ＤＮＡメチル化部位の局在検出方法
【課題】組織及び細胞の固定試料において、特定の配列を持つＤＮＡのメチル化部位を検出するように設計された、ＤＮＡのメチル化部位の新規検出方法の提供。
【解決手段】（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに（ｖ）標識部位を検出する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化部位の検出方法など。
【解決手段】（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに（ｖ）標識部位を検出する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化部位の検出方法など。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞分化のエピジェネティック制御をより良く理解するためには、特定の部位におけるＤＮＡのメチル化を解析することが重要である。ＤＮＡのメチル化は、哺乳動物において、正常な精子形成の維持に関与する。メチル化のマークは、始原生殖細胞では消失し、性決定後、性特異的な様式で生殖ＤＮＡは再メチル化される（非特許文献１〜３）。ＤＮＡのメチル化は、哺乳動物において、ＣｐＧ配列のシトシン残基で起こる。しかしながら、ＣｐＧアイランドは、一般的に、メチル化されていない。残りのゲノムは、高度にメチル化されており、非−ＣｐＧ−アイランドＤＮＡのメチル化状態は、体細胞組織におけるＧＣ含量の局在レベルと負に相関する。その一方で、精巣では、低ＧＣ含量領域は、特異的に低メチル化されている（非特許文献４）。
【０００２】
哺乳動物の精子形成は、精祖細胞の増殖、精母細胞の減数分裂、及び精子完成からなる、秩序立った工程である（非特許文献５）。他方で、精子形成はまた、生殖細胞の段階的な分化において、ユークロマチンを、完全に凝縮されたヘテロクロマチンへと凝縮する役割を果たす工程であるとも考えられる（非特許文献６）。精子形成の間、生殖細胞の死滅は非常に一般的であり、実際に、予測される精子収量の２５〜７５％が失われていると考えられている（非特許文献７〜９）。ラット及びマウスでは、生殖細胞の死滅の態様は、ほとんどアポトーシス性の性質を有し（非特許文献１０、１１）、ミトコンドリアの死のシグナルが、正常な精子形成における自発的細胞死の誘導に関与する（非特許文献６）。
【０００３】
いくつかの証拠によって、ＤＮＡのメチル化の状態が、精子形成において重要な役割を果たすことが示唆されている。非特許文献１２は、ＤＮＡのメチル化レベルを減少させることが知られているシチジンアナログの５−アザ−２’−デオキシシチジンの使用が、精巣において組織学的異常をもたらすことを報告した。さらに、精巣においてＤＮＡの低メチル化を示す、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ様タンパク質（Ｄｎｍｔ３Ｌ）ホモ接合性の変異体マウスは、不妊であり（非特許文献１３、１４）、減数分裂異常となってアポトーシス様生殖細胞が出現する（非特許文献１５、１６）。
ＤＮＡのメチル化が、クロマチン凝縮と密接に関連していることを考慮し、本発明者らは、ＤＮＡのメチル化のどのような異常でも、おそらく不十分なヘテロクロマチン化に起因するアポトーシスの誘導をもたらすであろうと仮定した。ＤＮＡのメチル化の状態を、アポトーシス生殖細胞と関連付けるためには、組織化学的なアプローチが適当である。実際、５−メチルシトシンに対する抗体が入手可能であり、個々の細胞におけるＤＮＡのメチル化状態を免疫組織化学的に解析可能である。しかしながら、解析可能なメチル化部位（ＣｐＧ）の数が多過ぎて、免疫組織化学染色のデータをＤＮＡの特定の配列と関連付けることができない。また、これまでの研究によって、適切な制限エンドヌクレアーゼの組合せを用いた、細胞及び組織から抽出された単離ＤＮＡのメチル化が記述されているが、組織細胞レベルに対する適用は報告されていない。
【非特許文献１】Reik W. et al., Science 293: 1089-1093 (2001)
【非特許文献２】Yamazaki Y. et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 12207-12212 (2003)
【非特許文献３】Li J. Y. et al., Genomics 84: 952-960 (2004)
【非特許文献４】Oakes C. C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 228-233 (2007)
【非特許文献５】Bellve A. R. et al., Histochem Cytochem 25: 480-494(1977)
【非特許文献６】Koji T., Hishikawa Y., Arch Histol Cytol 66: 1-16(2003)
【非特許文献７】Oakberg E. F., Am J Anat 99: 391-413 (1956)
【非特許文献８】Huckins C., Anat Rec 190: 905-926 (1978)
【非特許文献９】Johnson L. et al., Biol Reprod 29: 207-215 (1983)
【非特許文献１０】Allan D. J. et al., Cell Prolif 25: 241-250 (1992)
【非特許文献１１】Wang R. A. et al., Biol Reprod 58: 1250-1256 (1998)
【非特許文献１２】Kelly T. L. et al., J Androl 24: 822-830 （2003）
【非特許文献１３】Bourc’his D. et al., Science 294:2536-2539 (2001)
【非特許文献１４】Hata K. et al., Development 129: 1983-1993(2002)
【非特許文献１５】Bourc’his D., Bestor T. H., Nature 431: 96-99 (2004)
【非特許文献１６】Hata K. et al., Mol Reprod Dev 73: 116-122(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、組織及び細胞の固定試料において、特定の配列を持つＤＮＡのメチル化部位を検出するように設計された、ＤＮＡのメチル化部位の新規検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、マウス精巣の組織学的切片を、メチル化感受性（ＨｐａＩＩ）及びメチル化非感受性（ＭｓｐＩ）のイソ制限酵素のセットを用いて処理し、次いで切断部位を標識し、標識部位を検出することによって、ＣＣＧＧ配列のような特定部位でのＤＮＡのメチル化レベルを評価できることを見出した。発明者らは、組織切片における特定の配列を持つＤＮＡのメチル化部位を検出するように設計されたこの新たな方法を、ＤＮＡのメチル化部位の組織エンドヌクレアーゼ連関検出法（histo endonuclease-linked detection of methylation sites of DNA：ＨＥＬＭＥＴ）と命名した。
本発明者らは、ＨＥＬＭＥＴを用いたところ、ほとんどの生殖細胞において、ＣＣＧＧ部位の高度メチル化が見られたものの、非メチル化ＣＣＧＧは、伸長精細胞中に共局在化していることを発見し、ＨＥＬＭＥＴによって個々の細胞レベルにおける、ＤＮＡのメチル化を解析できることを見出した。さらに、ＨＥＬＭＥＴとアポトーシス細胞を検出するための方法として知られているＴＵＮＥＬ法を組み合わせることによって、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性の生殖細胞（哺乳動物の精子形成において、頻出する）は、顕著にＨｐａＩＩ反応性となり、ＣＣＧＧ部位がアポトーシスの間に脱メチル化され、かつＣＣＧＧ部位のメチル化レベルが、精原細胞の分化段階によって変動することを明らかにした。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである：
〔１〕 （ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖ）標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
〔２〕 （ｉ）’組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）’前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）’工程（ｉｉ）’の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程、
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
〔３〕 工程（ｉｉｉ）’と工程（ｉｖ）’との間に、
（ｉｉｉ）’’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程；
をさらに含み、工程（ｉｖ）’が工程（ｉｉｉ）’’の固定試料に対して行われる、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕 第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素又はメチル化非感受性制限酵素である、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕 メチル化感受性制限酵素がＨｐａＩＩである、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕 第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、前記〔２〕又は〔３〕に記載の方法。
〔７〕 メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素との組合せが、それぞれＨｐａＩＩとＭｓｐＩ、ＡｖａＩＩとＳｉｎＩ、又はＳａｕ３ＡＩとＭｂｏＩ若しくはＮｄｅＩＩのいずれかである、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕 標識が、酵素、ハプテン、フルオロフォア及び放射性物質からなる群より選択される、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕 ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩである、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕 工程（ｉ）と（ｉｉ）との間又は工程（ｉ）’と（ｉｉ）’との間に、
（ａ）前処理した固定試料と、標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程；
をさらに含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕 工程（ａ）が、前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕 ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕 工程（ａ）において、標識された核酸分子が標識された核酸プローブであり、固定試料中のＤＮＡと該核酸プローブとの二本鎖を形成させる条件下で接触が行われる、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕 ２個以上の隣接組織固定試料をそれぞれ工程（ｉ）〜工程（ｖ）に供し、工程（ｖ）で検出された２個以上の隣接組織固定試料間の標識部位像を重ね合わせる工程をさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１５〕 ２個の隣接組織固定試料の一方を前記〔１〕に記載の方法に供して検出された標識部位像と、他方の隣接組織固定試料におけるＴＵＮＥＬ染色像とを重ね合わせて視覚化する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのアポトーシスとＤＮＡメチル化との関連性の検出方法。
〔１６〕 ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、第一の制限酵素、第一の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子、第二の制限酵素、第二の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子を別々の容器に含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出キット。
〔１７〕 第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、前記〔１６〕に記載のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、組織及び細胞試料の個々の細胞において、ＤＮＡのメチル化部位の局在を検出することが可能となる。また、本発明により、細胞の分化や増殖などの個々の細胞の状態と、ＤＮＡのメチル化又は非メチル化との関連付けが可能となる。これにより、癌の発症、治療、予後の病理のエピジェネティックな診断も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、以下の工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化部位又は非メチル化部位の検出方法（Ｉ）を提供する：
（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖ）標識部位を検出する工程。
【０００９】
本発明において「組織又は細胞の固定試料」とは、組織又は細胞集団を形成する個々の細胞の形態や構造内容物を観察可能に固体支持体上に固定した試料をいう。対象となる試料の由来は特に制限されず、いかなる生物由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）であり、より好ましくはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ等、特に好ましくはヒトである。組織試料の場合、試料はミクロトーム等で薄く切片化された組織切片を用いても、ホールマウントされた組織又は個体を用いても良いが、好ましくは、組織切片が用いられる。組織切片は、凍結組織を切片化し、パラフィンまたは樹脂で包埋された切片であってもよい。組織としては、例えば、脳、脊髄、眼球、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋などが挙げられる。細胞としては、前記組織から単離された細胞、及びそれら細胞から樹立した細胞株などが挙げられる。固体支持体上で培養した細胞又はサイトスピン等で固体支持体上に集めた細胞を乾燥させ、固定した後に細胞試料として用いられ得る。試料の固定には自体公知の方法を用いればよく、例えば、パラホルムアルデヒド液、グルタルアルデヒド液、四酸化オスミウム液、酢酸アルコール、メタノール、エタノールなどを用いる方法、凍結法、マイクロウェーブ乾燥法などが挙げられる。前記試料を固定する固体支持体は、固定操作及び以下に説明する前処理操作に耐えられるものであり、好ましくは顕微鏡観察に適するものであればよい。例えば、スライドガラスが挙げられる。
【００１０】
（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程
本発明において「固定試料を前処理する」とは、固定試料をタンパク質分解酵素処理することをいい、当該除タンパク質処理によって、その後に固定試料に作用させる酵素、ジデオキシヌクレオチド、及び核酸分子等の、固定試料内部への浸透性が高められる。また、当該処理によって、内因性ヌクレアーゼが不活性化されるため、本発明の標的物質であるＤＮＡの保存にも効果的である。前処理に用いられるタンパク質分解酵素は特に制限されないが、例えば、トリプシン、プロナーゼ、及びプロテイナーゼＫが挙げられ、特にプロテイナーゼＫが好ましい。
【００１１】
前処理の条件は、用いるタンパク質分解酵素に応じて適宜設定することができるが、例えばプロテイナーゼＫを用いた場合、当該酵素の濃度が１〜１００μｇ／ｍｌのリン酸緩衝液中、２０〜４０℃で１〜６０分が例示される。
【００１２】
固定試料がパラフィン包埋切片または樹脂包埋切片の場合、常法により脱パラフィンまたは脱樹脂を行った後に上記タンパク質分解酵素処理に供することができる。
【００１３】
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程
本発明の種々の検出方法に共通して用いられる、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素は、例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＤＮＡリガーゼのいずれかを用いても良く、より好ましくはＴｄＴ又はＤＮＡポリメラーゼＩであり、最も好ましくはＴｄＴである。
【００１４】
本発明の種々の検出方法に共通して用いられるジデオキシヌクレオチドは、ＤＮＡの３’末端に付加され、当該ＤＮＡの伸長反応を停止させるものであれば特に制限されないが、例えばｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＵＴＰ、ｄｄＴＴＰもしくはｄｄＡＴＰが単独で又は組み合わせて用いられ、好ましくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＴＴＰもしくはｄｄＡＴＰが単独で又は組み合わせて用いられる。
【００１５】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液の組成は、用いる酵素に応じて適宜設定することができるが、例えばＴｄＴを用いた場合、０．１〜０．５Ｍ カコジル酸塩、０．１〜１．０ｍＭ ＣｏＣｌ２及び０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）の緩衝液中、１００〜１０００ユニット／ｍｌ ＴｄＴ及び０．１〜１．０μＭ ジデオキシヌクレオチドが例示される。
接触時間は、２０〜４０℃で１０〜１２０分が例示されるが、これに限定されるものではない。また、接触の前に、酵素及びヌクレオチドを添加しない上記緩衝液のみで１〜数十分間プレインキュベーションしてもよい。
当該接触工程により、細胞内のＤＮＡの３’の遊離ＯＨ基がブロックされる。
【００１６】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程
本発明における第一の制限酵素は、特に制限されないが、好ましくは、ＤＮＡの認識配列中の塩基がメチル化されている場合に、メチル化された塩基の種類や位置においてＤＮＡを切断できなくなるメチル化感受性制限酵素であり、例としてＨｐａＩＩ、ＡｖａＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＡｐａＩ、ＣｓｐＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＮｌｕＩ、ＮａｒＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ等が挙げられる。より好ましくは、本発明のメチル化感受性制限酵素はメチル化シトシンの影響を受けるＨｐａＩＩ、ＡｖａＩＩ、又はＳａｕ３ＡＩであり、最も好ましくはＨｐａＩＩである。
また、本発明における第一の制限酵素は、ＤＮＡの認識配列中の塩基がメチル化されているかメチル化されていないかに関わらずＤＮＡを切断する、非メチル化感受性制限酵素であってもよく、例として、ＭｓｐＩ、ＳｉｎＩ、ＭｂｏＩ、ＮｄｅＩＩ、ＸｍａＩ、ＰａｃＩ、ＳｍａＩ、Ｓｓｅ８３８７１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
第一の制限酵素の作用条件は、用いる制限酵素に応じて、溶液中での制限酵素によるＤＮＡの切断条件に準じて適宜設定することができる。例えばＨｐａＩＩを用いた場合、当該酵素を１〜１００ユニット／ｍｌ含み、１〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５〜５．０ｍＭ ＤＴＴを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を工程（ｉｉ）の固定試料上に滴下し、２０〜４０℃で１〜６０分インキュベートする条件が例示される。
【００１８】
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程
本発明における標識された核酸分子とは、放射性又は非放射性物質で標識された核酸分子をいう。標識は特に限定されないが、例えば、放射性物質としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性同位体（ＲＩ）が挙げられる。非放射性物質としては、酵素、ハプテン及びフルオロフォア等が挙げられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ等が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ及びチミン二量体等が挙げられる。また、フルオロフォアとしては、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＡＭＣＡＴＭ、ＢＯＤＩＰＹＴＭ、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＴＭ、Ｃｙ２ＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、Ｃｙ５ＴＭ、Ｃｙ７ＴＭ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ、ＮＢＤＴＭ、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６ＧＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ、Ｒｈｏｄｏｌ ＧｒｅｅｎＴＭ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＶＩＣＴＭ等が挙げられる。特に非放射性物質は汚染や被爆の危険性がないため取り扱いが容易であり、後述する二重染色やマージ像を得る目的のためには好ましく用いられる。
【００１９】
標識された核酸分子の塩基長は、特に制限されず、例えば１〜５０塩基のポリヌクレオチド、好ましくは１〜２０塩基のポリヌクレオチド、より好ましくは１〜５塩基のオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、４塩基、３塩基、２塩基のオリゴヌクレオチド、最も好ましくは１塩基のヌクレオチドである。
【００２０】
標識された核酸分子は、酵素を用いた内部標識法によってＰＣＲ又は自動合成の際に標識化合物を核酸分子に取り込ませて作製してもよいし、酵素を用いた末端標識法によって、標識ヌクレオチドを核酸分子に付加して作製してもよい。あるいは、市販のＲＩ標識（オリゴ）ヌクレオチド、酵素標識ヌクレオチド、ハプテン標識ヌクレオチド、又は蛍光標識ヌクレオチド等を用いても良い。さらに、核酸分子と標識との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることによって、酵素が間接的に結合して標識された核酸分子を作製することもできる。
【００２１】
標識された核酸分子による第一の制限酵素切断部位の標識は、前記工程（ｉｉ）において、ジデオキシヌクレオチドの代わりに標識された核酸分子を用いること以外は、工程（ｉｉ）と同様に行うことができる。
【００２２】
（ｖ）標識部位を検出する工程
標識部位の検出とは、標識の特性又は活性を利用して、その存在箇所を視覚化することを意味し、用いた標識に応じて、自体公知の方法によって行われる。例えば、放射性物質の場合はオートラジオグラフィーにより、酵素の場合は酵素−基質反応による発色の検出により、ハプテンの場合はハプテンに結合する物質（抗体等）とかかる結合物質を認識する蛍光標識抗体とを用いた免疫反応の蛍光検出により、フルオロフォアの場合は特定の波長で励起させて特定の波長の蛍光を検出することにより行うことができる。なお、ハプテンを認識するための蛍光標識抗体に使用する蛍光物質は、前記フルオロフォアで例示したものを用いることができる。
【００２３】
検出手段としては、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、などが挙げられる。検出したシグナルをデジタル画像処理して三次元的に検出することも可能である。
【００２４】
検出方法（Ｉ）により、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化部位又は非メチル化部位が容易に可視化され、検出することができる。メチル化感受性制限酵素を用いることにより非メチル化部位が検出され、メチル化非感受性制限酵素を用いることにより非メチル化部位とメチル化部位とが同時に検出される。メチル化部位を特異的に検出するためには、後述する同時検出方法または検出された像を重ね合わせる方法を用いる。
【００２５】
本発明はまた、以下の工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化部位又は非メチル化部位の検出方法（ＩＩ）を提供する：
（ｉ）’組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）’前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）’工程（ｉｉ）’の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程、
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程。
【００２６】
検出方法（ＩＩ）において、組織又は細胞の固定試料、固定試料の前処理、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液、標識された核酸分子及びその検出については、上記検出方法（Ｉ）に関して記載したとおりである。よって、工程（ｉ）’〜工程（ｉｉｉ）’は、それぞれ検出方法（Ｉ）の工程（ｉ）〜工程（ｉｉｉ）と同様に行うことができる。なお、工程（ｉｉｉ）’における第一の制限酵素については、検出方法（Ｉ）において上述したもののうち、メチル化感受性制限酵素を用いることが望ましい。工程（ｉｖ）’は、工程（ｉｉ）又は工程（ｉｉ）’に準じて同様に行うことができる。
【００２７】
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程
本発明における第二の制限酵素は、特に制限されないが、好ましくは、第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素である場合、その認識する塩基配列と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素（即ち、第一及び第二の制限酵素はイソ制限酵素である）である。第一のメチル化感受性制限酵素と第二のメチル化非感受性制限酵素との好ましい組合せとしては、例えば、ＨｐａＩＩとＭｓｐＩ、ＡｖａＩＩとＳｉｎＩ、又はＳａｕ３ＡＩとＭｂｏＩ若しくはＮｄｅＩＩ等が挙げられる。ＣｐＧ部位でのシトシンのメチル化の有無を検出するためには、第一及び第二の制限酵素の組合せは、ＨｐａＩＩとＭｓｐＩが好ましい。第一のメチル化感受性制限酵素により非メチル化部位を切断し、当該切断部位をブロックした後に、第二のメチル化非感受性制限酵素を作用させることにより、特定の塩基配列中のメチル化部位が特異的に切断される。原核生物及び真核生物のメチル化塩基に対する感受性制限酵素及び非感受性制限酵素については、例えば、McClelland, M. et al., Nucleic Acids Res. 22:3640-3659, 1994に詳しく記載されている。
【００２８】
第二の制限酵素の作用条件は、用いる制限酵素に応じて、溶液中での制限酵素によるＤＮＡの切断条件に準じて適宜設定することができる。例えばＭｓｐＩを用いた場合、当該酵素を１〜１００ユニット／ｍｌ含み、１〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５〜５．０ｍＭ ＤＴＴを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を工程（ｉｖ）’の固定試料上に滴下し、２０〜４０℃で１〜６０分インキュベートする条件が例示される。
【００２９】
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程
本工程において、前記工程（ｉｖ）と同様の操作が行われる。第一の制限酵素としてメチル化感受性制限酵素を用い、第二の制限酵素として第一の制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素を用いた場合、特定の塩基配列中のメチル化部位が特異的に標識される。
【００３０】
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程
本工程は、前記工程（ｖ）と同様の操作で行うことができる。工程（ｖｉ）’で標識された部位を本工程で検出することにより、第一の制限酵素としてメチル化感受性制限酵素を用い、第二の制限酵素として第一の制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素を用いた場合、特定の塩基配列中のメチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで特異的に検出することができる。
【００３１】
本発明の検出方法（ＩＩ）は、工程（ｉｉｉ）’と工程（ｉｖ）’との間に、工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程（ｉｉｉ）’’を含んでいても良い。ここで、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びそれを含有する溶液は、上述のとおりであり、工程（ｉｉｉ）’’は、前記工程（ｉｖ）と同様に行われる。
【００３２】
工程（ｉｉｉ）’’において、標識された核酸分子としては、上述した標識された核酸分子のいずれかを用いればよいが、本工程で用いる標識された核酸分子と、後の工程（ｖｉ）’において、第二の制限酵素切断部位を標識するために用いる標識された核酸分子とは、異なる標識を保有している必要がある。異なる標識の組み合わせは、上述の放射性物質、酵素、ハプテン、フルオロフォアのいずれかから選択されることが好ましい。
【００３３】
本発明の検出方法（ＩＩ）が工程（ｉｉｉ）’’を含む場合、続く工程（ｉｖ）’は、工程（ｉｉｉ）’’の固定試料に対して行われる。工程（ｉｉｉ）’’をさらに含む本発明の検出方法（ＩＩ）は、第一の制限酵素としてメチル化感受性制限酵素を用いて切断部位を検出することにより、特定の塩基配列中の非メチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで特異的に検出することができ、次いで、第二の制限酵素として第一の制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素を用いた場合、該特定の同じ塩基配列中のメチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで特異的に検出することができる。かかる検出方法は、同一の固定試料に対して連続的に行うことができ、いわゆる二重染色標本を提供することができる。
【００３４】
本発明の検出方法（Ｉ）及び（ＩＩ）において、それぞれの工程（ｉ）と（ｉｉ）との間又は工程（ｉ）’と（ｉｉ）’との間に、前処理した固定試料と、標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程（ａ）をさらに含んでいてもよい。
【００３５】
工程（ａ）の例としては
（ａ−１）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程、及び
（ａ−２）前処理した固定試料と、標識された核酸プローブを含有する溶液とを接触させ、固定試料中のＤＮＡと該核酸プローブとの二本鎖を形成させる条件下で接触が行われる工程
が挙げられる。
【００３６】
工程（ａ−１）は、上述した検出方法（Ｉ）の工程（ｉｖ）に準じて行うことができ、前記工程（ｖ）と同様に、標識部位を検出することができる。工程（ａ−１）により、固定試料中のＤＮＡの３’末端を標識し、所望により標識部位を検出することができる。
【００３７】
工程（ａ−１）を含む方法としては、例えば、アポトーシス細胞等で見られるＤＮＡの断片化を検出するためのＴＵＮＥＬ染色が公知である。ＴＵＮＥＬ染色は、Gavrieli et al., J Cell Biol 119: 493-501 (1992)、Koji et al., Biol Reprod 64: 946-954 (2001)、及びAn et al., Histochem Cell Biol 123: 249-261 (2005)等に記載の方法にしたがって行われ得、下記の実施例において、一例を開示する。よって、工程（ａ−１）を含む本発明の検出方法（Ｉ）又は（ＩＩ）は、細胞のアポトーシスと特定の塩基配列中のＤＮＡのメチル化または非メチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで同時に検出することができる。
【００３８】
工程（ａ−２）において、標識された核酸プローブは、前処理した固定試料中のＤＮＡと二本鎖を形成する核酸である。固定試料中のＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。核酸プローブと固定試料中のＤＮＡとは、互いに相補的な塩基配列間でハイブリダイズし、試料中のＤＮＡと核酸プローブとの二本鎖が形成される。本工程において、かかる二本鎖が形成される条件下で接触が行われる。
【００３９】
標識された核酸プローブは、標的となる固定試料中のＤＮＡ配列と二本鎖を形成し得る塩基配列を含む核酸プローブであれば、特に制限されない。プローブの標識は、前記核酸分子の標識で記載した標識の中から目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
本発明核酸プローブの塩基長は、対象となる標的ＤＮＡ配列と特異的に二本鎖を形成し得る限り特に制限されず、例えば１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上が挙げられる。合成の容易さなどを考慮すれば、核酸プローブ長は２００塩基以下であることが好ましく、１００塩基以下であることがより好ましい。プローブの合成は、例えば、標的とするメチル化部位を含む特定の塩基配列を選択し、その相補配列を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによって行うことができる。相補配列の同一性は、目的とするＤＮＡ配列に対して完全相補的（１００％）であってもよく、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい。
【００４１】
工程（ａ−２）の溶液は、核酸プローブと固定試料中のＤＮＡとが二本鎖を形成する組成であれば特に制限されないが、溶液の組成の例として、例えば以下が挙げられる：
１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４） ２．５０μｌ
５Ｍ ＮａＣｌ ３０．００μｌ
０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４） １．２５μｌ
脱イオン化ホルムアミド １００．００μｌ
１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液 ２．５０μｌ
酵母 ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） ６．２５μｌ
サケ精巣 ＤＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ） ６．２５μｌ
硫酸デキストラン（５０％） ５０．００μｌ
プローブ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４） ５１．２５μｌ
合計 ２５０．００μｌ
【００４２】
当該プローブを含む溶液と固定試料との接触及びハイブリダイズ後の洗浄条件は、当業者であれば、溶液の塩濃度、反応の温度（プローブの融解温度に基づき適宜設定する、例えば約２５℃〜約５０℃）、核酸プローブ濃度（０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２μｇ／ｍｌ）、核酸プローブの塩基長、ミスマッチの数、反応時間（約３０分〜約一日、好ましくは約１２０分〜約９００分）等を適宜変更することにより、容易に設定することができる。
【００４３】
工程（ａ−２）において、前記工程（ｖ）に準じて、所望により形成された二本鎖を検出することができる。
【００４４】
工程（ａ−２）を含む方法としては、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが公知である。よって、工程（ａ−２）を含む本発明の検出方法（Ｉ）又は（ＩＩ）は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと組み合わせることによって細胞の特定の塩基配列中のＤＮＡのメチル化または非メチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで同時に検出することができる。
【００４５】
本発明はまた、２個以上の隣接組織試料をそれぞれ工程（ｉ）〜工程（ｖ）に供し、工程（ｖ）で検出された２個以上の隣接組織固定試料間の標識部位像を重ね合わせる工程をさらに含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化又は非メチル化部位の検出方法（ＩＩＩ）を提供する。
【００４６】
検出方法（ＩＩＩ）で用いる隣接組織固定試料とは、組織試料から作製した連続切片の相互に隣接した組織切片の組み合わせをいう。隣接組織固定試料は、検出対象の試料としてほぼ同一の試料とみなすことができる。隣接組織試料として、特にミラー切片（切断面を鏡像のように合わせることができる２枚の連続切片の組合せをいう）が最も好ましい。
【００４７】
検出方法（ＩＩＩ）において、２個以上の隣接組織固定試料を用いることにより、第一の制限酵素を２種以上選択してＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位を検出することができる。得られたメチル化又は非メチル化像をそれぞれ解析したり、互いに重ね合わせることによって、メチル化又は非メチル化に関する様々な情報をｉｎ ｓｉｔｕで得ることができる。
【００４８】
本発明はまた、２個の隣接組織固定試料の一方を検出方法（Ｉ）の方法に供して検出された標識部位像と、他方の隣接組織固定試料におけるＴＵＮＥＬ染色像とを重ね合わせて視覚化する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのアポトーシスとＤＮＡメチル化との関連性の検出方法（ＩＶ）を提供する。これにより、得られたＴＵＮＥＬ染色像とメチル化又は非メチル化像とを別々に解析したり、互いに重ね合わせることによって、アポトーシスとＤＮＡメチル化に関する様々な情報をｉｎ ｓｉｔｕで得ることができる。
【００４９】
また、本発明は、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、第一の制限酵素、第一の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子、第二の制限酵素、第二の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子を別々の容器に含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出キットを提供する。当該キットにおいて、第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せが好ましい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００５１】
化学薬品及び生化学薬品：
パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）は、メルク（Darmstadt、ドイツ）から購入し、３，３’−ジアミノベンジジン・４ＨＣｌ（ＤＡＢ）は、株式会社同仁化学研究所（熊本、日本）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（本質的に脂肪酸及びグロブリンを含まない）及びトリス（Ｔｒｉｚｍａ）塩基及びＢｒｉｊ−３５は、シグマ化学株式会社（St. Louis、MO、アメリカ）の物を入手した。ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、ロシュ・ダイアグノスティックス（Mannheim、ドイツ）の物を入手した。ジデオキシＡＴＰ（ｄｄＡＴＰ）及びジデオキシＴＴＰ（ｄｄＴＴＰ）は、ジェナ・バイオサイエンス（Jena、ドイツ）の物を入手した。ＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩは、タカラバイオ株式会社（滋賀、日本）から購入した。パーマウント（Permount）は、フィッシャー・サイエンティフィック株式会社（NJ、アメリカ）から購入した。本研究で用いた他の全ての試薬は、和光純薬（大阪、日本）の物であり、分析グレードであった。
【００５２】
抗体：
マウスモノクローナル抗５−メチルシトシン抗体（２．５μｇ／ｍｌ）は、カルバイオケム（San Diego、CA、アメリカ）から購入した。正常ヤギＩｇＧ及びヒツジＩｇＧは、ダコ（Glostrup、デンマーク）から購入した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）、ＨＲＰ標識ヤギ抗ビオチン抗体（１：１００）及びＨＲＰ標識ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（１：１００）は、ケミコン・インターナショナル株式会社（Temecula、CA、アメリカ）の物を入手した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ビオチン抗体（１：１００）は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Burlingame、CA、アメリカ）の物を入手し、ローダミン標識ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（１：１００）は、ロシュ・ダイアグノスティックス（Mannheim）の物を入手した。
【００５３】
動物及び組織標本:
本研究では、２７〜３８ｇの雄成体ＩＣＲマウス（８〜１０週齢）を用いた。一部のマウスには、コーン油に溶解したジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を、５日ごとに２０ｍｇ／ｋｇ体重にて、４回接種し、生殖細胞アポトーシスを誘導した（Koji T. et al., Biol Reprod 64: 946-954 (2001)）。ＤＥＳ又はビヒクル単独での２０日間の処置後、マウスを解剖した。実験プロトコルは、長崎大学の動物倫理審査委員会によって承認されたものである（＃０１１２１０００１２及び＃０２０２２０００４８）。
解剖して摘出した精巣を、細片に切り分け、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％のＰＦＡで一晩、４℃で固定し、標準的な様式でパラフィンに包埋した。いくつかの連続切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、生殖細胞の精上皮周期及び分化段階の同定に用いた。
【００５４】
５−メチルシトシンの免疫組織化学染色：
以前に詳述された方法（Matsuo Y. et al., Acta Histochem Cytochem 40: 69-75 (2007)）で、マウス精巣のパラフィン切片に対して５−メチルシトシンの免疫組織化学的検出を行った。脱パラフィンした後、切片を、１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に浸し、１２０℃で１５分間オートクレーブし、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１％ ＢＳＡに溶解した５００μｇ／ｍｌの正常ヤギＩｇＧと、１時間プレインキュベートした。他に特に規定がなければ、全ての反応を室温（ＲＴ）にて行った。次いで、切片を、ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ中の抗５−メチルシトシン抗体（２．５μｇ／ｍｌ）と一晩反応させた。ＰＢＳ中０．０７５％ Ｂｒｉｊで３回、各１５分間洗浄後、ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ中に溶解したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、１時間反応させた。ＰＢＳ中０．０７５％ Ｂｒｉｊで３回、各１５分間洗浄後、ＨＲＰの部位を、ニッケル及びコバルトイオンの存在下、ＤＡＢ及びＨ２Ｏ２で可視化した（Shukuwa K. et al., Histochem Cell Biol 126: 111-123 (2006)）。ネガティブコントロールとして、いくつかの切片を、特異的なモノクローナル抗体の代わりに、正常マウスＩｇＧと反応させた。
【００５５】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）染色：
アポトーシス生殖細胞を同定するために、Gavrieli Y. et al., J Cell Biol 119: 493-501（1992）の方法に従って、わずかな改変を加えて（Koji T. et al., Biol Reprod 64: 946-954 (2001); An S. et al., Histochem Cell Biol 123: 249-261 (2005)）、ＴＵＮＥＬを行った。シランコートしたスライドガラス上のパラフィン切片（厚さ５〜６μｍ）を脱パラフィンし、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで、３７℃にて、１５分間消化した。次いで、切片をＴｄＴ緩衝液（０．２Ｍ カコジル酸カリウム及び０．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する８２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．６）単独で、ＲＴにて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを、０．５μＭ ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、２０μＭ ｄＡＴＰ、１．５ｍＭ ＣｏＣｌ２及び０．１ｍＭ ジチオスレイトールを添加したＴｄＴ緩衝液中に溶解した８００ユニット／ｍｌのＴｄＴと、３７℃で９０分間反応させた。ネガティブコントロールとして、ＴｄＴ反応を、ビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりに０．５μＭ ＴＴＰで行い、あるいはＴｄＴを含めずに行った。ミリＱ水（Millipore、Molsheim、フランス）（DDW）で洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ビオチン抗体又はＦＩＴＣ標識ヤギ抗ビオチン抗体で、免疫組織化学的にシグナルを検出した。ＨＲＰの部位を、上述のように、ＤＡＢ、過酸化水素、ニッケル及びコバルトイオンの混合物によって可視化した。
【００５６】
ＨＥＬＭＥＴ：
まず、ＴｄＴ反応を、上述のようにして（ただしＤＮＡの遊離３’−ＯＨ末端をブロックするために、ｄＡＴＰ及びビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりに２０μＭ ｄｄＡＴＰ及び２０μＭ ｄｄＴＴＰを用いた）マウス精巣のパラフィン切片上に対して、３７℃にて２時間行った。ＤＤＷ及びＰＢＳで連続して洗浄後、切片を、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡで５分間固定し、次いで、ＰＢＳで２回、ＤＤＷで１回、各５分間ずつ洗浄した。次いで、切片を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ジチオスレイトールを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中、に溶解した１００ユニット／ｍｌのＨｐａＩＩと、３７℃で２時間反応させた。次いで、スライドをＤＤＷで３回、各５分間ずつ洗浄した。ＤＮＡの非メチル化ＣＣＧＧ配列の部位を検出するために、ＴＵＮＥＬのＴｄＴ反応と類似したＴｄＴ反応を、０．５μＭ ビオチン−１６−ｄＵＴＰ又は０．５μＭ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで、３７℃にて、１．５時間、湿室中で行い、ついでＰＢＳで３回、各５分間ずつ洗浄した。シグナルを可視化するために、酵素免疫組織化学染色の場合、スライドをＰＢＳ中５００μｇ／ｍｌの正常ヤギＩｇＧ又は正常ヒツジＩｇＧと５％ ＢＳＡとの混合物とともに１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中５％ ＢＳＡに溶解したＨＲＰ−ヤギ抗ビオチン抗体又はＨＲＰ−ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体と、それぞれ１時間反応させた。ＰＢＳ中０．０７５％ Ｂｒｉｊで３回、次いでＰＢＳ単独で、各１０分間ずつ洗浄後、シグナルを、上述のように、ＤＡＢ、Ｈ２Ｏ２、ニッケル及びコバルトイオンからなる色素原溶液で可視化した。スライドを、段階的濃度のエタノール溶液を通して脱水し、キシレンで透徹し、次いでパーマウントでマウントした。蛍光免疫組織化学染色の場合、ＰＢＳ中５％ ＢＳＡに溶解したＦＩＴＣ−ヤギ抗ビオチン抗体又はローダミン−ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体を、１時間反応させ、同様に洗浄した。スライドを、ＰＢＳ中９０％（ｖ／ｖ）グリセロールでマウントした。
ＤＮＡのメチル化ＣＣＧＧ配列の部位を検出するために、切片を、ＨｐａＩＩで消化し、次いで、上述のように、ＴｄＴによってジデオキシヌクレオチドの混合物でブロックした。次に、それらをＰＢＳ中４％ ＰＦＡで５分間固定し、ＰＢＳで２回、各１５分ずつ洗浄した。ＤＤＷで洗浄後、切片を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ジチオスレイトール、６６ｍＭ 酢酸カリウム及び０．１％ ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解した１００ユニット／ｍｌのＭｓｐＩで、３７℃にて２時間消化した。ＤＤＷで３回、各５分間ずつ洗浄後、０．５μＭ ビオチン−１６−ｄＵＴＰ又は０．５μＭ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで、３７℃にて２時間、湿室中でＴｄＴ反応を行い、次いで、ＰＢＳで３回、各５分間ずつ洗浄した。次に、非メチル化ＣＣＧＧ部位の検出に用いた手順と同じ手順で、メチル化ＣＣＧＧ部位を可視化した。
非メチル化部位及びメチル化部位の二重染色のために、ＨｐａＩＩ切断部位を、ＴｄＴ反応によってビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、ジデオキシヌクレオチドでブロックした。次に、メチル化部位を検出する手順で、ＭｓｐＩ切断部位を、ＴｄＴ反応によって、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識した。最後に、両方のハプテンを、それぞれＦＩＴＣ−抗ビオチン抗体及びローダミン−抗ジゴキシゲニン抗体によって可視化した。
蛍光シグナルの解析は、ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ（Ｖ３．２）（Carl Zeiss Co.、Jena、ドイツ）で行った。本研究では、ＦＩＴＣ及びローダミンシグナルは、それぞれ５０５〜５３０ｎｍ（励起、４８８ｎｍ）の発光フィルター及び５６０〜ｎｍフィルター（励起、５４３ｎｍ）で得た。観察は、Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ ２０×／０．５及び４０×／０．７５の対物レンズで行い、それぞれの光学的切片の厚みは、０．５μｍ及び０．７μｍであった。
【００５７】
ＨＥＬＭＥＴのコントロール実験：
シグナルの特異性を確認するために、発明者らはいくつかのコントロール実験を行った。ＨｐａＩＩ消化の前後におけるジデオキシヌクレオチドでの３’−ＯＨ末端のブロッキングが必須であり、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ又はジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでのＴｄＴ反応によって評価した。エンドヌクレアーゼ活性の切断部位に対する依存性を検討するために、いくつかのスライドを、１０分間煮沸して冷却した酵素溶液と反応させた。ＴｄＴ反応のコントロールとして、いくつかのスライドを、反応混合物中、ＴｄＴの不存在下で、又はビオチン−１６−ｄＵＴＰもしくはジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰと共に反応させた。酵素−免疫組織化学染色における内因性ペルオキシダーゼの活性もしくは蛍光−免疫組織化学染色における自己蛍光を評価するために、いくつかのスライドを、免疫組織化学的染色の工程においてＨＲＰ標識抗体又は蛍光色素標識抗体を省いて処理した。
【００５８】
ＴＵＮＥＬ及びＨＥＬＭＥＴのための二重染色：
ＴＵＮＥＬ陽性細胞を、ＣＣＧＧ配列のメチル化状態と直接関連付けるために、まずマウス精巣のパラフィン切片でＴＵＮＥＬを行った。ビオチン−１６−ｄＵＴＰとのＴｄＴ反応後、切片を、上記のようにジデオキシヌクレオチドでブロックし、ＰＢＳ中４% ＰＦＡで５分間固定した。次いで、切片をＰＢＳで２回（各１５分間）及びＤＤＷで１回（５分間）洗浄し、上記の手順において説明したように、ＨｐａＩＩ又はＭｓｐＩで消化した。ＣＣＧＧの非メチル化部位又はメチル化部位との共局在化のために、切断部位をＴｄＴによってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、最後に、ビオチン部分及びジゴキシゲニン部分の両方を、それぞれＦＩＴＣ−抗ビオチン抗体及びローダミン−抗ジゴキシゲニン抗体で、上に詳述したように可視化した。
【００５９】
（試験例１）
ＨＥＬＭＥＴにおける種々のパラメータの最適化
基本的に、本方法は、ＴＵＮＥＬにおいて用いられるＴｄＴ反応に依存する；制限酵素によってもたらされる切断部位の３’−ＯＨ末端を、ＴｄＴ反応によってハプテン性のｄＵＴＰアナログで標識し、次いで酵素免疫組織化学染色又は蛍光免疫組織化学染色によって可視化した。本プロトコルでは、以前に記述された（Koji T., Molecular Histochemical Techniques (Springer Lab Manuals),（2000）; Koji T., Biol Reprod 64: 946-954(2001)）ように最適化されたＴｄＴ反応の条件を用いた。発明者らは、制限酵素の条件（濃度及び持続時間）を、シグナル強度が最大となるように設定した。ＤＮＡの非特異的な切断の検出又はＤＮＡの３’−ＯＨ末端の不要な伸長を防ぐために、ＴｄＴ反応のための、ジデオキシヌクレオチドでの３’−ＯＨ末端のブロッキングが必須であった。種々の濃度（５〜２０μＭ）のｄｄＵＴＰ、ｄｄＴＴＰ及びｄｄＡＴＰを、単独で又は組合せて用い、ブロッキング効果を比較したところ、２０μＭ ｄｄＴＴＰ及び２０μＭ ｄｄＡＴＰの混合物で、さらなるＴｄＴ反応に対する完全なブロックが達成された（データ示さず）。さらに、ＰＢＳ中４％ ＰＦＡでの繰り返しの固定もまた、好ましくない染色を減少させるのに効果的であり、それはおそらく、組織切片においてもともとマスキングされていたＤＮＡの、アンマスキングが減少したためである（データ示さず）。
【００６０】
（試験例２）
マウス精巣における非メチル化ＣＣＧＧ配列及びメチル化ＣＣＧＧ配列の両方の同時局在
精原細胞の異なる分化段階間の、ＤＮＡの非メチル化ＣＣＧＧ配列対メチル化ＣＣＧＧ配列の比における差異を評価するために、発明者らは、ＨＥＬＭＥＴにより、両方のＣＣＧＧ配列の同時染色を行った。図１Ａ及び１Ｄにおいて示すように、ＨｐａＩＩ陽性の非メチル化ＣＣＧＧは、主にいくつかの大型細胞の核（矢印）及びステップ１０〜１１よりも後の段階における伸長精細胞（矢じり）に局在し、精原細胞の核ではより低強度であった。一方で、ＭｓｐＩ陽性のメチル化ＣＣＧＧの染色は全体としてより強く、ほとんどの生殖細胞が陽性であった（図１Ｂ及び１Ｅ）。しかし、いくつかの大型細胞は、わずかにしか又は全く染色されなかった。マージ像（図１Ｃ及び１Ｆ）において、大型細胞が黄色又は緑であることが明らかであり、非メチル化ＣＣＧＧが等しく又は優勢に存在していたこと示す。Ｈ＆Ｅ染色スライドに基づき、それらの大型細胞は、アポトーシスを経ていたと考えられる。したがって、発明者らは、細胞をＴＵＮＥＬ及びＨＥＬＭＥＴで、二重染色することにした。
さらに、発明者らは、種々のコントロール実験を行った；図１Ｇ及び１Ｈで示すように、ＨｐａＩＩ消化前後では、ＤＮＡの３’−ＯＨ末端は、ジデオキシヌクレオチドで完全にブロックされていた。不活化エンドヌクレアーゼとのインキュベーションは、いかなるシグナルも呈さなかった（図１Ｉ及び１Ｊ）。さらに、ＨｐａＩＩ消化後にビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行った場合（図１Ｋ）、又はＭｓｐＩ消化後にジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行った場合（図１Ｌ）、いかなるシグナルも検出されなかった。蛍光色素標識抗体を除いても、シグナルは生成されなかった（データ示さず）。
【００６１】
（試験例３）
マウス精巣の隣接切片のＤＮＡの非メチル化及びメチル化ＣＣＧＧ部位の分染
マウス精巣の隣接切片を用い、発明者らは、ＴＵＮＥＬ、非メチル化ＣＣＧＧ部位、及びメチル化ＣＣＧＧ部位の酵素免疫組織化学染色を比較した。図２Ｂに示すように、発明者らは、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性細胞がアポトーシス細胞であることを見出した。プロテイナーゼ消化後に切片をジデオキシヌクレオチドで標識した場合、ＴＵＮＥＬにおけるさらなるＴｄＴ反応は、いかなる染色も示さなかった（図２Ｃ）。次に、ジデオキシヌクレオチドでブロックした切片を、ＨｐａＩＩで消化し、非メチル化ＣＣＧＧ部位を、ＴｄＴによってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ジゴキシゲニン抗体で可視化した（図２Ｄ）。生殖細胞の過半数は、非常に弱くしか染色されなかったものの、ＴＵＮＥＬ陽性細胞と同定された、強く染色されたいくつかの細胞もまた見られた。他の切片を、ＨｐａＩＩで消化し、ジデオキシヌクレオチドでブロックし、次いで、ＭｓｐＩで消化し、ＴｄＴによってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ジゴキシゲニン抗体で可視化した（図２Ｆ）。生殖細胞の過半数は、多かれ少なかれ陽性であったものの、染色の強度は生殖細胞間で異なり、いくつかの精原細胞、細胞分裂中の精母細胞及び精子細胞（円形及び伸長）は、強く染色されていた。セルトリ細胞の核は、核小体以外は、ごくわずかにしか染色されていなかった。興味深いことに、非メチル化ＣＣＧＧ部位の染色と異なり、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性細胞のメチル化ＣＣＧＧ部位の染色は、非常に弱かった。ＭｓｐＩ消化を行わなかったコントロール切片では、染色は見られず（図２Ｅ）、ＨｐａＩＩ消化後のジデオキシヌクレオチドでのブロッキングが完璧であったことを示している。さらに、ビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴＵＮＥＬを行った場合、又はＴｄＴなしでＴＵＮＥＬを行った場合、いかなる染色も検出されなかった（データ示さず）。
ＴＵＮＥＬ陽性細胞におけるＣＣＧＧ部位のメチル化状態を直接的に明らかにするために、ＴＵＮＥＬとＨｐａＩＩ切断部位又はＭｓｐＩ切断部位との二重染色を行った。図３に示すように、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、常にＨｐａＩＩ切断部位（非メチル化ＣＣＧＧ）に関して陽性であったが（図３Ｃ）、ＭｓｐＩ切断部位（メチル化ＣＣＧＧ）に関しては、常には陽性ではなかった（図３Ｆ）。
【００６２】
（試験例４）
マウス精巣における５−メチルシトシンの免疫組織化学的検出
ＨＥＬＭＥＴによって検出されたメチル化ＣＣＧＧの局在パターンと５−メチルシトシンの局在パターンとの比較のために、発明者らは、抗５−メチルシトシンモノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学染色を行った。図４Ａに示すように、ほとんどの生殖細胞の核は、強く染色され、種々の分化段階における生殖細胞間での染色強度の顕著な差異はなかった。さらに、ＤＥＳ処理精巣切片における５−メチルシトシンの免疫組織化学染色は、ほとんどの生殖細胞で重度の核染色を示した（図４Ｂ）が、ＴＵＮＥＬ陽性細胞とＴＵＮＥＬ陰性細胞との間には差はなかった（図４Ｃ）。
【００６３】
（考察）
本研究において発明者らは、組織切片における非メチル化及びメチル化ＣＣＧＧ配列を識別するように設計された、新たな組織化学的な方法、ＨＥＬＭＥＴ、を説明した。新たな方法ＨＥＬＭＥＴを、マウス精巣のパラフィン包埋切片の解析に適用し、その結果は、５−メチルシトシンの免疫組織化学染色の結果とは異なり、生殖細胞の分化段階に依存するＣＣＧＧ部位のメチル化レベルの差異を明らかにした。結果はさらに、ほとんどがアポトーシスを経ていたＴＵＮＥＬ陽性生殖細胞において、ＣＣＧＧ部位が、正常な生殖細胞と比べて、多かれ少なかれ脱メチル化されていたことを示した。これは、生殖細胞のアポトーシス誘導において、エピジェネティック制御障害が関与している可能性に関する、初めての直接的な証拠である。
ＣＣＧＧ部位の脱メチル化は、ステップ１０〜１１よりも後の段階での伸長精細胞でも見られたものの、ＣＣＧＧ部位の最も顕著な脱メチル化は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞において見られた。クロマチンは、伸長精細胞及びアポトーシス細胞の両方において、高度に凝縮されているため、ＣＣＧＧ部位のメチル化は、ヘテロクロマチン形成と密接に関連しているわけではないかもしれない。むしろ、より重要なのは、ＣＣＧＧ部位のメチル化のダウンレギュレーションが、減数分裂前の生殖細胞における生殖細胞のアポトーシス誘導の引き金であり得ることである。発明者らの発見と一致して、マウス精巣においてＤＮＡメチル化の減少又は喪失を誘導する５−アザ−２’−デオキシシチジンでの処置（Kelly T. L. et al., J Androl 24: 822-830 (2003)）及びＤｎｍｔ３Ｌ遺伝子の変異（Hata K. et al., Mol Reprod Dev 73: 116-122(2006)）が、マウス精巣における組織的な異常及び生殖細胞の喪失をもたらすことは、既に知られている。
本結果はまた、生殖細胞のＣＣＧＧ部位におけるメチル化レベルは、セルトリ細胞のような体細胞よりも一般的に高いことを示した。これに関連して、ＣｐＧアイランドは、通常メチル化されておらず、またゲノムＤＮＡの他の部分では、メチル化レベルは、体細胞におけるＧＣ含量と反比例することに留意すべきである。しかし、生殖細胞におけるＤＮＡのメチル化レベルは、ＤＮＡセグメントのＧＣ含量に依存することが、近年の研究によって報告された（Oakes C. C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 228-233 (2007)）。したがって、ＨＥＬＭＥＴによる生殖細胞の一般的に強い染色は、この傾向を反映しているのかもしれない。さらに、脱メチル化を誘導する機構がまだ知られていないため、アポトーシス生殖細胞のＣＣＧＧ部位が、アポトーシス中に脱メチル化されることは、興味深い発見であった。発明者らの生殖細胞研究は、「デメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）」の存在に関する、重要な証拠を提供するかもしれない。
一般的に、ＤＮＡの高度メチル化は、ヘテロクロマチン形成と関連していると考えられている（Li E., Nat Rev Genet 3: 662-673 (2002)）。しかし、高度に凝縮されたクロマチンを有すると考えられている伸長精細胞の核において（Koji T., Hishikawa Y., Arch Histol Cytol 66: 1-16 (2003)）、予測していなかったＣＣＧＧ部位の低メチル化が見られた。ＣＣＧＧ部位のメチル化レベルが、ヘテロクロマチン領域と密接な関係を有するか否か、あるいはヘテロクロマチン領域とどのように密接に関係しているかを決定するためには、さらなる研究が必要である。この点を確認するためには、そのような研究は、ヘテロクロマチン領域のＣＣＧＧ部位のメチル化状態を決定するために、電子顕微鏡の使用を含むべきである。
ＣｐＧのメチル化は、哺乳動物のゲノムを通じて、３×１０７の部位で起こり、ＨＥＬＭＥＴによって解析したＣＣＧＧ部位は、メチル化されるＣｐＧの全体数のうち、最大で約５％を構成する（Kelly T. L. et al., J Androl 24: 822-830 (2003)）。したがって、５−メチルシトシンの免疫組織化学染色がアポトーシス生殖細胞と非アポトーシス生殖細胞との間のメチル化レベルの差異を同定できなかったものの、ＨＥＬＭＥＴがアポトーシス生殖細胞における低メチル化の検出を可能としたことは当然である。さらに重要なことには、イソ制限酵素であるＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩの使用は、ＤＮＡのより特異的な部位のメチル化に関する情報を提供できる。この方法を、異なる制限酵素の組合せの使用にまで広げ、又はこの方法を特定の遺伝子の部分がオリゴデオキシヌクレオチドプローブとｉｎ ｓｉｔｕでハイブリダイズする標本に適用すること（Koji T., Nakane P. K., J Electron Microsc 45: 119-127 (1996)）によって、個々の細胞の特定の遺伝子のメチル化状態を解析することが可能となるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の検出方法を駆使して、エピジュネティックスの基礎的な研究が進展することが期待される。これにより、エピジュネティックスとエピジュネティックな変化に基づく疾患との関連が解明され、本発明の検出方法は、エピジュネティックな変化に基づく疾患の発症、治療及び予後の診断にも役立つことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】マウス精巣のパラフィン包埋切片における、ＨＥＬＭＥＴによる非メチル化及びメチル化ＣＣＧＧ配列の同時局在を示す図である。パラフィン包埋切片は、ＴｄＴによってジデオキシヌクレオチド混合物でブロックし、次いでＨｐａＩＩ切断部位を、ビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識した。ジデオキシヌクレオチドでのブロック後、ＭｓｐＩ切断部位を、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、次いで、両ハプテンを、それぞれＦＩＴＣ−抗ビオチン抗体（Ａ、Ｄ）及びローダミン−抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂ、Ｅ）で可視化した。マージ像をＣ及びＦに示す。矢印：大型細胞、矢じり：伸長精細胞。（Ｇ）ブロッキング後のＴｄＴ反応。ジデオキシヌクレオチドでのブロッキング直後に、ビオチン−１６−ｄＵＴＰでのＴｄＴ反応を、いくつかのスライドに対して行った。いかなる染色も見られなかった。（Ｈ）ＨｐａＩＩ消化に次いでブロッキングした後のＨＥＬＭＥＴ。ＴｄＴ反応は、（Ｇ）と同様に行った。いかなる染色も見られなかった。さらなるコントロールとして、煮沸した（不活化した）ＨｐａＩＩ（Ｉ）又はＭｓｐＩ（Ｊ）を、ジデオキシヌクレオチドでのブロッキング後にスライドと反応させ、次いでビオチン−１６−ｄＵＴＰ又はジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰそれぞれとのＨＥＬＭＥＴを行った。蛍光−免疫組織化学染色のコントロールとしては、ＨＥＬＭＥＴにおいて、ＨｐａＩＩ消化後に、ビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行い（Ｋ）、あるいはＭｓｐＩ消化後に、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行った（Ｌ）。いかなる蛍光も見られなかった。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ：バー＝１００μｍ、Ｄ、Ｅ、Ｆ：バー＝５０μｍ。
【図２】マウス精巣の隣接切片におけるＴＵＮＥＬ陽性生殖細胞のＣＣＧＧ部位のメチル化レベルを示す。パラフィン包埋マウス精巣の隣接切片の、（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色、及び（Ｂ）ＴＵＮＥＬ染色を示す。（Ｃ）ＴｄＴによるジデオキシヌクレオチドでの３’−ＯＨ末端のブロッキング。ブロッキング後、切片をＴｄＴによってビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、組込まれたビオチンを、ＨＲＰ−抗ビオチン抗体で検出した。いかなるシグナルも観察されなかった。（Ｄ）非メチル化ＣＣＧＧ部位の染色。（Ｃ）で記述したブロッキングの手順後、切片をＨｐａＩＩで消化し、ビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ビオチン抗体で酵素免疫組織化学染色によって可視化した。（Ｅ）ＴｄＴによるジデオキシヌクレオチドでの、ＨｐａＩＩ切断部位のブロッキング。切片を、ＨｐａＩＩで消化し、切断部位をジデオキシヌクレオチド混合物でブロッキングした。次いで、切片を、（Ｃ）で記述したのと同様の様式で処理した。（Ｆ）メチル化ＣＣＧＧ部位の染色。ジデオキシヌクレオチドでのＨｐａＩＩ切断部位のブロッキング後、切片をＭｓｐＩで消化し、切断部位をビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ビオチン抗体で可視化した。バー＝１００μｍ。
【図３】マウス精巣のパラフィン包埋切片におけるＴＵＮＥＬ及び非メチル化ＣＣＧＧ部位又はメチル化ＣＣＧＧ部位の二重染色を示す。（Ａ、Ｄ）タネル（ＴＵＮＥＬ）染色。（Ｂ）ＨｐａＩＩ切断部位の染色（非メチル化ＣＣＧＧ部位）。（Ｃ）Ａ及びＢのマージ像。（Ｅ）ＭｓｐＩ切断部位の染色（メチル化ＣＣＧＧ部位）。（Ｆ）Ｄ及びＥのマージ像。バー＝１００μｍ。矢印（Ａ、Ｂ及びＣ）並びに矢じり（Ｄ、Ｅ及びＦ）は、同一の細胞を示す。
【図４】ＤＥＳ処理マウス精巣のパラフィン包埋切片における、５−メチルシトシンの免疫組織化学的検出を示す。（Ａ）コーン油処理又は（Ｂ）ＤＥＳ処理したマウス精巣のパラフィン包埋切片を、抗５−メチルシトシン抗体と反応させ、シグナルを、酵素免疫組織化学染色によって検出した。（Ｂ）で用いた切片のミラー切片を、ＴＵＮＥＬで用いた（Ｃ）。矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す。バー＝１００μｍ。
【背景技術】
【０００１】
細胞分化のエピジェネティック制御をより良く理解するためには、特定の部位におけるＤＮＡのメチル化を解析することが重要である。ＤＮＡのメチル化は、哺乳動物において、正常な精子形成の維持に関与する。メチル化のマークは、始原生殖細胞では消失し、性決定後、性特異的な様式で生殖ＤＮＡは再メチル化される（非特許文献１〜３）。ＤＮＡのメチル化は、哺乳動物において、ＣｐＧ配列のシトシン残基で起こる。しかしながら、ＣｐＧアイランドは、一般的に、メチル化されていない。残りのゲノムは、高度にメチル化されており、非−ＣｐＧ−アイランドＤＮＡのメチル化状態は、体細胞組織におけるＧＣ含量の局在レベルと負に相関する。その一方で、精巣では、低ＧＣ含量領域は、特異的に低メチル化されている（非特許文献４）。
【０００２】
哺乳動物の精子形成は、精祖細胞の増殖、精母細胞の減数分裂、及び精子完成からなる、秩序立った工程である（非特許文献５）。他方で、精子形成はまた、生殖細胞の段階的な分化において、ユークロマチンを、完全に凝縮されたヘテロクロマチンへと凝縮する役割を果たす工程であるとも考えられる（非特許文献６）。精子形成の間、生殖細胞の死滅は非常に一般的であり、実際に、予測される精子収量の２５〜７５％が失われていると考えられている（非特許文献７〜９）。ラット及びマウスでは、生殖細胞の死滅の態様は、ほとんどアポトーシス性の性質を有し（非特許文献１０、１１）、ミトコンドリアの死のシグナルが、正常な精子形成における自発的細胞死の誘導に関与する（非特許文献６）。
【０００３】
いくつかの証拠によって、ＤＮＡのメチル化の状態が、精子形成において重要な役割を果たすことが示唆されている。非特許文献１２は、ＤＮＡのメチル化レベルを減少させることが知られているシチジンアナログの５−アザ−２’−デオキシシチジンの使用が、精巣において組織学的異常をもたらすことを報告した。さらに、精巣においてＤＮＡの低メチル化を示す、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ様タンパク質（Ｄｎｍｔ３Ｌ）ホモ接合性の変異体マウスは、不妊であり（非特許文献１３、１４）、減数分裂異常となってアポトーシス様生殖細胞が出現する（非特許文献１５、１６）。
ＤＮＡのメチル化が、クロマチン凝縮と密接に関連していることを考慮し、本発明者らは、ＤＮＡのメチル化のどのような異常でも、おそらく不十分なヘテロクロマチン化に起因するアポトーシスの誘導をもたらすであろうと仮定した。ＤＮＡのメチル化の状態を、アポトーシス生殖細胞と関連付けるためには、組織化学的なアプローチが適当である。実際、５−メチルシトシンに対する抗体が入手可能であり、個々の細胞におけるＤＮＡのメチル化状態を免疫組織化学的に解析可能である。しかしながら、解析可能なメチル化部位（ＣｐＧ）の数が多過ぎて、免疫組織化学染色のデータをＤＮＡの特定の配列と関連付けることができない。また、これまでの研究によって、適切な制限エンドヌクレアーゼの組合せを用いた、細胞及び組織から抽出された単離ＤＮＡのメチル化が記述されているが、組織細胞レベルに対する適用は報告されていない。
【非特許文献１】Reik W. et al., Science 293: 1089-1093 (2001)
【非特許文献２】Yamazaki Y. et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 12207-12212 (2003)
【非特許文献３】Li J. Y. et al., Genomics 84: 952-960 (2004)
【非特許文献４】Oakes C. C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 228-233 (2007)
【非特許文献５】Bellve A. R. et al., Histochem Cytochem 25: 480-494(1977)
【非特許文献６】Koji T., Hishikawa Y., Arch Histol Cytol 66: 1-16(2003)
【非特許文献７】Oakberg E. F., Am J Anat 99: 391-413 (1956)
【非特許文献８】Huckins C., Anat Rec 190: 905-926 (1978)
【非特許文献９】Johnson L. et al., Biol Reprod 29: 207-215 (1983)
【非特許文献１０】Allan D. J. et al., Cell Prolif 25: 241-250 (1992)
【非特許文献１１】Wang R. A. et al., Biol Reprod 58: 1250-1256 (1998)
【非特許文献１２】Kelly T. L. et al., J Androl 24: 822-830 （2003）
【非特許文献１３】Bourc’his D. et al., Science 294:2536-2539 (2001)
【非特許文献１４】Hata K. et al., Development 129: 1983-1993(2002)
【非特許文献１５】Bourc’his D., Bestor T. H., Nature 431: 96-99 (2004)
【非特許文献１６】Hata K. et al., Mol Reprod Dev 73: 116-122(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、組織及び細胞の固定試料において、特定の配列を持つＤＮＡのメチル化部位を検出するように設計された、ＤＮＡのメチル化部位の新規検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、マウス精巣の組織学的切片を、メチル化感受性（ＨｐａＩＩ）及びメチル化非感受性（ＭｓｐＩ）のイソ制限酵素のセットを用いて処理し、次いで切断部位を標識し、標識部位を検出することによって、ＣＣＧＧ配列のような特定部位でのＤＮＡのメチル化レベルを評価できることを見出した。発明者らは、組織切片における特定の配列を持つＤＮＡのメチル化部位を検出するように設計されたこの新たな方法を、ＤＮＡのメチル化部位の組織エンドヌクレアーゼ連関検出法（histo endonuclease-linked detection of methylation sites of DNA：ＨＥＬＭＥＴ）と命名した。
本発明者らは、ＨＥＬＭＥＴを用いたところ、ほとんどの生殖細胞において、ＣＣＧＧ部位の高度メチル化が見られたものの、非メチル化ＣＣＧＧは、伸長精細胞中に共局在化していることを発見し、ＨＥＬＭＥＴによって個々の細胞レベルにおける、ＤＮＡのメチル化を解析できることを見出した。さらに、ＨＥＬＭＥＴとアポトーシス細胞を検出するための方法として知られているＴＵＮＥＬ法を組み合わせることによって、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性の生殖細胞（哺乳動物の精子形成において、頻出する）は、顕著にＨｐａＩＩ反応性となり、ＣＣＧＧ部位がアポトーシスの間に脱メチル化され、かつＣＣＧＧ部位のメチル化レベルが、精原細胞の分化段階によって変動することを明らかにした。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである：
〔１〕 （ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖ）標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
〔２〕 （ｉ）’組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）’前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）’工程（ｉｉ）’の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程、
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
〔３〕 工程（ｉｉｉ）’と工程（ｉｖ）’との間に、
（ｉｉｉ）’’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程；
をさらに含み、工程（ｉｖ）’が工程（ｉｉｉ）’’の固定試料に対して行われる、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕 第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素又はメチル化非感受性制限酵素である、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕 メチル化感受性制限酵素がＨｐａＩＩである、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕 第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、前記〔２〕又は〔３〕に記載の方法。
〔７〕 メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素との組合せが、それぞれＨｐａＩＩとＭｓｐＩ、ＡｖａＩＩとＳｉｎＩ、又はＳａｕ３ＡＩとＭｂｏＩ若しくはＮｄｅＩＩのいずれかである、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕 標識が、酵素、ハプテン、フルオロフォア及び放射性物質からなる群より選択される、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕 ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩである、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕 工程（ｉ）と（ｉｉ）との間又は工程（ｉ）’と（ｉｉ）’との間に、
（ａ）前処理した固定試料と、標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程；
をさらに含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕 工程（ａ）が、前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕 ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕 工程（ａ）において、標識された核酸分子が標識された核酸プローブであり、固定試料中のＤＮＡと該核酸プローブとの二本鎖を形成させる条件下で接触が行われる、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕 ２個以上の隣接組織固定試料をそれぞれ工程（ｉ）〜工程（ｖ）に供し、工程（ｖ）で検出された２個以上の隣接組織固定試料間の標識部位像を重ね合わせる工程をさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔１５〕 ２個の隣接組織固定試料の一方を前記〔１〕に記載の方法に供して検出された標識部位像と、他方の隣接組織固定試料におけるＴＵＮＥＬ染色像とを重ね合わせて視覚化する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのアポトーシスとＤＮＡメチル化との関連性の検出方法。
〔１６〕 ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、第一の制限酵素、第一の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子、第二の制限酵素、第二の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子を別々の容器に含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出キット。
〔１７〕 第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、前記〔１６〕に記載のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、組織及び細胞試料の個々の細胞において、ＤＮＡのメチル化部位の局在を検出することが可能となる。また、本発明により、細胞の分化や増殖などの個々の細胞の状態と、ＤＮＡのメチル化又は非メチル化との関連付けが可能となる。これにより、癌の発症、治療、予後の病理のエピジェネティックな診断も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、以下の工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化部位又は非メチル化部位の検出方法（Ｉ）を提供する：
（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖ）標識部位を検出する工程。
【０００９】
本発明において「組織又は細胞の固定試料」とは、組織又は細胞集団を形成する個々の細胞の形態や構造内容物を観察可能に固体支持体上に固定した試料をいう。対象となる試料の由来は特に制限されず、いかなる生物由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）であり、より好ましくはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ等、特に好ましくはヒトである。組織試料の場合、試料はミクロトーム等で薄く切片化された組織切片を用いても、ホールマウントされた組織又は個体を用いても良いが、好ましくは、組織切片が用いられる。組織切片は、凍結組織を切片化し、パラフィンまたは樹脂で包埋された切片であってもよい。組織としては、例えば、脳、脊髄、眼球、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋などが挙げられる。細胞としては、前記組織から単離された細胞、及びそれら細胞から樹立した細胞株などが挙げられる。固体支持体上で培養した細胞又はサイトスピン等で固体支持体上に集めた細胞を乾燥させ、固定した後に細胞試料として用いられ得る。試料の固定には自体公知の方法を用いればよく、例えば、パラホルムアルデヒド液、グルタルアルデヒド液、四酸化オスミウム液、酢酸アルコール、メタノール、エタノールなどを用いる方法、凍結法、マイクロウェーブ乾燥法などが挙げられる。前記試料を固定する固体支持体は、固定操作及び以下に説明する前処理操作に耐えられるものであり、好ましくは顕微鏡観察に適するものであればよい。例えば、スライドガラスが挙げられる。
【００１０】
（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程
本発明において「固定試料を前処理する」とは、固定試料をタンパク質分解酵素処理することをいい、当該除タンパク質処理によって、その後に固定試料に作用させる酵素、ジデオキシヌクレオチド、及び核酸分子等の、固定試料内部への浸透性が高められる。また、当該処理によって、内因性ヌクレアーゼが不活性化されるため、本発明の標的物質であるＤＮＡの保存にも効果的である。前処理に用いられるタンパク質分解酵素は特に制限されないが、例えば、トリプシン、プロナーゼ、及びプロテイナーゼＫが挙げられ、特にプロテイナーゼＫが好ましい。
【００１１】
前処理の条件は、用いるタンパク質分解酵素に応じて適宜設定することができるが、例えばプロテイナーゼＫを用いた場合、当該酵素の濃度が１〜１００μｇ／ｍｌのリン酸緩衝液中、２０〜４０℃で１〜６０分が例示される。
【００１２】
固定試料がパラフィン包埋切片または樹脂包埋切片の場合、常法により脱パラフィンまたは脱樹脂を行った後に上記タンパク質分解酵素処理に供することができる。
【００１３】
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程
本発明の種々の検出方法に共通して用いられる、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素は、例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びＤＮＡリガーゼのいずれかを用いても良く、より好ましくはＴｄＴ又はＤＮＡポリメラーゼＩであり、最も好ましくはＴｄＴである。
【００１４】
本発明の種々の検出方法に共通して用いられるジデオキシヌクレオチドは、ＤＮＡの３’末端に付加され、当該ＤＮＡの伸長反応を停止させるものであれば特に制限されないが、例えばｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＵＴＰ、ｄｄＴＴＰもしくはｄｄＡＴＰが単独で又は組み合わせて用いられ、好ましくはｄｄＵＴＰ、ｄｄＴＴＰもしくはｄｄＡＴＰが単独で又は組み合わせて用いられる。
【００１５】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液の組成は、用いる酵素に応じて適宜設定することができるが、例えばＴｄＴを用いた場合、０．１〜０．５Ｍ カコジル酸塩、０．１〜１．０ｍＭ ＣｏＣｌ２及び０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）の緩衝液中、１００〜１０００ユニット／ｍｌ ＴｄＴ及び０．１〜１．０μＭ ジデオキシヌクレオチドが例示される。
接触時間は、２０〜４０℃で１０〜１２０分が例示されるが、これに限定されるものではない。また、接触の前に、酵素及びヌクレオチドを添加しない上記緩衝液のみで１〜数十分間プレインキュベーションしてもよい。
当該接触工程により、細胞内のＤＮＡの３’の遊離ＯＨ基がブロックされる。
【００１６】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程
本発明における第一の制限酵素は、特に制限されないが、好ましくは、ＤＮＡの認識配列中の塩基がメチル化されている場合に、メチル化された塩基の種類や位置においてＤＮＡを切断できなくなるメチル化感受性制限酵素であり、例としてＨｐａＩＩ、ＡｖａＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＡｐａＩ、ＣｓｐＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｈａＩ、ＮｌｕＩ、ＮａｒＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ等が挙げられる。より好ましくは、本発明のメチル化感受性制限酵素はメチル化シトシンの影響を受けるＨｐａＩＩ、ＡｖａＩＩ、又はＳａｕ３ＡＩであり、最も好ましくはＨｐａＩＩである。
また、本発明における第一の制限酵素は、ＤＮＡの認識配列中の塩基がメチル化されているかメチル化されていないかに関わらずＤＮＡを切断する、非メチル化感受性制限酵素であってもよく、例として、ＭｓｐＩ、ＳｉｎＩ、ＭｂｏＩ、ＮｄｅＩＩ、ＸｍａＩ、ＰａｃＩ、ＳｍａＩ、Ｓｓｅ８３８７１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
第一の制限酵素の作用条件は、用いる制限酵素に応じて、溶液中での制限酵素によるＤＮＡの切断条件に準じて適宜設定することができる。例えばＨｐａＩＩを用いた場合、当該酵素を１〜１００ユニット／ｍｌ含み、１〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５〜５．０ｍＭ ＤＴＴを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を工程（ｉｉ）の固定試料上に滴下し、２０〜４０℃で１〜６０分インキュベートする条件が例示される。
【００１８】
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程
本発明における標識された核酸分子とは、放射性又は非放射性物質で標識された核酸分子をいう。標識は特に限定されないが、例えば、放射性物質としては、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性同位体（ＲＩ）が挙げられる。非放射性物質としては、酵素、ハプテン及びフルオロフォア等が挙げられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ等が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ及びチミン二量体等が挙げられる。また、フルオロフォアとしては、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＡＭＣＡＴＭ、ＢＯＤＩＰＹＴＭ、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＴＭ、Ｃｙ２ＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、Ｃｙ５ＴＭ、Ｃｙ７ＴＭ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、６−ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＪＯＥ、ＨＥＸＴＭ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ、ＮＢＤＴＭ、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６ＧＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ、Ｒｈｏｄｏｌ ＧｒｅｅｎＴＭ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ、ＮＥＤＴＭ、ＶＩＣＴＭ等が挙げられる。特に非放射性物質は汚染や被爆の危険性がないため取り扱いが容易であり、後述する二重染色やマージ像を得る目的のためには好ましく用いられる。
【００１９】
標識された核酸分子の塩基長は、特に制限されず、例えば１〜５０塩基のポリヌクレオチド、好ましくは１〜２０塩基のポリヌクレオチド、より好ましくは１〜５塩基のオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、４塩基、３塩基、２塩基のオリゴヌクレオチド、最も好ましくは１塩基のヌクレオチドである。
【００２０】
標識された核酸分子は、酵素を用いた内部標識法によってＰＣＲ又は自動合成の際に標識化合物を核酸分子に取り込ませて作製してもよいし、酵素を用いた末端標識法によって、標識ヌクレオチドを核酸分子に付加して作製してもよい。あるいは、市販のＲＩ標識（オリゴ）ヌクレオチド、酵素標識ヌクレオチド、ハプテン標識ヌクレオチド、又は蛍光標識ヌクレオチド等を用いても良い。さらに、核酸分子と標識との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることによって、酵素が間接的に結合して標識された核酸分子を作製することもできる。
【００２１】
標識された核酸分子による第一の制限酵素切断部位の標識は、前記工程（ｉｉ）において、ジデオキシヌクレオチドの代わりに標識された核酸分子を用いること以外は、工程（ｉｉ）と同様に行うことができる。
【００２２】
（ｖ）標識部位を検出する工程
標識部位の検出とは、標識の特性又は活性を利用して、その存在箇所を視覚化することを意味し、用いた標識に応じて、自体公知の方法によって行われる。例えば、放射性物質の場合はオートラジオグラフィーにより、酵素の場合は酵素−基質反応による発色の検出により、ハプテンの場合はハプテンに結合する物質（抗体等）とかかる結合物質を認識する蛍光標識抗体とを用いた免疫反応の蛍光検出により、フルオロフォアの場合は特定の波長で励起させて特定の波長の蛍光を検出することにより行うことができる。なお、ハプテンを認識するための蛍光標識抗体に使用する蛍光物質は、前記フルオロフォアで例示したものを用いることができる。
【００２３】
検出手段としては、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、などが挙げられる。検出したシグナルをデジタル画像処理して三次元的に検出することも可能である。
【００２４】
検出方法（Ｉ）により、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化部位又は非メチル化部位が容易に可視化され、検出することができる。メチル化感受性制限酵素を用いることにより非メチル化部位が検出され、メチル化非感受性制限酵素を用いることにより非メチル化部位とメチル化部位とが同時に検出される。メチル化部位を特異的に検出するためには、後述する同時検出方法または検出された像を重ね合わせる方法を用いる。
【００２５】
本発明はまた、以下の工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化部位又は非メチル化部位の検出方法（ＩＩ）を提供する：
（ｉ）’組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）’前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）’工程（ｉｉ）’の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程、
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程。
【００２６】
検出方法（ＩＩ）において、組織又は細胞の固定試料、固定試料の前処理、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液、標識された核酸分子及びその検出については、上記検出方法（Ｉ）に関して記載したとおりである。よって、工程（ｉ）’〜工程（ｉｉｉ）’は、それぞれ検出方法（Ｉ）の工程（ｉ）〜工程（ｉｉｉ）と同様に行うことができる。なお、工程（ｉｉｉ）’における第一の制限酵素については、検出方法（Ｉ）において上述したもののうち、メチル化感受性制限酵素を用いることが望ましい。工程（ｉｖ）’は、工程（ｉｉ）又は工程（ｉｉ）’に準じて同様に行うことができる。
【００２７】
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程
本発明における第二の制限酵素は、特に制限されないが、好ましくは、第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素である場合、その認識する塩基配列と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素（即ち、第一及び第二の制限酵素はイソ制限酵素である）である。第一のメチル化感受性制限酵素と第二のメチル化非感受性制限酵素との好ましい組合せとしては、例えば、ＨｐａＩＩとＭｓｐＩ、ＡｖａＩＩとＳｉｎＩ、又はＳａｕ３ＡＩとＭｂｏＩ若しくはＮｄｅＩＩ等が挙げられる。ＣｐＧ部位でのシトシンのメチル化の有無を検出するためには、第一及び第二の制限酵素の組合せは、ＨｐａＩＩとＭｓｐＩが好ましい。第一のメチル化感受性制限酵素により非メチル化部位を切断し、当該切断部位をブロックした後に、第二のメチル化非感受性制限酵素を作用させることにより、特定の塩基配列中のメチル化部位が特異的に切断される。原核生物及び真核生物のメチル化塩基に対する感受性制限酵素及び非感受性制限酵素については、例えば、McClelland, M. et al., Nucleic Acids Res. 22:3640-3659, 1994に詳しく記載されている。
【００２８】
第二の制限酵素の作用条件は、用いる制限酵素に応じて、溶液中での制限酵素によるＤＮＡの切断条件に準じて適宜設定することができる。例えばＭｓｐＩを用いた場合、当該酵素を１〜１００ユニット／ｍｌ含み、１〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．５〜５．０ｍＭ ＤＴＴを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を工程（ｉｖ）’の固定試料上に滴下し、２０〜４０℃で１〜６０分インキュベートする条件が例示される。
【００２９】
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程
本工程において、前記工程（ｉｖ）と同様の操作が行われる。第一の制限酵素としてメチル化感受性制限酵素を用い、第二の制限酵素として第一の制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素を用いた場合、特定の塩基配列中のメチル化部位が特異的に標識される。
【００３０】
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程
本工程は、前記工程（ｖ）と同様の操作で行うことができる。工程（ｖｉ）’で標識された部位を本工程で検出することにより、第一の制限酵素としてメチル化感受性制限酵素を用い、第二の制限酵素として第一の制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素を用いた場合、特定の塩基配列中のメチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで特異的に検出することができる。
【００３１】
本発明の検出方法（ＩＩ）は、工程（ｉｉｉ）’と工程（ｉｖ）’との間に、工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程（ｉｉｉ）’’を含んでいても良い。ここで、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びそれを含有する溶液は、上述のとおりであり、工程（ｉｉｉ）’’は、前記工程（ｉｖ）と同様に行われる。
【００３２】
工程（ｉｉｉ）’’において、標識された核酸分子としては、上述した標識された核酸分子のいずれかを用いればよいが、本工程で用いる標識された核酸分子と、後の工程（ｖｉ）’において、第二の制限酵素切断部位を標識するために用いる標識された核酸分子とは、異なる標識を保有している必要がある。異なる標識の組み合わせは、上述の放射性物質、酵素、ハプテン、フルオロフォアのいずれかから選択されることが好ましい。
【００３３】
本発明の検出方法（ＩＩ）が工程（ｉｉｉ）’’を含む場合、続く工程（ｉｖ）’は、工程（ｉｉｉ）’’の固定試料に対して行われる。工程（ｉｉｉ）’’をさらに含む本発明の検出方法（ＩＩ）は、第一の制限酵素としてメチル化感受性制限酵素を用いて切断部位を検出することにより、特定の塩基配列中の非メチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで特異的に検出することができ、次いで、第二の制限酵素として第一の制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素を用いた場合、該特定の同じ塩基配列中のメチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで特異的に検出することができる。かかる検出方法は、同一の固定試料に対して連続的に行うことができ、いわゆる二重染色標本を提供することができる。
【００３４】
本発明の検出方法（Ｉ）及び（ＩＩ）において、それぞれの工程（ｉ）と（ｉｉ）との間又は工程（ｉ）’と（ｉｉ）’との間に、前処理した固定試料と、標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程（ａ）をさらに含んでいてもよい。
【００３５】
工程（ａ）の例としては
（ａ−１）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程、及び
（ａ−２）前処理した固定試料と、標識された核酸プローブを含有する溶液とを接触させ、固定試料中のＤＮＡと該核酸プローブとの二本鎖を形成させる条件下で接触が行われる工程
が挙げられる。
【００３６】
工程（ａ−１）は、上述した検出方法（Ｉ）の工程（ｉｖ）に準じて行うことができ、前記工程（ｖ）と同様に、標識部位を検出することができる。工程（ａ−１）により、固定試料中のＤＮＡの３’末端を標識し、所望により標識部位を検出することができる。
【００３７】
工程（ａ−１）を含む方法としては、例えば、アポトーシス細胞等で見られるＤＮＡの断片化を検出するためのＴＵＮＥＬ染色が公知である。ＴＵＮＥＬ染色は、Gavrieli et al., J Cell Biol 119: 493-501 (1992)、Koji et al., Biol Reprod 64: 946-954 (2001)、及びAn et al., Histochem Cell Biol 123: 249-261 (2005)等に記載の方法にしたがって行われ得、下記の実施例において、一例を開示する。よって、工程（ａ−１）を含む本発明の検出方法（Ｉ）又は（ＩＩ）は、細胞のアポトーシスと特定の塩基配列中のＤＮＡのメチル化または非メチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで同時に検出することができる。
【００３８】
工程（ａ−２）において、標識された核酸プローブは、前処理した固定試料中のＤＮＡと二本鎖を形成する核酸である。固定試料中のＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。核酸プローブと固定試料中のＤＮＡとは、互いに相補的な塩基配列間でハイブリダイズし、試料中のＤＮＡと核酸プローブとの二本鎖が形成される。本工程において、かかる二本鎖が形成される条件下で接触が行われる。
【００３９】
標識された核酸プローブは、標的となる固定試料中のＤＮＡ配列と二本鎖を形成し得る塩基配列を含む核酸プローブであれば、特に制限されない。プローブの標識は、前記核酸分子の標識で記載した標識の中から目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
本発明核酸プローブの塩基長は、対象となる標的ＤＮＡ配列と特異的に二本鎖を形成し得る限り特に制限されず、例えば１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上が挙げられる。合成の容易さなどを考慮すれば、核酸プローブ長は２００塩基以下であることが好ましく、１００塩基以下であることがより好ましい。プローブの合成は、例えば、標的とするメチル化部位を含む特定の塩基配列を選択し、その相補配列を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機等を用いて化学的に合成することによって行うことができる。相補配列の同一性は、目的とするＤＮＡ配列に対して完全相補的（１００％）であってもよく、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であってもよい。
【００４１】
工程（ａ−２）の溶液は、核酸プローブと固定試料中のＤＮＡとが二本鎖を形成する組成であれば特に制限されないが、溶液の組成の例として、例えば以下が挙げられる：
１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４） ２．５０μｌ
５Ｍ ＮａＣｌ ３０．００μｌ
０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４） １．２５μｌ
脱イオン化ホルムアミド １００．００μｌ
１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液 ２．５０μｌ
酵母 ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） ６．２５μｌ
サケ精巣 ＤＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ） ６．２５μｌ
硫酸デキストラン（５０％） ５０．００μｌ
プローブ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４） ５１．２５μｌ
合計 ２５０．００μｌ
【００４２】
当該プローブを含む溶液と固定試料との接触及びハイブリダイズ後の洗浄条件は、当業者であれば、溶液の塩濃度、反応の温度（プローブの融解温度に基づき適宜設定する、例えば約２５℃〜約５０℃）、核酸プローブ濃度（０．１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２μｇ／ｍｌ）、核酸プローブの塩基長、ミスマッチの数、反応時間（約３０分〜約一日、好ましくは約１２０分〜約９００分）等を適宜変更することにより、容易に設定することができる。
【００４３】
工程（ａ−２）において、前記工程（ｖ）に準じて、所望により形成された二本鎖を検出することができる。
【００４４】
工程（ａ−２）を含む方法としては、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが公知である。よって、工程（ａ−２）を含む本発明の検出方法（Ｉ）又は（ＩＩ）は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと組み合わせることによって細胞の特定の塩基配列中のＤＮＡのメチル化または非メチル化部位をｉｎ ｓｉｔｕで同時に検出することができる。
【００４５】
本発明はまた、２個以上の隣接組織試料をそれぞれ工程（ｉ）〜工程（ｖ）に供し、工程（ｖ）で検出された２個以上の隣接組織固定試料間の標識部位像を重ね合わせる工程をさらに含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡメチル化又は非メチル化部位の検出方法（ＩＩＩ）を提供する。
【００４６】
検出方法（ＩＩＩ）で用いる隣接組織固定試料とは、組織試料から作製した連続切片の相互に隣接した組織切片の組み合わせをいう。隣接組織固定試料は、検出対象の試料としてほぼ同一の試料とみなすことができる。隣接組織試料として、特にミラー切片（切断面を鏡像のように合わせることができる２枚の連続切片の組合せをいう）が最も好ましい。
【００４７】
検出方法（ＩＩＩ）において、２個以上の隣接組織固定試料を用いることにより、第一の制限酵素を２種以上選択してＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位を検出することができる。得られたメチル化又は非メチル化像をそれぞれ解析したり、互いに重ね合わせることによって、メチル化又は非メチル化に関する様々な情報をｉｎ ｓｉｔｕで得ることができる。
【００４８】
本発明はまた、２個の隣接組織固定試料の一方を検出方法（Ｉ）の方法に供して検出された標識部位像と、他方の隣接組織固定試料におけるＴＵＮＥＬ染色像とを重ね合わせて視覚化する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのアポトーシスとＤＮＡメチル化との関連性の検出方法（ＩＶ）を提供する。これにより、得られたＴＵＮＥＬ染色像とメチル化又は非メチル化像とを別々に解析したり、互いに重ね合わせることによって、アポトーシスとＤＮＡメチル化に関する様々な情報をｉｎ ｓｉｔｕで得ることができる。
【００４９】
また、本発明は、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、第一の制限酵素、第一の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子、第二の制限酵素、第二の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子を別々の容器に含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出キットを提供する。当該キットにおいて、第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せが好ましい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００５１】
化学薬品及び生化学薬品：
パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）は、メルク（Darmstadt、ドイツ）から購入し、３，３’−ジアミノベンジジン・４ＨＣｌ（ＤＡＢ）は、株式会社同仁化学研究所（熊本、日本）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（本質的に脂肪酸及びグロブリンを含まない）及びトリス（Ｔｒｉｚｍａ）塩基及びＢｒｉｊ−３５は、シグマ化学株式会社（St. Louis、MO、アメリカ）の物を入手した。ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、ロシュ・ダイアグノスティックス（Mannheim、ドイツ）の物を入手した。ジデオキシＡＴＰ（ｄｄＡＴＰ）及びジデオキシＴＴＰ（ｄｄＴＴＰ）は、ジェナ・バイオサイエンス（Jena、ドイツ）の物を入手した。ＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩは、タカラバイオ株式会社（滋賀、日本）から購入した。パーマウント（Permount）は、フィッシャー・サイエンティフィック株式会社（NJ、アメリカ）から購入した。本研究で用いた他の全ての試薬は、和光純薬（大阪、日本）の物であり、分析グレードであった。
【００５２】
抗体：
マウスモノクローナル抗５−メチルシトシン抗体（２．５μｇ／ｍｌ）は、カルバイオケム（San Diego、CA、アメリカ）から購入した。正常ヤギＩｇＧ及びヒツジＩｇＧは、ダコ（Glostrup、デンマーク）から購入した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）、ＨＲＰ標識ヤギ抗ビオチン抗体（１：１００）及びＨＲＰ標識ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（１：１００）は、ケミコン・インターナショナル株式会社（Temecula、CA、アメリカ）の物を入手した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ビオチン抗体（１：１００）は、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Burlingame、CA、アメリカ）の物を入手し、ローダミン標識ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体（１：１００）は、ロシュ・ダイアグノスティックス（Mannheim）の物を入手した。
【００５３】
動物及び組織標本:
本研究では、２７〜３８ｇの雄成体ＩＣＲマウス（８〜１０週齢）を用いた。一部のマウスには、コーン油に溶解したジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を、５日ごとに２０ｍｇ／ｋｇ体重にて、４回接種し、生殖細胞アポトーシスを誘導した（Koji T. et al., Biol Reprod 64: 946-954 (2001)）。ＤＥＳ又はビヒクル単独での２０日間の処置後、マウスを解剖した。実験プロトコルは、長崎大学の動物倫理審査委員会によって承認されたものである（＃０１１２１０００１２及び＃０２０２２０００４８）。
解剖して摘出した精巣を、細片に切り分け、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％のＰＦＡで一晩、４℃で固定し、標準的な様式でパラフィンに包埋した。いくつかの連続切片を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、生殖細胞の精上皮周期及び分化段階の同定に用いた。
【００５４】
５−メチルシトシンの免疫組織化学染色：
以前に詳述された方法（Matsuo Y. et al., Acta Histochem Cytochem 40: 69-75 (2007)）で、マウス精巣のパラフィン切片に対して５−メチルシトシンの免疫組織化学的検出を行った。脱パラフィンした後、切片を、１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０中に浸し、１２０℃で１５分間オートクレーブし、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１％ ＢＳＡに溶解した５００μｇ／ｍｌの正常ヤギＩｇＧと、１時間プレインキュベートした。他に特に規定がなければ、全ての反応を室温（ＲＴ）にて行った。次いで、切片を、ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ中の抗５−メチルシトシン抗体（２．５μｇ／ｍｌ）と一晩反応させた。ＰＢＳ中０．０７５％ Ｂｒｉｊで３回、各１５分間洗浄後、ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ中に溶解したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、１時間反応させた。ＰＢＳ中０．０７５％ Ｂｒｉｊで３回、各１５分間洗浄後、ＨＲＰの部位を、ニッケル及びコバルトイオンの存在下、ＤＡＢ及びＨ２Ｏ２で可視化した（Shukuwa K. et al., Histochem Cell Biol 126: 111-123 (2006)）。ネガティブコントロールとして、いくつかの切片を、特異的なモノクローナル抗体の代わりに、正常マウスＩｇＧと反応させた。
【００５５】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）染色：
アポトーシス生殖細胞を同定するために、Gavrieli Y. et al., J Cell Biol 119: 493-501（1992）の方法に従って、わずかな改変を加えて（Koji T. et al., Biol Reprod 64: 946-954 (2001); An S. et al., Histochem Cell Biol 123: 249-261 (2005)）、ＴＵＮＥＬを行った。シランコートしたスライドガラス上のパラフィン切片（厚さ５〜６μｍ）を脱パラフィンし、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで、３７℃にて、１５分間消化した。次いで、切片をＴｄＴ緩衝液（０．２Ｍ カコジル酸カリウム及び０．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する８２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６．６）単独で、ＲＴにて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを、０．５μＭ ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、２０μＭ ｄＡＴＰ、１．５ｍＭ ＣｏＣｌ２及び０．１ｍＭ ジチオスレイトールを添加したＴｄＴ緩衝液中に溶解した８００ユニット／ｍｌのＴｄＴと、３７℃で９０分間反応させた。ネガティブコントロールとして、ＴｄＴ反応を、ビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりに０．５μＭ ＴＴＰで行い、あるいはＴｄＴを含めずに行った。ミリＱ水（Millipore、Molsheim、フランス）（DDW）で洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ビオチン抗体又はＦＩＴＣ標識ヤギ抗ビオチン抗体で、免疫組織化学的にシグナルを検出した。ＨＲＰの部位を、上述のように、ＤＡＢ、過酸化水素、ニッケル及びコバルトイオンの混合物によって可視化した。
【００５６】
ＨＥＬＭＥＴ：
まず、ＴｄＴ反応を、上述のようにして（ただしＤＮＡの遊離３’−ＯＨ末端をブロックするために、ｄＡＴＰ及びビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりに２０μＭ ｄｄＡＴＰ及び２０μＭ ｄｄＴＴＰを用いた）マウス精巣のパラフィン切片上に対して、３７℃にて２時間行った。ＤＤＷ及びＰＢＳで連続して洗浄後、切片を、ＰＢＳ中の４％ ＰＦＡで５分間固定し、次いで、ＰＢＳで２回、ＤＤＷで１回、各５分間ずつ洗浄した。次いで、切片を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ジチオスレイトールを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中、に溶解した１００ユニット／ｍｌのＨｐａＩＩと、３７℃で２時間反応させた。次いで、スライドをＤＤＷで３回、各５分間ずつ洗浄した。ＤＮＡの非メチル化ＣＣＧＧ配列の部位を検出するために、ＴＵＮＥＬのＴｄＴ反応と類似したＴｄＴ反応を、０．５μＭ ビオチン−１６−ｄＵＴＰ又は０．５μＭ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで、３７℃にて、１．５時間、湿室中で行い、ついでＰＢＳで３回、各５分間ずつ洗浄した。シグナルを可視化するために、酵素免疫組織化学染色の場合、スライドをＰＢＳ中５００μｇ／ｍｌの正常ヤギＩｇＧ又は正常ヒツジＩｇＧと５％ ＢＳＡとの混合物とともに１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中５％ ＢＳＡに溶解したＨＲＰ−ヤギ抗ビオチン抗体又はＨＲＰ−ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体と、それぞれ１時間反応させた。ＰＢＳ中０．０７５％ Ｂｒｉｊで３回、次いでＰＢＳ単独で、各１０分間ずつ洗浄後、シグナルを、上述のように、ＤＡＢ、Ｈ２Ｏ２、ニッケル及びコバルトイオンからなる色素原溶液で可視化した。スライドを、段階的濃度のエタノール溶液を通して脱水し、キシレンで透徹し、次いでパーマウントでマウントした。蛍光免疫組織化学染色の場合、ＰＢＳ中５％ ＢＳＡに溶解したＦＩＴＣ−ヤギ抗ビオチン抗体又はローダミン−ヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体を、１時間反応させ、同様に洗浄した。スライドを、ＰＢＳ中９０％（ｖ／ｖ）グリセロールでマウントした。
ＤＮＡのメチル化ＣＣＧＧ配列の部位を検出するために、切片を、ＨｐａＩＩで消化し、次いで、上述のように、ＴｄＴによってジデオキシヌクレオチドの混合物でブロックした。次に、それらをＰＢＳ中４％ ＰＦＡで５分間固定し、ＰＢＳで２回、各１５分ずつ洗浄した。ＤＤＷで洗浄後、切片を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ジチオスレイトール、６６ｍＭ 酢酸カリウム及び０．１％ ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）に溶解した１００ユニット／ｍｌのＭｓｐＩで、３７℃にて２時間消化した。ＤＤＷで３回、各５分間ずつ洗浄後、０．５μＭ ビオチン−１６−ｄＵＴＰ又は０．５μＭ ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで、３７℃にて２時間、湿室中でＴｄＴ反応を行い、次いで、ＰＢＳで３回、各５分間ずつ洗浄した。次に、非メチル化ＣＣＧＧ部位の検出に用いた手順と同じ手順で、メチル化ＣＣＧＧ部位を可視化した。
非メチル化部位及びメチル化部位の二重染色のために、ＨｐａＩＩ切断部位を、ＴｄＴ反応によってビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、ジデオキシヌクレオチドでブロックした。次に、メチル化部位を検出する手順で、ＭｓｐＩ切断部位を、ＴｄＴ反応によって、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識した。最後に、両方のハプテンを、それぞれＦＩＴＣ−抗ビオチン抗体及びローダミン−抗ジゴキシゲニン抗体によって可視化した。
蛍光シグナルの解析は、ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ（Ｖ３．２）（Carl Zeiss Co.、Jena、ドイツ）で行った。本研究では、ＦＩＴＣ及びローダミンシグナルは、それぞれ５０５〜５３０ｎｍ（励起、４８８ｎｍ）の発光フィルター及び５６０〜ｎｍフィルター（励起、５４３ｎｍ）で得た。観察は、Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ ２０×／０．５及び４０×／０．７５の対物レンズで行い、それぞれの光学的切片の厚みは、０．５μｍ及び０．７μｍであった。
【００５７】
ＨＥＬＭＥＴのコントロール実験：
シグナルの特異性を確認するために、発明者らはいくつかのコントロール実験を行った。ＨｐａＩＩ消化の前後におけるジデオキシヌクレオチドでの３’−ＯＨ末端のブロッキングが必須であり、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ又はジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでのＴｄＴ反応によって評価した。エンドヌクレアーゼ活性の切断部位に対する依存性を検討するために、いくつかのスライドを、１０分間煮沸して冷却した酵素溶液と反応させた。ＴｄＴ反応のコントロールとして、いくつかのスライドを、反応混合物中、ＴｄＴの不存在下で、又はビオチン−１６−ｄＵＴＰもしくはジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰと共に反応させた。酵素−免疫組織化学染色における内因性ペルオキシダーゼの活性もしくは蛍光−免疫組織化学染色における自己蛍光を評価するために、いくつかのスライドを、免疫組織化学的染色の工程においてＨＲＰ標識抗体又は蛍光色素標識抗体を省いて処理した。
【００５８】
ＴＵＮＥＬ及びＨＥＬＭＥＴのための二重染色：
ＴＵＮＥＬ陽性細胞を、ＣＣＧＧ配列のメチル化状態と直接関連付けるために、まずマウス精巣のパラフィン切片でＴＵＮＥＬを行った。ビオチン−１６−ｄＵＴＰとのＴｄＴ反応後、切片を、上記のようにジデオキシヌクレオチドでブロックし、ＰＢＳ中４% ＰＦＡで５分間固定した。次いで、切片をＰＢＳで２回（各１５分間）及びＤＤＷで１回（５分間）洗浄し、上記の手順において説明したように、ＨｐａＩＩ又はＭｓｐＩで消化した。ＣＣＧＧの非メチル化部位又はメチル化部位との共局在化のために、切断部位をＴｄＴによってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、最後に、ビオチン部分及びジゴキシゲニン部分の両方を、それぞれＦＩＴＣ−抗ビオチン抗体及びローダミン−抗ジゴキシゲニン抗体で、上に詳述したように可視化した。
【００５９】
（試験例１）
ＨＥＬＭＥＴにおける種々のパラメータの最適化
基本的に、本方法は、ＴＵＮＥＬにおいて用いられるＴｄＴ反応に依存する；制限酵素によってもたらされる切断部位の３’−ＯＨ末端を、ＴｄＴ反応によってハプテン性のｄＵＴＰアナログで標識し、次いで酵素免疫組織化学染色又は蛍光免疫組織化学染色によって可視化した。本プロトコルでは、以前に記述された（Koji T., Molecular Histochemical Techniques (Springer Lab Manuals),（2000）; Koji T., Biol Reprod 64: 946-954(2001)）ように最適化されたＴｄＴ反応の条件を用いた。発明者らは、制限酵素の条件（濃度及び持続時間）を、シグナル強度が最大となるように設定した。ＤＮＡの非特異的な切断の検出又はＤＮＡの３’−ＯＨ末端の不要な伸長を防ぐために、ＴｄＴ反応のための、ジデオキシヌクレオチドでの３’−ＯＨ末端のブロッキングが必須であった。種々の濃度（５〜２０μＭ）のｄｄＵＴＰ、ｄｄＴＴＰ及びｄｄＡＴＰを、単独で又は組合せて用い、ブロッキング効果を比較したところ、２０μＭ ｄｄＴＴＰ及び２０μＭ ｄｄＡＴＰの混合物で、さらなるＴｄＴ反応に対する完全なブロックが達成された（データ示さず）。さらに、ＰＢＳ中４％ ＰＦＡでの繰り返しの固定もまた、好ましくない染色を減少させるのに効果的であり、それはおそらく、組織切片においてもともとマスキングされていたＤＮＡの、アンマスキングが減少したためである（データ示さず）。
【００６０】
（試験例２）
マウス精巣における非メチル化ＣＣＧＧ配列及びメチル化ＣＣＧＧ配列の両方の同時局在
精原細胞の異なる分化段階間の、ＤＮＡの非メチル化ＣＣＧＧ配列対メチル化ＣＣＧＧ配列の比における差異を評価するために、発明者らは、ＨＥＬＭＥＴにより、両方のＣＣＧＧ配列の同時染色を行った。図１Ａ及び１Ｄにおいて示すように、ＨｐａＩＩ陽性の非メチル化ＣＣＧＧは、主にいくつかの大型細胞の核（矢印）及びステップ１０〜１１よりも後の段階における伸長精細胞（矢じり）に局在し、精原細胞の核ではより低強度であった。一方で、ＭｓｐＩ陽性のメチル化ＣＣＧＧの染色は全体としてより強く、ほとんどの生殖細胞が陽性であった（図１Ｂ及び１Ｅ）。しかし、いくつかの大型細胞は、わずかにしか又は全く染色されなかった。マージ像（図１Ｃ及び１Ｆ）において、大型細胞が黄色又は緑であることが明らかであり、非メチル化ＣＣＧＧが等しく又は優勢に存在していたこと示す。Ｈ＆Ｅ染色スライドに基づき、それらの大型細胞は、アポトーシスを経ていたと考えられる。したがって、発明者らは、細胞をＴＵＮＥＬ及びＨＥＬＭＥＴで、二重染色することにした。
さらに、発明者らは、種々のコントロール実験を行った；図１Ｇ及び１Ｈで示すように、ＨｐａＩＩ消化前後では、ＤＮＡの３’−ＯＨ末端は、ジデオキシヌクレオチドで完全にブロックされていた。不活化エンドヌクレアーゼとのインキュベーションは、いかなるシグナルも呈さなかった（図１Ｉ及び１Ｊ）。さらに、ＨｐａＩＩ消化後にビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行った場合（図１Ｋ）、又はＭｓｐＩ消化後にジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行った場合（図１Ｌ）、いかなるシグナルも検出されなかった。蛍光色素標識抗体を除いても、シグナルは生成されなかった（データ示さず）。
【００６１】
（試験例３）
マウス精巣の隣接切片のＤＮＡの非メチル化及びメチル化ＣＣＧＧ部位の分染
マウス精巣の隣接切片を用い、発明者らは、ＴＵＮＥＬ、非メチル化ＣＣＧＧ部位、及びメチル化ＣＣＧＧ部位の酵素免疫組織化学染色を比較した。図２Ｂに示すように、発明者らは、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性細胞がアポトーシス細胞であることを見出した。プロテイナーゼ消化後に切片をジデオキシヌクレオチドで標識した場合、ＴＵＮＥＬにおけるさらなるＴｄＴ反応は、いかなる染色も示さなかった（図２Ｃ）。次に、ジデオキシヌクレオチドでブロックした切片を、ＨｐａＩＩで消化し、非メチル化ＣＣＧＧ部位を、ＴｄＴによってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ジゴキシゲニン抗体で可視化した（図２Ｄ）。生殖細胞の過半数は、非常に弱くしか染色されなかったものの、ＴＵＮＥＬ陽性細胞と同定された、強く染色されたいくつかの細胞もまた見られた。他の切片を、ＨｐａＩＩで消化し、ジデオキシヌクレオチドでブロックし、次いで、ＭｓｐＩで消化し、ＴｄＴによってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ジゴキシゲニン抗体で可視化した（図２Ｆ）。生殖細胞の過半数は、多かれ少なかれ陽性であったものの、染色の強度は生殖細胞間で異なり、いくつかの精原細胞、細胞分裂中の精母細胞及び精子細胞（円形及び伸長）は、強く染色されていた。セルトリ細胞の核は、核小体以外は、ごくわずかにしか染色されていなかった。興味深いことに、非メチル化ＣＣＧＧ部位の染色と異なり、いくつかのＴＵＮＥＬ陽性細胞のメチル化ＣＣＧＧ部位の染色は、非常に弱かった。ＭｓｐＩ消化を行わなかったコントロール切片では、染色は見られず（図２Ｅ）、ＨｐａＩＩ消化後のジデオキシヌクレオチドでのブロッキングが完璧であったことを示している。さらに、ビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴＵＮＥＬを行った場合、又はＴｄＴなしでＴＵＮＥＬを行った場合、いかなる染色も検出されなかった（データ示さず）。
ＴＵＮＥＬ陽性細胞におけるＣＣＧＧ部位のメチル化状態を直接的に明らかにするために、ＴＵＮＥＬとＨｐａＩＩ切断部位又はＭｓｐＩ切断部位との二重染色を行った。図３に示すように、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、常にＨｐａＩＩ切断部位（非メチル化ＣＣＧＧ）に関して陽性であったが（図３Ｃ）、ＭｓｐＩ切断部位（メチル化ＣＣＧＧ）に関しては、常には陽性ではなかった（図３Ｆ）。
【００６２】
（試験例４）
マウス精巣における５−メチルシトシンの免疫組織化学的検出
ＨＥＬＭＥＴによって検出されたメチル化ＣＣＧＧの局在パターンと５−メチルシトシンの局在パターンとの比較のために、発明者らは、抗５−メチルシトシンモノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学染色を行った。図４Ａに示すように、ほとんどの生殖細胞の核は、強く染色され、種々の分化段階における生殖細胞間での染色強度の顕著な差異はなかった。さらに、ＤＥＳ処理精巣切片における５−メチルシトシンの免疫組織化学染色は、ほとんどの生殖細胞で重度の核染色を示した（図４Ｂ）が、ＴＵＮＥＬ陽性細胞とＴＵＮＥＬ陰性細胞との間には差はなかった（図４Ｃ）。
【００６３】
（考察）
本研究において発明者らは、組織切片における非メチル化及びメチル化ＣＣＧＧ配列を識別するように設計された、新たな組織化学的な方法、ＨＥＬＭＥＴ、を説明した。新たな方法ＨＥＬＭＥＴを、マウス精巣のパラフィン包埋切片の解析に適用し、その結果は、５−メチルシトシンの免疫組織化学染色の結果とは異なり、生殖細胞の分化段階に依存するＣＣＧＧ部位のメチル化レベルの差異を明らかにした。結果はさらに、ほとんどがアポトーシスを経ていたＴＵＮＥＬ陽性生殖細胞において、ＣＣＧＧ部位が、正常な生殖細胞と比べて、多かれ少なかれ脱メチル化されていたことを示した。これは、生殖細胞のアポトーシス誘導において、エピジェネティック制御障害が関与している可能性に関する、初めての直接的な証拠である。
ＣＣＧＧ部位の脱メチル化は、ステップ１０〜１１よりも後の段階での伸長精細胞でも見られたものの、ＣＣＧＧ部位の最も顕著な脱メチル化は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞において見られた。クロマチンは、伸長精細胞及びアポトーシス細胞の両方において、高度に凝縮されているため、ＣＣＧＧ部位のメチル化は、ヘテロクロマチン形成と密接に関連しているわけではないかもしれない。むしろ、より重要なのは、ＣＣＧＧ部位のメチル化のダウンレギュレーションが、減数分裂前の生殖細胞における生殖細胞のアポトーシス誘導の引き金であり得ることである。発明者らの発見と一致して、マウス精巣においてＤＮＡメチル化の減少又は喪失を誘導する５−アザ−２’−デオキシシチジンでの処置（Kelly T. L. et al., J Androl 24: 822-830 (2003)）及びＤｎｍｔ３Ｌ遺伝子の変異（Hata K. et al., Mol Reprod Dev 73: 116-122(2006)）が、マウス精巣における組織的な異常及び生殖細胞の喪失をもたらすことは、既に知られている。
本結果はまた、生殖細胞のＣＣＧＧ部位におけるメチル化レベルは、セルトリ細胞のような体細胞よりも一般的に高いことを示した。これに関連して、ＣｐＧアイランドは、通常メチル化されておらず、またゲノムＤＮＡの他の部分では、メチル化レベルは、体細胞におけるＧＣ含量と反比例することに留意すべきである。しかし、生殖細胞におけるＤＮＡのメチル化レベルは、ＤＮＡセグメントのＧＣ含量に依存することが、近年の研究によって報告された（Oakes C. C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 104: 228-233 (2007)）。したがって、ＨＥＬＭＥＴによる生殖細胞の一般的に強い染色は、この傾向を反映しているのかもしれない。さらに、脱メチル化を誘導する機構がまだ知られていないため、アポトーシス生殖細胞のＣＣＧＧ部位が、アポトーシス中に脱メチル化されることは、興味深い発見であった。発明者らの生殖細胞研究は、「デメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）」の存在に関する、重要な証拠を提供するかもしれない。
一般的に、ＤＮＡの高度メチル化は、ヘテロクロマチン形成と関連していると考えられている（Li E., Nat Rev Genet 3: 662-673 (2002)）。しかし、高度に凝縮されたクロマチンを有すると考えられている伸長精細胞の核において（Koji T., Hishikawa Y., Arch Histol Cytol 66: 1-16 (2003)）、予測していなかったＣＣＧＧ部位の低メチル化が見られた。ＣＣＧＧ部位のメチル化レベルが、ヘテロクロマチン領域と密接な関係を有するか否か、あるいはヘテロクロマチン領域とどのように密接に関係しているかを決定するためには、さらなる研究が必要である。この点を確認するためには、そのような研究は、ヘテロクロマチン領域のＣＣＧＧ部位のメチル化状態を決定するために、電子顕微鏡の使用を含むべきである。
ＣｐＧのメチル化は、哺乳動物のゲノムを通じて、３×１０７の部位で起こり、ＨＥＬＭＥＴによって解析したＣＣＧＧ部位は、メチル化されるＣｐＧの全体数のうち、最大で約５％を構成する（Kelly T. L. et al., J Androl 24: 822-830 (2003)）。したがって、５−メチルシトシンの免疫組織化学染色がアポトーシス生殖細胞と非アポトーシス生殖細胞との間のメチル化レベルの差異を同定できなかったものの、ＨＥＬＭＥＴがアポトーシス生殖細胞における低メチル化の検出を可能としたことは当然である。さらに重要なことには、イソ制限酵素であるＨｐａＩＩ及びＭｓｐＩの使用は、ＤＮＡのより特異的な部位のメチル化に関する情報を提供できる。この方法を、異なる制限酵素の組合せの使用にまで広げ、又はこの方法を特定の遺伝子の部分がオリゴデオキシヌクレオチドプローブとｉｎ ｓｉｔｕでハイブリダイズする標本に適用すること（Koji T., Nakane P. K., J Electron Microsc 45: 119-127 (1996)）によって、個々の細胞の特定の遺伝子のメチル化状態を解析することが可能となるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の検出方法を駆使して、エピジュネティックスの基礎的な研究が進展することが期待される。これにより、エピジュネティックスとエピジュネティックな変化に基づく疾患との関連が解明され、本発明の検出方法は、エピジュネティックな変化に基づく疾患の発症、治療及び予後の診断にも役立つことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】マウス精巣のパラフィン包埋切片における、ＨＥＬＭＥＴによる非メチル化及びメチル化ＣＣＧＧ配列の同時局在を示す図である。パラフィン包埋切片は、ＴｄＴによってジデオキシヌクレオチド混合物でブロックし、次いでＨｐａＩＩ切断部位を、ビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識した。ジデオキシヌクレオチドでのブロック後、ＭｓｐＩ切断部位を、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、次いで、両ハプテンを、それぞれＦＩＴＣ−抗ビオチン抗体（Ａ、Ｄ）及びローダミン−抗ジゴキシゲニン抗体（Ｂ、Ｅ）で可視化した。マージ像をＣ及びＦに示す。矢印：大型細胞、矢じり：伸長精細胞。（Ｇ）ブロッキング後のＴｄＴ反応。ジデオキシヌクレオチドでのブロッキング直後に、ビオチン−１６−ｄＵＴＰでのＴｄＴ反応を、いくつかのスライドに対して行った。いかなる染色も見られなかった。（Ｈ）ＨｐａＩＩ消化に次いでブロッキングした後のＨＥＬＭＥＴ。ＴｄＴ反応は、（Ｇ）と同様に行った。いかなる染色も見られなかった。さらなるコントロールとして、煮沸した（不活化した）ＨｐａＩＩ（Ｉ）又はＭｓｐＩ（Ｊ）を、ジデオキシヌクレオチドでのブロッキング後にスライドと反応させ、次いでビオチン−１６−ｄＵＴＰ又はジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰそれぞれとのＨＥＬＭＥＴを行った。蛍光−免疫組織化学染色のコントロールとしては、ＨＥＬＭＥＴにおいて、ＨｐａＩＩ消化後に、ビオチン−１６−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行い（Ｋ）、あるいはＭｓｐＩ消化後に、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰの代わりにＴＴＰでＴｄＴ反応を行った（Ｌ）。いかなる蛍光も見られなかった。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ：バー＝１００μｍ、Ｄ、Ｅ、Ｆ：バー＝５０μｍ。
【図２】マウス精巣の隣接切片におけるＴＵＮＥＬ陽性生殖細胞のＣＣＧＧ部位のメチル化レベルを示す。パラフィン包埋マウス精巣の隣接切片の、（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色、及び（Ｂ）ＴＵＮＥＬ染色を示す。（Ｃ）ＴｄＴによるジデオキシヌクレオチドでの３’−ＯＨ末端のブロッキング。ブロッキング後、切片をＴｄＴによってビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、組込まれたビオチンを、ＨＲＰ−抗ビオチン抗体で検出した。いかなるシグナルも観察されなかった。（Ｄ）非メチル化ＣＣＧＧ部位の染色。（Ｃ）で記述したブロッキングの手順後、切片をＨｐａＩＩで消化し、ビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ビオチン抗体で酵素免疫組織化学染色によって可視化した。（Ｅ）ＴｄＴによるジデオキシヌクレオチドでの、ＨｐａＩＩ切断部位のブロッキング。切片を、ＨｐａＩＩで消化し、切断部位をジデオキシヌクレオチド混合物でブロッキングした。次いで、切片を、（Ｃ）で記述したのと同様の様式で処理した。（Ｆ）メチル化ＣＣＧＧ部位の染色。ジデオキシヌクレオチドでのＨｐａＩＩ切断部位のブロッキング後、切片をＭｓｐＩで消化し、切断部位をビオチン−１６−ｄＵＴＰで標識し、ＨＲＰ−抗ビオチン抗体で可視化した。バー＝１００μｍ。
【図３】マウス精巣のパラフィン包埋切片におけるＴＵＮＥＬ及び非メチル化ＣＣＧＧ部位又はメチル化ＣＣＧＧ部位の二重染色を示す。（Ａ、Ｄ）タネル（ＴＵＮＥＬ）染色。（Ｂ）ＨｐａＩＩ切断部位の染色（非メチル化ＣＣＧＧ部位）。（Ｃ）Ａ及びＢのマージ像。（Ｅ）ＭｓｐＩ切断部位の染色（メチル化ＣＣＧＧ部位）。（Ｆ）Ｄ及びＥのマージ像。バー＝１００μｍ。矢印（Ａ、Ｂ及びＣ）並びに矢じり（Ｄ、Ｅ及びＦ）は、同一の細胞を示す。
【図４】ＤＥＳ処理マウス精巣のパラフィン包埋切片における、５−メチルシトシンの免疫組織化学的検出を示す。（Ａ）コーン油処理又は（Ｂ）ＤＥＳ処理したマウス精巣のパラフィン包埋切片を、抗５−メチルシトシン抗体と反応させ、シグナルを、酵素免疫組織化学染色によって検出した。（Ｂ）で用いた切片のミラー切片を、ＴＵＮＥＬで用いた（Ｃ）。矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を示す。バー＝１００μｍ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖ）標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
【請求項２】
（ｉ）’組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）’前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）’工程（ｉｉ）’の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程、
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
【請求項３】
工程（ｉｉｉ）’と工程（ｉｖ）’との間に、
（ｉｉｉ）’’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程；
をさらに含み、工程（ｉｖ）’が工程（ｉｉｉ）’’の固定試料に対して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素又はメチル化非感受性制限酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
メチル化感受性制限酵素がＨｐａＩＩである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素との組合せが、それぞれＨｐａＩＩとＭｓｐＩ、ＡｖａＩＩとＳｉｎＩ、又はＳａｕ３ＡＩとＭｂｏＩ若しくはＮｄｅＩＩのいずれかである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識が、酵素、ハプテン、フルオロフォア及び放射性物質からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉ）と（ｉｉ）との間又は工程（ｉ）’と（ｉｉ）’との間に、
（ａ）前処理した固定試料と、標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程；
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）が、前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において、標識された核酸分子が標識された核酸プローブであり、固定試料中のＤＮＡと該核酸プローブとの二本鎖を形成させる条件下で接触が行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
２個以上の隣接組織固定試料をそれぞれ工程（ｉ）〜工程（ｖ）に供し、工程（ｖ）で検出された２個以上の隣接組織固定試料間の標識部位像を重ね合わせる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２個の隣接組織固定試料の一方を請求項１に記載の方法に供して検出された標識部位像と、他方の隣接組織固定試料におけるＴＵＮＥＬ染色像とを重ね合わせて視覚化する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのアポトーシスとＤＮＡメチル化との関連性の検出方法。
【請求項１６】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、第一の制限酵素、第一の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子、第二の制限酵素、第二の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子を別々の容器に含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出キット。
【請求項１７】
第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１】
（ｉ）組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖ）標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
【請求項２】
（ｉ）’組織又は細胞の固定試料を前処理する工程、
（ｉｉ）’前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｉｉｉ）’工程（ｉｉ）’の固定試料上で、第一の制限酵素を作用させる工程、
（ｉｖ）’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及びジデオキシヌクレオチドを含有する溶液とを接触させる工程、
（ｖ）’工程（ｉｖ）’の固定試料上で、第二の制限酵素を作用させる工程、
（ｖｉ）’工程（ｖ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第二の制限酵素切断部位を標識する工程、並びに
（ｖｉｉ）’標識部位を検出する工程；
を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出方法。
【請求項３】
工程（ｉｉｉ）’と工程（ｉｖ）’との間に、
（ｉｉｉ）’’工程（ｉｉｉ）’の固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させ、第一の制限酵素切断部位を標識する工程；
をさらに含み、工程（ｉｖ）’が工程（ｉｉｉ）’’の固定試料に対して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素又はメチル化非感受性制限酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
メチル化感受性制限酵素がＨｐａＩＩである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素との組合せが、それぞれＨｐａＩＩとＭｓｐＩ、ＡｖａＩＩとＳｉｎＩ、又はＳａｕ３ＡＩとＭｂｏＩ若しくはＮｄｅＩＩのいずれかである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識が、酵素、ハプテン、フルオロフォア及び放射性物質からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉ）と（ｉｉ）との間又は工程（ｉ）’と（ｉｉ）’との間に、
（ａ）前処理した固定試料と、標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程；
をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）が、前処理した固定試料と、ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素及び標識された核酸分子を含有する溶液とを接触させる工程である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素がターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において、標識された核酸分子が標識された核酸プローブであり、固定試料中のＤＮＡと該核酸プローブとの二本鎖を形成させる条件下で接触が行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
２個以上の隣接組織固定試料をそれぞれ工程（ｉ）〜工程（ｖ）に供し、工程（ｖ）で検出された２個以上の隣接組織固定試料間の標識部位像を重ね合わせる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
２個の隣接組織固定試料の一方を請求項１に記載の方法に供して検出された標識部位像と、他方の隣接組織固定試料におけるＴＵＮＥＬ染色像とを重ね合わせて視覚化する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのアポトーシスとＤＮＡメチル化との関連性の検出方法。
【請求項１６】
ＤＮＡの３’末端に塩基を付加する酵素、ジデオキシヌクレオチド、第一の制限酵素、第一の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子、第二の制限酵素、第二の制限酵素切断部位を標識する標識された核酸分子を別々の容器に含む、ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＮＡのメチル化又は非メチル化部位の検出キット。
【請求項１７】
第一の制限酵素がメチル化感受性制限酵素であり、第二の制限酵素がメチル化非感受性制限酵素であるイソ制限酵素の組合せである、請求項１６に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−６８７７５（Ｐ２０１０−６８７７５Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４１６７９（Ｐ２００８−２４１６７９）
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年９月１７日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｒｉｎｇｅｒｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｍ５ｇ５５ｈ０８２３ｒ０５６ｈ／？ｐ＝０ｆ６５ｂｄ９ｅ０５３ａ４８ｆ６ｂ９ｄａｃ４５ｄ５８ｂ４２ｂ５１＆ｐｉ＝３を通じて発表
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１９日（２００８．９．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年９月１７日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｒｉｎｇｅｒｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｍ５ｇ５５ｈ０８２３ｒ０５６ｈ／？ｐ＝０ｆ６５ｂｄ９ｅ０５３ａ４８ｆ６ｂ９ｄａｃ４５ｄ５８ｂ４２ｂ５１＆ｐｉ＝３を通じて発表
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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