ＨＣＭＶウイルスに対して特異的な抗体を同定するための改良されたウェスタンブロット試験
【課題】ヒト血清中の抗−ＨＣＭＶ抗体を同定するための診断用ツールの提供。
【解決手段】診断用ツールは、２つのセクションを有する固体支持体から成り、セクション１は、所定のパターンを形成する個別のバンドに集中した精製ビリオンから得られた複数のＨＣＭＶタンパク質（ｖｐ）を担持しており、これらのバンドの１つはＨＣＭＶのｐｐ１５０であり、セクション２は、対照となる組換え融合タンパク質を担持しており、少なくとも１つのバンドがｐｐ１５０の少なくとも１つのエピトープを含む組換え融合タンパク質から成る。
【解決手段】診断用ツールは、２つのセクションを有する固体支持体から成り、セクション１は、所定のパターンを形成する個別のバンドに集中した精製ビリオンから得られた複数のＨＣＭＶタンパク質（ｖｐ）を担持しており、これらのバンドの１つはＨＣＭＶのｐｐ１５０であり、セクション２は、対照となる組換え融合タンパク質を担持しており、少なくとも１つのバンドがｐｐ１５０の少なくとも１つのエピトープを含む組換え融合タンパク質から成る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清中のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に特異的な抗体を同定するための診断用ツールに関する。本発明は更に、上記の診断用ツールを利用して抗ＨＣＭＶ抗体を同定するための改良された形態のウェスタンブロット試験に関する。このような試験は、より高いレベルの信頼性を有しており、従って、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）のような慣用の技術を用いて行われた第一試験の結果の参照標準として血清学的対照に有利に使用でき、また、抗ＨＣＭＶ抗体検査に単独で使用できる。本発明は更に、上記の改良されたウェスタンブロット試験を用いてヒト血清中のサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡを同定する方法に関する。本発明は最後に、上記の方法において、精製ビリオンから得られた他のウイルス抗原と共に使用される組換え融合タンパク質、及び、該タンパク質を発現するプラスミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＭＶはヒトの遍在性感染物質である。ＨＣＭＶは、健康な成人の体内で病原性となることは極めて少ないが、免疫の低下した人の体内では種々の障害に関与する。ＨＣＭＶは更に、ヒトの先天性感染症の最も普遍的な原因であり、新生児の精神薄弱の原因として知られたダウン症候群に次いで二番目に多い母系感染症である（２）。
【０００３】
ＨＣＭＶを原因とする感染症の血清学的診断には一般に、種々のレベルまで精製されたウイルス自体または感染細胞の溶解液を抗原性物質として用いる酵素免疫検定法（ＥＩＡ）が用いられている。このような試験を行うための種々のキット商品は現在も市場で入手できるが、これらのキットには参照すべき標準がない。そのため、キットによって与えられた結果が互いに一致しない場合が多い。例えば、幾つかのキットは極めて高い特異性を有しているが感度が十分でなく、また別の幾つかのキットは極めて高感度であるが特異性が十分でない（６）。従って総体的には、疑陽性や疑陰性などの応答が多数生じる。
【０００４】
また、“ウェスタンブロット”法を用いて行われる血清学的分析はＥＩＡ試験に比べて費用も時間も掛かるが、特に最終結果の特異性に関してはＥＩＡ試験よりもはるかに信頼性が高いことが知られている。このような理由で、特にＨＩＶ感染については、ＥＩＡ試験で感染を確定できなかった場合には、感染を確認するためにウェスタンブロット試験（しばしば“ＷＢ”と略称される）が常に使用されている。
【０００５】
ＨＣＭＶの血清学的検査に最も有効な抗原性物質は間違いなくウイルス自体である。従来のウェスタンブロット試験の手順では、感染細胞の培養物の精製によって得られたウイルスを変性用混合物に懸濁させ、その構造タンパク質を分取用ポリアクリルアミドゲルで分画する。このようにして得られた典型的なタンパク質パターンを固体支持体（通常はニトロセルロース）に転移させ、得られたスポット（“ブロット”）を順次に数ミリメートル幅の種々のストリップに細分する。次に、各ストリップを被検血清と共に用いてアッセイを行う。
【０００６】
しかしながらＷＢ試験に全く欠点がないとは言えない。第一に、最も高い免疫原性能力を有しており最も長期間の免疫学的応答を生じるＨＣＭＶウイルスの構造抗原は分子量１５０ｋＤのポリペプチドである（ウイルス自体のＵＬ３２遺伝子によってコードされており、従ってｐｐＵＬ３２と呼ぶ）が、通常はこのポリペプチドがポリアクリルアミドゲル中で、同じ分子量をもつＨＣＭＶウイルスの別の構造成分（ＵＬ８６遺伝子によってコードされており、従ってｐｐＵＬ８６と呼ぶ）と一緒に泳動する。後者のポリペプチドは比較的有効な免疫原性物質ではあるが、ヘルペスウイルス科の他のウイルスの相同タンパク質に共通の抗原エピトープを含むので“グループ抗原”として定義されており、従って特異性に乏しい。ＷＢ試験では１５０ｋＤのバンドが唯一の反応性バンドであると判明するケースが比較的多いが、このような場合に、被検患者が特異的抗原ｐｐ１５０に対する直接抗体を有しているのか非特異的グループ抗原ｐｐＵＬ８６に対する直接抗体を有しているのかを（少なくとも十分な程度に）判断することができないので、結局は結果を確定することができない〔１１〕。
【０００７】
第二に、ウイルスタンパク質（ｖｐ）から得られるブロットは非構造ウイルスタンパク質を含まない。しかしながら幾つかの非構造ウイルスタンパク質は極めて強力な免疫原性物質である。例えば、このようなタンパク質に対する直接抗体、特に、５２ｋＤのリンタンパク質（ＨＣＭＶのゲノムのＵＬ４４遺伝子によってコードされている）に対する直接抗体が産生される。これらの抗体が存在し同時に主構造抗原ｐｐ１５０に対する弱い反応が存在するときは、これらの抗体の存在によって一次感染を血清学的に同定できる。
【０００８】
従って、上述のような欠点がなく、特に、有利な参照標準（“至適参照標準（ｇｏｌｄｅｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄ）”）を構成し得る十分な特異性及び感度を有している改良されたウェスタンブロット試験でヒト血清中のＨＣＭＶ特異的抗体を同定するために使用できる診断用ツールを提供することが要望されている。更に、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＭを同定するように改良されたウェスタンブロット試験を提供することが要望されている。
【０００９】
また、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的な免疫グロブリンＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡを同定するための、疑陽性または疑陰性となる結果さえも識別できる高い信頼性レベルを有する方法を提供することが要望されている。
【００１０】
また、本発明を用いた試験及び本発明を用いたＷＢ方法に使用するための組換えタンパク質材料を提供することが要望されている。
【００１１】
最後に、このような組換えタンパク質材料、特にタンパク質ＣＫＳと融合する組換えタンパク質材料を発現させるために、原核性及び／または真核性の宿主生物に挿入できるプラスミドを提供することが要望されている。
【００１２】
従って本発明によれば、ヒト血清中のＨＣＭＶに対する抗体を同定するための診断用ツールが提供される。本発明の診断用ツールは、精製ビリオンから得られた複数のウイルスタンパク質（ｖｐ）を担持する第一セクションをもつ固体支持体手段から成り、前記ウイルスタンパク質は対応するバンドに集中的に存在しており、これらのバンドは所定のパターンに従って互いから離間して固体支持体の第一セクションによって支持されており、前記バンドの１つは分子量約１５０ｋＤを有する少なくとも１つのウイルスタンパク質によって形成されている。この診断用ツールの特徴は、
（ｉ）前記固体支持体手段が、更に、所定のパターンに従って互いに離間した複数のバンドを含む第二セクションを有しており、この第二セクションの少なくとも１つの第一バンドが、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０の少なくとも１つのエピトープに対応するアミノ酸配列を再現する第一領域と外因性タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を再現する第二領域とから成り原核性または真核性の宿主生物中で発現され得る単一の組換えタンパク質（ｒｐ）を含んでおり、
（ｉｉ）第二セクションの少なくとも１つの第二バンドは、ＨＣＭＶウイルスの第一の非構造タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープに対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と上記外因性タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を再現する第二領域とから成る組換えタンパク質を含んでおり、
（ｉｉｉ）前記外因性タンパク質によって形成された少なくとも１つの対照バンドを含む、ことである。
【００１３】
特に、第二セクションの上記第一バンドに含まれている上記組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１００６とａａ１０４８との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸（Ｆ３）の配列を再現する上記第一領域と、上記ウイルスタンパク質ｐｐ１５０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５９５とａａ６１４との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸（Ａ１Ｃ２）の配列を再現する第三領域とから成る。これらの領域は上記の第一組換えタンパク質の内部で様々な相互的位置関係で配置され得る。
【００１４】
更に、第二セクションの第二バンドはウイルスタンパク質ｐｐ５２のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ２０２とａａ４３４との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸（Ｈ１０）の配列を再現する第一領域を有している組換えタンパク質を含んでいる。
【００１５】
抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭの検出に特に好適な本発明の１つの好ましい実施態様では、第二セクションが更に、Ｈμ鎖のアリコートを含む第二の対照バンドに加えて、少なくとも１つのバンドに配置された２つの追加の組換えタンパク質を含む。第一の追加組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５４０とａａ６０１との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と、外因性タンパク質のアミノ酸の配列の少なくとも一部分を再現する少なくとも１つの第二領域とから成り、第二の追加組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と、外因性タンパク質のアミノ酸の配列の少なくとも一部分を再現する少なくとも１つの第二領域とから成る。組換えタンパク質のこれらの領域は、各々の組換えタンパク質の内部で様々な相互的位置関係で配置され得る。
【００１６】
上記の外因性タンパク質は好ましくはＣＫＳであり、上記の領域の上記の組換えタンパク質は、タンパク質ｐｐ５２、ｐｐ１５０及びｐ１３０の各々の完全アミノ酸配列を含む。ウイルスタンパク質の上記の配列はＣＫＳのａａ１７１位の直後の位置でＣＫＳに組込まれている。
【００１７】
このようにして、本発明の診断用ツールを用いて行われる改良されたウェスタンブロット試験は、市場で入手できる公知の試験のすべての欠点を解消し得る。一方では、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０とタンパク質ベクターに結合したｐｐ１５０の最も免疫原性の２つの配列から成る対応する組換え融合タンパク質とを固体支持体手段に同時に存在させることによって、１５０ｋＤのバンドだけに対する直接応答の非特異性の問題が解決される。他方では、精製ビリオンに由来のウイルスタンパク質中で非構造ウイルスタンパク質が欠失しているという問題は、ＨＣＭＶウイルスの非構造タンパク質のうちの最も強力な免疫原性エピトープを含む１つまたは複数の（特に追加の３つの）組換えタンパク質（ベクタータンパク質ＣＫＳに結合）、より特定的には、ＩｇＭの定量に最適なｐｐ５２の配列Ｈ１０（ａａ２０２−ａａ４３４）、並びに、（ＵＬ５７によってコードされる）ｐ１３０のａａ５４０−ａａ６０１の間の配列及びａａ１１４４−ａａ１２３３の間の配列、をツールの第二セクションに挿入することによって解決される。
【００１８】
従って、本発明の基本原理は、同一診断用ツール内部の２つのバンドセクションの組合せにあることが理解されよう。第一セクションを構成するバンドは精製ビリオンから従来の方法で得られる。第二セクションを構成するバンドは組換えタンパク質のみから形成される。これらの組換えタンパク質はその構造の内部に、２つのセクションの応答を交差照合（クロスチェック）する目的で適正に選択されたウイルスタンパク質の強力な抗原決定基を含む。このため、本発明の改良されたＷＢ試験を“コンボＷＢ”試験と呼ぶ。
【００１９】
更に、疑陽性または疑陰性の応答を防止するために、組換えセクションに２つの対照バンドを挿入する。第一の対照バンドは、使用される全部の融合組換えタンパク質のベクタータンパク質として使用される同一タンパク質、この場合にはタンパク質ＣＫＳによって形成される。このバンドの陽性応答は、被検血清中に抗ＣＫＳ抗体が存在し、恐らくはそのために疑陽性が生じたことを示す。また、μ鎖によって形成されるバンドの陰性応答は、試験中に操作ミスがあり、そのために疑陰性が生じたことを示す。
【００２０】
本発明によれば更に、ＩｇＧまたはＩｇＡの特異的同定を目的とするウェスタンブロット試験の容易な実施、及び、本文中で実施したＩｇＭ検査と同様の優れた結果の保証が、たとえその可能性が実験的手段によって未だ確認されていないにしても、上記の記載の応用によって可能であると考えられる。この目的のためには、例えば、ｐ１３０の免疫原性配列から成る組換えタンパク質によって形成されるバンドを、ＣＫＳと必ず融合する適正に選択された別の組換えタンパク質、特にウイルスタンパク質ｇＢ（ＵＬ５５遺伝子によって発現される）の部分またはウイルスタンパク質ｐ２８（ＵＬ９９遺伝子によって発現される）の部分から成る組換えタンパク質によって置換するだけで十分であろう。この場合には明らかに、第二の対照バンドのクラスμのＨ鎖がクラスγまたはαのＨ鎖によって置換されるであろう。
【００２１】
従ってより普遍的には、固体支持体の第二セクションは、構造的または非構造的なＨＣＭＶの第二タンパク質の少なくとも１つのエピトープに対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と外因性タンパク質のアミノ酸の配列の少なくとも１つの部分を再現する第二領域とを有する少なくとも１つの組換えタンパク質を含む少なくとも１つの第三バンドを支持している。このような構造的または非構造的な第二のウイルスタンパク質は、診断用ツールによって検出される抗体のクラス、特にＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡとの関連によって選択される。この場合、支持体のこの第二セクションは更に、ヒト免疫グロブリンクラスのＨμ鎖、Ｈγ鎖及びＨα鎖から成るグループから適正に選択されたＨ鎖のアリコートから成る第二の対照バンドを含む。
【００２２】
固体支持体手段は一般には、ウイルスタンパク質（ｖｐ）及び組換えタンパク質（ｒｐ）が所定のパターンに従って典型的には吸着によって配置されたニトロセルロースのストリップまたはシートから構成される。
【００２３】
上記パターンは例えば、典型的なポリアクリルアミドゲル電気泳動分画パターンに対応する。
【００２４】
特にＨＣＭＶウイルス特異的ＩｇＭの同定に使用される本発明の診断用ツールの好ましい実施態様は、精製ビリオンから得られた少なくともウイルスタンパク質ｖｐ１５０、ｖｐ８２、ｖｐ６５、ｖｐ３８及びｖｐ２８と、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０及びｐｐ５２及び好ましくはｐｐ１３０（または組換え手段によって得られた他の非構造タンパク質）の免疫原性領域を含み該領域がＣＫＳに組込まれている複数の組換えタンパク質と、タンパク質ＣＫＳ自体と、ヒト免疫グロブリンのＨμ鎖とから成り、これらのタンパク質材料の全部が、ニトロセルロースから成る固体支持体に例えば吸着によって支持されている。
【００２５】
別の特徴によれば本発明は、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡの同定方法に関する。この方法は以下の段階、即ち、
ＨＣＭＶのビリオンを精製し、これらの精製ビリオンから少なくともウイルスタンパク質ｖｐ１５０、ｖｐ８２、ｖｐ６５、ｖｐ３８及びｖｐ２８を単離する段階と、
好ましくは遺伝子操作の技術を用い、構造的または非構造的なウイルスタンパク質の免疫原性領域とこの生物中で発現され得る外因性タンパク質の少なくとも１つの領域とから成り宿主生物中で発現され得る組換えタンパク質であって、上記の構造的または非構造的なウイルスタンパク質の免疫原性領域の少なくとも１つがＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡ特異的免疫応答を刺激する能力に基づいて選択されているような複数の組換えタンパク質を作製する段階と、
所定のパターンに従って互いに離間して位置決めされた上記のウイルスタンパク質と上記の組換えタンパク質とを固体支持体手段に配置する段階と、
上記外因性タンパク質とヒト免疫グロブリンのＨμ鎖及び／またはＨγ鎖及び／またはＨα鎖のアリコートとを、同様に上記ウイルスタンパク質及び上記組換えタンパク質から離間しかつ互いに離間して固体支持体手段に配置する段階と、
上記のタンパク質と免疫グロブリンのＨ鎖とを含む固体支持体手段を、検査すべきヒト血清、及び、抗体検出用物質（例えばペルオキシダーゼまたはその他の標識酵素とのコンジュゲート）と共にインキュベートする段階と、
その後のウイルスタンパク質及び組換えタンパク質の反応を比較する段階とから成り、少なくとも１つのウイルスタンパク質及び少なくとも１つの組換えタンパク質が同時に被検血清と反応し外因性タンパク質が反応しないときにだけ試験が陽性であると判定し、免疫グロブリンのＨ鎖が反応しないときは再試験を行う。
【００２６】
本発明は更に、ｐＣＭＶ−３０及びｐＣＭＶ−３１と呼ばれる２つのプラスミドに関する。これらのプラスミドは原核性または真核性の宿主生物に挿入でき、それぞれが、ＨＣＭＶウイルスのウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５４０とａａ６０１との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分をコードしているＤＮＡの配列、及び、ウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分をコードしているＤＮＡの配列を含む。これらの２つのプラスミドは、ブダペスト条約に規定された条項に従って、１９９６年５月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡに寄託され、それぞれアクセス番号ＡＴＣＣ９８，０６５及び９８，０６６として受託された。
【００２７】
別の特徴によれば、本発明は更に、いずれも原核性または真核性の宿主生物に挿入可能な別の２つのプラスミドを含む。これらの２つのプラスミドは、ブダペスト条約に規定された条項に従って、１９９６年４月３０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡに寄託され、それぞれｐＣＭＶ−１Ａ（ＡＴＣＣアクセス番号９８，０４２）及びｐＣＭＶ−５Ａ（ＡＴＣＣアクセス番号９８，０４４）と命名されている。これらの２つのプラスミドは、タンパク質ｐｐ１５０の免疫原性配列Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＣＫＳと融合したタンパク質ｐｐ５２の配列Ｈ１０を産生し得る。これらの配列は、国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１に記載されている。該特許の記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする。本発明はまた、プラスミドｐＣＭＶ−１ＡまたはｐＣＭＶ−５Ａを含む組換え宿主生物を包含する。
【００２８】
最後に本発明は、プラスミドｐＣＭＶ−３０、ｐＣＭＶ−３１、ｐＣＭＶ−１ＡまたはｐＣＭＶ−５Ａのいずれか１つが挿入された宿主生物中で発現された組換えタンパク質から成りＨＣＭＶ特異的抗体に結合できる組換えタンパク質材料を包含する。より特定的には本発明に包含されるタンパク質は、
（２）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
（３）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
である。
【００２９】
式中、ＣＫＳ（１−１７１ａａ）及びＴ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）はそれぞれ、アミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１からａａ１７１（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基、及び、アミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１７１からａａ２６０（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基を表す。Ｔ及びＲはそれぞれトレオニン及びアルギニンを表す。ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）はアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５４０からａａ６０１（両端を含む）までのウイルスタンパク質ｐ１３０の残基を表し、ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）はアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４からａａ１２３３（両端を含む）までのウイルスタンパク質ｐ１３０の残基を表す。
【００３０】
また、ＨＣＭＶの血清学的診断用診断試薬、及び、上記の組換えタンパク質材料、及び、血清学的方法によって抗−ＨＣＭＶ抗体の存在を同定するための上記の診断試薬を含む任意の診断用キットも本発明の範囲に包含される。
【００３１】
本発明のその他の特徴及び利点は、幾つかの非限定実施例に関する添付図面に基づく以下の記載から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、プラスミドｐＣＭＶ−５Ａの構築を示す概略説明図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＮＡ ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）及びｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）の配列を含むＰＣＲフラグメントの作製を示す概略説明図である。
【図２Ｂ】図２ＢはプラスミドｐＣＭＶ−３０及びｐＣＭＶ−３１の構築を示す概略説明図である。
【図３】図３は血液ドナーから採取した５００の血清サンプルで観察されたＩｇＭの反応性を示す表１である。
【図４Ａ−１】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図４Ａ−２】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図４Ｂ−１】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図４Ｂ−２】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図５】図５は選択されたヒト血清のコンボＷＢ試験に対する反応性を示す表３である。
【図６】図６は、本発明の試験に用いる試験ストリップを示す。図の右端の数値は変性条件下のポリペプチドの見掛け分子量を表す（ｖｐ＝ウイルスタンパク質；ｒｐ＝組換えタンパク質；μ＝クラスＭのヒト免疫グロブリンの精製μ鎖）。図の上端の番号は種々の血清サンプルを表し、１−３はＩｇＧ／ＩｇＭ陽性（ＥＩＡ）の妊娠女性；４及び５はＩｇＧ／ＩｇＭ陽性（ＥＩＡ）の腎移植レシピエント；６及び７はＩｇＧ陽性ＩｇＭ陰性（ＥＩＡ）の妊娠女性の血清サンプルである。
【図７】図７は図６と同様の試験ストリップを示す：一次感染した妊娠女性（ウイルスが胎児に感染）の経時試験（“追跡”）：１はＩｇＧ及びＩｇＭに陰性（ｎｅｇ．）の第一サンプル；２はＩｇＧ陰性、ＩｇＭ陽性（ｐｏｓ．）の第二サンプル；３から５は、２週おきに継続的に採取したＩｇＧ及びＩｇＭに陽性のサンプル；６はＩｇＧ及びＩｇＭに陰性の第一サンプル；７はＩｇＧ陰性、ＩｇＭ陽性の第二サンプル；８はＩｇＧ及びＩｇＭに陽性の第三サンプル；９はＩｇＧ及びＩｇＭ陰性の第一サンプル；１０から１３は７カ月間継続的に採取したＩｇＧ及びＩｇＭ陽性のサンプル：ウイルス尿が検出された新生児：１４はＩｇＧ陽性、ＩｇＭ陰性の血清サンプル。
【図８】図８は、特異的抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭを同定するための本発明の診断用ツールの概略説明図である。
【００３３】
図８を参照すると、符号（１）はヒト血清中の特異的抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭを同定するための診断用ツールを表す。ツールは、複数のバンドを担持する例えばニトロセルロースストリップの固体支持体手段（２）から成り、各バンドは、所定のパターンに従って配置された１つまたは複数のタンパク質から形成されている。より詳細には支持体ストリップ（２）は、２つのセクション（３）及び（４）から成る。第一セクション（３）はウイルスタンパク質によって形成され互いに（ｉ１），（ｉ２），（ｉ３），（ｉ４）の間隔を隔てる第一シリーズのバンド（５−ａ）（５−ｂ）（５−ｃ）（５−ｄ）（５−ｅ）を担持しており、第二セクション（４）は組換えタンパク質によって形成され互いに（ｅ１），（ｅ２）の間隔を隔てる第二シリーズのバンド（６ａ）（６ｂ）（６ｃ）を担持している。第二セクション（４）は更に、２つの対照バンド（７）及び（８）を含む。バンド（５−ａ）（５−ｂ）（５−ｃ）（５−ｄ）（５−ｅ）は好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分画によって精製され支持体ストリップ（２）に吸収されたビリオンから得られたＨＣＭＶのウイルスタンパク質ｖｐ２８、ｖｐ３８、ｖｐ６５、ｖｐ８２及びｖｐ１５０からそれぞれ形成されている。従って、バンド（５−ａ）（５−ｂ）（５−ｃ）（５−ｄ）（５−ｅ）は典型的な電気泳動パターンに従って配置され、距離（ｉ１），（ｉ２），（ｉ３），（ｉ４）はそれぞれの分子量の差に比例している。勿論、ウイルスタンパク質を別の方法で採取し支持体に転移させてもよい。その場合には、距離（ｉ１），（ｉ２），（ｉ３），（ｉ４）は異なる値になり、バンドは別のパターンで配置されるであろう。バンド（６ａ），（６ｂ），（６ｃ）は、例えば、遺伝子操作の技術を使用し外因性タンパク質ＣＫＳにウイルスタンパク質ｐ１３０、ｐｐ５２またはｐｐ１５０の１つまたは複数の免疫原性領域を組込むことによって作製された組換えタンパク質から形成されている。第一の対照バンド（７）はタンパク質ＣＫＳ自体から形成され、第二の対照バンド（８）はヒト免疫グロブリンのＨμ鎖のアリコートを含んでいる。
【００３４】
使用するときは、２つのセクション（３）及び（４）の各バンドを検査中の血清及び展開剤と共に試験する。バンドを形成するタンパク質を血清と共にインキュベーションした後、１つのバンドに対応するブロットの出現は、該バンドのタンパク質とＩｇＭとが反応したことを表し、その結果として検査中の血清中に上記抗体が存在することを示す。２つのセクション（３）及び（４）の応答の交差照合（クロスチェック）を行うことによって、従来のＷＢ試験で生じたような非特異的応答を防止し得る。更に、２つの対照バンド（７）及び（８）によって疑陽性または疑陰性の結果を識別することが可能である。即ち、タンパク質ＣＫＳによって形成されたバンド（７）の反応は、血清中に抗ＣＫＳ抗体が存在し、その結果として疑陽性が生じる可能性があることを示している。逆に、μ鎖を含むバンド（８）が反応しない場合には、試験の進行に過誤があり、結果が疑陰性になったと推定できる。
【００３５】
本発明によれば、以下により詳細に記載するような根拠に基づいて、第一セクション（３）の少なくとも１つのウイルスタンパク質及び第二セクション（４）の少なくとも１つの組換えタンパク質が検査中の血清と同時に反応するが、第一の対照バンド（７）を構成する外因性タンパク質は反応を示さず、第二の対照バンド（８）を形成するヒト免疫グロブリンのＨ鎖が反応しないときにだけ試験の結果が陽性であると判定される。
【００３６】
組換えセクション（４）では１つまたは複数のバンドが反応性であるが、セクション（３）ではウイルスタンパク質ｖｐ８２によって形成されるバンドだけが反応性であるときは試験の結果が不確定であると判定される。
【００３７】
最後に、対照バンド（８）が反応しない場合、（ヒト免疫グロブリンのμ鎖は必ず反応する筈であるから）試験の進行に過誤があったことが確認されるので、再試験が必要である。
【００３８】
本発明を更に十分に理解するために以下の非限定実施例によって本発明をより詳細に説明する。
【００３９】
実施例１：一般手順
１．材料及び入手先
制限酵素、Ｔ４ファージのリガーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）、キナーゼポリヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）から入手した。ＤＮアーゼＩ及びアプロチニンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．から入手した。
【００４０】
標準分子量のＤＮＡ及びタンパク質、Ｄａｉｉｃｈｉのプレフォームアクリルアミドゲル、セミドライ転移システム、対応するバッファは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４１】
イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、アクリルアミド、Ｎ′，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、４−クロロ、１−ナフトロ、染料クーマシー・ブルー（登録商標）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＢｉｏ Ｒｅａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４２】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した抗体は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。大腸菌細胞Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ Ｃｏｌｉ（登録商標）ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＥ４４ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ〔Ｆ′ ｐｒｏＡＢ ｌａｃｌｑ ＺΔＭ１５ Ｔｎ（Ｔｅｔｒ）〕、ＤＮＡ精製キット、ＲＮＡ精製キット、ｃＤＮＡ合成キットＺＡＰ（登録商標）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４３】
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）試薬キット及びＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ （Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）から入手した。一般手順で使用したデオキシヌクレオチド三リン酸はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）キットから採用した。
【００４４】
支持体付きのニトロセルロース膜は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４５】
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）及び７−デアザ−ｄＧＴＰでＤＮＡを配列決定するためのヌクレオチドキット及びＤＮＡポリメラーゼＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）のＶｅｒｓｉｏｎ ２．０は、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４６】
ｍＲＮＡポリＡ＋精製用キットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．ＵＳＡ）から入手した。
【００４７】
アンピシリンを含むルリアブイヨンのプレート（ＬＢａｍｐプレート）はＭｉｃｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４８】
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地、ウシ胎仔血清、燐酸塩緩衝生理食塩水、適当な大腸菌ＤＨ５ａ細胞（φ−Ｆ８０ｄｌａｃＺＤＭ１５Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｐｈｏＡ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−，ｍＫ＋）ｓｕｐＥ４４ １− ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１）、及び、アガロースゲルｕｌｔｒａＰＵＲＥ（登録商標）は、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４９】
バクトトリプトン、バクト酵母エキス、バクト寒天は、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）から入手した。
【００５０】
ＮＺＹ（登録商標）ブイヨンは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。
【００５１】
サケ精子のＤＮＡ、リゾチーム、アンピシリン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、チメロサール、バッファ、カゼインの酸加水分解物、トゥイーン２０（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、フェニルメチルスルホノフルオリド（ＰＭＳＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、尿素、グリセロール、ＥＤＴＡ、デオキシコール酸ナトリウム及び無機塩は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。
【００５２】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）はＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）から入手し、メタノールはＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇ〔ｉ〕ｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手した。
【００５３】
２．培地、バッファ及び遺伝試薬
“ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ ＩＩ”は、１１．２５ｇ／リットルのトリプトンと２２．５ｇ／リットルの酵母エキスと１１．４ｇ／リットルの二塩基性リン酸カリウムと１．７ｇ／リットルの一塩基性リン酸カリウムと１０ｍｌ／リットルのグリセロールとを含有し、水酸化ナトリウムによってｐＨ７．２に調整されている。
【００５４】
“トリス生理食塩水バッファ”即ち“ＴＢＳ”は、２０ｍＭのトリスと５００ｍＭのＮａＣｌとから成るｐＨ７．５のバッファである。“トゥイーン２０（登録商標）−トリス生理食塩水バッファ”即ち“ＴＢＳＴ”は、ＴＢＳに０．０５％のトゥイーン２０（登録商標）を加えたバッファである。
【００５５】
“膜ブロッキング溶液”は、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１％のカゼインの酸加水分解物と０．０５％のトゥイーン２０（登録商標）とを加えたＴＢＳから成る。
【００５６】
サンプル希釈バッファ“Ｒｕｂａｚｙｍｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ”即ち“Ｒｕｂａｚｙｍｅ ＳＤＢ”は、１００ｍＭのトリスと１３５ｍＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＥＤＴＡと０．２％のトゥイーン２０（登録商標）と０．０１％のチメロサールと４％のウシ胎仔血清とから成るｐＨ７．５のバッファである。
【００５７】
コンジュゲート希釈バッファ“Ｒｕｂａｚｙｍｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ”は、１００ｍＭのトリスと１３５ｍＭのＮａＣｌと０．０１％のチメロサールと１０％のウシ胎仔血清とから成るｐＨ７．５のバッファである。
【００５８】
“ＨＲＰＯ呈色溶液”は、０．０６％の４−クロロ−１−ナフトロと０．０２％のＨ２Ｏ２と０．２％のメタノールとを含むＴＢＳから成る。
【００５９】
“ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファ”は、２％のＳＤＳと１０％のグリセロールと５％のβ−メルカプトエタノールと０．１％のブロモフェノールブルーとを含む６２ｍＭのトリスから成るｐＨ６．８のバッファである。
【００６０】
“ＴＥバッファ”は１０ｍＭのトリスと１ｍＭのＥＤＴＡとから成るｐＨ８．０のバッファである。
【００６１】
“ＴＥＭ溶解バッファ”は５０ｍＭのトリスと１０ｍＭのＥＤＴＡと２０ｍＭのＭｇＣｌ２とから成るｐＨ８．５のバッファである。
【００６２】
“ＰＴＥバッファ”は５０ｍＭのトリスと１０ｍＭのＥＤＴＡとから成るｐＨ８．５のバッファである。
【００６３】
３．ウイルスの増殖及びｃＤＮＡの調製
５％のウシ胎仔血清を含む培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中で増殖させたヒト線維芽細胞で培養したＨＣＭＶウルイスの菌株ＡＤ１６９またはＴｏｗｎｅのいずれを使用してもよい。ＨＣＭＶのＡＤ１６９菌株及びＨＣＭＶのゲノムはＣｈｅｅら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．，１５４：１２５（１９９０）及びＢａｎｋｉｅｒら，ＤＮＡ Ｓｅｑ．２：１（１９９１）の著書に記載されている。これらの文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００６４】
線維芽細胞をＨＣＭＶ感染させ、６日後にこれらの細胞を収集し、遠心し、ＰＢＳで洗浄し、ｖｅｔｒｏ−Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ホモジナイザーで均質混合した。Ｍｏｃａｒｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：１２６６（１９８５）に記載の手順で完全ウイルスＤＮＡを単離した。均質混合した細胞からＲＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて完全ＲＮＡを単離し、メッセンジャーＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＲＮＡポリＡ＋を単離した。精製したウイルスｍＲＮＡからＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キットを用いてＨＣＭＶのｃＤＮＡを合成した。
【００６５】
４．一般方法
ＤＮＡの酵素消化はいずれも製造業者の指示通りに行った。１マイクログラムのＤＮＡあたり少なくとも５単位の酵素を使用し、ＤＮＡの完全消化に十分なインキュベーション時間で反応を進行させた。ＤＮＡ及びＲＮＡの種々の操作キットの使用、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの合成、及び、ＤＮＡの配列決定は、製造業者によって提供されたプロトコル通りに行った。大腸菌のプラスミドＤＮＡの小規模または大規模の調製、λファージ感染大腸菌細胞のファージ溶解液からのＤＮＡの調製、抗大腸菌抗体を吸着させるための大腸菌溶解物の調製、フェノール−クロロホルムによるＤＮＡの抽出及び沈殿、アガロースゲルにおける制限の分析、アガロースゲル及びポリアクリルアミドゲルによるＤＮＡフラグメントの精製、制限酵素消化によって生じたＤＮＡの不完全３’端（カルボキシル末端）に対するＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによる埋戻し及びＴ４ファージのリガーゼによるＤＮＡフラグメントの結合、適当なＴＢ１細胞（Ｆａｒａ ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ φ−８０ｄｌａｃＺＤＭ１５ｈｓｄＲ１７）の調製は、製造業者によって提供されたプロトコル通りに行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。
【００６６】
作製したプラスミドにＰＣＲ増幅によってクローニングさせるＤＮＡフラグメントを、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させてから、制限酵素で消化した。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定に使用したオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のオリゴヌクレオチドシンセサイザー３８０ Ｂまたは３９４モデルを使用し、製造業者のプロトコルに従って合成した。
【００６７】
５．ベクターの構築
前駆プラスミドｐＪＯ２００，ｐＥＥ１，ｐＭＢ３４及びｐＲＯＳＨ１０は、国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１及びＬａｎｄｉｎｉらの論文（４）に記載されている。
【００６８】
実施例２：ｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＪＯ２００に由来のプラスミドｐＣＭＶ−１Ａは、ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含むＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築した。このＤＮＡフラグメントは、国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１及びＬａｎｄｉｎらの論文（４）に記載されているように、ｐＭＢ３４に含まれているＤＮＡ Ａ１Ｃ２Ｆ３をｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位でＰＣＲ増幅させることによって得られた。プラスミドｐＣＭＶ−１Ａはブダペスト条約に規定された条項に従って１９９６年４月３０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセス番号ＡＴＣＣ９８０４２で受託された。
【００６９】
実施例３：ｐＣＭＶ−５Ａ：ＣＫＳ−Ｈ１０−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＪＯ２００（図１）の誘導体であるプラスミドｐＣＭＶ−５Ａは、ＨＣＭＶ−Ｈ１０を含むＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築した。このＤＮＡフラグメントは、ｐＲＯＳＨ１０に含まれているＤＮＡ Ｈ１０をｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位にＰＣＲ増幅することによって得られた。プラスミドｐＣＭＶ−５Ａはブダペスト条約に規定された条項に従って１９９６年４月３０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセス番号ＡＴＣＣ９８０４４で受託された。
【００７０】
プラスミドＤＮＡ（ｐＲＯＳＨ１０及びｐＪＯ２００）の大規模精製は一般方法によって行った。プラスミドｐＪＯ２００のＤＮＡをＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクターの骨格をアガロースゲルで精製した。ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ消化によってＣＫＳ遺伝子の３′端の一部分を除去し、“結合”反応後に再構築した。ＰＣＲ増幅によって得られた２つのＤＮＡフラグメントを三方向“結合”反応によってベクターの骨格にクローニングした。Ｈ１０をＤＮＡフラグメントＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩとしてクローニングし、ＣＫＳ遺伝子の残りの３′部分をＤＮＡのＭ１ｕＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローニングし、これによって完全なＣＫＳ遺伝子を再構築した。
【００７１】
ｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４を起点としＳｔｕＩ部位を含むセンスプライマーと、ｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９を起点としＭ１ｕＩ部位を含むアンチセンスプライマーとを合成し、これらのプライマーをプラスミドｐＲＯＳＨ１０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲによる増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩによって消化し、得られたＨ１０を含む６９６ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製した。ｐＪＯ２００のヌクレオチド６４０を起点とし（Ｍ１ｕＩ部位を含む）センスプライマーと、ｐＪＯ２００のヌクレオチド９０５を起点とするアンチセンスプライマーとを合成し、プラスミドｐＪＯ２００を含むＰＣＲ反応混合物に加えた（ヌクレオチドの番号は前述のようにＬａｄｉｎｉらによる国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１の図１２にｐＪＯ２００として示されているＤＮＡの配列に対応する）。ＰＣＲによる増幅後、反応混合物をＭ１ｕＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、得られたＣＫＳ遺伝子の３’部分を含む２６６ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲルによって精製した。得られたこれらの精製ＤＮＡフラグメントを次に、ｐＪＯ２００／ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩに１６℃で一夜結合させた。翌日、結合混合物を形質転換のために適当なＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に導入した。
【００７２】
次に、形質転換物質を用いてＤＮＡを小規模で調製し、ｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位に挿入されたＨ１０の存在を分析した。プラスミドｐＣＭＶ−５ＡはＳｔｕＩ部位に挿入されたＨ２０を含んでいることが判明した。Ｈ１０のＤＮＡ及びＣＫＳの３’端の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。タンパク質ｒｐＣＭＶ−５Ａをコードする構築物ＣＫＳ−Ｈ１０−ＣＫＳのコーディング領域は、Ｈ１０とＣＫＳの３’端との間にＭ１ｕＩ部位を有する２つのアミノ酸（トレオニン及びアルギニン）のブリッジを含んでいることが判明した。更に次式で示すように、ＣＫＳのアミノ酸１７１は構築物中で複製されていた。
（１）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ｈ１０−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩからコードされているトレオニン及びアルギニン残基を表す。
【００７３】
実施例４
ＣＫＳ−ｐＵＬ５７−ＣＫＳを発現するｐＥＥ１に基づくベクターの構築
２つの融合構築物ＣＫＳ−ｐＵＬ５７−ＣＫＳを構築するための出発プラスミドとして、タンパク質ＣＫＳを発現するベクターｐＥＥ１を使用した。各構築物を得るために、プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化し、ベクターの骨格を精製した。構造ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩは、ＰＣＲ増幅によって作製され５’端（アミノ末端）にＳｔｕＩ部位をもち３’端（カルボキシル末端）にＭ１ｕＩ部位をもつｐＵＬ５７遺伝子のフラグメントを受容し得る。ＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化後、ｐＵＬ５７遺伝子のフラグメントをＰＣＲによって骨格ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩに“インフレーム”でクローニングした。これらのベクターによって発現される融合タンパク質ＣＫＳ−ＰＵＬ５７−ＣＫＳは次式で示される。
ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐＵＬ５７−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩにコードされているトレオニン及びアルギニン残基である。
【００７４】
操作１：ｐＣＭＶ−３０：ＣＫＳ−ｐＵＬ５７（５４０−６０１ａａ）−ＣＫＳの構築
ＨＣＭＶのｃＤＮＡのアミノ酸５４０−６０１をコードするｐＵＬ５７の領域のＰＣＲ増幅によって得られたＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングすることによってプラスミドｐＥＥ１の誘導体であるプラスミドｐＣＭＶ−３０（図２Ａ及び２Ｂ）を構築した。使用されるＤＮＡフラグメントは、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１６１８−１８０３から成り、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１及び３７７６はそれぞれ、既知のＡＤ１６９の配列の追加フィラメントのヌクレオチド９０２８１及び８６５０６に対応する。プラスミドｐＣＭＶ−３０はブダペスト条約に規定された条項に従ってＡＴＣＣに寄託され、アクセス番号ＡＴＣＣ９８０６５として受託された。
【００７５】
ＨＣＭＶのｃＤＮＡを鋳型として用い、ＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）をＰＣＲ増幅反応によって２段階（“入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）”）で作製した。外側の入れ子の増幅反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１３７９を起点とするセンスプライマーと、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１９３３を起点とするアンチセンスプライマーとを合成した。次に、ｃＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを加えた。ＰＣＲ増幅後、外側の入れ子の増幅混合物を内側の入れ子のＰＣＲ増幅反応の鋳型として使用した。内側の反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１６１８を起点としＳｔｕＩ部位を含むセンスプライマーとｐＵＬ５７のヌクレオチド１８０３を起点としＰｓｔＩ部位を含むアンチセンスプライマーとを合成した。次に外側入れ子反応で増幅されたＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを添加した。ＰＣＲ増幅反応後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＰｓｔＩで消化し、ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）を含む１８６ｂｐのフラグメントをアガロースゲルで精製した。
【００７６】
一般方法を用い、プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１）を大規模で調製した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化し、ベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩの骨格をアガロースゲルで精製した。精製したＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）ＳｔｕＩ／ＰｓｔＩをベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩに１６℃で一夜結合させた。翌日、結合混合物を形質転換物質を用いて適当なＸｌ−１ Ｂｌｕｅ細胞に挿入した。形質転換物質をプラスミドＤＮＡから小規模で調製し、次いで、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に挿入されたＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）の存在を分析した。プラスミドｐＣＭＶ−３０はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に局在するｐ１３０（５４０−６０１ａａ）を含むことが判明した。更に、ＤＮＡ配列決定によってｐ１３０（５４０−６０１ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。この融合構築物ＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳは次式で示される。
（２）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩからコードされているトレオニン及びアルギニン残基を表す。
【００７７】
操作２：ｐＣＭＶ−３１：ＣＫＳ−ｐＵＬ５７（１１４４−１２３３ａａ）−ＣＫＳの構築
アミノ酸１１４４−１２３３をコードするｐＵＬ５７の領域のＨＣＭＶのｃＤＮＡからＰＣＲ増幅によって得られたＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングすることによってプラスミドｐＥＥ１の誘導体であるプラスミドｐＣＭＶ−３１（図２Ａ及び２Ｂ）を構築した。使用したＤＮＡフラグメントは、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３４３０−３６９９から成る。ｐＵＬ５７のヌクレオチド１及び３７７６はそれぞれ、既知のＡＤ１６９の配列の追加フィラメントのヌクレオチド９０２８１及び８６５０６に対応する。プラスミドｐＣＭＶ−３１はブダペスト条約に規定された条項に従ってＡＴＣＣに寄託され、アクセス番号ＡＴＣＣ９８０６６として受託された。
【００７８】
ＨＣＭＶのｃＤＮＡを鋳型として用い、ＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）をＰＣＲ増幅反応によって２段階（“入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）”）で作製した。外側の入れ子の増幅反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３３５１を起点とするセンスプライマーと、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３７６６を起点とするアンチセンスプライマーとを合成した。次に、ｃＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを加えた。ＰＣＲ増幅後、外側の入れ子の増幅混合物を内側の入れ子のＰＣＲ増幅反応の鋳型として使用した。内側の反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３４３０を起点としＳｔｕＩ部位を含むセンスプライマーとｐＵＬ５７のヌクレオチド３６９９を起点としＰｓｔＩ部位を含むアンチセンスプライマーとを合成した。次に、外側入れ子反応で増幅されたＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを加えた。ＰＣＲ増幅反応後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＰｓｔＩで消化し、ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）を含む２７０ｂｐのフラグメントをアガロースゲルで精製した。
【００７９】
一般方法によってプラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１）を大規模で調製した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化し、ベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩの骨格をアガロースゲルで精製した。精製したＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩをベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩに１６℃で一夜結合させた。翌日、結合混合物を形質転換によって適当なＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に挿入した。形質転換物質からプラスミドＤＮＡを小規模で調製し、次いで、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に挿入されたＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）の存在を分析した。プラスミドｐＣＭＶ−３１がｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に局在するｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）を実際に含むことが判明した。更に、ＤＮＡ配列決定によってｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。この融合構築物ＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳは次式で示される。
（３）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩからコードされているトレオニン及びアルギニン残基を表す。
【００８０】
実施例５：ＨＣＭＶの組換え抗原の産生及び精製
１．ＨＣＭＶの遺伝子の発現
非融合タンパク質ＣＫＳを発現する細菌性対照菌株、並びに、実施例２〔ｒｐＣＭＶ−１Ａ（Ａ１Ｃ２Ｆ３／ｐｐＵＬ３２／ｐｐ１５０）〕、実施例３〔ｒｐＣＭＶ−５Ａ（Ｈ１０／ｐｐＵＬ４４／ｐｐ５２）〕、実施例４〔ｒｐＣＭＶ−３０（ｐＵＬ５７／ｐ１３０）及びｒｐＣＭＶ−３１（ｐＵＬ５７／ｐ１３０）〕のようなＨＣＭＶの融合タンパク質を発現する細菌性クローンの全部を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地“ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ ＩＩ”で対数増殖期まで培養した。融合タンパク質ＣＫＳ−ＨＣＭＶの合成を、（９）に記載されているようにＩＰＴＧの添加によって誘発した。誘発の４時間後、細胞を遠心によって収集し、タンパク質の精製時点までペレットを−８０℃で凍結した。
【００８１】
２．非融合タンパク質ＣＫＳ及び組換えタンパク質ＣＫＳ−ＨＭＶの精製
不溶性の融合タンパク質ＣＫＳ−ＨＣＭＶ（ｒｐＣＭＶ−１Ａ，ｒｐＣＭＶ−５Ａ，ｒｐＣＭＶ−３０，ｒｐＣＭＶ−３１）を、界面活性剤による一連の洗浄及び８Ｍの尿素中の可溶化（９）を順次行う溶菌処理によって精製した。細胞溶解後の可溶性タンパク質ＣＫＳを硫安沈殿及びＤＥＡＥクロマトグラフィーを順次用いて精製した。
【００８２】
実施例６：実験的試験−“コンボＷＢ”
１．ヒト血清のサンプル
特に疑陽性に注目してコンボＷＢの特異性レベルを従来のＥＩＡとの比較によって評価するために、採取血清群から無作為に選択した５００のドナー血液の血清サンプルを試験した。
【００８３】
コンボＷＢ試験の感度を評価するために、種々の方法、特に２つの商業的ＥＩＡ試験及び従来のＷＢ試験による測定で抗−ＣＭＶ ＩｇＭ陽性を示したサンプルから１００の血清を選択した。上記の３つの試験の全部で陽性を示したサンプルだけをこのグループに入れ、以後の試験に使用した。試験の感度を更に評価するために、別の２つのサンプルグループを選択した。１つのサンプルグループは、ＰＣＲによって多形核白血球（ＰＭＮＬ）中のＨＣＭＶが陽性を示した心移植レシピエント（ＨＴＲ）から採取した８５の血清から構成され、もう１つのサンプルグループは、尿からのウイルス単離またはＩｇＧの血清変換によってＨＣＭＶ感染が判明した妊娠女性から採取した３８の血清から構成されていた。
【００８４】
更に、コンボＷＢ試験で測定したときのＨＣＭＶウイルスに対する免疫応答の出現及び発生の時間を決定するために、１０人の移植レシピエントに関する経時試験（“追跡”）を行った。即ち、これらの移植レシピエントから合計７４の血液サンプルを採取し、これらのサンプルの抗原血分析または従来のＥＩＡ及びコンボＷＢによる抗−ＣＭＶ特異的ＩｇＭの検定を実施した。
【００８５】
２．ＨＣＭＶウイルスの一部分に対する感染のウイルス学的診断
２．１．ウイルスの単離
尿及び唾液からウイルスを単離するために“シェルバイアル（ｓｈｅｌｌ ｖｉａｌ）”手順（１）を使用した。病原性物質を接種したヒト線維芽様細胞を接種後２４〜４８時間定着させ、遺伝子産物ＨＣＭＶ−ＩＥ１／ＩＥ２と反応するモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｉｎｅ社製，Ｐａｒｉｓ，ＦｒａｎｃｅのＥ１３）を用いた間接免疫蛍光（ＩＩＦ）によって呈色させた。
【００８６】
２．２．抗原血
ＰＭＮＬを富化したＰＢＬ画分中のＨＣＭＶ−ｐｐ６５の存在を、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｉｊｉら（１０）が発案しＲｅｖｅｌｌｏら（８）が修正した手順で、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５特異的モノクローナル抗体（Ａｒｇｅｎｅ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅのクローン１Ｃ３）を用いた間接ＩＩＦ試験で測定した。
【００８７】
蛍光顕微鏡で観察し、細胞数２００，０００あたりのｐｐ６５陽性の細胞数をカウントすることによって結果を定量した。２００，０００個に１個の割合の陽性細胞は、結果を抗原血陽性と判定するために十分であった。
【００８８】
３．ＨＣＭＶウイルス感染症の血清学的診断
３．１．従来のＥＩＡ試験
市販のＥＩＡ抗−ＣＭＶ／ＩｇＧキット（Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔのアルファ法によってＨＣＭＶウイルスに対して特異的なＩｇＧの力価測定を行った。ＥＩＡ用の全自動マイクロリーダー（Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ）を用いてマイクロプレートを読取った。Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔの抗−ＣＭＶ／ＩｇＭキット（Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ）を用いて抗−ＣＭＶ ＩｇＭを評価した。製造業者から提供された指示に従って結果を解釈した。
【００８９】
３．２．抗−ＣＭＶ ＩｇＭを同定するための“コンボＷＢ”試験
参考文献（３）に記載されている従来のＷＢ技術を使用し、精製ビリオンの溶解液をポリアクリルアミドゲルで分画した。このようにして分離したポリペプチドを次に、それぞれの電気泳動プロフィルに従ってニトロセルロースシートに転移させた。ニトロセルロースシートの底面が組換えタンパク質に十分なスペースを与えるようにニトロセルロースシートの長さをゲルのほぼ２．５割増しの寸法にした。電気泳動によるウイルスタンパク質の転移後、ミニブロッターのチャンネルがポリアクリルアミドゲル上のタンパク質の泳動方向に垂直になる方向で各ブロットをミニブロッターにマウントした。３つの組換えタンパク質の懸濁液を小ウェルに滴下した。ベクタータンパク質に対する非特異的反応をチェックし、免疫複合体を正しく同定するために、ベクタータンパク質ＣＫＳとヒト免疫グロブリンのμ鎖をそれぞれ滴下した２つの対照チャンネルを設けた。次に、ミニブロッターを振動プラットホームに４℃で一夜維持することによって軽度に撹拌した。フィルターをＴＢＳで簡単に洗浄し、次いでブロッキング溶液（ＴＢＳ中の３％魚ゼラチン、１％ＢＳＡ、５％脱脂粉乳、０．０５％トゥイーン２０）で飽和し室温で１時間インキュベートした。フィルターを幅３ｍｍのストリップに裁断し、各ストリップが標品ウイルスタンパク質（上部）または組換えポリペプチド（下部）を含むようにし、従来のＷＢセクションと組換えバンドのセクションとの組合せを形成した。このように形成したニトロセルロースストリップを用いて、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＭを検出する血清学的分析を行った。血清を、４％のウシ胎仔血清（ＳＢＦ）、０．１％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで１：５０に希釈した。ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヒト抗−μ鎖抗体（ヤギの抗−ヒトＩｇＭ）を、１０％ＳＢＦを含むＴＢＳで希釈した。
【００９０】
３．３．ＩｇＭを同定するためのコンボＷＢ試験の解釈アルゴリズム
ストリップのウイルスタンパク質を含むＷＢセクションは、タンパク質ｐｐ１５０，ｐｐ６５，ｐ５５，ｐ３８，ｐ２８のいずれか１つがヒト血清に対して反応性を示したときだけ陽性であると判定される。ストリップの組換えセクションは、組換えウイルスタンパク質に対応するバンドの少なくとも１つが反応性を示したときに陽性であると判定される。即ち、試験の結果は以下のごとく判定される。
【００９１】
−ストリップの従来のＷＢセクションで少なくとも１つのバンドが反応性を示し、同時に、組換えセクションで少なくとも１つのバンドが反応性を示すことが確認されたときに結果は陽性である。
【００９２】
−ストリップの２つのセクションのうちの一方のセクションが完全に陰性のときは他方のセクションにいくつの反応性バンドが存在するかに関わりなく結果は陰性である。
【００９３】
−ストリップのＷＢセクションのｐ８２だけが陽性を示し、組換えセクションの１つまたは複数のバンドが陽性を示したときは結果は不確定であり、陰性であるか陽性であるか決められない。
【００９４】
試験の有効性を確認するために、μ鎖の位置の陽性反応及びベクタータンパク質の位置の無反応が必要であった。
【００９５】
３．４．抗−ＨＣＭＶ ＩｇＧまたはＩｇＡを同定するためのコンボＷＢ
上述のように作製したコンボＷＢストリップはまた、ヒト血清中のＨＣＭＶウイルス特異的ＩｇＧ及びＩｇＡを検査する血清学的試験でも使用され得る。４％のＳＢＦ及び０．１％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで血清を１：１００に希釈する。ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたγ鎖及びα鎖のそれぞれに特異的な抗体（ヤギの抗−ヒトＩｇＭ）を、１０％のＳＢＦを含むＴＢＳで希釈する。
【００９６】
４．結果
４．４．コンボＷＢ試験によるＩｇＭ特異的抗−ＨＣＭＶの同定
ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭに対するコンボＷＢ試験の特異性を確認するために、血液ドナー及び健康な個人から採取した多数のサンプルを用い、従来のＥＩＡ試験と平行試験を実施した。米国で採取した３００の血清と、イタリアで採取した２００の血清とから成る合計５００の血清を分析した。血清の約７９％がＩｇＧ陽性であることが判明していた。ＩｇＭ陽性は従来のＥＩＡ試験では０．２％、組合せ方法では１．８％であった。この分析の詳細を表１にまとめる。即ち、１４の血清（２．８％）がｖｐ１５０だけと反応し、３つの血清（０．６％）がｖｐ８２だけと反応し、少数の他の血清（０．４％以下）が１つまたは複数の他のウイルスタンパク質と反応したが、これらのうちで組換えタンパク質と反応するものはなかった。３つの血清（０．６％）が１つまたは複数の組換えタンパク質と反応したが、ウイルス反応との同時的反応は全く生じなかった。これらの２つの血清グループはいずれもＩｇＭ陰性であると判定される。９個の血清（１．８％）は少なくとも１つのウイルスタンパク質及び１つの組換え体と反応し、従って、ＩｇＭ陽性であると判定される。更に、本発明の第二の試験のＩｇＭに対する感度を測定するために、商業的ＥＩＡ試験または従来のＷＢ試験でＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ陽性と判定された別の１００の血清をコンボＷＢで分析した。これらの血清の１００％がコンボＷＢ試験でも同じく陽性であると判定された。試験の感度を更に評価するために、別の２つの血清グループを試験した。ＰＭＮＬ中のＨＣＭＶウイルスがＰＣＲ陽性であると判定されていた心移植患者から採取した８５のサンプルから成る第一グループについて、市販のＥＩＡキット及びコンボＷＢを用いてＨＣＭＶ特異的ＩｇＭの存在を分析した。市販のキットでは３９のサンプルが陽性であったが、コンボＷＢでは５８のサンプルが陽性であった（表３）。最後に、妊娠女性の血清から採血時点の能動感染の存在に基づいて３８の血清サンプルを選択した。これらの血清サンプルについて、ＥＩＡ試験及びコンボＷＢ試験で抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭの存在を分析すると、前者の方法では２２のサンプルが陽性であり、後者の試験では３４のサンプルが陽性であった（表３参照）。コンボＷＢ試験による血清サンプルの反応性のいくつかの例を図６及び図７に示す。血清は、急性感染の妊娠女性（図６、レーン１〜３）、感染の進行した妊娠女性（図６、レーン６及び７）、胎児へのウイルス感染が確認された一次感染の妊娠女性（図７）から採取した。
【００９７】
急性感染の場合、コンボＷＢによって測定されるＩｇＭの免疫応答の出現及び発生の時点を確認する目的で、更に１０人の臓器移植レシピエントのグループを実験的分析に追加し、これらの被験者（合計７４人）から採取した血清のサンプルの経時試験（“追跡”）を実施した。第一サンプルは、外科処置前の各レシピエントから採取し、以後２〜７８日（両端値を含む）の間隔をおいて定期的にサンプルを採取した。血清を、抗原血試験、ＩｇＭに対する商業的ＥＩＡ試験及びコンボＷＢ試験によって平行試験した。表２に示すように、４つの場合（Ａｒｑ，Ｆｉｒ，Ｆｅｒ及びＢａｔ）に、３つの方法が同等の感度を示し、全部の試験でこれらのサンプルが最初から陽性であると判定された。２つの場合（Ｆｉｏ及びＢｏｓ）に、抗原血試験が最初に感染反応を示し、他の試験よりもそれぞれ１４日及び９日早かった。１つの場合（Ｃｕｐ）に、コンボＷＢが最初に感染反応を示し、抗原血よりも１９日早かった。１つの場合（Ｓａｂ）に、抗原血及びコンボＷＢはＥＩＡよりも１週間早く感染反応を示した。コンボＷＢにおけるこれらの血清の反応性の一例を図６のレーン４及び５に示す。
抗−ＣＭＶ ＩｇＭの血清学的分析だけを考察すると、コンボＷＢは２つの場合（Ｓａｂ，Ｃｕｐ）にＥＩＡ試験よりも早かった。別の２つの場合（Ｆｉｏ及びＣｉｃ）には順序が逆であったが、残りの６つの場合にはＥＩＡ及びコンボＷＢが同時に陽性を示すことが知見された。
【００９８】
４．２．コンボＷＢ試験による抗−ＨＣＭＶ ＩｇＧ及びＩｇＡの同定
修正された形態のコンボＷＢ試験をヒト血清サンプル中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの同定に応用し得る。ＩｇＭの特異的検出に使用するストリップと本質的に同じ方法でニトロセルロースのストリップを作製するが、ｐＵＬ５７の一部分を発現する組換えタンパク質の代わりに、ｇＢ（ＵＬ５５）及びｐ２８（ＵＬ９９）の部分を発現する組換えタンパク質を使用する。
【００９９】
５．検討
ＷＢ技術の方法に基づく新規な血清学的試験方法が開発された。この新規な試験方法は天然型のウイルスタンパク質または組換え免疫原を抗原性物質として使用する。
即ち、標品ウイルス物質の明確な特異性または組換えによって産生された抗原の信頼性を有している診断用製品を作製するために、感染細胞に由来のウイルス産物と遺伝子操作の技術によって得られた組換え抗原とを組合せた。即ち、本発明の目的は、市販のＨＣＭＶ抗原性物質に内部標準を付加することによって、明確な結果を確認できるようにし、同時に、特異的抗体が認識し得る標的ウイルスの種類を非構造ウイルス抗原によって拡大することである。本発明の別の目的は、組換えタンパク質に対するヒト血清の反応性の内部標準を与えるために、所定のＨＣＭＶの組換え抗原の混合物に構造ウイルス産物標品を組合せることである。実際に試験の結果は、試験自体から構成されるこの相互的内部対照の直接結果に基づいて解釈される。即ち、試験の双方の部で少なくとも１つの有意なバンドが陽性を示すときにだけ結果が陽性であると判定される。
【０１００】
実験の結果は、本発明のコンボＷＢ試験が、
（１）従来のＥＩＡ試験（Ｂｅｈｒｉｎｇ）よりも高感度であること、
（２）従来のＷＢ試験よりも優れた特異性を有すること、
を示した。
【０１０１】
統計的には血液ドナーまたは健康な成人の集団から採取した血清サンプルのうちの平均０．３％〜１．１％がＨＣＭＶ ＩｇＭ陽性であると文献に記載されているので（７）、実験の結果は、コンボＷＢが従来のＷＢに比べて向上した特異性を保証することを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清中のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に特異的な抗体を同定するための診断用ツールに関する。本発明は更に、上記の診断用ツールを利用して抗ＨＣＭＶ抗体を同定するための改良された形態のウェスタンブロット試験に関する。このような試験は、より高いレベルの信頼性を有しており、従って、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）のような慣用の技術を用いて行われた第一試験の結果の参照標準として血清学的対照に有利に使用でき、また、抗ＨＣＭＶ抗体検査に単独で使用できる。本発明は更に、上記の改良されたウェスタンブロット試験を用いてヒト血清中のサイトメガロウイルス特異的ＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡを同定する方法に関する。本発明は最後に、上記の方法において、精製ビリオンから得られた他のウイルス抗原と共に使用される組換え融合タンパク質、及び、該タンパク質を発現するプラスミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＭＶはヒトの遍在性感染物質である。ＨＣＭＶは、健康な成人の体内で病原性となることは極めて少ないが、免疫の低下した人の体内では種々の障害に関与する。ＨＣＭＶは更に、ヒトの先天性感染症の最も普遍的な原因であり、新生児の精神薄弱の原因として知られたダウン症候群に次いで二番目に多い母系感染症である（２）。
【０００３】
ＨＣＭＶを原因とする感染症の血清学的診断には一般に、種々のレベルまで精製されたウイルス自体または感染細胞の溶解液を抗原性物質として用いる酵素免疫検定法（ＥＩＡ）が用いられている。このような試験を行うための種々のキット商品は現在も市場で入手できるが、これらのキットには参照すべき標準がない。そのため、キットによって与えられた結果が互いに一致しない場合が多い。例えば、幾つかのキットは極めて高い特異性を有しているが感度が十分でなく、また別の幾つかのキットは極めて高感度であるが特異性が十分でない（６）。従って総体的には、疑陽性や疑陰性などの応答が多数生じる。
【０００４】
また、“ウェスタンブロット”法を用いて行われる血清学的分析はＥＩＡ試験に比べて費用も時間も掛かるが、特に最終結果の特異性に関してはＥＩＡ試験よりもはるかに信頼性が高いことが知られている。このような理由で、特にＨＩＶ感染については、ＥＩＡ試験で感染を確定できなかった場合には、感染を確認するためにウェスタンブロット試験（しばしば“ＷＢ”と略称される）が常に使用されている。
【０００５】
ＨＣＭＶの血清学的検査に最も有効な抗原性物質は間違いなくウイルス自体である。従来のウェスタンブロット試験の手順では、感染細胞の培養物の精製によって得られたウイルスを変性用混合物に懸濁させ、その構造タンパク質を分取用ポリアクリルアミドゲルで分画する。このようにして得られた典型的なタンパク質パターンを固体支持体（通常はニトロセルロース）に転移させ、得られたスポット（“ブロット”）を順次に数ミリメートル幅の種々のストリップに細分する。次に、各ストリップを被検血清と共に用いてアッセイを行う。
【０００６】
しかしながらＷＢ試験に全く欠点がないとは言えない。第一に、最も高い免疫原性能力を有しており最も長期間の免疫学的応答を生じるＨＣＭＶウイルスの構造抗原は分子量１５０ｋＤのポリペプチドである（ウイルス自体のＵＬ３２遺伝子によってコードされており、従ってｐｐＵＬ３２と呼ぶ）が、通常はこのポリペプチドがポリアクリルアミドゲル中で、同じ分子量をもつＨＣＭＶウイルスの別の構造成分（ＵＬ８６遺伝子によってコードされており、従ってｐｐＵＬ８６と呼ぶ）と一緒に泳動する。後者のポリペプチドは比較的有効な免疫原性物質ではあるが、ヘルペスウイルス科の他のウイルスの相同タンパク質に共通の抗原エピトープを含むので“グループ抗原”として定義されており、従って特異性に乏しい。ＷＢ試験では１５０ｋＤのバンドが唯一の反応性バンドであると判明するケースが比較的多いが、このような場合に、被検患者が特異的抗原ｐｐ１５０に対する直接抗体を有しているのか非特異的グループ抗原ｐｐＵＬ８６に対する直接抗体を有しているのかを（少なくとも十分な程度に）判断することができないので、結局は結果を確定することができない〔１１〕。
【０００７】
第二に、ウイルスタンパク質（ｖｐ）から得られるブロットは非構造ウイルスタンパク質を含まない。しかしながら幾つかの非構造ウイルスタンパク質は極めて強力な免疫原性物質である。例えば、このようなタンパク質に対する直接抗体、特に、５２ｋＤのリンタンパク質（ＨＣＭＶのゲノムのＵＬ４４遺伝子によってコードされている）に対する直接抗体が産生される。これらの抗体が存在し同時に主構造抗原ｐｐ１５０に対する弱い反応が存在するときは、これらの抗体の存在によって一次感染を血清学的に同定できる。
【０００８】
従って、上述のような欠点がなく、特に、有利な参照標準（“至適参照標準（ｇｏｌｄｅｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄ）”）を構成し得る十分な特異性及び感度を有している改良されたウェスタンブロット試験でヒト血清中のＨＣＭＶ特異的抗体を同定するために使用できる診断用ツールを提供することが要望されている。更に、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＭを同定するように改良されたウェスタンブロット試験を提供することが要望されている。
【０００９】
また、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的な免疫グロブリンＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡを同定するための、疑陽性または疑陰性となる結果さえも識別できる高い信頼性レベルを有する方法を提供することが要望されている。
【００１０】
また、本発明を用いた試験及び本発明を用いたＷＢ方法に使用するための組換えタンパク質材料を提供することが要望されている。
【００１１】
最後に、このような組換えタンパク質材料、特にタンパク質ＣＫＳと融合する組換えタンパク質材料を発現させるために、原核性及び／または真核性の宿主生物に挿入できるプラスミドを提供することが要望されている。
【００１２】
従って本発明によれば、ヒト血清中のＨＣＭＶに対する抗体を同定するための診断用ツールが提供される。本発明の診断用ツールは、精製ビリオンから得られた複数のウイルスタンパク質（ｖｐ）を担持する第一セクションをもつ固体支持体手段から成り、前記ウイルスタンパク質は対応するバンドに集中的に存在しており、これらのバンドは所定のパターンに従って互いから離間して固体支持体の第一セクションによって支持されており、前記バンドの１つは分子量約１５０ｋＤを有する少なくとも１つのウイルスタンパク質によって形成されている。この診断用ツールの特徴は、
（ｉ）前記固体支持体手段が、更に、所定のパターンに従って互いに離間した複数のバンドを含む第二セクションを有しており、この第二セクションの少なくとも１つの第一バンドが、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０の少なくとも１つのエピトープに対応するアミノ酸配列を再現する第一領域と外因性タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を再現する第二領域とから成り原核性または真核性の宿主生物中で発現され得る単一の組換えタンパク質（ｒｐ）を含んでおり、
（ｉｉ）第二セクションの少なくとも１つの第二バンドは、ＨＣＭＶウイルスの第一の非構造タンパク質の少なくとも１つの免疫原性エピトープに対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と上記外因性タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を再現する第二領域とから成る組換えタンパク質を含んでおり、
（ｉｉｉ）前記外因性タンパク質によって形成された少なくとも１つの対照バンドを含む、ことである。
【００１３】
特に、第二セクションの上記第一バンドに含まれている上記組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１００６とａａ１０４８との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸（Ｆ３）の配列を再現する上記第一領域と、上記ウイルスタンパク質ｐｐ１５０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５９５とａａ６１４との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸（Ａ１Ｃ２）の配列を再現する第三領域とから成る。これらの領域は上記の第一組換えタンパク質の内部で様々な相互的位置関係で配置され得る。
【００１４】
更に、第二セクションの第二バンドはウイルスタンパク質ｐｐ５２のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ２０２とａａ４３４との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸（Ｈ１０）の配列を再現する第一領域を有している組換えタンパク質を含んでいる。
【００１５】
抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭの検出に特に好適な本発明の１つの好ましい実施態様では、第二セクションが更に、Ｈμ鎖のアリコートを含む第二の対照バンドに加えて、少なくとも１つのバンドに配置された２つの追加の組換えタンパク質を含む。第一の追加組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５４０とａａ６０１との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と、外因性タンパク質のアミノ酸の配列の少なくとも一部分を再現する少なくとも１つの第二領域とから成り、第二の追加組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と、外因性タンパク質のアミノ酸の配列の少なくとも一部分を再現する少なくとも１つの第二領域とから成る。組換えタンパク質のこれらの領域は、各々の組換えタンパク質の内部で様々な相互的位置関係で配置され得る。
【００１６】
上記の外因性タンパク質は好ましくはＣＫＳであり、上記の領域の上記の組換えタンパク質は、タンパク質ｐｐ５２、ｐｐ１５０及びｐ１３０の各々の完全アミノ酸配列を含む。ウイルスタンパク質の上記の配列はＣＫＳのａａ１７１位の直後の位置でＣＫＳに組込まれている。
【００１７】
このようにして、本発明の診断用ツールを用いて行われる改良されたウェスタンブロット試験は、市場で入手できる公知の試験のすべての欠点を解消し得る。一方では、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０とタンパク質ベクターに結合したｐｐ１５０の最も免疫原性の２つの配列から成る対応する組換え融合タンパク質とを固体支持体手段に同時に存在させることによって、１５０ｋＤのバンドだけに対する直接応答の非特異性の問題が解決される。他方では、精製ビリオンに由来のウイルスタンパク質中で非構造ウイルスタンパク質が欠失しているという問題は、ＨＣＭＶウイルスの非構造タンパク質のうちの最も強力な免疫原性エピトープを含む１つまたは複数の（特に追加の３つの）組換えタンパク質（ベクタータンパク質ＣＫＳに結合）、より特定的には、ＩｇＭの定量に最適なｐｐ５２の配列Ｈ１０（ａａ２０２−ａａ４３４）、並びに、（ＵＬ５７によってコードされる）ｐ１３０のａａ５４０−ａａ６０１の間の配列及びａａ１１４４−ａａ１２３３の間の配列、をツールの第二セクションに挿入することによって解決される。
【００１８】
従って、本発明の基本原理は、同一診断用ツール内部の２つのバンドセクションの組合せにあることが理解されよう。第一セクションを構成するバンドは精製ビリオンから従来の方法で得られる。第二セクションを構成するバンドは組換えタンパク質のみから形成される。これらの組換えタンパク質はその構造の内部に、２つのセクションの応答を交差照合（クロスチェック）する目的で適正に選択されたウイルスタンパク質の強力な抗原決定基を含む。このため、本発明の改良されたＷＢ試験を“コンボＷＢ”試験と呼ぶ。
【００１９】
更に、疑陽性または疑陰性の応答を防止するために、組換えセクションに２つの対照バンドを挿入する。第一の対照バンドは、使用される全部の融合組換えタンパク質のベクタータンパク質として使用される同一タンパク質、この場合にはタンパク質ＣＫＳによって形成される。このバンドの陽性応答は、被検血清中に抗ＣＫＳ抗体が存在し、恐らくはそのために疑陽性が生じたことを示す。また、μ鎖によって形成されるバンドの陰性応答は、試験中に操作ミスがあり、そのために疑陰性が生じたことを示す。
【００２０】
本発明によれば更に、ＩｇＧまたはＩｇＡの特異的同定を目的とするウェスタンブロット試験の容易な実施、及び、本文中で実施したＩｇＭ検査と同様の優れた結果の保証が、たとえその可能性が実験的手段によって未だ確認されていないにしても、上記の記載の応用によって可能であると考えられる。この目的のためには、例えば、ｐ１３０の免疫原性配列から成る組換えタンパク質によって形成されるバンドを、ＣＫＳと必ず融合する適正に選択された別の組換えタンパク質、特にウイルスタンパク質ｇＢ（ＵＬ５５遺伝子によって発現される）の部分またはウイルスタンパク質ｐ２８（ＵＬ９９遺伝子によって発現される）の部分から成る組換えタンパク質によって置換するだけで十分であろう。この場合には明らかに、第二の対照バンドのクラスμのＨ鎖がクラスγまたはαのＨ鎖によって置換されるであろう。
【００２１】
従ってより普遍的には、固体支持体の第二セクションは、構造的または非構造的なＨＣＭＶの第二タンパク質の少なくとも１つのエピトープに対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と外因性タンパク質のアミノ酸の配列の少なくとも１つの部分を再現する第二領域とを有する少なくとも１つの組換えタンパク質を含む少なくとも１つの第三バンドを支持している。このような構造的または非構造的な第二のウイルスタンパク質は、診断用ツールによって検出される抗体のクラス、特にＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡとの関連によって選択される。この場合、支持体のこの第二セクションは更に、ヒト免疫グロブリンクラスのＨμ鎖、Ｈγ鎖及びＨα鎖から成るグループから適正に選択されたＨ鎖のアリコートから成る第二の対照バンドを含む。
【００２２】
固体支持体手段は一般には、ウイルスタンパク質（ｖｐ）及び組換えタンパク質（ｒｐ）が所定のパターンに従って典型的には吸着によって配置されたニトロセルロースのストリップまたはシートから構成される。
【００２３】
上記パターンは例えば、典型的なポリアクリルアミドゲル電気泳動分画パターンに対応する。
【００２４】
特にＨＣＭＶウイルス特異的ＩｇＭの同定に使用される本発明の診断用ツールの好ましい実施態様は、精製ビリオンから得られた少なくともウイルスタンパク質ｖｐ１５０、ｖｐ８２、ｖｐ６５、ｖｐ３８及びｖｐ２８と、ウイルスタンパク質ｐｐ１５０及びｐｐ５２及び好ましくはｐｐ１３０（または組換え手段によって得られた他の非構造タンパク質）の免疫原性領域を含み該領域がＣＫＳに組込まれている複数の組換えタンパク質と、タンパク質ＣＫＳ自体と、ヒト免疫グロブリンのＨμ鎖とから成り、これらのタンパク質材料の全部が、ニトロセルロースから成る固体支持体に例えば吸着によって支持されている。
【００２５】
別の特徴によれば本発明は、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡの同定方法に関する。この方法は以下の段階、即ち、
ＨＣＭＶのビリオンを精製し、これらの精製ビリオンから少なくともウイルスタンパク質ｖｐ１５０、ｖｐ８２、ｖｐ６５、ｖｐ３８及びｖｐ２８を単離する段階と、
好ましくは遺伝子操作の技術を用い、構造的または非構造的なウイルスタンパク質の免疫原性領域とこの生物中で発現され得る外因性タンパク質の少なくとも１つの領域とから成り宿主生物中で発現され得る組換えタンパク質であって、上記の構造的または非構造的なウイルスタンパク質の免疫原性領域の少なくとも１つがＩｇＭ及び／またはＩｇＧ及び／またはＩｇＡ特異的免疫応答を刺激する能力に基づいて選択されているような複数の組換えタンパク質を作製する段階と、
所定のパターンに従って互いに離間して位置決めされた上記のウイルスタンパク質と上記の組換えタンパク質とを固体支持体手段に配置する段階と、
上記外因性タンパク質とヒト免疫グロブリンのＨμ鎖及び／またはＨγ鎖及び／またはＨα鎖のアリコートとを、同様に上記ウイルスタンパク質及び上記組換えタンパク質から離間しかつ互いに離間して固体支持体手段に配置する段階と、
上記のタンパク質と免疫グロブリンのＨ鎖とを含む固体支持体手段を、検査すべきヒト血清、及び、抗体検出用物質（例えばペルオキシダーゼまたはその他の標識酵素とのコンジュゲート）と共にインキュベートする段階と、
その後のウイルスタンパク質及び組換えタンパク質の反応を比較する段階とから成り、少なくとも１つのウイルスタンパク質及び少なくとも１つの組換えタンパク質が同時に被検血清と反応し外因性タンパク質が反応しないときにだけ試験が陽性であると判定し、免疫グロブリンのＨ鎖が反応しないときは再試験を行う。
【００２６】
本発明は更に、ｐＣＭＶ−３０及びｐＣＭＶ−３１と呼ばれる２つのプラスミドに関する。これらのプラスミドは原核性または真核性の宿主生物に挿入でき、それぞれが、ＨＣＭＶウイルスのウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５４０とａａ６０１との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分をコードしているＤＮＡの配列、及び、ウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分をコードしているＤＮＡの配列を含む。これらの２つのプラスミドは、ブダペスト条約に規定された条項に従って、１９９６年５月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡに寄託され、それぞれアクセス番号ＡＴＣＣ９８，０６５及び９８，０６６として受託された。
【００２７】
別の特徴によれば、本発明は更に、いずれも原核性または真核性の宿主生物に挿入可能な別の２つのプラスミドを含む。これらの２つのプラスミドは、ブダペスト条約に規定された条項に従って、１９９６年４月３０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡに寄託され、それぞれｐＣＭＶ−１Ａ（ＡＴＣＣアクセス番号９８，０４２）及びｐＣＭＶ−５Ａ（ＡＴＣＣアクセス番号９８，０４４）と命名されている。これらの２つのプラスミドは、タンパク質ｐｐ１５０の免疫原性配列Ａ１Ｃ２Ｆ３及びＣＫＳと融合したタンパク質ｐｐ５２の配列Ｈ１０を産生し得る。これらの配列は、国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１に記載されている。該特許の記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする。本発明はまた、プラスミドｐＣＭＶ−１ＡまたはｐＣＭＶ−５Ａを含む組換え宿主生物を包含する。
【００２８】
最後に本発明は、プラスミドｐＣＭＶ−３０、ｐＣＭＶ−３１、ｐＣＭＶ−１ＡまたはｐＣＭＶ−５Ａのいずれか１つが挿入された宿主生物中で発現された組換えタンパク質から成りＨＣＭＶ特異的抗体に結合できる組換えタンパク質材料を包含する。より特定的には本発明に包含されるタンパク質は、
（２）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
（３）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）
である。
【００２９】
式中、ＣＫＳ（１−１７１ａａ）及びＴ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）はそれぞれ、アミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１からａａ１７１（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基、及び、アミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１７１からａａ２６０（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基を表す。Ｔ及びＲはそれぞれトレオニン及びアルギニンを表す。ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）はアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ５４０からａａ６０１（両端を含む）までのウイルスタンパク質ｐ１３０の残基を表し、ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）はアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４からａａ１２３３（両端を含む）までのウイルスタンパク質ｐ１３０の残基を表す。
【００３０】
また、ＨＣＭＶの血清学的診断用診断試薬、及び、上記の組換えタンパク質材料、及び、血清学的方法によって抗−ＨＣＭＶ抗体の存在を同定するための上記の診断試薬を含む任意の診断用キットも本発明の範囲に包含される。
【００３１】
本発明のその他の特徴及び利点は、幾つかの非限定実施例に関する添付図面に基づく以下の記載から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、プラスミドｐＣＭＶ−５Ａの構築を示す概略説明図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＮＡ ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）及びｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）の配列を含むＰＣＲフラグメントの作製を示す概略説明図である。
【図２Ｂ】図２ＢはプラスミドｐＣＭＶ−３０及びｐＣＭＶ−３１の構築を示す概略説明図である。
【図３】図３は血液ドナーから採取した５００の血清サンプルで観察されたＩｇＭの反応性を示す表１である。
【図４Ａ−１】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図４Ａ−２】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図４Ｂ−１】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図４Ｂ−２】図４Ａ及び４Ｂは臓器移植患者から採取した血清の経時試験（“追跡”）を要約した表２である（表２は図２−Ａから始まり、図２−Ｂに続く）。
【図５】図５は選択されたヒト血清のコンボＷＢ試験に対する反応性を示す表３である。
【図６】図６は、本発明の試験に用いる試験ストリップを示す。図の右端の数値は変性条件下のポリペプチドの見掛け分子量を表す（ｖｐ＝ウイルスタンパク質；ｒｐ＝組換えタンパク質；μ＝クラスＭのヒト免疫グロブリンの精製μ鎖）。図の上端の番号は種々の血清サンプルを表し、１−３はＩｇＧ／ＩｇＭ陽性（ＥＩＡ）の妊娠女性；４及び５はＩｇＧ／ＩｇＭ陽性（ＥＩＡ）の腎移植レシピエント；６及び７はＩｇＧ陽性ＩｇＭ陰性（ＥＩＡ）の妊娠女性の血清サンプルである。
【図７】図７は図６と同様の試験ストリップを示す：一次感染した妊娠女性（ウイルスが胎児に感染）の経時試験（“追跡”）：１はＩｇＧ及びＩｇＭに陰性（ｎｅｇ．）の第一サンプル；２はＩｇＧ陰性、ＩｇＭ陽性（ｐｏｓ．）の第二サンプル；３から５は、２週おきに継続的に採取したＩｇＧ及びＩｇＭに陽性のサンプル；６はＩｇＧ及びＩｇＭに陰性の第一サンプル；７はＩｇＧ陰性、ＩｇＭ陽性の第二サンプル；８はＩｇＧ及びＩｇＭに陽性の第三サンプル；９はＩｇＧ及びＩｇＭ陰性の第一サンプル；１０から１３は７カ月間継続的に採取したＩｇＧ及びＩｇＭ陽性のサンプル：ウイルス尿が検出された新生児：１４はＩｇＧ陽性、ＩｇＭ陰性の血清サンプル。
【図８】図８は、特異的抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭを同定するための本発明の診断用ツールの概略説明図である。
【００３３】
図８を参照すると、符号（１）はヒト血清中の特異的抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭを同定するための診断用ツールを表す。ツールは、複数のバンドを担持する例えばニトロセルロースストリップの固体支持体手段（２）から成り、各バンドは、所定のパターンに従って配置された１つまたは複数のタンパク質から形成されている。より詳細には支持体ストリップ（２）は、２つのセクション（３）及び（４）から成る。第一セクション（３）はウイルスタンパク質によって形成され互いに（ｉ１），（ｉ２），（ｉ３），（ｉ４）の間隔を隔てる第一シリーズのバンド（５−ａ）（５−ｂ）（５−ｃ）（５−ｄ）（５−ｅ）を担持しており、第二セクション（４）は組換えタンパク質によって形成され互いに（ｅ１），（ｅ２）の間隔を隔てる第二シリーズのバンド（６ａ）（６ｂ）（６ｃ）を担持している。第二セクション（４）は更に、２つの対照バンド（７）及び（８）を含む。バンド（５−ａ）（５−ｂ）（５−ｃ）（５−ｄ）（５−ｅ）は好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分画によって精製され支持体ストリップ（２）に吸収されたビリオンから得られたＨＣＭＶのウイルスタンパク質ｖｐ２８、ｖｐ３８、ｖｐ６５、ｖｐ８２及びｖｐ１５０からそれぞれ形成されている。従って、バンド（５−ａ）（５−ｂ）（５−ｃ）（５−ｄ）（５−ｅ）は典型的な電気泳動パターンに従って配置され、距離（ｉ１），（ｉ２），（ｉ３），（ｉ４）はそれぞれの分子量の差に比例している。勿論、ウイルスタンパク質を別の方法で採取し支持体に転移させてもよい。その場合には、距離（ｉ１），（ｉ２），（ｉ３），（ｉ４）は異なる値になり、バンドは別のパターンで配置されるであろう。バンド（６ａ），（６ｂ），（６ｃ）は、例えば、遺伝子操作の技術を使用し外因性タンパク質ＣＫＳにウイルスタンパク質ｐ１３０、ｐｐ５２またはｐｐ１５０の１つまたは複数の免疫原性領域を組込むことによって作製された組換えタンパク質から形成されている。第一の対照バンド（７）はタンパク質ＣＫＳ自体から形成され、第二の対照バンド（８）はヒト免疫グロブリンのＨμ鎖のアリコートを含んでいる。
【００３４】
使用するときは、２つのセクション（３）及び（４）の各バンドを検査中の血清及び展開剤と共に試験する。バンドを形成するタンパク質を血清と共にインキュベーションした後、１つのバンドに対応するブロットの出現は、該バンドのタンパク質とＩｇＭとが反応したことを表し、その結果として検査中の血清中に上記抗体が存在することを示す。２つのセクション（３）及び（４）の応答の交差照合（クロスチェック）を行うことによって、従来のＷＢ試験で生じたような非特異的応答を防止し得る。更に、２つの対照バンド（７）及び（８）によって疑陽性または疑陰性の結果を識別することが可能である。即ち、タンパク質ＣＫＳによって形成されたバンド（７）の反応は、血清中に抗ＣＫＳ抗体が存在し、その結果として疑陽性が生じる可能性があることを示している。逆に、μ鎖を含むバンド（８）が反応しない場合には、試験の進行に過誤があり、結果が疑陰性になったと推定できる。
【００３５】
本発明によれば、以下により詳細に記載するような根拠に基づいて、第一セクション（３）の少なくとも１つのウイルスタンパク質及び第二セクション（４）の少なくとも１つの組換えタンパク質が検査中の血清と同時に反応するが、第一の対照バンド（７）を構成する外因性タンパク質は反応を示さず、第二の対照バンド（８）を形成するヒト免疫グロブリンのＨ鎖が反応しないときにだけ試験の結果が陽性であると判定される。
【００３６】
組換えセクション（４）では１つまたは複数のバンドが反応性であるが、セクション（３）ではウイルスタンパク質ｖｐ８２によって形成されるバンドだけが反応性であるときは試験の結果が不確定であると判定される。
【００３７】
最後に、対照バンド（８）が反応しない場合、（ヒト免疫グロブリンのμ鎖は必ず反応する筈であるから）試験の進行に過誤があったことが確認されるので、再試験が必要である。
【００３８】
本発明を更に十分に理解するために以下の非限定実施例によって本発明をより詳細に説明する。
【００３９】
実施例１：一般手順
１．材料及び入手先
制限酵素、Ｔ４ファージのリガーゼ、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）、キナーゼポリヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）から入手した。ＤＮアーゼＩ及びアプロチニンはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．から入手した。
【００４０】
標準分子量のＤＮＡ及びタンパク質、Ｄａｉｉｃｈｉのプレフォームアクリルアミドゲル、セミドライ転移システム、対応するバッファは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４１】
イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、アクリルアミド、Ｎ′，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、４−クロロ、１−ナフトロ、染料クーマシー・ブルー（登録商標）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）はＢｉｏ Ｒｅａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４２】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した抗体は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。大腸菌細胞Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ Ｃｏｌｉ（登録商標）ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ−１ ｈｓｄＲ１７ ｓｕｐＥ４４ ｒｅｌＥ４４ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ〔Ｆ′ ｐｒｏＡＢ ｌａｃｌｑ ＺΔＭ１５ Ｔｎ（Ｔｅｔｒ）〕、ＤＮＡ精製キット、ＲＮＡ精製キット、ｃＤＮＡ合成キットＺＡＰ（登録商標）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４３】
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）試薬キット及びＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ （Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）から入手した。一般手順で使用したデオキシヌクレオチド三リン酸はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）キットから採用した。
【００４４】
支持体付きのニトロセルロース膜は、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４５】
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）及び７−デアザ−ｄＧＴＰでＤＮＡを配列決定するためのヌクレオチドキット及びＤＮＡポリメラーゼＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）のＶｅｒｓｉｏｎ ２．０は、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４６】
ｍＲＮＡポリＡ＋精製用キットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．ＵＳＡ）から入手した。
【００４７】
アンピシリンを含むルリアブイヨンのプレート（ＬＢａｍｐプレート）はＭｉｃｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｍｂａｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４８】
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地、ウシ胎仔血清、燐酸塩緩衝生理食塩水、適当な大腸菌ＤＨ５ａ細胞（φ−Ｆ８０ｄｌａｃＺＤＭ１５Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｐｈｏＡ ｈｓｄＲ１７（ｒＫ−，ｍＫ＋）ｓｕｐＥ４４ １− ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１）、及び、アガロースゲルｕｌｔｒａＰＵＲＥ（登録商標）は、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｉｎｃ．（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手した。
【００４９】
バクトトリプトン、バクト酵母エキス、バクト寒天は、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）から入手した。
【００５０】
ＮＺＹ（登録商標）ブイヨンは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。
【００５１】
サケ精子のＤＮＡ、リゾチーム、アンピシリン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、チメロサール、バッファ、カゼインの酸加水分解物、トゥイーン２０（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、フェニルメチルスルホノフルオリド（ＰＭＳＦ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、尿素、グリセロール、ＥＤＴＡ、デオキシコール酸ナトリウム及び無機塩は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。
【００５２】
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）はＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）から入手し、メタノールはＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇ〔ｉ〕ｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から入手した。
【００５３】
２．培地、バッファ及び遺伝試薬
“ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ ＩＩ”は、１１．２５ｇ／リットルのトリプトンと２２．５ｇ／リットルの酵母エキスと１１．４ｇ／リットルの二塩基性リン酸カリウムと１．７ｇ／リットルの一塩基性リン酸カリウムと１０ｍｌ／リットルのグリセロールとを含有し、水酸化ナトリウムによってｐＨ７．２に調整されている。
【００５４】
“トリス生理食塩水バッファ”即ち“ＴＢＳ”は、２０ｍＭのトリスと５００ｍＭのＮａＣｌとから成るｐＨ７．５のバッファである。“トゥイーン２０（登録商標）−トリス生理食塩水バッファ”即ち“ＴＢＳＴ”は、ＴＢＳに０．０５％のトゥイーン２０（登録商標）を加えたバッファである。
【００５５】
“膜ブロッキング溶液”は、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１％のカゼインの酸加水分解物と０．０５％のトゥイーン２０（登録商標）とを加えたＴＢＳから成る。
【００５６】
サンプル希釈バッファ“Ｒｕｂａｚｙｍｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ”即ち“Ｒｕｂａｚｙｍｅ ＳＤＢ”は、１００ｍＭのトリスと１３５ｍＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＥＤＴＡと０．２％のトゥイーン２０（登録商標）と０．０１％のチメロサールと４％のウシ胎仔血清とから成るｐＨ７．５のバッファである。
【００５７】
コンジュゲート希釈バッファ“Ｒｕｂａｚｙｍｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ”は、１００ｍＭのトリスと１３５ｍＭのＮａＣｌと０．０１％のチメロサールと１０％のウシ胎仔血清とから成るｐＨ７．５のバッファである。
【００５８】
“ＨＲＰＯ呈色溶液”は、０．０６％の４−クロロ−１−ナフトロと０．０２％のＨ２Ｏ２と０．２％のメタノールとを含むＴＢＳから成る。
【００５９】
“ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファ”は、２％のＳＤＳと１０％のグリセロールと５％のβ−メルカプトエタノールと０．１％のブロモフェノールブルーとを含む６２ｍＭのトリスから成るｐＨ６．８のバッファである。
【００６０】
“ＴＥバッファ”は１０ｍＭのトリスと１ｍＭのＥＤＴＡとから成るｐＨ８．０のバッファである。
【００６１】
“ＴＥＭ溶解バッファ”は５０ｍＭのトリスと１０ｍＭのＥＤＴＡと２０ｍＭのＭｇＣｌ２とから成るｐＨ８．５のバッファである。
【００６２】
“ＰＴＥバッファ”は５０ｍＭのトリスと１０ｍＭのＥＤＴＡとから成るｐＨ８．５のバッファである。
【００６３】
３．ウイルスの増殖及びｃＤＮＡの調製
５％のウシ胎仔血清を含む培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）中で増殖させたヒト線維芽細胞で培養したＨＣＭＶウルイスの菌株ＡＤ１６９またはＴｏｗｎｅのいずれを使用してもよい。ＨＣＭＶのＡＤ１６９菌株及びＨＣＭＶのゲノムはＣｈｅｅら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．，１５４：１２５（１９９０）及びＢａｎｋｉｅｒら，ＤＮＡ Ｓｅｑ．２：１（１９９１）の著書に記載されている。これらの文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００６４】
線維芽細胞をＨＣＭＶ感染させ、６日後にこれらの細胞を収集し、遠心し、ＰＢＳで洗浄し、ｖｅｔｒｏ−Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ホモジナイザーで均質混合した。Ｍｏｃａｒｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：１２６６（１９８５）に記載の手順で完全ウイルスＤＮＡを単離した。均質混合した細胞からＲＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて完全ＲＮＡを単離し、メッセンジャーＲＮＡ精製キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＲＮＡポリＡ＋を単離した。精製したウイルスｍＲＮＡからＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キットを用いてＨＣＭＶのｃＤＮＡを合成した。
【００６５】
４．一般方法
ＤＮＡの酵素消化はいずれも製造業者の指示通りに行った。１マイクログラムのＤＮＡあたり少なくとも５単位の酵素を使用し、ＤＮＡの完全消化に十分なインキュベーション時間で反応を進行させた。ＤＮＡ及びＲＮＡの種々の操作キットの使用、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの合成、及び、ＤＮＡの配列決定は、製造業者によって提供されたプロトコル通りに行った。大腸菌のプラスミドＤＮＡの小規模または大規模の調製、λファージ感染大腸菌細胞のファージ溶解液からのＤＮＡの調製、抗大腸菌抗体を吸着させるための大腸菌溶解物の調製、フェノール−クロロホルムによるＤＮＡの抽出及び沈殿、アガロースゲルにおける制限の分析、アガロースゲル及びポリアクリルアミドゲルによるＤＮＡフラグメントの精製、制限酵素消化によって生じたＤＮＡの不完全３’端（カルボキシル末端）に対するＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによる埋戻し及びＴ４ファージのリガーゼによるＤＮＡフラグメントの結合、適当なＴＢ１細胞（Ｆａｒａ ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ φ−８０ｄｌａｃＺＤＭ１５ｈｓｄＲ１７）の調製は、製造業者によって提供されたプロトコル通りに行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。
【００６６】
作製したプラスミドにＰＣＲ増幅によってクローニングさせるＤＮＡフラグメントを、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させてから、制限酵素で消化した。ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定に使用したオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のオリゴヌクレオチドシンセサイザー３８０ Ｂまたは３９４モデルを使用し、製造業者のプロトコルに従って合成した。
【００６７】
５．ベクターの構築
前駆プラスミドｐＪＯ２００，ｐＥＥ１，ｐＭＢ３４及びｐＲＯＳＨ１０は、国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１及びＬａｎｄｉｎｉらの論文（４）に記載されている。
【００６８】
実施例２：ｐＣＭＶ−１Ａ：ＣＫＳ−Ａ１Ｃ２Ｆ３−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＪＯ２００に由来のプラスミドｐＣＭＶ−１Ａは、ＨＣＭＶ−Ａ１Ｃ２Ｆ３を含むＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築した。このＤＮＡフラグメントは、国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１及びＬａｎｄｉｎらの論文（４）に記載されているように、ｐＭＢ３４に含まれているＤＮＡ Ａ１Ｃ２Ｆ３をｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位でＰＣＲ増幅させることによって得られた。プラスミドｐＣＭＶ−１Ａはブダペスト条約に規定された条項に従って１９９６年４月３０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセス番号ＡＴＣＣ９８０４２で受託された。
【００６９】
実施例３：ｐＣＭＶ−５Ａ：ＣＫＳ−Ｈ１０−ＣＫＳの構築
プラスミドｐＪＯ２００（図１）の誘導体であるプラスミドｐＣＭＶ−５Ａは、ＨＣＭＶ−Ｈ１０を含むＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって構築した。このＤＮＡフラグメントは、ｐＲＯＳＨ１０に含まれているＤＮＡ Ｈ１０をｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位にＰＣＲ増幅することによって得られた。プラスミドｐＣＭＶ−５Ａはブダペスト条約に規定された条項に従って１９９６年４月３０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセス番号ＡＴＣＣ９８０４４で受託された。
【００７０】
プラスミドＤＮＡ（ｐＲＯＳＨ１０及びｐＪＯ２００）の大規模精製は一般方法によって行った。プラスミドｐＪＯ２００のＤＮＡをＳｔｕＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ベクターの骨格をアガロースゲルで精製した。ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ消化によってＣＫＳ遺伝子の３′端の一部分を除去し、“結合”反応後に再構築した。ＰＣＲ増幅によって得られた２つのＤＮＡフラグメントを三方向“結合”反応によってベクターの骨格にクローニングした。Ｈ１０をＤＮＡフラグメントＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩとしてクローニングし、ＣＫＳ遺伝子の残りの３′部分をＤＮＡのＭ１ｕＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローニングし、これによって完全なＣＫＳ遺伝子を再構築した。
【００７１】
ｐｐＵＬ４４のヌクレオチド６０４を起点としＳｔｕＩ部位を含むセンスプライマーと、ｐｐＵＬ４４のヌクレオチド１２９９を起点としＭ１ｕＩ部位を含むアンチセンスプライマーとを合成し、これらのプライマーをプラスミドｐＲＯＳＨ１０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲによる増幅後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩによって消化し、得られたＨ１０を含む６９６ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製した。ｐＪＯ２００のヌクレオチド６４０を起点とし（Ｍ１ｕＩ部位を含む）センスプライマーと、ｐＪＯ２００のヌクレオチド９０５を起点とするアンチセンスプライマーとを合成し、プラスミドｐＪＯ２００を含むＰＣＲ反応混合物に加えた（ヌクレオチドの番号は前述のようにＬａｄｉｎｉらによる国際特許出願ＷＯ９６／０１３２１の図１２にｐＪＯ２００として示されているＤＮＡの配列に対応する）。ＰＣＲによる増幅後、反応混合物をＭ１ｕＩ及びＢａｍＨＩによって消化し、得られたＣＫＳ遺伝子の３’部分を含む２６６ｂｐのＤＮＡフラグメントをゲルによって精製した。得られたこれらの精製ＤＮＡフラグメントを次に、ｐＪＯ２００／ＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩに１６℃で一夜結合させた。翌日、結合混合物を形質転換のために適当なＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に導入した。
【００７２】
次に、形質転換物質を用いてＤＮＡを小規模で調製し、ｐＪＯ２００のＳｔｕＩ部位に挿入されたＨ１０の存在を分析した。プラスミドｐＣＭＶ−５ＡはＳｔｕＩ部位に挿入されたＨ２０を含んでいることが判明した。Ｈ１０のＤＮＡ及びＣＫＳの３’端の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。タンパク質ｒｐＣＭＶ−５Ａをコードする構築物ＣＫＳ−Ｈ１０−ＣＫＳのコーディング領域は、Ｈ１０とＣＫＳの３’端との間にＭ１ｕＩ部位を有する２つのアミノ酸（トレオニン及びアルギニン）のブリッジを含んでいることが判明した。更に次式で示すように、ＣＫＳのアミノ酸１７１は構築物中で複製されていた。
（１）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−Ｈ１０−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩからコードされているトレオニン及びアルギニン残基を表す。
【００７３】
実施例４
ＣＫＳ−ｐＵＬ５７−ＣＫＳを発現するｐＥＥ１に基づくベクターの構築
２つの融合構築物ＣＫＳ−ｐＵＬ５７−ＣＫＳを構築するための出発プラスミドとして、タンパク質ＣＫＳを発現するベクターｐＥＥ１を使用した。各構築物を得るために、プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化し、ベクターの骨格を精製した。構造ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩは、ＰＣＲ増幅によって作製され５’端（アミノ末端）にＳｔｕＩ部位をもち３’端（カルボキシル末端）にＭ１ｕＩ部位をもつｐＵＬ５７遺伝子のフラグメントを受容し得る。ＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化後、ｐＵＬ５７遺伝子のフラグメントをＰＣＲによって骨格ｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩに“インフレーム”でクローニングした。これらのベクターによって発現される融合タンパク質ＣＫＳ−ＰＵＬ５７−ＣＫＳは次式で示される。
ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐＵＬ５７−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩにコードされているトレオニン及びアルギニン残基である。
【００７４】
操作１：ｐＣＭＶ−３０：ＣＫＳ−ｐＵＬ５７（５４０−６０１ａａ）−ＣＫＳの構築
ＨＣＭＶのｃＤＮＡのアミノ酸５４０−６０１をコードするｐＵＬ５７の領域のＰＣＲ増幅によって得られたＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングすることによってプラスミドｐＥＥ１の誘導体であるプラスミドｐＣＭＶ−３０（図２Ａ及び２Ｂ）を構築した。使用されるＤＮＡフラグメントは、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１６１８−１８０３から成り、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１及び３７７６はそれぞれ、既知のＡＤ１６９の配列の追加フィラメントのヌクレオチド９０２８１及び８６５０６に対応する。プラスミドｐＣＭＶ−３０はブダペスト条約に規定された条項に従ってＡＴＣＣに寄託され、アクセス番号ＡＴＣＣ９８０６５として受託された。
【００７５】
ＨＣＭＶのｃＤＮＡを鋳型として用い、ＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）をＰＣＲ増幅反応によって２段階（“入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）”）で作製した。外側の入れ子の増幅反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１３７９を起点とするセンスプライマーと、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１９３３を起点とするアンチセンスプライマーとを合成した。次に、ｃＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを加えた。ＰＣＲ増幅後、外側の入れ子の増幅混合物を内側の入れ子のＰＣＲ増幅反応の鋳型として使用した。内側の反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド１６１８を起点としＳｔｕＩ部位を含むセンスプライマーとｐＵＬ５７のヌクレオチド１８０３を起点としＰｓｔＩ部位を含むアンチセンスプライマーとを合成した。次に外側入れ子反応で増幅されたＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを添加した。ＰＣＲ増幅反応後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＰｓｔＩで消化し、ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）を含む１８６ｂｐのフラグメントをアガロースゲルで精製した。
【００７６】
一般方法を用い、プラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１）を大規模で調製した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化し、ベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩの骨格をアガロースゲルで精製した。精製したＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）ＳｔｕＩ／ＰｓｔＩをベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩに１６℃で一夜結合させた。翌日、結合混合物を形質転換物質を用いて適当なＸｌ−１ Ｂｌｕｅ細胞に挿入した。形質転換物質をプラスミドＤＮＡから小規模で調製し、次いで、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に挿入されたＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）の存在を分析した。プラスミドｐＣＭＶ−３０はｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に局在するｐ１３０（５４０−６０１ａａ）を含むことが判明した。更に、ＤＮＡ配列決定によってｐ１３０（５４０−６０１ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。この融合構築物ＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳは次式で示される。
（２）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（５４０−６０１ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩからコードされているトレオニン及びアルギニン残基を表す。
【００７７】
操作２：ｐＣＭＶ−３１：ＣＫＳ−ｐＵＬ５７（１１４４−１２３３ａａ）−ＣＫＳの構築
アミノ酸１１４４−１２３３をコードするｐＵＬ５７の領域のＨＣＭＶのｃＤＮＡからＰＣＲ増幅によって得られたＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）を含むＤＮＡフラグメントをｐＥＥ１にクローニングすることによってプラスミドｐＥＥ１の誘導体であるプラスミドｐＣＭＶ−３１（図２Ａ及び２Ｂ）を構築した。使用したＤＮＡフラグメントは、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３４３０−３６９９から成る。ｐＵＬ５７のヌクレオチド１及び３７７６はそれぞれ、既知のＡＤ１６９の配列の追加フィラメントのヌクレオチド９０２８１及び８６５０６に対応する。プラスミドｐＣＭＶ−３１はブダペスト条約に規定された条項に従ってＡＴＣＣに寄託され、アクセス番号ＡＴＣＣ９８０６６として受託された。
【００７８】
ＨＣＭＶのｃＤＮＡを鋳型として用い、ＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）をＰＣＲ増幅反応によって２段階（“入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）”）で作製した。外側の入れ子の増幅反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３３５１を起点とするセンスプライマーと、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３７６６を起点とするアンチセンスプライマーとを合成した。次に、ｃＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを加えた。ＰＣＲ増幅後、外側の入れ子の増幅混合物を内側の入れ子のＰＣＲ増幅反応の鋳型として使用した。内側の反応のために、ｐＵＬ５７のヌクレオチド３４３０を起点としＳｔｕＩ部位を含むセンスプライマーとｐＵＬ５７のヌクレオチド３６９９を起点としＰｓｔＩ部位を含むアンチセンスプライマーとを合成した。次に、外側入れ子反応で増幅されたＤＮＡを含有する混合物に双方のプライマーを加えた。ＰＣＲ増幅反応後、反応混合物をＳｔｕＩ及びＰｓｔＩで消化し、ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）を含む２７０ｂｐのフラグメントをアガロースゲルで精製した。
【００７９】
一般方法によってプラスミドＤＮＡ（ｐＥＥ１）を大規模で調製した。プラスミドｐＥＥ１をＳｔｕＩ及びＭ１ｕＩで消化し、ベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩの骨格をアガロースゲルで精製した。精製したＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩをベクターｐＥＥ１／ＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩに１６℃で一夜結合させた。翌日、結合混合物を形質転換によって適当なＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に挿入した。形質転換物質からプラスミドＤＮＡを小規模で調製し、次いで、ｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に挿入されたＤＮＡフラグメントＨＣＭＶ−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）の存在を分析した。プラスミドｐＣＭＶ−３１がｐＥＥ１のＳｔｕＩ／Ｍ１ｕＩ部位に局在するｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）を実際に含むことが判明した。更に、ＤＮＡ配列決定によってｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）のＤＮＡ配列を確認した。この融合構築物ＣＫＳ−ＣＭＶ−ＣＫＳは次式で示される。
（３）ＣＫＳ（１−１７１ａａ）−ｐ１３０（１１４４−１２３３ａａ）−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ（１７１−２６０ａａ）；
式中、Ｔ及びＲはそれぞれ、ベクターに導入された合成部位ＰｓｔＩ及びＭ１ｕＩからコードされているトレオニン及びアルギニン残基を表す。
【００８０】
実施例５：ＨＣＭＶの組換え抗原の産生及び精製
１．ＨＣＭＶの遺伝子の発現
非融合タンパク質ＣＫＳを発現する細菌性対照菌株、並びに、実施例２〔ｒｐＣＭＶ−１Ａ（Ａ１Ｃ２Ｆ３／ｐｐＵＬ３２／ｐｐ１５０）〕、実施例３〔ｒｐＣＭＶ−５Ａ（Ｈ１０／ｐｐＵＬ４４／ｐｐ５２）〕、実施例４〔ｒｐＣＭＶ−３０（ｐＵＬ５７／ｐ１３０）及びｒｐＣＭＶ−３１（ｐＵＬ５７／ｐ１３０）〕のようなＨＣＭＶの融合タンパク質を発現する細菌性クローンの全部を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地“ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ ＩＩ”で対数増殖期まで培養した。融合タンパク質ＣＫＳ−ＨＣＭＶの合成を、（９）に記載されているようにＩＰＴＧの添加によって誘発した。誘発の４時間後、細胞を遠心によって収集し、タンパク質の精製時点までペレットを−８０℃で凍結した。
【００８１】
２．非融合タンパク質ＣＫＳ及び組換えタンパク質ＣＫＳ−ＨＭＶの精製
不溶性の融合タンパク質ＣＫＳ−ＨＣＭＶ（ｒｐＣＭＶ−１Ａ，ｒｐＣＭＶ−５Ａ，ｒｐＣＭＶ−３０，ｒｐＣＭＶ−３１）を、界面活性剤による一連の洗浄及び８Ｍの尿素中の可溶化（９）を順次行う溶菌処理によって精製した。細胞溶解後の可溶性タンパク質ＣＫＳを硫安沈殿及びＤＥＡＥクロマトグラフィーを順次用いて精製した。
【００８２】
実施例６：実験的試験−“コンボＷＢ”
１．ヒト血清のサンプル
特に疑陽性に注目してコンボＷＢの特異性レベルを従来のＥＩＡとの比較によって評価するために、採取血清群から無作為に選択した５００のドナー血液の血清サンプルを試験した。
【００８３】
コンボＷＢ試験の感度を評価するために、種々の方法、特に２つの商業的ＥＩＡ試験及び従来のＷＢ試験による測定で抗−ＣＭＶ ＩｇＭ陽性を示したサンプルから１００の血清を選択した。上記の３つの試験の全部で陽性を示したサンプルだけをこのグループに入れ、以後の試験に使用した。試験の感度を更に評価するために、別の２つのサンプルグループを選択した。１つのサンプルグループは、ＰＣＲによって多形核白血球（ＰＭＮＬ）中のＨＣＭＶが陽性を示した心移植レシピエント（ＨＴＲ）から採取した８５の血清から構成され、もう１つのサンプルグループは、尿からのウイルス単離またはＩｇＧの血清変換によってＨＣＭＶ感染が判明した妊娠女性から採取した３８の血清から構成されていた。
【００８４】
更に、コンボＷＢ試験で測定したときのＨＣＭＶウイルスに対する免疫応答の出現及び発生の時間を決定するために、１０人の移植レシピエントに関する経時試験（“追跡”）を行った。即ち、これらの移植レシピエントから合計７４の血液サンプルを採取し、これらのサンプルの抗原血分析または従来のＥＩＡ及びコンボＷＢによる抗−ＣＭＶ特異的ＩｇＭの検定を実施した。
【００８５】
２．ＨＣＭＶウイルスの一部分に対する感染のウイルス学的診断
２．１．ウイルスの単離
尿及び唾液からウイルスを単離するために“シェルバイアル（ｓｈｅｌｌ ｖｉａｌ）”手順（１）を使用した。病原性物質を接種したヒト線維芽様細胞を接種後２４〜４８時間定着させ、遺伝子産物ＨＣＭＶ−ＩＥ１／ＩＥ２と反応するモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｉｎｅ社製，Ｐａｒｉｓ，ＦｒａｎｃｅのＥ１３）を用いた間接免疫蛍光（ＩＩＦ）によって呈色させた。
【００８６】
２．２．抗原血
ＰＭＮＬを富化したＰＢＬ画分中のＨＣＭＶ−ｐｐ６５の存在を、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｉｊｉら（１０）が発案しＲｅｖｅｌｌｏら（８）が修正した手順で、ＨＣＭＶ−ｐｐ６５特異的モノクローナル抗体（Ａｒｇｅｎｅ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅのクローン１Ｃ３）を用いた間接ＩＩＦ試験で測定した。
【００８７】
蛍光顕微鏡で観察し、細胞数２００，０００あたりのｐｐ６５陽性の細胞数をカウントすることによって結果を定量した。２００，０００個に１個の割合の陽性細胞は、結果を抗原血陽性と判定するために十分であった。
【００８８】
３．ＨＣＭＶウイルス感染症の血清学的診断
３．１．従来のＥＩＡ試験
市販のＥＩＡ抗−ＣＭＶ／ＩｇＧキット（Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔのアルファ法によってＨＣＭＶウイルスに対して特異的なＩｇＧの力価測定を行った。ＥＩＡ用の全自動マイクロリーダー（Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ）を用いてマイクロプレートを読取った。Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔの抗−ＣＭＶ／ＩｇＭキット（Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ）を用いて抗−ＣＭＶ ＩｇＭを評価した。製造業者から提供された指示に従って結果を解釈した。
【００８９】
３．２．抗−ＣＭＶ ＩｇＭを同定するための“コンボＷＢ”試験
参考文献（３）に記載されている従来のＷＢ技術を使用し、精製ビリオンの溶解液をポリアクリルアミドゲルで分画した。このようにして分離したポリペプチドを次に、それぞれの電気泳動プロフィルに従ってニトロセルロースシートに転移させた。ニトロセルロースシートの底面が組換えタンパク質に十分なスペースを与えるようにニトロセルロースシートの長さをゲルのほぼ２．５割増しの寸法にした。電気泳動によるウイルスタンパク質の転移後、ミニブロッターのチャンネルがポリアクリルアミドゲル上のタンパク質の泳動方向に垂直になる方向で各ブロットをミニブロッターにマウントした。３つの組換えタンパク質の懸濁液を小ウェルに滴下した。ベクタータンパク質に対する非特異的反応をチェックし、免疫複合体を正しく同定するために、ベクタータンパク質ＣＫＳとヒト免疫グロブリンのμ鎖をそれぞれ滴下した２つの対照チャンネルを設けた。次に、ミニブロッターを振動プラットホームに４℃で一夜維持することによって軽度に撹拌した。フィルターをＴＢＳで簡単に洗浄し、次いでブロッキング溶液（ＴＢＳ中の３％魚ゼラチン、１％ＢＳＡ、５％脱脂粉乳、０．０５％トゥイーン２０）で飽和し室温で１時間インキュベートした。フィルターを幅３ｍｍのストリップに裁断し、各ストリップが標品ウイルスタンパク質（上部）または組換えポリペプチド（下部）を含むようにし、従来のＷＢセクションと組換えバンドのセクションとの組合せを形成した。このように形成したニトロセルロースストリップを用いて、ヒト血清中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＭを検出する血清学的分析を行った。血清を、４％のウシ胎仔血清（ＳＢＦ）、０．１％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで１：５０に希釈した。ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヒト抗−μ鎖抗体（ヤギの抗−ヒトＩｇＭ）を、１０％ＳＢＦを含むＴＢＳで希釈した。
【００９０】
３．３．ＩｇＭを同定するためのコンボＷＢ試験の解釈アルゴリズム
ストリップのウイルスタンパク質を含むＷＢセクションは、タンパク質ｐｐ１５０，ｐｐ６５，ｐ５５，ｐ３８，ｐ２８のいずれか１つがヒト血清に対して反応性を示したときだけ陽性であると判定される。ストリップの組換えセクションは、組換えウイルスタンパク質に対応するバンドの少なくとも１つが反応性を示したときに陽性であると判定される。即ち、試験の結果は以下のごとく判定される。
【００９１】
−ストリップの従来のＷＢセクションで少なくとも１つのバンドが反応性を示し、同時に、組換えセクションで少なくとも１つのバンドが反応性を示すことが確認されたときに結果は陽性である。
【００９２】
−ストリップの２つのセクションのうちの一方のセクションが完全に陰性のときは他方のセクションにいくつの反応性バンドが存在するかに関わりなく結果は陰性である。
【００９３】
−ストリップのＷＢセクションのｐ８２だけが陽性を示し、組換えセクションの１つまたは複数のバンドが陽性を示したときは結果は不確定であり、陰性であるか陽性であるか決められない。
【００９４】
試験の有効性を確認するために、μ鎖の位置の陽性反応及びベクタータンパク質の位置の無反応が必要であった。
【００９５】
３．４．抗−ＨＣＭＶ ＩｇＧまたはＩｇＡを同定するためのコンボＷＢ
上述のように作製したコンボＷＢストリップはまた、ヒト血清中のＨＣＭＶウイルス特異的ＩｇＧ及びＩｇＡを検査する血清学的試験でも使用され得る。４％のＳＢＦ及び０．１％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで血清を１：１００に希釈する。ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたγ鎖及びα鎖のそれぞれに特異的な抗体（ヤギの抗−ヒトＩｇＭ）を、１０％のＳＢＦを含むＴＢＳで希釈する。
【００９６】
４．結果
４．４．コンボＷＢ試験によるＩｇＭ特異的抗−ＨＣＭＶの同定
ＨＣＭＶ特異的ＩｇＭに対するコンボＷＢ試験の特異性を確認するために、血液ドナー及び健康な個人から採取した多数のサンプルを用い、従来のＥＩＡ試験と平行試験を実施した。米国で採取した３００の血清と、イタリアで採取した２００の血清とから成る合計５００の血清を分析した。血清の約７９％がＩｇＧ陽性であることが判明していた。ＩｇＭ陽性は従来のＥＩＡ試験では０．２％、組合せ方法では１．８％であった。この分析の詳細を表１にまとめる。即ち、１４の血清（２．８％）がｖｐ１５０だけと反応し、３つの血清（０．６％）がｖｐ８２だけと反応し、少数の他の血清（０．４％以下）が１つまたは複数の他のウイルスタンパク質と反応したが、これらのうちで組換えタンパク質と反応するものはなかった。３つの血清（０．６％）が１つまたは複数の組換えタンパク質と反応したが、ウイルス反応との同時的反応は全く生じなかった。これらの２つの血清グループはいずれもＩｇＭ陰性であると判定される。９個の血清（１．８％）は少なくとも１つのウイルスタンパク質及び１つの組換え体と反応し、従って、ＩｇＭ陽性であると判定される。更に、本発明の第二の試験のＩｇＭに対する感度を測定するために、商業的ＥＩＡ試験または従来のＷＢ試験でＨＣＭＶ特異的ＩｇＭ陽性と判定された別の１００の血清をコンボＷＢで分析した。これらの血清の１００％がコンボＷＢ試験でも同じく陽性であると判定された。試験の感度を更に評価するために、別の２つの血清グループを試験した。ＰＭＮＬ中のＨＣＭＶウイルスがＰＣＲ陽性であると判定されていた心移植患者から採取した８５のサンプルから成る第一グループについて、市販のＥＩＡキット及びコンボＷＢを用いてＨＣＭＶ特異的ＩｇＭの存在を分析した。市販のキットでは３９のサンプルが陽性であったが、コンボＷＢでは５８のサンプルが陽性であった（表３）。最後に、妊娠女性の血清から採血時点の能動感染の存在に基づいて３８の血清サンプルを選択した。これらの血清サンプルについて、ＥＩＡ試験及びコンボＷＢ試験で抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭの存在を分析すると、前者の方法では２２のサンプルが陽性であり、後者の試験では３４のサンプルが陽性であった（表３参照）。コンボＷＢ試験による血清サンプルの反応性のいくつかの例を図６及び図７に示す。血清は、急性感染の妊娠女性（図６、レーン１〜３）、感染の進行した妊娠女性（図６、レーン６及び７）、胎児へのウイルス感染が確認された一次感染の妊娠女性（図７）から採取した。
【００９７】
急性感染の場合、コンボＷＢによって測定されるＩｇＭの免疫応答の出現及び発生の時点を確認する目的で、更に１０人の臓器移植レシピエントのグループを実験的分析に追加し、これらの被験者（合計７４人）から採取した血清のサンプルの経時試験（“追跡”）を実施した。第一サンプルは、外科処置前の各レシピエントから採取し、以後２〜７８日（両端値を含む）の間隔をおいて定期的にサンプルを採取した。血清を、抗原血試験、ＩｇＭに対する商業的ＥＩＡ試験及びコンボＷＢ試験によって平行試験した。表２に示すように、４つの場合（Ａｒｑ，Ｆｉｒ，Ｆｅｒ及びＢａｔ）に、３つの方法が同等の感度を示し、全部の試験でこれらのサンプルが最初から陽性であると判定された。２つの場合（Ｆｉｏ及びＢｏｓ）に、抗原血試験が最初に感染反応を示し、他の試験よりもそれぞれ１４日及び９日早かった。１つの場合（Ｃｕｐ）に、コンボＷＢが最初に感染反応を示し、抗原血よりも１９日早かった。１つの場合（Ｓａｂ）に、抗原血及びコンボＷＢはＥＩＡよりも１週間早く感染反応を示した。コンボＷＢにおけるこれらの血清の反応性の一例を図６のレーン４及び５に示す。
抗−ＣＭＶ ＩｇＭの血清学的分析だけを考察すると、コンボＷＢは２つの場合（Ｓａｂ，Ｃｕｐ）にＥＩＡ試験よりも早かった。別の２つの場合（Ｆｉｏ及びＣｉｃ）には順序が逆であったが、残りの６つの場合にはＥＩＡ及びコンボＷＢが同時に陽性を示すことが知見された。
【００９８】
４．２．コンボＷＢ試験による抗−ＨＣＭＶ ＩｇＧ及びＩｇＡの同定
修正された形態のコンボＷＢ試験をヒト血清サンプル中のＨＣＭＶ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの同定に応用し得る。ＩｇＭの特異的検出に使用するストリップと本質的に同じ方法でニトロセルロースのストリップを作製するが、ｐＵＬ５７の一部分を発現する組換えタンパク質の代わりに、ｇＢ（ＵＬ５５）及びｐ２８（ＵＬ９９）の部分を発現する組換えタンパク質を使用する。
【００９９】
５．検討
ＷＢ技術の方法に基づく新規な血清学的試験方法が開発された。この新規な試験方法は天然型のウイルスタンパク質または組換え免疫原を抗原性物質として使用する。
即ち、標品ウイルス物質の明確な特異性または組換えによって産生された抗原の信頼性を有している診断用製品を作製するために、感染細胞に由来のウイルス産物と遺伝子操作の技術によって得られた組換え抗原とを組合せた。即ち、本発明の目的は、市販のＨＣＭＶ抗原性物質に内部標準を付加することによって、明確な結果を確認できるようにし、同時に、特異的抗体が認識し得る標的ウイルスの種類を非構造ウイルス抗原によって拡大することである。本発明の別の目的は、組換えタンパク質に対するヒト血清の反応性の内部標準を与えるために、所定のＨＣＭＶの組換え抗原の混合物に構造ウイルス産物標品を組合せることである。実際に試験の結果は、試験自体から構成されるこの相互的内部対照の直接結果に基づいて解釈される。即ち、試験の双方の部で少なくとも１つの有意なバンドが陽性を示すときにだけ結果が陽性であると判定される。
【０１００】
実験の結果は、本発明のコンボＷＢ試験が、
（１）従来のＥＩＡ試験（Ｂｅｈｒｉｎｇ）よりも高感度であること、
（２）従来のＷＢ試験よりも優れた特異性を有すること、
を示した。
【０１０１】
統計的には血液ドナーまたは健康な成人の集団から採取した血清サンプルのうちの平均０．３％〜１．１％がＨＣＭＶ ＩｇＭ陽性であると文献に記載されているので（７）、実験の結果は、コンボＷＢが従来のＷＢに比べて向上した特異性を保証することを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＭＶウイルスのタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ配列から成ることを特徴とする原核性または真核性の宿主生物に挿入され得るプラスミド。
【請求項２】
ＡＴＣＣアクセス番号９８，０６６でＡＴＣＣに寄託されたプラスミドｐＣＭＶ−３１の特性を有していることを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
ＨＣＭＶウイルスのウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と、タンパク質ＣＫＳのアミノ酸配列の少なくとも一部分を再現する少なくとも１つの第二領域とから成り、前記領域が前記組換えタンパク質の内部で様々な相互的位置関係で配置され得るような組換えタンパク質を産生し得る請求項１または２に記載のプラスミドを含む宿主生物。
【請求項４】
請求項１または２のいずれかに記載のプラスミドが挿入された宿主生物中で発現された組換えタンパク質から成ることを特徴とする抗−ＨＣＭＶ抗体に結合し得る組換えタンパク質材料。
【請求項５】
抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭに結合し得る組換えタンパク質材料であって、以下の組換えタンパク質、即ち、
（３）ＣＫＳ(1-171aa)−ｐ１３０(1144-1233aa)−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ(171-260aa)
〔式中、ＣＫＳ(1-171aa)及びＴ−Ｒ−ＣＫＳ(171-260aa)はそれぞれ、アミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１からａａ１７１（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基及びアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１７１からａａ２６０（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基を表す。Ｔ及びＲはそれぞれトレオニン及びアルギニンを表す。Ｐ１３０(1144-1233aa)はアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４からａａ１２３３（両端を含む）までのウイルスタンパク質ｐ１３０の残基を表す〕から成ることを特徴とする組換えタンパク質材料。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えタンパク質材料を含むＨＣＭＶ感染の血清学的診断に用いる診断試薬。
【請求項７】
請求項６に記載の少なくとも１種類の診断試薬を含むことを特徴とする抗−ＨＣＭＶ抗体の存在を血清学的手段によって判定するための診断用キット。
【請求項１】
ＨＣＭＶウイルスのタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ配列から成ることを特徴とする原核性または真核性の宿主生物に挿入され得るプラスミド。
【請求項２】
ＡＴＣＣアクセス番号９８，０６６でＡＴＣＣに寄託されたプラスミドｐＣＭＶ−３１の特性を有していることを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
ＨＣＭＶウイルスのウイルスタンパク質ｐ１３０のアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４とａａ１２３３との間（両端を含む）の配列の少なくとも一部分に対応するアミノ酸の配列を再現する第一領域と、タンパク質ＣＫＳのアミノ酸配列の少なくとも一部分を再現する少なくとも１つの第二領域とから成り、前記領域が前記組換えタンパク質の内部で様々な相互的位置関係で配置され得るような組換えタンパク質を産生し得る請求項１または２に記載のプラスミドを含む宿主生物。
【請求項４】
請求項１または２のいずれかに記載のプラスミドが挿入された宿主生物中で発現された組換えタンパク質から成ることを特徴とする抗−ＨＣＭＶ抗体に結合し得る組換えタンパク質材料。
【請求項５】
抗−ＨＣＭＶ ＩｇＭに結合し得る組換えタンパク質材料であって、以下の組換えタンパク質、即ち、
（３）ＣＫＳ(1-171aa)−ｐ１３０(1144-1233aa)−Ｔ−Ｒ−ＣＫＳ(171-260aa)
〔式中、ＣＫＳ(1-171aa)及びＴ−Ｒ−ＣＫＳ(171-260aa)はそれぞれ、アミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１からａａ１７１（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基及びアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１７１からａａ２６０（両端を含む）までのタンパク質ＣＫＳの残基を表す。Ｔ及びＲはそれぞれトレオニン及びアルギニンを表す。Ｐ１３０(1144-1233aa)はアミノ末端からカルボキシル末端の方向でａａ１１４４からａａ１２３３（両端を含む）までのウイルスタンパク質ｐ１３０の残基を表す〕から成ることを特徴とする組換えタンパク質材料。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えタンパク質材料を含むＨＣＭＶ感染の血清学的診断に用いる診断試薬。
【請求項７】
請求項６に記載の少なくとも１種類の診断試薬を含むことを特徴とする抗−ＨＣＭＶ抗体の存在を血清学的手段によって判定するための診断用キット。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ−１】
【図４Ａ−２】
【図４Ｂ−１】
【図４Ｂ−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ−１】
【図４Ａ−２】
【図４Ｂ−１】
【図４Ｂ−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−１５８２５１（Ｐ２０１０−１５８２５１Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４９１９５（Ｐ２０１０−４９１９５）
【出願日】平成２２年３月５日（２０１０．３．５）
【分割の表示】特願２００８−２３８２７６（Ｐ２００８−２３８２７６）の分割
【原出願日】平成９年８月７日（１９９７．８．７）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月５日（２０１０．３．５）
【分割の表示】特願２００８−２３８２７６（Ｐ２００８−２３８２７６）の分割
【原出願日】平成９年８月７日（１９９７．８．７）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]