製品はＱｉａｇｅｎ，ＧｍｂＨ製品である「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）ウイルス核酸抽出キットである。キットの詳細とその使用方法については、１９９９年１月発行“ＱＩ ａｍｐ７ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”参照。
【００５３】
要約すると、「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）キットはシリカベースの「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）スピンカラムの結合性を利用して変性試薬の存在下にサンプル溶解液からウイルスＲＮＡ及びＤＮＡを単離する。特別に処方された試薬を使用して試験サンプルを溶解させてウイルス粒子を破砕し、核酸を遊離させ、ＲＮＡとＤＮＡをヌクレアーゼ消化から保護する。試験サンプル溶解物（溶解液）を「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）核酸結合用スピンカラムに移す。「ＱＩ ａｍｐ」カラムマトリックスに結合したら、洗浄用緩衝液を使用して核酸を精製し、ＰＣＲを妨げる汚染物質を除去する。サンプル溶解液と洗浄用試薬のカラム処理には、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）製品である「ＬＣｘ」（登録商標）真空システム等の真空システムを使用する。あるいは、遠心を使用して各種洗浄用試薬をカラムに流すこともできる。「ＬＣｘ」（登録商標）真空システムは４８個のサンプルを同時に処理することができるので好ましい。「ＱＩ ａｍｐ」カラムを遠心することにより精製核酸を水で溶出させる。蛋白質、ヌクレアーゼ、及び他の汚染物質を含まない溶出液からウイルス核酸を回収する。「ＱＩ ａｍｐ」カラムから溶出後に、試験サンプルからの精製核酸（ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照の両者）はそれ以上精製又は調製せずに増幅することができる。
【００５４】
ＰＣＲにより増幅反応を実施する場合には、最初の変性段階後までＰＣＲ反応を開始しないことが好ましい。これを行うのに適した方法としては限定されないが、最初の変性段階で反応混合物を加熱するまで反応成分を冷温に維持する方法や、高温に暴露しないと活性化されない酵素の使用や、酵素と結合して重合を阻害する（非熱安定）抗体の存在下に反応に酵素を添加する方法が挙げられる。
【００５５】
プライマー：
上述のように、本方法で使用するプライマーは１５〜３０ヌクレオチド長が好ましく、試験サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡと内部対照のみの逆転写と増幅を特異的に開始する必要がある。
【００５６】
本発明者らは表１に記載するサブ配列（又はその相補配列）のいずれかを含むフォワードプライマーがＨＣＶゲノムＲＮＡに特に特異的であることを発見した。
【００５７】
【表１】
表中、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧとすることができる。
【００５８】
これらのサブ配列のうちで、好適フォワードプライマーは配列番号１、配列番号２２、配列番号３０、及び配列番号３５に示すようなサブ配列（又はその相補配列）を含むものである。
【００５９】
リバースプライマーの種類はフォワードプライマーほど本発明の実施に重要ではない。即ち、一般に、本発明はＨＣＶＲＮと内部対照を特異的に増幅するためにフォワードプライマーと共働する任意リバースプライマーを使用して実施され、許容可能な結果が得られる。但し、選択したフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより少なくとも２０ヌクレオチド長で好ましくは２５０ヌクレオチド長未満の増幅産物が得られることが好ましい。
【００６０】
本発明のＰＣＲ態様で使用するのに好適なリバースプライマーは、
配列番号４４：ＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣ ＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣ ＧＣ、及び
配列番号４５：ＡＴＧＴＧＣＡＣＧＧ ＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣ ＣＴＣＣである。
【００６１】
フォワードプライマーは（限定しないが）カルバゾール等の捕獲試薬をその５’末端に含むように修飾したリバースプライマーで標識しないことが好ましい。
【００６２】
内部対照核酸：
内部対照は、好ましくはＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域（ｕｔｒ）に由来するＨＣＶゲノム核酸の転写産物である。内部対照は内部対照のアンプリコンに特異的なプローブと配列が相補的なユニークプローブ結合領域を含むように修飾する。他方、他の全点において、内部対照はＨＣＶゲノムの一部と配列が一致する。従って、内部対照はＨＣＶゲノム核酸自体の内側の対応する位置と同一のプライマー結合部位をもつ。
【００６３】
内部対照とＨＣＶ ＲＮＡは同時逆転写され、同時増幅されるので、本発明では逆転写及び増幅反応の効率の有害な変動を補償することができる。従って、内部対照は逆転写及び増幅中にＨＣＶ ＲＮＡと厳密に同一条件下におかれる。
【００６４】
本方法は内部対照のアンプリコンに特異的にハイブリダイズする第２のプローブと、ＨＣＶゲノムＲＮＡのアンプリコンに特異的にハイブリダイズする第１のプローブの２種の別個のオリゴヌクレオチドプローブを使用する。どちらのプローブもアダマンタンやダンシル等の検出可能なラベル（即ちハプテン）を含むように修飾される。プローブはアッセイの検出段階で相互に区別できるように異なるハプテンで標識する必要がある。
【００６５】
ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンの好適プローブは、
配列番号４６：ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＴＧである。
【００６６】
ラベルと捕獲試薬（ハプテン）：
上述のように、本発明で使用する２種のプローブは相互に検出及び区別できるように示差的に標識する。ラベルの検出は直接又は間接手段により実施することができる。ラベルがプローブと夫々のアンプリコンのハイブリダイゼーションを妨げず、アッセイの他の成分に有害でない限り、ラベルの厳密な種類は本発明の総合機能性に重要ではない。本発明で使用するのに最も好適な２種の示差検出可能なラベルはアダマンタン由来ラベル（本明細書では単に「アダマンタン」と総称する）とダンシルである。好適アダマンタンラベルは米国特許第５，４２４，４１４号に記載されている。
【００６７】
このようなラベルをオリゴヌクレオチドに付着することは当分野で公知である。適切な標識法については、例えば、米国特許第５，４６４，７４６号；５，４２４，４１４号；及び４，９４８，８８２号参照。
【００６８】
所定の好適捕獲試薬は米国特許第５，４６４，７４６号に記載されている。
【００６９】
増幅：
ＲＴ−ＰＣＲ増幅は好ましくは上記標識プライマーを使用して常法通りに実施される。
【００７０】
内部対照とサンプル中に存在するゲノムＨＣＶ ＲＮＡ内の増幅ターゲット配列はＨＣＶゲノムの５’ｕｔｒ領域内にある。この領域はＨＣＶに特異的であり、全公知ＨＣＶ遺伝子型で高度に保存されている。好適プライマーは各種ＨＣＶ遺伝子型間のミスマッチが最少になるように５’ｕｔｒ内のターゲット領域とハイブリダイズするように設計される。この結果、遺伝子型変動が最少になり、本方法により全公知ＨＣＶ遺伝子を正確に検出及び定量することが可能になる。本明細書に記載するように、リバースプライマーは部分で標識し、ＨＣＶ特異的プローブは第１のラベルで標識し、内部対照特異的プローブは第２のラベルで標識することが好ましい。
【００７１】
逆転写反応は増幅反応と別個に実施してもよい。しかし、熱安定性ｒＴｔｈ等の逆転写酵素活性を含むポリメラーゼを使用して２反応を単一プロトコールとして実施することが好ましい。
【００７２】
従って、好適態様では、熱安定性ポリメラーゼは二重酵素機能をもち、逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両者として機能する。長期インキュベーション期間中に逆転写酵素活性はＲＮＡターゲット（ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照）とハイブリダイズしたリバースプライマーからｃＤＮＡ伸長産物を生産する。このｃＤＮＡ産物はその後、ＰＣＲ増幅中に鋳型として直接作用する。第２のプライマーはｃＤＮＡ産物の領域に相補的であり、ＤＮＡ産物からのＰＣＲ伸長のプライマーとして作用する。
【００７３】
熱サイクル中に、ハイブリダイズした産物の融点よりも反応温度を上げると鎖は解離する。温度を下げると、過剰のプライマーは解離した鎖とアニールし、新規産物を生産する。高温と低温の反復サイクルにより産物の指数的増幅が達成される。４５熱サイクルでターゲット配列を１０９倍以上に増幅するのに十分である。両者ターゲット（存在する場合にはＨＣＶと内部対照）の増幅は同一反応で同時に実施される。
【００７４】
高温変性と低温インキュベーションを含む付加サイクルにより、ＨＣＶ特異的プローブと内部対照特異的検出プローブを夫々のアンプリコンにアニールすることができる。
【００７５】
増幅試薬の適切な混合物は以下の成分を指定濃度で含む：５０ｍＭ ｂｉｃｉｎｅ，１１５ｍＭ Ｋ＋，１５０μＭ ｄＮＴＰ，１２５ｎＭ捕獲部分修飾リバースプライマー，５０ｎＭフォワードプライマー，内部対照（〜１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ），５０ｎＭ標識ＨＣＶ核酸特異的プローブ，５０ｎＭ標識内部対照核酸特異的プローブ，ｒＴｔｈポリメラーゼ２．５単位，アセチル化ＢＳＡ０．０１ｍｇ／ｍｌ，０．０２％アジ化ナトリウム，８％グリセロール，０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．２２５％アジ化ナトリウム，及び０．００５％キシレノールオレンジ色素，ｐＨ８．２５に場合により０．３１２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加。
【００７６】
逆転写反応と増幅反応の両者を実施するための典型的熱サイクル条件セットは以下の通りである：
ｃＤＮＡ合成：９４℃，１分；６２℃，３０分；９４℃，２分；１サイクル。
増幅：９４℃，１分；６２℃，１分；４５サイクル。
プローブハイブリダイゼーション：９７℃，５分；１５℃，５分；１サイクル。
【００７７】
使用する熱サイクル装置がより完全にプログラム可能である場合には、次の条件が好ましい：
ｃＤＮＡ合成：９４℃，１分；６２℃，３０分；９４℃，２分；１サイクル。
増幅：９４℃，１５秒；５８℃，２０秒；サイクル毎に１秒の伸長を挟んで５サイクル；次いで９４℃，１５秒；６２℃，２５秒；サイクル毎に１秒の伸長を挟んで４０サイクル。
プローブハイブリダイゼーション：９７℃，５分；１５℃，５分；１サイクル。
【００７８】
アンプリコンは後期分析前に９６時間まで１５℃で増幅試薬混合物に浸漬することができる。
【００７９】
プライマーと内部対照は２種のターゲット（ＨＣＶゲノムＲＮＡと内部対照）がプライマーを競合するように最適化させる。従って、増幅プロトコールは競合的であると言う。ＨＣＶゲノムＲＮＡ濃度が内部対照の量に比較して高い場合には、これに対応して内部対照から生産されるアンプリコンの数は減少する。そこで、内部対照から生産されるアンプリコンの量とＨＣＶゲノムＲＮＡから生産されるアンプリコンの量の比を使用して試験サンプル中に存在するＨＣＶゲノムＲＮＡの量を定量する。
【００８０】
検出：
増幅反応が完了し、ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照プローブのハイブリダイゼーションが完了した後に、サンプルを検出できるようになる。増幅プロトコールの最終段階で、反応体を検出プローブの融点未満に冷却する最終サイクル中にＨＣＶプローブと内部対照プローブは夫々の増幅産物とハイブリダイズする。検出プローブはターゲット鎖の内部配列に相補的であるので、偽増幅産物（例えばプライマーダイマー）を検出から排除することによりアッセイの特異性が増す。２プローブフォーマットデザインによりＨＣＶアンプリコンと内部対照アンプリコンの両者の二重検出が可能になる。
【００８１】
従って、好適態様では、ＨＣＶプローブと内部対照プローブを示差的に標識し、プライマーの一方又は両方（好ましくはリバースプライマーのみ）に捕獲部分を加えるように修飾する。検出段階において、捕獲試薬で被覆した不活性支持体にアンプリコンと未反応プライマーを固相化し、アンプリコンの後記分析を容易にする。従って、例えば、リバースプライマーにカルバゾール捕獲部分を加えるように修飾する場合には、不活性支持体、好ましくは微粒子を抗カルバゾール抗体（ウサギ）で被覆する。捕獲部分を含むアンプリコンと未反応プライマーの両者を微粒子に固相化することに留意すべきである。しかし、未反応プライマーは後記検出段階で検出されない（プライマーは標識しない）ので、分析結果に悪影響はない。
【００８２】
被覆微粒子を含む反応ウェルに増幅産物のアリコートを移す。被覆微粒子は増幅産物と未反応遊離リバースプライマー上に存在する捕獲部分を認識してこれと結合する。好適態様では、「ＬＣｘ」（登録商標）分析器を使用して微粒子複合体が不可逆的に結合するグラスファイバーマトリックスに反応混合物を自動移送する。洗浄後に、ＨＣＶアンプリコンと内部対照アンプリコンの量を検出及び定量することが可能な試薬と共に結合微粒子複合体をインキュベートする。これはＨＣＶプローブと内部対照プローブ上に存在する示差ラベルを検出することにより実施される。
【００８３】
好適態様では、ＨＣＶプローブをアダマンタンで標識し、内部対照プローブをダンシルで標識する。これらのラベルを検出するためには、ラベルに特異的な抗体を直接検出可能な酵素とコンジュゲートする。その後、コンジュゲートを微粒子と接触させると、コンジュゲートは夫々のラベルと結合する。次に、酵素基質を添加すると、ＨＣＶアンプリコンの明白なシグナルと内部対照アンプリコンの明白なシグナルが発生する。次にこれらの２値を比較して比を求め、元の試験サンプル中のＨＣＶ核酸の量を決定する。
【００８４】
例えば、（本例ではアダマンタンで標識した）ＨＣＶプローブを検出するためには、抗アダマンタン抗体を（例えば）アルカリホスファターゼ酵素とコンジュゲートする。抗アダマンタン／アルカリホスファターゼコンジュゲートはＨＣＶ特異的プローブのみと結合する。コンジュゲートの抗体部分がアダマンタンプローブと結合するために十分な条件と時間で微粒子を抗アダマンタン／アルカリホスファターゼコンジュゲートと共にインキュベートする。次に、アルカリホスファターゼ基質ＭＵＰをインキュベーション反応に添加する。その結果、ＭＵＰ基質がコンジュゲートのアルカリホスファターゼ部分により開裂され、蛍光産物を生産する反応が生じる。蛍光産物は光度計等の周知光学蛍光検出手段により検出される。蛍光シグナルの大きさはＨＣＶアンプリコン結合量に比例する。
【００８５】
同様に、（本例ではダンシルで標識した）内部対照プローブを検出するためには、抗ダンシル抗体を（例えば）β−ガラクトシダーゼ酵素とコンジュゲートする。抗ダンシル／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートは内部対照特異的プローブのみと結合する。コンジュゲートの抗体部分がダンシルプローブと結合するために十分な条件と時間で微粒子を抗ダンシル／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートする。次に、β−ガラクトシダーゼ基質ＡＵＧをインキュベーション反応に添加する。その結果、ＡＵＧ基質がコンジュゲートのβ−ガラクトシダーゼ部分により開裂され、蛍光産物を生産する反応が生じる。蛍光産物は光度計等の周知光学蛍光検出手段により検出される。この第２の蛍光シグナルの大きさは内部対照アンプリコン結合量に比例する。
【００８６】
プローブ検出順は重要ではない。プローブ上の特異的ラベルの種類も本発明の機能に重要ではないが、以下の３点に注意すべきである。
【００８７】
１．ラベルは逆転写又は増幅反応を妨げないことが好ましい。
【００８８】
２．選択する２種のラベル（ＨＣＶプローブのラベルと内部対照プローブのラベル）は必ず相互に異なっていなければならず、２種のシグナルを相互に区別できるように示差的に検出可能でなければならない。
【００８９】
３．２種の異なるラベルを検出するために必要な化学反応は相互に干渉しないことが好ましい。
【００９０】
これらの３点を満足するならば、本発明は放射性、蛍光、色素、及び酵素ラベル等の任意２種の示差検出可能なラベルを用いて実施することができる。
【００９１】
こうして作製された抗体とアルカリホスファターゼ等の酵素をコンジュゲートするには、当分野で周知の手段により実施される。例えば、以下のスキームによりアルカリホスファターゼを抗体とコンジュゲートすることができる。
【００９２】
１．５ｍｇ／ｍｌ抗体溶液を０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ６．８）２Ｌで４℃にて透析する。
【００９３】
２．抗体溶液を透析メンブレンから除去し、ＰＢＳで３ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００９４】
３．１．５ｍｌ遠心管でアルカリホスファターゼ９０μｌに透析抗体溶液１００μｌを加える。
【００９５】
４．グルタルアルデヒド５ｍｌを加えて静かに混合する。室温で放置する。
【００９６】
５．２５μｌサンプルを０、５、１０、１５、３０、６０、及び１２０分に取出し、別々の１．５ｍｌマイクロ遠心管に加える。ＰＢＳ１２５μｌを各サンプルに加えた後、Ｔｒｉｓ／オボアルブミン溶液１．１ｍｌを加える。時間経過が完了するまで各サンプルを氷上に保存する。
【００９７】
６．サンプルを段階１に記載したようにＰＢＳで透析する。各サンプルのアルカリホスファターゼ活性を試験し、最高活性酵素コンジュゲートが得られたコンジュゲーション時間を決定する。
【００９８】
７．段階１〜４を繰返すが、段階４では段階６で決定された最適コンジュゲーション時間にわたって反応を進行させる。
【００９９】
８．アジ化ナトリウムを０．１％まで加え、コンジュゲートを４℃で遮光保存する。１年まで活性に維持されるべきである。あるいは、等容量のグリセロールを加えてコンジュゲートを−２０℃で凍結保存する。
【０１００】
校正曲線：
本発明の顕著な利点の１つは、内部対照がＲＴ−ＰＣＲからアンプリコンの単離分析に至る全工程に介在するので、１組の校正曲線を使用して方法を先験的に校正できる点にある。従って、末端使用者が実施しなければならない校正操作数が最小限になる。要約すると、使用者はアッセイを実施し、比：｛ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンのカウント率（即ちｃ／ｓ／ｓ）と内部対照アンプリコンのカウント率（ｃ／ｓ／ｓ）の比｝の対数を計算し、得られた値を試験サンプル中のＨＣＶの濃度に到達するまで対応する予備作成校正曲線と比較するだけでよい。
【０１０１】
適切な校正曲線を作成するために使用される校正サンプルは各々固定既知濃度の内部対照（例えば、１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。校正サンプルは更に方法のダイナミックレンジ全体にわたる系統的変動レベルのＨＣＶ転写産物を含む。従って、典型的な校正サンプル系列は以下のサンプルを含む（内部対照２，０００又は１０，０００コピー／サンプル）。
【０１０２】
【表２】
異なる数組の校正サンプルを集めて好適方法により試験した。校正サンプルを作成するために使用したＨＣＶ転写産物はＳａｎｑｕｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｐｌｅｓｍａｎｌａａｎ １２５，１０６６ＣＸ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，オランダ（旧名称ＣＬＢ）から入手した世界保健機構候補基準物質に準じた。
【０１０３】
従って、例えば各サンプルが内部対照１０、０００コピーとＨＣＶ転写産物０、ｌｏｇ２．５０、ｌｏｇ３．０２、ｌｏｇ３．５９、ｌｏｇ４．０９、ｌｏｇ６．１５及びｌｏｇ７．１９コピー／ｍｌを含む一連の校正サンプルに対する本方法の反復試験（ｎ＞１００）では、以下の標準偏差が得られた。
【０１０４】
【表３】
０の校正サンプルとｌｏｇ２．５の校正サンプルの前後の３個の標準偏差範囲はオーバーラップしないことに留意されたい。従って、陰性サンプルは「弱陽性」サンプル即ちＨＣＶ約ｌｏｇ２．５０コピー／ｍｌを含むサンプルから容易に区別される。
【０１０５】
１０人の既知ＨＣＶ陰性患者から採取した血清血漿を使用する試験で各患者から３種のサンプル（血清サンプル、ＥＤＴＡ血漿サンプル、及びＡＣＤ血漿サンプル）を調製した。各サンプルをｌｏｇ３．００コピーＨＣＶ／ｍｌでスパイクした後に本方法の好適態様に従って試験した。これらの３０個のサンプルの標準偏差は０．１１６であり、表３のｌｏｇ３．０２コピー／ｍｌキャリブレーターサンプルの標準偏差０．１３３と非常に近似する値であった。
【０１０６】
陰性血清サンプルと「弱陽性」血清サンプル（ｌｏｇ３．５ＨＣＶコピー／ｍｌ）も潜在干渉化合物でスパイクし、これらの化合物がサンプル中のＨＣＶの正確な測定を妨害するか否かを調べた。蛋白質（合計９０ｍｇ／ｍｌ−アルブミン５５ｍｇ／ｍｌとγグロブリン３５ｍｇ／ｍｌ）、ヘモグロビン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ビリルビン（０．４ｍｇ／ｍｌ）、脂質（３０ｍｇ／ｍｌ及び２０％リポシンＩＩ）、又はＨＣＶ抗ウイルス剤（２７３ＩＵ／ｍｌインターフェロンα−２ｂ又は２７３ＩＵ／ｍｌインターフェロンα−２ｂと０．０５μｇ／ｍｌリバビリンの併用）をサンプルに添加したが、スパイクしたサンプルから得られる結果は対照に比較して有意変化がなかった。
【０１０７】
キット：
本発明は本発明の方法を実施するために必要なプライマー、プローブ、ラベル、試薬等の全部又はサブセットを含むキットにも関する。従って、キットの好適態様はフォワード及びリバースプライマー、内部対照、ＨＣＶ特異的プローブ、及び内部対照特異的プローブを含む１個以上の容器を含む。これらの成分は適切な緩衝液に溶かす又は凍結乾燥して供給することができる。キットは場合によりＨＣＶ検出法を実施するための説明書を添付してもよい。キットは場合により予備作成校正曲線を添付してもよい。
【０１０８】
キットの他の態様は緩衝液、ｄＮＴＰ、ｒＴｔｈ酵素、停止試薬、コンジュゲート試薬混合物等の更に広範な試薬群を含む。これらの成分は末端使用者が本方法をより簡便に実施できるように複数の容器に収容される。従って、本発明によるこのようなキットの１例はそれ自体の容器に各々収容された以下の混合物を含むことができる。
【０１０９】
１．２ｘ増幅試薬ミックス：１００ｍＭ ｂｉｃｉｎｅ，２３０ｍＭ Ｋ＋，３００μＭ ｄＮＴＰ，２５０ｎＭリバースプライマー，本質的に配列番号１〜４３から構成される配列をもつ１００ｎＭフォワードプライマー，１００ｎＭ標識ＨＣＶ核酸特異的プローブ，１００ｎＭ標識内部対照核酸特異的プローブ，ｒＴｔｈポリメラーゼ５単位，アセチル化ＢＳＡ０．０２ｍｇ／ｍｌ，０．０４％アジ化ナトリウム，１６％グリセロール，内部対照（１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ）（ｐＨ８．２５）。これを１００％希釈して１ｘ増幅試薬ミックスとする。
【０１１０】
２．活性化試薬ミックス：１０ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．４５％アジ化ナトリウム，０．０１０％キシレノールオレンジ色素。活性化試薬ミックスを１ｘ増幅試薬ミックスに添加し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を開始する。従って、サンプルを増幅できるようになるまでこのミックスは添加しない。
【０１１１】
３．内部対照核酸試薬ミックス：あるいは、内部対照ＲＮＡ転写産物（１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ）（上記増幅試薬ミックスの欄に記載）を別成分として添付してもよい。内部対照は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，アセチル化ＢＳＡ１００μｇ／ｍｌ，１０ｍＭ ＤＴＴ，ＲＮアーゼインヒビター０．５Ｕ／μｌ，ｐｏｌｙ−Ａ８７２５μｇ／ｍｌ，０．０４５％アジ化ナトリウムの溶液で提供される。
【０１１２】
４．抗カルバゾール微粒子：０．２６５％トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液中ウサギ抗カルバゾール抗体で被覆した直径０．４００μｍ粒子。
【０１１３】
５．コンジュゲート試薬ミックス：抗ダンシル／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートと抗アダマンタン／アルカリホスファターゼコンジュゲート；各々抗体１ｍｌ当たり〜１μｇ。
【０１１４】
６．夫々アルカリホスファターゼとβ−ガラクトシダーゼの酵素基質であるＭＵＰ（緩衝液中１．２ｍＭ）とＡＵＧ（緩衝液中３．０ｍＭ）。
【０１１５】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の検出及び定量方法及び試薬と、前記方法を実施するためのキットに関する。
【０００２】
本明細書に引用する文献については、明細書の末尾に参考文献の項目で包括目録を添付する。本明細書に引用する全文献は参考資料として本明細書に組込む。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は約９，４００ヌクレオチドのゲノムを含む１本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｃｌａｒｋ（１９９７）参照。ＨＣＶは輸血後非Ａ、非Ｂ肝炎の主要な病因物質として世界中で同定されている。Ｒｏｓｅｎ ＆ Ｇｒｅｔｃｈ（１９９９）参照。ＨＣＶ感染個体の約８５％が慢性肝炎を発症し、慢性感染個体の約２０％が肝硬変を発症している。Ｒｏｓｅｎ ＆ Ｇｒｅｔｃｈ（１９９９）。肝硬変患者における肝細胞癌の発生率は年間約１％〜４％である。Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ（１９９９）参照。
【０００４】
抗ＨＣＶ抗体の検出用血清試験が開発されている。Ｃｌａｒｋ（１９９７）参照。しかし、終息した感染を活動中の感染から区別することができないので、抗ＨＣＶの存在がＨＣＶウイルス血症の直接指標となる訳ではない。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性が活動中のＨＣＶ感染の代用指標として使用されているが、ＡＬＴ活性もＨＣＶウイルス血症の直接指標にはならない。例えば、米国特許第５，２７９，９４４号参照。
【０００５】
ＨＣＶ ＲＮＡの検出及び定量用核酸試験はＨＣＶウイルス血症の直接指標となるので、血液安全性を改善し、治療中の患者をモニターするために益々重要になっている。ＨＣＶの定性試験は輸血後ＨＣＶ感染症例数を低下させるのに役立っている。これらの定性試験の典型例はＮａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の製品であるＵｌｔｒａＱｕａｌ（登録商標）ＨＣＶ−ＲＴ−ＰＣＲアッセイである。この試験はヒト血漿プールにおけるＨＣＶの存在の定性試験として米国食品医薬品局により認可されている。１９９６年６月１８日発行米国特許第５，５２７，６６９号も参照。
【０００６】
同様に、ＨＣＶ ＲＮＡの定量試験もインターフェロン単独療法及びインターフェロン／リバビリン併用療法等の治療に対する抗ウイルス応答の効力を把握するのに役立っている。ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎら（１９９８）及びＤａｖｉｓら（１９９８）参照。抗ウイルス剤の投与前、投与中及び投与後にＨＣＶウイルス負荷試験が実施されている。投与前の基線測定時における低レベルのウイルス血症がインターフェロン療法に対する高応答に有意に相関したことから、このような療法に対する個々の患者の応答を予測するためにＨＣＶウイルス負荷が使用された。Ｉｚｏｐｅｔら（１９９８）；Ｋａｋｕｍｕら（１９９７）；及びＴｏｙｏｄａら（１９９６）参照。ＨＣＶウイルス負荷試験により治療をモニターすると、医師は治療に応答する患者と応答しない患者を区別することができ、治療期間を決定し、個々の患者に治療を調整することができる。Ｉｚｏｐｅｔら（１９９８）；Ｋａｋｕｍｕら（１９９７）；Ｙａｍａｋａｗａら（１９９８）；及びＴｏｎｇら（１９９７）参照。治療の終了後にＨＣＶ ＲＮＡレベルを使用して再発を予測し、長期応答者を確認している。Ｐａｗｌｏｔｓｋｙら（１９９６）及びＣｈｅｍｅｌｌｏら（１９９６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，２７９，９４４号
【特許文献２】米国特許第５，５２７，６６９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｌａｒｋｅ（１９９７）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２３９７−２４１０
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎ ＆ Ｇｒｅｔｃｈ（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ ５：３９３−９９
【非特許文献３】Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ（１９９９）、ｐａｔｏｌ．３０：９５６−６１
【非特許文献４】ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｇｏｒｄｏｎ， ＆ Ｓｔｕａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１４８５−９２
【非特許文献５】Ｄａｖｉｓ，Ｅｓｔｅｂａｎ Ｍｕｒ， ＆ Ｒｕｓｔｇｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１４９３−９９
【非特許文献６】Ｉｚｏｐｅｔ，Ｐａｙｅｎ， ＆ Ａｌｒｉｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５４：８６−９１
【非特許文献７】Ｋａｋｕｍｕ，Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ， ＆ Ｏｋｕｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１２：４６８−７２
【非特許文献８】Ｔｏｙｏｄａ，Ｎａｋａｎｏ， ＆ Ｋｕｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４８：３５４−５９
【非特許文献９】Ｙａｍａｋａｗａ，Ｓａｔａ， ＆ Ｓｕｚｕｋｉ（１９９８）、Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．４５：１３３−３６
【非特許文献１０】Ｔｏｎｇ，Ｂｌａｔｔ， ＆ ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）、Ｈｅｐａｔｏｌ．２６：１６４０−４５
【非特許文献１１】Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，Ｒｏｕｄｏｔ−Ｔｈｏｒａｖａｌ， ＆ Ｂａｓｔｉｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７４：１−７
【非特許文献１２】Ｃｈｅｍｅｌｌｏ，Ｃａｖａｌｅｔｔｏ， ＆ Ｃａｓａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２４：１０５８−６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は生体サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の改善定量方法、試薬及びキットを提供する。本方法は適切な任意核酸増幅法、好ましくは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と得られたアンプリコンの示差標識及び捕獲を併用して生体サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡの量を定量的に測定する。本方法はサンプル中にＨＣＶ ＲＮＡが存在する場合にこれと同時増幅される内部対照ＨＣＶ ＲＮＡ転写産物を使用する。内部対照とサンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡは競合的に同時増幅される。従って、内部対照の増幅量とＨＣＶ ＲＮＡの増幅量を比較することにより、試験サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を正確且つ精密に計算することができる。また、本方法は内部対照に基づいて校正するので、校正曲線を予め作成し、アッセイキットに同梱することができるため、使用者が実施しなければならない校正実験数を減らすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
好適方法は一般に次のように実施される。まず当分野で現在公知であるか又は将来開発される任意手段により生体検体からＲＮＡを抽出する。好適態様では、市販キット「ＱＩ ａｍｐ（登録商標）ウイルス核酸抽出キット（Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）」（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を使用してＲＮＡを抽出する。“ＱＩ ａｍｐ７Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｊａｎｕａｒｙ １９９９参照。好ましくはプロテイナーゼＫの存在下にイソチオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）等のカオトロープでビリオンを溶解させ、ウイルスＲＮＡを放出させると同時にサンプル中に存在している可能性のあるＲＮアーゼによる分解から保護する。
【００１１】
カオトロープをサンプルに添加すると同時に、既知量の内部対照ＨＣＶ ＲＮＡ転写産物もサンプルに添加する。内部対照は内部対照の示差検出を可能にする修飾プローブ結合領域以外はＨＣＶ ＲＮＡと同一配列である。内部対照は（ユニークなプローブ結合領域以外は）ＨＣＶ ＲＮＡと同一であるので、内部対照は野生型ＨＣＶ ＲＮＡと同一のプライマー結合部位をもつ。
【００１２】
次に、現在公知であるか又は将来開発される適切な手段により（例えばエタノールを添加することにより）ＲＮＡ（即ちサンプル中に存在する場合にはＨＣＶ ＲＮＡと内部対照の両者）を沈殿させることが好ましい。次にＲＮＡをシリカメンブレン等のメンブレンに接着させる。接着したＲＮＡを次に洗浄して非ＲＮＡ成分を除去する。例えば、メンブレンに接着したＲＮＡを高濃度塩洗浄液で洗浄後に低濃度塩洗浄液で洗浄し、非ＲＮＡ汚染物質をメンブレンから除去することができる。次にＲＮＡをメンブレンから溶出させる。本方法では、内部対照核酸をサンプル中に存在するＨＣＶ核酸と同時抽出する点に注目すべきである。要約すると、内部対照を方法全体に介在させ、ＨＣＶ ＲＮＡと厳密に同一操作を行う。このため、本方法により得られる結果の精度が増す。
【００１３】
単離したＲＮＡ（ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照）を次に好ましくは本明細書に記載する新規プライマーを使用して慣用ＲＴ−ＰＣＲプロトコールにより同時増幅する。ＲＴ−ＰＣＲで使用する慣用増幅試薬に加え、ＨＣＶアンプリコンに特異的な第１のプローブと内部対照アンプリコンに特異的な第２のプローブの２種の別個の標識オリゴヌクレオチドプローブ（プライマーではない）も反応に加える。第２のプローブは内部対照上のユニークなプローブ結合領域を介して内部対照アンプリコンと結合する。従って、まず逆転写酵素（好ましくはｒＴｔｈ）の作用によりＲＮＡをＲＮＡ−ＤＮＡヘテロデュプレクスに変換する（即ちｃＤＮＡ鎖を生産する）。次にｃＤＮＡを慣用ＰＣＲにより増幅し、２本鎖ＤＮＡアンプリコンを得る。ｃＤＮＡを生産する逆転写反応は後続増幅反応で使用するポリメラーゼとは異なる転写酵素を使用して触媒してもよい。しかし、好適態様では、組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼｒＴｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離）を使用する。この酵素は逆転写反応と後続増幅反応の両者を触媒することができる。
【００１４】
内部対照とプライマーの濃度は２種のターゲット配列（サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡと内部対照）がプライマーを競合するように最適化させる。従って、この競合は試験サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を測定する基礎である。サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡの濃度が高いほどＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンを生産するのに多量のプライマーが使用される。同時に、これに対応して内部対照から生産されるアンプリコンの数は減少する。従って、患者に由来するアンプリコンと内部対照アンプリコンの比から患者に由来するＨＣＶと内部対照の初期比を決定することができる。従って、本発明は特に患者に由来するサンプル等のサンプル中のＨＣＶ核酸の量の定量方法を提供する。
【００１５】
上述のように、ＲＴ−ＰＣＲで使用される慣用増幅試薬に加え、ＨＣＶアンプリコンに特異的な第１のプローブと内部対照アンプリコンに特異的な第２のプローブの２種のオリゴヌクレオチドプローブも反応に添加する。これらのプローブは相互に検出及び区別できるように示差的に標識する。最終加熱冷却段階によりこれらのプローブを夫々のアンプリコンにハイブリダイズさせる。次に（当分野で現在公知であるか又は将来開発される任意手段により）プローブを検出し、夫々のプローブ上の夫々のラベルにより発生されたシグナルに基づいてＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンと内部対照アンプリコンの量を計算する。詳細な説明の欄に詳細に記載するように、好適態様では、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製品である「ＬＣｘ」（登録商標）自動分析器を使用して微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）フォーマットでプローブ−アンプリコンデュプレクスを検出する。
【００１６】
本発明の好適態様では、ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照の両者を増幅するために使用するプライマーの一方又は両方に捕獲部分、好ましくはカルバゾールに由来するハプテンを含むように修飾する。本発明で使用するのに適した数種のカルバゾール及びジベンゾフランハプテンを記載した米国特許第５，４６４，７４６号参照。好適態様では、リバースプライマーのみに捕獲部分を加えるように修飾する。
【００１７】
第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブ（即ち夫々ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンと内部対照アンプリコンにハイブリダイズするように設計されたプローブ）を相互に区別できるようにする別個のラベルで標識する。好適態様では、プローブの一方をアダマンタンで標識し、他方のプローブをダンシルで標識する。（これらはラベルの例に過ぎない。本発明で使用することができる適切なラベルのより詳細なリストについては「略語と定義」の欄を参照されたい）。
【００１８】
ＲＴ−ＰＣＲと最終加熱冷却段階で第１及び第２のプローブを夫々のアンプリコンにハイブリダイズさせた後、アンプリコン中に存在する捕獲部分を認識する捕獲試薬（例えば抗体）で被覆した微粒子と増幅産物のアリコートを接触させる。例えば、リバースプライマー上の捕獲部分がカルバゾールである場合には、プライマー上のカルバゾール部分を特異的に認識してこれと結合する抗カルバゾール捕獲試薬（好ましくは抗カルバゾール抗体）で微粒子を被覆する。こうして、微粒子は増幅産物と遊離リバースプライマーに存在する捕獲部分を認識し、これと結合する。こうして、アンプリコン（及び未反応プライマー）は微粒子に固相化し、（第１又は第２のプローブを含むものとハイブリダイズしたアンプリコンのみに存在する）ラベルは自由に反応する。
【００１９】
好適態様では、次に「ＬＣｘ」（登録商標）分析器を使用して微粒子をグラスファイバーマトリックスに接着させる（不可逆的が好ましいが、不可逆的結合が不要な場合もある）。結合した微粒子を次に第１及び第２のプローブ上の異なるラベルを検出するのに適した試薬と共にインキュベートする。これはサンドイッチ型イムノアッセイにより実施することが好ましい。例えば、ＨＣＶ ＲＮＡプローブをアダマンタンで標識し、内部対照プローブをダンシルで標識する場合には、（例えば）抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲートと抗ダンシル抗体／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートを含む反応混合物と共に微粒子複合体をインキュベートする。アルカリホスファターゼコンジュゲートは（ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコン上の）アダマンタンで標識したプローブと特異的に結合し、β−ガラクトシダーゼコンジュゲートは（内部対照上の）ダンシルで標識したプローブと特異的に結合する。アルカリホスファターゼ基質ＭＵＰを反応に添加するとＭＵＰが開裂し、蛍光シグナルが発生するので、測定及び保存する。シグナルの測定後、グラスファイバーマトリックスを洗浄し、β−ガラクトシダーゼ基質ＡＵＧを添加する。β−ガラクトシダーゼコンジュゲートはＡＵＧを開裂し、第１の蛍光シグナルとは異なる第２の蛍光シグナルを発生する。この第２のシグナルも測定及び保存する。各シグナルの量はＲＴ−ＰＣＲプロトコール中にＨＣＶ ＲＮＡと内部対照から競合的に生産されるアンプリコンの夫々の量に比例する。次に、試験サンプルから発生されたシグナルを標準校正曲線と比較することによりサンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの量を決定することができる。校正曲線は本方法を使用して一連の校正サンプルを分析し、２種のラベルにより発生されるシグナル出力の関数としてＨＣＶ濃度を表す曲線を作成することにより作成される。一連のサンプル内の各校正サンプルは固定既知量の内部対照を含む。適切な任意量の内部対照を使用することができる。例えば、校正サンプル当たり１０００、５００、又は場合により５０コピー程度の少数の内部対照を多数の態様で使用することができる。同様に、校正サンプル当たり３，０００、１０，０００、又は場合により３０，０００コピーといった多数の内部対照も使用できる。従って、サンプルは各試験に含まれる患者又はサンプルに由来するＨＣＶ ＲＮＡの量が異なる。方法のダイナミック検出レンジ全体をカバーするように十分なサンプルを試験する。例えば、比：｛ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンのカウント率（即ちカウント／秒／秒（「ｃ／ｓ／ｓ」））と内部対照アンプリコンのカウント率（ｃ／ｓ／ｓ）の比｝の対数を求め、実験値を校正曲線上の対応値と比較することによりウイルスＲＮＡのコピー数を計算することができる。こうして、試験サンプルからのシグナル出力を試験サンプル中に存在するＨＣＶの濃度値に変換する。
【００２０】
まとめると、本発明の最適方法は、ＨＣＶゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、（ｉ）ＨＣＶ核酸の転写産物を含む既知量の内部対照と；（ｉｉ）内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第２の標識プローブと；（ｉｉｉ）ＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第１の標識プローブを添加する段階を含む。次に、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用して内部対照転写産物とＨＣＶゲノム核酸が試験サンプル中に存在する場合にはこれを競合的に同時増幅することにより、内部対照転写産物のアンプリコンとＨＣＶゲノム核酸が試験サンプル中に存在する場合にはそのアンプリコンを生産する。次に、第１の標識プローブを内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンにハイブリダイズさせると共に第２の標識プローブをＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンにハイブリダイズさせる条件下で試験サンプルをインキュベートすることにより、ハイブリッドを形成する。次に、第１の標識プローブと内部対照転写産物のアンプリコンの間で形成されたハイブリッドと、第２の標識プローブとＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンの間で形成されたハイブリッドを検出する。これらの結果を校正曲線と比較すると、試験サンプル中に存在するＨＣＶゲノム核酸の量を定量することができる。
【００２１】
本発明はＨＣＶ負荷を測定する現行手段に勝る多数の利点がある。例えば、現在市販されているＨＣＶアッセイはダイナミックレンジと感度に制限がある。これに対して、本発明は遺伝子型に依存せず、１０５〜１０６以上のダイナミックレンジにわたってＨＣＶ ＲＮＡレベルを測定することが可能なＨＣＶ ＲＮＡの検出定量法に関する。本方法は１００コピー／ｍｌ未満までのＨＣＶレベルを正確に測定することができる。
【００２２】
上記利点は本明細書に記載するユニークなＲＴ−ＰＣＲプライマーによる所が大きい。これらのプライマーは従来技術のプライマーに比較してＨＣＶ ＲＮＡに対する特異性と親和性が非常に高い。本明細書に開示するこれらのプライマーはＨＣＶ遺伝子型１〜６の全てを遺伝子型による変動なしにより安定的に定量する。
【００２３】
本方法は更にフォワードＲＴ−ＰＣＲプライマーの親和性と特異性が高いため、高濃度の競合内部対照を利用できる。即ち、サンプル容量に応じて、本方法は反応当たり約１０，０００コピーの内部対照を利用する場合であっても、約２００コピー／ｍｌのＨＣＶ ＲＮＡを含むサンプルを高い信頼性で検出する。各反応は比較的高濃度のターゲット配列を含む（即ち、ＨＣＶ ＲＮＡを含まないサンプルでも好適態様では約１０，０００コピーの内部対照を含む）ので、増幅と検出がより安定し、従って、最終結果は他のＨＣＶ検出フォーマットよりも高精度になる。
【００２４】
本発明の方法は、逆転写、増幅及びオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応が単一反応容器で実施されるという利点もある。反応容器を手で開く必要なしに検出を自動的に実施することができる。ターゲット配列と産物配列の操作が１段階添加まで減るので、試験サンプルの汚染の可能性が最小限になる。
【００２５】
更に、後述するように、本方法はプライマーの特異性と内部対照配列の添加により予め校正することができる。従って、個々の任意試験から発生されるシグナルを予め作成した校正曲線に比較評価し、ＨＣＶ負荷値を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
略語と定義
「増幅試薬」とは選択したＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ増幅法を実施するために使用される各種緩衝液、酵素、プライマー、デオキシヌクレオシド三リン酸、及びオリゴヌクレオチドの総称である。
【００２７】
「増幅する」又は「増幅」とは特定オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを使用する適切な任意核酸増幅法を意味する。当分野で公知の適切な技術としては、ＮＡＳＢＡ、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）等が挙げられる。但し、これらの用語は特定ターゲット配列を増幅するように設計されたＰＣＲの結果としてのターゲット配列の任意の本質的に量的及び対数的な増加を意味することが好ましい。
【００２８】
「アンプリコン」とは増幅産物を意味する。
【００２９】
「アニール」とはオリゴヌクレオチドとターゲット配列の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、逆転写酵素もしくはＤＮＡポリメラーゼに所望のプライミングを達成するため又はハイブリダイゼーションシグナルを検出するためにハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げることにより導入される可能性がある多少のミスマッチも含む。
【００３０】
「ＡＵＧ」とは基質７−β−ガラクトピラノシルオキシ−クマリン−４−酢酸−（２−ヒドロキシエチルアミド）を意味する。この基質はβ−ガラクトシダーゼコンジュゲートにより開裂され、蛍光シグナルを発生する。
【００３１】
「捕獲試薬／捕獲部分」とは相互に特異的に認識し、結合する化合物又は部分の任意組み合わせを意味する。本発明の範囲に含まれる捕獲試薬／捕獲部分組み合わせの典型例としてはハプテンとハプテンに特異的反応性の抗体（例えばカルバゾールと抗カルバゾール抗体）が挙げられる。例えば、ビオチンとアビジンや、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の周知捕獲反応も明白に該当する。本明細書で使用する「ハプテン」なる用語は抗体と結合することができるが、キャリヤー蛋白質と結合しない限り、抗体形成を誘導することができない部分抗原又は非蛋白質結合メンバーを意味する。ハプテンの例としてはビオチン、アビジン、アダマンタン及びカルバゾールが挙げられる。
【００３２】
「ラベル」とは検出可能な性質又は特性をもつ分子又は部分を意味する。ラベルは例えば放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等のように直接検出可能なものでもよいし、例えば特異的結合メンバーのように間接検出可能なものでもよい。上記例は明白に「ラベル」の定義に含まれる。当然のことながら、直接検出可能なラベルがラベルを検出できるようにするために例えば基質、トリガー試薬、光等の付加成分を必要とする場合もある。間接検出可能なラベルを使用する場合には、「コンジュゲート」と併用するのが一般的である。コンジュゲートは一般に直接検出可能なラベルに付着又は結合されている特異的結合メンバーである。コンジュゲートを合成するためのカップリング化学は当分野で周知であり、例えば特異的結合メンバーの特異的結合性又はラベルの検出能を損なわない任意化学的手段及び／又は物理的手段が挙げられる。本明細書で使用する「特異的結合メンバー」とは結合対、即ち一方の分子が例えば化学的又は物理的手段により他方の分子と特異的に結合する２個の異なる分子のメンバーを意味する。抗原と抗体に特異的な結合対以外に他の特異的結合対としては限定されないが、アビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子又は基質と酵素等が挙げられる。
【００３３】
ハプテンをオリゴヌクレオチドプローブに添加する方法は多数のものが文献から公知である。このようなコンジュゲートに関する文献としてはＧｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）が挙げられる。米国特許第５，４６４，７４６号；５，４２４，４１４号；及び４，９４８，８８２号に記載されているようにラベル、ハプテン等をオリゴヌクレオチドに添加することもできる。
【００３４】
「ＭＥＩＡ」とは微粒子酵素免疫測定法を意味する。例えば、Ｆｉｏｒｅら（１９８８）、米国特許第５，３５８，６９１号（ＭＥＩＡプロトコールを実施するための自動装置について記載）及び５，５０７，４１０号（自動ＭＥＩＡ装置用カートリッジフィーダーについて記載）参照。ＭＥＩＡフォーマットでは、不活性微粒子（通常はラテックスビーズ）を所与分析物（この場合にはＲＴ−ＰＣＲ反応からのプローブ標識アンプリコン）に特異的な捕獲抗体と共有結合する。所与分析物を含む疑いのあるサンプルと接触させた後に、微粒子を次に例えばアルカリホスファターゼ−抗体コンジュゲート又はβ−ガラクトシダーゼ−抗体コンジュゲートと接触させる。未吸着材料を各段階で毛管作用と緩衝液洗浄により除去する。未結合コンジュゲートの除去後に、酵素基質（例えばＭＵＰ及び／又はＡＵＧ）を順次添加し、基質添加後毎に蛍光増加率を測定する。本発明では、ＭＥＩＡフォーマットが好ましい。ＭＥＩＡはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製品である「ＬＣｘ」（登録商標）分析器（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）等の自動装置を使用して実施することが好ましい。自動装置を使用すると、手動操作による試験サンプルの汚染の可能性が少なくなる。固相微粒子は磁性でも非磁性でもよい。例えば、公開ＥＰＯ出願第ＥＰ ０ ４２５ ６３３号及びＥＰ ０ ４２４ ６３４号参照。
【００３５】
「ＭＵＰ」とは基質４−メチルウンベリフェリルリン酸を意味する。この基質はアルカリホスファターゼコンジュゲートにより開裂され、蛍光シグナルを発生する。
【００３６】
「核酸」とは１本鎖又は２本鎖形のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、特に限定しない限り、天然ヌクレオチドと同一又は同様に機能することができる天然ヌクレオチドの公知類似体も含む。
【００３７】
「オリゴヌクレオチド」とは、プライマー、プローブ、検出すべき核酸フラグメント、及び核酸対照等の２個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子を意味する。オリゴヌクレオチドの厳密なサイズは多数の因子とオリゴヌクレオチドの最終機能又は用途によって異なる。オリゴヌクレオチドは当分野で現在公知又は将来開発される適切な任意方法により作製することができ、例えば周知慣用ヌクレオチドホスホロアミダイト化学や、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＤｕＰｏｎｔ，（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）；又はＭｉｌｌｉｇｅｎ，（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から市販されている装置の使用が挙げられる。
【００３８】
「ＰＣＲ」とはポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００３９】
「プライマー」とは核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下、即ち適当な緩衝液中で適切な温度にて４種の異なるヌクレオシド三リン酸と重合剤（即ちＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下にＤＮＡ合成の開始点として作用することが可能な天然又は合成オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。プライマーの適切な長さはプライマーの所期用途によって異なるが、一般に１５〜３０ヌクレオチドであり、８ヌクレオチド程度でもよいし、５０又は１００ヌクレオチドでもよい。短いプライマー分子は一般に鋳型と共に十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために低温が必要である。プライマーは鋳型の厳密な配列を示す必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。
【００４０】
「プローブ」とは配列特異的なストリンジェント条件下で指定ターゲット配列とハイブリダイズすることが可能な天然又は合成オリゴヌクレオチドを意味する。プローブは鋳型の厳密な配列を示す必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。プローブの適切な長さはプローブの所期用途によって異なり、８ヌクレオチド程度でもよいし、５０又は１００ヌクレオチドでもよいが、一般には１５〜３０ヌクレオチドである。
【００４１】
「ＲＴ−ＰＣＲ」とは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００４２】
「逆転写酵素」とはリボ核酸鋳型に相補的なプライマー伸長産物を形成するためにデオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。この酵素はＲＮＡ鋳型にアニールされるプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終了するまでＲＮＡ鋳型の５’末端に向かって進行する。ＲＮＡターゲット配列を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適切な重合剤の例はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（好適例）である。組換えＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ）はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号Ｎ８０８−００９８，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されている。
【００４３】
「ストリンジェント条件」とは配列依存的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅条件を意味し、状況によって異なる。一般に、ストリンジェント条件は規定イオン強度及びｐＨで特定配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低温に選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）ターゲット配列の５０％が完全一致プローブとハイブリダイズする温度である。一般に、ＰＣＲ増幅のストリンジェント条件は緩衝液が５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ，及び１．５ｍＭｍｇＣｌ２を含有するような条件である。このような緩衝液は室温でｐＨ約８．３であるが、ｐＨは７２℃で約７．２まで低下する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ １４参照。
【００４４】
「ターゲット配列」又は「ターゲット領域」とは同義語であり、検出及び／又は増幅されるか、あるいは本明細書に記載するプライマー又はプローブの１種とストリンジェント条件下でアニールする核酸配列（１本鎖又は２本鎖）を意味する。ターゲット配列は多型とすることができる。
【００４５】
「試験サンプル」とはターゲット配列を含む疑いのあるものを意味する。試験サンプルは無制限任意生物源に由来するものとすることができる。試験サンプルは（ｉ）資源から得られたまま直接使用してもよいし；（ｉｉ）試験サンプルの特性を改変するように前処理後に使用してもよい。即ち、試験サンプルは使用前に例えば細胞及び／又はビリオンの破砕、固体試験サンプルから液体の調製、粘性液体の希釈、液体濾過、液体蒸留、液体濃縮、妨害成分の不活化、試薬添加、核酸精製等により前処理することができる。
【００４６】
「熱安定性ポリメラーゼ」とは熱に比較的安定であり、ターゲット配列の核酸鎖の１つと相補的なプライマー伸長産物を形成するためにヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を意味する。この酵素は鋳型にアニールされるプライマーの３’末端で合成を開始し、合成が終了するまで鋳型の５’末端に向かって進行する。精製熱安定性ポリメラーゼ酵素は米国特許第４，８８９，８１８号及び５，０７９，３５２号により詳細に記載されている。この用語は逆転写酵素活性をもつポリメラーゼも含む。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓやＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ等の製造業者から多数の熱安定性ポリメラーゼが市販されている。
【００４７】
「転写産物」とはＲＮＡポリメラーゼ、一般にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの産物を意味する。
【００４８】
説明：
一般に、ゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、同時又は後続段階として配列特異的オリゴヌクレオチドでＨＣＶ ｃＤＮＡアンプリコンの存在をプローブすることにより、（限定しないが）血清又は血漿等の生体サンプル中のＨＣＶゲノムＲＮＡを検出することができる。
【００４９】
更に、内部対照を使用し、サンプル中に存在するサンプル由来ＨＣＶ ＲＮＡと厳密に同一の実験室操作（例えば、ＲＮＡ精製、逆転写、増幅、支持体固相化等）を内部対照に実施することにより、本発明の方法は信頼性の高い結果が得られる。要約すると、内部対照とサンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡの両者を同一反応容器で同時分析する。従って、サンプル調製効率の僅かな変動も容易に補償することができる。
【００５０】
方法の好適態様の基本段階は発明の開示の欄に記載した通りである。以下、方法の各段階を順に説明し、各段階で使用することができる種々の好適及び代替試薬について記載する。
【００５１】
検体調製：
検体調製の目的は検体を非感染性にし、検体から潜在的増幅阻害剤を除去し、ターゲットＲＮＡ分子を濃縮して増幅できるようにすることである。本発明ではこれらの目的を達成する任意手段を使用することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応用核酸製造方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。このようなＲＮＡ製造方法は当分野で周知であるので、これ以上詳細に記載しない。
【００５２】
好適アプローチでは、検体を蛋白質消化によりプロセシングした後にこの目的に特別に設計された市販カラムを使用して試験サンプル中に存在する他の成分から核酸を分離することにより上記目的を達成する。好適市販製品はＱｉａｇｅｎ，ＧｍｂＨ製品である「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）ウイルス核酸抽出キットである。キットの詳細とその使用方法については、１９９９年１月発行“ＱＩ ａｍｐ７ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”参照。
【００５３】
要約すると、「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）キットはシリカベースの「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）スピンカラムの結合性を利用して変性試薬の存在下にサンプル溶解液からウイルスＲＮＡ及びＤＮＡを単離する。特別に処方された試薬を使用して試験サンプルを溶解させてウイルス粒子を破砕し、核酸を遊離させ、ＲＮＡとＤＮＡをヌクレアーゼ消化から保護する。試験サンプル溶解物（溶解液）を「ＱＩ ａｍｐ」（登録商標）核酸結合用スピンカラムに移す。「ＱＩ ａｍｐ」カラムマトリックスに結合したら、洗浄用緩衝液を使用して核酸を精製し、ＰＣＲを妨げる汚染物質を除去する。サンプル溶解液と洗浄用試薬のカラム処理には、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）製品である「ＬＣｘ」（登録商標）真空システム等の真空システムを使用する。あるいは、遠心を使用して各種洗浄用試薬をカラムに流すこともできる。「ＬＣｘ」（登録商標）真空システムは４８個のサンプルを同時に処理することができるので好ましい。「ＱＩ ａｍｐ」カラムを遠心することにより精製核酸を水で溶出させる。蛋白質、ヌクレアーゼ、及び他の汚染物質を含まない溶出液からウイルス核酸を回収する。「ＱＩ ａｍｐ」カラムから溶出後に、試験サンプルからの精製核酸（ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照の両者）はそれ以上精製又は調製せずに増幅することができる。
【００５４】
ＰＣＲにより増幅反応を実施する場合には、最初の変性段階後までＰＣＲ反応を開始しないことが好ましい。これを行うのに適した方法としては限定されないが、最初の変性段階で反応混合物を加熱するまで反応成分を冷温に維持する方法や、高温に暴露しないと活性化されない酵素の使用や、酵素と結合して重合を阻害する（非熱安定）抗体の存在下に反応に酵素を添加する方法が挙げられる。
【００５５】
プライマー：
上述のように、本方法で使用するプライマーは１５〜３０ヌクレオチド長が好ましく、試験サンプル中に存在するＨＣＶ ＲＮＡと内部対照のみの逆転写と増幅を特異的に開始する必要がある。
【００５６】
本発明者らは表１に記載するサブ配列（又はその相補配列）のいずれかを含むフォワードプライマーがＨＣＶゲノムＲＮＡに特に特異的であることを発見した。
【００５７】
【表１】
表中、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧとすることができる。
【００５８】
これらのサブ配列のうちで、好適フォワードプライマーは配列番号１、配列番号２２、配列番号３０、及び配列番号３５に示すようなサブ配列（又はその相補配列）を含むものである。
【００５９】
リバースプライマーの種類はフォワードプライマーほど本発明の実施に重要ではない。即ち、一般に、本発明はＨＣＶＲＮと内部対照を特異的に増幅するためにフォワードプライマーと共働する任意リバースプライマーを使用して実施され、許容可能な結果が得られる。但し、選択したフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより少なくとも２０ヌクレオチド長で好ましくは２５０ヌクレオチド長未満の増幅産物が得られることが好ましい。
【００６０】
本発明のＰＣＲ態様で使用するのに好適なリバースプライマーは、
配列番号４４：ＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣ ＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣ ＧＣ、及び
配列番号４５：ＡＴＧＴＧＣＡＣＧＧ ＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣ ＣＴＣＣである。
【００６１】
フォワードプライマーは（限定しないが）カルバゾール等の捕獲試薬をその５’末端に含むように修飾したリバースプライマーで標識しないことが好ましい。
【００６２】
内部対照核酸：
内部対照は、好ましくはＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域（ｕｔｒ）に由来するＨＣＶゲノム核酸の転写産物である。内部対照は内部対照のアンプリコンに特異的なプローブと配列が相補的なユニークプローブ結合領域を含むように修飾する。他方、他の全点において、内部対照はＨＣＶゲノムの一部と配列が一致する。従って、内部対照はＨＣＶゲノム核酸自体の内側の対応する位置と同一のプライマー結合部位をもつ。
【００６３】
内部対照とＨＣＶ ＲＮＡは同時逆転写され、同時増幅されるので、本発明では逆転写及び増幅反応の効率の有害な変動を補償することができる。従って、内部対照は逆転写及び増幅中にＨＣＶ ＲＮＡと厳密に同一条件下におかれる。
【００６４】
本方法は内部対照のアンプリコンに特異的にハイブリダイズする第２のプローブと、ＨＣＶゲノムＲＮＡのアンプリコンに特異的にハイブリダイズする第１のプローブの２種の別個のオリゴヌクレオチドプローブを使用する。どちらのプローブもアダマンタンやダンシル等の検出可能なラベル（即ちハプテン）を含むように修飾される。プローブはアッセイの検出段階で相互に区別できるように異なるハプテンで標識する必要がある。
【００６５】
ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンの好適プローブは、
配列番号４６：ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＧＧ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＴＧである。
【００６６】
ラベルと捕獲試薬（ハプテン）：
上述のように、本発明で使用する２種のプローブは相互に検出及び区別できるように示差的に標識する。ラベルの検出は直接又は間接手段により実施することができる。ラベルがプローブと夫々のアンプリコンのハイブリダイゼーションを妨げず、アッセイの他の成分に有害でない限り、ラベルの厳密な種類は本発明の総合機能性に重要ではない。本発明で使用するのに最も好適な２種の示差検出可能なラベルはアダマンタン由来ラベル（本明細書では単に「アダマンタン」と総称する）とダンシルである。好適アダマンタンラベルは米国特許第５，４２４，４１４号に記載されている。
【００６７】
このようなラベルをオリゴヌクレオチドに付着することは当分野で公知である。適切な標識法については、例えば、米国特許第５，４６４，７４６号；５，４２４，４１４号；及び４，９４８，８８２号参照。
【００６８】
所定の好適捕獲試薬は米国特許第５，４６４，７４６号に記載されている。
【００６９】
増幅：
ＲＴ−ＰＣＲ増幅は好ましくは上記標識プライマーを使用して常法通りに実施される。
【００７０】
内部対照とサンプル中に存在するゲノムＨＣＶ ＲＮＡ内の増幅ターゲット配列はＨＣＶゲノムの５’ｕｔｒ領域内にある。この領域はＨＣＶに特異的であり、全公知ＨＣＶ遺伝子型で高度に保存されている。好適プライマーは各種ＨＣＶ遺伝子型間のミスマッチが最少になるように５’ｕｔｒ内のターゲット領域とハイブリダイズするように設計される。この結果、遺伝子型変動が最少になり、本方法により全公知ＨＣＶ遺伝子を正確に検出及び定量することが可能になる。本明細書に記載するように、リバースプライマーは部分で標識し、ＨＣＶ特異的プローブは第１のラベルで標識し、内部対照特異的プローブは第２のラベルで標識することが好ましい。
【００７１】
逆転写反応は増幅反応と別個に実施してもよい。しかし、熱安定性ｒＴｔｈ等の逆転写酵素活性を含むポリメラーゼを使用して２反応を単一プロトコールとして実施することが好ましい。
【００７２】
従って、好適態様では、熱安定性ポリメラーゼは二重酵素機能をもち、逆転写酵素とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両者として機能する。長期インキュベーション期間中に逆転写酵素活性はＲＮＡターゲット（ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照）とハイブリダイズしたリバースプライマーからｃＤＮＡ伸長産物を生産する。このｃＤＮＡ産物はその後、ＰＣＲ増幅中に鋳型として直接作用する。第２のプライマーはｃＤＮＡ産物の領域に相補的であり、ＤＮＡ産物からのＰＣＲ伸長のプライマーとして作用する。
【００７３】
熱サイクル中に、ハイブリダイズした産物の融点よりも反応温度を上げると鎖は解離する。温度を下げると、過剰のプライマーは解離した鎖とアニールし、新規産物を生産する。高温と低温の反復サイクルにより産物の指数的増幅が達成される。４５熱サイクルでターゲット配列を１０９倍以上に増幅するのに十分である。両者ターゲット（存在する場合にはＨＣＶと内部対照）の増幅は同一反応で同時に実施される。
【００７４】
高温変性と低温インキュベーションを含む付加サイクルにより、ＨＣＶ特異的プローブと内部対照特異的検出プローブを夫々のアンプリコンにアニールすることができる。
【００７５】
増幅試薬の適切な混合物は以下の成分を指定濃度で含む：５０ｍＭ ｂｉｃｉｎｅ，１１５ｍＭ Ｋ＋，１５０μＭ ｄＮＴＰ，１２５ｎＭ捕獲部分修飾リバースプライマー，５０ｎＭフォワードプライマー，内部対照（〜１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ），５０ｎＭ標識ＨＣＶ核酸特異的プローブ，５０ｎＭ標識内部対照核酸特異的プローブ，ｒＴｔｈポリメラーゼ２．５単位，アセチル化ＢＳＡ０．０１ｍｇ／ｍｌ，０．０２％アジ化ナトリウム，８％グリセロール，０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．２２５％アジ化ナトリウム，及び０．００５％キシレノールオレンジ色素，ｐＨ８．２５に場合により０．３１２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加。
【００７６】
逆転写反応と増幅反応の両者を実施するための典型的熱サイクル条件セットは以下の通りである：
ｃＤＮＡ合成：９４℃，１分；６２℃，３０分；９４℃，２分；１サイクル。
増幅：９４℃，１分；６２℃，１分；４５サイクル。
プローブハイブリダイゼーション：９７℃，５分；１５℃，５分；１サイクル。
【００７７】
使用する熱サイクル装置がより完全にプログラム可能である場合には、次の条件が好ましい：
ｃＤＮＡ合成：９４℃，１分；６２℃，３０分；９４℃，２分；１サイクル。
増幅：９４℃，１５秒；５８℃，２０秒；サイクル毎に１秒の伸長を挟んで５サイクル；次いで９４℃，１５秒；６２℃，２５秒；サイクル毎に１秒の伸長を挟んで４０サイクル。
プローブハイブリダイゼーション：９７℃，５分；１５℃，５分；１サイクル。
【００７８】
アンプリコンは後期分析前に９６時間まで１５℃で増幅試薬混合物に浸漬することができる。
【００７９】
プライマーと内部対照は２種のターゲット（ＨＣＶゲノムＲＮＡと内部対照）がプライマーを競合するように最適化させる。従って、増幅プロトコールは競合的であると言う。ＨＣＶゲノムＲＮＡ濃度が内部対照の量に比較して高い場合には、これに対応して内部対照から生産されるアンプリコンの数は減少する。そこで、内部対照から生産されるアンプリコンの量とＨＣＶゲノムＲＮＡから生産されるアンプリコンの量の比を使用して試験サンプル中に存在するＨＣＶゲノムＲＮＡの量を定量する。
【００８０】
検出：
増幅反応が完了し、ＨＣＶ ＲＮＡと内部対照プローブのハイブリダイゼーションが完了した後に、サンプルを検出できるようになる。増幅プロトコールの最終段階で、反応体を検出プローブの融点未満に冷却する最終サイクル中にＨＣＶプローブと内部対照プローブは夫々の増幅産物とハイブリダイズする。検出プローブはターゲット鎖の内部配列に相補的であるので、偽増幅産物（例えばプライマーダイマー）を検出から排除することによりアッセイの特異性が増す。２プローブフォーマットデザインによりＨＣＶアンプリコンと内部対照アンプリコンの両者の二重検出が可能になる。
【００８１】
従って、好適態様では、ＨＣＶプローブと内部対照プローブを示差的に標識し、プライマーの一方又は両方（好ましくはリバースプライマーのみ）に捕獲部分を加えるように修飾する。検出段階において、捕獲試薬で被覆した不活性支持体にアンプリコンと未反応プライマーを固相化し、アンプリコンの後記分析を容易にする。従って、例えば、リバースプライマーにカルバゾール捕獲部分を加えるように修飾する場合には、不活性支持体、好ましくは微粒子を抗カルバゾール抗体（ウサギ）で被覆する。捕獲部分を含むアンプリコンと未反応プライマーの両者を微粒子に固相化することに留意すべきである。しかし、未反応プライマーは後記検出段階で検出されない（プライマーは標識しない）ので、分析結果に悪影響はない。
【００８２】
被覆微粒子を含む反応ウェルに増幅産物のアリコートを移す。被覆微粒子は増幅産物と未反応遊離リバースプライマー上に存在する捕獲部分を認識してこれと結合する。好適態様では、「ＬＣｘ」（登録商標）分析器を使用して微粒子複合体が不可逆的に結合するグラスファイバーマトリックスに反応混合物を自動移送する。洗浄後に、ＨＣＶアンプリコンと内部対照アンプリコンの量を検出及び定量することが可能な試薬と共に結合微粒子複合体をインキュベートする。これはＨＣＶプローブと内部対照プローブ上に存在する示差ラベルを検出することにより実施される。
【００８３】
好適態様では、ＨＣＶプローブをアダマンタンで標識し、内部対照プローブをダンシルで標識する。これらのラベルを検出するためには、ラベルに特異的な抗体を直接検出可能な酵素とコンジュゲートする。その後、コンジュゲートを微粒子と接触させると、コンジュゲートは夫々のラベルと結合する。次に、酵素基質を添加すると、ＨＣＶアンプリコンの明白なシグナルと内部対照アンプリコンの明白なシグナルが発生する。次にこれらの２値を比較して比を求め、元の試験サンプル中のＨＣＶ核酸の量を決定する。
【００８４】
例えば、（本例ではアダマンタンで標識した）ＨＣＶプローブを検出するためには、抗アダマンタン抗体を（例えば）アルカリホスファターゼ酵素とコンジュゲートする。抗アダマンタン／アルカリホスファターゼコンジュゲートはＨＣＶ特異的プローブのみと結合する。コンジュゲートの抗体部分がアダマンタンプローブと結合するために十分な条件と時間で微粒子を抗アダマンタン／アルカリホスファターゼコンジュゲートと共にインキュベートする。次に、アルカリホスファターゼ基質ＭＵＰをインキュベーション反応に添加する。その結果、ＭＵＰ基質がコンジュゲートのアルカリホスファターゼ部分により開裂され、蛍光産物を生産する反応が生じる。蛍光産物は光度計等の周知光学蛍光検出手段により検出される。蛍光シグナルの大きさはＨＣＶアンプリコン結合量に比例する。
【００８５】
同様に、（本例ではダンシルで標識した）内部対照プローブを検出するためには、抗ダンシル抗体を（例えば）β−ガラクトシダーゼ酵素とコンジュゲートする。抗ダンシル／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートは内部対照特異的プローブのみと結合する。コンジュゲートの抗体部分がダンシルプローブと結合するために十分な条件と時間で微粒子を抗ダンシル／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートする。次に、β−ガラクトシダーゼ基質ＡＵＧをインキュベーション反応に添加する。その結果、ＡＵＧ基質がコンジュゲートのβ−ガラクトシダーゼ部分により開裂され、蛍光産物を生産する反応が生じる。蛍光産物は光度計等の周知光学蛍光検出手段により検出される。この第２の蛍光シグナルの大きさは内部対照アンプリコン結合量に比例する。
【００８６】
プローブ検出順は重要ではない。プローブ上の特異的ラベルの種類も本発明の機能に重要ではないが、以下の３点に注意すべきである。
【００８７】
１．ラベルは逆転写又は増幅反応を妨げないことが好ましい。
【００８８】
２．選択する２種のラベル（ＨＣＶプローブのラベルと内部対照プローブのラベル）は必ず相互に異なっていなければならず、２種のシグナルを相互に区別できるように示差的に検出可能でなければならない。
【００８９】
３．２種の異なるラベルを検出するために必要な化学反応は相互に干渉しないことが好ましい。
【００９０】
これらの３点を満足するならば、本発明は放射性、蛍光、色素、及び酵素ラベル等の任意２種の示差検出可能なラベルを用いて実施することができる。
【００９１】
こうして作製された抗体とアルカリホスファターゼ等の酵素をコンジュゲートするには、当分野で周知の手段により実施される。例えば、以下のスキームによりアルカリホスファターゼを抗体とコンジュゲートすることができる。
【００９２】
１．５ｍｇ／ｍｌ抗体溶液を０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ６．８）２Ｌで４℃にて透析する。
【００９３】
２．抗体溶液を透析メンブレンから除去し、ＰＢＳで３ｍｇ／ｍｌに調整する。
【００９４】
３．１．５ｍｌ遠心管でアルカリホスファターゼ９０μｌに透析抗体溶液１００μｌを加える。
【００９５】
４．グルタルアルデヒド５ｍｌを加えて静かに混合する。室温で放置する。
【００９６】
５．２５μｌサンプルを０、５、１０、１５、３０、６０、及び１２０分に取出し、別々の１．５ｍｌマイクロ遠心管に加える。ＰＢＳ１２５μｌを各サンプルに加えた後、Ｔｒｉｓ／オボアルブミン溶液１．１ｍｌを加える。時間経過が完了するまで各サンプルを氷上に保存する。
【００９７】
６．サンプルを段階１に記載したようにＰＢＳで透析する。各サンプルのアルカリホスファターゼ活性を試験し、最高活性酵素コンジュゲートが得られたコンジュゲーション時間を決定する。
【００９８】
７．段階１〜４を繰返すが、段階４では段階６で決定された最適コンジュゲーション時間にわたって反応を進行させる。
【００９９】
８．アジ化ナトリウムを０．１％まで加え、コンジュゲートを４℃で遮光保存する。１年まで活性に維持されるべきである。あるいは、等容量のグリセロールを加えてコンジュゲートを−２０℃で凍結保存する。
【０１００】
校正曲線：
本発明の顕著な利点の１つは、内部対照がＲＴ−ＰＣＲからアンプリコンの単離分析に至る全工程に介在するので、１組の校正曲線を使用して方法を先験的に校正できる点にある。従って、末端使用者が実施しなければならない校正操作数が最小限になる。要約すると、使用者はアッセイを実施し、比：｛ＨＣＶ ＲＮＡアンプリコンのカウント率（即ちｃ／ｓ／ｓ）と内部対照アンプリコンのカウント率（ｃ／ｓ／ｓ）の比｝の対数を計算し、得られた値を試験サンプル中のＨＣＶの濃度に到達するまで対応する予備作成校正曲線と比較するだけでよい。
【０１０１】
適切な校正曲線を作成するために使用される校正サンプルは各々固定既知濃度の内部対照（例えば、１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。校正サンプルは更に方法のダイナミックレンジ全体にわたる系統的変動レベルのＨＣＶ転写産物を含む。従って、典型的な校正サンプル系列は以下のサンプルを含む（内部対照２，０００又は１０，０００コピー／サンプル）。
【０１０２】
【表２】
異なる数組の校正サンプルを集めて好適方法により試験した。校正サンプルを作成するために使用したＨＣＶ転写産物はＳａｎｑｕｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｙ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｐｌｅｓｍａｎｌａａｎ １２５，１０６６ＣＸ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，オランダ（旧名称ＣＬＢ）から入手した世界保健機構候補基準物質に準じた。
【０１０３】
従って、例えば各サンプルが内部対照１０、０００コピーとＨＣＶ転写産物０、ｌｏｇ２．５０、ｌｏｇ３．０２、ｌｏｇ３．５９、ｌｏｇ４．０９、ｌｏｇ６．１５及びｌｏｇ７．１９コピー／ｍｌを含む一連の校正サンプルに対する本方法の反復試験（ｎ＞１００）では、以下の標準偏差が得られた。
【０１０４】
【表３】
０の校正サンプルとｌｏｇ２．５の校正サンプルの前後の３個の標準偏差範囲はオーバーラップしないことに留意されたい。従って、陰性サンプルは「弱陽性」サンプル即ちＨＣＶ約ｌｏｇ２．５０コピー／ｍｌを含むサンプルから容易に区別される。
【０１０５】
１０人の既知ＨＣＶ陰性患者から採取した血清血漿を使用する試験で各患者から３種のサンプル（血清サンプル、ＥＤＴＡ血漿サンプル、及びＡＣＤ血漿サンプル）を調製した。各サンプルをｌｏｇ３．００コピーＨＣＶ／ｍｌでスパイクした後に本方法の好適態様に従って試験した。これらの３０個のサンプルの標準偏差は０．１１６であり、表３のｌｏｇ３．０２コピー／ｍｌキャリブレーターサンプルの標準偏差０．１３３と非常に近似する値であった。
【０１０６】
陰性血清サンプルと「弱陽性」血清サンプル（ｌｏｇ３．５ＨＣＶコピー／ｍｌ）も潜在干渉化合物でスパイクし、これらの化合物がサンプル中のＨＣＶの正確な測定を妨害するか否かを調べた。蛋白質（合計９０ｍｇ／ｍｌ−アルブミン５５ｍｇ／ｍｌとγグロブリン３５ｍｇ／ｍｌ）、ヘモグロビン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ビリルビン（０．４ｍｇ／ｍｌ）、脂質（３０ｍｇ／ｍｌ及び２０％リポシンＩＩ）、又はＨＣＶ抗ウイルス剤（２７３ＩＵ／ｍｌインターフェロンα−２ｂ又は２７３ＩＵ／ｍｌインターフェロンα−２ｂと０．０５μｇ／ｍｌリバビリンの併用）をサンプルに添加したが、スパイクしたサンプルから得られる結果は対照に比較して有意変化がなかった。
【０１０７】
キット：
本発明は本発明の方法を実施するために必要なプライマー、プローブ、ラベル、試薬等の全部又はサブセットを含むキットにも関する。従って、キットの好適態様はフォワード及びリバースプライマー、内部対照、ＨＣＶ特異的プローブ、及び内部対照特異的プローブを含む１個以上の容器を含む。これらの成分は適切な緩衝液に溶かす又は凍結乾燥して供給することができる。キットは場合によりＨＣＶ検出法を実施するための説明書を添付してもよい。キットは場合により予備作成校正曲線を添付してもよい。
【０１０８】
キットの他の態様は緩衝液、ｄＮＴＰ、ｒＴｔｈ酵素、停止試薬、コンジュゲート試薬混合物等の更に広範な試薬群を含む。これらの成分は末端使用者が本方法をより簡便に実施できるように複数の容器に収容される。従って、本発明によるこのようなキットの１例はそれ自体の容器に各々収容された以下の混合物を含むことができる。
【０１０９】
１．２ｘ増幅試薬ミックス：１００ｍＭ ｂｉｃｉｎｅ，２３０ｍＭ Ｋ＋，３００μＭ ｄＮＴＰ，２５０ｎＭリバースプライマー，本質的に配列番号１〜４３から構成される配列をもつ１００ｎＭフォワードプライマー，１００ｎＭ標識ＨＣＶ核酸特異的プローブ，１００ｎＭ標識内部対照核酸特異的プローブ，ｒＴｔｈポリメラーゼ５単位，アセチル化ＢＳＡ０．０２ｍｇ／ｍｌ，０．０４％アジ化ナトリウム，１６％グリセロール，内部対照（１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ）（ｐＨ８．２５）。これを１００％希釈して１ｘ増幅試薬ミックスとする。
【０１１０】
２．活性化試薬ミックス：１０ｍＭ ＭｎＣｌ２，０．４５％アジ化ナトリウム，０．０１０％キシレノールオレンジ色素。活性化試薬ミックスを１ｘ増幅試薬ミックスに添加し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を開始する。従って、サンプルを増幅できるようになるまでこのミックスは添加しない。
【０１１１】
３．内部対照核酸試薬ミックス：あるいは、内部対照ＲＮＡ転写産物（１０，０００コピー／ＲＴ−ＰＣＲ）（上記増幅試薬ミックスの欄に記載）を別成分として添付してもよい。内部対照は１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，０．２ｍＭ ＥＤＴＡ，アセチル化ＢＳＡ１００μｇ／ｍｌ，１０ｍＭ ＤＴＴ，ＲＮアーゼインヒビター０．５Ｕ／μｌ，ｐｏｌｙ−Ａ８７２５μｇ／ｍｌ，０．０４５％アジ化ナトリウムの溶液で提供される。
【０１１２】
４．抗カルバゾール微粒子：０．２６５％トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液中ウサギ抗カルバゾール抗体で被覆した直径０．４００μｍ粒子。
【０１１３】
５．コンジュゲート試薬ミックス：抗ダンシル／β−ガラクトシダーゼコンジュゲートと抗アダマンタン／アルカリホスファターゼコンジュゲート；各々抗体１ｍｌ当たり〜１μｇ。
【０１１４】
６．夫々アルカリホスファターゼとβ−ガラクトシダーゼの酵素基質であるＭＵＰ（緩衝液中１．２ｍＭ）とＡＵＧ（緩衝液中３．０ｍＭ）。
【０１１５】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、
当該オリゴヌクレオチドは、（ａ）配列番号１〜２１、２３〜２５または２７−４３のいずれか１つ；又は（ｂ）（ａ）と長さが同一である（ａ）の相補配列から成る前記化合物。
【請求項２】
（ａ）のオリゴヌクレオチドが配列番号１〜８のいずれか１つから成る請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ａ）のオリゴヌクレオチドが配列番号９〜２１のいずれか１つから成る請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
（ａ）のオリゴヌクレオチドが配列番号２３〜２５または２７〜４３のいずれか１つから成る請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが標識されている請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドがハプテンで標識されている請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
（ａ）ＨＣＶゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、（ｉ）ＨＣＶ核酸配列を含む既知量の内部対照オリゴヌクレオチドと；（ｉｉ）内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第１の標識プローブと；（ｉｉｉ）ＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第２の標識プローブを添加する段階と；次に
（ｂ）（ｉ）配列番号１〜２１、２３〜２５または２７−４３のいずれか１つ；又は（ｉ）と長さが同一である（ｉ）の相補配列から成るフォワードプライマーとリバースプライマーを使用して段階（ａ）からの試験サンプル中に存在する内部対照オリゴヌクレオチドとＨＣＶゲノム核酸が存在する場合にはこれを競合的に同時増幅することにより、試験サンプル中に存在する内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンとＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンを生産する段階と；次に
（ｃ）第１の標識プローブを内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンにハイブリダイズさせると共に第２の標識プローブをＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンにハイブリダイズさせる条件下で段階（ｂ）からの試験サンプルをインキュベートすることにより、ハイブリッドを形成する段階と；次に
（ｄ）第１の標識プローブと内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンの間で形成されたハイブリッドと、第２の標識プローブとＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンの間で形成されたハイブリッドを検出することにより、試験サンプル中に存在するＨＣＶゲノム核酸の量を定量する段階を含む試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム核酸の量の定量方法。
【請求項８】
段階（ａ）において第１の標識プローブが配列番号４６又は配列番号４６と長さが同一である配列番号４６の相補配列から構成されるオリゴヌクレオチドを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）（ｉ）の配列が配列番号１〜８のいずれか１つである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＣＶゲノム核酸を特異的に増幅することが可能であるプライマー対を収容する第１の容器であって、
一方のプライマーは、（ａ）配列番号１〜２１、２３〜２５または２７〜４３のいずれか１つ；又は（ｂ）（ａ）と長さが同一である（ａ）の相補配列から成る配列を有する前記第１の容器と；
ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域からの核酸転写産物を含む内部対照ＨＣＶオリゴヌクレオチドを収容する第２の容器と；
ＨＣＶゲノムＲＮＡのアンプリコンに特異的な第１のプローブと内部対照ＨＣＶオリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第２のプローブを収容する第３の容器を併有する、試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム核酸の量の定量用キット。
【請求項１】
単離オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、
当該オリゴヌクレオチドは、（ａ）配列番号１〜２１、２３〜２５または２７−４３のいずれか１つ；又は（ｂ）（ａ）と長さが同一である（ａ）の相補配列から成る前記化合物。
【請求項２】
（ａ）のオリゴヌクレオチドが配列番号１〜８のいずれか１つから成る請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（ａ）のオリゴヌクレオチドが配列番号９〜２１のいずれか１つから成る請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
（ａ）のオリゴヌクレオチドが配列番号２３〜２５または２７〜４３のいずれか１つから成る請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが標識されている請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドがハプテンで標識されている請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
（ａ）ＨＣＶゲノム核酸を含む疑いのある試験サンプルに、（ｉ）ＨＣＶ核酸配列を含む既知量の内部対照オリゴヌクレオチドと；（ｉｉ）内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第１の標識プローブと；（ｉｉｉ）ＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンに特異的な第２の標識プローブを添加する段階と；次に
（ｂ）（ｉ）配列番号１〜２１、２３〜２５または２７−４３のいずれか１つ；又は（ｉ）と長さが同一である（ｉ）の相補配列から成るフォワードプライマーとリバースプライマーを使用して段階（ａ）からの試験サンプル中に存在する内部対照オリゴヌクレオチドとＨＣＶゲノム核酸が存在する場合にはこれを競合的に同時増幅することにより、試験サンプル中に存在する内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンとＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンを生産する段階と；次に
（ｃ）第１の標識プローブを内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンにハイブリダイズさせると共に第２の標識プローブをＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンにハイブリダイズさせる条件下で段階（ｂ）からの試験サンプルをインキュベートすることにより、ハイブリッドを形成する段階と；次に
（ｄ）第１の標識プローブと内部対照オリゴヌクレオチドのアンプリコンの間で形成されたハイブリッドと、第２の標識プローブとＨＣＶゲノム核酸のアンプリコンの間で形成されたハイブリッドを検出することにより、試験サンプル中に存在するＨＣＶゲノム核酸の量を定量する段階を含む試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム核酸の量の定量方法。
【請求項８】
段階（ａ）において第１の標識プローブが配列番号４６又は配列番号４６と長さが同一である配列番号４６の相補配列から構成されるオリゴヌクレオチドを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）（ｉ）の配列が配列番号１〜８のいずれか１つである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＣＶゲノム核酸を特異的に増幅することが可能であるプライマー対を収容する第１の容器であって、
一方のプライマーは、（ａ）配列番号１〜２１、２３〜２５または２７〜４３のいずれか１つ；又は（ｂ）（ａ）と長さが同一である（ａ）の相補配列から成る配列を有する前記第１の容器と；
ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域からの核酸転写産物を含む内部対照ＨＣＶオリゴヌクレオチドを収容する第２の容器と；
ＨＣＶゲノムＲＮＡのアンプリコンに特異的な第１のプローブと内部対照ＨＣＶオリゴヌクレオチドのアンプリコンに特異的な第２のプローブを収容する第３の容器を併有する、試験サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム核酸の量の定量用キット。
【公開番号】特開２０１０−２４６５５５（Ｐ２０１０−２４６５５５Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１３６８２４（Ｐ２０１０−１３６８２４）
【出願日】平成２２年６月１６日（２０１０．６．１６）
【分割の表示】特願２００４−５２４８８４（Ｐ２００４−５２４８８４）の分割
【原出願日】平成１５年７月２５日（２００３．７．２５）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３６８２４（Ｐ２０１０−１３６８２４）
【出願日】平成２２年６月１６日（２０１０．６．１６）
【分割の表示】特願２００４−５２４８８４（Ｐ２００４−５２４８８４）の分割
【原出願日】平成１５年７月２５日（２００３．７．２５）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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