FENエンドヌクレアーゼ
【課題】核酸の切断および改変のための新規の切断物質およびポリメラーゼを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる、精製されたアーキアグロブス・ベネフィカスFEN−1エンドヌクレアーゼを含む組成物および前記エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸を含む組成物。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示唆される。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる、精製されたアーキアグロブス・ベネフィカスFEN−1エンドヌクレアーゼを含む組成物および前記エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸を含む組成物。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示唆される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸の切断および改変のための新規の切断物質を提供する。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示される。
【背景技術】
【0002】
特異的な核酸配列および配列の変異を検出および特徴付けるための方法は、感染を示すウイルスまたは細菌性の核酸配列の存在を検出するため、疾患および癌に関連する遺伝子の変種または対立遺伝子の存在を検出するために使用されている。これらの方法は、法医学的な分析または父子鑑定のためなどの、核酸起源の同定における適用も見出されている。
【0003】
特定の核酸配列および配列の変種を検出および特徴付けるために、当技術分野において様々な方法が知られている。それにもかかわらず、ヒトゲノムおよび多くの病原性生物ゲノムの核酸配列決定の完了に伴い、特異的な核酸配列を検出するための、迅速で、信頼性が高く、費用効果性が高く、且つ使いやすい試験の必要性が依然として増加している。重要なことに、これらの試験は関心対象の配列のわずかに数コピーを含む試料から検出可能なシグナルを発生させることができなければならない。本発明は、改良された核酸検出方法のための、新規の構成要素を提供する。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、核酸の切断および改変のための新規の切断物質を提供する。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示される。本発明は、臨床診断薬の目的を含むが、これらに制限されることはない様々な使用のための新規検出法の使用を意図する。
【0005】
本発明は、複数の精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼである、精製された天然型のエンドヌクレアーゼおよび組換えエンドヌクレアーゼの両方を提供する。好ましい態様において、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼは、古細菌生物または真正細菌生物から得られる。特に好ましい態様において、FEN-1エンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカス(Archaeaglobus veneficus)から得られる。好ましい態様において、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼは約39キロダルトンの分子量を有する。
【0006】
本発明はさらに、キメラ構造特異的ヌクレアーゼを提供する。1つの態様において、本発明は、FEN-1、XPG、およびRAD相同体からなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来するアミノ酸部分を含むキメラのエンドヌクレアーゼを提供する。好ましい態様において、キメラのエンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカスのFEN-1エンドヌクレアーゼに由来するアミノ酸部分を含む。
【0007】
本発明はさらに、キメラのエンドヌクレアーゼをコードする単離オリゴヌクレオチドを提供する。
【0008】
他の態様において、本発明は、上記のキメラのエンドヌクレアーゼをコードする単離オリゴヌクレオチドを含む組換えDNAベクターを提供する。
【0009】
これらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞もまた提供される。
【0010】
本発明はまた、以下の段階を含む核酸を処理する方法を提供する:a)精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼおよび核酸基質を提供する段階;b)基質が1つまたは複数の切断構造を形成するような条件下で、核酸基質を処理する段階;ならびにc)エンドヌクレアーゼと切断構造を反応させて、1つまたは複数の切断産物を作製する段階。いくつかの態様において、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカスのFEN-1エンドヌクレアーゼである。
【0011】
本発明はさらに、アーキアグロブス・ベネフィカスのエンドヌクレアーゼと組み合わせて使用される、本明細書に記載の任意の組成物、混合物、方法、およびキットを提供する。これらには、生物に由来する精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼ(本明細書に提供された配列によって記載される特定のエンドヌクレアーゼならびに変種および相同体を含む)を含む組成物、これらの組成物を含むキット、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼの少なくとも一部分を含むキメラのエンドヌクレアーゼを含む組成物、そのような組成物を含むキット、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む組成物(ベクターおよび宿主細胞を含む)、そのような組成物を含むキット、エンドヌクレアーゼに対して産生される抗体、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼを含む混合物、切断アッセイ法においてエンドヌクレアーゼを使用する方法(例えば、侵襲的切断アッセイ法、CFLPなど)、およびそのような方法に有用な構成要素を含むキットが含まれる。
【0012】
いくつかの好ましい態様において、本発明は、核酸切断アッセイ法において機能的改変(例えば、改良)が提供される非相同機能ドメインを含む酵素を含む組成物を提供する。本発明は、核酸切断アッセイ法の性質に制限されることはない。例えば核酸切断アッセイ法は、酵素の存在下で、核酸が直接または間接的に切断される任意のアッセイ法を含む。特定の好ましい態様において、核酸切断アッセイ法は、侵襲的切断アッセイ法である。特に好ましい態様において、切断アッセイ法には、少なくとも1つのRNA構成要素を有する切断構造が利用される。他の特に好ましい態様において、切断アッセイには少なくとも1つのRNA構成要素を有する切断構造が利用され、切断構造のDNAメンバーが切断される。
【0013】
本発明は、非相同機能ドメインにより提供される機能的改変の性質によって制限されるものではない。例示的な改変には、非相同機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたヌクレアーゼ活性、改良された基質結合活性、および/または改良されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列(例えば、1つまたは複数のアミノ酸)を含むような酵素が含まれるが、これらに制限されることはない。
【0014】
本発明は非相同機能ドメインの性質によって制限されるものではない。例えばいくつかの態様において、非相同機能ドメインは、ポリメラーゼにおけるポリメラーゼドメインに由来する2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む(例えば、キメラ機能ドメインの挿入によって酵素に導入された、または突然変異によって生じた)。特定の好ましい態様において、2つまたはそれ以上のアミノ酸のうち少なくとも1つは、ポリメラーゼドメインのパーム(palm)領域またはサム(thumb)領域に由来する。本発明は、選択される2つまたはそれ以上のアミノ酸からポリメラーゼの同一性が制限されることはない。特定の好ましい態様において、ポリメラーゼには、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)のポリメラーゼが含まれる。
【0015】
本発明の新規の酵素には、疾患もしくは他の状態に関連するか、または関連する可能性のあるヒト、他の動物、または植物を非制限的に含む、野生型遺伝子および変異型対立遺伝子を含む標的DNAおよびRNAの検出が含まれるが、これらに制限されることはない。加えて、本発明の酵素を、細菌、真菌、原虫、繊毛虫、およびウイルスを含む微生物の株を検出および/または同定するため(および特にC型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスなどのRNAゲノムを有するウイルスの検出および同定のため)に使用してもよい。例えば、本発明は、本発明の酵素および基質核酸を提供する段階;ならびに(例えば、検出されうる切断産物を作製するため)基質核酸を酵素に曝露する段階を含む、核酸を切断する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】図面
【図1B】図面
【図1C】図面
【図1D】図面
【図1E】図面
【図1F】図面
【図1G】図面
【図1H】図面
【図2A】図面
【図2B】図面
【図2C】図面
【図3】図面
【図4】図面
【図5】図面
【図6】図面
【図7】図面
【図8】図面
【図9】図面
【図10】図面
【図11A】図面
【図11B】図面
【図12A】図面
【図12B】図面
【図13】図面
【図14】図面
【図15】図面
【図16】図面
【図17】図面
【図18A】図面
【図18B】図面
【図19】図面
【図20A】図面
【図20B】図面
【図21】図面
【図22】図面
【図23】図面
【図24A】図面
【図24B】図面
【図25】図面
【図26】図面
【図27】図面
【図28】図面
【図29】図面
【図30】図面
【図31】図面
【図32】図面
【図33】図面
【図34】図面
【図35】図面
【図36】図面
【図37】図面
【図38】図面
【図39】図面
【図40】図面
【図41】図面
【図42】図面
【図43】図面
【図44】図面
【図45】図面
【図46】図面
【図47】図面
【図48】図面
【図49】図面
【図50】図面
【図51】図面
【図52】図面
【図53】図面
【図54】図面
【図55】図面
【図56】図面
【図57】図面
【図58】図面
【図59A】図面
【図59B】図面
【図59C】図面
【図59D】図面
【図59E】図面
【図60】図面
【図61】図面
【図62】図面
【図63】図面
【図64】図面
【図65】図面
【図66】図面
【図67】図面
【図68】図面
【図69】図面
【図70】図面
【図71】図面
【図72】図面
【図73】図面
【図74】図面
【図75】図面
【図76】図面
【図77】図面
【図78】図面
【図79】図面
【図80】図面
【図81】図面
【図82】図面
【図83】図面
【図84】図面
【図85】図面
【図86A】図面
【図86B】図面
【図86C】図面
【図86D】図面
【図87】図面
【図88】図面
【図89】図面
【図90】図面
【図91】図面
【図92】図面
【図93】図面
【図94】図面
【図95】図面
【図96】図面
【図97】図面
【図98】図面
【図99】図面
【図100】図面
【図101】図面
【図102】図面
【図103】図面
【図104】図面
【図105】図面
【図106】図面
【図107】図面
【図108A】図面
【図108B】図面
【図108C】図面
【図109A】図面
【図109B】図面
【図110A】図面
【図110B】図面
【図110C】図面
【図111】図面
【図112】図面
【図113A】図面
【図113B】図面
【図113C】図面
【図113D】図面
【図114A】図面
【図114B】図面
【図115A】図面
【図115B】図面
【図115C】図面
【図115D】図面
【図116】図面
【図117A】図面
【図117B】図面
【図118】図面
【図119A】図面
【図119B】図面
【図120】図面
【図121A】図面
【図121B】図面
【図122】図面
【図123A】図面
【図123B】図面
【図124】図面
【図125A】図面
【図125B】図面
【図126】図面
【図127A】図面
【図127B】図面
【図128】図面
【図129】図面
【図130−1】図面
【図130−2】図面
【図130−3】図面
【図131A】図面
【図131B】図面
【図132】図面
【図133−1】図面
【図133−2】図面
【図134】図面
【図135】図面
【図136】図面
【図137−1】図面
【図137−2】図面
【図138】図面
【図139−1】図面
【図139−2】図面
【図140】図面
【図141】図面
【図142】図面
【図143】図面
【図144】図面
【図145】図面
【図146A】図面
【図146B】図面
【図146C】図面
【図146D】図面
【図146E】図面
【図146F】図面
【図146G】図面
【図146H】図面
【図146I】図面
【図146J】図面
【図147】図面
【図148】図面
【発明を実施するための形態】
【0017】
発明の説明
本発明のヌクレアーゼの新規の特性は、特定の核酸配列を検出する方法の基礎となる。
【0018】
本発明の方法における特に有用なFEN-1ヌクレアーゼには、アーキアグロブス・ベネフィカスが含まれる。
【0019】
Ave FEN1 ORF DNA配列
【0020】
Ave FEN1タンパク質配列
【0021】
本発明は、標的核酸の存在に依存する核酸切断構造を形成するための手段、および特徴的な切断産物を放出するように核酸切断構造を切断するための手段を提供する。例えば、5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、得られた切断産物により試料中の特異的な標的核酸配列の存在が示される。二本鎖の核酸またはオリゴヌクレオチドの場合、両者は、重複する侵襲性切断構造を形成するように標的核酸鎖とハイブリダイズし、以下に示すように、侵襲性切断が生じ得る。切断物質(例えば、5'ヌクレアーゼ)と上流のオリゴヌクレオチドとの相互作用により、切断物質は特徴的な断片を産生するような方法において、内部部位で下流のオリゴヌクレオチドを切断させることができる。このような態様は、INVADERアッセイ法(Third Wave Technologies)と呼ばれ、米国特許出願第5,846,717号、同第5,985,557号、同第5,994,069号、同第6,001,567号、同第6,090,543号、国際公開公報第97/27214号、および国際公開公報第98/42873号に記載されている。
【0022】
酵素の改良によって、1つまたは複数の種類の構造の切断率が増加もしくは減少しうる。また、改良により、1つまたは複数の切断構造においてより多数の切断部位またはより少数の切断部位が生じうる。核酸切断アッセイ法に使用するための新規の構造特異的ヌクレアーゼのライブラリーの開発において、改良には多くの異なる態様が含まれ、その各々は特定のアッセイ法に使用される特異的基質構造に関連する。
【0023】
本発明はさらに、キメラ構造特異的ヌクレアーゼを提供する。好ましい態様において、キメラ構造特異的ヌクレアーゼは、5'ヌクレアーゼに由来する機能ドメイン(例えば、アーチ領域またはそれと物理的に関連する配列を含む酵素領域)を、他の酵素(例えば、他の5'ヌクレアーゼ)に由来するドメインと結合させたものを含む。いくつかの好ましい態様において、所与の機能ドメインは2つまたはそれ以上の酵素に由来する配列を含む。例えば、第1の構造特異的ヌクレアーゼの機能ドメインにおけるアミノ酸配列を、1つまたは複数のアミノ酸の位置で変化させ、機能ドメインまたはその一部を第2の構造特異的ヌクレアーゼの配列に改変し、それによって、第1における第2のヌクレアーゼの特徴付けがなされる。このような特徴付けには、触媒活性、特異性、および安定性(例えば、熱安定性)が含まれるが、これらに制限されることはない。
【0024】
本発明のいくつかの態様は、本明細書に記載の酵素の変異体または変種の形態を提供する。切断率、基質特異性、安定性などを増強するなどの目的のため、本明細書に記載の酵素活性を有するペプチド構造を改変することができる。例えば、改変ペプチドは、アミノ酸配列をアミノ酸の置換、欠失、または付加などにより変化させて産生される。例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリンへの単離された置換、またはアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸への類似置換(即ち、保存的突然変異)は、得られた分子の生物活性に大きな作用を及ぼすことはないと考えられる。したがって、本発明のいくつかの態様は、保存的置換を含む本明細書に記載の酵素の変種を提供する。保存的置換は、アミノ酸側鎖の関連するアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。遺伝子コードアミノ酸は、4つのファミリーに分けることができる:(1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸);(2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン);(3)非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン);および(4)非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン)。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として両方に分類されることがある。同様の様式において、アミノ酸のレパートリーは以下のように分類されうる:(1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸);(2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン);(3)脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン)、セリンおよびトレオニンは任意で別個に脂肪族-水酸基として分類される;(4)芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン);(5)アミド(アスパラギン、グルタミン);ならびに(6)含硫(システインおよびメチオニン)(ストライヤー(Stryer)編、「生化学(Biochemistry)」、第2版、WH Freeman and Co. (1981)参照)。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能相同体を生じるかどうかは、本明細書に記載のアッセイ法を使用して、野生型タンパク質と同様の様式で反応を生じる、変種ペプチドの能力を評価することによって、容易に決定することができる。複数の置換が生じたペプチドを同じ方法で容易に試験することができる。
【0025】
本明細書において、「キメラタンパク質」および「キメラ性タンパク質」という用語は、2つまたはそれ以上の親タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む単一のタンパク質分子を意味する。これらの親分子は、遺伝的に異なる起源に由来する類似のタンパク質、単一の生物に由来する異なるタンパク質、または異なる生物に由来するものであってもよい。例示の方法によって(これらの例示の方法によって制限されることはないが)、本発明のキメラ構造特異的ヌクレアーゼは、非天然型のヌクレアーゼを形成するように組み合わされた、FEN-1遺伝子を有する2つまたはそれ以上の生物からのFEN-1遺伝子に由来したアミノ酸配列の混合物を含みうる。本明細書において、「キメラ」という用語は、天然型遺伝子から特定の割合のいかなる寄与を意味することも意図されることはなく、その部分が組み合わされる方法に制限されることもない。本明細書に記載の試験方法によって決定されるような切断活性を有する任意のキメラ構造特異的ヌクレアーゼは、本発明の範囲内の改良された切断物質である。
【0026】
本明細書に使用される「融合タンパク質」という用語は、外因性タンパク質断片に結合した関心対象のタンパク質を含むキメラタンパク質を意味する。融合相手は、宿主細胞で発現されるように、組換えキメラタンパク質の溶解性を増強させてもよく、宿主細胞もしくは培養上清またはその両方からの組換え融合タンパク質の精製を可能にするために、アフィニティータグ(例えばヒス-タグ)を付与してもよい。望ましい場合には、融合タンパク質は、当技術分野に公知の様々な酵素的手法または化学的手法によって、関心対象のタンパク質から分離してもよい。
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸の切断および改変のための新規の切断物質を提供する。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示される。
【背景技術】
【0002】
特異的な核酸配列および配列の変異を検出および特徴付けるための方法は、感染を示すウイルスまたは細菌性の核酸配列の存在を検出するため、疾患および癌に関連する遺伝子の変種または対立遺伝子の存在を検出するために使用されている。これらの方法は、法医学的な分析または父子鑑定のためなどの、核酸起源の同定における適用も見出されている。
【0003】
特定の核酸配列および配列の変種を検出および特徴付けるために、当技術分野において様々な方法が知られている。それにもかかわらず、ヒトゲノムおよび多くの病原性生物ゲノムの核酸配列決定の完了に伴い、特異的な核酸配列を検出するための、迅速で、信頼性が高く、費用効果性が高く、且つ使いやすい試験の必要性が依然として増加している。重要なことに、これらの試験は関心対象の配列のわずかに数コピーを含む試料から検出可能なシグナルを発生させることができなければならない。本発明は、改良された核酸検出方法のための、新規の構成要素を提供する。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、核酸の切断および改変のための新規の切断物質を提供する。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示される。本発明は、臨床診断薬の目的を含むが、これらに制限されることはない様々な使用のための新規検出法の使用を意図する。
【0005】
本発明は、複数の精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼである、精製された天然型のエンドヌクレアーゼおよび組換えエンドヌクレアーゼの両方を提供する。好ましい態様において、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼは、古細菌生物または真正細菌生物から得られる。特に好ましい態様において、FEN-1エンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカス(Archaeaglobus veneficus)から得られる。好ましい態様において、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼは約39キロダルトンの分子量を有する。
【0006】
本発明はさらに、キメラ構造特異的ヌクレアーゼを提供する。1つの態様において、本発明は、FEN-1、XPG、およびRAD相同体からなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来するアミノ酸部分を含むキメラのエンドヌクレアーゼを提供する。好ましい態様において、キメラのエンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカスのFEN-1エンドヌクレアーゼに由来するアミノ酸部分を含む。
【0007】
本発明はさらに、キメラのエンドヌクレアーゼをコードする単離オリゴヌクレオチドを提供する。
【0008】
他の態様において、本発明は、上記のキメラのエンドヌクレアーゼをコードする単離オリゴヌクレオチドを含む組換えDNAベクターを提供する。
【0009】
これらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞もまた提供される。
【0010】
本発明はまた、以下の段階を含む核酸を処理する方法を提供する:a)精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼおよび核酸基質を提供する段階;b)基質が1つまたは複数の切断構造を形成するような条件下で、核酸基質を処理する段階;ならびにc)エンドヌクレアーゼと切断構造を反応させて、1つまたは複数の切断産物を作製する段階。いくつかの態様において、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカスのFEN-1エンドヌクレアーゼである。
【0011】
本発明はさらに、アーキアグロブス・ベネフィカスのエンドヌクレアーゼと組み合わせて使用される、本明細書に記載の任意の組成物、混合物、方法、およびキットを提供する。これらには、生物に由来する精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼ(本明細書に提供された配列によって記載される特定のエンドヌクレアーゼならびに変種および相同体を含む)を含む組成物、これらの組成物を含むキット、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼの少なくとも一部分を含むキメラのエンドヌクレアーゼを含む組成物、そのような組成物を含むキット、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む組成物(ベクターおよび宿主細胞を含む)、そのような組成物を含むキット、エンドヌクレアーゼに対して産生される抗体、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼを含む混合物、切断アッセイ法においてエンドヌクレアーゼを使用する方法(例えば、侵襲的切断アッセイ法、CFLPなど)、およびそのような方法に有用な構成要素を含むキットが含まれる。
【0012】
いくつかの好ましい態様において、本発明は、核酸切断アッセイ法において機能的改変(例えば、改良)が提供される非相同機能ドメインを含む酵素を含む組成物を提供する。本発明は、核酸切断アッセイ法の性質に制限されることはない。例えば核酸切断アッセイ法は、酵素の存在下で、核酸が直接または間接的に切断される任意のアッセイ法を含む。特定の好ましい態様において、核酸切断アッセイ法は、侵襲的切断アッセイ法である。特に好ましい態様において、切断アッセイ法には、少なくとも1つのRNA構成要素を有する切断構造が利用される。他の特に好ましい態様において、切断アッセイには少なくとも1つのRNA構成要素を有する切断構造が利用され、切断構造のDNAメンバーが切断される。
【0013】
本発明は、非相同機能ドメインにより提供される機能的改変の性質によって制限されるものではない。例示的な改変には、非相同機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたヌクレアーゼ活性、改良された基質結合活性、および/または改良されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列(例えば、1つまたは複数のアミノ酸)を含むような酵素が含まれるが、これらに制限されることはない。
【0014】
本発明は非相同機能ドメインの性質によって制限されるものではない。例えばいくつかの態様において、非相同機能ドメインは、ポリメラーゼにおけるポリメラーゼドメインに由来する2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む(例えば、キメラ機能ドメインの挿入によって酵素に導入された、または突然変異によって生じた)。特定の好ましい態様において、2つまたはそれ以上のアミノ酸のうち少なくとも1つは、ポリメラーゼドメインのパーム(palm)領域またはサム(thumb)領域に由来する。本発明は、選択される2つまたはそれ以上のアミノ酸からポリメラーゼの同一性が制限されることはない。特定の好ましい態様において、ポリメラーゼには、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)のポリメラーゼが含まれる。
【0015】
本発明の新規の酵素には、疾患もしくは他の状態に関連するか、または関連する可能性のあるヒト、他の動物、または植物を非制限的に含む、野生型遺伝子および変異型対立遺伝子を含む標的DNAおよびRNAの検出が含まれるが、これらに制限されることはない。加えて、本発明の酵素を、細菌、真菌、原虫、繊毛虫、およびウイルスを含む微生物の株を検出および/または同定するため(および特にC型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスなどのRNAゲノムを有するウイルスの検出および同定のため)に使用してもよい。例えば、本発明は、本発明の酵素および基質核酸を提供する段階;ならびに(例えば、検出されうる切断産物を作製するため)基質核酸を酵素に曝露する段階を含む、核酸を切断する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】図面
【図1B】図面
【図1C】図面
【図1D】図面
【図1E】図面
【図1F】図面
【図1G】図面
【図1H】図面
【図2A】図面
【図2B】図面
【図2C】図面
【図3】図面
【図4】図面
【図5】図面
【図6】図面
【図7】図面
【図8】図面
【図9】図面
【図10】図面
【図11A】図面
【図11B】図面
【図12A】図面
【図12B】図面
【図13】図面
【図14】図面
【図15】図面
【図16】図面
【図17】図面
【図18A】図面
【図18B】図面
【図19】図面
【図20A】図面
【図20B】図面
【図21】図面
【図22】図面
【図23】図面
【図24A】図面
【図24B】図面
【図25】図面
【図26】図面
【図27】図面
【図28】図面
【図29】図面
【図30】図面
【図31】図面
【図32】図面
【図33】図面
【図34】図面
【図35】図面
【図36】図面
【図37】図面
【図38】図面
【図39】図面
【図40】図面
【図41】図面
【図42】図面
【図43】図面
【図44】図面
【図45】図面
【図46】図面
【図47】図面
【図48】図面
【図49】図面
【図50】図面
【図51】図面
【図52】図面
【図53】図面
【図54】図面
【図55】図面
【図56】図面
【図57】図面
【図58】図面
【図59A】図面
【図59B】図面
【図59C】図面
【図59D】図面
【図59E】図面
【図60】図面
【図61】図面
【図62】図面
【図63】図面
【図64】図面
【図65】図面
【図66】図面
【図67】図面
【図68】図面
【図69】図面
【図70】図面
【図71】図面
【図72】図面
【図73】図面
【図74】図面
【図75】図面
【図76】図面
【図77】図面
【図78】図面
【図79】図面
【図80】図面
【図81】図面
【図82】図面
【図83】図面
【図84】図面
【図85】図面
【図86A】図面
【図86B】図面
【図86C】図面
【図86D】図面
【図87】図面
【図88】図面
【図89】図面
【図90】図面
【図91】図面
【図92】図面
【図93】図面
【図94】図面
【図95】図面
【図96】図面
【図97】図面
【図98】図面
【図99】図面
【図100】図面
【図101】図面
【図102】図面
【図103】図面
【図104】図面
【図105】図面
【図106】図面
【図107】図面
【図108A】図面
【図108B】図面
【図108C】図面
【図109A】図面
【図109B】図面
【図110A】図面
【図110B】図面
【図110C】図面
【図111】図面
【図112】図面
【図113A】図面
【図113B】図面
【図113C】図面
【図113D】図面
【図114A】図面
【図114B】図面
【図115A】図面
【図115B】図面
【図115C】図面
【図115D】図面
【図116】図面
【図117A】図面
【図117B】図面
【図118】図面
【図119A】図面
【図119B】図面
【図120】図面
【図121A】図面
【図121B】図面
【図122】図面
【図123A】図面
【図123B】図面
【図124】図面
【図125A】図面
【図125B】図面
【図126】図面
【図127A】図面
【図127B】図面
【図128】図面
【図129】図面
【図130−1】図面
【図130−2】図面
【図130−3】図面
【図131A】図面
【図131B】図面
【図132】図面
【図133−1】図面
【図133−2】図面
【図134】図面
【図135】図面
【図136】図面
【図137−1】図面
【図137−2】図面
【図138】図面
【図139−1】図面
【図139−2】図面
【図140】図面
【図141】図面
【図142】図面
【図143】図面
【図144】図面
【図145】図面
【図146A】図面
【図146B】図面
【図146C】図面
【図146D】図面
【図146E】図面
【図146F】図面
【図146G】図面
【図146H】図面
【図146I】図面
【図146J】図面
【図147】図面
【図148】図面
【発明を実施するための形態】
【0017】
発明の説明
本発明のヌクレアーゼの新規の特性は、特定の核酸配列を検出する方法の基礎となる。
【0018】
本発明の方法における特に有用なFEN-1ヌクレアーゼには、アーキアグロブス・ベネフィカスが含まれる。
【0019】
Ave FEN1 ORF DNA配列
【0020】
Ave FEN1タンパク質配列
【0021】
本発明は、標的核酸の存在に依存する核酸切断構造を形成するための手段、および特徴的な切断産物を放出するように核酸切断構造を切断するための手段を提供する。例えば、5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、得られた切断産物により試料中の特異的な標的核酸配列の存在が示される。二本鎖の核酸またはオリゴヌクレオチドの場合、両者は、重複する侵襲性切断構造を形成するように標的核酸鎖とハイブリダイズし、以下に示すように、侵襲性切断が生じ得る。切断物質(例えば、5'ヌクレアーゼ)と上流のオリゴヌクレオチドとの相互作用により、切断物質は特徴的な断片を産生するような方法において、内部部位で下流のオリゴヌクレオチドを切断させることができる。このような態様は、INVADERアッセイ法(Third Wave Technologies)と呼ばれ、米国特許出願第5,846,717号、同第5,985,557号、同第5,994,069号、同第6,001,567号、同第6,090,543号、国際公開公報第97/27214号、および国際公開公報第98/42873号に記載されている。
【0022】
酵素の改良によって、1つまたは複数の種類の構造の切断率が増加もしくは減少しうる。また、改良により、1つまたは複数の切断構造においてより多数の切断部位またはより少数の切断部位が生じうる。核酸切断アッセイ法に使用するための新規の構造特異的ヌクレアーゼのライブラリーの開発において、改良には多くの異なる態様が含まれ、その各々は特定のアッセイ法に使用される特異的基質構造に関連する。
【0023】
本発明はさらに、キメラ構造特異的ヌクレアーゼを提供する。好ましい態様において、キメラ構造特異的ヌクレアーゼは、5'ヌクレアーゼに由来する機能ドメイン(例えば、アーチ領域またはそれと物理的に関連する配列を含む酵素領域)を、他の酵素(例えば、他の5'ヌクレアーゼ)に由来するドメインと結合させたものを含む。いくつかの好ましい態様において、所与の機能ドメインは2つまたはそれ以上の酵素に由来する配列を含む。例えば、第1の構造特異的ヌクレアーゼの機能ドメインにおけるアミノ酸配列を、1つまたは複数のアミノ酸の位置で変化させ、機能ドメインまたはその一部を第2の構造特異的ヌクレアーゼの配列に改変し、それによって、第1における第2のヌクレアーゼの特徴付けがなされる。このような特徴付けには、触媒活性、特異性、および安定性(例えば、熱安定性)が含まれるが、これらに制限されることはない。
【0024】
本発明のいくつかの態様は、本明細書に記載の酵素の変異体または変種の形態を提供する。切断率、基質特異性、安定性などを増強するなどの目的のため、本明細書に記載の酵素活性を有するペプチド構造を改変することができる。例えば、改変ペプチドは、アミノ酸配列をアミノ酸の置換、欠失、または付加などにより変化させて産生される。例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリンへの単離された置換、またはアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸への類似置換(即ち、保存的突然変異)は、得られた分子の生物活性に大きな作用を及ぼすことはないと考えられる。したがって、本発明のいくつかの態様は、保存的置換を含む本明細書に記載の酵素の変種を提供する。保存的置換は、アミノ酸側鎖の関連するアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。遺伝子コードアミノ酸は、4つのファミリーに分けることができる:(1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸);(2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン);(3)非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン);および(4)非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン)。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として両方に分類されることがある。同様の様式において、アミノ酸のレパートリーは以下のように分類されうる:(1)酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸);(2)塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン);(3)脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン)、セリンおよびトレオニンは任意で別個に脂肪族-水酸基として分類される;(4)芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン);(5)アミド(アスパラギン、グルタミン);ならびに(6)含硫(システインおよびメチオニン)(ストライヤー(Stryer)編、「生化学(Biochemistry)」、第2版、WH Freeman and Co. (1981)参照)。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能相同体を生じるかどうかは、本明細書に記載のアッセイ法を使用して、野生型タンパク質と同様の様式で反応を生じる、変種ペプチドの能力を評価することによって、容易に決定することができる。複数の置換が生じたペプチドを同じ方法で容易に試験することができる。
【0025】
本明細書において、「キメラタンパク質」および「キメラ性タンパク質」という用語は、2つまたはそれ以上の親タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む単一のタンパク質分子を意味する。これらの親分子は、遺伝的に異なる起源に由来する類似のタンパク質、単一の生物に由来する異なるタンパク質、または異なる生物に由来するものであってもよい。例示の方法によって(これらの例示の方法によって制限されることはないが)、本発明のキメラ構造特異的ヌクレアーゼは、非天然型のヌクレアーゼを形成するように組み合わされた、FEN-1遺伝子を有する2つまたはそれ以上の生物からのFEN-1遺伝子に由来したアミノ酸配列の混合物を含みうる。本明細書において、「キメラ」という用語は、天然型遺伝子から特定の割合のいかなる寄与を意味することも意図されることはなく、その部分が組み合わされる方法に制限されることもない。本明細書に記載の試験方法によって決定されるような切断活性を有する任意のキメラ構造特異的ヌクレアーゼは、本発明の範囲内の改良された切断物質である。
【0026】
本明細書に使用される「融合タンパク質」という用語は、外因性タンパク質断片に結合した関心対象のタンパク質を含むキメラタンパク質を意味する。融合相手は、宿主細胞で発現されるように、組換えキメラタンパク質の溶解性を増強させてもよく、宿主細胞もしくは培養上清またはその両方からの組換え融合タンパク質の精製を可能にするために、アフィニティータグ(例えばヒス-タグ)を付与してもよい。望ましい場合には、融合タンパク質は、当技術分野に公知の様々な酵素的手法または化学的手法によって、関心対象のタンパク質から分離してもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
精製されたアーキアグロブス・ベネフィカスFEN-1エンドヌクレアーゼを含む組成物であって、該エンドヌクレアーゼが配列番号:1を含むアミノ酸配列、または配列番号:1のアミノ酸配列において1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を含む、前記組成物。
【請求項2】
単離核酸を含む組成物であって、該核酸が請求項1記載のエンドヌクレアーゼをコードする、組成物。
【請求項3】
請求項1記載の組成物を含むキット。
【請求項4】
キメラFEN-1エンドヌクレアーゼを含む組成物であって、該キメラFEN-1エンドヌクレアーゼが請求項1記載のエンドヌクレアーゼの少なくとも一部分を含む、組成物。
【請求項5】
請求項4記載の組成物を含むキット。
【請求項6】
該核酸が配列番号:2を含む塩基配列を有することを特徴とする、請求項2記載の組成物。
【請求項7】
ベクターを含む組成物であって、該ベクターが請求項6記載の核酸を含む、組成物。
【請求項8】
宿主細胞を含む組成物であって、該宿主細胞が請求項7記載のベクターを含む、組成物。
【請求項9】
請求項6記載の核酸を含むキット。
【請求項10】
FEN-1エンドヌクレアーゼがヒスチジンタグを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項11】
以下の段階を含む、標的核酸を検出する方法:
a)標的核酸と共に切断構造を形成する段階;および
b)該切断構造をアーキアグロブス・ベネフィカスFEN-1エンドヌクレアーゼに曝露する段階。
【請求項1】
精製されたアーキアグロブス・ベネフィカスFEN-1エンドヌクレアーゼを含む組成物であって、該エンドヌクレアーゼが配列番号:1を含むアミノ酸配列、または配列番号:1のアミノ酸配列において1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を含む、前記組成物。
【請求項2】
単離核酸を含む組成物であって、該核酸が請求項1記載のエンドヌクレアーゼをコードする、組成物。
【請求項3】
請求項1記載の組成物を含むキット。
【請求項4】
キメラFEN-1エンドヌクレアーゼを含む組成物であって、該キメラFEN-1エンドヌクレアーゼが請求項1記載のエンドヌクレアーゼの少なくとも一部分を含む、組成物。
【請求項5】
請求項4記載の組成物を含むキット。
【請求項6】
該核酸が配列番号:2を含む塩基配列を有することを特徴とする、請求項2記載の組成物。
【請求項7】
ベクターを含む組成物であって、該ベクターが請求項6記載の核酸を含む、組成物。
【請求項8】
宿主細胞を含む組成物であって、該宿主細胞が請求項7記載のベクターを含む、組成物。
【請求項9】
請求項6記載の核酸を含むキット。
【請求項10】
FEN-1エンドヌクレアーゼがヒスチジンタグを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項11】
以下の段階を含む、標的核酸を検出する方法:
a)標的核酸と共に切断構造を形成する段階;および
b)該切断構造をアーキアグロブス・ベネフィカスFEN-1エンドヌクレアーゼに曝露する段階。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59A】
【図59B】
【図59C】
【図59D】
【図59E】
【図60】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【図67】
【図68】
【図69】
【図70】
【図71】
【図72】
【図73】
【図74】
【図75】
【図76】
【図77】
【図78】
【図79】
【図80】
【図81】
【図82】
【図83】
【図84】
【図85】
【図86A】
【図86B】
【図86C】
【図86D】
【図87】
【図88】
【図89】
【図90】
【図91】
【図92】
【図93】
【図94】
【図95】
【図96】
【図97】
【図98】
【図99】
【図100】
【図101】
【図102】
【図103】
【図104】
【図105】
【図106】
【図107】
【図108A】
【図108B】
【図108C】
【図109A】
【図109B】
【図110A】
【図110B】
【図110C】
【図111】
【図112】
【図113A】
【図113B】
【図113C】
【図113D】
【図114A】
【図114B】
【図115A】
【図115B】
【図115C】
【図115D】
【図116】
【図117A】
【図117B】
【図118】
【図119A】
【図119B】
【図120】
【図121A】
【図121B】
【図122】
【図123A】
【図123B】
【図124】
【図125A】
【図125B】
【図126】
【図127A】
【図127B】
【図128】
【図129】
【図130−1】
【図130−2】
【図130−3】
【図131A】
【図131B】
【図132】
【図133−1】
【図133−2】
【図134】
【図135】
【図136】
【図137−1】
【図137−2】
【図138】
【図139−1】
【図139−2】
【図140】
【図141】
【図142】
【図143】
【図144】
【図145】
【図146A】
【図146B】
【図146C】
【図146D】
【図146E】
【図146F】
【図146G】
【図146H】
【図146I】
【図146J】
【図147】
【図148】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59A】
【図59B】
【図59C】
【図59D】
【図59E】
【図60】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【図67】
【図68】
【図69】
【図70】
【図71】
【図72】
【図73】
【図74】
【図75】
【図76】
【図77】
【図78】
【図79】
【図80】
【図81】
【図82】
【図83】
【図84】
【図85】
【図86A】
【図86B】
【図86C】
【図86D】
【図87】
【図88】
【図89】
【図90】
【図91】
【図92】
【図93】
【図94】
【図95】
【図96】
【図97】
【図98】
【図99】
【図100】
【図101】
【図102】
【図103】
【図104】
【図105】
【図106】
【図107】
【図108A】
【図108B】
【図108C】
【図109A】
【図109B】
【図110A】
【図110B】
【図110C】
【図111】
【図112】
【図113A】
【図113B】
【図113C】
【図113D】
【図114A】
【図114B】
【図115A】
【図115B】
【図115C】
【図115D】
【図116】
【図117A】
【図117B】
【図118】
【図119A】
【図119B】
【図120】
【図121A】
【図121B】
【図122】
【図123A】
【図123B】
【図124】
【図125A】
【図125B】
【図126】
【図127A】
【図127B】
【図128】
【図129】
【図130−1】
【図130−2】
【図130−3】
【図131A】
【図131B】
【図132】
【図133−1】
【図133−2】
【図134】
【図135】
【図136】
【図137−1】
【図137−2】
【図138】
【図139−1】
【図139−2】
【図140】
【図141】
【図142】
【図143】
【図144】
【図145】
【図146A】
【図146B】
【図146C】
【図146D】
【図146E】
【図146F】
【図146G】
【図146H】
【図146I】
【図146J】
【図147】
【図148】
【公開番号】特開2009−148292(P2009−148292A)
【公開日】平成21年7月9日(2009.7.9)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−51151(P2009−51151)
【出願日】平成21年3月4日(2009.3.4)
【分割の表示】特願2002−570777(P2002−570777)の分割
【原出願日】平成13年11月15日(2001.11.15)
【出願人】(500228791)サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク (10)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成21年7月9日(2009.7.9)
【国際特許分類】
【出願日】平成21年3月4日(2009.3.4)
【分割の表示】特願2002−570777(P2002−570777)の分割
【原出願日】平成13年11月15日(2001.11.15)
【出願人】(500228791)サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク (10)
【Fターム(参考)】
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