ＥＣＴ２のプレクストリン相同ドメインを含むポリペプチド、及びホスファチジルイノシトールに対するその結合特異性
本発明は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインの特異的な脂質結合能に関する。詳細には、本発明は、Ｅｃｔ２配列に由来し、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示す配列を有する単離ＤＨ−ＰＨ直列型ドメイン及びその使用、並びにＥｃｔ２の細胞周期活性、及びＥｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの相互作用を修飾する作用物質をスクリーニングする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインの特異的な脂質結合能に関する。詳細には、本発明は、この能力の同定、及びＥｃｔ２活性の調節物質を同定するアッセイでのこのドメインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常細胞の増殖性の成長は、一連の異なるステップである細胞周期として知られる過程を介する規則的な進行を必要とする。細胞周期を介する進行は、リン酸化カスケードが関与する複雑なシグナル伝達経路を介して、栄養利用能、細胞サイズ、及び成長因子によって調節され、特定のタンパク質の厳密に制御された発現及び安定性が細胞周期の各期で必要である。
【０００３】
細胞周期はＭ期から始まり、その期では細胞質の分裂（細胞質分裂）が生じる。Ｍ期の後にはＧ１期が続き、その期で細胞は高率の生合成及び成長を再開する。Ｓ期はＤＮＡ合成から始まり、ＤＮＡ量が２倍になったときに終了する。次いで細胞はＧ２期に入り、その期は、凝縮した染色体の出現によってシグナル伝達される有糸分裂が開始するときに終了する。最終分化細胞はＧ１期で停止し、その細胞ではもはや細胞分裂は行われない。
【０００４】
細胞周期事象の順序は、別個の各段階が、次の段階が開始する前に確実に終了するように特定のチェックポイントで厳重に調節されている。癌を含めて、異常な細胞増殖と関係するヒト疾患は、細胞周期進行のこの厳重な調節が乱れたときに生じる。細胞周期に関与するシグナル伝達経路、及びその調節におけるその経路の特定の役割を解明すると、癌及び他の増殖関連疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）の予防的、診断的及び治療的な対処に新たな機会がもたらされる。
【０００５】
その一方で、調節された形での細胞の増殖の亢進が好ましいこともある。例えば、細胞の増殖は、創傷治癒、及び組織の成長が望ましい場合に有用である。したがって、シグナル伝達経路及び機構を、増殖の抑制を促進し、亢進し又は防止する調節物質と共に同定することが望ましい。
【０００６】
細胞周期の構成成分及び調節物質を同定することが望ましいにも関わらず、この分野でそのような化合物が不足している。新たな化合物を同定する手法の１つは、タンパク質のシグナル伝達の相互作用を解明し、この相互作用を抑制し又は亢進する化合物を同定することである。
【０００７】
小さな（２１ｋＤａ）ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）のスーパーファミリーは、５つのサブファミリー：Ｒａｓ、Ｒｈｏ、ＡＤＰリボシル化因子（ＡＲＦ）、Ｒａｂ、及びＲａｎを含み、これらは多数の細胞応答を制御する分子スイッチとして働く。ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーの構成要素には、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、Ｒａｃ−１、Ｒａｃ−２、及びＣｄｃ４２がある。
【０００８】
Ｒｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼは、ＧＤＰの結合状態でもＧＴＰの結合状態でも認めることができる。ＧＴＰと結合するとき、それは、遺伝子発現の制御、アクチン細胞骨格及び細胞接着の制御、平滑筋収縮の制御、細胞形態、細胞運動、神経突起の退縮、細胞質分裂、及び細胞の形質転換を含めて、多様な細胞の過程に最終的に変化を誘導することができるシグナル伝達カスケードの下流の構成要素と相互作用する（Hall, A. Science (1998) 279:509-514）。
【０００９】
ＧＴＰとＧＤＰの結合状態の交換は、正及び負の制御機構の調節下にある。ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）は、ＧＴＰアーゼ活性を高め、それによってＧＤＰの結合状態が促進され、その状態は、ＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）との相互作用によって隔離し安定化することができる。ＧＡＰもＧＤＩも、ＧＴＰ結合Ｒｈｏファミリータンパク質のレベルの低下に作用し、それによってシグナル伝達が「切（off）」になる。その一方でグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）は低分子量ＧＴＰアーゼと相互作用し、ＧＴＰとのＧＤＰの交換を促進し、それによってその経路におけるシグナル伝達が亢進する。
【００１０】
Ｅｃｔ２は、Ｒｈｏ−ＧＥＦファミリータンパク質の構成要素であり、したがってＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼ（Ｒｈｏ、Ｒａｃ及びｃｄｃ４２）に対してＧＴＰとのＧＤＰの交換を促進する（Tatsumoto et al, 1999）。ｅｃｔ２遺伝子は、哺乳動物及び昆虫において配列及び機能レベルで保存されている。ショウジョウバエのｐｅｂｂｌｅ遺伝子（GenBank ＩＤ＃（ＧＩ）５８１７６０３）は、マウス（ＧＩ２９３３３１）及びヒトｅｃｔ２のオルソログであり、細胞質分裂の開始に必要である（Lehner CF, J. Cell Sci. (1992) 103: 1021-1030；Prokopenko SN, et al., Genes Dev (1999) 13(1 7):2301-2314）。
【００１１】
そのタンパク質は、長さが８８３アミノ酸であり、分子量が約１００ｋＤである。それは、ＢＲＣＴドメイン（ａａ１４０〜２２９及び２３５〜３２３）、Ｄｂｌ相同（ＤＨ）ドメイン（ａａ４２１〜６１０）及びプレクストリン相同ドメイン（ａａ６４４〜７６３）という４個の機能ドメインからなる。直列型のＤＨ−ＰＨドメイン構築はＧＥＦに特徴的である。データから、ＤＨドメインが相手のＧＴＰアーゼと相互作用し、そのＧＴＰアーゼ上でのヌクレオチド交換を促進し、ＰＨドメインがＤＨの交換活性のターゲッティング又は制御に関与することが示されている（Zheng et al., 2001により総説されている）。
【００１２】
Ｅｃｔ２のリン酸化は、その交換活性に必要であり、Ｇ２期とＭ期の間で起こる。ヒトＥｃｔ２は、細胞質分裂の制御に関与する。ヒトｅｃｔ２遺伝子は、第３染色体長腕の３ｑ２６に位置し（Takai S. et al., Genomics (1995) 27(1):220-222）、それは多数の癌でコピー数及び発現が増大している領域である（Bitter MA, et al., Blood (1985) 66(6): 1362-1370；Kim DH, et al., Int J Cancer. (1995) 60(6):812-8 19；Brzoska PM, et al., Cancer Res. (1995) 55(14):3055-3059；Balsara BR, et al., Cancer Res. (1997) 57(1 1):2116-2120；Heselmeyer K. et al., Genes Chromosomes Cancer (1997) 19(4):233-240；Sonoda G, et al., Genes Chromosomes Cancer. (1997) 20(4):320-8）。米国国立癌研究所から入手可能なデータ（www.ncbi.nlm.nih..cov/ncicgap）により、ヒトｅｃｔ２が、卵巣、子宮、副甲状腺、精巣、脳、及び結腸の癌で過剰発現していることが示唆される。
【００１３】
既知の機能ドメインとの相同性を有するいくつかのドメインがＥｃｔ２ポリペプチド中で同定されている。しかし、その機能はこれまで依然として不明である。これらのドメインの役割、及びこれらのドメインを調節することによりＥｃｔ２活性を調節する可能性は、細胞周期進行を調節するための依然として重要な標的である。
【００１４】
上流のシグナル伝達事象による刺激の前に、多数のＧＥＦが、部分的に活性な状態で、又は不活性な状態でも存在する。活性化は、Ｖａｖでの事象などのリン酸化事象から生じる可能性があり、Ｖａｖでの事象では、Ｙ１７４でのリン酸化によりＲａｃ相互作用部位を遮蔽するα−へリックスの折畳み構造がほどけ、それによって交換反応の進行が可能となる（Bustelo, 2000）。Ｅｃｔ２自体が、有糸分裂中のリン酸化事象の後に最大の交換活性を示すことが報告されている（Tatsumoto et al, 1999）。タンパク質とタンパク質の相互作用は、ＡＰＣのアルマジロドメインとＲａｃ特異的なＧＥＦのＡｓｅｆの相互作用によって示されるように、ＧＥＦ活性に影響を及ぼす可能性もある（Kawasaki et al., 2000）。この相互作用は、ＡｓｅｆのＧＥＦ活性の亢進をもたらし、最終的にＭＤＣＫ細胞における細胞形態の変化をもたらした。
【００１５】
ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）（下記に示す）は、真核生物のイノシトール脂質の中心単位である。それは、ホスホジエステル結合を介してジアシルグリセロールと結合したＤ−ミオ−イノシトール−１−リン酸からなる。イノシトールの頭部基は、５個の遊離ヒドロキシル基を有し、そのうち３、４及び５位にあるものが、単独で又は細胞環境との組合せでリン酸化された状態で同定されている。
【００１６】
【化１】
【００１７】
ホスファチジルイノシトール及びそのリン酸化された誘導体は、ホスホイノサイト（phosphoinosite）又はＰＩと称される。それらはすべての膜中に存在し、キナーゼ、リパーゼ及びホスファターゼを含めた様々な細胞酵素の基質となることが示されている。
【００１８】
ホスファチジルイノシトールは、哺乳動物細胞中で認められる最も豊富なイノシトール脂質であり、正常な静止細胞中でＰｔｄＩｎｓ４Ｐ及びＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２の１０〜２０倍の濃度で存在する。単独でリン酸化されたＰｔｄＩｎｓのうち、９５％に近いものがＰｔｄＩｎｓ４Ｐとして存在し、残りがＰｔｄＩｎｓ３Ｐ及びＰｔｄＩｎｓ５Ｐからなる。ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２は、最高に豊富な二重リン酸化種であり、その種は９９％を超えるそのような脂質からなり、ＰｔｄＩｎｓ３，４Ｐ２及びＰｔｄＩｎｓ３，５Ｐ２が残りを形成する。三重にリン酸化されたＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３のレベル（Stephens et al., 2000；Rameh et al., 1997）
【００１９】
リン脂質とＤｂｌファミリーのＧＥＦのＰＨドメインとの結合は、ＧＥＦ活性の調節をもたらすこともできる。Ｖａｖ及びＳｏｓのＧＥＦ活性が、ＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３の結合により活性化し（Han et al., 1998、Nimnual et al., 1998）、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２との相互作用によって抑制される（Das et al., 2000）ことが示されている。癌原遺伝子Ｄｂｌは、ＧＥＦ活性を低下させ、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２ともＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３とも相互作用することが示されている（Russo et al., 2001）。
【００２０】
リン脂質の結合は、Ｅｃｔ２のプレクストリン相同ドメイン（ａａ６４４〜７６３）によって媒介される。その小さな機能ドメインは、シグナル伝達に関与する多数のタンパク質に存在し、タンパク質キナーゼＣの基質であるプレクストリン中で最初に同定された。そのドメインの折畳みである、ｃ末端に両親媒性のへリックスが付いた２つの垂直な逆平行βシートは、リン酸化チロシン結合の折畳み（ＰＴＢ）、Ｅｎａｂｌｅｄ／ＶＡＳＰ相同ドメイン（ＥＶＨ１）及びＲａｎ結合ドメイン（ＲａｎＢＤ）と構造上非常に類似しているが、アミノ酸レベルでは類似性がほとんどない。
【００２１】
ＰＨドメインによる脂質結合は、幾名かの研究者によって研究され、これにより脂質結合特異性によるＰＨドメインの分類がなされた。一般に、脂質結合ＰＨドメインは、下記に示す４つの種類のうち１つに入れることができる（Kavran et al., 1998、Rameh et al., 1997）。
【００２２】
【００２３】
すべてのＧＥＦ由来のＰＨドメインがリン脂質の結合に関与するかどうかはまだ明らかとなっていない。ＤＨ−ＰＨの対形成における電荷の分布は、約５０％が正に帯電した残基を有し、その残基が脂質の相互作用に必要である可能性が高いことを示すものである。実際、正規の脂質結合部位の周りで負に帯電したＰＨドメインの分析では、７個のうち５個がＤＨドメインと対になっており、酸性のリン脂質と結合する可能性は低い（Blomberg & Nilges, 1997）。この考えを支持して、Olsonらは、Ｒｈｏ特異的なＧＥＦのＬｂｃ由来の負に帯電したＰＨドメインが、任意の細胞膜ではなくアクチン線維にそのタンパク質を局在化させる役割を果たすことを示した。
【００２４】
したがって、ＤｂｌファミリーのＧＥＦのＰＨドメインが交換活性に対して制御的な役割を果たすことができ、この制御がＰＩの結合により調節できることが示されている。これまで、分析されたほとんどのＰＨドメインは、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２又はＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３に対する特異性を有する。
【００２５】
これまで、ＰｔｄＩｎｓ３，５−Ｐ２と結合するＰＨドメインについての記載はほとんどない。その脂質は、ＰＩ３とＰＩ−３−Ｐ５キナーゼの連続した作用によって合成される。その生理的な役割は依然として不明であるが、その合成は、浸透圧負荷をかけた酵母でＰＩ３キナーゼ依存的に活性化される（Dove et al., 1997）。Ａｒｆ−ＧＡＰファミリーの構成要素であるβ−センタウリンだけが、ＰｔｄＩｎｓ３，５−Ｐ２と単独で結合することが示されている（Dowler et al., 2000）。このファミリーは、リン脂質結合プロファイルが異なる１０種のＰＨドメイン含有構成要素からなるが、その機能的な関連は依然として不明である。
【００２６】
さらに、Ｒｈｏ−ＧＥＦのＥｃｔ２に由来するＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの脂質結合特異性は、これまで実証されていない。
【非特許文献１】Hall, A. Science (1998) 279:509-514
【非特許文献２】Lehner CF, J. Cell Sci. (1992) 103: 1021-1030
【非特許文献３】Prokopenko SN, et al., Genes Dev (1999) 13(1 7):2301-2314
【非特許文献４】Takai S. et al., Genomics (1995) 27(1):220-222
【非特許文献５】Bitter MA, et al., Blood (1985) 66(6): 1362-1370
【非特許文献６】Kim DH, et al., Int J Cancer. (1995) 60(6):812-8 19
【非特許文献７】Brzoska PM, et al., Cancer Res. (1995) 55(14):3055-3059
【非特許文献８】Balsara BR, et al., Cancer Res. (1997) 57(1 1):2116-2120
【非特許文献９】Heselmeyer K. et al., Genes Chromosomes Cancer (1997) 19(4):233-240
【非特許文献１０】Sonoda G, et al., Genes Chromosomes Cancer. (1997) 20(4):320-8
【非特許文献１１】www.ncbi.nlm.nih..cov/ncicgap
【非特許文献１２】Stephens et al., 2000
【非特許文献１３】Dove et al., 1997
【非特許文献１４】Dowler et al., 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明は、Ｅｃｔ２に由来するＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの同定について記載し、様々なＰＩに対するこの特異性を実証する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
したがって、本発明の一態様では、Ｅｃｔ２配列に由来し、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示されるヌクレオチド配列を有する単離ＤＨ−ＰＨ直列型ドメインが提供される。好ましくは、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列１（配列番号３）として示すアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、単離ＤＨ−ＰＨ配列は、アミノ酸配列２（配列番号４）として示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列１（配列番号２）で示されるものなどの発現構築物の一部である。
【００２９】
本発明の他の態様では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの相互作用を調節する作用物質（agent）をスクリーニングする方法が提供され、この方法は、結合を導く条件下でＥｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチド及び前記ＰＩを候補作用物質と共にインキュベートするステップと、前記候補作用物質がＥｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの結合を調節するかどうかを判定するステップとを含む。
【００３０】
「Ｅｃｔ２のＰＨドメイン」とは、Ｅｃｔ２ポリペプチドのアミノ酸６４４〜７６３で示されるプレクストリン相同ドメインに対応するアミノ酸配列を有するＥｃｔ２ポリペプチドの領域、或いはその断片、誘導体又は相同な配列を意味する。したがって、「Ｅｃｔ２のＰＨドメイン」という語句は、そのポリペプチドの配列と、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示されるヌクレオチド配列など、そのポリペプチドの配列をコードするヌクレオチド配列の両方を示すのに使用する。適切には、前記Ｅｃｔ２のＰＨドメインを、その天然の構造を有する折り畳まれたポリペプチドとして提供する。好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを、本明細書に記載のＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの一部として提供する。したがって、特に好ましい実施形態では、ＰＨドメインを、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示される配列を有する構築物の一部として提供する。
【００３１】
一実施形態では、ＰＩは、イノシトール環の３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩである。適切には、ＰＩには、ＰｔｄＩｎｓ３−Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ５−Ｐ及びＰｔｄＩｎｓ３，５−Ｐ２がある。
【００３２】
好ましい実施形態では、前記作用物質は、抗体、有機小分子又はアンチセンスオリゴマーである。
【００３３】
他の態様では、Ｅｃｔ２の活性を調節する作用物質を同定する方法が提供され、その方法は、
（ａ）Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドと候補作用物質とを含む試料を提供するステップと、
（ｂ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合を測定するステップと、
（ｃ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合を、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドに結合しないことが知られている対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合と比較するステップとを含み、
対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合と比較した、試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性の亢進から、候補作用物質がＥｃｔ２の細胞周期機能を調節することが示唆される。
【００３４】
一実施形態では、Ｅｃｔ２の活性は脂質結合活性である。適切には、Ｅｃｔ２の活性はその細胞周期活性である。
【００３５】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインが、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩとの結合に対する特異性を有することを本明細書において実証する。４位のリン酸基は、３位及び／又は５位がリン酸化されている場合でもＰＩとＥｃｔ２の結合を抑制すると思われる。
【００３６】
したがって、本発明の他の態様では、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩによるシグナル伝達の調節に適した化合物を同定するスクリーニング法における、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩと結合できるが、４位にリン酸基を有するＰＩと結合できないポリペプチドの使用が提供される。
【００３７】
適切には、ポリペプチドは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含む。一実施形態では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインは、ＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの形態である。具体的には、Ｅｃｔ２のＰＨドメインは、本明細書に示す配列を有する構築物として提供される。
【００３８】
ＤＮＡ配列１（配列番号１）は、Ｅｃｔ２のＤＨ−ＰＨドメインをコードするｃＤＮＡ分子である。
【００３９】
ＤＮＡ配列２（配列番号２）は、発現ｃＤＮＡ分子構築物である。
【００４０】
ＡＡ配列１（配列番号３）は、ＤＮＡ配列１（配列番号１）に対応するアミノ酸配列である。
【００４１】
ＡＡ配列２（配列番号４）は、ＤＮＡ配列２（配列番号２）に対応するアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
特に明示しない限り、本明細書で使用するすべての技術的及び科学的用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学における）当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。分子的方法、遺伝学的方法及び生化学的方法には標準的な技術を使用する。一般には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.；並びにGuthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991)、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.)、McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991)、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.)、及びGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)を参照されたい。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本発明との関係では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインという用語は、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩに対して特異的にその化合物と結合するのに必要な能力を有する限り、その範囲内にその変異体、誘導体及び断片も含む。
【００４４】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドに関して「変異体」又は「誘導体」という用語は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドの配列からの又はそれへの、１個（又は複数個の）アミノ酸の任意の置換、変異、修飾、代替、欠失又は付加が生じたものを含む。好ましくは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインをコードする核酸は、その変異体又は誘導体を含むと理解される。
【００４５】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの天然の変異体は、保存的なアミノ酸置換を含む可能性が高い。保存的な置換は、例えば下記の表に従って定義することができる。第２列の同じ区画の、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００４６】
【００４７】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの適切な断片は、長さが少なくとも約５アミノ酸、例えば１０、１２、１５又は２０アミノ酸である。その断片は、長さが１００、７５又は５０アミノ酸未満でもよい。その断片は、保存的な置換を含めて、１個又は複数個の（例えば、５、１０、１５、又は２０個の）置換、欠失又は挿入を含んでよい。
【００４８】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの好ましいタンパク質誘導体又は断片は、完全長配列のアミノ酸６４４〜７６３として示すＥｃｔ２のＰＨドメインのうち連続した範囲と、一部の場合では、完全長配列のアミノ酸６４４〜７６３に対応するＥｃｔ２のＰＨドメインの配列の長さ全体と少なくとも８０％の配列同一性又は類似性を有し、好ましくは少なくとも８５％の、より好ましくは少なくとも９０％の、さらに好ましくは少なくとも９５％の、最も好ましくは９７％又は１００％の配列同一性又は類似性を有する。好ましいＥｃｔ２のＰＨドメインはさらに、Ｅｃｔ２の完全アミノ酸配列のアミノ酸４５０〜６４８（ＲＨＯＧＥＦドメイン）に対応するアミノ酸配列、或いはその断片又は誘導体を含む。これらのドメインは、ｐｆａｍプログラム（Bateman et al., Nucleic Acids Res. (1999) 27:260-262；http://pfam.wustl.edu/）を用いて同定することができ、このプログラムは、各ドメインの詳細な説明も含む（ＲＨＯＧＥＦドメイン：ＰＦ００６２ Ｉ；ＰＨドメイン：ＰＦＯＯ １６９）。
【００４９】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの断片又は誘導体は「機能的に活性」であることが好ましく、このことは、それがアミノ酸６４４〜７６３のアミノ酸配列を含む完全長野生型のＥｃｔ２のＰＨドメインに伴う１種又は複数種の機能的な活性を示すことを意味する。
【００５０】
一例として、断片又は誘導体は抗原性を有してもよく、その結果、Ｅｃｔ２タンパク質に対する抗体の生成に関して下記でさらに論じるように、イムノアッセイ、免疫感作、Ｅｃｔ２活性の調節などでそれを使用することができる。好ましくは、機能的に活性なＥｃｔ２のＰＨドメインの断片又は誘導体は、シグナル伝達活性や、３位又は５位にリン酸を有するＰＩに対して特異的なＰＩとの結合など、１種又は複数種の生物活性を示すものである。
【００５１】
「Ｅｃｔ２の核酸」という用語は、Ｅｃｔ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。好ましくは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチド又は核酸或いはその断片は、ヒト由来である（例えば、本明細書でＤＮＡ配列１（配列番号１）で示される）が、好ましくはＤＮＡ配列１（配列番号１）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するそのオルソログ又は誘導体でもよい。オルソログは、当業者に知られている方法を用いて、ＤＮＡ配列１（配列番号１）を使用したＢＬＡＳＴ分析によって同定することができる（Huynen MA and Fork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5849-5856；Huynen MA et al., Genome Research (2000) 10: 1204-1210）。
【００５２】
Ｅｃｔ２の核酸及びポリヌクレオチドの単離、生成、及び発現
Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドを得るのに多様な方法が利用可能である。一般に、ポリペプチドの使用目的から、発現、生成、及び精製の方法の詳細が決定される。例えば、調節作用物質のスクリーニングに使用するポリペプチドの生成には、このタンパク質の特定の生物活性を保存する方法が必要となることがあるが、抗体生成用のポリペプチドの生成には、特定のエピトープの構造的な完全性が必要となることがある。スクリーニング又は抗体生成用に精製するポリペプチドの発現には、特定のタグの付加（すなわち、融合タンパク質の生成）が必要となることがある。タンパク質の発現、生成、及び精製のための技術は、当業者に周知である；そのための任意の適切な手段を使用することができる（例えば、Higgins SI and Hames ED (eds.) Protein Expression:A Practical Approach, Oxford University Press Inc., New York 1999；Stanbury PF et al., Principles of Fermentation Technology, 2nd edition, Elsevier Science, New York, 1995；Doonan S (ed3 Protein Purification Protocols, Huinana Press, New Jersey, 1996；Coligan JE et al, Current Protocols in Protein Science (eds.), 1999, John Wiley & Sons, New York；米国特許第６，１６５，９９２号)。Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、挿入したタンパク質コード配列を発現させるための任意の適当なベクター中に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めた必要な転写及び翻訳のシグナルは、天然のｅｃｔ２遺伝子及び／又はその隣接領域に由来するものでもよく、或いは異種のものでもよい。
【００５３】
原核細胞又は真核細胞中でｅｃｔ２遺伝子を発現させることができ、選択する方法は、そのタンパク質の使用目的に依存する。具体的には、天然の折畳み及び翻訳後修飾が必要であるとき、真核生物の系は特に有用である。好ましい原核細胞には、大腸菌及び枯草菌がある。好ましい真核細胞には、哺乳動物細胞（ヒト、マウス、サルやチャイニーズハムスター卵巣の細胞など）、酵母細胞（ピキア（Pichia）属やサッカロミセス属の種など）、及び昆虫細胞（ショウジョウバエや、種々の鱗翅目細胞系統、例えばＳｆ９細胞など）がある。Ｅｃｔ２ポリペプチドを単離するために、細胞の抽出物又は上清を精製することができる。好ましい精製技術には、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、並びに当業者に知られている他のタンパク質精製技術がある。
【００５４】
場合によっては、ペプチド結合を介して異種のタンパク質の配列と結合した融合又はキメラ産物として、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドを発現させることができる。例えば、Ｅｃｔ２由来のポリペプチドの検出及び／又は精製を促進するために、Ｅｃｔ２発現ベクター構築物は、Ｅｃｔ２コード領域のＮ末端、Ｃ末端及び／又はその遺伝子配列内の任意の位置に１個又は複数個の抗体のエピトープコード配列を含んでもよい。適切な配列には、Ｍｙｃエピトープ、ＨＡエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ又はポリヒスチジンエピトープ（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照）がある。他の例として、ＧＦＰやルシフェラーゼなどの転写レポーターと結合した融合タンパク質として、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドを発現させることができる。標準的な方法を用いて適当なコードフレーム中で所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を互いに連結し、そのキメラ産物を発現させることにより、キメラタンパク質を作製することができる。タンパク質合成技術によって、例えばペプチド合成装置の使用によってキメラタンパク質を作製することもできる（Hunkapiller et al., Nature (1984) 310:105-111）。
【００５５】
Ｅｃｔ２調節作用物質
本発明は、ＰＨドメインとの相互作用により、したがってＰＩとの、特に３位及び／又は５位にリン酸を有するＰＩとの結合の調節により、Ｅｃｔ２及び／又はｐ２１経路と相互作用しかつ／又はその機能を調節する作用物質を同定する方法を提供する。そのような作用物質は、ｐ２１経路、細胞周期及びイノシトールシグナル伝達の欠陥が関与する疾患又は異常と関係する様々な診断及び治療上の適用にも、Ｅｃｔ２タンパク質並びに細部周期及びｐ２１経路に対するその寄与についてのさらなる分析にも有用である。
【００５６】
好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２調節作用物質は、Ｅｃｔ２活性を抑制又は亢進し、或いは、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、及び細胞の又は細胞外の活性を含めた正常なＥｃｔ２の機能にその他の形で影響を及ぼす。さらに好ましい実施形態では、候補イノシトールシグナル伝達経路調節作用物質は、Ｅｃｔ２の機能を特異的に調節する。「特異的な調節作用物質」、「特異的に調節する」などの語句は、本明細書において、Ｅｃｔ２のポリペプチド又は核酸と直接結合し、好ましくはＥｃｔ２の機能を抑制し、亢進し又はその他の形で変化させる調節作用物質を指すのに使用される。その用語は、Ｅｃｔ２とその結合相手又は基質の相互作用を（例えば、Ｅｃｔ２の結合相手と、又はタンパク質／結合相手の複合体と結合し、その機能を抑制することにより）変化させる調節作用物質も包含する。
【００５７】
好ましいＥｃｔ２調節作用物質には、小分子化学作用物質、抗体及び他の生物学的治療物質を含めたＥｃｔ２相互作用タンパク質、並びにアンチセンスオリゴマー及びＲＮＡを含めた核酸調節物質がある。調節作用物質は、例えば、併用療法の場合と同様に、他の有効成分、及び／或いは適切な担体又は添加剤を含むことがある組成物として、薬剤組成物中で製剤することができる。生物学的治療用作用物質を製剤する方法は、米国特許第６，１４６，６２８号中に詳細に記載されている。化合物を製剤し投与する技術は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th edition中に見つけることができる。
【００５８】
小分子調節物質
小分子調節物質は通常、分子量が１０，０００未満であり、好ましくは５，０００未満であり、より好ましくは１，０００未満であり、最も好ましくは５００未満である有機非ペプチド性分子である。この種類の調節物質には、化学的に合成された分子、例えばコンビナトリアル化学ライブラリー由来の化合物がある。小分子調節物質は、既知の構造的な特性、例えば３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩとの結合能、或いは上記に記載の方法を用いて識別される他の特性に基づいて合理的に設計することができる。相手のＧタンパク質（ＲｈｏＡ／Ｒａｃ／ＣＤＣ４２）との複合体中でのＥｃｔ２の構造は、ＧＥＦ活性に必要なタンパク質とタンパク質の相互作用の詳細を示すものであり、それを使用して、これらの相互作用の機構を調節し、それによってＧＥＦの機能を破壊する小分子化合物の合理的な設計の助けとすることができる。ＧＥＦ活性の調節に使用する小分子リガンドとの複合体中でのＥｃｔ２ポリペプチドの構造から、触媒活性部位に直接関与し、又はその活性部位に対してアロステリック効果を発揮し、それによってＧＥＦ活性を調節するＥｃｔ２分子の部分が示される。小分子調節物質は、化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。
【００５９】
代替の小分子調節物質には、天然の産物、特に植物や菌類などの生物からの二次代謝物があり、Ｅｃｔ２の調節活性があるかどうか化合物ライブラリーをスクリーニングすることによってそれを同定することもできる。化合物を生成し取得する方法は、当技術分野で周知である（Schreiber SL, Science (2000) 151: 1964-1969; Radmann J and GuntherJ, Science (2000) 15 1:1947-1948）。
【００６０】
スクリーニングアッセイから同定された小分子調節物質は、下記に記載のように、リード化合物として使用することができ、それから候補の臨床的な化合物を設計し、最適化し、合成することができる。そのような臨床的な化合物は、細胞周期又はイノシトールシグナル伝達の欠陥に関連する病変の治療に有用性がある可能性がある。二次の機能検証の反復、構造決定、並びに候補調節物質の修飾及びその試験により、候補小分子調節物質の活性を数倍高めることができる。さらに、候補の臨床的な化合物は、臨床及び薬剤上の特性を特に考慮して生成される。例えば、薬剤開発で試薬を誘導体化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのアッセイを用いて再度スクリーニングして、活性を最適化し毒性を最小限にすることができる。
【００６１】
タンパク質調節物質
Ｅｃｔ２のＰＨドメインと相互作用するタンパク質は、内因性、すなわちＥｃｔ２と遺伝学的に又は生化学的に通常相互作用するものでよい。Ｅｃｔ２調節物質には、顕性不活性型のＥｃｔ２相互作用タンパク質及びＥｃｔ２タンパク質自体が含まれる。酵母２ハイブリッド及び変異体スクリーニングは、内因性のＥｃｔ２相互作用タンパク質を同定するための好ましい方法を提供するものである（Finley, R. L. et al. (1996), DNA Cloning-Expression Systems: A Practical Approach, eds. Glover D. & Hames B. D (Oxford University Press, Oxford, England), pp. 169-203；Fashema SF et al., Gene (2000) 250:1-14；Drees BL Curr Opin Chem Biol (1999) 3:64-70: Vidal M and Legrain P Nucleic Acids Res (1999) 27:919-29；及び米国特許第５，９２８，８６８号）。質量分析は、タンパク質複合体を解明するための代替の好ましい方法を提供するものである（例えば、Pandley A and Mann M, Nature (2000) 405:837-846；Yates JR, Trends Genet (2000) 16:5-8に総説がある）。
【００６２】
Ｅｃｔ２相互作用タンパク質は、Ｅｃｔ２特異的な抗体又はＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でもよい（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照）。Ｅｃｔ２抗体については、下記でさらに論じる。
【００６３】
好ましい一実施形態では、Ｅｃｔ２相互作用タンパク質は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインと特異的に結合する。代替の好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２調節作用物質は、Ｅｃｔ２の基質、結合相手、又は補因子と結合する。特定の適用では、Ｅｃｔ２相互作用タンパク質をスクリーニングで使用して小分子調節物質を同定するとき、様々な既知の方法により、結合の平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ）及び免疫原性の特性を含めて、Ｅｃｔ２タンパク質とのその相互作用タンパク質の結合特異性についてアッセイを行うことができる。酵素及び受容体に関しては、基質及びリガンドのプロセシングにより、結合についてそれぞれアッセイを行うことができる。
【００６４】
特異的抗体
好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２相互作用タンパク質は抗体である。Ｅｃｔ２ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、既知の方法を使用して生成することができる。好ましくは、抗体は、哺乳動物Ｅｃｔ２ポリペプチドに、より好ましくはヒトＥｃｔ２に特異的である。特に好ましい実施形態では、抗体は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインと特異的に結合する。
【００６５】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片でもよい。記載されている通りに、標準的な手順によって、親和性が１０８Ｍ−１であり、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１であり又はそれより強いモノクローナル抗体を作製することができる（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratory (1988)；Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York；並びに米国特許第４，３８１，２９２号；第４，４５１，５７０号；及び第４，６１８，５７７号）。Ｅｃｔ２を発現する細胞の抽出物に対して、或いは実質的に精製されたＥｃｔ２又はその断片から抗体を生成することができる。Ｅｃｔ２の断片を使用する場合、その断片は、好ましくはＥｃｔ２タンパク質の少なくとも１０個の、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。適切には、Ｅｃｔ２の断片はＰＨドメインを含む。特定の実施形態では、Ｅｃｔ２特異的な抗原及び／又は免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質と結合している。例えば、対象のポリペプチドをスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）担体と共有結合させ、その結合物を、免疫応答を亢進するフロイント完全アジュバント中で乳化する。実験用のウサギやマウスなどの適当な免疫系を、従来のプロトコールに従って免疫感作させる。
【００６６】
固定化された対応するＥｃｔ２ポリペプチドを用いた固相の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの適当なアッセイにより、Ｅｃｔ２特異的抗体が存在するかどうかアッセイを行う。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなどの他のアッセイを使用することもできる。
【００６７】
異なる動物種由来の異なる部分を含むＥｃｔ２ポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。例えば、抗体の生物活性がヒト抗体に由来し、その結合特異性がネズミ断片に由来するように、ヒトイムノグロブリンの定常領域をネズミｍＡｂの可変領域と結合することができる。それぞれの種由来の適当な領域をコードする遺伝子を互いにスプライシングすることによってキメラ抗体を生成する（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1984) 81:6851-6855；Neuberger et al., Nature (1984) 312:604-608；Takeda et al., Nature (1985) 31:452-454）。組換えＤＮＡ技術によってマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）（Carlos, T. M., 3. M. Harlan., Blood (1994) 84:2068-2101）をヒトのフレームワーク領域及び定常領域中に移植することにより、キメラ抗体の形態であるヒト化抗体を生成することができる（Riechmann LM, et al,, Nature (1988) 323:323-327）。ヒト化抗体は、ネズミの配列を約１０％、ヒトの配列を約９０％含み、したがって抗体の特異性を保持しながら免疫原性がさらに軽減され又は除去される（Co MS, and Queen C., Nature (1991) 35 1:501-501；Morrison SL., Ann. Rev. Immun. (1992) 10:239-265）。ヒト化抗体及びその生成方法は当技術分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。
【００６８】
組換え体であるＥｃｔ２特異的な単鎖抗体、アミノ酸の橋を介してＦｖ領域の重鎖と軽鎖の断片を結合することによって形成された単鎖ポリペプチドを生成することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, Science (1988) 242:423-426；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883；及びWard et al., Nature (1989) 334:544-546）。
【００６９】
抗体生成に適した他の技術では、リンパ球を抗原性ポリペプチドに、或いはファージ又は同様のベクターの抗体ライブラリーから選択されたものにｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露する（Ruse et al., Science (1989) 246:1275-1281）。
【００７０】
本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾して又は修飾せずに使用することができる。しばしば、検出可能なシグナルをもたらし、又は標的とするタンパク質を発現する細胞に対して毒性がある物質を共有結合又は非共有結合することによってポリペプチド及び抗体を標識する（Menard S, et al., Int J. Biol Markers (1989)4: 131-134）。多様な標識及びその結合技術が知られており、科学文献でも特許文献でも広範に報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、抑制物質、蛍光部分、蛍光放射性ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁性粒子などがある（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；及び第４，３６６，２４１号）。また、組換えイムノグロブリンを生成することもできる（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通性毒素タンパク質と結合することによって、細胞質タンパク質に対する抗体を送達し、その標的に到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
【００７１】
患者において治療上使用するとき、本発明の抗体は、通常は非経口で、可能であれば標的部位に、又は静脈内に投与する。治療上有効な投与量及び投与法は、臨床試験によって決定する。通常、投与する抗体の量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与では、製剤上許容される賦形剤と合わせて、単位投与量を注射可能な形態（例えば、液剤、懸濁剤、乳剤）で抗体を製剤する。そのような賦形剤は、本質的に非毒性であり非治療的なものである。例としては、水、食塩水、リンガー液、デキストロース液、及び５％ヒト血清アルブミンがある。不揮発性油、オレイン酸エチルやリポソーム担体などの非水性賦形剤を使用することもできる。賦形剤は、等張性及び化学的安定性を高め、又はその他の形で治療潜在性を高める緩衝液や保存剤など少量の付加剤を含んでもよい。そのような賦形剤中での抗体の濃度は通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法の方法は、文献中にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６号；ＷＯ００７３４６９）。
【００７２】
核酸調節物質
他の好ましいＥｃｔ２調節作用物質は、アンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）など、一般にＥｃｔ２活性を抑制する核酸分子を含む。
【００７３】
好ましいアンチセンスオリゴマーは、ＤＮＡ複製、転写、Ｅｃｔ２ＲＮＡの移行、Ｅｃｔ２ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＲＮＡスプライシングやＥｃｔ２ＲＮＡの任意の触媒活性など、Ｅｃｔ２核酸の機能に干渉する。
【００７４】
代替の好ましいＥｃｔ２調節作用物質は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉとは、配列特異的な、動物及び植物における翻訳後の遺伝子発現抑制の方法であり、発現抑制される遺伝子と配列が相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫（C. elegans）、ショウジョウバエ、植物及び哺乳動物で遺伝子を発現抑制するＲＮＡｉの使用に関する方法は、当技術分野で既知である（Fire A, et al., 1998 Nature 391:806-811；Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)；Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)；Hammond, S. M., et al., Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)；Tuschl, T. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001)；Hamilton, A. et al., Science 286, 950-952 (1999)；Hammond, S. M., et al., Nature 404, 293-296 (2000)；Zamore, P. D., et al., Cell 101,25-33 (2000)；Bernstein, E., etal., Nature 409, 363-366 (2001)；Elbashir, S. M., etal., Genes Dev. 15, 188-200 (2001)；ＷＯ０１２９０５８；ＷＯ９９３２６１９、及びElbashir SM, et al., 2001 Nature 4 11:494-498）。
【００７５】
アッセイ系
本発明は、Ｅｃｔ２活性の特異的な調節物質を同定するアッセイ系を提供する。一般に、一次アッセイを使用して、Ｅｃｔ２の核酸又はタンパク質或いはＥｃｔ２のＰＨドメインに関する調節物質の特異的な生化学的又は分子的効果を同定し又は確認する。一般に、二次アッセイで、一次アッセイによって同定されたＥｃｔ２調節作用物質の活性をさらに評価し、その調節作用物質が細胞周期の制御に関係のある形でＥｃｔ２に影響を及ぼすことを確認することができる。
【００７６】
プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインは、２つの垂直な逆平行βシートと、Ｃ末端の両親媒性のへリックスとを含む。その結合ループにおける変異性が大きいことが報告されている。ＰＨドメインについての報告された機能には、ヘテロマーＧタンパク質のβ／γサブユニットの結合、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２の結合、ホスホＳｅｒ／Ｔｈｒの結合、及び膜相互作用がある。
【００７７】
ＲｈｏＧＥＦドメイン（ＤＨ又はＤｂｌドメイン）は、平らに引き伸ばされたαへリックスの束に折り畳まれた１１個のαへリックスを含む。その役割は、Ｒｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼと結合したＧＤＰの解離を促進し、ＧＴＰの結合を促進し、それによってシグナル伝達を活性化することであると考えられる。
【００７８】
小分子のＧＥＦ活性抑制能の検出に適したアッセイでは、Ｅｃｔ２に由来するポリペプチドをＲｈｏＡと共に３Ｈ ＧＤＰの存在下でインキュベートし、候補小分子の存在下又は不在下での３Ｈの保持率を検出する。
【００７９】
一次アッセイ
一般に、試験する調節物質の種類によって一次アッセイの種類が決定される。
【００８０】
小分子調節物質では、スクリーニングアッセイを使用して候補調節物質を同定する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、或いは標的タンパク質の重要な生化学反応を再現し又は保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam OS et al., Curr Opin Chem Biol (1997) 1:384-91及び添付の参照文献に総説がある）。本明細書において、「細胞に基づく」という用語は、生細胞、死細胞、又は膜、小胞体やミトコンドリア分画などの特定の細胞分画を使用するアッセイを指す。細胞に基づくスクリーニングアッセイは通常、Ｅｃｔ２のＰＨドメインの組換え発現の系、及び特定のアッセイで要求される任意の補助タンパク質を必要とする。「無細胞」という用語は、実質的に精製されたタンパク質（内因性、又は組換えにより生成）、部分的に精製された細胞抽出物、又は粗細胞抽出物を使用するアッセイを包含する。スクリーニングアッセイで、タンパク質とＤＮＡの相互作用、タンパク質とタンパク質の相互作用（例えば、受容体とリガンドの結合）、転写活性（例えばレポーター遺伝子を使用して）、酵素活性（例えば、基質の特性を介して）、二次メッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態の変化又は他の細胞の特徴を含めた様々な分子的事象を検出することができる。適当なスクリーニングアッセイでは、蛍光法（Klebe C, et al., Biochemistry (1995) 34:12543-12552）、放射活性法（Hart M, et al., Nature (1991) 354:311-314）、比色法、分光光度法、及び電流測定法を含めた広範な検出方法を使用して、しばしば高処理能スクリーニング（ＨＴＳ）の形式で（例えば、HertzbergRP, and Pope AJ, Current Opinion in Chemical Biology (2000) 4:445-451を参照）、検出した特定の分子的事象を読み出すことができる。
【００８１】
結合性の作用物質のアッセイには、天然のＥｃｔ２結合標的とのＥｃｔ２の相互作用を調節する化合物のスクリーニングがある。そのようなアッセイで使用するＥｃｔ２ポリペプチドを、検出又は固着用などのペプチドタグなど他のポリペプチドと融合することができる。特定の実施形態では、その結合標的は、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＣ、Ｒａｃ、又はＣｄｃ４２、或いはその一部であり、それはアッセイ中で好都合にも測定可能である対象のＥｃｔ２ポリペプチドに結合特異性及び結合活性をもたらし、好ましくは完全なＲｈｏＡ、ＲｈｏＣ、Ｒａｅ、又はＣｄｃ４２に類似する。候補調節作用物質が存在しなければ、Ｅｃｔ２ポリペプチドが細胞の結合標的、その一部又はアナログと基準の結合親和性で特異的に結合する条件下で、Ｅｃｔ２及び結合標的を候補Ｅｃｔ２調節作用物質の存在下及び不在下（すなわち調節下）でインキュベートする。インキュベーションの後、その作用物質によって偏向した、Ｅｃｔ２ポリペプチドと１個又は複数個の結合標的間の結合が、光学密度又は電子密度、放射性の放出、非放射性のエネルギー転移などを介するものや、抗体結合物での間接的な検出など、その産物及び他のアッセイ構成成分の性質に依存する様々な方法のいずれかによって検出される。作用物質の存在下での結合親和性と比較した、作用物質の不在下での標的とのＥｃｔ２の結合親和性の差から、その作用物質がＥｃｔ２結合標的とのＥｃｔ２の結合を調節することが示唆される。本明細書においては、差は統計上有意であり、好ましくは５０％の、好ましくは６０％の、より好ましくは７５％の、最も好ましくは９０％の差となる。
【００８２】
他の好ましいアッセイ形式は、蛍光偏光法、時間分解蛍光法、蛍光共鳴エネルギー転移法を含めた蛍光技術を使用するものである。これらの系は、色素標識分子から放出されたシグナルの強度が相手の分子とのその相互作用に依存する、タンパク質とタンパク質の、又はＤＮＡとタンパク質の相互作用をモニターする手段を提供する（例えば、Selvin PR, Nat Struct Biol (2000) 7:730-4；Fernandes PB, Curr Opin Chem Biol (1998) 2:597-603；Hertzberg RP and Pope AJ, Curr Opin Chem Biol (2000) 4:445-451）。
【００８３】
抗体の調節物質では、適当な一次アッセイは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインタンパク質に対するその抗体の特異性及び親和性を試験するものである。抗体の特異性及び親和性を試験する方法は当技術分野で周知である。或いは、又はさらには、抗体の調節物質の一次アッセイは、上記に記載のスクリーニングアッセイを含んでもよく、それを用いてＥｃｔ２調節物質特異的な活性を検出する。
【００８４】
二次の検証は、イノシトールシグナル伝達関連経路におけるｅｃｔ２のＰＨドメインの関与を機能的に検証するのに使用する基本的に同じアッセイを使用することができる。二次の検証アッセイは、候補調節物質の存在下及び不在下での細胞の集団（例えば、野生型細胞の２種のプール）を一般に比較する。
【００８５】
他の実施形態では、二次の検証は、高処理能スクリーニングに使用する同じアッセイを使用することができる。この方法では、抗体やアンチセンスオリゴヌクレオチド調節物質など高処理能スクリーニングにより同定されない調節物質の活性を確認することもでき、或いは異なる高処理能スクリーニングアッセイを使用して同定された小分子調節物質の活性を確認することもできる。このアッセイを使用して、候補作用物質の特異性を確認することもできる。
【００８６】
さらに、細胞周期に関連する形でＥｃｔ２に対するその有効性について調節物質のアッセイを行う。そのようなアッセイには、特に、上記に記載の細胞周期、アポトーシス、増殖、及び低酸素誘導アッセイがある。
【００８７】
治療及び診断上の適用
患者において抗腫瘍療法に使用するとき、患者の腫瘍量をなくし又は減らす治療有効量でＥｃｔ２調節作用物質を患者に投与する。その作用物質は、通常は非経口で、可能であれば標的細胞部位に、又は静脈内に投与する。投与量及び投与法は、癌の性質（原発性又は転移性）、その集団、標的部位、特定の免疫毒素の特徴（使用時）、例えば、その治療指数、他の治療薬と併用して作用物質を投与するかどうか、及び患者の病歴に依存する。投与する作用物質の量は通常、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【００８８】
非経口投与では、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、製剤上許容される賦形剤と合わせて、単位投与量を注射可能な又は吸入可能な形態（例えば、液剤、懸濁剤、乳剤）で作用物質を製剤する。
【００８９】
Ｅｃｔ２と特異的に結合する抗体は、Ｅｃｔ２の発現を特徴とする状態又は疾患の診断に、或いはＥｃｔ２調節作用物質で治療している患者をモニターするアッセイで使用することができる。Ｅｃｔ２の診断アッセイには、抗体及び標識を利用して、ヒトの体液或いは細胞又は組織の抽出物中でＥｃｔ２を検出する方法がある。抗体は、修飾して又は修飾せずに使用することができ、それをレポーター分子と共有結合又は非共有結合することによって標識することができる。
【００９０】
Ｅｃｔ２の発現を特徴とする状態の診断は、患者試料中でのＥｃｔ２の発現を測定する（上記で論じた）ノーザン分析やTaqMan（登録商標）分析など様々な方法のいずれかによって行うこともできる。
【００９１】
次に、限定するものではないが以下の実施例を参照しながら本発明を説明する。
【実施例】
【００９２】
方法
Ｅｃｔ２のクローン化及び発現
その対応するアミノ酸配列がＥｃｔ２のＡＡ配列１（配列番号３）として示される、ＤＨ−ＰＨドメインをコードするｃＤＮＡ（ＤＮＡ配列１（配列番号１））を、pENTR-3cベクター（GIBCO社製）中のEcoR1部位にクローン化した。次いで、組換え反応を用いてこの配列をpDEST10（GIBCO社製）に移し、分子量が４９．８ｋＤと推定され、Ｅｃｔ２由来のＤＨドメイン（ａａ３９〜２３５）及びＰＨドメイン（ａａ２６９〜３８８）、並びに精製用のＮ末端ｈｉｓタグ（ａａ５〜１０）を含む４３４ａａのタンパク質を発現する構築物を得た。最終的な発現構築物の配列は、ＤＮＡ配列２（配列番号２）中に示す。
【００９３】
ＤＮＡ配列１（配列番号１）
ccagttccttcaaagcagtcagcaaggtggcaagttgcaaaagagctttatcaaactgaaagtaattatgttaatatattggcaacaattattcagttatttcaagtaccattggaagaggaaggacaacgtggtggacctatccttgcaccagaggagattaagactatttttggtagcatcccagatatctttgatgtacacactaagataaaggatgatcttgaagaccttatagttaattgggatgagagcaaaagcattggtgacatttttctgaaatattcaaaagatttggtaaaaacctaccctccctttgtaaacttctttgaaatgagcaaggaaacaattattaaatgtgaaaaacagaaaccaagatttcatgcttttctcaagataaaccaagcaaaaccagaatgtggacggcagagccttgttgaacttcttatccgaccagtacagaggttacccagtgttgcattacttttaaatgatcttaagaagcatacagctgatgaaaatccagacaaaagcactttagaaaaagctattggatcactgaaggaagtaatgacgcatattaatgaggataagagaaaaacagaagctcaaaagcaaatttttgatgttgtttatgaagtagatggatgcccagctaatcttttatcttctcaccgaagcttagtacagcgggttgaaacaatttctctaggtgagcacccctgtgacagaggagaacaagtaactctcttcctcttcaatgattgcctagagatagcaagaaaacggcacaaggttattggcacttttaggagtcctcatggccaaacccgacccccagcttctcttaagcatattcacctaatgcctctttctcagattaagaaggtattggacataagagagacagaagattgccataatgcttttgccttgcttgtgaggccaccaacagagcaggcaaatgtgctactcagtttccagatgacatcagatgaacttccaaaagaaaactggctaaagatgctgtgtcgacatgtagctaacaccatttgtaaa
【００９４】
ＤＮＡ配列２（配列番号２）
atgtcgtactaccatcaccatcaccatcacctcgaatcaacaagtttgtacaaaaaagcaggctctttaaaggaaccaattcagtcgactggatccggtaccgaattcgcccttccagttccttcaaagcagtcagcaaggtggcaagttgcaaaagagctttatcaaactgaaagtaattatgttaatatattggcaacaattattcagttatttcaagtaccattggaagaggaaggacaacgtggtggacctatccttgcaccagaggagattaagactatttttggtagcatcccagatatctttgatgtacacactaagataaaggatgatcttgaagaccttatagttaattgggatgagagcaaaagcattggtgacatttttctgaaatattcaaaagatttggtaaaaacctaccctccctttgtaaacttctttgaaatgagcaaggaaacaattattaaatgtgaaaaacagaaaccaagatttcatgcttttctcaagataaaccaagcaaaaccagaatgtggacggcagagccttgttgaacttcttatccgaccagtacagaggttacccagtgttgcattacttttaaatgatcttaagaagcatacagctgatgaaaatccagacaaaagcactttagaaaaagctattggatcactgaaggaagtaatgacgcatattaatgaggataagagaaaaacagaagctcaaaagcaaatttttgatgttgtttatgaagtagatggatgcccagctaatcttttatcttctcaccgaagcttagtacagcgggttgaaacaatttctctaggtgagcacccctgtgacagaggagaacaagtaactctcttcctcttcaatgattgcctagagatagcaagaaaacggcacaaggttattggcacttttaggagtcctcatggccaaacccgacccccagcttctcttaagcatattcacctaatgcctctttctcagattaagaaggtattggacataagagagacagaagattgccataatgcttttgccttgcttgtgaggccaccaacagagcaggcaaatgtgctactcagtttccagatgacatcagatgaacttccaaaagaaaactggctaaagatgctgtgtcgacatgtagctaacaccatttgtaaagcaagggcgaattcgcggccgcactcgagatatctagacccagctttcttgtacaaagtggttgattcgaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactag
【００９５】
ＡＡ配列１（配列番号３）
pvpskqsarwqvakelyqtesnyvnilatiiqlfqvpleeegqrggpilapeeiktifgsipdifdvhtkikddledlivnwdesksigdiflkyskdlvktyppfvnffemsketiikcekqkprfhaflkinqakpecgrqslvellirpvqrlpsvalllndlkkhtadenpdkstlekaigslkevmthinedkrkteaqkqifdvvyevdgcpanllsshrslvqrvetislgehpcdrgeqvtlflfndcleiarkrhkvigtfrsphgqtrppaslkhihlmplsqikkvldiretedchnafallvrppteqanvllsfqmtsdelpkenwlkmlcrhvantick
【００９６】
ＡＡ配列２（配列番号４）
msyyhhhhhhlestslykkagslkepiqstgsgtefalpvpskqsarwqvakelyqtesnyvnilatiiqlfqvpleeegqrggpilapeeiktifgsipdifdvhtkikddledlivnwdesksigdiflkyskdlvktyppfvnffemsketiikcekqkprfhaflkinqakpecgrqslvellirpvqrlpsvalllndlkkhtadenpdkstlekaigslkevmthinedkrkteaqkqifdvvyevdgcpanllsshrslvqrvetislgehpcdrgeqvtlflfndcleiarkrhkvigtfrsphgqtrppaslkhihlmplsqikkvldiretedchnafallvrppteqanvllsfqmtsdelpkenwlkmlcrhvantickaransrphsryldpaflykvvdsrlltkperklswllpplsnn
【００９７】
Ｅｃｔ２−ＤＨ−ＰＨをRosetta(DE3)pLysS細胞中で発現させた。細胞を３７℃で増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導してから３時間後にそれを回収した。細胞ペレットをBugBuster HTタンパク質抽出試薬（Novagen社製）で製造元の説明書に従って処理することによって封入体分画を単離した。
【００９８】
封入体ペレットを、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０／１ｍＭ ＤＴＴ／６Ｍ ＧｕＨＣｌ中、タンパク質濃度０．３８ｍｇ／ｍｌで再可溶化した。次いでタンパク質を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、潜在的な核形成部位を除去した。可溶性分画を「再折畳み用緩衝液」５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０／１ｍＭ ＤＴＴ／１０％グリセロール／１００ｍＭ ＮａＣｌ中に迅速に希釈（１：１１）することによって、タンパク質の再折畳みを開始させた。次いで試料を０．２μｍフィルターによりろ過し、その後「再折畳み用緩衝液」に対して広範な透析を４℃で１晩行って残存する微量のＧｄｎＨＣｌを除去した。タンパク質を０．２μｍフィルターにより再度ろ過し、その後１０ｋＤａで遮断するAmicon社製Centriprepを用いて濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、この段階でのタンパク質を純度＞８０％であると判断した。
【００９９】
リン脂質結合アッセイ
Ｅｃｔ２のＤＨ−ＰＨドメイン（Ｅｃｔ２−ＤＨ−ＰＨ）のリン脂質結合特異性を評価するため、脂質重層アッセイを行った。クロロホルム／メタノール／水（１：２：０．８）の混合物中に溶解した２５０ｐｍｏｌのリン脂質を含む脂質溶液（１μｌ）を、Hybond-C extra膜上にスポット化し、室温で乾燥させた。脂肪酸を含まないＢＳＡを３％（ｗ：ｖ）含むＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス／Ｈｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Tween-20）中で６０分間インキュベートすることによりその膜をブロッキング処理した。次いで、０．５ｍｇ／ｍｌのＥｃｔ２−ＤＨ−ＰＨを含む同じ溶液中でその膜を４℃で１晩インキュベートした。次いでその膜をＴＢＳＴで広範に洗浄し、１：１０００希釈した抗６＊ｈｉｓ抗体（Sigma社製）を含むＴＢＳＴと共に６０分間インキュベートした。以前の通りにＴＢＳＴでその膜を洗浄した後に、１：５０００希釈した抗マウスＨＲＰ結合物を含むＴＢＳＴ中で６０分間インキュベートした。次いで、以前の通りにその膜を洗浄し、その膜をECL試薬（AmershamPharmacia社製）中に浸し、その膜を写真フィルム（Kodak社製）に露出することによってＥｃｔ２−ＤＨ−ＰＨの存在を検出した。
【０１００】
結果
図１はＥｃｔ２ＤＨ−ＰＨの発現を示す。
Ｅｃｔ２ＤＨ−ＰＨは、E.Coli (DE3)pLysS中で不溶性タンパク質として発現した。封入体分画を調製し、６Ｍ ＧｄｎＨＣｌを含む緩衝液中へと変性させ、その後迅速に希釈し透析して変性剤を除去することによって、タンパク質の再折畳みを行った。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシー染色（左図）又はウェスタンブロット法（右図）によって視覚化した。図１（ａ）はＥｃｔ２ＤＨの発現を示し、レーン１：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝０、レーン２：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋１時間、レーン３：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋２時間、レーン４：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋３時間である。図１（ｂ）は、再折畳みを行ったＥｃｔ２ＤＨを示し、レーン１〜４は、再折畳みを行った異なる添加量のＥｃｔ２ＤＨを示す。
【０１０１】
図２は、Ｅｃｔ２のＰＩＰ結合の特異性を示す。
１ ホスファチジルコリン
２ ホスファチジルエタノールアミン
３ ホスファチジルイノシトール
４ ホスファチジルイノシトール−３リン酸（ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ）
５ ホスファチジルイノシトール−４リン酸（ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ）
６ ホスファチジルイノシトール−５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ５Ｐ）
７ ホスファチジルイノシトール−３，４リン酸（ＰｔｄＩｎｓ３，４Ｐ２）
８ ホスファチジルイノシトール−３，５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ３，５Ｐ２）
９ ホスファチジルイノシトール−４，５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２）
【０１０２】
これらの結果から、３位及び／又は５位にあるＰＯ３−は結合を促進するが、４位にあるＰＯ３−は３位又は５位がリン酸化されている場合でも結合を抑制することが示唆される。
【０１０３】
[参考文献]
Blomberg, N. & Nilges, M., Folding & Design, 2, 343 - 355, 1997.
Bustelo, X.R., Mol. Cell Biol., 20, 1461 - 1477, 2000.
Das et al., J. Biol. Chem., 275, 15074 - 15081, 2000.
Han et al., Science, 279, 558 - 560, 1998.
Kavran et al., J. Bio. Che., 273, 30497 - 30508, 1998.
Kawasaki et al., Science, 289, 1194 - 1197, 2000.
Nimnual et al., Science, 279, 560 - 563.
Rameh et al., J. Biol. Chem., 272, 22059 - 22066, 1997.
Russo et al., J. Biol. Chem., 276, 19524 - 19531, 2001.
Tatsumoto et al., J. Cell Biol., 147(5), 921 - 927, 1999.
Zheng, Y., TIBS, 26(12), 724 - 732, 2001.
【０１０４】
本明細書で引用されているすべての特許、特許出願、及び刊行された参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。その好ましい実施形態を参照しながら本発明を特に示し説明してきたが、添付した特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書においてその形態及び詳細に様々な変更を加えることができることが当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図であり、クマシー染色（左図）又はウェスタンブロット法（右図）によって視覚化した。（ａ）はＥｃｔ２ＤＨの発現を示し、レーン１：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝０、レーン２：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋１時間、レーン３：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋２時間、レーン４：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋３時間である；（ｂ）は、再折畳みを行ったＥｃｔ２ＤＨを示し、レーン１〜４は、再折畳みを行った異なる添加量のＥｃｔ２ＤＨを示す。
【図２】リン脂質結合アッセイの結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインの特異的な脂質結合能に関する。詳細には、本発明は、この能力の同定、及びＥｃｔ２活性の調節物質を同定するアッセイでのこのドメインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常細胞の増殖性の成長は、一連の異なるステップである細胞周期として知られる過程を介する規則的な進行を必要とする。細胞周期を介する進行は、リン酸化カスケードが関与する複雑なシグナル伝達経路を介して、栄養利用能、細胞サイズ、及び成長因子によって調節され、特定のタンパク質の厳密に制御された発現及び安定性が細胞周期の各期で必要である。
【０００３】
細胞周期はＭ期から始まり、その期では細胞質の分裂（細胞質分裂）が生じる。Ｍ期の後にはＧ１期が続き、その期で細胞は高率の生合成及び成長を再開する。Ｓ期はＤＮＡ合成から始まり、ＤＮＡ量が２倍になったときに終了する。次いで細胞はＧ２期に入り、その期は、凝縮した染色体の出現によってシグナル伝達される有糸分裂が開始するときに終了する。最終分化細胞はＧ１期で停止し、その細胞ではもはや細胞分裂は行われない。
【０００４】
細胞周期事象の順序は、別個の各段階が、次の段階が開始する前に確実に終了するように特定のチェックポイントで厳重に調節されている。癌を含めて、異常な細胞増殖と関係するヒト疾患は、細胞周期進行のこの厳重な調節が乱れたときに生じる。細胞周期に関与するシグナル伝達経路、及びその調節におけるその経路の特定の役割を解明すると、癌及び他の増殖関連疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）の予防的、診断的及び治療的な対処に新たな機会がもたらされる。
【０００５】
その一方で、調節された形での細胞の増殖の亢進が好ましいこともある。例えば、細胞の増殖は、創傷治癒、及び組織の成長が望ましい場合に有用である。したがって、シグナル伝達経路及び機構を、増殖の抑制を促進し、亢進し又は防止する調節物質と共に同定することが望ましい。
【０００６】
細胞周期の構成成分及び調節物質を同定することが望ましいにも関わらず、この分野でそのような化合物が不足している。新たな化合物を同定する手法の１つは、タンパク質のシグナル伝達の相互作用を解明し、この相互作用を抑制し又は亢進する化合物を同定することである。
【０００７】
小さな（２１ｋＤａ）ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）のスーパーファミリーは、５つのサブファミリー：Ｒａｓ、Ｒｈｏ、ＡＤＰリボシル化因子（ＡＲＦ）、Ｒａｂ、及びＲａｎを含み、これらは多数の細胞応答を制御する分子スイッチとして働く。ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーの構成要素には、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、Ｒａｃ−１、Ｒａｃ−２、及びＣｄｃ４２がある。
【０００８】
Ｒｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼは、ＧＤＰの結合状態でもＧＴＰの結合状態でも認めることができる。ＧＴＰと結合するとき、それは、遺伝子発現の制御、アクチン細胞骨格及び細胞接着の制御、平滑筋収縮の制御、細胞形態、細胞運動、神経突起の退縮、細胞質分裂、及び細胞の形質転換を含めて、多様な細胞の過程に最終的に変化を誘導することができるシグナル伝達カスケードの下流の構成要素と相互作用する（Hall, A. Science (1998) 279:509-514）。
【０００９】
ＧＴＰとＧＤＰの結合状態の交換は、正及び負の制御機構の調節下にある。ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）は、ＧＴＰアーゼ活性を高め、それによってＧＤＰの結合状態が促進され、その状態は、ＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）との相互作用によって隔離し安定化することができる。ＧＡＰもＧＤＩも、ＧＴＰ結合Ｒｈｏファミリータンパク質のレベルの低下に作用し、それによってシグナル伝達が「切（off）」になる。その一方でグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）は低分子量ＧＴＰアーゼと相互作用し、ＧＴＰとのＧＤＰの交換を促進し、それによってその経路におけるシグナル伝達が亢進する。
【００１０】
Ｅｃｔ２は、Ｒｈｏ−ＧＥＦファミリータンパク質の構成要素であり、したがってＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼ（Ｒｈｏ、Ｒａｃ及びｃｄｃ４２）に対してＧＴＰとのＧＤＰの交換を促進する（Tatsumoto et al, 1999）。ｅｃｔ２遺伝子は、哺乳動物及び昆虫において配列及び機能レベルで保存されている。ショウジョウバエのｐｅｂｂｌｅ遺伝子（GenBank ＩＤ＃（ＧＩ）５８１７６０３）は、マウス（ＧＩ２９３３３１）及びヒトｅｃｔ２のオルソログであり、細胞質分裂の開始に必要である（Lehner CF, J. Cell Sci. (1992) 103: 1021-1030；Prokopenko SN, et al., Genes Dev (1999) 13(1 7):2301-2314）。
【００１１】
そのタンパク質は、長さが８８３アミノ酸であり、分子量が約１００ｋＤである。それは、ＢＲＣＴドメイン（ａａ１４０〜２２９及び２３５〜３２３）、Ｄｂｌ相同（ＤＨ）ドメイン（ａａ４２１〜６１０）及びプレクストリン相同ドメイン（ａａ６４４〜７６３）という４個の機能ドメインからなる。直列型のＤＨ−ＰＨドメイン構築はＧＥＦに特徴的である。データから、ＤＨドメインが相手のＧＴＰアーゼと相互作用し、そのＧＴＰアーゼ上でのヌクレオチド交換を促進し、ＰＨドメインがＤＨの交換活性のターゲッティング又は制御に関与することが示されている（Zheng et al., 2001により総説されている）。
【００１２】
Ｅｃｔ２のリン酸化は、その交換活性に必要であり、Ｇ２期とＭ期の間で起こる。ヒトＥｃｔ２は、細胞質分裂の制御に関与する。ヒトｅｃｔ２遺伝子は、第３染色体長腕の３ｑ２６に位置し（Takai S. et al., Genomics (1995) 27(1):220-222）、それは多数の癌でコピー数及び発現が増大している領域である（Bitter MA, et al., Blood (1985) 66(6): 1362-1370；Kim DH, et al., Int J Cancer. (1995) 60(6):812-8 19；Brzoska PM, et al., Cancer Res. (1995) 55(14):3055-3059；Balsara BR, et al., Cancer Res. (1997) 57(1 1):2116-2120；Heselmeyer K. et al., Genes Chromosomes Cancer (1997) 19(4):233-240；Sonoda G, et al., Genes Chromosomes Cancer. (1997) 20(4):320-8）。米国国立癌研究所から入手可能なデータ（www.ncbi.nlm.nih..cov/ncicgap）により、ヒトｅｃｔ２が、卵巣、子宮、副甲状腺、精巣、脳、及び結腸の癌で過剰発現していることが示唆される。
【００１３】
既知の機能ドメインとの相同性を有するいくつかのドメインがＥｃｔ２ポリペプチド中で同定されている。しかし、その機能はこれまで依然として不明である。これらのドメインの役割、及びこれらのドメインを調節することによりＥｃｔ２活性を調節する可能性は、細胞周期進行を調節するための依然として重要な標的である。
【００１４】
上流のシグナル伝達事象による刺激の前に、多数のＧＥＦが、部分的に活性な状態で、又は不活性な状態でも存在する。活性化は、Ｖａｖでの事象などのリン酸化事象から生じる可能性があり、Ｖａｖでの事象では、Ｙ１７４でのリン酸化によりＲａｃ相互作用部位を遮蔽するα−へリックスの折畳み構造がほどけ、それによって交換反応の進行が可能となる（Bustelo, 2000）。Ｅｃｔ２自体が、有糸分裂中のリン酸化事象の後に最大の交換活性を示すことが報告されている（Tatsumoto et al, 1999）。タンパク質とタンパク質の相互作用は、ＡＰＣのアルマジロドメインとＲａｃ特異的なＧＥＦのＡｓｅｆの相互作用によって示されるように、ＧＥＦ活性に影響を及ぼす可能性もある（Kawasaki et al., 2000）。この相互作用は、ＡｓｅｆのＧＥＦ活性の亢進をもたらし、最終的にＭＤＣＫ細胞における細胞形態の変化をもたらした。
【００１５】
ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）（下記に示す）は、真核生物のイノシトール脂質の中心単位である。それは、ホスホジエステル結合を介してジアシルグリセロールと結合したＤ−ミオ−イノシトール−１−リン酸からなる。イノシトールの頭部基は、５個の遊離ヒドロキシル基を有し、そのうち３、４及び５位にあるものが、単独で又は細胞環境との組合せでリン酸化された状態で同定されている。
【００１６】
【化１】
【００１７】
ホスファチジルイノシトール及びそのリン酸化された誘導体は、ホスホイノサイト（phosphoinosite）又はＰＩと称される。それらはすべての膜中に存在し、キナーゼ、リパーゼ及びホスファターゼを含めた様々な細胞酵素の基質となることが示されている。
【００１８】
ホスファチジルイノシトールは、哺乳動物細胞中で認められる最も豊富なイノシトール脂質であり、正常な静止細胞中でＰｔｄＩｎｓ４Ｐ及びＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２の１０〜２０倍の濃度で存在する。単独でリン酸化されたＰｔｄＩｎｓのうち、９５％に近いものがＰｔｄＩｎｓ４Ｐとして存在し、残りがＰｔｄＩｎｓ３Ｐ及びＰｔｄＩｎｓ５Ｐからなる。ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２は、最高に豊富な二重リン酸化種であり、その種は９９％を超えるそのような脂質からなり、ＰｔｄＩｎｓ３，４Ｐ２及びＰｔｄＩｎｓ３，５Ｐ２が残りを形成する。三重にリン酸化されたＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３のレベル（Stephens et al., 2000；Rameh et al., 1997）
【００１９】
リン脂質とＤｂｌファミリーのＧＥＦのＰＨドメインとの結合は、ＧＥＦ活性の調節をもたらすこともできる。Ｖａｖ及びＳｏｓのＧＥＦ活性が、ＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３の結合により活性化し（Han et al., 1998、Nimnual et al., 1998）、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２との相互作用によって抑制される（Das et al., 2000）ことが示されている。癌原遺伝子Ｄｂｌは、ＧＥＦ活性を低下させ、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２ともＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３とも相互作用することが示されている（Russo et al., 2001）。
【００２０】
リン脂質の結合は、Ｅｃｔ２のプレクストリン相同ドメイン（ａａ６４４〜７６３）によって媒介される。その小さな機能ドメインは、シグナル伝達に関与する多数のタンパク質に存在し、タンパク質キナーゼＣの基質であるプレクストリン中で最初に同定された。そのドメインの折畳みである、ｃ末端に両親媒性のへリックスが付いた２つの垂直な逆平行βシートは、リン酸化チロシン結合の折畳み（ＰＴＢ）、Ｅｎａｂｌｅｄ／ＶＡＳＰ相同ドメイン（ＥＶＨ１）及びＲａｎ結合ドメイン（ＲａｎＢＤ）と構造上非常に類似しているが、アミノ酸レベルでは類似性がほとんどない。
【００２１】
ＰＨドメインによる脂質結合は、幾名かの研究者によって研究され、これにより脂質結合特異性によるＰＨドメインの分類がなされた。一般に、脂質結合ＰＨドメインは、下記に示す４つの種類のうち１つに入れることができる（Kavran et al., 1998、Rameh et al., 1997）。
【００２２】
【００２３】
すべてのＧＥＦ由来のＰＨドメインがリン脂質の結合に関与するかどうかはまだ明らかとなっていない。ＤＨ−ＰＨの対形成における電荷の分布は、約５０％が正に帯電した残基を有し、その残基が脂質の相互作用に必要である可能性が高いことを示すものである。実際、正規の脂質結合部位の周りで負に帯電したＰＨドメインの分析では、７個のうち５個がＤＨドメインと対になっており、酸性のリン脂質と結合する可能性は低い（Blomberg & Nilges, 1997）。この考えを支持して、Olsonらは、Ｒｈｏ特異的なＧＥＦのＬｂｃ由来の負に帯電したＰＨドメインが、任意の細胞膜ではなくアクチン線維にそのタンパク質を局在化させる役割を果たすことを示した。
【００２４】
したがって、ＤｂｌファミリーのＧＥＦのＰＨドメインが交換活性に対して制御的な役割を果たすことができ、この制御がＰＩの結合により調節できることが示されている。これまで、分析されたほとんどのＰＨドメインは、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２又はＰｔｄＩｎｓ３，４，５Ｐ３に対する特異性を有する。
【００２５】
これまで、ＰｔｄＩｎｓ３，５−Ｐ２と結合するＰＨドメインについての記載はほとんどない。その脂質は、ＰＩ３とＰＩ−３−Ｐ５キナーゼの連続した作用によって合成される。その生理的な役割は依然として不明であるが、その合成は、浸透圧負荷をかけた酵母でＰＩ３キナーゼ依存的に活性化される（Dove et al., 1997）。Ａｒｆ−ＧＡＰファミリーの構成要素であるβ−センタウリンだけが、ＰｔｄＩｎｓ３，５−Ｐ２と単独で結合することが示されている（Dowler et al., 2000）。このファミリーは、リン脂質結合プロファイルが異なる１０種のＰＨドメイン含有構成要素からなるが、その機能的な関連は依然として不明である。
【００２６】
さらに、Ｒｈｏ−ＧＥＦのＥｃｔ２に由来するＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの脂質結合特異性は、これまで実証されていない。
【非特許文献１】Hall, A. Science (1998) 279:509-514
【非特許文献２】Lehner CF, J. Cell Sci. (1992) 103: 1021-1030
【非特許文献３】Prokopenko SN, et al., Genes Dev (1999) 13(1 7):2301-2314
【非特許文献４】Takai S. et al., Genomics (1995) 27(1):220-222
【非特許文献５】Bitter MA, et al., Blood (1985) 66(6): 1362-1370
【非特許文献６】Kim DH, et al., Int J Cancer. (1995) 60(6):812-8 19
【非特許文献７】Brzoska PM, et al., Cancer Res. (1995) 55(14):3055-3059
【非特許文献８】Balsara BR, et al., Cancer Res. (1997) 57(1 1):2116-2120
【非特許文献９】Heselmeyer K. et al., Genes Chromosomes Cancer (1997) 19(4):233-240
【非特許文献１０】Sonoda G, et al., Genes Chromosomes Cancer. (1997) 20(4):320-8
【非特許文献１１】www.ncbi.nlm.nih..cov/ncicgap
【非特許文献１２】Stephens et al., 2000
【非特許文献１３】Dove et al., 1997
【非特許文献１４】Dowler et al., 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明は、Ｅｃｔ２に由来するＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの同定について記載し、様々なＰＩに対するこの特異性を実証する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
したがって、本発明の一態様では、Ｅｃｔ２配列に由来し、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示されるヌクレオチド配列を有する単離ＤＨ−ＰＨ直列型ドメインが提供される。好ましくは、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列１（配列番号３）として示すアミノ酸配列をコードする。他の実施形態では、単離ＤＨ−ＰＨ配列は、アミノ酸配列２（配列番号４）として示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列１（配列番号２）で示されるものなどの発現構築物の一部である。
【００２９】
本発明の他の態様では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの相互作用を調節する作用物質（agent）をスクリーニングする方法が提供され、この方法は、結合を導く条件下でＥｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチド及び前記ＰＩを候補作用物質と共にインキュベートするステップと、前記候補作用物質がＥｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの結合を調節するかどうかを判定するステップとを含む。
【００３０】
「Ｅｃｔ２のＰＨドメイン」とは、Ｅｃｔ２ポリペプチドのアミノ酸６４４〜７６３で示されるプレクストリン相同ドメインに対応するアミノ酸配列を有するＥｃｔ２ポリペプチドの領域、或いはその断片、誘導体又は相同な配列を意味する。したがって、「Ｅｃｔ２のＰＨドメイン」という語句は、そのポリペプチドの配列と、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示されるヌクレオチド配列など、そのポリペプチドの配列をコードするヌクレオチド配列の両方を示すのに使用する。適切には、前記Ｅｃｔ２のＰＨドメインを、その天然の構造を有する折り畳まれたポリペプチドとして提供する。好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを、本明細書に記載のＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの一部として提供する。したがって、特に好ましい実施形態では、ＰＨドメインを、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示される配列を有する構築物の一部として提供する。
【００３１】
一実施形態では、ＰＩは、イノシトール環の３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩである。適切には、ＰＩには、ＰｔｄＩｎｓ３−Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ５−Ｐ及びＰｔｄＩｎｓ３，５−Ｐ２がある。
【００３２】
好ましい実施形態では、前記作用物質は、抗体、有機小分子又はアンチセンスオリゴマーである。
【００３３】
他の態様では、Ｅｃｔ２の活性を調節する作用物質を同定する方法が提供され、その方法は、
（ａ）Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドと候補作用物質とを含む試料を提供するステップと、
（ｂ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合を測定するステップと、
（ｃ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合を、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドに結合しないことが知られている対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合と比較するステップとを含み、
対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合と比較した、試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性の亢進から、候補作用物質がＥｃｔ２の細胞周期機能を調節することが示唆される。
【００３４】
一実施形態では、Ｅｃｔ２の活性は脂質結合活性である。適切には、Ｅｃｔ２の活性はその細胞周期活性である。
【００３５】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインが、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩとの結合に対する特異性を有することを本明細書において実証する。４位のリン酸基は、３位及び／又は５位がリン酸化されている場合でもＰＩとＥｃｔ２の結合を抑制すると思われる。
【００３６】
したがって、本発明の他の態様では、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩによるシグナル伝達の調節に適した化合物を同定するスクリーニング法における、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩと結合できるが、４位にリン酸基を有するＰＩと結合できないポリペプチドの使用が提供される。
【００３７】
適切には、ポリペプチドは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含む。一実施形態では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインは、ＤＨ−ＰＨ直列型ドメインの形態である。具体的には、Ｅｃｔ２のＰＨドメインは、本明細書に示す配列を有する構築物として提供される。
【００３８】
ＤＮＡ配列１（配列番号１）は、Ｅｃｔ２のＤＨ−ＰＨドメインをコードするｃＤＮＡ分子である。
【００３９】
ＤＮＡ配列２（配列番号２）は、発現ｃＤＮＡ分子構築物である。
【００４０】
ＡＡ配列１（配列番号３）は、ＤＮＡ配列１（配列番号１）に対応するアミノ酸配列である。
【００４１】
ＡＡ配列２（配列番号４）は、ＤＮＡ配列２（配列番号２）に対応するアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
特に明示しない限り、本明細書で使用するすべての技術的及び科学的用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学における）当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。分子的方法、遺伝学的方法及び生化学的方法には標準的な技術を使用する。一般には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.及びAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.；並びにGuthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991)、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, Calif.)、McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991)、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.)、及びGene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)を参照されたい。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本発明との関係では、Ｅｃｔ２のＰＨドメインという用語は、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩに対して特異的にその化合物と結合するのに必要な能力を有する限り、その範囲内にその変異体、誘導体及び断片も含む。
【００４４】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドに関して「変異体」又は「誘導体」という用語は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドの配列からの又はそれへの、１個（又は複数個の）アミノ酸の任意の置換、変異、修飾、代替、欠失又は付加が生じたものを含む。好ましくは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインをコードする核酸は、その変異体又は誘導体を含むと理解される。
【００４５】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの天然の変異体は、保存的なアミノ酸置換を含む可能性が高い。保存的な置換は、例えば下記の表に従って定義することができる。第２列の同じ区画の、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００４６】
【００４７】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの適切な断片は、長さが少なくとも約５アミノ酸、例えば１０、１２、１５又は２０アミノ酸である。その断片は、長さが１００、７５又は５０アミノ酸未満でもよい。その断片は、保存的な置換を含めて、１個又は複数個の（例えば、５、１０、１５、又は２０個の）置換、欠失又は挿入を含んでよい。
【００４８】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの好ましいタンパク質誘導体又は断片は、完全長配列のアミノ酸６４４〜７６３として示すＥｃｔ２のＰＨドメインのうち連続した範囲と、一部の場合では、完全長配列のアミノ酸６４４〜７６３に対応するＥｃｔ２のＰＨドメインの配列の長さ全体と少なくとも８０％の配列同一性又は類似性を有し、好ましくは少なくとも８５％の、より好ましくは少なくとも９０％の、さらに好ましくは少なくとも９５％の、最も好ましくは９７％又は１００％の配列同一性又は類似性を有する。好ましいＥｃｔ２のＰＨドメインはさらに、Ｅｃｔ２の完全アミノ酸配列のアミノ酸４５０〜６４８（ＲＨＯＧＥＦドメイン）に対応するアミノ酸配列、或いはその断片又は誘導体を含む。これらのドメインは、ｐｆａｍプログラム（Bateman et al., Nucleic Acids Res. (1999) 27:260-262；http://pfam.wustl.edu/）を用いて同定することができ、このプログラムは、各ドメインの詳細な説明も含む（ＲＨＯＧＥＦドメイン：ＰＦ００６２ Ｉ；ＰＨドメイン：ＰＦＯＯ １６９）。
【００４９】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインの断片又は誘導体は「機能的に活性」であることが好ましく、このことは、それがアミノ酸６４４〜７６３のアミノ酸配列を含む完全長野生型のＥｃｔ２のＰＨドメインに伴う１種又は複数種の機能的な活性を示すことを意味する。
【００５０】
一例として、断片又は誘導体は抗原性を有してもよく、その結果、Ｅｃｔ２タンパク質に対する抗体の生成に関して下記でさらに論じるように、イムノアッセイ、免疫感作、Ｅｃｔ２活性の調節などでそれを使用することができる。好ましくは、機能的に活性なＥｃｔ２のＰＨドメインの断片又は誘導体は、シグナル伝達活性や、３位又は５位にリン酸を有するＰＩに対して特異的なＰＩとの結合など、１種又は複数種の生物活性を示すものである。
【００５１】
「Ｅｃｔ２の核酸」という用語は、Ｅｃｔ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。好ましくは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチド又は核酸或いはその断片は、ヒト由来である（例えば、本明細書でＤＮＡ配列１（配列番号１）で示される）が、好ましくはＤＮＡ配列１（配列番号１）に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するそのオルソログ又は誘導体でもよい。オルソログは、当業者に知られている方法を用いて、ＤＮＡ配列１（配列番号１）を使用したＢＬＡＳＴ分析によって同定することができる（Huynen MA and Fork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5849-5856；Huynen MA et al., Genome Research (2000) 10: 1204-1210）。
【００５２】
Ｅｃｔ２の核酸及びポリヌクレオチドの単離、生成、及び発現
Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドを得るのに多様な方法が利用可能である。一般に、ポリペプチドの使用目的から、発現、生成、及び精製の方法の詳細が決定される。例えば、調節作用物質のスクリーニングに使用するポリペプチドの生成には、このタンパク質の特定の生物活性を保存する方法が必要となることがあるが、抗体生成用のポリペプチドの生成には、特定のエピトープの構造的な完全性が必要となることがある。スクリーニング又は抗体生成用に精製するポリペプチドの発現には、特定のタグの付加（すなわち、融合タンパク質の生成）が必要となることがある。タンパク質の発現、生成、及び精製のための技術は、当業者に周知である；そのための任意の適切な手段を使用することができる（例えば、Higgins SI and Hames ED (eds.) Protein Expression:A Practical Approach, Oxford University Press Inc., New York 1999；Stanbury PF et al., Principles of Fermentation Technology, 2nd edition, Elsevier Science, New York, 1995；Doonan S (ed3 Protein Purification Protocols, Huinana Press, New Jersey, 1996；Coligan JE et al, Current Protocols in Protein Science (eds.), 1999, John Wiley & Sons, New York；米国特許第６，１６５，９９２号)。Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、挿入したタンパク質コード配列を発現させるための任意の適当なベクター中に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めた必要な転写及び翻訳のシグナルは、天然のｅｃｔ２遺伝子及び／又はその隣接領域に由来するものでもよく、或いは異種のものでもよい。
【００５３】
原核細胞又は真核細胞中でｅｃｔ２遺伝子を発現させることができ、選択する方法は、そのタンパク質の使用目的に依存する。具体的には、天然の折畳み及び翻訳後修飾が必要であるとき、真核生物の系は特に有用である。好ましい原核細胞には、大腸菌及び枯草菌がある。好ましい真核細胞には、哺乳動物細胞（ヒト、マウス、サルやチャイニーズハムスター卵巣の細胞など）、酵母細胞（ピキア（Pichia）属やサッカロミセス属の種など）、及び昆虫細胞（ショウジョウバエや、種々の鱗翅目細胞系統、例えばＳｆ９細胞など）がある。Ｅｃｔ２ポリペプチドを単離するために、細胞の抽出物又は上清を精製することができる。好ましい精製技術には、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン及び陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、並びに当業者に知られている他のタンパク質精製技術がある。
【００５４】
場合によっては、ペプチド結合を介して異種のタンパク質の配列と結合した融合又はキメラ産物として、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドを発現させることができる。例えば、Ｅｃｔ２由来のポリペプチドの検出及び／又は精製を促進するために、Ｅｃｔ２発現ベクター構築物は、Ｅｃｔ２コード領域のＮ末端、Ｃ末端及び／又はその遺伝子配列内の任意の位置に１個又は複数個の抗体のエピトープコード配列を含んでもよい。適切な配列には、Ｍｙｃエピトープ、ＨＡエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ又はポリヒスチジンエピトープ（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照）がある。他の例として、ＧＦＰやルシフェラーゼなどの転写レポーターと結合した融合タンパク質として、Ｅｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチドを発現させることができる。標準的な方法を用いて適当なコードフレーム中で所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を互いに連結し、そのキメラ産物を発現させることにより、キメラタンパク質を作製することができる。タンパク質合成技術によって、例えばペプチド合成装置の使用によってキメラタンパク質を作製することもできる（Hunkapiller et al., Nature (1984) 310:105-111）。
【００５５】
Ｅｃｔ２調節作用物質
本発明は、ＰＨドメインとの相互作用により、したがってＰＩとの、特に３位及び／又は５位にリン酸を有するＰＩとの結合の調節により、Ｅｃｔ２及び／又はｐ２１経路と相互作用しかつ／又はその機能を調節する作用物質を同定する方法を提供する。そのような作用物質は、ｐ２１経路、細胞周期及びイノシトールシグナル伝達の欠陥が関与する疾患又は異常と関係する様々な診断及び治療上の適用にも、Ｅｃｔ２タンパク質並びに細部周期及びｐ２１経路に対するその寄与についてのさらなる分析にも有用である。
【００５６】
好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２調節作用物質は、Ｅｃｔ２活性を抑制又は亢進し、或いは、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、及び細胞の又は細胞外の活性を含めた正常なＥｃｔ２の機能にその他の形で影響を及ぼす。さらに好ましい実施形態では、候補イノシトールシグナル伝達経路調節作用物質は、Ｅｃｔ２の機能を特異的に調節する。「特異的な調節作用物質」、「特異的に調節する」などの語句は、本明細書において、Ｅｃｔ２のポリペプチド又は核酸と直接結合し、好ましくはＥｃｔ２の機能を抑制し、亢進し又はその他の形で変化させる調節作用物質を指すのに使用される。その用語は、Ｅｃｔ２とその結合相手又は基質の相互作用を（例えば、Ｅｃｔ２の結合相手と、又はタンパク質／結合相手の複合体と結合し、その機能を抑制することにより）変化させる調節作用物質も包含する。
【００５７】
好ましいＥｃｔ２調節作用物質には、小分子化学作用物質、抗体及び他の生物学的治療物質を含めたＥｃｔ２相互作用タンパク質、並びにアンチセンスオリゴマー及びＲＮＡを含めた核酸調節物質がある。調節作用物質は、例えば、併用療法の場合と同様に、他の有効成分、及び／或いは適切な担体又は添加剤を含むことがある組成物として、薬剤組成物中で製剤することができる。生物学的治療用作用物質を製剤する方法は、米国特許第６，１４６，６２８号中に詳細に記載されている。化合物を製剤し投与する技術は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th edition中に見つけることができる。
【００５８】
小分子調節物質
小分子調節物質は通常、分子量が１０，０００未満であり、好ましくは５，０００未満であり、より好ましくは１，０００未満であり、最も好ましくは５００未満である有機非ペプチド性分子である。この種類の調節物質には、化学的に合成された分子、例えばコンビナトリアル化学ライブラリー由来の化合物がある。小分子調節物質は、既知の構造的な特性、例えば３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩとの結合能、或いは上記に記載の方法を用いて識別される他の特性に基づいて合理的に設計することができる。相手のＧタンパク質（ＲｈｏＡ／Ｒａｃ／ＣＤＣ４２）との複合体中でのＥｃｔ２の構造は、ＧＥＦ活性に必要なタンパク質とタンパク質の相互作用の詳細を示すものであり、それを使用して、これらの相互作用の機構を調節し、それによってＧＥＦの機能を破壊する小分子化合物の合理的な設計の助けとすることができる。ＧＥＦ活性の調節に使用する小分子リガンドとの複合体中でのＥｃｔ２ポリペプチドの構造から、触媒活性部位に直接関与し、又はその活性部位に対してアロステリック効果を発揮し、それによってＧＥＦ活性を調節するＥｃｔ２分子の部分が示される。小分子調節物質は、化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。
【００５９】
代替の小分子調節物質には、天然の産物、特に植物や菌類などの生物からの二次代謝物があり、Ｅｃｔ２の調節活性があるかどうか化合物ライブラリーをスクリーニングすることによってそれを同定することもできる。化合物を生成し取得する方法は、当技術分野で周知である（Schreiber SL, Science (2000) 151: 1964-1969; Radmann J and GuntherJ, Science (2000) 15 1:1947-1948）。
【００６０】
スクリーニングアッセイから同定された小分子調節物質は、下記に記載のように、リード化合物として使用することができ、それから候補の臨床的な化合物を設計し、最適化し、合成することができる。そのような臨床的な化合物は、細胞周期又はイノシトールシグナル伝達の欠陥に関連する病変の治療に有用性がある可能性がある。二次の機能検証の反復、構造決定、並びに候補調節物質の修飾及びその試験により、候補小分子調節物質の活性を数倍高めることができる。さらに、候補の臨床的な化合物は、臨床及び薬剤上の特性を特に考慮して生成される。例えば、薬剤開発で試薬を誘導体化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのアッセイを用いて再度スクリーニングして、活性を最適化し毒性を最小限にすることができる。
【００６１】
タンパク質調節物質
Ｅｃｔ２のＰＨドメインと相互作用するタンパク質は、内因性、すなわちＥｃｔ２と遺伝学的に又は生化学的に通常相互作用するものでよい。Ｅｃｔ２調節物質には、顕性不活性型のＥｃｔ２相互作用タンパク質及びＥｃｔ２タンパク質自体が含まれる。酵母２ハイブリッド及び変異体スクリーニングは、内因性のＥｃｔ２相互作用タンパク質を同定するための好ましい方法を提供するものである（Finley, R. L. et al. (1996), DNA Cloning-Expression Systems: A Practical Approach, eds. Glover D. & Hames B. D (Oxford University Press, Oxford, England), pp. 169-203；Fashema SF et al., Gene (2000) 250:1-14；Drees BL Curr Opin Chem Biol (1999) 3:64-70: Vidal M and Legrain P Nucleic Acids Res (1999) 27:919-29；及び米国特許第５，９２８，８６８号）。質量分析は、タンパク質複合体を解明するための代替の好ましい方法を提供するものである（例えば、Pandley A and Mann M, Nature (2000) 405:837-846；Yates JR, Trends Genet (2000) 16:5-8に総説がある）。
【００６２】
Ｅｃｔ２相互作用タンパク質は、Ｅｃｔ２特異的な抗体又はＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でもよい（例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratoryを参照）。Ｅｃｔ２抗体については、下記でさらに論じる。
【００６３】
好ましい一実施形態では、Ｅｃｔ２相互作用タンパク質は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインと特異的に結合する。代替の好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２調節作用物質は、Ｅｃｔ２の基質、結合相手、又は補因子と結合する。特定の適用では、Ｅｃｔ２相互作用タンパク質をスクリーニングで使用して小分子調節物質を同定するとき、様々な既知の方法により、結合の平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ）及び免疫原性の特性を含めて、Ｅｃｔ２タンパク質とのその相互作用タンパク質の結合特異性についてアッセイを行うことができる。酵素及び受容体に関しては、基質及びリガンドのプロセシングにより、結合についてそれぞれアッセイを行うことができる。
【００６４】
特異的抗体
好ましい実施形態では、Ｅｃｔ２相互作用タンパク質は抗体である。Ｅｃｔ２ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、既知の方法を使用して生成することができる。好ましくは、抗体は、哺乳動物Ｅｃｔ２ポリペプチドに、より好ましくはヒトＥｃｔ２に特異的である。特に好ましい実施形態では、抗体は、Ｅｃｔ２のＰＨドメインと特異的に結合する。
【００６５】
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片でもよい。記載されている通りに、標準的な手順によって、親和性が１０８Ｍ−１であり、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１であり又はそれより強いモノクローナル抗体を作製することができる（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratory (1988)；Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York；並びに米国特許第４，３８１，２９２号；第４，４５１，５７０号；及び第４，６１８，５７７号）。Ｅｃｔ２を発現する細胞の抽出物に対して、或いは実質的に精製されたＥｃｔ２又はその断片から抗体を生成することができる。Ｅｃｔ２の断片を使用する場合、その断片は、好ましくはＥｃｔ２タンパク質の少なくとも１０個の、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。適切には、Ｅｃｔ２の断片はＰＨドメインを含む。特定の実施形態では、Ｅｃｔ２特異的な抗原及び／又は免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質と結合している。例えば、対象のポリペプチドをスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）担体と共有結合させ、その結合物を、免疫応答を亢進するフロイント完全アジュバント中で乳化する。実験用のウサギやマウスなどの適当な免疫系を、従来のプロトコールに従って免疫感作させる。
【００６６】
固定化された対応するＥｃｔ２ポリペプチドを用いた固相の酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの適当なアッセイにより、Ｅｃｔ２特異的抗体が存在するかどうかアッセイを行う。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなどの他のアッセイを使用することもできる。
【００６７】
異なる動物種由来の異なる部分を含むＥｃｔ２ポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。例えば、抗体の生物活性がヒト抗体に由来し、その結合特異性がネズミ断片に由来するように、ヒトイムノグロブリンの定常領域をネズミｍＡｂの可変領域と結合することができる。それぞれの種由来の適当な領域をコードする遺伝子を互いにスプライシングすることによってキメラ抗体を生成する（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1984) 81:6851-6855；Neuberger et al., Nature (1984) 312:604-608；Takeda et al., Nature (1985) 31:452-454）。組換えＤＮＡ技術によってマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）（Carlos, T. M., 3. M. Harlan., Blood (1994) 84:2068-2101）をヒトのフレームワーク領域及び定常領域中に移植することにより、キメラ抗体の形態であるヒト化抗体を生成することができる（Riechmann LM, et al,, Nature (1988) 323:323-327）。ヒト化抗体は、ネズミの配列を約１０％、ヒトの配列を約９０％含み、したがって抗体の特異性を保持しながら免疫原性がさらに軽減され又は除去される（Co MS, and Queen C., Nature (1991) 35 1:501-501；Morrison SL., Ann. Rev. Immun. (1992) 10:239-265）。ヒト化抗体及びその生成方法は当技術分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。
【００６８】
組換え体であるＥｃｔ２特異的な単鎖抗体、アミノ酸の橋を介してＦｖ領域の重鎖と軽鎖の断片を結合することによって形成された単鎖ポリペプチドを生成することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, Science (1988) 242:423-426；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883；及びWard et al., Nature (1989) 334:544-546）。
【００６９】
抗体生成に適した他の技術では、リンパ球を抗原性ポリペプチドに、或いはファージ又は同様のベクターの抗体ライブラリーから選択されたものにｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露する（Ruse et al., Science (1989) 246:1275-1281）。
【００７０】
本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾して又は修飾せずに使用することができる。しばしば、検出可能なシグナルをもたらし、又は標的とするタンパク質を発現する細胞に対して毒性がある物質を共有結合又は非共有結合することによってポリペプチド及び抗体を標識する（Menard S, et al., Int J. Biol Markers (1989)4: 131-134）。多様な標識及びその結合技術が知られており、科学文献でも特許文献でも広範に報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、抑制物質、蛍光部分、蛍光放射性ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁性粒子などがある（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；及び第４，３６６，２４１号）。また、組換えイムノグロブリンを生成することもできる（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通性毒素タンパク質と結合することによって、細胞質タンパク質に対する抗体を送達し、その標的に到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
【００７１】
患者において治療上使用するとき、本発明の抗体は、通常は非経口で、可能であれば標的部位に、又は静脈内に投与する。治療上有効な投与量及び投与法は、臨床試験によって決定する。通常、投与する抗体の量は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与では、製剤上許容される賦形剤と合わせて、単位投与量を注射可能な形態（例えば、液剤、懸濁剤、乳剤）で抗体を製剤する。そのような賦形剤は、本質的に非毒性であり非治療的なものである。例としては、水、食塩水、リンガー液、デキストロース液、及び５％ヒト血清アルブミンがある。不揮発性油、オレイン酸エチルやリポソーム担体などの非水性賦形剤を使用することもできる。賦形剤は、等張性及び化学的安定性を高め、又はその他の形で治療潜在性を高める緩衝液や保存剤など少量の付加剤を含んでもよい。そのような賦形剤中での抗体の濃度は通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法の方法は、文献中にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６号；ＷＯ００７３４６９）。
【００７２】
核酸調節物質
他の好ましいＥｃｔ２調節作用物質は、アンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）など、一般にＥｃｔ２活性を抑制する核酸分子を含む。
【００７３】
好ましいアンチセンスオリゴマーは、ＤＮＡ複製、転写、Ｅｃｔ２ＲＮＡの移行、Ｅｃｔ２ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＲＮＡスプライシングやＥｃｔ２ＲＮＡの任意の触媒活性など、Ｅｃｔ２核酸の機能に干渉する。
【００７４】
代替の好ましいＥｃｔ２調節作用物質は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉとは、配列特異的な、動物及び植物における翻訳後の遺伝子発現抑制の方法であり、発現抑制される遺伝子と配列が相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫（C. elegans）、ショウジョウバエ、植物及び哺乳動物で遺伝子を発現抑制するＲＮＡｉの使用に関する方法は、当技術分野で既知である（Fire A, et al., 1998 Nature 391:806-811；Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)；Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)；Hammond, S. M., et al., Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)；Tuschl, T. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001)；Hamilton, A. et al., Science 286, 950-952 (1999)；Hammond, S. M., et al., Nature 404, 293-296 (2000)；Zamore, P. D., et al., Cell 101,25-33 (2000)；Bernstein, E., etal., Nature 409, 363-366 (2001)；Elbashir, S. M., etal., Genes Dev. 15, 188-200 (2001)；ＷＯ０１２９０５８；ＷＯ９９３２６１９、及びElbashir SM, et al., 2001 Nature 4 11:494-498）。
【００７５】
アッセイ系
本発明は、Ｅｃｔ２活性の特異的な調節物質を同定するアッセイ系を提供する。一般に、一次アッセイを使用して、Ｅｃｔ２の核酸又はタンパク質或いはＥｃｔ２のＰＨドメインに関する調節物質の特異的な生化学的又は分子的効果を同定し又は確認する。一般に、二次アッセイで、一次アッセイによって同定されたＥｃｔ２調節作用物質の活性をさらに評価し、その調節作用物質が細胞周期の制御に関係のある形でＥｃｔ２に影響を及ぼすことを確認することができる。
【００７６】
プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインは、２つの垂直な逆平行βシートと、Ｃ末端の両親媒性のへリックスとを含む。その結合ループにおける変異性が大きいことが報告されている。ＰＨドメインについての報告された機能には、ヘテロマーＧタンパク質のβ／γサブユニットの結合、ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２の結合、ホスホＳｅｒ／Ｔｈｒの結合、及び膜相互作用がある。
【００７７】
ＲｈｏＧＥＦドメイン（ＤＨ又はＤｂｌドメイン）は、平らに引き伸ばされたαへリックスの束に折り畳まれた１１個のαへリックスを含む。その役割は、Ｒｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰアーゼと結合したＧＤＰの解離を促進し、ＧＴＰの結合を促進し、それによってシグナル伝達を活性化することであると考えられる。
【００７８】
小分子のＧＥＦ活性抑制能の検出に適したアッセイでは、Ｅｃｔ２に由来するポリペプチドをＲｈｏＡと共に３Ｈ ＧＤＰの存在下でインキュベートし、候補小分子の存在下又は不在下での３Ｈの保持率を検出する。
【００７９】
一次アッセイ
一般に、試験する調節物質の種類によって一次アッセイの種類が決定される。
【００８０】
小分子調節物質では、スクリーニングアッセイを使用して候補調節物質を同定する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、或いは標的タンパク質の重要な生化学反応を再現し又は保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam OS et al., Curr Opin Chem Biol (1997) 1:384-91及び添付の参照文献に総説がある）。本明細書において、「細胞に基づく」という用語は、生細胞、死細胞、又は膜、小胞体やミトコンドリア分画などの特定の細胞分画を使用するアッセイを指す。細胞に基づくスクリーニングアッセイは通常、Ｅｃｔ２のＰＨドメインの組換え発現の系、及び特定のアッセイで要求される任意の補助タンパク質を必要とする。「無細胞」という用語は、実質的に精製されたタンパク質（内因性、又は組換えにより生成）、部分的に精製された細胞抽出物、又は粗細胞抽出物を使用するアッセイを包含する。スクリーニングアッセイで、タンパク質とＤＮＡの相互作用、タンパク質とタンパク質の相互作用（例えば、受容体とリガンドの結合）、転写活性（例えばレポーター遺伝子を使用して）、酵素活性（例えば、基質の特性を介して）、二次メッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態の変化又は他の細胞の特徴を含めた様々な分子的事象を検出することができる。適当なスクリーニングアッセイでは、蛍光法（Klebe C, et al., Biochemistry (1995) 34:12543-12552）、放射活性法（Hart M, et al., Nature (1991) 354:311-314）、比色法、分光光度法、及び電流測定法を含めた広範な検出方法を使用して、しばしば高処理能スクリーニング（ＨＴＳ）の形式で（例えば、HertzbergRP, and Pope AJ, Current Opinion in Chemical Biology (2000) 4:445-451を参照）、検出した特定の分子的事象を読み出すことができる。
【００８１】
結合性の作用物質のアッセイには、天然のＥｃｔ２結合標的とのＥｃｔ２の相互作用を調節する化合物のスクリーニングがある。そのようなアッセイで使用するＥｃｔ２ポリペプチドを、検出又は固着用などのペプチドタグなど他のポリペプチドと融合することができる。特定の実施形態では、その結合標的は、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＣ、Ｒａｃ、又はＣｄｃ４２、或いはその一部であり、それはアッセイ中で好都合にも測定可能である対象のＥｃｔ２ポリペプチドに結合特異性及び結合活性をもたらし、好ましくは完全なＲｈｏＡ、ＲｈｏＣ、Ｒａｅ、又はＣｄｃ４２に類似する。候補調節作用物質が存在しなければ、Ｅｃｔ２ポリペプチドが細胞の結合標的、その一部又はアナログと基準の結合親和性で特異的に結合する条件下で、Ｅｃｔ２及び結合標的を候補Ｅｃｔ２調節作用物質の存在下及び不在下（すなわち調節下）でインキュベートする。インキュベーションの後、その作用物質によって偏向した、Ｅｃｔ２ポリペプチドと１個又は複数個の結合標的間の結合が、光学密度又は電子密度、放射性の放出、非放射性のエネルギー転移などを介するものや、抗体結合物での間接的な検出など、その産物及び他のアッセイ構成成分の性質に依存する様々な方法のいずれかによって検出される。作用物質の存在下での結合親和性と比較した、作用物質の不在下での標的とのＥｃｔ２の結合親和性の差から、その作用物質がＥｃｔ２結合標的とのＥｃｔ２の結合を調節することが示唆される。本明細書においては、差は統計上有意であり、好ましくは５０％の、好ましくは６０％の、より好ましくは７５％の、最も好ましくは９０％の差となる。
【００８２】
他の好ましいアッセイ形式は、蛍光偏光法、時間分解蛍光法、蛍光共鳴エネルギー転移法を含めた蛍光技術を使用するものである。これらの系は、色素標識分子から放出されたシグナルの強度が相手の分子とのその相互作用に依存する、タンパク質とタンパク質の、又はＤＮＡとタンパク質の相互作用をモニターする手段を提供する（例えば、Selvin PR, Nat Struct Biol (2000) 7:730-4；Fernandes PB, Curr Opin Chem Biol (1998) 2:597-603；Hertzberg RP and Pope AJ, Curr Opin Chem Biol (2000) 4:445-451）。
【００８３】
抗体の調節物質では、適当な一次アッセイは、Ｅｃｔ２のＰＨドメインタンパク質に対するその抗体の特異性及び親和性を試験するものである。抗体の特異性及び親和性を試験する方法は当技術分野で周知である。或いは、又はさらには、抗体の調節物質の一次アッセイは、上記に記載のスクリーニングアッセイを含んでもよく、それを用いてＥｃｔ２調節物質特異的な活性を検出する。
【００８４】
二次の検証は、イノシトールシグナル伝達関連経路におけるｅｃｔ２のＰＨドメインの関与を機能的に検証するのに使用する基本的に同じアッセイを使用することができる。二次の検証アッセイは、候補調節物質の存在下及び不在下での細胞の集団（例えば、野生型細胞の２種のプール）を一般に比較する。
【００８５】
他の実施形態では、二次の検証は、高処理能スクリーニングに使用する同じアッセイを使用することができる。この方法では、抗体やアンチセンスオリゴヌクレオチド調節物質など高処理能スクリーニングにより同定されない調節物質の活性を確認することもでき、或いは異なる高処理能スクリーニングアッセイを使用して同定された小分子調節物質の活性を確認することもできる。このアッセイを使用して、候補作用物質の特異性を確認することもできる。
【００８６】
さらに、細胞周期に関連する形でＥｃｔ２に対するその有効性について調節物質のアッセイを行う。そのようなアッセイには、特に、上記に記載の細胞周期、アポトーシス、増殖、及び低酸素誘導アッセイがある。
【００８７】
治療及び診断上の適用
患者において抗腫瘍療法に使用するとき、患者の腫瘍量をなくし又は減らす治療有効量でＥｃｔ２調節作用物質を患者に投与する。その作用物質は、通常は非経口で、可能であれば標的細胞部位に、又は静脈内に投与する。投与量及び投与法は、癌の性質（原発性又は転移性）、その集団、標的部位、特定の免疫毒素の特徴（使用時）、例えば、その治療指数、他の治療薬と併用して作用物質を投与するかどうか、及び患者の病歴に依存する。投与する作用物質の量は通常、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【００８８】
非経口投与では、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、製剤上許容される賦形剤と合わせて、単位投与量を注射可能な又は吸入可能な形態（例えば、液剤、懸濁剤、乳剤）で作用物質を製剤する。
【００８９】
Ｅｃｔ２と特異的に結合する抗体は、Ｅｃｔ２の発現を特徴とする状態又は疾患の診断に、或いはＥｃｔ２調節作用物質で治療している患者をモニターするアッセイで使用することができる。Ｅｃｔ２の診断アッセイには、抗体及び標識を利用して、ヒトの体液或いは細胞又は組織の抽出物中でＥｃｔ２を検出する方法がある。抗体は、修飾して又は修飾せずに使用することができ、それをレポーター分子と共有結合又は非共有結合することによって標識することができる。
【００９０】
Ｅｃｔ２の発現を特徴とする状態の診断は、患者試料中でのＥｃｔ２の発現を測定する（上記で論じた）ノーザン分析やTaqMan（登録商標）分析など様々な方法のいずれかによって行うこともできる。
【００９１】
次に、限定するものではないが以下の実施例を参照しながら本発明を説明する。
【実施例】
【００９２】
方法
Ｅｃｔ２のクローン化及び発現
その対応するアミノ酸配列がＥｃｔ２のＡＡ配列１（配列番号３）として示される、ＤＨ−ＰＨドメインをコードするｃＤＮＡ（ＤＮＡ配列１（配列番号１））を、pENTR-3cベクター（GIBCO社製）中のEcoR1部位にクローン化した。次いで、組換え反応を用いてこの配列をpDEST10（GIBCO社製）に移し、分子量が４９．８ｋＤと推定され、Ｅｃｔ２由来のＤＨドメイン（ａａ３９〜２３５）及びＰＨドメイン（ａａ２６９〜３８８）、並びに精製用のＮ末端ｈｉｓタグ（ａａ５〜１０）を含む４３４ａａのタンパク質を発現する構築物を得た。最終的な発現構築物の配列は、ＤＮＡ配列２（配列番号２）中に示す。
【００９３】
ＤＮＡ配列１（配列番号１）
ccagttccttcaaagcagtcagcaaggtggcaagttgcaaaagagctttatcaaactgaaagtaattatgttaatatattggcaacaattattcagttatttcaagtaccattggaagaggaaggacaacgtggtggacctatccttgcaccagaggagattaagactatttttggtagcatcccagatatctttgatgtacacactaagataaaggatgatcttgaagaccttatagttaattgggatgagagcaaaagcattggtgacatttttctgaaatattcaaaagatttggtaaaaacctaccctccctttgtaaacttctttgaaatgagcaaggaaacaattattaaatgtgaaaaacagaaaccaagatttcatgcttttctcaagataaaccaagcaaaaccagaatgtggacggcagagccttgttgaacttcttatccgaccagtacagaggttacccagtgttgcattacttttaaatgatcttaagaagcatacagctgatgaaaatccagacaaaagcactttagaaaaagctattggatcactgaaggaagtaatgacgcatattaatgaggataagagaaaaacagaagctcaaaagcaaatttttgatgttgtttatgaagtagatggatgcccagctaatcttttatcttctcaccgaagcttagtacagcgggttgaaacaatttctctaggtgagcacccctgtgacagaggagaacaagtaactctcttcctcttcaatgattgcctagagatagcaagaaaacggcacaaggttattggcacttttaggagtcctcatggccaaacccgacccccagcttctcttaagcatattcacctaatgcctctttctcagattaagaaggtattggacataagagagacagaagattgccataatgcttttgccttgcttgtgaggccaccaacagagcaggcaaatgtgctactcagtttccagatgacatcagatgaacttccaaaagaaaactggctaaagatgctgtgtcgacatgtagctaacaccatttgtaaa
【００９４】
ＤＮＡ配列２（配列番号２）
atgtcgtactaccatcaccatcaccatcacctcgaatcaacaagtttgtacaaaaaagcaggctctttaaaggaaccaattcagtcgactggatccggtaccgaattcgcccttccagttccttcaaagcagtcagcaaggtggcaagttgcaaaagagctttatcaaactgaaagtaattatgttaatatattggcaacaattattcagttatttcaagtaccattggaagaggaaggacaacgtggtggacctatccttgcaccagaggagattaagactatttttggtagcatcccagatatctttgatgtacacactaagataaaggatgatcttgaagaccttatagttaattgggatgagagcaaaagcattggtgacatttttctgaaatattcaaaagatttggtaaaaacctaccctccctttgtaaacttctttgaaatgagcaaggaaacaattattaaatgtgaaaaacagaaaccaagatttcatgcttttctcaagataaaccaagcaaaaccagaatgtggacggcagagccttgttgaacttcttatccgaccagtacagaggttacccagtgttgcattacttttaaatgatcttaagaagcatacagctgatgaaaatccagacaaaagcactttagaaaaagctattggatcactgaaggaagtaatgacgcatattaatgaggataagagaaaaacagaagctcaaaagcaaatttttgatgttgtttatgaagtagatggatgcccagctaatcttttatcttctcaccgaagcttagtacagcgggttgaaacaatttctctaggtgagcacccctgtgacagaggagaacaagtaactctcttcctcttcaatgattgcctagagatagcaagaaaacggcacaaggttattggcacttttaggagtcctcatggccaaacccgacccccagcttctcttaagcatattcacctaatgcctctttctcagattaagaaggtattggacataagagagacagaagattgccataatgcttttgccttgcttgtgaggccaccaacagagcaggcaaatgtgctactcagtttccagatgacatcagatgaacttccaaaagaaaactggctaaagatgctgtgtcgacatgtagctaacaccatttgtaaagcaagggcgaattcgcggccgcactcgagatatctagacccagctttcttgtacaaagtggttgattcgaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactag
【００９５】
ＡＡ配列１（配列番号３）
pvpskqsarwqvakelyqtesnyvnilatiiqlfqvpleeegqrggpilapeeiktifgsipdifdvhtkikddledlivnwdesksigdiflkyskdlvktyppfvnffemsketiikcekqkprfhaflkinqakpecgrqslvellirpvqrlpsvalllndlkkhtadenpdkstlekaigslkevmthinedkrkteaqkqifdvvyevdgcpanllsshrslvqrvetislgehpcdrgeqvtlflfndcleiarkrhkvigtfrsphgqtrppaslkhihlmplsqikkvldiretedchnafallvrppteqanvllsfqmtsdelpkenwlkmlcrhvantick
【００９６】
ＡＡ配列２（配列番号４）
msyyhhhhhhlestslykkagslkepiqstgsgtefalpvpskqsarwqvakelyqtesnyvnilatiiqlfqvpleeegqrggpilapeeiktifgsipdifdvhtkikddledlivnwdesksigdiflkyskdlvktyppfvnffemsketiikcekqkprfhaflkinqakpecgrqslvellirpvqrlpsvalllndlkkhtadenpdkstlekaigslkevmthinedkrkteaqkqifdvvyevdgcpanllsshrslvqrvetislgehpcdrgeqvtlflfndcleiarkrhkvigtfrsphgqtrppaslkhihlmplsqikkvldiretedchnafallvrppteqanvllsfqmtsdelpkenwlkmlcrhvantickaransrphsryldpaflykvvdsrlltkperklswllpplsnn
【００９７】
Ｅｃｔ２−ＤＨ−ＰＨをRosetta(DE3)pLysS細胞中で発現させた。細胞を３７℃で増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導してから３時間後にそれを回収した。細胞ペレットをBugBuster HTタンパク質抽出試薬（Novagen社製）で製造元の説明書に従って処理することによって封入体分画を単離した。
【００９８】
封入体ペレットを、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０／１ｍＭ ＤＴＴ／６Ｍ ＧｕＨＣｌ中、タンパク質濃度０．３８ｍｇ／ｍｌで再可溶化した。次いでタンパク質を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、潜在的な核形成部位を除去した。可溶性分画を「再折畳み用緩衝液」５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．０／１ｍＭ ＤＴＴ／１０％グリセロール／１００ｍＭ ＮａＣｌ中に迅速に希釈（１：１１）することによって、タンパク質の再折畳みを開始させた。次いで試料を０．２μｍフィルターによりろ過し、その後「再折畳み用緩衝液」に対して広範な透析を４℃で１晩行って残存する微量のＧｄｎＨＣｌを除去した。タンパク質を０．２μｍフィルターにより再度ろ過し、その後１０ｋＤａで遮断するAmicon社製Centriprepを用いて濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、この段階でのタンパク質を純度＞８０％であると判断した。
【００９９】
リン脂質結合アッセイ
Ｅｃｔ２のＤＨ−ＰＨドメイン（Ｅｃｔ２−ＤＨ−ＰＨ）のリン脂質結合特異性を評価するため、脂質重層アッセイを行った。クロロホルム／メタノール／水（１：２：０．８）の混合物中に溶解した２５０ｐｍｏｌのリン脂質を含む脂質溶液（１μｌ）を、Hybond-C extra膜上にスポット化し、室温で乾燥させた。脂肪酸を含まないＢＳＡを３％（ｗ：ｖ）含むＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス／Ｈｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Tween-20）中で６０分間インキュベートすることによりその膜をブロッキング処理した。次いで、０．５ｍｇ／ｍｌのＥｃｔ２−ＤＨ−ＰＨを含む同じ溶液中でその膜を４℃で１晩インキュベートした。次いでその膜をＴＢＳＴで広範に洗浄し、１：１０００希釈した抗６＊ｈｉｓ抗体（Sigma社製）を含むＴＢＳＴと共に６０分間インキュベートした。以前の通りにＴＢＳＴでその膜を洗浄した後に、１：５０００希釈した抗マウスＨＲＰ結合物を含むＴＢＳＴ中で６０分間インキュベートした。次いで、以前の通りにその膜を洗浄し、その膜をECL試薬（AmershamPharmacia社製）中に浸し、その膜を写真フィルム（Kodak社製）に露出することによってＥｃｔ２−ＤＨ−ＰＨの存在を検出した。
【０１００】
結果
図１はＥｃｔ２ＤＨ−ＰＨの発現を示す。
Ｅｃｔ２ＤＨ−ＰＨは、E.Coli (DE3)pLysS中で不溶性タンパク質として発現した。封入体分画を調製し、６Ｍ ＧｄｎＨＣｌを含む緩衝液中へと変性させ、その後迅速に希釈し透析して変性剤を除去することによって、タンパク質の再折畳みを行った。試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシー染色（左図）又はウェスタンブロット法（右図）によって視覚化した。図１（ａ）はＥｃｔ２ＤＨの発現を示し、レーン１：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝０、レーン２：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋１時間、レーン３：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋２時間、レーン４：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋３時間である。図１（ｂ）は、再折畳みを行ったＥｃｔ２ＤＨを示し、レーン１〜４は、再折畳みを行った異なる添加量のＥｃｔ２ＤＨを示す。
【０１０１】
図２は、Ｅｃｔ２のＰＩＰ結合の特異性を示す。
１ ホスファチジルコリン
２ ホスファチジルエタノールアミン
３ ホスファチジルイノシトール
４ ホスファチジルイノシトール−３リン酸（ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ）
５ ホスファチジルイノシトール−４リン酸（ＰｔｄＩｎｓ４Ｐ）
６ ホスファチジルイノシトール−５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ５Ｐ）
７ ホスファチジルイノシトール−３，４リン酸（ＰｔｄＩｎｓ３，４Ｐ２）
８ ホスファチジルイノシトール−３，５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ３，５Ｐ２）
９ ホスファチジルイノシトール−４，５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ４，５Ｐ２）
【０１０２】
これらの結果から、３位及び／又は５位にあるＰＯ３−は結合を促進するが、４位にあるＰＯ３−は３位又は５位がリン酸化されている場合でも結合を抑制することが示唆される。
【０１０３】
[参考文献]
Blomberg, N. & Nilges, M., Folding & Design, 2, 343 - 355, 1997.
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Zheng, Y., TIBS, 26(12), 724 - 732, 2001.
【０１０４】
本明細書で引用されているすべての特許、特許出願、及び刊行された参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。その好ましい実施形態を参照しながら本発明を特に示し説明してきたが、添付した特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書においてその形態及び詳細に様々な変更を加えることができることが当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図であり、クマシー染色（左図）又はウェスタンブロット法（右図）によって視覚化した。（ａ）はＥｃｔ２ＤＨの発現を示し、レーン１：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝０、レーン２：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋１時間、レーン３：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋２時間、レーン４：ＩＰＴＧ誘導ｔ＝＋３時間である；（ｂ）は、再折畳みを行ったＥｃｔ２ＤＨを示し、レーン１〜４は、再折畳みを行った異なる添加量のＥｃｔ２ＤＨを示す。
【図２】リン脂質結合アッセイの結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｃｔ２配列に由来し、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示す配列を有する単離ＤＨ−ＰＨ直列型ドメイン。
【請求項２】
ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ５Ｐ又はＰｔｄＩｎｓ３，５Ｐ２に対する特異性を有する、請求項１に記載の単離ドメイン。
【請求項３】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの相互作用を調節する作用物質をスクリーニングする方法であって、結合を導く条件下でＥｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチド及び前記ＰＩを候補作用物質と共にインキュベートするステップと、前記候補作用物質がＥｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの結合を調節するかどうかを判定するステップとを含む方法。
【請求項４】
ＰＩが、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
作用物質が、抗体、有機小分子又は核酸分子である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＨドメインが、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示される配列を有する構築物の一部として提供される、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｅｃｔ２の細胞周期活性を調節する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドと候補作用物質とを含む試料を提供するステップと、
（ｂ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合を測定するステップと、
（ｃ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性を、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドに結合しないことが知られている対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性と比較するステップとを含み、
対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合と比較した、試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性の亢進から、候補作用物質がＥｃｔ２の細胞周期機能を調節することが示唆される方法。
【請求項８】
３位及び／又は５位のリン酸基を有するＰＩによるシグナル伝達の調節に適した化合物を同定するスクリーニング法における、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩと結合できるが、４位にリン酸基を有するＰＩと結合できないポリペプチドの使用。
【請求項９】
ポリペプチドがＥｃｔ２のＰＨドメインを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１】
Ｅｃｔ２配列に由来し、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示す配列を有する単離ＤＨ−ＰＨ直列型ドメイン。
【請求項２】
ＰｔｄＩｎｓ３Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ５Ｐ又はＰｔｄＩｎｓ３，５Ｐ２に対する特異性を有する、請求項１に記載の単離ドメイン。
【請求項３】
Ｅｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの相互作用を調節する作用物質をスクリーニングする方法であって、結合を導く条件下でＥｃｔ２のＰＨドメインのポリペプチド及び前記ＰＩを候補作用物質と共にインキュベートするステップと、前記候補作用物質がＥｃｔ２のＰＨドメインとＰＩの結合を調節するかどうかを判定するステップとを含む方法。
【請求項４】
ＰＩが、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
作用物質が、抗体、有機小分子又は核酸分子である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＨドメインが、ＤＮＡ配列１（配列番号１）で示される配列を有する構築物の一部として提供される、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｅｃｔ２の細胞周期活性を調節する作用物質を同定する方法であって、
（ａ）Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドと候補作用物質とを含む試料を提供するステップと、
（ｂ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合を測定するステップと、
（ｃ）試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性を、Ｅｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドに結合しないことが知られている対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性と比較するステップとを含み、
対照作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合と比較した、試料中での候補作用物質へのＥｃｔ２のＰＨドメインを含むポリペプチドの結合性の亢進から、候補作用物質がＥｃｔ２の細胞周期機能を調節することが示唆される方法。
【請求項８】
３位及び／又は５位のリン酸基を有するＰＩによるシグナル伝達の調節に適した化合物を同定するスクリーニング法における、３位及び／又は５位にリン酸基を有するＰＩと結合できるが、４位にリン酸基を有するＰＩと結合できないポリペプチドの使用。
【請求項９】
ポリペプチドがＥｃｔ２のＰＨドメインを含む、請求項８に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５０４２２４（Ｐ２００８−５０４２２４Ａ）
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１９３４（Ｐ２００６−５５１９３４）
【出願日】平成１７年２月９日（２００５．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００４３９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７９７５
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５０６１３８０３０）サイクラセル リミテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月９日（２００５．２．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００４３９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７７９７５
【国際公開日】平成１７年８月２５日（２００５．８．２５）
【出願人】（５０６１３８０３０）サイクラセル リミテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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