ＨＩＶワクチン
本発明はＤＮＡワクチン接種のためのポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチドは、非構造タンパク質またはカプシドタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体から選択される追加のＨＩＶタンパク質と融合したＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントまたは免疫原性誘導体をコード化する。好ましくは、ＨＩＶエンベロープ分子はｇｐ１２０であり、好ましい融合物は１以上のＨＩＶ Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔを含む。好ましくは、ＨＩＶエンベロープ分子は哺乳動物細胞においてグリコシル化されていない。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は核酸構築物、かかる構築物を含むベクター、該ベクターおよび構築物を調製する方法ならびに予防または治療、特に治療用ワクチンにおけるその使用に関する。本発明はさらに、該構築物およびベクターを含む宿主細胞および該構築物によりコード化されるポリペプチドならびにポリペプチドそれ自体に関する。本発明はさらに構築物およびベクターを含む医薬処方ならびに医学における該構築物およびベクターの使用に関する。本発明は特に、ＨＩＶ感染症の予防および治療において、さらに詳細には粒子性送達により投与された場合に有用なＤＮＡワクチンに関する。
【０００２】
（背景技術）
ＨＩＶ−１は世界の主要な健康上の問題の１つと見なされる後天性免疫不全症候群（エイズ）の主な原因である。世界中でワクチンを作り出すための大規模な研究が行われてきたが、このような努力はこれまでのところ成功していなかった。
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０は宿主細胞に結合させるために用いられるウイルスタンパク質である。ＣＤ４および２つのケモカインレセプターＣＣＲ−４またはＣＸＣＲ−５の１つとして知られるヘルパーＴ細胞とマクロファージと２つの表面分子を結合させることによりこの結合が行われる。ｇｐ１２０タンパク質をまず大きな前駆体分子（ｇｐ１６０）として発現し、これを次いで翻訳後開裂させて、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を得る。ｇｐ１２０タンパク質はｇｐ４１分子と結合させることによりビリオンの表面上に保持され、これはウイルス膜中に挿入される。
【０００３】
ｇｐ１２０タンパク質は、中和抗体の主要な目標であるが、残念なことに該タンパク質の最免疫原性領域（Ｖ３ループ）はタンパク質の最も可変的な部分でもある。そのために、ワクチン抗原として中和抗体を惹起するためのｇｐ１２０（またはその前駆物質ｇｐ１６０）の使用は概して保護のワクチンに関して限られた効果しかないと考えられる。ｇｐ１２０タンパク質は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されるエピトープも含有している。これらのエフェクター細胞はウイルスに感染した細胞を排除することができ、その結果第二の主要な抗ウイルスの免疫機構を構成する。中和抗体の標的領域と対照的に、あるＣＴＬエピトープは異なるＨＩＶ株間で比較的保存されるようである。この理由のために、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０は細胞性免疫反応（特にＣＴＬ）を惹起することを目的とするワクチンにおいて有用な抗原性成分である可能性がある。
ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質は記載されており、例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の産物などの内部構造タンパク質およびＲｅｖ、Ｎｅｆ、ＶｉｆおよびＴａｔなどの他の非構造タンパク質を含む（Ｇｒｅｅｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ、３２４、５、３０８以下参照（１９９１）およびＢｒｙａｎｔら、（Ｅｄ．Ｐｉｚｚｏ）、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．、１１、５、３９０以下参照（１９９２）。
【０００４】
ＨＩＶ ＴａｔおよびＮｅｆタンパクは初期タンパク質である。すなわち、これらは感染の初期に、構造タンパク質の不在下で発現される。
Ｎｅｆタンパク質は細胞表面からのＣＤ４、ＨＩＶレセプターの除去を引き起こすことが知られているが、この機能の生物学的重要性が論議されている。さらに、ＮｅｆはＴ細胞のシグナル経路と相互作用し、活性状態を誘発し、これは次いでより有効な遺伝子発現を促進し得る。あるＨＩＶ単離物はこの領域において突然変異を有し、これにより機能的タンパク質をコード化しなくなり、そのインビボでの複製および病原性を非常に犠牲にする。
【０００５】
Ｔａｔ遺伝子は感染中のいろいろな時に多くの差別的にスプライスされた転写物を生じさせる。最初のエクソンは感染の初期に優勢である８６アミノ酸タンパク質をコード化する。第二のエクソンはさらに１４のアミノ酸をコード化し、このＴａｔの部分的にスプライスされた形態は感染の後期において見られる。両方の形態は完全に機能的なトランスアクチベーターであるが、さらに長い形態もαｖβ３およびα５β１インテグリンとの結合に重要なＲＧＤモチーフを含有する。Ｔａｔは、ＨＩＶ ＲＮＡの５’末端に位置し、ＨＩＶ ＬＴＲからの転写を少なくとも１０００倍増加調節するトランス活性化反応エレメント（ＴＡＲ）として知られるショートステムループ構造と結合する。ＴａｔはＨＩＶ感染の延長期の促進に関与し、完全長ウイルス転写物の産生を刺激する。Ｔａｔは多くの細胞遺伝子の発現に影響を与えることができ、ＴＮＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−６をはじめとする多くの細胞の遺伝子の発現を活性化することができ、ｐ５３およびＢｃｌ−２の発現を調節する。Ｔａｔは過剰で生産され、感染した細胞から分泌される。この細胞外Ｔａｔは他の細胞に侵入でき、ＨＩＶによる感染について細胞をプライムするか、または新たに感染した細胞においてＨＩＶ複製の速度を加速させることができる。
【０００６】
会議の発表（Ｃ．Ｄａｖｉｄ Ｐａｕｚａ、Ｔａｔ毒素での免疫化はアカゲザルにおけるＳＨＩＶ８９．６ＰＤ感染を弱毒化する（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔａｔ ｔｏｘｏｉｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ＳＨＩＶ８９．６ＰＤ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）、第１２回Ｃｅｎｔ Ｇａｒｄｅｓ会議、Ｍａｒｎｅｓ−Ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、２６．１０．１９９９）において、アカゲザルをＴａｔ毒素単独またはエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０ワクチンコンビネーション（１回量の組み換えワクシニアウイルスと１回量の組み換えタンパク質）との組み合わせで免疫化した実験が説明された。観察された結果から、エンベロープ糖タンパク質の存在はＴａｔ単独で行われた実験よりも有利でないことが示された。
Ｇａｇ遺伝子は完全長ＲＮＡから翻訳されて前駆体ポリタンパク質を生じ、これをつづいて３〜５のカプシドタンパク質；マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質およびタンパク質およびプロテアーゼを結合する核酸に開裂させる。（１．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ ＢＫ、Ｋｎｉｐｅ ＤＭおよびＨｏｗｌｅｙ Ｍ １９９６ ２．Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２巻、１９９６）。
【０００７】
ｇａｇ遺伝子は５５キロダルトン（ｋＤ）のＧａｇ前駆体タンパク質（ｐ５５とも称する）を生じさせ、これは未スプライスウイルスｍＲＮＡから発現される。翻訳中、ｐ５５のＮ末端はミリストイル化され、細胞膜の細胞質性と関連させる。膜結合Ｇａｇポリタンパク質は２コピーのウイルスゲノムＲＮＡを、感染した細胞の表面からのウイルス粒子の出芽を引き起こす他のウイルスおよび細胞タンパク質とともに利用する。出芽後、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（カプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオカプシド［ｐ９］）、およびｐ６（４）で表される４つの小さなタンパク質中へのウイルス成熟のプロセス中、ｐ５５はウイルスによりコード化されたプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）により開裂される。
３つの主要なＧａｇタンパク質に加えて、すべてのＧａｇ前駆体は、開裂して、様々なサイズのペプチドとしてビリオン中に残存するいくつかの他の領域を含む。これらのタンパク質は異なる役割を果たす。例えば、ｐ２タンパク質はプロテアーゼの活性の調節において提案されている役割を果たし、タンパク分解処理の的確な時間調節に寄与する。
【０００８】
ＭＡポリペプチドは ｐ５５のＮ−末端ミリストイル化末端から誘導される。ほとんどのＭＡ分子はビリオン脂質二重層の内部表面と結合したままであり、粒子を安定化する。ＭＡのサブセットはビリオンの深い方の層の内部に補充され、ここでウイルスＤＮＡを核へと送り届ける複合体の一部になる。ＭＡ上の求核シグナルは細胞核輸入機構により認識されるので、これらのＭＡ分子はウイルスゲノムの核輸送を促進する。この現象は、ＨＩＶが非分裂細胞に感染することを許容し、これはレトロウイルスについては通常でない性質である。
ｐ２４（Ｃａ）タンパク質はウイルス粒子の円錐コアを形成する。シクロフィリンＡはｐ５５のｐ２４領域と相互作用して、ＨＩＶ粒子中に組み入れられることが証明されている。シクロスポリンＡによるこの相互作用の中断はウイルス複製を阻害するので、ＧａｇとシクロフィリンＡ間の相互作用は最も重要である。
【０００９】
ＧａｇのＮＣ領域は、ＨＩＶのいわゆるパッケージングシグナルの特異的認識に関与する。パッケージシグナルはウイルスＲＮＡの５’末端付近に位置する４ステムループ構造からなり、ヘテロローガスなＲＮＡのＨＩＶ−１ビリオン中への組み入れを媒介するために十分である。ＮＣは２つの亜鉛フィンガー（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ）モチーフによって媒介される相互作用によりパッケージングシグナルと結合する。ＮＣはまた逆転写を促進する。
ｐ６ポリペプチド領域はｐ５５ Ｇａｇと補助タンパク質Ｖｐｒ間の相互作用を媒介し、Ｖｐｒをアセンブリングビリオンに組み込むことにまでに至る。ｐ６領域はまた、感染した細胞からの出芽ビリオンの有効な放出に必要ないわゆる後期ドメインも含有する。
【００１０】
Ｐｏｌ遺伝子は、初期感染においてウイルスにより必要とされる２つの活性を含有する２つのタンパク質、ウイルスＤＮＡの細胞ＤＮＡ中への組み込みに必要なＲＴおよびインテグラーゼタンパク質をコード化する。Ｐｏｌの主な生成物は、ビリオンプロテアーゼにより開裂されて、ＤＮＡ合成（ＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ）に必要な活性を含有するアミノ末端ＲＴペプチドおよびカルボキシ末端インテグラーゼタンパク質を得る。ＨＩＶ ＲＴは、完全長ＲＴ（ｐ６６）およびカルボキシ末端Ｒｎａｓｅインテグラーゼドメインが欠損した開裂産物（ｐ５１）のヘテロダイマーである。
ＲＴはレトロウイルスゲノムによりコード化された最も高度に保存されたタンパク質の１つである。ＲＴの２つの主な活性は、ＤＮＡ ＰｏｌおよびリボヌクレアーゼＨである。ＲＴのＤＮＡ Ｐｏｌ活性はＲＮＡおよびＤＮＡをテンプレートとして交換可能に使用し、公知の全てのＤＮＡポリメラーゼのように新たにＤＮＡ合成を開始することができないが、既存の分子がプライマー（ＲＮＡ）としての役割をすることを必要とする。
【００１１】
ＤＮＡ合成が進行するにつれ、ＲＮＡゲノムを除去する複製の初期において、全ＲＴタンパク質に固有のＲｎａｓｅ Ｈ活性は不可欠な役割を果たす。これはすべてのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子からＲＮＡを選択的に分解する。構造的にポリメラーゼおよびｒｉｂｏＨは、ＰｏｌがＰｏｌの３分の２のアミノの範囲に及ぶ別々の非重複ドメインを占める。
ｐ６６触媒サブユニットは５つの独立したサブドメイン中に折り畳まれている。これらのアミノ末端２３はＲＴ活性を有する部分を有する。これらのカルボキシ末端はＲｎａｓｅ Ｈドメインである。
【００１２】
宿主細胞の感染の後に、レトロウイルスＲＮＡゲノムは感染粒子中に存在する逆転写酵素によって直線状ｄｓ ＤＮＡの中にコピーされる。インテグラーゼ（Ｓｋａｌｋａ ＡＭ’９９ Ａｄｖ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５２ ２７１−２７３に概論）はウイルスＤＮＡの両端を認識し、これらを切断し、ウイルスＤＮＡを宿主染色体部位に同伴して組み入れを触媒する。宿主ＤＮＡ中の多くの部位が組み込みのための目標であり得る。インテグラーゼはインビトロでの組み入れを触媒するために十分であるが、これはインビボでウイルスＤＮＡと結合した唯一のタンパク質−大タンパク質−ではなく、感染した細胞から単離されたウイルスＤＮＡ複合体は組み込み前複合体を意味する。これは子孫ウイルスのゲノムによる宿主細胞遺伝子の獲得を容易にする
【００１３】
インテグラーゼは３つの別のドメイン、Ｎ末端ドメイン、触媒コアおよびＣ末端ドメインで構成されている。触媒コアドメインはポリヌクレオチド移動の化学的性質のための必要条件のすべてを含む。
ＤＮＡワクチンは通常、強力なプロモーターがその中へ挿入されたバクテリアプラスミドベクター、抗原性ペプチドをコード化する興味のある遺伝子およびポリアデニル化／転写末端配列からなる。興味のある遺伝子は、完全タンパク質または単に病原体、腫瘍またはそれに対して防御することを意図される他の因子に関連する抗原性ペプチド配列をコード化し得る。プラスミドはバクテリア、例えばイー・コリ中で成長し、次いで単離され、宿主に投与される前に意図される投与経路に応じて適当な培地中で調製することができる。投与後にプラスミドは宿主の細胞に取り込まれるか、または直接宿主細胞中に送達され、ここでコード化されたペプチドが産生される。プラスミドベクターは好ましくは哺乳動物の宿主におけるプラスミド複製および関連する動物の染色体ＤＮＡ内の組み入れを防止するために、真核細胞において有効な複製の起源無しに構成される。
【００１４】
伝統的なワクチン接種技術に対してＤＮＡワクチン接種には利点が数多くある。第一に、ＤＮＡ配列によってコード化されるタンパク質は宿主において合成されるので、タンパク質の構造または立体構造は疾患状態と関連する本来のタンパク質に類似するであろうと予測される。保存されたタンパク質からエピトープを認識する細胞毒性Ｔリンパ球反応を生成することにより、ＤＮＡワクチン接種が異なった種類のウイルスに対して防御を提供することも同様にあり得る。技術により多くの疾患状態に関して同時免疫化を促進するために単一製剤中に多様な免疫原を組み合わせる可能性も提供される。
ＤＮＡワクチン接種に関連する有用な背景情報は、Ｄｏｎｎｅｌｙら、「ＤＮＡワクチン」Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ １５：６１７−６４８（その開示は全体として出典明示により本発明の一部として参照される）に記載されている。
Ｄｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４：２３６９−２３７６は、グリコシル化における多様性がどのようにｇｐ１２０に対するＣＤ８＋ＣＴＬ反応に影響を及ぼすかを調査し、哺乳動物ＣＨＯ細胞において産生されたｇｐ１２０は、Ｎ−結合オリゴ糖が免疫化の前に除去されなければ昆虫または酵母細胞由来のエンベロープタンパク質と比較した場合にＣＴＬ反応をプライムする能力が減少していることを見いだした。
【００１５】
この度、ＨＩＶのワクチンにおいて、非グリコシル化ＨＩＶエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを使用することにより得られる利益があることが見いだされた。意外にも、分泌シグナルなしでｇｐ１２０を発現し、従ってグリコシル化されないかまたは細胞から分泌されないＤＮＡベクターは、その本来の分泌シグナルを有するｇｐ１２０を発現するＤＮＡベクターよりも、さらに有効なＣＴＬ反応の刺激物質である。分泌シグナルが、糖鎖形成が起きる細胞内部位へｇｐ１２０を導くことに関与するので、その本来の分泌シグナルが欠損したｇｐ１２０はグリコシル化されない。さらに、非グリコシル化ｇｐ１２０との融合タンパク質において非構造ＨＩＶタンパク質、例えばＴａｔが存在すると、ｇｐ１２０に対するＣＴＬ反応が増大する。対照的に、正常なｇｐ１２０との融合タンパク質におけるＴａｔは分泌を防止するが、免疫反応の増大には至らない。非グリコシル化ｇｐ１２０は他のＨＩＶ抗原（構造および非構造の両方）との融合タンパク質においてもうまく発現することができる。
【００１６】
（発明の開示）
従って、本発明はＨＩＶ感染症およびＡＩＤＳの予防および治療用の核酸またはポリペプチドワクチンにおいて用いられる新規構築物を提供する。
一態様において、本発明は、ヘテロローガスなプロモーターと操作可能に連結した、哺乳動物の標的細胞にて発現した場合に、グリコシル化されていないか、または実質的にグリコシル化されていない、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質はｇｐ１２０である。あるいは、ｇｐ１６０またはｇｐ１４０などのエンベロープタンパク質の他の形態であり得る。
【００１７】
哺乳動物細胞において発現されたｇｐ１２０などのＨＩＶエンベロープタンパク質は通常グリコシル化されるであろう。本発明によれば、ｇｐ１２０コード化配列を用いて、哺乳動物標的細胞、特にヒト標的細胞におけるグリコシル化を軽減または防止する。グリコシル化は多くの異なる方法で、例えばグリコシル化部位の除去または突然変異によるか、または本来の分泌シグナルを除去することにより軽減または防止することができる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド構築物において、ｇｐ１２０またはＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態は機能的分泌シグナルが欠損している。分泌シグナルはＨＩＶ単離物間で長さが異なる。例えば、本明細書において記載されるＷ６１Ｄ単離物においては３０アミノ酸長であるが、異なる単離物についてはこれ以上またはこれ以下であり得る。一般に、分泌シグナルは明らかに表され、その全体が除去されるが、必ずしもそうではない場合もある。エンベロープタンパク質をグリコシル化に関与する細胞機構に取り込むその機能を防止するために十分な量のシグナルが除去されるであろう。これは容易に試験することができる。
【００１８】
エンベロープタンパク質は機能的分泌シグナルを有しないが、まだわずかなグリコシル化が起こる可能性もあり、このことは本発明から排除されていない。かくして、本発明のエンベロープタンパク質は、哺乳動物細胞にて、実質的にグリコシル化されておらず、その結果として、その大部分、例えば、その５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上が細胞より分泌されていない。
ＨＩＶエンベロープタンパク質、特にｇｐ１２０は、好ましくはＮｅｆ、Ｔａｔおよび逆転写酵素（ＲＴ）などの非構造タンパク質ならびに構造タンパク質、特にＧａｇまたはフラグメントあるいはこれらのいずれかの免疫原性誘導体などのカプシドタンパク質より選択される少なくとも１つのＨＩＶタンパク質を含む融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００１９】
一具体例において、融合タンパク質はｇｐ１２０およびＲＴ−含有融合タンパク質であり、所望によりＧａｇおよび／またはＮｅｆも含んでもよい。
もう１つの具体例において、融合タンパク質は所望によりＲＴおよび／またはＮｅｆを含んでもよいｇｐ１２０およびＧａｇ含有融合タンパク質である。
さらに別の具体例において、融合タンパク質は所望によりＲＴおよび／またはＧａｇも含んでもよいｇｐ１２０およびＮｅｆ含有融合タンパク質である。
次の好ましい具体例において、融合タンパク質は、ｇｐ１２０、ＲＴ、ＮｅｆおよびＧａｇまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体の融合物である。
ｇｐ１２０−ＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇ
ＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇ−ｇｐ１２０
【００２０】
もう１つの具体例は、ｇｐ１２０およびＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を含む融合物である。このような具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、ｇｐ１２０およびＴａｔ含有融合タンパク質をコード化するためにＴａｔコード化配列と結合したｇｐ１２０コード化配列を含む。
特定の具体例において、ｇｐ１２０およびＴａｔ配列は、ｇｐ１２０、ＴａｔおよびＮｅｆ含有融合タンパク質、最も好ましくはｇｐ１２０−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合物をコード化するために、Ｎｅｆコード化配列とさらに結合される。
追加のＨＩＶ配列、例えばＧａｇコード化配列を含めることができる。
もう１つの特定の具体例において、本発明のポリヌクレオチドによりコード化された融合はｇｐ１２０−Ｇａｇ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合である。
好ましくは、本発明において用いられるＴａｔ配列は、トランス活性化活性が欠失しているが、その免疫原性エピトープを保持する生物学的に不活性なＴａｔをコード化するように突然変異させられる。Ｔａｔトランス活性化活性は、ＨＩＶ ＬＴＲレポーター系、例えばクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子がＨＩＶ−１の長い末端繰り返しの制御下にあるＣＡＴ分析系により測定することができる。好適な特定のＣＡＴ分析系は、ＦｅｌｂｅｒおよびＰａｖｌａｋｉｓ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１８４−１８７において記述され、Ｍｉｓｃｈｉａｔｉら（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ａｕｇ １１（４）：２０９−１７においても用いられるＨＬ３Ｔ１細胞系を使用する。ＨＬ３Ｔ１は、ＣＡＴ遺伝子と結合したＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターの安定に組み入れられたサイレントコピーを含有するＨｅＬａ細胞系である。これらの細胞はＴａｔ遺伝子を含有するＤＮＡベクター（修飾または未修飾）でトランスフェクトされる。ＣＡＴは活性Ｔａｔの存在により産生され、ＥＬＩＳＡにより測定される。
【００２１】
好ましい突然変異Ｔａｔ配列（ＢＨ１０分子クローン起源）は活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）およびＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→ＬｙｓおよびＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）
において突然変異を有する（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：４８−６４、１９９７）。
所望により、本発明において用いられるＮｅｆ配列は、Ｎ末端領域をコード化する配列を除去するために、すなわち３０〜８５、好ましくは６０〜８５、好ましくはＮ末端６５アミノ酸の除去のために切除される（後者の切除は本発明においてｔｒＮｅｆと称する）。有利には、Ｎｅｆは１以上のミリスチル化部位を除去するために修飾することができる。例えば、Ｇｌｙ２ミリスチル化部位は、欠失または置換により除去することができる。別法として、あるいはさらには、一方または両方のロイシンの欠失または置換によりＬｅｕ１７４およびＬｅｕ１７５のジロイシンモチーフを変更するためにＮｅｆを修飾することができる。ＣＤ４減少調節におけるジロイシンモチーフの重要性は、Ｂｒｅｓｎａｈａｎ Ｐ．Ａ．ら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８（２２）：１２３５−８に記載されている。
【００２２】
好ましくは本発明において用いられるＧａｇはＧａｇ Ｐ６ポリペプチドをコード化しない。
本発明において用いられる好ましいＧａｇ配列はＰ１７および／または２４を含む。
本発明において用いられるＲＴポリヌクレオチドは好ましくは突然変異をコード化して逆転写酵素活性を実質的に不活化する。好ましい不活化突然変異体は、ＫリシンのＷトリプトファン２２９の置換を含む。ＷＯ０３／０２５００３参照。
好ましくは、例えばｇｐ１２０、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＧａｇまたはＲＴをコード化する本発明のポリヌクレオチド中に含まれる１以上のＨＩＶ配列は哺乳動物細胞に関して、最も好ましくは、そのコドン使用において高度に発現されたヒト遺伝子に類似するように最適化されたコドンである。
【００２３】
融合物はさらなるＨＩＶ配列を含み得る。本発明に含まれるＨＩＶ配列すべてに関して、これらは必ずしも完全長または本来のタンパク質をコード化する配列を表すとは限らないと理解される。少なくとも１つのＨＩＶエピトープ、好ましくはＣＴＬエピトープ、典型的には少なくとも８個のアミノ酸のペプチドをコード化するフラグメントのように、免疫原性誘導体、例えば切形または他の方法で変更された、例えば突然変異タンパク質も含まれる。フラグメントの免疫原性誘導体も予想される。免疫原性誘導体は未変性抗原またはそのフラグメントと架橋反応する。少なくとも８、例えば８〜１０のアミノ酸または最高２０、５０、６０、７０、１００、１５０または２００のアミノ酸の長さのフラグメントをコード化するポリヌクレオチドは、コード化されたオリゴまたはポリペプチドがＨＩＶ抗原性を示す限り本発明の範囲内に含まれると考えられる。本発明のポリヌクレオチド配列によりコード化されたＨＩＶポリペプチド分子は、天然のタンパク質の少なくとも５０％の長さのフラグメントを表し、該フラグメントは突然変異を含み得るが、少なくとも１つのＨＩＶエピトープを保持し、ＨＩＶ抗原性を示す。同様に、本発明の免疫原性誘導体はＨＩＶ抗原性を示さなければならない。本発明の好ましい免疫原性誘導体は、酵素活性（ＲＴ）、トランス活性化活性（Ｔａｔ）、またはＣＤ４減少調節（Ｎｅｆ）などの、ワクチン抗原において望ましくない本来のタンパク質の機能の軽減または除去など、本来のタンパク質よりもいくつかの潜在的な利点を提供する。ポリヌクレオチド配列は好ましくは本発明の好ましい態様に従って哺乳動物細胞に関して最適化されたコドンである。
【００２４】
好ましいポリヌクレオチド配列は次の群から選択される：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
６．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
７．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
８．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＮｅｆ−ｍＴａｔ
９．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１０．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
【００２５】
１１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ
１６．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
【００２６】
ｍＮｅｆ＝非ミリストイル化Ｎｅｆを得るためのＧ２の欠失
Ｌ１ Ｎｅｆ＝ＮｅｆにおけるＬ１７４Ａ突然変異
Ｌ２Ｎｅｆ＝ＮｅｆにおけるＬ１７５Ａ突然変異
ＬＬＮｅｆ＝ＮｅｆにおけるＬ１７４ＡおよびＬ１７５Ａ突然変異
ＴｒＮｅｆ＝末端アミノ酸１−６５をコード化するヌクレオチドが欠損したＮｅｆ
ｍＲＴ＝生物学的活性（Ｗ２２９Ｋ）を除去するために突然変異した逆転写酵素。ＲＴは最適化されたコドンである。
Ｇａｇ＝最適化されたＧａｇコドン
【００２７】
発明は好ましくはＨＩＶ−１に関する。本明細書において記載される構築物はＨＩＶクレードＶまたはクレードＣ、特にクレードＢから誘導されるのが好ましい。
好ましくは、プロモーターはＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子からのプロモーターであり、さらに詳細には、ＷＯ０２／３６７９２に記載されているようにエクソン１を含むＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子の５’未翻訳領域が含まれているプロモーターである。
【００２８】
もう１つ別の態様において、本発明は本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ポリヌクレオチド配列は好ましくはＤＮＡであり、好ましくは二本鎖ＤＮＡプラスミドであるベクター内に含まれる。別のベクターを以下に記載し、これは特定のアデノウイルスベクター、例えばチンパンジー由来のアデノウイルスベクターＰａｎ９またはＰａｎ５、６および７を含み、好ましくは、これらは複製欠損である場合、標的細胞において複製できない。
本発明のもう一つ別の態様はＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体、特にｇｐ１２０と、別個に１またはそれ以上のＨＩＶタンパク質、例えばＲＴ、Ｇａｇ、Ｎｅｆ、Ｔａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する一組のポリヌクレオチドに関する。
すなわち、本発明は、ｇｐ１２０のような本明細書中に記載のポリヌクレオチドまたは他の形態のＨＩＶエンベロープタンパク質と、少なくとも１つのＨＩＶ Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドとを含む、所望により追加のプロモーターに連結されていてもよい、一組のポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
本明細書に記載されるアデノウイルスなどの他のベクターも意図するものであるが、その一組のポリヌクレオチドは、シングルベクターに含まれ、特にＤＮＡプラスミドに含まれることが好ましい。好ましくは、該ポリヌクレオチドは２つまたはそれ以上の別々のプロモーターの制御下にあることが好ましい。別法として、２つのポリヌクレオチドはシングルプロモーターの制御下にあってもよく、所望により第２のポリヌクレオチドの翻訳をポリヌクレオチドの間に内部リボソーム侵入部位を入れることで強化してもよい。
好ましくは一組のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のｇｐ１２０ポリヌクレオチドと、ＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇの融合体またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化するさらなるポリヌクレオチドとを含む。
【００３０】
好ましい一組のポリヌクレオチドは以下の群より選択される：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ＋ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ
【００３１】
これらの好ましい２つのポリヌクレオチドの組が、２つの別個のプロモーターの制御下、シングルベクターに含まれる場合には、このベクターをデュアルプロモーターと言うこともできる。
本発明の一組のポリヌクレオチドの一方または両方のタンパク質あるいは融合タンパク質の好ましいプロモーターは、より詳細には、５’非翻訳リーダー配列がＷＯ０２／３６７９２に記載され、本明細書にも記載されるように、エクソン１を含む場合の、ＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子から由来のプロモーターである。
【００３２】
さらにもう一つ別の態様において、本発明は本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドおよびベクターを提供する。
一の具体例において、本発明は、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体と、少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体とを含み、該追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの、融合タンパク質を提供する。
もう一つ別の具体例において、本発明は、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体と、少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体とを含み、当該少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの組成物を提供する。
【００３３】
もう一つ別の具体例において、本発明は、哺乳動物の細胞について最適化されるコドンであるポリヌクレオチドから発現される、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびベクターおよびポリペプチドを、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、担体またはアジュバントと共に含む医薬組成物を提供する。好ましい具体例において、ポリヌクレオチドであって、好ましくはＤＮＡベクターの形態で、好ましくは少なくとも１つのコドン最適化ＨＩＶ配列を含むものが、複数の粒子、好ましくは金ビーズなどのビーズであって、その上にＤＮＡがコートされているものを含む組成物中に存在する。
本発明のポリヌクレオチドの送達は、好ましくは粒子性送達、特に衝撃法により行われる。
本発明のベクターは免疫刺激剤と共に使用することができ、必ずしもそうとは限らないが、ベクターと同時に投与されるのが好ましく、本発明の組成物中に一緒に処方されるのが好ましい。
【００３４】
本発明において用いられる免疫刺激剤は次のものを包含するが、これらは排他的ではなく、他の薬剤を排除するものではない：合成イミダゾキノリン、例えば、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）［Ｓ−２６３０８、Ｒ−８３７］（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、「イミキモドを単独または糖タンパクワクチンとの組み合わせにおいて使用する再発性ＨＳＶ疾患の軽減（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＨＳＶ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｌｏｎｅ ｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１８２０−１８２６、（２００１））；およびレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）［Ｓ−２８４６３、Ｒ−８４８］（Ｖａｓｉｌａｋｏｓら「免疫反応修飾剤Ｒ−８４８のアジュバント活性：ＣｐＧ ＯＤＮとの比較（Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｒ−８４８：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＣｐＧ ＯＤＮ）」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０４：６４−７４（２０００））、抗原提示細胞およびＴ細胞表面上で構成的に発現されるカルボニルおよびアミンのシッフ塩基、例えばツカレソール（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｊ．ら「共刺激シッフ塩基形成薬による免疫系の治療的増強作用（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｓｃｈｉｆｆ−ｂａｓｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：７１−７５（１９９５））、サイトカイン、ケモカインおよびタンパク質またはペプチドまたはＤＮＡのいずれかとしての共刺激分子（これは炎症性サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータを包含する）、Ｔｈ１インデューサー、例えばインターフェロンガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８、Ｔｈ２インデューサー、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３および他のケモカインおよび共刺激遺伝子、例えばＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＣＡ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０Ｌ、他の免疫刺激ターゲティングリガンド、例えばＣＴＬＡ−４およびＬ−セレクチン、アポトーシス刺激タンパク質およびペプチド、例えばＦａｓ、（４９）、合成脂質ベースのリガンド、例えばバクスフェクチン（ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）、（Ｒｅｙｅｓら、「バクスフェクチンは抗原特異性抗体価を向上させ、プラスミドＤＮＡ免疫化に対するＴｈ１タイプの免疫反応を維持する（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｒｅｓ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｓ Ｔｈ１ ｔｙｐｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３７７８−３７８６）、スクアレン、アルファ−トコフェロール、ポリソルベート８０、ＤＯＰＣおよびコレステロール、エンドトキシン、［ＬＰＳ］（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．，「エンドトキシン、Ｔｏｌｌ様レセプター４、および先天性免疫の求心性四肢（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，‘Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４，ａｎｄ ｔｈｅ ａｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｍｂ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：２３−３０（２０００））；ＣｐＧ ｏｌｉｇｏ−およびジヌクレオチド、Ｓａｔｏ，Ｙ．ら、「有効な皮内遺伝子免疫化に必要な免疫刺激ＤＮＡ配列（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ ｇｅｎｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３（５２７３）：３５２−３５４（１９９６）。Ｈｅｍｍｉ、Ｈら、「Ｔｏｌｌ様レセプターはバクテリアＤＮＡを認識する（Ａ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ）」、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５、（２０００）およびＴｏｌｌレセプターが適当なＴｈ−１誘発サイトカイン、例えば合成マイコバクテリアリポタンパク質、マイコバクテリアタンパク質ｐ１９、ペプチドグリカン、タイコ酸およびリピッドＡを産生する引き金となる他の潜在的なリガンド。
【００３５】
本発明に関して用いられる好ましい免疫刺激剤はＧＭ−ＣＳＦである。これは本発明のＤＮＡワクチンと共に同時投与されるＧＭ−ＣＳＦを発現するポリヌクレオチドの形態で用いることができる。ＧＭ−ＣＳＦをコード化するＤＮＡプラスミドは本発明のポリヌクレオチドを含む医薬組成物中に存在していてもよい。
主にＴｈ−１型反応を惹起するための好ましいアジュバントとしては、例えば、リピッドＡ誘導体、例えばモノホスホリルリピッドＡ、または好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピッドＡが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（シアトル、ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号および第４，９１２，０９４号参照）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣＰＧジヌクレオチドがメチル化されていない）も主にＴｈ１反応を惹起する。このようなオリゴヌクレオチドはよく知られていて、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および第５，８５６，４６２号において記載されている。免疫刺激ＤＮＡ配列も、例えばＳａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２、１９９６により記載されている。もう一つ別の好ましいアジュバントは、サポニン、例えばＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）をはじめとするＱｕｉｌ Ａ、またはその誘導体；Ｅｓｃｉｎ；ジギトニン；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａまたはＣｈｅｍｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。
【００３６】
本発明のさらに別の態様によると、ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞、または本発明の発現ベクターが提供される。宿主細胞は例えばバクテリア、例えばイー／コリ、哺乳動物、例えばヒトであってもよいし、あるいは昆虫細胞であってもよい。本発明のベクターを含む哺乳動物細胞はインビトロでトランスフェクトされた培養された細胞であってもよいし、あるいはベクターを哺乳動物に投与することによりインビボでトランスフェクトされた細胞であってもよい。
コドン最適化とは、ＤＮＡ配列が哺乳動物における遺伝子のコドン使用に類似するように最適化されることを意味する。特に、配列におけるコドン使用は高度に発現されたヒト遺伝子と類似するように最適化される。
ＤＮＡコードは４文字（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を有し、生物の遺伝子におけるコード化されたアミノ酸タンパク質を表す３文字「コドン」を表すためにこれらを使用する。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線状配列を、これらの遺伝子によりコード化されるタンパク質におけるアミノ酸の直線状配列に翻訳する。コードは非常に縮重し、６１コドンが２０の天然のアミノ酸をコードし、３コドンが「停止」シグナルを表す。従って、ほとんどのアミノ酸は１以上のコドンによりコードされ、実際いくつかは４以上の異なるコドンによりコードされる。
【００３７】
所定のアミノ酸をコードするために１以上のコドンが利用可能である場合、生物のコドン使用パターンは非常に非無作為であることが観察されている。異なる種はそのコドン選択において異なった傾向を示し、さらにコドンの利用は高レベルおよび低レベルで発現される遺伝子間の一つの種において著しく異なる。この傾向は、ウイルス、植物、バクテリアおよび哺乳動物細胞において異なり、ある種は他よりもランダムなコドン選択からより強力な偏りを示す。例えば、ヒトおよび他の哺乳動物はある種のバクテリアまたはウイルスほど強力に偏っていない。これらの理由のために、イー・コリにおいて発現される哺乳動物遺伝子または哺乳動物細胞において発現される組み換え遺伝子が有効な発現のために不適当なコドンを有する顕著な可能性がある。コドンのクラスターまたは多量のコドンのヘテロローガスなＤＮＡ配列における存在は、発現顔凝る宿主においてほとんど観察されず、該宿主における低いヘテロローガスな発現レベルの前兆である。
本発明の一具体例において、実質的に非グリコシル化ｇｐ１２０アミノ酸配列をコード化するｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列が提供され、ここにおいて、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは高度に発現された哺乳動物遺伝子と類似している。好ましくは、ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。望ましくは、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは高度に発現されたヒト遺伝子に典型的である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、コドン使用パターンはヒト免疫不全ウイルスに典型的なものから変更されて、標的生物、例えば哺乳動物、特にヒトのコドン傾向をさらに厳密に対応する。「コドン使用係数（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）」は、所定のポリヌクレオチド配列のコドンパターンが標的種のものとどれほど厳密に類似しているかの尺度である。コドン頻度は多くの種の高度に発現された遺伝子に関して文献から得ることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６、２４：２１４−２１５参照）。６１コドンのそれぞれについてのコドン頻度（選択された種類の遺伝子の１０００コドンあたりの発生数として表す）を２０の天然のアミノ酸のそれぞれについて標準化し、各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンについての値を１に設定し、それほど頻繁でないコドンにつての頻度を０から１の間になるように評価する。このようにして、６１コドンのそれぞれを標的種の高度に発現された遺伝子について１またはそれ以下に割り当てる。特定のポリヌクレオチドについてのコドン使用係数を、該種の高度に発現された遺伝子に対して計算するために、特定のポリヌクレオチドの各コドンについての評価された値を記録し、これらの値全ての幾何平均を取る（これらの値の自然対数の合計をコドンの総数で割り、真数を取る）。係数は０から１の間の値を有し、係数が高いほど、ポリヌクレオチドにおいてより多くのコドンが頻繁に用いられるコドンである。ポリヌクレオチド配列がコドン使用係数１を有するならば、コドンのすべては標的種の高度に発現された遺伝子の「最も頻繁な」コドンである。
【００３９】
本発明によると、ポリヌクレオチドのコドン使用パターンは好ましくは希少なコドンを排除する。希少コドンは、標的生物の高度に発現された遺伝子において特定のアミノ酸に関して用いられるコドンの＜２０％以上、またはさらに好ましくは＜１０％に対応するコドンとして定義される。あるいは、希少コドンは、標的生物の高度に発現された遺伝子において＜０．３、またはさらに好ましくは＜０．２の比較的同義のコドン使用（ＲＳＣＵ）値を有するコドンとして定義することができる。ＲＳＣＵ値は、該アミノ酸についての全コドンが等しい頻度で使用される場合に予想される数で観察されるコドン数を割ったものである。希少コドンの適当な定義は当業者には明かであろう。
本発明のポリヌクレオチドは一般に、０．３以上、好ましくは０．４以上、最も好ましくは０．５以上の高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用係数を有する。好ましくは、コドン使用係数は１．０未満、好ましくは０．９未満、さらに好ましくは０．８未満である。従って、０．５から０．９の間、または０．５から０．８の間のコドン使用係数が最も好ましい。ヒトについてのコドン使用表はＧｅｎｂａｎｋにおいて見いだすことができる。
比較として、高度に発現されたβアクチン遺伝子は０．７４７のコドン使用係数を有する。
【００４０】
人類のコドン使用表を以下に示す：
ヒト（高度に発現された）遺伝子のコドン使用 １／２４／９１（ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ）
アミノ酸 コドン 数 ／１０００ フラクション
Ｇｌｙ ＧＧＧ ９０５．００ １８．７６ ０．２４
Ｇｌｙ ＧＧＡ ５２５．００ １０．８８ ０．１４
Ｇｌｙ ＧＧＴ ４４１．００ ９．１４ ０．１２
Ｇｌｙ ＧＧＣ １８６７．００ ３８．７０ ０．５０
Ｇｌｕ ＧＡＧ ２４２０．００ ５０．１６ ０．７５
Ｇｌｕ ＧＡＡ ７９２．００ １６．４２ ０．２５
Ａｓｐ ＧＡＴ ５９２．００ １２．２７ ０．２５
Ａｓｐ ＧＡＣ １８２１．００ ３７．７５ ０．７５
Ｖａｌ ＧＴＧ １８６６．００ ３８．６８ ０．６４
Ｖａｌ ＧＴＡ １３４．００ ２．７８ ０．０５
Ｖａｌ ＧＴＴ １９８．００ ４．１０ ０．０７
Ｖａｌ ＧＴＣ ７２８．００ １５．０９ ０．２５
Ａｌａ ＧＣＧ ６５２．００ １３．５１ ０．１７
Ａｌａ ＧＣＡ ４８８．００ １０．１２ ０．１３
Ａｌａ ＧＣＴ ６５４．００ １３．５６ ０．１７
Ａｌａ ＧＣＣ ２０５７．００ ４２．６４ ０．５３
Ａｒｇ ＡＧＧ ５１２．００ １０．６１ ０．１８
Ａｒｇ ＡＧＡ ２９８．００ ６．１８ ０．１０
Ｓｅｒ ＡＧＴ ３５４．００ ７．３４ ０．１０
Ｓｅｒ ＡＧＣ １１７１．００ ２４．２７ ０．３４
Ｌｙｓ ＡＡＧ ２１１７．００ ４３．８８ ０．８２
Ｌｙｓ ＡＡＡ ４７１．００ ９．７６ ０．１８
Ａｓｎ ＡＡＴ ３１４．００ ６．５１ ０．２２
Ａｓｎ ＡＡＣ １１２０．００ ２３．２２ ０．７８
Ｍｅｔ ＡＴＧ １０７７．００ ２２．３２ １．００
Ｉｌｅ ＡＴＡ ８８．００ １．８２ ０．０５
Ｉｌｅ ＡＴＴ ３１５．００ ６．５３ ０．１８
Ｉｌｅ ＡＴＣ １３６９．００ ２８．３８ ０．７７
Ｔｈｒ ＡＣＧ ４０５．００ ８．４０ ０．１５
Ｔｈｒ ＡＣＡ ３７３．００ ７．７３ ０．１４
Ｔｈｒ ＡＣＴ ３５８．００ ７．４２ ０．１４
Ｔｈｒ ＡＣＣ １５０２．００ ３１．１３ ０．５７
Ｔｒｐ ＴＧＧ ６５２．００ １３．５１ １．００
Ｅｎｄ ＴＧＡ １０９．００ ２．２６ ０．５５
Ｃｙｓ ＴＧＴ ３２５．００ ６．７４ ０．３２
Ｃｙｓ ＴＧＣ ７０６．００ １４．６３ ０．６８
Ｅｎｄ ＴＡＧ ４２．００ ０．８７ ０．２１
Ｅｎｄ ＴＡＡ ４６．００ ０．９５ ０．２３
Ｔｙｒ ＴＡＴ ３６０．００ ７．４６ ０．２６
Ｔｙｒ ＴＡＣ １０４２．００ ２１．６０ ０．７４
Ｌｅｕ ＴＴＧ ３１３．００ ６．４９ ０．０６
Ｌｅｕ ＴＴＡ ７６．００ １．５８ ０．０２
Ｐｈｅ ＴＴＴ ３３６．００ ６．９６ ０．２０
Ｐｈｅ ＴＴＣ １３７７．００ ２８．５４ ０．８０
Ｓｅｒ ＴＣＧ ３２５．００ ６．７４ ０．０９
Ｓｅｒ ＴＣＡ １６５．００ ３．４２ ０．０５
Ｓｅｒ ＴＣＴ ４５０．００ ９．３３ ０．１３
Ｓｅｒ ＴＣＣ ９５８．００ １９．８６ ０．２８
Ａｒｇ ＣＧＧ ６１１．００ １２．６７ ０．２１
Ａｒｇ ＣＧＡ １８３．００ ３．７９ ０．０６
Ａｒｇ ＣＧＴ ２１０．００ ４．３５ ０．０７
Ａｒｇ ＣＧＣ １０８６．００ ２２．５１ ０．３７
Ｇｌｎ ＣＡＧ ２０２０．００ ４１．８７ ０．８８
Ｇｌｎ ＣＡＡ ２８３．００ ５．８７ ０．１２
Ｈｉｓ ＣＡＴ ２３４．００ ４．８５ ０．２１
Ｈｉｓ ＣＡＣ ８７０．００ １８．０３ ０．７９
Ｌｅｕ ＣＴＧ ２８８４．００ ５９．７８ ０．５８
Ｌｅｕ ＣＴＡ １６６．００ ３．４４ ０．０３
Ｌｅｕ ＣＴＴ ２３８．００ ４．９３ ０．０５
Ｌｅｕ ＣＴＣ １２７６．００ ２６．４５ ０．２６
Ｐｒｏ ＣＣＧ ４８２．００ ９．９９ ０．１７
Ｐｒｏ ＣＣＡ ４５６．００ ９．４５ ０．１６
Ｐｒｏ ＣＣＴ ５６８．００ １１．７７ ０．１９
Ｐｒｏ ＣＣＣ １４１０．００ ２９．２３ ０．４８
【００４１】
本発明のさらに別の態様に従って、本発明の第一の態様のポリヌクレオチド配列の発現を行うことができる発現ベクターであって、特にｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが高度に発現された哺乳動物遺伝子、好ましくは高度に発現されたヒト遺伝子に典型的である発現ベクターが提供される。ベクターはバクテリア、昆虫または哺乳動物の細胞、特にヒトの細胞においてヘテロローガスなＤＮＡの発現を行うのに好適である。一具体例において、発現ベクターはｐ７３１３である（図１参照）。
さらに別の態様において、本発明は、ＨＩＶ感染症、これに関連する任意の症状または疾患を治療または予防する方法であって、安全かつ有効な量の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
医薬組成物の投与は、１または１以上の個々の投与形態、例えば同じＤＮＡプラスミドの繰り返し量として、またはヘテロローガスな「プライムブースト」ワクチン接種レジメにおいて、特に治療用ワクチン接種レジメの形態をとることができる。ヘテロローガスなプライムブーストレジメは、プライムおよびブーストにおける異なる形態のワクチンの投与を使用し、そのそれぞれはそれ自体が２回以上の投与を含む。必ずしもそうでなくてよいが、好ましくは、プライミングおよびブースティング組成物は同じ抗原または同じ抗原の異なる形態を含む。プライミング組成物およびブースティング組成物は、いずれにしても少なくとも１つの抗原を共通に有するが、これは必ずしも同じ抗原の形態である必要はなく、同じ抗原の異なる形態であってもよい。同じ抗原の異なる形態の一例は、機能的シグナル配列が欠失し、哺乳動物細胞において実質的にグリコシル化されていないｇｐ１２０をコード化するポリヌクレオチド、およびそのシグナル配列を有するｇｐ１２０であり、グリコシル化されているポリペプチドの場合である。同じタンパク質の完全長および切形バージョン、または同じタンパク質の突然変異および非突然変異形態も、本発明のプライム−ブーストフォーマットの目的に関して同じ抗原の異なる形態と見なすことができる。
【００４３】
プライム−ブーストレジメの一例において、「プライム」ワクチン接種は、好ましくはプラスミドベクター中に組み入れられた、本発明のポリヌクレオチドまたは一組のポリヌクレオチドを含むプライミング組成物の粒子媒介ＤＮＡ送達によることができ、一方、「ブースト」投与は、同じポリヌクレオチド配列またはプライミング組成物によりコード化される同じ抗原の少なくとも１つをコード化するポリヌクレオチド配列を含む組み換えウイルスベクターを含むブースティング組成物のものであってもよい。あるいは、ブースティングは、アジュバント中タンパク質の形態において同じ抗原の少なくとも１つを用いて行うことができる。反対に、プライミングは、ウイルスベクターを含むプライミング組成物またはタンパク質処方、典型的にはアジュバント中に処方されたタンパク質を用いて行うことができ、ブーストは本発明のＤＮＡワクチンを用いて行うことができる。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドに関して用いられる好ましいプライム−ブーストフォーマットは次のものから選択される：
いる使用のための優先の主要なブーストのフォーマットが本発明によれば選択される：
タンパク質プライム／生ベクターブースト
生ベクタープライム／タンパク質ブースト
タンパク質プライム／ＤＮＡプラスミドブースト
ＤＮＡプラスミドプライム／タンパク質ブースト
生ベクタープライム／ＤＮＡプラスミドブースト
ＤＮＡプラスミドプライム／生ベクターブースト
【００４５】
好ましい生ベクターは、生ウイルスベクター、特に本明細書に記載するようなアデノウイルスベクターを包含する。
好ましくは、プライミングおよびブースティング組成物は、抗原に加えて、特定の組成物によっては異なっていてもよい適当なアジュバントを含む。
プライミング組成物およびブースティング組成物はどちらも１以上の用量で送達することができる。さらに、初回プライミングおよびブースティング用量に引き続いてさらなる投与を行い、これを交互に行って、その結果、例えば、ＤＮＡプラスミドプライム／タンパク質ブースト／さらなるＤＮＡプラスミド用量／さらなるタンパク質用量となる。
本発明はさらに、本明細書に記載するようなポリヌクレオチドの産生法であって、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープ分子、好ましくはｇｐ１２０またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化するヌクレオチド配列と、所望により追加のＨＩＶタンパク質、例えばＴａｔなどのＨＩＶ非構造タンパク質またはＧａｇなどのＨＩＶカプシドタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列とをヘテロローガスなプロモーター配列と結合させることを含む方法を提供する。
【００４６】
前記のように、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。このような発現ベクターは、分子生物学の分野において日常的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適当な開始剤、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えば、タンパク質発現を可能にするために必要である可能性があり、正しい方向に配置されたポリアデニル化シグナルの使用を含む。他の適当なベクターおよびこれの構築法は当業者には明らかである。この点に関するさらなる例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクター中で本発明において使用するためのポリヌクレオチドは宿主細胞によるコーディング配列の発現を提供することができる調節配列と操作可能に結合している。すなわち、ベクターは発現ベクターである。「操作可能に結合」なる用語は、記載される成分が、それらが意図される方法で機能することを許容する関係にある並置を意味する。コーディング配列と「操作可能に結合」した調節配列、例えばプロモーターは、コーディング配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるような位置にある。
【００４７】
本発明の核酸配列は、遺伝子治療において有用な専門的なデリバリーベクターにより投与することができる。遺伝子治療法は、例えば、Ｖｅｒｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７、３８９：２３９−２４２により論議されている。ウイルスおよび非ウイルスベクター系のいずれも使用できる。ベクターは、例えば、プラスミド、人工染色体（例えばＢＡＣ，ＰＡＣ、ＹＡＣ）、複製の起源を備えたウイルスまたはファージベクター、所望によりポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび所望によりプロモーターのレギュレーターであってもよい。ベクターは１以上の選択マーカー遺伝子、例えば、バクテリアプラスミドの場合においてはアンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子あるいは真菌ベクターの耐性遺伝子を含有することができる。ベクターは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの産生のためにインビトロで使用できるか、またはベクターによりコード化されるタンパク質の産生に関しては宿主細胞、例えば哺乳動物細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用できる。ベクターはまた、例えばＤＮＡワクチン接種法または遺伝子治療法において、インビトロで使用するために適用することもできる。
適当なウイルスベクターの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスを含む）、アルファ−ウイルス、水痘ウイルス、例えばカナリア痘およびワクシニアウイルス系を包含する。これらのウイルスを使用する遺伝子導入技術は当業者には周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定に組み入れるためにレトロウイルスベクターを使用できるが、このような組み換えは好ましくない。複製−欠失アデノウイルスベクターは対照的にエピソームであり、従って一過性発現を許容する。例えばサブユニットワクチンとしてまたはイムノアッセイにおいて使用するための、本発明のポリヌクレオチドによりコード化される多量のＨＩＶタンパク質を産生するために、昆虫細胞（例えばバクロウイルスベクター）、ヒト細胞、酵母またはバクテリアにおける発現を行うことができるベクターを用いることができる。
【００４８】
好ましい具体例において、生ベクターとして用いられるアデノウイルスは複製欠失類人猿アデノウイルスである。典型的には、これらのウイルスはＥ１欠失を含み、Ｅ１遺伝子で形質転換された細胞系上で増殖させることができる。好ましい類人猿アデノウイルスは、チンパンジーから単離されたウイルスである。特に、Ｃ６８（Ｐａｎ９としても知られる）（米国特許第６０８３７１６号参照）およびＰａｎ５、６およびＰａｎ７（ＷＯ０３／０４６１２４）が本発明における使用に好ましい。従って、これらのベクターは本発明のヘテロローガスな遺伝子を挿入して、遺伝子産物が発現されるように操作することができる。このような組み換えアデノウイルスの使用、処方および製造は、ＷＯ０３／０４６１４２において詳細に記載されている。
【００４９】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、それに対して発現がデザインされる宿主細胞と適合するように選択することができる。例えば、哺乳動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属に反応して誘発することができるメタロチオネインプロモーター、およびβ−アクチンプロモーターを包含する。ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）も使用できる。これらのプロモーターは全てよく記載され、当該分野において容易に入手可能である。
好ましいプロモーターエレメントは、イントロンＡが欠損しているが、エクソン１を含むＣＭＶ前初期プロモーターである。従って、ＨＣＭＶ ＩＥ初期プロモーターの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。適当なＨＣＭＶ ＩＥプロモーターはＷＯ０２／３６７９２に記載されている。
【００５０】
非ウイルスベースの系は、核酸、微小球カプセル化技術、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）およびリポソームベースの系の直接投与を包含する。
本発明のポリヌクレオチドはコード化されたタンパク質の発現による産生において有用性を有し、発現はインビトロ、インビボまたはエクスビボで行うことができる。従って、ヌクレオチドは、例えば収率を増大させるために組み換えタンパク質合成に関与することができるか、または実際それ自体が治療薬として有用であり、ＤＮＡワクチン接種技術において用いられる。本発明のポリヌクレオチドがインビトロまたはエクスビボでコード化されたタンパク質の産生において用いられる場合、例えば細胞培養物における細胞は発現されるポリヌクレオチドを含むように修飾される。このような細胞は一過性、または好ましくは安定な哺乳動物細胞系を包含する。本発明のポリペプチドをコード化するベクターの挿入により修飾することができる細胞の特定の例は、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３およびＣＯＳ細胞を包含する。好ましくは、選択される細胞系は安定なものである。発現は形質転換された卵母細胞において達成することができる。ポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞において本発明のポリヌクレオチドから発現することができる。本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
本発明はさらに、哺乳動物患者にワクチン接種する方法であって、有効量の本発明のワクチンまたはワクチン組成物を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡワクチン、ワクチン組成物および免疫療法において用いられる発現ベクターはプラスミドベクターまたは生ウイルスベクターである。
ＤＮＡワクチンは、「裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ」の形態、例えばシリンジまたは高圧ジェットを用いて投与される液体処方において、またはリポソームまたは刺激トランスフェクションエンハンサーとともに処方されたＤＮＡ、または本明細書においてさらに詳細に記載するような粒子性ＤＮＡ送達（ＰＭＤＤまたは粒子性免疫治療送達ＰＭＩＤ）により投与することができる。これらの送達系はすべて当該分野において周知である。ベクターは、例えばウイルスベクター送達システムにより哺乳動物に導入することができる。
【００５２】
本発明の組成物は、例えば筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内または経粘膜などの多くの経路により送達することができる。
本発明はさらに本明細書に記載するような医薬組成物を含む皮内送達装置を提供する。
好ましい具体例において、組成物は皮内送達される。特に、組成物は、特に、ベクターをビーズ（例えば金ビーズ）上にコートし、これを高圧下で表皮中に投与することを含む粒子衝撃投与技術を用いた遺伝子銃により送達される。これは、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４４：３７−４２（１９９６）に記載されている。
【００５３】
粒子衝撃法を行うための多くの方法が知られている。例えばＷＯ９１／０７４８７参照。一例において、ガスで作動する粒子加速は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）により製造されるものなどの装置を用いて達成することができ、その例のいくつかは、米国特許第５，８４６，７９６号；第６，０１０，４７８号；第５，８６５，７９６号；第５，５８４，８０７号；および欧州特許番号０５００７９９に記載されている。この方法は、注射針不要の送達法を提供し、該方法において、ポリヌクレオチドなどの微細粒子の乾燥粉末処方は、携帯型装置により生じるヘリウムガスジェット内で高速に加速され、興味のある標的組織、典型的には皮膚中に粒子を推進させる。粒子は好ましくは０．４〜４．０μｍ、さらに好ましくは０．６〜２．０μｍの直径の金ビーズ、およびこれらの上にコートされ、その後送達装置中に入れられるカートリッジまたはカセット中に入れられるＤＮＡ接合体である。
【００５４】
関連する具体例において、本発明の組成物のガスで作動するニードルレス注入に有用である他の装置および方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）により提供されるものを包含し、その例のいくつかは、米国特許第４，７９０，８２４号；第５，０６４，４１３号；第５，３１２，３３５号；第５，３８３，８５１号；第５，３９９，１６３号；第５，５２０，６３９号および第５，９９３，４１２号に記載されている。
抗原ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むベクターは、予防的または治療的に有効であるような量において投与される。投与される量は一般に、粒子性送達については１ピコグラムから１ミリグラム、好ましくは１ピコグラムから１０マイクログラムの範囲であり、他の経路については１００ナノグラムから１０ミリグラムの範囲（ヌクレオチド／用量）である。正確な量は免疫化される患者の体重および投与経路によってかなり変化し得る。
【００５５】
抗原ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む免疫原成分を単発で投与するか、または例えば１〜７回の間、好ましくは１〜４回の間、約１日〜約１８日の間の間隔で繰り返し投与することが可能である。患者の一生涯免疫反応を維持するために必要ならばさらなる投与を行うこともできる。しかしながら、この治療形態は、関連する患者の大きさ、投与されるヌクレオチド配列の量、投与経路、および熟練した医師には自明であろう他の要因によって著しく変わるであろう。患者は１以上の他の抗ＨＩＶレトロウイルス薬を全体的な治療レジメの一部として受けることができる。さらに、核酸免疫源をアジュバントと共に投与することができる。
本明細書において指定されるアジュバント成分を、例えば、経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、皮内または局所経路などの様々な異なる投与経路により同様に投与することができる。好ましくは、アジュバント成分は、皮内または局所経路、最も好ましくは局所経路により投与される。この投与はヌクレオチド配列の投与前約１４日から投与後約１４日の間、好ましくはヌクレオチド配列の投与前約１日から投与後約３の間で行うことができる。
【００５６】
アジュバント成分は、一具体例において、ヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に投与される。「実質的に同時」とは、アジュバント成分の投与が好ましくはヌクレオチドの投与と同時であるか、またはもしそうでなければ、ヌクレオチド配列投与の前後何れかの少なくとも数時間以内であることを意味する。最も好ましい治療プロトコルにおいて、アジュバント成分はヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に投与される。明らかに、このプロトコルは必要に応じて、前記の種類の変数にしたがって変化し得る。アジュバントは１Ｈ−イミダゾ［４，５ｃ］キノリン−４−アミン誘導体、例えばイミキモドであるのが好ましい。典型的には、イミキモドは局所クリーム処方として提供され、前記プロトコルにしたがって投与される。
【００５７】
ここでも、このような変数によって、誘導体の投与量も変化するが、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、ここにおいて「／ｋｇ」とは関連する哺乳動物の体重を意味する。１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体の投与は、それぞれの後にまたは追加のヌクレオチド配列投与を伴って繰り返される。最も好ましくは、投与量は約１ｍ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間である。本明細書に記載するような「プライム−ブースト」スキームの場合において、イミキモドまたは他の１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体をプライムまたはブーストの何れかまたはプライムとブーストの両方で投与することができる。
【００５８】
アジュバント成分が未処理の化学状態で投与される１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体のみを含むことができる場合、投与は医薬処方の形態であるのが好ましい。すなわち、アジュバント成分は好ましくは１以上の医薬的に許容される担体、および所望により他の治療成分との組み合わせで１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む。担体は処方内の他の成分と適合性であり、その受容者に対して有害でないという意味で「許容され」なければならない。処方の性質は意図される投与経路に従って当然変わり、製薬分野において周知の方法により調製することができる。全ての方法は、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を適当な担体と結合させる工程を含む。一般に、処方は、誘導体を液体担体または微粉化された固体担体または両者と均一かつ密接に結合させ、次いで必要ならば所望の処方に生成物を成形することにより調製される。経口投与に好適な本発明の処方は、それぞれがあらかじめ決められた量の活性成分を含有するカプセル、カシェ剤または錠剤などの個別の単位として；粉末または顆粒として；水性液体または非水性液体中溶液または懸濁液として；または水中油液体エマルジョンまたは油中水エマルジョンとして提供することができる。活性成分はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提供することもできる。
【００５９】
錠剤は所望により１以上の補助成分と共に圧縮または成形することにより調製できる。圧縮錠剤は、適当な機械で、所望によりバインダー、滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤または分散剤と混合した粉末または顆粒などの易流動性形態において活性成分を圧縮することにより調製できる。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を適当な機械で成形することにより製造できる。
錠剤は所望によりコートするかまたはスコアリングすることができ、活性成分の遅延または制御放出を提供できるように処方できる。
【００６０】
例えば、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下投与経路による注射用処方は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および意図される受容者の血液と等張な処方にする溶質を含有する水性および非水性無菌注射液；および懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液を含む。処方は、１回量または複数回量容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中で提示することができ、使用直前に、無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態において貯蔵することができる。即席の注射溶液および懸濁液は、既に記載したような種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。口腔または鼻腔を経由した肺投与に適した処方は、活性成分を含有し、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子が受容者の気管支樹中に送達されるように提示される。かかる処方は、好都合には、吸入装置において使用するための、適当には例えばゼラチンなどの穿孔可能なカプセルにおいて、あるいは活性成分、適当な液体プロペラントおよび所望により他の成分、例えば界面活性剤および／または固体希釈剤を含む自己推進性処方としてのいずれかで提示できる微粉砕された粉末の形態であり得る。活性成分が溶液または懸濁液の液滴の形態中に分配されている自己推進処方も用いることができる。自己推進性処方は当該分野において公知のものと類似であり、確立された手順により調製することができる。これらは適当には所望の噴霧特性を有する手動で作動可能かまたは自動的に機能するバルブの何れかを備え；有利には該バルブはそのそれぞれの操作により例えば５０〜１００μＬの一定体積を送達する定量タイプのものである。
【００６１】
さらなる可能性において、アジュバント成分は、アトマイザーまたはネブライザーにおいて用いられる溶液の形態であり、これにより気流または超音波撹拌を用いて、吸入用の微細液滴のミストが生じる。
鼻内投与に適した処方は、一般に肺投与について既に記載したものと類似した形態を包含するが、鼻腔内での停留を可能にするためには、このような処方は約１０〜約２００ミクロンの範囲の粒子直径を有するのが好ましい。これは、必要に応じて、適当な粒子サイズの粉末を使用するか、または適当なバルブを選択することにより達成できる。他の適当な処方は、鼻に近づけて保持された容器から鼻道を通って迅速に吸入することによる投与については、約２０〜約５００ミクロンの範囲の粒子直径を有する粗粉末、および水性または油性溶液中約０．２〜５重量％の活性成分を含む点鼻薬を包含する。本発明の一具体例において、抗原性ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むベクターを１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体と同じ処方内で投与することが可能である。従って、この具体例において、免疫原性およびアジュバント成分は同じ処方内で見いだされる。
【００６２】
一具体例において、アジュバント成分は、バイオリスティック投与に好適な形態において調製され、ヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に該経路により投与される。この方法での使用に適した処方の調製について、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を凍結乾燥し、例えばバイオリスティック投与に適した金ビーズなどの粒子上に付着させることが必要とされる。
別の具体例において、アジュバント成分は乾燥粉末として、高圧ガス推進により投与することができる。
一緒に処方されないとしても、アジュバント成分をヌクレオチド配列と同じ投与部位またはその付近に投与することが適当である。
製剤の他の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｙｓｙｌｖａｎｉａ（１９８５）において見いだすことができる（この開示は全体として本発明の一部として参照される）。
【００６３】
裸のポリヌクレオチドまたはベクターを患者に導入するための適当な技術はまた、適当なビヒクルを用いた局所適用を包含する。核酸は皮膚に、または粘膜表面に、例えば鼻内、経口、膣内または直腸内投与により局所投与することができる。裸のポリヌクレオチドまたはベクターは、医薬的に許容される賦形剤、例えばリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）とともに存在し得る。ＤＮＡ取込みは、促進剤、例えばブピバカインをＤＮＡ処方と別にまたはＤＮＡ処方中に含めてのいずれかで使用することによりさらに促進することができる。核酸を直接受容者に投与する他の方法は、超音波、電気刺激、エレクトロポレーションおよび米国特許第５，６９７，９０１号に記載されているマイクロシーディングを包含する。
核酸構築物の取込みは、いくつかの公知トランスフェクション技術、例えばトランスフェクション剤の使用を含むものにより向上させることができる。これらの薬剤の例としては、カチオン剤、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランおよびリポフェクタント、例えばリポフェクタムおよびトランスフェクタムが挙げられる。投与される核酸の用量は変更することができる。
【００６４】
本発明の核酸配列はまた、遺伝子治療において有用な専門のデリバリーベクターにより投与することもできる。遺伝子治療法は、例えば、Ｖｅｒｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７、３８９：２３９−２４２により論じられる。ウイルスおよび非ウイルスベクター系の両方とも使用でき、前記のとおりである。ウイルスおよび非ウイルス送達系は、初回ワクチン接種後にブースター注射を提供することが望ましい場合に組み合わせることができる。例えば、プラスミドなどの非ウイルスベクターを用いて初回「プライム」ＤＮＡワクチン接種をし、続いてウイルスベクターまたは非ウイルスベースの系を用いて１回以上「ブースト」ワクチン接種を行う。同様に、本発明は、本発明のポリヌクレオチドでのプライムブースト系と、それに続いてアジュバント中タンパク質を追加抗原投与すること、またはその逆を意図する。
【００６５】
本発明の核酸配列は形質転換された細胞によっても投与することができる。このような細胞は、対象から収穫される細胞を包含する。本発明の裸のポリヌクレオチドまたはベクターをインビトロでこのような細胞中に導入することができ、形質転換された細胞を後に対象に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドはホモローガスな組み換え事象により細胞中に既に存在する核酸中に組み入れることができる。形質転換された細胞は、所望により、インビトロで成長させることができ、１以上の結果として得られる細胞を本発明において使用できる。細胞を公知の外科または顕微鏡手術技術（例えば、グラフティング、微量注射など）により患者における適当な部位に提供することができる。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、前記のようなアジュバント化合物、またはＤＮＡによりコード化されるタンパク質により誘発される免疫反応を増大させる働きをする他の物質を含むことができる。これらは、抗原と別にあるいは抗原との融合物としてのいずれかでＤＮＡによりコード化することができるか、または処方の非ＤＮＡエレメントとして含めることができる。本発明の処方中に含めることができるアジュバントタイプの物質の例としては、ユビキチン、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、ＦＬＴ３−リガンド（プロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞の生成において重要なサイトカイン）および他のサイトカイン、例えばＩＦＮ−γおよびＧＭＣＳＦが挙げられる。他の好ましいアジュバントとしては、イミキモドおよびレスイミキモドおよびツカラソールが挙げられ、イミキモドが特に好ましい。
【００６７】
本発明の特定の具体例において、イミキモドと共に投与される、ＨＩＶ感染症の治療または予防のための本明細書に記載されている核酸分子の使用が提供される。イミキモドは好ましくは局所投与されるが、核酸分子は粒子性送達により投与されるのが好ましい。
従って、本発明はさらにＨＩＶ感染症にかかっている患者またはかかりやすい患者の治療法であって、本明細書に記載するような核酸分子およびイミキモドを投与することを含む方法も提供する。
【００６８】
本発明を以下の実施例を用いて説明する：
実施例１
プラスミド構築
１ ｇｐ１２０含有プラスミドの構築
以下の実施例において記載されている組み換えｇｐ１２０糖タンパク質は、ＨＩＶ−１単離株Ｗ６１Ｄのｇｐ１２０エンベロープタンパク質の合成形態である。
最適化コドン（ｐｇｐ１２０ｃ）
遺伝子配列はＨＩＶ−１単離株Ｗ６１Ｄからのｇｐ１２０配列に基づくものであった。これは、０．２９７のコドン使用係数を有する。最適化はＳｙｎＧｅｎｅ２ｄを用いて行われ、その結果、０．７４９のＣＵＣが得られた（Ｅｒｔｌ、ＰＦ．、Ｔｈｏｍｓｅｎ、ＬＬ．核酸ワクチンの構築における技術的問題（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．）（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ３１（３）；１９９−２０６）。ＳｙｎＧｅｎｅは使用の相対頻度に基づくコドン最適化のための数学的方法を使用する。簡単に言うと、コドンは、より頻度の高いコドンがより広い範囲を有するように、その頻度に従って割り当てられた値の範囲であり、頻度の昇順に並べられる。値の範囲は、＞＝０．０００、＞＝０．０？？、＞＝０．？？？などとして表される。０から０．９９９９９の間に乱数が生じる。次いでコドンを選択するためにこれを使用し、これは乱数がその中に収まるような範囲を割り当てられたコドンであろう。希少コドンを排除するために、０．１−１．０９９９９の範囲に収まるように、値０．１を乱数に加える。
ｇｐ１２０配列は４０の重複オリゴヌクレオチドに開裂され、ＰＣＲ構築され、エンドプライマーを用いて回収される。遺伝子をＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてベクターｐ７３１３−ｉｅ（図１に示す）中にクローンし、配列化させる。３つの当初のクローンからの制限フラグメントを組み合わせて、単一の適当なクローンを得た。アミノ酸配列およびコドン最適化ＤＮＡ配列を図２に示す。
【００６９】
１．２ Ｎｅｆ／Ｔａｔ含有プラスミドの生成
Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｐＮＴｍおよびｐｔｒＮＴｍ）
Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合タンパク質の遺伝子がプラスミドｐＲＩＴ１５２４４（図３）において供給された。プラスミドｐＲＩＴ１５２４４はＨｉｓテイルが欠失している以外は以下に記載するｐＲＩＴ１４９１３と同じである。
【００７０】
総論
Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離株からのＮｅｆ遺伝子（Ｃｅｌｌ ４０：９−１７、１９８５）はコンセンサスＮｅｆに最も密接に関連するものに含まれるので、これを構築物に関して選択した。
Ｂｒｕ／Ｌａｉ Ｎｅｆ遺伝子の出発物質は、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３上でクローンされた１１７０ｂｐのＤＮＡフラグメント（ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆ）であった。
Ｔａｔ遺伝子はＢＨ１０分子クローンに由来する。この遺伝子はｐＣＶ１と称し、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９、ｐ６９−７３、１９８５に記載されているＨＴＬＶ ＩＩＩ ｃＤＮＡクローンとして受容される。このＴａｔ遺伝子は、活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）およびＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→ＬｙｓおよびＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）において突然変異を有する（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：４８−６４、１９９７）。
突然変異ｔａｔ遺伝子は、ＣＭＶ発現プラスミド（ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥ）内のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間でサブクローンされたｃＤＮＡフラグメントとして受容された。
【００７１】
ベクターｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質をコード化する）の構築
ｎｅｆ遺伝子はプライマー０１および０２でｐｃＤＮＡ３／ＮｅｆプラスミドからＰＣＲにより増幅された。
ＮｃｏＩ
プライマー０１：５’ＡＴＣＧＴＣＣＡＴＧ．ＧＧＴ．ＧＧＣ．ＡＡＧ．ＴＧＧ．Ｔ３［配列番号１］
ＳｐｅＩ
プライマー０２：５’ＣＧＧＣＴＡＣＴＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡ３［配列番号２ ］された
【００７２】
組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターＰＨＩＬ−Ｄ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用した。このベクターはヘテロローガスなタンパク質の発現が、ＡＯＸ１遺伝子の本来のＡＴＧコドンの直後で始まり、１つのグリシンおよび６つのヒスチジン残基のテールを有する組み換えタンパク質を産生するように修飾された。ＰＨＩＬＥ−Ｄ２ベクターの隣接するＡｓｕＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位間にオリゴヌクレオチドリンカーをクローンすることにより、このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを構築した。Ｈｉｓテールに加えて、このリンカーはｎｅｆ、ｔａｔおよびｎｅｆ−ｔａｔ融合物がその間に挿入されたＮｃｏＩ、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を有する。
得られたｎｅｆＰＣＲフラグメントおよび組み込みＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターはどちらもＮｃｏＩおよびＳｐｅＩによって制限され、アガロースゲル上で精製され、結紮されて、組み込みプラスミドｐＲＩＴ１４５９７を形成する。
【００７３】
ベクターｐＲＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異体−Ｈｉｓをコード化する）の構築
ｐＲＩＴ１４９１３を構築するために、プライマー０３および０４でｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドからＰＣＲによりｔａｔ突然変異遺伝子を増幅した。
ＳｐｅＩ
プライマー０３：５’ＡＴＣＧＴＡＣＴＡＧＴ．ＧＡＧ．ＣＣＡ．ＧＴＡ．ＧＡＴ．３［配列番号３］
ＳｐｅＩ
プライマー０４：５’ＣＧＧＣＴＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴ３’［配列番号４］
得られたＰＣＲフラグメントおよびプラスミドｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）はどちらもＳｐｅＩ制限酵素によって消化され、アガロースゲル上で精製され、結紮されて、組み込みプラスミドｐＲＩＴ１４９１３を形成した。
【００７４】
ｇｐ１２０およびＮｅｆ／ＴａｔのＰＭＩＤベクターの生成
ｇｐ１２０：コドン最適化ｇｐ１２０は前記のようにして提供された。
Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｐＮＴｍおよびｐｔｒＮＴｍ）：
Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合タンパク質の遺伝子は前記のプラスミドｐＲＩＴ１５２４４において提供された。このプラスミドにおけるＴａｔはトランス活性化機能を不活化する３つの突然変異を含有する。融合物は、Ｎ−末端切断により排除される、免疫調節機能を有する完全長Ｎｅｆ（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＢｏｌｔｉｍｏｒｅ（１９９９））を含有する。従って、構築物は完全長Ｎｅｆ／突然変異体Ｔａｔ（ｐＮＴｍ）および切形Ｎｅｆ／突然変異体Ｔａｔ（ｐｔｒＮＴｍ）（Ｎｅｆの最初の６５アミノ酸が除去されている）の両方について生成した。これらの配列を、次のプライマーを使用してｐＲＩＴ１５２４４からＰＣＲ増幅した：
５’Ｎｅｆ ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧ
５’ｔｒＮｅｆ ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＣ
３’Ｔａｔ ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧ［配列番号：５，６，７］
ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅ中にクローンし、配列化した。ＰＮＴｍおよびｐｔｒＮＴｍおよびＮｅｆ／Ｔａｔおよび切断Ｎｅｆ／Ｔａｔ配列を図４および５に示す。
【００７５】
二重発現ベクター：（ｐＲＩＸ１およびｐＲＩＸ２）
Ｎｅｆ／ＴａｔおよびｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ発現カセットをＣｌａＩ−ＸｍｎＩ制限フラグメントとして切除し、コドン最適化ｇｐ１２０（ｐｇｐ１２０ｃ）を含有するベクターのＣｌａＩおよび平滑化されたＳｓｅ８３８７Ｉ部位中に結紮して、両タンパク質の発現のためのシングルプラスミド（それぞれｐＲＩＸ１およびｐＲＩＸ２）を得た。
【００７６】
プラスミドｐ７３１３−ｉｅの組成（図１）
ｐＵＣ１９のＥａｍ１１０５Ｉ−Ｐｓｔ１フラグメントを含有するベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｓ、ＨＰ７ ９ＮＡから入手可能）を、カナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＵＣ４ＫのＥｃｏＲＩフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と置換し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて両フラグメントを平滑末端にすることにより、プラスミドを構築した。ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター／エンハンサー、イントロンＡは、Ｈａｒｒｉｅｔ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ博士（マサチューセッツ大学）から入手し、ＸｈｏＩ−Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＵＣ１９のＳａｌ１部位中に挿入されたプラスミドＪＷ４３０３から誘導され、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを組み入れている。プロモーターからの５’ＳａｌＩ−ＢａｎＩフラグメントの欠失により、ベクターにおいて用いられる最小プロモーターが生じた（ＷＯ００／２３５９２−Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．）。ＨＢＶ表面抗原３’ＵＴＲは、ベクターｐＡＭ６においてＢ型肝炎ウイルス、血清型ａｄｗから誘導された（Ｍｏｒｉａｒｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、２６０６−１０、１９８１）。ｐＡＭ６（ｐＢＲ３２２ベースのベクター）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（カタログ番号ＡＴＣＣ ４５０２０）から入手した。３’ＵＴＲを、ＢａｍＨＩ部位を除去するために挿入のために平滑末端化した１．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントとしてポリアデニル化シグナルに対して５’に挿入した。一連の工程（Ｂｇｌ ＩＩ、クレノウポリメラーゼ処理、ＢｓｔＸ Ｉでの消化、Ｎｃｏ Ｉでの消化、オーバーハングを除去するためのマング・ビーンヌクレアーゼでの処理、およびＢｓｔＸ Ｉでのさらなる消化を含む）において、Ｘ遺伝子プロモーターとｂＧＨｐＡシグナル間の５コドンよりも大きなオープンフィーディングフレームをすべて除去するためにＨＢＶ Ｓ遺伝子の３’未翻訳領域およびｂＧＨｐＡシグナルの間の領域に修飾を施した。この結果、Ｘタンパク質の翻訳可能な部分（９アミノ酸）をコード化する配列およびＸ遺伝子開始コドンが欠失した。ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを、ウサギベータグロブリンポリアデニル化シグナルと置換した。Ｓ抗原の５’非コーディングおよびコーディング配列を切除し、オリゴヌクレオチドリンカーと置換すると、図示するような複数のクローニング部位が提供され、プラスミドｐ７３１３−ＰＬが産生された。
Ｈｉｎｄ−−−ＮｏｔＩ―― ＥｃｏＲＶ− −ＮｄｅＩ− −ＢａｍＨＩ
ＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣ ・・・
．．． ＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＧＧＣＣＧＧ
−ＮｈｅＩ− −ＫｐｎＩ− −ＳａｌＩ− ΔＮｏｔＩ
［配列番号：８］
【００７７】
このポリリンカーはＫｐｎＩおよびＳａｌＩ部位間の追加のオリゴヌクレオチドリンカーの挿入によってさらに伸長された：
ＡｓｐＩ− −ＭｕｎＩ− ＮａｅＩ− ＮｄｅＩ−− ＢｇｌＩＩ−
ＧＴＡＣＣＧＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧ−−−−
ＧＣＣＡＧＴＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴ
ＡｇｅＩ− −ＮａｒＩ―― ＡａｔＩＩ− ＳａｌＩ
［配列番号９］
【００７８】
ＣｏｌＥ１ ｃｅｒ配列を、Ｄａｖｉｄ Ｈｏｄｇｅｓｏｎ（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得たプラスミドｐＤＡＨ２１２からのサブクローンから得、プライマーを用いてＰＣＲにより増幅して、配列の末端にＥｃｏＲＩ制限部位を配置した。ｃｅｒ配列は次いでｐ７３１３−ＰＬのＥｃｏＲＩ部位中に挿入されて、プラスミドｐ７３１３−ＰＬｃを生じる。増幅されたｃｅｒの配列をＧｅｎｂａｎｋエントリーＭ１１４１１に対して検証した。
プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間のＨＢＶ ３’ＵＴＲ配列を、プライマー：
センス：ＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣ［配列番号１０］
アンチセンス：ＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣ［配列番号１１］
を用いてポリアデニル化シグナルのＰＣＲ増幅により除去した。
結果として得られる生成物を、ＢａｍＨＩおよびＸｍｎＩで切断し、ポリアデニル化シグナルおよび３’ＵＴＲの両方を含有する対応するフラグメントを置換するために使用した。
プライマー：
センス：ＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣ［配列番号１２］
アンチセンス：ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＴＴＧＧＣＡＣＧＧＧＧ［配列番号１３］
を用いたＣＭＶプロモーター／エンハンサーのＰＣＲ増幅により、イントロンＡ配列をプラスミドから除去した。
結果として得られる生成物をＳｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩで切断し、親ベクターのＳｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩ部位中に挿入した。
【００７９】
実施例２
ｇｐ１２０およびＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍｕｔ）発現ベクターの修飾
ｇｐ１２０構築物を修飾して、タンパク質の分泌を減少させた。
構築物の生成：
分泌シグナルがないｇｐ１２０（ｄｓｇｐ１２０、ｐＲｉｘ１２ 図２および６参照）
次のプライマーを使用してｇｐ１２０遺伝子をｐｇｐ１２０ｃからＰＣＲ増幅した：
５’１２０ｄｓ：５’ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣ［配列番号１４］
Ｌ０１：５’ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＧ［配列番号：１５］
ＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）およびサイクル：
９５℃（３０秒）９５℃（３０秒）５０℃（３０秒）７２℃（９０秒）７２℃（１２０秒）４℃（保持） ＼＿＿＿＿ ２０回繰り返し＿＿＿＿／
を使用してフラグメントを増幅した。
生成物をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐ７３１７中にクローンして、ｐＲｉｘ１２を得た（図６）。
結果
２９３Ｔ細胞において、分泌シグナルが欠失したベクターｐＲＩＸ１２は、良好な量の分泌されない６０ｋＤａの非グリコシル化タンパク質を形成する。
【００８０】
実施例３
シングルプラスミドからのｇｐ１２０およびＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍｕｔ）の発現のためのベクターの構築
ベクター構築：
ｐｇ１２０およびＮｅｒ／Ｔａｔ（ｍ）またはｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）ｏｒｆｓをステッチするＰＣＲにより、ｇｐ１２０Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）構築物を得た。
５’および３’Ｇｐ１２０、５’および３’Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）および５’ｔｒＮｅｆ／ＴａｔをｐＲｉｘ１から増幅した。３’ｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）をｐＮＴｍから増幅した。次のプライマーを使用した：
３’１２０：（アンチセンス）：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡ［配列番号１６］
５’１２０／ＮＴ：
ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴ［配列番号１７］
３’ＮＴ（アンチセンス）：ＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡ［配列番号１８］
５’ＮＴ／１２０：
ＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡＧ［配列番号１９］
５’１２０／ｔｒＮ：
ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣ［配列番号２０］
５’ｔｒＮｅｆ：
ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＣ ［配列番号２１］
Ｌ０１：
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＧ［配列番号：２２］
Ｌ０２：
ＡＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣ［配列番号２３］
【００８１】
フラグメントを、ＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）およびサイクル：
９５℃（６０秒）９５℃（３０秒）５５℃（３０秒）７２℃（１２０秒）７２℃（１２０秒）４℃（保持） ＼＿＿＿＿ ２０回繰り返し＿＿＿＿／
を使用して増幅した。
プライマーＬ１を３’ｇｐ１２０の３’プライマーとして使用した。しかしながら、Ｎｅｆ／ＴａｔまたはｔｒＮｅｆ／Ｔをｇｐ１２０の５’末端とステッチする場合にこのプライマーを使用すると問題があったので、プライマーＬ２を代わりに使用した。
ステッチされたｇｐ１２０−Ｎ／Ｔｍおよびｇｐ１２０−ｔｒＮ／ＴｍフラグメントをＮｏｔ１およびＢａｍＨＩで切断し、同様に切断されたｐ７３１３−ｉｅ中にクローンした。Ｌ１ではなくプライマーＬ２を使用することにより、Ｎ／Ｔｍ−ｇｐ１２０およびｔｒＮ／Ｔｍ−ｇｐ１２０フラグメントはＢａｍＨＩ部位が欠失するので、これらをＮｏｔＩおよびＡｃｃＩで切断し、同様に切断されたｐｇｐ１２０ｃ中にクローンした。すべての挿入物をシーケンシングにより完全に検証した。プラスミドはｐＲｉｘ６（ｇｐ１２０ｃ ＮｅｆＴａｔｍ）およびｐＲｉｘ１１（ｇｐ１２０ｃ ｔｒＮｅｆＴａｔｍ）で表される。
【００８２】
実施例４
グリコシル化および分泌、Ｔａｔの包含およびＧａｇ（ｐ１７／２４）およびＮｅｆおよびＲＴの包含のｇｐ１２０およびｇｐ１２０融合物に対する影響を調査するためのベクターの構築
図２９および３０（概略図）に示すようにベクターを構築した。
ｐＲｉｘ２８およびｐＲｉｘ２９（図７および８）
ｐＲｉｘ６（２３１５ｂｐ）およびｐＲｉｘ１１（２１２３ｂｐ）からのＡｃｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを同様に切断されたＲｉｘ１２（ｄｓ ｇｐ１２０ｃ）中に移すことにより、ｄｓ ｇｐ１２０ｃ ＮｅｆＴａｔｍおよびｄｓ ｇｐ１２０ｃ ｔｒＮｅｆＴａｔを含有するｐＲｉｘ２８および２９が生成した。
ｐＲｉｘ３０およびｐＲｉｘ３１（図９）
Ｔａｔがないｇｐ１２０ｃ Ｎｅｆのグリコシル化および非グリコシル化融合ベクターを生成するために、ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＲｉｘ１１（１５８０ｂｐ）またはｐＲｉｘ２９（１４９６ｂｐ）から同様に切断されたｐＲｉｘ１５、Ｔａｔ／ｔｒＮｅｆを含有するベクター中に移した。
【００８３】
（ｐＲｉｘ１５）−Ｔａｔ（ｍｕｔ）ｔｒＮｅｆ
ＴａｔおよびｔｒＮｅｆの遺伝子は次のプライマーを使用してｐＮＴｍからＰＣＲ増幅された：
５’Ｔａｔ：５’ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣ［配列番号２４］
３’Ｔａｔ：’ＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＣ［配列番号２５］
５’ｔｒＴＮ：ＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣ［配列番号２６］
３’Ｎｅｆ：ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ［配列番号２７］
個々の遺伝子をゲル精製し、次いでエンドプライマーを使用してＴｍｔｒＮを得るためにＰＣＲステッチした。融合物を次いでＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐ７３１３−ｉｅ中にクローンした。
【００８４】
ｐＲｉｘ３２
ｐ１７／２４を含有する融合物を生成するために、プライマーＵ１および３’１２０を用いてｐｇｐ１２０ｃからｇｐ１２０をＰＣＲ増幅し、プライマー５’１２０Ｇおよび３’Ｎｅｆを使用してｐ７３ｉ−ＧＮ２からｐ１７／２４−Ｎｅｆを増幅し、Ｕ１および３’Ｎｅｆを使用して両者をＰＣＲステッチした。ｐ７３Ｉ−ＧＮ２はＨＸＢ２（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＫ０３４５５）に基づくｐ１７／ｐ２４の合成コドン最適化配列を含有し、ＳｙｎＧｅｎｅを使用して設計され、前記のコドン最適化ｇｐ１２０について記載したように重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、プラスミドｐＨＸＢΔＰｒ（Ｂ．Ｍａｓｃｈｅｒａ、Ｅ ＦｕｒｆｉｎｅおよびＥ．Ｄ．Ｂｌａｉｒ １９５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６９ ５４３１−５４３６）からＰＣＲにより得たＨＸＢ２ Ｎｅｆと融合させた。このプラスミドにおけるＨＸＢ２ ｎｅｆ遺伝子は早期終止コドンを含有するので、２つの重複するＰＣＲを使用してコドン（ＴＧＡ［ｓｔｏｐ］からＴＧＧ［Ｔｒｐ］）を修復した。修復されたコドンの位置は配列において下線を施した。ｐ１７／ｐ２４／Ｎｅｆ遺伝子をプラスミドｐ７３１３ｉｅのＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位中に挿入した。コーディング配列およびマップを図１０位示す。＊はｐ２４／ｔｒＮｅｆ接合点を表わす。
【００８５】
プライマー：
Ｕ１：
ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧ［配列番号２８］
３’１２０：ＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣ［配列番号２９］
５’１２０Ｇ：
ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣ［配列番号３０］
３’Ｎｅｆ：ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ［配列番号３１］
初期サイクル：
９４℃（３０秒）２０ｘ［９４℃（３０秒）５０℃（３０秒）６８℃（１８０秒）］６８℃（１２０秒）４℃（０秒）
ｐｆｘポリメラーゼと１×エンハンサーを使用。
ステッチ：
９４℃（３０秒）２０ｘ［９４℃（３０秒）５０℃（３０秒）７２℃（１８０秒）］７２℃（１２０秒）４℃（０秒）
標準条件においてＶｅｎｔポリメラーゼ＋２ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用。
【００８６】
生成物をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐ７３１３−ｉ３中にクローンした。
配列化すると、構築物はシグナルペプチドにおいて誤差を有することが見いだされ、これはｇｐ１２０の後部からＮｅｆの前部までを含有する２５６０ｂｐ ＢｓｔＥＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＲｉｘ３０中に移すことにより修正された。
ｐＲｉｘ３３（図１１）、ｐＲｉｘ３４およびｐＲｉｘ３５（図１２）
Ｎｅｆの後部からＮｅｆの前部までを含有する２５６０ｂｐのＢｓｔＥＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＲｉｘ３１、ｐＲｉｘ１１およびｐＲｉｘ２９に移して、それぞれベクターｐＲｉｘ３３（図１１）、３４および３５（図１２）を形成した。
ｐＲｉｘ３９（最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４ｇａｇ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−図１３）およびｐＲｉｘ４０−４７（構築物ｐＲｉｘ４０−４７は非グリコシル化ｇｐ１２０、ｇａｇ−ｐ１７／２４、Ｎｅｆおよび、ミリスチル化部位において突然変異および／またはＮｅｆのジロイシンモチーフを有するＴａｔ（ｍ）融合物を含有する）
プライマー：
５’１２０Ｇ：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣ［配列番号３２］
および
ｐ２４ＡＳ：ＣＡＡＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ［配列番号３３］
を用いて、ｇａｇ ｐ１７／２４を含有するフラグメントをベクターｐＲｉｘ３５からＰＣＲ増幅した。
【００８７】
プライマー：
５’ｐ２４−Ｎ：ＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧ［配列番号３４］
および
３’Ｎｅｆ：ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ［配列番号３５］
を使用して、完全長ＮｅｆをｐＮＴｍからＰＣＲ増幅した。
エンドプライマー（５’１２０Ｇおよび３’Ｎｅｆ）を使用して２つのフラグメントをＰＣＲステッチした。生成物をＳａｌＩおよびＫｐｎＩで切断し、ｐＲｉｘ３５における対応するフラグメントを置換してｐＲｉｘ３９を形成するために、ｐ２４およびＮｅｆの部分を含有する４２３ｂｐフラグメントを使用した（図１３）。
プライマー５’ｐ２４−Ｎをプライマー：
５’ｐ２４−Ｎｄｍ：
ＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧ［配列番号３６］
Ｇ Ｈ Ｋ Ａ Ｒ Ｖ Ｌ｜ Ｍ Ｇ Ｋ Ｗ Ｓ Ｋ Ｓ
と置換する以外は同様にしてｐＲｉｘ４０（図１４）を構築した。
このプライマーは１つのＧが欠失し、Ｎｅｆの開始点でミリストイル化部位を破壊する。
【００８８】
ｐＲｉｘ４１〜４４、４６および４７（図１５〜２０）
Ｎｅｆ（Ｌ１７４Ｌ１７５）におけるジロイシンモチーフに対する突然変異をＰＣＲ により行った：
突然変異を挿入するために、５’ＮｅｆプライマーおよびａｓＮｅｆＬＬを使用して、ＬＬモチーフに対するＮｅｆ５’の部分をＰＣＲ増幅した。
５’Ｎｅｆ ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧ［配列番号３７］
ａｓＮｅｆＬＬ（アンチセンス）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣ［配列番号３８］
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ
Ｌ１７４、Ｌ１７５または１７４および１７５の両方に対する突然変異は、順プライマー
ｓＮｅｆＬ１ （Ｌ１７４Ａ）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧ
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ｜ Ａ Ｌ Ｈ Ｐ Ｖ Ｓ Ｌ Ｈ
［配列番号３９］
ｓＮｅｆＬ２ （Ｌ１７５Ａ）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧ
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ｜ Ｌ ａ Ｈ Ｐ Ｖ Ｓ Ｌ Ｈ
［配列番号４０］
ＳｎｅｆＬＬ（ＬＬ１７４／５ＡＡ）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧ
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ｜ Ａ Ａ Ｈ Ｐ Ｖ Ｓ Ｌ Ｈ
［配列番号４１］
および３’ＮＴプライマー：
３’ＮＴ（アンチセンス）：ＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡ ［配列番号４２］
を使用して、Ｎｅｆの３’部分を増幅するために生じた。５’および３’産物のそれぞれを、５’Ｎｅｆおよび３’ＮＴプライマーを使用してＰＣＲステッチした。これらをＫｐｎＩおよびＳｐｅＩで切断し、同様に切断されたｐＲｉｘ３９中に挿入して、ｐＲｉｘ４１（Ｌ１７４Ａ）、ｐＲｉｘ４２（Ｌ１７５Ａ）およびｐＲｉｘ４３（ＬＬ１７４／１７５Ａ）がミリストイル化部位突然変異の不在下で生じるか、あるいはｐＲｉｘ４０中に挿入されて、ミリストイル化突然変異を有するｐＲｉｘ４４（ｍＬＬ１７４／１７５ＡＡ）ｐＲｉｘ４６（ｍＬ１７４Ａ）およびｐＲｉｘ４７（ｍＬ１７５Ａ）が生じた。
【００８９】
ｐＲｉｘ５０、５１および５２ならびに５３、５４および６０（図２３ないし２７）
非グリコシル化ｇｐ１２０を含有するデュアルプロモーターベクターを生成するために、まずｐＲｉｘ１２をＳｓｅ８３７Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にしてオーバーハングを除去し、ＣｌａＩで切断した。４５７３ｂｐの生成物をゲル精製に付した（フラグメントＡ）。
ｐＲｉｘ５０：プラスミドｐＮＴｍをＣｌａＩおよびＸｍｎＩで切断し、１８９７ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ５１：プラスミドｐ７３ｉ−ＧＮ２をＣｌａＩおよびＸｍｎＩで切断し、２５３３ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ５２：プラスミドｐ７３ｉ−ＧＮ２およびｐＮＴｍをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、４０９０ｂｐおよび１０６０ｂｐのフラグメントを個々の消化物より単離した。これらのフラグメントをライゲートし、ベクターｐＲｉｘ５２を得た。
【００９０】
ｐＲｉｘ５３：プラスミドｐＲｉｘ５２をＣｌａＩおよびＸｍｎＩおよびＡｐａＬＩで切断し、２７９４ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ５４：プラスミドｐＴ−ｒｎｇ（ＰＧ５０３５に記載）をＣｌａＩおよびＸｍｎＩで切断し、４２１９ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ６０：ｐＴ−ｍｇをＳｓｅ８３８７Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にしてオーバーハングを除去し、ＣｌａＩで切断した。ラージフラグメントをゲル精製に付した。プラスミドｐＲｉｘ１２をＣｌａＩおよびＤｒａＩで切断し、２４７６ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、ｐＴ−ｍｇからのフラグメントとライゲートした。
【００９１】
ｐＲｉｘ５８（図２１）
シグナル配列がないｇｐ１２０フラグメントを、プライマー：
５’ｄｓ１２０：ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣ［配列番号４３］
３’１２０：（アンチセンス）：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡ ［配列番号４４］
を使用してｐｇｐ１２０ｃからＰＣＲ増幅した。
ＲＴの５’末端（最適化され、Ｗ２２９Ｋ不活化突然変異を含むコドン）を、３’１２０とホモローガスな配列を挿入するために５’プライマー、およびＲＴ内のプライマーを用いて、ｐｔ−ｒｎｇ（図２８−ＷＯ０３／０２５００３を参照）からＰＣＲ増幅した。
１２０ＲＴｆ：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＣＡＴＣ［配列番号４５］
ＲＴ３ＳＲ１：ＣＧＴＣＡＣＧＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣ［配列番号４６］
エンドプライマーを用いて２つの生成物をＰＣＲステッチし、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩで切断した。フラグメントをゲル精製し、ｐＴ−ｒｎｇからＮｏｔＩ−ＮｈｅＩフラグメントを置換するために使用した。
【００９２】
ｐＲｉｘ５９（図２２）：３’Ｇａｇフラグメントは、ｐ２４におけるＭｕｎＩ部位に対するプライマー５’およびｄｓｇｐ１２０の開始をコード化する３’プライマーを用いてｐＴ−ｒｎｇからＰＣＲ増幅され、５’末端に近いＢｓｔＥＩＩ部位の位置に及ぶ
ＧａｇＭｕｎｆ
ＧＴＧＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＧ ［配列番号４７］
ＧＡＧ１２０Ｒ（アンチセンス：）
Ｇａｇ −−−−−−−−−−−−−−−−−− ｄｓ１２０
ＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣ
［配列番号４８］
生成物をＭｕｎＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、ＭｕｎＩ−ＢｓｔＥＩＩ切断ｐＲｉｘ５４からの７１１３ｂｐフラグメント中に挿入した。
【００９３】
結果
発現データを図２９、３０および３１に示す。
２４ウェルプレートにおける２９３Ｔ細胞単層を、製造業者が提供したプロトコルにしたがってリポフェクトアミン２０００を用いて表示されたそれぞれのＤＮＡ１μｇでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を分離し、遠心分離により培地から分離した。１×１０４細胞または１２μｌの培地と等しいサンプルをＰＡＧＥまたはウェスタンブロットにより調べた。
ｇｐ１２０ｃ構築物は、高度にグリコシル化され、よく分泌されたタンパク質をもたらした。ｃ−末端Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合物（ｐＲｉｘ６およびｐＲｉｘ１１）の添加の結果、細胞内タンパク質レベルが低下し、分泌が失われた。ｇｐ１２０ｃ（ｐＲｉｘ１２）から分泌シグナルを除去すると、タンパク質の非グリコシル化非分泌形態が得られた。
予想されるように、分泌シグナルｐＲｉｘ２８、２９、３１、３３および３５がない融合構築物は非グリコシル化細胞内タンパク質を同様の量で形成した。驚くべきことに、分泌シグナルは構築物ｐＲｉｘ３０、３２および３４中に存在していたが、ｐＲｉｘ３４のみが分泌されなかった。融合物におけるＴａｔの存在はタンパク質の分泌を阻害するようである。初期ｐＲｉｘ３２．１構築物は点突然変異を有し、その結果発現が不十分であった。これはｐＲｉｘ３２．７において修正され、これは非常に向上された発現を示した。
【００９４】
ｐＲｉｘ４０−４７に関して、図３１におけるウェスタンブロットは、表示されたプラスミドでのトランスフェクション後２４時間で２９３Ｔ細胞におけるＮｅｆにおける突然変異を有するｄｓｇｐ１２０／Ｇａｇ／Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合物の発現を示す。約１ｘ１０４細胞と等しい全細胞抽出物をゲル上にロードした。ブロットを抗ｎｅｆ抗血清でプローブし、ライトブロットを抗−ｇｐ１２０抗血清でプローブした。
【００９５】
参考文献：
Ａｎｄｒｅ Ｓ．Ｓｅｅｄ Ｂ．Ｅｂｅｒｌｅ Ｊ．Ｓｃｈｒａｕｔ Ｗ．Ｂｕｌｔｍａｎｎ Ａ．Ｈａａｓ Ｊ．（１９９８）最適化されたコドン使用を有する合成ｇｐ１２０配列を用いたＤＮＡワクチン接種により惹起される増大した免疫反応（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｐ１２０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ．）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２（２）：１４９７−５０３．
Ｖｉｎｎｅｒ Ｌ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ＨＶ．Ｂｒｙｄｅｒ Ｋ．Ｃｏｒｂｅｔ Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｃ．Ｆｏｍｓｇａａｒｄ Ａ．（１９９９）哺乳動物コドンを使用したＲｅｖ−非依存性合成ＨＩＶ−１ｇｐ１６０エンベロープ遺伝子での遺伝子銃ＤＮＡワクチン接種（Ｇｅｎｅ ｇｕｎ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｅｖ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｏｄｏｎｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ．１７（１７）：２１６６−７５
Ｃｏｌｌｉｎｓ ＫＬ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ．（１９９９）細胞免疫反応のＨＩＶの回避（ＨＩＶ’ｓ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ．１６８：６５−７４．
【００９６】
実施例５
プラスミドＤＮＡ（約１μｇ／μｌ）、例えば１００ｕｇ、および２μｇの金粒子、例えば５０ｍｇ、（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ）を、０．０５Ｍスペルミジン、例えば１００ｕｌ、（Ｓｉｇｍａ）中に懸濁させた。１Ｍ ＣａＣｌ２、たとえば１００ｕｌ（Ａｍｅｒｉｃａｌ Ｐｈａｒｎａｃｅｕｔｉａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）の添加により金粒子上に沈殿させた。ＤＮＡ／金複合物を１０分間室温でインキュベートし、無水エタノール中で３回、例えば１ｍｌで３回洗浄した（モレキュラシーブ３Ａ（ＢＤＨ）上であらかじめ乾燥）。０．０５ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｓｉｇｍａ）を含有する無水エタノール中にサンプルを再懸濁させ、１．５ｍｌのミクロ遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中に、３の等しいアリコートに分けた。アリコートは、（ａ）「金スラリー」、（ｂ）（ａ）から溶出された溶出物−プラスミドの分析のため、および（ｃ）「遺伝子銃」の金／プラスミドコートされたＴｅｆｚｅｌカートリッジを調製するためのものであった。（下記の実施例３参照）。サンプル（ａ）および（ｂ）の調製に関して、エタノール／ＰＶＰ中プラスミドＤＮＡ／「金スラリー」を含有する試験管をＥｐｐｅｎｄｏｒｆミクロ遠心管中、最高速度で２分間スピンさせ、上清を除去し、「金スラリー」を１０分間室温で乾燥させた。サンプル（ａ）を０．５〜１．０ｕｇ／ｕｌのＴＥ中プラスミドＤＮＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、コーティングの約５０％と推定される。溶出に関して、サンプル（ｂ）をＴＥｐＨ８．０中０．５〜１．０ｕｇ／ｕｌのプラスミドＤＮＡに再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートし、激しく振とうし、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１８ミクロ遠心管中、最高速度で２分間スピンさせ、上清、溶出液を除去し、−２０℃で貯蔵した。溶出された正確なＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅｑｕａｎｔＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた分光光度定量化により決定した。
【００９７】
実施例６
ＤＮＡ免疫化用カートリッジの調製
Ａｃｃｅｌｌ遺伝子導入装置のカートリッジの調製は既に記載されたとおりであった（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３ 第１２巻 Ｎｏ．９ ７９１−７９７ページ；Ｐｅｒｔｎｅｒら）。簡単に言うと、プラスミドＤＮＡを２μｍ金粒子（ＤｅＧｕｓｓａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）上にコートし、Ｔｅｆｚｅｌ管中にロードし、これをカートリッジとしての働きをするように次いで１．２７ｃｍの長さに切断し、使用するまで４℃で乾燥保存した。典型的なワクチン接種において、各カートリッジは０．５ｍｇの合計０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジでコートされた金を含有していた。
【００９８】
実施例７
ｇｐ１２０分泌シグナルが欠失したｇｐ１２０−Ｎｅｆ−Ｔａｔ三重融合物を含むＰＭＩＤ免疫化
プロトコル：ＰＭＩＤに関して、実施例５および６に記載するような標準法を使用するために免疫化（ＤＮＡ）カートリッジを調製した。約０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジをもたらすＤＮＡローディング速度２を使用し、各免疫化は２回の注射からなっていた。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＤＮＡの一次免疫を行った（ＰＭＩＤを使用）。マウスに２８日後ＤＮＡで追加抗原投与を行った（ＰＭＩＤを使用）。マウスを７日後に処分し、血清および脾臓を集めた。脾臓細胞を抽出することにより、脾臓細胞を収穫し、赤血球を溶解させた。脾臓細胞を洗浄し、計数した。特殊ＥＬＩｓｐｏｔプレート（インターフェロン−ガンマ捕捉抗体でコートされ、ブロックされたもの）を使用した。脾臓細胞をこれらのプレートに移し、ｇｐ１２０ペプチド、ＲＴペプチドまたはＧａｇペプチドの存在下、３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。脾臓細胞を溶解させ、存在するインターフェロン−ガンマ分泌細胞の数を示すために標準的手順を用いてプレートを展開させた。特定の抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ分析により血清を分析した。結果を図３２〜３４に示す。
【００９９】
結論
意外にも、構築物を発現するｄｓｇｐ１２０（分泌シグナルが欠失したｇｐ１２０）で免疫化された細胞性免疫反応は、ｇｐ１２０構築物で免疫化されたマウスの約２倍であった（図３２および３３参照）。これは、インビトロトランスフェクション研究において、ｄｅｇｐ１２０の発現は関連する細胞の大部分は残存していたが、ｇｐ１２０は排出されたという観察と一致した。
ｄｓｇｐ１２０構築物中にＴａｔ（突然変異したＴａｔ）を含めることにより細胞性免疫反応が、Ｔａｔのないｄｓｇｐ１２０構築物の２倍に増大した（図３２および３３）。Ｔａｔ自体はｇｐ１２０に対する免疫反応に影響を及ぼさなかったが、ｄｅｇｐ１２０と共に相乗作用して細胞反応を最適化した。
他のＨＩＶ抗原を構築物中に含めることにより、含まれる異なる抗原全てに対してバランスのとれた細胞反応が生じ、その結果、ｇｐ１２０のみのベクターと比較して拡大された免疫反応が生じた（図３４）。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
（原文に記載なし）
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２１−３】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２２−３】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８−１】
【図２８−２】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は核酸構築物、かかる構築物を含むベクター、該ベクターおよび構築物を調製する方法ならびに予防または治療、特に治療用ワクチンにおけるその使用に関する。本発明はさらに、該構築物およびベクターを含む宿主細胞および該構築物によりコード化されるポリペプチドならびにポリペプチドそれ自体に関する。本発明はさらに構築物およびベクターを含む医薬処方ならびに医学における該構築物およびベクターの使用に関する。本発明は特に、ＨＩＶ感染症の予防および治療において、さらに詳細には粒子性送達により投与された場合に有用なＤＮＡワクチンに関する。
【０００２】
（背景技術）
ＨＩＶ−１は世界の主要な健康上の問題の１つと見なされる後天性免疫不全症候群（エイズ）の主な原因である。世界中でワクチンを作り出すための大規模な研究が行われてきたが、このような努力はこれまでのところ成功していなかった。
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０は宿主細胞に結合させるために用いられるウイルスタンパク質である。ＣＤ４および２つのケモカインレセプターＣＣＲ−４またはＣＸＣＲ−５の１つとして知られるヘルパーＴ細胞とマクロファージと２つの表面分子を結合させることによりこの結合が行われる。ｇｐ１２０タンパク質をまず大きな前駆体分子（ｇｐ１６０）として発現し、これを次いで翻訳後開裂させて、ｇｐ１２０およびｇｐ４１を得る。ｇｐ１２０タンパク質はｇｐ４１分子と結合させることによりビリオンの表面上に保持され、これはウイルス膜中に挿入される。
【０００３】
ｇｐ１２０タンパク質は、中和抗体の主要な目標であるが、残念なことに該タンパク質の最免疫原性領域（Ｖ３ループ）はタンパク質の最も可変的な部分でもある。そのために、ワクチン抗原として中和抗体を惹起するためのｇｐ１２０（またはその前駆物質ｇｐ１６０）の使用は概して保護のワクチンに関して限られた効果しかないと考えられる。ｇｐ１２０タンパク質は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されるエピトープも含有している。これらのエフェクター細胞はウイルスに感染した細胞を排除することができ、その結果第二の主要な抗ウイルスの免疫機構を構成する。中和抗体の標的領域と対照的に、あるＣＴＬエピトープは異なるＨＩＶ株間で比較的保存されるようである。この理由のために、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０は細胞性免疫反応（特にＣＴＬ）を惹起することを目的とするワクチンにおいて有用な抗原性成分である可能性がある。
ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質は記載されており、例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の産物などの内部構造タンパク質およびＲｅｖ、Ｎｅｆ、ＶｉｆおよびＴａｔなどの他の非構造タンパク質を含む（Ｇｒｅｅｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ、３２４、５、３０８以下参照（１９９１）およびＢｒｙａｎｔら、（Ｅｄ．Ｐｉｚｚｏ）、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．、１１、５、３９０以下参照（１９９２）。
【０００４】
ＨＩＶ ＴａｔおよびＮｅｆタンパクは初期タンパク質である。すなわち、これらは感染の初期に、構造タンパク質の不在下で発現される。
Ｎｅｆタンパク質は細胞表面からのＣＤ４、ＨＩＶレセプターの除去を引き起こすことが知られているが、この機能の生物学的重要性が論議されている。さらに、ＮｅｆはＴ細胞のシグナル経路と相互作用し、活性状態を誘発し、これは次いでより有効な遺伝子発現を促進し得る。あるＨＩＶ単離物はこの領域において突然変異を有し、これにより機能的タンパク質をコード化しなくなり、そのインビボでの複製および病原性を非常に犠牲にする。
【０００５】
Ｔａｔ遺伝子は感染中のいろいろな時に多くの差別的にスプライスされた転写物を生じさせる。最初のエクソンは感染の初期に優勢である８６アミノ酸タンパク質をコード化する。第二のエクソンはさらに１４のアミノ酸をコード化し、このＴａｔの部分的にスプライスされた形態は感染の後期において見られる。両方の形態は完全に機能的なトランスアクチベーターであるが、さらに長い形態もαｖβ３およびα５β１インテグリンとの結合に重要なＲＧＤモチーフを含有する。Ｔａｔは、ＨＩＶ ＲＮＡの５’末端に位置し、ＨＩＶ ＬＴＲからの転写を少なくとも１０００倍増加調節するトランス活性化反応エレメント（ＴＡＲ）として知られるショートステムループ構造と結合する。ＴａｔはＨＩＶ感染の延長期の促進に関与し、完全長ウイルス転写物の産生を刺激する。Ｔａｔは多くの細胞遺伝子の発現に影響を与えることができ、ＴＮＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−６をはじめとする多くの細胞の遺伝子の発現を活性化することができ、ｐ５３およびＢｃｌ−２の発現を調節する。Ｔａｔは過剰で生産され、感染した細胞から分泌される。この細胞外Ｔａｔは他の細胞に侵入でき、ＨＩＶによる感染について細胞をプライムするか、または新たに感染した細胞においてＨＩＶ複製の速度を加速させることができる。
【０００６】
会議の発表（Ｃ．Ｄａｖｉｄ Ｐａｕｚａ、Ｔａｔ毒素での免疫化はアカゲザルにおけるＳＨＩＶ８９．６ＰＤ感染を弱毒化する（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔａｔ ｔｏｘｏｉｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ＳＨＩＶ８９．６ＰＤ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）、第１２回Ｃｅｎｔ Ｇａｒｄｅｓ会議、Ｍａｒｎｅｓ−Ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、２６．１０．１９９９）において、アカゲザルをＴａｔ毒素単独またはエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０ワクチンコンビネーション（１回量の組み換えワクシニアウイルスと１回量の組み換えタンパク質）との組み合わせで免疫化した実験が説明された。観察された結果から、エンベロープ糖タンパク質の存在はＴａｔ単独で行われた実験よりも有利でないことが示された。
Ｇａｇ遺伝子は完全長ＲＮＡから翻訳されて前駆体ポリタンパク質を生じ、これをつづいて３〜５のカプシドタンパク質；マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質およびタンパク質およびプロテアーゼを結合する核酸に開裂させる。（１．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｆｉｅｌｄｓ ＢＫ、Ｋｎｉｐｅ ＤＭおよびＨｏｗｌｅｙ Ｍ １９９６ ２．Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第２巻、１９９６）。
【０００７】
ｇａｇ遺伝子は５５キロダルトン（ｋＤ）のＧａｇ前駆体タンパク質（ｐ５５とも称する）を生じさせ、これは未スプライスウイルスｍＲＮＡから発現される。翻訳中、ｐ５５のＮ末端はミリストイル化され、細胞膜の細胞質性と関連させる。膜結合Ｇａｇポリタンパク質は２コピーのウイルスゲノムＲＮＡを、感染した細胞の表面からのウイルス粒子の出芽を引き起こす他のウイルスおよび細胞タンパク質とともに利用する。出芽後、ＭＡ（マトリックス［ｐ１７］）、ＣＡ（カプシド［ｐ２４］）、ＮＣ（ヌクレオカプシド［ｐ９］）、およびｐ６（４）で表される４つの小さなタンパク質中へのウイルス成熟のプロセス中、ｐ５５はウイルスによりコード化されたプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）により開裂される。
３つの主要なＧａｇタンパク質に加えて、すべてのＧａｇ前駆体は、開裂して、様々なサイズのペプチドとしてビリオン中に残存するいくつかの他の領域を含む。これらのタンパク質は異なる役割を果たす。例えば、ｐ２タンパク質はプロテアーゼの活性の調節において提案されている役割を果たし、タンパク分解処理の的確な時間調節に寄与する。
【０００８】
ＭＡポリペプチドは ｐ５５のＮ−末端ミリストイル化末端から誘導される。ほとんどのＭＡ分子はビリオン脂質二重層の内部表面と結合したままであり、粒子を安定化する。ＭＡのサブセットはビリオンの深い方の層の内部に補充され、ここでウイルスＤＮＡを核へと送り届ける複合体の一部になる。ＭＡ上の求核シグナルは細胞核輸入機構により認識されるので、これらのＭＡ分子はウイルスゲノムの核輸送を促進する。この現象は、ＨＩＶが非分裂細胞に感染することを許容し、これはレトロウイルスについては通常でない性質である。
ｐ２４（Ｃａ）タンパク質はウイルス粒子の円錐コアを形成する。シクロフィリンＡはｐ５５のｐ２４領域と相互作用して、ＨＩＶ粒子中に組み入れられることが証明されている。シクロスポリンＡによるこの相互作用の中断はウイルス複製を阻害するので、ＧａｇとシクロフィリンＡ間の相互作用は最も重要である。
【０００９】
ＧａｇのＮＣ領域は、ＨＩＶのいわゆるパッケージングシグナルの特異的認識に関与する。パッケージシグナルはウイルスＲＮＡの５’末端付近に位置する４ステムループ構造からなり、ヘテロローガスなＲＮＡのＨＩＶ−１ビリオン中への組み入れを媒介するために十分である。ＮＣは２つの亜鉛フィンガー（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ）モチーフによって媒介される相互作用によりパッケージングシグナルと結合する。ＮＣはまた逆転写を促進する。
ｐ６ポリペプチド領域はｐ５５ Ｇａｇと補助タンパク質Ｖｐｒ間の相互作用を媒介し、Ｖｐｒをアセンブリングビリオンに組み込むことにまでに至る。ｐ６領域はまた、感染した細胞からの出芽ビリオンの有効な放出に必要ないわゆる後期ドメインも含有する。
【００１０】
Ｐｏｌ遺伝子は、初期感染においてウイルスにより必要とされる２つの活性を含有する２つのタンパク質、ウイルスＤＮＡの細胞ＤＮＡ中への組み込みに必要なＲＴおよびインテグラーゼタンパク質をコード化する。Ｐｏｌの主な生成物は、ビリオンプロテアーゼにより開裂されて、ＤＮＡ合成（ＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼＨ）に必要な活性を含有するアミノ末端ＲＴペプチドおよびカルボキシ末端インテグラーゼタンパク質を得る。ＨＩＶ ＲＴは、完全長ＲＴ（ｐ６６）およびカルボキシ末端Ｒｎａｓｅインテグラーゼドメインが欠損した開裂産物（ｐ５１）のヘテロダイマーである。
ＲＴはレトロウイルスゲノムによりコード化された最も高度に保存されたタンパク質の１つである。ＲＴの２つの主な活性は、ＤＮＡ ＰｏｌおよびリボヌクレアーゼＨである。ＲＴのＤＮＡ Ｐｏｌ活性はＲＮＡおよびＤＮＡをテンプレートとして交換可能に使用し、公知の全てのＤＮＡポリメラーゼのように新たにＤＮＡ合成を開始することができないが、既存の分子がプライマー（ＲＮＡ）としての役割をすることを必要とする。
【００１１】
ＤＮＡ合成が進行するにつれ、ＲＮＡゲノムを除去する複製の初期において、全ＲＴタンパク質に固有のＲｎａｓｅ Ｈ活性は不可欠な役割を果たす。これはすべてのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子からＲＮＡを選択的に分解する。構造的にポリメラーゼおよびｒｉｂｏＨは、ＰｏｌがＰｏｌの３分の２のアミノの範囲に及ぶ別々の非重複ドメインを占める。
ｐ６６触媒サブユニットは５つの独立したサブドメイン中に折り畳まれている。これらのアミノ末端２３はＲＴ活性を有する部分を有する。これらのカルボキシ末端はＲｎａｓｅ Ｈドメインである。
【００１２】
宿主細胞の感染の後に、レトロウイルスＲＮＡゲノムは感染粒子中に存在する逆転写酵素によって直線状ｄｓ ＤＮＡの中にコピーされる。インテグラーゼ（Ｓｋａｌｋａ ＡＭ’９９ Ａｄｖ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ５２ ２７１−２７３に概論）はウイルスＤＮＡの両端を認識し、これらを切断し、ウイルスＤＮＡを宿主染色体部位に同伴して組み入れを触媒する。宿主ＤＮＡ中の多くの部位が組み込みのための目標であり得る。インテグラーゼはインビトロでの組み入れを触媒するために十分であるが、これはインビボでウイルスＤＮＡと結合した唯一のタンパク質−大タンパク質−ではなく、感染した細胞から単離されたウイルスＤＮＡ複合体は組み込み前複合体を意味する。これは子孫ウイルスのゲノムによる宿主細胞遺伝子の獲得を容易にする
【００１３】
インテグラーゼは３つの別のドメイン、Ｎ末端ドメイン、触媒コアおよびＣ末端ドメインで構成されている。触媒コアドメインはポリヌクレオチド移動の化学的性質のための必要条件のすべてを含む。
ＤＮＡワクチンは通常、強力なプロモーターがその中へ挿入されたバクテリアプラスミドベクター、抗原性ペプチドをコード化する興味のある遺伝子およびポリアデニル化／転写末端配列からなる。興味のある遺伝子は、完全タンパク質または単に病原体、腫瘍またはそれに対して防御することを意図される他の因子に関連する抗原性ペプチド配列をコード化し得る。プラスミドはバクテリア、例えばイー・コリ中で成長し、次いで単離され、宿主に投与される前に意図される投与経路に応じて適当な培地中で調製することができる。投与後にプラスミドは宿主の細胞に取り込まれるか、または直接宿主細胞中に送達され、ここでコード化されたペプチドが産生される。プラスミドベクターは好ましくは哺乳動物の宿主におけるプラスミド複製および関連する動物の染色体ＤＮＡ内の組み入れを防止するために、真核細胞において有効な複製の起源無しに構成される。
【００１４】
伝統的なワクチン接種技術に対してＤＮＡワクチン接種には利点が数多くある。第一に、ＤＮＡ配列によってコード化されるタンパク質は宿主において合成されるので、タンパク質の構造または立体構造は疾患状態と関連する本来のタンパク質に類似するであろうと予測される。保存されたタンパク質からエピトープを認識する細胞毒性Ｔリンパ球反応を生成することにより、ＤＮＡワクチン接種が異なった種類のウイルスに対して防御を提供することも同様にあり得る。技術により多くの疾患状態に関して同時免疫化を促進するために単一製剤中に多様な免疫原を組み合わせる可能性も提供される。
ＤＮＡワクチン接種に関連する有用な背景情報は、Ｄｏｎｎｅｌｙら、「ＤＮＡワクチン」Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ １５：６１７−６４８（その開示は全体として出典明示により本発明の一部として参照される）に記載されている。
Ｄｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４：２３６９−２３７６は、グリコシル化における多様性がどのようにｇｐ１２０に対するＣＤ８＋ＣＴＬ反応に影響を及ぼすかを調査し、哺乳動物ＣＨＯ細胞において産生されたｇｐ１２０は、Ｎ−結合オリゴ糖が免疫化の前に除去されなければ昆虫または酵母細胞由来のエンベロープタンパク質と比較した場合にＣＴＬ反応をプライムする能力が減少していることを見いだした。
【００１５】
この度、ＨＩＶのワクチンにおいて、非グリコシル化ＨＩＶエンベロープタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを使用することにより得られる利益があることが見いだされた。意外にも、分泌シグナルなしでｇｐ１２０を発現し、従ってグリコシル化されないかまたは細胞から分泌されないＤＮＡベクターは、その本来の分泌シグナルを有するｇｐ１２０を発現するＤＮＡベクターよりも、さらに有効なＣＴＬ反応の刺激物質である。分泌シグナルが、糖鎖形成が起きる細胞内部位へｇｐ１２０を導くことに関与するので、その本来の分泌シグナルが欠損したｇｐ１２０はグリコシル化されない。さらに、非グリコシル化ｇｐ１２０との融合タンパク質において非構造ＨＩＶタンパク質、例えばＴａｔが存在すると、ｇｐ１２０に対するＣＴＬ反応が増大する。対照的に、正常なｇｐ１２０との融合タンパク質におけるＴａｔは分泌を防止するが、免疫反応の増大には至らない。非グリコシル化ｇｐ１２０は他のＨＩＶ抗原（構造および非構造の両方）との融合タンパク質においてもうまく発現することができる。
【００１６】
（発明の開示）
従って、本発明はＨＩＶ感染症およびＡＩＤＳの予防および治療用の核酸またはポリペプチドワクチンにおいて用いられる新規構築物を提供する。
一態様において、本発明は、ヘテロローガスなプロモーターと操作可能に連結した、哺乳動物の標的細胞にて発現した場合に、グリコシル化されていないか、または実質的にグリコシル化されていない、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質はｇｐ１２０である。あるいは、ｇｐ１６０またはｇｐ１４０などのエンベロープタンパク質の他の形態であり得る。
【００１７】
哺乳動物細胞において発現されたｇｐ１２０などのＨＩＶエンベロープタンパク質は通常グリコシル化されるであろう。本発明によれば、ｇｐ１２０コード化配列を用いて、哺乳動物標的細胞、特にヒト標的細胞におけるグリコシル化を軽減または防止する。グリコシル化は多くの異なる方法で、例えばグリコシル化部位の除去または突然変異によるか、または本来の分泌シグナルを除去することにより軽減または防止することができる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド構築物において、ｇｐ１２０またはＨＩＶエンベロープタンパク質の他の形態は機能的分泌シグナルが欠損している。分泌シグナルはＨＩＶ単離物間で長さが異なる。例えば、本明細書において記載されるＷ６１Ｄ単離物においては３０アミノ酸長であるが、異なる単離物についてはこれ以上またはこれ以下であり得る。一般に、分泌シグナルは明らかに表され、その全体が除去されるが、必ずしもそうではない場合もある。エンベロープタンパク質をグリコシル化に関与する細胞機構に取り込むその機能を防止するために十分な量のシグナルが除去されるであろう。これは容易に試験することができる。
【００１８】
エンベロープタンパク質は機能的分泌シグナルを有しないが、まだわずかなグリコシル化が起こる可能性もあり、このことは本発明から排除されていない。かくして、本発明のエンベロープタンパク質は、哺乳動物細胞にて、実質的にグリコシル化されておらず、その結果として、その大部分、例えば、その５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上が細胞より分泌されていない。
ＨＩＶエンベロープタンパク質、特にｇｐ１２０は、好ましくはＮｅｆ、Ｔａｔおよび逆転写酵素（ＲＴ）などの非構造タンパク質ならびに構造タンパク質、特にＧａｇまたはフラグメントあるいはこれらのいずれかの免疫原性誘導体などのカプシドタンパク質より選択される少なくとも１つのＨＩＶタンパク質を含む融合タンパク質として発現されることが好ましい。
【００１９】
一具体例において、融合タンパク質はｇｐ１２０およびＲＴ−含有融合タンパク質であり、所望によりＧａｇおよび／またはＮｅｆも含んでもよい。
もう１つの具体例において、融合タンパク質は所望によりＲＴおよび／またはＮｅｆを含んでもよいｇｐ１２０およびＧａｇ含有融合タンパク質である。
さらに別の具体例において、融合タンパク質は所望によりＲＴおよび／またはＧａｇも含んでもよいｇｐ１２０およびＮｅｆ含有融合タンパク質である。
次の好ましい具体例において、融合タンパク質は、ｇｐ１２０、ＲＴ、ＮｅｆおよびＧａｇまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体の融合物である。
ｇｐ１２０−ＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇ
ＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇ−ｇｐ１２０
【００２０】
もう１つの具体例は、ｇｐ１２０およびＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を含む融合物である。このような具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、ｇｐ１２０およびＴａｔ含有融合タンパク質をコード化するためにＴａｔコード化配列と結合したｇｐ１２０コード化配列を含む。
特定の具体例において、ｇｐ１２０およびＴａｔ配列は、ｇｐ１２０、ＴａｔおよびＮｅｆ含有融合タンパク質、最も好ましくはｇｐ１２０−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合物をコード化するために、Ｎｅｆコード化配列とさらに結合される。
追加のＨＩＶ配列、例えばＧａｇコード化配列を含めることができる。
もう１つの特定の具体例において、本発明のポリヌクレオチドによりコード化された融合はｇｐ１２０−Ｇａｇ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合である。
好ましくは、本発明において用いられるＴａｔ配列は、トランス活性化活性が欠失しているが、その免疫原性エピトープを保持する生物学的に不活性なＴａｔをコード化するように突然変異させられる。Ｔａｔトランス活性化活性は、ＨＩＶ ＬＴＲレポーター系、例えばクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼレポーター遺伝子がＨＩＶ−１の長い末端繰り返しの制御下にあるＣＡＴ分析系により測定することができる。好適な特定のＣＡＴ分析系は、ＦｅｌｂｅｒおよびＰａｖｌａｋｉｓ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１８４−１８７において記述され、Ｍｉｓｃｈｉａｔｉら（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ａｕｇ １１（４）：２０９−１７においても用いられるＨＬ３Ｔ１細胞系を使用する。ＨＬ３Ｔ１は、ＣＡＴ遺伝子と結合したＨＩＶ−１ ＬＴＲプロモーターの安定に組み入れられたサイレントコピーを含有するＨｅＬａ細胞系である。これらの細胞はＴａｔ遺伝子を含有するＤＮＡベクター（修飾または未修飾）でトランスフェクトされる。ＣＡＴは活性Ｔａｔの存在により産生され、ＥＬＩＳＡにより測定される。
【００２１】
好ましい突然変異Ｔａｔ配列（ＢＨ１０分子クローン起源）は活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）およびＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→ＬｙｓおよびＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）
において突然変異を有する（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：４８−６４、１９９７）。
所望により、本発明において用いられるＮｅｆ配列は、Ｎ末端領域をコード化する配列を除去するために、すなわち３０〜８５、好ましくは６０〜８５、好ましくはＮ末端６５アミノ酸の除去のために切除される（後者の切除は本発明においてｔｒＮｅｆと称する）。有利には、Ｎｅｆは１以上のミリスチル化部位を除去するために修飾することができる。例えば、Ｇｌｙ２ミリスチル化部位は、欠失または置換により除去することができる。別法として、あるいはさらには、一方または両方のロイシンの欠失または置換によりＬｅｕ１７４およびＬｅｕ１７５のジロイシンモチーフを変更するためにＮｅｆを修飾することができる。ＣＤ４減少調節におけるジロイシンモチーフの重要性は、Ｂｒｅｓｎａｈａｎ Ｐ．Ａ．ら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８（２２）：１２３５−８に記載されている。
【００２２】
好ましくは本発明において用いられるＧａｇはＧａｇ Ｐ６ポリペプチドをコード化しない。
本発明において用いられる好ましいＧａｇ配列はＰ１７および／または２４を含む。
本発明において用いられるＲＴポリヌクレオチドは好ましくは突然変異をコード化して逆転写酵素活性を実質的に不活化する。好ましい不活化突然変異体は、ＫリシンのＷトリプトファン２２９の置換を含む。ＷＯ０３／０２５００３参照。
好ましくは、例えばｇｐ１２０、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、ＧａｇまたはＲＴをコード化する本発明のポリヌクレオチド中に含まれる１以上のＨＩＶ配列は哺乳動物細胞に関して、最も好ましくは、そのコドン使用において高度に発現されたヒト遺伝子に類似するように最適化されたコドンである。
【００２３】
融合物はさらなるＨＩＶ配列を含み得る。本発明に含まれるＨＩＶ配列すべてに関して、これらは必ずしも完全長または本来のタンパク質をコード化する配列を表すとは限らないと理解される。少なくとも１つのＨＩＶエピトープ、好ましくはＣＴＬエピトープ、典型的には少なくとも８個のアミノ酸のペプチドをコード化するフラグメントのように、免疫原性誘導体、例えば切形または他の方法で変更された、例えば突然変異タンパク質も含まれる。フラグメントの免疫原性誘導体も予想される。免疫原性誘導体は未変性抗原またはそのフラグメントと架橋反応する。少なくとも８、例えば８〜１０のアミノ酸または最高２０、５０、６０、７０、１００、１５０または２００のアミノ酸の長さのフラグメントをコード化するポリヌクレオチドは、コード化されたオリゴまたはポリペプチドがＨＩＶ抗原性を示す限り本発明の範囲内に含まれると考えられる。本発明のポリヌクレオチド配列によりコード化されたＨＩＶポリペプチド分子は、天然のタンパク質の少なくとも５０％の長さのフラグメントを表し、該フラグメントは突然変異を含み得るが、少なくとも１つのＨＩＶエピトープを保持し、ＨＩＶ抗原性を示す。同様に、本発明の免疫原性誘導体はＨＩＶ抗原性を示さなければならない。本発明の好ましい免疫原性誘導体は、酵素活性（ＲＴ）、トランス活性化活性（Ｔａｔ）、またはＣＤ４減少調節（Ｎｅｆ）などの、ワクチン抗原において望ましくない本来のタンパク質の機能の軽減または除去など、本来のタンパク質よりもいくつかの潜在的な利点を提供する。ポリヌクレオチド配列は好ましくは本発明の好ましい態様に従って哺乳動物細胞に関して最適化されたコドンである。
【００２４】
好ましいポリヌクレオチド配列は次の群から選択される：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
６．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
７．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
８．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＮｅｆ−ｍＴａｔ
９．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１０．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
【００２５】
１１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ
１６．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
【００２６】
ｍＮｅｆ＝非ミリストイル化Ｎｅｆを得るためのＧ２の欠失
Ｌ１ Ｎｅｆ＝ＮｅｆにおけるＬ１７４Ａ突然変異
Ｌ２Ｎｅｆ＝ＮｅｆにおけるＬ１７５Ａ突然変異
ＬＬＮｅｆ＝ＮｅｆにおけるＬ１７４ＡおよびＬ１７５Ａ突然変異
ＴｒＮｅｆ＝末端アミノ酸１−６５をコード化するヌクレオチドが欠損したＮｅｆ
ｍＲＴ＝生物学的活性（Ｗ２２９Ｋ）を除去するために突然変異した逆転写酵素。ＲＴは最適化されたコドンである。
Ｇａｇ＝最適化されたＧａｇコドン
【００２７】
発明は好ましくはＨＩＶ−１に関する。本明細書において記載される構築物はＨＩＶクレードＶまたはクレードＣ、特にクレードＢから誘導されるのが好ましい。
好ましくは、プロモーターはＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子からのプロモーターであり、さらに詳細には、ＷＯ０２／３６７９２に記載されているようにエクソン１を含むＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子の５’未翻訳領域が含まれているプロモーターである。
【００２８】
もう１つ別の態様において、本発明は本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ポリヌクレオチド配列は好ましくはＤＮＡであり、好ましくは二本鎖ＤＮＡプラスミドであるベクター内に含まれる。別のベクターを以下に記載し、これは特定のアデノウイルスベクター、例えばチンパンジー由来のアデノウイルスベクターＰａｎ９またはＰａｎ５、６および７を含み、好ましくは、これらは複製欠損である場合、標的細胞において複製できない。
本発明のもう一つ別の態様はＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体、特にｇｐ１２０と、別個に１またはそれ以上のＨＩＶタンパク質、例えばＲＴ、Ｇａｇ、Ｎｅｆ、Ｔａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する一組のポリヌクレオチドに関する。
すなわち、本発明は、ｇｐ１２０のような本明細書中に記載のポリヌクレオチドまたは他の形態のＨＩＶエンベロープタンパク質と、少なくとも１つのＨＩＶ Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドとを含む、所望により追加のプロモーターに連結されていてもよい、一組のポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
本明細書に記載されるアデノウイルスなどの他のベクターも意図するものであるが、その一組のポリヌクレオチドは、シングルベクターに含まれ、特にＤＮＡプラスミドに含まれることが好ましい。好ましくは、該ポリヌクレオチドは２つまたはそれ以上の別々のプロモーターの制御下にあることが好ましい。別法として、２つのポリヌクレオチドはシングルプロモーターの制御下にあってもよく、所望により第２のポリヌクレオチドの翻訳をポリヌクレオチドの間に内部リボソーム侵入部位を入れることで強化してもよい。
好ましくは一組のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のｇｐ１２０ポリヌクレオチドと、ＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇの融合体またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化するさらなるポリヌクレオチドとを含む。
【００３０】
好ましい一組のポリヌクレオチドは以下の群より選択される：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ＋ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ
【００３１】
これらの好ましい２つのポリヌクレオチドの組が、２つの別個のプロモーターの制御下、シングルベクターに含まれる場合には、このベクターをデュアルプロモーターと言うこともできる。
本発明の一組のポリヌクレオチドの一方または両方のタンパク質あるいは融合タンパク質の好ましいプロモーターは、より詳細には、５’非翻訳リーダー配列がＷＯ０２／３６７９２に記載され、本明細書にも記載されるように、エクソン１を含む場合の、ＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子から由来のプロモーターである。
【００３２】
さらにもう一つ別の態様において、本発明は本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドおよびベクターを提供する。
一の具体例において、本発明は、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体と、少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体とを含み、該追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの、融合タンパク質を提供する。
もう一つ別の具体例において、本発明は、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体と、少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体とを含み、当該少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの組成物を提供する。
【００３３】
もう一つ別の具体例において、本発明は、哺乳動物の細胞について最適化されるコドンであるポリヌクレオチドから発現される、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびベクターおよびポリペプチドを、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、担体またはアジュバントと共に含む医薬組成物を提供する。好ましい具体例において、ポリヌクレオチドであって、好ましくはＤＮＡベクターの形態で、好ましくは少なくとも１つのコドン最適化ＨＩＶ配列を含むものが、複数の粒子、好ましくは金ビーズなどのビーズであって、その上にＤＮＡがコートされているものを含む組成物中に存在する。
本発明のポリヌクレオチドの送達は、好ましくは粒子性送達、特に衝撃法により行われる。
本発明のベクターは免疫刺激剤と共に使用することができ、必ずしもそうとは限らないが、ベクターと同時に投与されるのが好ましく、本発明の組成物中に一緒に処方されるのが好ましい。
【００３４】
本発明において用いられる免疫刺激剤は次のものを包含するが、これらは排他的ではなく、他の薬剤を排除するものではない：合成イミダゾキノリン、例えば、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）［Ｓ−２６３０８、Ｒ−８３７］（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、「イミキモドを単独または糖タンパクワクチンとの組み合わせにおいて使用する再発性ＨＳＶ疾患の軽減（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ＨＳＶ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｌｏｎｅ ｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１８２０−１８２６、（２００１））；およびレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）［Ｓ−２８４６３、Ｒ−８４８］（Ｖａｓｉｌａｋｏｓら「免疫反応修飾剤Ｒ−８４８のアジュバント活性：ＣｐＧ ＯＤＮとの比較（Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｒ−８４８：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＣｐＧ ＯＤＮ）」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０４：６４−７４（２０００））、抗原提示細胞およびＴ細胞表面上で構成的に発現されるカルボニルおよびアミンのシッフ塩基、例えばツカレソール（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｊ．ら「共刺激シッフ塩基形成薬による免疫系の治療的増強作用（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ Ｓｃｈｉｆｆ−ｂａｓｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：７１−７５（１９９５））、サイトカイン、ケモカインおよびタンパク質またはペプチドまたはＤＮＡのいずれかとしての共刺激分子（これは炎症性サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータを包含する）、Ｔｈ１インデューサー、例えばインターフェロンガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８、Ｔｈ２インデューサー、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３および他のケモカインおよび共刺激遺伝子、例えばＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＣＡ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０Ｌ、他の免疫刺激ターゲティングリガンド、例えばＣＴＬＡ−４およびＬ−セレクチン、アポトーシス刺激タンパク質およびペプチド、例えばＦａｓ、（４９）、合成脂質ベースのリガンド、例えばバクスフェクチン（ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）、（Ｒｅｙｅｓら、「バクスフェクチンは抗原特異性抗体価を向上させ、プラスミドＤＮＡ免疫化に対するＴｈ１タイプの免疫反応を維持する（Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｒｅｓ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｓ Ｔｈ１ ｔｙｐｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３７７８−３７８６）、スクアレン、アルファ−トコフェロール、ポリソルベート８０、ＤＯＰＣおよびコレステロール、エンドトキシン、［ＬＰＳ］（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．，「エンドトキシン、Ｔｏｌｌ様レセプター４、および先天性免疫の求心性四肢（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，‘Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４，ａｎｄ ｔｈｅ ａｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｍｂ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：２３−３０（２０００））；ＣｐＧ ｏｌｉｇｏ−およびジヌクレオチド、Ｓａｔｏ，Ｙ．ら、「有効な皮内遺伝子免疫化に必要な免疫刺激ＤＮＡ配列（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ ｇｅｎｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３（５２７３）：３５２−３５４（１９９６）。Ｈｅｍｍｉ、Ｈら、「Ｔｏｌｌ様レセプターはバクテリアＤＮＡを認識する（Ａ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ）」、Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５、（２０００）およびＴｏｌｌレセプターが適当なＴｈ−１誘発サイトカイン、例えば合成マイコバクテリアリポタンパク質、マイコバクテリアタンパク質ｐ１９、ペプチドグリカン、タイコ酸およびリピッドＡを産生する引き金となる他の潜在的なリガンド。
【００３５】
本発明に関して用いられる好ましい免疫刺激剤はＧＭ−ＣＳＦである。これは本発明のＤＮＡワクチンと共に同時投与されるＧＭ−ＣＳＦを発現するポリヌクレオチドの形態で用いることができる。ＧＭ−ＣＳＦをコード化するＤＮＡプラスミドは本発明のポリヌクレオチドを含む医薬組成物中に存在していてもよい。
主にＴｈ−１型反応を惹起するための好ましいアジュバントとしては、例えば、リピッドＡ誘導体、例えばモノホスホリルリピッドＡ、または好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピッドＡが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（シアトル、ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号および第４，９１２，０９４号参照）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣＰＧジヌクレオチドがメチル化されていない）も主にＴｈ１反応を惹起する。このようなオリゴヌクレオチドはよく知られていて、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および第５，８５６，４６２号において記載されている。免疫刺激ＤＮＡ配列も、例えばＳａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２、１９９６により記載されている。もう一つ別の好ましいアジュバントは、サポニン、例えばＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）をはじめとするＱｕｉｌ Ａ、またはその誘導体；Ｅｓｃｉｎ；ジギトニン；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａまたはＣｈｅｍｏｐｏｄｉｕｍ ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。
【００３６】
本発明のさらに別の態様によると、ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞、または本発明の発現ベクターが提供される。宿主細胞は例えばバクテリア、例えばイー／コリ、哺乳動物、例えばヒトであってもよいし、あるいは昆虫細胞であってもよい。本発明のベクターを含む哺乳動物細胞はインビトロでトランスフェクトされた培養された細胞であってもよいし、あるいはベクターを哺乳動物に投与することによりインビボでトランスフェクトされた細胞であってもよい。
コドン最適化とは、ＤＮＡ配列が哺乳動物における遺伝子のコドン使用に類似するように最適化されることを意味する。特に、配列におけるコドン使用は高度に発現されたヒト遺伝子と類似するように最適化される。
ＤＮＡコードは４文字（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）を有し、生物の遺伝子におけるコード化されたアミノ酸タンパク質を表す３文字「コドン」を表すためにこれらを使用する。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線状配列を、これらの遺伝子によりコード化されるタンパク質におけるアミノ酸の直線状配列に翻訳する。コードは非常に縮重し、６１コドンが２０の天然のアミノ酸をコードし、３コドンが「停止」シグナルを表す。従って、ほとんどのアミノ酸は１以上のコドンによりコードされ、実際いくつかは４以上の異なるコドンによりコードされる。
【００３７】
所定のアミノ酸をコードするために１以上のコドンが利用可能である場合、生物のコドン使用パターンは非常に非無作為であることが観察されている。異なる種はそのコドン選択において異なった傾向を示し、さらにコドンの利用は高レベルおよび低レベルで発現される遺伝子間の一つの種において著しく異なる。この傾向は、ウイルス、植物、バクテリアおよび哺乳動物細胞において異なり、ある種は他よりもランダムなコドン選択からより強力な偏りを示す。例えば、ヒトおよび他の哺乳動物はある種のバクテリアまたはウイルスほど強力に偏っていない。これらの理由のために、イー・コリにおいて発現される哺乳動物遺伝子または哺乳動物細胞において発現される組み換え遺伝子が有効な発現のために不適当なコドンを有する顕著な可能性がある。コドンのクラスターまたは多量のコドンのヘテロローガスなＤＮＡ配列における存在は、発現顔凝る宿主においてほとんど観察されず、該宿主における低いヘテロローガスな発現レベルの前兆である。
本発明の一具体例において、実質的に非グリコシル化ｇｐ１２０アミノ酸配列をコード化するｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列が提供され、ここにおいて、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは高度に発現された哺乳動物遺伝子と類似している。好ましくは、ポリヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。望ましくは、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは高度に発現されたヒト遺伝子に典型的である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、コドン使用パターンはヒト免疫不全ウイルスに典型的なものから変更されて、標的生物、例えば哺乳動物、特にヒトのコドン傾向をさらに厳密に対応する。「コドン使用係数（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）」は、所定のポリヌクレオチド配列のコドンパターンが標的種のものとどれほど厳密に類似しているかの尺度である。コドン頻度は多くの種の高度に発現された遺伝子に関して文献から得ることができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９６、２４：２１４−２１５参照）。６１コドンのそれぞれについてのコドン頻度（選択された種類の遺伝子の１０００コドンあたりの発生数として表す）を２０の天然のアミノ酸のそれぞれについて標準化し、各アミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンについての値を１に設定し、それほど頻繁でないコドンにつての頻度を０から１の間になるように評価する。このようにして、６１コドンのそれぞれを標的種の高度に発現された遺伝子について１またはそれ以下に割り当てる。特定のポリヌクレオチドについてのコドン使用係数を、該種の高度に発現された遺伝子に対して計算するために、特定のポリヌクレオチドの各コドンについての評価された値を記録し、これらの値全ての幾何平均を取る（これらの値の自然対数の合計をコドンの総数で割り、真数を取る）。係数は０から１の間の値を有し、係数が高いほど、ポリヌクレオチドにおいてより多くのコドンが頻繁に用いられるコドンである。ポリヌクレオチド配列がコドン使用係数１を有するならば、コドンのすべては標的種の高度に発現された遺伝子の「最も頻繁な」コドンである。
【００３９】
本発明によると、ポリヌクレオチドのコドン使用パターンは好ましくは希少なコドンを排除する。希少コドンは、標的生物の高度に発現された遺伝子において特定のアミノ酸に関して用いられるコドンの＜２０％以上、またはさらに好ましくは＜１０％に対応するコドンとして定義される。あるいは、希少コドンは、標的生物の高度に発現された遺伝子において＜０．３、またはさらに好ましくは＜０．２の比較的同義のコドン使用（ＲＳＣＵ）値を有するコドンとして定義することができる。ＲＳＣＵ値は、該アミノ酸についての全コドンが等しい頻度で使用される場合に予想される数で観察されるコドン数を割ったものである。希少コドンの適当な定義は当業者には明かであろう。
本発明のポリヌクレオチドは一般に、０．３以上、好ましくは０．４以上、最も好ましくは０．５以上の高度に発現されたヒト遺伝子のコドン使用係数を有する。好ましくは、コドン使用係数は１．０未満、好ましくは０．９未満、さらに好ましくは０．８未満である。従って、０．５から０．９の間、または０．５から０．８の間のコドン使用係数が最も好ましい。ヒトについてのコドン使用表はＧｅｎｂａｎｋにおいて見いだすことができる。
比較として、高度に発現されたβアクチン遺伝子は０．７４７のコドン使用係数を有する。
【００４０】
人類のコドン使用表を以下に示す：
ヒト（高度に発現された）遺伝子のコドン使用 １／２４／９１（ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ）
アミノ酸 コドン 数 ／１０００ フラクション
Ｇｌｙ ＧＧＧ ９０５．００ １８．７６ ０．２４
Ｇｌｙ ＧＧＡ ５２５．００ １０．８８ ０．１４
Ｇｌｙ ＧＧＴ ４４１．００ ９．１４ ０．１２
Ｇｌｙ ＧＧＣ １８６７．００ ３８．７０ ０．５０
Ｇｌｕ ＧＡＧ ２４２０．００ ５０．１６ ０．７５
Ｇｌｕ ＧＡＡ ７９２．００ １６．４２ ０．２５
Ａｓｐ ＧＡＴ ５９２．００ １２．２７ ０．２５
Ａｓｐ ＧＡＣ １８２１．００ ３７．７５ ０．７５
Ｖａｌ ＧＴＧ １８６６．００ ３８．６８ ０．６４
Ｖａｌ ＧＴＡ １３４．００ ２．７８ ０．０５
Ｖａｌ ＧＴＴ １９８．００ ４．１０ ０．０７
Ｖａｌ ＧＴＣ ７２８．００ １５．０９ ０．２５
Ａｌａ ＧＣＧ ６５２．００ １３．５１ ０．１７
Ａｌａ ＧＣＡ ４８８．００ １０．１２ ０．１３
Ａｌａ ＧＣＴ ６５４．００ １３．５６ ０．１７
Ａｌａ ＧＣＣ ２０５７．００ ４２．６４ ０．５３
Ａｒｇ ＡＧＧ ５１２．００ １０．６１ ０．１８
Ａｒｇ ＡＧＡ ２９８．００ ６．１８ ０．１０
Ｓｅｒ ＡＧＴ ３５４．００ ７．３４ ０．１０
Ｓｅｒ ＡＧＣ １１７１．００ ２４．２７ ０．３４
Ｌｙｓ ＡＡＧ ２１１７．００ ４３．８８ ０．８２
Ｌｙｓ ＡＡＡ ４７１．００ ９．７６ ０．１８
Ａｓｎ ＡＡＴ ３１４．００ ６．５１ ０．２２
Ａｓｎ ＡＡＣ １１２０．００ ２３．２２ ０．７８
Ｍｅｔ ＡＴＧ １０７７．００ ２２．３２ １．００
Ｉｌｅ ＡＴＡ ８８．００ １．８２ ０．０５
Ｉｌｅ ＡＴＴ ３１５．００ ６．５３ ０．１８
Ｉｌｅ ＡＴＣ １３６９．００ ２８．３８ ０．７７
Ｔｈｒ ＡＣＧ ４０５．００ ８．４０ ０．１５
Ｔｈｒ ＡＣＡ ３７３．００ ７．７３ ０．１４
Ｔｈｒ ＡＣＴ ３５８．００ ７．４２ ０．１４
Ｔｈｒ ＡＣＣ １５０２．００ ３１．１３ ０．５７
Ｔｒｐ ＴＧＧ ６５２．００ １３．５１ １．００
Ｅｎｄ ＴＧＡ １０９．００ ２．２６ ０．５５
Ｃｙｓ ＴＧＴ ３２５．００ ６．７４ ０．３２
Ｃｙｓ ＴＧＣ ７０６．００ １４．６３ ０．６８
Ｅｎｄ ＴＡＧ ４２．００ ０．８７ ０．２１
Ｅｎｄ ＴＡＡ ４６．００ ０．９５ ０．２３
Ｔｙｒ ＴＡＴ ３６０．００ ７．４６ ０．２６
Ｔｙｒ ＴＡＣ １０４２．００ ２１．６０ ０．７４
Ｌｅｕ ＴＴＧ ３１３．００ ６．４９ ０．０６
Ｌｅｕ ＴＴＡ ７６．００ １．５８ ０．０２
Ｐｈｅ ＴＴＴ ３３６．００ ６．９６ ０．２０
Ｐｈｅ ＴＴＣ １３７７．００ ２８．５４ ０．８０
Ｓｅｒ ＴＣＧ ３２５．００ ６．７４ ０．０９
Ｓｅｒ ＴＣＡ １６５．００ ３．４２ ０．０５
Ｓｅｒ ＴＣＴ ４５０．００ ９．３３ ０．１３
Ｓｅｒ ＴＣＣ ９５８．００ １９．８６ ０．２８
Ａｒｇ ＣＧＧ ６１１．００ １２．６７ ０．２１
Ａｒｇ ＣＧＡ １８３．００ ３．７９ ０．０６
Ａｒｇ ＣＧＴ ２１０．００ ４．３５ ０．０７
Ａｒｇ ＣＧＣ １０８６．００ ２２．５１ ０．３７
Ｇｌｎ ＣＡＧ ２０２０．００ ４１．８７ ０．８８
Ｇｌｎ ＣＡＡ ２８３．００ ５．８７ ０．１２
Ｈｉｓ ＣＡＴ ２３４．００ ４．８５ ０．２１
Ｈｉｓ ＣＡＣ ８７０．００ １８．０３ ０．７９
Ｌｅｕ ＣＴＧ ２８８４．００ ５９．７８ ０．５８
Ｌｅｕ ＣＴＡ １６６．００ ３．４４ ０．０３
Ｌｅｕ ＣＴＴ ２３８．００ ４．９３ ０．０５
Ｌｅｕ ＣＴＣ １２７６．００ ２６．４５ ０．２６
Ｐｒｏ ＣＣＧ ４８２．００ ９．９９ ０．１７
Ｐｒｏ ＣＣＡ ４５６．００ ９．４５ ０．１６
Ｐｒｏ ＣＣＴ ５６８．００ １１．７７ ０．１９
Ｐｒｏ ＣＣＣ １４１０．００ ２９．２３ ０．４８
【００４１】
本発明のさらに別の態様に従って、本発明の第一の態様のポリヌクレオチド配列の発現を行うことができる発現ベクターであって、特にｇｐ１２０ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが高度に発現された哺乳動物遺伝子、好ましくは高度に発現されたヒト遺伝子に典型的である発現ベクターが提供される。ベクターはバクテリア、昆虫または哺乳動物の細胞、特にヒトの細胞においてヘテロローガスなＤＮＡの発現を行うのに好適である。一具体例において、発現ベクターはｐ７３１３である（図１参照）。
さらに別の態様において、本発明は、ＨＩＶ感染症、これに関連する任意の症状または疾患を治療または予防する方法であって、安全かつ有効な量の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
医薬組成物の投与は、１または１以上の個々の投与形態、例えば同じＤＮＡプラスミドの繰り返し量として、またはヘテロローガスな「プライムブースト」ワクチン接種レジメにおいて、特に治療用ワクチン接種レジメの形態をとることができる。ヘテロローガスなプライムブーストレジメは、プライムおよびブーストにおける異なる形態のワクチンの投与を使用し、そのそれぞれはそれ自体が２回以上の投与を含む。必ずしもそうでなくてよいが、好ましくは、プライミングおよびブースティング組成物は同じ抗原または同じ抗原の異なる形態を含む。プライミング組成物およびブースティング組成物は、いずれにしても少なくとも１つの抗原を共通に有するが、これは必ずしも同じ抗原の形態である必要はなく、同じ抗原の異なる形態であってもよい。同じ抗原の異なる形態の一例は、機能的シグナル配列が欠失し、哺乳動物細胞において実質的にグリコシル化されていないｇｐ１２０をコード化するポリヌクレオチド、およびそのシグナル配列を有するｇｐ１２０であり、グリコシル化されているポリペプチドの場合である。同じタンパク質の完全長および切形バージョン、または同じタンパク質の突然変異および非突然変異形態も、本発明のプライム−ブーストフォーマットの目的に関して同じ抗原の異なる形態と見なすことができる。
【００４３】
プライム−ブーストレジメの一例において、「プライム」ワクチン接種は、好ましくはプラスミドベクター中に組み入れられた、本発明のポリヌクレオチドまたは一組のポリヌクレオチドを含むプライミング組成物の粒子媒介ＤＮＡ送達によることができ、一方、「ブースト」投与は、同じポリヌクレオチド配列またはプライミング組成物によりコード化される同じ抗原の少なくとも１つをコード化するポリヌクレオチド配列を含む組み換えウイルスベクターを含むブースティング組成物のものであってもよい。あるいは、ブースティングは、アジュバント中タンパク質の形態において同じ抗原の少なくとも１つを用いて行うことができる。反対に、プライミングは、ウイルスベクターを含むプライミング組成物またはタンパク質処方、典型的にはアジュバント中に処方されたタンパク質を用いて行うことができ、ブーストは本発明のＤＮＡワクチンを用いて行うことができる。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドに関して用いられる好ましいプライム−ブーストフォーマットは次のものから選択される：
いる使用のための優先の主要なブーストのフォーマットが本発明によれば選択される：
タンパク質プライム／生ベクターブースト
生ベクタープライム／タンパク質ブースト
タンパク質プライム／ＤＮＡプラスミドブースト
ＤＮＡプラスミドプライム／タンパク質ブースト
生ベクタープライム／ＤＮＡプラスミドブースト
ＤＮＡプラスミドプライム／生ベクターブースト
【００４５】
好ましい生ベクターは、生ウイルスベクター、特に本明細書に記載するようなアデノウイルスベクターを包含する。
好ましくは、プライミングおよびブースティング組成物は、抗原に加えて、特定の組成物によっては異なっていてもよい適当なアジュバントを含む。
プライミング組成物およびブースティング組成物はどちらも１以上の用量で送達することができる。さらに、初回プライミングおよびブースティング用量に引き続いてさらなる投与を行い、これを交互に行って、その結果、例えば、ＤＮＡプラスミドプライム／タンパク質ブースト／さらなるＤＮＡプラスミド用量／さらなるタンパク質用量となる。
本発明はさらに、本明細書に記載するようなポリヌクレオチドの産生法であって、実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープ分子、好ましくはｇｐ１２０またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化するヌクレオチド配列と、所望により追加のＨＩＶタンパク質、例えばＴａｔなどのＨＩＶ非構造タンパク質またはＧａｇなどのＨＩＶカプシドタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列とをヘテロローガスなプロモーター配列と結合させることを含む方法を提供する。
【００４６】
前記のように、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを包含する。このような発現ベクターは、分子生物学の分野において日常的に構築され、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適当な開始剤、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えば、タンパク質発現を可能にするために必要である可能性があり、正しい方向に配置されたポリアデニル化シグナルの使用を含む。他の適当なベクターおよびこれの構築法は当業者には明らかである。この点に関するさらなる例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクター中で本発明において使用するためのポリヌクレオチドは宿主細胞によるコーディング配列の発現を提供することができる調節配列と操作可能に結合している。すなわち、ベクターは発現ベクターである。「操作可能に結合」なる用語は、記載される成分が、それらが意図される方法で機能することを許容する関係にある並置を意味する。コーディング配列と「操作可能に結合」した調節配列、例えばプロモーターは、コーディング配列の発現が調節配列と適合する条件下で達成されるような位置にある。
【００４７】
本発明の核酸配列は、遺伝子治療において有用な専門的なデリバリーベクターにより投与することができる。遺伝子治療法は、例えば、Ｖｅｒｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７、３８９：２３９−２４２により論議されている。ウイルスおよび非ウイルスベクター系のいずれも使用できる。ベクターは、例えば、プラスミド、人工染色体（例えばＢＡＣ，ＰＡＣ、ＹＡＣ）、複製の起源を備えたウイルスまたはファージベクター、所望によりポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび所望によりプロモーターのレギュレーターであってもよい。ベクターは１以上の選択マーカー遺伝子、例えば、バクテリアプラスミドの場合においてはアンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子あるいは真菌ベクターの耐性遺伝子を含有することができる。ベクターは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの産生のためにインビトロで使用できるか、またはベクターによりコード化されるタンパク質の産生に関しては宿主細胞、例えば哺乳動物細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用できる。ベクターはまた、例えばＤＮＡワクチン接種法または遺伝子治療法において、インビトロで使用するために適用することもできる。
適当なウイルスベクターの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスを含む）、アルファ−ウイルス、水痘ウイルス、例えばカナリア痘およびワクシニアウイルス系を包含する。これらのウイルスを使用する遺伝子導入技術は当業者には周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定に組み入れるためにレトロウイルスベクターを使用できるが、このような組み換えは好ましくない。複製−欠失アデノウイルスベクターは対照的にエピソームであり、従って一過性発現を許容する。例えばサブユニットワクチンとしてまたはイムノアッセイにおいて使用するための、本発明のポリヌクレオチドによりコード化される多量のＨＩＶタンパク質を産生するために、昆虫細胞（例えばバクロウイルスベクター）、ヒト細胞、酵母またはバクテリアにおける発現を行うことができるベクターを用いることができる。
【００４８】
好ましい具体例において、生ベクターとして用いられるアデノウイルスは複製欠失類人猿アデノウイルスである。典型的には、これらのウイルスはＥ１欠失を含み、Ｅ１遺伝子で形質転換された細胞系上で増殖させることができる。好ましい類人猿アデノウイルスは、チンパンジーから単離されたウイルスである。特に、Ｃ６８（Ｐａｎ９としても知られる）（米国特許第６０８３７１６号参照）およびＰａｎ５、６およびＰａｎ７（ＷＯ０３／０４６１２４）が本発明における使用に好ましい。従って、これらのベクターは本発明のヘテロローガスな遺伝子を挿入して、遺伝子産物が発現されるように操作することができる。このような組み換えアデノウイルスの使用、処方および製造は、ＷＯ０３／０４６１４２において詳細に記載されている。
【００４９】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、それに対して発現がデザインされる宿主細胞と適合するように選択することができる。例えば、哺乳動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属に反応して誘発することができるメタロチオネインプロモーター、およびβ−アクチンプロモーターを包含する。ウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）も使用できる。これらのプロモーターは全てよく記載され、当該分野において容易に入手可能である。
好ましいプロモーターエレメントは、イントロンＡが欠損しているが、エクソン１を含むＣＭＶ前初期プロモーターである。従って、ＨＣＭＶ ＩＥ初期プロモーターの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。適当なＨＣＭＶ ＩＥプロモーターはＷＯ０２／３６７９２に記載されている。
【００５０】
非ウイルスベースの系は、核酸、微小球カプセル化技術、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）およびリポソームベースの系の直接投与を包含する。
本発明のポリヌクレオチドはコード化されたタンパク質の発現による産生において有用性を有し、発現はインビトロ、インビボまたはエクスビボで行うことができる。従って、ヌクレオチドは、例えば収率を増大させるために組み換えタンパク質合成に関与することができるか、または実際それ自体が治療薬として有用であり、ＤＮＡワクチン接種技術において用いられる。本発明のポリヌクレオチドがインビトロまたはエクスビボでコード化されたタンパク質の産生において用いられる場合、例えば細胞培養物における細胞は発現されるポリヌクレオチドを含むように修飾される。このような細胞は一過性、または好ましくは安定な哺乳動物細胞系を包含する。本発明のポリペプチドをコード化するベクターの挿入により修飾することができる細胞の特定の例は、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３およびＣＯＳ細胞を包含する。好ましくは、選択される細胞系は安定なものである。発現は形質転換された卵母細胞において達成することができる。ポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞において本発明のポリヌクレオチドから発現することができる。本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
本発明はさらに、哺乳動物患者にワクチン接種する方法であって、有効量の本発明のワクチンまたはワクチン組成物を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡワクチン、ワクチン組成物および免疫療法において用いられる発現ベクターはプラスミドベクターまたは生ウイルスベクターである。
ＤＮＡワクチンは、「裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ」の形態、例えばシリンジまたは高圧ジェットを用いて投与される液体処方において、またはリポソームまたは刺激トランスフェクションエンハンサーとともに処方されたＤＮＡ、または本明細書においてさらに詳細に記載するような粒子性ＤＮＡ送達（ＰＭＤＤまたは粒子性免疫治療送達ＰＭＩＤ）により投与することができる。これらの送達系はすべて当該分野において周知である。ベクターは、例えばウイルスベクター送達システムにより哺乳動物に導入することができる。
【００５２】
本発明の組成物は、例えば筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内または経粘膜などの多くの経路により送達することができる。
本発明はさらに本明細書に記載するような医薬組成物を含む皮内送達装置を提供する。
好ましい具体例において、組成物は皮内送達される。特に、組成物は、特に、ベクターをビーズ（例えば金ビーズ）上にコートし、これを高圧下で表皮中に投与することを含む粒子衝撃投与技術を用いた遺伝子銃により送達される。これは、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４４：３７−４２（１９９６）に記載されている。
【００５３】
粒子衝撃法を行うための多くの方法が知られている。例えばＷＯ９１／０７４８７参照。一例において、ガスで作動する粒子加速は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）により製造されるものなどの装置を用いて達成することができ、その例のいくつかは、米国特許第５，８４６，７９６号；第６，０１０，４７８号；第５，８６５，７９６号；第５，５８４，８０７号；および欧州特許番号０５００７９９に記載されている。この方法は、注射針不要の送達法を提供し、該方法において、ポリヌクレオチドなどの微細粒子の乾燥粉末処方は、携帯型装置により生じるヘリウムガスジェット内で高速に加速され、興味のある標的組織、典型的には皮膚中に粒子を推進させる。粒子は好ましくは０．４〜４．０μｍ、さらに好ましくは０．６〜２．０μｍの直径の金ビーズ、およびこれらの上にコートされ、その後送達装置中に入れられるカートリッジまたはカセット中に入れられるＤＮＡ接合体である。
【００５４】
関連する具体例において、本発明の組成物のガスで作動するニードルレス注入に有用である他の装置および方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）により提供されるものを包含し、その例のいくつかは、米国特許第４，７９０，８２４号；第５，０６４，４１３号；第５，３１２，３３５号；第５，３８３，８５１号；第５，３９９，１６３号；第５，５２０，６３９号および第５，９９３，４１２号に記載されている。
抗原ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むベクターは、予防的または治療的に有効であるような量において投与される。投与される量は一般に、粒子性送達については１ピコグラムから１ミリグラム、好ましくは１ピコグラムから１０マイクログラムの範囲であり、他の経路については１００ナノグラムから１０ミリグラムの範囲（ヌクレオチド／用量）である。正確な量は免疫化される患者の体重および投与経路によってかなり変化し得る。
【００５５】
抗原ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む免疫原成分を単発で投与するか、または例えば１〜７回の間、好ましくは１〜４回の間、約１日〜約１８日の間の間隔で繰り返し投与することが可能である。患者の一生涯免疫反応を維持するために必要ならばさらなる投与を行うこともできる。しかしながら、この治療形態は、関連する患者の大きさ、投与されるヌクレオチド配列の量、投与経路、および熟練した医師には自明であろう他の要因によって著しく変わるであろう。患者は１以上の他の抗ＨＩＶレトロウイルス薬を全体的な治療レジメの一部として受けることができる。さらに、核酸免疫源をアジュバントと共に投与することができる。
本明細書において指定されるアジュバント成分を、例えば、経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、皮内または局所経路などの様々な異なる投与経路により同様に投与することができる。好ましくは、アジュバント成分は、皮内または局所経路、最も好ましくは局所経路により投与される。この投与はヌクレオチド配列の投与前約１４日から投与後約１４日の間、好ましくはヌクレオチド配列の投与前約１日から投与後約３の間で行うことができる。
【００５６】
アジュバント成分は、一具体例において、ヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に投与される。「実質的に同時」とは、アジュバント成分の投与が好ましくはヌクレオチドの投与と同時であるか、またはもしそうでなければ、ヌクレオチド配列投与の前後何れかの少なくとも数時間以内であることを意味する。最も好ましい治療プロトコルにおいて、アジュバント成分はヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に投与される。明らかに、このプロトコルは必要に応じて、前記の種類の変数にしたがって変化し得る。アジュバントは１Ｈ−イミダゾ［４，５ｃ］キノリン−４−アミン誘導体、例えばイミキモドであるのが好ましい。典型的には、イミキモドは局所クリーム処方として提供され、前記プロトコルにしたがって投与される。
【００５７】
ここでも、このような変数によって、誘導体の投与量も変化するが、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、ここにおいて「／ｋｇ」とは関連する哺乳動物の体重を意味する。１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体の投与は、それぞれの後にまたは追加のヌクレオチド配列投与を伴って繰り返される。最も好ましくは、投与量は約１ｍ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間である。本明細書に記載するような「プライム−ブースト」スキームの場合において、イミキモドまたは他の１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体をプライムまたはブーストの何れかまたはプライムとブーストの両方で投与することができる。
【００５８】
アジュバント成分が未処理の化学状態で投与される１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体のみを含むことができる場合、投与は医薬処方の形態であるのが好ましい。すなわち、アジュバント成分は好ましくは１以上の医薬的に許容される担体、および所望により他の治療成分との組み合わせで１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンを含む。担体は処方内の他の成分と適合性であり、その受容者に対して有害でないという意味で「許容され」なければならない。処方の性質は意図される投与経路に従って当然変わり、製薬分野において周知の方法により調製することができる。全ての方法は、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を適当な担体と結合させる工程を含む。一般に、処方は、誘導体を液体担体または微粉化された固体担体または両者と均一かつ密接に結合させ、次いで必要ならば所望の処方に生成物を成形することにより調製される。経口投与に好適な本発明の処方は、それぞれがあらかじめ決められた量の活性成分を含有するカプセル、カシェ剤または錠剤などの個別の単位として；粉末または顆粒として；水性液体または非水性液体中溶液または懸濁液として；または水中油液体エマルジョンまたは油中水エマルジョンとして提供することができる。活性成分はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提供することもできる。
【００５９】
錠剤は所望により１以上の補助成分と共に圧縮または成形することにより調製できる。圧縮錠剤は、適当な機械で、所望によりバインダー、滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤または分散剤と混合した粉末または顆粒などの易流動性形態において活性成分を圧縮することにより調製できる。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を適当な機械で成形することにより製造できる。
錠剤は所望によりコートするかまたはスコアリングすることができ、活性成分の遅延または制御放出を提供できるように処方できる。
【００６０】
例えば、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下投与経路による注射用処方は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および意図される受容者の血液と等張な処方にする溶質を含有する水性および非水性無菌注射液；および懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液を含む。処方は、１回量または複数回量容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中で提示することができ、使用直前に、無菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態において貯蔵することができる。即席の注射溶液および懸濁液は、既に記載したような種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。口腔または鼻腔を経由した肺投与に適した処方は、活性成分を含有し、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子が受容者の気管支樹中に送達されるように提示される。かかる処方は、好都合には、吸入装置において使用するための、適当には例えばゼラチンなどの穿孔可能なカプセルにおいて、あるいは活性成分、適当な液体プロペラントおよび所望により他の成分、例えば界面活性剤および／または固体希釈剤を含む自己推進性処方としてのいずれかで提示できる微粉砕された粉末の形態であり得る。活性成分が溶液または懸濁液の液滴の形態中に分配されている自己推進処方も用いることができる。自己推進性処方は当該分野において公知のものと類似であり、確立された手順により調製することができる。これらは適当には所望の噴霧特性を有する手動で作動可能かまたは自動的に機能するバルブの何れかを備え；有利には該バルブはそのそれぞれの操作により例えば５０〜１００μＬの一定体積を送達する定量タイプのものである。
【００６１】
さらなる可能性において、アジュバント成分は、アトマイザーまたはネブライザーにおいて用いられる溶液の形態であり、これにより気流または超音波撹拌を用いて、吸入用の微細液滴のミストが生じる。
鼻内投与に適した処方は、一般に肺投与について既に記載したものと類似した形態を包含するが、鼻腔内での停留を可能にするためには、このような処方は約１０〜約２００ミクロンの範囲の粒子直径を有するのが好ましい。これは、必要に応じて、適当な粒子サイズの粉末を使用するか、または適当なバルブを選択することにより達成できる。他の適当な処方は、鼻に近づけて保持された容器から鼻道を通って迅速に吸入することによる投与については、約２０〜約５００ミクロンの範囲の粒子直径を有する粗粉末、および水性または油性溶液中約０．２〜５重量％の活性成分を含む点鼻薬を包含する。本発明の一具体例において、抗原性ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むベクターを１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体と同じ処方内で投与することが可能である。従って、この具体例において、免疫原性およびアジュバント成分は同じ処方内で見いだされる。
【００６２】
一具体例において、アジュバント成分は、バイオリスティック投与に好適な形態において調製され、ヌクレオチド配列の投与と実質的に同時に該経路により投与される。この方法での使用に適した処方の調製について、１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン誘導体を凍結乾燥し、例えばバイオリスティック投与に適した金ビーズなどの粒子上に付着させることが必要とされる。
別の具体例において、アジュバント成分は乾燥粉末として、高圧ガス推進により投与することができる。
一緒に処方されないとしても、アジュバント成分をヌクレオチド配列と同じ投与部位またはその付近に投与することが適当である。
製剤の他の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｙｓｙｌｖａｎｉａ（１９８５）において見いだすことができる（この開示は全体として本発明の一部として参照される）。
【００６３】
裸のポリヌクレオチドまたはベクターを患者に導入するための適当な技術はまた、適当なビヒクルを用いた局所適用を包含する。核酸は皮膚に、または粘膜表面に、例えば鼻内、経口、膣内または直腸内投与により局所投与することができる。裸のポリヌクレオチドまたはベクターは、医薬的に許容される賦形剤、例えばリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）とともに存在し得る。ＤＮＡ取込みは、促進剤、例えばブピバカインをＤＮＡ処方と別にまたはＤＮＡ処方中に含めてのいずれかで使用することによりさらに促進することができる。核酸を直接受容者に投与する他の方法は、超音波、電気刺激、エレクトロポレーションおよび米国特許第５，６９７，９０１号に記載されているマイクロシーディングを包含する。
核酸構築物の取込みは、いくつかの公知トランスフェクション技術、例えばトランスフェクション剤の使用を含むものにより向上させることができる。これらの薬剤の例としては、カチオン剤、例えばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランおよびリポフェクタント、例えばリポフェクタムおよびトランスフェクタムが挙げられる。投与される核酸の用量は変更することができる。
【００６４】
本発明の核酸配列はまた、遺伝子治療において有用な専門のデリバリーベクターにより投与することもできる。遺伝子治療法は、例えば、Ｖｅｒｍｅら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７、３８９：２３９−２４２により論じられる。ウイルスおよび非ウイルスベクター系の両方とも使用でき、前記のとおりである。ウイルスおよび非ウイルス送達系は、初回ワクチン接種後にブースター注射を提供することが望ましい場合に組み合わせることができる。例えば、プラスミドなどの非ウイルスベクターを用いて初回「プライム」ＤＮＡワクチン接種をし、続いてウイルスベクターまたは非ウイルスベースの系を用いて１回以上「ブースト」ワクチン接種を行う。同様に、本発明は、本発明のポリヌクレオチドでのプライムブースト系と、それに続いてアジュバント中タンパク質を追加抗原投与すること、またはその逆を意図する。
【００６５】
本発明の核酸配列は形質転換された細胞によっても投与することができる。このような細胞は、対象から収穫される細胞を包含する。本発明の裸のポリヌクレオチドまたはベクターをインビトロでこのような細胞中に導入することができ、形質転換された細胞を後に対象に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドはホモローガスな組み換え事象により細胞中に既に存在する核酸中に組み入れることができる。形質転換された細胞は、所望により、インビトロで成長させることができ、１以上の結果として得られる細胞を本発明において使用できる。細胞を公知の外科または顕微鏡手術技術（例えば、グラフティング、微量注射など）により患者における適当な部位に提供することができる。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、前記のようなアジュバント化合物、またはＤＮＡによりコード化されるタンパク質により誘発される免疫反応を増大させる働きをする他の物質を含むことができる。これらは、抗原と別にあるいは抗原との融合物としてのいずれかでＤＮＡによりコード化することができるか、または処方の非ＤＮＡエレメントとして含めることができる。本発明の処方中に含めることができるアジュバントタイプの物質の例としては、ユビキチン、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、ＦＬＴ３−リガンド（プロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞の生成において重要なサイトカイン）および他のサイトカイン、例えばＩＦＮ−γおよびＧＭＣＳＦが挙げられる。他の好ましいアジュバントとしては、イミキモドおよびレスイミキモドおよびツカラソールが挙げられ、イミキモドが特に好ましい。
【００６７】
本発明の特定の具体例において、イミキモドと共に投与される、ＨＩＶ感染症の治療または予防のための本明細書に記載されている核酸分子の使用が提供される。イミキモドは好ましくは局所投与されるが、核酸分子は粒子性送達により投与されるのが好ましい。
従って、本発明はさらにＨＩＶ感染症にかかっている患者またはかかりやすい患者の治療法であって、本明細書に記載するような核酸分子およびイミキモドを投与することを含む方法も提供する。
【００６８】
本発明を以下の実施例を用いて説明する：
実施例１
プラスミド構築
１ ｇｐ１２０含有プラスミドの構築
以下の実施例において記載されている組み換えｇｐ１２０糖タンパク質は、ＨＩＶ−１単離株Ｗ６１Ｄのｇｐ１２０エンベロープタンパク質の合成形態である。
最適化コドン（ｐｇｐ１２０ｃ）
遺伝子配列はＨＩＶ−１単離株Ｗ６１Ｄからのｇｐ１２０配列に基づくものであった。これは、０．２９７のコドン使用係数を有する。最適化はＳｙｎＧｅｎｅ２ｄを用いて行われ、その結果、０．７４９のＣＵＣが得られた（Ｅｒｔｌ、ＰＦ．、Ｔｈｏｍｓｅｎ、ＬＬ．核酸ワクチンの構築における技術的問題（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．）（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ３１（３）；１９９−２０６）。ＳｙｎＧｅｎｅは使用の相対頻度に基づくコドン最適化のための数学的方法を使用する。簡単に言うと、コドンは、より頻度の高いコドンがより広い範囲を有するように、その頻度に従って割り当てられた値の範囲であり、頻度の昇順に並べられる。値の範囲は、＞＝０．０００、＞＝０．０？？、＞＝０．？？？などとして表される。０から０．９９９９９の間に乱数が生じる。次いでコドンを選択するためにこれを使用し、これは乱数がその中に収まるような範囲を割り当てられたコドンであろう。希少コドンを排除するために、０．１−１．０９９９９の範囲に収まるように、値０．１を乱数に加える。
ｇｐ１２０配列は４０の重複オリゴヌクレオチドに開裂され、ＰＣＲ構築され、エンドプライマーを用いて回収される。遺伝子をＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてベクターｐ７３１３−ｉｅ（図１に示す）中にクローンし、配列化させる。３つの当初のクローンからの制限フラグメントを組み合わせて、単一の適当なクローンを得た。アミノ酸配列およびコドン最適化ＤＮＡ配列を図２に示す。
【００６９】
１．２ Ｎｅｆ／Ｔａｔ含有プラスミドの生成
Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｐＮＴｍおよびｐｔｒＮＴｍ）
Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合タンパク質の遺伝子がプラスミドｐＲＩＴ１５２４４（図３）において供給された。プラスミドｐＲＩＴ１５２４４はＨｉｓテイルが欠失している以外は以下に記載するｐＲＩＴ１４９１３と同じである。
【００７０】
総論
Ｂｒｕ／Ｌａｉ単離株からのＮｅｆ遺伝子（Ｃｅｌｌ ４０：９−１７、１９８５）はコンセンサスＮｅｆに最も密接に関連するものに含まれるので、これを構築物に関して選択した。
Ｂｒｕ／Ｌａｉ Ｎｅｆ遺伝子の出発物質は、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３上でクローンされた１１７０ｂｐのＤＮＡフラグメント（ｐｃＤＮＡ３／Ｎｅｆ）であった。
Ｔａｔ遺伝子はＢＨ１０分子クローンに由来する。この遺伝子はｐＣＶ１と称し、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９、ｐ６９−７３、１９８５に記載されているＨＴＬＶ ＩＩＩ ｃＤＮＡクローンとして受容される。このＴａｔ遺伝子は、活性部位領域（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）およびＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ７８→ＬｙｓおよびＡｓｐ８０→Ｇｌｕ）において突然変異を有する（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：４８−６４、１９９７）。
突然変異ｔａｔ遺伝子は、ＣＭＶ発現プラスミド（ｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥ）内のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間でサブクローンされたｃＤＮＡフラグメントとして受容された。
【００７１】
ベクターｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質をコード化する）の構築
ｎｅｆ遺伝子はプライマー０１および０２でｐｃＤＮＡ３／ＮｅｆプラスミドからＰＣＲにより増幅された。
ＮｃｏＩ
プライマー０１：５’ＡＴＣＧＴＣＣＡＴＧ．ＧＧＴ．ＧＧＣ．ＡＡＧ．ＴＧＧ．Ｔ３［配列番号１］
ＳｐｅＩ
プライマー０２：５’ＣＧＧＣＴＡＣＴＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡ３［配列番号２ ］された
【００７２】
組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターＰＨＩＬ−Ｄ２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用した。このベクターはヘテロローガスなタンパク質の発現が、ＡＯＸ１遺伝子の本来のＡＴＧコドンの直後で始まり、１つのグリシンおよび６つのヒスチジン残基のテールを有する組み換えタンパク質を産生するように修飾された。ＰＨＩＬＥ−Ｄ２ベクターの隣接するＡｓｕＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位間にオリゴヌクレオチドリンカーをクローンすることにより、このＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターを構築した。Ｈｉｓテールに加えて、このリンカーはｎｅｆ、ｔａｔおよびｎｅｆ−ｔａｔ融合物がその間に挿入されたＮｃｏＩ、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を有する。
得られたｎｅｆＰＣＲフラグメントおよび組み込みＰＨＩＬ−Ｄ２−ＭＯＤベクターはどちらもＮｃｏＩおよびＳｐｅＩによって制限され、アガロースゲル上で精製され、結紮されて、組み込みプラスミドｐＲＩＴ１４５９７を形成する。
【００７３】
ベクターｐＲＩＴ１４９１３（融合Ｎｅｆ−Ｔａｔ突然変異体−Ｈｉｓをコード化する）の構築
ｐＲＩＴ１４９１３を構築するために、プライマー０３および０４でｐＣＭＶＬｙｓ４１／ＫＧＥプラスミドからＰＣＲによりｔａｔ突然変異遺伝子を増幅した。
ＳｐｅＩ
プライマー０３：５’ＡＴＣＧＴＡＣＴＡＧＴ．ＧＡＧ．ＣＣＡ．ＧＴＡ．ＧＡＴ．３［配列番号３］
ＳｐｅＩ
プライマー０４：５’ＣＧＧＣＴＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴ３’［配列番号４］
得られたＰＣＲフラグメントおよびプラスミドｐＲＩＴ１４５９７（Ｎｅｆ−Ｈｉｓタンパク質を発現する）はどちらもＳｐｅＩ制限酵素によって消化され、アガロースゲル上で精製され、結紮されて、組み込みプラスミドｐＲＩＴ１４９１３を形成した。
【００７４】
ｇｐ１２０およびＮｅｆ／ＴａｔのＰＭＩＤベクターの生成
ｇｐ１２０：コドン最適化ｇｐ１２０は前記のようにして提供された。
Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｐＮＴｍおよびｐｔｒＮＴｍ）：
Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合タンパク質の遺伝子は前記のプラスミドｐＲＩＴ１５２４４において提供された。このプラスミドにおけるＴａｔはトランス活性化機能を不活化する３つの突然変異を含有する。融合物は、Ｎ−末端切断により排除される、免疫調節機能を有する完全長Ｎｅｆ（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＢｏｌｔｉｍｏｒｅ（１９９９））を含有する。従って、構築物は完全長Ｎｅｆ／突然変異体Ｔａｔ（ｐＮＴｍ）および切形Ｎｅｆ／突然変異体Ｔａｔ（ｐｔｒＮＴｍ）（Ｎｅｆの最初の６５アミノ酸が除去されている）の両方について生成した。これらの配列を、次のプライマーを使用してｐＲＩＴ１５２４４からＰＣＲ増幅した：
５’Ｎｅｆ ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧ
５’ｔｒＮｅｆ ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＣ
３’Ｔａｔ ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧ［配列番号：５，６，７］
ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして遺伝子をベクターｐ７３１３−ｉｅ中にクローンし、配列化した。ＰＮＴｍおよびｐｔｒＮＴｍおよびＮｅｆ／Ｔａｔおよび切断Ｎｅｆ／Ｔａｔ配列を図４および５に示す。
【００７５】
二重発現ベクター：（ｐＲＩＸ１およびｐＲＩＸ２）
Ｎｅｆ／ＴａｔおよびｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ発現カセットをＣｌａＩ−ＸｍｎＩ制限フラグメントとして切除し、コドン最適化ｇｐ１２０（ｐｇｐ１２０ｃ）を含有するベクターのＣｌａＩおよび平滑化されたＳｓｅ８３８７Ｉ部位中に結紮して、両タンパク質の発現のためのシングルプラスミド（それぞれｐＲＩＸ１およびｐＲＩＸ２）を得た。
【００７６】
プラスミドｐ７３１３−ｉｅの組成（図１）
ｐＵＣ１９のＥａｍ１１０５Ｉ−Ｐｓｔ１フラグメントを含有するベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｔｄ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｌａｃｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｓ、ＨＰ７ ９ＮＡから入手可能）を、カナマイシン耐性遺伝子を含有するｐＵＣ４ＫのＥｃｏＲＩフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と置換し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて両フラグメントを平滑末端にすることにより、プラスミドを構築した。ヒトサイトメガロウイルスＩＥ１プロモーター／エンハンサー、イントロンＡは、Ｈａｒｒｉｅｔ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ博士（マサチューセッツ大学）から入手し、ＸｈｏＩ−Ｓａｌ１フラグメントとしてｐＵＣ１９のＳａｌ１部位中に挿入されたプラスミドＪＷ４３０３から誘導され、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを組み入れている。プロモーターからの５’ＳａｌＩ−ＢａｎＩフラグメントの欠失により、ベクターにおいて用いられる最小プロモーターが生じた（ＷＯ００／２３５９２−Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．）。ＨＢＶ表面抗原３’ＵＴＲは、ベクターｐＡＭ６においてＢ型肝炎ウイルス、血清型ａｄｗから誘導された（Ｍｏｒｉａｒｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、２６０６−１０、１９８１）。ｐＡＭ６（ｐＢＲ３２２ベースのベクター）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（カタログ番号ＡＴＣＣ ４５０２０）から入手した。３’ＵＴＲを、ＢａｍＨＩ部位を除去するために挿入のために平滑末端化した１．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントとしてポリアデニル化シグナルに対して５’に挿入した。一連の工程（Ｂｇｌ ＩＩ、クレノウポリメラーゼ処理、ＢｓｔＸ Ｉでの消化、Ｎｃｏ Ｉでの消化、オーバーハングを除去するためのマング・ビーンヌクレアーゼでの処理、およびＢｓｔＸ Ｉでのさらなる消化を含む）において、Ｘ遺伝子プロモーターとｂＧＨｐＡシグナル間の５コドンよりも大きなオープンフィーディングフレームをすべて除去するためにＨＢＶ Ｓ遺伝子の３’未翻訳領域およびｂＧＨｐＡシグナルの間の領域に修飾を施した。この結果、Ｘタンパク質の翻訳可能な部分（９アミノ酸）をコード化する配列およびＸ遺伝子開始コドンが欠失した。ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを、ウサギベータグロブリンポリアデニル化シグナルと置換した。Ｓ抗原の５’非コーディングおよびコーディング配列を切除し、オリゴヌクレオチドリンカーと置換すると、図示するような複数のクローニング部位が提供され、プラスミドｐ７３１３−ＰＬが産生された。
Ｈｉｎｄ−−−ＮｏｔＩ―― ＥｃｏＲＶ− −ＮｄｅＩ− −ＢａｍＨＩ
ＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＴＡＣＣＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣ ・・・
．．． ＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＧＧＣＣＧＧ
−ＮｈｅＩ− −ＫｐｎＩ− −ＳａｌＩ− ΔＮｏｔＩ
［配列番号：８］
【００７７】
このポリリンカーはＫｐｎＩおよびＳａｌＩ部位間の追加のオリゴヌクレオチドリンカーの挿入によってさらに伸長された：
ＡｓｐＩ− −ＭｕｎＩ− ＮａｅＩ− ＮｄｅＩ−− ＢｇｌＩＩ−
ＧＴＡＣＣＧＧＴＣＡＡＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧ−−−−
ＧＣＣＡＧＴＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴ
ＡｇｅＩ− −ＮａｒＩ―― ＡａｔＩＩ− ＳａｌＩ
［配列番号９］
【００７８】
ＣｏｌＥ１ ｃｅｒ配列を、Ｄａｖｉｄ Ｈｏｄｇｅｓｏｎ（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得たプラスミドｐＤＡＨ２１２からのサブクローンから得、プライマーを用いてＰＣＲにより増幅して、配列の末端にＥｃｏＲＩ制限部位を配置した。ｃｅｒ配列は次いでｐ７３１３−ＰＬのＥｃｏＲＩ部位中に挿入されて、プラスミドｐ７３１３−ＰＬｃを生じる。増幅されたｃｅｒの配列をＧｅｎｂａｎｋエントリーＭ１１４１１に対して検証した。
プロモーターおよびポリアデニル化シグナル間のＨＢＶ ３’ＵＴＲ配列を、プライマー：
センス：ＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣ［配列番号１０］
アンチセンス：ＧＴＴＡＧＧＧＴＧＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣ［配列番号１１］
を用いてポリアデニル化シグナルのＰＣＲ増幅により除去した。
結果として得られる生成物を、ＢａｍＨＩおよびＸｍｎＩで切断し、ポリアデニル化シグナルおよび３’ＵＴＲの両方を含有する対応するフラグメントを置換するために使用した。
プライマー：
センス：ＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣ［配列番号１２］
アンチセンス：ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＴＴＧＧＣＡＣＧＧＧＧ［配列番号１３］
を用いたＣＭＶプロモーター／エンハンサーのＰＣＲ増幅により、イントロンＡ配列をプラスミドから除去した。
結果として得られる生成物をＳｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩで切断し、親ベクターのＳｓｅ８３８７ＩおよびＮｏｔＩ部位中に挿入した。
【００７９】
実施例２
ｇｐ１２０およびＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍｕｔ）発現ベクターの修飾
ｇｐ１２０構築物を修飾して、タンパク質の分泌を減少させた。
構築物の生成：
分泌シグナルがないｇｐ１２０（ｄｓｇｐ１２０、ｐＲｉｘ１２ 図２および６参照）
次のプライマーを使用してｇｐ１２０遺伝子をｐｇｐ１２０ｃからＰＣＲ増幅した：
５’１２０ｄｓ：５’ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣ［配列番号１４］
Ｌ０１：５’ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＧ［配列番号：１５］
ＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）およびサイクル：
９５℃（３０秒）９５℃（３０秒）５０℃（３０秒）７２℃（９０秒）７２℃（１２０秒）４℃（保持） ＼＿＿＿＿ ２０回繰り返し＿＿＿＿／
を使用してフラグメントを増幅した。
生成物をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐ７３１７中にクローンして、ｐＲｉｘ１２を得た（図６）。
結果
２９３Ｔ細胞において、分泌シグナルが欠失したベクターｐＲＩＸ１２は、良好な量の分泌されない６０ｋＤａの非グリコシル化タンパク質を形成する。
【００８０】
実施例３
シングルプラスミドからのｇｐ１２０およびＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍｕｔ）の発現のためのベクターの構築
ベクター構築：
ｐｇ１２０およびＮｅｒ／Ｔａｔ（ｍ）またはｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）ｏｒｆｓをステッチするＰＣＲにより、ｇｐ１２０Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）構築物を得た。
５’および３’Ｇｐ１２０、５’および３’Ｎｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）および５’ｔｒＮｅｆ／ＴａｔをｐＲｉｘ１から増幅した。３’ｔｒＮｅｆ／Ｔａｔ（ｍ）をｐＮＴｍから増幅した。次のプライマーを使用した：
３’１２０：（アンチセンス）：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡ［配列番号１６］
５’１２０／ＮＴ：
ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴ［配列番号１７］
３’ＮＴ（アンチセンス）：ＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡ［配列番号１８］
５’ＮＴ／１２０：
ＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡＧ［配列番号１９］
５’１２０／ｔｒＮ：
ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣ［配列番号２０］
５’ｔｒＮｅｆ：
ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣＣ ［配列番号２１］
Ｌ０１：
ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＧ［配列番号：２２］
Ｌ０２：
ＡＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣ［配列番号２３］
【００８１】
フラグメントを、ＰＷＯ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）およびサイクル：
９５℃（６０秒）９５℃（３０秒）５５℃（３０秒）７２℃（１２０秒）７２℃（１２０秒）４℃（保持） ＼＿＿＿＿ ２０回繰り返し＿＿＿＿／
を使用して増幅した。
プライマーＬ１を３’ｇｐ１２０の３’プライマーとして使用した。しかしながら、Ｎｅｆ／ＴａｔまたはｔｒＮｅｆ／Ｔをｇｐ１２０の５’末端とステッチする場合にこのプライマーを使用すると問題があったので、プライマーＬ２を代わりに使用した。
ステッチされたｇｐ１２０−Ｎ／Ｔｍおよびｇｐ１２０−ｔｒＮ／ＴｍフラグメントをＮｏｔ１およびＢａｍＨＩで切断し、同様に切断されたｐ７３１３−ｉｅ中にクローンした。Ｌ１ではなくプライマーＬ２を使用することにより、Ｎ／Ｔｍ−ｇｐ１２０およびｔｒＮ／Ｔｍ−ｇｐ１２０フラグメントはＢａｍＨＩ部位が欠失するので、これらをＮｏｔＩおよびＡｃｃＩで切断し、同様に切断されたｐｇｐ１２０ｃ中にクローンした。すべての挿入物をシーケンシングにより完全に検証した。プラスミドはｐＲｉｘ６（ｇｐ１２０ｃ ＮｅｆＴａｔｍ）およびｐＲｉｘ１１（ｇｐ１２０ｃ ｔｒＮｅｆＴａｔｍ）で表される。
【００８２】
実施例４
グリコシル化および分泌、Ｔａｔの包含およびＧａｇ（ｐ１７／２４）およびＮｅｆおよびＲＴの包含のｇｐ１２０およびｇｐ１２０融合物に対する影響を調査するためのベクターの構築
図２９および３０（概略図）に示すようにベクターを構築した。
ｐＲｉｘ２８およびｐＲｉｘ２９（図７および８）
ｐＲｉｘ６（２３１５ｂｐ）およびｐＲｉｘ１１（２１２３ｂｐ）からのＡｃｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを同様に切断されたＲｉｘ１２（ｄｓ ｇｐ１２０ｃ）中に移すことにより、ｄｓ ｇｐ１２０ｃ ＮｅｆＴａｔｍおよびｄｓ ｇｐ１２０ｃ ｔｒＮｅｆＴａｔを含有するｐＲｉｘ２８および２９が生成した。
ｐＲｉｘ３０およびｐＲｉｘ３１（図９）
Ｔａｔがないｇｐ１２０ｃ Ｎｅｆのグリコシル化および非グリコシル化融合ベクターを生成するために、ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＲｉｘ１１（１５８０ｂｐ）またはｐＲｉｘ２９（１４９６ｂｐ）から同様に切断されたｐＲｉｘ１５、Ｔａｔ／ｔｒＮｅｆを含有するベクター中に移した。
【００８３】
（ｐＲｉｘ１５）−Ｔａｔ（ｍｕｔ）ｔｒＮｅｆ
ＴａｔおよびｔｒＮｅｆの遺伝子は次のプライマーを使用してｐＮＴｍからＰＣＲ増幅された：
５’Ｔａｔ：５’ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣ［配列番号２４］
３’Ｔａｔ：’ＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＣ［配列番号２５］
５’ｔｒＴＮ：ＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＣＡＣＡＣ［配列番号２６］
３’Ｎｅｆ：ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ［配列番号２７］
個々の遺伝子をゲル精製し、次いでエンドプライマーを使用してＴｍｔｒＮを得るためにＰＣＲステッチした。融合物を次いでＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐ７３１３−ｉｅ中にクローンした。
【００８４】
ｐＲｉｘ３２
ｐ１７／２４を含有する融合物を生成するために、プライマーＵ１および３’１２０を用いてｐｇｐ１２０ｃからｇｐ１２０をＰＣＲ増幅し、プライマー５’１２０Ｇおよび３’Ｎｅｆを使用してｐ７３ｉ−ＧＮ２からｐ１７／２４−Ｎｅｆを増幅し、Ｕ１および３’Ｎｅｆを使用して両者をＰＣＲステッチした。ｐ７３Ｉ−ＧＮ２はＨＸＢ２（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＫ０３４５５）に基づくｐ１７／ｐ２４の合成コドン最適化配列を含有し、ＳｙｎＧｅｎｅを使用して設計され、前記のコドン最適化ｇｐ１２０について記載したように重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、プラスミドｐＨＸＢΔＰｒ（Ｂ．Ｍａｓｃｈｅｒａ、Ｅ ＦｕｒｆｉｎｅおよびＥ．Ｄ．Ｂｌａｉｒ １９５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６９ ５４３１−５４３６）からＰＣＲにより得たＨＸＢ２ Ｎｅｆと融合させた。このプラスミドにおけるＨＸＢ２ ｎｅｆ遺伝子は早期終止コドンを含有するので、２つの重複するＰＣＲを使用してコドン（ＴＧＡ［ｓｔｏｐ］からＴＧＧ［Ｔｒｐ］）を修復した。修復されたコドンの位置は配列において下線を施した。ｐ１７／ｐ２４／Ｎｅｆ遺伝子をプラスミドｐ７３１３ｉｅのＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位中に挿入した。コーディング配列およびマップを図１０位示す。＊はｐ２４／ｔｒＮｅｆ接合点を表わす。
【００８５】
プライマー：
Ｕ１：
ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧ［配列番号２８］
３’１２０：ＴＣＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣ［配列番号２９］
５’１２０Ｇ：
ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣ［配列番号３０］
３’Ｎｅｆ：ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ［配列番号３１］
初期サイクル：
９４℃（３０秒）２０ｘ［９４℃（３０秒）５０℃（３０秒）６８℃（１８０秒）］６８℃（１２０秒）４℃（０秒）
ｐｆｘポリメラーゼと１×エンハンサーを使用。
ステッチ：
９４℃（３０秒）２０ｘ［９４℃（３０秒）５０℃（３０秒）７２℃（１８０秒）］７２℃（１２０秒）４℃（０秒）
標準条件においてＶｅｎｔポリメラーゼ＋２ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用。
【００８６】
生成物をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐ７３１３−ｉ３中にクローンした。
配列化すると、構築物はシグナルペプチドにおいて誤差を有することが見いだされ、これはｇｐ１２０の後部からＮｅｆの前部までを含有する２５６０ｂｐ ＢｓｔＥＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＲｉｘ３０中に移すことにより修正された。
ｐＲｉｘ３３（図１１）、ｐＲｉｘ３４およびｐＲｉｘ３５（図１２）
Ｎｅｆの後部からＮｅｆの前部までを含有する２５６０ｂｐのＢｓｔＥＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＲｉｘ３１、ｐＲｉｘ１１およびｐＲｉｘ２９に移して、それぞれベクターｐＲｉｘ３３（図１１）、３４および３５（図１２）を形成した。
ｐＲｉｘ３９（最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４ｇａｇ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ−図１３）およびｐＲｉｘ４０−４７（構築物ｐＲｉｘ４０−４７は非グリコシル化ｇｐ１２０、ｇａｇ−ｐ１７／２４、Ｎｅｆおよび、ミリスチル化部位において突然変異および／またはＮｅｆのジロイシンモチーフを有するＴａｔ（ｍ）融合物を含有する）
プライマー：
５’１２０Ｇ：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣ［配列番号３２］
および
ｐ２４ＡＳ：ＣＡＡＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ［配列番号３３］
を用いて、ｇａｇ ｐ１７／２４を含有するフラグメントをベクターｐＲｉｘ３５からＰＣＲ増幅した。
【００８７】
プライマー：
５’ｐ２４−Ｎ：ＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧ［配列番号３４］
および
３’Ｎｅｆ：ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ［配列番号３５］
を使用して、完全長ＮｅｆをｐＮＴｍからＰＣＲ増幅した。
エンドプライマー（５’１２０Ｇおよび３’Ｎｅｆ）を使用して２つのフラグメントをＰＣＲステッチした。生成物をＳａｌＩおよびＫｐｎＩで切断し、ｐＲｉｘ３５における対応するフラグメントを置換してｐＲｉｘ３９を形成するために、ｐ２４およびＮｅｆの部分を含有する４２３ｂｐフラグメントを使用した（図１３）。
プライマー５’ｐ２４−Ｎをプライマー：
５’ｐ２４−Ｎｄｍ：
ＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧ［配列番号３６］
Ｇ Ｈ Ｋ Ａ Ｒ Ｖ Ｌ｜ Ｍ Ｇ Ｋ Ｗ Ｓ Ｋ Ｓ
と置換する以外は同様にしてｐＲｉｘ４０（図１４）を構築した。
このプライマーは１つのＧが欠失し、Ｎｅｆの開始点でミリストイル化部位を破壊する。
【００８８】
ｐＲｉｘ４１〜４４、４６および４７（図１５〜２０）
Ｎｅｆ（Ｌ１７４Ｌ１７５）におけるジロイシンモチーフに対する突然変異をＰＣＲ により行った：
突然変異を挿入するために、５’ＮｅｆプライマーおよびａｓＮｅｆＬＬを使用して、ＬＬモチーフに対するＮｅｆ５’の部分をＰＣＲ増幅した。
５’Ｎｅｆ ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧ［配列番号３７］
ａｓＮｅｆＬＬ（アンチセンス）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣ［配列番号３８］
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ
Ｌ１７４、Ｌ１７５または１７４および１７５の両方に対する突然変異は、順プライマー
ｓＮｅｆＬ１ （Ｌ１７４Ａ）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧ
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ｜ Ａ Ｌ Ｈ Ｐ Ｖ Ｓ Ｌ Ｈ
［配列番号３９］
ｓＮｅｆＬ２ （Ｌ１７５Ａ）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧ
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ｜ Ｌ ａ Ｈ Ｐ Ｖ Ｓ Ｌ Ｈ
［配列番号４０］
ＳｎｅｆＬＬ（ＬＬ１７４／５ＡＡ）
ＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧ
Ａ Ｎ Ｋ Ｇ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ｜ Ａ Ａ Ｈ Ｐ Ｖ Ｓ Ｌ Ｈ
［配列番号４１］
および３’ＮＴプライマー：
３’ＮＴ（アンチセンス）：ＧＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡ ［配列番号４２］
を使用して、Ｎｅｆの３’部分を増幅するために生じた。５’および３’産物のそれぞれを、５’Ｎｅｆおよび３’ＮＴプライマーを使用してＰＣＲステッチした。これらをＫｐｎＩおよびＳｐｅＩで切断し、同様に切断されたｐＲｉｘ３９中に挿入して、ｐＲｉｘ４１（Ｌ１７４Ａ）、ｐＲｉｘ４２（Ｌ１７５Ａ）およびｐＲｉｘ４３（ＬＬ１７４／１７５Ａ）がミリストイル化部位突然変異の不在下で生じるか、あるいはｐＲｉｘ４０中に挿入されて、ミリストイル化突然変異を有するｐＲｉｘ４４（ｍＬＬ１７４／１７５ＡＡ）ｐＲｉｘ４６（ｍＬ１７４Ａ）およびｐＲｉｘ４７（ｍＬ１７５Ａ）が生じた。
【００８９】
ｐＲｉｘ５０、５１および５２ならびに５３、５４および６０（図２３ないし２７）
非グリコシル化ｇｐ１２０を含有するデュアルプロモーターベクターを生成するために、まずｐＲｉｘ１２をＳｓｅ８３７Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にしてオーバーハングを除去し、ＣｌａＩで切断した。４５７３ｂｐの生成物をゲル精製に付した（フラグメントＡ）。
ｐＲｉｘ５０：プラスミドｐＮＴｍをＣｌａＩおよびＸｍｎＩで切断し、１８９７ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ５１：プラスミドｐ７３ｉ−ＧＮ２をＣｌａＩおよびＸｍｎＩで切断し、２５３３ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ５２：プラスミドｐ７３ｉ−ＧＮ２およびｐＮＴｍをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、４０９０ｂｐおよび１０６０ｂｐのフラグメントを個々の消化物より単離した。これらのフラグメントをライゲートし、ベクターｐＲｉｘ５２を得た。
【００９０】
ｐＲｉｘ５３：プラスミドｐＲｉｘ５２をＣｌａＩおよびＸｍｎＩおよびＡｐａＬＩで切断し、２７９４ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ５４：プラスミドｐＴ−ｒｎｇ（ＰＧ５０３５に記載）をＣｌａＩおよびＸｍｎＩで切断し、４２１９ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、フラグメントＡとライゲートした。
ｐＲｉｘ６０：ｐＴ−ｍｇをＳｓｅ８３８７Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にしてオーバーハングを除去し、ＣｌａＩで切断した。ラージフラグメントをゲル精製に付した。プラスミドｐＲｉｘ１２をＣｌａＩおよびＤｒａＩで切断し、２４７６ｂｐのフラグメントをゲル精製に付し、ｐＴ−ｍｇからのフラグメントとライゲートした。
【００９１】
ｐＲｉｘ５８（図２１）
シグナル配列がないｇｐ１２０フラグメントを、プライマー：
５’ｄｓ１２０：ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣ［配列番号４３］
３’１２０：（アンチセンス）：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡ ［配列番号４４］
を使用してｐｇｐ１２０ｃからＰＣＲ増幅した。
ＲＴの５’末端（最適化され、Ｗ２２９Ｋ不活化突然変異を含むコドン）を、３’１２０とホモローガスな配列を挿入するために５’プライマー、およびＲＴ内のプライマーを用いて、ｐｔ−ｒｎｇ（図２８−ＷＯ０３／０２５００３を参照）からＰＣＲ増幅した。
１２０ＲＴｆ：ＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＣＣＡＴＣ［配列番号４５］
ＲＴ３ＳＲ１：ＣＧＴＣＡＣＧＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣ［配列番号４６］
エンドプライマーを用いて２つの生成物をＰＣＲステッチし、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩで切断した。フラグメントをゲル精製し、ｐＴ−ｒｎｇからＮｏｔＩ−ＮｈｅＩフラグメントを置換するために使用した。
【００９２】
ｐＲｉｘ５９（図２２）：３’Ｇａｇフラグメントは、ｐ２４におけるＭｕｎＩ部位に対するプライマー５’およびｄｓｇｐ１２０の開始をコード化する３’プライマーを用いてｐＴ−ｒｎｇからＰＣＲ増幅され、５’末端に近いＢｓｔＥＩＩ部位の位置に及ぶ
ＧａｇＭｕｎｆ
ＧＴＧＧＣＣＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＧ ［配列番号４７］
ＧＡＧ１２０Ｒ（アンチセンス：）
Ｇａｇ −−−−−−−−−−−−−−−−−− ｄｓ１２０
ＧＧＡＣＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣ
［配列番号４８］
生成物をＭｕｎＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、ＭｕｎＩ−ＢｓｔＥＩＩ切断ｐＲｉｘ５４からの７１１３ｂｐフラグメント中に挿入した。
【００９３】
結果
発現データを図２９、３０および３１に示す。
２４ウェルプレートにおける２９３Ｔ細胞単層を、製造業者が提供したプロトコルにしたがってリポフェクトアミン２０００を用いて表示されたそれぞれのＤＮＡ１μｇでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を分離し、遠心分離により培地から分離した。１×１０４細胞または１２μｌの培地と等しいサンプルをＰＡＧＥまたはウェスタンブロットにより調べた。
ｇｐ１２０ｃ構築物は、高度にグリコシル化され、よく分泌されたタンパク質をもたらした。ｃ−末端Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合物（ｐＲｉｘ６およびｐＲｉｘ１１）の添加の結果、細胞内タンパク質レベルが低下し、分泌が失われた。ｇｐ１２０ｃ（ｐＲｉｘ１２）から分泌シグナルを除去すると、タンパク質の非グリコシル化非分泌形態が得られた。
予想されるように、分泌シグナルｐＲｉｘ２８、２９、３１、３３および３５がない融合構築物は非グリコシル化細胞内タンパク質を同様の量で形成した。驚くべきことに、分泌シグナルは構築物ｐＲｉｘ３０、３２および３４中に存在していたが、ｐＲｉｘ３４のみが分泌されなかった。融合物におけるＴａｔの存在はタンパク質の分泌を阻害するようである。初期ｐＲｉｘ３２．１構築物は点突然変異を有し、その結果発現が不十分であった。これはｐＲｉｘ３２．７において修正され、これは非常に向上された発現を示した。
【００９４】
ｐＲｉｘ４０−４７に関して、図３１におけるウェスタンブロットは、表示されたプラスミドでのトランスフェクション後２４時間で２９３Ｔ細胞におけるＮｅｆにおける突然変異を有するｄｓｇｐ１２０／Ｇａｇ／Ｎｅｆ／Ｔａｔ融合物の発現を示す。約１ｘ１０４細胞と等しい全細胞抽出物をゲル上にロードした。ブロットを抗ｎｅｆ抗血清でプローブし、ライトブロットを抗−ｇｐ１２０抗血清でプローブした。
【００９５】
参考文献：
Ａｎｄｒｅ Ｓ．Ｓｅｅｄ Ｂ．Ｅｂｅｒｌｅ Ｊ．Ｓｃｈｒａｕｔ Ｗ．Ｂｕｌｔｍａｎｎ Ａ．Ｈａａｓ Ｊ．（１９９８）最適化されたコドン使用を有する合成ｇｐ１２０配列を用いたＤＮＡワクチン接種により惹起される増大した免疫反応（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｐ１２０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ．）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２（２）：１４９７−５０３．
Ｖｉｎｎｅｒ Ｌ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ＨＶ．Ｂｒｙｄｅｒ Ｋ．Ｃｏｒｂｅｔ Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｃ．Ｆｏｍｓｇａａｒｄ Ａ．（１９９９）哺乳動物コドンを使用したＲｅｖ−非依存性合成ＨＩＶ−１ｇｐ１６０エンベロープ遺伝子での遺伝子銃ＤＮＡワクチン接種（Ｇｅｎｅ ｇｕｎ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｅｖ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｅｎｅ ｕｓｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｏｄｏｎｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ．１７（１７）：２１６６−７５
Ｃｏｌｌｉｎｓ ＫＬ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ．（１９９９）細胞免疫反応のＨＩＶの回避（ＨＩＶ’ｓ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ．１６８：６５−７４．
【００９６】
実施例５
プラスミドＤＮＡ（約１μｇ／μｌ）、例えば１００ｕｇ、および２μｇの金粒子、例えば５０ｍｇ、（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ）を、０．０５Ｍスペルミジン、例えば１００ｕｌ、（Ｓｉｇｍａ）中に懸濁させた。１Ｍ ＣａＣｌ２、たとえば１００ｕｌ（Ａｍｅｒｉｃａｌ Ｐｈａｒｎａｃｅｕｔｉａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）の添加により金粒子上に沈殿させた。ＤＮＡ／金複合物を１０分間室温でインキュベートし、無水エタノール中で３回、例えば１ｍｌで３回洗浄した（モレキュラシーブ３Ａ（ＢＤＨ）上であらかじめ乾燥）。０．０５ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｓｉｇｍａ）を含有する無水エタノール中にサンプルを再懸濁させ、１．５ｍｌのミクロ遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中に、３の等しいアリコートに分けた。アリコートは、（ａ）「金スラリー」、（ｂ）（ａ）から溶出された溶出物−プラスミドの分析のため、および（ｃ）「遺伝子銃」の金／プラスミドコートされたＴｅｆｚｅｌカートリッジを調製するためのものであった。（下記の実施例３参照）。サンプル（ａ）および（ｂ）の調製に関して、エタノール／ＰＶＰ中プラスミドＤＮＡ／「金スラリー」を含有する試験管をＥｐｐｅｎｄｏｒｆミクロ遠心管中、最高速度で２分間スピンさせ、上清を除去し、「金スラリー」を１０分間室温で乾燥させた。サンプル（ａ）を０．５〜１．０ｕｇ／ｕｌのＴＥ中プラスミドＤＮＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、コーティングの約５０％と推定される。溶出に関して、サンプル（ｂ）をＴＥｐＨ８．０中０．５〜１．０ｕｇ／ｕｌのプラスミドＤＮＡに再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートし、激しく振とうし、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１８ミクロ遠心管中、最高速度で２分間スピンさせ、上清、溶出液を除去し、−２０℃で貯蔵した。溶出された正確なＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅｑｕａｎｔＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた分光光度定量化により決定した。
【００９７】
実施例６
ＤＮＡ免疫化用カートリッジの調製
Ａｃｃｅｌｌ遺伝子導入装置のカートリッジの調製は既に記載されたとおりであった（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３ 第１２巻 Ｎｏ．９ ７９１−７９７ページ；Ｐｅｒｔｎｅｒら）。簡単に言うと、プラスミドＤＮＡを２μｍ金粒子（ＤｅＧｕｓｓａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）上にコートし、Ｔｅｆｚｅｌ管中にロードし、これをカートリッジとしての働きをするように次いで１．２７ｃｍの長さに切断し、使用するまで４℃で乾燥保存した。典型的なワクチン接種において、各カートリッジは０．５ｍｇの合計０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジでコートされた金を含有していた。
【００９８】
実施例７
ｇｐ１２０分泌シグナルが欠失したｇｐ１２０−Ｎｅｆ−Ｔａｔ三重融合物を含むＰＭＩＤ免疫化
プロトコル：ＰＭＩＤに関して、実施例５および６に記載するような標準法を使用するために免疫化（ＤＮＡ）カートリッジを調製した。約０．５μｇのＤＮＡ／カートリッジをもたらすＤＮＡローディング速度２を使用し、各免疫化は２回の注射からなっていた。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＤＮＡの一次免疫を行った（ＰＭＩＤを使用）。マウスに２８日後ＤＮＡで追加抗原投与を行った（ＰＭＩＤを使用）。マウスを７日後に処分し、血清および脾臓を集めた。脾臓細胞を抽出することにより、脾臓細胞を収穫し、赤血球を溶解させた。脾臓細胞を洗浄し、計数した。特殊ＥＬＩｓｐｏｔプレート（インターフェロン−ガンマ捕捉抗体でコートされ、ブロックされたもの）を使用した。脾臓細胞をこれらのプレートに移し、ｇｐ１２０ペプチド、ＲＴペプチドまたはＧａｇペプチドの存在下、３７℃／５％ＣＯ２で一夜インキュベートした。脾臓細胞を溶解させ、存在するインターフェロン−ガンマ分泌細胞の数を示すために標準的手順を用いてプレートを展開させた。特定の抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ分析により血清を分析した。結果を図３２〜３４に示す。
【００９９】
結論
意外にも、構築物を発現するｄｓｇｐ１２０（分泌シグナルが欠失したｇｐ１２０）で免疫化された細胞性免疫反応は、ｇｐ１２０構築物で免疫化されたマウスの約２倍であった（図３２および３３参照）。これは、インビトロトランスフェクション研究において、ｄｅｇｐ１２０の発現は関連する細胞の大部分は残存していたが、ｇｐ１２０は排出されたという観察と一致した。
ｄｓｇｐ１２０構築物中にＴａｔ（突然変異したＴａｔ）を含めることにより細胞性免疫反応が、Ｔａｔのないｄｓｇｐ１２０構築物の２倍に増大した（図３２および３３）。Ｔａｔ自体はｇｐ１２０に対する免疫反応に影響を及ぼさなかったが、ｄｅｇｐ１２０と共に相乗作用して細胞反応を最適化した。
他のＨＩＶ抗原を構築物中に含めることにより、含まれる異なる抗原全てに対してバランスのとれた細胞反応が生じ、その結果、ｇｐ１２０のみのベクターと比較して拡大された免疫反応が生じた（図３４）。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
（原文に記載なし）
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３−１】
【図１３−２】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８−１】
【図１８−２】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２１−３】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２２−３】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８−１】
【図２８−２】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロローガスなプロモーターに操作可能に結合した、哺乳動物標的細胞において発現される場合に実質的にグリコシル化されていない、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体がｇｐ１２０またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体であるところの請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
エンベロープタンパク質が機能的分泌シグナルに欠けているところの請求項１または請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｇｐ１２０が少なくとも１つの他のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を含む融合タンパク質として発現されるところの請求項２または請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つの他のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体が、Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔから選択されるところの請求項４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ｇｐ１２０コード化配列が、ｇｐ１２０、ＲＴ、ＧａｇおよびＮｅｆ−含有融合タンパク質をコード化する、ＨＩＶ ＲＴまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列およびＨＩＶ Ｇａｇまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列およびＨＩＶ Ｎｅｆまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列と結合しているところの請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
融合がｇｐ１２０−ＲＴ−Ｎｅｆ−ＧａｇおよびＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇ−ｇｐ１２０から選択されるところの請求項６記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ｇｐ１２０配列が、ＨＩＶ Ｔａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列およびＨＩＶ Ｎｅｆまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列に結合し、ｇｐ１２０、ＮｅｆおよびＴａｔ−含有融合タンパク質をコード化するところの請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
融合がｇｐ１２０−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合であるところの請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ｇｐ１２０がさらに、ＨＩＶ Ｇａｇまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列と結合し、ｇｐ１２０、Ｎｅｆ、ＴａｔおよびＧａｇ−含有融合タンパク質をコード化するところの請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
融合がｇｐ１２０−Ｇａｇ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合であるところの請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＧａｇがＰ１７および／または２４を含むところの請求項５、６、７、１０または１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ｇｐ１２０、Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する１つまたはそれ以上の配列が、高度に発現されたヒト遺伝子におけるコドン用途に類似するように最適化されたコドンであるところの請求項１〜１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
次の群から選択されるポリヌクレオチド配列：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
６．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
７．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
８．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＮｅｆ−ｍＴａｔ
９．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１０．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ
１６．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル（ＲＴおよびＧａｇは最適化されたコドンである）。
【請求項１５】
プロモーターがＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子からのプロモーターであるところの請求項１〜１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
プロモーターとコーディングポリヌクレオチド間の５’未翻訳領域がエクソン１を含むところの請求項１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、および少なくとも１つのＨＩＶ Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドを含む一組のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが２つまたはそれ以上の別々のプロモーターの制御下でシングルベクター上に含まれるところの請求項１７記載の一組のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ｇｐ１２０またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体およびＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇの融合体またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体の融合体をコード化する、請求項１７または１８記載の一組のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
以下の群より選択される請求項１７または請求項１８記載の一組のポリヌクレオチド：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ＋ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ（ＲＴおよびＧａｇは最適化されたコドンである）
【請求項２１】
請求項１ないし２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド（複数でも可）を含むベクター。
【請求項２２】
二本鎖ＤＮＡプラスミドである請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
複製能欠損アデノウイルスベクターである請求項２１記載のベクター。
【請求項２４】
Ｐａｎ９、５、６または７から誘導される請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】
実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体および少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を含み、該追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの、融合タンパク質。
【請求項２６】
実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体および少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を好ましくは融合タンパク質の形態にて含み、該少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたはベクターによりコード化されるポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列または一組のヌクレオチド配列、請求項２１〜２４記載のベクター、請求項２５記載の融合タンパク質、請求項２６記載の組成物あるいは請求項２７記載のポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤、希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項２９】
担体が金ビーズなどの複数の粒子である請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
プライムブーストフォーマットにおいて送達される請求項２８または２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２８〜３０のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む皮内送達装置。
【請求項３２】
安全で有効な量の請求項２８〜３０のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む病気にかかっているかまたはかかりやすい患者を治療する方法。
【請求項３３】
医学にて用いられる請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ベクター、融合タンパク質、組成物またはポリペプチド。
【請求項３４】
疾患の治療用医薬の製造における請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ベクター、融合タンパク質、組成物またはポリペプチドの使用。
【請求項３５】
実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープ分子またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化するヌクレオチド配列、所望によりＨＩＶ調節タンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列をヘテロローガスなプロモーター配列と結合させることを含む、請求項１〜２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの産生法。
【請求項１】
ヘテロローガスなプロモーターに操作可能に結合した、哺乳動物標的細胞において発現される場合に実質的にグリコシル化されていない、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体がｇｐ１２０またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体であるところの請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
エンベロープタンパク質が機能的分泌シグナルに欠けているところの請求項１または請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｇｐ１２０が少なくとも１つの他のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を含む融合タンパク質として発現されるところの請求項２または請求項３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つの他のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体が、Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔから選択されるところの請求項４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ｇｐ１２０コード化配列が、ｇｐ１２０、ＲＴ、ＧａｇおよびＮｅｆ−含有融合タンパク質をコード化する、ＨＩＶ ＲＴまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列およびＨＩＶ Ｇａｇまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列およびＨＩＶ Ｎｅｆまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列と結合しているところの請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
融合がｇｐ１２０−ＲＴ−Ｎｅｆ−ＧａｇおよびＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇ−ｇｐ１２０から選択されるところの請求項６記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
ｇｐ１２０配列が、ＨＩＶ Ｔａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列およびＨＩＶ Ｎｅｆまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列に結合し、ｇｐ１２０、ＮｅｆおよびＴａｔ−含有融合タンパク質をコード化するところの請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
融合がｇｐ１２０−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合であるところの請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ｇｐ１２０がさらに、ＨＩＶ Ｇａｇまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列と結合し、ｇｐ１２０、Ｎｅｆ、ＴａｔおよびＧａｇ−含有融合タンパク質をコード化するところの請求項８記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
融合がｇｐ１２０−Ｇａｇ−Ｎｅｆ−Ｔａｔ融合であるところの請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＧａｇがＰ１７および／または２４を含むところの請求項５、６、７、１０または１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ｇｐ１２０、Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する１つまたはそれ以上の配列が、高度に発現されたヒト遺伝子におけるコドン用途に類似するように最適化されたコドンであるところの請求項１〜１２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
次の群から選択されるポリヌクレオチド配列：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
６．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
７．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
８．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＮｅｆ−ｍＴａｔ
９．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１０．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｌ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬＬＮｅｆ−ｍＴａｔ
１３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ１Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１４．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｍＬ２Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
１５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル−ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ
１６．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル（ＲＴおよびＧａｇは最適化されたコドンである）。
【請求項１５】
プロモーターがＨＣＭＶ ＩＥ遺伝子からのプロモーターであるところの請求項１〜１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
プロモーターとコーディングポリヌクレオチド間の５’未翻訳領域がエクソン１を含むところの請求項１５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、および少なくとも１つのＨＩＶ Ｎｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴまたはＴａｔまたはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する少なくとも１つのさらなるポリヌクレオチドを含む一組のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが２つまたはそれ以上の別々のプロモーターの制御下でシングルベクター上に含まれるところの請求項１７記載の一組のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ｇｐ１２０またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体およびＲＴ−Ｎｅｆ−Ｇａｇの融合体またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体の融合体をコード化する、請求項１７または１８記載の一組のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
以下の群より選択される請求項１７または請求項１８記載の一組のポリヌクレオチド：
１．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｔｒＮｅｆ−ｍＴａｔ
２．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−ｔｒＮｅｆ
３．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋Ｐ１７／２４Ｇａｇ−Ｎｅｆ−ｍＴａｔ
４．最適化されたｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ＋ｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル
５．最適化されたｇｐ１２０コドン、マイナス分泌シグナル＋ｍＲＴ−ｔｒＮｅｆ−Ｐ１７／２４Ｇａｇ（ＲＴおよびＧａｇは最適化されたコドンである）
【請求項２１】
請求項１ないし２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド（複数でも可）を含むベクター。
【請求項２２】
二本鎖ＤＮＡプラスミドである請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
複製能欠損アデノウイルスベクターである請求項２１記載のベクター。
【請求項２４】
Ｐａｎ９、５、６または７から誘導される請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】
実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体および少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を含み、該追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの、融合タンパク質。
【請求項２６】
実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体および少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体を好ましくは融合タンパク質の形態にて含み、該少なくとも１つの追加のＨＩＶタンパク質がＮｅｆ、Ｇａｇ、ＲＴおよびＴａｔから選択されるところの組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたはベクターによりコード化されるポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列または一組のヌクレオチド配列、請求項２１〜２４記載のベクター、請求項２５記載の融合タンパク質、請求項２６記載の組成物あるいは請求項２７記載のポリペプチド、および医薬上許容される賦形剤、希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項２９】
担体が金ビーズなどの複数の粒子である請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
プライムブーストフォーマットにおいて送達される請求項２８または２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２８〜３０のいずれか１つに記載の医薬組成物を含む皮内送達装置。
【請求項３２】
安全で有効な量の請求項２８〜３０のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む病気にかかっているかまたはかかりやすい患者を治療する方法。
【請求項３３】
医学にて用いられる請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ベクター、融合タンパク質、組成物またはポリペプチド。
【請求項３４】
疾患の治療用医薬の製造における請求項１〜２７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、ベクター、融合タンパク質、組成物またはポリペプチドの使用。
【請求項３５】
実質的にグリコシル化されていないＨＩＶエンベロープ分子またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化するヌクレオチド配列、所望によりＨＩＶ調節タンパク質またはフラグメントあるいはその免疫原性誘導体をコード化する配列をヘテロローガスなプロモーター配列と結合させることを含む、請求項１〜２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの産生法。
【公表番号】特表２００６−５２０１８５（Ｐ２００６−５２０１８５Ａ）
【公表日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４９１３６（Ｐ２００４−５４９１３６）
【出願日】平成１５年１１月３日（２００３．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１２４０２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４１８５２
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月３日（２００３．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１２４０２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４１８５２
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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