ＣＸＣＬ８媒介肺炎症の治療のための組成物
本発明は、好中球浸潤を有する肺炎症を予防又は治療することにおける使用のための、例えば、慢性閉塞性肺疾患、膵嚢胞性繊維症、重症喘息、気管支炎、細気管支炎、急性肺損傷及び急性呼吸困難症候群の予防又は治療のための、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して増加したＧＡＧ結合アフィニティー及びさらに阻害又は下方制御されたＧＰＣＲ活性を有する改質されたインターロイキン８（ＩＬ−８）を含む組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球浸潤での肺炎症を予防する又は治療するための、特にＣＸＣＬ８媒介肺炎症の予防又は治療のための、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び阻害させた又は下方制御させた受容体結合アフィニティーを有する媒介させたインターロイキン（ＩＬ−８、ＣＸＣＬ８）の新たな使用に関する。特に、吸入剤として媒介させたＩＬ−８の使用を提供する。
【０００２】
発明の背景：
肺炎症疾患は、ヒト集団及び効果的な治療の欠如におけるそれらの優位さを考慮して特に関連がある。特に、好中球の炎症を増加させることを示した肺炎症は、慢性閉塞性肺疾患、膵嚢胞性繊維症、慢性重症喘息及びよりその重症型と共に急性肺損傷、急性呼吸困難症候群である。
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、２０２０（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ． １９９８）によって世界的に三番目の死因になると予測されている進行性の衰弱性疾患である。タバコの煙は、その発達のための最も重要な病因として確立されているが、しかしながら、１５〜２０％のみの煙でＣＯＰＤは発達し、遺伝的構成及び他の環境因子が疾患の病原論における役割を果たすことが示唆されている。
【０００４】
患者の肺において観察されるＣＯＰＤでの炎症反応は、複雑であり、かつ先天性の及び後天性の免疫反応の活性を含む。しかしながら、疾患の進行は、白血球遊走、炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの製造、並びに潜在的な破壊性プロテアーゼによって左右される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ２００８）。
【０００５】
特に、好中球は、痰及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料において、ＣＯＰＤ患者の肺中で最も豊富な炎症細胞であることが知られている（Ｎｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９６； Ｐｅｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。ＣＸＣＬ８レベルは、疾患の進行の異なるステージ（健康な状態に対して１０〜１５倍増加）でＣＯＰＤ患者の痰及びＢＡＬにおいて著しく上昇し、かつ疾患の重さ及び好中球の存在に関連し（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｔａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、その際好中球移動中に含まれるキーケモカイン（ｋｅｙ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）としてＣＸＣＬ８を同定する（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。さらに、ＣＸＣＬ８の上昇レベルは、増悪中にＣＯＰＤ患者の痰中にも存在する（Ａａｒｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００１；Ｓｐｒｕｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【０００６】
しかしながら、現在の治療は、支持療法及び対症療法としてより作用し、抗炎症活性を有する。世界保健機関及びＧＯＬＤの推奨に基づいてＣＯＰＤの管理のために使用される薬剤は、短時間及び長時間作用性のβ２アゴニスト、短時間及び長時間作用性の抗コリン作用薬、メチルキサンチン、吸入型又は全身性グルココステロイド（ｇｌｕｃｏｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）を含む（Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｌｅｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｋｈａｌｔａｅｖ ２００５）。それらの治療は、急性増悪を調整することに対するいくつかの効果を有するが、しかし従来のグルココルチコステロイドでの治療は、主に効果をもたらさず、かつＣＯＰＤを有する患者における弱毒化炎症を欠き（Ｃｕｌｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ． ２００７）、新たな抗炎症戦略の開発の必要を強調している（Ｆａｂｂｒｉ ｅｔ ａｌ ２００４）。
【０００７】
他の好中球の炎症によって特徴付けられる肺疾患は、膵嚢胞性繊維症（ＣＦ）である。いくつかの研究は、ＢＡＬ及び痰におけるＣＸＣＬ−８の増加レベル、並びにＣＦを有する患者の気管支腺におけるＣＸＣＬ８の増加した発現を記録している（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． １９９２； Ｔａｂａｒｙ ｅｔ ａｌ． １９９８）。その効力のある好中球化学誘因物質の特性は、気道における大量の好中球の流入を刺激する（Ｃｈｍｉｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００２）。細菌性感染は、さらに、ＣＸＣＬ８レベルを増加し、いっそう肺へ好中球を浸潤させ、そして中断することが難しい悪循環を生じ、そして慢性肺炎症をもたらす。ＣＸＣＬ８誘発性炎症に対して作用する治療、例えばＰＡ４０１でのこの悪循環に対する作用は、現在、気管支拡張及び粘液溶解薬又は抗生物質での支持療法のみに依存する、ＣＦ患者のための最も効果的な治療をもたらす。
【０００８】
１０人の喘息患者のうち１人は、しばしば、症状を調整するための試みにおいて徐々に高いステロイドの投与量を要求する、重症な前記疾患を示す。重症喘息は、より軽少であるよりも、疾病及び死の非常に高い危険性とも関連する。
【０００９】
強い関連は、現在、好中球炎症と、慢性重症喘息（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００２； Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｊａｔａｋａｎｏｎ ｅｔ ａｌ １９９９， Ｏｒｄｏｎｅｚ ａｔ ａｌ． ２０００， Ｋａｍａｔｈ ｅｔ ａｌ． ２００５； Ｆａｈｙ ２００９）、小児喘息（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００６）、喘息増悪（Ｆａｈｙ ｅｔ ａｌ． １９９５）、耐コルチコステロイド喘息（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ ２００２）、夜間喘息（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ １９９１）、喫煙者における喘息（Ｃｈａｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００１）及び職業性喘息（Ａｎｅｅｓ ｅｔ ａｌ．２００２）とを確立している。慢性好中球重症喘息が、その増加が喘息症状において示し、かつＣＯＰＤを有する特徴を共有するよりむしろ、明らかに異なる臨床表現型を示すことが、現在ますます認識されている（ＥＮＦＵＭＯＳＡ研究グループ）。慢性重症喘息の場合においても、上皮細胞誘発ＣＸＣＬ８は、主な好中球化学誘因物質として最も有望な候補であり（Ｌａｍｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｏｒｄｏｎｅｚ ｅｔ ａｌ． ２０００）、新たな抗炎症治療の開発のための潜在的な候補である。
【００１０】
本発明の目的は、従って、好中球で浸潤される肺炎症病理の予防又は治療のための方法を提供することである。
【００１１】
発明の要約
本発明は、それぞれ野生型のＩＬ−８と比較した、増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び阻害又は下方制御させたＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体、すなわちＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２）活性を有する改質したインターロイキン８（ＩＬ−８）を、好中球浸潤での肺炎症の予防及び治療のために使用することの発見に基づく。特に、ＩＬ−８の増加レベルが、疾患の進行及び重症さを有し、それらと関連するＣＯＰＤにおいて及びＣＯＰＤ増悪において（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｔａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、好中球移動において含まれるキーケモカインを標的とした治療発明（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）は、有益な抗炎症活性を提供する。さらに、それらの患者のための最新の治療は、支持療法及び症状療法に依存する一方で、従来のグリココルチコステロイドの適用が、主に効果がないことを証明し（Ｃｕｌｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ． ２００７）、新たな抗炎症戦略の開発の要求を強調している（Ｆａｂｂｒｉ ｅｔ ａｌ． ２００４， ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００７）。
【００１２】
改質したＩＬ−８の使用が、既に、肺における高レベルの好中球炎症を欠いた"通常の"喘息の治療のために簡単に記載されているが、好中球浸潤を有する肺炎症の治療及び予防のための前記の改質ＩＬ−８分子の成功した使用は、以前鋳示されておらず、又は示されていない。前記改質ＩＬ−８分子の抗喘息活性は、他の、喘息に関連したケモカイン、例えばエオタキシンの非特異的又は続発性の置換から生じる。
【００１３】
阻害又は下方制御された活性は、少なくとも、ＧＰＣＲの活性化による好中球の活性化の減少又は完全な欠失である。ＣＸＣＬ−８媒介肺炎症又はＩＬ−８誘発好中球浸潤が特定の肺疾患において有意であることが長く確立されてきたが、前記改質ＩＬ−８、"タンパク質を基礎としたＧＡＧアンタゴニスト"は、好中球浸潤での肺炎症疾患の予防又は治療におけるかかる効力を有することは、報告又は示唆されていない。
【００１４】
従って、本発明の主題は、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して、増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び阻害又は下方制御させたＧＰＣＲ活性を、個々の好中球浸潤での肺炎症疾患の予防又は治療のための使用のために提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＬＰＳを点滴注入したマウスの気管支肺胞洗浄における合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図２】ＬＰＳを点滴注入したマウスの気管支肺胞洗浄のサイトスピンにおける好中球の数に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図３】ＬＰＳを点滴注入したマウスの気管支肺胞洗浄のサイトスピンにおけるリンパ球の数に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図４】ＬＰＳをエアロゾル化にして散布したマウスの気管支肺胞洗浄における合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図５】ＬＰＳをエアロゾル化にして散布したマウスの気管支肺胞洗浄のサイトスピンにおける好中球の数に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図６】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄における合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１（図６ａ）及びロフルミラスト（図６ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図７】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄における好中球浸潤に対するＰＡ４０１（図７ａ）及びロフルミラスト（図７ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図８】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄におけるマクロファージ浸潤に対するＰＡ４０１（図８ａ）及びロフルミラスト（図８ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図９】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄における上皮細胞浸潤に対するＰＡ４０１（図９ａ）及びロフルミラスト（図９ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図１０】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄におけるリンパ球浸潤に対するＰＡ４０１（図１０ａ）及びロフルミラスト（図１０ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図１１】ＰＡ４０１（図１１ａ）の１日２回、毎日及び隔日の投与後の合計細胞浸潤に対する効果、及びロフルミラストとの比較（図１１ｂ）を示す図。
【図１２】ＰＡ４０１（図１２ａ）による全ての治療頻度での好中球の減少、及びロフルミラストとの比較（図１２ｂ）を示す図。
【図１３】ＰＡ４０１（図１３ａ）による全ての治療頻度での上皮細胞の減少、及びロフルミラストとの比較（図１３ｂ）を示す図。
【図１４】ＰＡ４０１が隔日投与された場合（図１４ａ）に、ｂ．ｉ．ｄ．及びｑ．ｄ．投与で得られたリンパ球における著しい減少の損失、及びロフルミラストとの比較（図１４ｂ）を示す図。
【図１５】ＰＡ４０１が隔日投与された場合（図１５ａ）に、ｂ．ｉ．ｄ．及びｑ．ｄ．投与で得られたマクロファージにおける著しい減少の損失、及びロフルミラストとの比較（図１５ｂ）を示す図。
【図１６】４００〜４０ｇ／ｋｇ投与後に観察された合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１の効果（図１６ａ）、ロフルミラストとの比較（図１６ｂ）を示す図。
【図１７】ＢＡＬにおける好中球の数の減少（ＰＡ４０１、図１７ａ及びロフルミラスト、図１７ｂ）を示す図。
【図１８】ＢＡＬにおける上皮細胞の数の減少（ＰＡ４０１、図１８ａ及びロフルミラスト、図１８ｂ）を示す図。
【図１９】ＢＡＬにおけるリンパ球の数の減少（ＰＡ４０１、図１９ａ及びロフルミラスト、図１９ｂ）を示す図。
【図２０】ＢＡＬにおけるマクロファージの数の減少（ＰＡ４０１、図２０ａ及びロフルミラスト、図２０ｂ）を示す図。
【図２１】ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における合計の細胞数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す図。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図２２】ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における好中球の数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す図。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【００１６】
発明の詳細な説明
ＣＸＣＬ−８媒介肺炎症は、患者の肺における好中球浸潤を導くことができる。
【００１７】
本発明は、好中球浸潤を有する肺炎症の予防又は治療のための使用のための、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して、増加されたＧＡＧ結合アフィニティー、及びさらに阻害又は下方制御されたＧＰＣＲ活性を有する改質インターロイキン８（ＩＬ−８）を含む。好中球浸潤を有する肺炎症の治療のための本発明において使用されるような改質されたＩＬ−８分子は、ＧＡＧ、ＩＬ−８特異的ＧＡＧリガンドに対して増加したアフィニティーを導くＧＡＧ（グリコサミノグリカン）結合領域において改質される。改質は、自然に生じるＧＡＧ結合領域であってよく、又は代わりに、新たなＧＡＧ結合領域が、ＧＡＧに対する増加したアフィニティーをもたらす前記分子中で導入されうる。少なくとも１つの自然に生じるアミノ酸をアミノ酸、有利には塩基性又は電子供与性アミノ酸に置換すること、並びに／又は少なくとも１つの嵩高な及び／又は酸性アミノ酸をＧＡＧ結合領域中で置換することによって、人工の及び／又は改良したＧＡＧ結合部位が、前記タンパク質に導入される。この方法によって、全体のより電気陰性の分子の特徴が、ケモカイン中に導入されうる。
【００１８】
主な目的は、塩基性又は電子供与性アミノ酸、有利にはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎの相対量を、前記部位におけるアミノ酸の合計量と比較して、増加することであり、それによって、得られたＧＡＧ結合部位が、有利には少なくとも３つの塩基性アミノ酸、さらに有利には少なくとも４つの、最も有利には少なくとも５つのアミノ酸を含有する。これは、そのＨＳＰＧ共受容体からケモカインを基礎としたＧＡＧアンタゴニストに競合しているｗｔＩＬ−８を導く。
【００１９】
特定の一実施態様において、ＧＡＧ結合部位は、ＧＡＧ結合アフィニティーを増加するために改質されたＣ末端のアルファヘリックスである。
【００２０】
"嵩高なアミノ酸"の用語は、長い又は立体的に妨害側鎖を有するアミノ酸を意味し、特にＴｒｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒである。有利には、ケモカイン上のＧＡＧ結合部位は、嵩高なアミノ酸を有さず、ＧＡＧリガンドによる最適な誘導適合を可能にする。有利には、ＩＬ−８における１７位、２１位、７０位及び／又は７１位は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎによって置換される。最も有利には、ＩＬ−８の全ての４つの１７位、２１位、７０位及び７１位は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎ、有利にはＬｙｓによって置換される。
【００２１】
本発明において使用される改質されたＩＬ−８は、阻害又は下方制御された受容体結合領域、特にＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体）結合も含む。従って、本発明によるタンパク工学による不活性化は、好中球活性の促進において低減された又は好中球活性を促進することができないＩＬ−８分子を導く。
【００２２】
これは、一方でＧＡＧ結合アフィニティーが、野生型ＧＡＧ結合タンパク質よりも高い全体的なアプローチのために意味し、その結果、改質タンパク質は、野生型タンパク質の代わりに、大部分は結合する。他方で、タンパク質がＧＡＧに結合される場合に主に生じる野生型タンパク質のＧＰＣＲ活性は、阻害又は下方制御される。それというのも、改質されたタンパク質が、この特定の活性で実施されず、又はより小さい範囲までこの活性が実施される。
【００２３】
受容体結合領域は、欠失、挿入、並びに／又は、例えばアラニン、立体及び／又は静電的に同様の残基での置換によって改質されうる。受容体結合領域において、少なくとも１つのアミノ酸を欠失又は挿入又は置換することが可能である。
【００２４】
使用される改質ＩＬ−８において、ＧＰＣＲ結合領域は、最初の１０個のＮ末端アミノ酸内に位置する。最初のＮ末端アミノ酸は、白血球活性中に含まれ、それによって特にＧｌｕ−４、Ｌｅｕ−５及びＡｒｇ−６は、受容体結合及び活性化のために必須であるべきと認識される。従って、それらの３つ又は最初の１０個までのＮ末端のアミノ酸は、受容体結合及び活性を阻害又は下方制御するために置換又は欠失されうる。
【００２５】
例えば、改質されたＩＬ−８は、欠失された最初の６個のＮ末端アミノ酸を有してよい。前記のように、この突然変異体は全くないか、白血球をより少ない程度で結合し、かつ活性化し、及び／又は好中球の活性を促進し、結果として特に臓器移植拒絶の治療に適している。
【００２６】
有利には、改質されたＩＬ−８は、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＫＮ７１Ｒ、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ、ｄｅｌ６Ｅ７０ＫＮ７１Ｋ、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ、及びｄｅｌ６Ｆ１７ＫＦ２１ＫＥ７０ＫＮ７１Ｋからなる群から選択される。
【００２７】
改質されたＩＬ８分子のアミノ酸配列は、有利には、一般式
［Ｘ１はアミノ酸配列ＳＡＫＥＬＲであり、
Ｘ２は、アミノ酸配列ＣＱＣＩであり、
Ｘ３は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＲであり、
Ｘ４は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、
Ｘ５は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
Ｘ６は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
かつｎ及び／又はｍは、０又は１である］によって記載される。
【００２８】
好ましい一実施態様において、改質されたＩＬ−８分子の配列は
であり、その際最初の６つのアミノ酸（ＳＡＫＥＬＲ）は、消失される。
【００２９】
有利には、改質されたＩＬ−８は、ＷＯ ０５／０５４２８５において開示されているような改質されたＩＬ−８と類似又は同一である。
【００３０】
組成物の投与は、静脈内経路、筋肉内経路又は皮下経路によってよい。それぞれの成分の所望の血中レベルを確立してよい他の投与経路、例えば全身投与又は吸入も含まれる。
【００３１】
特に、肺、有利には吸入又は気管内投与に対する局所デリバリーは、有利な投与形式であることが示されている。従って、改質されたＩＬ−８を、吸入剤として調合することができ、かつ当業者に公知の吸入システムによって投与することができる。改質されたＩＬ−８は、液体、エアロゾル又は粉末として調合されうる。
【００３２】
本発明による組成物を含有する医薬品は、製剤学的に認容性のキャリヤーと共に調合されうる。
【００３３】
"製剤学的に認容性の"とは、活性成分の生物学的活性の有効性と干渉せず、かつ投与される宿主に対して毒性のない、あらゆるキャリヤーを包含することを意味する。例えば、非経口投与のために、改質されたＩＬ−８は、ビヒクルにおける注入のための単一投与型、例えば食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液中で調合されてよい。さらに、製剤学的に認容性のキャリヤーは、少量の添加剤、例えば安定剤、付形剤、緩衝液及び保存薬も含まれうる。
【００３４】
組成物を含有する改質されたＩＬ−８は、好中球浸潤によって特徴付けられるあらゆる肺炎症疾患を予防又は治療するための医薬品を製造するために使用される。より詳述すれば、これらの疾患は、例えば慢性閉塞性肺疾患、膵膿疱性繊維症、重症喘息、気管支炎、急性肺損傷及び急性呼吸困難症であってよい。
【００３５】
特に、改質されたＩＬ−８は、ＣＯＰＤの治療のために使用される。
【００３６】
代わりの一実施態様として、好中球性喘息又は増悪の予防又は治療は、特に本明細書に従って改質されたＩＬ−８を使用して含まれる。
【００３７】
本発明によって、ＬＰＳ吸入によって誘発されるあらゆる肺炎症も、治療又は予防されうる。それというのも、ＬＰＳが、ＩＬ−８発現を誘発する主な因子（感染症におけるケモカイン及びケモカイン受容体）の１つであるからである。（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｓ， Ｋａｒｕｐｉａｈ Ｇ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９９ Ｄｅｃ；７７（６）：４６９−７５）。ＬＰＳは、グラム陰性菌における壁の構成成分であり、かつ従ってグラム陰性菌の感染が生じる場合に存在し、又は汚染物質において及びタバコの葉において存在する。
【００３８】
代わりに、改質されたＩＬ−８の治療的有効量を被験者に投与することを含むことを必要とする被験者における好中球浸潤を有する肺炎症の治療方法は、本発明によって覆われる。特に、前記投与は、吸入によって又は気管内投与による。
【００３９】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
特に、好中球は、痰及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料において、ＣＯＰＤ患者の肺中で最も豊富な炎症細胞であることが知られている（Ｎｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９６； Ｐｅｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。タバコの煙は、おそらく骨髄からの移動を増加させることによって（Ｃｏｗｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ． ２００８）、好中球の循環の上昇の原因であり、かつ肺毛細血管へのそれらの滞留は、肺循環を出る。この特徴は、肺循環に関して特有である。それというのも、全身的な循環において、好中球が、後毛細管小静脈のレベルで出るからである。
【００４０】
好中球は、そして、気管支の壁に及び肺柔組織まで移動する（Ｐｅｌｅｍａｎ ａｔ ａｌ． １９９９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ２００８）。続く、酸素種とエラスターゼとの反応の放出での好中球の活性は、肺損傷及び慢性機能不全の主な原因と考えられる。実際に、血中好中球は、以前から、最大努力呼気肺活量に関して測定された肺機能における低下率に関連がある（ＦＥＶ； Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ． １９８４）。
【００４１】
ＣＸＣＬ８レベルは、病気の進行の種々のステージ（健康な状態に対して１０〜１５倍増加）でのＣＯＰＤ患者の痰及びＢＡＬにおいて著しく上昇し、かつ疾患の選択性及び好中球の存在に関係し（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｔａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、好中球移動に含まれるキーケモカインとしてＣＸＣＬ８が同定される（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。さらに、ＣＸＣＬ８の上昇レベルは、憎悪中にＣＯＰＤ患者の痰中にも存在する（Ａａｒｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００１；Ｓｐｒｕｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【００４２】
膵膿疱性繊維症
膵膿疱性繊維症（ＣＦ）は、欠陥的上皮塩素分泌を導くＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子における種々の突然変異を有する、外分泌腺中のイオン輸送の重症な単一遺伝子疾患である（Ｒｉｏｒｄａｎ １９８９； Ｒａｔｊｅｎ ２００９）。外分泌腺の管における脱水及び粘膜分泌の填塞は、特に胃腸、肝胆道、生殖管及び気道における多臓器臨床兆候に罹患しやすくする。
【００４３】
慢性細菌感染及び肺の炎症は、ＣＦ患者にける罹患率及び死亡率の主な原因である（Ｒａｔｊｅｎ ２００６）。年齢の増加と共に、ＣＦ患者は、気道閉塞が生じ、かつそれらの患者の多くは、気道過敏症及び喘息様症状にも苦しむ。
【００４４】
多くの炎症性サイトカインは、ＣＦ患者における気道において製造される（Ｓａｇｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００２）。いくつかの研究は、ＢＡＬ及び痰におけるＣＸＣＬ−８の増加レベル、並びにＣＦを有する患者の気管支腺におけるＣＸＣＬ８の増加した発現を記録している（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． １９９２； Ｔａｂａｒｙ ｅｔ ａｌ． １９９８）。その効力のある好中球化学誘因物質の特性は、気道における大量の好中球の流入を刺激する（Ｃｈｍｉｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００２）。さらに、ＣＦの子供からの好中球は、ＣＦを有さないものと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＸＣＬ８に高い遊走応答性を示し、その際持続的に上昇させたＣＸＣＬ８レベルが、"第一の"ＣＦ好中球であってよいことを示唆している（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ． ２００１）。
【００４５】
ＣＦ好中球及びＣＦＴＲ突然変異体を有する気管支上皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養に対する最近の研究において、ＣＦ患者において、多くの数の気道上皮上への、及び上昇したＣＸＣＬ８レベルと関連のある非アポトーシス性好中球付着は、持続性の及び過度の気道における炎症反応に寄与することが示唆されている（Ｔａｂａｒｙ ｅｔ ａｌ． ２００６）。
【００４６】
実際に、Ｎａ−Ｃｌの平衡異常は、最初にＣＸＣＬ８の増加した製造及び続く好中球浸潤の原因であると思われる。細菌性感染は、さらに、ＣＸＣＬ８レベルを増加し、いっそう肺へ好中球を浸潤させ、そして中断することが難しい悪循環を生じ、そして慢性肺炎症をもたらす。この悪循環に対する作用は、現在、支持療法又は抗生物質のみに依存する、ＣＦ患者のための最も効果的な治療をもたらしうる。
【００４７】
重症喘息
好酸球炎症は、長い間、喘息の特有の病理学的に顕著な特徴と見なされていた。しかしながら、好酸球炎症は、喘息患者の５０％のみの気道において存在し（Ｄｏｕｗｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００２）、かつしばしば喘息増悪において観察されない。
【００４８】
強い関連は、現在、好中球炎症と、慢性重症喘息（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００２； Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｊａｔａｋａｎｏｎ ｅｔ ａｌ １９９９， Ｏｒｄｏｎｅｚ ａｔ ａｌ． ２０００， Ｋａｍａｔｈ ｅｔ ａｌ． ２００５； Ｆａｈｙ ２００９）、小児喘息（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００６）、喘息増悪（Ｆａｈｙ ｅｔ ａｌ． １９９５）、耐コルチコステロイド喘息（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ ２００２）、夜間喘息（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ １９９１）、喫煙者における喘息（Ｃｈａｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００１）及び職業性喘息（Ａｎｅｅｓ ｅｔ ａｌ．２００２）とを確立している。
【００４９】
急性喘息発作中に、好酸球及び好中球が共存する（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ １９９９）が、しかし、好中球が、経時的に最も多い細胞集団になることが示唆されている。それらの起動中での存在は、疾患の重症度及び進行に比例し（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ １９９７）、かつ空気流閉塞及び減少した肺機能に関連する（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ． ２００７）。好中球は、非常に重症な状態において観察される白血球数でもあり、かつしばしば突然発症によって特徴付けられる喘息の致命的な形である（突然発症喘息；Ｓｕｒ ｅｔ ａｌ． １９９３）。
【００５０】
急性肺損傷（ＡＬＩ）及び急性呼吸不全症候群（ＡＲＳＤ）
急性肺損傷（ＡＬＩ）及びそのより重症な形、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）は、高められた血管透過性及び増加した重症度の肺水腫形成を有する急性肺炎症によって特徴付けられる、同様の疾患の２つの異なるステージを示す（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ． １９９４）。病理学は、改良された集中治療介入にもかかわらず、過去１０年において増加の傾向がない非常に高い死亡率（約４０％）をもたらす（Ｐｕｈａ ｅｔ ａｌ． ２００９）。
ＡＬＩ及びＡＲＤＳにおける好中球の関与は、いくつかのグループ（Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ ２０００； Ａｂｒａｈａｍ ２００３）によって証明されており、かつＢＡＬにおける好中球の増加されたレベル及び増加したＣＸＣＬ８レベルとその関係が報告されている（Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ． ２０００）。さらに、ＢＡＬにおけるレベルの上昇したＣＸＣＬ８は、リスクの高い患者に対するＡＲＤＳの発達と関連がある（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ． １９９３； Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ． １９９５）。
【００５１】
肺において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、間質の非線維性区画の主な成分であり、かつ上皮下組織中に及び気管支壁中に、並びに気道分泌物中にある。それらの存在は、水分補給及びホメオスタシスを調整すること、組織構造を維持すること、及び炎症反応を調整することを必須とする（例えばＳｏｕｚａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００６）。
【００５２】
他の人間の病理学と比較して、肺の疾患において系もカイン作用を媒介するＧＡＧの介入を支持する多くの文献は存在しない。
【００５３】
ヘパリン／ヘパラン硫酸、コンドロイチン／デルマタン硫酸、ケラチン硫酸及びヒアルロナンを含むグリコサミノグリカンの全ての４つの種類が、通常の肺において存在する。ヘパラン硫酸は、主な形（〜４０％）と報告されており、続いてコンドロイチン／デルマタン硫酸（〜３１％）であり、より少ない範囲としてヒアルロナン（〜１４％）、及びケラチン硫酸である（Ｆｒｅｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【００５４】
前記は、次の実施例に関してより完全に理解されうる。かかる実施例は、しかしながら、単に本発明の１つ以上の実施態様を実施する方法の代表に過ぎず、かつ本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５５】
実施例
ほとんど、全ての肺の病理学、肺血管透過率及びマトリックスが観察されない場合を考慮すると、ＰＡ４０１（ｄｅｌ６Ｆ１７ＫＦ２１ＫＥ７０ＫＮ７１Ｋ ＩＬ−８突然変異体）の全身投与が、適正な双方の肺血管でのＰＡ４０１のレベル及び上皮レベルに達することに適当であるべきである。
【００５６】
実施例１：
ＰＡ４０１は、マウスにおけるＬＰＳ誘発性急性肺炎症モデルに対して効果がある。
【００５７】
種々の刺激は、肺中への好中球遊走を誘発する。最も頻繁に使用され、かつ良好に特徴付けられた炎症誘発因子の中には、グラム陰性菌（リポ多糖：ＬＰＳ）の菌体内毒素がある。
【００５８】
鼻腔内に滴下された、又はエアロゾル化して散布したＬＰＳは、攻撃後４〜８時間に達せられるピークレベルで、及びマウスにおいて２４時間までの間の基準線を著しく越えたままである、肺血管、間質及びＢＡＬ（Ｒｅｕｔｅｒｓｈａｎ ｅｔ ａｌ． ２００５）における好中球浸潤に依存する投与量及び時間を生じる。
【００５９】
投与されるＬＰＳ投与量は、ＬＰＳ血清型、適用方法、及び使用したマウスの染色に依存して、０．１μｇ／マウスまで低く、８００μｇ／マウスまでのＬＰＳの投与量に関して報告されている著しいＢＡＬ好中球で変化する。
【００６０】
ＬＰＳ吸入は、種を超えて肺好中球浸潤を誘発することができる（例えばマウス及びラット、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００７；モルモット、Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ２００２；ウサギ、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． ２００８；ヒツジ、Ｗａｅｒｈａｕｇ ｅｔ ａｌ． ２００９；ウマ、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００６；イヌ、Ｋｏｓｈｉｋａ ｅｔ ａｌ． ２００１）。健康な被験者における１〜１００ｇのＬＰＳの吸入は、急性肺炎症（Ｍａｒｉｓ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｋｉｔｚ ｅｔ ａｌ． ２００８）及び慢性閉塞性肺疾患増悪（Ｋｈａｒｉｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ， ２００７）のための、確固とした及び信頼できるモデルと見なされている。
【００６１】
急性肺好中球のモデルにおける抗炎症薬としてのＰＡ４０１の潜在性を評価するために、ＬＰＳ（０．３μｇ／マウス、血清型緑膿菌）を鼻腔内滴下したＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスのマウスにおける４、４０、２００及び４００μｇ／Ｋｇの投与量でのＰＡ４０１の皮下投与での投与応答の研究を実施した。擬似滴下（食塩水）した動物、及びデキサメタゾン３ｍｇ／ｋｇ（皮下）（ＬＰＳ滴下前のｔ＝−１時間で投与した）処理した動物を、対照として使用した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、ＬＰＳ滴下の４時間後に実施し、そしてＢＡＬ試料に対する合計細胞計数及びＢＡＬサイトスピンでの種々の細胞計数を測定した。
【００６２】
ＰＡ４０１は、ＢＡＬ液体において評価された肺において滴下された細胞の合計数における投与量依存の減少を誘発した（図１）。その作用は、４ｇ／ｋｇと低いＰＡ４０１の投与に関する著しい作用での好中球（図２）及びリンパ球（図３）の数における著しい減少によった。驚くべきことに、２００〜４００ｇ／ｋｇの投与量でのＰＡ４０１で得られたＢＡＬにおける細胞浸潤の阻害は、デキサメタゾンの高い投与量（３ｍｇ／ｋｇ）での治療で得られたものと比較できた。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００６３】
実施例２
第二の研究は、異なるマウスの系統及び性別（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの代わりにオスのＢａｌｂ／ｃ）、異なるＬＰＳ系統及び血清型（Ｅ． Ｃｏｌｉの代わりにサルモネラ菌）、及び異なるＬＰＳ投与（鼻腔内の代わりに、エアロゾルで、３０分にわたって３．５ｍｇ／１ｍＬ）を含む、わずかに異なるモデルを使用して実施した。４、４０及び４００ｇ／ｋｇのＰＡ４０１投与量を、ＬＰＳ露出からｔ＝−５及びｔ＝＋３時間で皮下経路又は静脈内経路によって投与した。ＢＡＬ合計及び種々の細胞計数を、ｔ＝８時間で測定し、最も遅い時点を、以前の研究と比較した。
【００６４】
食塩水をエアロゾル化して散布したマウス及びデキサメタソンの気管内投与（ｔ＝−１時間で２０μｇ／２０μｌマウス）を受けたマウスを、対照として使用した。
【００６５】
この場合において、ＰＡ４０１は、ＢＡＬにおける合計細胞の数におけるかなり著しい減少（図４）を、好中球計数における減少（図５）によって、誘導した。ＰＡ４０１の活性は、さらに明らかに、皮下経路によるよりも静脈内によって投与された場合に、デキサメタゾンの気管内投与の同様の阻害効果に達した。この研究は、英国のＰｎｅｕｍｏｌａｂｓ Ｌｔｄで行われた。
【００６６】
これらの研究は、ヒトＡＬＩ／ＡＲＤＳ及びＣＯＰＤ増悪に類似している２つの急性肺好中球炎症の動物モデルにおける皮下経路又は静脈内経路によって投与されたＰＡ４０１の強い活性を証明した。この効果は、動物の性別又は遺伝的背景、ＬＰＳ血清型、及び鼻腔内滴下及びエアロゾル化曝露後とは無関係に得られた。
【００６７】
実施例３
ＰＡ４０１は、タバコの煙が誘発する肺炎症の急性モデルで作用する。マウスのタバコの煙への急な曝露は、少なくとも１部分で、ＣＯＰＤ患者において観察される肺炎症に似ている肺反応を導く。種々のマウスの系統は、急なタバコの煙の曝露に従って、肺炎症の変動する程度を示す（Ｇｕｅｒｒａｓｓｉｍｏｖ ｅｔ ａｌ． ２００４， Ｖｌａｈｏｓ ｅｔ ａｌ． ２００６）。マウスにおける反応におけるこの遺伝的変動性は、ヒトの喫煙者の中でＣＯＰＤを発達する変動する罹患率を表し、従って、このモデルは、ヒトの病理学をモデルとするために、最も関連性があると考えられる。
【００６８】
肺炎症は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスのマウス（影響されやすい系統）において、４日間にわたって４〜６本のタバコの煙にさらすことによって、誘発された。気管支肺胞洗浄での細胞浸潤に対する、煙曝露からの、ｔ＝＋３０分及びｔ＝＋６時間で投与された４、４０及び４００ｇ／ｋｇの投与量での皮下ＰＡ４０１治療の投与応答活性は、最後のタバコの煙にさらした２４時間後に上昇した。空気曝露、及びロフルミラスト（５ｍｇ／ｋｇ（経口））で処理した動物を対照として与えた。
【００６９】
ＣＯＰＤのこの動物モデルにおいても、ＰＡ４０１投与は、依存して、ＢＡＬにおいて回復した合計細胞数における増加を誘発したタバコの煙を阻害した。
【００７０】
合計細胞浸潤に対する非常に著しい効果を、４０及び４００ｈ／ｋｇで観察した（図６）。使用した最も高い投与量で、ＰＡ４０１は、好中球（図７）、マクロファージ（図８）、上皮細胞（図９）及びリンパ球（図１０）のＢＡＬにおける数を著しく減少した。これらの細胞亜型に対する著しい効果を、研究において使用した他の２つの投与量に関しても観察した。４００ｇ／ｋｇのＰＡ４０１の阻害効果を、ロフルミラスト５ｍｇ／ｋｇで得られたものと比較した。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００７１】
ＰＡ４０１
この研究は、タバコの煙への曝露を示した４日によって誘発された、混合した細胞浸潤に対するＰＡ４０１の活性、及びＣＯＰＤ患者における抗炎症活性の前兆となる動物モデルを証明する。
【００７２】
実施例４
ＰＡ４０１は、タバコの煙が誘発する肺炎症の亜慢性モデルで作用する。
【００７３】
この研究において、肺炎症を、１１日間にわたって、４〜６本のタバコの煙にさらすことによって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのメスのマウスにおいて誘発した。実施例３における研究に基づいて、気管支肺胞洗浄に対する細胞浸潤に対する、１回は１日３時間（１日４回）及び隔日（ｑ．ｏ．ｄ）は＋３時間での煙の曝露（１日２回）からｔ＝−３０分及びｔ＝＋６時間で投与した４００ｇ／ｋｇの最適投与量での皮下ＰＡ４０１治療の投与頻度活性を、最後のタバコの煙にさらした２４時間後に測定した。空気曝露、及びロフルミラスト（５ｍｇ／ｋｇ（経口））で処理した動物を対照として与えた。
【００７４】
合計細胞浸潤に対する著しい効果を、１日２回、毎日及び隔日投与後に観察した（図１１）。使用したすべての処理頻度で、ＰＡ４０１は、ＢＡＬにおける好中球（図１２）及び上皮細胞（図１３）の数が著しく減少した一方で、ｂ．ｉ．ｄ．及びｑ．ｄ．投与で得られたリンパ球（図１４）及びマクロファージ（図１５）における著しい減少は、ＰＡ４０１が隔日で投与された場合にはみられなかった。２回１日１回投与したＰＡ４０１の阻害効果を、ロフルミラスト５ｍｇ／ｋｇで得られたものと比較した。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００７５】
ＰＡ４０１
この研究は、１日２回及び１日１回の控えの４００μｇ／ｋｇの投与量でのＰＡ４０１投与が、タバコの煙への１１日間繰り返した曝露によって誘発された混合した細胞浸潤に対して同等の活性を有することを証明する。
【００７６】
実施例５
ＰＡ４０１は、タバコの煙が誘発する肺炎症の亜慢性モデルで作用する。
【００７７】
この研究において、肺炎症を、１１日間にわたって、４〜６本のタバコの煙にさらすことによって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのメスのマウスにおいて誘発した。 毎日の皮下への４００μｇ／ｋｇの投与量でのＰＡ４０１を、毎日の皮下への４０μｇ／ｋｇの投与量と比較した。処理をｔ＋３時間で実施し、そして気管支肺胞洗浄に対する細胞浸潤に対する作用を、最期のタバコの煙にさらした２４時間後に評価した。空気曝露、ロフルミラスト（５ｍｇ／ｋｇ（経口））処理した動物、及びＣＸＣＲ２アンタゴニストＳＣＨ５２７１２３で処理した動物（１日２回１０ｍｇ／ｋｇ（経口）−合計日投与量２０ｍｇ／ｋｇ）を、対照として扱った。
【００７８】
合計細胞浸潤に対する著しい効果を、４００及び４０μｇ／ｋｇの投与後に観察した（図１６）。これは、ＢＡＬにおける好中球（図１７）、上皮細胞（図１８）、リンパ球（図１９）及びマクロファージ（図２０）の数における著しい減少によった。４００μｇ／ｋｇの投与量で投与されたＰＡ４０１の阻害効果を、５ｍｇ／ｋｇのロフルミラスト及び２０ｍｇ（１０ｍｇ／ｋｇを１日２回）のＣＸＣＲ２アンタゴニストＳＣＨ５２７１２３で得られたものと比較した。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００７９】
ＰＡ４０１
この研究は、タバコの煙への１１日間繰り返した曝露によって誘発された混合した細胞浸潤に対して、皮下に４００μｇ／ｋｇ及び４０μｇ／ｋｇの投与量で１日１回投与したＰＡ４０１の活性を証明する。
【００８０】
実施例６
肺への局所デリバリー後の肺炎症におけるＰＡ４０１効果
実験を、ＬＰＳで誘発される肺炎症の動物モデルにおける肺への局所デリバリー後に、ＰＡ４０１の活性を検証するために実施した。
【００８１】
この実験において、肺炎症を、オスのＢａｌｂ／ｃマウスにおけるエアロゾル（サルモネラ菌、３０分にわたって３．５ｍｇ／７ｍＬ）によるＬＰＳのデリバリーよって誘発した。ＰＡ４０１を、ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（ＦＪＭ−２５０ ｓｙｒｉｎｇｅ； ＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙ）、直接肺にエアロゾル（質量中央径１６〜２２μｍ）の煙流のデリバリーを可能にする装置を使用して気管内（ｉ．ｔ．）に投与した。ＰＡ４０１のｉ．ｔ．投与を、ＬＰＳ曝露の１時間前、又はＬＰＳ曝露の修了１時間後に、１００、４０、１０及び４ｇ／ｋｇの投与量で実施した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）をＬＰＳ曝露の８時間後に実施し、そして合計細胞及び好中球の数を測定した。デキサメタゾン２０ｇ／２０ｌ（マウス、ｉ．ｔ．）を参照化合物として使用した。
【００８２】
ＰＡ４０１は、主に好中球数の減少（図２２）によって、ＢＡＬにおける合計細胞の著しい投与量依存減少（図２１）を誘発した。治療処置（ｔ＝＋１時間）は、著しい活性である１００、４０及び１０ｇ／ｋｇの投与量での予防処置（−１時間）と比較して、約１０％改良した活性をもたらした。
【００８３】
図２１は、ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における合計の細胞数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【００８４】
図２２は、ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における好中球計数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【００８５】
これらのデータは、肺への局所デリバリーに続くＰＡ４０１の活性を証明し、慢性的な肺への適用のための静脈内又は皮下投与の代替品として、通常の良好な患者のコンプライアンスを有する、この投与形路の使用に対する可能性を開く。
【００８６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球浸潤での肺炎症を予防する又は治療するための、特にＣＸＣＬ８媒介肺炎症の予防又は治療のための、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び阻害させた又は下方制御させた受容体結合アフィニティーを有する媒介させたインターロイキン（ＩＬ−８、ＣＸＣＬ８）の新たな使用に関する。特に、吸入剤として媒介させたＩＬ−８の使用を提供する。
【０００２】
発明の背景：
肺炎症疾患は、ヒト集団及び効果的な治療の欠如におけるそれらの優位さを考慮して特に関連がある。特に、好中球の炎症を増加させることを示した肺炎症は、慢性閉塞性肺疾患、膵嚢胞性繊維症、慢性重症喘息及びよりその重症型と共に急性肺損傷、急性呼吸困難症候群である。
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、２０２０（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ． １９９８）によって世界的に三番目の死因になると予測されている進行性の衰弱性疾患である。タバコの煙は、その発達のための最も重要な病因として確立されているが、しかしながら、１５〜２０％のみの煙でＣＯＰＤは発達し、遺伝的構成及び他の環境因子が疾患の病原論における役割を果たすことが示唆されている。
【０００４】
患者の肺において観察されるＣＯＰＤでの炎症反応は、複雑であり、かつ先天性の及び後天性の免疫反応の活性を含む。しかしながら、疾患の進行は、白血球遊走、炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの製造、並びに潜在的な破壊性プロテアーゼによって左右される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ２００８）。
【０００５】
特に、好中球は、痰及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料において、ＣＯＰＤ患者の肺中で最も豊富な炎症細胞であることが知られている（Ｎｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９６； Ｐｅｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。ＣＸＣＬ８レベルは、疾患の進行の異なるステージ（健康な状態に対して１０〜１５倍増加）でＣＯＰＤ患者の痰及びＢＡＬにおいて著しく上昇し、かつ疾患の重さ及び好中球の存在に関連し（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｔａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、その際好中球移動中に含まれるキーケモカイン（ｋｅｙ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）としてＣＸＣＬ８を同定する（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。さらに、ＣＸＣＬ８の上昇レベルは、増悪中にＣＯＰＤ患者の痰中にも存在する（Ａａｒｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００１；Ｓｐｒｕｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【０００６】
しかしながら、現在の治療は、支持療法及び対症療法としてより作用し、抗炎症活性を有する。世界保健機関及びＧＯＬＤの推奨に基づいてＣＯＰＤの管理のために使用される薬剤は、短時間及び長時間作用性のβ２アゴニスト、短時間及び長時間作用性の抗コリン作用薬、メチルキサンチン、吸入型又は全身性グルココステロイド（ｇｌｕｃｏｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）を含む（Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｌｅｎｆａｎｔ ａｎｄ Ｋｈａｌｔａｅｖ ２００５）。それらの治療は、急性増悪を調整することに対するいくつかの効果を有するが、しかし従来のグルココルチコステロイドでの治療は、主に効果をもたらさず、かつＣＯＰＤを有する患者における弱毒化炎症を欠き（Ｃｕｌｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ． ２００７）、新たな抗炎症戦略の開発の必要を強調している（Ｆａｂｂｒｉ ｅｔ ａｌ ２００４）。
【０００７】
他の好中球の炎症によって特徴付けられる肺疾患は、膵嚢胞性繊維症（ＣＦ）である。いくつかの研究は、ＢＡＬ及び痰におけるＣＸＣＬ−８の増加レベル、並びにＣＦを有する患者の気管支腺におけるＣＸＣＬ８の増加した発現を記録している（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． １９９２； Ｔａｂａｒｙ ｅｔ ａｌ． １９９８）。その効力のある好中球化学誘因物質の特性は、気道における大量の好中球の流入を刺激する（Ｃｈｍｉｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００２）。細菌性感染は、さらに、ＣＸＣＬ８レベルを増加し、いっそう肺へ好中球を浸潤させ、そして中断することが難しい悪循環を生じ、そして慢性肺炎症をもたらす。ＣＸＣＬ８誘発性炎症に対して作用する治療、例えばＰＡ４０１でのこの悪循環に対する作用は、現在、気管支拡張及び粘液溶解薬又は抗生物質での支持療法のみに依存する、ＣＦ患者のための最も効果的な治療をもたらす。
【０００８】
１０人の喘息患者のうち１人は、しばしば、症状を調整するための試みにおいて徐々に高いステロイドの投与量を要求する、重症な前記疾患を示す。重症喘息は、より軽少であるよりも、疾病及び死の非常に高い危険性とも関連する。
【０００９】
強い関連は、現在、好中球炎症と、慢性重症喘息（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００２； Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｊａｔａｋａｎｏｎ ｅｔ ａｌ １９９９， Ｏｒｄｏｎｅｚ ａｔ ａｌ． ２０００， Ｋａｍａｔｈ ｅｔ ａｌ． ２００５； Ｆａｈｙ ２００９）、小児喘息（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００６）、喘息増悪（Ｆａｈｙ ｅｔ ａｌ． １９９５）、耐コルチコステロイド喘息（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ ２００２）、夜間喘息（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ １９９１）、喫煙者における喘息（Ｃｈａｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００１）及び職業性喘息（Ａｎｅｅｓ ｅｔ ａｌ．２００２）とを確立している。慢性好中球重症喘息が、その増加が喘息症状において示し、かつＣＯＰＤを有する特徴を共有するよりむしろ、明らかに異なる臨床表現型を示すことが、現在ますます認識されている（ＥＮＦＵＭＯＳＡ研究グループ）。慢性重症喘息の場合においても、上皮細胞誘発ＣＸＣＬ８は、主な好中球化学誘因物質として最も有望な候補であり（Ｌａｍｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｏｒｄｏｎｅｚ ｅｔ ａｌ． ２０００）、新たな抗炎症治療の開発のための潜在的な候補である。
【００１０】
本発明の目的は、従って、好中球で浸潤される肺炎症病理の予防又は治療のための方法を提供することである。
【００１１】
発明の要約
本発明は、それぞれ野生型のＩＬ−８と比較した、増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び阻害又は下方制御させたＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体、すなわちＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２）活性を有する改質したインターロイキン８（ＩＬ−８）を、好中球浸潤での肺炎症の予防及び治療のために使用することの発見に基づく。特に、ＩＬ−８の増加レベルが、疾患の進行及び重症さを有し、それらと関連するＣＯＰＤにおいて及びＣＯＰＤ増悪において（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｔａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、好中球移動において含まれるキーケモカインを標的とした治療発明（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）は、有益な抗炎症活性を提供する。さらに、それらの患者のための最新の治療は、支持療法及び症状療法に依存する一方で、従来のグリココルチコステロイドの適用が、主に効果がないことを証明し（Ｃｕｌｐｉｔｔ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ． ２００７）、新たな抗炎症戦略の開発の要求を強調している（Ｆａｂｂｒｉ ｅｔ ａｌ． ２００４， ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００７）。
【００１２】
改質したＩＬ−８の使用が、既に、肺における高レベルの好中球炎症を欠いた"通常の"喘息の治療のために簡単に記載されているが、好中球浸潤を有する肺炎症の治療及び予防のための前記の改質ＩＬ−８分子の成功した使用は、以前鋳示されておらず、又は示されていない。前記改質ＩＬ−８分子の抗喘息活性は、他の、喘息に関連したケモカイン、例えばエオタキシンの非特異的又は続発性の置換から生じる。
【００１３】
阻害又は下方制御された活性は、少なくとも、ＧＰＣＲの活性化による好中球の活性化の減少又は完全な欠失である。ＣＸＣＬ−８媒介肺炎症又はＩＬ−８誘発好中球浸潤が特定の肺疾患において有意であることが長く確立されてきたが、前記改質ＩＬ−８、"タンパク質を基礎としたＧＡＧアンタゴニスト"は、好中球浸潤での肺炎症疾患の予防又は治療におけるかかる効力を有することは、報告又は示唆されていない。
【００１４】
従って、本発明の主題は、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して、増加させたＧＡＧ結合アフィニティー及び阻害又は下方制御させたＧＰＣＲ活性を、個々の好中球浸潤での肺炎症疾患の予防又は治療のための使用のために提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＬＰＳを点滴注入したマウスの気管支肺胞洗浄における合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図２】ＬＰＳを点滴注入したマウスの気管支肺胞洗浄のサイトスピンにおける好中球の数に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図３】ＬＰＳを点滴注入したマウスの気管支肺胞洗浄のサイトスピンにおけるリンパ球の数に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図４】ＬＰＳをエアロゾル化にして散布したマウスの気管支肺胞洗浄における合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図５】ＬＰＳをエアロゾル化にして散布したマウスの気管支肺胞洗浄のサイトスピンにおける好中球の数に対するＰＡ４０１の用量応答効果を示す図。
【図６】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄における合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１（図６ａ）及びロフルミラスト（図６ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図７】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄における好中球浸潤に対するＰＡ４０１（図７ａ）及びロフルミラスト（図７ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図８】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄におけるマクロファージ浸潤に対するＰＡ４０１（図８ａ）及びロフルミラスト（図８ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図９】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄における上皮細胞浸潤に対するＰＡ４０１（図９ａ）及びロフルミラスト（図９ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図１０】４日間タバコの煙にさらしたマウスの気管支肺胞洗浄におけるリンパ球浸潤に対するＰＡ４０１（図１０ａ）及びロフルミラスト（図１０ｂ）の用量応答効果を示す図。
【図１１】ＰＡ４０１（図１１ａ）の１日２回、毎日及び隔日の投与後の合計細胞浸潤に対する効果、及びロフルミラストとの比較（図１１ｂ）を示す図。
【図１２】ＰＡ４０１（図１２ａ）による全ての治療頻度での好中球の減少、及びロフルミラストとの比較（図１２ｂ）を示す図。
【図１３】ＰＡ４０１（図１３ａ）による全ての治療頻度での上皮細胞の減少、及びロフルミラストとの比較（図１３ｂ）を示す図。
【図１４】ＰＡ４０１が隔日投与された場合（図１４ａ）に、ｂ．ｉ．ｄ．及びｑ．ｄ．投与で得られたリンパ球における著しい減少の損失、及びロフルミラストとの比較（図１４ｂ）を示す図。
【図１５】ＰＡ４０１が隔日投与された場合（図１５ａ）に、ｂ．ｉ．ｄ．及びｑ．ｄ．投与で得られたマクロファージにおける著しい減少の損失、及びロフルミラストとの比較（図１５ｂ）を示す図。
【図１６】４００〜４０ｇ／ｋｇ投与後に観察された合計細胞浸潤に対するＰＡ４０１の効果（図１６ａ）、ロフルミラストとの比較（図１６ｂ）を示す図。
【図１７】ＢＡＬにおける好中球の数の減少（ＰＡ４０１、図１７ａ及びロフルミラスト、図１７ｂ）を示す図。
【図１８】ＢＡＬにおける上皮細胞の数の減少（ＰＡ４０１、図１８ａ及びロフルミラスト、図１８ｂ）を示す図。
【図１９】ＢＡＬにおけるリンパ球の数の減少（ＰＡ４０１、図１９ａ及びロフルミラスト、図１９ｂ）を示す図。
【図２０】ＢＡＬにおけるマクロファージの数の減少（ＰＡ４０１、図２０ａ及びロフルミラスト、図２０ｂ）を示す図。
【図２１】ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における合計の細胞数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す図。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図２２】ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における好中球の数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す図。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【００１６】
発明の詳細な説明
ＣＸＣＬ−８媒介肺炎症は、患者の肺における好中球浸潤を導くことができる。
【００１７】
本発明は、好中球浸潤を有する肺炎症の予防又は治療のための使用のための、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して、増加されたＧＡＧ結合アフィニティー、及びさらに阻害又は下方制御されたＧＰＣＲ活性を有する改質インターロイキン８（ＩＬ−８）を含む。好中球浸潤を有する肺炎症の治療のための本発明において使用されるような改質されたＩＬ−８分子は、ＧＡＧ、ＩＬ−８特異的ＧＡＧリガンドに対して増加したアフィニティーを導くＧＡＧ（グリコサミノグリカン）結合領域において改質される。改質は、自然に生じるＧＡＧ結合領域であってよく、又は代わりに、新たなＧＡＧ結合領域が、ＧＡＧに対する増加したアフィニティーをもたらす前記分子中で導入されうる。少なくとも１つの自然に生じるアミノ酸をアミノ酸、有利には塩基性又は電子供与性アミノ酸に置換すること、並びに／又は少なくとも１つの嵩高な及び／又は酸性アミノ酸をＧＡＧ結合領域中で置換することによって、人工の及び／又は改良したＧＡＧ結合部位が、前記タンパク質に導入される。この方法によって、全体のより電気陰性の分子の特徴が、ケモカイン中に導入されうる。
【００１８】
主な目的は、塩基性又は電子供与性アミノ酸、有利にはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎの相対量を、前記部位におけるアミノ酸の合計量と比較して、増加することであり、それによって、得られたＧＡＧ結合部位が、有利には少なくとも３つの塩基性アミノ酸、さらに有利には少なくとも４つの、最も有利には少なくとも５つのアミノ酸を含有する。これは、そのＨＳＰＧ共受容体からケモカインを基礎としたＧＡＧアンタゴニストに競合しているｗｔＩＬ−８を導く。
【００１９】
特定の一実施態様において、ＧＡＧ結合部位は、ＧＡＧ結合アフィニティーを増加するために改質されたＣ末端のアルファヘリックスである。
【００２０】
"嵩高なアミノ酸"の用語は、長い又は立体的に妨害側鎖を有するアミノ酸を意味し、特にＴｒｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒである。有利には、ケモカイン上のＧＡＧ結合部位は、嵩高なアミノ酸を有さず、ＧＡＧリガンドによる最適な誘導適合を可能にする。有利には、ＩＬ−８における１７位、２１位、７０位及び／又は７１位は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎによって置換される。最も有利には、ＩＬ−８の全ての４つの１７位、２１位、７０位及び７１位は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎ、有利にはＬｙｓによって置換される。
【００２１】
本発明において使用される改質されたＩＬ−８は、阻害又は下方制御された受容体結合領域、特にＧＰＣＲ（Ｇタンパク質結合受容体）結合も含む。従って、本発明によるタンパク工学による不活性化は、好中球活性の促進において低減された又は好中球活性を促進することができないＩＬ−８分子を導く。
【００２２】
これは、一方でＧＡＧ結合アフィニティーが、野生型ＧＡＧ結合タンパク質よりも高い全体的なアプローチのために意味し、その結果、改質タンパク質は、野生型タンパク質の代わりに、大部分は結合する。他方で、タンパク質がＧＡＧに結合される場合に主に生じる野生型タンパク質のＧＰＣＲ活性は、阻害又は下方制御される。それというのも、改質されたタンパク質が、この特定の活性で実施されず、又はより小さい範囲までこの活性が実施される。
【００２３】
受容体結合領域は、欠失、挿入、並びに／又は、例えばアラニン、立体及び／又は静電的に同様の残基での置換によって改質されうる。受容体結合領域において、少なくとも１つのアミノ酸を欠失又は挿入又は置換することが可能である。
【００２４】
使用される改質ＩＬ−８において、ＧＰＣＲ結合領域は、最初の１０個のＮ末端アミノ酸内に位置する。最初のＮ末端アミノ酸は、白血球活性中に含まれ、それによって特にＧｌｕ−４、Ｌｅｕ−５及びＡｒｇ−６は、受容体結合及び活性化のために必須であるべきと認識される。従って、それらの３つ又は最初の１０個までのＮ末端のアミノ酸は、受容体結合及び活性を阻害又は下方制御するために置換又は欠失されうる。
【００２５】
例えば、改質されたＩＬ−８は、欠失された最初の６個のＮ末端アミノ酸を有してよい。前記のように、この突然変異体は全くないか、白血球をより少ない程度で結合し、かつ活性化し、及び／又は好中球の活性を促進し、結果として特に臓器移植拒絶の治療に適している。
【００２６】
有利には、改質されたＩＬ−８は、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＫＮ７１Ｒ、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ、ｄｅｌ６Ｅ７０ＫＮ７１Ｋ、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ、及びｄｅｌ６Ｆ１７ＫＦ２１ＫＥ７０ＫＮ７１Ｋからなる群から選択される。
【００２７】
改質されたＩＬ８分子のアミノ酸配列は、有利には、一般式
［Ｘ１はアミノ酸配列ＳＡＫＥＬＲであり、
Ｘ２は、アミノ酸配列ＣＱＣＩであり、
Ｘ３は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＲであり、
Ｘ４は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、
Ｘ５は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
Ｘ６は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＫであり、
かつｎ及び／又はｍは、０又は１である］によって記載される。
【００２８】
好ましい一実施態様において、改質されたＩＬ−８分子の配列は
であり、その際最初の６つのアミノ酸（ＳＡＫＥＬＲ）は、消失される。
【００２９】
有利には、改質されたＩＬ−８は、ＷＯ ０５／０５４２８５において開示されているような改質されたＩＬ−８と類似又は同一である。
【００３０】
組成物の投与は、静脈内経路、筋肉内経路又は皮下経路によってよい。それぞれの成分の所望の血中レベルを確立してよい他の投与経路、例えば全身投与又は吸入も含まれる。
【００３１】
特に、肺、有利には吸入又は気管内投与に対する局所デリバリーは、有利な投与形式であることが示されている。従って、改質されたＩＬ−８を、吸入剤として調合することができ、かつ当業者に公知の吸入システムによって投与することができる。改質されたＩＬ−８は、液体、エアロゾル又は粉末として調合されうる。
【００３２】
本発明による組成物を含有する医薬品は、製剤学的に認容性のキャリヤーと共に調合されうる。
【００３３】
"製剤学的に認容性の"とは、活性成分の生物学的活性の有効性と干渉せず、かつ投与される宿主に対して毒性のない、あらゆるキャリヤーを包含することを意味する。例えば、非経口投与のために、改質されたＩＬ−８は、ビヒクルにおける注入のための単一投与型、例えば食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液中で調合されてよい。さらに、製剤学的に認容性のキャリヤーは、少量の添加剤、例えば安定剤、付形剤、緩衝液及び保存薬も含まれうる。
【００３４】
組成物を含有する改質されたＩＬ−８は、好中球浸潤によって特徴付けられるあらゆる肺炎症疾患を予防又は治療するための医薬品を製造するために使用される。より詳述すれば、これらの疾患は、例えば慢性閉塞性肺疾患、膵膿疱性繊維症、重症喘息、気管支炎、急性肺損傷及び急性呼吸困難症であってよい。
【００３５】
特に、改質されたＩＬ−８は、ＣＯＰＤの治療のために使用される。
【００３６】
代わりの一実施態様として、好中球性喘息又は増悪の予防又は治療は、特に本明細書に従って改質されたＩＬ−８を使用して含まれる。
【００３７】
本発明によって、ＬＰＳ吸入によって誘発されるあらゆる肺炎症も、治療又は予防されうる。それというのも、ＬＰＳが、ＩＬ−８発現を誘発する主な因子（感染症におけるケモカイン及びケモカイン受容体）の１つであるからである。（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｓ， Ｋａｒｕｐｉａｈ Ｇ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９９ Ｄｅｃ；７７（６）：４６９−７５）。ＬＰＳは、グラム陰性菌における壁の構成成分であり、かつ従ってグラム陰性菌の感染が生じる場合に存在し、又は汚染物質において及びタバコの葉において存在する。
【００３８】
代わりに、改質されたＩＬ−８の治療的有効量を被験者に投与することを含むことを必要とする被験者における好中球浸潤を有する肺炎症の治療方法は、本発明によって覆われる。特に、前記投与は、吸入によって又は気管内投与による。
【００３９】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
特に、好中球は、痰及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料において、ＣＯＰＤ患者の肺中で最も豊富な炎症細胞であることが知られている（Ｎｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９６； Ｐｅｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。タバコの煙は、おそらく骨髄からの移動を増加させることによって（Ｃｏｗｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ． ２００８）、好中球の循環の上昇の原因であり、かつ肺毛細血管へのそれらの滞留は、肺循環を出る。この特徴は、肺循環に関して特有である。それというのも、全身的な循環において、好中球が、後毛細管小静脈のレベルで出るからである。
【００４０】
好中球は、そして、気管支の壁に及び肺柔組織まで移動する（Ｐｅｌｅｍａｎ ａｔ ａｌ． １９９９； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ２００８）。続く、酸素種とエラスターゼとの反応の放出での好中球の活性は、肺損傷及び慢性機能不全の主な原因と考えられる。実際に、血中好中球は、以前から、最大努力呼気肺活量に関して測定された肺機能における低下率に関連がある（ＦＥＶ； Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ． １９８４）。
【００４１】
ＣＸＣＬ８レベルは、病気の進行の種々のステージ（健康な状態に対して１０〜１５倍増加）でのＣＯＰＤ患者の痰及びＢＡＬにおいて著しく上昇し、かつ疾患の選択性及び好中球の存在に関係し（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｔａｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、好中球移動に含まれるキーケモカインとしてＣＸＣＬ８が同定される（Ｗｏｏｌｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２）。さらに、ＣＸＣＬ８の上昇レベルは、憎悪中にＣＯＰＤ患者の痰中にも存在する（Ａａｒｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００１；Ｓｐｒｕｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【００４２】
膵膿疱性繊維症
膵膿疱性繊維症（ＣＦ）は、欠陥的上皮塩素分泌を導くＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子における種々の突然変異を有する、外分泌腺中のイオン輸送の重症な単一遺伝子疾患である（Ｒｉｏｒｄａｎ １９８９； Ｒａｔｊｅｎ ２００９）。外分泌腺の管における脱水及び粘膜分泌の填塞は、特に胃腸、肝胆道、生殖管及び気道における多臓器臨床兆候に罹患しやすくする。
【００４３】
慢性細菌感染及び肺の炎症は、ＣＦ患者にける罹患率及び死亡率の主な原因である（Ｒａｔｊｅｎ ２００６）。年齢の増加と共に、ＣＦ患者は、気道閉塞が生じ、かつそれらの患者の多くは、気道過敏症及び喘息様症状にも苦しむ。
【００４４】
多くの炎症性サイトカインは、ＣＦ患者における気道において製造される（Ｓａｇｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００２）。いくつかの研究は、ＢＡＬ及び痰におけるＣＸＣＬ−８の増加レベル、並びにＣＦを有する患者の気管支腺におけるＣＸＣＬ８の増加した発現を記録している（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． １９９２； Ｔａｂａｒｙ ｅｔ ａｌ． １９９８）。その効力のある好中球化学誘因物質の特性は、気道における大量の好中球の流入を刺激する（Ｃｈｍｉｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００２）。さらに、ＣＦの子供からの好中球は、ＣＦを有さないものと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＸＣＬ８に高い遊走応答性を示し、その際持続的に上昇させたＣＸＣＬ８レベルが、"第一の"ＣＦ好中球であってよいことを示唆している（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ． ２００１）。
【００４５】
ＣＦ好中球及びＣＦＴＲ突然変異体を有する気管支上皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの共培養に対する最近の研究において、ＣＦ患者において、多くの数の気道上皮上への、及び上昇したＣＸＣＬ８レベルと関連のある非アポトーシス性好中球付着は、持続性の及び過度の気道における炎症反応に寄与することが示唆されている（Ｔａｂａｒｙ ｅｔ ａｌ． ２００６）。
【００４６】
実際に、Ｎａ−Ｃｌの平衡異常は、最初にＣＸＣＬ８の増加した製造及び続く好中球浸潤の原因であると思われる。細菌性感染は、さらに、ＣＸＣＬ８レベルを増加し、いっそう肺へ好中球を浸潤させ、そして中断することが難しい悪循環を生じ、そして慢性肺炎症をもたらす。この悪循環に対する作用は、現在、支持療法又は抗生物質のみに依存する、ＣＦ患者のための最も効果的な治療をもたらしうる。
【００４７】
重症喘息
好酸球炎症は、長い間、喘息の特有の病理学的に顕著な特徴と見なされていた。しかしながら、好酸球炎症は、喘息患者の５０％のみの気道において存在し（Ｄｏｕｗｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００２）、かつしばしば喘息増悪において観察されない。
【００４８】
強い関連は、現在、好中球炎症と、慢性重症喘息（Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００２； Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｊａｔａｋａｎｏｎ ｅｔ ａｌ １９９９， Ｏｒｄｏｎｅｚ ａｔ ａｌ． ２０００， Ｋａｍａｔｈ ｅｔ ａｌ． ２００５； Ｆａｈｙ ２００９）、小児喘息（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ ｅｔ ａｌ． ２００６）、喘息増悪（Ｆａｈｙ ｅｔ ａｌ． １９９５）、耐コルチコステロイド喘息（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ ２００２）、夜間喘息（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ １９９１）、喫煙者における喘息（Ｃｈａｌｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２００１）及び職業性喘息（Ａｎｅｅｓ ｅｔ ａｌ．２００２）とを確立している。
【００４９】
急性喘息発作中に、好酸球及び好中球が共存する（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ １９９９）が、しかし、好中球が、経時的に最も多い細胞集団になることが示唆されている。それらの起動中での存在は、疾患の重症度及び進行に比例し（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ １９９７）、かつ空気流閉塞及び減少した肺機能に関連する（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ． ２００７）。好中球は、非常に重症な状態において観察される白血球数でもあり、かつしばしば突然発症によって特徴付けられる喘息の致命的な形である（突然発症喘息；Ｓｕｒ ｅｔ ａｌ． １９９３）。
【００５０】
急性肺損傷（ＡＬＩ）及び急性呼吸不全症候群（ＡＲＳＤ）
急性肺損傷（ＡＬＩ）及びそのより重症な形、急性呼吸不全症候群（ＡＲＤＳ）は、高められた血管透過性及び増加した重症度の肺水腫形成を有する急性肺炎症によって特徴付けられる、同様の疾患の２つの異なるステージを示す（Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ． １９９４）。病理学は、改良された集中治療介入にもかかわらず、過去１０年において増加の傾向がない非常に高い死亡率（約４０％）をもたらす（Ｐｕｈａ ｅｔ ａｌ． ２００９）。
ＡＬＩ及びＡＲＤＳにおける好中球の関与は、いくつかのグループ（Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ ２０００； Ａｂｒａｈａｍ ２００３）によって証明されており、かつＢＡＬにおける好中球の増加されたレベル及び増加したＣＸＣＬ８レベルとその関係が報告されている（Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ． ２０００）。さらに、ＢＡＬにおけるレベルの上昇したＣＸＣＬ８は、リスクの高い患者に対するＡＲＤＳの発達と関連がある（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ． １９９３； Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ． １９９５）。
【００５１】
肺において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、間質の非線維性区画の主な成分であり、かつ上皮下組織中に及び気管支壁中に、並びに気道分泌物中にある。それらの存在は、水分補給及びホメオスタシスを調整すること、組織構造を維持すること、及び炎症反応を調整することを必須とする（例えばＳｏｕｚａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００６）。
【００５２】
他の人間の病理学と比較して、肺の疾患において系もカイン作用を媒介するＧＡＧの介入を支持する多くの文献は存在しない。
【００５３】
ヘパリン／ヘパラン硫酸、コンドロイチン／デルマタン硫酸、ケラチン硫酸及びヒアルロナンを含むグリコサミノグリカンの全ての４つの種類が、通常の肺において存在する。ヘパラン硫酸は、主な形（〜４０％）と報告されており、続いてコンドロイチン／デルマタン硫酸（〜３１％）であり、より少ない範囲としてヒアルロナン（〜１４％）、及びケラチン硫酸である（Ｆｒｅｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。
【００５４】
前記は、次の実施例に関してより完全に理解されうる。かかる実施例は、しかしながら、単に本発明の１つ以上の実施態様を実施する方法の代表に過ぎず、かつ本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００５５】
実施例
ほとんど、全ての肺の病理学、肺血管透過率及びマトリックスが観察されない場合を考慮すると、ＰＡ４０１（ｄｅｌ６Ｆ１７ＫＦ２１ＫＥ７０ＫＮ７１Ｋ ＩＬ−８突然変異体）の全身投与が、適正な双方の肺血管でのＰＡ４０１のレベル及び上皮レベルに達することに適当であるべきである。
【００５６】
実施例１：
ＰＡ４０１は、マウスにおけるＬＰＳ誘発性急性肺炎症モデルに対して効果がある。
【００５７】
種々の刺激は、肺中への好中球遊走を誘発する。最も頻繁に使用され、かつ良好に特徴付けられた炎症誘発因子の中には、グラム陰性菌（リポ多糖：ＬＰＳ）の菌体内毒素がある。
【００５８】
鼻腔内に滴下された、又はエアロゾル化して散布したＬＰＳは、攻撃後４〜８時間に達せられるピークレベルで、及びマウスにおいて２４時間までの間の基準線を著しく越えたままである、肺血管、間質及びＢＡＬ（Ｒｅｕｔｅｒｓｈａｎ ｅｔ ａｌ． ２００５）における好中球浸潤に依存する投与量及び時間を生じる。
【００５９】
投与されるＬＰＳ投与量は、ＬＰＳ血清型、適用方法、及び使用したマウスの染色に依存して、０．１μｇ／マウスまで低く、８００μｇ／マウスまでのＬＰＳの投与量に関して報告されている著しいＢＡＬ好中球で変化する。
【００６０】
ＬＰＳ吸入は、種を超えて肺好中球浸潤を誘発することができる（例えばマウス及びラット、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００７；モルモット、Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ２００２；ウサギ、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． ２００８；ヒツジ、Ｗａｅｒｈａｕｇ ｅｔ ａｌ． ２００９；ウマ、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００６；イヌ、Ｋｏｓｈｉｋａ ｅｔ ａｌ． ２００１）。健康な被験者における１〜１００ｇのＬＰＳの吸入は、急性肺炎症（Ｍａｒｉｓ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｋｉｔｚ ｅｔ ａｌ． ２００８）及び慢性閉塞性肺疾患増悪（Ｋｈａｒｉｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ， ２００７）のための、確固とした及び信頼できるモデルと見なされている。
【００６１】
急性肺好中球のモデルにおける抗炎症薬としてのＰＡ４０１の潜在性を評価するために、ＬＰＳ（０．３μｇ／マウス、血清型緑膿菌）を鼻腔内滴下したＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスのマウスにおける４、４０、２００及び４００μｇ／Ｋｇの投与量でのＰＡ４０１の皮下投与での投与応答の研究を実施した。擬似滴下（食塩水）した動物、及びデキサメタゾン３ｍｇ／ｋｇ（皮下）（ＬＰＳ滴下前のｔ＝−１時間で投与した）処理した動物を、対照として使用した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、ＬＰＳ滴下の４時間後に実施し、そしてＢＡＬ試料に対する合計細胞計数及びＢＡＬサイトスピンでの種々の細胞計数を測定した。
【００６２】
ＰＡ４０１は、ＢＡＬ液体において評価された肺において滴下された細胞の合計数における投与量依存の減少を誘発した（図１）。その作用は、４ｇ／ｋｇと低いＰＡ４０１の投与に関する著しい作用での好中球（図２）及びリンパ球（図３）の数における著しい減少によった。驚くべきことに、２００〜４００ｇ／ｋｇの投与量でのＰＡ４０１で得られたＢＡＬにおける細胞浸潤の阻害は、デキサメタゾンの高い投与量（３ｍｇ／ｋｇ）での治療で得られたものと比較できた。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００６３】
実施例２
第二の研究は、異なるマウスの系統及び性別（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの代わりにオスのＢａｌｂ／ｃ）、異なるＬＰＳ系統及び血清型（Ｅ． Ｃｏｌｉの代わりにサルモネラ菌）、及び異なるＬＰＳ投与（鼻腔内の代わりに、エアロゾルで、３０分にわたって３．５ｍｇ／１ｍＬ）を含む、わずかに異なるモデルを使用して実施した。４、４０及び４００ｇ／ｋｇのＰＡ４０１投与量を、ＬＰＳ露出からｔ＝−５及びｔ＝＋３時間で皮下経路又は静脈内経路によって投与した。ＢＡＬ合計及び種々の細胞計数を、ｔ＝８時間で測定し、最も遅い時点を、以前の研究と比較した。
【００６４】
食塩水をエアロゾル化して散布したマウス及びデキサメタソンの気管内投与（ｔ＝−１時間で２０μｇ／２０μｌマウス）を受けたマウスを、対照として使用した。
【００６５】
この場合において、ＰＡ４０１は、ＢＡＬにおける合計細胞の数におけるかなり著しい減少（図４）を、好中球計数における減少（図５）によって、誘導した。ＰＡ４０１の活性は、さらに明らかに、皮下経路によるよりも静脈内によって投与された場合に、デキサメタゾンの気管内投与の同様の阻害効果に達した。この研究は、英国のＰｎｅｕｍｏｌａｂｓ Ｌｔｄで行われた。
【００６６】
これらの研究は、ヒトＡＬＩ／ＡＲＤＳ及びＣＯＰＤ増悪に類似している２つの急性肺好中球炎症の動物モデルにおける皮下経路又は静脈内経路によって投与されたＰＡ４０１の強い活性を証明した。この効果は、動物の性別又は遺伝的背景、ＬＰＳ血清型、及び鼻腔内滴下及びエアロゾル化曝露後とは無関係に得られた。
【００６７】
実施例３
ＰＡ４０１は、タバコの煙が誘発する肺炎症の急性モデルで作用する。マウスのタバコの煙への急な曝露は、少なくとも１部分で、ＣＯＰＤ患者において観察される肺炎症に似ている肺反応を導く。種々のマウスの系統は、急なタバコの煙の曝露に従って、肺炎症の変動する程度を示す（Ｇｕｅｒｒａｓｓｉｍｏｖ ｅｔ ａｌ． ２００４， Ｖｌａｈｏｓ ｅｔ ａｌ． ２００６）。マウスにおける反応におけるこの遺伝的変動性は、ヒトの喫煙者の中でＣＯＰＤを発達する変動する罹患率を表し、従って、このモデルは、ヒトの病理学をモデルとするために、最も関連性があると考えられる。
【００６８】
肺炎症は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスのマウス（影響されやすい系統）において、４日間にわたって４〜６本のタバコの煙にさらすことによって、誘発された。気管支肺胞洗浄での細胞浸潤に対する、煙曝露からの、ｔ＝＋３０分及びｔ＝＋６時間で投与された４、４０及び４００ｇ／ｋｇの投与量での皮下ＰＡ４０１治療の投与応答活性は、最後のタバコの煙にさらした２４時間後に上昇した。空気曝露、及びロフルミラスト（５ｍｇ／ｋｇ（経口））で処理した動物を対照として与えた。
【００６９】
ＣＯＰＤのこの動物モデルにおいても、ＰＡ４０１投与は、依存して、ＢＡＬにおいて回復した合計細胞数における増加を誘発したタバコの煙を阻害した。
【００７０】
合計細胞浸潤に対する非常に著しい効果を、４０及び４００ｈ／ｋｇで観察した（図６）。使用した最も高い投与量で、ＰＡ４０１は、好中球（図７）、マクロファージ（図８）、上皮細胞（図９）及びリンパ球（図１０）のＢＡＬにおける数を著しく減少した。これらの細胞亜型に対する著しい効果を、研究において使用した他の２つの投与量に関しても観察した。４００ｇ／ｋｇのＰＡ４０１の阻害効果を、ロフルミラスト５ｍｇ／ｋｇで得られたものと比較した。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００７１】
ＰＡ４０１
この研究は、タバコの煙への曝露を示した４日によって誘発された、混合した細胞浸潤に対するＰＡ４０１の活性、及びＣＯＰＤ患者における抗炎症活性の前兆となる動物モデルを証明する。
【００７２】
実施例４
ＰＡ４０１は、タバコの煙が誘発する肺炎症の亜慢性モデルで作用する。
【００７３】
この研究において、肺炎症を、１１日間にわたって、４〜６本のタバコの煙にさらすことによって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのメスのマウスにおいて誘発した。実施例３における研究に基づいて、気管支肺胞洗浄に対する細胞浸潤に対する、１回は１日３時間（１日４回）及び隔日（ｑ．ｏ．ｄ）は＋３時間での煙の曝露（１日２回）からｔ＝−３０分及びｔ＝＋６時間で投与した４００ｇ／ｋｇの最適投与量での皮下ＰＡ４０１治療の投与頻度活性を、最後のタバコの煙にさらした２４時間後に測定した。空気曝露、及びロフルミラスト（５ｍｇ／ｋｇ（経口））で処理した動物を対照として与えた。
【００７４】
合計細胞浸潤に対する著しい効果を、１日２回、毎日及び隔日投与後に観察した（図１１）。使用したすべての処理頻度で、ＰＡ４０１は、ＢＡＬにおける好中球（図１２）及び上皮細胞（図１３）の数が著しく減少した一方で、ｂ．ｉ．ｄ．及びｑ．ｄ．投与で得られたリンパ球（図１４）及びマクロファージ（図１５）における著しい減少は、ＰＡ４０１が隔日で投与された場合にはみられなかった。２回１日１回投与したＰＡ４０１の阻害効果を、ロフルミラスト５ｍｇ／ｋｇで得られたものと比較した。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００７５】
ＰＡ４０１
この研究は、１日２回及び１日１回の控えの４００μｇ／ｋｇの投与量でのＰＡ４０１投与が、タバコの煙への１１日間繰り返した曝露によって誘発された混合した細胞浸潤に対して同等の活性を有することを証明する。
【００７６】
実施例５
ＰＡ４０１は、タバコの煙が誘発する肺炎症の亜慢性モデルで作用する。
【００７７】
この研究において、肺炎症を、１１日間にわたって、４〜６本のタバコの煙にさらすことによって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのメスのマウスにおいて誘発した。 毎日の皮下への４００μｇ／ｋｇの投与量でのＰＡ４０１を、毎日の皮下への４０μｇ／ｋｇの投与量と比較した。処理をｔ＋３時間で実施し、そして気管支肺胞洗浄に対する細胞浸潤に対する作用を、最期のタバコの煙にさらした２４時間後に評価した。空気曝露、ロフルミラスト（５ｍｇ／ｋｇ（経口））処理した動物、及びＣＸＣＲ２アンタゴニストＳＣＨ５２７１２３で処理した動物（１日２回１０ｍｇ／ｋｇ（経口）−合計日投与量２０ｍｇ／ｋｇ）を、対照として扱った。
【００７８】
合計細胞浸潤に対する著しい効果を、４００及び４０μｇ／ｋｇの投与後に観察した（図１６）。これは、ＢＡＬにおける好中球（図１７）、上皮細胞（図１８）、リンパ球（図１９）及びマクロファージ（図２０）の数における著しい減少によった。４００μｇ／ｋｇの投与量で投与されたＰＡ４０１の阻害効果を、５ｍｇ／ｋｇのロフルミラスト及び２０ｍｇ（１０ｍｇ／ｋｇを１日２回）のＣＸＣＲ２アンタゴニストＳＣＨ５２７１２３で得られたものと比較した。この研究は、英国のＡｒｇｅｎｔａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｔｄで行われた。
【００７９】
ＰＡ４０１
この研究は、タバコの煙への１１日間繰り返した曝露によって誘発された混合した細胞浸潤に対して、皮下に４００μｇ／ｋｇ及び４０μｇ／ｋｇの投与量で１日１回投与したＰＡ４０１の活性を証明する。
【００８０】
実施例６
肺への局所デリバリー後の肺炎症におけるＰＡ４０１効果
実験を、ＬＰＳで誘発される肺炎症の動物モデルにおける肺への局所デリバリー後に、ＰＡ４０１の活性を検証するために実施した。
【００８１】
この実験において、肺炎症を、オスのＢａｌｂ／ｃマウスにおけるエアロゾル（サルモネラ菌、３０分にわたって３．５ｍｇ／７ｍＬ）によるＬＰＳのデリバリーよって誘発した。ＰＡ４０１を、ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（ＦＪＭ−２５０ ｓｙｒｉｎｇｅ； ＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙ）、直接肺にエアロゾル（質量中央径１６〜２２μｍ）の煙流のデリバリーを可能にする装置を使用して気管内（ｉ．ｔ．）に投与した。ＰＡ４０１のｉ．ｔ．投与を、ＬＰＳ曝露の１時間前、又はＬＰＳ曝露の修了１時間後に、１００、４０、１０及び４ｇ／ｋｇの投与量で実施した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）をＬＰＳ曝露の８時間後に実施し、そして合計細胞及び好中球の数を測定した。デキサメタゾン２０ｇ／２０ｌ（マウス、ｉ．ｔ．）を参照化合物として使用した。
【００８２】
ＰＡ４０１は、主に好中球数の減少（図２２）によって、ＢＡＬにおける合計細胞の著しい投与量依存減少（図２１）を誘発した。治療処置（ｔ＝＋１時間）は、著しい活性である１００、４０及び１０ｇ／ｋｇの投与量での予防処置（−１時間）と比較して、約１０％改良した活性をもたらした。
【００８３】
図２１は、ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における合計の細胞数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【００８４】
図２２は、ＬＰＳの８時間後に採取した気管支肺胞洗浄における好中球計数に対するＬＰＳエアロゾル露出の１時間前（−１時間）及び１時間後（＋１時間）の、ＰＡ４０１の気管支内投与に対する用量応答活性を示す。ＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｎｅｔｔの試験：ビヒクル試験した動物に対して*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【００８５】
これらのデータは、肺への局所デリバリーに続くＰＡ４０１の活性を証明し、慢性的な肺への適用のための静脈内又は皮下投与の代替品として、通常の良好な患者のコンプライアンスを有する、この投与形路の使用に対する可能性を開く。
【００８６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球浸潤を有する肺炎症の予防又は治療における使用のための、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して、増加されたグリオサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティー、及びさらに阻害又は下方制御されたＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）活性を有する改質されたインターロイキン８（ＩＬ−８）。
【請求項２】
前記改質されたＩＬ−８が、ＧＡＧ結合領域中で塩基性アミノ酸の相対量を増加し、かつ／又は有利には溶剤露出位置でのＧＡＧ結合領域中で嵩高い及び／又は酸性アミノ酸の量を減少するために、少なくとも１つのアミノ酸での置換、挿入、及び／又は欠失によって改質されたＧＡＧ結合領域を含む、請求項１に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項３】
Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸が、前記ＧＡＧ結合領域中に挿入される、請求項２に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項４】
ＩＬ−８の１７位、２１位、７０位及び／又は７１位が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎによって置換される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項５】
ＩＬ−８のＧＰＣＲ結合領域が、有利には、アラニン、立体的に及び／又は静電的に類似の残基での、欠失、挿入、及び／又は置換によって改質される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項６】
前記改質されたＩＬ−８分子のアミノ酸配列が、
［Ｘ１は、アミノ酸配列ＳＡＫＥＬＲであり、
Ｘ２は、アミノ酸配列ＣＱＣＩであり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ３はＫであり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ４はＫであり、
Ｘ５は、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ５はＫであり、
Ｘ６は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ６はＫであり、
かつｎ及び／又はｍは、０又は１である］である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項７】
前記改質されたＩＬ−８分子が、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＫＮ７１Ｒ、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ、ｄｅｌ６Ｅ７０ＫＮ７１Ｋ、及びｄｅｌ６Ｆ１７ＫＦ２１ＫＥ７０ＫＮ７１Ｋからなる群から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項８】
前記改質されたＩＬ−８分子のアミノ酸配列が、
である、請求項１から７までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項９】
好中球浸潤を有する肺炎症が、慢性閉塞性肺疾患、膵嚢胞性繊維症、重症喘息、気管支炎、細気管支炎、急性肺損傷及び急性呼吸困難症候群から選択される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項１０】
吸入薬として調合された、請求項１から９までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項１１】
改質されたＩＬ−８の治療的有効量を被験者に投与することを含むことを必要とする被験者における、好中球浸潤を有する肺炎症の治療のための方法。
【請求項１２】
前記投与が、吸入による、又は気管内投与による、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
好中球浸潤を有する肺炎症の予防又は治療における使用のための、それぞれ野生型ＩＬ−８と比較して、増加されたグリオサミノグリカン（ＧＡＧ）結合アフィニティー、及びさらに阻害又は下方制御されたＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）活性を有する改質されたインターロイキン８（ＩＬ−８）。
【請求項２】
前記改質されたＩＬ−８が、ＧＡＧ結合領域中で塩基性アミノ酸の相対量を増加し、かつ／又は有利には溶剤露出位置でのＧＡＧ結合領域中で嵩高い及び／又は酸性アミノ酸の量を減少するために、少なくとも１つのアミノ酸での置換、挿入、及び／又は欠失によって改質されたＧＡＧ結合領域を含む、請求項１に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項３】
Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＨｉｓからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸が、前記ＧＡＧ結合領域中に挿入される、請求項２に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項４】
ＩＬ−８の１７位、２１位、７０位及び／又は７１位が、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ及び／又はＧｌｎによって置換される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項５】
ＩＬ−８のＧＰＣＲ結合領域が、有利には、アラニン、立体的に及び／又は静電的に類似の残基での、欠失、挿入、及び／又は置換によって改質される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項６】
前記改質されたＩＬ−８分子のアミノ酸配列が、
［Ｘ１は、アミノ酸配列ＳＡＫＥＬＲであり、
Ｘ２は、アミノ酸配列ＣＱＣＩであり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ３はＫであり、
Ｘ４は、Ｆ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ４はＫであり、
Ｘ５は、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ５はＫであり、
Ｘ６は、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｎ及び／又はＱからなる群から選択され、有利にはＸ６はＫであり、
かつｎ及び／又はｍは、０又は１である］である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項７】
前記改質されたＩＬ−８分子が、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＫＮ７１Ｒ、ｄｅｌ６Ｆ１７ＲＥ７０ＲＮ７１Ｋ、ｄｅｌ６Ｅ７０ＫＮ７１Ｋ、及びｄｅｌ６Ｆ１７ＫＦ２１ＫＥ７０ＫＮ７１Ｋからなる群から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項８】
前記改質されたＩＬ−８分子のアミノ酸配列が、
である、請求項１から７までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項９】
好中球浸潤を有する肺炎症が、慢性閉塞性肺疾患、膵嚢胞性繊維症、重症喘息、気管支炎、細気管支炎、急性肺損傷及び急性呼吸困難症候群から選択される、請求項１から８までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項１０】
吸入薬として調合された、請求項１から９までのいずれか１項に記載の改質されたＩＬ−８。
【請求項１１】
改質されたＩＬ−８の治療的有効量を被験者に投与することを含むことを必要とする被験者における、好中球浸潤を有する肺炎症の治療のための方法。
【請求項１２】
前記投与が、吸入による、又は気管内投与による、請求項１１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１３−５０４５４５（Ｐ２０１３−５０４５４５Ａ）
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８３８０（Ｐ２０１２−５２８３８０）
【出願日】平成２２年９月１３日（２０１０．９．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６３３８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９９３１
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５０５４７１９２３）プロットアフィン ビオテヒノロギー アクチエンゲゼルシャフト (4)
【住所又は居所原語表記】Ｉｍｐｕｌｓｚｅｎｔｒｕｍ Ｇｒａｚ−Ｗｅｓｔ，Ｒｅｉｎｉｎｇｈａｕｓｓｔｒａｓｓｅ １３ａ，８０２０ Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月７日（２０１３．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１３日（２０１０．９．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６３３８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２９９３１
【国際公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【出願人】（５０５４７１９２３）プロットアフィン ビオテヒノロギー アクチエンゲゼルシャフト (4)
【住所又は居所原語表記】Ｉｍｐｕｌｓｚｅｎｔｒｕｍ Ｇｒａｚ−Ｗｅｓｔ，Ｒｅｉｎｉｎｇｈａｕｓｓｔｒａｓｓｅ １３ａ，８０２０ Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ
【Ｆターム（参考）】
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