Ｅ３−１９Ｋタンパク質の小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルス及び癌治療におけるその用途
【課題】本発明は、複製する、且つＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスを提供する。
【解決手段】癌の治療における前記突然変異体の用途であり、前記突然変異ウイルスは、また、選択性及び抗腫瘍能を付与するために用いられる他の突然変異及びＤＮＡ配列の挿入を含むことができ、癌療法の分野に適用される。
【解決手段】癌の治療における前記突然変異体の用途であり、前記突然変異ウイルスは、また、選択性及び抗腫瘍能を付与するために用いられる他の突然変異及びＤＮＡ配列の挿入を含むことができ、癌療法の分野に適用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、一般に癌の治療に関するものであり、より詳細には、小胞体保持ドメインにおいて突然変異しているＥ３−１９Ｋ遺伝子を含むアデノウイルス、及び癌を治療するためのこれらのアデノウイルスの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在の癌治療は、主に、化学療法、放射線療法及び外科手術に基づいている。治療が初期に適用されるときの成功率は高いにも関わらず、進行した疾患のほとんどの症例では、腫瘍を外科手術によって切除することができないか、又は照射可能な放射線及び化学治療線量が正常細胞に対する毒性によって制限されるために、根治することができない。
【０００３】
この問題を軽減するため、より高い選択性及び力価を求めて、バイオテクノロジーによる方策が開発されてきた。それらのなかでも、遺伝子療法及びウイルス療法は、癌を治療する目的でウイルスを用いるものである。遺伝子療法では、ウイルスは、その複製を回避し、且つ、治療用の遺伝子材料の媒体又はベクターとして機能するように改変される。
【０００４】
逆に、ウイルス療法は、腫瘍細胞内で選択的に複製及び増殖するウイルスを用いる。ウイルス療法では、腫瘍細胞は、治療遺伝子の作用によるのではなく、細胞内部でウイルスが複製することで引き起こされる細胞変性効果によって死滅する。腫瘍細胞内での選択的な複製は、腫瘍溶解（ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ）として知られている。腫瘍内で選択的に複製するウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスとして知られている。
【０００５】
癌ウイルス療法は、遺伝子療法より古い。ウイルスによる癌治療に関する最初の報告は、前世紀初頭まで遡る。１９１２年、Ｄｅ Ｐａｃｅは、子宮頸癌において、狂犬病ウイルスを接種した後に、腫瘍退縮を得た（Ｄｅ Ｐａｃｅ Ｎ．Ｓｕｌｌａ ｓｃｏｍｐａｒｓａ ｄｉ ｕｎ ｅｎｏｒｍｅ ｃｒａｎｃｏ ｖｅｇｅｔａｎｔｅ ｄｅｌ ｃｏｌｌｏ ｄｅｌｌ’ｕｔｅｒｏ ｓｅｎｚａ ｃｕｒａ ｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ．Ｇｉｎｅｃｏｌｏｇｉａ １９１２；９：８２−８９頁）。それ以降、腫瘍を治療するため、多様なウイルス種が腫瘍に注入されてきた。自律性のパルボウイルス、水疱性口内炎ウイルス及びレオウイルスなど、天然で腫瘍親和性を呈するウイルスがある。
【０００６】
他のウイルスは、遺伝的に操作することで、腫瘍における選択的複製能を獲得し得る。例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、腫瘍細胞などの、増殖が活発に進行している細胞に不要な酵素活性であるリボヌクレオチド還元酵素遺伝子を欠失させることによって、腫瘍親和性にされている。しかしながら、病原性が低く、且つ腫瘍細胞を感染させる力価が高いことから、癌のウイルス療法（ｖｉｒｏｔｅｈｒａｐｙ）及び遺伝子療法においては、アデノウイルスが最も一般的に用いられているウイルスとなっている。
【０００７】
アデノウイルスには、５１種の血清型が同定されており、ＡからＦの異なる６群に分類されている。ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）はＣ群に属し、３６キロベースの直鎖状ＤＮＡを含む二十面体のタンパク質カプシドからなる。Ａｄ５感染は、成人では、多くの場合に、無症候性であり、小児では、感冒及び結膜炎を引き起こす。概して言えば、Ａｄ５は、上皮細胞に感染し、自然感染では、これは、気管支上皮細胞である。
【０００８】
Ａｄ５は、カプシドの１２個の頂点からアンテナのように伸張するウイルスタンパク質である線維が、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）として知られる細胞間接着に関与する細胞タンパク質と相互作用することによって、細胞に侵入する。
【０００９】
ウイルスＤＮＡが核に達すると、初期遺伝子（Ｅ１からＥ４）の転写が始まる。最初に発現するのは、初期１Ａ領域の遺伝子（Ｅ１Ａ）である。Ｅ１Ａは、細胞タンパク質ｐＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）に結合して、転写因子Ｅ２Ｆを放出し、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４などの他のウイルス遺伝子、及び細胞周期を活性化させる細胞遺伝子の転写を活性化させる。
【００１０】
他方で、Ｅ１Ｂは、転写因子ｐ５３に結合して、細胞周期を活性化させるとともに、感染細胞のアポトーシスを阻害する。Ｅ２は、ウイルスを複製するタンパク質をコードする。Ｅ３は、抗ウイルス免疫反応を抑制するタンパク質をコードする。
【００１１】
Ｅ４は、ウイルスＡＲＮを輸送するタンパク質をコードする。初期遺伝子の発現によって、ゲノムの複製がもたらされ、複製されると、主要な後期プロモーターが活性化される。このプロモーターが、ｍＲＮＡの発現を駆動し、ｍＲＮＡが、ディファレンシャルスプライシングによって、プロセシングを受けることで、カプシドを形成する構造タンパク質をコードする全てのＲＮＡが生じる。
【００１２】
本発明に特に関連して、Ｅ３タンパク質が、より詳細に記載される。ウイルスのライフサイクルの初期段階では、ゲノムの複製前に、Ｅ３遺伝子が、Ｅ３プロモーターから発現する。このプロモーターは、ｍＲＮＡ前駆体の発現を駆動し、このｍＲＮＡ前駆体が、スプライシングによって、９種の異なるｍＲＮＡを産生する。
【００１３】
アデノウイルスのほとんどの血清型、すなわち、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群及びＥ群の血清型において、これらのｍＲＮＡから７種のタンパク質（ポリペプチド）：Ｅ３−１２．５Ｋ、Ｅ３−６．７Ｋ、Ｅ３−１９Ｋ、Ｅ３−１１．６Ｋ（アデノウイルスデスタンパク質、すなわちＡＤＰとしても知られている）、Ｅ３−１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、Ｅ３−１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）、及びＥ３−１４．７Ｋ（ゲノム中、左から右への位置）が合成される。
【００１４】
後期の段階では、Ｅ３プロモーターは、抑制され、主要後期プロモーターが活性化される。このプロモーターから１つのｍＲＮＡ前駆体が合成され、スプライシングによって、異なるｍＲＮＡが生じる。これらの後期ｍＲＡＮから合成されるＥ３タンパク質は、Ｅ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）のみである。
【００１５】
ＡＤＰ、すなわちＥ３−１１．６Ｋは、核膜、ゴルジ膜及び小胞体膜に位置する内在性膜タンパク質である。これは、感染細胞の溶解において役割を果たす。残りのＥ３タンパク質は、感染細胞に対する免疫応答の抑制に関連した機能を有する。例えば、Ｅ３−６．７Ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβ及びＥ３−１４．７Ｋは、ＴＮＦ介在性アポトーシスから細胞を保護する。
【００１６】
Ｅ３−１９Ｋは、主要組織適合性クラス１タンパク質（ＭＨＣ−Ｉ）を小胞体に保持する膜タンパク質である。従って、Ｅ３−１９Ｋは、感染細胞の膜内での抗原提示を回避する。
【００１７】
このＥ３−１９Ｋ機能の媒介に重要なペプチド領域又はペプチドドメインが２つある。１つは、Ｅ３−１９Ｋ ＭＨＣ−Ｉ結合ドメインである。もう１つは、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端側終端にあるペプチド配列であり、これは、タンパク質を小胞体に保持し、その細胞膜への通過を回避する。当該ドメインに特異的な突然変異を有するＥ３−１９Ｋのこうした機能ドメインの記載は、発現プラスミドにおいて単離されたＥ３−１９Ｋを用いてなされている（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ Ｒ、Ｋｖｉｓｔ Ｓ、Ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０；１１１（５ 第１部）：１８０３−１０頁）。
【００１８】
腫瘍溶解性アデノウイルスの設計に関しては、重要な考慮点が２つあり、すなわち、選択性及び力価である。腫瘍細胞を指向する選択性を実現するため、腫瘍細胞に不要なウイルス機能の欠失と、ウイルスプロモーターの腫瘍選択性プロモーターとの置換という２つの方策が用いられている。
【００１９】
かかる遺伝子修飾によって、相当なレベルの選択性が得られており、腫瘍細胞における複製効率は正常細胞と比べて１万倍高い。腫瘍溶解性の力価に関しても、それを高めるためのいくつかの遺伝子修飾が同様に記載されている。こうした修飾は、ウイルスの細胞への侵入又はウイルスの細胞からの放出のいずれかに影響を及ぼす。
【００２０】
侵入ステップを増やすため、ウイルスが細胞を感染させるために用いるカプシドタンパク質が修飾されている。例えば、ＲＧＤペプチド（アルギニン−グリシン−アスパラギンモチーフ）を線維に挿入することにより、アデノウイルスは、インテグリンを用いて細胞に結合することが可能となり、野生型アデノウイルスの場合のように、単に内部に入り込むだけではなくなる。
【００２１】
ウイルスの細胞受容体としてインテグリンを用いると、感染価及び腫瘍溶解力価が高まる。感染細胞からのウイルスの放出を増加させる修飾に関しては、Ｅ１Ｂ−１９Ｋの欠失と、Ｅ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）の過剰発現との２つの記載がなされている。Ｅ１Ｂ−１９Ｋは、Ｂｃｌ−２と相同なアポトーシス阻害因子である。Ｅ１Ｂ−１９Ｋを欠失させると、感染細胞の早期アポトーシスによる細胞死が増加する。
【００２２】
この早期アポトーシスは、多くの感染細胞系において、ウイルス総産生量の減少をもたらすことが多いが、しかしながら、早期アポトーシスは、ウイルスの速やかな放出、ひいては細胞培養物におけるウイルスの伝播を加速させる。従って、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現しない突然変異体は、プラークアッセイで野生型アデノウイルスと比較して大きいプラーク表現型を呈する。
【００２３】
アデノウイルスの腫瘍溶解力価を高めるために用いられる別の方策は、Ｅ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）タンパク質の過剰発現である。このタンパク質は、感染細胞の溶解において役割を果たし、ＡＤＰ過剰発現によって、核の内部に蓄積されたウイルスの放出を増加させる。ＡＤＰ過剰発現ウイルスの表現型も、また、大きいプラーク、及び感染細胞の上清中に存在するウイルスの多さによって特徴付けられる。
【００２４】
ＡＤＰ過剰発現は、２つの機序によって実現されている：１）ＡＤＰ以外の、又はＡＤＰ及びＥ３−１２．５Ｋ以外のＥ３遺伝子の除去。この欠失によって、Ｅ３プロモーターによって駆動されるｍＲＮＡ前駆体内の他のスプライシング部位が取り除かれる。それらのスプライス部位についての競合がないため、ｍＲＮＡコード化ＡＤＰのプロセシングが優先される。２）強力プロモーターの後ろへのＡＤＰ遺伝子の挿入。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｄｅ Ｐａｃｅ Ｎ．Ｓｕｌｌａ ｓｃｏｍｐａｒｓａ ｄｉ ｕｎ ｅｎｏｒｍｅ ｃｒａｎｃｏ ｖｅｇｅｔａｎｔｅ ｄｅｌ ｃｏｌｌｏ ｄｅｌｌ’ｕｔｅｒｏ ｓｅｎｚａ ｃｕｒａ ｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ．Ｇｉｎｅｃｏｌｏｇｉａ １９１２；９：８２−８９頁
【非特許文献２】Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ Ｒ、Ｋｖｉｓｔ Ｓ、Ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０；１１１（５ 第１部）：１８０３−１０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の突然変異に基づき感染細胞からのアデノウイルスの放出を増加させるための、改良された新規機序を開示する。
【００２７】
具体的には、本発明は、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の小胞体保持ドメインの突然変異に基づくアデノウイルスの放出亢進について記載する。本発明は、Ｅ３−１９Ｋの細胞局在に影響を及ぼす突然変異に関連する表現型が、ＡＤＰの過剰発現とは関連せず、従って、感染細胞からのアデノウイルスの放出の増加が、これまでに記載されているものとも、又は示唆されているものとも異なる機序であることを実証する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
アデノウイルス５型ゲノムのランダム突然変異誘発と、それに続き、より高い腫瘍溶解力価を獲得した突然変異体の選択を行った。亜硝酸ナトリウムによる突然変異誘発によって、過渡的な突然変異が起こり、そこで、ヌクレオチド塩基の脱アミノ化が生じる。ＤＮＡの複製後、これらの脱アミノ化された塩基によって新しい対合が起こり、突然変異が固定される。アデノウイルス５型原液の突然変異誘発後、得られたプールを癌細胞系において増幅し、標準的手順によって精製した。
【００２９】
ウイルス原液は、アデノウイルス参照物質（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ：ＡＲＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ配列ファイルＡＹ３３９５６８）に相当する。事前に、ヒト腫瘍を接種した免疫不全マウス（ヌードマウス）において、腫瘍溶解性突然変異体のバイオセレクション（ｂｉｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）プロセスをインビボで実施した。血中でより長く生存し、且つ腫瘍内でより効率的に複製されたウイルスを単離し、増幅し、その後のバイオセレクションラウンドにおいて腫瘍を有するマウスに再び注入した。
【００３０】
より高い腫瘍溶解力価を呈する突然変異体を見つけるために、このランダム法を用いた例は既にあるが、その先例で用いられたバイオセレクションプロセスは異なる（Ｙａｎ Ｗ、Ｋｉｔｚｅｓ Ｇ、Ｄｏｒｍｉｓｈｉａｎ Ｆ、Ｈａｗｋｉｎｓ Ｌ、Ｓａｍｐｓｏｎ−Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ａ、Ｗａｔａｎａｂｅ Ｊら、Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３；７７（４）：２６４０−５０頁）。この先例は、本発明が主題とするものとは、異なる他の突然変異を見つけ出すものである。
【００３１】
本発明は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むことを特徴とするアデノウイルスに関する。特に、Ｅ３−１９Ｋが小胞体に保持されないようにし、それを細胞膜まで通過させるため、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｎｉｎａｌ）ドメインが除去されるか、又は修飾される。複製し、且つＥ３−１９Ｋのこの特定の突然変異を含むアデノウイルスは、感染細胞からより効率的に放出される。このより高い放出率によって、腫瘍溶解作用が高まる。この腫瘍溶解作用の亢進は、癌の治療に有用である。
【００３２】
Ｅ３−１９Ｋの記載されている機能は、免疫調節機能であることから、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端側終端の突然変異によって、感染細胞からのアデノウイルスの放出が増加することが確認されたのは意外である。特に、Ｅ３−１９Ｋについて記載されている機能は、ＭＨＣ−Ｉと結合してＭＨＣ−Ｉを小胞体に保持することによる、ＭＨＣ−Ｉの細胞膜への通過及びＭＨＣ−Ｉに関連する抗原の提示の回避に関するものである。
【００３３】
それゆえ、Ｅ３−１９Ｋを発現しないアデノウイルス突然変異体の表現型は、細胞膜におけるＭＨＣ−Ｉの存在、及びウイルスに対するより高い免疫応答を特徴とする。この表現型は、インビトロでの細胞培養物におけるアデノウイルスの増殖に影響を及ぼさず、従って、遺伝子治療ベクターのようなアデノウイルス分野の専門家は、一般に、ウイルス産生に有害な作用を有することなくＥ３領域全体を欠失させている。
【００３４】
Ｅ３−１９Ｋドメインの機能研究は、アデノウイルスの文脈を離れ、単離されたＥ３−１９Ｋタンパク質で実施されているため、Ｅ３−１９Ｋを発現しないというアデノウイルスの表現型に関するこの知識の他には、Ｅ３−１９Ｋの部分欠失を有するアデノウイルスを特徴付ける表現型は知られていない（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ Ｒ、Ｋｖｉｓｔ Ｓ、Ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０；１１１（５ 第１部）：１８０３−１０頁）。
【００３５】
こうした研究において、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端テール又は小胞体保持ドメインの欠失によってウイルス放出が増加し得ると示唆されたことはなかった。このように、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの修飾が、感染細胞からのアデノウイルスの放出率を高める結果となり得ることを示唆する合理的な先行知識はない。この結果は、本発明において、感染細胞からより効率的に放出されるアデノウイルスの選択を優先する手順を用いて実施されたアデノウイルスのランダム突然変異体ライブラリのスクリーニングから出されたものである。
【００３６】
従って、本発明は、アデノウイルスを包含し、ここで、このアデノウイルスは、複製能を有し、且つＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む。
【００３７】
本発明で考察されるＥ３−１９Ｋ突然変異は、Ｅ３−１９Ｋをコードする遺伝子配列の１つ又は複数の塩基対の挿入、変更又は欠失であり得る。いずれの場合にも、作用は同じであって、それが、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに変化をもたらし、その結果、Ｅ３−１９Ｋの小胞体膜から細胞膜への移動が生じる。
【００３８】
同様に、結果として、Ｅ３−１９Ｋの同様の移動が間接的に生じる他の突然変異は、本発明の目的である。例えば、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端を取り除くプロテアーゼ標的部位の挿入、又はＥ３−１９Ｋを細胞膜に移動させることができる代替的な細胞内輸送シグナルの挿入である。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスは、また、腫瘍内での選択的複製を実現するため、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、及びＶＡ−ＲＮＡの群の１つ又は複数の遺伝子においても突然変異している。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含み、且つ腫瘍内での選択的複製を実現するための組織特異的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターをさらに含む複製アデノウイルスである。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、複製アデノウイルスはＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含み、且つ、腫瘍内での選択的複製を実現するための、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、及びＥ４からなる群からの１つ又は複数の遺伝子の発現を制御するプロモーター配列をさらに含む。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と、腫瘍細胞における感染価又は腫瘍細胞に存在する受容体に対する標的性を高めるためのカプシド修飾とを含む複製アデノウイルスである。
【００４３】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含み、且つ癌遺伝子療法の分野で一般に用いられる遺伝子をさらに含む複製アデノウイルスである。好ましくは、癌遺伝子療法の分野で一般に用いられる遺伝子は、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）及び免疫賦活遺伝子からなる群から選択される。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と、結果として前記Ｅ３−１９Ｋタンパク質の発現の亢進をもたらすゲノム修飾とを含む複製アデノウイルスである。ヌクレオチド配列の配列番号１を含む本発明の複製アデノウイルス。
【００４５】
本発明の別の態様において、複製アデノウイルスは、配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する。
【００４６】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスであり、前記アデノウイルスはヌクレオチド配列の配列番号４を含む。
【００４７】
本発明の複製アデノウイルスは、配列番号５を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する。
【００４８】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスであり、前記アデノウイルスは、少なくともヌクレオチド配列の配列番号１、配列番号７及び配列番号８を含む。
【００４９】
本発明の複製アデノウイルスは、配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含み；且つＲＧＤモチーフ（配列番号８の１６４８〜１６５６位により定義される）と；前記アデノウイルスの腫瘍細胞内での選択的複製能を付与する調節領域であって、ＤＭ１インスレーター（配列番号７の３６７〜１０９５位により定義される）、Ｅ２Ｆ１プロモーターの断片（配列番号７の１２８２〜１５４５位により定義される）、ｃｃａｃｃコザック配列（配列番号７の１５４６〜１５５０位により定義される）及びＥ１ａ−Δ２４変異アデノウイルス遺伝子（配列番号７の１５５１〜２５１２位により定義される）において構成される調節領域との挿入を含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する。
【００５０】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスの薬理学的に有効な投薬量と、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物である。
【００５１】
本発明の別の目的は、薬剤として使用される上記に定義されるとおりの複製アデノウイルスである。
【００５２】
癌における予防薬及び／又は治療薬としての本発明の複製アデノウイルス。
【００５３】
本発明は、また、癌の新規治療方法も提供し、これは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスの投与を含む。
【００５４】
本発明の別の目的は、癌又は癌につながる前悪性疾患を治療又は予防するための医薬製剤の調製における、上記に定義されるとおりの複製アデノウイルスの使用である。
【００５５】
別の実施形態において、本発明のＥ３−１９Ｋ突然変異アデノウイルスは、化学療法又は放射線療法などの他の癌療法と組み合わせて使用され得る。
【００５６】
本発明は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルス、及び癌又は癌につながる前悪性疾患を治療又は予防するための前記アデノウイルスの用途について記載する。腫瘍溶解性アデノウイルスにおけるＥ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）の過剰発現又はＥ１Ｂ−１９Ｋの欠失に関しては、既に報告されている。本発明とは逆に、これまでに記載されているこれらの修飾は、Ｅ３−１９Ｋの細胞膜における局在を含意することもなければ、それを必要とすることもなく、それらの作用機序は異なる。
【００５７】
本発明以前には、小胞体に結合し続けることができないＥ３−１９Ｋタンパク質の活性が、ウイルスゲノムにおいて分析されたことはなかった。Ｅ３−１９Ｋの機能については、ＭＨＣ−Ｉとの結合しか記載がなく、及びこの結合性Ｅ３−１９Ｋを介して抗原提示及び免疫応答が低下するため、ウイルスの放出と結び付く腫瘍溶解力価の上昇に関係する前記タンパク質の活性は、意外である。
【００５８】
本発明の目的である、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスは、ＨＥＫ−２９３及びＡ５４９などの、遺伝子療法及びウイルス療法の分野で一般に用いられる細胞系において増殖及び増幅される。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスを癌の治療に使用するために精製する手順は、癌のウイルス療法（ｖｉｒｏｔｅｈｒａｐｙ）及び遺伝子療法に用いられる他のアデノウイルス及びアデノウイルスベクターについて記載されるものと同じ手順である。
【発明の効果】
【００５９】
本発明は、限定はされないが、膵癌、結腸癌及び肺癌を含む癌の改良された療法に対する必要性に応えるものである。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む腫瘍溶解性アデノウイルスによる癌の治療は、アデノウイルスによる遺伝子療法及びウイルス療法の分野における標準方法を用いた腫瘍内へのウイルスの直接注入か、又は癌患者への全身投与によって実施され得る。
【００６０】
添付の図面は、上記の特徴、利点及び構造を明らかとし、且つ詳細な理解が得られるようにするために本明細書に含められている。これらの図面は本明細書の一部をなし、好ましい実施形態を例示しているが、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒトアデノウイルス血清型５（ＧｅｎＢａｎｋ配列ファイルＡＹ３３９８６５）のゲノムの概略図。通常、３５９３４塩基対の直鎖状ゲノムが左から右に１００マップ単位（ｍｕ）に分割される。初期（Ｅ１〜Ｅ４）ＲＮＡ及び後期（Ｌ）ＲＮＡをコードする領域が示される。Ｅ３領域は、ディファレンシャルスプライシングによるｍＲＮＡ前駆体転写産物に由来する７つのタンパク質をコードする。本発明は、Ｅ３−１９Ｋタンパク質及びそのカルボキシ末端テールに影響を及ぼす突然変異に関する。
【図２】突然変異体ＡｄＴ１の大きいプラーク表現型特性。この突然変異体は、ヒトアデノウイルス５型のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ配列ファイルＡＹ３３９８６５）のランダム突然変異誘発と、それに続く、移植腫瘍を有するマウスの血液及び腫瘍からのウイルスの単離に基づくスクリーニングによって得られた。腫瘍細胞に対するアデノウイルスＡｄＴ１の細胞毒性を、野生型アデノウイルス（Ａｄｗｔ）の細胞毒性と比較した。ヒト腫瘍Ａ５４９細胞を６ウェルプレートに播種した。８０％のコンフルエンスで、段階希釈したＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を細胞に感染させた。感染後４時間でウイルスを取り除き、アガロースと混合した培地層で細胞単層を被覆した。感染細胞を６日間インキュベートし、次に生細胞によってのみ吸収される色素であるニュートラルレッドで染色した。結果は、ＡｄＴ１によって生じたプラークが、Ａｄｗｔによって生じたプラークと比べてより大きい直径を有することを示している（上部パネル）。下部パネルは、光学顕微鏡で観察したプラークの拡大像（１００×）を示し、ここでは、ウイルスＡｄＴ１の細胞毒性がより高いことが確認され得る。
【図３】ＡｄＴ１に大きいプラーク表現型を付与する突然変異の同定。Ａｄｗｔ及び突然変異体ＡｄＴ１の組換えによって一連のアデノウイルスを作製し、そのうち大きいプラーク表現型を呈する組換体を調べた。図では、Ａｄｗｔゲノムが細い線で、及びＡｄＴ１ゲノムが太い線で表される。大きいプラーク表現型を示した組換体の全てに存在する共通領域を配列決定した。本発明者らは、野生型アデノウイルス５型配列との比較によって、アデノウイルス５型の２９１７３位にある１つの塩基対（ウイルスゲノムの左から右へのセンス鎖におけるＡ）の挿入を同定した。この挿入は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持シグナルを変化させる。
【図４】野生型アデノウイルス血清型５（Ａｄｗｔ）の配列と比較したときＡｄＴ１（配列番号１）に存在する突然変異の配列。図示されるＡｄｗｔヌクレオチド配列は、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端テールをコードするＡＹ３３９８６５の断片に相当する（配列番号３）。アデノウイルス突然変異体のランダムライブラリから、静脈内投与後の血液中及び腫瘍中でのより長い生存期間に対するインビボ選択（異種移植ヒト腫瘍を有する免疫不全マウスにおける）によって、ＡｄＴ１ウイルスを単離した。ＡｄＴ１ウイルスは、タンパク質Ｅ３−１９ＫをコードするＤＮＡの４４５位にアデノシンヌクレオチド（Ａ）の挿入を含む。この突然変異（以降、本明細書では４４５−Ａと称する）は、アミノ酸の配列を変化させてＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを除去する。野生型配列と比較して、突然変異配列はより短いカルボキシ末端テールを生じる。
【図５】Ｅ３−１９Ｋタンパク質及びＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける４４５−Ａ突然変異の影響の模式図。Ｅ３−１９Ｋは、アデノウイルス感染細胞の小胞体に結合する膜貫通糖タンパク質である。機能上、Ｅ３−１９Ｋは、主要組織適合性複合体クラス１タンパク質（ＭＨＣ−１）と相互作用するアミノ酸残基を含む内腔ドメイン（アミノ末端）と；小胞体における保持にポジティブなシグナル（ＥＫＫＭＰ又は配列番号６）を含む細胞質ドメイン（カルボキシ末端）とを含む。図は、Ｅ３−１９Ｋの検出に用いられる、抗体Ｔｗ１．３によって認識されるエピトープを示す。突然変異４４５−Ａは、Ｃ末端テールにおけるフレームシフト突然変異であり、ＥＫＫＭＰシグナルに相当するアミノ酸残基１５６〜１６０位を取り除くものである。この突然変異は、結果として、Ｅ３−１９Ｋの細胞膜への再局在化をもたらす。
【図６】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの４４５−Ａ突然変異の挿入によって、媒介される野生型アデノウイルスに対する大きいプラーク表現型の導入。ＡｄＴ１に存在する４４５−Ａ突然変異を、酵母の相同組換え技術を用いて野生型ウイルス（Ａｄｗｔ）に導入して、アデノウイルスＡｄ１９Ｋ−４４５Ａを得た。本発明者らは、また、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持シグナルを除去する独立した突然変異を含む別のアデノウイルス突然変異体、アデノウイルスＡｄ１９Ｋ−ＫＳも作成し、ここでは、２つのセリン（ＳＳ）が、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保持に関与するシグナルの２つのリジン（ＫＫ）に置換された（配列番号４及び配列番号５）。プラークアッセイにおいて、ＡｄＴ１、Ａｄ１９Ｋ−４４５Ａ、及びＡｄ１９Ｋ−ＫＳのプラークサイズを比較した。３つのウイルスは、大きいプラーク表現型を示した。
【図７】Ｅ３−１９Ｋの細胞局在に対するＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異の影響。挿入された突然変異がアデノウイルスＥ３−１９Ｋタンパク質の細胞局在を変化させることを実証するため、本発明者らは、ヒト腫瘍細胞系（Ａ５４９）に等用量のＡｄｗｔ及びＡｄＴ１を感染させた（ウイルス粒子１５００個／細胞）。感染後３６時間で細胞を回収し、ＰＢＳ中でインキュベートするか、又は７０％エタノールで透過処理した。次に、細胞を抗体Ｔｗ１．３（抗Ｅ３−１９Ｋ）と共にインキュベートし、緑色蛍光タンパク質で標識された二次抗体を用いてこの抗体を検出した。細胞懸濁液をフローサイトメーターに通過させたうえで、３つの独立した結果の平均値を示す。細胞膜の透過処理を行わないとき、Ｅ３−１９Ｋタンパク質はＡｄＴ１に感染した細胞のみで検出され、これは細胞表面におけるその露出を示すものである。
【図８】ＭＨＣ−Ｉの細胞局在に対するＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異の影響。突然変異型のＥ３−１９Ｋの細胞内局在が変化することによって、主要組織適合性複合体クラス１（ＭＨＣ−１）の露出が変わることを実証するため、ヒト腫瘍細胞（Ａ５４９）に等用量のＡｄｗｔ又はＡｄＴ１（ウイルス粒子１５００個／細胞）を感染させて、感染後２４時間で細胞を回収した。次に、細胞を透過処理なしに抗体Ｗ６／３２（対ＭＨＣ−１）と共にインキュベートして、細胞膜に位置するＭＨＣ−１画分のみを標識した。次に、緑色蛍光タンパク質で標識された二次抗体を用いて、結合したＷ６／３２を検出した。懸濁細胞をフローサイトメーターに通過させた。３つの独立した分析の平均値が示される。ＡｄＴ１に感染した細胞からのＭＨＣ−Ｉは、膜において、非感染細胞のＭＨＣ−Ｉと同じレベルに、及びＡｄｗｔ感染細胞のＭＨＣ−Ｉより高いレベルまで露出している。
【図９】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と関連する大きいプラーク表現型が、ＭＨＣ−Ｉの機能に依存しないことの証明。（Ａ）において、本発明者らは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを取り除く４４５Ａ突然変異を含み、且つＥ３−１９ＫのＭＨＣ−Ｉ結合ドメインに影響を及ぼす突然変異（ＣＳ４０）も含むＡｄ１９Ｋ−４４５Ａ−ＣＳ４０と命名されるアデノウイルスを作製した。Ａ５４９に感染させると、この突然変異体はＡｄＴ１と同じ大きいプラーク表現型を示し、これは、この表現型にＭＨＣ−Ｉとの結合が必要でないことを示している。下部パネル（Ｂ）は、ＭＨＣ−１が欠損した細胞系（ＤＬＤ−１細胞、ヒト結腸腺癌由来）におけるＡｄＴ１のプラークアッセイを示し、同じく大きいプラーク表現型が認められる。
【図１０】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、アデノウイルスデスタンパク質（ＡＤＰ）の過剰発現をもたらさないことの証明。本発明者らは、細胞系Ａ５４９の細胞にＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を感染させて（ウイルス粒子１５００個／細胞）、全ての細胞タンパク質を示される時点で抽出した。対照として、同じだが感染していない（モック）細胞を使用した。各試料からの等量のタンパク質抽出物（３０マイクログラム）をアクリルアミド１５％ゲルに負荷してタンパク質を分離した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ゲルに通した後、タンパク質をニトロセルロースフィルタに移し（ウエスタンブロット手順）、ＡＤＰに対する抗体で検出した。結果は、ＡｄＴ１及びＡｄｗｔが同じ量のＡＤＰを同じ動態で発現することを示している。
【図１１】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスに感染させた細胞の上清への、ウイルスのより高い放出率の証明。（Ａ）において、Ａ５４９細胞にＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を感染させて（ウイルス粒子１５００個／細胞）、上清に放出されたウイルス、又は細胞抽出物中に存在するウイルスの量（ウイルス総量）を種々の時点で計測した。生じたウイルス総量は、ＡｄｗｔとＡｄＴ１とで同じであるが、ＡｄＴ１突然変異体は、より効率的に上清に放出される。下部パネル（Ｂ）は、いくつかの細胞系に対して適用された同じ実験を示し、感染後の示される時点において、感染細胞の上清中に検出されたウイルスの量を表す。全ての細胞系において、ＡｄＴ１はより効率的に培養上清に放出される。
【図１２】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスに感染させたヒト線維芽細胞培養物の上清へのウイルスの放出。ヒト線維芽細胞にＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を感染させて（ウイルス粒子４５００個／細胞）、上清に放出されたウイルス、又は細胞抽出物中に存在するウイルスの量（ウイルス総量）を種々の時点で計測した。結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むウイルスＡｄＴ１の放出率がより高いことを示す。
【図１３】野生型アデノウイルスと比較した、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスの抗腫瘍作用。ヒト膵腺癌細胞（ＮＰ−９）を免疫不全マウス（ヌード）に皮下接種した。腫瘍が発育したところで、ウイルス粒子２×１０１０個／マウスの野生型アデノウイルス（Ａｄｗｔ）又は突然変異体ＡｄＴ１アデノウイルス（マウス１０匹／群）による単回用量で、マウスを静脈内処置した。腫瘍成長率が、０日目に対する時間（処置時間）の関数として示される。結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異によってアデノウイルスの腫瘍溶解力価が高まることを証明している。
【図１４】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの４４５−Ａ（配列番号１及び配列番号２）突然変異の挿入によって媒介される腫瘍溶解性アデノウイルスに対する大きいプラーク表現型の導入。ＩＣＯＶＩＲ５（ＣＡＳＣＡＬＬＯ Ｍ、ＡＬＯＮＳＯ ＭＭ、ＲＯＪＡＳ ＪＪ、ＰＥＲＥＺ−ＧＩＭＥＮＥＺ Ａ、ＦＵＥＹＯ Ｊ及びＡＬＥＭＡＮＹ Ｒ、「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ−Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＩＣＯＶＩＲ−５，ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐＲＢ Ｐａｔｈｗａｙ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００７年９月；１５（９）：１６０７−１５頁に開示されるとおりの）は、腫瘍溶解性アデノウイルスであり、Ｅ１ａ遺伝子における突然変異（Δ２４突然変異、デルタ２４突然変異、Ｅ１ａのｐＲＢ結合部位を取り除くＡＤ５の９２２〜９４６位のヌクレオチドの欠失）、Ｅ１ａ−Δ２４、ＤＭ１インスレーター、及びｃｃａｃｃコザック配列（これらの突然変異は全て、配列番号７によって定義されるとおり）などの発現を制御するためのＥ２Ｆ１プロモーター配列、並びに腫瘍細胞に対するその感染価を高めるためのカプシド修飾（ＲＧＤペプチド挿入）（配列番号８の突然変異）を含む。配列番号７の１〜３６６位の位置は、ヒトアデノウイルス５型（血清型）（ＡＹ３３９８６５）のＩＴＲ及びパッケージングシグナルを含む。配列番号８では、１〜１６３８位の位置、及び１６６６〜１７７３位の位置が、ヒトアデノウイルス５型の線維のコード化領域であり、それぞれ、ＡＹ３３９８６５のヌクレオチド３１０３７〜３２６７４位、及びヌクレオチド３２６７５〜３２７８２位の位置に対応する。酵母の相同組換え技術を用いてＡｄＴ１に存在する４４５−Ａ突然変異を腫瘍溶解性アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ５に導入して、アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１を得た。ＡｄΔ２４ＲＧＤ（ＳＵＺＵＫＩ，Ｋ．、ＦＵＥＹＯ，Ｊ．、ＫＲＡＳＮＹＫＨ，Ｖ．、ＲＥＹＮＯＬＤＳ，Ｐ．、ＣＵＲＩＥＬ，Ｄ．Ｔ．、及びＡＬＥＭＡＮＹ，Ｒ．、２００１年、「Ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ−２００１；７（１）：１２０−１２６頁によって開示されるとおり）は、Δ２４及びＲＧＤ突然変異を含む別のアデノウイルス突然変異体である。Ａ５４９肺腺癌細胞の単層に、細胞当たり１個（左側パネル）又は細胞当たり０．１個（右側パネル）のＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１、ＩＣＯＶＩＲ５又はＡｄΔ２４ＲＧＤのウイルス粒子を感染させるプラークアッセイにおいて、ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１、ＩＣＯＶＩＲ５及びＡｄΔ２４ＲＧＤのプラークサイズを比較した。１０日後に撮影したプレート。ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１は、ＩＣＯＶＩＲ５及びＡｄΔ２４ＲＧＤと比較して大きいプラーク表現型を示した。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
Ａ．Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの構造及び機能、並びに癌治療におけるその用途
本発明は、癌を治療するための、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに、突然変異を有するアデノウイルスの用途について記載する。この治療は、こうしたウイルスの腫瘍内での複製に基づく。
【００６３】
ウイルスゲノムの操作には、いくつかの方法が用いられる。遺伝的に修飾されたアデノウイルスの作製に用いられる方法は、遺伝子療法及びアデノウイルスによるウイルス療法の分野において、十分に確立されている。最も一般的に用いられている方法は、修飾されるアデノウイルスゲノムの領域を含むプラスミドに所望の遺伝子修飾を導入し、次に、細菌において、ウイルスゲノムの残りの部分を含むプラスミドと相同組換えを実施することに基づく。
【００６４】
腫瘍選択的複製を得るため、様々なタイプの突然変異及び遺伝子操作が行われている。そのうちの１つが、腫瘍細胞において活性を有し、且つウイルス遺伝子の発現を制御するために使用されるプロモーターの挿入である。こうしたプロモーターとしては、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、チロシナーゼプロモーター、前立腺特異的抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｅ）（ＰＳＡ）プロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、シクロオキシゲナーゼ２（ｃｏｘ−２）プロモーター、及びＨＩＦ−１（低酸素誘導因子）、Ｅｔｓ（Ｅ２６ファミリーの転写因子）及びｔｃｆ（Ｔ細胞因子）などの転写因子結合部位の導入に基づく人工プロモーターが挙げられる。本発明の一実施形態は、こうしたプロモーターと組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途である。
【００６５】
腫瘍選択的複製を実現するための、記載がなされている別の修飾は、ｐＲＢ経路を遮断する初期Ｅ１Ａ機能の欠失である。かかる突然変異体の選択的複製は、いくつかの先行技術文献で実証されている。Ｅ４及びＥ４ｏｒｆ６／７などの、ｐＲＢと直接相互作用する他のウイルス遺伝子が、腫瘍細胞における選択的複製を実現するための欠失候補である。本発明の一実施形態は、選択的複製能を付与するこうしたＥ１欠失突然変異体と組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途である。
【００６６】
腫瘍選択的複製を実現するための、記載がなされている別の修飾は、ウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡ−ＲＮＡ）をコードするアデノウイルス遺伝子の欠失である。こうしたＲＮＡはインターフェロンの抗ウイルス活性を遮断するもので、その欠失は、結果として、インターフェロンの抑制を受けることのできるアデノウイルスをもたらす。腫瘍細胞中のインターフェロン経路における特有の切断に起因して、かかるアデノウイルスは、通常、腫瘍において複製する。本発明の一実施形態は、選択的複製能を付与するウイルス関連ＲＮＡにおけるこうした欠失と組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途である。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスは、そのカプシドに修飾を含み、それによって、その感染価を高め、又は腫瘍細胞に存在する受容体に特異的となり得る。アデノウイルスのカプシドタンパク質は、感染価を亢進し、又はウイルスを腫瘍細胞に存在する受容体に対して特異的にするリガンドを含むよう、遺伝的に修飾されている。
【００６８】
ウイルスを腫瘍に対し特異的にすることは、一端でウイルスと、及び他方の端部で腫瘍受容体と結合する二機能性リガンドによってもまた実現することができる。カプシドは、また、アデノウイルスの血中生存期間を延ばして、播種性腫瘍結節に到達する可能性を高めるため、ポリエチレングリコールなどのポリマーでコートされてもよい。本発明の一実施形態は、こうしたカプシド修飾と組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの使用である。
【００６９】
本発明の別の実施形態は、複製し（複製能を有するアデノウイルス）、且つＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と、前記突然変異型Ｅ３−１９Ｋタンパク質の発現が亢進される結果となる他のゲノム修飾とを含むアデノウイルスである。突然変異型Ｅ３−１９Ｋの発現を亢進する方法は、いくつかあり得る。例えば、遺伝子転写を増加させるＥ３プロモーターの修飾、又はウイルスＲＮＡのプロセシング及びタンパク質合成に関与するウイルスタンパク質の活性を亢進する突然変異である。突然変異型Ｅ３−１９Ｋは、新規機能を提供するため、その過剰発現は、結果として、機能の向上をもたらし得る。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスに関連し、これは、また、チミジンキナーゼ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、アポトーシス促進遺伝子、免疫賦活遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子などの、腫瘍細胞におけるその細胞毒性を増加させる他の遺伝子も含む。
【００７１】
Ｂ．Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの産生、精製及び製剤
本発明で記載されるアデノウイルスは、Ｇｒａｈａｍ ＦＬ、Ｐｒｅｖｅｃ Ｌ、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；１９９１年；及びＡｌｅｍａｎｙ Ｒ、Ｚｈａｎｇ Ｗ、「Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；１９９９年に開示されるとおりの、アデノウイルス学及びアデノウイルスベクターの分野における標準方法に従って増殖させることができる。
【００７２】
好ましい増殖方法は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの複製を可能にする細胞系の感染において構成される。肺腺癌Ａ５４９細胞系は、かかる細胞系の一例である。増殖は、例えば、以下のとおり行われる：Ａ５４９細胞をプラスチック製の細胞培養プレート内で成長させて、細胞当たり５０個のウイルス粒子に感染させる。
【００７３】
２日後、細胞が剥離して「ぶどうの房様」の集団が形成されると、細胞変性効果がウイルス産生の証拠となる。細胞は回収され、試験管に保存される。細胞は、１０００ｇで５分間遠心し、細胞ペレットの凍結及び解凍を３回行って細胞内ウイルスを遊離させる。得られた細胞抽出物を１０００ｇで５分間遠心し、ウイルスを含む上清を塩化セシウム勾配上に重層し、３５．０００ｇで１時間にわたり遠心する。
【００７４】
得られたウイルスのバンドを回収し、別の塩化セシウム勾配上に再び重層して、３５．０００ｇで１６時間にわたり遠心する。ウイルスのバンドを回収し、ＰＢＳ−１０％グリセロールで透析する。透析したウイルスを一定量取り分け、−８０℃に保つ。標準プロトコルに従ってウイルス粒子及びプラーク形成単位の数の定量を行う。
【００７５】
１０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が、アデノウイルスの保存に用いられる標準的な製剤である。しかしながら、ウイルスの安定性を改善する他の製剤も記載されている。
【００７６】
Ｃ．Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの癌治療における用途
本発明は、癌を治療するための、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途について記載する。この治療は、こうしたウイルスの腫瘍細胞内での複製に基づく。
【００７７】
癌を治療するための、本発明で記載されるウイルスの使用プロトコルは、アデノウイルスによるウイルス療法及び遺伝子療法の分野で用いられるものと同じ手順に従う。遺伝子療法の分野では、複製欠損アデノウイルス及び複製コンピテントアデノウイルスの使用には、幅広い経験がある。いくつかの刊行物が、インビトロ、動物モデル又は患者による臨床治験における腫瘍細胞の処置について記載している。
【００７８】
インビトロでの細胞の処置には、上記のいずれかの製剤中にある精製されたアデノウイルスを培養培地に添加して、腫瘍細胞を感染させる。動物モデル又は患者の腫瘍を処置するためには、腫瘍内若しくは腔内注射による局所若しくは局部投与によるか、又は静脈内注入によって全身的に、アデノウイルスが送り込まれ得る。本発明の中で記載されるアデノウイルスによる腫瘍の処置は、腫瘍溶解性アデノウイルスの分野で既に記載されているとおり、化学療法又は放射線療法などの他の治療モダリティと組み合わせて用いられ得る。
【実施例】
【００７９】
実施例１
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスは、より効率的に伝播する。
突然変異を誘発されたアデノウイルスのライブラリを、以下のとおり作製した：２×１０１０個のヒトアデノウイルス５型（Ａｄｗｔ）のウイルス粒子を、０．７Ｍの亜硝酸で８分間処理することによって、突然変異を誘発した。次に、ウイルス溶液を希釈して透析し、突然変異誘発剤を除去した。突然変異を固定するため、突然変異を誘発されたウイルスを用いて、ヒト腫瘍Ａ５４９細胞を感染させて増幅し、先述のとおり、塩化セシウム勾配で精製した。
【００８０】
突然変異を誘発された原液を、皮下膵ＮＰ−９腫瘍異種移植によって、免疫抑制マウスに注入した。注入後４時間のマウスの血液中に含まれるウイルスを、Ａ５４９細胞において、インビトロで増幅し、精製し、その後のバイオセレクションラウンドにおいて、再び静脈内注入した。数ラウンド後、腫瘍中に含まれるウイルスの中で、最高の腫瘍退縮（最高の腫瘍溶解活性）を示したものを抽出した（Ｔ１抽出物）。
【００８１】
最後に、ＡｄＴ１と命名されるウイルスを、プラークアッセイを用いてＴ１抽出物から単離した。このアッセイは、腫瘍細胞の単層をウイルスの希釈溶液で感染させること、及び感染後、アガロース重層を添加することにおいて構成される。寒天は、ゼリー状ポリマーを形成し、これによって、培養物全体にわたるウイルスの伝播が防止され、ウイルスは、最初に感染した細胞から局所的に伝播し、結果として、プラークと呼ばれる細胞のないほぼ丸い範囲を形成する。
【００８２】
プラークアッセイは、Ｔ１のプラークが、親Ａｄ５プラークより大きいことを実証した（本発明の図２を参照）。この表現型により、ＡｄＴ１の細胞から細胞への伝播がＡｄｗｔより速いことが示された。この伝播性の亢進は、本発明で実証されたとおり、抗腫瘍活性を増加させることができるため、癌のウイルス療法におけるその適用に非常に有利である。
【００８３】
ＡｄＴ１ウイルスの単離後、次のステップは、大きいプラーク表現型に関与する遺伝子修飾の決定であった。ＡｄＴ１ゲノムの断片を、Ａｄ５野生型ゲノムに挿入することによって、いくつかのウイルスを作製した（図３を参照）。この表現型マップにより、大きいプラーク表現型に関与する突然変異は、アデノウイルス配列の７５．８（Ａｄ５の２７３００位）から１００マップ単位までの領域に存在することが示された。
【００８４】
ＡｄＴ１のこの領域を配列決定し、Ａｄｗｔの配列と比較した。認められた突然変異は、小胞体保持ドメインにおけるＥ３−１９Ｋタンパク質のＣ末端領域のみに局在していた（本発明の図４及び５を参照）。４４５−Ａと命名されたこの突然変異は、１つの塩基対（配列番号１に見られるとおり、翻訳鎖のアデニン及び相補鎖の各チミン）を挿入するもので、これは、ｍＲＮＡのリーディングフレームを変化させ、結果として、未変性タンパク質のＣ末端側終端の残基５’−ＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ−３’（配列番号３）に変化をもたらす。
【００８５】
この突然変異が、ウイルスＡｄＴ１の表現型に関与したことを実証するため、この突然変異を含むアデノウイルス５型を、部位特異的突然変異誘発によって作製した。Ａｄ−１９Ｋ−４４５Ａと命名されたこのウイルスは、ウイルスＡｄＴ１と同じ大きいプラーク表現型を生じたことから、ＡｄＴ１の表現型が突然変異Ｅ３−１９Ｋ ４４５−Ａによって引き起こされたことが実証された（本発明の図６を参照）。
【００８６】
本発明以前には、細胞培養物中での細胞から細胞へのより良い伝播を示す大きいプラーク表現型が、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と結び付けられたことはなかった。実際、本発明者らの知る限りでは、Ｅ３−１９Ｋのこのドメインに突然変異を含むウイルスについての発表はなく、これは、上で指摘したとおり、Ｅ３−１９Ｋのドメイン研究が単離されたタンパク質のｃＤＮＡで実施されており、ウイルスの文脈ではないためである。この先行研究は、Ｅ３−１９ＫのＣ末端テールの突然変異により細胞膜にタンパク質が存在する結果となることを記載した。
【００８７】
ＡｄＴ１の突然変異体Ｅ３−１９Ｋタンパク質が細胞膜に局在するかどうかを証明するため、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の検出を、透過処理されていない細胞において、このタンパク質に特異的な抗体（Ｔｗ１．３抗体）を用いて実施した。こうした条件下では、ＡｄＴ１を感染させた細胞は、Ｅ３−１９Ｋの細胞表面発現を提示したが、一方、Ａｄｗｔを感染させた細胞は提示しなかった（本発明の図７を参照）。膜を透過処理すると、Ｅ３−１９Ｋの小胞体にある部分は、抗体に到達可能となり、ＡｄＴ１に感染した細胞及びＡｄｗｔに感染した細胞の双方において、検出される。
【００８８】
アデノウイルスＡｄＴ１に存在する突然変異４４５−Ａは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに影響を及ぼし、結果として、細胞から細胞へのウイルス伝播の向上を示す大きいプラーク表現型をもたらす。この表現型が、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の小胞体から細胞膜への局在の変化に関連し、局在の変化が関係しない特定の４４５−Ａ突然変異に関連したものではないことを実証するため、４４５−Ａとは異なるが、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の小胞体保持ドメインに同様に影響を及ぼす突然変異を有する別のウイルを作製した。
【００８９】
Ａｄ１９Ｋ−ＫＳと呼ばれるこのアデノウイルスは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの２つのリジンの、２つのセリンに代わる置換を特徴とする（配列番号４及び配列番号５）。単離したタンパク質の研究では、このＥ３−１９Ｋにおける修飾によって、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保持がなくなることが報告されている（Ｐａｈｌ ＨＬ、Ｓｅｓｔｅｒ Ｍ、Ｂｕｒｇｅｒｔ ＨＧ、Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｂｙ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｉｔｓ ＥＲ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９６；１３２（４）：５１１−２２頁）。
【００９０】
本発明の図６に示されるとおり、作製されたアデノウイルス（Ａｄ１９Ｋ−ＫＳ）もまた、大きいプラーク表現型を呈する。この結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体局在に影響を及ぼす異なる突然変異が、結果として、ウイルス伝播性の亢進をもたらすことを実証している。
【００９１】
Ｅ３−１９Ｋの主要な機能は、ＭＨＣ Ｉとの結合及び小胞体でのＭＨＣ Ｉの保持による、感染細胞に対する免疫応答の防止であるため、ＡｄＴ１の表現型とこの機能との間の関係を調べた。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに、突然変異を含むＡｄＴ１に感染させると、結果として、Ｅ３−１９Ｋの細胞表面発現が増加する（図７）。同時に、野生型アデノウイルスに感染させた細胞と比較したとき、ＭＨＣ Ｉの細胞表面発現の増加もあった（図８）。
【００９２】
このＥ３−１９Ｋ／ＭＨＣ−Ｉ複合体の局在の変化は、大きいプラーク表現型に関与している可能性がある。この仮説を証明するため、ＡｄＴ１の４４５−Ａと、ＣＳ−４０と命名されたＥ３−１９ＫのＭＨＣ Ｉ結合ドメインにおける突然変異（未変性タンパク質のアミノ酸４０位におけるシステインからセリンへの変化）との双方の突然変異を含むウイルスを作成した。
【００９３】
ウイルスＡｄ１９Ｋ−４４５Ａ−ＣＳ４０は依然として大きいプラーク表現型を呈したが（図９を参照）、これは、大きいプラーク表現型の誘導に、細胞膜におけるＥ３−１９Ｋ／ＭＨＣ Ｉ複合体の存在は必要でないことを示している。ＭＨＣ−Ｉが大きいプラーク表現型に関与しなかったことを確認するさらなる証拠は、ＤＬＤ−１細胞のＡｄＴ１への感染であった。こうした細胞は、細胞表面ＭＨＣ Ｉ発現を欠いていたが、それでもなおＡｄＴ１はＡｄｗｔより大きいプラークを呈した（図９を参照）。
【００９４】
以前に、ＡＤＰ（Ｅ３−１１．６Ｋ）過剰発現が、結果として、本発明で提示されたものと同様の表現型をもたらすことが記載されている。ＡＤＰ過剰発現を有するアデノウイルスは、ウイルスが感染細胞からより効率的に、且つ早期に放出される結果としての、大きいプラーク表現型を特徴とする。ＡＤＰの過剰発現は、Ｅ３−１９Ｋ及び他のＥ３タンパク質を除去することにより、ひいてはＥ３−１１．６Ｋ ｍＲＮＡのスプライシングが亢進されることで実現され得る。
【００９５】
本発明の目的である、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスが、結果として、この表現型を説明し得るＡＤＰの過剰発現をもたらすかどうかを試験するため、ＡｄＴ１感染細胞におけるＡＤＰ発現を測定した。本発明の図１０に見られるとおり、抗ＡＤＰ抗体を用いたウエスタンブロットによるＡＤＰ検出から、ＡｄＴ１感染細胞のタンパク質抽出物が、Ａｄｗｔ感染細胞の抽出物と同じ量のＡＤＰを含み、同様の動態で発現したことが示された。これは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異によって引き起こされた伝播性の亢進が、ＡＤＰの過剰発現に依存しないことを実証しており、本発明の分野で既に記載されているものとは異なる新規機序を含意するものである。
【００９６】
要約すれば、この実施例は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、結果として、アデノウイルスの伝播性の向上をもたらすことを示す。いずれもこのドメインに影響を及ぼす２つの異なる突然変異が同じ効果を有し、これは、この表現型がＥ３−１９Ｋの局在の変化に関連し、特定の突然変異配列には関連しないことを示している。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの伝播性の亢進は、ＭＨＣ Ｉとの相互作用にも、ＡＤＰの過剰発現にも依存しない。
【００９７】
実施例２
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスは、感染細胞から上清中により効率的に放出される。実施例１で明らかとなった大きいプラーク表現型は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの伝播性の亢進を示す。プラークアッセイは、少数の感染細胞で開始され、ウイルスが数サイクルする結果としてのウイルスの細胞から細胞への伝播を反映する。
【００９８】
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、１回のウイルスサイクルの経過において確かな表現型の変化をもたらしたかどうかを判断するため、細胞の単層を多量のＡｄＴ１に感染させて、子孫ウイルスの産生及び放出をＡｄｗｔと比較した。１サイクルのウイルス複製におけるウイルスの産生及び放出の総量についての情報を得るため、細胞内ウイルス及び細胞培養物の上清に存在するウイルスを別個に計測した。６ウェルプレート中のＡ５４９細胞の単層に、細胞当たり１５００個のウイルス粒子を感染させた。上清及び細胞抽出物に存在するウイルスを、感染後の種々の時点で計測した。
【００９９】
結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスＡｄＴ１が、Ａｄｗｔより１００倍効率的に放出されるが、ウイルス総産生量は、影響を受けなかったことを示している（本発明の図１１上）。このアッセイは、異なる起源の腫瘍細胞系の集団で実施した。ＡｄＴ１は、全ての被験細胞系において、Ａｄｗｔより効率的に放出され（図１１下）、ウイルス放出の差は、５〜１２５倍の範囲であった。上清への放出が亢進されたこの表現型が、非腫瘍細胞においても明らかであるかどうかを確認するため、ヒト癌腫関連線維芽細胞をヒト腫瘍生検から単離した。
【０１００】
その結果から、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスＡｄＴ１が、これらの線維芽細胞においてもより効率的に放出されることが示された。要約すれば、この実施例は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有する複製コンピテントなアデノウイルスが、感染細胞からより効率的に放出されることを実証している。ウイルスの感染細胞からの放出の亢進は、癌の治療に適切なアデノウイルスの複製特性である。
【０１０１】
実施例３
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異はアデノウイルスの腫瘍溶解力価を亢進し、この突然変異を有するアデノウイルスは、腫瘍の効率的な治療に使用することができる。
皮下膵ヒト腫瘍を内包するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて、インビボ実験を実施した。合計８×１０６個のＮＰ−９細胞を、マウスの側腹部に皮下注入した。１５日後、腫瘍容積が８０〜１００ｍｍ３に達したところで、マウスを無作為に選んで異なる実験群に分けた（ｎ＝１０匹／群）。対照腫瘍は、リン酸緩衝生理食塩水を尾静脈から静脈内注入した（１５０マイクロリットル）。
【０１０２】
ＡｄＴ１による処置群は、２×１０１０個のウイルス粒子／マウスの単回静脈内注入を受けた。２日毎に腫瘍を計測し、式：Ｖ（ｍｍ３）＝Ａ（ｍｍ）Ｂ２（ｍｍ２）×３．１４／６（式中、Ｂは腫瘍の長さである）によって容積を計算した。図１３は、注射した日（０日目）以降の腫瘍成長を示す。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示される。
【０１０３】
対でない試料のためのノンパラメトリックマンホイットニー検定を用いて、差の有意性を計算した。分散分析を利用して成長曲線を比較した。結果は、ｐ＜０．０５の場合に有意であると見なされた。ＳＰＳＳ統計パッケージ（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）によって計算を実施した。ＡｄＴ１によって処置された腫瘍の成長において、注入後１０日目から実験の終了時まで有意な差が認められた。
【０１０４】
実施例４
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有する腫瘍溶解性条件付き複製アデノウイルス（ＩＣＯＶＩＲ５）は、より効率的に伝播する。
ＩＣＯＶＩＲ５（Ｃａｓｃａｌｌｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５：１６０７頁、２００７年）は、Ｅ１ａ遺伝子において突然変異している（Δ２４突然変異）腫瘍選択的アデノウイルスであり、かかる突然変異型Ｅ１ａ（突然変異は配列番号７に反映されている）の発現を制御するためのＥ２Ｆ１プロモーター配列を含み、及び配列番号８によって定義されるとおりの、腫瘍細胞に対するその感染価を高めるためのカプシド修飾（ＲＧＤペプチド挿入）を含む。
【０１０５】
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、腫瘍溶解性アデノウイルスの特徴であるこれらの遺伝子修飾と効果的に組み合わされ得ることを実証するため、Ｅ３−１９Ｋに４４５−Ａ突然変異を含むＩＣＯＶＩＲ５の誘導体（配列番号１及び配列番号２に係る）を作製し、ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１と命名した。このウイルスをプラークアッセイにおいて、親ウイルスＩＣＯＶＩＲ５、及びΔ２４突然変異及びＲＧＤ突然変異を有する第２の対照ウイルス（ＡｄΔ２４ＲＧＤと命名された）と比較した。
【０１０６】
プラークアッセイは、腫瘍細胞単層をウイルスの希釈溶液で感染させること、及び感染後に寒天重層を添加することにおいて構成される。寒天がゼリー状ポリマーを形成し、これによって、培養物全体にわたるウイルスの伝播が防止され、ウイルスは、最初に感染した細胞から局所的に伝播して、結果として、細胞単層に「プラーク」として知られる穴を形成する。
【０１０７】
Ａ５４９肺腺癌細胞の単層に、ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１、ＩＣＯＶＩＲ５又はＡｄΔ２４ＲＧＤの細胞１個当たり１個又は０．１個のウイルス粒子を感染させてプラークアッセイを実施した。１０日後に撮影したプレート（本発明の図１４）。ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１のプラークは、ＩＣＯＶＩＲ５及びＡｄΔ２４ＲＧＤのプラークより大きかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
上述された例は、血清型５から得られたＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスを例示しているが、当業者には、Ｅ３遺伝子を有し、且つタンパク質Ｅ３−１９Ｋを翻訳可能な全ての血清型が、同様に本発明の目的であることを理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、一般に癌の治療に関するものであり、より詳細には、小胞体保持ドメインにおいて突然変異しているＥ３−１９Ｋ遺伝子を含むアデノウイルス、及び癌を治療するためのこれらのアデノウイルスの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在の癌治療は、主に、化学療法、放射線療法及び外科手術に基づいている。治療が初期に適用されるときの成功率は高いにも関わらず、進行した疾患のほとんどの症例では、腫瘍を外科手術によって切除することができないか、又は照射可能な放射線及び化学治療線量が正常細胞に対する毒性によって制限されるために、根治することができない。
【０００３】
この問題を軽減するため、より高い選択性及び力価を求めて、バイオテクノロジーによる方策が開発されてきた。それらのなかでも、遺伝子療法及びウイルス療法は、癌を治療する目的でウイルスを用いるものである。遺伝子療法では、ウイルスは、その複製を回避し、且つ、治療用の遺伝子材料の媒体又はベクターとして機能するように改変される。
【０００４】
逆に、ウイルス療法は、腫瘍細胞内で選択的に複製及び増殖するウイルスを用いる。ウイルス療法では、腫瘍細胞は、治療遺伝子の作用によるのではなく、細胞内部でウイルスが複製することで引き起こされる細胞変性効果によって死滅する。腫瘍細胞内での選択的な複製は、腫瘍溶解（ｏｎｃｏｌｙｓｉｓ）として知られている。腫瘍内で選択的に複製するウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスとして知られている。
【０００５】
癌ウイルス療法は、遺伝子療法より古い。ウイルスによる癌治療に関する最初の報告は、前世紀初頭まで遡る。１９１２年、Ｄｅ Ｐａｃｅは、子宮頸癌において、狂犬病ウイルスを接種した後に、腫瘍退縮を得た（Ｄｅ Ｐａｃｅ Ｎ．Ｓｕｌｌａ ｓｃｏｍｐａｒｓａ ｄｉ ｕｎ ｅｎｏｒｍｅ ｃｒａｎｃｏ ｖｅｇｅｔａｎｔｅ ｄｅｌ ｃｏｌｌｏ ｄｅｌｌ’ｕｔｅｒｏ ｓｅｎｚａ ｃｕｒａ ｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ．Ｇｉｎｅｃｏｌｏｇｉａ １９１２；９：８２−８９頁）。それ以降、腫瘍を治療するため、多様なウイルス種が腫瘍に注入されてきた。自律性のパルボウイルス、水疱性口内炎ウイルス及びレオウイルスなど、天然で腫瘍親和性を呈するウイルスがある。
【０００６】
他のウイルスは、遺伝的に操作することで、腫瘍における選択的複製能を獲得し得る。例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、腫瘍細胞などの、増殖が活発に進行している細胞に不要な酵素活性であるリボヌクレオチド還元酵素遺伝子を欠失させることによって、腫瘍親和性にされている。しかしながら、病原性が低く、且つ腫瘍細胞を感染させる力価が高いことから、癌のウイルス療法（ｖｉｒｏｔｅｈｒａｐｙ）及び遺伝子療法においては、アデノウイルスが最も一般的に用いられているウイルスとなっている。
【０００７】
アデノウイルスには、５１種の血清型が同定されており、ＡからＦの異なる６群に分類されている。ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）はＣ群に属し、３６キロベースの直鎖状ＤＮＡを含む二十面体のタンパク質カプシドからなる。Ａｄ５感染は、成人では、多くの場合に、無症候性であり、小児では、感冒及び結膜炎を引き起こす。概して言えば、Ａｄ５は、上皮細胞に感染し、自然感染では、これは、気管支上皮細胞である。
【０００８】
Ａｄ５は、カプシドの１２個の頂点からアンテナのように伸張するウイルスタンパク質である線維が、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）として知られる細胞間接着に関与する細胞タンパク質と相互作用することによって、細胞に侵入する。
【０００９】
ウイルスＤＮＡが核に達すると、初期遺伝子（Ｅ１からＥ４）の転写が始まる。最初に発現するのは、初期１Ａ領域の遺伝子（Ｅ１Ａ）である。Ｅ１Ａは、細胞タンパク質ｐＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）に結合して、転写因子Ｅ２Ｆを放出し、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４などの他のウイルス遺伝子、及び細胞周期を活性化させる細胞遺伝子の転写を活性化させる。
【００１０】
他方で、Ｅ１Ｂは、転写因子ｐ５３に結合して、細胞周期を活性化させるとともに、感染細胞のアポトーシスを阻害する。Ｅ２は、ウイルスを複製するタンパク質をコードする。Ｅ３は、抗ウイルス免疫反応を抑制するタンパク質をコードする。
【００１１】
Ｅ４は、ウイルスＡＲＮを輸送するタンパク質をコードする。初期遺伝子の発現によって、ゲノムの複製がもたらされ、複製されると、主要な後期プロモーターが活性化される。このプロモーターが、ｍＲＮＡの発現を駆動し、ｍＲＮＡが、ディファレンシャルスプライシングによって、プロセシングを受けることで、カプシドを形成する構造タンパク質をコードする全てのＲＮＡが生じる。
【００１２】
本発明に特に関連して、Ｅ３タンパク質が、より詳細に記載される。ウイルスのライフサイクルの初期段階では、ゲノムの複製前に、Ｅ３遺伝子が、Ｅ３プロモーターから発現する。このプロモーターは、ｍＲＮＡ前駆体の発現を駆動し、このｍＲＮＡ前駆体が、スプライシングによって、９種の異なるｍＲＮＡを産生する。
【００１３】
アデノウイルスのほとんどの血清型、すなわち、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群及びＥ群の血清型において、これらのｍＲＮＡから７種のタンパク質（ポリペプチド）：Ｅ３−１２．５Ｋ、Ｅ３−６．７Ｋ、Ｅ３−１９Ｋ、Ｅ３−１１．６Ｋ（アデノウイルスデスタンパク質、すなわちＡＤＰとしても知られている）、Ｅ３−１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、Ｅ３−１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）、及びＥ３−１４．７Ｋ（ゲノム中、左から右への位置）が合成される。
【００１４】
後期の段階では、Ｅ３プロモーターは、抑制され、主要後期プロモーターが活性化される。このプロモーターから１つのｍＲＮＡ前駆体が合成され、スプライシングによって、異なるｍＲＮＡが生じる。これらの後期ｍＲＡＮから合成されるＥ３タンパク質は、Ｅ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）のみである。
【００１５】
ＡＤＰ、すなわちＥ３−１１．６Ｋは、核膜、ゴルジ膜及び小胞体膜に位置する内在性膜タンパク質である。これは、感染細胞の溶解において役割を果たす。残りのＥ３タンパク質は、感染細胞に対する免疫応答の抑制に関連した機能を有する。例えば、Ｅ３−６．７Ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβ及びＥ３−１４．７Ｋは、ＴＮＦ介在性アポトーシスから細胞を保護する。
【００１６】
Ｅ３−１９Ｋは、主要組織適合性クラス１タンパク質（ＭＨＣ−Ｉ）を小胞体に保持する膜タンパク質である。従って、Ｅ３−１９Ｋは、感染細胞の膜内での抗原提示を回避する。
【００１７】
このＥ３−１９Ｋ機能の媒介に重要なペプチド領域又はペプチドドメインが２つある。１つは、Ｅ３−１９Ｋ ＭＨＣ−Ｉ結合ドメインである。もう１つは、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端側終端にあるペプチド配列であり、これは、タンパク質を小胞体に保持し、その細胞膜への通過を回避する。当該ドメインに特異的な突然変異を有するＥ３−１９Ｋのこうした機能ドメインの記載は、発現プラスミドにおいて単離されたＥ３−１９Ｋを用いてなされている（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ Ｒ、Ｋｖｉｓｔ Ｓ、Ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０；１１１（５ 第１部）：１８０３−１０頁）。
【００１８】
腫瘍溶解性アデノウイルスの設計に関しては、重要な考慮点が２つあり、すなわち、選択性及び力価である。腫瘍細胞を指向する選択性を実現するため、腫瘍細胞に不要なウイルス機能の欠失と、ウイルスプロモーターの腫瘍選択性プロモーターとの置換という２つの方策が用いられている。
【００１９】
かかる遺伝子修飾によって、相当なレベルの選択性が得られており、腫瘍細胞における複製効率は正常細胞と比べて１万倍高い。腫瘍溶解性の力価に関しても、それを高めるためのいくつかの遺伝子修飾が同様に記載されている。こうした修飾は、ウイルスの細胞への侵入又はウイルスの細胞からの放出のいずれかに影響を及ぼす。
【００２０】
侵入ステップを増やすため、ウイルスが細胞を感染させるために用いるカプシドタンパク質が修飾されている。例えば、ＲＧＤペプチド（アルギニン−グリシン−アスパラギンモチーフ）を線維に挿入することにより、アデノウイルスは、インテグリンを用いて細胞に結合することが可能となり、野生型アデノウイルスの場合のように、単に内部に入り込むだけではなくなる。
【００２１】
ウイルスの細胞受容体としてインテグリンを用いると、感染価及び腫瘍溶解力価が高まる。感染細胞からのウイルスの放出を増加させる修飾に関しては、Ｅ１Ｂ−１９Ｋの欠失と、Ｅ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）の過剰発現との２つの記載がなされている。Ｅ１Ｂ−１９Ｋは、Ｂｃｌ−２と相同なアポトーシス阻害因子である。Ｅ１Ｂ−１９Ｋを欠失させると、感染細胞の早期アポトーシスによる細胞死が増加する。
【００２２】
この早期アポトーシスは、多くの感染細胞系において、ウイルス総産生量の減少をもたらすことが多いが、しかしながら、早期アポトーシスは、ウイルスの速やかな放出、ひいては細胞培養物におけるウイルスの伝播を加速させる。従って、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現しない突然変異体は、プラークアッセイで野生型アデノウイルスと比較して大きいプラーク表現型を呈する。
【００２３】
アデノウイルスの腫瘍溶解力価を高めるために用いられる別の方策は、Ｅ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）タンパク質の過剰発現である。このタンパク質は、感染細胞の溶解において役割を果たし、ＡＤＰ過剰発現によって、核の内部に蓄積されたウイルスの放出を増加させる。ＡＤＰ過剰発現ウイルスの表現型も、また、大きいプラーク、及び感染細胞の上清中に存在するウイルスの多さによって特徴付けられる。
【００２４】
ＡＤＰ過剰発現は、２つの機序によって実現されている：１）ＡＤＰ以外の、又はＡＤＰ及びＥ３−１２．５Ｋ以外のＥ３遺伝子の除去。この欠失によって、Ｅ３プロモーターによって駆動されるｍＲＮＡ前駆体内の他のスプライシング部位が取り除かれる。それらのスプライス部位についての競合がないため、ｍＲＮＡコード化ＡＤＰのプロセシングが優先される。２）強力プロモーターの後ろへのＡＤＰ遺伝子の挿入。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｄｅ Ｐａｃｅ Ｎ．Ｓｕｌｌａ ｓｃｏｍｐａｒｓａ ｄｉ ｕｎ ｅｎｏｒｍｅ ｃｒａｎｃｏ ｖｅｇｅｔａｎｔｅ ｄｅｌ ｃｏｌｌｏ ｄｅｌｌ’ｕｔｅｒｏ ｓｅｎｚａ ｃｕｒａ ｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ．Ｇｉｎｅｃｏｌｏｇｉａ １９１２；９：８２−８９頁
【非特許文献２】Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ Ｒ、Ｋｖｉｓｔ Ｓ、Ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０；１１１（５ 第１部）：１８０３−１０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の突然変異に基づき感染細胞からのアデノウイルスの放出を増加させるための、改良された新規機序を開示する。
【００２７】
具体的には、本発明は、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の小胞体保持ドメインの突然変異に基づくアデノウイルスの放出亢進について記載する。本発明は、Ｅ３−１９Ｋの細胞局在に影響を及ぼす突然変異に関連する表現型が、ＡＤＰの過剰発現とは関連せず、従って、感染細胞からのアデノウイルスの放出の増加が、これまでに記載されているものとも、又は示唆されているものとも異なる機序であることを実証する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
アデノウイルス５型ゲノムのランダム突然変異誘発と、それに続き、より高い腫瘍溶解力価を獲得した突然変異体の選択を行った。亜硝酸ナトリウムによる突然変異誘発によって、過渡的な突然変異が起こり、そこで、ヌクレオチド塩基の脱アミノ化が生じる。ＤＮＡの複製後、これらの脱アミノ化された塩基によって新しい対合が起こり、突然変異が固定される。アデノウイルス５型原液の突然変異誘発後、得られたプールを癌細胞系において増幅し、標準的手順によって精製した。
【００２９】
ウイルス原液は、アデノウイルス参照物質（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ：ＡＲＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ配列ファイルＡＹ３３９５６８）に相当する。事前に、ヒト腫瘍を接種した免疫不全マウス（ヌードマウス）において、腫瘍溶解性突然変異体のバイオセレクション（ｂｉｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）プロセスをインビボで実施した。血中でより長く生存し、且つ腫瘍内でより効率的に複製されたウイルスを単離し、増幅し、その後のバイオセレクションラウンドにおいて腫瘍を有するマウスに再び注入した。
【００３０】
より高い腫瘍溶解力価を呈する突然変異体を見つけるために、このランダム法を用いた例は既にあるが、その先例で用いられたバイオセレクションプロセスは異なる（Ｙａｎ Ｗ、Ｋｉｔｚｅｓ Ｇ、Ｄｏｒｍｉｓｈｉａｎ Ｆ、Ｈａｗｋｉｎｓ Ｌ、Ｓａｍｐｓｏｎ−Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ａ、Ｗａｔａｎａｂｅ Ｊら、Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３；７７（４）：２６４０−５０頁）。この先例は、本発明が主題とするものとは、異なる他の突然変異を見つけ出すものである。
【００３１】
本発明は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むことを特徴とするアデノウイルスに関する。特に、Ｅ３−１９Ｋが小胞体に保持されないようにし、それを細胞膜まで通過させるため、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｎｉｎａｌ）ドメインが除去されるか、又は修飾される。複製し、且つＥ３−１９Ｋのこの特定の突然変異を含むアデノウイルスは、感染細胞からより効率的に放出される。このより高い放出率によって、腫瘍溶解作用が高まる。この腫瘍溶解作用の亢進は、癌の治療に有用である。
【００３２】
Ｅ３−１９Ｋの記載されている機能は、免疫調節機能であることから、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端側終端の突然変異によって、感染細胞からのアデノウイルスの放出が増加することが確認されたのは意外である。特に、Ｅ３−１９Ｋについて記載されている機能は、ＭＨＣ−Ｉと結合してＭＨＣ−Ｉを小胞体に保持することによる、ＭＨＣ−Ｉの細胞膜への通過及びＭＨＣ−Ｉに関連する抗原の提示の回避に関するものである。
【００３３】
それゆえ、Ｅ３−１９Ｋを発現しないアデノウイルス突然変異体の表現型は、細胞膜におけるＭＨＣ−Ｉの存在、及びウイルスに対するより高い免疫応答を特徴とする。この表現型は、インビトロでの細胞培養物におけるアデノウイルスの増殖に影響を及ぼさず、従って、遺伝子治療ベクターのようなアデノウイルス分野の専門家は、一般に、ウイルス産生に有害な作用を有することなくＥ３領域全体を欠失させている。
【００３４】
Ｅ３−１９Ｋドメインの機能研究は、アデノウイルスの文脈を離れ、単離されたＥ３−１９Ｋタンパク質で実施されているため、Ｅ３−１９Ｋを発現しないというアデノウイルスの表現型に関するこの知識の他には、Ｅ３−１９Ｋの部分欠失を有するアデノウイルスを特徴付ける表現型は知られていない（Ｇａｂａｔｈｕｌｅｒ Ｒ、Ｋｖｉｓｔ Ｓ、Ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｅｐａｒａｔｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｔ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０；１１１（５ 第１部）：１８０３−１０頁）。
【００３５】
こうした研究において、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端テール又は小胞体保持ドメインの欠失によってウイルス放出が増加し得ると示唆されたことはなかった。このように、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの修飾が、感染細胞からのアデノウイルスの放出率を高める結果となり得ることを示唆する合理的な先行知識はない。この結果は、本発明において、感染細胞からより効率的に放出されるアデノウイルスの選択を優先する手順を用いて実施されたアデノウイルスのランダム突然変異体ライブラリのスクリーニングから出されたものである。
【００３６】
従って、本発明は、アデノウイルスを包含し、ここで、このアデノウイルスは、複製能を有し、且つＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む。
【００３７】
本発明で考察されるＥ３−１９Ｋ突然変異は、Ｅ３−１９Ｋをコードする遺伝子配列の１つ又は複数の塩基対の挿入、変更又は欠失であり得る。いずれの場合にも、作用は同じであって、それが、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに変化をもたらし、その結果、Ｅ３−１９Ｋの小胞体膜から細胞膜への移動が生じる。
【００３８】
同様に、結果として、Ｅ３−１９Ｋの同様の移動が間接的に生じる他の突然変異は、本発明の目的である。例えば、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端を取り除くプロテアーゼ標的部位の挿入、又はＥ３−１９Ｋを細胞膜に移動させることができる代替的な細胞内輸送シグナルの挿入である。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスは、また、腫瘍内での選択的複製を実現するため、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、及びＶＡ−ＲＮＡの群の１つ又は複数の遺伝子においても突然変異している。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含み、且つ腫瘍内での選択的複製を実現するための組織特異的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターをさらに含む複製アデノウイルスである。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、複製アデノウイルスはＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含み、且つ、腫瘍内での選択的複製を実現するための、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、及びＥ４からなる群からの１つ又は複数の遺伝子の発現を制御するプロモーター配列をさらに含む。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と、腫瘍細胞における感染価又は腫瘍細胞に存在する受容体に対する標的性を高めるためのカプシド修飾とを含む複製アデノウイルスである。
【００４３】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含み、且つ癌遺伝子療法の分野で一般に用いられる遺伝子をさらに含む複製アデノウイルスである。好ましくは、癌遺伝子療法の分野で一般に用いられる遺伝子は、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）及び免疫賦活遺伝子からなる群から選択される。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と、結果として前記Ｅ３−１９Ｋタンパク質の発現の亢進をもたらすゲノム修飾とを含む複製アデノウイルスである。ヌクレオチド配列の配列番号１を含む本発明の複製アデノウイルス。
【００４５】
本発明の別の態様において、複製アデノウイルスは、配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する。
【００４６】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスであり、前記アデノウイルスはヌクレオチド配列の配列番号４を含む。
【００４７】
本発明の複製アデノウイルスは、配列番号５を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する。
【００４８】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスであり、前記アデノウイルスは、少なくともヌクレオチド配列の配列番号１、配列番号７及び配列番号８を含む。
【００４９】
本発明の複製アデノウイルスは、配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含み；且つＲＧＤモチーフ（配列番号８の１６４８〜１６５６位により定義される）と；前記アデノウイルスの腫瘍細胞内での選択的複製能を付与する調節領域であって、ＤＭ１インスレーター（配列番号７の３６７〜１０９５位により定義される）、Ｅ２Ｆ１プロモーターの断片（配列番号７の１２８２〜１５４５位により定義される）、ｃｃａｃｃコザック配列（配列番号７の１５４６〜１５５０位により定義される）及びＥ１ａ−Δ２４変異アデノウイルス遺伝子（配列番号７の１５５１〜２５１２位により定義される）において構成される調節領域との挿入を含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する。
【００５０】
本発明の別の目的は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスの薬理学的に有効な投薬量と、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物である。
【００５１】
本発明の別の目的は、薬剤として使用される上記に定義されるとおりの複製アデノウイルスである。
【００５２】
癌における予防薬及び／又は治療薬としての本発明の複製アデノウイルス。
【００５３】
本発明は、また、癌の新規治療方法も提供し、これは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルスの投与を含む。
【００５４】
本発明の別の目的は、癌又は癌につながる前悪性疾患を治療又は予防するための医薬製剤の調製における、上記に定義されるとおりの複製アデノウイルスの使用である。
【００５５】
別の実施形態において、本発明のＥ３−１９Ｋ突然変異アデノウイルスは、化学療法又は放射線療法などの他の癌療法と組み合わせて使用され得る。
【００５６】
本発明は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルス、及び癌又は癌につながる前悪性疾患を治療又は予防するための前記アデノウイルスの用途について記載する。腫瘍溶解性アデノウイルスにおけるＥ３−１１．６Ｋ（ＡＤＰ）の過剰発現又はＥ１Ｂ−１９Ｋの欠失に関しては、既に報告されている。本発明とは逆に、これまでに記載されているこれらの修飾は、Ｅ３−１９Ｋの細胞膜における局在を含意することもなければ、それを必要とすることもなく、それらの作用機序は異なる。
【００５７】
本発明以前には、小胞体に結合し続けることができないＥ３−１９Ｋタンパク質の活性が、ウイルスゲノムにおいて分析されたことはなかった。Ｅ３−１９Ｋの機能については、ＭＨＣ−Ｉとの結合しか記載がなく、及びこの結合性Ｅ３−１９Ｋを介して抗原提示及び免疫応答が低下するため、ウイルスの放出と結び付く腫瘍溶解力価の上昇に関係する前記タンパク質の活性は、意外である。
【００５８】
本発明の目的である、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスは、ＨＥＫ−２９３及びＡ５４９などの、遺伝子療法及びウイルス療法の分野で一般に用いられる細胞系において増殖及び増幅される。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスを癌の治療に使用するために精製する手順は、癌のウイルス療法（ｖｉｒｏｔｅｈｒａｐｙ）及び遺伝子療法に用いられる他のアデノウイルス及びアデノウイルスベクターについて記載されるものと同じ手順である。
【発明の効果】
【００５９】
本発明は、限定はされないが、膵癌、結腸癌及び肺癌を含む癌の改良された療法に対する必要性に応えるものである。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む腫瘍溶解性アデノウイルスによる癌の治療は、アデノウイルスによる遺伝子療法及びウイルス療法の分野における標準方法を用いた腫瘍内へのウイルスの直接注入か、又は癌患者への全身投与によって実施され得る。
【００６０】
添付の図面は、上記の特徴、利点及び構造を明らかとし、且つ詳細な理解が得られるようにするために本明細書に含められている。これらの図面は本明細書の一部をなし、好ましい実施形態を例示しているが、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ヒトアデノウイルス血清型５（ＧｅｎＢａｎｋ配列ファイルＡＹ３３９８６５）のゲノムの概略図。通常、３５９３４塩基対の直鎖状ゲノムが左から右に１００マップ単位（ｍｕ）に分割される。初期（Ｅ１〜Ｅ４）ＲＮＡ及び後期（Ｌ）ＲＮＡをコードする領域が示される。Ｅ３領域は、ディファレンシャルスプライシングによるｍＲＮＡ前駆体転写産物に由来する７つのタンパク質をコードする。本発明は、Ｅ３−１９Ｋタンパク質及びそのカルボキシ末端テールに影響を及ぼす突然変異に関する。
【図２】突然変異体ＡｄＴ１の大きいプラーク表現型特性。この突然変異体は、ヒトアデノウイルス５型のゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ配列ファイルＡＹ３３９８６５）のランダム突然変異誘発と、それに続く、移植腫瘍を有するマウスの血液及び腫瘍からのウイルスの単離に基づくスクリーニングによって得られた。腫瘍細胞に対するアデノウイルスＡｄＴ１の細胞毒性を、野生型アデノウイルス（Ａｄｗｔ）の細胞毒性と比較した。ヒト腫瘍Ａ５４９細胞を６ウェルプレートに播種した。８０％のコンフルエンスで、段階希釈したＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を細胞に感染させた。感染後４時間でウイルスを取り除き、アガロースと混合した培地層で細胞単層を被覆した。感染細胞を６日間インキュベートし、次に生細胞によってのみ吸収される色素であるニュートラルレッドで染色した。結果は、ＡｄＴ１によって生じたプラークが、Ａｄｗｔによって生じたプラークと比べてより大きい直径を有することを示している（上部パネル）。下部パネルは、光学顕微鏡で観察したプラークの拡大像（１００×）を示し、ここでは、ウイルスＡｄＴ１の細胞毒性がより高いことが確認され得る。
【図３】ＡｄＴ１に大きいプラーク表現型を付与する突然変異の同定。Ａｄｗｔ及び突然変異体ＡｄＴ１の組換えによって一連のアデノウイルスを作製し、そのうち大きいプラーク表現型を呈する組換体を調べた。図では、Ａｄｗｔゲノムが細い線で、及びＡｄＴ１ゲノムが太い線で表される。大きいプラーク表現型を示した組換体の全てに存在する共通領域を配列決定した。本発明者らは、野生型アデノウイルス５型配列との比較によって、アデノウイルス５型の２９１７３位にある１つの塩基対（ウイルスゲノムの左から右へのセンス鎖におけるＡ）の挿入を同定した。この挿入は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持シグナルを変化させる。
【図４】野生型アデノウイルス血清型５（Ａｄｗｔ）の配列と比較したときＡｄＴ１（配列番号１）に存在する突然変異の配列。図示されるＡｄｗｔヌクレオチド配列は、Ｅ３−１９Ｋのカルボキシ末端テールをコードするＡＹ３３９８６５の断片に相当する（配列番号３）。アデノウイルス突然変異体のランダムライブラリから、静脈内投与後の血液中及び腫瘍中でのより長い生存期間に対するインビボ選択（異種移植ヒト腫瘍を有する免疫不全マウスにおける）によって、ＡｄＴ１ウイルスを単離した。ＡｄＴ１ウイルスは、タンパク質Ｅ３−１９ＫをコードするＤＮＡの４４５位にアデノシンヌクレオチド（Ａ）の挿入を含む。この突然変異（以降、本明細書では４４５−Ａと称する）は、アミノ酸の配列を変化させてＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを除去する。野生型配列と比較して、突然変異配列はより短いカルボキシ末端テールを生じる。
【図５】Ｅ３−１９Ｋタンパク質及びＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける４４５−Ａ突然変異の影響の模式図。Ｅ３−１９Ｋは、アデノウイルス感染細胞の小胞体に結合する膜貫通糖タンパク質である。機能上、Ｅ３−１９Ｋは、主要組織適合性複合体クラス１タンパク質（ＭＨＣ−１）と相互作用するアミノ酸残基を含む内腔ドメイン（アミノ末端）と；小胞体における保持にポジティブなシグナル（ＥＫＫＭＰ又は配列番号６）を含む細胞質ドメイン（カルボキシ末端）とを含む。図は、Ｅ３−１９Ｋの検出に用いられる、抗体Ｔｗ１．３によって認識されるエピトープを示す。突然変異４４５−Ａは、Ｃ末端テールにおけるフレームシフト突然変異であり、ＥＫＫＭＰシグナルに相当するアミノ酸残基１５６〜１６０位を取り除くものである。この突然変異は、結果として、Ｅ３−１９Ｋの細胞膜への再局在化をもたらす。
【図６】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの４４５−Ａ突然変異の挿入によって、媒介される野生型アデノウイルスに対する大きいプラーク表現型の導入。ＡｄＴ１に存在する４４５−Ａ突然変異を、酵母の相同組換え技術を用いて野生型ウイルス（Ａｄｗｔ）に導入して、アデノウイルスＡｄ１９Ｋ−４４５Ａを得た。本発明者らは、また、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持シグナルを除去する独立した突然変異を含む別のアデノウイルス突然変異体、アデノウイルスＡｄ１９Ｋ−ＫＳも作成し、ここでは、２つのセリン（ＳＳ）が、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保持に関与するシグナルの２つのリジン（ＫＫ）に置換された（配列番号４及び配列番号５）。プラークアッセイにおいて、ＡｄＴ１、Ａｄ１９Ｋ−４４５Ａ、及びＡｄ１９Ｋ−ＫＳのプラークサイズを比較した。３つのウイルスは、大きいプラーク表現型を示した。
【図７】Ｅ３−１９Ｋの細胞局在に対するＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異の影響。挿入された突然変異がアデノウイルスＥ３−１９Ｋタンパク質の細胞局在を変化させることを実証するため、本発明者らは、ヒト腫瘍細胞系（Ａ５４９）に等用量のＡｄｗｔ及びＡｄＴ１を感染させた（ウイルス粒子１５００個／細胞）。感染後３６時間で細胞を回収し、ＰＢＳ中でインキュベートするか、又は７０％エタノールで透過処理した。次に、細胞を抗体Ｔｗ１．３（抗Ｅ３−１９Ｋ）と共にインキュベートし、緑色蛍光タンパク質で標識された二次抗体を用いてこの抗体を検出した。細胞懸濁液をフローサイトメーターに通過させたうえで、３つの独立した結果の平均値を示す。細胞膜の透過処理を行わないとき、Ｅ３−１９Ｋタンパク質はＡｄＴ１に感染した細胞のみで検出され、これは細胞表面におけるその露出を示すものである。
【図８】ＭＨＣ−Ｉの細胞局在に対するＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異の影響。突然変異型のＥ３−１９Ｋの細胞内局在が変化することによって、主要組織適合性複合体クラス１（ＭＨＣ−１）の露出が変わることを実証するため、ヒト腫瘍細胞（Ａ５４９）に等用量のＡｄｗｔ又はＡｄＴ１（ウイルス粒子１５００個／細胞）を感染させて、感染後２４時間で細胞を回収した。次に、細胞を透過処理なしに抗体Ｗ６／３２（対ＭＨＣ−１）と共にインキュベートして、細胞膜に位置するＭＨＣ−１画分のみを標識した。次に、緑色蛍光タンパク質で標識された二次抗体を用いて、結合したＷ６／３２を検出した。懸濁細胞をフローサイトメーターに通過させた。３つの独立した分析の平均値が示される。ＡｄＴ１に感染した細胞からのＭＨＣ−Ｉは、膜において、非感染細胞のＭＨＣ−Ｉと同じレベルに、及びＡｄｗｔ感染細胞のＭＨＣ−Ｉより高いレベルまで露出している。
【図９】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と関連する大きいプラーク表現型が、ＭＨＣ−Ｉの機能に依存しないことの証明。（Ａ）において、本発明者らは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを取り除く４４５Ａ突然変異を含み、且つＥ３−１９ＫのＭＨＣ−Ｉ結合ドメインに影響を及ぼす突然変異（ＣＳ４０）も含むＡｄ１９Ｋ−４４５Ａ−ＣＳ４０と命名されるアデノウイルスを作製した。Ａ５４９に感染させると、この突然変異体はＡｄＴ１と同じ大きいプラーク表現型を示し、これは、この表現型にＭＨＣ−Ｉとの結合が必要でないことを示している。下部パネル（Ｂ）は、ＭＨＣ−１が欠損した細胞系（ＤＬＤ−１細胞、ヒト結腸腺癌由来）におけるＡｄＴ１のプラークアッセイを示し、同じく大きいプラーク表現型が認められる。
【図１０】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、アデノウイルスデスタンパク質（ＡＤＰ）の過剰発現をもたらさないことの証明。本発明者らは、細胞系Ａ５４９の細胞にＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を感染させて（ウイルス粒子１５００個／細胞）、全ての細胞タンパク質を示される時点で抽出した。対照として、同じだが感染していない（モック）細胞を使用した。各試料からの等量のタンパク質抽出物（３０マイクログラム）をアクリルアミド１５％ゲルに負荷してタンパク質を分離した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ゲルに通した後、タンパク質をニトロセルロースフィルタに移し（ウエスタンブロット手順）、ＡＤＰに対する抗体で検出した。結果は、ＡｄＴ１及びＡｄｗｔが同じ量のＡＤＰを同じ動態で発現することを示している。
【図１１】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスに感染させた細胞の上清への、ウイルスのより高い放出率の証明。（Ａ）において、Ａ５４９細胞にＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を感染させて（ウイルス粒子１５００個／細胞）、上清に放出されたウイルス、又は細胞抽出物中に存在するウイルスの量（ウイルス総量）を種々の時点で計測した。生じたウイルス総量は、ＡｄｗｔとＡｄＴ１とで同じであるが、ＡｄＴ１突然変異体は、より効率的に上清に放出される。下部パネル（Ｂ）は、いくつかの細胞系に対して適用された同じ実験を示し、感染後の示される時点において、感染細胞の上清中に検出されたウイルスの量を表す。全ての細胞系において、ＡｄＴ１はより効率的に培養上清に放出される。
【図１２】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスに感染させたヒト線維芽細胞培養物の上清へのウイルスの放出。ヒト線維芽細胞にＡｄｗｔ又はＡｄＴ１を感染させて（ウイルス粒子４５００個／細胞）、上清に放出されたウイルス、又は細胞抽出物中に存在するウイルスの量（ウイルス総量）を種々の時点で計測した。結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むウイルスＡｄＴ１の放出率がより高いことを示す。
【図１３】野生型アデノウイルスと比較した、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスの抗腫瘍作用。ヒト膵腺癌細胞（ＮＰ−９）を免疫不全マウス（ヌード）に皮下接種した。腫瘍が発育したところで、ウイルス粒子２×１０１０個／マウスの野生型アデノウイルス（Ａｄｗｔ）又は突然変異体ＡｄＴ１アデノウイルス（マウス１０匹／群）による単回用量で、マウスを静脈内処置した。腫瘍成長率が、０日目に対する時間（処置時間）の関数として示される。結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異によってアデノウイルスの腫瘍溶解力価が高まることを証明している。
【図１４】Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの４４５−Ａ（配列番号１及び配列番号２）突然変異の挿入によって媒介される腫瘍溶解性アデノウイルスに対する大きいプラーク表現型の導入。ＩＣＯＶＩＲ５（ＣＡＳＣＡＬＬＯ Ｍ、ＡＬＯＮＳＯ ＭＭ、ＲＯＪＡＳ ＪＪ、ＰＥＲＥＺ−ＧＩＭＥＮＥＺ Ａ、ＦＵＥＹＯ Ｊ及びＡＬＥＭＡＮＹ Ｒ、「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ−Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＩＣＯＶＩＲ−５，ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐＲＢ Ｐａｔｈｗａｙ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００７年９月；１５（９）：１６０７−１５頁に開示されるとおりの）は、腫瘍溶解性アデノウイルスであり、Ｅ１ａ遺伝子における突然変異（Δ２４突然変異、デルタ２４突然変異、Ｅ１ａのｐＲＢ結合部位を取り除くＡＤ５の９２２〜９４６位のヌクレオチドの欠失）、Ｅ１ａ−Δ２４、ＤＭ１インスレーター、及びｃｃａｃｃコザック配列（これらの突然変異は全て、配列番号７によって定義されるとおり）などの発現を制御するためのＥ２Ｆ１プロモーター配列、並びに腫瘍細胞に対するその感染価を高めるためのカプシド修飾（ＲＧＤペプチド挿入）（配列番号８の突然変異）を含む。配列番号７の１〜３６６位の位置は、ヒトアデノウイルス５型（血清型）（ＡＹ３３９８６５）のＩＴＲ及びパッケージングシグナルを含む。配列番号８では、１〜１６３８位の位置、及び１６６６〜１７７３位の位置が、ヒトアデノウイルス５型の線維のコード化領域であり、それぞれ、ＡＹ３３９８６５のヌクレオチド３１０３７〜３２６７４位、及びヌクレオチド３２６７５〜３２７８２位の位置に対応する。酵母の相同組換え技術を用いてＡｄＴ１に存在する４４５−Ａ突然変異を腫瘍溶解性アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ５に導入して、アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１を得た。ＡｄΔ２４ＲＧＤ（ＳＵＺＵＫＩ，Ｋ．、ＦＵＥＹＯ，Ｊ．、ＫＲＡＳＮＹＫＨ，Ｖ．、ＲＥＹＮＯＬＤＳ，Ｐ．、ＣＵＲＩＥＬ，Ｄ．Ｔ．、及びＡＬＥＭＡＮＹ，Ｒ．、２００１年、「Ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ−２００１；７（１）：１２０−１２６頁によって開示されるとおり）は、Δ２４及びＲＧＤ突然変異を含む別のアデノウイルス突然変異体である。Ａ５４９肺腺癌細胞の単層に、細胞当たり１個（左側パネル）又は細胞当たり０．１個（右側パネル）のＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１、ＩＣＯＶＩＲ５又はＡｄΔ２４ＲＧＤのウイルス粒子を感染させるプラークアッセイにおいて、ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１、ＩＣＯＶＩＲ５及びＡｄΔ２４ＲＧＤのプラークサイズを比較した。１０日後に撮影したプレート。ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１は、ＩＣＯＶＩＲ５及びＡｄΔ２４ＲＧＤと比較して大きいプラーク表現型を示した。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
Ａ．Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの構造及び機能、並びに癌治療におけるその用途
本発明は、癌を治療するための、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに、突然変異を有するアデノウイルスの用途について記載する。この治療は、こうしたウイルスの腫瘍内での複製に基づく。
【００６３】
ウイルスゲノムの操作には、いくつかの方法が用いられる。遺伝的に修飾されたアデノウイルスの作製に用いられる方法は、遺伝子療法及びアデノウイルスによるウイルス療法の分野において、十分に確立されている。最も一般的に用いられている方法は、修飾されるアデノウイルスゲノムの領域を含むプラスミドに所望の遺伝子修飾を導入し、次に、細菌において、ウイルスゲノムの残りの部分を含むプラスミドと相同組換えを実施することに基づく。
【００６４】
腫瘍選択的複製を得るため、様々なタイプの突然変異及び遺伝子操作が行われている。そのうちの１つが、腫瘍細胞において活性を有し、且つウイルス遺伝子の発現を制御するために使用されるプロモーターの挿入である。こうしたプロモーターとしては、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、チロシナーゼプロモーター、前立腺特異的抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｅ）（ＰＳＡ）プロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、シクロオキシゲナーゼ２（ｃｏｘ−２）プロモーター、及びＨＩＦ−１（低酸素誘導因子）、Ｅｔｓ（Ｅ２６ファミリーの転写因子）及びｔｃｆ（Ｔ細胞因子）などの転写因子結合部位の導入に基づく人工プロモーターが挙げられる。本発明の一実施形態は、こうしたプロモーターと組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途である。
【００６５】
腫瘍選択的複製を実現するための、記載がなされている別の修飾は、ｐＲＢ経路を遮断する初期Ｅ１Ａ機能の欠失である。かかる突然変異体の選択的複製は、いくつかの先行技術文献で実証されている。Ｅ４及びＥ４ｏｒｆ６／７などの、ｐＲＢと直接相互作用する他のウイルス遺伝子が、腫瘍細胞における選択的複製を実現するための欠失候補である。本発明の一実施形態は、選択的複製能を付与するこうしたＥ１欠失突然変異体と組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途である。
【００６６】
腫瘍選択的複製を実現するための、記載がなされている別の修飾は、ウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡ−ＲＮＡ）をコードするアデノウイルス遺伝子の欠失である。こうしたＲＮＡはインターフェロンの抗ウイルス活性を遮断するもので、その欠失は、結果として、インターフェロンの抑制を受けることのできるアデノウイルスをもたらす。腫瘍細胞中のインターフェロン経路における特有の切断に起因して、かかるアデノウイルスは、通常、腫瘍において複製する。本発明の一実施形態は、選択的複製能を付与するウイルス関連ＲＮＡにおけるこうした欠失と組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途である。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスは、そのカプシドに修飾を含み、それによって、その感染価を高め、又は腫瘍細胞に存在する受容体に特異的となり得る。アデノウイルスのカプシドタンパク質は、感染価を亢進し、又はウイルスを腫瘍細胞に存在する受容体に対して特異的にするリガンドを含むよう、遺伝的に修飾されている。
【００６８】
ウイルスを腫瘍に対し特異的にすることは、一端でウイルスと、及び他方の端部で腫瘍受容体と結合する二機能性リガンドによってもまた実現することができる。カプシドは、また、アデノウイルスの血中生存期間を延ばして、播種性腫瘍結節に到達する可能性を高めるため、ポリエチレングリコールなどのポリマーでコートされてもよい。本発明の一実施形態は、こうしたカプシド修飾と組み合わせた、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの使用である。
【００６９】
本発明の別の実施形態は、複製し（複製能を有するアデノウイルス）、且つＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と、前記突然変異型Ｅ３−１９Ｋタンパク質の発現が亢進される結果となる他のゲノム修飾とを含むアデノウイルスである。突然変異型Ｅ３−１９Ｋの発現を亢進する方法は、いくつかあり得る。例えば、遺伝子転写を増加させるＥ３プロモーターの修飾、又はウイルスＲＮＡのプロセシング及びタンパク質合成に関与するウイルスタンパク質の活性を亢進する突然変異である。突然変異型Ｅ３−１９Ｋは、新規機能を提供するため、その過剰発現は、結果として、機能の向上をもたらし得る。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスに関連し、これは、また、チミジンキナーゼ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、アポトーシス促進遺伝子、免疫賦活遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子などの、腫瘍細胞におけるその細胞毒性を増加させる他の遺伝子も含む。
【００７１】
Ｂ．Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの産生、精製及び製剤
本発明で記載されるアデノウイルスは、Ｇｒａｈａｍ ＦＬ、Ｐｒｅｖｅｃ Ｌ、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；１９９１年；及びＡｌｅｍａｎｙ Ｒ、Ｚｈａｎｇ Ｗ、「Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；１９９９年に開示されるとおりの、アデノウイルス学及びアデノウイルスベクターの分野における標準方法に従って増殖させることができる。
【００７２】
好ましい増殖方法は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの複製を可能にする細胞系の感染において構成される。肺腺癌Ａ５４９細胞系は、かかる細胞系の一例である。増殖は、例えば、以下のとおり行われる：Ａ５４９細胞をプラスチック製の細胞培養プレート内で成長させて、細胞当たり５０個のウイルス粒子に感染させる。
【００７３】
２日後、細胞が剥離して「ぶどうの房様」の集団が形成されると、細胞変性効果がウイルス産生の証拠となる。細胞は回収され、試験管に保存される。細胞は、１０００ｇで５分間遠心し、細胞ペレットの凍結及び解凍を３回行って細胞内ウイルスを遊離させる。得られた細胞抽出物を１０００ｇで５分間遠心し、ウイルスを含む上清を塩化セシウム勾配上に重層し、３５．０００ｇで１時間にわたり遠心する。
【００７４】
得られたウイルスのバンドを回収し、別の塩化セシウム勾配上に再び重層して、３５．０００ｇで１６時間にわたり遠心する。ウイルスのバンドを回収し、ＰＢＳ−１０％グリセロールで透析する。透析したウイルスを一定量取り分け、−８０℃に保つ。標準プロトコルに従ってウイルス粒子及びプラーク形成単位の数の定量を行う。
【００７５】
１０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が、アデノウイルスの保存に用いられる標準的な製剤である。しかしながら、ウイルスの安定性を改善する他の製剤も記載されている。
【００７６】
Ｃ．Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの癌治療における用途
本発明は、癌を治療するための、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの用途について記載する。この治療は、こうしたウイルスの腫瘍細胞内での複製に基づく。
【００７７】
癌を治療するための、本発明で記載されるウイルスの使用プロトコルは、アデノウイルスによるウイルス療法及び遺伝子療法の分野で用いられるものと同じ手順に従う。遺伝子療法の分野では、複製欠損アデノウイルス及び複製コンピテントアデノウイルスの使用には、幅広い経験がある。いくつかの刊行物が、インビトロ、動物モデル又は患者による臨床治験における腫瘍細胞の処置について記載している。
【００７８】
インビトロでの細胞の処置には、上記のいずれかの製剤中にある精製されたアデノウイルスを培養培地に添加して、腫瘍細胞を感染させる。動物モデル又は患者の腫瘍を処置するためには、腫瘍内若しくは腔内注射による局所若しくは局部投与によるか、又は静脈内注入によって全身的に、アデノウイルスが送り込まれ得る。本発明の中で記載されるアデノウイルスによる腫瘍の処置は、腫瘍溶解性アデノウイルスの分野で既に記載されているとおり、化学療法又は放射線療法などの他の治療モダリティと組み合わせて用いられ得る。
【実施例】
【００７９】
実施例１
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスは、より効率的に伝播する。
突然変異を誘発されたアデノウイルスのライブラリを、以下のとおり作製した：２×１０１０個のヒトアデノウイルス５型（Ａｄｗｔ）のウイルス粒子を、０．７Ｍの亜硝酸で８分間処理することによって、突然変異を誘発した。次に、ウイルス溶液を希釈して透析し、突然変異誘発剤を除去した。突然変異を固定するため、突然変異を誘発されたウイルスを用いて、ヒト腫瘍Ａ５４９細胞を感染させて増幅し、先述のとおり、塩化セシウム勾配で精製した。
【００８０】
突然変異を誘発された原液を、皮下膵ＮＰ−９腫瘍異種移植によって、免疫抑制マウスに注入した。注入後４時間のマウスの血液中に含まれるウイルスを、Ａ５４９細胞において、インビトロで増幅し、精製し、その後のバイオセレクションラウンドにおいて、再び静脈内注入した。数ラウンド後、腫瘍中に含まれるウイルスの中で、最高の腫瘍退縮（最高の腫瘍溶解活性）を示したものを抽出した（Ｔ１抽出物）。
【００８１】
最後に、ＡｄＴ１と命名されるウイルスを、プラークアッセイを用いてＴ１抽出物から単離した。このアッセイは、腫瘍細胞の単層をウイルスの希釈溶液で感染させること、及び感染後、アガロース重層を添加することにおいて構成される。寒天は、ゼリー状ポリマーを形成し、これによって、培養物全体にわたるウイルスの伝播が防止され、ウイルスは、最初に感染した細胞から局所的に伝播し、結果として、プラークと呼ばれる細胞のないほぼ丸い範囲を形成する。
【００８２】
プラークアッセイは、Ｔ１のプラークが、親Ａｄ５プラークより大きいことを実証した（本発明の図２を参照）。この表現型により、ＡｄＴ１の細胞から細胞への伝播がＡｄｗｔより速いことが示された。この伝播性の亢進は、本発明で実証されたとおり、抗腫瘍活性を増加させることができるため、癌のウイルス療法におけるその適用に非常に有利である。
【００８３】
ＡｄＴ１ウイルスの単離後、次のステップは、大きいプラーク表現型に関与する遺伝子修飾の決定であった。ＡｄＴ１ゲノムの断片を、Ａｄ５野生型ゲノムに挿入することによって、いくつかのウイルスを作製した（図３を参照）。この表現型マップにより、大きいプラーク表現型に関与する突然変異は、アデノウイルス配列の７５．８（Ａｄ５の２７３００位）から１００マップ単位までの領域に存在することが示された。
【００８４】
ＡｄＴ１のこの領域を配列決定し、Ａｄｗｔの配列と比較した。認められた突然変異は、小胞体保持ドメインにおけるＥ３−１９Ｋタンパク質のＣ末端領域のみに局在していた（本発明の図４及び５を参照）。４４５−Ａと命名されたこの突然変異は、１つの塩基対（配列番号１に見られるとおり、翻訳鎖のアデニン及び相補鎖の各チミン）を挿入するもので、これは、ｍＲＮＡのリーディングフレームを変化させ、結果として、未変性タンパク質のＣ末端側終端の残基５’−ＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ−３’（配列番号３）に変化をもたらす。
【００８５】
この突然変異が、ウイルスＡｄＴ１の表現型に関与したことを実証するため、この突然変異を含むアデノウイルス５型を、部位特異的突然変異誘発によって作製した。Ａｄ−１９Ｋ−４４５Ａと命名されたこのウイルスは、ウイルスＡｄＴ１と同じ大きいプラーク表現型を生じたことから、ＡｄＴ１の表現型が突然変異Ｅ３−１９Ｋ ４４５−Ａによって引き起こされたことが実証された（本発明の図６を参照）。
【００８６】
本発明以前には、細胞培養物中での細胞から細胞へのより良い伝播を示す大きいプラーク表現型が、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異と結び付けられたことはなかった。実際、本発明者らの知る限りでは、Ｅ３−１９Ｋのこのドメインに突然変異を含むウイルスについての発表はなく、これは、上で指摘したとおり、Ｅ３−１９Ｋのドメイン研究が単離されたタンパク質のｃＤＮＡで実施されており、ウイルスの文脈ではないためである。この先行研究は、Ｅ３−１９ＫのＣ末端テールの突然変異により細胞膜にタンパク質が存在する結果となることを記載した。
【００８７】
ＡｄＴ１の突然変異体Ｅ３−１９Ｋタンパク質が細胞膜に局在するかどうかを証明するため、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の検出を、透過処理されていない細胞において、このタンパク質に特異的な抗体（Ｔｗ１．３抗体）を用いて実施した。こうした条件下では、ＡｄＴ１を感染させた細胞は、Ｅ３−１９Ｋの細胞表面発現を提示したが、一方、Ａｄｗｔを感染させた細胞は提示しなかった（本発明の図７を参照）。膜を透過処理すると、Ｅ３−１９Ｋの小胞体にある部分は、抗体に到達可能となり、ＡｄＴ１に感染した細胞及びＡｄｗｔに感染した細胞の双方において、検出される。
【００８８】
アデノウイルスＡｄＴ１に存在する突然変異４４５−Ａは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに影響を及ぼし、結果として、細胞から細胞へのウイルス伝播の向上を示す大きいプラーク表現型をもたらす。この表現型が、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の小胞体から細胞膜への局在の変化に関連し、局在の変化が関係しない特定の４４５−Ａ突然変異に関連したものではないことを実証するため、４４５−Ａとは異なるが、Ｅ３−１９Ｋタンパク質の小胞体保持ドメインに同様に影響を及ぼす突然変異を有する別のウイルを作製した。
【００８９】
Ａｄ１９Ｋ−ＫＳと呼ばれるこのアデノウイルスは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインの２つのリジンの、２つのセリンに代わる置換を特徴とする（配列番号４及び配列番号５）。単離したタンパク質の研究では、このＥ３−１９Ｋにおける修飾によって、小胞体におけるＥ３−１９Ｋの保持がなくなることが報告されている（Ｐａｈｌ ＨＬ、Ｓｅｓｔｅｒ Ｍ、Ｂｕｒｇｅｒｔ ＨＧ、Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＮＦ−ｋａｐｐａＢ ｂｙ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ３／１９Ｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｉｔｓ ＥＲ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９６；１３２（４）：５１１−２２頁）。
【００９０】
本発明の図６に示されるとおり、作製されたアデノウイルス（Ａｄ１９Ｋ−ＫＳ）もまた、大きいプラーク表現型を呈する。この結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体局在に影響を及ぼす異なる突然変異が、結果として、ウイルス伝播性の亢進をもたらすことを実証している。
【００９１】
Ｅ３−１９Ｋの主要な機能は、ＭＨＣ Ｉとの結合及び小胞体でのＭＨＣ Ｉの保持による、感染細胞に対する免疫応答の防止であるため、ＡｄＴ１の表現型とこの機能との間の関係を調べた。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに、突然変異を含むＡｄＴ１に感染させると、結果として、Ｅ３−１９Ｋの細胞表面発現が増加する（図７）。同時に、野生型アデノウイルスに感染させた細胞と比較したとき、ＭＨＣ Ｉの細胞表面発現の増加もあった（図８）。
【００９２】
このＥ３−１９Ｋ／ＭＨＣ−Ｉ複合体の局在の変化は、大きいプラーク表現型に関与している可能性がある。この仮説を証明するため、ＡｄＴ１の４４５−Ａと、ＣＳ−４０と命名されたＥ３−１９ＫのＭＨＣ Ｉ結合ドメインにおける突然変異（未変性タンパク質のアミノ酸４０位におけるシステインからセリンへの変化）との双方の突然変異を含むウイルスを作成した。
【００９３】
ウイルスＡｄ１９Ｋ−４４５Ａ−ＣＳ４０は依然として大きいプラーク表現型を呈したが（図９を参照）、これは、大きいプラーク表現型の誘導に、細胞膜におけるＥ３−１９Ｋ／ＭＨＣ Ｉ複合体の存在は必要でないことを示している。ＭＨＣ−Ｉが大きいプラーク表現型に関与しなかったことを確認するさらなる証拠は、ＤＬＤ−１細胞のＡｄＴ１への感染であった。こうした細胞は、細胞表面ＭＨＣ Ｉ発現を欠いていたが、それでもなおＡｄＴ１はＡｄｗｔより大きいプラークを呈した（図９を参照）。
【００９４】
以前に、ＡＤＰ（Ｅ３−１１．６Ｋ）過剰発現が、結果として、本発明で提示されたものと同様の表現型をもたらすことが記載されている。ＡＤＰ過剰発現を有するアデノウイルスは、ウイルスが感染細胞からより効率的に、且つ早期に放出される結果としての、大きいプラーク表現型を特徴とする。ＡＤＰの過剰発現は、Ｅ３−１９Ｋ及び他のＥ３タンパク質を除去することにより、ひいてはＥ３−１１．６Ｋ ｍＲＮＡのスプライシングが亢進されることで実現され得る。
【００９５】
本発明の目的である、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスが、結果として、この表現型を説明し得るＡＤＰの過剰発現をもたらすかどうかを試験するため、ＡｄＴ１感染細胞におけるＡＤＰ発現を測定した。本発明の図１０に見られるとおり、抗ＡＤＰ抗体を用いたウエスタンブロットによるＡＤＰ検出から、ＡｄＴ１感染細胞のタンパク質抽出物が、Ａｄｗｔ感染細胞の抽出物と同じ量のＡＤＰを含み、同様の動態で発現したことが示された。これは、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異によって引き起こされた伝播性の亢進が、ＡＤＰの過剰発現に依存しないことを実証しており、本発明の分野で既に記載されているものとは異なる新規機序を含意するものである。
【００９６】
要約すれば、この実施例は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、結果として、アデノウイルスの伝播性の向上をもたらすことを示す。いずれもこのドメインに影響を及ぼす２つの異なる突然変異が同じ効果を有し、これは、この表現型がＥ３−１９Ｋの局在の変化に関連し、特定の突然変異配列には関連しないことを示している。Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの伝播性の亢進は、ＭＨＣ Ｉとの相互作用にも、ＡＤＰの過剰発現にも依存しない。
【００９７】
実施例２
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスは、感染細胞から上清中により効率的に放出される。実施例１で明らかとなった大きいプラーク表現型は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスの伝播性の亢進を示す。プラークアッセイは、少数の感染細胞で開始され、ウイルスが数サイクルする結果としてのウイルスの細胞から細胞への伝播を反映する。
【００９８】
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、１回のウイルスサイクルの経過において確かな表現型の変化をもたらしたかどうかを判断するため、細胞の単層を多量のＡｄＴ１に感染させて、子孫ウイルスの産生及び放出をＡｄｗｔと比較した。１サイクルのウイルス複製におけるウイルスの産生及び放出の総量についての情報を得るため、細胞内ウイルス及び細胞培養物の上清に存在するウイルスを別個に計測した。６ウェルプレート中のＡ５４９細胞の単層に、細胞当たり１５００個のウイルス粒子を感染させた。上清及び細胞抽出物に存在するウイルスを、感染後の種々の時点で計測した。
【００９９】
結果は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含むアデノウイルスＡｄＴ１が、Ａｄｗｔより１００倍効率的に放出されるが、ウイルス総産生量は、影響を受けなかったことを示している（本発明の図１１上）。このアッセイは、異なる起源の腫瘍細胞系の集団で実施した。ＡｄＴ１は、全ての被験細胞系において、Ａｄｗｔより効率的に放出され（図１１下）、ウイルス放出の差は、５〜１２５倍の範囲であった。上清への放出が亢進されたこの表現型が、非腫瘍細胞においても明らかであるかどうかを確認するため、ヒト癌腫関連線維芽細胞をヒト腫瘍生検から単離した。
【０１００】
その結果から、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスＡｄＴ１が、これらの線維芽細胞においてもより効率的に放出されることが示された。要約すれば、この実施例は、Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有する複製コンピテントなアデノウイルスが、感染細胞からより効率的に放出されることを実証している。ウイルスの感染細胞からの放出の亢進は、癌の治療に適切なアデノウイルスの複製特性である。
【０１０１】
実施例３
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異はアデノウイルスの腫瘍溶解力価を亢進し、この突然変異を有するアデノウイルスは、腫瘍の効率的な治療に使用することができる。
皮下膵ヒト腫瘍を内包するＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて、インビボ実験を実施した。合計８×１０６個のＮＰ−９細胞を、マウスの側腹部に皮下注入した。１５日後、腫瘍容積が８０〜１００ｍｍ３に達したところで、マウスを無作為に選んで異なる実験群に分けた（ｎ＝１０匹／群）。対照腫瘍は、リン酸緩衝生理食塩水を尾静脈から静脈内注入した（１５０マイクロリットル）。
【０１０２】
ＡｄＴ１による処置群は、２×１０１０個のウイルス粒子／マウスの単回静脈内注入を受けた。２日毎に腫瘍を計測し、式：Ｖ（ｍｍ３）＝Ａ（ｍｍ）Ｂ２（ｍｍ２）×３．１４／６（式中、Ｂは腫瘍の長さである）によって容積を計算した。図１３は、注射した日（０日目）以降の腫瘍成長を示す。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として提示される。
【０１０３】
対でない試料のためのノンパラメトリックマンホイットニー検定を用いて、差の有意性を計算した。分散分析を利用して成長曲線を比較した。結果は、ｐ＜０．０５の場合に有意であると見なされた。ＳＰＳＳ統計パッケージ（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）によって計算を実施した。ＡｄＴ１によって処置された腫瘍の成長において、注入後１０日目から実験の終了時まで有意な差が認められた。
【０１０４】
実施例４
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有する腫瘍溶解性条件付き複製アデノウイルス（ＩＣＯＶＩＲ５）は、より効率的に伝播する。
ＩＣＯＶＩＲ５（Ｃａｓｃａｌｌｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５：１６０７頁、２００７年）は、Ｅ１ａ遺伝子において突然変異している（Δ２４突然変異）腫瘍選択的アデノウイルスであり、かかる突然変異型Ｅ１ａ（突然変異は配列番号７に反映されている）の発現を制御するためのＥ２Ｆ１プロモーター配列を含み、及び配列番号８によって定義されるとおりの、腫瘍細胞に対するその感染価を高めるためのカプシド修飾（ＲＧＤペプチド挿入）を含む。
【０１０５】
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインにおける突然変異が、腫瘍溶解性アデノウイルスの特徴であるこれらの遺伝子修飾と効果的に組み合わされ得ることを実証するため、Ｅ３−１９Ｋに４４５−Ａ突然変異を含むＩＣＯＶＩＲ５の誘導体（配列番号１及び配列番号２に係る）を作製し、ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１と命名した。このウイルスをプラークアッセイにおいて、親ウイルスＩＣＯＶＩＲ５、及びΔ２４突然変異及びＲＧＤ突然変異を有する第２の対照ウイルス（ＡｄΔ２４ＲＧＤと命名された）と比較した。
【０１０６】
プラークアッセイは、腫瘍細胞単層をウイルスの希釈溶液で感染させること、及び感染後に寒天重層を添加することにおいて構成される。寒天がゼリー状ポリマーを形成し、これによって、培養物全体にわたるウイルスの伝播が防止され、ウイルスは、最初に感染した細胞から局所的に伝播して、結果として、細胞単層に「プラーク」として知られる穴を形成する。
【０１０７】
Ａ５４９肺腺癌細胞の単層に、ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１、ＩＣＯＶＩＲ５又はＡｄΔ２４ＲＧＤの細胞１個当たり１個又は０．１個のウイルス粒子を感染させてプラークアッセイを実施した。１０日後に撮影したプレート（本発明の図１４）。ＩＣＯＶＩＲ５−Ｔ１のプラークは、ＩＣＯＶＩＲ５及びＡｄΔ２４ＲＧＤのプラークより大きかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
上述された例は、血清型５から得られたＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を有するアデノウイルスを例示しているが、当業者には、Ｅ３遺伝子を有し、且つタンパク質Ｅ３−１９Ｋを翻訳可能な全ての血清型が、同様に本発明の目的であることを理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルス。
【請求項２】
腫瘍内での選択的複製を実現するため、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、及びＶＡ−ＲＮＡからなる群からの１つ又は複数の遺伝子にさらに突然変異を含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項３】
腫瘍内での選択的複製を実現するための組織特異的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターをさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項４】
前記組織特異的プロモーター又は前記腫瘍特異的プロモーターが、腫瘍内での選択的複製を実現するための、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、及びＥ４からなる群からの１つ又は複数の遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列である、請求項３に記載の複製アデノウイルス。
【請求項５】
感染価を高めるための、又は腫瘍細胞に存在する受容体に標的化するためのカプシド修飾をさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項６】
癌遺伝子療法の分野で一般に用いられる遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項７】
癌の分野で一般に用いられる前記遺伝子が、少なくとも、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、又は免疫賦活遺伝子からなる群から選択される遺伝子である、請求項６に記載の複製アデノウイルス。
【請求項８】
Ｅ３−１９Ｋタンパク質の発現を亢進する結果をもたらすゲノム修飾をさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項９】
ヌクレオチド配列の配列番号１を含む、請求項１−８のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１０】
配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する、請求項１−９のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列の配列番号４を有する、請求項１−８のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１２】
配列番号５を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する、請求項１−８及び１０のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１３】
少なくともヌクレオチド配列の配列番号１、配列番号７及び配列番号８を含む、請求項１−８のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１４】
配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する、請求項１３に記載の複製アデノウイルス。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載のアデノウイルスの薬理学的に有効な投薬量と、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
薬剤として使用される、請求項１から１４のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１７】
癌における予防薬及び／又は治療薬としての、請求項１６に記載の複製アデノウイルス。
【請求項１８】
癌又は癌につながる前悪性疾患の治療又は予防用医薬製剤を調製するための、請求項１−１４のいずれかに記載の複製アデノウイルスの利用方法。
【請求項１】
Ｅ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインに突然変異を含む複製アデノウイルス。
【請求項２】
腫瘍内での選択的複製を実現するため、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、及びＶＡ−ＲＮＡからなる群からの１つ又は複数の遺伝子にさらに突然変異を含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項３】
腫瘍内での選択的複製を実現するための組織特異的プロモーター又は腫瘍特異的プロモーターをさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項４】
前記組織特異的プロモーター又は前記腫瘍特異的プロモーターが、腫瘍内での選択的複製を実現するための、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、及びＥ４からなる群からの１つ又は複数の遺伝子の発現を制御するためのプロモーター配列である、請求項３に記載の複製アデノウイルス。
【請求項５】
感染価を高めるための、又は腫瘍細胞に存在する受容体に標的化するためのカプシド修飾をさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項６】
癌遺伝子療法の分野で一般に用いられる遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項７】
癌の分野で一般に用いられる前記遺伝子が、少なくとも、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、又は免疫賦活遺伝子からなる群から選択される遺伝子である、請求項６に記載の複製アデノウイルス。
【請求項８】
Ｅ３−１９Ｋタンパク質の発現を亢進する結果をもたらすゲノム修飾をさらに含む、請求項１に記載の複製アデノウイルス。
【請求項９】
ヌクレオチド配列の配列番号１を含む、請求項１−８のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１０】
配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する、請求項１−９のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列の配列番号４を有する、請求項１−８のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１２】
配列番号５を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する、請求項１−８及び１０のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１３】
少なくともヌクレオチド配列の配列番号１、配列番号７及び配列番号８を含む、請求項１−８のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１４】
配列番号２を有するカルボキシ末端テールを含むＥ３−１９Ｋの小胞体保持ドメインを発現する、請求項１３に記載の複製アデノウイルス。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載のアデノウイルスの薬理学的に有効な投薬量と、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
薬剤として使用される、請求項１から１４のいずれかに記載の複製アデノウイルス。
【請求項１７】
癌における予防薬及び／又は治療薬としての、請求項１６に記載の複製アデノウイルス。
【請求項１８】
癌又は癌につながる前悪性疾患の治療又は予防用医薬製剤を調製するための、請求項１−１４のいずれかに記載の複製アデノウイルスの利用方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５２０７６２（Ｐ２０１０−５２０７６２Ａ）
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５３１３８（Ｐ２００９−５５３１３８）
【出願日】平成２０年３月１２日（２００８．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５２９６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０５７９
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０８２３２４２６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１２日（２００８．３．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５２９６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０５７９
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０８２３２４２６）
【Ｆターム（参考）】
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