ＤＮＡ反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーおよびその製造方法（ＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｅｎｒｉｃｈｅｄｉｎＤＮＡｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａｒｉｎｇｔｈｅｒｅｏｆ）
【課題】 ＤＮＡ反復塩基配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーおよびその製造方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、哺乳動物の組織からゲノムＤＮＡを分離する段階と、超音波破砕して一定の大きさにＤＮＡを切断する段階、および加熱変成させた後再交雑させ、反応しない単一鎖部分を単一鎖に選択的な核酸分解酵素を利用して除去する段階で反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーおよびその製造方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、哺乳動物の組織からゲノムＤＮＡを分離する段階と、超音波破砕して一定の大きさにＤＮＡを切断する段階、および加熱変成させた後再交雑させ、反応しない単一鎖部分を単一鎖に選択的な核酸分解酵素を利用して除去する段階で反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーおよびその製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ反復塩基配列（ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選択濃縮したＤＮＡライブラリーおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＣＧＨ）は、ただ一つの遺伝子交雑反応によってＤＮＡ複製数（ｃｏｐｙ）の獲得と損失を確認することができる方法である。
多様なＤＮＡ交雑研究の例として、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、染色体彩色（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｎｔｉｎｇ）、ｃＤＮＡ−マイクロアレイ（ｃＤＮＡ−ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、マイクロアレイ−ＣＧＨまたは核酸プローブ（ｐｒｏｂｅ）を利用して組織、細胞または染色体上で特定ｍＲＮＡおよびＤＮＡを検出する蛍光インシトゥハイブリデーション法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
また、現在はマイクロアレイ技術と比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を結合させて有用性が向上したアレイ−ＣＧＨが開発されている。アレイ−ＣＧＨ方法は色々な病気のＤＮＡ複製数の異常を研究することに一般的に使用されている。
【０００３】
反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーは、多様なＤＮＡ交雑研究においてＤＮＡプローブ（ｐｒｏｂｅ）、例えば、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）、ＹＡＣｓおよび染色体彩色プローブなどの非特異的な反応を遮断することに使用される。
【０００４】
反復塩基配列は哺乳動物のＤＮＡのあちこちに分布しているため、プローブ（ｐｒｏｂｅ）と反復塩基配列の非特異的な反応は遺伝子の位置または発現程度を把握するのに差し支える。したがって、プローブ混合物に過剰の反復塩基配列を添加する過程を通じて、プローブが試料の反復塩基配列と結合されないように予め遮断する過程が必要である。この時に使用される反復塩基配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーは、配列が非常に多様なため人工的に作れないので、動物のゲノムＤＮＡから抽出して使用している。
【０００５】
このような反復塩基配列の遺伝子には、ハツカネズミ（ｍｏｕｓｅ）の場合、Ａｌｕ、Ｍｉｒ、ＬＩＮＥ、ＭＥＲ反復配列などがある。また、人間（hｕｍａｎ）の場合は、ＬＩＮＥ、Ａｌｕ反復配列がある。これら反復配列は人工的に合成して使用することができず、動物ゲノム遺伝子から選択的に抽出して使用しなければならない。
【０００６】
したがって、効率的に反復塩基配列を濃縮する方法および優れた作動性能を有する反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が目的とする技術的課題は、作動性能が優れた、ＤＮＡ反復配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーを提供することにある。
本発明が解決しようとする他の技術的課題は、効率的にＤＮＡ反復配列を選択濃縮するＤＮＡライブラリーの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は効率的にＤＮＡ反復配列を選択濃縮するＤＮＡライブラリーの製造方法を提供する。より詳しくは、本発明は動物細胞からゲノムＤＮＡを抽出する段階、超音波を用いて一定の大きさにＤＮＡを切断する段階、前記切断されたＤＮＡ鎖を変成させた後に再交雑させる段階、単一鎖に選択的な核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて前記再交雑されたＤＮＡ筋から単一鎖を選択的に分解する段階を含むことを特徴とする反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法を提供する。
また、本発明は、前記方法によって製造されたことを特徴とする、反復塩基配列が選択濃縮された、作動性能に優れたＤＮＡライブラリーを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によるＤＮＡ反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーはＤＮＡ交雑研究方法における非特異的な反応を効率的に遮断し、本発明によるＤＮＡライブラリーの製造方法は反復塩基配列を効率的に選択濃縮して、作動性能に優れた反復塩基配列を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１１】
ゲノムＤＮＡを抽出するための動物細胞として、全ての哺乳動物の細胞が用いられることができる。人の場合は他の組織より胎盤組織が好ましい。血液からもゲノムＤＮＡを抽出することができるが、十分な量（ｂｉｏｍａｓｓ）を得るのが困難である。
【００１２】
ＤＮＡ抽出は公知の方法によって行われる。ＤＮＡを大量抽出するための従来の方法としては、フェノールを使用する方法（米国特許３，８３８，１４８号）および陰イオン界面活性剤と高濃度の塩化ナトリウムを使用する方法（韓国特許第３５９７２号）などが提示されている。
【００１３】
前記フェノールを使用する方法は、フェノール／クロロホルム（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）またはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）を用いてＤＮＡを抽出する過程、エタノール（またはイソプロパノール）沈澱でＤＮＡを回収する過程、そして、汚染源をＤＮＡと分離する過程を経る。
【００１４】
前記エタノール（またはイソプロパノール）沈澱は、フェノール／クロロホルムによって抽出されたＤＮＡの液状溶液からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡから残余のフェノールとクロロホルムを除去する。
また、エタノール沈澱過程を通じて部分的にヌクレオシドトリホスフェート（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および３０個以下の塩基からなる短いオリゴヌクレオチドも除去することができる。
【００１５】
しかし、前記フェノール／クロロホルム抽出過程は、ＤＮＡを抽出することに多くの段階と時間を必要とし、人体に有害なフェノールとクロロホルムを使用しているため非常に危険である。
フェノールは皮膚に接すると焼けてしまうほど非常に危険であり、クロロホルムも揮発性、毒性、引火性が非常に高い。
このような危険なフェノールとクロロホルムを使用するためには、フード（ｈｏｏｄ）の中で実験しなければならないという短所もある。
また、フェノール／クロロホルム抽出過程を経れば、フェノールの酸化によってＤＮＡが大きく傷つけられるので、再蒸留した（ｒｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄ）フェノールだけを使用しなければならない。
【００１６】
したがって、前記フェノール／クロロホルム抽出過程とエタノール沈澱過程を通した伝統的なＤＮＡ分離過程よりさらに効果的且つ簡単であり、ＤＮＡ分離時間を最少化しようとする多様な方法が考案されてきた。
【００１７】
このような方法の例としては、従来のフェノール／クロロホルム処理および塩析する方法以外に、カオトロピック塩およびシリカ樹脂を使用する方法、親和性樹脂を使用する方法、イオン交換樹脂クロマトグラフィー法および磁気性ビードを使用する方法などがある（米国特許第５０５７４２６号、米国特許４９２３９７８号、ＥＰ第０５１２７６７Ａ１号、ＥＰ第０５１５４８４Ｂ号、ＷＯ第９７／１０３３１号、ＷＯ第９６／１８７３１号）。
【００１８】
最近はフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱方法の不便さを克服して利便性を図って、コラムを利用したキット（ｋｉｔｓ）がゲノムＤＮＡ抽出の基本になっている傾向にある。
【００１９】
このようなコラムを通じてゲノムＤＮＡを抽出する原理は、ＤＮＡと特異的に結合するガラス繊維（ｇｌａｓｓ ｆｉｂｅｒ）またはシリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用することで、水分子とＤＮＡの構造的相互作用（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の原理を利用することである。
このようなガラス繊維またはシリカ膜は、塩、蛋白質およびその他の細胞内物質とは結合しないため、窮極的にＤＮＡだけを純粋に分離することができる。
【００２０】
作動性能の優れた反復配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーを作るために、平均的に２００〜４００塩基対の大きさを有するように予め抽出されたゲノムＤＮＡを破砕する。
ＤＮＡの平均分子量が２００未満である場合には分子大きさが小さすぎるため非特異的な反応の遮断効果が低下するようになり、平均分子量が４００以上である場合には非反復的な配列も含まれることがあるため非特異的な反応の遮断効果がまた減少するようになる。
【００２１】
ゲノムＤＮＡの破砕方法としては酵素的処理、物理的処理があるが、超音波処理することが好ましい。
超音波は電気エネルギーを変換器（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）で縦方向の機械的振動に変化させるものであって、溶液中に浸漬すれば機械的振動を圧力波で伝達してキャビテーション現像（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）を引き起こす。
圧力波のサイクルが陰（−）である時に局所的な圧力低下によって気泡が形成され、この時形成された気泡は圧力波が陽（＋）である時に圧迫されてゆがむ。
この気泡の形成および破壊が繰り返されながら溶液中には激しい衝撃が発生するようになる。
酵素的処理の場合にはＤＮＡ大きさが一定に調節されることができないという短所があるが、超音波処理した場合には平均大きさを一定に調節することが容易である。
【００２２】
超音波処理によって一定の大きさに加工されたゲノムＤＮＡを加熱して変成させる。
加熱温度はＤＮＡが変成されて単一鎖になることができるように加熱すれば十分であるが、９５〜１００℃で加熱するのが反応時間を節約することができる。
【００２３】
前記変成されたゲノムＤＮＡは加熱冷却させて再交雑させる。
好ましくは、５５〜６５℃で５〜６時間反応させ、この過程で単一鎖に変成されたＤＮＡのうち、複製数（ｃｏｐｙ）が多い反復配列は再交雑されて二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ）になるが、単一複製（ｃｏｐｙ）遺伝子は再交雑されず、単一鎖そのままに残っているようになる。
この段階で単一複製遺伝子が二重鎖に交雑されないように反応温度および反応時間を調節することが必要である。
反応時間が延長されると単一複製遺伝子も二重鎖になることがあるため、反応時間が延長されないようにしなければならない。
【００２４】
再交雑されたＤＮＡにおいて単一複製遺伝子部分は単一鎖として存在しているため、Ｓ１核酸分解酵素（Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用して単一鎖のＤＮＡ配列を選択的に分解させる。
反応温度と反応時間は核酸分解酵素の製造者が推薦する説明書によって行うのが好ましい。
【００２５】
公知の方法によって蛋白質除去および精製過程を遂行する段階を追加的に含むことができる。この時、追加された蛋白質の除去および精製過程はクロマトグラフィー、沈澱および濾過などの方法を使用することができる。
【００２６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例１】
【００２７】
＜ハツカネズミゲノムからＤＮＡ反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーの製造＞
【００２８】
本発明によるＤＮＡライブラリーはハツカネズミ（ｍｏｕｓｅ）組織から抽出されることができ、その過程は以下の通りである。
【００２９】
１．ハツカネズミゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡ分離
【００３０】
１）ハツカネズミの組織５ｇに細胞溶解液２００ｍｌを添加し、組織を細かく切断して、表面積を広める（細胞溶解液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）１ｍｇ／ｍｌ）。
２）混合振盪器で５５℃状態で１２時間反応させる。
３）組織が完全に溶解されたことを確認し、ここに２００ｍｌのイソプロパノールを添加してゲノムＤＮＡを一次的に分離する。
４）一次分離されたＤＮＡをアルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）で洗浄して乾燥した後、ＴＥ緩衝溶液（ｐＨ８．０）５０ｍｌで溶かす。
５）溶かしたＤＮＡ液に同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を入れ、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して蛋白質を１次除去する。
６）上清液に再び同量のクロロホルムを添加し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してフェノールおよび蛋白質を追加的に除去させる。
７）上清液に同量のイソプロパノールを添加して精製されたゲノムＤＮＡを再び分離する。
【００３１】
２．反復配列ＤＮＡライブラリー抽出および精製
【００３２】
１）前記１段階の１−７過程で得られたゲノムＤＮＡをＴＥ溶液で溶かす。溶かした後、最終ＤＮＡ濃度が１．３μｇ／μｌ以上になるようにする。超音波破砕に入るＤＮＡの総絶対量をこの段階で予め計算しておく。
２）ＤＮＡ溶液を超音波破砕器（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕する。破砕されたゲノムＤＮＡの平均大きさは３００塩基対になるようにする（図２参照）。
３）超音波破砕したゲノムＤＮＡにＮａＣｌを最終濃度１Ｍになるように入れ、９０〜１００℃で７〜１２分間加熱する。
４）加熱後直ちに５５〜６５℃で５〜６時間反応させる。
５）ここに同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上反応させる。
６）遠心分離して沈殿させる（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
７）７０％アルコールで洗浄する。
８）乾燥された沈殿物を蒸溜水で溶かす。
９）ここに（１０Ｘ）Ｓ１核酸分解酵素緩衝溶液を最終体積の１／１０になるように添加する。
１０）Ｓ１核酸分解酵素をＤＮＡ１μｇ当り（２−１過程で計算された総量に対して）１単位入るように計算して入れる。
１１）２３℃（室温）で３０分間反応させる。
１２）反応液のＤＮＡ濃度検査を実施する。
この段階で、最初計算された量の３０〜３５％程度が残れば、適切なＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを得ることになる。
それ以上のＤＮＡが残っていれば、これは単一鎖として残っている非反復配列がＳ１核酸分解酵素によって完全に除去されなかったという証拠である。
１３）超音波破砕直後、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理前、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理後の試料をそれぞれ電気泳動して、再交雑過程がうまく行われたか、Ｓ１核酸分解酵素処理がうまく行われたか検証し、その結果を図２に示した。
図２のレーン１でＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡとして約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっているものを確認することができ、レーン２では２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素で処理する前の状態で再交雑によってＤＮＡの大きさが増加したものが上に引かれるように見えることを確認することができる。
レーン３では２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態で約３００ｂｐ大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したことを確認することができる。
１４）同量のフェノール−クロロホルムとクロロホルムでそれぞれ処理してＳ１核酸分解酵素および蛋白質を最終除去した。
１５）ここに３モルＮａＯＡｃを最終体積の１／１０になるように入れ、同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上恒温反応させた。
１６）遠心分離して沈殿させた（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
１７）７０％アルコールで洗浄した。
１８）滅菌ＴＥ溶液（ＴＥ＋アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ））に溶かし、ＤＮＡ量を測定して、１μｇ／μｌで濃度を合わせる。
１９）１００℃で１０分間処理後、直ちに冷却させて冷凍保管する。
２０）ＤＮＡ交雑研究方法中、定量的分析の可能なアレイ比較遺伝子再交雑反応に製造したＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを適用して、非特異反応遮断の可否を最終確認した（図３参照）。
図３は本発明によって製造されたＤＮＡライブラリーを用いてハツカネズミの（ｍｏｕｓｅ）アレイ−ＣＧＨした結果、正常の雄（ｍａｌｅ）と雌（ｆｅｍａｌｅ）の遺伝子を交雑すれば、雄（ｍａｌｅ）でＸ染色体が雌（ｆｅｍａｌｅ）より１複製少なくあることが正確に見えている。
【実施例２】
【００３３】
＜人間ゲノムからＤＮＡ反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーの製造＞
【００３４】
１．人間ゲノムＤＮＡ分離
【００３５】
１）胎盤組織５ｇに細胞溶解液２００ｍｌを添加し、組織を細かく切断して表面積を広める（細胞溶解液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、蛋白質分解酵素Ｋ １ｍｇ／ｍｌ）。
２）混合振盪器で５５℃状態で１２時間反応させる。
３）組織が完全に溶解されたことを確認し、ここに２００ｍｌのイソプロパノールを添加してゲノムＤＮＡを一次的に分離する。
４）一次分離されたＤＮＡをアルコールで洗浄して乾燥した後、ＴＥ緩衝溶液（ｐＨ８．０）５０ｍｌで溶かす。
５）溶かしたＤＮＡ液に同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を入れ、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して蛋白質を１次除去する。
６）上清液に再び同量のクロロホルムを添加し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してフェノールおよび蛋白質を追加的に除去する。
７）上清液に同量のイソプロパノールを添加して、精製されたゲノムＤＮＡを再び分離する。
【００３６】
２．反復配列ＤＮＡライブラリー抽出および精製
【００３７】
１）前記１段階の１−７過程で得られたゲノムＤＮＡをＴＥ溶液で溶かす。溶かした後、最終ＤＮＡ濃度が１．３ｕｇ／ｕｌ以上になるようにする。超音波破砕に入るＤＮＡの総絶対量をこの段階で予め計算しておく。
２）ＤＮＡ溶液を超音波破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して破砕する。破砕されたゲノムＤＮＡの平均大きさは３００塩基対になるようにする（図４参照）。
３）超音波破砕したゲノムＤＮＡにＮａＣｌを最終濃度が１モルになるように入れ、９０〜１００℃で７〜１２分間加熱する。
４）加熱後直ちに５５〜６５℃で５〜６時間反応させる。
５）ここに同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上反応させる。
６）遠心分離して沈殿させる（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
７）７０％アルコールで洗浄する。
８）乾燥された沈殿物を蒸溜水で溶かす。
９）ここに（１０Ｘ）Ｓ１核酸分解酵素緩衝溶液を最終体積の１／１０になるように添加する。
１０）Ｓ１核酸分解酵素をＤＮＡ１μｇ当り（２−１過程で計算された総量に対して）１単位入るように計算して入れる。
１１）２３℃（室温）で３０分間反応させる。
１２）反応液のＤＮＡ濃度を測定する。この段階で、最初計算された量の３０−３５％程度が残れば、適切にＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを得るようになる。
それ以上ＤＮＡが残っていれば、これは単一鎖として残っている非反復配列がＳ１核酸分解酵素によって完全に除去されなかったという証拠である。
１３）超音波破砕直後、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理前、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理後の試料をそれぞれ電気泳動して、再交雑過程がうまく行われたか、Ｓ１核酸分解酵素処理がうまく行われたか検証し、その結果を図５に示した。
図５のレーン１でＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡとして約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっていることを確認することができ、レーン２では２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素で処理する前の状態で再交雑によってＤＮＡの大きさが増加したものが上に引かれることを確認することができる。
レーン３では２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態で約３００ｂｐ大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したことを確認することができる。
１４）同量のフェノール−クロロホルムとクロロホルムでそれぞれ処理してＳ１核酸分解酵素および蛋白質を最終除去した。
１５）ここに３モルＮａＯＡｃを最終体積の１／１０になるように入れ、同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上恒温反応させた。
１６）遠心分離して沈殿させた（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
１７）７０％アルコールで洗浄した。
１８）滅菌ＴＥ溶液（ＴＥ＋アジ化ナトリウム）に溶かし、ＤＮＡ量を測定して、１μｇ／μｌで濃度を合わせる。
１９）１００℃で１０分間処理後、直ちに冷却させて冷凍保管する。
２０）ＤＮＡ交雑研究方法中、定量的分析の可能なアレイ比較遺伝子再交雑反応に製造したＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを適用して、非特異反応遮断の可否を最終確認した（図６参照）。
図６は本発明によって製造されたＤＮＡライブラリーを用いてアレイ−ＣＧＨした結果であって、図６を見てみると、正常の男性（ｍａｌｅ）と女性（ｆｅｍａｌｅ）の遺伝子を交雑すれば、女性（ｆｅｍａｌｅ）でＸ染色体が男性（ｍａｌｅ）より１複製数（ｃｏｐｙ）がもっとあることが正確に見えている。
また、Ｙ染色体は欠如していることも明確に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ハツカネズミのゲノムＤＮＡを超音波破砕して、平均大きさが約２００〜３００塩基対になる切片に作った写真である。
【図２】レーン１はＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡであって、約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっているものを示す。 レーン２は２−４過程後、Ｓ１核酸分解酵素で処理する前の状態であって、再交雑によってＤＮＡ大きさが増加して上に引かれるものを示し、レーン３は２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態であって、約３００塩基対大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したものを示す。
【図３】本発明によって製造された反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーを用いたマウスアレイＣＧＨ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の結果を示す。
【図４】人間ゲノムＤＮＡを超音波破砕して、平均大きさが約３００塩基対になる切片に作った写真である。
【図５】レーン１はＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程後、Ｓ１核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）処理する前の状態であって、再交雑によってＤＮＡ大きさが増加したものが上に引かれるように見えるものを示す。 レーン２は２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡであって、約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっているものを示し、レーン３は２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態であって、約３００ｂｐ大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したものを示す。
【図６】本発明によって製造された反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーを用いたマウスアレイＣＧＨの結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ反復塩基配列（ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を選択濃縮したＤＮＡライブラリーおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＣＧＨ）は、ただ一つの遺伝子交雑反応によってＤＮＡ複製数（ｃｏｐｙ）の獲得と損失を確認することができる方法である。
多様なＤＮＡ交雑研究の例として、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、染色体彩色（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｎｔｉｎｇ）、ｃＤＮＡ−マイクロアレイ（ｃＤＮＡ−ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）、マイクロアレイ−ＣＧＨまたは核酸プローブ（ｐｒｏｂｅ）を利用して組織、細胞または染色体上で特定ｍＲＮＡおよびＤＮＡを検出する蛍光インシトゥハイブリデーション法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）などが挙げられる。
また、現在はマイクロアレイ技術と比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を結合させて有用性が向上したアレイ−ＣＧＨが開発されている。アレイ−ＣＧＨ方法は色々な病気のＤＮＡ複製数の異常を研究することに一般的に使用されている。
【０００３】
反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーは、多様なＤＮＡ交雑研究においてＤＮＡプローブ（ｐｒｏｂｅ）、例えば、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）、ＹＡＣｓおよび染色体彩色プローブなどの非特異的な反応を遮断することに使用される。
【０００４】
反復塩基配列は哺乳動物のＤＮＡのあちこちに分布しているため、プローブ（ｐｒｏｂｅ）と反復塩基配列の非特異的な反応は遺伝子の位置または発現程度を把握するのに差し支える。したがって、プローブ混合物に過剰の反復塩基配列を添加する過程を通じて、プローブが試料の反復塩基配列と結合されないように予め遮断する過程が必要である。この時に使用される反復塩基配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーは、配列が非常に多様なため人工的に作れないので、動物のゲノムＤＮＡから抽出して使用している。
【０００５】
このような反復塩基配列の遺伝子には、ハツカネズミ（ｍｏｕｓｅ）の場合、Ａｌｕ、Ｍｉｒ、ＬＩＮＥ、ＭＥＲ反復配列などがある。また、人間（hｕｍａｎ）の場合は、ＬＩＮＥ、Ａｌｕ反復配列がある。これら反復配列は人工的に合成して使用することができず、動物ゲノム遺伝子から選択的に抽出して使用しなければならない。
【０００６】
したがって、効率的に反復塩基配列を濃縮する方法および優れた作動性能を有する反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が目的とする技術的課題は、作動性能が優れた、ＤＮＡ反復配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーを提供することにある。
本発明が解決しようとする他の技術的課題は、効率的にＤＮＡ反復配列を選択濃縮するＤＮＡライブラリーの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は効率的にＤＮＡ反復配列を選択濃縮するＤＮＡライブラリーの製造方法を提供する。より詳しくは、本発明は動物細胞からゲノムＤＮＡを抽出する段階、超音波を用いて一定の大きさにＤＮＡを切断する段階、前記切断されたＤＮＡ鎖を変成させた後に再交雑させる段階、単一鎖に選択的な核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて前記再交雑されたＤＮＡ筋から単一鎖を選択的に分解する段階を含むことを特徴とする反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法を提供する。
また、本発明は、前記方法によって製造されたことを特徴とする、反復塩基配列が選択濃縮された、作動性能に優れたＤＮＡライブラリーを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によるＤＮＡ反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーはＤＮＡ交雑研究方法における非特異的な反応を効率的に遮断し、本発明によるＤＮＡライブラリーの製造方法は反復塩基配列を効率的に選択濃縮して、作動性能に優れた反復塩基配列を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１１】
ゲノムＤＮＡを抽出するための動物細胞として、全ての哺乳動物の細胞が用いられることができる。人の場合は他の組織より胎盤組織が好ましい。血液からもゲノムＤＮＡを抽出することができるが、十分な量（ｂｉｏｍａｓｓ）を得るのが困難である。
【００１２】
ＤＮＡ抽出は公知の方法によって行われる。ＤＮＡを大量抽出するための従来の方法としては、フェノールを使用する方法（米国特許３，８３８，１４８号）および陰イオン界面活性剤と高濃度の塩化ナトリウムを使用する方法（韓国特許第３５９７２号）などが提示されている。
【００１３】
前記フェノールを使用する方法は、フェノール／クロロホルム（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）またはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）を用いてＤＮＡを抽出する過程、エタノール（またはイソプロパノール）沈澱でＤＮＡを回収する過程、そして、汚染源をＤＮＡと分離する過程を経る。
【００１４】
前記エタノール（またはイソプロパノール）沈澱は、フェノール／クロロホルムによって抽出されたＤＮＡの液状溶液からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡから残余のフェノールとクロロホルムを除去する。
また、エタノール沈澱過程を通じて部分的にヌクレオシドトリホスフェート（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および３０個以下の塩基からなる短いオリゴヌクレオチドも除去することができる。
【００１５】
しかし、前記フェノール／クロロホルム抽出過程は、ＤＮＡを抽出することに多くの段階と時間を必要とし、人体に有害なフェノールとクロロホルムを使用しているため非常に危険である。
フェノールは皮膚に接すると焼けてしまうほど非常に危険であり、クロロホルムも揮発性、毒性、引火性が非常に高い。
このような危険なフェノールとクロロホルムを使用するためには、フード（ｈｏｏｄ）の中で実験しなければならないという短所もある。
また、フェノール／クロロホルム抽出過程を経れば、フェノールの酸化によってＤＮＡが大きく傷つけられるので、再蒸留した（ｒｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄ）フェノールだけを使用しなければならない。
【００１６】
したがって、前記フェノール／クロロホルム抽出過程とエタノール沈澱過程を通した伝統的なＤＮＡ分離過程よりさらに効果的且つ簡単であり、ＤＮＡ分離時間を最少化しようとする多様な方法が考案されてきた。
【００１７】
このような方法の例としては、従来のフェノール／クロロホルム処理および塩析する方法以外に、カオトロピック塩およびシリカ樹脂を使用する方法、親和性樹脂を使用する方法、イオン交換樹脂クロマトグラフィー法および磁気性ビードを使用する方法などがある（米国特許第５０５７４２６号、米国特許４９２３９７８号、ＥＰ第０５１２７６７Ａ１号、ＥＰ第０５１５４８４Ｂ号、ＷＯ第９７／１０３３１号、ＷＯ第９６／１８７３１号）。
【００１８】
最近はフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱方法の不便さを克服して利便性を図って、コラムを利用したキット（ｋｉｔｓ）がゲノムＤＮＡ抽出の基本になっている傾向にある。
【００１９】
このようなコラムを通じてゲノムＤＮＡを抽出する原理は、ＤＮＡと特異的に結合するガラス繊維（ｇｌａｓｓ ｆｉｂｅｒ）またはシリカ膜（ｓｉｌｉｃａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用することで、水分子とＤＮＡの構造的相互作用（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の原理を利用することである。
このようなガラス繊維またはシリカ膜は、塩、蛋白質およびその他の細胞内物質とは結合しないため、窮極的にＤＮＡだけを純粋に分離することができる。
【００２０】
作動性能の優れた反復配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーを作るために、平均的に２００〜４００塩基対の大きさを有するように予め抽出されたゲノムＤＮＡを破砕する。
ＤＮＡの平均分子量が２００未満である場合には分子大きさが小さすぎるため非特異的な反応の遮断効果が低下するようになり、平均分子量が４００以上である場合には非反復的な配列も含まれることがあるため非特異的な反応の遮断効果がまた減少するようになる。
【００２１】
ゲノムＤＮＡの破砕方法としては酵素的処理、物理的処理があるが、超音波処理することが好ましい。
超音波は電気エネルギーを変換器（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）で縦方向の機械的振動に変化させるものであって、溶液中に浸漬すれば機械的振動を圧力波で伝達してキャビテーション現像（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）を引き起こす。
圧力波のサイクルが陰（−）である時に局所的な圧力低下によって気泡が形成され、この時形成された気泡は圧力波が陽（＋）である時に圧迫されてゆがむ。
この気泡の形成および破壊が繰り返されながら溶液中には激しい衝撃が発生するようになる。
酵素的処理の場合にはＤＮＡ大きさが一定に調節されることができないという短所があるが、超音波処理した場合には平均大きさを一定に調節することが容易である。
【００２２】
超音波処理によって一定の大きさに加工されたゲノムＤＮＡを加熱して変成させる。
加熱温度はＤＮＡが変成されて単一鎖になることができるように加熱すれば十分であるが、９５〜１００℃で加熱するのが反応時間を節約することができる。
【００２３】
前記変成されたゲノムＤＮＡは加熱冷却させて再交雑させる。
好ましくは、５５〜６５℃で５〜６時間反応させ、この過程で単一鎖に変成されたＤＮＡのうち、複製数（ｃｏｐｙ）が多い反復配列は再交雑されて二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ）になるが、単一複製（ｃｏｐｙ）遺伝子は再交雑されず、単一鎖そのままに残っているようになる。
この段階で単一複製遺伝子が二重鎖に交雑されないように反応温度および反応時間を調節することが必要である。
反応時間が延長されると単一複製遺伝子も二重鎖になることがあるため、反応時間が延長されないようにしなければならない。
【００２４】
再交雑されたＤＮＡにおいて単一複製遺伝子部分は単一鎖として存在しているため、Ｓ１核酸分解酵素（Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用して単一鎖のＤＮＡ配列を選択的に分解させる。
反応温度と反応時間は核酸分解酵素の製造者が推薦する説明書によって行うのが好ましい。
【００２５】
公知の方法によって蛋白質除去および精製過程を遂行する段階を追加的に含むことができる。この時、追加された蛋白質の除去および精製過程はクロマトグラフィー、沈澱および濾過などの方法を使用することができる。
【００２６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例１】
【００２７】
＜ハツカネズミゲノムからＤＮＡ反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーの製造＞
【００２８】
本発明によるＤＮＡライブラリーはハツカネズミ（ｍｏｕｓｅ）組織から抽出されることができ、その過程は以下の通りである。
【００２９】
１．ハツカネズミゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡ分離
【００３０】
１）ハツカネズミの組織５ｇに細胞溶解液２００ｍｌを添加し、組織を細かく切断して、表面積を広める（細胞溶解液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）１ｍｇ／ｍｌ）。
２）混合振盪器で５５℃状態で１２時間反応させる。
３）組織が完全に溶解されたことを確認し、ここに２００ｍｌのイソプロパノールを添加してゲノムＤＮＡを一次的に分離する。
４）一次分離されたＤＮＡをアルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）で洗浄して乾燥した後、ＴＥ緩衝溶液（ｐＨ８．０）５０ｍｌで溶かす。
５）溶かしたＤＮＡ液に同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を入れ、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して蛋白質を１次除去する。
６）上清液に再び同量のクロロホルムを添加し、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してフェノールおよび蛋白質を追加的に除去させる。
７）上清液に同量のイソプロパノールを添加して精製されたゲノムＤＮＡを再び分離する。
【００３１】
２．反復配列ＤＮＡライブラリー抽出および精製
【００３２】
１）前記１段階の１−７過程で得られたゲノムＤＮＡをＴＥ溶液で溶かす。溶かした後、最終ＤＮＡ濃度が１．３μｇ／μｌ以上になるようにする。超音波破砕に入るＤＮＡの総絶対量をこの段階で予め計算しておく。
２）ＤＮＡ溶液を超音波破砕器（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕する。破砕されたゲノムＤＮＡの平均大きさは３００塩基対になるようにする（図２参照）。
３）超音波破砕したゲノムＤＮＡにＮａＣｌを最終濃度１Ｍになるように入れ、９０〜１００℃で７〜１２分間加熱する。
４）加熱後直ちに５５〜６５℃で５〜６時間反応させる。
５）ここに同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上反応させる。
６）遠心分離して沈殿させる（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
７）７０％アルコールで洗浄する。
８）乾燥された沈殿物を蒸溜水で溶かす。
９）ここに（１０Ｘ）Ｓ１核酸分解酵素緩衝溶液を最終体積の１／１０になるように添加する。
１０）Ｓ１核酸分解酵素をＤＮＡ１μｇ当り（２−１過程で計算された総量に対して）１単位入るように計算して入れる。
１１）２３℃（室温）で３０分間反応させる。
１２）反応液のＤＮＡ濃度検査を実施する。
この段階で、最初計算された量の３０〜３５％程度が残れば、適切なＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを得ることになる。
それ以上のＤＮＡが残っていれば、これは単一鎖として残っている非反復配列がＳ１核酸分解酵素によって完全に除去されなかったという証拠である。
１３）超音波破砕直後、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理前、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理後の試料をそれぞれ電気泳動して、再交雑過程がうまく行われたか、Ｓ１核酸分解酵素処理がうまく行われたか検証し、その結果を図２に示した。
図２のレーン１でＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡとして約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっているものを確認することができ、レーン２では２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素で処理する前の状態で再交雑によってＤＮＡの大きさが増加したものが上に引かれるように見えることを確認することができる。
レーン３では２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態で約３００ｂｐ大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したことを確認することができる。
１４）同量のフェノール−クロロホルムとクロロホルムでそれぞれ処理してＳ１核酸分解酵素および蛋白質を最終除去した。
１５）ここに３モルＮａＯＡｃを最終体積の１／１０になるように入れ、同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上恒温反応させた。
１６）遠心分離して沈殿させた（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
１７）７０％アルコールで洗浄した。
１８）滅菌ＴＥ溶液（ＴＥ＋アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ））に溶かし、ＤＮＡ量を測定して、１μｇ／μｌで濃度を合わせる。
１９）１００℃で１０分間処理後、直ちに冷却させて冷凍保管する。
２０）ＤＮＡ交雑研究方法中、定量的分析の可能なアレイ比較遺伝子再交雑反応に製造したＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを適用して、非特異反応遮断の可否を最終確認した（図３参照）。
図３は本発明によって製造されたＤＮＡライブラリーを用いてハツカネズミの（ｍｏｕｓｅ）アレイ−ＣＧＨした結果、正常の雄（ｍａｌｅ）と雌（ｆｅｍａｌｅ）の遺伝子を交雑すれば、雄（ｍａｌｅ）でＸ染色体が雌（ｆｅｍａｌｅ）より１複製少なくあることが正確に見えている。
【実施例２】
【００３３】
＜人間ゲノムからＤＮＡ反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーの製造＞
【００３４】
１．人間ゲノムＤＮＡ分離
【００３５】
１）胎盤組織５ｇに細胞溶解液２００ｍｌを添加し、組織を細かく切断して表面積を広める（細胞溶解液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ、蛋白質分解酵素Ｋ １ｍｇ／ｍｌ）。
２）混合振盪器で５５℃状態で１２時間反応させる。
３）組織が完全に溶解されたことを確認し、ここに２００ｍｌのイソプロパノールを添加してゲノムＤＮＡを一次的に分離する。
４）一次分離されたＤＮＡをアルコールで洗浄して乾燥した後、ＴＥ緩衝溶液（ｐＨ８．０）５０ｍｌで溶かす。
５）溶かしたＤＮＡ液に同量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を入れ、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して蛋白質を１次除去する。
６）上清液に再び同量のクロロホルムを添加し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してフェノールおよび蛋白質を追加的に除去する。
７）上清液に同量のイソプロパノールを添加して、精製されたゲノムＤＮＡを再び分離する。
【００３６】
２．反復配列ＤＮＡライブラリー抽出および精製
【００３７】
１）前記１段階の１−７過程で得られたゲノムＤＮＡをＴＥ溶液で溶かす。溶かした後、最終ＤＮＡ濃度が１．３ｕｇ／ｕｌ以上になるようにする。超音波破砕に入るＤＮＡの総絶対量をこの段階で予め計算しておく。
２）ＤＮＡ溶液を超音波破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して破砕する。破砕されたゲノムＤＮＡの平均大きさは３００塩基対になるようにする（図４参照）。
３）超音波破砕したゲノムＤＮＡにＮａＣｌを最終濃度が１モルになるように入れ、９０〜１００℃で７〜１２分間加熱する。
４）加熱後直ちに５５〜６５℃で５〜６時間反応させる。
５）ここに同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上反応させる。
６）遠心分離して沈殿させる（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
７）７０％アルコールで洗浄する。
８）乾燥された沈殿物を蒸溜水で溶かす。
９）ここに（１０Ｘ）Ｓ１核酸分解酵素緩衝溶液を最終体積の１／１０になるように添加する。
１０）Ｓ１核酸分解酵素をＤＮＡ１μｇ当り（２−１過程で計算された総量に対して）１単位入るように計算して入れる。
１１）２３℃（室温）で３０分間反応させる。
１２）反応液のＤＮＡ濃度を測定する。この段階で、最初計算された量の３０−３５％程度が残れば、適切にＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを得るようになる。
それ以上ＤＮＡが残っていれば、これは単一鎖として残っている非反復配列がＳ１核酸分解酵素によって完全に除去されなかったという証拠である。
１３）超音波破砕直後、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理前、２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素処理後の試料をそれぞれ電気泳動して、再交雑過程がうまく行われたか、Ｓ１核酸分解酵素処理がうまく行われたか検証し、その結果を図５に示した。
図５のレーン１でＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡとして約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっていることを確認することができ、レーン２では２−４過程後Ｓ１核酸分解酵素で処理する前の状態で再交雑によってＤＮＡの大きさが増加したものが上に引かれることを確認することができる。
レーン３では２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態で約３００ｂｐ大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したことを確認することができる。
１４）同量のフェノール−クロロホルムとクロロホルムでそれぞれ処理してＳ１核酸分解酵素および蛋白質を最終除去した。
１５）ここに３モルＮａＯＡｃを最終体積の１／１０になるように入れ、同量のイソプロパノールを入れた後、−２０℃で１時間以上恒温反応させた。
１６）遠心分離して沈殿させた（１４，０００ｒｐｍ、１０分）。
１７）７０％アルコールで洗浄した。
１８）滅菌ＴＥ溶液（ＴＥ＋アジ化ナトリウム）に溶かし、ＤＮＡ量を測定して、１μｇ／μｌで濃度を合わせる。
１９）１００℃で１０分間処理後、直ちに冷却させて冷凍保管する。
２０）ＤＮＡ交雑研究方法中、定量的分析の可能なアレイ比較遺伝子再交雑反応に製造したＤＮＡ反復配列が選択的に濃縮されたＤＮＡライブラリーを適用して、非特異反応遮断の可否を最終確認した（図６参照）。
図６は本発明によって製造されたＤＮＡライブラリーを用いてアレイ−ＣＧＨした結果であって、図６を見てみると、正常の男性（ｍａｌｅ）と女性（ｆｅｍａｌｅ）の遺伝子を交雑すれば、女性（ｆｅｍａｌｅ）でＸ染色体が男性（ｍａｌｅ）より１複製数（ｃｏｐｙ）がもっとあることが正確に見えている。
また、Ｙ染色体は欠如していることも明確に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ハツカネズミのゲノムＤＮＡを超音波破砕して、平均大きさが約２００〜３００塩基対になる切片に作った写真である。
【図２】レーン１はＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡであって、約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっているものを示す。 レーン２は２−４過程後、Ｓ１核酸分解酵素で処理する前の状態であって、再交雑によってＤＮＡ大きさが増加して上に引かれるものを示し、レーン３は２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態であって、約３００塩基対大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したものを示す。
【図３】本発明によって製造された反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーを用いたマウスアレイＣＧＨ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の結果を示す。
【図４】人間ゲノムＤＮＡを超音波破砕して、平均大きさが約３００塩基対になる切片に作った写真である。
【図５】レーン１はＤＮＡ抽出および精製過程の２−４過程後、Ｓ１核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）処理する前の状態であって、再交雑によってＤＮＡ大きさが増加したものが上に引かれるように見えるものを示す。 レーン２は２−４過程前の超音波処理されたＤＮＡであって、約３００塩基対大きさのＤＮＡが集まっているものを示し、レーン３は２−４過程とＳ１核酸分解酵素処理を全て終えた状態であって、約３００ｂｐ大きさのＤＮＡが回収されているが、反復配列でない単一鎖はＳ１核酸分解酵素によって全て除去されたので、ＤＮＡ量は最初の約３分の１に減少したものを示す。
【図６】本発明によって製造された反復配列を選択濃縮したＤＮＡライブラリーを用いたマウスアレイＣＧＨの結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞からゲノムＤＮＡを抽出する段階と、
超音波を用いて平均２００〜４００ｂｐの大きさにＤＮＡを切断する段階と、
前記切断されたＤＮＡ鎖を変成させた後、再交雑させる段階と、
核酸分解酵素を用いて、前記再交雑されたＤＮＡ筋から単一鎖を選択的に分解する段階と、を含むことを特徴とする、
反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項２】
前記切断されたＤＮＡ鎖の変成は９５〜１００℃で７〜１０分間加熱させ、前記再交雑反応は５５〜６５℃で５〜６時間冷却反応させることを特徴とする、請求項１に記載の反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項３】
前記動物細胞は、ハツカネズミの細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項４】
前記動物細胞は、人間の細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のうちのいずれか一項の製造方法によって製造された反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリー。
【請求項１】
動物細胞からゲノムＤＮＡを抽出する段階と、
超音波を用いて平均２００〜４００ｂｐの大きさにＤＮＡを切断する段階と、
前記切断されたＤＮＡ鎖を変成させた後、再交雑させる段階と、
核酸分解酵素を用いて、前記再交雑されたＤＮＡ筋から単一鎖を選択的に分解する段階と、を含むことを特徴とする、
反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項２】
前記切断されたＤＮＡ鎖の変成は９５〜１００℃で７〜１０分間加熱させ、前記再交雑反応は５５〜６５℃で５〜６時間冷却反応させることを特徴とする、請求項１に記載の反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項３】
前記動物細胞は、ハツカネズミの細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項４】
前記動物細胞は、人間の細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項５】
請求項１乃至請求項４のうちのいずれか一項の製造方法によって製造された反復塩基配列が選択濃縮されたＤＮＡライブラリー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−１９５４４１（Ｐ２００７−１９５４４１Ａ）
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６８２５（Ｐ２００６−１６８２５）
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【出願人】（５０６０２８０９６）カソリック ユニバーシティー インダストリー アカデミー コオペレーション ファウンデーション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＴＨＯＬＩＣ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＡＣＡＤＥＭＹ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】５０５ Ｂａｎｐｏ−Ｄｏｎｇ， Ｓｅｏｃｈｏ−Ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２５日（２００６．１．２５）
【出願人】（５０６０２８０９６）カソリック ユニバーシティー インダストリー アカデミー コオペレーション ファウンデーション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＴＨＯＬＩＣ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＡＣＡＤＥＭＹ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】５０５ Ｂａｎｐｏ−Ｄｏｎｇ， Ｓｅｏｃｈｏ−Ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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