ＣＰＴ−２結晶
【課題】本発明は、CPT-2の結晶およびCPT-2と阻害剤化合物との共結晶を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（CPT）の結晶および本明細書に開示される結晶の座標に基づいて共結晶の構造を決定することによって、CPT-2の新規阻害剤のスクリーニングを可能にする、CPTと阻害剤化合物との共結晶を提供する。
【解決手段】本発明は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（CPT）の結晶および本明細書に開示される結晶の座標に基づいて共結晶の構造を決定することによって、CPT-2の新規阻害剤のスクリーニングを可能にする、CPTと阻害剤化合物との共結晶を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT-2)の結晶、およびCPT-2と阻害剤化合物との共結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（CPT）系は、高等真核生物のミトコンドリアへの長鎖脂肪酸の取り込みを促進する。CPT-1は、ミトコンドリア外膜に組み入れられて、アシル-CoAからの長鎖アシル部分のカルニチンへの転移を触媒する。逆の反応がCPT-2によって行われ、これはミトコンドリア内膜のマトリックス側に存在するタンパク質である。組織特異的CPT-1イソ型の触媒活性の調節は、非インスリン依存型（2型）真性糖尿病および肥満に対する新規薬剤を開発するための焦点となっている。
【０００３】
タンパク質の結晶構造は、酵素の活性部位に結合する化合物を同定して最大限に活用するために有用である。これまで、CPT-2の結晶構造は解明されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、CPT-2の結晶、およびCPT-2と阻害剤化合物との共結晶を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、完全長のラットCPT-2の単独構造、またはパルミトイルカルニチンを模倣する基質類似体である可逆的CPT阻害剤であるST1326との複合体の構造に関する。ST1326と複合体を形成したCPT-2の構造は、タンパク質-リガンド相互作用におけるCPT-1/2および短鎖アシルトランスフェラーゼにおいて保存された残基の役割に洞察を与える。
【０００６】
本発明（１）は、図4または図5に示される構造座標によって定義される構造を有する単離および精製タンパク質である。
本発明（２）は、a＝b＝66Å〜70Å、c＝302Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P43212対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶である。
本発明（３）は、a＝93Å〜97Å、b＝94Å〜98Å、c＝304Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、C2221対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶である。
本発明（４）は、タンパク質CPT-2と、CPT-2の活性部位に結合するリガンドの共結晶であって、a＝83Å〜87Å、b＝94Å〜98Å、c＝121Å〜127Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P212121対称性を有する共結晶である。
本発明（５）は、以下の段階を含む、タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定する方法である：
図4または図5に示すタンパク質CPT-2の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、タンパク質CPT-2の結合ポケットの空間座標を決定する段階；および
タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定するためにタンパク質CPT-2結合ポケットの空間座標に対して候補化合物の組の保存された空間座標を電子的にスクリーニングする段階。
本発明（６）は、以下の段階を含む、CPT-2を活性部位に結合するリガンドと共結晶させるプロセスである：
3.75〜50 mg/mlのCPT-2の緩衝水溶液を提供する段階、
CPT-2の水溶液にモル過剰量のリガンドを加える段階、および
平均分子量200 Da〜20,000 Daを有する0％〜30％（w/v）のPEGの緩衝レザバー(reservoir)溶液を用いて蒸気拡散またはマイクロバッチによって結晶を成長させる段階。
本発明（７）は、緩衝レザバーが、0 M〜2 Mクエン酸トリアンモニウム、pH 7、0 M〜1 M L-プロリン、0 M〜1 Mトリメチルアミン-N-オキシド、0 M〜1 M硫酸アンモニウム、0 M〜1 M硫酸リチウム、0 M〜1 M酢酸アンモニウム、0 M〜1 M蟻酸ナトリウムまたは蟻酸マグネシウム、および0 M〜1 M D/L-リンゴ酸pH 7をさらに含む、本発明(6)のプロセスである。
本発明（８）は、本発明(6)または(7)のプロセスによって生成された結晶である。
本発明（９）は、特に前述の実施例を参照して、先に請求された結晶、方法、およびプロセスである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、CPT-2の結晶、およびCPT-2と阻害剤化合物との共結晶が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
CPT-2の構造を、アポ酵素に関して2.0Åおよび1.6Åの分解能で、ならびにST1326との複合体に関して2.5Åの分解能で三つの異なる結晶型において決定した（詳細に関しては実施例および表1を参照されたい）。
【０００９】
CPT-2の全体的な折り畳みは、アミノ末端（残基111〜440）およびカルボキシ末端（残基441〜658、プラス32〜110）ドメインに細分することができる。これらのドメインは、中心の逆平行β鎖6本からなり、そのうち2本（β1、β16）は、主要なドメインの接触を媒介し、周辺のα-ヘリックス（図1/2）を取り囲む。CPT-2二次構造は、αヘリックス27個およびβ鎖18個を含む。ヘリックス22とへリックス23とを接続するループは、アポ構造において螺旋状のコンフォメーションをとり、したがってヘリックス22Bと呼ばれる。ST1326複合体構造の対応する領域は結晶の接触面に対して近位に存在し、これは二次構造の形成を干渉する可能性がある。他のカルニチンアシルトランスフェラーゼ（L-CPT-1の場合にはアミノ酸29個、図2）と比較した場合のCPT-2において独自に認められるアミノ酸30個のインサートは、アミノ末端ドメインから突出する。
【００１０】
ラットCPT-2の触媒コア全体の電子密度は十分に定義されている。His-タグおよび実際のCPT-2配列の残基5個を含む、結晶化のために用いられる構築物の最初の26個のアミノ末端のアミノ酸は、複合体および双方のアポ構造において不規則である。カルボキシ末端で解釈可能な電子密度を有する最後の残基は、Lys 654（ST1326複合体）およびIle 656（アポ、P43212）であり、完全なカルボキシ末端は、斜方（C2221）アポ構造のA鎖において認識できる。
【００１１】
アポCPT-2およびST1326複合体は、異なる結晶型において結晶化したが、構造は同等のCα原子間のr.m.s.距離0.38Åによって示されるように類似のコンフォメーションを有する。三つ全ての構造において、活性部位残基Arg 498は、ラマチャンドランプロットの寛大な許容領域(generously allowed region)に存在して、Leu 129はAsn 230と共にラマチャンドランプロットの都合のよい外面的形態(favoured geometry)に従わないが、明確な電子密度がこれらの残基に関して認識できる。Leu 129は、II型リバースターンにおける第二の残基（マウスCrATにおけるIle 116と同等、PDBコード1t7n）であるが、Asn 230は、隣接するAsp297およびArg 124との相互作用によりその幾何学が歪められる可能性があるβターンに存在する。Arg 124の変異は、遺伝性CPT-2欠損症に関連している（下記を参照されたい）。
【００１２】
このように、本発明は、図4または図5に示すように構造座標によって定義される構造を有する単離および精製タンパク質に関する。本発明はまた、タンパク質CPT-2の三つの結晶型にも関する。CPT-2の一つの結晶は単位格子寸法a＝b＝66Å〜70Å、c＝302Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°を有し、および結晶はP43212対称性を有する。もう一つの態様において、結晶は単位格子寸法a＝93Å〜97Å、b＝94Å〜98Å、c＝304Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°を有し、および結晶はC2221対称性を有する。本発明はまた、タンパク質CPT-2とCPT-2の活性部位に結合したリガンドとの共結晶にも関し、共結晶の単位格子寸法はa＝83Å〜87Å、b＝94Å〜98Å、c＝121Å〜127Å；α＝β＝γ＝90°を有し、および結晶はP212121対称性を有する。
【００１３】
（表１）データ収集および精密化統計値
*βOG洗浄剤分子（平均B＝54.9Å2）、二つのC16アルキル部分（平均B＝23.3Å2）、および二つの残存非特異的結合CoA分子（平均B＝37.7Å2）は、統計値に含めなかった。
【００１４】
CPT阻害剤ST1326は、ドメイン界面でCPT-2を貫通するトンネルに存在するCPT-2の活性部位に結合する（図3）。ST1326は、CPT-2の生理的基質であるパルミトイル-カルニチンの非切断型類似体である。CPT-2の三裂（Nic a' Bhaird, N., et al., Comparison of the active sites of the purified carnitine acyltransferases from peroxisomes and mitochondria by using a reaction-intermediate analogue. Biochem J., 294,645〜651(1993)）活性部位のアシルトンネルおよびカルニチントンネルは、ST1326によって占有されるが、CoA-トンネルは、CrATとCoAとの複合体構造に基づく相同性モデリングによって割付することができる（図3）。ST1326の親水性アミノカルニチンヘッドグループは、水素結合ネットワークにおいて堅固に結合している。触媒塩基His 372は、本来のリガンドであるパルミトイル-カルニチンのエステル酸素を置換するST1326のアミノ-窒素（N11）と水素結合を形成する。カルニチンアシルトランスフェラーゼの間で保存されたSer-Thr-SerモチーフのSer 590は、リガンドのカルバモイル-酸素（O13）に対して水素結合を形成する。カルボキシ末端ドメインのTyr 486、Ser 488、およびThr 499は、ST1326のカルボキシル酸素（O9およびO10）に対して直接水素結合する。Arg 554のグアニジウム基に対する水素結合は、Tyr 486およびThr 499の配向性をさらに安定化させる。アミノ末端ドメインの残基Trp 116、Tyr 120、およびAsp 376ならびに協奏的に固定された水分子も同様に、ST1326のカルボキシ基に結合する水素結合ネットワークの一部である。Arg 498は、Asp 376の側鎖と強い水素結合を形成し、そのグアニジウム基は、触媒ループにおけるSer373の主鎖カルボニル酸素と相互作用して、それによって活性部位残基を触媒作用にとって理想的な位置にする。ST1326の陽性荷電三級アミンは、保存されたPhe 602との陽イオン-pi相互作用によって安定化される。
【００１５】
ST1326の脂肪族テトラデカノイルテールを収容する疎水性トンネルには、ドメイン界面で逆平行β-シートを形成するβ鎖1および16の残基および二つのカルボキシ末端β鎖17および18の残基が並んでいる。2.5σで輪郭を示したシミュレーションアニーリングfofcマップ(simulated annealing fofc map)は、活性部位に結合したリガンドST1326に関して明確な電子密度を示す。疎水性トンネルを形成するβ鎖は、CrATおよびCrOTにおける閉鎖配列と比較して（PDBコード1ndb、1t7n、および1xl8）、基質類似体ST1326の伸長した疎水性テールのための空間を形成するために互いに離れている。よりかさの大きい残基がCrAT（Met 564）およびCrOT（Gln 552）において認められる位置でのグリシン残基Gly 600は、CPT-2におけるLCFAカルニチン誘導体の結合を可能にして、それによって基質特異性を決定する。CrATおよびCrOTとは対称的に、アシルトンネルはCPT-2の表面で開通している。
【００１６】
CPT-2のGlu 487およびGlu 500は、カルニチンアシルトランスフェラーゼの間において保存されており、変異体分析によって基質結合および触媒に関与している（Zheng, G., et al., Identification by mutagenesis of a conserved glutamate (Glu 487)residue important for catalytic activity in rat liver carnitine palmitoyltransferase II. J. Biol. Chem. 277,42219〜42223(2002)）。CPT-2の結晶構造から、実際にGlu 487がCoAを収容する活性部位トンネルの一部に存在することが判明した。Glu 487は、高度に保存されたAsp 464と共に、基質を活性部位に誘導するためにおそらく必要な陰性荷電の区画を形成する。Glu 500の側鎖は、アシルトランスフェラーゼ基質のカルニチン部分の結合にとって必要な水素ネットワークの重要な成分である保存されたArg 554の主鎖と相互作用する。
【００１７】
アポ構造において、Tyr 120の側鎖および触媒性His 372は、高品質のデータセットおよび構造分析の分解能にもかかわらず、不規則である。ST1326の親水性アミノカルニチンヘッドグループと相互作用する活性部位におけるそれらの残基ならびにSer590は、リガンド結合から離れているが、活性部位トンネルの全体的な形状は、アポ酵素では予め形成されている。
【００１８】
臨床的に不均一な疾患であるCPT-2欠損症は、CPT-2遺伝子における様々な変異によって引き起こされ、常染色体劣性様式で遺伝される（Bonnefont, J-P. et al. Carnitine palmitoyltransferases 1 and 2 : biochemical, molecular and medical aspects. Mol. Aspects Med., 25, 495〜520(2004)；Bonnefont, J.P. et al. Carnitine palmitoyltransferase deficiencies. Mol. Genet. Metab., 68,424〜440(1990)）。障害の二つの異なる症状、すなわち早期発症（新生児または乳児）型およびより頻繁な成人型は、CPT-2欠損症の発症時期に基づいて区別することができる。早期発症型は、心筋症および低ケトン性低血糖症を含む重度の総体的症状を特徴として、乳児突然死症候群における急性の肝不全に関連している（Demaugre, F. et al. Infantile form of carnitine palmitoyltransferase II deficiency with hepatomusucular symptoms and sudden death. Physiopathological approach to carnitine palmitoyltransferase II deficiencies. J. Clin. Invest., 87,859〜864(1991)）。成人CPT-2欠損症の臨床兆候は、絶食および疲労に反応した再発性の筋肉痛およびミオグロビン尿症である。
【００１９】
CPT-2のコード領域において、酵素における単アミノ酸交換に至る30個より多い点突然変異が、タンパク質のフレームシフトまたは切断を引き起こす欠失／挿入の他に同定されている。CPT-2遺伝子の切断が起こると、新生児においてCPT-2機能の喪失により重度CPT-2欠損症が表れることは不可避であるが、遺伝子型と臨床表現型の重症度との段階的相関は、ホモ接合状体において記述されているそれらのミスセンス変異に関して明白となっている（表2）（Bonnefont, J.P. et al. Carnitine palmitoyltransferase deficiencies. Mol. Genet. Metab., 68,424〜440(1999)；Thuillier, L. et al. Correlation between genotype, metabolic data, and clinical presentation in carnitine palmitoyltransferase 2(CPT2)deficiency. Hum. Mutat., 21, 493〜501(2003)）。この相関に対する例外は、Arg 631 Cys変異であり、これはCPT-2欠損症の乳児型と同様に成人型の双方のホモ接合患者において同定されている。CPT-2の結晶構造によって、記述の変異（表2に概要）のマッピングおよび効果の解釈が可能となる。成人型CPT-2欠損症のほとんど（60％）は、Ser113 Leu変異に関連している。Ser113は、ドメイン界面に近いヘリックスα5のアミノ末端に存在する。Ser113の側鎖は周囲のアミノ酸とは全く直接接触していないが、この残基がより大きい疎水性のLeuに変異すると、隣接するPhe 117との相互作用が変化する。これによって、触媒上重要な残基であるTrp 116およびArg 498の位置および環境が変化して、酵素の活性はより低くなる（Taroni, F. et al. Identification of a common mutation in the carnitine palmitoyltransferase II gene in familial recurrent myoglobinuria patients. Nat. Genet., 4,314〜320(1993)）。
【００２０】
Asp 213およびGlu 487は、天然に存在する変異によって影響を受け、生化学分析によりCPT-2機能にとって重要であることが決定されている（Zheng, G., et al., Identification by mutagenesis of a conserved glutamate(Glu 487)residue important for catalytic activity in rat liver carnitine palmitoyltransferase II. J. Biol. Chem. 277,42219〜42223(2002)；Liu, H., et al., Cysteine-scanning mutagenesis of muscle carnitine palmitoyltransferase I reveals a single cysteine residue (Cys-305) is important for catalysis. J. Biol. Chem., 280,4524〜4531(2005)）。Asp 213は、CPT-2のβ3とα10のあいだのループに存在し、全てのヒトCPT-1イソ型において保存されているシステインと共に整列する。このシステインがアラニンに変異すると、ヒトM-CPT-1において酵素活性は完全に消失し、このことはこの位置が全てのCPTイソ型における構造的完全性にとって極めて重要であることを示している。CPT-2において、Asp213の側鎖は、His 496の主鎖の窒素と強く相互作用する。これは、基質結合に関与するArg 498およびArg 499の配置にとって重要である。β13におけるGlu 487のアスパラギン酸への変異によって、CPT-2活性のほぼ完全な喪失が起こる。Glu 487は、CoAトンネル表面の一部であることから、この変異はCoA結合を妨害し得る。CPT-2の結晶構造から、487位のアスパラギン酸は、保存されたSTSモチーフのThr 589の側鎖と強い水素結合を形成して、それによって活性部位の外面的形態を歪めるであろうと予測することができる。Glu 487 Lys交換は、CPT-2欠損症において同定された変異6個中1個であり、これはCPT-1、CrATおよびCrOTにおいて完全に保存されている分子内塩橋または水素結合相互作用の破壊を引き起こす（表2）。Arg 296のグアニジウム窒素は、カルニチンアシルトランスフェラーゼにおいて保存されているAsp 353の側鎖酸素と強く（2.7Å）接触している。M-CPT-1における同等の残基Asp 454は、触媒トライアドの一部であると提唱されているが（Liu, H., et al., Cysteine-scanning mutagenesis of muscle carnitine palmitoyltransferase I reveals a single cysteine residue(Cys-305)is important for catalysis. J. Biol. Chem., 280,4524〜4531(2005)）、CPT-2結晶構造は、この残基が保存された塩橋を形成することを意味している。CPT-2欠損症に関連して報告された変異はいずれもインサートに存在せず、それらは三次元構造において均一に分布している。
【００２１】
（表２）ヒトCPT-2欠損症において変異している残基。
影響を受ける残基は全てラットおよびヒトCPT-2の間で保存されている。CPT-IIのヒトおよびラットイソ型に関する残基の番号付けは同一である。Aと記されたホモ接合変異は、晩発型の成人型CPT-2欠損症に関連しており、Iと記された変異は早期発症型乳児型に関連している。
【００２２】
本発明のアポ、誘導体、および共結晶は、バッチ法、（改変）マイクロバッチ法、液体架橋法、透析法、蒸気拡散法、および懸滴法を含む、タンパク質結晶学の技術分野において周知の技術によって得ることができる（例えば、McPherson, 1982, Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, NY；McPherson, 1990, Eur. J. Biochem. 189:1〜23；Webber, 1991, Adv. Protein Chem. 41:1〜36；Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, Edited by Arnaud Ducruix and Richard Giege, Oxford University Press；Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips. Edited by Terese Bergfors, International University Line, 1999を参照されたい）。一般的に、本発明のアポまたは共結晶は、実質的に純粋なCPT-2ポリペプチドを、タンパク質を沈殿させるために必要な濃度よりわずかに下の濃度の沈殿剤を含む水性緩衝液中に入れることによって成長させる。蒸発を制御することによって水を溶液から除去して、結晶化条件を形成して、これを結晶の成長が終わるまで維持する。
【００２３】
本明細書において用いられるように、「緩衝水溶液」は、酸または塩基を溶液に加えた場合に溶液のpHの変化を最小限にする基質を含む水性基剤の溶液を指す。
【００２４】
本明細書において用いられるように、「モル過剰量」とは、タンパク質分子の数より多いリガンド分子を指す。
【００２５】
本明細書において用いられるように、「蒸気拡散」は、結晶化溶液を気体相のみを通して沈殿剤レザバー溶液によって平衡化させる、当技術分野で周知のタンパク質結晶化法を指す。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、アポまたは共結晶は、蒸気拡散によって成長させる。この方法において、ポリペプチド／沈殿剤溶液を、結晶を生成させるために最適な沈殿剤濃度を有するより大きい水性レザバーを有する密封容器において平衡にする。一般的に実質的に純粋なポリペプチド溶液約10 μL未満を等量または類似の量のレザバー溶液と混合して、沈殿剤濃度を結晶化にとって必要な濃度である約2分の1にする。この溶液をカバーガラスの下に小滴として懸垂し、これをレザバーの上部で密封する。密封容器を、結晶が成長するまで1日〜1年、通常約2〜6週間静置する。
【００２７】
本発明の結晶に関して、室温（21℃±2℃）で成長させたラットCPT-2[25 mMトリス/HCl pH 8.0、0.15 M NaCl、2 mM TCEP、1％（w/v）n-オクチル-β-D-グルコピラノシド（βOG）または0.33％（w/v）CHAPSまたは1.15 mM n-ドデシル-β-D-マルトシド（DBM）および0.02％（w/v）NaN3において3.75〜50 mg/mlラットCPT-2]約2〜5μlと、レザバー緩衝液0.33〜1.0 mLの上に約1〜7日間懸垂した等量または類似の量のレザバー溶液（インデックス21、37、61、62、69、75、76、79、88、90、91、92、Hampton Resarchと共に、その成分のpHまたは濃度を変化させることによってこれらから誘導した溶液）とを含む懸滴が、高分解能X線構造決定にとって適した結晶を提供することが判明した。特に好ましい条件は、ラットCPT-2約0.1μl〜1μl（25 mMトリス/HCl pH 8.0、0.15 M NaCl、2 mM TCEP、および1％（w/v）β-D-OGにおいて13.5 mg/ml）を3倍モル過剰量のST1326と共にプレインキュベートすることによる（改変）マイクロバッチアッセイ法と共に、レザバー溶液（インデックス91、Hampton Resarch）0.33〜1.0 mlの上でインデックス91（Hampton Resarch）沈殿剤溶液0.5μl〜2μlと混合したラットCPT-2 1μl〜5μl（12 mg/ml、通常の発現から、またはセレノ-メチオニンによって標識したタンパク質として、25 mMトリス/HCl pH 8.0、0.15 M NaCl、2 mM TCEPおよび1％（w/v）β-D-OGにおいて）による懸滴アッセイであった。
【００２８】
懸滴において成長した結晶は全て、複合体構造の場合には液体窒素における凍結の前、または液体窒素冷却装置を備えたゴニオメーターに載せる前に、20％（w/v）〜30％（w/v）ポリエチレングリコール200（PEG 200）および適当なリガンド濃度を添加したそれぞれの母液に沈めた。マイクロバッチ法を用いて成長させた結晶は、懸滴において成長させた結晶について記述したように凍結するか、または結晶周囲の母液および油を約100％（v/v）パラフィン油に交換した。
【００２９】
典型的に2.0Åまでの回折データは、SLS、Villigen、SwitzerlandでシンクロトロンビームラインX10SA（PX1）またはX10SA（PX2）で凍結した結晶から回収した。最適な条件下で1.6Åまでのデータを記録した。
【００３０】
当然、当業者は、上記の結晶条件を変更できることを認識するであろう。そのような変更は、単独または併用して用いてもよく、ポリペプチド濃度1 mg/mL〜60 mg/mL、pHを約3.0〜約11.0に維持することができる市販の緩衝系、様々な濃度の還元成分（ジチオスレイトール、ジチオエリトール、β-メルカプトエタノールまたは他の等技術分野において認識される同等物）、濃度0％（w/v）〜30％（w/v）の糖もしくはグリセロールのような安定化成分を含むポリペプチド溶液、またはCPT-2に結合することが公知である他のリガンドの置換が含まれる。濃度約1％（w/v）〜約30％（w/v）のポリエチレングリコール（PEG）、平均分子量約200〜約20,000ダルトンのポリエチレングリコールを含む沈殿剤およびレザバー溶液、ならびに温度は4℃〜30℃の範囲である。
【００３１】
このように、本発明はまた、3.75〜50 mg/ml CPT-2の緩衝水溶液を提供する段階、CPT-2の水溶液にリガンドのモル過剰量を加える段階、および0％〜30％（w/v）PEGの緩衝レザバー溶液を用いて蒸気拡散またはマイクロバッチによって結晶を成長させる段階を含む、活性部位に結合するリガンドとCPT-2とを共結晶化させるプロセスであって、PEGが平均分子量200 Da〜20000 Daを有するプロセスに関する。PEGは、モノメチルエステルとして加えてもよい。平均分子量500 Da〜5,000 DaのPEGを用いてもよい。緩衝レザバー溶液はさらに、0 M〜2 Mクエン酸トリアンモニウム、pH 7、0 M〜1 M L-プロリン、0 M〜1 Mトリメチルアミン-N-オキシド、0 M〜1 M硫酸アンモニウム、0 M〜1 M硫酸リチウム、0 M〜1 M酢酸アンモニウム、0 M〜1 M蟻酸ナトリウムまたは蟻酸マグネシウム、および0 M〜1 M D/L-リンゴ酸pH 7を含む。該マイクロバッチは改変してもよい。本発明はさらに、本明細書において以下に記述されるプロセスによって生成される結晶にも関する。
【００３２】
本発明の誘導体結晶は、X線結晶学の当業者に公知の技法に従って重金属原子の塩を含む母液においてアポまたは共結晶を浸すことによって得ることができる。
【００３３】
本発明の共結晶は、母液または活性部位に結合するリガンドを含む任意の他の安定化溶液において、低親和性リガンドと共にCPT-2のアポ結晶もしくは結晶を浸すことによって得ることができ、または活性部位に結合する一つもしくはそれ以上のリガンドの存在下でCPT-2ポリペプチドを共結晶化することによって得ることができる。
【００３４】
本明細書に記述の結晶CPT-2の三次元構造を得る方法と共に、原子構造座標を得る方法は、当技術分野において周知である（例えば、D.E. McRee, Practical Protein Crystallography, Academic Press出版, San Diego(1993)およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【００３５】
本発明の結晶、および特にそこから得られる原子構造座標は、多様な用途を有する。例えば、本明細書に記述の結晶および構造座標は、新規治療物質を開発するためのアプローチとして、CPT-2の活性を阻害する、または一般的に改変する化合物を同定するために特に有用である。
【００３６】
本明細書に記述の構造座標は、さらなる天然または変異CPT-2の結晶構造と共に、そのようなCPT-2と結合した阻害剤または活性化剤との共結晶の構造を決定するためのフェージングモデルとして用いることができる。構造座標と共にそこから得られる三次元構造のモデルも同様に、NMRによって得られるもののような、天然または変異CPT-2の溶液に基づく構造の解明を助けるために用いることができる。このように、本発明の結晶および原子構造座標は、CPT-2の構造および機能を解明するための簡便な手段を提供する。
【００３７】
このように、本発明はまた、以下の段階を含む、タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定する方法を提供する：タンパク質CPT-2の結合ポケットの空間座標を決定するために、図4または図5に示されるタンパク質CPT-2の原子座標に、三次元分子モデリングアルゴリズムを適用する段階；およびタンパク質Pに結合することができる化合物を同定するために、タンパク質CPT-2結合ポケットの空間座標に対して候補化合物の組の保存された空間座標を電子的にスクリーニングする段階。
【００３８】
結晶、共結晶、方法、および本明細書において以降記述するプロセスに関する態様において、該CPT-2タンパク質はラットCPT-2タンパク質である。さらに、該ラットCPT-2タンパク質は、配列番号：2のタンパク質であってもよい。
【００３９】
明瞭性および考察の目的のために、本発明の結晶は、特異的CPT-2の例としてのアポ結晶および共結晶を参照して記述されるであろう。当業者は、本明細書に記述の原理が一般的に、配列番号：2のCPT-2が含まれるがこれらに限定されない任意の哺乳類CPT-2に応用可能であることを認識するであろう。
【００４０】
本明細書において用いられるように、「アポ結晶」は、部位特異的リガンドを加えずに形成されたCPT-2の結晶を指す。
【実施例】
【００４１】
実施例1：タンパク質発現および精製
ラットCPT-2のアミノ酸27〜658位をコードするDNA（V.A. Zammit博士, Hannah Research Institute, Ayr, Scotlandの贈与）を、Novagen pET28aベクターにサブクローニングした。この構築物を用いて、大腸菌株BL21DE3において20℃で完全長CPT-2（ミトコンドリア輸入配列、CPT-2前駆体のアミノ酸1〜26位を含まない）を発現させた。細胞の破壊後、溶解物（50 mM HEPES/NaOH pH 8、0.15 M NaCl、5 mM TCEP、10 mM MgCl2、30 mg/l DNアーゼI、30 Tbs./l Rocheコンプリートプロテアーゼインヒビター）を0.1％（v/v）トライトンX-100によって調節した。溶解および遠心（30,000 g、45分）の後に、Ni-NTA樹脂において固定金属アフィニティクロマトグラフィーを行った。洗浄剤を、カラムにおいて1％（v/v）n-オクチル-β-D-グルコピラノシド（βOG）に交換した。IMAC段階からの溶出液を、25 mMトリス/HCl pH 8、0.15 M NaCl、2 mM TCEP、1％（v/v）βOG、0.02％（w/v）NaN3によって平衡にしたサイズ排除クロマトグラフィーに供した。ESI-MSにより、CPT-IIの同一性が確認され、タンパク質がアミノ末端α-N-グルコノイル化によって修飾されていることが示された（Geoghegan, K.F. et al., Spontaneous alpha-N-6-phosphogluconoylation of a "His Tag" in Escherichia coli : the cause of extra mass of 258 or 178 Da in fusion proteins. Anal. Biochem., 267,169〜184(1999)）（データは示していない）。His-タグはトロンビンによって切断されなかった。10 L発酵物（バイオマス45 g）によって、電気泳動上純粋な、単量体および単分散タンパク質30 mgが生成された。
【００４２】
実施例2：タンパク質の結晶化
アポCPT-2およびST1326[(R)-N-テトラデシルカルバモイル-アミノカルニチン]複合体の結晶（H2O/NaOHにおいて33 mM保存溶液）は、タンパク質濃度15 mg/ml（25 mMトリス/HCl pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM TCEP、1％（w/v）n-オクチル-β-D-グルコピラノシドおよび0.02％（w/v）NaN3において）で21℃で、25％（w/v）PEG 1500による懸滴または0.15 M DL-リンゴ酸pH 7.0、20％（w/v）PEG 3350による改変マイクロバッチ（D'Arcy, A., et al., The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Cryst. D59,396〜399(2003)）法を用いてそれぞれ得た（インデックス37および91、Hampton Research）。複合体形成の場合、CPT-2を、結晶化の前に氷中で阻害剤ST1326の3倍モル過剰量と共に3時間インキュベートした。結晶を、25％（w/v）PEG 200（アポ）を添加した母液において30秒間浸した後、または100％（v/v）パラフィン油（ST1326）に対して過剰量の母液およびAl's油を交換した後に液体窒素中で瞬間凍結した。
【００４３】
実施例3：データ収集およびプロセシング
アポCPT-2およびST1326複合体のデータセットをSLS、Villigen、SwitzerlandのビームラインX10SAにおいて収集した。測定は、λ＝0.97853Å（アポ、Seピーク波長）およびλ＝1.008Å（ST1326）で100 Kで行った。データセットをXDSによって処理し、比較した（Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst., 26,795〜800(1993)）。空間群はP43212（アポ正方晶系、a＝b＝67.6、c＝307.3、α＝β＝γ＝90°、マシューズ係数＝2.4（Matthews, B.W. J. Mol. Biol., 33,491〜497(1968)）、C2221（アポ斜方晶系、a＝95.2、b＝97.3、c＝310.4、マシューズ係数＝2.4）、およびP212121（ST1326、a＝85.8、b＝96.2、c＝124.3、α＝β＝γ＝90°、マシューズ係数＝3.5）であると決定された。アポCPT-2の最初の結晶は、1.9Å分解能で回折したが、空間群を明白に割付することができなかった。対照的に、標準的な技術によって標識したセレノ-メチオニンである材料から得られたアポ結晶（Chene, C. et al. Crystallization of the complex of human IFN-gamma and the extracellular domain of the IFN-gamma receptor. Proteins, 23,591〜594(1995)）は、優れた回折品質を有し、これは、標識の際の異なる培地組成および細菌タンパク質発現プロファイルによりタンパク質品質の改善に帰し得るであろう。
【００４４】
XDS拒絶統計値は、0.26％の拒絶されたミスフィットを報告し、これはRmergeのかなり高い値16.7％にもかかわらず、複合体結晶に関して正確な空間群としてP212121の選択を完全に裏付ける。データ統計値を表1に要約する。どちらの結晶型も非対称単位あたりCPT-2を1分子含む。
【００４５】
構造溶液および精密化。CCP4界面においてAMoReを用いて分子置換を行った（Navazza, J. AMoRe : a new package for molecular replacement, in Molecular replacement. Proceedings of the CCP4 Study Weekend, 87-90, Daresbury Laboratory, Warrington, England(1992)；Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 suite : Programs for protein crystallography. Acta Cryst. D50, 760〜763(1994)）。ST1326複合体に関して、マウスCrAT（Hsiao, Y.S. et al., Structural and biochemical studies of the substrate selectivity of carnitine acetyltransferase. J. Biol. Chem., 279,31584〜31589(2004)）（PDBコード1t7n）に基づいてXSAE（C. Broger, F. Hoffman La Roche）によって構築したラットCPT-2相同体モデルを、検索モデルとして用いた。CNSによるシミュレーションアニーリングによって溶液を精密化した（Brunger, A.T. X-PLOR Manual Version 3.1. New Haven, CT, USA, Yale University Press(1992)）。最終的なモデルは、MOLOCにおけるモデル構築の反復性のサイクル（Gerber, P.R. Peptidemechanics : a force field for peptides and proteins working with entire residues as small units. Biopolymers, 32,1003〜1017(1992)）、autoBUSTERにおける溶媒構築（Roversi, P., et al., Modelling prior distributions of atoms for macromolecular refinement and completion. Acta Cryst., D56,1316〜1323(2000)）、およびRefmacにおける精密化（Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Lebedev, A., Wilson, K.S. & Dodson, E.J. Efficient anisotropic refinement of macromolecular structures using FFT. Acta Cryst. D55,247〜255(1999)）を用いて構築した。Se標識にもかかわらず、アポ構造はまた、検索モデルとして精密化複合体構造を用いた分子置換の後に、Arp/wArp（Perrakis, A., et al., Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol., 6,458〜463(1999)）による自動モデル構築、繰り返しRefmac、およびMOLOCサイクルによって解決された。斜方晶系（正方晶系）アポ構造に関して、残基の94.0％（92.7％）が最も好ましい領域に存在し、5.4％（6.8％）がラマチャンドランプロットのさらに許容される領域に存在した。ST1326複合体構造に関して、これらの値はそれぞれ88.2％および11.3％であった。Arg 498（寛大な許容領域）およびLeu 129と共にAsn 230（ラマチャンドランのアウトライアー）が、100％までの差の残りを占める。
【００４６】
精密化統計値を表1に概要する。分子を表す図は、PyMol（DeLano, W.L. The PyMOL User's Manual, DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA(2002)）およびMOE（Chemical Computing Group Inc., MOE, 1010 Sherbrooke Street West, Suite 910, Montreal, Canada, H3A 2R7）によって作製した。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ST1326が活性部位に結合したラットCPT-2の構造。リガンドST1326およびその周囲のfofcシミュレーションアニーリング電子密度マップ（2.5σでの輪郭）をA〜Cにおいてピンク色で示す。図1-A、ST1326は、ラットCPT-2のアミノ末端（オレンジ色）およびカルボキシ末端（シアン）ドメインの界面で結合する。図1-B、中央のβ鎖（青色）は、α-ヘリックス（緑色）によって取り囲まれ、CPT-2特異的インサート（赤色）は、アミノ末端ドメインから突出している。図1-C、Bと同じであるが、後方に90°回転させた。
【図２】ラットCPT-2（rCPT-2）およびヒトCPT-1（hCPT-1）のアミノ酸配列アラインメント。二次構造エレメント（S.S.）を示す。残基の番号付けは、rCPT-2前駆体に対応し、そのミトコンドリア輸入配列を斜体で示す。CPT-2特異的インサート（アミノ酸179〜208）を下線で示す。rCPT-2のアシルカルニチン結合部位のKeey残基を太字で示し、hCPT-1において完全に保存されている場合には*で標識する。CPT-2欠損症において変異することが報告されている残基を赤色で印字する。
【図３】図3-A、ドメイン界面に対して垂直に見た活性部位トンネルの立体図。重要な活性部位を黄色で示す。共結晶化したST1326をピンク色で示し、CoA分子（青色）は、CrAT-CoA複合体構造（PDBコード1t7q）からのCoA座標に基づいてモデルを作製した。図3-B、原子番号をつけたST1326のフィッシャー投影。
【図４−１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図である。
【図４−２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-1の続きである。
【図４−３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-2の続きである。
【図４−４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-3の続きである。
【図４−５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-4の続きである。
【図４−６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-5の続きである。
【図４−７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-6の続きである。
【図４−８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-7の続きである。
【図４−９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-8の続きである。
【図４−１０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-9の続きである。
【図４−１１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-10の続きである。
【図４−１２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-11の続きである。
【図４−１３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-12の続きである。
【図４−１４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-13の続きである。
【図４−１５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-14の続きである。
【図４−１６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-15の続きである。
【図４−１７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-16の続きである。
【図４−１８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-17の続きである。
【図４−１９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-18の続きである。
【図４−２０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-19の続きである。
【図４−２１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-20の続きである。
【図４−２２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-21の続きである。
【図４−２３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-22の続きである。
【図４−２４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-23の続きである。
【図４−２５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-24の続きである。
【図４−２６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-25の続きである。
【図４−２７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-26の続きである。
【図４−２８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-27の続きである。
【図４−２９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-28の続きである。
【図４−３０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-29の続きである。
【図４−３１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-30の続きである。
【図４−３２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-31の続きである。
【図４−３３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-32の続きである。
【図４−３４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-33の続きである。
【図４−３５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-34の続きである。
【図４−３６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-35の続きである。
【図４−３７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-36の続きである。
【図４−３８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-37の続きである。
【図４−３９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-38の続きである。
【図４−４０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-39の続きである。
【図４−４１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-40の続きである。
【図４−４２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-41の続きである。
【図４−４３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-42の続きである。
【図４−４４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-43の続きである。
【図４−４５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-44の続きである。
【図４−４６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-45の続きである。
【図４−４７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-46の続きである。
【図４−４８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-47の続きである。
【図４−４９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-48の続きである。
【図４−５０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-49の続きである。
【図４−５１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-50の続きである。
【図４−５２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-51の続きである。
【図４−５３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-52の続きである。
【図４−５４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-53の続きである。
【図４−５５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-54の続きである。
【図４−５６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-55の続きである。
【図４−５７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-56の続きである。
【図４−５８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-57の続きである。
【図４−５９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-58の続きである。
【図４−６０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-59の続きである。
【図４−６１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-60の続きである。
【図４−６２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-61の続きである。
【図４−６３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-62の続きである。
【図４−６４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-63の続きである。
【図４−６５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-64の続きである。
【図４−６６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-65の続きである。
【図４−６７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-66の続きである。
【図４−６８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-67の続きである。
【図４−６９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-68の続きである。
【図４−７０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-69の続きである。
【図４−７１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-70の続きである。
【図４−７２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-71の続きである。
【図４−７３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-72の続きである。
【図４−７４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-73の続きである。
【図４−７５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-74の続きである。
【図４−７６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-75の続きである。
【図４−７７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-76の続きである。
【図４−７８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-77の続きである。
【図４−７９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-78の続きである。
【図４−８０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-79の続きである。
【図４−８１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-80の続きである。
【図４−８２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-81の続きである。
【図４−８３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-82の続きである。
【図４−８４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-83の続きである。
【図４−８５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-84の続きである。
【図４−８６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-85の続きである。
【図４−８７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-86の続きである。
【図４−８８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-87の続きである。
【図４−８９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-88の続きである。
【図４−９０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-89の続きである。
【図４−９１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-90の続きである。
【図４−９２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-91の続きである。
【図４−９３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-92の続きである。
【図４−９４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-93の続きである。
【図４−９５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-94の続きである。
【図４−９６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-95の続きである。
【図４−９７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-96の続きである。
【図４−９８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-97の続きである。
【図４−９９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-98の続きである。
【図４−１００】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-99の続きである。
【図４−１０１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-100の続きである。
【図４−１０２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-101の続きである。
【図４−１０３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-102の続きである。
【図４−１０４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-103の続きである。
【図４−１０５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-104の続きである。
【図４−１０６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-105の続きである。
【図４−１０７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-106の続きである。
【図４−１０８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-107の続きである。
【図４−１０９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-108の続きである。
【図４−１１０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-109の続きである。
【図４−１１１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-110の続きである。
【図４−１１２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-111の続きである。
【図４−１１３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-112の続きである。
【図４−１１４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-113の続きである。
【図４−１１５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-114の続きである。
【図４−１１６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-115の続きである。
【図４−１１７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-116の続きである。
【図４−１１８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-117の続きである。
【図４−１１９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-118の続きである。
【図４−１２０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-119の続きである。
【図４−１２１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-120の続きである。
【図４−１２２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-121の続きである。
【図４−１２３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-122の続きである。
【図４−１２４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-123の続きである。
【図４−１２５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-124の続きである。
【図４−１２６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-125の続きである。
【図４−１２７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-126の続きである。
【図４−１２８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-127の続きである。
【図４−１２９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-128の続きである。
【図４−１３０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-129の続きである。
【図４−１３１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-130の続きである。
【図４−１３２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-131の続きである。
【図４−１３３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-132の続きである。
【図４−１３４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-133の続きである。
【図４−１３５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-134の続きである。
【図４−１３６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-135の続きである。
【図４−１３７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-136の続きである。
【図４−１３８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-137の続きである。
【図４−１３９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-138の続きである。
【図４−１４０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-139の続きである。
【図４−１４１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-140の続きである。
【図４−１４２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-141の続きである。
【図４−１４３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-142の続きである。
【図４−１４４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-143の続きである。
【図４−１４５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-144の続きである。
【図４−１４６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-145の続きである。
【図４−１４７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-146の続きである。
【図４−１４８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-147の続きである。
【図４−１４９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-148の続きである。
【図４−１５０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-149の続きである。
【図４−１５１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-150の続きである。
【図４−１５２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-151の続きである。
【図４−１５３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-152の続きである。
【図４−１５４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-153の続きである。
【図４−１５５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-154の続きである。
【図４−１５６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-155の続きである。
【図４−１５７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-156の続きである。
【図４−１５８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-157の続きである。
【図４−１５９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-158の続きである。
【図４−１６０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-159の続きである。
【図４−１６１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-160の続きである。
【図４−１６２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-161の続きである。
【図４−１６３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-162の続きである。
【図４−１６４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-163の続きである。
【図４−１６５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-164の続きである。
【図４−１６６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-165の続きである。
【図４−１６７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-166の続きである。
【図４−１６８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-167の続きである。
【図４−１６９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-168の続きである。
【図４−１７０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-169の続きである。
【図４−１７１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-170の続きである。
【図４−１７２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-171の続きである。
【図４−１７３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-172の続きである。
【図４−１７４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-173の続きである。
【図４−１７５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-174の続きである。
【図４−１７６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-175の続きである。
【図４−１７７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-176の続きである。
【図４−１７８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-177の続きである。
【図４−１７９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-178の続きである。
【図４−１８０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-179の続きである。
【図４−１８１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-180の続きである。
【図４−１８２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-181の続きである。
【図４−１８３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-182の続きである。
【図４−１８４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-183の続きである。
【図４−１８５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-184の続きである。
【図４−１８６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-185の続きである。
【図４−１８７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-186の続きである。
【図４−１８８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-187の続きである。
【図４−１８９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-188の続きである。
【図４−１９０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-189の続きである。
【図４−１９１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-190の続きである。
【図４−１９２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-191の続きである。
【図４−１９３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-192の続きである。
【図４−１９４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-193の続きである。
【図４−１９５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-194の続きである。
【図４−１９６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-195の続きである。
【図４−１９７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-196の続きである。
【図４−１９８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-197の続きである。
【図４−１９９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-198の続きである。
【図４−２００】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-199の続きである。
【図４−２０１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-200の続きである。
【図４−２０２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-201の続きである。
【図４−２０３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-202の続きである。
【図４−２０４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-203の続きである。
【図４−２０５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-204の続きである。
【図５−１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図である。
【図５−２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-1の続きである。
【図５−３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-2の続きである。
【図５−４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-3の続きである。
【図５−５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-4の続きである。
【図５−６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-5の続きである。
【図５−７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-6の続きである。
【図５−８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-7の続きである。
【図５−９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-8の続きである。
【図５−１０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-9の続きである。
【図５−１１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-10の続きである。
【図５−１２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-11の続きである。
【図５−１３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-12の続きである。
【図５−１４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-13の続きである。
【図５−１５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-14の続きである。
【図５−１６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-15の続きである。
【図５−１７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-16の続きである。
【図５−１８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-17の続きである。
【図５−１９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-18の続きである。
【図５−２０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-19の続きである。
【図５−２１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-20の続きである。
【図５−２２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-21の続きである。
【図５−２３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-22の続きである。
【図５−２４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-23の続きである。
【図５−２５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-24の続きである。
【図５−２６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-25の続きである。
【図５−２７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-26の続きである。
【図５−２８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-27の続きである。
【図５−２９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-28の続きである。
【図５−３０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-29の続きである。
【図５−３１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-30の続きである。
【図５−３２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-31の続きである。
【図５−３３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-32の続きである。
【図５−３４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-33の続きである。
【図５−３５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-34の続きである。
【図５−３６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-35の続きである。
【図５−３７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-36の続きである。
【図５−３８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-37の続きである。
【図５−３９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-38の続きである。
【図５−４０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-39の続きである。
【図５−４１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-40の続きである。
【図５−４２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-41の続きである。
【図５−４３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-42の続きである。
【図５−４４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-43の続きである。
【図５−４５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-44の続きである。
【図５−４６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-45の続きである。
【図５−４７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-46の続きである。
【図５−４８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-47の続きである。
【図５−４９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-48の続きである。
【図５−５０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-49の続きである。
【図５−５１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-50の続きである。
【図５−５２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-51の続きである。
【図５−５３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-52の続きである。
【図５−５４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-53の続きである。
【図５−５５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-54の続きである。
【図５−５６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-55の続きである。
【図５−５７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-56の続きである。
【図５−５８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-57の続きである。
【図５−５９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-58の続きである。
【図５−６０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-59の続きである。
【図５−６１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-60の続きである。
【図５−６２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-61の続きである。
【図５−６３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-62の続きである。
【図５−６４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-63の続きである。
【図５−６５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-64の続きである。
【図５−６６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-65の続きである。
【図５−６７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-66の続きである。
【図５−６８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-67の続きである。
【図５−６９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-68の続きである。
【図５−７０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-69の続きである。
【図５−７１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-70の続きである。
【図５−７２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-71の続きである。
【図５−７３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-72の続きである。
【図５−７４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-73の続きである。
【図５−７５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-74の続きである。
【図５−７６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-75の続きである。
【図５−７７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-76の続きである。
【図５−７８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-77の続きである。
【図５−７９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-78の続きである。
【図５−８０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-79の続きである。
【図５−８１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-80の続きである。
【図５−８２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-81の続きである。
【図５−８３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-82の続きである。
【図５−８４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-83の続きである。
【図５−８５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-84の続きである。
【図５−８６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-85の続きである。
【図５−８７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-86の続きである。
【図５−８８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-87の続きである。
【図５−８９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-88の続きである。
【図５−９０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-89の続きである。
【図５−９１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-90の続きである。
【図５−９２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-91の続きである。
【図５−９３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-92の続きである。
【図５−９４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-93の続きである。
【図５−９５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-94の続きである。
【図５−９６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-95の続きである。
【図５−９７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-96の続きである。
【図５−９８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-97の続きである。
【図５−９９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-98の続きである。
【図６−１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図である。
【図６−２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-1の続きである。
【図６−３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-2の続きである。
【図６−４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-3の続きである。
【図６−５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-4の続きである。
【図６−６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-5の続きである。
【図６−７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-6の続きである。
【図６−８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-7の続きである。
【図６−９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-8の続きである。
【図６−１０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-9の続きである。
【図６−１１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-10の続きである。
【図６−１２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-11の続きである。
【図６−１３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-12の続きである。
【図６−１４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-13の続きである。
【図６−１５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-14の続きである。
【図６−１６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-15の続きである。
【図６−１７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-16の続きである。
【図６−１８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-17の続きである。
【図６−１９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-18の続きである。
【図６−２０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-19の続きである。
【図６−２１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-20の続きである。
【図６−２２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-21の続きである。
【図６−２３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-22の続きである。
【図６−２４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-23の続きである。
【図６−２５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-24の続きである。
【図６−２６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-25の続きである。
【図６−２７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-26の続きである。
【図６−２８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-27の続きである。
【図６−２９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-28の続きである。
【図６−３０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-29の続きである。
【図６−３１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-30の続きである。
【図６−３２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-31の続きである。
【図６−３３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-32の続きである。
【図６−３４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-33の続きである。
【図６−３５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-34の続きである。
【図６−３６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-35の続きである。
【図６−３７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-36の続きである。
【図６−３８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-37の続きである。
【図６−３９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-38の続きである。
【図６−４０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-39の続きである。
【図６−４１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-40の続きである。
【図６−４２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-41の続きである。
【図６−４３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-42の続きである。
【図６−４４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-43の続きである。
【図６−４５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-44の続きである。
【図６−４６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-45の続きである。
【図６−４７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-46の続きである。
【図６−４８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-47の続きである。
【図６−４９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-48の続きである。
【図６−５０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-49の続きである。
【図６−５１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-50の続きである。
【図６−５２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-51の続きである。
【図６−５３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-52の続きである。
【図６−５４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-53の続きである。
【図６−５５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-54の続きである。
【図６−５６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-55の続きである。
【図６−５７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-56の続きである。
【図６−５８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-57の続きである。
【図６−５９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-58の続きである。
【図６−６０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-59の続きである。
【図６−６１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-60の続きである。
【図６−６２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-61の続きである。
【図６−６３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-62の続きである。
【図６−６４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-63の続きである。
【図６−６５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-64の続きである。
【図６−６６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-65の続きである。
【図６−６７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-66の続きである。
【図６−６８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-67の続きである。
【図６−６９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-68の続きである。
【図６−７０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-69の続きである。
【図６−７１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-70の続きである。
【図６−７２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-71の続きである。
【図６−７３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-72の続きである。
【図６−７４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-73の続きである。
【図６−７５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-74の続きである。
【図６−７６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-75の続きである。
【図６−７７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-76の続きである。
【図６−７８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-77の続きである。
【図６−７９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-78の続きである。
【図６−８０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-79の続きである。
【図６−８１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-80の続きである。
【図６−８２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-81の続きである。
【図６−８３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-82の続きである。
【図６−８４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-83の続きである。
【図６−８５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-84の続きである。
【図６−８６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-85の続きである。
【図６−８７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-86の続きである。
【図６−８８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-87の続きである。
【図６−８９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-88の続きである。
【図６−９０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-89の続きである。
【図６−９１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-90の続きである。
【図６−９２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-91の続きである。
【図６−９３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-92の続きである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT-2)の結晶、およびCPT-2と阻害剤化合物との共結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（CPT）系は、高等真核生物のミトコンドリアへの長鎖脂肪酸の取り込みを促進する。CPT-1は、ミトコンドリア外膜に組み入れられて、アシル-CoAからの長鎖アシル部分のカルニチンへの転移を触媒する。逆の反応がCPT-2によって行われ、これはミトコンドリア内膜のマトリックス側に存在するタンパク質である。組織特異的CPT-1イソ型の触媒活性の調節は、非インスリン依存型（2型）真性糖尿病および肥満に対する新規薬剤を開発するための焦点となっている。
【０００３】
タンパク質の結晶構造は、酵素の活性部位に結合する化合物を同定して最大限に活用するために有用である。これまで、CPT-2の結晶構造は解明されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、CPT-2の結晶、およびCPT-2と阻害剤化合物との共結晶を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、完全長のラットCPT-2の単独構造、またはパルミトイルカルニチンを模倣する基質類似体である可逆的CPT阻害剤であるST1326との複合体の構造に関する。ST1326と複合体を形成したCPT-2の構造は、タンパク質-リガンド相互作用におけるCPT-1/2および短鎖アシルトランスフェラーゼにおいて保存された残基の役割に洞察を与える。
【０００６】
本発明（１）は、図4または図5に示される構造座標によって定義される構造を有する単離および精製タンパク質である。
本発明（２）は、a＝b＝66Å〜70Å、c＝302Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P43212対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶である。
本発明（３）は、a＝93Å〜97Å、b＝94Å〜98Å、c＝304Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、C2221対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶である。
本発明（４）は、タンパク質CPT-2と、CPT-2の活性部位に結合するリガンドの共結晶であって、a＝83Å〜87Å、b＝94Å〜98Å、c＝121Å〜127Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P212121対称性を有する共結晶である。
本発明（５）は、以下の段階を含む、タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定する方法である：
図4または図5に示すタンパク質CPT-2の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、タンパク質CPT-2の結合ポケットの空間座標を決定する段階；および
タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定するためにタンパク質CPT-2結合ポケットの空間座標に対して候補化合物の組の保存された空間座標を電子的にスクリーニングする段階。
本発明（６）は、以下の段階を含む、CPT-2を活性部位に結合するリガンドと共結晶させるプロセスである：
3.75〜50 mg/mlのCPT-2の緩衝水溶液を提供する段階、
CPT-2の水溶液にモル過剰量のリガンドを加える段階、および
平均分子量200 Da〜20,000 Daを有する0％〜30％（w/v）のPEGの緩衝レザバー(reservoir)溶液を用いて蒸気拡散またはマイクロバッチによって結晶を成長させる段階。
本発明（７）は、緩衝レザバーが、0 M〜2 Mクエン酸トリアンモニウム、pH 7、0 M〜1 M L-プロリン、0 M〜1 Mトリメチルアミン-N-オキシド、0 M〜1 M硫酸アンモニウム、0 M〜1 M硫酸リチウム、0 M〜1 M酢酸アンモニウム、0 M〜1 M蟻酸ナトリウムまたは蟻酸マグネシウム、および0 M〜1 M D/L-リンゴ酸pH 7をさらに含む、本発明(6)のプロセスである。
本発明（８）は、本発明(6)または(7)のプロセスによって生成された結晶である。
本発明（９）は、特に前述の実施例を参照して、先に請求された結晶、方法、およびプロセスである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、CPT-2の結晶、およびCPT-2と阻害剤化合物との共結晶が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
CPT-2の構造を、アポ酵素に関して2.0Åおよび1.6Åの分解能で、ならびにST1326との複合体に関して2.5Åの分解能で三つの異なる結晶型において決定した（詳細に関しては実施例および表1を参照されたい）。
【０００９】
CPT-2の全体的な折り畳みは、アミノ末端（残基111〜440）およびカルボキシ末端（残基441〜658、プラス32〜110）ドメインに細分することができる。これらのドメインは、中心の逆平行β鎖6本からなり、そのうち2本（β1、β16）は、主要なドメインの接触を媒介し、周辺のα-ヘリックス（図1/2）を取り囲む。CPT-2二次構造は、αヘリックス27個およびβ鎖18個を含む。ヘリックス22とへリックス23とを接続するループは、アポ構造において螺旋状のコンフォメーションをとり、したがってヘリックス22Bと呼ばれる。ST1326複合体構造の対応する領域は結晶の接触面に対して近位に存在し、これは二次構造の形成を干渉する可能性がある。他のカルニチンアシルトランスフェラーゼ（L-CPT-1の場合にはアミノ酸29個、図2）と比較した場合のCPT-2において独自に認められるアミノ酸30個のインサートは、アミノ末端ドメインから突出する。
【００１０】
ラットCPT-2の触媒コア全体の電子密度は十分に定義されている。His-タグおよび実際のCPT-2配列の残基5個を含む、結晶化のために用いられる構築物の最初の26個のアミノ末端のアミノ酸は、複合体および双方のアポ構造において不規則である。カルボキシ末端で解釈可能な電子密度を有する最後の残基は、Lys 654（ST1326複合体）およびIle 656（アポ、P43212）であり、完全なカルボキシ末端は、斜方（C2221）アポ構造のA鎖において認識できる。
【００１１】
アポCPT-2およびST1326複合体は、異なる結晶型において結晶化したが、構造は同等のCα原子間のr.m.s.距離0.38Åによって示されるように類似のコンフォメーションを有する。三つ全ての構造において、活性部位残基Arg 498は、ラマチャンドランプロットの寛大な許容領域(generously allowed region)に存在して、Leu 129はAsn 230と共にラマチャンドランプロットの都合のよい外面的形態(favoured geometry)に従わないが、明確な電子密度がこれらの残基に関して認識できる。Leu 129は、II型リバースターンにおける第二の残基（マウスCrATにおけるIle 116と同等、PDBコード1t7n）であるが、Asn 230は、隣接するAsp297およびArg 124との相互作用によりその幾何学が歪められる可能性があるβターンに存在する。Arg 124の変異は、遺伝性CPT-2欠損症に関連している（下記を参照されたい）。
【００１２】
このように、本発明は、図4または図5に示すように構造座標によって定義される構造を有する単離および精製タンパク質に関する。本発明はまた、タンパク質CPT-2の三つの結晶型にも関する。CPT-2の一つの結晶は単位格子寸法a＝b＝66Å〜70Å、c＝302Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°を有し、および結晶はP43212対称性を有する。もう一つの態様において、結晶は単位格子寸法a＝93Å〜97Å、b＝94Å〜98Å、c＝304Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°を有し、および結晶はC2221対称性を有する。本発明はまた、タンパク質CPT-2とCPT-2の活性部位に結合したリガンドとの共結晶にも関し、共結晶の単位格子寸法はa＝83Å〜87Å、b＝94Å〜98Å、c＝121Å〜127Å；α＝β＝γ＝90°を有し、および結晶はP212121対称性を有する。
【００１３】
（表１）データ収集および精密化統計値
*βOG洗浄剤分子（平均B＝54.9Å2）、二つのC16アルキル部分（平均B＝23.3Å2）、および二つの残存非特異的結合CoA分子（平均B＝37.7Å2）は、統計値に含めなかった。
【００１４】
CPT阻害剤ST1326は、ドメイン界面でCPT-2を貫通するトンネルに存在するCPT-2の活性部位に結合する（図3）。ST1326は、CPT-2の生理的基質であるパルミトイル-カルニチンの非切断型類似体である。CPT-2の三裂（Nic a' Bhaird, N., et al., Comparison of the active sites of the purified carnitine acyltransferases from peroxisomes and mitochondria by using a reaction-intermediate analogue. Biochem J., 294,645〜651(1993)）活性部位のアシルトンネルおよびカルニチントンネルは、ST1326によって占有されるが、CoA-トンネルは、CrATとCoAとの複合体構造に基づく相同性モデリングによって割付することができる（図3）。ST1326の親水性アミノカルニチンヘッドグループは、水素結合ネットワークにおいて堅固に結合している。触媒塩基His 372は、本来のリガンドであるパルミトイル-カルニチンのエステル酸素を置換するST1326のアミノ-窒素（N11）と水素結合を形成する。カルニチンアシルトランスフェラーゼの間で保存されたSer-Thr-SerモチーフのSer 590は、リガンドのカルバモイル-酸素（O13）に対して水素結合を形成する。カルボキシ末端ドメインのTyr 486、Ser 488、およびThr 499は、ST1326のカルボキシル酸素（O9およびO10）に対して直接水素結合する。Arg 554のグアニジウム基に対する水素結合は、Tyr 486およびThr 499の配向性をさらに安定化させる。アミノ末端ドメインの残基Trp 116、Tyr 120、およびAsp 376ならびに協奏的に固定された水分子も同様に、ST1326のカルボキシ基に結合する水素結合ネットワークの一部である。Arg 498は、Asp 376の側鎖と強い水素結合を形成し、そのグアニジウム基は、触媒ループにおけるSer373の主鎖カルボニル酸素と相互作用して、それによって活性部位残基を触媒作用にとって理想的な位置にする。ST1326の陽性荷電三級アミンは、保存されたPhe 602との陽イオン-pi相互作用によって安定化される。
【００１５】
ST1326の脂肪族テトラデカノイルテールを収容する疎水性トンネルには、ドメイン界面で逆平行β-シートを形成するβ鎖1および16の残基および二つのカルボキシ末端β鎖17および18の残基が並んでいる。2.5σで輪郭を示したシミュレーションアニーリングfofcマップ(simulated annealing fofc map)は、活性部位に結合したリガンドST1326に関して明確な電子密度を示す。疎水性トンネルを形成するβ鎖は、CrATおよびCrOTにおける閉鎖配列と比較して（PDBコード1ndb、1t7n、および1xl8）、基質類似体ST1326の伸長した疎水性テールのための空間を形成するために互いに離れている。よりかさの大きい残基がCrAT（Met 564）およびCrOT（Gln 552）において認められる位置でのグリシン残基Gly 600は、CPT-2におけるLCFAカルニチン誘導体の結合を可能にして、それによって基質特異性を決定する。CrATおよびCrOTとは対称的に、アシルトンネルはCPT-2の表面で開通している。
【００１６】
CPT-2のGlu 487およびGlu 500は、カルニチンアシルトランスフェラーゼの間において保存されており、変異体分析によって基質結合および触媒に関与している（Zheng, G., et al., Identification by mutagenesis of a conserved glutamate (Glu 487)residue important for catalytic activity in rat liver carnitine palmitoyltransferase II. J. Biol. Chem. 277,42219〜42223(2002)）。CPT-2の結晶構造から、実際にGlu 487がCoAを収容する活性部位トンネルの一部に存在することが判明した。Glu 487は、高度に保存されたAsp 464と共に、基質を活性部位に誘導するためにおそらく必要な陰性荷電の区画を形成する。Glu 500の側鎖は、アシルトランスフェラーゼ基質のカルニチン部分の結合にとって必要な水素ネットワークの重要な成分である保存されたArg 554の主鎖と相互作用する。
【００１７】
アポ構造において、Tyr 120の側鎖および触媒性His 372は、高品質のデータセットおよび構造分析の分解能にもかかわらず、不規則である。ST1326の親水性アミノカルニチンヘッドグループと相互作用する活性部位におけるそれらの残基ならびにSer590は、リガンド結合から離れているが、活性部位トンネルの全体的な形状は、アポ酵素では予め形成されている。
【００１８】
臨床的に不均一な疾患であるCPT-2欠損症は、CPT-2遺伝子における様々な変異によって引き起こされ、常染色体劣性様式で遺伝される（Bonnefont, J-P. et al. Carnitine palmitoyltransferases 1 and 2 : biochemical, molecular and medical aspects. Mol. Aspects Med., 25, 495〜520(2004)；Bonnefont, J.P. et al. Carnitine palmitoyltransferase deficiencies. Mol. Genet. Metab., 68,424〜440(1990)）。障害の二つの異なる症状、すなわち早期発症（新生児または乳児）型およびより頻繁な成人型は、CPT-2欠損症の発症時期に基づいて区別することができる。早期発症型は、心筋症および低ケトン性低血糖症を含む重度の総体的症状を特徴として、乳児突然死症候群における急性の肝不全に関連している（Demaugre, F. et al. Infantile form of carnitine palmitoyltransferase II deficiency with hepatomusucular symptoms and sudden death. Physiopathological approach to carnitine palmitoyltransferase II deficiencies. J. Clin. Invest., 87,859〜864(1991)）。成人CPT-2欠損症の臨床兆候は、絶食および疲労に反応した再発性の筋肉痛およびミオグロビン尿症である。
【００１９】
CPT-2のコード領域において、酵素における単アミノ酸交換に至る30個より多い点突然変異が、タンパク質のフレームシフトまたは切断を引き起こす欠失／挿入の他に同定されている。CPT-2遺伝子の切断が起こると、新生児においてCPT-2機能の喪失により重度CPT-2欠損症が表れることは不可避であるが、遺伝子型と臨床表現型の重症度との段階的相関は、ホモ接合状体において記述されているそれらのミスセンス変異に関して明白となっている（表2）（Bonnefont, J.P. et al. Carnitine palmitoyltransferase deficiencies. Mol. Genet. Metab., 68,424〜440(1999)；Thuillier, L. et al. Correlation between genotype, metabolic data, and clinical presentation in carnitine palmitoyltransferase 2(CPT2)deficiency. Hum. Mutat., 21, 493〜501(2003)）。この相関に対する例外は、Arg 631 Cys変異であり、これはCPT-2欠損症の乳児型と同様に成人型の双方のホモ接合患者において同定されている。CPT-2の結晶構造によって、記述の変異（表2に概要）のマッピングおよび効果の解釈が可能となる。成人型CPT-2欠損症のほとんど（60％）は、Ser113 Leu変異に関連している。Ser113は、ドメイン界面に近いヘリックスα5のアミノ末端に存在する。Ser113の側鎖は周囲のアミノ酸とは全く直接接触していないが、この残基がより大きい疎水性のLeuに変異すると、隣接するPhe 117との相互作用が変化する。これによって、触媒上重要な残基であるTrp 116およびArg 498の位置および環境が変化して、酵素の活性はより低くなる（Taroni, F. et al. Identification of a common mutation in the carnitine palmitoyltransferase II gene in familial recurrent myoglobinuria patients. Nat. Genet., 4,314〜320(1993)）。
【００２０】
Asp 213およびGlu 487は、天然に存在する変異によって影響を受け、生化学分析によりCPT-2機能にとって重要であることが決定されている（Zheng, G., et al., Identification by mutagenesis of a conserved glutamate(Glu 487)residue important for catalytic activity in rat liver carnitine palmitoyltransferase II. J. Biol. Chem. 277,42219〜42223(2002)；Liu, H., et al., Cysteine-scanning mutagenesis of muscle carnitine palmitoyltransferase I reveals a single cysteine residue (Cys-305) is important for catalysis. J. Biol. Chem., 280,4524〜4531(2005)）。Asp 213は、CPT-2のβ3とα10のあいだのループに存在し、全てのヒトCPT-1イソ型において保存されているシステインと共に整列する。このシステインがアラニンに変異すると、ヒトM-CPT-1において酵素活性は完全に消失し、このことはこの位置が全てのCPTイソ型における構造的完全性にとって極めて重要であることを示している。CPT-2において、Asp213の側鎖は、His 496の主鎖の窒素と強く相互作用する。これは、基質結合に関与するArg 498およびArg 499の配置にとって重要である。β13におけるGlu 487のアスパラギン酸への変異によって、CPT-2活性のほぼ完全な喪失が起こる。Glu 487は、CoAトンネル表面の一部であることから、この変異はCoA結合を妨害し得る。CPT-2の結晶構造から、487位のアスパラギン酸は、保存されたSTSモチーフのThr 589の側鎖と強い水素結合を形成して、それによって活性部位の外面的形態を歪めるであろうと予測することができる。Glu 487 Lys交換は、CPT-2欠損症において同定された変異6個中1個であり、これはCPT-1、CrATおよびCrOTにおいて完全に保存されている分子内塩橋または水素結合相互作用の破壊を引き起こす（表2）。Arg 296のグアニジウム窒素は、カルニチンアシルトランスフェラーゼにおいて保存されているAsp 353の側鎖酸素と強く（2.7Å）接触している。M-CPT-1における同等の残基Asp 454は、触媒トライアドの一部であると提唱されているが（Liu, H., et al., Cysteine-scanning mutagenesis of muscle carnitine palmitoyltransferase I reveals a single cysteine residue(Cys-305)is important for catalysis. J. Biol. Chem., 280,4524〜4531(2005)）、CPT-2結晶構造は、この残基が保存された塩橋を形成することを意味している。CPT-2欠損症に関連して報告された変異はいずれもインサートに存在せず、それらは三次元構造において均一に分布している。
【００２１】
（表２）ヒトCPT-2欠損症において変異している残基。
影響を受ける残基は全てラットおよびヒトCPT-2の間で保存されている。CPT-IIのヒトおよびラットイソ型に関する残基の番号付けは同一である。Aと記されたホモ接合変異は、晩発型の成人型CPT-2欠損症に関連しており、Iと記された変異は早期発症型乳児型に関連している。
【００２２】
本発明のアポ、誘導体、および共結晶は、バッチ法、（改変）マイクロバッチ法、液体架橋法、透析法、蒸気拡散法、および懸滴法を含む、タンパク質結晶学の技術分野において周知の技術によって得ることができる（例えば、McPherson, 1982, Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, NY；McPherson, 1990, Eur. J. Biochem. 189:1〜23；Webber, 1991, Adv. Protein Chem. 41:1〜36；Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, Edited by Arnaud Ducruix and Richard Giege, Oxford University Press；Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips. Edited by Terese Bergfors, International University Line, 1999を参照されたい）。一般的に、本発明のアポまたは共結晶は、実質的に純粋なCPT-2ポリペプチドを、タンパク質を沈殿させるために必要な濃度よりわずかに下の濃度の沈殿剤を含む水性緩衝液中に入れることによって成長させる。蒸発を制御することによって水を溶液から除去して、結晶化条件を形成して、これを結晶の成長が終わるまで維持する。
【００２３】
本明細書において用いられるように、「緩衝水溶液」は、酸または塩基を溶液に加えた場合に溶液のpHの変化を最小限にする基質を含む水性基剤の溶液を指す。
【００２４】
本明細書において用いられるように、「モル過剰量」とは、タンパク質分子の数より多いリガンド分子を指す。
【００２５】
本明細書において用いられるように、「蒸気拡散」は、結晶化溶液を気体相のみを通して沈殿剤レザバー溶液によって平衡化させる、当技術分野で周知のタンパク質結晶化法を指す。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、アポまたは共結晶は、蒸気拡散によって成長させる。この方法において、ポリペプチド／沈殿剤溶液を、結晶を生成させるために最適な沈殿剤濃度を有するより大きい水性レザバーを有する密封容器において平衡にする。一般的に実質的に純粋なポリペプチド溶液約10 μL未満を等量または類似の量のレザバー溶液と混合して、沈殿剤濃度を結晶化にとって必要な濃度である約2分の1にする。この溶液をカバーガラスの下に小滴として懸垂し、これをレザバーの上部で密封する。密封容器を、結晶が成長するまで1日〜1年、通常約2〜6週間静置する。
【００２７】
本発明の結晶に関して、室温（21℃±2℃）で成長させたラットCPT-2[25 mMトリス/HCl pH 8.0、0.15 M NaCl、2 mM TCEP、1％（w/v）n-オクチル-β-D-グルコピラノシド（βOG）または0.33％（w/v）CHAPSまたは1.15 mM n-ドデシル-β-D-マルトシド（DBM）および0.02％（w/v）NaN3において3.75〜50 mg/mlラットCPT-2]約2〜5μlと、レザバー緩衝液0.33〜1.0 mLの上に約1〜7日間懸垂した等量または類似の量のレザバー溶液（インデックス21、37、61、62、69、75、76、79、88、90、91、92、Hampton Resarchと共に、その成分のpHまたは濃度を変化させることによってこれらから誘導した溶液）とを含む懸滴が、高分解能X線構造決定にとって適した結晶を提供することが判明した。特に好ましい条件は、ラットCPT-2約0.1μl〜1μl（25 mMトリス/HCl pH 8.0、0.15 M NaCl、2 mM TCEP、および1％（w/v）β-D-OGにおいて13.5 mg/ml）を3倍モル過剰量のST1326と共にプレインキュベートすることによる（改変）マイクロバッチアッセイ法と共に、レザバー溶液（インデックス91、Hampton Resarch）0.33〜1.0 mlの上でインデックス91（Hampton Resarch）沈殿剤溶液0.5μl〜2μlと混合したラットCPT-2 1μl〜5μl（12 mg/ml、通常の発現から、またはセレノ-メチオニンによって標識したタンパク質として、25 mMトリス/HCl pH 8.0、0.15 M NaCl、2 mM TCEPおよび1％（w/v）β-D-OGにおいて）による懸滴アッセイであった。
【００２８】
懸滴において成長した結晶は全て、複合体構造の場合には液体窒素における凍結の前、または液体窒素冷却装置を備えたゴニオメーターに載せる前に、20％（w/v）〜30％（w/v）ポリエチレングリコール200（PEG 200）および適当なリガンド濃度を添加したそれぞれの母液に沈めた。マイクロバッチ法を用いて成長させた結晶は、懸滴において成長させた結晶について記述したように凍結するか、または結晶周囲の母液および油を約100％（v/v）パラフィン油に交換した。
【００２９】
典型的に2.0Åまでの回折データは、SLS、Villigen、SwitzerlandでシンクロトロンビームラインX10SA（PX1）またはX10SA（PX2）で凍結した結晶から回収した。最適な条件下で1.6Åまでのデータを記録した。
【００３０】
当然、当業者は、上記の結晶条件を変更できることを認識するであろう。そのような変更は、単独または併用して用いてもよく、ポリペプチド濃度1 mg/mL〜60 mg/mL、pHを約3.0〜約11.0に維持することができる市販の緩衝系、様々な濃度の還元成分（ジチオスレイトール、ジチオエリトール、β-メルカプトエタノールまたは他の等技術分野において認識される同等物）、濃度0％（w/v）〜30％（w/v）の糖もしくはグリセロールのような安定化成分を含むポリペプチド溶液、またはCPT-2に結合することが公知である他のリガンドの置換が含まれる。濃度約1％（w/v）〜約30％（w/v）のポリエチレングリコール（PEG）、平均分子量約200〜約20,000ダルトンのポリエチレングリコールを含む沈殿剤およびレザバー溶液、ならびに温度は4℃〜30℃の範囲である。
【００３１】
このように、本発明はまた、3.75〜50 mg/ml CPT-2の緩衝水溶液を提供する段階、CPT-2の水溶液にリガンドのモル過剰量を加える段階、および0％〜30％（w/v）PEGの緩衝レザバー溶液を用いて蒸気拡散またはマイクロバッチによって結晶を成長させる段階を含む、活性部位に結合するリガンドとCPT-2とを共結晶化させるプロセスであって、PEGが平均分子量200 Da〜20000 Daを有するプロセスに関する。PEGは、モノメチルエステルとして加えてもよい。平均分子量500 Da〜5,000 DaのPEGを用いてもよい。緩衝レザバー溶液はさらに、0 M〜2 Mクエン酸トリアンモニウム、pH 7、0 M〜1 M L-プロリン、0 M〜1 Mトリメチルアミン-N-オキシド、0 M〜1 M硫酸アンモニウム、0 M〜1 M硫酸リチウム、0 M〜1 M酢酸アンモニウム、0 M〜1 M蟻酸ナトリウムまたは蟻酸マグネシウム、および0 M〜1 M D/L-リンゴ酸pH 7を含む。該マイクロバッチは改変してもよい。本発明はさらに、本明細書において以下に記述されるプロセスによって生成される結晶にも関する。
【００３２】
本発明の誘導体結晶は、X線結晶学の当業者に公知の技法に従って重金属原子の塩を含む母液においてアポまたは共結晶を浸すことによって得ることができる。
【００３３】
本発明の共結晶は、母液または活性部位に結合するリガンドを含む任意の他の安定化溶液において、低親和性リガンドと共にCPT-2のアポ結晶もしくは結晶を浸すことによって得ることができ、または活性部位に結合する一つもしくはそれ以上のリガンドの存在下でCPT-2ポリペプチドを共結晶化することによって得ることができる。
【００３４】
本明細書に記述の結晶CPT-2の三次元構造を得る方法と共に、原子構造座標を得る方法は、当技術分野において周知である（例えば、D.E. McRee, Practical Protein Crystallography, Academic Press出版, San Diego(1993)およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【００３５】
本発明の結晶、および特にそこから得られる原子構造座標は、多様な用途を有する。例えば、本明細書に記述の結晶および構造座標は、新規治療物質を開発するためのアプローチとして、CPT-2の活性を阻害する、または一般的に改変する化合物を同定するために特に有用である。
【００３６】
本明細書に記述の構造座標は、さらなる天然または変異CPT-2の結晶構造と共に、そのようなCPT-2と結合した阻害剤または活性化剤との共結晶の構造を決定するためのフェージングモデルとして用いることができる。構造座標と共にそこから得られる三次元構造のモデルも同様に、NMRによって得られるもののような、天然または変異CPT-2の溶液に基づく構造の解明を助けるために用いることができる。このように、本発明の結晶および原子構造座標は、CPT-2の構造および機能を解明するための簡便な手段を提供する。
【００３７】
このように、本発明はまた、以下の段階を含む、タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定する方法を提供する：タンパク質CPT-2の結合ポケットの空間座標を決定するために、図4または図5に示されるタンパク質CPT-2の原子座標に、三次元分子モデリングアルゴリズムを適用する段階；およびタンパク質Pに結合することができる化合物を同定するために、タンパク質CPT-2結合ポケットの空間座標に対して候補化合物の組の保存された空間座標を電子的にスクリーニングする段階。
【００３８】
結晶、共結晶、方法、および本明細書において以降記述するプロセスに関する態様において、該CPT-2タンパク質はラットCPT-2タンパク質である。さらに、該ラットCPT-2タンパク質は、配列番号：2のタンパク質であってもよい。
【００３９】
明瞭性および考察の目的のために、本発明の結晶は、特異的CPT-2の例としてのアポ結晶および共結晶を参照して記述されるであろう。当業者は、本明細書に記述の原理が一般的に、配列番号：2のCPT-2が含まれるがこれらに限定されない任意の哺乳類CPT-2に応用可能であることを認識するであろう。
【００４０】
本明細書において用いられるように、「アポ結晶」は、部位特異的リガンドを加えずに形成されたCPT-2の結晶を指す。
【実施例】
【００４１】
実施例1：タンパク質発現および精製
ラットCPT-2のアミノ酸27〜658位をコードするDNA（V.A. Zammit博士, Hannah Research Institute, Ayr, Scotlandの贈与）を、Novagen pET28aベクターにサブクローニングした。この構築物を用いて、大腸菌株BL21DE3において20℃で完全長CPT-2（ミトコンドリア輸入配列、CPT-2前駆体のアミノ酸1〜26位を含まない）を発現させた。細胞の破壊後、溶解物（50 mM HEPES/NaOH pH 8、0.15 M NaCl、5 mM TCEP、10 mM MgCl2、30 mg/l DNアーゼI、30 Tbs./l Rocheコンプリートプロテアーゼインヒビター）を0.1％（v/v）トライトンX-100によって調節した。溶解および遠心（30,000 g、45分）の後に、Ni-NTA樹脂において固定金属アフィニティクロマトグラフィーを行った。洗浄剤を、カラムにおいて1％（v/v）n-オクチル-β-D-グルコピラノシド（βOG）に交換した。IMAC段階からの溶出液を、25 mMトリス/HCl pH 8、0.15 M NaCl、2 mM TCEP、1％（v/v）βOG、0.02％（w/v）NaN3によって平衡にしたサイズ排除クロマトグラフィーに供した。ESI-MSにより、CPT-IIの同一性が確認され、タンパク質がアミノ末端α-N-グルコノイル化によって修飾されていることが示された（Geoghegan, K.F. et al., Spontaneous alpha-N-6-phosphogluconoylation of a "His Tag" in Escherichia coli : the cause of extra mass of 258 or 178 Da in fusion proteins. Anal. Biochem., 267,169〜184(1999)）（データは示していない）。His-タグはトロンビンによって切断されなかった。10 L発酵物（バイオマス45 g）によって、電気泳動上純粋な、単量体および単分散タンパク質30 mgが生成された。
【００４２】
実施例2：タンパク質の結晶化
アポCPT-2およびST1326[(R)-N-テトラデシルカルバモイル-アミノカルニチン]複合体の結晶（H2O/NaOHにおいて33 mM保存溶液）は、タンパク質濃度15 mg/ml（25 mMトリス/HCl pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM TCEP、1％（w/v）n-オクチル-β-D-グルコピラノシドおよび0.02％（w/v）NaN3において）で21℃で、25％（w/v）PEG 1500による懸滴または0.15 M DL-リンゴ酸pH 7.0、20％（w/v）PEG 3350による改変マイクロバッチ（D'Arcy, A., et al., The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Cryst. D59,396〜399(2003)）法を用いてそれぞれ得た（インデックス37および91、Hampton Research）。複合体形成の場合、CPT-2を、結晶化の前に氷中で阻害剤ST1326の3倍モル過剰量と共に3時間インキュベートした。結晶を、25％（w/v）PEG 200（アポ）を添加した母液において30秒間浸した後、または100％（v/v）パラフィン油（ST1326）に対して過剰量の母液およびAl's油を交換した後に液体窒素中で瞬間凍結した。
【００４３】
実施例3：データ収集およびプロセシング
アポCPT-2およびST1326複合体のデータセットをSLS、Villigen、SwitzerlandのビームラインX10SAにおいて収集した。測定は、λ＝0.97853Å（アポ、Seピーク波長）およびλ＝1.008Å（ST1326）で100 Kで行った。データセットをXDSによって処理し、比較した（Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst., 26,795〜800(1993)）。空間群はP43212（アポ正方晶系、a＝b＝67.6、c＝307.3、α＝β＝γ＝90°、マシューズ係数＝2.4（Matthews, B.W. J. Mol. Biol., 33,491〜497(1968)）、C2221（アポ斜方晶系、a＝95.2、b＝97.3、c＝310.4、マシューズ係数＝2.4）、およびP212121（ST1326、a＝85.8、b＝96.2、c＝124.3、α＝β＝γ＝90°、マシューズ係数＝3.5）であると決定された。アポCPT-2の最初の結晶は、1.9Å分解能で回折したが、空間群を明白に割付することができなかった。対照的に、標準的な技術によって標識したセレノ-メチオニンである材料から得られたアポ結晶（Chene, C. et al. Crystallization of the complex of human IFN-gamma and the extracellular domain of the IFN-gamma receptor. Proteins, 23,591〜594(1995)）は、優れた回折品質を有し、これは、標識の際の異なる培地組成および細菌タンパク質発現プロファイルによりタンパク質品質の改善に帰し得るであろう。
【００４４】
XDS拒絶統計値は、0.26％の拒絶されたミスフィットを報告し、これはRmergeのかなり高い値16.7％にもかかわらず、複合体結晶に関して正確な空間群としてP212121の選択を完全に裏付ける。データ統計値を表1に要約する。どちらの結晶型も非対称単位あたりCPT-2を1分子含む。
【００４５】
構造溶液および精密化。CCP4界面においてAMoReを用いて分子置換を行った（Navazza, J. AMoRe : a new package for molecular replacement, in Molecular replacement. Proceedings of the CCP4 Study Weekend, 87-90, Daresbury Laboratory, Warrington, England(1992)；Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 suite : Programs for protein crystallography. Acta Cryst. D50, 760〜763(1994)）。ST1326複合体に関して、マウスCrAT（Hsiao, Y.S. et al., Structural and biochemical studies of the substrate selectivity of carnitine acetyltransferase. J. Biol. Chem., 279,31584〜31589(2004)）（PDBコード1t7n）に基づいてXSAE（C. Broger, F. Hoffman La Roche）によって構築したラットCPT-2相同体モデルを、検索モデルとして用いた。CNSによるシミュレーションアニーリングによって溶液を精密化した（Brunger, A.T. X-PLOR Manual Version 3.1. New Haven, CT, USA, Yale University Press(1992)）。最終的なモデルは、MOLOCにおけるモデル構築の反復性のサイクル（Gerber, P.R. Peptidemechanics : a force field for peptides and proteins working with entire residues as small units. Biopolymers, 32,1003〜1017(1992)）、autoBUSTERにおける溶媒構築（Roversi, P., et al., Modelling prior distributions of atoms for macromolecular refinement and completion. Acta Cryst., D56,1316〜1323(2000)）、およびRefmacにおける精密化（Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Lebedev, A., Wilson, K.S. & Dodson, E.J. Efficient anisotropic refinement of macromolecular structures using FFT. Acta Cryst. D55,247〜255(1999)）を用いて構築した。Se標識にもかかわらず、アポ構造はまた、検索モデルとして精密化複合体構造を用いた分子置換の後に、Arp/wArp（Perrakis, A., et al., Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat. Struct. Biol., 6,458〜463(1999)）による自動モデル構築、繰り返しRefmac、およびMOLOCサイクルによって解決された。斜方晶系（正方晶系）アポ構造に関して、残基の94.0％（92.7％）が最も好ましい領域に存在し、5.4％（6.8％）がラマチャンドランプロットのさらに許容される領域に存在した。ST1326複合体構造に関して、これらの値はそれぞれ88.2％および11.3％であった。Arg 498（寛大な許容領域）およびLeu 129と共にAsn 230（ラマチャンドランのアウトライアー）が、100％までの差の残りを占める。
【００４６】
精密化統計値を表1に概要する。分子を表す図は、PyMol（DeLano, W.L. The PyMOL User's Manual, DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA(2002)）およびMOE（Chemical Computing Group Inc., MOE, 1010 Sherbrooke Street West, Suite 910, Montreal, Canada, H3A 2R7）によって作製した。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ST1326が活性部位に結合したラットCPT-2の構造。リガンドST1326およびその周囲のfofcシミュレーションアニーリング電子密度マップ（2.5σでの輪郭）をA〜Cにおいてピンク色で示す。図1-A、ST1326は、ラットCPT-2のアミノ末端（オレンジ色）およびカルボキシ末端（シアン）ドメインの界面で結合する。図1-B、中央のβ鎖（青色）は、α-ヘリックス（緑色）によって取り囲まれ、CPT-2特異的インサート（赤色）は、アミノ末端ドメインから突出している。図1-C、Bと同じであるが、後方に90°回転させた。
【図２】ラットCPT-2（rCPT-2）およびヒトCPT-1（hCPT-1）のアミノ酸配列アラインメント。二次構造エレメント（S.S.）を示す。残基の番号付けは、rCPT-2前駆体に対応し、そのミトコンドリア輸入配列を斜体で示す。CPT-2特異的インサート（アミノ酸179〜208）を下線で示す。rCPT-2のアシルカルニチン結合部位のKeey残基を太字で示し、hCPT-1において完全に保存されている場合には*で標識する。CPT-2欠損症において変異することが報告されている残基を赤色で印字する。
【図３】図3-A、ドメイン界面に対して垂直に見た活性部位トンネルの立体図。重要な活性部位を黄色で示す。共結晶化したST1326をピンク色で示し、CoA分子（青色）は、CrAT-CoA複合体構造（PDBコード1t7q）からのCoA座標に基づいてモデルを作製した。図3-B、原子番号をつけたST1326のフィッシャー投影。
【図４−１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図である。
【図４−２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-1の続きである。
【図４−３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-2の続きである。
【図４−４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-3の続きである。
【図４−５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-4の続きである。
【図４−６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-5の続きである。
【図４−７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-6の続きである。
【図４−８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-7の続きである。
【図４−９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-8の続きである。
【図４−１０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-9の続きである。
【図４−１１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-10の続きである。
【図４−１２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-11の続きである。
【図４−１３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-12の続きである。
【図４−１４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-13の続きである。
【図４−１５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-14の続きである。
【図４−１６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-15の続きである。
【図４−１７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-16の続きである。
【図４−１８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-17の続きである。
【図４−１９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-18の続きである。
【図４−２０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-19の続きである。
【図４−２１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-20の続きである。
【図４−２２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-21の続きである。
【図４−２３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-22の続きである。
【図４−２４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-23の続きである。
【図４−２５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-24の続きである。
【図４−２６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-25の続きである。
【図４−２７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-26の続きである。
【図４−２８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-27の続きである。
【図４−２９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-28の続きである。
【図４−３０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-29の続きである。
【図４−３１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-30の続きである。
【図４−３２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-31の続きである。
【図４−３３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-32の続きである。
【図４−３４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-33の続きである。
【図４−３５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-34の続きである。
【図４−３６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-35の続きである。
【図４−３７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-36の続きである。
【図４−３８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-37の続きである。
【図４−３９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-38の続きである。
【図４−４０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-39の続きである。
【図４−４１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-40の続きである。
【図４−４２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-41の続きである。
【図４−４３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-42の続きである。
【図４−４４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-43の続きである。
【図４−４５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-44の続きである。
【図４−４６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-45の続きである。
【図４−４７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-46の続きである。
【図４−４８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-47の続きである。
【図４−４９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-48の続きである。
【図４−５０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-49の続きである。
【図４−５１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-50の続きである。
【図４−５２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-51の続きである。
【図４−５３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-52の続きである。
【図４−５４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-53の続きである。
【図４−５５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-54の続きである。
【図４−５６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-55の続きである。
【図４−５７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-56の続きである。
【図４−５８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-57の続きである。
【図４−５９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-58の続きである。
【図４−６０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-59の続きである。
【図４−６１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-60の続きである。
【図４−６２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-61の続きである。
【図４−６３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-62の続きである。
【図４−６４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-63の続きである。
【図４−６５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-64の続きである。
【図４−６６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-65の続きである。
【図４−６７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-66の続きである。
【図４−６８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-67の続きである。
【図４−６９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-68の続きである。
【図４−７０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-69の続きである。
【図４−７１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-70の続きである。
【図４−７２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-71の続きである。
【図４−７３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-72の続きである。
【図４−７４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-73の続きである。
【図４−７５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-74の続きである。
【図４−７６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-75の続きである。
【図４−７７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-76の続きである。
【図４−７８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-77の続きである。
【図４−７９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-78の続きである。
【図４−８０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-79の続きである。
【図４−８１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-80の続きである。
【図４−８２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-81の続きである。
【図４−８３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-82の続きである。
【図４−８４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-83の続きである。
【図４−８５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-84の続きである。
【図４−８６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-85の続きである。
【図４−８７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-86の続きである。
【図４−８８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-87の続きである。
【図４−８９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-88の続きである。
【図４−９０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-89の続きである。
【図４−９１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-90の続きである。
【図４−９２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-91の続きである。
【図４−９３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-92の続きである。
【図４−９４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-93の続きである。
【図４−９５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-94の続きである。
【図４−９６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-95の続きである。
【図４−９７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-96の続きである。
【図４−９８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-97の続きである。
【図４−９９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-98の続きである。
【図４−１００】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-99の続きである。
【図４−１０１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-100の続きである。
【図４−１０２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-101の続きである。
【図４−１０３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-102の続きである。
【図４−１０４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-103の続きである。
【図４−１０５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-104の続きである。
【図４−１０６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-105の続きである。
【図４−１０７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-106の続きである。
【図４−１０８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-107の続きである。
【図４−１０９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-108の続きである。
【図４−１１０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-109の続きである。
【図４−１１１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-110の続きである。
【図４−１１２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-111の続きである。
【図４−１１３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-112の続きである。
【図４−１１４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-113の続きである。
【図４−１１５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-114の続きである。
【図４−１１６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-115の続きである。
【図４−１１７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-116の続きである。
【図４−１１８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-117の続きである。
【図４−１１９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-118の続きである。
【図４−１２０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-119の続きである。
【図４−１２１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-120の続きである。
【図４−１２２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-121の続きである。
【図４−１２３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-122の続きである。
【図４−１２４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-123の続きである。
【図４−１２５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-124の続きである。
【図４−１２６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-125の続きである。
【図４−１２７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-126の続きである。
【図４−１２８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-127の続きである。
【図４−１２９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-128の続きである。
【図４−１３０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-129の続きである。
【図４−１３１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-130の続きである。
【図４−１３２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-131の続きである。
【図４−１３３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-132の続きである。
【図４−１３４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-133の続きである。
【図４−１３５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-134の続きである。
【図４−１３６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-135の続きである。
【図４−１３７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-136の続きである。
【図４−１３８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-137の続きである。
【図４−１３９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-138の続きである。
【図４−１４０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-139の続きである。
【図４−１４１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-140の続きである。
【図４−１４２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-141の続きである。
【図４−１４３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-142の続きである。
【図４−１４４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-143の続きである。
【図４−１４５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-144の続きである。
【図４−１４６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-145の続きである。
【図４−１４７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-146の続きである。
【図４−１４８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-147の続きである。
【図４−１４９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-148の続きである。
【図４−１５０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-149の続きである。
【図４−１５１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-150の続きである。
【図４−１５２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-151の続きである。
【図４−１５３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-152の続きである。
【図４−１５４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-153の続きである。
【図４−１５５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-154の続きである。
【図４−１５６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-155の続きである。
【図４−１５７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-156の続きである。
【図４−１５８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-157の続きである。
【図４−１５９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-158の続きである。
【図４−１６０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-159の続きである。
【図４−１６１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-160の続きである。
【図４−１６２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-161の続きである。
【図４−１６３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-162の続きである。
【図４−１６４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-163の続きである。
【図４−１６５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-164の続きである。
【図４−１６６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-165の続きである。
【図４−１６７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-166の続きである。
【図４−１６８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-167の続きである。
【図４−１６９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-168の続きである。
【図４−１７０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-169の続きである。
【図４−１７１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-170の続きである。
【図４−１７２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-171の続きである。
【図４−１７３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-172の続きである。
【図４−１７４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-173の続きである。
【図４−１７５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-174の続きである。
【図４−１７６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-175の続きである。
【図４−１７７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-176の続きである。
【図４−１７８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-177の続きである。
【図４−１７９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-178の続きである。
【図４−１８０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-179の続きである。
【図４−１８１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-180の続きである。
【図４−１８２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-181の続きである。
【図４−１８３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-182の続きである。
【図４−１８４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-183の続きである。
【図４−１８５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-184の続きである。
【図４−１８６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-185の続きである。
【図４−１８７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-186の続きである。
【図４−１８８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-187の続きである。
【図４−１８９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-188の続きである。
【図４−１９０】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-189の続きである。
【図４−１９１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-190の続きである。
【図４−１９２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-191の続きである。
【図４−１９３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-192の続きである。
【図４−１９４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-193の続きである。
【図４−１９５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-194の続きである。
【図４−１９６】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-195の続きである。
【図４−１９７】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-196の続きである。
【図４−１９８】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-197の続きである。
【図４−１９９】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-198の続きである。
【図４−２００】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-199の続きである。
【図４−２０１】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-200の続きである。
【図４−２０２】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-201の続きである。
【図４−２０３】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-202の続きである。
【図４−２０４】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-203の続きである。
【図４−２０５】アポ1（C2221）結晶の座標を示す図であり、図4-204の続きである。
【図５−１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図である。
【図５−２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-1の続きである。
【図５−３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-2の続きである。
【図５−４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-3の続きである。
【図５−５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-4の続きである。
【図５−６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-5の続きである。
【図５−７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-6の続きである。
【図５−８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-7の続きである。
【図５−９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-8の続きである。
【図５−１０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-9の続きである。
【図５−１１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-10の続きである。
【図５−１２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-11の続きである。
【図５−１３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-12の続きである。
【図５−１４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-13の続きである。
【図５−１５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-14の続きである。
【図５−１６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-15の続きである。
【図５−１７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-16の続きである。
【図５−１８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-17の続きである。
【図５−１９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-18の続きである。
【図５−２０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-19の続きである。
【図５−２１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-20の続きである。
【図５−２２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-21の続きである。
【図５−２３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-22の続きである。
【図５−２４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-23の続きである。
【図５−２５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-24の続きである。
【図５−２６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-25の続きである。
【図５−２７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-26の続きである。
【図５−２８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-27の続きである。
【図５−２９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-28の続きである。
【図５−３０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-29の続きである。
【図５−３１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-30の続きである。
【図５−３２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-31の続きである。
【図５−３３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-32の続きである。
【図５−３４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-33の続きである。
【図５−３５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-34の続きである。
【図５−３６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-35の続きである。
【図５−３７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-36の続きである。
【図５−３８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-37の続きである。
【図５−３９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-38の続きである。
【図５−４０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-39の続きである。
【図５−４１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-40の続きである。
【図５−４２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-41の続きである。
【図５−４３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-42の続きである。
【図５−４４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-43の続きである。
【図５−４５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-44の続きである。
【図５−４６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-45の続きである。
【図５−４７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-46の続きである。
【図５−４８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-47の続きである。
【図５−４９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-48の続きである。
【図５−５０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-49の続きである。
【図５−５１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-50の続きである。
【図５−５２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-51の続きである。
【図５−５３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-52の続きである。
【図５−５４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-53の続きである。
【図５−５５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-54の続きである。
【図５−５６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-55の続きである。
【図５−５７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-56の続きである。
【図５−５８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-57の続きである。
【図５−５９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-58の続きである。
【図５−６０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-59の続きである。
【図５−６１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-60の続きである。
【図５−６２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-61の続きである。
【図５−６３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-62の続きである。
【図５−６４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-63の続きである。
【図５−６５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-64の続きである。
【図５−６６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-65の続きである。
【図５−６７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-66の続きである。
【図５−６８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-67の続きである。
【図５−６９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-68の続きである。
【図５−７０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-69の続きである。
【図５−７１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-70の続きである。
【図５−７２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-71の続きである。
【図５−７３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-72の続きである。
【図５−７４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-73の続きである。
【図５−７５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-74の続きである。
【図５−７６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-75の続きである。
【図５−７７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-76の続きである。
【図５−７８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-77の続きである。
【図５−７９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-78の続きである。
【図５−８０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-79の続きである。
【図５−８１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-80の続きである。
【図５−８２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-81の続きである。
【図５−８３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-82の続きである。
【図５−８４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-83の続きである。
【図５−８５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-84の続きである。
【図５−８６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-85の続きである。
【図５−８７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-86の続きである。
【図５−８８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-87の続きである。
【図５−８９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-88の続きである。
【図５−９０】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-89の続きである。
【図５−９１】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-90の続きである。
【図５−９２】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-91の続きである。
【図５−９３】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-92の続きである。
【図５−９４】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-93の続きである。
【図５−９５】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-94の続きである。
【図５−９６】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-95の続きである。
【図５−９７】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-96の続きである。
【図５−９８】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-97の続きである。
【図５−９９】アポ1（P43212）結晶の座標を示す図であり、図5-98の続きである。
【図６−１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図である。
【図６−２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-1の続きである。
【図６−３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-2の続きである。
【図６−４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-3の続きである。
【図６−５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-4の続きである。
【図６−６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-5の続きである。
【図６−７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-6の続きである。
【図６−８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-7の続きである。
【図６−９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-8の続きである。
【図６−１０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-9の続きである。
【図６−１１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-10の続きである。
【図６−１２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-11の続きである。
【図６−１３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-12の続きである。
【図６−１４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-13の続きである。
【図６−１５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-14の続きである。
【図６−１６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-15の続きである。
【図６−１７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-16の続きである。
【図６−１８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-17の続きである。
【図６−１９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-18の続きである。
【図６−２０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-19の続きである。
【図６−２１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-20の続きである。
【図６−２２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-21の続きである。
【図６−２３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-22の続きである。
【図６−２４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-23の続きである。
【図６−２５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-24の続きである。
【図６−２６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-25の続きである。
【図６−２７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-26の続きである。
【図６−２８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-27の続きである。
【図６−２９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-28の続きである。
【図６−３０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-29の続きである。
【図６−３１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-30の続きである。
【図６−３２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-31の続きである。
【図６−３３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-32の続きである。
【図６−３４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-33の続きである。
【図６−３５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-34の続きである。
【図６−３６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-35の続きである。
【図６−３７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-36の続きである。
【図６−３８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-37の続きである。
【図６−３９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-38の続きである。
【図６−４０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-39の続きである。
【図６−４１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-40の続きである。
【図６−４２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-41の続きである。
【図６−４３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-42の続きである。
【図６−４４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-43の続きである。
【図６−４５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-44の続きである。
【図６−４６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-45の続きである。
【図６−４７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-46の続きである。
【図６−４８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-47の続きである。
【図６−４９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-48の続きである。
【図６−５０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-49の続きである。
【図６−５１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-50の続きである。
【図６−５２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-51の続きである。
【図６−５３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-52の続きである。
【図６−５４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-53の続きである。
【図６−５５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-54の続きである。
【図６−５６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-55の続きである。
【図６−５７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-56の続きである。
【図６−５８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-57の続きである。
【図６−５９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-58の続きである。
【図６−６０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-59の続きである。
【図６−６１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-60の続きである。
【図６−６２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-61の続きである。
【図６−６３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-62の続きである。
【図６−６４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-63の続きである。
【図６−６５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-64の続きである。
【図６−６６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-65の続きである。
【図６−６７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-66の続きである。
【図６−６８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-67の続きである。
【図６−６９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-68の続きである。
【図６−７０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-69の続きである。
【図６−７１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-70の続きである。
【図６−７２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-71の続きである。
【図６−７３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-72の続きである。
【図６−７４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-73の続きである。
【図６−７５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-74の続きである。
【図６−７６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-75の続きである。
【図６−７７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-76の続きである。
【図６−７８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-77の続きである。
【図６−７９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-78の続きである。
【図６−８０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-79の続きである。
【図６−８１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-80の続きである。
【図６−８２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-81の続きである。
【図６−８３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-82の続きである。
【図６−８４】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-83の続きである。
【図６−８５】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-84の続きである。
【図６−８６】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-85の続きである。
【図６−８７】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-86の続きである。
【図６−８８】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-87の続きである。
【図６−８９】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-88の続きである。
【図６−９０】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-89の続きである。
【図６−９１】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-90の続きである。
【図６−９２】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-91の続きである。
【図６−９３】CPT-2/ST1316共結晶の座標を示す図であり、図6-92の続きである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図4または図5に示される構造座標によって定義される構造を有する単離および精製タンパク質。
【請求項２】
a＝b＝66Å〜70Å、c＝302Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P43212対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶。
【請求項３】
a＝93Å〜97Å、b＝94Å〜98Å、c＝304Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、C2221対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶。
【請求項４】
タンパク質CPT-2と、CPT-2の活性部位に結合するリガンドの共結晶であって、a＝83Å〜87Å、b＝94Å〜98Å、c＝121Å〜127Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P212121対称性を有する共結晶。
【請求項５】
以下の段階を含む、タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定する方法：
図4または図5に示すタンパク質CPT-2の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、タンパク質CPT-2の結合ポケットの空間座標を決定する段階；および
タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定するためにタンパク質CPT-2結合ポケットの空間座標に対して候補化合物の組の保存された空間座標を電子的にスクリーニングする段階。
【請求項６】
以下の段階を含む、CPT-2を活性部位に結合するリガンドと共結晶させるプロセス：
3.75〜50 mg/mlのCPT-2の緩衝水溶液を提供する段階、
CPT-2の水溶液にモル過剰量のリガンドを加える段階、および
平均分子量200 Da〜20,000 Daを有する0％〜30％（w/v）のPEGの緩衝レザバー(reservoir)溶液を用いて蒸気拡散またはマイクロバッチによって結晶を成長させる段階。
【請求項７】
緩衝レザバーが、0 M〜2 Mクエン酸トリアンモニウム、pH 7、0 M〜1 M L-プロリン、0 M〜1 Mトリメチルアミン-N-オキシド、0 M〜1 M硫酸アンモニウム、0 M〜1 M硫酸リチウム、0 M〜1 M酢酸アンモニウム、0 M〜1 M蟻酸ナトリウムまたは蟻酸マグネシウム、および0 M〜1 M D/L-リンゴ酸pH 7をさらに含む、請求項6記載のプロセス。
【請求項８】
請求項6または7記載のプロセスによって生成された結晶。
【請求項１】
図4または図5に示される構造座標によって定義される構造を有する単離および精製タンパク質。
【請求項２】
a＝b＝66Å〜70Å、c＝302Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P43212対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶。
【請求項３】
a＝93Å〜97Å、b＝94Å〜98Å、c＝304Å〜312Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、C2221対称性を有する、タンパク質CPT-2の結晶。
【請求項４】
タンパク質CPT-2と、CPT-2の活性部位に結合するリガンドの共結晶であって、a＝83Å〜87Å、b＝94Å〜98Å、c＝121Å〜127Å；α＝β＝γ＝90°の単位格子寸法を有し、P212121対称性を有する共結晶。
【請求項５】
以下の段階を含む、タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定する方法：
図4または図5に示すタンパク質CPT-2の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、タンパク質CPT-2の結合ポケットの空間座標を決定する段階；および
タンパク質CPT-2に結合することができる化合物を同定するためにタンパク質CPT-2結合ポケットの空間座標に対して候補化合物の組の保存された空間座標を電子的にスクリーニングする段階。
【請求項６】
以下の段階を含む、CPT-2を活性部位に結合するリガンドと共結晶させるプロセス：
3.75〜50 mg/mlのCPT-2の緩衝水溶液を提供する段階、
CPT-2の水溶液にモル過剰量のリガンドを加える段階、および
平均分子量200 Da〜20,000 Daを有する0％〜30％（w/v）のPEGの緩衝レザバー(reservoir)溶液を用いて蒸気拡散またはマイクロバッチによって結晶を成長させる段階。
【請求項７】
緩衝レザバーが、0 M〜2 Mクエン酸トリアンモニウム、pH 7、0 M〜1 M L-プロリン、0 M〜1 Mトリメチルアミン-N-オキシド、0 M〜1 M硫酸アンモニウム、0 M〜1 M硫酸リチウム、0 M〜1 M酢酸アンモニウム、0 M〜1 M蟻酸ナトリウムまたは蟻酸マグネシウム、および0 M〜1 M D/L-リンゴ酸pH 7をさらに含む、請求項6記載のプロセス。
【請求項８】
請求項6または7記載のプロセスによって生成された結晶。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図４−５】
【図４−６】
【図４−７】
【図４−８】
【図４−９】
【図４−１０】
【図４−１１】
【図４−１２】
【図４−１３】
【図４−１４】
【図４−１５】
【図４−１６】
【図４−１７】
【図４−１８】
【図４−１９】
【図４−２０】
【図４−２１】
【図４−２２】
【図４−２３】
【図４−２４】
【図４−２５】
【図４−２６】
【図４−２７】
【図４−２８】
【図４−２９】
【図４−３０】
【図４−３１】
【図４−３２】
【図４−３３】
【図４−３４】
【図４−３５】
【図４−３６】
【図４−３７】
【図４−３８】
【図４−３９】
【図４−４０】
【図４−４１】
【図４−４２】
【図４−４３】
【図４−４４】
【図４−４５】
【図４−４６】
【図４−４７】
【図４−４８】
【図４−４９】
【図４−５０】
【図４−５１】
【図４−５２】
【図４−５３】
【図４−５４】
【図４−５５】
【図４−５６】
【図４−５７】
【図４−５８】
【図４−５９】
【図４−６０】
【図４−６１】
【図４−６２】
【図４−６３】
【図４−６４】
【図４−６５】
【図４−６６】
【図４−６７】
【図４−６８】
【図４−６９】
【図４−７０】
【図４−７１】
【図４−７２】
【図４−７３】
【図４−７４】
【図４−７５】
【図４−７６】
【図４−７７】
【図４−７８】
【図４−７９】
【図４−８０】
【図４−８１】
【図４−８２】
【図４−８３】
【図４−８４】
【図４−８５】
【図４−８６】
【図４−８７】
【図４−８８】
【図４−８９】
【図４−９０】
【図４−９１】
【図４−９２】
【図４−９３】
【図４−９４】
【図４−９５】
【図４−９６】
【図４−９７】
【図４−９８】
【図４−９９】
【図４−１００】
【図４−１０１】
【図４−１０２】
【図４−１０３】
【図４−１０４】
【図４−１０５】
【図４−１０６】
【図４−１０７】
【図４−１０８】
【図４−１０９】
【図４−１１０】
【図４−１１１】
【図４−１１２】
【図４−１１３】
【図４−１１４】
【図４−１１５】
【図４−１１６】
【図４−１１７】
【図４−１１８】
【図４−１１９】
【図４−１２０】
【図４−１２１】
【図４−１２２】
【図４−１２３】
【図４−１２４】
【図４−１２５】
【図４−１２６】
【図４−１２７】
【図４−１２８】
【図４−１２９】
【図４−１３０】
【図４−１３１】
【図４−１３２】
【図４−１３３】
【図４−１３４】
【図４−１３５】
【図４−１３６】
【図４−１３７】
【図４−１３８】
【図４−１３９】
【図４−１４０】
【図４−１４１】
【図４−１４２】
【図４−１４３】
【図４−１４４】
【図４−１４５】
【図４−１４６】
【図４−１４７】
【図４−１４８】
【図４−１４９】
【図４−１５０】
【図４−１５１】
【図４−１５２】
【図４−１５３】
【図４−１５４】
【図４−１５５】
【図４−１５６】
【図４−１５７】
【図４−１５８】
【図４−１５９】
【図４−１６０】
【図４−１６１】
【図４−１６２】
【図４−１６３】
【図４−１６４】
【図４−１６５】
【図４−１６６】
【図４−１６７】
【図４−１６８】
【図４−１６９】
【図４−１７０】
【図４−１７１】
【図４−１７２】
【図４−１７３】
【図４−１７４】
【図４−１７５】
【図４−１７６】
【図４−１７７】
【図４−１７８】
【図４−１７９】
【図４−１８０】
【図４−１８１】
【図４−１８２】
【図４−１８３】
【図４−１８４】
【図４−１８５】
【図４−１８６】
【図４−１８７】
【図４−１８８】
【図４−１８９】
【図４−１９０】
【図４−１９１】
【図４−１９２】
【図４−１９３】
【図４−１９４】
【図４−１９５】
【図４−１９６】
【図４−１９７】
【図４−１９８】
【図４−１９９】
【図４−２００】
【図４−２０１】
【図４−２０２】
【図４−２０３】
【図４−２０４】
【図４−２０５】
【図５−１】
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【図５−６８】
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【図５−７０】
【図５−７１】
【図５−７２】
【図５−７３】
【図５−７４】
【図５−７５】
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【図５−７７】
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【図６−６】
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【図６−１０】
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【図６−１６】
【図６−１７】
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【図６−２１】
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【図６−３６】
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【図６−４７】
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【図６−５０】
【図６−５１】
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【図６−６６】
【図６−６７】
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【図６−７０】
【図６−７１】
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【図６−７５】
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【図４−１７０】
【図４−１７１】
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【図４−１７３】
【図４−１７４】
【図４−１７５】
【図４−１７６】
【図４−１７７】
【図４−１７８】
【図４−１７９】
【図４−１８０】
【図４−１８１】
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【図４−１８３】
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【図４−１８５】
【図４−１８６】
【図４−１８７】
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【図４−１９１】
【図４−１９２】
【図４−１９３】
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【図５−１】
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【図５−２５】
【図５−２６】
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【図６−２１】
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【図６−２４】
【図６−２５】
【図６−２６】
【図６−２７】
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【図６−３０】
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【図６−３３】
【図６−３４】
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【図６−４２】
【図６−４３】
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【図６−４５】
【図６−４６】
【図６−４７】
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【図６−４９】
【図６−５０】
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【図６−９３】
【公開番号】特開２００７−６１０９４（Ｐ２００７−６１０９４Ａ）
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３０５７８（Ｐ２００６−２３０５７８）
【出願日】平成１８年８月２８日（２００６．８．２８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２８日（２００６．８．２８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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