ＣＤ１Ｄリガンドを使用する免疫化のための組成物および方法
本発明は、追加免疫投与の非存在下および／または複数回のプライミング投与の非存在下で長期免疫記憶を誘発するＣＤ１ｄリガンドを含む免疫原性組成物に関する。本発明は、さらに、ＣＤ１ｄリガンドならびにインフルエンザウイルス、Ｂ群連鎖球菌、および血清型Ｂ株髄膜炎菌由来の抗原を含む免疫原性組成物に関する。免疫応答を誘導するために患者に投与されるＣＤ１ｄリガンドの量は、組成物が投与される患者の年齢および体重によって変化するが、通常は、１〜１００μｇ／ｋｇ患者体重で含み、これは、その抗原に対する長期免疫記憶を促進するのに十分である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に引用するすべての文献は、それら全体が参照として援用される。
【０００２】
本発明は、ワクチン組成物の分野および、ワクチン組成物を用いる免疫化方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
病原体に由来する抗原を含むワクチン組成物を最初に投与すると、抗原に対して活性化細胞および記憶細胞の両形態での一次応答を誘導する。それに続くその抗原への曝露（例えばその病原体への曝露）は、免疫記憶細胞の増殖および一次応答よりもより迅速で大きい二次応答を誘導し、それによってその病原体からの保護を与える。
【０００４】
免疫記憶細胞は、抗原への一次曝露の後、数カ月間または数年間でも存続するが、通常は、長期免疫記憶の維持を確実にするために抗原の追加免疫用量を与えることが必要である。従ってワクチン接種レジメンは、免疫記憶細胞の最初のバンクを与えるために何回かのプライミング注射、およびその後免疫記憶を維持するために次第に間隔をあけて何回かの追加免疫を含むことが多い。追加免疫注射と共に何回かのプライミング注射および頻度の必要性は、ワクチンおよび受容者の年齢によって変化する。
【０００５】
免疫記憶の維持を損なうことなく、プライミング投与の回数および追加免疫投与の頻度と回数を減少させることができることは、有利である。理想的には、追加のプライミング投与および追加免疫投与の必要性を完全に取り除き、単回投与としてワクチンを投与することが好ましい。従って、本発明の目的は、追加免疫投与の非存在下でおよび／または複数のプライミング投与の非存在下で長期免疫記憶を誘導する免疫原性組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の目的は、さらに、インフルエンザウイルス、Ｂ群連鎖球菌、および血清型Ｂ株髄膜炎菌に由来する抗原を含む免疫原生組成物を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ワクチンは、免疫活性を高めるためにアジュバントを含むことが多い。既知のアジュバントの例としては、アルミニウム塩、水中油型乳剤、サポニン、サイトカイン、脂質、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。現在は、アルミニウム塩、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄＭＰＬ」）、およびＭＦ５９だけがヒト用途として承認されている。
【０００８】
アジュバント特性を有することで知られている別の分子は、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒまたはα−ＧＣ）（糖脂質、より具体的にはグリコシルセラミド、最初は海綿から単離された）である［１］。α−ＧａｌＣｅｒは、ＭＨＣクラスＩ様分子のリガンド（ＣＤ１ｄ）であり、ＣＤ１ｄ分子によってインバリアントナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に提示される。α−ＧａｌＣｅｒは、最初は、腫瘍細胞に対するＮＫＴ細胞応答を誘導するその能力を研究された［２］。インバリアントＮＫＴ細胞は、また、Ｂ細胞活性化を誘導し、Ｂ細胞増殖および抗体産生を増強させることが示されている［３、４］。α−ＧａｌＣｅｒは、同時投与される種々のタンパク質抗原のためのアジュバントとして作用することが示されている［５］。マラリア抗原を発現する照射されたスポロゾイトまたは組換えウイルスとα−ＧａｌＣｅｒとの同時投与は、マウスでの抗マラリア防御免疫のレベルを増強させることが示されている［６］。α―ＧａｌＣｅｒは、また、ＤＮＡワクチンをコードするＨＩＶ１型ｇａｇ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子のためのアジュバントとして作用し［７］、鼻腔内に投与されると、インフルエンザウイルＨＡ型に対して液性および細胞性の免疫応答を誘導する［８］ことが示されている。
【０００９】
驚くべきことに、ワクチンアジュバントとしてのα−ＧａｌＣｅｒ等のＣＤ１ｄリガンドの使用は、ワクチンで抗原に対する抗体応答を著しく増強するばかりでなく、それらの抗原に対して特異的なＢ細胞記憶プールの増大を誘導することが、現在判明している。具体的には、α−ＧａｌＣｅｒおよび抗原を含む組成物の単回投与からなる投与は、１年後に抗原による攻撃に対する抗体応答を増強する特異的なＢ細胞記憶プールの増大を促進するのに十分であることが分った。特異的なＢ細胞記憶プールの増大を促進するこのＣＤ１ｄリガンドの能力は、ワクチンアジュバントとしてのＣＤ１ｄリガンドを使用すると、長期免疫記憶を得るために必要なプライミングおよび追加免疫投与回数と頻度を減少させることを示す。
【００１０】
また、ＣＤ１ｄリガンドは、Ｂ群連鎖球菌、血清型Ｂ株髄膜炎菌に由来する抗原および特定のインフルエンザウイルス抗原に驚くほど有効なアジュバントであることが分った。
【００１１】
長期免疫記憶を誘導する方法
本発明は、それを必要としている患者においてある抗原に対する長期免疫記憶を誘導する方法を提供し、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下で前述の抗原の投与と比較して、前述の患者がその後の前述の抗原への曝露に対する免疫応答を上げることができるように必要な前述の組成物の投与回数および／または頻度を減少するように、以下を含む組成物を前述の患者に投与することを含む：
ａ）前述の抗原および
ｂ）ＣＤ１ｄリガンド。
【００１２】
好ましくは、本発明の方法は、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下で前述の抗原の投与と比較して、前述の患者が前述の抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を上げることができるために必要な前述の組成物の投与回数および／または頻度を減少させる。「防御免疫応答」とは、抗原へのその後の曝露に対して上昇した免疫応答が、患者が抗原と関連する疾患に罹患するのを防ぐのに十分であることを意味する。抗原に対する防御免疫応答を上げるために必要な組成物の投与回数および／または頻度の減少は、当該技術分野で周知の標準方法で測定される。
【００１３】
本発明の方法は、その抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を誘導するのに必要な抗原を含む組成物の投与回数を減少させる。一部の免疫化は、現在、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を上げるために３回もしくは４回の抗原のプライミング投与を必要とする。好ましくは、本発明の方法は、抗原に対する防御免疫応答を誘導するのに必要な投与回数を単回プライミング投与まで減少させる。
【００１４】
現在の免疫化方法は、また、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を維持するために次第に間隔をあける追加免疫免疫化を必要とすることが多い。例えば、幼児期に施される免疫化は、通常は、初回量の投与から数カ月または数年後に施される追加免疫投与を含む。好ましくは、本発明の方法は、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を維持するために必要な抗原を含む組成物の追加免疫投与の頻度を減少させる。好ましくは、本発明の方法は、１年を超える、好ましくは２年を超える、好ましくは５年を超える、好ましくは１０年を超える間隔で追加免疫投与が投与されることを可能にする。本発明の好ましい実施形態により、追加免疫投与のための必要性は完全に排除され、抗原の単回投与は、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を誘導するのに十分である。
【００１５】
本発明の一態様によると、患者の抗原に対する免疫応答を誘導する方法は、抗原およびＣＤ１ｄリガンドが、１年より前にも投与された患者に以下を投与することを含み提供される：
ａ）前述の抗原および
ｂ）ＣＤ１ｄリガンド。
【００１６】
本発明は、また、抗原およびＣＤ１ｄリガンドが１年より前にも投与された患者において免疫応答を誘導するための薬物の製造で前述の抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。
【００１７】
好ましくは、免疫応答は、防御免疫応答である。好ましくは、前述の抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、前述の患者に１８カ月以上前に、好ましくは２年以上前に、好ましくは５年以上前に、好ましくは１０年以上前に投与された。
【００１８】
本発明のこの態様によって患者に投与される抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、混合物として、すなわち、抗原およびＣＤ１ｄリガンドの両方を含む単一組成物として投与される。あるいは、抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、最初に投与される抗原もしくはＣＤ１ｄリガンドのいずれかと同じ部位で患者に連続して投与される。抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、また、異なる部位で（例えば異なる四肢に）別々に患者に投与される。１年以上前に患者に投与されたＣＤ１ｄリガンドおよび抗原の初回投与は、また、ＣＤ１ｄリガンドと抗原との単一組成物として投与されることも可能であり、またはＣＤ１ｄリガンドと抗原は、連続してもしくは別々に投与される。免疫応答を誘導するために患者に投与されるＣＤ１ｄリガンドの量は、組成物が投与される患者の年齢および体重によって変化するが、通常は、１〜１００μｇ／ｋｇ患者体重で含む。驚くべきことに、低用量のＣＤ１ｄリガンドは、同時投与された抗原への免疫応答を増強し、その抗原に対する長期免疫記憶を促進するのに十分であることが分った。本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドの量は、従って、患者体重あたり５０μｇ／ｋｇ未満、２０μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満であってよい。
【００１９】
本発明の別の態様によると、患者の抗原に対する免疫応答を誘導する方法は、前述の患者に以下を投与することを含み提供される：
ａ）前述の抗原および
ｂ）ＣＤ１ｄリガンド；
ここでは、組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドの量は、患者体重あたり１０μｇ／ｋｇ未満、好ましくは、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満である。
【００２０】
本発明は、また、患者の免疫応答を誘導するための薬物の製造で抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。ここでのＣＤ１ｄリガンドの量は、患者の体重あたり１０μｇ／ｋｇ未満、好ましくは、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満である。
【００２１】
本発明のこの態様により患者に投与される抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、混合物として投与される；同じ部位（最初に投与される抗原またはＣＤ１ｄリガンドのいずれかと）に患者に連続して投与される；または異なる部位（例えば異なる四肢に）に別々に患者に投与される。
【００２２】
ＣＤ１ｄリガンド
本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄ分子に結合する任意の分子であってよい。ＣＤ１ｄ分子は、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単核細胞、および従来のＴ細胞の上に位置し、本発明のＣＤ１ｄリガンドは、これらの細胞のいずれかに位置するＣＤ１ｄ分子に結合する。本発明のＣＤ１ｄリガンドのＣＤ１ｄ分子への結合は、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単核細胞、および／または従来のＴ細胞を活性化する。好ましくは、ＣＤ１ｄリガンドのＣＤ１ｄ分子への結合は、ｉＮＫＴ細胞を活性化する。ＣＤ１ｄ分子に結合する分子の能力は、当該技術分野で周知の標準方法によって決定される。細胞、特にインパリアントＮＫＴ細胞を活性化するＣＤ１ｄリガンドの能力は、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下で放出されるサイトカインの濃度と比較して、ＣＤ１ｄリガンドの存在下で細胞から放出されるサイトカインの濃度を測定することで決定される。好ましくは、本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下でインバリアントＮＫＴ細胞によるサイトカイン分泌の濃度と比較して、インバリアントＮＫＴ細胞によるサイトカイン分泌の濃度を上昇させる。本発明のＣＤ１ｄリガンドは、Ｔｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカインの放出を促進する。好ましくは、本発明のＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下でインバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルと比較して、インバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルを上昇させる。
【００２３】
インバリアントＮＫＴ細胞を活性化するＣＤ１ｄリガンドとして作用する能力を検査される候補分子は、ペプチドおよびサッカライドを含む。好ましくは、本発明のＣＤ１ｄリガンドは糖脂質である。本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドとして作用することが知られている糖脂質抗原の総説は、参照文献９に示される。
【００２４】
本発明の組成物での使用に適したＣＤ１ｄリガンドの例は、α−グリコシルセラミドを含む。本発明の組成物で使用されるα−グリコシルセラミドは、好ましくは、式（Ｉ）の化合物である：
【００２５】
【化１】
（式中、
Ａは、Ｏ、ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２を表し、
Ｑは、ｎが０もしくは１の整数を表す（ＣＨ２）ｎを表し、
Ｒ１は、ＨもしくはＯＨを表し、
Ｘは、１から３０の整数を表し、
Ｒ２は、以下の（ａ）乃至（ｅ）から成る群から選択される置換基を表す（式中、Ｙは、５から１７の整数を表す）。
（ａ）−ＣＨ２（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）２
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、またはモノサッカライドを表し、
Ｒ４は、ＯＨまたはモノサッカライドを表し、
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはモノサッカライドを表し、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、またはモノサッカライドを表し、および
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、または−ＣＨ２−モノサッカライドを表す。
【００２６】
Ｘは、好ましくは、７から２７の間、より好ましくは、９から２４の間、およびより好ましくは１３から２０の間である。Ｙは、好ましくは、７から１５の間、より好ましくは、９から１３の間である。
【００２７】
用語「モノサッカライド」は、アルデヒド（アルドース）またはケトン（ケトース）の形で３〜１０の炭素原子の鎖を有する糖分子を意味する。本発明での使用に適したモノサッカライドは、自然発生と合成の両モノサッカライドを含む。モノサッカライドの例として、以下が挙げられる：トリオース（グリセロースおよびジヒドロキシアセトン等）；テキストロース（エリサノース（ｅｒｙｔｈａｎｏｓｅ）およびエリトルロース等）；ペントース（キシロース、アラビノース、リボース、キシルロース、リブロース等）；メチルペントース（６−デオキシヘキソース）（ラムノースおよびフルクトース等）；ヘキソース（グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、およびソルボース等）；ヘプトース（グルコヘプトース、ガラマンノヘプトーセ（ｇａｌａｍａｎｎｏｈｅｐｔｏｓｅ）、セドヘプツロース、およびマンノヘプツロース等）。好ましいモノサッカライドは、ヘキソースである。
【００２８】
モノサッカライド基は、グルコシル結合を形成するために、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の位置で構造に結合してよい。通常は、モノサッカライドは、モノサッカライドのＣ−１炭素に結合した酸素を介してＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の位置に結合し、グリコシド結合を形成する。
【００２９】
Ｒ３がモノサッカライドの場合、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、またはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３０】
Ｒ４がモノサッカライドの場合、β−Ｄ−ガラクトフラノースまたはＮ−アセチル α−Ｄ−ガラクトピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３１】
Ｒ５がモノサッカライドの場合、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、またはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３２】
Ｒ６がモノサッカライドの場合、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、またはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３３】
Ｒ７がモノサッカライドの場合、メチル α−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチル β−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチル α−Ｄ−グルコピラノシド、またはメチル β−Ｄ−グルコピラノシドから選択されるのが好ましい。
【００３４】
Ｒ５とＲ６は異なるのが好ましい。Ｒ５およびＲ６の１つはＨであるのが好ましい。
【００３５】
さらに、本発明の組成物の包含に適したα−グリコシルセラミドの例は、参照文献２に示される。
【００３６】
好ましくは、α−グリコシルセラミドは、以下に示す式を有するα−グリコシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）、またはその類似体である：
【００３７】
【化２】
本発明の組成物に含まれるα−ＧａｌＣｅｒおよびその類似体は、海綿から直接単離されることが可能であり、または化学的に合成される生成物であってよい。
【００３８】
本発明の組成物での使用に適したα−ＧａｌＣｅｒ類似体の例、およびこれらの生成物を合成する方法は、参照文献１０および１１に示される。好ましいα−ＧａｌＣｅｒ類似体は、式（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−ｌ，３，４−オクタデカントリオール）を有するＫＲＮ７０００である。ＫＲＮ７０００の合成は、参照文献１２に記述されている。
【００３９】
さらに好ましいα−ＧａｌＣｅｒ類似体は、参照文献１３、１４、および１５に記述されているもの等のα−ＧａｌＣｅｒのＣ結合類似体である。好ましいα−ＧａｌＣｅｒのＣ結合類似体は、ＣＲＯＮＹ−１０１であり、その合成は参照文献１３に記述されている。
【００４０】
α−ＧａｌＣｅｒと比較して脂肪酸アシル鎖および／またはスフィンゴシン鎖が切り詰められた切断型α−ＧａｌＣｅｒ類似体も、本発明で使用される。切断型α−ＧａｌＣｅｒ類似体の例は、参照文献１６に示されている。好ましいα−ＧａｌＣｅｒと比較して、好ましいα−ＧａｌＣｅｒの切断型類似体は、脂肪酸アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、スフィンゴシン鎖が９つの炭化水素の切断を有する（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ２＝ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）４ＣＨ３、Ｒ３＝０Ｈ、Ｒ４＝０Ｈ、Ｒ５＝０Ｈ、Ｒ６＝Ｈ、およびＲ７＝ＣＨ２ＯＨ）「ＯＣＨ」である。
【００４１】
さらに、好ましいα−ＧａｌＣｅｒと比較して、好ましいα−ＧａｌＣｅｒの切断型類似体は、脂肪酸アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、スフィンゴシン鎖が７つもしくは３つの炭化水素の切断を有する（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝Ｈ、Ｒ７＝ＣＨ２ＯＨ、およびＲ２がＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）６ＣＨ３またはＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）１０ＣＨ３のいずれかである）類似体を含む。
【００４２】
α−ＧａｌＣｅｒ、ＫＲＮ７０００、およびＯＣＨは、すべてフィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミドである。しかし、本発明は、また、スフィンゴシン包含ＫＲＮ７０００、ＯＣＨ、および上述の他のα−グリコシルセラミドの類似体の使用を含む。スフィンゴシン含有ＫＲＮ７０００およびＯＣＨの類似体の合成は、参照文献１７に記述されている。
【００４３】
本発明の組成物で使用されるＣＤ１ｄリガンドは、また、参照文献１８に記述されるようなスルファチド類似体を含んでよい。α−ＧａｌＣｅｒの好ましい類似体は、３’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドである。
【００４４】
α−ＧａｌＣｅｒは、最初は海綿から単離されたが、α−ＧａｌＣｅｒの類似の構造からなるＣＤ１ｄリガンドは、最近、グラム陰性細菌から単離されている。さらに、本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドは、従って、細菌に由来する糖脂質であり、特にスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）およびエーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）の外膜から単離される細菌性グリコシルセラミドである。そのようなグリコシルセラミドの例は、スフィンゴモナスに由来するα−グルクロノシルセラミドおよびα−ガラクツロンシルセラミドを含み、それらの生成は参照文献１９に記述されている。さらに、スフィンゴモナスおよびボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）に由来するＣＤ１ｄリガンドの生成は、参照文献１８に記述されている。
【００４５】
本発明は、また、スフィンゴ糖脂質ファミリーに属さないＣＤ１ｄリガンドの使用を含む。特に、本発明は、グリセロール糖脂質であるＣＤ１ｄリガンドの使用を含む。本発明で使用されるグリセロール糖脂質は、ジアシルグリセロール、特にモノガラクトシルジアシルグリセロールを含む。本発明での使用に適したモノガラクトシルジアシルグリセロールは、参照文献２０に記述されている。
【００４６】
組成物の抗原成分
上述の長期免疫記憶を誘導するための組成物に含まれる抗原は、免疫応答の誘導での用途で周知の任意の抗原であってよい。抗原は、タンパク質抗原またはサッカライド抗原を含んでよい。
【００４７】
サッカライド抗原
抗原がサッカライド抗原の場合、抗原は、好ましくは、キャリアタンパク質に抱合される。好ましくは、サッカライド抗原は、細菌サッカライドであり、特に細菌莢膜サッカライドである。
【００４８】
本発明の組成物に含まれる細菌莢膜サッカライドの例は、髄膜炎菌（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹ）、肺炎球菌（血清型４、６Ｂ、９Ｖ，１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆ型）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、またはＶＩＩＩ型）、インフルエンザ菌（分類可能株：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、またはｆ型）、緑膿菌、黄色ブドウ球菌等由来の莢膜サッカライドを含む。本発明の組成物に含まれる他のサッカライドは、グルカン（例えば、カンジダ・アルビカンス種もの等の真菌グルカン）、および真菌莢膜サッカライド（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンスの莢膜由来）を含む。
【００４９】
髄膜炎菌血清群Ａ（ＭｅｎＡ）莢膜は、（α１→６）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェート（Ｃ３およびＣ４の位置に部分的なＯ−アセチル化を有する）のホモポリマーである。髄膜炎菌血清群Ｂ（ＭｅｎＢ）莢膜は、（α２→８）結合シアル酸ホモポリマーである。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）莢膜サッカライドは、（α２→９）結合シアル酸（７および／または８の位置に可変のＯ−アセチル化を有する）のホモポリマーである。髄膜炎菌血清群Ｗ１３５サッカライドは、シアル酸−ガラクトースジサッカライドの単位［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］から成るポリマーである。血清群Ｗ１３５サッカライドは、シアル酸の７および９の位置に可変のＯ−アセチル化を有する［２１］。髄膜炎菌血清群Ｙサッカライドは、ジサッカライド繰り返し単位が、ガラクトース［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］の代わりにグルコースを含むことを除けば、血清群Ｗ１３５サッカライドと類似している。血清群Ｙサッカライドも、シアル酸の７および９の位置に可変のＯ−アセチル化を有する。
【００５０】
インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）莢膜サッカライドは、リボース、リビトール、およびホスフェート［‘ＰＲＰ’，（ポリ−３−β−Ｄ−リボース（１，１）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート）］のポリマーである。
【００５１】
本発明の組成物は、サッカライド抗原コンジュゲートの混合物を含んでよい。好ましくは、本発明の組成物は、髄膜炎菌の複数の血清群からのサッカライド抗原を含む。例えば、組成物は、血清群Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ等に由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。好ましい組成物は、血清群ＣおよびＹに由来するサッカライドコンジュゲートを含む。他の好ましい組成物は、血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹからのサッカライドコンジュゲートを含む。
【００５２】
混合物が、血清群Ａおよび少なくとも１つの他の血清群サッカライドに由来する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）性サッカライドを含む場合、ＭｅｎＡサッカライド対任意の他の血清群サッカライドの比（ｗ／ｗ）は、１より大きくてもよい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはそれ以上）。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来のサッカライドの好ましい比（ｗ／ｗ）は以下の通りである：１：１：１：１、１：１：１：２、２：１：１：１、４：２：１：１、８：４：２：１、４：２：１：２、８：４：１：２、４：２：２：１、２：２：１：１、４：４：２：１、２：２：１：２、４：４：１：２、および２：２：２：１。
【００５３】
本発明のさらに好ましい組成物は、Ｈｉｂサッカライドコンジュゲート、および髄膜炎菌の少なくとも１つの血清群に由来する、好ましくは髄膜炎菌の複数の血清群に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。例えば、本発明の組成物は、Ｈｉｂコンジュゲートならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来するコンジュゲートを含んでよい。
【００５４】
本発明は、さらに、肺炎球菌サッカライドコンジュゲートから構成される組成物を含む。好ましくは、組成物は、肺炎球菌の複数の血清型に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。好ましい組成物は、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ（７価）に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。組成物は、さらに、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、および５（９価）に由来するサッカライドコンジュゲートを含むことも可能であり、および肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、５、３、および７Ｆ（１１価）に由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。
【００５５】
本発明のさらに好ましい組成物は、肺炎球菌サッカライドコンジュゲートおよびＨｉｂおよび／または髄膜炎菌に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。好ましくは、本発明の組成物は、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来するサッカライドコンジュゲート、ならびにＨｉｂサッカライドコンジュゲートを含む。好ましくは、本発明の組成物は、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来するサッカライドコンジュゲート、ならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。本発明による組成物は、また、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来するサッカライドコンジュゲート、Ｈｉｂサッカライドコンジュゲート、ならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。
【００５６】
個々のサッカライド抗原コンジュゲートの予防効果は、それらを組み合わせることによって除去されないことが好ましい。しかし実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）が減少する可能性はある。
【００５７】
莢膜サッカライド抗原の調製
莢膜サッカライド抗原の調製方法は、周知である。例えば、参照文献２２は、髄膜炎菌に由来するサッカライド抗原の調製を記述している。インフルエンザ菌に由来するサッカライド抗原の調製は、参照文献８６の第１４章に記述されている。肺炎球菌に由来するサッカライド抗原およびコンジュゲートの調製は、当該技術分野で記述されている。例えば、Ｐｒｅｖｅｎａｒ（プレベナー）（登録商標）は、７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンである。ストレプトコッカス・アガラクチアに由来するサッカライド抗原の調製のプロセスは、参照文献２３および２４に詳細に記述されている。
【００５８】
サッカライド抗原は、化学的に修飾される。例えば、それらの抗原は、１つまたは複数のヒドロキシル基を封鎖基と置換するように修飾される。これは、加水分解を防ぐためにアセチル基が封鎖基と置換される可能性のある髄膜炎菌性血清群Ａにとって特に有用である［２５］。そのように修飾されたサッカライドは、依然として、本発明の目的の範囲内の血清群Ａサッカライドである。
【００５９】
莢膜サッカライドは、オリゴサッカライドの形で使用される。これらは、精製された莢膜ポリサッカライドの断片化によって（例えば加水分解によって）適宜に形成される。これは、通常、所望の大きさの断片に精製することを伴う。
【００６０】
ポリサッカライドの断片化は、好ましくは、最終の平均重合度（ＤＰ）３０未満のオリゴサッカライドをもたらすように実行される。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーによって、または比色分析によって適宜に測定されることが可能である［２６］。
【００６１】
加水分解が実行される場合、加水分解物は、通常、短いオリゴサッカライドを取り除くために大きさによって分けられる［２７］。これは、限外濾過等（それに続くイオン交換クロマトグラフィー）の種々の方法で達成されることが可能である。約６以下の重合度を有するオリゴサッカライドは、好ましくは、血清群Ａのために除去され、約４未満のものは、好ましくは、血清群Ｗ１３５およびＹのために除去される。
【００６２】
キャリア
好ましくは、キャリアはタンパク質である。本発明の組成物でサッカライド抗原が結合される好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド等の細菌性毒素である。適切なキャリアタンパク質として、以下が挙げられる：ジフテリア毒素変異体のＣＲＭ１９７［２８〜３０］；ジフテリアトキソイド；髄膜炎菌外膜タンパク質［３１］；合成ペプチド［３２、３３］；熱ショックタンパク質［３４、３５］；百日咳タンパク質［３６、３７］；サイトカイン［３８］；リンホカイン［３８］；ホルモン［３８］；増殖因子［３８］；Ｎ１９タンパク質［４０］、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に由来するタンパク質Ｄ［４１、４２］、肺炎球菌表面タンパク質（ＰｓｐＡ）、ニューモリシン［４４］、鉄取り込みタンパク質［４５］、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）［４６］に由来する毒素Ａまたは毒素Ｂ、ヒト血清アルブミン（好ましくは組換え型）等の種々の病原体に由来する抗原からの複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質。
【００６３】
キャリアへのサッカライド抗原の結合は、好ましくは、−ＮＨ２基（例えば、キャリアタンパク質内のリジン残基の側鎖内、またはアルギニン残基の側鎖内の）を介する。サッカライドが遊離アルデヒド基を有する場合、これは、還元的アミノ化によってコンジュゲートを形成するために、キャリア内のアミンと反応することができる。結合は、また−ＳＨ基（例えば、システイン残基の側鎖内の）を介してよい。
【００６４】
組成物が複数のサッカライド抗原を含む場合、例えば、キャリア抑制のリスクを減少させるために、複数のキャリアを使用することが可能である。従って、様々なキャリアが様々なサッカライド抗原に対して使用される。例えば、髄膜炎菌血清群Ａサッカライドは、ＣＲＭ１９７と結合されることもあり、一方血清群Ｃサッカライドは、破傷風トキソイドと結合されることもある。特定のサッカライド抗原に対して複数のキャリアを使用することも可能である。サッカライドには、２つのグループがある。ＣＲＭ１９７と結合されるものもあれば、破傷風トキソイドと結合されるものもある。しかしながら、概してすべてのサッカライドに対して同じキャリアを使用することが好まれる。
【００６５】
単一のキャリアタンパク質は、複数のサッカライド抗原を有してよい［４７、４８］。例えば、単一のキャリアタンパク質は、様々な病原体または同じ病原体の様々な血清群に由来するサッカライドに結合する。この目的を達成するために、様々なサッカライドは結合反応の前に混合される。しかしながら、概して、結合後に混合される様々なサッカライドを有する血清群ごとに別々のコンジュゲートを有することが好まれる。別々のコンジュゲートは、同じキャリアに基づくことが可能である。
【００６６】
サッカライド：タンパク質の比率（ｗ／ｗ）を１：５（すなわち過剰タンパク質）から５：１（すなわち過剰サッカライド）の間で有するコンジュゲートが好ましい。１：１．２５〜１：２．５の間の比率が好ましいように１：２から５：１の間の比率は、好ましい。
【００６７】
コンジュゲートは、遊離キャリアと組み合わせて使用される［４９］。所定のキャリアタンパク質が、本発明の組成物に遊離形態および結合形態の両方で存在するとき、非結合形態は、全体として組成物のキャリアタンパク質の全体量の５％を超えないことが好ましく、より好ましくは、２重量％未満で存在する。
【００６８】
任意の適切な結合反応は、必要に応じ任意の適切なリンカーとともに使用される。
【００６９】
サッカライドは、通常は、結合の前に活性化されるか、または官能化される。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸［５０、５１等］）等のシアノ化試薬を含んでよい。他の適切な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する（参照文献５２の導入部も参照）。
【００７０】
リンカー基を介する結合は、任意の既知の方法（例えば参照文献５３および５４に記述される方法）を用いてなされる。結合の１つの型は、ポリサッカライドの還元的アミノ化を含み、結果として生じるアミノ基をアジピン酸リンカー基の一端と結合させ、次いで、タンパク質をアジピン酸リンカー基の他端と結合させる［５５、５６］。他のリンカーとして、以下が挙げられる：Ｂ−プロピオンアミド［５７］、ニトロフェニル−エチルアミン［５８］、ハロアシルハライド［５９］、グリコシド結合［６０］、６−アミノカプロン酸［６１］、ＡＤＨ［６２］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［６３］等。リンカーを用いる代わりに直接結合を用いることも可能である。タンパク質への直接結合は、例えば、参照文献６４および６５に記述されるように、ポリサッカライドの酸化と、それに続くそのタンパク質による還元的アミノ化を含む。
【００７１】
アミノ基のサッカライドへの導入（例えば、末端＝０基を−ＮＨ２と置換することによる）、それに続くアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化、およびキャリアタンパク質との反応を含むプロセスが、好ましい。
【００７２】
結合の後、遊離サッカライドと結合サッカライドとは分離される。この分離のために多数の適切な方法があり、その方法として疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過法、ダイアフィルトレーション（参照文献６６、６７等も参照）等が挙げられる。
【００７３】
本発明の組成物が脱重合したサッカライドを含む場合、脱重合が結合に先行することが好ましい。
【００７４】
本発明の組成物への包含に適した適切なサッカライドコンジュゲート抗原の調製は、参照文献６８に記述されている。
【００７５】
タンパク質抗原
本発明の組成物に含まれる抗原が、タンパク質抗原である場合、以下から選択される：
−参照文献６９〜７５に記述されるもののように、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来するタンパク質抗原。参照文献７３の標準命名法を用いて、ＮＭＢ２１３２、ＮＭＢ１８７０、およびＮＭＢ０９９２は、適切な抗原の基本として使用される３つの好ましいタンパク質である。
−肺炎球菌に由来するタンパク質抗原（参照文献７６に開示されるように、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０、およびＳｐ１３３に由来する）。
−Ａ型肝炎ウイルス（不活性化ウイル等）に由来する抗原［例えば、参照文献７７および７８；８６の第１５章］。
−Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）［例えば、参照文献７８、７９；８６の第１６章］。
−Ｃ型肝炎ウイルスに由来する抗原［例えば８０］。使用されるＣ型肝炎ウイルス抗原は、以下から１つまたは複数を含んでよい：ＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２タンパク質、Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体複合体、コアタンパク質と非構造タンパク質（非構造たんぱく質は、酵素活性を除去するために任意に修飾されるが、免疫原性は保持する）［例えば８１、８２、および８３］、またはこれらの抗原の断片。
−百日咳菌に由来する抗原（百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および百日咳菌に由来する線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、任意にパータクチンおよび／または凝集原２および３の組み合わせ）［例えば参照文献８４および８５；参照文献８６の第２１章］。
−ジフテリア抗原（ジフテリアトキソイド等）［例えば参照文献８６の第１３章］。
−破傷風抗原（破傷風トキソイド等）［例えば参照文献８６の第２７章］。
−淋病に由来する抗原［例えば６９、７０、７１］。
−肺炎クラミジアに由来する抗原［例えば８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３］。
−トラコ−マクラミジアに由来する抗原［例えば９４］。
−ジンジバリス菌に由来する抗原［例えば９５］。
−ポリオ抗原（単数または複数の）［例えば参照文献９６、９７；８６の第２４章］（ＩＰＶ等）。
−狂犬病抗原（単数または複数の）［例えば９８］（凍結乾燥不活性化ウイルス等）［例えば９９、ＲａｂＡｖｅｒｔ（登録商標）］。
−麻疹、流行性耳下腺炎、および／または風疹抗原［例えば参照文献８６の第１９、２０、および２６章］。
−ピロリ菌に由来する抗原（ＣａｇＡ［１００〜１０３］、ＶａｃＡ［１０４、１０５］、ＮＡＰ［１０６、１０７、１０８］、ＨｏｐＸ［例えば１０９］、ＨｏｐＹ［例えば１０９］、および／またはウレアーゼ等）。
−インフルエンザ抗原（単数または複数の）［例えば参照文献８６の第１７、１８章］（赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）。
−カタル球菌に由来する抗原［例えば１１０］。
−ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）に由来するタンパク質抗原［例えば１１１、１１２］。
−化膿性連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）に由来する抗原［例えば１１２、１１３、１１４］。
−黄色ブドウ球菌に由来する抗原［例えば１１５］。
−パラミクソウイルスに由来する抗原（単数または複数の）（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ［１１６、１１７］）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［１１８］））。
−炭疽菌に由来する抗原［例えば１１９、１２０、１２１］。
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）のウイルスに由来する抗原（黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスの４血清型、ダニ媒介性脳炎、ウエストナイルウイルス等に由来）。
−ペスチウイルス抗原（古典的ブタ熱ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、および／またはボーダー病ウイルスに由来等）。
−パルボウイルス抗原（パルボウイルスＢ１９由来等）。
−単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原。本発明での使用に好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ２型株に由来するｇＤ（「ｇＤ２」抗原）を使用することが好ましい。組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が除去された［１２２］ｇＤ（例えば、Ｃ末端にアスパラギンおよびグルタミンの付加を有する天然タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含む切断型ｇＤ）の形態を使用することが可能である。この形態のタンパク質は、切断されて成熟２８３アミノ酸タンパク質を産生するシグナルペプチドを含む。アンカーの除去は、タンパク質が可溶型に調製されることを可能にする。
−ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原。本発明での使用に好ましいＨＰＶ抗原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として周知の構造を形成するために構築することが可能なＬ１カプシドタンパク質である。ＶＬＰは、酵母細胞（出芽酵母等）で、または昆虫細胞（例えば、ヨトウガ等のスポドプテラ細胞で、またはショウジョウバエ細胞で）でＬ１の組換え発現によって産生される。酵母細胞のために、プラスミドベクターはＬ１遺伝子（単数または複数の）を有する。昆虫細胞のために、バキュロウイルスベクターはＬ１遺伝子（単数または複数の）を有する。より好ましくは、組成物は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８の両株に由来するＬ１ ＶＬＰを含む。この二価の組み合わせは、効果が高いことが示されている［１２３］。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８の株に加えて、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の株に由来するＬ１ ＶＬＰを含むことも可能である。発癌性ＨＰＶ株の使用も可能である。ワクチンは、ＨＰＶ株あたり２０〜６０μｇ／ｍｌ（例えば、約４０μｇ／ｍｌ）のＬ１を含んでよい。
【００７６】
組成物は、必要に応じて解毒される（例えば、化学的および／または遺伝学的な方法による百日咳毒素の解毒）これらの抗原から１つまたは複数を含んでよい。
【００７７】
混合物にジフテリア抗原が含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含むことが好ましい。
【００７８】
混合物中の抗原は、通常は、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分な濃度である。
【００７９】
混合物中のタンパク質抗原を使用する代わりに、抗原をコードする核酸が使用される。混合物のタンパク質成分は、従って、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えばプラスミドの形態のＤＮＡ）によって置換される。同様に、本発明の組成物は、抗原を模倣する（例えばミモトープ［１２４］または抗イディオタイプ抗体）タンパク質を含んでよい。
【００８０】
あるいは、または上記の抗原に加えて、組成物は、参照文献１２５、１２６、１２７、１２８等に開示されるような髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する外膜小胞（ＯＭＶ）調製物を含んでよい。
【００８１】
付加的な組成物
さらに本発明の目的は、Ｂ群連鎖球菌、髄膜炎菌血清型Ｂ株および／またはインフルエンザウイルスからの保護を与えるワクチン組成物を提供することである。ＣＤ１ｄリガンドが、これらの病原体に由来する抗原に対して驚くほど有効なアジュバントであることが判明している。
【００８２】
以下に記述する組成物は、Ｂ群連鎖球菌、髄膜炎菌血清型Ｂ株またはインフルエンザウイルスに由来する抗原を少なくとも１つ含む。これらの組成物は、付加的な抗原を含んでよい。例えば、これらの組成物は、長期免疫記憶の誘導で使用する組成物に包含するために上述のような１つまたは複数のキャリアに結合される１つまたは複数のサッカライド抗原も含んでよい。あるいは、または加えて、これらの組成物は、上述のタンパク質抗原から１つまたは複数のタンパク質抗原を含んでよい。
【００８３】
Ｂ群連鎖球菌
従って、本発明は以下を含む組成物を提供する：ａ）ＣＤ１ｄリガンド、およびｂ）Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原。．
組成物に包含するＢ群連鎖球菌に由来する抗原の例は、参照文献１１１および１１２に見出せる。このように、組成物は、以下から１つまたは複数を含むタンパク質を含んでよい：（ｉ）参照文献１１２の連鎖球菌アミノ酸配列（参照文献１１２の偶数の配列番号２〜１０９６０）；（ｉｉ）（ｉ）の連鎖球菌アミノ酸配列に少なくと８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｉ）の連鎖球菌アミノ酸配列からのエピトープを含むアミノ酸配列。好ましくは、組成物は、参照文献１１２に記述されるようにＧＢＳ１からＧＢＳ６８９のタンパク質から１つまたは複数を含む（参照文献内の表ＩＶを参照）。より好ましくは、組成物はＧＢＳ８０タンパク質抗原を含む。
【００８４】
髄膜炎菌
本発明は、また、以下を含む組成物を提供する：ａ）ＣＤ１ｄリガント、およびｂ）髄膜炎菌に由来する抗原。
【００８５】
組成物に含まれる髄膜炎菌に由来する抗原は、タンパク質抗原または外膜小胞（ＯＭＶ）調製物であってよい。組成物に含まれるＯＭＶ調製物の例は、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹに由来するＯＭＶ調製物を含む。組成物に含まれる髄膜炎菌に由来するタンパク質抗原の例も、上述される。好ましくは、タンパク質抗原は、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来し、患者に投与されると、髄膜炎菌血清型Ｂ細胞と交差反応する免疫応答を誘発する。髄膜炎菌血清型Ｂ細胞と交差反応する免疫応答を誘発する好ましいタンパク質抗原は、「ΔＧ２８７ｎｚ−９５３」、「９３６−７４１」、および「９６１ｃ」タンパク質抗原を含む［１２９］。好ましくは、組成物は、髄膜炎菌に由来する複数の抗原を含む。好ましくは、組成物は、「ΔＧ２８７ｎｚ−９５３」、「９３６−７４１」、および「９６１ｃ」の３つのタンパク質抗原のすべてを含む。他の有用なタンパク質抗原は、ＮＭＢ２１３２、ＮＭＢ１８７０、およびＮＭＢ０９９２に基づく。
【００８６】
インフルエンザウイルス
本発明は、また、以下を含む組成物を提供する：ａ）ＣＤ１ｄリガント、およびｂ）インフルエンザウイルス抗原。
【００８７】
インフルエンザウイルス抗原は、通常は、インフルエンザビリオンから調製されるが、別の方法として、赤血球凝集素等の抗原が組換え宿主細胞で（例えば、バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞系で）発現され、精製された形で使用される［１３０、１３１］。しかしながら、概して、抗原はビリオン由来である。
【００８８】
抗原は、生きているウイルスの形態、またはより好ましくは、不活性化ウイルスの形態をとってよい。不活性化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、全ビリオン、分割ビリオン、または精製表面抗原（赤血球凝集素を含む、および通常は、ノイラミニダーゼも含む）を含んでよい。インフルエンザ抗原は、また、ビロソームの形態で提示される［１３２］。
【００８９】
インフルエンザウイルスは、減弱されることが可能である。インフルエンザウイルスは、温度感受性にすることが可能である。インフルエンザウイルスは、低温適応にすることが可能である。これらの３つの可能性は、特に生きているウイルスに適用される。
【００９０】
ワクチンで使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節ごとに変化する。現在の大流行間期では、ワクチンは、概して２つのインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２亜型）および１つのインフルエンザＢ型株を含むワクチン、および三価ワクチンが典型的である。本発明は、また、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９型のサブタイプ株（特に、インフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプ株）等のパンデミック株（すなわち、ワクチンの受容者およびヒト母集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用される。パンデミック株に対するインフルエンザワクチンは、一価であってよく、または通常の三価ワクチンを基にしてパンデミック株を追加してもよい。しかしながら、季節およびワクチンに含まれる抗原の性質によって、本発明は、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６型から１つまたは複数に対して保護される。
【００９１】
通常、組成物に含まれることが可能な他の株は、抗ウイルス療法に耐性を示す（例えば、オセルタミビル［１３３］および／またはザナミビルに耐性を示す）株であり、耐性パンデミック株［１３４］が含まれる。
【００９２】
本発明のアジュバントされた組成物は、特に、パンデミック株に対して免疫するのに有用である。パンデミックな発生を引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下の通りである：（ａ）現在循環しているヒト株における赤血球凝集素と比較して、それは、新しい赤血球凝集素を含む（すなわち、１０年以上の間ヒト集団で明らかでなかったもの（例えばＨ２型）、または以前にはヒト集団で全く見られなかったもの（一般的に、トリ集団でのみ見つけられていた例えば、Ｈ５、Ｈ６、またはＨ９型）、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであるようなもの）；（ｂ）それは、ヒト集団で横方向に伝染することができる；（ｃ）それは、ヒトに対して病原体である。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、Ｈ５Ｎ１亜型株等のパンデミックインフルエンザに対して免疫性を与えるために好まれる。他の可能な株として、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７亜型、ならびにその他可能性のある新たなパンデミック株が挙げられる。
【００９３】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１つまたは複数（例えば１、２、３、または４以上）のインフルエンザウイルス株に由来する抗原を含んでよい。ワクチンが複数のインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、通常、別々に増殖され、ウイルスを収集して、抗原を調製してから、混合される。従って、本発明のプロセスは、複数のインフルエンザ株に由来する抗原を混合するステップを含んでよい。
【００９４】
インフルエンザウイルスは、リアソータントな株であり得、かつ逆遺伝学技法によって得られる可能性がある。逆遺伝学技法［例えば１３５〜１３９］は、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを、プラスミドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することを可能にする。通常、それは、（ａ）所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子（例えばｐｏＩＩプロモーターから）、および（ｂ）ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子（例えばｐｏＩＩＩプロモーターから）を発現させ、細胞での両型のＤＮＡの発現が、完全にインタクトな感染性ビリオンの構築につながるように関与する。好ましくは、ＤＮＡは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質のすべてをもたらすが、一部のＲＮＡおよびウイルスタンパク質をもたらすためにヘルパーウイルスを使用することも可能である。各々のウイルスＲＮＡを生成するために別々のプラスミドを使用する、プラスミドに基づく方法が好まれる［１４０〜１４２］。これらの方法は、また、ウイルスタンパク質のすべてまたは一部を（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質だけを）発現させるためにプラスミドの使用（一部の方法では使用される最大１２までのプラスミド）を含む。必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［１４３］は、同一のプラスミド上で複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のための）（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのすべてのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミドの上でＲＮＡポリメラーセＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのすべてのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）とを組み合わせる。参照文献１４３の方法の好ましい態様は、以下を含む：（ａ）単一のプラスミド上で、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ ｍＲＮＡをコードする領域；および（ｂ）単一のプラスミド上で、ｖＲＮＡをコードする８つのすべてのセグメント。単一のテンプレートからウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするためにｐｏＩＩおよびｐｏＩＩＩの二重プロモーターを使用することは可能である［１４４、１４５］。
【００９５】
従って、特にウイルスが卵で増殖されるとき、ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つまたは複数のＲＮＡセグメント（通常は、１つのワクチン株からＨＡおよびＮセグメントを有するＡ／ＰＲ／８／３４に由来する６セグメント、すなわち６：２のリアソータント）を含んでよい。ウイルスは、また、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスから、またはワクチン調製のためのリアソータントなウイルスを生成するのに有用である任意の他のウイルス株から１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでよい。主として、本発明は、ヒト間の伝染が可能である株から保護し、従ってその株のゲノムは、通常、哺乳類（例えばヒト）インフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。
【００９６】
抗原の源として使用されるウイルスは、卵または細胞培養物のいずれかの上で増殖される。インフルエンザウイルス増殖の現在の標準方法は、卵の内容物（尿膜液）から精製されるウイルスとともに有胚ニワトリ卵を使用する。しかしながら、つい最近では、速さと患者のアレルギーの理由でウイルスは動物細胞培養で増殖されており、この増殖方法が好ましい。
【００９７】
細胞基質は、通常、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、ベロ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ−３８等の哺乳類細胞系である。インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましいノ哺乳類細胞系としては、以下が挙げられる：メイディン・ダービー・イヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［１４６〜１４９］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓に由来するベロ細胞［１５０〜１５２］；またはヒト胎児網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［１５３］。これらの細胞系は、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）［１５４］、コーリエル細胞集積［１５５］、または欧州動物細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７で様々なベロ細胞を供給し、またカタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０で入手可能である。哺乳類細胞系に代わるあまり好ましくないものとして、ウイルスはトリ細胞系［例えば参照文献１５６〜１５８］で増殖されることが可能であり、アヒル（例えばアヒル網膜）またはニワトリ（例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））等に由来する細胞系が含まれる。
【００９８】
ウイルスが哺乳類細胞系で増殖された場合には、組成物は、卵タンパク質（例えば卵白アルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを有利に含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。
【００９９】
ＭＤＣＫ等の細胞系での増殖に関して、ウイルスは、懸濁液培養［１４６］または付着培養の細胞上で増殖される。懸濁液培養に適したＭＤＣＫ細胞系の１つは、ＭＤＣＫ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９として寄託された）である。別の方法として、マイクロキャリア培養が使用される。
【０１００】
ウイルスが細胞系で増殖される場合、増殖培養は、好ましくは以下を含まない（すなわち、混入に対する検査を行い、陰性を示すことになる）：単純ヘルペスウイスル、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルス。単純ヘルペスウイルスがないことは、特に好ましい。
【０１０１】
ウイルスが細胞系で増殖される場合、組成物は、好ましくは、投与量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含有する。しかし、微量の宿主細胞ＤＮＡは存在する。通常、本発明の組成物から除外することが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００塩基対より長いＤＮＡである。
【０１０２】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤にとって所定の規定要件であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために用いられるアッセイ法は、通常は，実証済みアッセイである［１５９、１６０］。実証済みアッセイのパフォーマンス特性は、数学的用語および定量化可能な用語で記述されることが可能であり、エラーのその可能性のある源は同定されることになる。アッセイは、通常、正確さ、精度、特異性等の特性に対して検査されることになる。一旦アッセイが校正されて（例えば、周知の宿主細胞ＤＮＡの標準量に対して）検査されると、定量的なＤＮＡ測定は日常的に実行されることが可能になる。ＤＮＡ定量化の３つの原則技術は、ササンブロット（またはスロットブロット）［１６１］等のハイブリダイゼーション法；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システム［１６２］等のイムノアッセイ法；および定量ＰＣＲ法［１６３］が使用されることが可能である。これらの方法は、すべて当業者によく知られているが、各方法の詳細な特性は、問題（例えば、ハイブリダイゼーション用プローブの選択、増幅用プライマーおよび／またはプローブの選択等）の宿主細胞に依存することである。モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡ用定量アッセイであり、生物医薬品で混入しているＤＮＡのレベルのモニタリングで使用されている［１６２］。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の反応複合体の非配列特異的形成に関与する。アッセイのすべての成分は、製造業者から入手可能な完全な全ＤＮＡアッセイキットに含まれる。様々な商業製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出する定量ＰＣＲアッセイを提供している（例えば、ラボラトリーサービシス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）のＡｐｐＴｅｃ（登録商標）、アルセアテクノロジーズ（Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（登録商標）、等）。ヒトウイルス性ワクチンの宿主細胞ＤＮＡ混入を測定するための化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システムとの比較は、参照文献１６４に見出すことができる。
【０１０３】
混入しているＤＮＡは、ワクチン調製の間に標準精製方法（例えばクロマトグラフィー等）を用いて除去される。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えばデオキシリボヌクレアーゼを用いて）増進させることが可能である。宿主細胞ＤＮＡ混入を減少させる簡便な方法は、参照文献１６５および１６６に開示されている。その方法は、まず、デオキシリボヌクレアーゼ（例えばベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を用いて、次いでカチオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）を用いる、２段階処理を含む。
【０１０４】
１５μｇ赤血球凝集素あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンは好ましく、同様に０．２５ｍｌ容量あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンが好ましい。５０μｇ赤血球凝集素あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンは、より好ましく、同様に０．５ｍｌ容量あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンが好ましい。
【０１０５】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、無血清培地および／または無タンパク質培地で増殖される。培地は、本発明と関連して無血清培地（ヒトまたは動物に由来する血清からの添加物が含まれない）と呼ばれる。無タンパク質は、細胞の増殖が生じる培養（タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を除くが、ウイルスの増殖にとって必要であるトリプシンまたは他のタンパク質分解酵素等のタンパク質は任意に含まれる）を意味すると理解される。そのような培養物中で増殖する細胞は、自然にタンパク質をそれ自体に含む。
【０１０６】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、３７℃以下［１６７］（例えば３０〜３６℃）で増殖される。
【０１０７】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活性化インフルエンザワクチンの主要な免疫原であり、ワクチンの投与量は、通常は一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるように、ＨＡ濃度を参照して標準化される。ワクチンは、一般的に、株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、低用量ワクチンも、例えば小児用として、または大流行の場合に使用される。１／２（例えば株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４、および１／６等の分割量は、高用量（例えば３倍または９倍用量［１７０、１７１］）と同じように、使用されている［１６８、１６９］。従って、ワクチンは、インフルエンザ株あたり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは、０．１〜５０μｇ（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等）のＨＡを含んでよい。特定用量は、例えば、株あたり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５μｇ等を含む。従って、ワクチンは、インフルエンザ株あたり０．１〜２０μｇのＨＡ、好ましくは、０．１〜１５μｇ（例えば、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等）のＨＡを含んでよい。特定用量は、例えば、株あたり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９μｇ等を含む。これらの低用量は、ワクチンにアジュバントが存在するとき、本発明と同様に最も有用である。
【０１０８】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスに見つけられるような自然のＨＡであり得、または修飾されたものでもよい。例えば、ウイルスを鳥類で発病させることが高い決定因子（例えば超塩基性領域）を除去するためにＨＡを修飾することが周知であるが、これらの決定因子が、さもなければウイルスが卵内で増殖されるのを阻止することができるからである。
【０１０９】
不活性化されているが非全細胞のワクチン（例えば、分割ウイルスワクチン、または精製表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置している付加的なＴ細胞エピトープから利益を得るために、基質タンパク質を含んでよい。従って、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、分割ワクチン）は、さらに、Ｍ１および／またはＭ２基質タンパク質を含んでよい。基質タンパク質が存在する場合、Ｍ２基質タンパク質の検出可能な濃度を含むことは、好ましい。核タンパク質もまた、存在する。
【０１１０】
医薬組成物の製剤
上述の抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、特に、免疫原性組成物およびワクチンに含まれることに適している。本発明のプロセスは、従って、免疫原性組成物またはワクチンとして抗原およびＣＤ１ｄリガンドを製剤化するステップを含んでよい。本発明は、このような方法で得られることが可能な組成物またはワクチンを提供する。
【０１１１】
抗原（単数または複数の）およびＣＤ１ｄリガンドに加えて、本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、通常は、それ自体はその組成物を受ける個体にとって有害な抗体の生成を誘発しない任意のキャリアを含む「薬学的に許容されるキャリア」を含む。適切なキャリアは、通常は、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、トレハロース［１７２］、脂質集合体（油滴またはリポソーム等）、および不活性ウイルス粒子等の大きくて、ゆっくりと代謝される高分子である。そのようなキャリアは、当業者にとって周知である。ワクチンは、また、水、生理食塩水、グリセリン等の希釈液を含有する。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の補助剤が存在する。薬学的に許容される賦形剤についての徹底的な考察は、参照文献１７３で入手可能である。
【０１１２】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効量の抗原ならびに必要に応じて上記任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効量」は、単回投与で、または一連の投与の一部としてのいずれかで個体に投与されるその量が治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康および身体状態、年齢、治療される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、治療医の医学的状況の評価、および他の関連する様々な因子によって変動する。その量は、通例の治験を通して決定され得る比較的広範囲に収まると予想される。
【０１１３】
ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与される。ＣＤ１ｄリガンドは、本発明の免疫原性組成物の範囲内のアジュバントとして作用する。ワクチンは、付加的なアジュバントを含んでよい。そのようなアジュバントとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
本発明で使用されるアジュバントとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
・カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）を含むミネラル含有組成物。カルシウム塩は、カルシウムホスフェート（例えば、参照文献１７４に開示される「ＣＡＰ」粒子等）を含む。アルミニウム塩は、任意の適切な形態（例えばゲル形態、結晶形態、非晶形等）をとる塩を有する水酸化物、ホフォスフェート、硫酸塩を含む。これら塩への吸着は、好まれる。ミネラルを含む組成物は、また、金属塩［１７５］の粒子として製剤化される。アルミニウム塩アジュバントは、以下にさらに詳細に記述される。
・以下にさらに詳細に記述されるように水中油型乳剤。
・ＣｐＧモチーフ（グアノシンに結合したホスフェートによって結合される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むもの、ＴｐＧモチーフ［１７６］、二本鎖ＲＮＡ、パリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド等の免疫賦活性オリゴヌクレオチド。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾等のヌクレオチド修飾／類似体を含むことが可能であり、かつ二本鎖または（ＲＮＡを除いて）一本鎖であってよい。参照文献１７７〜１７９は可能な類似体置換（例えば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンの置換）を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに、参照文献１８０〜１８５に述べられている。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ［１８６］）に向けられる。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）等のＴｈ１免疫応答の誘発に特異的であってよく、または前述の配列は、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ等のＢ細胞応答の誘導により特異的であってよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参照文献１８７〜１８９で考察されている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用できるように構築される。任意に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー」を形成するためにそれらの３’末端で結合されてよい。例えば、参照文献１９０〜１９２を参照。有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ７９０９であり、ＰｒｏＭｕｎｅ（登録商標）（コーリー・ファマシューティカル・グループ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｏｕｐ Ｉｎｃ．））としても周知である。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも２０のヌクレオチドを含む。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１００未満のヌクレオチドを含む。
・３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄＭＰＬ」、「ＭＰＬ（登録商標）」としても周知である）［１９３〜１９６］。３ｄＭＰＬは、サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のヘプトースがない変異体から調製されたもので、化学的に脂質Ａに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠く。３ｄＭＰＬの調製は、最初に参照文献１９７に記述された。３ｄＭＰＬは、関連した分子の混合物の形をとることが可能であり、それらのアシル化によって変わる（例えば、異なる長さになるであろう３、４、５、または６つのアシル鎖を有する）。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても周知である）モノサッカライドは、それらの２位置の炭素で（すなわち２と２’の位置で）Ｎ−アシル化され、かつ３’の位置にもＯ−アシル化がある。
・イミキモド（「Ｒ−８３７」）［１９８、１９９］等のイミダゾキノリン化合物、レシキモド（「Ｒ−８４８」）［２００］、およびそれらの類似体；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫賦活性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参照文献２０１〜２０５に見出される。
・参照文献２０６に開示されるようなチオセミカルバゾン化合物。活性化合物の製剤化、製造、およびスクリーニングの方法も、参照文献２０６に記述されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球細胞の刺激に特に有効である。
・参照文献２０７に開示されるもの等のトリプタントリン化合物。活性化合物の製剤化、製造、およびスクリーニングの方法も、参照文献２０７に記述されている。トリプタントリンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球細胞の刺激に特に有効である。
・ヌクレオシド類似体、例えば（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１１４】
【化３】
、およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参照文献２０８〜２１０に開示される化合物；（ｆ）以下の式を有する化合物：
【０１１５】
【化４】
（式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ３は、欠けている、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルである；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであるか、またはＲ４−５にあるように、結合されて５員環を形成する；
【０１１６】
【化５】
結合で達成される結合は、
【０１１７】
【化６】
で示される。
Ｘ１およびＸ２は、各々独立してに、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳである；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄである；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、またはＲ９ａである；
ここでＲ９ａは、
【化７】
【０１１８】
結合で達成される結合は、
【化８】
【０１１９】
で示される。
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立してに、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨである；
ＲａおよびＲｂは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールである；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、または置換，Ｃ１−６アルキルである；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリール、またはヘテロシクリルである；
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルである；
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、または置換，Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートである；
各ｎは、独立して０、１、２、または３である；
各ｐは、独立して０、１、または２である；
または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）の任意の互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に許容される塩。
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［２１１］。
・参照文献２１２に開示されている以下を含む化合物：
アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［２１３、２１４］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物、ピロール化合物［２１５］、アントラキノン化合物、キノサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン化合物、およびベンザゾール化合物［２１６］。
・参照文献２１７に開示されている以下を含む化合物：３，４−ジ（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、スタウロスポリン類似体、誘導体化ピリダジン、クロメン−４−オン、インドリノン、キナゾリン、およびヌクレオシド類似体。
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えばＲＣ−５２９［２１８、２１９］。
・例えば、参照文献２２０および２２１に記述されるようにホスファゼン（例えば、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」））。
・以下のような小分子免疫賦活剤（ＳＭＩＰ）：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリンキノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−２−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−｛［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ｝エタノール
２−｛［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ｝エチルアセテート
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・サポニン［参照文献２４９の第２２章］。広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、および花にも見つかるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種基である。バラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンは、また、スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブライダルベール）、およびサボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（ソープルート）．に由来し商業的に入手可能である。サポニンアジュバント製剤は、精製製剤（ＱＳ２１等）ならびに脂質製剤（ＩＳＣＯＭ等）を含む。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）として市販されている。サポニン組成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されている。これらの技術を用いる特定の精製画分は同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参照文献２２２に開示されている。サポニン製剤は、またステロール（例えばコレステロール［２２３］）を含みんでよい。サポニンとコレステロールとの組み合わせは、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭ）［参照文献２４９の第２３章］と呼ばれる独特の粒子を形成するために使用される。ＩＳＣＯＭは、通常、リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）も含む。周知のどんなサポニンでも、ＩＳＣＯＭで使用される。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉ１Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣから１つまたは複数を含む。ＩＳＣＯＭは、さらに、参照文献２２３〜２２５に記述されている。任意に、ＩＳＣＯＭは、付加的な界面活性剤［２２６］がないこともある。サポニンに基づくアジュバントの開発の総説は、参照文献２２７および２２８に見出される。
・細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）、およびその解毒化誘導体（例えばＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２［２２９］として周知の変異毒素）。解毒化ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参照文献２３０に記述されており、非経口アジュバントとしての使用は、参照文献２３１に記述されている。
・生体接着剤および粘膜付着接着剤（エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［２３２］またはキトサンおよびその誘導体［２３３］）。
・微小粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの粒径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒径）で、生分解性および非毒性の物質から（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等）好ましくはポリ（ラクチド−コグリコリド）によって形成され、任意に、マイナスに帯電した表面を有するように（例えばＳＤＳによって）、またはプラスに帯電した表面を有するように（例えば、ＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤によって）処理されている。
・リポソーム（参照文献２４９の第１３および１４章）。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参照文献２３４〜２３６に記述されている。
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［２３７］。そのような製剤は、さらに、オクトキシノール［２３８］と組み合わせてポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、ならびに少なくとも１つの付加的な非イオン界面活性剤（例えばオクトキシノール［２３９］）と組み合わせてポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤を含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
・ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン−Ｌ−アラニル−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、もしくは「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（登録商標）」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
・第１のグラム陰性菌から調製される外膜タンパク質プロテオソームと、第２のグラム陰性菌に由来するリポサッカライド（ＬＰＳ）調製との組み合わせで、外膜タンパク質プロテオソームおよびＬＰＳ調製が、安定な非共有結合アジュバント複合体を形成する。そのような複合体は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）外膜およびＬＰＳから構成される複合体、「ＩＶＸ−９０８」を含む。
・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」［２４０］）。
・以下のような式を有するポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［２４１］。
【０１２０】
【化９】
ここでＲは、水素基、直線鎖もしく分枝、非置換もしくは置換、飽和もしくは不飽和のアシル基、アルキル（例えばシクロアルキル）基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む群から選択される。
例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリン等。
・γイヌリン［２４２］またはその誘導体（例えばアルガムリン）。
・式Ｉ、ＩＩ、もしくはＩＩＩ、またはその塩：
【化１０】
【０１２１】
参照文献２４３に定義されるように、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」、または「ＥＲ８０４０５７」等：
【化１１】
【０１２２】
・ＯＭ−１７４等の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する脂質Ａの誘導体［参照文献２４４および２４５に記述されている］。
・陽イオン性脂質および（通常、中性の）コリピド（アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパンアミニウムブロマイド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパンアミニウムブロマイド−ジオレオイルホスファチジル−エタノ−ルアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）の製剤。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（シン−９−テトラデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩を含有する製剤が好ましい［２４６］。
・非環式バックボーンを含むホスフェートに結合した脂質を含む化合物（例えばＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［２４７、２４８］）：：
【０１２３】
【化１２】
これらおよび他のアジュバント活性物質は、参照文献２４９および２５０により詳細に考察されている。
【０１２４】
医療方法および用途
一旦製剤化されると、本発明の組成物は、被験者に直接投与される。治療される被験者は、動物であり得、特にヒト被験者が治療される。ワクチンは、特に、小児およびティーンエイジャーに予防接種をするのに有用である。ワクチンは、ＭＨＣＩＩ−／−動物モデルにおいて有効であることが示されており、従って、ワクチンは免疫無防備状態の被験者を治療するのに有用であると考えられる。ワクチンは、全身経路および／または粘膜経路で送達される。
【０１２５】
通常は、免疫原性組成物は、溶液または懸濁液のいずれかで注射液として調製され、注入の前に、溶液にもしくは懸濁液に適した固形、液体媒体も調製される。調製は、また、アジュバントの効果を増強するために乳化される、またはリポソームにカプセル化される。組成物の直接送達は、通常、非経口である（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかに注射で、または組織の間質腔に送達される）。組成物は、病巣に投与されることも可能である。他の投与様式は、経口投与と肺内投与、座薬、および経皮投与または経皮的投与［例えば参照文献２５１を参照］、注射針、および皮下噴射器を含む。投与治療は、単回投与スケジュール、または複数回投与スケジュール（例えば追加免疫投与を含む）であってよい。
【０１２６】
本発明のワクチンは、好ましくは、無菌である。ワクチンは、好ましくは、発熱物質を含まない。ワクチンは、好ましくは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８の間で、通常、約ｐＨ７で緩衝される。
【０１２７】
本発明のワクチンは、低濃度（例えば＜０．００１％）で界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ）を含んでよい。本発明のワクチンは、特に、凍結乾燥させる場合には、糖アルコール（例えばマンニトール）またはトレハロースを、例えば約１５ｍｇ／ｍｌで含んでよい。
【０１２８】
個々の抗体の適量は、経験的に評価されることが可能である。しかしながら、一般に、本発明の抗原は、投与あたり各抗原を０．１〜１００μｇの用量を０．５ｍｌの典型的な投薬容量で投与される。用量は、通常、投与あたり各抗原５〜２０μｇである。
【０１２９】
免疫応答を誘発するために患者に投与されるＣＤ１ｄリガンドの量は、その組成物が投与される患者の年齢および体重に応じて変化するが、通常は、１〜１００μｇ／ｋｇ患者体重で含まれる。意外にも、低用量のＣＤ１ｄリガンドが、同時投与される抗原に対する免疫応答を増強させ、かつその抗原に対する長期免疫記憶を促進するのに十分であることが判明した。本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドの量は、従って、患者体重の５０μｇ／ｋｇ未満、２０μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満であってよい。
【０１３０】
本発明によるワクチンは、予防用（すなわち感染を阻止するため）または治療用（すなわち感染後、疾患を治療するため）のいずれかであってよいが、通常は、予防用である。
【０１３１】
本発明は、医学分野で使用するためにＣＤ１ｄリガンド、およびＢ群連鎖球菌に由来する抗原を提供する。本発明は、医学分野で使用するためにＣＤ１ｄリガンド、および髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原を提供する。本発明は、医学分野で使用するために、ＣＤ１ｄリガンド、およびパンデミックな発生を引き起こすことができるまたは可能性を有するインフルエンザ株から選択されたインフルエンザウイルスに由来する抗原を提供する。
【０１３２】
本発明は、また、本発明によるワクチンを患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。特に、本発明は、ＣＤ１ｄリガンド、およびＢ群連鎖球菌に由来する抗原を患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。本発明は、ＣＤ１ｄリガンド、および髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原を患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。本発明は、ＣＤ１ｄリガンド、およびパンデミックな発生を引き起こすことができるまたは可能性を有するインフルエンザ株から選択されたインフルエンザウイルスに由来する抗原を患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。
【０１３３】
抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、同時に、連続して、または別々に投与される。例えば、そのコンジュゲートに対する哺乳類の免疫応答を高めるために、抗原投与の前、または抗原投与の後に、ＣＤ１ｄリガンドが哺乳類を予備刺激するために投与されることも可能である。複数の抗原が投与される場合、抗原は、抗原混合物と別々に、同時に、または連続して投与されるＣＤ１ｄリガンドとともに同時に投与される。免疫応答を引き起こす方法は、抗原およびＣＤ１ｄリガンドの第１の用量を投与すること、それに続いて、任意に非アジュバント化抗原の第２の用量を投与することを含む。抗原およびＣＤ１ｄリガンドの第１の用量は、同時に、連続して、または別々に投与される。
【０１３４】
免疫応答は、好ましくは、防御応答であり、かつ液性免疫応答および／または細胞免疫応答を含んでよい。患者は、成人または小児であってよい。患者は、０〜６カ月、６〜１２カ月、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または５５歳を超える年齢であってよい。好ましくは、患者は小児である。
【０１３５】
患者は、免疫無防備状態であってよい。患者は、免疫系の機能不全に関連した障害、特に、ＣＤ４Ｔ細胞応答の機能不全に関連した障害を有することもある。そのような障害の例として以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＡＩＤＳ、血管拡張性失調症、ディジョージ症候群、汎低γグロブリン血症、ウィスコットアルドリッヒ症候群、および補体欠損症。
【０１３６】
本発明は、患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原の使用を提供し、この薬物は、ＣＤ１ｄリガンドとともに投与される。本発明は、患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供し、この薬物は、Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原とともに投与される。本発明は、患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原およびＣＤ１ｄリガントの使用を提供する。本発明は、また、ＣＤ１ｄリガントで事前処置された患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原の使用を提供する。本発明は、Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原で事前処置された患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。発明は、Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原およびＣＤ１ｄリガンドで事前処置された患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原の使用を提供する。
【０１３７】
本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造で髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原の使用を提供し、この薬物はＣＤ１ｄリガンドとともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供し、この薬物は髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原とともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、ＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造で髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原の使用を提供する。本発明は、さらに、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原で事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造で髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原の使用を提供する。
【０１３８】
本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原の使用を提供し、この薬物はＣＤ１ｄリガンドとともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供し、この薬物は、インフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原とともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、ＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原の使用を提供する。本発明は、さらに、インフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原で事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造にＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、インフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造にインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原の使用を提供する。
【０１３９】
薬物は、好ましくは、免疫原性組成物（例えばワクチン）である。薬物は、好ましくは、Ｂ群連鎖球菌、髄膜炎菌（例えば、髄膜炎、敗血症）に、またはインフルエンザウイルスに起因する疾患の予防用および／または治療用である。
【０１４０】
ワクチンは、標準動物モデル（例えば、参照文献２５２を参照）で検査される。
【０１４１】
本発明は、さらに、Ｂ群連鎖球菌抗原およびＣＤ１ｄリガンドを含むキットを提供する。本発明は、さらに、髄膜炎菌血清型Ｂ株およびＣＤ１ｄリガンドを含むキットを提供する。本発明は、さらに、インフルエンザウイルスに由来する抗原およびＣＤ１ｄリガンドを含むキットを提供する。抗原およびリガンドは、好ましくは、別々の投与に適するように（例えば、別々の四肢に）、別々の構成成分からなるキットとして供給される。
【０１４２】
定義
用語「構成される」は、「含む」ならびに「成る」を包含する（例えば、Ｘで「構成される」組成物は、全くＸだけから成る、または例えばＸプラスＹ等の付加的なものを含んでよい）。
【０１４３】
数値「ｘ」に関して用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。
【０１４４】
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない（例えば、「実質的に」Ｙを含まない組成物は、Ｙを完全に含まないこともある）。必要に応じて、語「実質的に」は、本発明の定義から取り除かれることも可能である。
【０１４５】
本発明を実施するための様式
本発明を実施するための様式に関する付加的情報は、参照文献２５３に見出される。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１） インバリアントＮＫＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで防御抗体応答を助け、Ｂ細胞記憶の維持に寄与する
概要
ＣＤ１ｄ制限インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、生得的リンパ球であり、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）等の糖脂質抗原を認識する。ｉｎ ｖｉｖｏで適応免疫応答への自然免疫系の影響を研究するために、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞が抗体応答の重要な特徴（例えば、感染症からの保護およびＢ細胞記憶）に影響をおよぼすかどうかを評価した。α−ＧＣと組み合わせた細菌タンパク質またはウイルスタンパク質でマウスを免疫し、タンパク質およびα−ＧＣで免疫されたマウスが、タンパク質単独によって誘発される力価よりも１〜２ログ高い抗体価をもたらすことを発見した。最も重要なことは、それらのマウスは、インフルエンザ等の感染症からさらに保護されることである。ＭＨＣクラスＩＩが欠如しているマウスは、タンパク質および従来のアジュバントで免疫されるとき、抗体を産生しない。しかし、タンパク質およびα−ＧＣによるこれらのマウスの免疫化は、そのタンパク質に特異的な検出可能なＩｇＧを誘発し、ｉＮＫＴ細胞がＢ細胞に対するその助けをクラスＩＩ制限ＣＤ４＋ Ｔ細胞に部分的に置き換えることを示した。最終的に、タンパク質およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、タンパク質特異的記憶Ｂ細胞の頻度（タンパク質単独で免疫されたマウスで観察される頻度よりも高い）を有することが分った。さらに、ｉＮＫＴ細胞が欠如しているマウスは、野性型マウスで観察される減衰よりも急速な循環抗体価の減衰を示し、形質細胞の寿命の対するｉＮＫＴ細胞の予想外の影響を示唆した。つまるところ、これらの結果は、抗体応答の調節におけるｉＮＫＴ細胞の重要な役割およびｉｎ ｖｉｖｏでＢ細胞記憶の維持を指し示している。
【０１４７】
結果
ｉＮＫＴ細胞の活性化は、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質抗原に対する抗体応答を増強する
ヒトｉＮＫＴ細胞が、Ｂリンパ球の増殖およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫グロブリンの生成に役立つことを本発明者らは、最近、実証した。この結果のｉｎ ｖｉｖｏでの関連性を決定するために、ＮＫＴ特異的糖脂質（α−ＧＣ）を用いて、または用いずに、細菌タンパク質（ＴＴ（破傷風トキソイド）もしくはＤＴ（ジフテリアトキソイド））またはウイルスタンパク質（Ｈ３Ｎ２（インフルエンザＡ型株由来の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼサブユニット））でＣ５７／ＢＬ６マウスを免疫し、種々の時点におけるタンパク質特異的抗体の血清力価を評価した。図１Ａは、抗原のすべてで、タンパク質およびα−ＧＣで免疫されたマウス（黒四角）の抗体価が、タンパク質単独で免疫されたマウス（白四角）の抗体価よりも１〜２ログ高かったことを示す。同様の結果がＢＡＬＢ／ｃ、ＣＤｌ、およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスでも得られた（データ図示せず）。
【０１４８】
α−ＧＣのアジュバント活性がｉＮＫＴ細胞の活性化によるものであることを証明するために、（Ｊａ１８＋／＋およびＪａ１８＋／−）を有するマウスまたは（Ｊａ１８−／−）ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスを、α−ＧＣを用いて、または用いずにインフルエンザタンパク質Ｈ３Ｎ２で免疫した。図１Ｂに示すように、Ｈ３Ｎ２単独で免疫されたすべてのマウス（白四角）は、ｉＮＫＴ細胞の存在にかかわらず、同程度の抗体応答をもたらした。しかしながら、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで（黒四角）免疫化を行うと、ｉＮＫＴ細胞を有するマウスはＨ３Ｎ２特異的抗体の血清力価に有意な増強を示し、一方ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスは、そのように増強できないことを図１Ｂは示している。これらの結果は、α−ＧＣがＣＤ１ｄ（ＣＤ１−／−）が欠如したマウスにおいてアジュバント活性を示さなかった結果（データは図示せず）、α−ＧＣをｉＮＫＴ細胞のＴ細胞受容体に提示する制限要素によって強化された。
【０１４９】
α−ＧＣの活性と、従来のアジュバントの活性とを比較するために、α−ＧＣまたは以下のアジュバントから１つの適量を用いて、ＴＴ単独で用量を増加させながら、マウスを免疫した：ＣＦＡ（マウスで用いられる最も強力なアジュバントの１つ［２５４］）、ＣｐＧ（現在、ヒトで検査されている強力なＴｈ０／Ｔｈ１免疫賦活剤［２５５］）、ＭＦ５９とアルミニウム塩（この２つのアジュバントはヒト用途として承認されていて［２５６、２５７］、両方ともＴｈ０／Ｔｈ２誘導因子と考えられる）。図２Ａに示すように、α−ＧＣは、全般的に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両抗体の産生に役立つ上記の基準アジュバントと同様に強力である。
【０１５０】
最終的に、タンパク質抗原に対する抗体応答が、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞の助けがなくとも（従来のアジュバントが役立たない状況）ｉＮＫＴリンパ球の助けで発生するかどうかを評価した。従って、ＭＨＣクラスＩＩ分子が欠如した（ＭＨＣ−ＩＩ−／−）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両群にＨ３Ｎ２単独で、またはα−ＧＣもしくはアルミニウム塩とともにＨ３Ｎ２で２回免疫させた。予想通りに、Ｈ３Ｎ２単独またはアルミニウム塩中のＨ３Ｎ２で免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは、抗原特異的抗体を何ら示さなかった（図２Ｂ）。代わりに、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは、検出可能な抗体（ＩｇＧ）価を示した。
【０１５１】
つまるところ、α−ＧＣによるｉｎ ｖｉｖｏでのｉＮＫＴ細胞活性化は、従来のアジュバントのそれに匹敵する方法でタンパク質抗原に対する抗体応答を増強することをこれらの結果は示している。これらのアジュバントとは違って、α−ＧＣは、抗体応答を生成するために、ＭＨＣ−クラスＩＩ制限ＣＤ４Ｔリンパ球を必要としない。
【０１５２】
ｉＮＫＴ細胞は、免疫に役立つ
α−ＧＣが病原体タンパク質に対する抗体応答を増強することを実証して、本発明者らは応答の質に取り組み、これらの抗体が感染症から保護することができるかどうかを追究した。この目的を達成するために、α−ＧＣのアジュバント効果とＭＦ５９（インフルエンザワクチンによるヒト用途として承認されているアジュバント）のそれとをインフルエンザウイルス感染症のマウスモデルで比較した。０日目と１５日目に、α−ＧＣまたはＭＦ５９を用いてＨ１Ｎ１タンパク質（ヒトインフルエンザウイルスＡ型／ニューカレドニア／２０／９９由来の）単独で、成体Ｃ５７ＢＬ／９マウスを免疫した。最後の免疫化から２週間後、マウス適応型Ａ／ＷＳ／３３インフルエンザウイルスを９０％致死量（ＬＤ）でマウスに接種した。マウスの生存を２週間経過観察した。図３Ａに示すように、接種の１日前、Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスが有する抗体価は、Ｈ１Ｎ１およびＭＦ５９で免疫されたマウスの抗体価に匹敵し、かつタンパク質ワクチン単独で免疫されたマウスで見られた力価よりも有意に高いものである。さらに、接種から２週間後、Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスの８０％、およびタンパク質およびＭＦ５９で免疫されたマウスの１００％が生存し、一方タンパク質単独に基づいたワクチンで免疫されたマウスのわずか１０％が経過観察の終了後も生存していたことを図３Ｂは示している。
【０１５３】
つまるところ、これらの結果から、本発明者らは、α−ＧＣ依存ｉＮＫＴ細胞活性化が感染症疾患に対するワクチンの効果を増強することが可能であると結論づける。
【０１５４】
Ｂ細胞に役立つｉＮＫＴ細胞の機序
次に、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞をｉｎ ｖｉｖｏでＢ細胞を助けるように向かわせる機序を調べた。
【０１５５】
まず、サイトカインの役割を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびサイトカインＩＬ−４またはＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γＲ）の受容体が欠如したコンジェニックマウスの両方でα−ＧＣのアジュバント効果を評価した。図４Ａ（左図）が示すように、野性型マウスにおいてインフルエンザタンパク質Ｈ３Ｎ２単独（白で示す）による免疫化が、ＩｇＧ１の存在およびＩｇＧ２ａの非存在によって示されるようにＴｈ２応答を誘発し、一方タンパク質およびα−ＧＣによる免疫化が、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（黒で示す）の両方の存在によって示されるようにバランスのとれたＴｈ０応答を誘発した。図４Ａの中央の図が示すように、ＩＬ−４が欠如したマウスは、タンパク質単独で免疫されたとき、何ら抗体応答がなかったのに対して、タンパク質およびα−ＧＣ（黒で示す）で免疫されたとき、それらのマウスはバランスのとれたＴｈ０応答を開始した。最後に、ＩＦＮ−γ受容体が欠如したマウス（図４Ａの右図）は、タンパク質単独（白で示す）で免疫されたとき、Ｔｈ２応答（ＩｇＧ１抗体）を示す。ＩｇＧ１力価は、タンパク質およびα−ＧＣ（黒で示す）で免疫されたマウスで有意に増加するが、ＩｇＧ２抗体はバックグラウンド濃度を上回る増加はない。つまるところ、ＩＬ−４はＢリンパ球を助けるためにα−ＧＣ依存ｉＮＫＴ細胞にとって個々に必要でないが、一方でＩＦＮ−γはｉＮＫＴ細胞のバランスのとれた（Ｔｈ０）ヘルパー効果にとって絶対必要であることをこれらの結果が示している。
【０１５６】
次いで、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用が、α−ＧＣ依存ｉＮＫＴ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで助けるために必要とされるどうかを追究した。従って、本発明者らは、中和抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体の飽和量で処置したマウスでＨ３Ｎ２に対する抗体応答を評価した。図４Ｂに示すように、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣによる免疫化に続いて、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体で処置したマウスは、対照ＩｇＧで処置したマウスで観察された抗体価よりも有意に低いＨ３Ｎ２抗体価を示した。
【０１５７】
α−ＧＣは、想起抗体応答を増強し、Ｂ細胞記憶の維持に寄与する
適応免疫系の重要な特徴は、それが以前に遭遇した抗原に対して迅速な「想起」応答を開始する能力である。α−ＧＣのアジュバント効果が想起抗体応答に影響を及ぼしたかどうかを評価するために、マウスを、０週目と２週目にＨ３Ｎ２単独でまたはα−ＧＣで２回免疫した。次いで、Ｈ３Ｎ２単独での第３の（想起）免疫化を、３０週目にすべてのマウスに施した。図１で報告したデータと一致して、最初の２回の投与後、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫されたマウスが、Ｈ３Ｎ２単独を受けるマウスからの力価よりも有意に高い抗体価を示したことを図５Ａは示している。マウスのすべてをＨ３Ｎ２単独による第３の免疫化によって追加免疫したとき、Ｈ３Ｎ２特異的抗体は、約３０週目に両群でバックグラウンド濃度に達し、ゆっくり時間をかけて減衰した。２週間後、抗体応答を評価し、最初の２回の免疫化でタンパク質およびα−ＧＣを施されたマウスは第３の免疫化後に、３回の免疫化のすべてでタンパク質単独で免疫されたマウスの抗体価より有意に高い抗体価を示したことが分った（図５Ａ）。これらの結果と一致して、同時実験で、３０週目（第３の免疫化の直前）に、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで２回免疫されたマウスの脾臓で検出されたＨ３Ｎ２抗体分泌細胞（ＡＳＣ）前駆体の頻度は、Ｈ３Ｎ２単独で２回免疫されたマウスの脾臓で観察された頻度よりも有意に高いことが分った（図５Ｂ）。
【０１５８】
Ｂ細胞記憶の調節におけるｉＮＫＴ細胞の役割をさらに調べるために、（Ｊａ１８＋／＋およびＪａ１８＋／−）を有するまたは（Ｊａ１８−／−）ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスの血清でタンパク質（Ｈ３Ｎ２）単独により誘発された抗原特異的抗体の持続を評価した。マウスのすべての群で、抗原特異的抗体の力価は、第２の免疫化から２週間後、同程度のレベルでピークに達した。しかし、図６が示すように、ｉＮＫＴ細胞抗原特異的抗体を有するマウスは、同様にゆっくりとした速度で減衰したが、ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスでの抗体価減衰は、著しく急速であった。これらのマウスのうちα−ＧＣを受けたものはないので、ｉＮＫＴ「自発」活性のあるレベルは、循環抗体の半減期に影響をおよぼすことが可能であると本発明者らは、結論づける。
【０１５９】
つまるところ、ｉＮＫＴ細胞活性化は、想起免疫化に対して高い抗体応答を生じ、これは抗原特異的記憶Ｂ細胞プールのさらなる拡大に起因することをこれらの結果が示している。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでのｉＮＫＴ自発活性は、循環抗体濃度の維持において恒常的に関与するように見える。
【０１６０】
（実施例２） 追加免疫の非存在下でα−ＧａｌＣｅｒによるプライミングは、抗体応答を増強させる
上述のように、３０週目（第３の免疫化の直前）に、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで２回免疫されたマウスの脾臓で検出したＨ３Ｎ２抗体分泌細胞（ＡＳＣ）前駆体（すなわち記憶Ｂ細胞）の頻度は、Ｈ３Ｎ２単独で２回免疫されたマウスの脾臓で観察した頻度よりも有意に高かった（図５Ｂ）。
【０１６１】
同様の結果を、破傷風トキソイド（図７および１８）で免疫されたマウスで行った実験で得た。図７は、０日目および１４日目に、アジュバントなし、α−ＧＣアジュバント、またはアルミニウム塩アジュバントを用いる破傷風トキソイドによる最後の２回の免疫化から６週間後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＳＣ前駆体の頻度を示す。アジュバントとしてのα−ＧＣの使用は、アルミニウム塩アジュバントの使用と比較して、ＡＳＣ前駆体の頻度を著しく増強させた。同様に、図１８が示すように、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣによる最後の２回の免疫化から３カ月後、ＧＢＳ８０およびアルミニウム塩による免疫化と比較して、ＣＤ１マウスのＡＳＣ前駆体の頻度が著しく高かった。
【０１６２】
一連の２回の免疫化でアジュバントとして投与したとき、アルミニウム塩と比較すると記憶Ｂ細胞の頻度を著しく増強させるα−ＧＣの能力は、単回免疫化でアジュバントとして使用されると、α−ＧＣが特定の記憶Ｂ細胞の増加を誘発することができることを示唆した。従って、α−ＧＣおよびＨ３Ｎ２抗原の特定のＢ細胞記憶プールへの単回投与の効果を評価するために実験を行った（図８〜１１）。
【０１６３】
図８は、実験で使用した免疫化スケジュールを示す。Ｃ５７ＢＬ／６メスのマウス（６〜８週齢）２０匹を５マウスずつ４群に分けた。群１）を０週目にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＨ３Ｎ２で免疫し、２週間後にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫した。群２）を０週目にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫し、２週間後にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群３）を０週目および２週目にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群４）を０週目および２週間後にＨ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫した。初回の免疫化から５６週間後、すべての群のマウスにＰＢＳ中の３μｇのＨ３Ｎ２を接種した。すべての免疫化は筋肉内であった。
【０１６４】
図９は、群３のマウス（ＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した）のＨ３Ｎ２抗体応答と、両免疫化でα−ＧＣを用いて（図Ａ）、第１の免疫化だけにα−ＧＣを用いて（図Ｂ）、第２の免疫化だけにα−ＧＣを用いて（図Ｃ）免疫されたマウスの応答とを比較する。第１のまたは第２の免疫化だけに与えても、α−ＧＣは抗体応答を増強することが分った。４つの群の間には抗体半減期の相違は観察されなかった。
【０１６５】
図１０は、観察した以下の抗体応答の対での比較を示す：Ａ）α−ＧＣによる２回の免疫化されたマウスｖｓ．第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化；Ｂ）α−ＧＣによる２回の免疫化されたマウスｖｓ．第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化；およびＣ）第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化ｖｓ．第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化。α−ＧＣを第１のワクチン投与に与えたとき、最大効果を観察した。第１のワクチン投与でのα−ＧＣの供給は、第２のワクチン投与でのα−ＧＣの供給に対して高い抗体応答をもたらした（図１０Ｃ）。α−ＧＣを第１のワクチン投与で供給した場合、抗体応答は、α−ＧＣを両ワクチン投与で供給した場合に得られた応答と類似していた（図１０Ｂ）。
【０１６６】
図１１は、α−ＧＣを２回のプライミング注射の第１または第２の投与のいずれかだけに入れた場合でも、α−ＧＣで予備刺激したマウスがワクチン接種に対して高い想起応答を示すことを確認する。これらの結果は、α−ＧＣをアジュバントとしてワクチン組成物に入れると、長期免疫記憶を達成するために必要とするプライミング免疫化の回数を減少させることが可能であり、かつ追加免疫免疫化の頻度および回数を減少させることを示唆する。
【０１６７】
（実施例３） α−ＧＣは、ストレプトコッカス・アガラクチアによって誘発された新生仔敗血症のマウスモデルで防御抗体応答を増強させる。
【０１６８】
ストレプトコッカス・アガラクチア感染症によって誘発された新生仔敗血症のマウスモデルで防御抗体応答を増強させるその能力に対して、α−ＧＣを検査した。
【０１６９】
メスのマウスを３つの群に分けた。群１を、０日目にアジュバント非存在下で２０μｇのＧＢＳ８０で予備刺激し、２１日目に同じ組成物で追加免疫した。２３日目にマウスを交配し、５０〜５３日目に仔を出産する前に、ＧＢＳ８０−ＩｇＧ力価の評価を行うために４３〜３６日目に採血した。出生から０〜４８時間に仔マウスにストレプトコッカス・アガラクチアの９０％致死量を接種した。追加免疫投与から３カ月後、母マウスを犠牲にして、脾臓を摘出し、ＧＢＳ８０−ＩｇＧ形質細胞前駆体の頻度を評価した。群２のマウスには、ＧＢＳ８０およびミョウバンで予備刺激および追加免疫を行い、群３のマウスには、ＧＢＳ８０および０．１μｇのα−ＧＣで予備刺激および追加免疫を行ったことを除いて、同じ免疫化スケジュールを群２および群３で続けた。
結果は、以下のとおりであった。
【０１７０】
【表１】
このように、アジュバントとしてのα−ＧＣの使用は、母マウスのＧＢＳ８０−ＩｇＧ反応を誘発し、ミョウバンによって誘発されたＩｇＧ応答よりも８倍高いものであった。母マウスの高い抗体応答は、Ｂ群連鎖球菌感染症からそれらの仔マウスの保護を増強させる結果になった。ＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫された母マウスの仔のうちわずかに３０％と比較すると、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスからの仔のうち７０％は、ストレプトコッカス・アガラクチアの接種から残存した。
【０１７１】
２０μｇまたは１μｇのＧＢＳ８０のいずれかで免疫されるマウスを用いて、実験を繰り返した。０日目にマウスのすべてを予備刺激し、２０日目に追加免疫し、３４日目に交配し、５４〜５８日目の仔の出産の前、４８日目に採血した。直ちに、仔マウスにストレプトコッカス・アガラクチアの９０％致死量を接種し、４８時間で生存を評価した。追加免疫から３カ月後、母マウスを犠牲にして、ＧＢＳ８０−ＩｇＧ形質細胞前駆体の頻度を評価するために脾臓を摘出した。ミョウバン、α−ＧＣとともに、アジュバントは含まずに１μｇのＧＢＳ８０で；ミョウバン、α−ＧＣとともに、アジュバントは含まずに２０μｇのＧＢＳ８０で；またはリン酸緩衝食塩水もしくはミョウバンアジュバント単独でマウスを免疫した。
【０１７２】
図１５に示すように、１μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、１μｇのＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスよりも有意に高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価を示した。２０μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、２０μｇのＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスと比べると、同等のＩｇＧ１力価を示し、より高いＩｇＧ２ａ力価を示した。結果は以下のとおりである。
【０１７３】
【表２】
このように、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスの％生存率は、ＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスの生存率と同等であった。
【０１７４】
ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスの脾臓は、また、ＧＢＳ８０ ＩｇＧ形質細胞および記憶Ｂ細胞の頻度を有意に高く含有していた（それぞれ図１７および１８）。参照文献２５８に記述されるように、ＧＢＳ８０特異的形質細胞および記憶Ｂ細胞の頻度を、培地だけで、またはＣｐＧおよびＩＬ−２の存在下の培地でインキュベートした脾細胞の１０日の限界希釈培養からの上清でＧＢＳ８０特異的抗体の存在を評価することで決定した。
【０１７５】
さらに実験で、妊娠したＣＤ１メスのマウスを、リン酸緩衝食塩水、ＧＢＳ８０、ＧＢＳ８０＋ミョウバン、またはＧＢＳ８０＋α−ＧＣで免疫した。免疫されたＣＤ１メスマウスの各群からまたはナイーブなＣＤ１メスマウスから出産１週間前に採取した血清をプールして、ナイーブなＣＤ１母マウスから生まれた２４時間齢の新生仔に皮下注射した（最終容量２０μｌ中３μｌ／投与）。３時間後、新生仔のすべてに生ウイルスのストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｔｉａｅ）１×ＬＤ９０（９０％致死量）を腹腔内に接種した。仔マウスの生存を２日間経過観察した。ＧＢＳ８０で免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウスは、すべて死亡し（２８仔マウスのうち２８匹）、リン酸緩衝食塩水で免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウス２７匹のうちわずか１匹が生き残った。アジュバント（ミョウバンまたはα−ＧＣ）の存在は、生存の増加においてミョウバンよりもより有効であるα−ＧＣでの免疫化により生存を向上させた。ＧＢＳ＋α−ＧＣで免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウスの生存は、ＧＢＳ＋ミョウバンで免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウスの生存より１６５％高かった。
【０１７６】
これらのデータは、α−ＧＣが、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｔｉａｅ）に対する防御免疫応答の誘発においてミョウバンよりも著しく有効であることを示する。
【０１７７】
（実施例４） α−ＧＣは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株由来のいくつかのタンパク質抗原を含有する混合ワクチンに対する抗体応答を増強する
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株（ＭｅｎＢ）抗原からの複数の抗原を組み合わせるためのアジュバントとして作用するα−ＧＣの能力を評価した。
【０１７８】
３種類のＭｅｎＢ抗原（ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃ）（各２０μｇ／用量）に０．１μｇのα−ＧＣを混合した、または０．６ｍｇのミョウバンを混合した混合物でマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を、０日目、２１日目、および３５日目に施し、各免疫化後に各抗体に対するＩｇＧ力価を評価した。図１９に示すように、α−ＧＣは、混合ワクチン中の３種類のＭｅｎＢ抗原のすべてに対する抗体応答を増強することにおいてミョウバンと同様に有効であった。
【０１７９】
α−ＧＣは、また、これらの抗原に対する殺菌応答を増強させた。図１６は、３種類のＭｅｎＢ抗原（ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃ）の混合物で免疫されたマウス、またはミョウバン、α−ＧＣと共に、またはアジュバントを含まずにこれらの抗原それぞれと別々の組み合わせで免疫されたマウスからの血清試料中のＭｅｎＢ型株ＭＣ５８、２９９６、Ｈ４４／７６、およびＮＺ９８／２５４に対する殺菌抗体応答を比較している。ＭｅｎＢ抗原およびα−ＧＣによる免疫化に対する殺菌応答は、ＭｅｎＢ抗原およびミョウバンによる免疫化に対する殺菌応答よりも一貫して高かった。
【０１８０】
ＭｅｎＢ抗原に対するｅｘ ｖｉｖｏでのＣＤ４Ｔ細胞応答を評価するために第２の実験を行った。６匹のＣＤ１メスマウスからなる複数群を、複数のＭｅｎＢ抗原の混合（リン酸緩衝食塩水、ミョウバン、またはα−ＧＣで製剤化した）で２回免疫した。第２の免疫化から１０日後、３マウス／群を犠牲にして、それらの脾臓を摘出した。別々のマウス由来の全脾細胞の懸濁液をＭｅｎＢ抗原を用いて１６時間培養した。培養の最後の１２時間は、ブレフェルジンＡの存在下で行い、サイトカインの細胞内蓄積を可能にした。刺激した脾細胞を固定、膜透過処理を行い、抗ＣＤ３、抗Ｃｄ４，抗ＣＤ６９，抗ＩＦＮｇ、およびＴＮＦαのモノクローナル抗体を用いて染色した。全ＣＤ４＋細胞集団中のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６９＋サイトカイン＋細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳ解析によって決定した。
【０１８１】
結果を図１４に示す。ＭｅｎＢ抗体に応答してＴＦＮαを産生するＣＤ４Ｔ細胞を増殖させることにおいてα−ＧＣは、ミョウバンよりもより有効であることが分り、α−ＧＣが、少なくともミョウバンと同程度でＭｅｎＢ抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発できることを示した。陽性対照として、ポリクローナル刺激に対する応答をマウスの３つ群のすべてで検査した。図１４の挿入部に示すように、マウスの３つの群のすべては、抗ＣＤ３抗体（ＩａＣＤ３）によるポリクローナル刺激に対して同じ応答を示した。
【０１８２】
ミョウバンまたはＭＦ５９と比較して同じ３種類のＭｅｎＢ抗原のためのアジュバントとして作用するα−ＧＣの能力を評価するために、追加の実験を行った。３種類のＭｅｎＢ抗原（ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃ）（各２０μｇ／用量、５μｇ／用量、または２．５μｇ／用量）に０．１μｇのα−ＧＣ、０．６ｍｇのミョウバン、１００μｇのＭＦ５９を混合、またはアジュバントを含まずに混合した混合物でマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を、０日目、２１日目、および３５日目に施し、各免疫化の後、各抗原に対するＩｇＧ力価を評価した。図１３に示すように、α−ＧＣおよびＭＦ５９は両方とも、ミョウバンよりも高い殺菌抗体価を誘発した。免疫されたマウスの脾臓のＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞の頻度も、決定した。図１２に示すように、ミョウバンと比較して、α−ＧＣまたはＭＦ５９で免疫されたマウスの脾臓により高い頻度のＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞が見られた。ＭｅｎＢ抗原に対する殺菌免疫応答を誘発する際、および長期免疫記憶に必要とされるＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞を誘発する際に、α−ＧＣはミョウバンよりもより有効であり、かつＭＦ５９と同程度に有効であることをこれらのデータは示す。
【０１８３】
当然のことながら、本発明は例の目的でのみ記述されており、詳細の変更は本発明の趣旨および適用範囲から逸脱することなくなされる。
【０１８４】
（参考文献）
【０１８５】
【化１３】
【０１８６】
【化１４】
【０１８７】
【化１５】
【０１８８】
【化１６】
【０１８９】
【化１７】
【０１９０】
【化１８】
【０１９１】
【化１９】
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】免疫グロブリン（Ｉｇ）力価のグラフを示す。Ａ）α−ＧＣおよび細菌タンパク質（破傷風トキソイド（ＴＴ）もしくはジフテリアトキソイド（ＤＴ））またはウイルスタンパク質（Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＡ型株からの赤血球凝集素−ノイラミニダーゼのサブユニット）により筋肉内に免疫されたＣ５７／ＢＬ６マウスのタンパク質特異的抗体の血清力価。タンパク質およびα−ＧＣ（黒四角）で免疫されたマウスは、タンパク質単独（白四角）で免疫されたマウスよりも、より高い抗体価を示した。Ｘ軸は、日数を示す。Ｂ）Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣ（黒四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞を有する（Ｊａ１８＋／＋）マウスは、Ｈ３Ｎ２単独（白四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞を有するマウスと比較して、Ｈ３Ｎ２特異的抗体の血清力価の増大を示す。Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣ（黒四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞が欠如した（Ｊａ１８−／−）マウスは、Ｈ３Ｎ２単独（白四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞を欠如したマウスと比較して、Ｈ３Ｎ２特異的抗体の血清力価の増強を示さない。すべての免疫化は、皮下であった。
【図２Ａ】免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価の平均値のグラフを示す。Ａ）ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両抗体の生成においてα−ＧＣは、ＣＦＡ、ＣｐＧ、ＭＦ５９、およびアルミウム塩と同様に強力である。抗原は、ＴＴであった。
【図２Ｂ】免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価の平均値のグラフを示す。Ｂ）Ｈ３Ｎ２で皮下に免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは、検出可能な抗体（ＩｇＧ）価を示したのに対して、Ｈ３Ｎ２単独またはミョウバンで皮下に免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは抗体価を示さなかった。
【図３】インフルエンザウイルス感染症のマウスモデルにおけるα−ＧＣとＭＦ５９との比較を示す。すべての免疫化は、筋肉内であった。Ａ）Ｈ１Ｎ１特異的ＩｇＧ力価（幾何平均）。Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスの抗体価は、Ｈ１Ｎ１およびＭＦ５９で免疫されたマウスの抗体価に匹敵するものであり、タンパク質単独のワクチンで免疫されたマウスに見られた力価よりも有意に高いものである。Ｂ）接種後の生存パーセンテージ対日数。Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスの８０％およびＨ１Ｎ１とＭＦ５９とで免疫されたマウスの１００％は、インフルエンザウイルス接種後生存している。
【図４】Ｈ３Ｎ２免疫グロブリン力価（幾何平均）を示す。白四角は、アジュバントなしであり、網掛け四角は、α−ＧＣを有する。Ａ）ＷＴ、ＩＬ−４−／−、およびＩＦＮ−γＲ−／−マウスのＨ３Ｎ２とα−ＧＣとでの皮下免疫化（存在するところは黒で示す）またはＨ３Ｎ２単独での皮下免疫化（存在するところは白で示す）に対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答。Ｈ３Ｎ２単独での野性型マウスの免疫化は、ＩｇＧ１応答（Ｔｈ２）を誘発し、一方Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣでの免疫化は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答（Ｔｈ０）を誘発した。Ｈ３Ｎ２単独でのＩＬ４−／−マウスの免疫化は、ＩｇＧ応答を誘発しなかったが、一方Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣでの免疫化は、ＩｇＧ１およびＩＧ２ａ応答（Ｔｈ０）を誘発した。Ｈ３Ｎ２単独でのＩＦＮ−γＲ−／−マウスの免疫化は、ＩｇＧ１応答（Ｔｈ２）を誘発し、一方Ｈ３Ｎ２およぼα−ＧＣでの免疫化は、有意に高いＩｇＧ１応答（Ｔｈ２）を誘発した。点線は、検査された血清の最小希釈を示す。Ｂ）Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣでの皮下免疫化の前と免疫化の間に、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体で処置されたマウスは、対照ＩｇＧで処置されたマウスで観察された抗体価よりも有意に低いＨ３Ｎ２抗体価を示す。
【図５】Ａ）０週目と２週目にＨ３Ｎ２単独またはＨ３Ｎ２とα−ＧＣによってマウスを予備刺激し、第１の免疫化から３０週間後に両群のマウスを単独のＨ３Ｎ２タンパク質で追加免疫した。図は、Ｈ３Ｎ２−Ｉｇ力価（幾何平均）対時間（週）を示す。矢印は、免疫化の時期を示す。Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣの２つの投与によって予備刺激し、その後タンパク質単独で追加免疫されたマウス（黒四角）は、Ｈ３Ｎ２単独によって予備刺激および追加免疫されたマウス（白四角）よりも有意に高い抗体価を示した。Ｂ）図５Ａにより予備刺激したマウスにおけるＨ３Ｎ２−抗体分泌細胞前駆体の頻度（１００万Ｂ細胞あたりのＨ３Ｎ２−ＩｇＧ ＡＳＣ前駆体）。３０週目でのＨ３Ｎ２−抗体を分泌する細胞前駆体の頻度は、Ｈ３Ｎ２単独で２回免疫されたマウス（白四角）よりもＨ３Ｎ２とα−ＧＣとで２回免疫されたマウス（網掛け四角）のほうが有意に高かった。
【図６】Ｈ３Ｎ２−Ｉｇ力価（幾何平均）対時間（週）。Ｈ３Ｎ２単独で皮下に２回免疫されたｉＮＫＴ細胞が欠損したマウス（Ｊａ１８−／−）およびｉＮＫＴ細胞を有するマウス（Ｊａ１８＋／＋）におけるＨ３Ｎ２特異的抗体の減衰。抗原特異的抗体は、ｉＮＫＴ細胞を有するマウス（楕円）よりもｉＮＫＴ細胞が欠損したマウス（三角）がより急速に減衰する。
【図７】破傷風トキソイド＋／−アジュバントによる最後（２回のうちの）の免疫化から６週間後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＳＣ前駆体（すなわち記憶Ｂ細胞）の頻度を、１００万Ｂ細胞あたりの数として示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目と１４日目にアジュバント、α−ＧＣ、もしくはミョウバンを含まない破傷風トキソイドによって筋肉内に免疫した。破傷風トキソイドおよびα−ＧＣで免疫されたマウスは、破傷風トキソイド単独で免疫されたマウスよりも有意に高いＴＴ特異的記憶Ｂ細胞の頻度を示し、ミョウバン中の破傷風トキソイドで免疫された全マウスは、示さなかった。＊は、ｐ＜０．００５ｖｓ無抗原投与を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。＊＊＊は、ｐ＜０．００５ｖｓアジュバントを含まないＴＴを示す。
【図８】プライミングで使用されるすべてのワクチン投与でα−ＧＣの存在を必要とするかどうかを評価するために使用した免疫化スケジュール。Ｃ５７ＢＬ／６メスのマウス（６〜８週齢）２０匹を５匹のマウスの４群に分けた。群１）を０週目にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＨ３Ｎ２で免疫し、２週間後にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫した。群２）を０週目にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫し、２週間後にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群３）を０週目および２週目にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群４）を０週目および２週間後にＨ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫した。初回の免疫化から５６週間後、すべての群のマウスにＰＢＳ中の３μｇのＨ３Ｎ２を接種し、５８週目に想起応答を評価した。すべての免疫化は筋肉内であった。
【図９】図８の群３のマウス（ＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で２回免疫された）のＨ３Ｎ２抗体応答と以下Ａ〜Ｃとの比較：Ａ）図８の群４のマウス（α−ＧＣ中のＨ３Ｎ２で２回免疫された）の応答；Ｂ）図８の群１のマウス（ＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で、次いでα−ＧＣ中のＨ３Ｎ２で免疫された）の応答；およびＣ）図８の群２のマウス（α−ＧＣ中のＨ３Ｎ２で、次いでＰＢＳ中のＨ３Ｎ２での免疫化）の応答。抗体半減期における相違はなかった。
【図１０】以下のように観察されたＨ３Ｎ２−抗体応答の比較：Ａ）α−ＧＣによる２回の免疫化（群４）ｖｓ第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣ（群１）；Ｂ）α−ＧＣで２回免疫されたマウス（群４）ｖｓ第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣ（群２）；およびＣ）第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化（群２）ｖｓ第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化（群１）。
【図１１】図８に記述するように免疫されたマウスの想起応答。Ｈ３Ｎ２単独による追加免疫（５６週目に施した）の免疫化から２週間後、α−ＧＣの１ないし２回投与によって予備刺激されたマウスは、Ｈ３Ｎ２単独の２回投与で予備刺激されたマウスより高い想起応答を示した。データは、５６週目と５８週目のＨ３Ｎ２のＩｇ力価（幾何平均）である。
【図１２】図１３に記述するように免疫されたマウスの脾臓のＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞の頻度を決定した。ＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞のより高い頻度は、ミョウバンと比較して、α−ＧＣまたはＭＦ５９で免疫されたマウスの脾臓で見つかった。グラフは、１００万Ｂリンパ球あたりのＭｅｍＢ特異的ＩｇＧ記憶Ｂ細胞を示す。＊および＊＊は、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１ｖｓアジュバントなしを示す。
【図１３】ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃの３種類のＭｅｎＢ抗原（各々２０μｇ／用量、５μｇ／用量、または２．５μｇ／用量）に０．１μｇのα−ＧＣ、０．６ｍｇのミョウバン、１００μｌのＭＦ５９、またはアジュバントなしを混合した混合物によってマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を０日目、２１日目、および３５日目に施し、各抗原に対するＩｇＧ力価を各免疫化から１０５日目まで評価した。α−ＧＣとＭＦ５９の両方は、ミョウバンよりも高い殺菌抗体価を誘発した。
【図１４】０日目および２１日目に以下によって筋肉内に免疫されたマウスにおける組換えＭｅｎＢ抗原に対するＣＤ４Ｔ細胞応答の比較：ａ）３種類のＭｅｎＢ抗原およびα−ＧＣを含有する混合ワクチン；ｂ）３種類のＭｅｎＢ抗原およびミョウバンを含有する混合ワクチン；またはｃ）３種類のＭｅｎＢ抗原だけを含有する混合ワクチン。第２の免疫化から２週間後、表示した量のＭｅｎＢ組換えタンパク質を用いて全脾細胞を１６時間（最後の１４時間は、ブレフェルジンＡの存在下で行った）インキュベートすることによってＣＤ４Ｔ細胞応答を評価した。ＴＮＦａを産生するＣＤ４Ｔ細胞の数を細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって決定した。３種類のＭｅｎＢ抗原およびα−ＧＣの混合で免疫されたマウスは、複数のＭｅｎＢ抗原とミョウバンまたはアジュバントなしの混合によって免疫されたマウスと比較して、一貫してより高いＣＤ４応答を示した。陽性対照として、ポリクローナル刺激に対するマウスの３群すべての応答を検査した。図の挿入部に示すようにマウスの３群すべては、抗ＣＤ３抗体（ＩａＣＤ３）によるポリクローナル刺激に対して同じ応答を示した。すべてのＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとして、Ｙ軸はＴＮＦαを産生するＣＤ４Ｔ細胞を示す。
【図１５】力価（幾何平均）。ＧＢＳ抗原で免疫されたマウスにおけるＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの力価の比較。１μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、１μｇのＧＢＳ８０単独で免疫されたマウスよりも有意に高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価を示したが、ミョウバン中のＧＢＳ８０で免疫されたマウスは、示さなかった。２０μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、２０μｇのＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスに等しいＩｇＧ１力価を示し、かつより高いＩｇＧ２ａ力価を示した。＊、＊＊ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１ｖｓアジュバントなしでのＧＢＳ８０
【図１６】０日目と２１日目に、３種類のＭｅｎＢ抗原（ＤＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、または９６１ｃ）のうちの１つまたは以下と組み合わせた３種類の抗原全ての混合でマウスを免疫した：ａ）α−ＧＣ；ｂ）ミョウバン；またはｃ）アジュバントなし。ＭｅｎＢ型株（ＭＣ５８、２９９６、Ｈ４４／７６、およびＮＺ９８／２５４）に対する殺菌抗体の濃度を、第２の免疫化から２週間後、および第３の免疫化から２週間後に評価した。アジュバントとしてα−ＧＣとともに混合ワクチンを投与したとき、殺菌抗体は、ミョウバンと比較して有意に高かった。免疫化のすべては筋肉内であった。
【図１７】ＧＢＳ８０で免疫された母マウスの脾臓の記憶Ｂ細胞の頻度。ＧＢＳ８０特異的抗体を産生する形質細胞の頻度は、ＧＢＳ８０単独でまたはミョウバンで免疫された母マウスの脾臓よりも、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスからの脾臓において有意に高かった。グラフは、１００万Ｂリンパ球あたりのＧＢＳ８０ＩｇＧ形質細胞の数を示す。
【図１８】ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスとＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫された母マウスとの形質細胞頻度の比較。形質細胞頻度は、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスにおいて有意に高かった。グラフは、１００万Ｂリンパ球あたりのＧＢＳ８０ＩｇＧ形質細胞の数を示す。
【図１９】ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃの３種類のＭｅｎＢ抗原（各々２０μｇ／用量）単独に０．１μｇのα−ＧＣを混合した、または０．６ｍｇのミョウバンを混合した混合物でマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を、０日目、２１日目、および３５日目に施し、各々の免疫化後、各抗原に対するＩｇＧ力価を評価した。α−ＧＣは、混合ワクチンの３種類のＭｅｎＢ抗原のすべてに対する抗体応答の増強においてミョウバンと同様に有効であった。免疫化のすべては、筋肉内であった。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に引用するすべての文献は、それら全体が参照として援用される。
【０００２】
本発明は、ワクチン組成物の分野および、ワクチン組成物を用いる免疫化方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
病原体に由来する抗原を含むワクチン組成物を最初に投与すると、抗原に対して活性化細胞および記憶細胞の両形態での一次応答を誘導する。それに続くその抗原への曝露（例えばその病原体への曝露）は、免疫記憶細胞の増殖および一次応答よりもより迅速で大きい二次応答を誘導し、それによってその病原体からの保護を与える。
【０００４】
免疫記憶細胞は、抗原への一次曝露の後、数カ月間または数年間でも存続するが、通常は、長期免疫記憶の維持を確実にするために抗原の追加免疫用量を与えることが必要である。従ってワクチン接種レジメンは、免疫記憶細胞の最初のバンクを与えるために何回かのプライミング注射、およびその後免疫記憶を維持するために次第に間隔をあけて何回かの追加免疫を含むことが多い。追加免疫注射と共に何回かのプライミング注射および頻度の必要性は、ワクチンおよび受容者の年齢によって変化する。
【０００５】
免疫記憶の維持を損なうことなく、プライミング投与の回数および追加免疫投与の頻度と回数を減少させることができることは、有利である。理想的には、追加のプライミング投与および追加免疫投与の必要性を完全に取り除き、単回投与としてワクチンを投与することが好ましい。従って、本発明の目的は、追加免疫投与の非存在下でおよび／または複数のプライミング投与の非存在下で長期免疫記憶を誘導する免疫原性組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の目的は、さらに、インフルエンザウイルス、Ｂ群連鎖球菌、および血清型Ｂ株髄膜炎菌に由来する抗原を含む免疫原生組成物を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ワクチンは、免疫活性を高めるためにアジュバントを含むことが多い。既知のアジュバントの例としては、アルミニウム塩、水中油型乳剤、サポニン、サイトカイン、脂質、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。現在は、アルミニウム塩、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄＭＰＬ」）、およびＭＦ５９だけがヒト用途として承認されている。
【０００８】
アジュバント特性を有することで知られている別の分子は、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒまたはα−ＧＣ）（糖脂質、より具体的にはグリコシルセラミド、最初は海綿から単離された）である［１］。α−ＧａｌＣｅｒは、ＭＨＣクラスＩ様分子のリガンド（ＣＤ１ｄ）であり、ＣＤ１ｄ分子によってインバリアントナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に提示される。α−ＧａｌＣｅｒは、最初は、腫瘍細胞に対するＮＫＴ細胞応答を誘導するその能力を研究された［２］。インバリアントＮＫＴ細胞は、また、Ｂ細胞活性化を誘導し、Ｂ細胞増殖および抗体産生を増強させることが示されている［３、４］。α−ＧａｌＣｅｒは、同時投与される種々のタンパク質抗原のためのアジュバントとして作用することが示されている［５］。マラリア抗原を発現する照射されたスポロゾイトまたは組換えウイルスとα−ＧａｌＣｅｒとの同時投与は、マウスでの抗マラリア防御免疫のレベルを増強させることが示されている［６］。α―ＧａｌＣｅｒは、また、ＤＮＡワクチンをコードするＨＩＶ１型ｇａｇ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子のためのアジュバントとして作用し［７］、鼻腔内に投与されると、インフルエンザウイルＨＡ型に対して液性および細胞性の免疫応答を誘導する［８］ことが示されている。
【０００９】
驚くべきことに、ワクチンアジュバントとしてのα−ＧａｌＣｅｒ等のＣＤ１ｄリガンドの使用は、ワクチンで抗原に対する抗体応答を著しく増強するばかりでなく、それらの抗原に対して特異的なＢ細胞記憶プールの増大を誘導することが、現在判明している。具体的には、α−ＧａｌＣｅｒおよび抗原を含む組成物の単回投与からなる投与は、１年後に抗原による攻撃に対する抗体応答を増強する特異的なＢ細胞記憶プールの増大を促進するのに十分であることが分った。特異的なＢ細胞記憶プールの増大を促進するこのＣＤ１ｄリガンドの能力は、ワクチンアジュバントとしてのＣＤ１ｄリガンドを使用すると、長期免疫記憶を得るために必要なプライミングおよび追加免疫投与回数と頻度を減少させることを示す。
【００１０】
また、ＣＤ１ｄリガンドは、Ｂ群連鎖球菌、血清型Ｂ株髄膜炎菌に由来する抗原および特定のインフルエンザウイルス抗原に驚くほど有効なアジュバントであることが分った。
【００１１】
長期免疫記憶を誘導する方法
本発明は、それを必要としている患者においてある抗原に対する長期免疫記憶を誘導する方法を提供し、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下で前述の抗原の投与と比較して、前述の患者がその後の前述の抗原への曝露に対する免疫応答を上げることができるように必要な前述の組成物の投与回数および／または頻度を減少するように、以下を含む組成物を前述の患者に投与することを含む：
ａ）前述の抗原および
ｂ）ＣＤ１ｄリガンド。
【００１２】
好ましくは、本発明の方法は、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下で前述の抗原の投与と比較して、前述の患者が前述の抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を上げることができるために必要な前述の組成物の投与回数および／または頻度を減少させる。「防御免疫応答」とは、抗原へのその後の曝露に対して上昇した免疫応答が、患者が抗原と関連する疾患に罹患するのを防ぐのに十分であることを意味する。抗原に対する防御免疫応答を上げるために必要な組成物の投与回数および／または頻度の減少は、当該技術分野で周知の標準方法で測定される。
【００１３】
本発明の方法は、その抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を誘導するのに必要な抗原を含む組成物の投与回数を減少させる。一部の免疫化は、現在、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を上げるために３回もしくは４回の抗原のプライミング投与を必要とする。好ましくは、本発明の方法は、抗原に対する防御免疫応答を誘導するのに必要な投与回数を単回プライミング投与まで減少させる。
【００１４】
現在の免疫化方法は、また、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を維持するために次第に間隔をあける追加免疫免疫化を必要とすることが多い。例えば、幼児期に施される免疫化は、通常は、初回量の投与から数カ月または数年後に施される追加免疫投与を含む。好ましくは、本発明の方法は、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を維持するために必要な抗原を含む組成物の追加免疫投与の頻度を減少させる。好ましくは、本発明の方法は、１年を超える、好ましくは２年を超える、好ましくは５年を超える、好ましくは１０年を超える間隔で追加免疫投与が投与されることを可能にする。本発明の好ましい実施形態により、追加免疫投与のための必要性は完全に排除され、抗原の単回投与は、抗原へのその後の曝露に対する防御免疫応答を誘導するのに十分である。
【００１５】
本発明の一態様によると、患者の抗原に対する免疫応答を誘導する方法は、抗原およびＣＤ１ｄリガンドが、１年より前にも投与された患者に以下を投与することを含み提供される：
ａ）前述の抗原および
ｂ）ＣＤ１ｄリガンド。
【００１６】
本発明は、また、抗原およびＣＤ１ｄリガンドが１年より前にも投与された患者において免疫応答を誘導するための薬物の製造で前述の抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。
【００１７】
好ましくは、免疫応答は、防御免疫応答である。好ましくは、前述の抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、前述の患者に１８カ月以上前に、好ましくは２年以上前に、好ましくは５年以上前に、好ましくは１０年以上前に投与された。
【００１８】
本発明のこの態様によって患者に投与される抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、混合物として、すなわち、抗原およびＣＤ１ｄリガンドの両方を含む単一組成物として投与される。あるいは、抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、最初に投与される抗原もしくはＣＤ１ｄリガンドのいずれかと同じ部位で患者に連続して投与される。抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、また、異なる部位で（例えば異なる四肢に）別々に患者に投与される。１年以上前に患者に投与されたＣＤ１ｄリガンドおよび抗原の初回投与は、また、ＣＤ１ｄリガンドと抗原との単一組成物として投与されることも可能であり、またはＣＤ１ｄリガンドと抗原は、連続してもしくは別々に投与される。免疫応答を誘導するために患者に投与されるＣＤ１ｄリガンドの量は、組成物が投与される患者の年齢および体重によって変化するが、通常は、１〜１００μｇ／ｋｇ患者体重で含む。驚くべきことに、低用量のＣＤ１ｄリガンドは、同時投与された抗原への免疫応答を増強し、その抗原に対する長期免疫記憶を促進するのに十分であることが分った。本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドの量は、従って、患者体重あたり５０μｇ／ｋｇ未満、２０μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満であってよい。
【００１９】
本発明の別の態様によると、患者の抗原に対する免疫応答を誘導する方法は、前述の患者に以下を投与することを含み提供される：
ａ）前述の抗原および
ｂ）ＣＤ１ｄリガンド；
ここでは、組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドの量は、患者体重あたり１０μｇ／ｋｇ未満、好ましくは、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満である。
【００２０】
本発明は、また、患者の免疫応答を誘導するための薬物の製造で抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。ここでのＣＤ１ｄリガンドの量は、患者の体重あたり１０μｇ／ｋｇ未満、好ましくは、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満である。
【００２１】
本発明のこの態様により患者に投与される抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、混合物として投与される；同じ部位（最初に投与される抗原またはＣＤ１ｄリガンドのいずれかと）に患者に連続して投与される；または異なる部位（例えば異なる四肢に）に別々に患者に投与される。
【００２２】
ＣＤ１ｄリガンド
本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄ分子に結合する任意の分子であってよい。ＣＤ１ｄ分子は、インバリアントＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単核細胞、および従来のＴ細胞の上に位置し、本発明のＣＤ１ｄリガンドは、これらの細胞のいずれかに位置するＣＤ１ｄ分子に結合する。本発明のＣＤ１ｄリガンドのＣＤ１ｄ分子への結合は、ｉＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単核細胞、および／または従来のＴ細胞を活性化する。好ましくは、ＣＤ１ｄリガンドのＣＤ１ｄ分子への結合は、ｉＮＫＴ細胞を活性化する。ＣＤ１ｄ分子に結合する分子の能力は、当該技術分野で周知の標準方法によって決定される。細胞、特にインパリアントＮＫＴ細胞を活性化するＣＤ１ｄリガンドの能力は、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下で放出されるサイトカインの濃度と比較して、ＣＤ１ｄリガンドの存在下で細胞から放出されるサイトカインの濃度を測定することで決定される。好ましくは、本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下でインバリアントＮＫＴ細胞によるサイトカイン分泌の濃度と比較して、インバリアントＮＫＴ細胞によるサイトカイン分泌の濃度を上昇させる。本発明のＣＤ１ｄリガンドは、Ｔｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカインの放出を促進する。好ましくは、本発明のＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下でインバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルと比較して、インバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルを上昇させる。
【００２３】
インバリアントＮＫＴ細胞を活性化するＣＤ１ｄリガンドとして作用する能力を検査される候補分子は、ペプチドおよびサッカライドを含む。好ましくは、本発明のＣＤ１ｄリガンドは糖脂質である。本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドとして作用することが知られている糖脂質抗原の総説は、参照文献９に示される。
【００２４】
本発明の組成物での使用に適したＣＤ１ｄリガンドの例は、α−グリコシルセラミドを含む。本発明の組成物で使用されるα−グリコシルセラミドは、好ましくは、式（Ｉ）の化合物である：
【００２５】
【化１】
（式中、
Ａは、Ｏ、ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２を表し、
Ｑは、ｎが０もしくは１の整数を表す（ＣＨ２）ｎを表し、
Ｒ１は、ＨもしくはＯＨを表し、
Ｘは、１から３０の整数を表し、
Ｒ２は、以下の（ａ）乃至（ｅ）から成る群から選択される置換基を表す（式中、Ｙは、５から１７の整数を表す）。
（ａ）−ＣＨ２（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）２
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、
Ｒ３は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、またはモノサッカライドを表し、
Ｒ４は、ＯＨまたはモノサッカライドを表し、
Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはモノサッカライドを表し、
Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、またはモノサッカライドを表し、および
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、または−ＣＨ２−モノサッカライドを表す。
【００２６】
Ｘは、好ましくは、７から２７の間、より好ましくは、９から２４の間、およびより好ましくは１３から２０の間である。Ｙは、好ましくは、７から１５の間、より好ましくは、９から１３の間である。
【００２７】
用語「モノサッカライド」は、アルデヒド（アルドース）またはケトン（ケトース）の形で３〜１０の炭素原子の鎖を有する糖分子を意味する。本発明での使用に適したモノサッカライドは、自然発生と合成の両モノサッカライドを含む。モノサッカライドの例として、以下が挙げられる：トリオース（グリセロースおよびジヒドロキシアセトン等）；テキストロース（エリサノース（ｅｒｙｔｈａｎｏｓｅ）およびエリトルロース等）；ペントース（キシロース、アラビノース、リボース、キシルロース、リブロース等）；メチルペントース（６−デオキシヘキソース）（ラムノースおよびフルクトース等）；ヘキソース（グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、およびソルボース等）；ヘプトース（グルコヘプトース、ガラマンノヘプトーセ（ｇａｌａｍａｎｎｏｈｅｐｔｏｓｅ）、セドヘプツロース、およびマンノヘプツロース等）。好ましいモノサッカライドは、ヘキソースである。
【００２８】
モノサッカライド基は、グルコシル結合を形成するために、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の位置で構造に結合してよい。通常は、モノサッカライドは、モノサッカライドのＣ−１炭素に結合した酸素を介してＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の位置に結合し、グリコシド結合を形成する。
【００２９】
Ｒ３がモノサッカライドの場合、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、またはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３０】
Ｒ４がモノサッカライドの場合、β−Ｄ−ガラクトフラノースまたはＮ−アセチル α−Ｄ−ガラクトピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３１】
Ｒ５がモノサッカライドの場合、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、またはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３２】
Ｒ６がモノサッカライドの場合、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、またはβ−Ｄ−グルコピラノースから選択されるのが好ましい。
【００３３】
Ｒ７がモノサッカライドの場合、メチル α−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチル β−Ｄ−ガラクトピラノシド、メチル α−Ｄ−グルコピラノシド、またはメチル β−Ｄ−グルコピラノシドから選択されるのが好ましい。
【００３４】
Ｒ５とＲ６は異なるのが好ましい。Ｒ５およびＲ６の１つはＨであるのが好ましい。
【００３５】
さらに、本発明の組成物の包含に適したα−グリコシルセラミドの例は、参照文献２に示される。
【００３６】
好ましくは、α−グリコシルセラミドは、以下に示す式を有するα−グリコシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）、またはその類似体である：
【００３７】
【化２】
本発明の組成物に含まれるα−ＧａｌＣｅｒおよびその類似体は、海綿から直接単離されることが可能であり、または化学的に合成される生成物であってよい。
【００３８】
本発明の組成物での使用に適したα−ＧａｌＣｅｒ類似体の例、およびこれらの生成物を合成する方法は、参照文献１０および１１に示される。好ましいα−ＧａｌＣｅｒ類似体は、式（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−ｌ，３，４−オクタデカントリオール）を有するＫＲＮ７０００である。ＫＲＮ７０００の合成は、参照文献１２に記述されている。
【００３９】
さらに好ましいα−ＧａｌＣｅｒ類似体は、参照文献１３、１４、および１５に記述されているもの等のα−ＧａｌＣｅｒのＣ結合類似体である。好ましいα−ＧａｌＣｅｒのＣ結合類似体は、ＣＲＯＮＹ−１０１であり、その合成は参照文献１３に記述されている。
【００４０】
α−ＧａｌＣｅｒと比較して脂肪酸アシル鎖および／またはスフィンゴシン鎖が切り詰められた切断型α−ＧａｌＣｅｒ類似体も、本発明で使用される。切断型α−ＧａｌＣｅｒ類似体の例は、参照文献１６に示されている。好ましいα−ＧａｌＣｅｒと比較して、好ましいα−ＧａｌＣｅｒの切断型類似体は、脂肪酸アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、スフィンゴシン鎖が９つの炭化水素の切断を有する（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ２＝ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）４ＣＨ３、Ｒ３＝０Ｈ、Ｒ４＝０Ｈ、Ｒ５＝０Ｈ、Ｒ６＝Ｈ、およびＲ７＝ＣＨ２ＯＨ）「ＯＣＨ」である。
【００４１】
さらに、好ましいα−ＧａｌＣｅｒと比較して、好ましいα−ＧａｌＣｅｒの切断型類似体は、脂肪酸アシル鎖が２つの炭化水素の切断を有し、スフィンゴシン鎖が７つもしくは３つの炭化水素の切断を有する（すなわち、Ｒ１＝Ｈ、Ｘ＝２１、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ５＝ＯＨ、Ｒ６＝Ｈ、Ｒ７＝ＣＨ２ＯＨ、およびＲ２がＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）６ＣＨ３またはＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）１０ＣＨ３のいずれかである）類似体を含む。
【００４２】
α−ＧａｌＣｅｒ、ＫＲＮ７０００、およびＯＣＨは、すべてフィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミドである。しかし、本発明は、また、スフィンゴシン包含ＫＲＮ７０００、ＯＣＨ、および上述の他のα−グリコシルセラミドの類似体の使用を含む。スフィンゴシン含有ＫＲＮ７０００およびＯＣＨの類似体の合成は、参照文献１７に記述されている。
【００４３】
本発明の組成物で使用されるＣＤ１ｄリガンドは、また、参照文献１８に記述されるようなスルファチド類似体を含んでよい。α−ＧａｌＣｅｒの好ましい類似体は、３’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドである。
【００４４】
α−ＧａｌＣｅｒは、最初は海綿から単離されたが、α−ＧａｌＣｅｒの類似の構造からなるＣＤ１ｄリガンドは、最近、グラム陰性細菌から単離されている。さらに、本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドは、従って、細菌に由来する糖脂質であり、特にスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）およびエーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）の外膜から単離される細菌性グリコシルセラミドである。そのようなグリコシルセラミドの例は、スフィンゴモナスに由来するα−グルクロノシルセラミドおよびα−ガラクツロンシルセラミドを含み、それらの生成は参照文献１９に記述されている。さらに、スフィンゴモナスおよびボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）に由来するＣＤ１ｄリガンドの生成は、参照文献１８に記述されている。
【００４５】
本発明は、また、スフィンゴ糖脂質ファミリーに属さないＣＤ１ｄリガンドの使用を含む。特に、本発明は、グリセロール糖脂質であるＣＤ１ｄリガンドの使用を含む。本発明で使用されるグリセロール糖脂質は、ジアシルグリセロール、特にモノガラクトシルジアシルグリセロールを含む。本発明での使用に適したモノガラクトシルジアシルグリセロールは、参照文献２０に記述されている。
【００４６】
組成物の抗原成分
上述の長期免疫記憶を誘導するための組成物に含まれる抗原は、免疫応答の誘導での用途で周知の任意の抗原であってよい。抗原は、タンパク質抗原またはサッカライド抗原を含んでよい。
【００４７】
サッカライド抗原
抗原がサッカライド抗原の場合、抗原は、好ましくは、キャリアタンパク質に抱合される。好ましくは、サッカライド抗原は、細菌サッカライドであり、特に細菌莢膜サッカライドである。
【００４８】
本発明の組成物に含まれる細菌莢膜サッカライドの例は、髄膜炎菌（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹ）、肺炎球菌（血清型４、６Ｂ、９Ｖ，１４、１８Ｃ、１９Ｆ、または２３Ｆ型）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、またはＶＩＩＩ型）、インフルエンザ菌（分類可能株：ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、またはｆ型）、緑膿菌、黄色ブドウ球菌等由来の莢膜サッカライドを含む。本発明の組成物に含まれる他のサッカライドは、グルカン（例えば、カンジダ・アルビカンス種もの等の真菌グルカン）、および真菌莢膜サッカライド（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンスの莢膜由来）を含む。
【００４９】
髄膜炎菌血清群Ａ（ＭｅｎＡ）莢膜は、（α１→６）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェート（Ｃ３およびＣ４の位置に部分的なＯ−アセチル化を有する）のホモポリマーである。髄膜炎菌血清群Ｂ（ＭｅｎＢ）莢膜は、（α２→８）結合シアル酸ホモポリマーである。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ（ＭｅｎＣ）莢膜サッカライドは、（α２→９）結合シアル酸（７および／または８の位置に可変のＯ−アセチル化を有する）のホモポリマーである。髄膜炎菌血清群Ｗ１３５サッカライドは、シアル酸−ガラクトースジサッカライドの単位［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］から成るポリマーである。血清群Ｗ１３５サッカライドは、シアル酸の７および９の位置に可変のＯ−アセチル化を有する［２１］。髄膜炎菌血清群Ｙサッカライドは、ジサッカライド繰り返し単位が、ガラクトース［→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→］の代わりにグルコースを含むことを除けば、血清群Ｗ１３５サッカライドと類似している。血清群Ｙサッカライドも、シアル酸の７および９の位置に可変のＯ−アセチル化を有する。
【００５０】
インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）莢膜サッカライドは、リボース、リビトール、およびホスフェート［‘ＰＲＰ’，（ポリ−３−β−Ｄ−リボース（１，１）−Ｄ−リビトール−５−ホスフェート）］のポリマーである。
【００５１】
本発明の組成物は、サッカライド抗原コンジュゲートの混合物を含んでよい。好ましくは、本発明の組成物は、髄膜炎菌の複数の血清群からのサッカライド抗原を含む。例えば、組成物は、血清群Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ等に由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。好ましい組成物は、血清群ＣおよびＹに由来するサッカライドコンジュゲートを含む。他の好ましい組成物は、血清群Ｃ、Ｗ１３５、およびＹからのサッカライドコンジュゲートを含む。
【００５２】
混合物が、血清群Ａおよび少なくとも１つの他の血清群サッカライドに由来する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）性サッカライドを含む場合、ＭｅｎＡサッカライド対任意の他の血清群サッカライドの比（ｗ／ｗ）は、１より大きくてもよい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはそれ以上）。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来のサッカライドの好ましい比（ｗ／ｗ）は以下の通りである：１：１：１：１、１：１：１：２、２：１：１：１、４：２：１：１、８：４：２：１、４：２：１：２、８：４：１：２、４：２：２：１、２：２：１：１、４：４：２：１、２：２：１：２、４：４：１：２、および２：２：２：１。
【００５３】
本発明のさらに好ましい組成物は、Ｈｉｂサッカライドコンジュゲート、および髄膜炎菌の少なくとも１つの血清群に由来する、好ましくは髄膜炎菌の複数の血清群に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。例えば、本発明の組成物は、Ｈｉｂコンジュゲートならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来するコンジュゲートを含んでよい。
【００５４】
本発明は、さらに、肺炎球菌サッカライドコンジュゲートから構成される組成物を含む。好ましくは、組成物は、肺炎球菌の複数の血清型に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。好ましい組成物は、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ（７価）に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。組成物は、さらに、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、および５（９価）に由来するサッカライドコンジュゲートを含むことも可能であり、および肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、５、３、および７Ｆ（１１価）に由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。
【００５５】
本発明のさらに好ましい組成物は、肺炎球菌サッカライドコンジュゲートおよびＨｉｂおよび／または髄膜炎菌に由来するサッカライドコンジュゲートを含む。好ましくは、本発明の組成物は、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来するサッカライドコンジュゲート、ならびにＨｉｂサッカライドコンジュゲートを含む。好ましくは、本発明の組成物は、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来するサッカライドコンジュゲート、ならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。本発明による組成物は、また、肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来するサッカライドコンジュゲート、Ｈｉｂサッカライドコンジュゲート、ならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹに由来するサッカライドコンジュゲートを含んでよい。
【００５６】
個々のサッカライド抗原コンジュゲートの予防効果は、それらを組み合わせることによって除去されないことが好ましい。しかし実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）が減少する可能性はある。
【００５７】
莢膜サッカライド抗原の調製
莢膜サッカライド抗原の調製方法は、周知である。例えば、参照文献２２は、髄膜炎菌に由来するサッカライド抗原の調製を記述している。インフルエンザ菌に由来するサッカライド抗原の調製は、参照文献８６の第１４章に記述されている。肺炎球菌に由来するサッカライド抗原およびコンジュゲートの調製は、当該技術分野で記述されている。例えば、Ｐｒｅｖｅｎａｒ（プレベナー）（登録商標）は、７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンである。ストレプトコッカス・アガラクチアに由来するサッカライド抗原の調製のプロセスは、参照文献２３および２４に詳細に記述されている。
【００５８】
サッカライド抗原は、化学的に修飾される。例えば、それらの抗原は、１つまたは複数のヒドロキシル基を封鎖基と置換するように修飾される。これは、加水分解を防ぐためにアセチル基が封鎖基と置換される可能性のある髄膜炎菌性血清群Ａにとって特に有用である［２５］。そのように修飾されたサッカライドは、依然として、本発明の目的の範囲内の血清群Ａサッカライドである。
【００５９】
莢膜サッカライドは、オリゴサッカライドの形で使用される。これらは、精製された莢膜ポリサッカライドの断片化によって（例えば加水分解によって）適宜に形成される。これは、通常、所望の大きさの断片に精製することを伴う。
【００６０】
ポリサッカライドの断片化は、好ましくは、最終の平均重合度（ＤＰ）３０未満のオリゴサッカライドをもたらすように実行される。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーによって、または比色分析によって適宜に測定されることが可能である［２６］。
【００６１】
加水分解が実行される場合、加水分解物は、通常、短いオリゴサッカライドを取り除くために大きさによって分けられる［２７］。これは、限外濾過等（それに続くイオン交換クロマトグラフィー）の種々の方法で達成されることが可能である。約６以下の重合度を有するオリゴサッカライドは、好ましくは、血清群Ａのために除去され、約４未満のものは、好ましくは、血清群Ｗ１３５およびＹのために除去される。
【００６２】
キャリア
好ましくは、キャリアはタンパク質である。本発明の組成物でサッカライド抗原が結合される好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド等の細菌性毒素である。適切なキャリアタンパク質として、以下が挙げられる：ジフテリア毒素変異体のＣＲＭ１９７［２８〜３０］；ジフテリアトキソイド；髄膜炎菌外膜タンパク質［３１］；合成ペプチド［３２、３３］；熱ショックタンパク質［３４、３５］；百日咳タンパク質［３６、３７］；サイトカイン［３８］；リンホカイン［３８］；ホルモン［３８］；増殖因子［３８］；Ｎ１９タンパク質［４０］、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に由来するタンパク質Ｄ［４１、４２］、肺炎球菌表面タンパク質（ＰｓｐＡ）、ニューモリシン［４４］、鉄取り込みタンパク質［４５］、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）［４６］に由来する毒素Ａまたは毒素Ｂ、ヒト血清アルブミン（好ましくは組換え型）等の種々の病原体に由来する抗原からの複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質。
【００６３】
キャリアへのサッカライド抗原の結合は、好ましくは、−ＮＨ２基（例えば、キャリアタンパク質内のリジン残基の側鎖内、またはアルギニン残基の側鎖内の）を介する。サッカライドが遊離アルデヒド基を有する場合、これは、還元的アミノ化によってコンジュゲートを形成するために、キャリア内のアミンと反応することができる。結合は、また−ＳＨ基（例えば、システイン残基の側鎖内の）を介してよい。
【００６４】
組成物が複数のサッカライド抗原を含む場合、例えば、キャリア抑制のリスクを減少させるために、複数のキャリアを使用することが可能である。従って、様々なキャリアが様々なサッカライド抗原に対して使用される。例えば、髄膜炎菌血清群Ａサッカライドは、ＣＲＭ１９７と結合されることもあり、一方血清群Ｃサッカライドは、破傷風トキソイドと結合されることもある。特定のサッカライド抗原に対して複数のキャリアを使用することも可能である。サッカライドには、２つのグループがある。ＣＲＭ１９７と結合されるものもあれば、破傷風トキソイドと結合されるものもある。しかしながら、概してすべてのサッカライドに対して同じキャリアを使用することが好まれる。
【００６５】
単一のキャリアタンパク質は、複数のサッカライド抗原を有してよい［４７、４８］。例えば、単一のキャリアタンパク質は、様々な病原体または同じ病原体の様々な血清群に由来するサッカライドに結合する。この目的を達成するために、様々なサッカライドは結合反応の前に混合される。しかしながら、概して、結合後に混合される様々なサッカライドを有する血清群ごとに別々のコンジュゲートを有することが好まれる。別々のコンジュゲートは、同じキャリアに基づくことが可能である。
【００６６】
サッカライド：タンパク質の比率（ｗ／ｗ）を１：５（すなわち過剰タンパク質）から５：１（すなわち過剰サッカライド）の間で有するコンジュゲートが好ましい。１：１．２５〜１：２．５の間の比率が好ましいように１：２から５：１の間の比率は、好ましい。
【００６７】
コンジュゲートは、遊離キャリアと組み合わせて使用される［４９］。所定のキャリアタンパク質が、本発明の組成物に遊離形態および結合形態の両方で存在するとき、非結合形態は、全体として組成物のキャリアタンパク質の全体量の５％を超えないことが好ましく、より好ましくは、２重量％未満で存在する。
【００６８】
任意の適切な結合反応は、必要に応じ任意の適切なリンカーとともに使用される。
【００６９】
サッカライドは、通常は、結合の前に活性化されるか、または官能化される。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸［５０、５１等］）等のシアノ化試薬を含んでよい。他の適切な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する（参照文献５２の導入部も参照）。
【００７０】
リンカー基を介する結合は、任意の既知の方法（例えば参照文献５３および５４に記述される方法）を用いてなされる。結合の１つの型は、ポリサッカライドの還元的アミノ化を含み、結果として生じるアミノ基をアジピン酸リンカー基の一端と結合させ、次いで、タンパク質をアジピン酸リンカー基の他端と結合させる［５５、５６］。他のリンカーとして、以下が挙げられる：Ｂ−プロピオンアミド［５７］、ニトロフェニル−エチルアミン［５８］、ハロアシルハライド［５９］、グリコシド結合［６０］、６−アミノカプロン酸［６１］、ＡＤＨ［６２］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［６３］等。リンカーを用いる代わりに直接結合を用いることも可能である。タンパク質への直接結合は、例えば、参照文献６４および６５に記述されるように、ポリサッカライドの酸化と、それに続くそのタンパク質による還元的アミノ化を含む。
【００７１】
アミノ基のサッカライドへの導入（例えば、末端＝０基を−ＮＨ２と置換することによる）、それに続くアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化、およびキャリアタンパク質との反応を含むプロセスが、好ましい。
【００７２】
結合の後、遊離サッカライドと結合サッカライドとは分離される。この分離のために多数の適切な方法があり、その方法として疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過法、ダイアフィルトレーション（参照文献６６、６７等も参照）等が挙げられる。
【００７３】
本発明の組成物が脱重合したサッカライドを含む場合、脱重合が結合に先行することが好ましい。
【００７４】
本発明の組成物への包含に適した適切なサッカライドコンジュゲート抗原の調製は、参照文献６８に記述されている。
【００７５】
タンパク質抗原
本発明の組成物に含まれる抗原が、タンパク質抗原である場合、以下から選択される：
−参照文献６９〜７５に記述されるもののように、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来するタンパク質抗原。参照文献７３の標準命名法を用いて、ＮＭＢ２１３２、ＮＭＢ１８７０、およびＮＭＢ０９９２は、適切な抗原の基本として使用される３つの好ましいタンパク質である。
−肺炎球菌に由来するタンパク質抗原（参照文献７６に開示されるように、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０、およびＳｐ１３３に由来する）。
−Ａ型肝炎ウイルス（不活性化ウイル等）に由来する抗原［例えば、参照文献７７および７８；８６の第１５章］。
−Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）［例えば、参照文献７８、７９；８６の第１６章］。
−Ｃ型肝炎ウイルスに由来する抗原［例えば８０］。使用されるＣ型肝炎ウイルス抗原は、以下から１つまたは複数を含んでよい：ＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２タンパク質、Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体複合体、コアタンパク質と非構造タンパク質（非構造たんぱく質は、酵素活性を除去するために任意に修飾されるが、免疫原性は保持する）［例えば８１、８２、および８３］、またはこれらの抗原の断片。
−百日咳菌に由来する抗原（百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および百日咳菌に由来する線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、任意にパータクチンおよび／または凝集原２および３の組み合わせ）［例えば参照文献８４および８５；参照文献８６の第２１章］。
−ジフテリア抗原（ジフテリアトキソイド等）［例えば参照文献８６の第１３章］。
−破傷風抗原（破傷風トキソイド等）［例えば参照文献８６の第２７章］。
−淋病に由来する抗原［例えば６９、７０、７１］。
−肺炎クラミジアに由来する抗原［例えば８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３］。
−トラコ−マクラミジアに由来する抗原［例えば９４］。
−ジンジバリス菌に由来する抗原［例えば９５］。
−ポリオ抗原（単数または複数の）［例えば参照文献９６、９７；８６の第２４章］（ＩＰＶ等）。
−狂犬病抗原（単数または複数の）［例えば９８］（凍結乾燥不活性化ウイルス等）［例えば９９、ＲａｂＡｖｅｒｔ（登録商標）］。
−麻疹、流行性耳下腺炎、および／または風疹抗原［例えば参照文献８６の第１９、２０、および２６章］。
−ピロリ菌に由来する抗原（ＣａｇＡ［１００〜１０３］、ＶａｃＡ［１０４、１０５］、ＮＡＰ［１０６、１０７、１０８］、ＨｏｐＸ［例えば１０９］、ＨｏｐＹ［例えば１０９］、および／またはウレアーゼ等）。
−インフルエンザ抗原（単数または複数の）［例えば参照文献８６の第１７、１８章］（赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）。
−カタル球菌に由来する抗原［例えば１１０］。
−ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）に由来するタンパク質抗原［例えば１１１、１１２］。
−化膿性連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）に由来する抗原［例えば１１２、１１３、１１４］。
−黄色ブドウ球菌に由来する抗原［例えば１１５］。
−パラミクソウイルスに由来する抗原（単数または複数の）（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ［１１６、１１７］）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［１１８］））。
−炭疽菌に由来する抗原［例えば１１９、１２０、１２１］。
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）のウイルスに由来する抗原（黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスの４血清型、ダニ媒介性脳炎、ウエストナイルウイルス等に由来）。
−ペスチウイルス抗原（古典的ブタ熱ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、および／またはボーダー病ウイルスに由来等）。
−パルボウイルス抗原（パルボウイルスＢ１９由来等）。
−単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗原。本発明での使用に好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ２型株に由来するｇＤ（「ｇＤ２」抗原）を使用することが好ましい。組成物は、Ｃ末端膜アンカー領域が除去された［１２２］ｇＤ（例えば、Ｃ末端にアスパラギンおよびグルタミンの付加を有する天然タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含む切断型ｇＤ）の形態を使用することが可能である。この形態のタンパク質は、切断されて成熟２８３アミノ酸タンパク質を産生するシグナルペプチドを含む。アンカーの除去は、タンパク質が可溶型に調製されることを可能にする。
−ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原。本発明での使用に好ましいＨＰＶ抗原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として周知の構造を形成するために構築することが可能なＬ１カプシドタンパク質である。ＶＬＰは、酵母細胞（出芽酵母等）で、または昆虫細胞（例えば、ヨトウガ等のスポドプテラ細胞で、またはショウジョウバエ細胞で）でＬ１の組換え発現によって産生される。酵母細胞のために、プラスミドベクターはＬ１遺伝子（単数または複数の）を有する。昆虫細胞のために、バキュロウイルスベクターはＬ１遺伝子（単数または複数の）を有する。より好ましくは、組成物は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８の両株に由来するＬ１ ＶＬＰを含む。この二価の組み合わせは、効果が高いことが示されている［１２３］。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８の株に加えて、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の株に由来するＬ１ ＶＬＰを含むことも可能である。発癌性ＨＰＶ株の使用も可能である。ワクチンは、ＨＰＶ株あたり２０〜６０μｇ／ｍｌ（例えば、約４０μｇ／ｍｌ）のＬ１を含んでよい。
【００７６】
組成物は、必要に応じて解毒される（例えば、化学的および／または遺伝学的な方法による百日咳毒素の解毒）これらの抗原から１つまたは複数を含んでよい。
【００７７】
混合物にジフテリア抗原が含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含むことが好ましい。
【００７８】
混合物中の抗原は、通常は、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分な濃度である。
【００７９】
混合物中のタンパク質抗原を使用する代わりに、抗原をコードする核酸が使用される。混合物のタンパク質成分は、従って、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えばプラスミドの形態のＤＮＡ）によって置換される。同様に、本発明の組成物は、抗原を模倣する（例えばミモトープ［１２４］または抗イディオタイプ抗体）タンパク質を含んでよい。
【００８０】
あるいは、または上記の抗原に加えて、組成物は、参照文献１２５、１２６、１２７、１２８等に開示されるような髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する外膜小胞（ＯＭＶ）調製物を含んでよい。
【００８１】
付加的な組成物
さらに本発明の目的は、Ｂ群連鎖球菌、髄膜炎菌血清型Ｂ株および／またはインフルエンザウイルスからの保護を与えるワクチン組成物を提供することである。ＣＤ１ｄリガンドが、これらの病原体に由来する抗原に対して驚くほど有効なアジュバントであることが判明している。
【００８２】
以下に記述する組成物は、Ｂ群連鎖球菌、髄膜炎菌血清型Ｂ株またはインフルエンザウイルスに由来する抗原を少なくとも１つ含む。これらの組成物は、付加的な抗原を含んでよい。例えば、これらの組成物は、長期免疫記憶の誘導で使用する組成物に包含するために上述のような１つまたは複数のキャリアに結合される１つまたは複数のサッカライド抗原も含んでよい。あるいは、または加えて、これらの組成物は、上述のタンパク質抗原から１つまたは複数のタンパク質抗原を含んでよい。
【００８３】
Ｂ群連鎖球菌
従って、本発明は以下を含む組成物を提供する：ａ）ＣＤ１ｄリガンド、およびｂ）Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原。．
組成物に包含するＢ群連鎖球菌に由来する抗原の例は、参照文献１１１および１１２に見出せる。このように、組成物は、以下から１つまたは複数を含むタンパク質を含んでよい：（ｉ）参照文献１１２の連鎖球菌アミノ酸配列（参照文献１１２の偶数の配列番号２〜１０９６０）；（ｉｉ）（ｉ）の連鎖球菌アミノ酸配列に少なくと８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；（ｉ）の連鎖球菌アミノ酸配列からのエピトープを含むアミノ酸配列。好ましくは、組成物は、参照文献１１２に記述されるようにＧＢＳ１からＧＢＳ６８９のタンパク質から１つまたは複数を含む（参照文献内の表ＩＶを参照）。より好ましくは、組成物はＧＢＳ８０タンパク質抗原を含む。
【００８４】
髄膜炎菌
本発明は、また、以下を含む組成物を提供する：ａ）ＣＤ１ｄリガント、およびｂ）髄膜炎菌に由来する抗原。
【００８５】
組成物に含まれる髄膜炎菌に由来する抗原は、タンパク質抗原または外膜小胞（ＯＭＶ）調製物であってよい。組成物に含まれるＯＭＶ調製物の例は、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹに由来するＯＭＶ調製物を含む。組成物に含まれる髄膜炎菌に由来するタンパク質抗原の例も、上述される。好ましくは、タンパク質抗原は、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来し、患者に投与されると、髄膜炎菌血清型Ｂ細胞と交差反応する免疫応答を誘発する。髄膜炎菌血清型Ｂ細胞と交差反応する免疫応答を誘発する好ましいタンパク質抗原は、「ΔＧ２８７ｎｚ−９５３」、「９３６−７４１」、および「９６１ｃ」タンパク質抗原を含む［１２９］。好ましくは、組成物は、髄膜炎菌に由来する複数の抗原を含む。好ましくは、組成物は、「ΔＧ２８７ｎｚ−９５３」、「９３６−７４１」、および「９６１ｃ」の３つのタンパク質抗原のすべてを含む。他の有用なタンパク質抗原は、ＮＭＢ２１３２、ＮＭＢ１８７０、およびＮＭＢ０９９２に基づく。
【００８６】
インフルエンザウイルス
本発明は、また、以下を含む組成物を提供する：ａ）ＣＤ１ｄリガント、およびｂ）インフルエンザウイルス抗原。
【００８７】
インフルエンザウイルス抗原は、通常は、インフルエンザビリオンから調製されるが、別の方法として、赤血球凝集素等の抗原が組換え宿主細胞で（例えば、バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞系で）発現され、精製された形で使用される［１３０、１３１］。しかしながら、概して、抗原はビリオン由来である。
【００８８】
抗原は、生きているウイルスの形態、またはより好ましくは、不活性化ウイルスの形態をとってよい。不活性化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、全ビリオン、分割ビリオン、または精製表面抗原（赤血球凝集素を含む、および通常は、ノイラミニダーゼも含む）を含んでよい。インフルエンザ抗原は、また、ビロソームの形態で提示される［１３２］。
【００８９】
インフルエンザウイルスは、減弱されることが可能である。インフルエンザウイルスは、温度感受性にすることが可能である。インフルエンザウイルスは、低温適応にすることが可能である。これらの３つの可能性は、特に生きているウイルスに適用される。
【００９０】
ワクチンで使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節ごとに変化する。現在の大流行間期では、ワクチンは、概して２つのインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２亜型）および１つのインフルエンザＢ型株を含むワクチン、および三価ワクチンが典型的である。本発明は、また、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９型のサブタイプ株（特に、インフルエンザＡ型ウイルスのサブタイプ株）等のパンデミック株（すなわち、ワクチンの受容者およびヒト母集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用される。パンデミック株に対するインフルエンザワクチンは、一価であってよく、または通常の三価ワクチンを基にしてパンデミック株を追加してもよい。しかしながら、季節およびワクチンに含まれる抗原の性質によって、本発明は、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６型から１つまたは複数に対して保護される。
【００９１】
通常、組成物に含まれることが可能な他の株は、抗ウイルス療法に耐性を示す（例えば、オセルタミビル［１３３］および／またはザナミビルに耐性を示す）株であり、耐性パンデミック株［１３４］が含まれる。
【００９２】
本発明のアジュバントされた組成物は、特に、パンデミック株に対して免疫するのに有用である。パンデミックな発生を引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下の通りである：（ａ）現在循環しているヒト株における赤血球凝集素と比較して、それは、新しい赤血球凝集素を含む（すなわち、１０年以上の間ヒト集団で明らかでなかったもの（例えばＨ２型）、または以前にはヒト集団で全く見られなかったもの（一般的に、トリ集団でのみ見つけられていた例えば、Ｈ５、Ｈ６、またはＨ９型）、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであるようなもの）；（ｂ）それは、ヒト集団で横方向に伝染することができる；（ｃ）それは、ヒトに対して病原体である。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、Ｈ５Ｎ１亜型株等のパンデミックインフルエンザに対して免疫性を与えるために好まれる。他の可能な株として、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、およびＨ７Ｎ７亜型、ならびにその他可能性のある新たなパンデミック株が挙げられる。
【００９３】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１つまたは複数（例えば１、２、３、または４以上）のインフルエンザウイルス株に由来する抗原を含んでよい。ワクチンが複数のインフルエンザ株を含む場合、異なる株は、通常、別々に増殖され、ウイルスを収集して、抗原を調製してから、混合される。従って、本発明のプロセスは、複数のインフルエンザ株に由来する抗原を混合するステップを含んでよい。
【００９４】
インフルエンザウイルスは、リアソータントな株であり得、かつ逆遺伝学技法によって得られる可能性がある。逆遺伝学技法［例えば１３５〜１３９］は、所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを、プラスミドを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することを可能にする。通常、それは、（ａ）所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子（例えばｐｏＩＩプロモーターから）、および（ｂ）ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子（例えばｐｏＩＩＩプロモーターから）を発現させ、細胞での両型のＤＮＡの発現が、完全にインタクトな感染性ビリオンの構築につながるように関与する。好ましくは、ＤＮＡは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質のすべてをもたらすが、一部のＲＮＡおよびウイルスタンパク質をもたらすためにヘルパーウイルスを使用することも可能である。各々のウイルスＲＮＡを生成するために別々のプラスミドを使用する、プラスミドに基づく方法が好まれる［１４０〜１４２］。これらの方法は、また、ウイルスタンパク質のすべてまたは一部を（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰタンパク質だけを）発現させるためにプラスミドの使用（一部の方法では使用される最大１２までのプラスミド）を含む。必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［１４３］は、同一のプラスミド上で複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成のための）（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのすべてのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミドの上でＲＮＡポリメラーセＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのすべてのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）とを組み合わせる。参照文献１４３の方法の好ましい態様は、以下を含む：（ａ）単一のプラスミド上で、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ ｍＲＮＡをコードする領域；および（ｂ）単一のプラスミド上で、ｖＲＮＡをコードする８つのすべてのセグメント。単一のテンプレートからウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするためにｐｏＩＩおよびｐｏＩＩＩの二重プロモーターを使用することは可能である［１４４、１４５］。
【００９５】
従って、特にウイルスが卵で増殖されるとき、ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つまたは複数のＲＮＡセグメント（通常は、１つのワクチン株からＨＡおよびＮセグメントを有するＡ／ＰＲ／８／３４に由来する６セグメント、すなわち６：２のリアソータント）を含んでよい。ウイルスは、また、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスから、またはワクチン調製のためのリアソータントなウイルスを生成するのに有用である任意の他のウイルス株から１つまたは複数のＲＮＡセグメントを含んでよい。主として、本発明は、ヒト間の伝染が可能である株から保護し、従ってその株のゲノムは、通常、哺乳類（例えばヒト）インフルエンザウイルスに由来した少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。
【００９６】
抗原の源として使用されるウイルスは、卵または細胞培養物のいずれかの上で増殖される。インフルエンザウイルス増殖の現在の標準方法は、卵の内容物（尿膜液）から精製されるウイルスとともに有胚ニワトリ卵を使用する。しかしながら、つい最近では、速さと患者のアレルギーの理由でウイルスは動物細胞培養で増殖されており、この増殖方法が好ましい。
【００９７】
細胞基質は、通常、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、ＢＨＫ、ベロ、ＭＲＣ−５、ＰＥＲ．Ｃ６、ＷＩ−３８等の哺乳類細胞系である。インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましいノ哺乳類細胞系としては、以下が挙げられる：メイディン・ダービー・イヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［１４６〜１４９］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓に由来するベロ細胞［１５０〜１５２］；またはヒト胎児網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［１５３］。これらの細胞系は、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）［１５４］、コーリエル細胞集積［１５５］、または欧州動物細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６、およびＣＲＬ−１５８７で様々なベロ細胞を供給し、またカタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、ＥＣＡＣＣから寄託番号９６０２２９４０で入手可能である。哺乳類細胞系に代わるあまり好ましくないものとして、ウイルスはトリ細胞系［例えば参照文献１５６〜１５８］で増殖されることが可能であり、アヒル（例えばアヒル網膜）またはニワトリ（例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））等に由来する細胞系が含まれる。
【００９８】
ウイルスが哺乳類細胞系で増殖された場合には、組成物は、卵タンパク質（例えば卵白アルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを有利に含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。
【００９９】
ＭＤＣＫ等の細胞系での増殖に関して、ウイルスは、懸濁液培養［１４６］または付着培養の細胞上で増殖される。懸濁液培養に適したＭＤＣＫ細胞系の１つは、ＭＤＣＫ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９として寄託された）である。別の方法として、マイクロキャリア培養が使用される。
【０１００】
ウイルスが細胞系で増殖される場合、増殖培養は、好ましくは以下を含まない（すなわち、混入に対する検査を行い、陰性を示すことになる）：単純ヘルペスウイスル、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルス。単純ヘルペスウイルスがないことは、特に好ましい。
【０１０１】
ウイルスが細胞系で増殖される場合、組成物は、好ましくは、投与量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含有する。しかし、微量の宿主細胞ＤＮＡは存在する。通常、本発明の組成物から除外することが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００塩基対より長いＤＮＡである。
【０１０２】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤にとって所定の規定要件であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために用いられるアッセイ法は、通常は，実証済みアッセイである［１５９、１６０］。実証済みアッセイのパフォーマンス特性は、数学的用語および定量化可能な用語で記述されることが可能であり、エラーのその可能性のある源は同定されることになる。アッセイは、通常、正確さ、精度、特異性等の特性に対して検査されることになる。一旦アッセイが校正されて（例えば、周知の宿主細胞ＤＮＡの標準量に対して）検査されると、定量的なＤＮＡ測定は日常的に実行されることが可能になる。ＤＮＡ定量化の３つの原則技術は、ササンブロット（またはスロットブロット）［１６１］等のハイブリダイゼーション法；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システム［１６２］等のイムノアッセイ法；および定量ＰＣＲ法［１６３］が使用されることが可能である。これらの方法は、すべて当業者によく知られているが、各方法の詳細な特性は、問題（例えば、ハイブリダイゼーション用プローブの選択、増幅用プライマーおよび／またはプローブの選択等）の宿主細胞に依存することである。モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡ用定量アッセイであり、生物医薬品で混入しているＤＮＡのレベルのモニタリングで使用されている［１６２］。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間の反応複合体の非配列特異的形成に関与する。アッセイのすべての成分は、製造業者から入手可能な完全な全ＤＮＡアッセイキットに含まれる。様々な商業製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出する定量ＰＣＲアッセイを提供している（例えば、ラボラトリーサービシス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）のＡｐｐＴｅｃ（登録商標）、アルセアテクノロジーズ（Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（登録商標）、等）。ヒトウイルス性ワクチンの宿主細胞ＤＮＡ混入を測定するための化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（登録商標）システムとの比較は、参照文献１６４に見出すことができる。
【０１０３】
混入しているＤＮＡは、ワクチン調製の間に標準精製方法（例えばクロマトグラフィー等）を用いて除去される。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えばデオキシリボヌクレアーゼを用いて）増進させることが可能である。宿主細胞ＤＮＡ混入を減少させる簡便な方法は、参照文献１６５および１６６に開示されている。その方法は、まず、デオキシリボヌクレアーゼ（例えばベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を用いて、次いでカチオン性界面活性剤（例えばＣＴＡＢ）を用いる、２段階処理を含む。
【０１０４】
１５μｇ赤血球凝集素あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンは好ましく、同様に０．２５ｍｌ容量あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンが好ましい。５０μｇ赤血球凝集素あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンは、より好ましく、同様に０．５ｍｌ容量あたり宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含むワクチンが好ましい。
【０１０５】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、無血清培地および／または無タンパク質培地で増殖される。培地は、本発明と関連して無血清培地（ヒトまたは動物に由来する血清からの添加物が含まれない）と呼ばれる。無タンパク質は、細胞の増殖が生じる培養（タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、および非血清タンパク質を除くが、ウイルスの増殖にとって必要であるトリプシンまたは他のタンパク質分解酵素等のタンパク質は任意に含まれる）を意味すると理解される。そのような培養物中で増殖する細胞は、自然にタンパク質をそれ自体に含む。
【０１０６】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、３７℃以下［１６７］（例えば３０〜３６℃）で増殖される。
【０１０７】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活性化インフルエンザワクチンの主要な免疫原であり、ワクチンの投与量は、通常は一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるように、ＨＡ濃度を参照して標準化される。ワクチンは、一般的に、株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、低用量ワクチンも、例えば小児用として、または大流行の場合に使用される。１／２（例えば株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４、および１／６等の分割量は、高用量（例えば３倍または９倍用量［１７０、１７１］）と同じように、使用されている［１６８、１６９］。従って、ワクチンは、インフルエンザ株あたり０．１〜１５０μｇのＨＡ、好ましくは、０．１〜５０μｇ（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等）のＨＡを含んでよい。特定用量は、例えば、株あたり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５μｇ等を含む。従って、ワクチンは、インフルエンザ株あたり０．１〜２０μｇのＨＡ、好ましくは、０．１〜１５μｇ（例えば、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ等）のＨＡを含んでよい。特定用量は、例えば、株あたり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９μｇ等を含む。これらの低用量は、ワクチンにアジュバントが存在するとき、本発明と同様に最も有用である。
【０１０８】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスに見つけられるような自然のＨＡであり得、または修飾されたものでもよい。例えば、ウイルスを鳥類で発病させることが高い決定因子（例えば超塩基性領域）を除去するためにＨＡを修飾することが周知であるが、これらの決定因子が、さもなければウイルスが卵内で増殖されるのを阻止することができるからである。
【０１０９】
不活性化されているが非全細胞のワクチン（例えば、分割ウイルスワクチン、または精製表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置している付加的なＴ細胞エピトープから利益を得るために、基質タンパク質を含んでよい。従って、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、分割ワクチン）は、さらに、Ｍ１および／またはＭ２基質タンパク質を含んでよい。基質タンパク質が存在する場合、Ｍ２基質タンパク質の検出可能な濃度を含むことは、好ましい。核タンパク質もまた、存在する。
【０１１０】
医薬組成物の製剤
上述の抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、特に、免疫原性組成物およびワクチンに含まれることに適している。本発明のプロセスは、従って、免疫原性組成物またはワクチンとして抗原およびＣＤ１ｄリガンドを製剤化するステップを含んでよい。本発明は、このような方法で得られることが可能な組成物またはワクチンを提供する。
【０１１１】
抗原（単数または複数の）およびＣＤ１ｄリガンドに加えて、本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、通常は、それ自体はその組成物を受ける個体にとって有害な抗体の生成を誘発しない任意のキャリアを含む「薬学的に許容されるキャリア」を含む。適切なキャリアは、通常は、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、トレハロース［１７２］、脂質集合体（油滴またはリポソーム等）、および不活性ウイルス粒子等の大きくて、ゆっくりと代謝される高分子である。そのようなキャリアは、当業者にとって周知である。ワクチンは、また、水、生理食塩水、グリセリン等の希釈液を含有する。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の補助剤が存在する。薬学的に許容される賦形剤についての徹底的な考察は、参照文献１７３で入手可能である。
【０１１２】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効量の抗原ならびに必要に応じて上記任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効量」は、単回投与で、または一連の投与の一部としてのいずれかで個体に投与されるその量が治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康および身体状態、年齢、治療される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、治療医の医学的状況の評価、および他の関連する様々な因子によって変動する。その量は、通例の治験を通して決定され得る比較的広範囲に収まると予想される。
【０１１３】
ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与される。ＣＤ１ｄリガンドは、本発明の免疫原性組成物の範囲内のアジュバントとして作用する。ワクチンは、付加的なアジュバントを含んでよい。そのようなアジュバントとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
本発明で使用されるアジュバントとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
・カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）を含むミネラル含有組成物。カルシウム塩は、カルシウムホスフェート（例えば、参照文献１７４に開示される「ＣＡＰ」粒子等）を含む。アルミニウム塩は、任意の適切な形態（例えばゲル形態、結晶形態、非晶形等）をとる塩を有する水酸化物、ホフォスフェート、硫酸塩を含む。これら塩への吸着は、好まれる。ミネラルを含む組成物は、また、金属塩［１７５］の粒子として製剤化される。アルミニウム塩アジュバントは、以下にさらに詳細に記述される。
・以下にさらに詳細に記述されるように水中油型乳剤。
・ＣｐＧモチーフ（グアノシンに結合したホスフェートによって結合される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むもの、ＴｐＧモチーフ［１７６］、二本鎖ＲＮＡ、パリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド等の免疫賦活性オリゴヌクレオチド。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾等のヌクレオチド修飾／類似体を含むことが可能であり、かつ二本鎖または（ＲＮＡを除いて）一本鎖であってよい。参照文献１７７〜１７９は可能な類似体置換（例えば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンの置換）を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに、参照文献１８０〜１８５に述べられている。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ［１８６］）に向けられる。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）等のＴｈ１免疫応答の誘発に特異的であってよく、または前述の配列は、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ等のＢ細胞応答の誘導により特異的であってよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参照文献１８７〜１８９で考察されている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用できるように構築される。任意に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー」を形成するためにそれらの３’末端で結合されてよい。例えば、参照文献１９０〜１９２を参照。有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ７９０９であり、ＰｒｏＭｕｎｅ（登録商標）（コーリー・ファマシューティカル・グループ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｏｕｐ Ｉｎｃ．））としても周知である。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも２０のヌクレオチドを含む。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、１００未満のヌクレオチドを含む。
・３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄＭＰＬ」、「ＭＰＬ（登録商標）」としても周知である）［１９３〜１９６］。３ｄＭＰＬは、サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のヘプトースがない変異体から調製されたもので、化学的に脂質Ａに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠く。３ｄＭＰＬの調製は、最初に参照文献１９７に記述された。３ｄＭＰＬは、関連した分子の混合物の形をとることが可能であり、それらのアシル化によって変わる（例えば、異なる長さになるであろう３、４、５、または６つのアシル鎖を有する）。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても周知である）モノサッカライドは、それらの２位置の炭素で（すなわち２と２’の位置で）Ｎ−アシル化され、かつ３’の位置にもＯ−アシル化がある。
・イミキモド（「Ｒ−８３７」）［１９８、１９９］等のイミダゾキノリン化合物、レシキモド（「Ｒ−８４８」）［２００］、およびそれらの類似体；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫賦活性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参照文献２０１〜２０５に見出される。
・参照文献２０６に開示されるようなチオセミカルバゾン化合物。活性化合物の製剤化、製造、およびスクリーニングの方法も、参照文献２０６に記述されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球細胞の刺激に特に有効である。
・参照文献２０７に開示されるもの等のトリプタントリン化合物。活性化合物の製剤化、製造、およびスクリーニングの方法も、参照文献２０７に記述されている。トリプタントリンは、ＴＮＦ−α等のサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核球細胞の刺激に特に有効である。
・ヌクレオシド類似体、例えば（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１１４】
【化３】
、およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参照文献２０８〜２１０に開示される化合物；（ｆ）以下の式を有する化合物：
【０１１５】
【化４】
（式中：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルである；
Ｒ３は、欠けている、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルである；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであるか、またはＲ４−５にあるように、結合されて５員環を形成する；
【０１１６】
【化５】
結合で達成される結合は、
【０１１７】
【化６】
で示される。
Ｘ１およびＸ２は、各々独立してに、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳである；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄである；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、またはＲ９ａである；
ここでＲ９ａは、
【化７】
【０１１８】
結合で達成される結合は、
【化８】
【０１１９】
で示される。
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立してに、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨである；
ＲａおよびＲｂは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールである；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、または置換，Ｃ１−６アルキルである；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリール、またはヘテロシクリルである；
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルである；
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、または置換，Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートである；
各ｎは、独立して０、１、２、または３である；
各ｐは、独立して０、１、または２である；
または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の薬学的に許容される塩、（ａ）〜（ｆ）の任意の互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に許容される塩。
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［２１１］。
・参照文献２１２に開示されている以下を含む化合物：
アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［２１３、２１４］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物、ピロール化合物［２１５］、アントラキノン化合物、キノサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン化合物、およびベンザゾール化合物［２１６］。
・参照文献２１７に開示されている以下を含む化合物：３，４−ジ（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、スタウロスポリン類似体、誘導体化ピリダジン、クロメン−４−オン、インドリノン、キナゾリン、およびヌクレオシド類似体。
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えばＲＣ−５２９［２１８、２１９］。
・例えば、参照文献２２０および２２１に記述されるようにホスファゼン（例えば、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」））。
・以下のような小分子免疫賦活剤（ＳＭＩＰ）：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリンキノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−２−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−｛［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ｝エタノール
２−｛［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ｝エチルアセテート
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
・サポニン［参照文献２４９の第２２章］。広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、および花にも見つかるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種基である。バラ科キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンは、また、スミラックス・オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ）（サルサパリラ）、シュッコンカスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（ブライダルベール）、およびサボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（ソープルート）．に由来し商業的に入手可能である。サポニンアジュバント製剤は、精製製剤（ＱＳ２１等）ならびに脂質製剤（ＩＳＣＯＭ等）を含む。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）として市販されている。サポニン組成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されている。これらの技術を用いる特定の精製画分は同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参照文献２２２に開示されている。サポニン製剤は、またステロール（例えばコレステロール［２２３］）を含みんでよい。サポニンとコレステロールとの組み合わせは、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭ）［参照文献２４９の第２３章］と呼ばれる独特の粒子を形成するために使用される。ＩＳＣＯＭは、通常、リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）も含む。周知のどんなサポニンでも、ＩＳＣＯＭで使用される。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉ１Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣから１つまたは複数を含む。ＩＳＣＯＭは、さらに、参照文献２２３〜２２５に記述されている。任意に、ＩＳＣＯＭは、付加的な界面活性剤［２２６］がないこともある。サポニンに基づくアジュバントの開発の総説は、参照文献２２７および２２８に見出される。
・細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）、およびその解毒化誘導体（例えばＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２［２２９］として周知の変異毒素）。解毒化ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参照文献２３０に記述されており、非経口アジュバントとしての使用は、参照文献２３１に記述されている。
・生体接着剤および粘膜付着接着剤（エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［２３２］またはキトサンおよびその誘導体［２３３］）。
・微小粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの粒径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒径）で、生分解性および非毒性の物質から（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等）好ましくはポリ（ラクチド−コグリコリド）によって形成され、任意に、マイナスに帯電した表面を有するように（例えばＳＤＳによって）、またはプラスに帯電した表面を有するように（例えば、ＣＴＡＢ等のカチオン性界面活性剤によって）処理されている。
・リポソーム（参照文献２４９の第１３および１４章）。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参照文献２３４〜２３６に記述されている。
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［２３７］。そのような製剤は、さらに、オクトキシノール［２３８］と組み合わせてポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、ならびに少なくとも１つの付加的な非イオン界面活性剤（例えばオクトキシノール［２３９］）と組み合わせてポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤を含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
・ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン−Ｌ−アラニル−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、もしくは「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（登録商標）」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
・第１のグラム陰性菌から調製される外膜タンパク質プロテオソームと、第２のグラム陰性菌に由来するリポサッカライド（ＬＰＳ）調製との組み合わせで、外膜タンパク質プロテオソームおよびＬＰＳ調製が、安定な非共有結合アジュバント複合体を形成する。そのような複合体は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）外膜およびＬＰＳから構成される複合体、「ＩＶＸ−９０８」を含む。
・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」［２４０］）。
・以下のような式を有するポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［２４１］。
【０１２０】
【化９】
ここでＲは、水素基、直線鎖もしく分枝、非置換もしくは置換、飽和もしくは不飽和のアシル基、アルキル（例えばシクロアルキル）基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を含む群から選択される。
例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリン等。
・γイヌリン［２４２］またはその誘導体（例えばアルガムリン）。
・式Ｉ、ＩＩ、もしくはＩＩＩ、またはその塩：
【化１０】
【０１２１】
参照文献２４３に定義されるように、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」、または「ＥＲ８０４０５７」等：
【化１１】
【０１２２】
・ＯＭ−１７４等の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する脂質Ａの誘導体［参照文献２４４および２４５に記述されている］。
・陽イオン性脂質および（通常、中性の）コリピド（アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパンアミニウムブロマイド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（登録商標）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパンアミニウムブロマイド−ジオレオイルホスファチジル−エタノ−ルアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）の製剤。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（シン−９−テトラデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウム塩を含有する製剤が好ましい［２４６］。
・非環式バックボーンを含むホスフェートに結合した脂質を含む化合物（例えばＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［２４７、２４８］）：：
【０１２３】
【化１２】
これらおよび他のアジュバント活性物質は、参照文献２４９および２５０により詳細に考察されている。
【０１２４】
医療方法および用途
一旦製剤化されると、本発明の組成物は、被験者に直接投与される。治療される被験者は、動物であり得、特にヒト被験者が治療される。ワクチンは、特に、小児およびティーンエイジャーに予防接種をするのに有用である。ワクチンは、ＭＨＣＩＩ−／−動物モデルにおいて有効であることが示されており、従って、ワクチンは免疫無防備状態の被験者を治療するのに有用であると考えられる。ワクチンは、全身経路および／または粘膜経路で送達される。
【０１２５】
通常は、免疫原性組成物は、溶液または懸濁液のいずれかで注射液として調製され、注入の前に、溶液にもしくは懸濁液に適した固形、液体媒体も調製される。調製は、また、アジュバントの効果を増強するために乳化される、またはリポソームにカプセル化される。組成物の直接送達は、通常、非経口である（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかに注射で、または組織の間質腔に送達される）。組成物は、病巣に投与されることも可能である。他の投与様式は、経口投与と肺内投与、座薬、および経皮投与または経皮的投与［例えば参照文献２５１を参照］、注射針、および皮下噴射器を含む。投与治療は、単回投与スケジュール、または複数回投与スケジュール（例えば追加免疫投与を含む）であってよい。
【０１２６】
本発明のワクチンは、好ましくは、無菌である。ワクチンは、好ましくは、発熱物質を含まない。ワクチンは、好ましくは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８の間で、通常、約ｐＨ７で緩衝される。
【０１２７】
本発明のワクチンは、低濃度（例えば＜０．００１％）で界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ）を含んでよい。本発明のワクチンは、特に、凍結乾燥させる場合には、糖アルコール（例えばマンニトール）またはトレハロースを、例えば約１５ｍｇ／ｍｌで含んでよい。
【０１２８】
個々の抗体の適量は、経験的に評価されることが可能である。しかしながら、一般に、本発明の抗原は、投与あたり各抗原を０．１〜１００μｇの用量を０．５ｍｌの典型的な投薬容量で投与される。用量は、通常、投与あたり各抗原５〜２０μｇである。
【０１２９】
免疫応答を誘発するために患者に投与されるＣＤ１ｄリガンドの量は、その組成物が投与される患者の年齢および体重に応じて変化するが、通常は、１〜１００μｇ／ｋｇ患者体重で含まれる。意外にも、低用量のＣＤ１ｄリガンドが、同時投与される抗原に対する免疫応答を増強させ、かつその抗原に対する長期免疫記憶を促進するのに十分であることが判明した。本発明の組成物に含まれるＣＤ１ｄリガンドの量は、従って、患者体重の５０μｇ／ｋｇ未満、２０μｇ／ｋｇ未満、１０μｇ／ｋｇ未満、５μｇ／ｋｇ未満、４μｇ／ｋｇ未満、または３μｇ／ｋｇ未満であってよい。
【０１３０】
本発明によるワクチンは、予防用（すなわち感染を阻止するため）または治療用（すなわち感染後、疾患を治療するため）のいずれかであってよいが、通常は、予防用である。
【０１３１】
本発明は、医学分野で使用するためにＣＤ１ｄリガンド、およびＢ群連鎖球菌に由来する抗原を提供する。本発明は、医学分野で使用するためにＣＤ１ｄリガンド、および髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原を提供する。本発明は、医学分野で使用するために、ＣＤ１ｄリガンド、およびパンデミックな発生を引き起こすことができるまたは可能性を有するインフルエンザ株から選択されたインフルエンザウイルスに由来する抗原を提供する。
【０１３２】
本発明は、また、本発明によるワクチンを患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。特に、本発明は、ＣＤ１ｄリガンド、およびＢ群連鎖球菌に由来する抗原を患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。本発明は、ＣＤ１ｄリガンド、および髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原を患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。本発明は、ＣＤ１ｄリガンド、およびパンデミックな発生を引き起こすことができるまたは可能性を有するインフルエンザ株から選択されたインフルエンザウイルスに由来する抗原を患者に投与することを含む、患者に免疫応答を引き起こす方法を提供する。
【０１３３】
抗原およびＣＤ１ｄリガンドは、同時に、連続して、または別々に投与される。例えば、そのコンジュゲートに対する哺乳類の免疫応答を高めるために、抗原投与の前、または抗原投与の後に、ＣＤ１ｄリガンドが哺乳類を予備刺激するために投与されることも可能である。複数の抗原が投与される場合、抗原は、抗原混合物と別々に、同時に、または連続して投与されるＣＤ１ｄリガンドとともに同時に投与される。免疫応答を引き起こす方法は、抗原およびＣＤ１ｄリガンドの第１の用量を投与すること、それに続いて、任意に非アジュバント化抗原の第２の用量を投与することを含む。抗原およびＣＤ１ｄリガンドの第１の用量は、同時に、連続して、または別々に投与される。
【０１３４】
免疫応答は、好ましくは、防御応答であり、かつ液性免疫応答および／または細胞免疫応答を含んでよい。患者は、成人または小児であってよい。患者は、０〜６カ月、６〜１２カ月、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または５５歳を超える年齢であってよい。好ましくは、患者は小児である。
【０１３５】
患者は、免疫無防備状態であってよい。患者は、免疫系の機能不全に関連した障害、特に、ＣＤ４Ｔ細胞応答の機能不全に関連した障害を有することもある。そのような障害の例として以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＡＩＤＳ、血管拡張性失調症、ディジョージ症候群、汎低γグロブリン血症、ウィスコットアルドリッヒ症候群、および補体欠損症。
【０１３６】
本発明は、患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原の使用を提供し、この薬物は、ＣＤ１ｄリガンドとともに投与される。本発明は、患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供し、この薬物は、Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原とともに投与される。本発明は、患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原およびＣＤ１ｄリガントの使用を提供する。本発明は、また、ＣＤ１ｄリガントで事前処置された患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原の使用を提供する。本発明は、Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原で事前処置された患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。発明は、Ｂ群連鎖球菌に由来する抗原およびＣＤ１ｄリガンドで事前処置された患者に免疫応答を引き起こすための薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原の使用を提供する。
【０１３７】
本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造で髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原の使用を提供し、この薬物はＣＤ１ｄリガンドとともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供し、この薬物は髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原とともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＢ群連鎖球菌に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、ＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造で髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原の使用を提供する。本発明は、さらに、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原で事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造で髄膜炎菌血清型Ｂ株に由来する抗原の使用を提供する。
【０１３８】
本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原の使用を提供し、この薬物はＣＤ１ｄリガンドとともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でＣＤ１ｄリガンドの使用を提供し、この薬物は、インフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原とともに投与される。本発明は、また、患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、ＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造でインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原の使用を提供する。本発明は、さらに、インフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原で事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造にＣＤ１ｄリガンドの使用を提供する。本発明は、また、インフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原、およびＣＤ１ｄリガンドで事前に処置された患者に免疫応答を引き起こす薬物の製造にインフルエンザウイルス（上述のように）に由来する抗原の使用を提供する。
【０１３９】
薬物は、好ましくは、免疫原性組成物（例えばワクチン）である。薬物は、好ましくは、Ｂ群連鎖球菌、髄膜炎菌（例えば、髄膜炎、敗血症）に、またはインフルエンザウイルスに起因する疾患の予防用および／または治療用である。
【０１４０】
ワクチンは、標準動物モデル（例えば、参照文献２５２を参照）で検査される。
【０１４１】
本発明は、さらに、Ｂ群連鎖球菌抗原およびＣＤ１ｄリガンドを含むキットを提供する。本発明は、さらに、髄膜炎菌血清型Ｂ株およびＣＤ１ｄリガンドを含むキットを提供する。本発明は、さらに、インフルエンザウイルスに由来する抗原およびＣＤ１ｄリガンドを含むキットを提供する。抗原およびリガンドは、好ましくは、別々の投与に適するように（例えば、別々の四肢に）、別々の構成成分からなるキットとして供給される。
【０１４２】
定義
用語「構成される」は、「含む」ならびに「成る」を包含する（例えば、Ｘで「構成される」組成物は、全くＸだけから成る、または例えばＸプラスＹ等の付加的なものを含んでよい）。
【０１４３】
数値「ｘ」に関して用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。
【０１４４】
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない（例えば、「実質的に」Ｙを含まない組成物は、Ｙを完全に含まないこともある）。必要に応じて、語「実質的に」は、本発明の定義から取り除かれることも可能である。
【０１４５】
本発明を実施するための様式
本発明を実施するための様式に関する付加的情報は、参照文献２５３に見出される。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１） インバリアントＮＫＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで防御抗体応答を助け、Ｂ細胞記憶の維持に寄与する
概要
ＣＤ１ｄ制限インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、生得的リンパ球であり、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧＣ）等の糖脂質抗原を認識する。ｉｎ ｖｉｖｏで適応免疫応答への自然免疫系の影響を研究するために、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞が抗体応答の重要な特徴（例えば、感染症からの保護およびＢ細胞記憶）に影響をおよぼすかどうかを評価した。α−ＧＣと組み合わせた細菌タンパク質またはウイルスタンパク質でマウスを免疫し、タンパク質およびα−ＧＣで免疫されたマウスが、タンパク質単独によって誘発される力価よりも１〜２ログ高い抗体価をもたらすことを発見した。最も重要なことは、それらのマウスは、インフルエンザ等の感染症からさらに保護されることである。ＭＨＣクラスＩＩが欠如しているマウスは、タンパク質および従来のアジュバントで免疫されるとき、抗体を産生しない。しかし、タンパク質およびα−ＧＣによるこれらのマウスの免疫化は、そのタンパク質に特異的な検出可能なＩｇＧを誘発し、ｉＮＫＴ細胞がＢ細胞に対するその助けをクラスＩＩ制限ＣＤ４＋ Ｔ細胞に部分的に置き換えることを示した。最終的に、タンパク質およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、タンパク質特異的記憶Ｂ細胞の頻度（タンパク質単独で免疫されたマウスで観察される頻度よりも高い）を有することが分った。さらに、ｉＮＫＴ細胞が欠如しているマウスは、野性型マウスで観察される減衰よりも急速な循環抗体価の減衰を示し、形質細胞の寿命の対するｉＮＫＴ細胞の予想外の影響を示唆した。つまるところ、これらの結果は、抗体応答の調節におけるｉＮＫＴ細胞の重要な役割およびｉｎ ｖｉｖｏでＢ細胞記憶の維持を指し示している。
【０１４７】
結果
ｉＮＫＴ細胞の活性化は、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質抗原に対する抗体応答を増強する
ヒトｉＮＫＴ細胞が、Ｂリンパ球の増殖およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫グロブリンの生成に役立つことを本発明者らは、最近、実証した。この結果のｉｎ ｖｉｖｏでの関連性を決定するために、ＮＫＴ特異的糖脂質（α−ＧＣ）を用いて、または用いずに、細菌タンパク質（ＴＴ（破傷風トキソイド）もしくはＤＴ（ジフテリアトキソイド））またはウイルスタンパク質（Ｈ３Ｎ２（インフルエンザＡ型株由来の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼサブユニット））でＣ５７／ＢＬ６マウスを免疫し、種々の時点におけるタンパク質特異的抗体の血清力価を評価した。図１Ａは、抗原のすべてで、タンパク質およびα−ＧＣで免疫されたマウス（黒四角）の抗体価が、タンパク質単独で免疫されたマウス（白四角）の抗体価よりも１〜２ログ高かったことを示す。同様の結果がＢＡＬＢ／ｃ、ＣＤｌ、およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスでも得られた（データ図示せず）。
【０１４８】
α−ＧＣのアジュバント活性がｉＮＫＴ細胞の活性化によるものであることを証明するために、（Ｊａ１８＋／＋およびＪａ１８＋／−）を有するマウスまたは（Ｊａ１８−／−）ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスを、α−ＧＣを用いて、または用いずにインフルエンザタンパク質Ｈ３Ｎ２で免疫した。図１Ｂに示すように、Ｈ３Ｎ２単独で免疫されたすべてのマウス（白四角）は、ｉＮＫＴ細胞の存在にかかわらず、同程度の抗体応答をもたらした。しかしながら、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで（黒四角）免疫化を行うと、ｉＮＫＴ細胞を有するマウスはＨ３Ｎ２特異的抗体の血清力価に有意な増強を示し、一方ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスは、そのように増強できないことを図１Ｂは示している。これらの結果は、α−ＧＣがＣＤ１ｄ（ＣＤ１−／−）が欠如したマウスにおいてアジュバント活性を示さなかった結果（データは図示せず）、α−ＧＣをｉＮＫＴ細胞のＴ細胞受容体に提示する制限要素によって強化された。
【０１４９】
α−ＧＣの活性と、従来のアジュバントの活性とを比較するために、α−ＧＣまたは以下のアジュバントから１つの適量を用いて、ＴＴ単独で用量を増加させながら、マウスを免疫した：ＣＦＡ（マウスで用いられる最も強力なアジュバントの１つ［２５４］）、ＣｐＧ（現在、ヒトで検査されている強力なＴｈ０／Ｔｈ１免疫賦活剤［２５５］）、ＭＦ５９とアルミニウム塩（この２つのアジュバントはヒト用途として承認されていて［２５６、２５７］、両方ともＴｈ０／Ｔｈ２誘導因子と考えられる）。図２Ａに示すように、α−ＧＣは、全般的に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両抗体の産生に役立つ上記の基準アジュバントと同様に強力である。
【０１５０】
最終的に、タンパク質抗原に対する抗体応答が、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞の助けがなくとも（従来のアジュバントが役立たない状況）ｉＮＫＴリンパ球の助けで発生するかどうかを評価した。従って、ＭＨＣクラスＩＩ分子が欠如した（ＭＨＣ−ＩＩ−／−）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両群にＨ３Ｎ２単独で、またはα−ＧＣもしくはアルミニウム塩とともにＨ３Ｎ２で２回免疫させた。予想通りに、Ｈ３Ｎ２単独またはアルミニウム塩中のＨ３Ｎ２で免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは、抗原特異的抗体を何ら示さなかった（図２Ｂ）。代わりに、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは、検出可能な抗体（ＩｇＧ）価を示した。
【０１５１】
つまるところ、α−ＧＣによるｉｎ ｖｉｖｏでのｉＮＫＴ細胞活性化は、従来のアジュバントのそれに匹敵する方法でタンパク質抗原に対する抗体応答を増強することをこれらの結果は示している。これらのアジュバントとは違って、α−ＧＣは、抗体応答を生成するために、ＭＨＣ−クラスＩＩ制限ＣＤ４Ｔリンパ球を必要としない。
【０１５２】
ｉＮＫＴ細胞は、免疫に役立つ
α−ＧＣが病原体タンパク質に対する抗体応答を増強することを実証して、本発明者らは応答の質に取り組み、これらの抗体が感染症から保護することができるかどうかを追究した。この目的を達成するために、α−ＧＣのアジュバント効果とＭＦ５９（インフルエンザワクチンによるヒト用途として承認されているアジュバント）のそれとをインフルエンザウイルス感染症のマウスモデルで比較した。０日目と１５日目に、α−ＧＣまたはＭＦ５９を用いてＨ１Ｎ１タンパク質（ヒトインフルエンザウイルスＡ型／ニューカレドニア／２０／９９由来の）単独で、成体Ｃ５７ＢＬ／９マウスを免疫した。最後の免疫化から２週間後、マウス適応型Ａ／ＷＳ／３３インフルエンザウイルスを９０％致死量（ＬＤ）でマウスに接種した。マウスの生存を２週間経過観察した。図３Ａに示すように、接種の１日前、Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスが有する抗体価は、Ｈ１Ｎ１およびＭＦ５９で免疫されたマウスの抗体価に匹敵し、かつタンパク質ワクチン単独で免疫されたマウスで見られた力価よりも有意に高いものである。さらに、接種から２週間後、Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスの８０％、およびタンパク質およびＭＦ５９で免疫されたマウスの１００％が生存し、一方タンパク質単独に基づいたワクチンで免疫されたマウスのわずか１０％が経過観察の終了後も生存していたことを図３Ｂは示している。
【０１５３】
つまるところ、これらの結果から、本発明者らは、α−ＧＣ依存ｉＮＫＴ細胞活性化が感染症疾患に対するワクチンの効果を増強することが可能であると結論づける。
【０１５４】
Ｂ細胞に役立つｉＮＫＴ細胞の機序
次に、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞をｉｎ ｖｉｖｏでＢ細胞を助けるように向かわせる機序を調べた。
【０１５５】
まず、サイトカインの役割を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびサイトカインＩＬ−４またはＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−γＲ）の受容体が欠如したコンジェニックマウスの両方でα−ＧＣのアジュバント効果を評価した。図４Ａ（左図）が示すように、野性型マウスにおいてインフルエンザタンパク質Ｈ３Ｎ２単独（白で示す）による免疫化が、ＩｇＧ１の存在およびＩｇＧ２ａの非存在によって示されるようにＴｈ２応答を誘発し、一方タンパク質およびα−ＧＣによる免疫化が、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（黒で示す）の両方の存在によって示されるようにバランスのとれたＴｈ０応答を誘発した。図４Ａの中央の図が示すように、ＩＬ−４が欠如したマウスは、タンパク質単独で免疫されたとき、何ら抗体応答がなかったのに対して、タンパク質およびα−ＧＣ（黒で示す）で免疫されたとき、それらのマウスはバランスのとれたＴｈ０応答を開始した。最後に、ＩＦＮ−γ受容体が欠如したマウス（図４Ａの右図）は、タンパク質単独（白で示す）で免疫されたとき、Ｔｈ２応答（ＩｇＧ１抗体）を示す。ＩｇＧ１力価は、タンパク質およびα−ＧＣ（黒で示す）で免疫されたマウスで有意に増加するが、ＩｇＧ２抗体はバックグラウンド濃度を上回る増加はない。つまるところ、ＩＬ−４はＢリンパ球を助けるためにα−ＧＣ依存ｉＮＫＴ細胞にとって個々に必要でないが、一方でＩＦＮ−γはｉＮＫＴ細胞のバランスのとれた（Ｔｈ０）ヘルパー効果にとって絶対必要であることをこれらの結果が示している。
【０１５６】
次いで、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用が、α−ＧＣ依存ｉＮＫＴ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで助けるために必要とされるどうかを追究した。従って、本発明者らは、中和抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体の飽和量で処置したマウスでＨ３Ｎ２に対する抗体応答を評価した。図４Ｂに示すように、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣによる免疫化に続いて、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体で処置したマウスは、対照ＩｇＧで処置したマウスで観察された抗体価よりも有意に低いＨ３Ｎ２抗体価を示した。
【０１５７】
α−ＧＣは、想起抗体応答を増強し、Ｂ細胞記憶の維持に寄与する
適応免疫系の重要な特徴は、それが以前に遭遇した抗原に対して迅速な「想起」応答を開始する能力である。α−ＧＣのアジュバント効果が想起抗体応答に影響を及ぼしたかどうかを評価するために、マウスを、０週目と２週目にＨ３Ｎ２単独でまたはα−ＧＣで２回免疫した。次いで、Ｈ３Ｎ２単独での第３の（想起）免疫化を、３０週目にすべてのマウスに施した。図１で報告したデータと一致して、最初の２回の投与後、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫されたマウスが、Ｈ３Ｎ２単独を受けるマウスからの力価よりも有意に高い抗体価を示したことを図５Ａは示している。マウスのすべてをＨ３Ｎ２単独による第３の免疫化によって追加免疫したとき、Ｈ３Ｎ２特異的抗体は、約３０週目に両群でバックグラウンド濃度に達し、ゆっくり時間をかけて減衰した。２週間後、抗体応答を評価し、最初の２回の免疫化でタンパク質およびα−ＧＣを施されたマウスは第３の免疫化後に、３回の免疫化のすべてでタンパク質単独で免疫されたマウスの抗体価より有意に高い抗体価を示したことが分った（図５Ａ）。これらの結果と一致して、同時実験で、３０週目（第３の免疫化の直前）に、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで２回免疫されたマウスの脾臓で検出されたＨ３Ｎ２抗体分泌細胞（ＡＳＣ）前駆体の頻度は、Ｈ３Ｎ２単独で２回免疫されたマウスの脾臓で観察された頻度よりも有意に高いことが分った（図５Ｂ）。
【０１５８】
Ｂ細胞記憶の調節におけるｉＮＫＴ細胞の役割をさらに調べるために、（Ｊａ１８＋／＋およびＪａ１８＋／−）を有するまたは（Ｊａ１８−／−）ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスの血清でタンパク質（Ｈ３Ｎ２）単独により誘発された抗原特異的抗体の持続を評価した。マウスのすべての群で、抗原特異的抗体の力価は、第２の免疫化から２週間後、同程度のレベルでピークに達した。しかし、図６が示すように、ｉＮＫＴ細胞抗原特異的抗体を有するマウスは、同様にゆっくりとした速度で減衰したが、ｉＮＫＴ細胞が欠如したマウスでの抗体価減衰は、著しく急速であった。これらのマウスのうちα−ＧＣを受けたものはないので、ｉＮＫＴ「自発」活性のあるレベルは、循環抗体の半減期に影響をおよぼすことが可能であると本発明者らは、結論づける。
【０１５９】
つまるところ、ｉＮＫＴ細胞活性化は、想起免疫化に対して高い抗体応答を生じ、これは抗原特異的記憶Ｂ細胞プールのさらなる拡大に起因することをこれらの結果が示している。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでのｉＮＫＴ自発活性は、循環抗体濃度の維持において恒常的に関与するように見える。
【０１６０】
（実施例２） 追加免疫の非存在下でα−ＧａｌＣｅｒによるプライミングは、抗体応答を増強させる
上述のように、３０週目（第３の免疫化の直前）に、Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣで２回免疫されたマウスの脾臓で検出したＨ３Ｎ２抗体分泌細胞（ＡＳＣ）前駆体（すなわち記憶Ｂ細胞）の頻度は、Ｈ３Ｎ２単独で２回免疫されたマウスの脾臓で観察した頻度よりも有意に高かった（図５Ｂ）。
【０１６１】
同様の結果を、破傷風トキソイド（図７および１８）で免疫されたマウスで行った実験で得た。図７は、０日目および１４日目に、アジュバントなし、α−ＧＣアジュバント、またはアルミニウム塩アジュバントを用いる破傷風トキソイドによる最後の２回の免疫化から６週間後にＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＳＣ前駆体の頻度を示す。アジュバントとしてのα−ＧＣの使用は、アルミニウム塩アジュバントの使用と比較して、ＡＳＣ前駆体の頻度を著しく増強させた。同様に、図１８が示すように、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣによる最後の２回の免疫化から３カ月後、ＧＢＳ８０およびアルミニウム塩による免疫化と比較して、ＣＤ１マウスのＡＳＣ前駆体の頻度が著しく高かった。
【０１６２】
一連の２回の免疫化でアジュバントとして投与したとき、アルミニウム塩と比較すると記憶Ｂ細胞の頻度を著しく増強させるα−ＧＣの能力は、単回免疫化でアジュバントとして使用されると、α−ＧＣが特定の記憶Ｂ細胞の増加を誘発することができることを示唆した。従って、α−ＧＣおよびＨ３Ｎ２抗原の特定のＢ細胞記憶プールへの単回投与の効果を評価するために実験を行った（図８〜１１）。
【０１６３】
図８は、実験で使用した免疫化スケジュールを示す。Ｃ５７ＢＬ／６メスのマウス（６〜８週齢）２０匹を５マウスずつ４群に分けた。群１）を０週目にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＨ３Ｎ２で免疫し、２週間後にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫した。群２）を０週目にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫し、２週間後にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群３）を０週目および２週目にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群４）を０週目および２週間後にＨ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫した。初回の免疫化から５６週間後、すべての群のマウスにＰＢＳ中の３μｇのＨ３Ｎ２を接種した。すべての免疫化は筋肉内であった。
【０１６４】
図９は、群３のマウス（ＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した）のＨ３Ｎ２抗体応答と、両免疫化でα−ＧＣを用いて（図Ａ）、第１の免疫化だけにα−ＧＣを用いて（図Ｂ）、第２の免疫化だけにα−ＧＣを用いて（図Ｃ）免疫されたマウスの応答とを比較する。第１のまたは第２の免疫化だけに与えても、α−ＧＣは抗体応答を増強することが分った。４つの群の間には抗体半減期の相違は観察されなかった。
【０１６５】
図１０は、観察した以下の抗体応答の対での比較を示す：Ａ）α−ＧＣによる２回の免疫化されたマウスｖｓ．第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化；Ｂ）α−ＧＣによる２回の免疫化されたマウスｖｓ．第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化；およびＣ）第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化ｖｓ．第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化。α−ＧＣを第１のワクチン投与に与えたとき、最大効果を観察した。第１のワクチン投与でのα−ＧＣの供給は、第２のワクチン投与でのα−ＧＣの供給に対して高い抗体応答をもたらした（図１０Ｃ）。α−ＧＣを第１のワクチン投与で供給した場合、抗体応答は、α−ＧＣを両ワクチン投与で供給した場合に得られた応答と類似していた（図１０Ｂ）。
【０１６６】
図１１は、α−ＧＣを２回のプライミング注射の第１または第２の投与のいずれかだけに入れた場合でも、α−ＧＣで予備刺激したマウスがワクチン接種に対して高い想起応答を示すことを確認する。これらの結果は、α−ＧＣをアジュバントとしてワクチン組成物に入れると、長期免疫記憶を達成するために必要とするプライミング免疫化の回数を減少させることが可能であり、かつ追加免疫免疫化の頻度および回数を減少させることを示唆する。
【０１６７】
（実施例３） α−ＧＣは、ストレプトコッカス・アガラクチアによって誘発された新生仔敗血症のマウスモデルで防御抗体応答を増強させる。
【０１６８】
ストレプトコッカス・アガラクチア感染症によって誘発された新生仔敗血症のマウスモデルで防御抗体応答を増強させるその能力に対して、α−ＧＣを検査した。
【０１６９】
メスのマウスを３つの群に分けた。群１を、０日目にアジュバント非存在下で２０μｇのＧＢＳ８０で予備刺激し、２１日目に同じ組成物で追加免疫した。２３日目にマウスを交配し、５０〜５３日目に仔を出産する前に、ＧＢＳ８０−ＩｇＧ力価の評価を行うために４３〜３６日目に採血した。出生から０〜４８時間に仔マウスにストレプトコッカス・アガラクチアの９０％致死量を接種した。追加免疫投与から３カ月後、母マウスを犠牲にして、脾臓を摘出し、ＧＢＳ８０−ＩｇＧ形質細胞前駆体の頻度を評価した。群２のマウスには、ＧＢＳ８０およびミョウバンで予備刺激および追加免疫を行い、群３のマウスには、ＧＢＳ８０および０．１μｇのα−ＧＣで予備刺激および追加免疫を行ったことを除いて、同じ免疫化スケジュールを群２および群３で続けた。
結果は、以下のとおりであった。
【０１７０】
【表１】
このように、アジュバントとしてのα−ＧＣの使用は、母マウスのＧＢＳ８０−ＩｇＧ反応を誘発し、ミョウバンによって誘発されたＩｇＧ応答よりも８倍高いものであった。母マウスの高い抗体応答は、Ｂ群連鎖球菌感染症からそれらの仔マウスの保護を増強させる結果になった。ＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫された母マウスの仔のうちわずかに３０％と比較すると、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスからの仔のうち７０％は、ストレプトコッカス・アガラクチアの接種から残存した。
【０１７１】
２０μｇまたは１μｇのＧＢＳ８０のいずれかで免疫されるマウスを用いて、実験を繰り返した。０日目にマウスのすべてを予備刺激し、２０日目に追加免疫し、３４日目に交配し、５４〜５８日目の仔の出産の前、４８日目に採血した。直ちに、仔マウスにストレプトコッカス・アガラクチアの９０％致死量を接種し、４８時間で生存を評価した。追加免疫から３カ月後、母マウスを犠牲にして、ＧＢＳ８０−ＩｇＧ形質細胞前駆体の頻度を評価するために脾臓を摘出した。ミョウバン、α−ＧＣとともに、アジュバントは含まずに１μｇのＧＢＳ８０で；ミョウバン、α−ＧＣとともに、アジュバントは含まずに２０μｇのＧＢＳ８０で；またはリン酸緩衝食塩水もしくはミョウバンアジュバント単独でマウスを免疫した。
【０１７２】
図１５に示すように、１μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、１μｇのＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスよりも有意に高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ力価を示した。２０μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、２０μｇのＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスと比べると、同等のＩｇＧ１力価を示し、より高いＩｇＧ２ａ力価を示した。結果は以下のとおりである。
【０１７３】
【表２】
このように、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスの％生存率は、ＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスの生存率と同等であった。
【０１７４】
ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスの脾臓は、また、ＧＢＳ８０ ＩｇＧ形質細胞および記憶Ｂ細胞の頻度を有意に高く含有していた（それぞれ図１７および１８）。参照文献２５８に記述されるように、ＧＢＳ８０特異的形質細胞および記憶Ｂ細胞の頻度を、培地だけで、またはＣｐＧおよびＩＬ−２の存在下の培地でインキュベートした脾細胞の１０日の限界希釈培養からの上清でＧＢＳ８０特異的抗体の存在を評価することで決定した。
【０１７５】
さらに実験で、妊娠したＣＤ１メスのマウスを、リン酸緩衝食塩水、ＧＢＳ８０、ＧＢＳ８０＋ミョウバン、またはＧＢＳ８０＋α−ＧＣで免疫した。免疫されたＣＤ１メスマウスの各群からまたはナイーブなＣＤ１メスマウスから出産１週間前に採取した血清をプールして、ナイーブなＣＤ１母マウスから生まれた２４時間齢の新生仔に皮下注射した（最終容量２０μｌ中３μｌ／投与）。３時間後、新生仔のすべてに生ウイルスのストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｔｉａｅ）１×ＬＤ９０（９０％致死量）を腹腔内に接種した。仔マウスの生存を２日間経過観察した。ＧＢＳ８０で免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウスは、すべて死亡し（２８仔マウスのうち２８匹）、リン酸緩衝食塩水で免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウス２７匹のうちわずか１匹が生き残った。アジュバント（ミョウバンまたはα−ＧＣ）の存在は、生存の増加においてミョウバンよりもより有効であるα−ＧＣでの免疫化により生存を向上させた。ＧＢＳ＋α−ＧＣで免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウスの生存は、ＧＢＳ＋ミョウバンで免疫された母マウスからの血清で免疫された仔マウスの生存より１６５％高かった。
【０１７６】
これらのデータは、α−ＧＣが、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｔｉａｅ）に対する防御免疫応答の誘発においてミョウバンよりも著しく有効であることを示する。
【０１７７】
（実施例４） α−ＧＣは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株由来のいくつかのタンパク質抗原を含有する混合ワクチンに対する抗体応答を増強する
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株（ＭｅｎＢ）抗原からの複数の抗原を組み合わせるためのアジュバントとして作用するα−ＧＣの能力を評価した。
【０１７８】
３種類のＭｅｎＢ抗原（ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃ）（各２０μｇ／用量）に０．１μｇのα−ＧＣを混合した、または０．６ｍｇのミョウバンを混合した混合物でマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を、０日目、２１日目、および３５日目に施し、各免疫化後に各抗体に対するＩｇＧ力価を評価した。図１９に示すように、α−ＧＣは、混合ワクチン中の３種類のＭｅｎＢ抗原のすべてに対する抗体応答を増強することにおいてミョウバンと同様に有効であった。
【０１７９】
α−ＧＣは、また、これらの抗原に対する殺菌応答を増強させた。図１６は、３種類のＭｅｎＢ抗原（ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃ）の混合物で免疫されたマウス、またはミョウバン、α−ＧＣと共に、またはアジュバントを含まずにこれらの抗原それぞれと別々の組み合わせで免疫されたマウスからの血清試料中のＭｅｎＢ型株ＭＣ５８、２９９６、Ｈ４４／７６、およびＮＺ９８／２５４に対する殺菌抗体応答を比較している。ＭｅｎＢ抗原およびα−ＧＣによる免疫化に対する殺菌応答は、ＭｅｎＢ抗原およびミョウバンによる免疫化に対する殺菌応答よりも一貫して高かった。
【０１８０】
ＭｅｎＢ抗原に対するｅｘ ｖｉｖｏでのＣＤ４Ｔ細胞応答を評価するために第２の実験を行った。６匹のＣＤ１メスマウスからなる複数群を、複数のＭｅｎＢ抗原の混合（リン酸緩衝食塩水、ミョウバン、またはα−ＧＣで製剤化した）で２回免疫した。第２の免疫化から１０日後、３マウス／群を犠牲にして、それらの脾臓を摘出した。別々のマウス由来の全脾細胞の懸濁液をＭｅｎＢ抗原を用いて１６時間培養した。培養の最後の１２時間は、ブレフェルジンＡの存在下で行い、サイトカインの細胞内蓄積を可能にした。刺激した脾細胞を固定、膜透過処理を行い、抗ＣＤ３、抗Ｃｄ４，抗ＣＤ６９，抗ＩＦＮｇ、およびＴＮＦαのモノクローナル抗体を用いて染色した。全ＣＤ４＋細胞集団中のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６９＋サイトカイン＋細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳ解析によって決定した。
【０１８１】
結果を図１４に示す。ＭｅｎＢ抗体に応答してＴＦＮαを産生するＣＤ４Ｔ細胞を増殖させることにおいてα−ＧＣは、ミョウバンよりもより有効であることが分り、α−ＧＣが、少なくともミョウバンと同程度でＭｅｎＢ抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発できることを示した。陽性対照として、ポリクローナル刺激に対する応答をマウスの３つ群のすべてで検査した。図１４の挿入部に示すように、マウスの３つの群のすべては、抗ＣＤ３抗体（ＩａＣＤ３）によるポリクローナル刺激に対して同じ応答を示した。
【０１８２】
ミョウバンまたはＭＦ５９と比較して同じ３種類のＭｅｎＢ抗原のためのアジュバントとして作用するα−ＧＣの能力を評価するために、追加の実験を行った。３種類のＭｅｎＢ抗原（ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃ）（各２０μｇ／用量、５μｇ／用量、または２．５μｇ／用量）に０．１μｇのα−ＧＣ、０．６ｍｇのミョウバン、１００μｇのＭＦ５９を混合、またはアジュバントを含まずに混合した混合物でマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を、０日目、２１日目、および３５日目に施し、各免疫化の後、各抗原に対するＩｇＧ力価を評価した。図１３に示すように、α−ＧＣおよびＭＦ５９は両方とも、ミョウバンよりも高い殺菌抗体価を誘発した。免疫されたマウスの脾臓のＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞の頻度も、決定した。図１２に示すように、ミョウバンと比較して、α−ＧＣまたはＭＦ５９で免疫されたマウスの脾臓により高い頻度のＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞が見られた。ＭｅｎＢ抗原に対する殺菌免疫応答を誘発する際、および長期免疫記憶に必要とされるＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞を誘発する際に、α−ＧＣはミョウバンよりもより有効であり、かつＭＦ５９と同程度に有効であることをこれらのデータは示す。
【０１８３】
当然のことながら、本発明は例の目的でのみ記述されており、詳細の変更は本発明の趣旨および適用範囲から逸脱することなくなされる。
【０１８４】
（参考文献）
【０１８５】
【化１３】
【０１８６】
【化１４】
【０１８７】
【化１５】
【０１８８】
【化１６】
【０１８９】
【化１７】
【０１９０】
【化１８】
【０１９１】
【化１９】
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】免疫グロブリン（Ｉｇ）力価のグラフを示す。Ａ）α−ＧＣおよび細菌タンパク質（破傷風トキソイド（ＴＴ）もしくはジフテリアトキソイド（ＤＴ））またはウイルスタンパク質（Ｈ３Ｎ２、インフルエンザＡ型株からの赤血球凝集素−ノイラミニダーゼのサブユニット）により筋肉内に免疫されたＣ５７／ＢＬ６マウスのタンパク質特異的抗体の血清力価。タンパク質およびα−ＧＣ（黒四角）で免疫されたマウスは、タンパク質単独（白四角）で免疫されたマウスよりも、より高い抗体価を示した。Ｘ軸は、日数を示す。Ｂ）Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣ（黒四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞を有する（Ｊａ１８＋／＋）マウスは、Ｈ３Ｎ２単独（白四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞を有するマウスと比較して、Ｈ３Ｎ２特異的抗体の血清力価の増大を示す。Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣ（黒四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞が欠如した（Ｊａ１８−／−）マウスは、Ｈ３Ｎ２単独（白四角）で免疫されたｉＮＫＴ細胞を欠如したマウスと比較して、Ｈ３Ｎ２特異的抗体の血清力価の増強を示さない。すべての免疫化は、皮下であった。
【図２Ａ】免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価の平均値のグラフを示す。Ａ）ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両抗体の生成においてα−ＧＣは、ＣＦＡ、ＣｐＧ、ＭＦ５９、およびアルミウム塩と同様に強力である。抗原は、ＴＴであった。
【図２Ｂ】免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価の平均値のグラフを示す。Ｂ）Ｈ３Ｎ２で皮下に免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは、検出可能な抗体（ＩｇＧ）価を示したのに対して、Ｈ３Ｎ２単独またはミョウバンで皮下に免疫されたＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスは抗体価を示さなかった。
【図３】インフルエンザウイルス感染症のマウスモデルにおけるα−ＧＣとＭＦ５９との比較を示す。すべての免疫化は、筋肉内であった。Ａ）Ｈ１Ｎ１特異的ＩｇＧ力価（幾何平均）。Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスの抗体価は、Ｈ１Ｎ１およびＭＦ５９で免疫されたマウスの抗体価に匹敵するものであり、タンパク質単独のワクチンで免疫されたマウスに見られた力価よりも有意に高いものである。Ｂ）接種後の生存パーセンテージ対日数。Ｈ１Ｎ１およびα−ＧＣで免疫されたマウスの８０％およびＨ１Ｎ１とＭＦ５９とで免疫されたマウスの１００％は、インフルエンザウイルス接種後生存している。
【図４】Ｈ３Ｎ２免疫グロブリン力価（幾何平均）を示す。白四角は、アジュバントなしであり、網掛け四角は、α−ＧＣを有する。Ａ）ＷＴ、ＩＬ−４−／−、およびＩＦＮ−γＲ−／−マウスのＨ３Ｎ２とα−ＧＣとでの皮下免疫化（存在するところは黒で示す）またはＨ３Ｎ２単独での皮下免疫化（存在するところは白で示す）に対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答。Ｈ３Ｎ２単独での野性型マウスの免疫化は、ＩｇＧ１応答（Ｔｈ２）を誘発し、一方Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣでの免疫化は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答（Ｔｈ０）を誘発した。Ｈ３Ｎ２単独でのＩＬ４−／−マウスの免疫化は、ＩｇＧ応答を誘発しなかったが、一方Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣでの免疫化は、ＩｇＧ１およびＩＧ２ａ応答（Ｔｈ０）を誘発した。Ｈ３Ｎ２単独でのＩＦＮ−γＲ−／−マウスの免疫化は、ＩｇＧ１応答（Ｔｈ２）を誘発し、一方Ｈ３Ｎ２およぼα−ＧＣでの免疫化は、有意に高いＩｇＧ１応答（Ｔｈ２）を誘発した。点線は、検査された血清の最小希釈を示す。Ｂ）Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣでの皮下免疫化の前と免疫化の間に、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体で処置されたマウスは、対照ＩｇＧで処置されたマウスで観察された抗体価よりも有意に低いＨ３Ｎ２抗体価を示す。
【図５】Ａ）０週目と２週目にＨ３Ｎ２単独またはＨ３Ｎ２とα−ＧＣによってマウスを予備刺激し、第１の免疫化から３０週間後に両群のマウスを単独のＨ３Ｎ２タンパク質で追加免疫した。図は、Ｈ３Ｎ２−Ｉｇ力価（幾何平均）対時間（週）を示す。矢印は、免疫化の時期を示す。Ｈ３Ｎ２およびα−ＧＣの２つの投与によって予備刺激し、その後タンパク質単独で追加免疫されたマウス（黒四角）は、Ｈ３Ｎ２単独によって予備刺激および追加免疫されたマウス（白四角）よりも有意に高い抗体価を示した。Ｂ）図５Ａにより予備刺激したマウスにおけるＨ３Ｎ２−抗体分泌細胞前駆体の頻度（１００万Ｂ細胞あたりのＨ３Ｎ２−ＩｇＧ ＡＳＣ前駆体）。３０週目でのＨ３Ｎ２−抗体を分泌する細胞前駆体の頻度は、Ｈ３Ｎ２単独で２回免疫されたマウス（白四角）よりもＨ３Ｎ２とα−ＧＣとで２回免疫されたマウス（網掛け四角）のほうが有意に高かった。
【図６】Ｈ３Ｎ２−Ｉｇ力価（幾何平均）対時間（週）。Ｈ３Ｎ２単独で皮下に２回免疫されたｉＮＫＴ細胞が欠損したマウス（Ｊａ１８−／−）およびｉＮＫＴ細胞を有するマウス（Ｊａ１８＋／＋）におけるＨ３Ｎ２特異的抗体の減衰。抗原特異的抗体は、ｉＮＫＴ細胞を有するマウス（楕円）よりもｉＮＫＴ細胞が欠損したマウス（三角）がより急速に減衰する。
【図７】破傷風トキソイド＋／−アジュバントによる最後（２回のうちの）の免疫化から６週間後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＳＣ前駆体（すなわち記憶Ｂ細胞）の頻度を、１００万Ｂ細胞あたりの数として示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目と１４日目にアジュバント、α−ＧＣ、もしくはミョウバンを含まない破傷風トキソイドによって筋肉内に免疫した。破傷風トキソイドおよびα−ＧＣで免疫されたマウスは、破傷風トキソイド単独で免疫されたマウスよりも有意に高いＴＴ特異的記憶Ｂ細胞の頻度を示し、ミョウバン中の破傷風トキソイドで免疫された全マウスは、示さなかった。＊は、ｐ＜０．００５ｖｓ無抗原投与を示し、＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。＊＊＊は、ｐ＜０．００５ｖｓアジュバントを含まないＴＴを示す。
【図８】プライミングで使用されるすべてのワクチン投与でα−ＧＣの存在を必要とするかどうかを評価するために使用した免疫化スケジュール。Ｃ５７ＢＬ／６メスのマウス（６〜８週齢）２０匹を５匹のマウスの４群に分けた。群１）を０週目にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＨ３Ｎ２で免疫し、２週間後にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫した。群２）を０週目にＨ３Ｎ２＋α−ＧＣで免疫し、２週間後にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群３）を０週目および２週目にＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で免疫した。群４）を０週目および２週間後にＨ３Ｎ２およびα−ＧＣで免疫した。初回の免疫化から５６週間後、すべての群のマウスにＰＢＳ中の３μｇのＨ３Ｎ２を接種し、５８週目に想起応答を評価した。すべての免疫化は筋肉内であった。
【図９】図８の群３のマウス（ＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で２回免疫された）のＨ３Ｎ２抗体応答と以下Ａ〜Ｃとの比較：Ａ）図８の群４のマウス（α−ＧＣ中のＨ３Ｎ２で２回免疫された）の応答；Ｂ）図８の群１のマウス（ＰＢＳ中のＨ３Ｎ２で、次いでα−ＧＣ中のＨ３Ｎ２で免疫された）の応答；およびＣ）図８の群２のマウス（α−ＧＣ中のＨ３Ｎ２で、次いでＰＢＳ中のＨ３Ｎ２での免疫化）の応答。抗体半減期における相違はなかった。
【図１０】以下のように観察されたＨ３Ｎ２−抗体応答の比較：Ａ）α−ＧＣによる２回の免疫化（群４）ｖｓ第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣ（群１）；Ｂ）α−ＧＣで２回免疫されたマウス（群４）ｖｓ第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣ（群２）；およびＣ）第１の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化（群２）ｖｓ第２の免疫化だけにおけるα−ＧＣによる免疫化（群１）。
【図１１】図８に記述するように免疫されたマウスの想起応答。Ｈ３Ｎ２単独による追加免疫（５６週目に施した）の免疫化から２週間後、α−ＧＣの１ないし２回投与によって予備刺激されたマウスは、Ｈ３Ｎ２単独の２回投与で予備刺激されたマウスより高い想起応答を示した。データは、５６週目と５８週目のＨ３Ｎ２のＩｇ力価（幾何平均）である。
【図１２】図１３に記述するように免疫されたマウスの脾臓のＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞の頻度を決定した。ＭｅｎＢ特異的記憶Ｂ細胞のより高い頻度は、ミョウバンと比較して、α−ＧＣまたはＭＦ５９で免疫されたマウスの脾臓で見つかった。グラフは、１００万Ｂリンパ球あたりのＭｅｍＢ特異的ＩｇＧ記憶Ｂ細胞を示す。＊および＊＊は、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１ｖｓアジュバントなしを示す。
【図１３】ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃの３種類のＭｅｎＢ抗原（各々２０μｇ／用量、５μｇ／用量、または２．５μｇ／用量）に０．１μｇのα−ＧＣ、０．６ｍｇのミョウバン、１００μｌのＭＦ５９、またはアジュバントなしを混合した混合物によってマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を０日目、２１日目、および３５日目に施し、各抗原に対するＩｇＧ力価を各免疫化から１０５日目まで評価した。α−ＧＣとＭＦ５９の両方は、ミョウバンよりも高い殺菌抗体価を誘発した。
【図１４】０日目および２１日目に以下によって筋肉内に免疫されたマウスにおける組換えＭｅｎＢ抗原に対するＣＤ４Ｔ細胞応答の比較：ａ）３種類のＭｅｎＢ抗原およびα−ＧＣを含有する混合ワクチン；ｂ）３種類のＭｅｎＢ抗原およびミョウバンを含有する混合ワクチン；またはｃ）３種類のＭｅｎＢ抗原だけを含有する混合ワクチン。第２の免疫化から２週間後、表示した量のＭｅｎＢ組換えタンパク質を用いて全脾細胞を１６時間（最後の１４時間は、ブレフェルジンＡの存在下で行った）インキュベートすることによってＣＤ４Ｔ細胞応答を評価した。ＴＮＦａを産生するＣＤ４Ｔ細胞の数を細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって決定した。３種類のＭｅｎＢ抗原およびα−ＧＣの混合で免疫されたマウスは、複数のＭｅｎＢ抗原とミョウバンまたはアジュバントなしの混合によって免疫されたマウスと比較して、一貫してより高いＣＤ４応答を示した。陽性対照として、ポリクローナル刺激に対するマウスの３群すべての応答を検査した。図の挿入部に示すようにマウスの３群すべては、抗ＣＤ３抗体（ＩａＣＤ３）によるポリクローナル刺激に対して同じ応答を示した。すべてのＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージとして、Ｙ軸はＴＮＦαを産生するＣＤ４Ｔ細胞を示す。
【図１５】力価（幾何平均）。ＧＢＳ抗原で免疫されたマウスにおけるＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａの力価の比較。１μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、１μｇのＧＢＳ８０単独で免疫されたマウスよりも有意に高いＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価を示したが、ミョウバン中のＧＢＳ８０で免疫されたマウスは、示さなかった。２０μｇのＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫されたマウスは、２０μｇのＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫されたマウスに等しいＩｇＧ１力価を示し、かつより高いＩｇＧ２ａ力価を示した。＊、＊＊ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１ｖｓアジュバントなしでのＧＢＳ８０
【図１６】０日目と２１日目に、３種類のＭｅｎＢ抗原（ＤＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、または９６１ｃ）のうちの１つまたは以下と組み合わせた３種類の抗原全ての混合でマウスを免疫した：ａ）α−ＧＣ；ｂ）ミョウバン；またはｃ）アジュバントなし。ＭｅｎＢ型株（ＭＣ５８、２９９６、Ｈ４４／７６、およびＮＺ９８／２５４）に対する殺菌抗体の濃度を、第２の免疫化から２週間後、および第３の免疫化から２週間後に評価した。アジュバントとしてα−ＧＣとともに混合ワクチンを投与したとき、殺菌抗体は、ミョウバンと比較して有意に高かった。免疫化のすべては筋肉内であった。
【図１７】ＧＢＳ８０で免疫された母マウスの脾臓の記憶Ｂ細胞の頻度。ＧＢＳ８０特異的抗体を産生する形質細胞の頻度は、ＧＢＳ８０単独でまたはミョウバンで免疫された母マウスの脾臓よりも、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスからの脾臓において有意に高かった。グラフは、１００万Ｂリンパ球あたりのＧＢＳ８０ＩｇＧ形質細胞の数を示す。
【図１８】ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスとＧＢＳ８０およびミョウバンで免疫された母マウスとの形質細胞頻度の比較。形質細胞頻度は、ＧＢＳ８０およびα−ＧＣで免疫された母マウスにおいて有意に高かった。グラフは、１００万Ｂリンパ球あたりのＧＢＳ８０ＩｇＧ形質細胞の数を示す。
【図１９】ΔＧ２８７ｎｚ−９５３、９３６−７４１、および９６１ｃの３種類のＭｅｎＢ抗原（各々２０μｇ／用量）単独に０．１μｇのα−ＧＣを混合した、または０．６ｍｇのミョウバンを混合した混合物でマウスを免疫した。一連の３回の免疫化を、０日目、２１日目、および３５日目に施し、各々の免疫化後、各抗原に対するＩｇＧ力価を評価した。α−ＧＣは、混合ワクチンの３種類のＭｅｎＢ抗原のすべてに対する抗体応答の増強においてミョウバンと同様に有効であった。免疫化のすべては、筋肉内であった。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＣＤ１ｄリガンドと、ｂ）Ｂ群連鎖球菌由来の抗原とを含む組成物。
【請求項２】
ａ）ＣＤ１ｄリガンドと、ｂ）髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原とを含む組成物。
【請求項３】
ａ）ＣＤ１ｄリガンドと、ｂ）インフルエンザウイルス抗原とを含む組成物。
【請求項４】
医薬に使用するためのＣＤ１ｄリガンドおよびＢ群連鎖球菌由来の抗原。
【請求項５】
医薬に使用するためのＣＤ１ｄリガンドおよび髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原。
【請求項６】
医薬に使用するためのＣＤ１ｄリガンドおよびインフルエンザウイルス抗原。
【請求項７】
患者に免疫応答を引き起こす方法であって、患者にＣＤ１ｄリガンドおよびＢ群連鎖球菌由来の抗原を投与することを含む方法。
【請求項８】
患者に免疫応答を引き起こす方法であって、患者にＣＤ１ｄリガンドおよび髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原を投与することを含む方法。
【請求項９】
患者に免疫応答を引き起こす方法であって、患者にＣＤ１ｄリガンドおよびインフルエンザウイルス抗原を投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記抗原および前記ＣＤ１ｄリガンドが、同時に、連続して、または別々に投与される、請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
患者に免疫応答を引き起こすためのＢ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原の使用であって、該抗原が、ＣＤ１ｄリガンドとともに投与される、抗原の使用。
【請求項１２】
患者に免疫応答を引き起こすためのＣＤ１ｄリガンドの使用であって、前記ＣＤ１ｄリガンドが、Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原とともに投与される、ＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項１３】
患者に免疫応答を引き起こすためのａ）Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原、およびｂ）ＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項１４】
患者に免疫応答を引き起こすためのＢ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原の使用であって、該患者が、ＣＤ１ｄリガンドで事前処置されている、抗原の使用。
【請求項１５】
患者に免疫応答を引き起こすためのＣＤ１ｄリガンドの使用であって、該患者が、Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原で事前処置されている、ＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項１６】
前記患者に投与される前記ＣＤ１ｄリガンドの量が、１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である、請求項７乃至１５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１７】
キットであって、（ａ）Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原と、（ｂ）ＣＤ１ｄリガンドとを含むキット。
【請求項１８】
必要とする患者において抗原に対する長期免疫記憶を誘導する方法であって、
ａ）該抗原と、ｂ）ＣＤ１ｄリガンドと
を含む組成物を、該患者が該抗原へのその後の曝露に対して免疫応答を引き起こすことができるために必要な該組成物の投与回数および／または頻度が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減されるように該患者に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記患者が、前記抗原へのその後の曝露に対して防御免疫応答を引き起こすことができるために必要な前記組成物の投与回数および／または頻度が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、前記抗原へのその後の曝露に対して防御免疫応答を引き起こすことができるために必要な前記組成物の投与回数が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
防御免疫応答を誘導するために必要とされる投与回数が、単回プライミング投与まで減少する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が、前記抗原へのその後の曝露に対して防御免疫応答を引き起こすことができるために必要な前記組成物の追加免疫投与の頻度が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
追加免疫投与が１年を超える間隔で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
追加免疫投与のための必要性が完全に除去される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者に抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、該患者にａ）該抗原と、ｂ）ＣＤ１ｄリガンドとを投与することを含み、
該抗原およびＣＤ１ｄリガンドが１年より前にも該患者に投与されている、方法。
【請求項２６】
患者に免疫応答を誘導するための抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用であって、該抗原およびＣＤ１ｄリガンドが１年より前にも該患者に投与されている、抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項２７】
前記免疫応答が防御免疫応答である、請求項２５に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗原およびＣＤ１ｄリガンドが、同時に、連続して、または別々に投与される、請求項２５乃至２７のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項２９】
前記患者に投与された前記ＣＤ１ｄリガンドの量が、１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である、請求項１８乃至２８のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項３０】
患者に抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、該患者に
ａ）該抗原と、ｂ）ＣＤ１ｄリガンドとを投与することを含み、
該組成物に含まれる該ＣＤ１ｄリガンドの量が１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である、方法。
【請求項３１】
患者に免疫応答を誘導するための抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用であって、前記ＣＤ１ｄリガンドの量が１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である使用。
【請求項３２】
前記免疫応答が、防御免疫応答である、請求項３０または請求項３１に記載の方法または使用。
【請求項３３】
前記ＣＤ１ｄリガンドおよび抗原が、同時に、連続して、または別々に投与される、請求項３０乃至３２のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項３４】
前記抗原が、キャリアタンパク質に結合されたサッカライド抗原である、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３５】
前記抗原が、タンパク質抗原である、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３６】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、インバリアントＮＫＴ細胞を活性化する、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項３７】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、該ＣＤ１ｄリガンドの非存在下でインバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルと比較して、インバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルを増加させる、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項３８】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、糖脂質である、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項３９】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、α−グリコシルセラミドである、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項４０】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、α−ガラクトシルセラミドまたはその類似体である、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項４１】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、ＫＲＮ７０００、ＯＣＨ、またはＣＲＯＮＹ−１０１から選択されるα−ガラクトシルセラミド類似体である、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項１】
ａ）ＣＤ１ｄリガンドと、ｂ）Ｂ群連鎖球菌由来の抗原とを含む組成物。
【請求項２】
ａ）ＣＤ１ｄリガンドと、ｂ）髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原とを含む組成物。
【請求項３】
ａ）ＣＤ１ｄリガンドと、ｂ）インフルエンザウイルス抗原とを含む組成物。
【請求項４】
医薬に使用するためのＣＤ１ｄリガンドおよびＢ群連鎖球菌由来の抗原。
【請求項５】
医薬に使用するためのＣＤ１ｄリガンドおよび髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原。
【請求項６】
医薬に使用するためのＣＤ１ｄリガンドおよびインフルエンザウイルス抗原。
【請求項７】
患者に免疫応答を引き起こす方法であって、患者にＣＤ１ｄリガンドおよびＢ群連鎖球菌由来の抗原を投与することを含む方法。
【請求項８】
患者に免疫応答を引き起こす方法であって、患者にＣＤ１ｄリガンドおよび髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原を投与することを含む方法。
【請求項９】
患者に免疫応答を引き起こす方法であって、患者にＣＤ１ｄリガンドおよびインフルエンザウイルス抗原を投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記抗原および前記ＣＤ１ｄリガンドが、同時に、連続して、または別々に投与される、請求項７乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
患者に免疫応答を引き起こすためのＢ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原の使用であって、該抗原が、ＣＤ１ｄリガンドとともに投与される、抗原の使用。
【請求項１２】
患者に免疫応答を引き起こすためのＣＤ１ｄリガンドの使用であって、前記ＣＤ１ｄリガンドが、Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原とともに投与される、ＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項１３】
患者に免疫応答を引き起こすためのａ）Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原、およびｂ）ＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項１４】
患者に免疫応答を引き起こすためのＢ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原の使用であって、該患者が、ＣＤ１ｄリガンドで事前処置されている、抗原の使用。
【請求項１５】
患者に免疫応答を引き起こすためのＣＤ１ｄリガンドの使用であって、該患者が、Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原で事前処置されている、ＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項１６】
前記患者に投与される前記ＣＤ１ｄリガンドの量が、１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である、請求項７乃至１５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１７】
キットであって、（ａ）Ｂ群連鎖球菌由来の抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原、またはインフルエンザウイルス抗原と、（ｂ）ＣＤ１ｄリガンドとを含むキット。
【請求項１８】
必要とする患者において抗原に対する長期免疫記憶を誘導する方法であって、
ａ）該抗原と、ｂ）ＣＤ１ｄリガンドと
を含む組成物を、該患者が該抗原へのその後の曝露に対して免疫応答を引き起こすことができるために必要な該組成物の投与回数および／または頻度が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減されるように該患者に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記患者が、前記抗原へのその後の曝露に対して防御免疫応答を引き起こすことができるために必要な前記組成物の投与回数および／または頻度が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、前記抗原へのその後の曝露に対して防御免疫応答を引き起こすことができるために必要な前記組成物の投与回数が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
防御免疫応答を誘導するために必要とされる投与回数が、単回プライミング投与まで減少する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が、前記抗原へのその後の曝露に対して防御免疫応答を引き起こすことができるために必要な前記組成物の追加免疫投与の頻度が、ＣＤ１ｄリガンドの非存在下での該抗原の投与と比較して低減される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
追加免疫投与が１年を超える間隔で投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
追加免疫投与のための必要性が完全に除去される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者に抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、該患者にａ）該抗原と、ｂ）ＣＤ１ｄリガンドとを投与することを含み、
該抗原およびＣＤ１ｄリガンドが１年より前にも該患者に投与されている、方法。
【請求項２６】
患者に免疫応答を誘導するための抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用であって、該抗原およびＣＤ１ｄリガンドが１年より前にも該患者に投与されている、抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用。
【請求項２７】
前記免疫応答が防御免疫応答である、請求項２５に記載の方法または請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗原およびＣＤ１ｄリガンドが、同時に、連続して、または別々に投与される、請求項２５乃至２７のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項２９】
前記患者に投与された前記ＣＤ１ｄリガンドの量が、１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である、請求項１８乃至２８のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項３０】
患者に抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、該患者に
ａ）該抗原と、ｂ）ＣＤ１ｄリガンドとを投与することを含み、
該組成物に含まれる該ＣＤ１ｄリガンドの量が１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である、方法。
【請求項３１】
患者に免疫応答を誘導するための抗原およびＣＤ１ｄリガンドの使用であって、前記ＣＤ１ｄリガンドの量が１０μｇ／ｋｇ患者体重未満である使用。
【請求項３２】
前記免疫応答が、防御免疫応答である、請求項３０または請求項３１に記載の方法または使用。
【請求項３３】
前記ＣＤ１ｄリガンドおよび抗原が、同時に、連続して、または別々に投与される、請求項３０乃至３２のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項３４】
前記抗原が、キャリアタンパク質に結合されたサッカライド抗原である、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３５】
前記抗原が、タンパク質抗原である、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項３６】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、インバリアントＮＫＴ細胞を活性化する、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項３７】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、該ＣＤ１ｄリガンドの非存在下でインバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルと比較して、インバリアントＮＫＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３のレベルを増加させる、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項３８】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、糖脂質である、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項３９】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、α−グリコシルセラミドである、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項４０】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、α−ガラクトシルセラミドまたはその類似体である、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【請求項４１】
前記ＣＤ１ｄリガンドが、ＫＲＮ７０００、ＯＣＨ、またはＣＲＯＮＹ−１０１から選択されるα−ガラクトシルセラミド類似体である、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法、使用、組成物、またはキット。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２００９−５３０２６４（Ｐ２００９−５３０２６４Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８９４３（Ｐ２００８−５５８９４３）
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０５１１５
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１７４４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０５１１５
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
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