ＤＮＡ塩基配列解析装置およびＤＮＡ塩基配列解析方法
【課題】従来技術より長い塩基長のＤＮＡ塩基配列を解析することができるＤＮＡ塩基配列解析方法およびＤＮＡ塩基配列解析装置を提供する。
【解決手段】ゲート絶縁膜１５を有した電界効果デバイス２と、ＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡをハイブリダイズし、前記ゲート絶縁膜１５上で、酵素および基質を導入し、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置１において、前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子８と前記磁性粒子８を前記ゲート絶縁膜１５に引き寄せる磁石４とを備えたＤＮＡ塩基配列解析装置１。
【解決手段】ゲート絶縁膜１５を有した電界効果デバイス２と、ＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡをハイブリダイズし、前記ゲート絶縁膜１５上で、酵素および基質を導入し、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置１において、前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子８と前記磁性粒子８を前記ゲート絶縁膜１５に引き寄せる磁石４とを備えたＤＮＡ塩基配列解析装置１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ塩基解析装置およびＤＮＡ塩基配列解析方法に関し、特に電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの全塩基配列解読が終了し、他の生物のゲノム塩基配列解読が急速に進展する中、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。これらのゲノム塩基配列情報をもとに、遺伝子機能解析が分子生物学,薬物遺伝学,臨床研究の新規分野で著しい進歩をみせている。
【０００３】
これらの新規分野発展の基礎となっているのが、塩基配列情報に加えて遺伝子の機能情報である。遺伝子機能解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる装置として、電気泳動システム、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップとＤＮＡマイクロアレイを総称して「ＤＮＡマイクロアレイ」という。）などが開発されている。
【０００４】
しかし、現状の電気泳動システムやＤＮＡマイクロアレイの多くは蛍光検出を基本原理としているので、試料を蛍光標識でラベルする必要があり、レーザや複雑な光学系が必要となり、装置が大型化する。
【０００５】
これらの問題を解決する装置として、酸化・還元標識と組み合わせた電流検出方式のＤＮＡマイクロアレイや、パイロシーケンシングなどが開発されてきたが、いずれも検出精度や検出速度の課題がある。
【０００６】
また、電界効果デバイスのゲート絶縁層表面にターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブを固定し、当該ＤＮＡプローブの伸長反応に伴ったゲート絶縁層上の電荷密度の変化をしきい値電圧の変化として直接検出することで、ＤＮＡ塩基配列解析を行う試みも開示されている（例えば特許文献１）。
【０００７】
上記した電界効果デバイス方式では、ゲート絶縁膜としてＳｉＯ２層、その上層に保護膜であるＳｉ３Ｎ４を成膜した二層構造のゲート絶縁層を用いている。このゲート絶縁層にＤＮＡプローブを固定し、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡポリメラーゼと一種類の塩基のｄＮＴＰを含む溶液を導入し伸長反応させる。ここで、Ｎはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）のいずれかである。ｄＮＴＰ分子は1個のリン酸基を有し、水溶液中では負電荷を有している。そのため、ｄＮＴＰ分子がＤＮＡプローブ分子の伸長鎖に取り込まれると、電界効果デバイス表面の電荷密度が変化する。この電荷密度の変化はしきい値電圧の変化として検出することができる。そのため、しきい値電圧の変化量から、ｄＮＴＰの取り込み量を計測することができる。以上のｄＮＴＰの取り込み反応プロセスを、塩基の種類を例えばＡ→Ｃ→Ｇ→Ｔのように順次変えて段階的に繰り返すことによって、ターゲットＤＮＡ分子の塩基配列を解析することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０２２３７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記従来技術のうち電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析方法は、システムを容易に小型化できる簡便な方法である。しかし、ターゲットＤＮＡがハイブリダイズしたＤＮＡプローブの伸長反応に伴う電荷密度変化のしきい値電圧に及ぼす影響は、センサ表面からの距離の増加と共に減少する。つまり、ターゲットＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡプローブの伸長反応が進み、伸長反応部位がセンサ表面から遠ざかっていくほど、一塩基の伸長反応当たりのしきい値電圧変化量は小さくなり、伸長反応を検出することが困難となる。上記ＤＮＡ塩基配列解析方法で実際に読み取り可能な塩基長は１０塩基程度であるため、実用的ではないという問題があった。
【００１０】
そこで、本発明は、上記課題を解決するため、従来技術より長い塩基長のＤＮＡ塩基配列を容易に解析することができるＤＮＡ塩基配列解析装置およびＤＮＡ塩基配列解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の請求項１に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、前記磁性粒子を前記ゲート絶縁膜に引き寄せる磁石とを備えたことを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項２に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記ターゲットＤＮＡの両端が、前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブにそれぞれハイブリダイズされていることを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項３に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項４に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記ガイド部が、前記チャネルに対応した前記ゲート絶縁膜の周囲に立設された支柱であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項５に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項６に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記磁石が、前記ゲート絶縁膜に一体的に形成された磁性膜で構成されていることを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項７に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスと、前記電界効果デバイスと別体に設けられ、前記ゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部とを備え、前記測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、前記磁性粒子を前記測定部に引き寄せる磁石とを備えたことを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項８に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記測定部上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項９に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、前記ＤＮＡプローブを固定する、自重で前記ゲート絶縁膜上に沈殿する粒子を備えたことを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項１０に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記ゲート絶縁膜上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項１１に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブに、前記ターゲットＤＮＡの両端をそれぞれハイブリダイズするステップを含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明の請求項１２に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする。
【００２３】
本発明の請求項１３に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、電界効果デバイスと別体に設けられ、前記電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記測定部上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とする。
【００２４】
本発明の請求項１４に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、前記ＤＮＡプローブを固定した粒子を前記ゲート絶縁膜上に自重で沈殿させるステップを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のＤＮＡ塩基配列解析装置およびＤＮＡ塩基配列解析方法によれば、磁石により磁性粒子をゲート絶縁膜に引き寄せることにより、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブをゲート絶縁膜に近づけることができるので、従来の電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析よりも長い塩基長のＤＮＡ塩基配列を容易に解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図２】本実施形態で用いる磁性粒子複合体の構成を示す概略図である。
【図３】本実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置によるＤＮＡ配列解析の原理である一塩基伸長反応過程を説明する図である。
【図４】本実施形態の磁性粒子複合体の変形例を示す概略図である。
【図５】第２実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図６】第２実施形態の変形例の電界効果トランジスタの表面の構成を示す斜視図である。
【図７】第２実施形態の変形例のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図８】第３実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図９】第３実施形態において磁石によって引き付けられた磁性粒子がゲート絶縁膜上に固定されたことを示す部分概略図である。
【図１０】第４実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の構成を示す概略図である。
【図１１】第４実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図１２】第５実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図１３】第５実施形態の測定部を示す平面図である。
【図１４】第６実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
１．第１実施形態
図１は、本発明による電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置１を説明する断面模式図である。ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、電界効果デバイスとしての電界効果トランジスタ２、測定セル３、磁石４、電流計５、参照電極６、電源７、磁性粒子８を備える。
【００２８】
電界効果トランジスタ２は、シリコン基板１０の中に形成されたｐ型領域１１と、該ｐ型領域１１の中に形成されたｎ型領域１２を有する。当該ｎ型領域１２は、ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄとを構成し、ソース１２Ｓからドレイン１２Ｄへドレイン電流が流れる。ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄ上には、ゲート絶縁膜１５が形成されている。
【００２９】
ゲート絶縁膜１５は、絶縁膜１３と、当該絶縁膜１３上に形成された保護絶縁膜１４とを有する二層構造からなる。絶縁膜１３は、特に限定されるものではないが、本実施形態では、二酸化シリコン（ＳｉＯ２）を用いる。保護絶縁膜１４としては窒化シリコン（ＳｉＮまたはＳｉ３Ｎ４）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）などの材料を単独または組み合わせて用いる。絶縁膜１３は、二酸化シリコンが水溶液と接触すると水和化し、絶縁性が劣化するが、保護絶縁膜１４で覆うことにより、シリコン表面の電気的特性を良好に保つことができる。
【００３０】
ゲート絶縁膜１５の表面は、前記測定セル３に収容された溶液９で満たされる。本実施形態の場合、測定セル３はゲート絶縁膜１５を囲むように設けられた側壁で構成される。溶液９にはリン酸緩衝溶液を用いる。溶液９中には後述する手順において酵素、基質などが導入される。
【００３１】
参照電極６は溶液９中に配置されている。参照電極６とシリコン基板１０は直流電源７および半導体パラメータアナライザ１６に電気的に接続されている。また、上記ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄは、直流電源１７および電流計５に電気的に接続されている。これにより、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、所定のドレイン電流が流れるときのしきい値電圧を半導体パラメータアナライザ１６で測定し得るように構成されている。
【００３２】
磁石４は電界効果トランジスタ２の下部に配置されている。磁石４は溶液９中の磁性粒子８をゲート絶縁膜１５表面に引き寄せる。
【００３３】
磁性粒子８は図２に示すようにポリマー被覆された磁性体１８と、当該磁性体１８に固定された官能基１９によって構成されている。磁性体１８はマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、各種フェライト（ＸＦｅ２Ｏ４、Ｘ＝Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５、Ｆｅ０．５など）、三酸化二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）などから選択することができる。官能基１９は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基などから選択することができる。官能基１９は磁性体１８の表面に固定されており、末端にＤＮＡプローブ２０が固定される。該ＤＮＡプローブ２０にはターゲットＤＮＡ２１がハイブリダイズされている。このように、ターゲットＤＮＡ２１がハイブリダイズされたＤＮＡプローブ２０を固定した磁性粒子８を、磁性粒子複合体２２と呼ぶ。
【００３４】
次に解析方法について説明する。上記ＤＮＡプローブ２０と上記磁性粒子８を、５０℃で一晩反応させることにより、上記磁性粒子８表面の官能基１９にＤＮＡプローブ２０を固定する。
【００３５】
ターゲットＤＮＡ２１と上記ＤＮＡプローブ２０が固定された磁性粒子８を５０℃で１時間ハイブリダイズすることにより、上記磁性粒子複合体２２を形成する（図３（Ａ））。
【００３６】
しきい値電圧を測定するために上記測定セル３内に溶液９を導入し、ゲート絶縁膜１５表面を溶液９で満たす。該溶液９中に上記参照電極６を配置する。
【００３７】
上記磁性粒子複合体２２を該溶液９に混合する。磁石４を電界効果トランジスタ２の下部に近づけ、上記磁性粒子複合体２２をゲート絶縁膜１５表面に引き寄せる。電源７から参照電極６に電圧を印加することにより、所定のドレイン電流がソース、ドレイン間に流れる時のしきい値電圧を測定する。以下この値を基準値と呼ぶ。
【００３８】
基準値測定後、伸長反応を起こすため磁石４を電界効果トランジスタ２から離し、ピペッティングによりゲート絶縁膜１５上から磁性粒子複合体２２を引き離す。ゲート絶縁膜１５上から引き離された磁性粒子複合体２２は溶液９中を浮遊する。
【００３９】
次いで、基質であるｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのうち1つを使い溶液９中に導入する。例えばｄＣＴＰを導入する。上記基質導入後、磁石４で磁性粒子複合体２２を上記ゲート絶縁膜１５表面に引き寄せ、参照電極６に電圧を引加することにより所定のドレイン電流がソース１２Ｓ、ドレイン１２Ｄ間に流れる時のしきい値電圧を測定する。以下この値を測定値と呼ぶ。
【００４０】
ＤＮＡは水溶液中で負電荷を有するので、溶液９中に基質を導入したことにより伸長反応が起きた場合、測定値は基準値に対し正の方向へ変化する。すなわち、測定値が基準値に対し正の方向へ変化した場合、導入した基質であるｄＣＴＰに含まれるシトシンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起こったことを意味する。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基は、シトシンと相補的であるグアニンであると解析することができる（図３（Ｂ））。このようにして、測定値と基準値との差をゲート絶縁膜１５表面の電荷密度の変化として評価することにより、ターゲットＤＮＡ２１の塩基を解析することができる。
【００４１】
一方、基準値が測定値に対し変化しなかった場合、導入された基質に含まれるシトシンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起きなかったといえる。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基はシトシンと相補的であるグアニンではないと解析することができる。
【００４２】
測定後、未反応の酵素、基質を溶液９から除去する。除去後、再度直前に用いた基質とは異なる基質を導入する。例えばｄＡＴＰを導入する。再び、測定値を測定する。すなわち、磁石４で磁性粒子複合体２２を上記ゲート絶縁膜１５表面に引き寄せ、参照電極６に電圧７を引加することにより所定のドレイン電流がソース１２Ｓ、ドレイン１２Ｄ間に流れる時のしきい値電圧を測定する。そして、上記と同様に測定値と基準値との差から、ターゲットＤＮＡ２１の塩基を解析する。すなわち測定値が基準値に対し正の方向へ変化した場合、導入した基質であるｄＡＴＰに含まれるアデニンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起こったことを意味する。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基は、アデニンと相補的であるチミンであると解析することができる（図３（Ｃ））。
【００４３】
一方、基準値が測定値に対し変化しなかった場合、導入された基質に含まれるアデニンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起きなかったといえる。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基はアデニンと相補的であるチミンではないと解析することができる。
【００４４】
上記の手順で測定を繰り返すことにより、最終的にターゲットＤＮＡ２１の全塩基配列を解析することができる。
【００４５】
全塩基配列解析後、上記ゲート絶縁膜１５表面上の磁性粒子複合体２２を全て廃棄し、電界効果トランジスタ２表面を洗浄することにより、洗浄後の電界効果トランジスタ２を再利用することができる。
【００４６】
上記した通り、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置１は、磁性粒子複合体２２を前記ゲート絶縁膜１５上に引き寄せる構成とした。これにより、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、ＤＮＡプローブ２０とターゲットＤＮＡ２１をゲート絶縁膜１５の表面に近づけた状態で、しきい値電圧を測定することができるので、従来に比べ、長い塩基長のＤＮＡ塩基配列を容易に解析することができる。
【００４７】
また、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、磁性粒子複合体２２を磁石４でゲート絶縁膜１５表面に引き寄せる構成としたことにより、ＤＮＡプローブ２０をゲート絶縁膜１５表面に固定せずにしきい値電圧を測定することができるので、電界効果トランジスタ２を洗浄するだけで容易に再利用することができる。
【００４８】
また、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、伸長反応を行う際、磁石４を電界効果トランジスタ２から離し、磁性粒子複合体２２を溶液９中に浮遊させることができるので、より容易に伸長反応をさせることができる。
【００４９】
２．第２実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第１実施形態に対し、ゲート絶縁膜２４表面上の形態が異なる。図１と同様の構成について同様の符号を付した図５を参照して説明する。本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置３０において、電界効果トランジスタ３７には、シリコン基板１０の中にソース１２Ｓとドレイン１２Ｄが形成されており、ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄ間にはチャネル３１が形成されている。シリコン基板１０上にはゲート絶縁膜３４が形成されている。チャネル３１は、参照電極６に電圧が印加されると電流が流れる部分である。当該ゲート絶縁膜３４は絶縁膜３２と当該絶縁膜３２上に形成された保護絶縁膜３３とを有する二層構造からなっている。本実施形態の場合、チャネル３１の上部に形成されたチャネルに対応するゲート絶縁膜３４は、ガイド部３５に囲まれている。ガイド部３５に囲まれた当該ゲート絶縁膜３４は１つの磁性粒子複合体のみを載置し得る大きさを有している。
【００５０】
ガイド部３５は、１つの磁性粒子複合体２２が１つのチャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４上に載置されると共に、載置された磁性粒子複合体２２が溶液９中に浮遊し得るように、出入り自在に形成されている。本実施形態の場合、ガイド部３５はチャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４の四隅の近傍に１個ずつ（合計４個）設けられた支柱３６で構成されている。
【００５１】
このように本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置３０において、磁石４を電界効果トランジスタ３７の下部に近づけると溶液９中に浮遊している磁性粒子複合体２２はゲート絶縁膜３４表面に引き寄せられる。当該磁性粒子複合体２２は当該ゲート絶縁膜３４上に設けられたガイド部３５によりチャネル３１に対応する当該ゲート絶縁膜３４上へ正確に載置される。
【００５２】
しかもガイド部３５は１つの磁性粒子複合体２２のみを１つのチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４に載置するように形成されているので、１つのチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４に１つの磁性粒子複合体２２を載置することができる。したがって、ＤＮＡ塩基配列解析装置３０は再現性の高い一塩基伸長反応の計測を実現できる。
【００５３】
また、ガイド部３５はチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４の周囲に立設された支柱３６で構成したことにより、磁石４を電界効果トランジスタ３７の下部から離すと、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に載置された磁性粒子複合体２２を容易に引き離し、当該磁性粒子複合体２２を溶液中に浮遊させることができる。したがって、電界効果トランジスタ３７上を洗浄し、電界効果トランジスタ３７を再利用してＤＮＡ配列解析を行う手順を繰り返す際に、磁性粒子複合体２２をゲート絶縁膜表面から自由に着脱することができる。
【００５４】
３．変形例１
本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更することが可能である。
【００５５】
例えば図４に示したように、磁性粒子８に固定されたＤＮＡプローブ２０にターゲットＤＮＡ２１の両端をそれぞれハイブリダイズし、本発明の方法を用いたＤＮＡ塩基配列解析を行うことができる。該ＤＮＡ塩基配列解析により、従来の電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析よりも長塩基の配列をより容易に解析することができる。
【００５６】
上記実施形態では電界効果デバイスとして、トランジスタを用いた場合について説明したが、本発明はこれに限らず電界効果キャパシターを用いることもできる。
【００５７】
上記実施形態では二層構造を有したゲート絶縁膜について説明したが、本発明はこれに限らず単層構造のゲート絶縁膜を用いることもできる。
【００５８】
また、上記実施形態では測定セルを側壁で構成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、ゲート絶縁膜表面に連通する流路で構成してもよい。
【００５９】
また、図５に示したガイド部３５は、チャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４の四隅の近傍に１個ずつ（合計４個）設けられた支柱３６で構成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、１つのチャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４上に１つの磁性粒子複合体を載置し得るように構成されていたり、支柱３６を３個または５個以上としてもよい。
【００６０】
さらにガイド部３５は、複数の支柱３６で構成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、チャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４に立設された側壁で構成してもよい。
【００６１】
また、図６に示したように、チャネルが複数設けられた電界効果トランジスタ（本図には図示しない）を用い、ゲート絶縁膜３４上にそれぞれのチャネル３１に対応したガイド部３５を配置することとしてもよい。これにより、再現性の高い一塩基伸長反応の計測が実現できる。なお、この場合、それぞれのチャネル３１に対応したソースとドレインは、それぞれ直流電源および電流計に電気的に接続されており、チャネル毎に電気的に互いに隔離されている。
【００６２】
また、図７に示したように、ゲート絶縁膜３４と電気的に接続された測定部３８を設け、当該測定部３８上に磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入し、測定部３８上において測定することとしてもよい。これにより、単位面積あたりに多数のチャネルを配置することができ、高感度の一塩基伸長反応の計測が実現できる。なお、この場合、測定部３８は基板３９と当該基板３９の一側表面に形成された電荷検出部４０を有している。また、前記電界効果トランジスタ３７のゲート絶縁膜３４上に形成された金属電極４１と前記測定部３８とが電気的に接続されている。
【００６３】
４．第３実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第１実施形態に対し、ゲート絶縁膜の構成のみ異なる。図１と同様の構成について同様の符号を付した図８を参照して説明する。本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５０において、電界効果トランジスタ５１のソース１２Ｓとドレイン１２Ｄの上にゲート絶縁膜５２が形成されている。ゲート絶縁膜５２は、絶縁膜５３と、保護絶縁膜５５の間に磁石としての磁性膜５４が形成された３層構造を有する。磁性膜５４は材料としてネオジウム合金などを用いる。
【００６４】
このように本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５０において、磁性粒子複合体２２を溶液９内に導入すると、磁性粒子複合体２２は磁性膜５４によって引き寄せられ、ゲート絶縁膜５２の表面に固定される（図９）。
【００６５】
磁性粒子複合体２２がゲート絶縁膜５２の表面に固定された状態で、前記基準値を測定する。次いで、測定セル３内の溶液９を入れ替えることにより、伸長反応を起こすことができる。そして、測定セル３内の溶液９を入れ替えた後で測定値を測定する。このように、溶液９の入れ替えと測定値の測定とを繰り返すことによって最終的にターゲットＤＮＡ２１のＤＮＡ配列解析を行うことができる。
【００６６】
このように、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５０は、磁性膜５４で磁性粒子複合体２２をゲート絶縁膜５２表面に固定する構成としたので、従来のように化学処理を行わなくても、常にデバイ長内に磁性粒子複合体２２を保持することができる。したがって、ＤＮＡ塩基配列解析装置５０は、ゲート絶縁膜５２表面に対し略平行方向に伸びるＤＮＡプローブ２０とターゲットＤＮＡ２１においてデバイ長内で伸長反応を起こすことができるので、長塩基のＤＮＡ配列解析をより簡便な構成で行うことができる。
【００６７】
５．第４実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第１実施形態に対し、測定セルの形態が異なる。図１と同様の構成について同様の符号を付した図１０を参照して説明する。本実施形態に係る電界効果トランジスタ６１を用いたＤＮＡ塩基配列解析装置５９は、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に測定セルとしての流路６４が形成されている。
【００６８】
流路６４はゲート絶縁膜３４上に設けられたガラス膜に形成した溝で構成され、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４の長手方向に沿って形成されている。流路６４内は、溶液９で満たされている。また流路６４の内腔は、１つの磁性粒子複合体２２が通過できる大きさを有している。したがって、チャネル３１は、流路６４と同様に、幅が１つの磁性粒子複合体２２と略同じ大きさに形成されている。
【００６９】
図１１に示すように、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５９では、流路６４に磁性粒子複合体２２を含む溶液９を供給する供給部６２が連通されている。
【００７０】
供給部６２は、流路６４の出口に連通された排出層６５、反応タンク６６、および、流路６４の入口に連通された吸入槽６３で構成されており、排出層６５、反応タンク６６、吸入槽６３の順に供給路６７で連通されている。
【００７１】
反応タンク６６は溶液９を導入する開口部７０を備える。開口部７０から導入される溶液９は、磁性粒子複合体２２および基質を含むこともできる。排出層６５および吸入層６３には、図示しないシリンジポンプが設けられている。
【００７２】
次に、上記のよう構成された本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５９を用いた解析方法の一例について説明する。なお、以下に説明する解析方法は一例であり、本発明はこれに限定されない。
【００７３】
ＤＮＡ塩基配列解析装置５９において、複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を吸入槽６３に導入し、吸入層６３に設けられた図示しないシリンジポンプを用いて、吸入槽６３から溶液９を押し出す。吸入層６３から押し出された複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９は、供給路６７を通過して流路６４に誘導される。
【００７４】
複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が流路６４内に流通した時点で、シリンジポンプを停止し、流路６４内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を滞留させる。流路６４内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が滞留した状態で、磁石４を電界効果トランジスタ６１の下部に近づける。そうすると、複数の磁性粒子複合体２２がチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４表面に引き寄せられ、磁性粒子複合体２２がチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４表面に固定される。これにより、１つのチャネルに対応したゲート絶縁膜３４上に複数の磁性粒子複合体２２を固定することができる。複数の磁性粒子複合体２２を１つのチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に固定した状態で基準値を測定する。
【００７５】
基準値を測定した後、磁石４を電界効果トランジスタ６１から離し、ゲート絶縁膜３４上から磁性粒子複合体２２を引き離し、磁性粒子複合体２２を溶液９中に浮遊させる。次いで、排出層６５に設けられた図示しないシリンジポンプを用いて、流路６４内の溶液９を吸引して、磁性粒子複合体２２を流路６４から反応タンク６６に誘導する。
【００７６】
複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を流路６４から反応タンク６６に戻した時点で、排出層６５のシリンジポンプを停止する。反応タンク６６内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が貯留された状態で第２の磁石６８を反応タンク６６の下に近づける。そうすると、複数の磁性粒子複合体２２が反応タンク６６の底面６９に引き寄せられ、底面６９に固定される。複数の磁性粒子複合体２２を反応タンク６６の底面６９に固定した状態で図示しない排水口から反応タンク６６内の溶液９を排出する。次いで、開口部７０から所望の基質を含んだ溶液９を新たに反応タンク６６内に導入し、伸長反応を起こす。次いで、図示しない排水口から基質を含んだ溶液９を排出し、溶液９を新たに反応タンク６６内に導入する。そして、底面６９から磁石６８を引き離し、磁性粒子複合体２２を溶液９内に浮遊させる。
【００７７】
次いで、吸入層６３に設けられた図示しないシリンジポンプを用いて、伸張反応後の複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を流路６４内に誘導する。この後、上記した基準値と同様の手順で測定値を測定する。
【００７８】
当該測定を繰り返すことにより、最終的にターゲットＤＮＡ２１の全塩基配列を解析することができる。
【００７９】
このように、本実施形態ＤＮＡ塩基配列解析装置５９は、チャネルの幅を狭く形成し、さらにチャネルの長手方向に複数の磁性粒子複合体２２を配置し、同時に測定を行えるため、高感度のＤＮＡ塩基配列解析が実現できる。
【００８０】
６．第５実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第４実施形態に対し、ゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部が電界効果トランジスタとは別体に設けられている点が異なる。図１０と同様の構成について同様の符号を付した図１２を参照して説明する。
【００８１】
本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置６１は、電界効果トランジスタ３７と、ゲート絶縁膜３４上に形成された金属電極４１と、当該金属電極４１と電気的に接続され前記電界効果トランジスタ３７とは別体に設けられた測定部７４とを備える。
測定部７４は基板７１と当該基板７１の一側表面に形成された電荷検出部７２とを有している。
【００８２】
図１３に示すように、本実施形態に係る測定部７４は、複数（本図においては４個）の電荷検出部７２が互いに平行に配置されている。当該複数の電荷検出部７２に対し略直交する方向に流路７３が複数（本図においては４個）配置されている。したがって、各流路７３が、複数の電荷検出部７２を交差するように形成されている。また、流路７３には、上記第４実施形態と同様の供給部が連通されており、流路７３内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入し、及び排出し得るように構成されている。
【００８３】
次に、上記のよう構成された本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置６１を用いた解析方法の一例について説明する。なお、以下に説明する解析方法は一例であり、本発明はこれに限定されない。
【００８４】
ＤＮＡ塩基配列解析装置６１において、まず、１行目の流路７３Ａに複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入する。１行目の流路７３Ａ内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が滞留した状態で、磁石４を測定部７４の下部に近づける。そうすると、複数の磁性粒子複合体２２が電荷検出部７２表面に引き寄せられ、１行目の流路７３Ａと交差した各電荷検出部７２表面に磁性粒子複合体２２が１個ずつ固定される。これにより、各電荷検出部７２において、１個毎の磁性粒子複合体２２の基準値を複数同時に測定する。
【００８５】
次いで、２行目の流路７３Ｂに任意の基質を用いて伸長反応を起こした複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入する。そして、基準値と同様の手順で測定値を測定する。同様の測定を３行目（７３Ｃ）、及び４行目（７３Ｄ）の流路において順に行う。このような手順を繰り返し行うことにより、各電荷検出部７２において、１個の磁性粒子複合体２２の全塩基配列解析することができる。
【００８６】
このように、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置６１は、測定部７４に複数の電荷検出部７２を互いに平行に配置し、複数の電荷検出部７２に対し略直交する方向に流路７３を複数配置して、流路７３と交差する電荷検出部７２表面に磁性粒子複合体２２を１個ずつ固定するように構成した。これにより、各電荷検出部７２において１個の磁性粒子複合体２２の基準値および測定値を測定できるので、全体として同時に複数の磁性粒子複合体２２の基準値および測定値を測定できる。したがって、ＤＮＡ塩基配列解析装置６１は、各電荷検出部７２毎に測定された１個の磁性粒子複合体２２の基準値および測定値を比較することにより、測定誤差の検証を行うことができる。
【００８７】
７．第６実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第２実施形態に対し、磁石が配置されないことのみが異なる。図１４に示す電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置８０は、ゲート絶縁膜３４上にガイド部３５が設けられている。本実施形態に係る粒子８１は、比重が溶液９より大きく、自重で測定セル３の下部、すなわちゲート絶縁膜３４上に沈殿し得るように構成されている。粒子８１は、粒子本体（図示しない）と当該粒子本体に固定された官能基１９によって構成されている。図示しない粒子本体は、磁性体１８、シリカ、金、その他金属酸化物から選択することができる。また、粒子８１は、直径１μｍ以上の図示しない粒子本体を用いることが好ましい。このように構成されたＤＮＡ塩基配列解析装置８０では、自重で粒子８１が沈殿するので、磁石を近づける手順を省略することができ、より容易にＤＮＡ塩基配列解析を行うことができる。
【００８８】
８．変形例２
上記実施形態では、ＤＮＡ塩基配列解析装置５９における供給部６２の排出層６５および吸入層６３に、図示しないシリンジポンプが設けられている場合について説明したが、本発明はそれに限らず、排出層６５または吸入槽６３のいずれか１つのみに図示しないシリンジポンプを設けてもよい。
【００８９】
また、上記実施形態では、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に１つの流路６４が形成されている場合について説明したが、本発明はそれに限らず、２つ以上の流路６４を互いに平行に形成してもよい。
【００９０】
第３実施形態では、磁性粒子複合体２２が球形状である場合について説明したが、本発明はこれに限らず、例えば、立方体形状や円柱形状であってもよい。
【００９１】
９．実施例
第１実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置を用いて一回の伸長反応で５０塩基を延長した際のしきい値電圧の変化を測定した。
【００９２】
本実施例では表面にカルボキシル基が固定された直径1μmの市販の磁性粒子（7-12×109 beads/ml, Dynabeads MyOne Carboxylic Acid, invitrogen）を使用した。ターゲットＤＮＡ（(5') H2N-GCA・・・T TCA GAG GAC G-H2N(3')、６１塩基）は、（0.14）% (w/v)のWSCを含んだTE bufferで５０μl、（３７）μMに調製された。ターゲットＤＮＡは両末端がアミノ基で修飾されており、磁性粒子表面のカルボキシル基とアミド結合を作ることによって固定することができる。上述のターゲットＤＮＡ溶液に磁性粒子を浸し、50℃で一晩反応させて、磁性粒子表面にＤＮＡプローブを固定化した。
【００９３】
0.1 ％SDS（ニッポンジーン）を含む４×SSC溶液（シグマアルドリッチジャパン）を調節した。この溶液で、ターゲットＤＮＡに対し相補的な塩基配列をもつプライマー役のＤＮＡ（(3') A AGT CTC CTG C (5')、１１塩基）の溶液を５０μMで５０μl調整し、ターゲットＤＮＡを固定化した磁性粒子を浸漬して、50℃で反応させることでハイブリダイゼーションを行った。
【００９４】
本実施例で用いた電界効果トランジスタは、ゲート絶縁膜がTa2O5/Si3N4/SiO2であるnチャネルディプレッション型である。それぞれの膜厚は、Ta2O5が５０nm、Si3N4が１００nm、SiO2が１００nmである。また、半導体パラメータアナライザは、Agilent製（Ｂ１５００Ａ）を用いた。
【００９５】
本実施例のＤＮＡ塩基配列解析装置に400μｌのリン酸緩衝液(1μM Na2HPO4and 1μM KH2PO4)を導入し、上記リン酸緩衝液で１００倍希釈した磁性粒子を混合し、酵素（Klenow Fragment）と基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を使い３７℃で１０分間プライマー役のＤＮＡの３’末端から５０塩基の伸長反応を行った。伸長反応終了後、磁石を使い、ゲート絶縁膜表面に磁性粒子を誘引した。30分後、ドレイン電流が1mA時のしきい値電圧を測定し、上記基準値との差を磁性粒子表面の電荷密度の変化として定めた。その結果、しきい値電圧が正の方向に５５．２ｍＶシフトした。この結果から、ＤＮＡ塩基配列解析装置で、長い塩基長である５０塩基のしきい値電圧の変化を測定できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、高精度、高速度での遺伝子測定が可能で、かつ低価格、小規模なシステムを実現できるＤＮＡ塩基配列解析方法及び解析装置を提供する。
【符号の説明】
【００９７】
１ ＤＮＡ塩基配列解析装置
２ 電界効果トランジスタ
４ 磁石
８ 磁性粒子
１５ ゲート絶縁膜
２０ ＤＮＡプローブ
２１ ターゲットＤＮＡ
３０ ＤＮＡ塩基配列解析装置
３１ チャネル
３２ 電界効果トランジスタ
３４ ゲート絶縁膜
３５ ガイド部
３６ 支柱
３７ 電界効果トランジスタ
３８ 測定部
５０ ＤＮＡ塩基配列解析装置
５２ ゲート絶縁膜
５４ 磁性膜
５９ ＤＮＡ塩基配列解析装置
６１ 電界効果トランジスタ
６４ 流路
７３Ａ 流路
７３Ｂ 流路
７３Ｃ 流路
７３Ｄ 流路
７４ 測定部
８１ 粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ塩基解析装置およびＤＮＡ塩基配列解析方法に関し、特に電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの全塩基配列解読が終了し、他の生物のゲノム塩基配列解読が急速に進展する中、膨大な塩基配列情報が蓄積されつつある。これらのゲノム塩基配列情報をもとに、遺伝子機能解析が分子生物学,薬物遺伝学,臨床研究の新規分野で著しい進歩をみせている。
【０００３】
これらの新規分野発展の基礎となっているのが、塩基配列情報に加えて遺伝子の機能情報である。遺伝子機能解析を大規模に行い、遺伝子検査へ発展させる装置として、電気泳動システム、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップとＤＮＡマイクロアレイを総称して「ＤＮＡマイクロアレイ」という。）などが開発されている。
【０００４】
しかし、現状の電気泳動システムやＤＮＡマイクロアレイの多くは蛍光検出を基本原理としているので、試料を蛍光標識でラベルする必要があり、レーザや複雑な光学系が必要となり、装置が大型化する。
【０００５】
これらの問題を解決する装置として、酸化・還元標識と組み合わせた電流検出方式のＤＮＡマイクロアレイや、パイロシーケンシングなどが開発されてきたが、いずれも検出精度や検出速度の課題がある。
【０００６】
また、電界効果デバイスのゲート絶縁層表面にターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブを固定し、当該ＤＮＡプローブの伸長反応に伴ったゲート絶縁層上の電荷密度の変化をしきい値電圧の変化として直接検出することで、ＤＮＡ塩基配列解析を行う試みも開示されている（例えば特許文献１）。
【０００７】
上記した電界効果デバイス方式では、ゲート絶縁膜としてＳｉＯ２層、その上層に保護膜であるＳｉ３Ｎ４を成膜した二層構造のゲート絶縁層を用いている。このゲート絶縁層にＤＮＡプローブを固定し、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡポリメラーゼと一種類の塩基のｄＮＴＰを含む溶液を導入し伸長反応させる。ここで、Ｎはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）のいずれかである。ｄＮＴＰ分子は1個のリン酸基を有し、水溶液中では負電荷を有している。そのため、ｄＮＴＰ分子がＤＮＡプローブ分子の伸長鎖に取り込まれると、電界効果デバイス表面の電荷密度が変化する。この電荷密度の変化はしきい値電圧の変化として検出することができる。そのため、しきい値電圧の変化量から、ｄＮＴＰの取り込み量を計測することができる。以上のｄＮＴＰの取り込み反応プロセスを、塩基の種類を例えばＡ→Ｃ→Ｇ→Ｔのように順次変えて段階的に繰り返すことによって、ターゲットＤＮＡ分子の塩基配列を解析することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０２２３７０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記従来技術のうち電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析方法は、システムを容易に小型化できる簡便な方法である。しかし、ターゲットＤＮＡがハイブリダイズしたＤＮＡプローブの伸長反応に伴う電荷密度変化のしきい値電圧に及ぼす影響は、センサ表面からの距離の増加と共に減少する。つまり、ターゲットＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡプローブの伸長反応が進み、伸長反応部位がセンサ表面から遠ざかっていくほど、一塩基の伸長反応当たりのしきい値電圧変化量は小さくなり、伸長反応を検出することが困難となる。上記ＤＮＡ塩基配列解析方法で実際に読み取り可能な塩基長は１０塩基程度であるため、実用的ではないという問題があった。
【００１０】
そこで、本発明は、上記課題を解決するため、従来技術より長い塩基長のＤＮＡ塩基配列を容易に解析することができるＤＮＡ塩基配列解析装置およびＤＮＡ塩基配列解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の請求項１に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、前記磁性粒子を前記ゲート絶縁膜に引き寄せる磁石とを備えたことを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項２に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記ターゲットＤＮＡの両端が、前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブにそれぞれハイブリダイズされていることを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項３に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項４に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記ガイド部が、前記チャネルに対応した前記ゲート絶縁膜の周囲に立設された支柱であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項５に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項６に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記磁石が、前記ゲート絶縁膜に一体的に形成された磁性膜で構成されていることを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項７に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスと、前記電界効果デバイスと別体に設けられ、前記ゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部とを備え、前記測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、前記磁性粒子を前記測定部に引き寄せる磁石とを備えたことを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項８に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、前記測定部上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項９に係るＤＮＡ塩基配列解析装置は、ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、前記ＤＮＡプローブを固定する、自重で前記ゲート絶縁膜上に沈殿する粒子を備えたことを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項１０に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記ゲート絶縁膜上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項１１に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブに、前記ターゲットＤＮＡの両端をそれぞれハイブリダイズするステップを含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明の請求項１２に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする。
【００２３】
本発明の請求項１３に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、電界効果デバイスと別体に設けられ、前記電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記測定部上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とする。
【００２４】
本発明の請求項１４に係るＤＮＡ塩基配列解析方法は、電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、前記ＤＮＡプローブを固定した粒子を前記ゲート絶縁膜上に自重で沈殿させるステップを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のＤＮＡ塩基配列解析装置およびＤＮＡ塩基配列解析方法によれば、磁石により磁性粒子をゲート絶縁膜に引き寄せることにより、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブをゲート絶縁膜に近づけることができるので、従来の電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析よりも長い塩基長のＤＮＡ塩基配列を容易に解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】第１実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図２】本実施形態で用いる磁性粒子複合体の構成を示す概略図である。
【図３】本実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置によるＤＮＡ配列解析の原理である一塩基伸長反応過程を説明する図である。
【図４】本実施形態の磁性粒子複合体の変形例を示す概略図である。
【図５】第２実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図６】第２実施形態の変形例の電界効果トランジスタの表面の構成を示す斜視図である。
【図７】第２実施形態の変形例のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図８】第３実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図９】第３実施形態において磁石によって引き付けられた磁性粒子がゲート絶縁膜上に固定されたことを示す部分概略図である。
【図１０】第４実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の構成を示す概略図である。
【図１１】第４実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図１２】第５実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【図１３】第５実施形態の測定部を示す平面図である。
【図１４】第６実施形態のＤＮＡ塩基配列解析装置の全体構成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
１．第１実施形態
図１は、本発明による電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置１を説明する断面模式図である。ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、電界効果デバイスとしての電界効果トランジスタ２、測定セル３、磁石４、電流計５、参照電極６、電源７、磁性粒子８を備える。
【００２８】
電界効果トランジスタ２は、シリコン基板１０の中に形成されたｐ型領域１１と、該ｐ型領域１１の中に形成されたｎ型領域１２を有する。当該ｎ型領域１２は、ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄとを構成し、ソース１２Ｓからドレイン１２Ｄへドレイン電流が流れる。ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄ上には、ゲート絶縁膜１５が形成されている。
【００２９】
ゲート絶縁膜１５は、絶縁膜１３と、当該絶縁膜１３上に形成された保護絶縁膜１４とを有する二層構造からなる。絶縁膜１３は、特に限定されるものではないが、本実施形態では、二酸化シリコン（ＳｉＯ２）を用いる。保護絶縁膜１４としては窒化シリコン（ＳｉＮまたはＳｉ３Ｎ４）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）などの材料を単独または組み合わせて用いる。絶縁膜１３は、二酸化シリコンが水溶液と接触すると水和化し、絶縁性が劣化するが、保護絶縁膜１４で覆うことにより、シリコン表面の電気的特性を良好に保つことができる。
【００３０】
ゲート絶縁膜１５の表面は、前記測定セル３に収容された溶液９で満たされる。本実施形態の場合、測定セル３はゲート絶縁膜１５を囲むように設けられた側壁で構成される。溶液９にはリン酸緩衝溶液を用いる。溶液９中には後述する手順において酵素、基質などが導入される。
【００３１】
参照電極６は溶液９中に配置されている。参照電極６とシリコン基板１０は直流電源７および半導体パラメータアナライザ１６に電気的に接続されている。また、上記ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄは、直流電源１７および電流計５に電気的に接続されている。これにより、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、所定のドレイン電流が流れるときのしきい値電圧を半導体パラメータアナライザ１６で測定し得るように構成されている。
【００３２】
磁石４は電界効果トランジスタ２の下部に配置されている。磁石４は溶液９中の磁性粒子８をゲート絶縁膜１５表面に引き寄せる。
【００３３】
磁性粒子８は図２に示すようにポリマー被覆された磁性体１８と、当該磁性体１８に固定された官能基１９によって構成されている。磁性体１８はマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、各種フェライト（ＸＦｅ２Ｏ４、Ｘ＝Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５、Ｆｅ０．５など）、三酸化二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）などから選択することができる。官能基１９は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基などから選択することができる。官能基１９は磁性体１８の表面に固定されており、末端にＤＮＡプローブ２０が固定される。該ＤＮＡプローブ２０にはターゲットＤＮＡ２１がハイブリダイズされている。このように、ターゲットＤＮＡ２１がハイブリダイズされたＤＮＡプローブ２０を固定した磁性粒子８を、磁性粒子複合体２２と呼ぶ。
【００３４】
次に解析方法について説明する。上記ＤＮＡプローブ２０と上記磁性粒子８を、５０℃で一晩反応させることにより、上記磁性粒子８表面の官能基１９にＤＮＡプローブ２０を固定する。
【００３５】
ターゲットＤＮＡ２１と上記ＤＮＡプローブ２０が固定された磁性粒子８を５０℃で１時間ハイブリダイズすることにより、上記磁性粒子複合体２２を形成する（図３（Ａ））。
【００３６】
しきい値電圧を測定するために上記測定セル３内に溶液９を導入し、ゲート絶縁膜１５表面を溶液９で満たす。該溶液９中に上記参照電極６を配置する。
【００３７】
上記磁性粒子複合体２２を該溶液９に混合する。磁石４を電界効果トランジスタ２の下部に近づけ、上記磁性粒子複合体２２をゲート絶縁膜１５表面に引き寄せる。電源７から参照電極６に電圧を印加することにより、所定のドレイン電流がソース、ドレイン間に流れる時のしきい値電圧を測定する。以下この値を基準値と呼ぶ。
【００３８】
基準値測定後、伸長反応を起こすため磁石４を電界効果トランジスタ２から離し、ピペッティングによりゲート絶縁膜１５上から磁性粒子複合体２２を引き離す。ゲート絶縁膜１５上から引き離された磁性粒子複合体２２は溶液９中を浮遊する。
【００３９】
次いで、基質であるｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのうち1つを使い溶液９中に導入する。例えばｄＣＴＰを導入する。上記基質導入後、磁石４で磁性粒子複合体２２を上記ゲート絶縁膜１５表面に引き寄せ、参照電極６に電圧を引加することにより所定のドレイン電流がソース１２Ｓ、ドレイン１２Ｄ間に流れる時のしきい値電圧を測定する。以下この値を測定値と呼ぶ。
【００４０】
ＤＮＡは水溶液中で負電荷を有するので、溶液９中に基質を導入したことにより伸長反応が起きた場合、測定値は基準値に対し正の方向へ変化する。すなわち、測定値が基準値に対し正の方向へ変化した場合、導入した基質であるｄＣＴＰに含まれるシトシンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起こったことを意味する。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基は、シトシンと相補的であるグアニンであると解析することができる（図３（Ｂ））。このようにして、測定値と基準値との差をゲート絶縁膜１５表面の電荷密度の変化として評価することにより、ターゲットＤＮＡ２１の塩基を解析することができる。
【００４１】
一方、基準値が測定値に対し変化しなかった場合、導入された基質に含まれるシトシンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起きなかったといえる。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基はシトシンと相補的であるグアニンではないと解析することができる。
【００４２】
測定後、未反応の酵素、基質を溶液９から除去する。除去後、再度直前に用いた基質とは異なる基質を導入する。例えばｄＡＴＰを導入する。再び、測定値を測定する。すなわち、磁石４で磁性粒子複合体２２を上記ゲート絶縁膜１５表面に引き寄せ、参照電極６に電圧７を引加することにより所定のドレイン電流がソース１２Ｓ、ドレイン１２Ｄ間に流れる時のしきい値電圧を測定する。そして、上記と同様に測定値と基準値との差から、ターゲットＤＮＡ２１の塩基を解析する。すなわち測定値が基準値に対し正の方向へ変化した場合、導入した基質であるｄＡＴＰに含まれるアデニンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起こったことを意味する。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基は、アデニンと相補的であるチミンであると解析することができる（図３（Ｃ））。
【００４３】
一方、基準値が測定値に対し変化しなかった場合、導入された基質に含まれるアデニンにより、ＤＮＡプローブ２０の３’末端から伸長反応が起きなかったといえる。この場合、ターゲットＤＮＡ２１上の塩基はアデニンと相補的であるチミンではないと解析することができる。
【００４４】
上記の手順で測定を繰り返すことにより、最終的にターゲットＤＮＡ２１の全塩基配列を解析することができる。
【００４５】
全塩基配列解析後、上記ゲート絶縁膜１５表面上の磁性粒子複合体２２を全て廃棄し、電界効果トランジスタ２表面を洗浄することにより、洗浄後の電界効果トランジスタ２を再利用することができる。
【００４６】
上記した通り、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置１は、磁性粒子複合体２２を前記ゲート絶縁膜１５上に引き寄せる構成とした。これにより、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、ＤＮＡプローブ２０とターゲットＤＮＡ２１をゲート絶縁膜１５の表面に近づけた状態で、しきい値電圧を測定することができるので、従来に比べ、長い塩基長のＤＮＡ塩基配列を容易に解析することができる。
【００４７】
また、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、磁性粒子複合体２２を磁石４でゲート絶縁膜１５表面に引き寄せる構成としたことにより、ＤＮＡプローブ２０をゲート絶縁膜１５表面に固定せずにしきい値電圧を測定することができるので、電界効果トランジスタ２を洗浄するだけで容易に再利用することができる。
【００４８】
また、ＤＮＡ塩基配列解析装置１は、伸長反応を行う際、磁石４を電界効果トランジスタ２から離し、磁性粒子複合体２２を溶液９中に浮遊させることができるので、より容易に伸長反応をさせることができる。
【００４９】
２．第２実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第１実施形態に対し、ゲート絶縁膜２４表面上の形態が異なる。図１と同様の構成について同様の符号を付した図５を参照して説明する。本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置３０において、電界効果トランジスタ３７には、シリコン基板１０の中にソース１２Ｓとドレイン１２Ｄが形成されており、ソース１２Ｓとドレイン１２Ｄ間にはチャネル３１が形成されている。シリコン基板１０上にはゲート絶縁膜３４が形成されている。チャネル３１は、参照電極６に電圧が印加されると電流が流れる部分である。当該ゲート絶縁膜３４は絶縁膜３２と当該絶縁膜３２上に形成された保護絶縁膜３３とを有する二層構造からなっている。本実施形態の場合、チャネル３１の上部に形成されたチャネルに対応するゲート絶縁膜３４は、ガイド部３５に囲まれている。ガイド部３５に囲まれた当該ゲート絶縁膜３４は１つの磁性粒子複合体のみを載置し得る大きさを有している。
【００５０】
ガイド部３５は、１つの磁性粒子複合体２２が１つのチャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４上に載置されると共に、載置された磁性粒子複合体２２が溶液９中に浮遊し得るように、出入り自在に形成されている。本実施形態の場合、ガイド部３５はチャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４の四隅の近傍に１個ずつ（合計４個）設けられた支柱３６で構成されている。
【００５１】
このように本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置３０において、磁石４を電界効果トランジスタ３７の下部に近づけると溶液９中に浮遊している磁性粒子複合体２２はゲート絶縁膜３４表面に引き寄せられる。当該磁性粒子複合体２２は当該ゲート絶縁膜３４上に設けられたガイド部３５によりチャネル３１に対応する当該ゲート絶縁膜３４上へ正確に載置される。
【００５２】
しかもガイド部３５は１つの磁性粒子複合体２２のみを１つのチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４に載置するように形成されているので、１つのチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４に１つの磁性粒子複合体２２を載置することができる。したがって、ＤＮＡ塩基配列解析装置３０は再現性の高い一塩基伸長反応の計測を実現できる。
【００５３】
また、ガイド部３５はチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４の周囲に立設された支柱３６で構成したことにより、磁石４を電界効果トランジスタ３７の下部から離すと、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に載置された磁性粒子複合体２２を容易に引き離し、当該磁性粒子複合体２２を溶液中に浮遊させることができる。したがって、電界効果トランジスタ３７上を洗浄し、電界効果トランジスタ３７を再利用してＤＮＡ配列解析を行う手順を繰り返す際に、磁性粒子複合体２２をゲート絶縁膜表面から自由に着脱することができる。
【００５４】
３．変形例１
本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更することが可能である。
【００５５】
例えば図４に示したように、磁性粒子８に固定されたＤＮＡプローブ２０にターゲットＤＮＡ２１の両端をそれぞれハイブリダイズし、本発明の方法を用いたＤＮＡ塩基配列解析を行うことができる。該ＤＮＡ塩基配列解析により、従来の電界効果デバイスを用いたＤＮＡ塩基配列解析よりも長塩基の配列をより容易に解析することができる。
【００５６】
上記実施形態では電界効果デバイスとして、トランジスタを用いた場合について説明したが、本発明はこれに限らず電界効果キャパシターを用いることもできる。
【００５７】
上記実施形態では二層構造を有したゲート絶縁膜について説明したが、本発明はこれに限らず単層構造のゲート絶縁膜を用いることもできる。
【００５８】
また、上記実施形態では測定セルを側壁で構成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、ゲート絶縁膜表面に連通する流路で構成してもよい。
【００５９】
また、図５に示したガイド部３５は、チャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４の四隅の近傍に１個ずつ（合計４個）設けられた支柱３６で構成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、１つのチャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４上に１つの磁性粒子複合体を載置し得るように構成されていたり、支柱３６を３個または５個以上としてもよい。
【００６０】
さらにガイド部３５は、複数の支柱３６で構成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、チャネル３１に対応するゲート絶縁膜３４に立設された側壁で構成してもよい。
【００６１】
また、図６に示したように、チャネルが複数設けられた電界効果トランジスタ（本図には図示しない）を用い、ゲート絶縁膜３４上にそれぞれのチャネル３１に対応したガイド部３５を配置することとしてもよい。これにより、再現性の高い一塩基伸長反応の計測が実現できる。なお、この場合、それぞれのチャネル３１に対応したソースとドレインは、それぞれ直流電源および電流計に電気的に接続されており、チャネル毎に電気的に互いに隔離されている。
【００６２】
また、図７に示したように、ゲート絶縁膜３４と電気的に接続された測定部３８を設け、当該測定部３８上に磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入し、測定部３８上において測定することとしてもよい。これにより、単位面積あたりに多数のチャネルを配置することができ、高感度の一塩基伸長反応の計測が実現できる。なお、この場合、測定部３８は基板３９と当該基板３９の一側表面に形成された電荷検出部４０を有している。また、前記電界効果トランジスタ３７のゲート絶縁膜３４上に形成された金属電極４１と前記測定部３８とが電気的に接続されている。
【００６３】
４．第３実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第１実施形態に対し、ゲート絶縁膜の構成のみ異なる。図１と同様の構成について同様の符号を付した図８を参照して説明する。本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５０において、電界効果トランジスタ５１のソース１２Ｓとドレイン１２Ｄの上にゲート絶縁膜５２が形成されている。ゲート絶縁膜５２は、絶縁膜５３と、保護絶縁膜５５の間に磁石としての磁性膜５４が形成された３層構造を有する。磁性膜５４は材料としてネオジウム合金などを用いる。
【００６４】
このように本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５０において、磁性粒子複合体２２を溶液９内に導入すると、磁性粒子複合体２２は磁性膜５４によって引き寄せられ、ゲート絶縁膜５２の表面に固定される（図９）。
【００６５】
磁性粒子複合体２２がゲート絶縁膜５２の表面に固定された状態で、前記基準値を測定する。次いで、測定セル３内の溶液９を入れ替えることにより、伸長反応を起こすことができる。そして、測定セル３内の溶液９を入れ替えた後で測定値を測定する。このように、溶液９の入れ替えと測定値の測定とを繰り返すことによって最終的にターゲットＤＮＡ２１のＤＮＡ配列解析を行うことができる。
【００６６】
このように、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５０は、磁性膜５４で磁性粒子複合体２２をゲート絶縁膜５２表面に固定する構成としたので、従来のように化学処理を行わなくても、常にデバイ長内に磁性粒子複合体２２を保持することができる。したがって、ＤＮＡ塩基配列解析装置５０は、ゲート絶縁膜５２表面に対し略平行方向に伸びるＤＮＡプローブ２０とターゲットＤＮＡ２１においてデバイ長内で伸長反応を起こすことができるので、長塩基のＤＮＡ配列解析をより簡便な構成で行うことができる。
【００６７】
５．第４実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第１実施形態に対し、測定セルの形態が異なる。図１と同様の構成について同様の符号を付した図１０を参照して説明する。本実施形態に係る電界効果トランジスタ６１を用いたＤＮＡ塩基配列解析装置５９は、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に測定セルとしての流路６４が形成されている。
【００６８】
流路６４はゲート絶縁膜３４上に設けられたガラス膜に形成した溝で構成され、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４の長手方向に沿って形成されている。流路６４内は、溶液９で満たされている。また流路６４の内腔は、１つの磁性粒子複合体２２が通過できる大きさを有している。したがって、チャネル３１は、流路６４と同様に、幅が１つの磁性粒子複合体２２と略同じ大きさに形成されている。
【００６９】
図１１に示すように、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５９では、流路６４に磁性粒子複合体２２を含む溶液９を供給する供給部６２が連通されている。
【００７０】
供給部６２は、流路６４の出口に連通された排出層６５、反応タンク６６、および、流路６４の入口に連通された吸入槽６３で構成されており、排出層６５、反応タンク６６、吸入槽６３の順に供給路６７で連通されている。
【００７１】
反応タンク６６は溶液９を導入する開口部７０を備える。開口部７０から導入される溶液９は、磁性粒子複合体２２および基質を含むこともできる。排出層６５および吸入層６３には、図示しないシリンジポンプが設けられている。
【００７２】
次に、上記のよう構成された本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置５９を用いた解析方法の一例について説明する。なお、以下に説明する解析方法は一例であり、本発明はこれに限定されない。
【００７３】
ＤＮＡ塩基配列解析装置５９において、複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を吸入槽６３に導入し、吸入層６３に設けられた図示しないシリンジポンプを用いて、吸入槽６３から溶液９を押し出す。吸入層６３から押し出された複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９は、供給路６７を通過して流路６４に誘導される。
【００７４】
複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が流路６４内に流通した時点で、シリンジポンプを停止し、流路６４内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を滞留させる。流路６４内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が滞留した状態で、磁石４を電界効果トランジスタ６１の下部に近づける。そうすると、複数の磁性粒子複合体２２がチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４表面に引き寄せられ、磁性粒子複合体２２がチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４表面に固定される。これにより、１つのチャネルに対応したゲート絶縁膜３４上に複数の磁性粒子複合体２２を固定することができる。複数の磁性粒子複合体２２を１つのチャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に固定した状態で基準値を測定する。
【００７５】
基準値を測定した後、磁石４を電界効果トランジスタ６１から離し、ゲート絶縁膜３４上から磁性粒子複合体２２を引き離し、磁性粒子複合体２２を溶液９中に浮遊させる。次いで、排出層６５に設けられた図示しないシリンジポンプを用いて、流路６４内の溶液９を吸引して、磁性粒子複合体２２を流路６４から反応タンク６６に誘導する。
【００７６】
複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を流路６４から反応タンク６６に戻した時点で、排出層６５のシリンジポンプを停止する。反応タンク６６内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が貯留された状態で第２の磁石６８を反応タンク６６の下に近づける。そうすると、複数の磁性粒子複合体２２が反応タンク６６の底面６９に引き寄せられ、底面６９に固定される。複数の磁性粒子複合体２２を反応タンク６６の底面６９に固定した状態で図示しない排水口から反応タンク６６内の溶液９を排出する。次いで、開口部７０から所望の基質を含んだ溶液９を新たに反応タンク６６内に導入し、伸長反応を起こす。次いで、図示しない排水口から基質を含んだ溶液９を排出し、溶液９を新たに反応タンク６６内に導入する。そして、底面６９から磁石６８を引き離し、磁性粒子複合体２２を溶液９内に浮遊させる。
【００７７】
次いで、吸入層６３に設けられた図示しないシリンジポンプを用いて、伸張反応後の複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を流路６４内に誘導する。この後、上記した基準値と同様の手順で測定値を測定する。
【００７８】
当該測定を繰り返すことにより、最終的にターゲットＤＮＡ２１の全塩基配列を解析することができる。
【００７９】
このように、本実施形態ＤＮＡ塩基配列解析装置５９は、チャネルの幅を狭く形成し、さらにチャネルの長手方向に複数の磁性粒子複合体２２を配置し、同時に測定を行えるため、高感度のＤＮＡ塩基配列解析が実現できる。
【００８０】
６．第５実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第４実施形態に対し、ゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部が電界効果トランジスタとは別体に設けられている点が異なる。図１０と同様の構成について同様の符号を付した図１２を参照して説明する。
【００８１】
本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置６１は、電界効果トランジスタ３７と、ゲート絶縁膜３４上に形成された金属電極４１と、当該金属電極４１と電気的に接続され前記電界効果トランジスタ３７とは別体に設けられた測定部７４とを備える。
測定部７４は基板７１と当該基板７１の一側表面に形成された電荷検出部７２とを有している。
【００８２】
図１３に示すように、本実施形態に係る測定部７４は、複数（本図においては４個）の電荷検出部７２が互いに平行に配置されている。当該複数の電荷検出部７２に対し略直交する方向に流路７３が複数（本図においては４個）配置されている。したがって、各流路７３が、複数の電荷検出部７２を交差するように形成されている。また、流路７３には、上記第４実施形態と同様の供給部が連通されており、流路７３内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入し、及び排出し得るように構成されている。
【００８３】
次に、上記のよう構成された本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置６１を用いた解析方法の一例について説明する。なお、以下に説明する解析方法は一例であり、本発明はこれに限定されない。
【００８４】
ＤＮＡ塩基配列解析装置６１において、まず、１行目の流路７３Ａに複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入する。１行目の流路７３Ａ内に複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９が滞留した状態で、磁石４を測定部７４の下部に近づける。そうすると、複数の磁性粒子複合体２２が電荷検出部７２表面に引き寄せられ、１行目の流路７３Ａと交差した各電荷検出部７２表面に磁性粒子複合体２２が１個ずつ固定される。これにより、各電荷検出部７２において、１個毎の磁性粒子複合体２２の基準値を複数同時に測定する。
【００８５】
次いで、２行目の流路７３Ｂに任意の基質を用いて伸長反応を起こした複数の磁性粒子複合体２２を含んだ溶液９を導入する。そして、基準値と同様の手順で測定値を測定する。同様の測定を３行目（７３Ｃ）、及び４行目（７３Ｄ）の流路において順に行う。このような手順を繰り返し行うことにより、各電荷検出部７２において、１個の磁性粒子複合体２２の全塩基配列解析することができる。
【００８６】
このように、本実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置６１は、測定部７４に複数の電荷検出部７２を互いに平行に配置し、複数の電荷検出部７２に対し略直交する方向に流路７３を複数配置して、流路７３と交差する電荷検出部７２表面に磁性粒子複合体２２を１個ずつ固定するように構成した。これにより、各電荷検出部７２において１個の磁性粒子複合体２２の基準値および測定値を測定できるので、全体として同時に複数の磁性粒子複合体２２の基準値および測定値を測定できる。したがって、ＤＮＡ塩基配列解析装置６１は、各電荷検出部７２毎に測定された１個の磁性粒子複合体２２の基準値および測定値を比較することにより、測定誤差の検証を行うことができる。
【００８７】
７．第６実施形態
本実施形態に係る電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置は、上記第２実施形態に対し、磁石が配置されないことのみが異なる。図１４に示す電界効果トランジスタを用いたＤＮＡ塩基配列解析装置８０は、ゲート絶縁膜３４上にガイド部３５が設けられている。本実施形態に係る粒子８１は、比重が溶液９より大きく、自重で測定セル３の下部、すなわちゲート絶縁膜３４上に沈殿し得るように構成されている。粒子８１は、粒子本体（図示しない）と当該粒子本体に固定された官能基１９によって構成されている。図示しない粒子本体は、磁性体１８、シリカ、金、その他金属酸化物から選択することができる。また、粒子８１は、直径１μｍ以上の図示しない粒子本体を用いることが好ましい。このように構成されたＤＮＡ塩基配列解析装置８０では、自重で粒子８１が沈殿するので、磁石を近づける手順を省略することができ、より容易にＤＮＡ塩基配列解析を行うことができる。
【００８８】
８．変形例２
上記実施形態では、ＤＮＡ塩基配列解析装置５９における供給部６２の排出層６５および吸入層６３に、図示しないシリンジポンプが設けられている場合について説明したが、本発明はそれに限らず、排出層６５または吸入槽６３のいずれか１つのみに図示しないシリンジポンプを設けてもよい。
【００８９】
また、上記実施形態では、チャネル３１に対応したゲート絶縁膜３４上に１つの流路６４が形成されている場合について説明したが、本発明はそれに限らず、２つ以上の流路６４を互いに平行に形成してもよい。
【００９０】
第３実施形態では、磁性粒子複合体２２が球形状である場合について説明したが、本発明はこれに限らず、例えば、立方体形状や円柱形状であってもよい。
【００９１】
９．実施例
第１実施形態に係るＤＮＡ塩基配列解析装置を用いて一回の伸長反応で５０塩基を延長した際のしきい値電圧の変化を測定した。
【００９２】
本実施例では表面にカルボキシル基が固定された直径1μmの市販の磁性粒子（7-12×109 beads/ml, Dynabeads MyOne Carboxylic Acid, invitrogen）を使用した。ターゲットＤＮＡ（(5') H2N-GCA・・・T TCA GAG GAC G-H2N(3')、６１塩基）は、（0.14）% (w/v)のWSCを含んだTE bufferで５０μl、（３７）μMに調製された。ターゲットＤＮＡは両末端がアミノ基で修飾されており、磁性粒子表面のカルボキシル基とアミド結合を作ることによって固定することができる。上述のターゲットＤＮＡ溶液に磁性粒子を浸し、50℃で一晩反応させて、磁性粒子表面にＤＮＡプローブを固定化した。
【００９３】
0.1 ％SDS（ニッポンジーン）を含む４×SSC溶液（シグマアルドリッチジャパン）を調節した。この溶液で、ターゲットＤＮＡに対し相補的な塩基配列をもつプライマー役のＤＮＡ（(3') A AGT CTC CTG C (5')、１１塩基）の溶液を５０μMで５０μl調整し、ターゲットＤＮＡを固定化した磁性粒子を浸漬して、50℃で反応させることでハイブリダイゼーションを行った。
【００９４】
本実施例で用いた電界効果トランジスタは、ゲート絶縁膜がTa2O5/Si3N4/SiO2であるnチャネルディプレッション型である。それぞれの膜厚は、Ta2O5が５０nm、Si3N4が１００nm、SiO2が１００nmである。また、半導体パラメータアナライザは、Agilent製（Ｂ１５００Ａ）を用いた。
【００９５】
本実施例のＤＮＡ塩基配列解析装置に400μｌのリン酸緩衝液(1μM Na2HPO4and 1μM KH2PO4)を導入し、上記リン酸緩衝液で１００倍希釈した磁性粒子を混合し、酵素（Klenow Fragment）と基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を使い３７℃で１０分間プライマー役のＤＮＡの３’末端から５０塩基の伸長反応を行った。伸長反応終了後、磁石を使い、ゲート絶縁膜表面に磁性粒子を誘引した。30分後、ドレイン電流が1mA時のしきい値電圧を測定し、上記基準値との差を磁性粒子表面の電荷密度の変化として定めた。その結果、しきい値電圧が正の方向に５５．２ｍＶシフトした。この結果から、ＤＮＡ塩基配列解析装置で、長い塩基長である５０塩基のしきい値電圧の変化を測定できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、高精度、高速度での遺伝子測定が可能で、かつ低価格、小規模なシステムを実現できるＤＮＡ塩基配列解析方法及び解析装置を提供する。
【符号の説明】
【００９７】
１ ＤＮＡ塩基配列解析装置
２ 電界効果トランジスタ
４ 磁石
８ 磁性粒子
１５ ゲート絶縁膜
２０ ＤＮＡプローブ
２１ ターゲットＤＮＡ
３０ ＤＮＡ塩基配列解析装置
３１ チャネル
３２ 電界効果トランジスタ
３４ ゲート絶縁膜
３５ ガイド部
３６ 支柱
３７ 電界効果トランジスタ
３８ 測定部
５０ ＤＮＡ塩基配列解析装置
５２ ゲート絶縁膜
５４ 磁性膜
５９ ＤＮＡ塩基配列解析装置
６１ 電界効果トランジスタ
６４ 流路
７３Ａ 流路
７３Ｂ 流路
７３Ｃ 流路
７３Ｄ 流路
７４ 測定部
８１ 粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、
前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、
前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、
前記磁性粒子を前記ゲート絶縁膜に引き寄せる磁石と
を備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項２】
前記ターゲットＤＮＡの両端が、前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブにそれぞれハイブリダイズされていることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項３】
前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項４】
前記ガイド部は、前記チャネルに対応した前記ゲート絶縁膜の周囲に立設された支柱であることを特徴とする請求項３のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項５】
前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項６】
前記磁石は、前記ゲート絶縁膜に一体的に形成された磁性膜で構成されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項７】
ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスと、
前記電界効果デバイスと別体に設けられ、前記ゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部とを備え、
前記測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、
前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、
前記磁性粒子を前記測定部に引き寄せる磁石と
を備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項８】
前記測定部上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする請求項７記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項９】
ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、
前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、
前記ＤＮＡプローブを固定する、自重で前記ゲート絶縁膜上に沈殿する粒子を備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項１０】
電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、
前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記ゲート絶縁膜上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１１】
前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブに、前記ターゲットＤＮＡの両端をそれぞれハイブリダイズするステップを含むことを特徴とする請求項１０記載のＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１２】
前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする請求項１０または１１に記載のＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１３】
電界効果デバイスと別体に設けられ、前記電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、
前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記測定部上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１４】
電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、
前記ＤＮＡプローブを固定した粒子を前記ゲート絶縁膜上に自重で沈殿させるステップを備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１】
ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、
前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、
前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、
前記磁性粒子を前記ゲート絶縁膜に引き寄せる磁石と
を備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項２】
前記ターゲットＤＮＡの両端が、前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブにそれぞれハイブリダイズされていることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項３】
前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項４】
前記ガイド部は、前記チャネルに対応した前記ゲート絶縁膜の周囲に立設された支柱であることを特徴とする請求項３のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項５】
前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項６】
前記磁石は、前記ゲート絶縁膜に一体的に形成された磁性膜で構成されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項７】
ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスと、
前記電界効果デバイスと別体に設けられ、前記ゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部とを備え、
前記測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、
前記ＤＮＡプローブを固定する磁性粒子と、
前記磁性粒子を前記測定部に引き寄せる磁石と
を備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項８】
前記測定部上に前記磁性粒子を含んだ溶液を供給する流路を備えることを特徴とする請求項７記載のＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項９】
ゲート絶縁膜を有した電界効果デバイスを備え、
前記ゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析装置において、
前記ＤＮＡプローブを固定する、自重で前記ゲート絶縁膜上に沈殿する粒子を備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析装置。
【請求項１０】
電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、
前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記ゲート絶縁膜上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１１】
前記磁性粒子に固定された前記ＤＮＡプローブに、前記ターゲットＤＮＡの両端をそれぞれハイブリダイズするステップを含むことを特徴とする請求項１０記載のＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１２】
前記電界効果デバイスに形成された1つのチャネルに対応した前記ゲート絶縁膜上に１つの磁性粒子を載置させるガイド部を備えたことを特徴とする請求項１０または１１に記載のＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１３】
電界効果デバイスと別体に設けられ、前記電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜と電気的に接続された測定部上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、
前記ＤＮＡプローブを固定した磁性粒子を前記測定部上に引き寄せるステップを備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析方法。
【請求項１４】
電界効果デバイスに設けられたゲート絶縁膜上に、ターゲットＤＮＡをハイブリダイズしたＤＮＡプローブ及び、酵素と基質を導入して、伸長反応した時のしきい値電圧変化を測定し、前記ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ塩基配列解析方法において、
前記ＤＮＡプローブを固定した粒子を前記ゲート絶縁膜上に自重で沈殿させるステップを備えたことを特徴とするＤＮＡ塩基配列解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−８０８７３（Ｐ２０１２−８０８７３Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０３８７（Ｐ２０１１−５０３８７）
【出願日】平成２３年３月８日（２０１１．３．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人科学技術振興機構、半導体バイオセンシング技術による１チップゲノム解析事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月８日（２０１１．３．８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人科学技術振興機構、半導体バイオセンシング技術による１チップゲノム解析事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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