ＩＢＤとＩＢＳとの区別、ＩＢＤの疾患タイプ間の更なる識別における使用する方法およびキット
排泄物または血液の試料を用いて、患者が過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を患っているか、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を患っているかを正確に決定するのに、および生検を用いた追跡調査解析で、同患者が潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に罹患しているか、クローン病（ＣＤ）に罹患しているかを決定するのに、いくつかの特定の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質の発現レベルの定量化を利用することができる。この方法は、疾患の重度の決定、ならびに治療に対する患者の応答の観察における有用性も有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重遺伝子アプローチを用いた炎症性腸疾患の診断に使用する方法に関する。より詳細には、本発明は、少なくとも１つの特定のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現を、例えば前記マーカー遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを用いて決定するか、または対応するタンパク質の発現を、例えば前記特定のマーカー遺伝子（単数または複数）によってコードされるタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて決定することによって、炎症性腸症候群（ＩＢＳ, inflammatory bowel disease）から、炎症性腸疾患（ＩＢＤ, inflammatory bowel syndrome）を診断および／または区別するのに使用をする方法およびキットに関する。改善された正確度および再現性により、これらの疾患の早期診断および区別において、この診断方法および対応するキットを有利に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、慢性再発性腸炎の状態を表す。疾患病因の現在の理解は、多様な環境および遺伝因子の複雑な相互作用を示唆する。それは、欧州を起源とする集団においてかなりの罹患率を引き起こし、２つの主要な形態、すなわち、クローン病（ＣＤ, Cronhn's disease）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ, ulcerative coliteis）の合計した有病率は１５０〜２５０／１００００である。ＩＢＤの両形態は、成人期早期の最高発生率を有するが、いずれの段階でも発症する可能性がある。それらは、およそ等しい程度で男女に影響を及ぼす。ＩＢＤの発症についての環境的危険因子ははっきりと明確にされていない。最も特徴付けられた因子は喫煙であり、明確でない理由で、クローン病を発症する危険性を明確に増加させるが、潰瘍性大腸炎に対しては保護している。
【０００３】
現在、いずれの状態に対しても治療法がないため、疾患管理は、患者と医師の両方にとって長期のコミットメントである。およそ３０％のＩＢＤ患者は、患者の生存期間中に外科的処置を受け、長期間のＩＢＤを有する患者は、結腸直腸癌を発症する危険がかなりある。１０人のＩＢＤ患者のうち３人は、かなりの副作用を引き起こす高投薬量を使用する場合でさえ、現在利用可能な最良の薬物療法にも応答しない。
【０００４】
潰瘍性大腸炎は、典型的には、血性下痢および便意切迫の症状を引き起こす。炎症は直腸を冒し、近接結腸の一部、または全近接結腸に連続的に拡張し得る。組織学的試験を行うと、結腸粘膜の表層に限定されている慢性炎症性細胞の浸潤が明らかになる。肉芽腫は特徴ではない。クローン病は、ややより多形性である。クローン病は、貫壁性炎症の非連続的な病変によって病理学的に特徴付けられ、それらは、口から肛門の胃腸管のいずれの部分も冒し得るが、最も一般的には回盲部を冒す。肉芽種は組織学的な顕著な特徴であるが、臨床的特徴は、腸罹患部位に依存してやや変化し易い。結腸が炎症を起こしている場合、その症状は、潰瘍性大腸炎の症状を正確に模倣し得る。
【０００５】
初期段階でＵＣを結腸ＣＤから臨床的に区別する可能性が、患者と医師の両方に多大な利益を与えることは明らかである。それは、正確な治療処方計画の設計を可能にし、不要な薬物の使用を妨げ、治療費を削減する。
【０００６】
炎症性腸症候群、すなわちＩＢＳは、腸壁の平滑筋が、ストレスなどの誘因に対して、またはコーヒーにさえ、過敏となり、腫脹、吐き気、嘔吐および便秘または下痢を引き起こす胃腸障害でもある。残念なことに、多くの症状はＩＢＤの症状と類似しているため、ＩＢＳは、多くの場合、誤診される。
【０００７】
米国だけでＩＢＳがおよそ５００万件の症例がある。より重篤なＩＢＤ症例からＩＢＳを区別することができれば、ＩＢＤであることが疑われるＩＢＳ患者による医師への不必要な訪問数を減少させることになる。また、医師が最も適切なタイプの処置を選択する手助けともなる。
【０００８】
特許文献は、ＩＢＤの異なる形態を相互に識別するため、詳細には、ＵＣとＣＤとを区別するために利用可能な方法が、上記に示した様々な検査手順の例を別にすれば、抗体に基づく方法に集中してきたことを示す。
【０００９】
例えば、ＷＯ０３／０３６２６２は、クローン病に対するマーカーとして排泄物の抗サッカロマイセス・セレヴィシエ抗体（ＡＳＣＡ, anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies）の存在を用いて、ＵＣおよびＩＢＳなどの他の胃腸病からＣＤを区別するための方法およびキットが提供されることを報告している。キットは、ヒト排泄物試料中の総内因性ＡＳＣＡを測定するための、ヒト免疫グロビンに特異的な抗体を利用する酵素統合イムノアッセイまたは他のイムノアッセイを含む。
【００１０】
ＷＯ０１／５８９２７は、幹部組織におけるｈＴＭに対する自己抗原応答と関連した疾患、および特にＵＣを検出するための診断方法を記載する。
【００１１】
別の集中的に研究された抗体アプローチ（米国特許第５，６９１，１５１号、第５，８３０，６７５号および第６，０３３，８６４号参照）は、好中球に対する自己抗体（異型核周囲の抗好中球細胞質抗体）Ｐ−ＡＮＣＡ（atypical perinuclear anti-neutrophil cytoplasimc antibodies)である。それらは主にＵＣ（５０〜６７％）に見出されるが、さらにＣＤ（６〜１５％）にも見出される。ＡＮＣＡおよびＡＳＣＡの組み合わせは、不確定な結腸炎の患者において良好な手助けとなると考えられる。しかし、注目すべき所見は、不確定な結腸炎を有する患者の約５０％が血清反応陰性の患者であるということである。これは、彼らはＡＳＣＡとＡＮＣＡの抗体を作らず、したがって、平均して１０年間は診断することができないことを意味する（Ｂｏｓｓｕｙｔ Ｘ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００６，５２：２，１７１−１８１）。
【００１２】
ＷＯ２００４／００１０７３は、ＵＣに対する診断マーカーとして本発明において言及されている７つの遺伝子を記載する。ＲＮＡレベルでのこれらのマーカーの発現は、結腸からの粘膜生検において決定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ０３／０３６２６２
【特許文献２】ＷＯ０１／５８９２７
【特許文献３】米国特許第５，６９１，１５１号、
【特許文献４】米国特許第５，８３０，６７５号
【特許文献５】米国特許第６，０３３，８６４号
【特許文献６】ＷＯ２００４／００１０７３
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】KS Bishnupuri LQ, N Murmu, C W Houchen, S Anant, B K Dieckgraefe. Reg IV activates the epidermal growth factor receptor/Akt/AP-1 signaling pathway in colon adenocarcinomas. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.
【非特許文献２】Bossuyt X. Serologic Markers in Inflammatory Bowel Disease. Clin Chem. 2006; 52: 171 -181
【非特許文献３】Heller et al., Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays, Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18; 94(6): 2150-5.
【非特許文献４】Hirata I, Murano M, Nitta M, Sasaki S, Toshina K, Maemura K, Katsu K (2001 ). Estimation of mucosal inflammatory mediators in rat DSS-induced colitis. Possible role of PGE(2) in protection against mucosal damage. Digestion. 63 Suppl 1: 73-80
【非特許文献５】Isaacs KL, Sartor RB, Haskill S (1992). Cytokine messenger RNA profiles in inflammatory bowel disease mucosa detected by polymerase chain reaction amplification. Gastroenterology. 103: 1587-95
【非特許文献６】Keiichi Mitsuyama OT, Nobuo Tomiyasu, Koseku Takaki, Asuka Suzuki, Junya Masuds Hiroshi Yamasaki, Atsushi Toyonaga, Michio Sata. Increased Circulating Concentrations of Growth-Related Oncogene (GRO)-α in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Digestive Diseases and Sciences 2006; 51: 173-77
【非特許文献７】Kohler and Milstein (Nature (1975) 256:495)
【非特許文献８】Lawrance IC, Fiocchi C, Chakravarti S (2001 ). Ulcerative colitis and Crohn's disease: distinctive gene expression profiles and novel susceptibility candidate genes. Hum Mol Genet. 10: 445-56.
【非特許文献９】Newell KJ et al., Matrilysin (matrix metalloproteinase-7) expression in ulcerative colitis-related tumorigenesis, Mol Carcinog. 2002 Jun;34(2): 59-63.
【非特許文献１０】Pitari G et al., Pantetheinase activity of membrane-bound Vanin-1: lack of free cysteamine in tissues of Vanin-1 deficient mice, FEBS Lett. 2000 Oct 20; 483(2- 3): 149-54
【非特許文献１１】Silver DL, Wang N, Vogel S. Identification of Small PDZK1-associated Protein, DD96/MAP17, as a Regulator of PDZK1 and Plasma High Density Lipoprotein Levels. The Journal of Biological Chemistry 2003;278:28528-532.
【非特許文献１２】Spandau et al., High expression of chemokines Gro-alpha (CXCL-1 ), IL-8 (CXCL- 8), and MCP-1 (CCL-2) in inflamed human corneas in vivo, Ophthalmol. 2003 Jun; 121 (6): 825-31.
【非特許文献１３】Woessner JF Jr, Regulation of matrilysin in the rat uterus, Biochem Cell Biol. 1996; 74(6): 777-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
胃腸障害を報告する患者の正確、迅速かつ信頼できるスクリーニングを行い、ＩＢＤ患者と非ＩＢＤ患者、例えばＩＢＳを患っている患者とを区別するための改善された方法に関する必要性が残されている。患者および病院の両方の観点から、とりわけ、患者が回腸結腸内視鏡検査に送られる前に、最初のスクリーニングを行うことができるならば、それが望ましいであろう。
【００１６】
とりわけ、ＩＢＤ患者における潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別することに関連して、改善された潰瘍性大腸炎の診断も必要である。
【００１７】
本発明の１つの目的は、これらの用途に供する方法およびキットを利用可能にすることである。１つの特定の目的は、疾患の早期段階で信頼性のある診断を達成できるようにする方法およびキットを利用可能にすることである。別の目的は、治療に対する応答を追跡し、治療を受けている患者において改善を確認する、信頼性があり、なお簡便であり、侵襲の少ない方法の方法を利用可能にすることである。
【００１８】
別の目的は、通常使用される生検または回腸結腸内視鏡検査と対照的に、非侵襲的であるかまたは最小限に侵襲的である試料採取技術を用いて、第１のスクリーニングを行うことを可能にすることである。また、バリウム注腸検査はも、その検査が患者に与える非常な不快さと緊張により、侵襲的手法として分類されるべきである。臨床像が非常に類似し得る、ＩＢＤとＩＢＳとを区別するため、および困難な症例におけるＣＤとＵＣとを区別するための方法およびキットを利用可能にすることも目的である。
【００１９】
本発明の根底にある更なる目的、ならびに本発明によって与えられる解決および関連した利点は、本明細書、実施例および特許請求の範囲の検討に基づいて当業者に明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、驚くべきことに人体から採取された試料、好ましくは患者の排泄物もしくは血液から採取された試料、または腸の炎症部分から得られた生検試料において遺伝子の発現プロフィールが検査される多重遺伝子アプローチによって、ＩＢＤとＩＢＳとの区別、および、患者がＩＢＤを患っていることが決定されている症例では、ＵＣとＣＤとの更なる識別が可能となることを見出した。
【００２１】
本発明は、共同で、単独でまたは部分集合的に、ＩＢＤとＩＢＳとを識別するための基礎を形成する潜在的なマーカー遺伝子の同定に基づいている。
【００２２】
実験的に確認されている、本発明の一実施形態は、排泄物または血液からの試料を用いて、患者がＩＢＤを患っているかどうかを正確かつ簡便に決定するのに、および生検を用いた追跡調査解析で、患者がＵＣに冒されているか、ＣＤに冒されているかを決定するのに、いくつかの特異的遺伝子および対応するタンパク質の発現レベルの定量化を利用することができることである。
【００２３】
より具体的には、７つの異なるマーカーの発現レベルを定量するための遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドまたは抗体を用いて、単独でまたはその部分集合で上記マーカーの検出を可能にする方法が提供される。オリゴヌクレオチドまたは抗体は、対応する遺伝子配列またはマーカータンパク質を特異的に認識するように設計される。生物学的試料中の前記７つのマーカー遺伝子またはそのサブセットの発現状態を検出および監視するためのアッセイおよびキットが提供される。マーカー遺伝子（括弧内は受託番号）は以下の通りである：ＳＬＣ６Ａ１４（ＮＭ ００７２３１）；ＳＬＣ２６Ａ２（ＮＭ ０００１１２）；ＧＲＯ−１（ＮＭ ００１５１１）；ＭＭＰ−７（ＢＣ００３６３５）；ＭＡＰ−１７（ＮＭ ００５７６４）；ＲｅｇＩＶ（ＢＣ０１７０８９）、およびバニン−１（ＮＭ ００４６６６）。
【００２４】
本発明者らによって得られた結果は、血液試料中のＲＮＡを解析する場合にはバニン−１が好ましいマーカー遺伝子であることを示す。また、マーカーＳＬＣ２６Ａ２、ＭＡＰ−１７も血液における有用性を示す。
【００２５】
アッセイは、好ましくは、ＰＣＲ法に基づいてＲＮＡを定量するための方法およびキットである。
【００２６】
あるいは、アッセイは、上記のマーカータンパク質を検出するための、培養しない、抗体に基づくアッセイである。
【００２７】
したがって、本発明の別の実施形態は、人体から採取された試料中において、ヒト遺伝子ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１によって発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、初期段階のＵＣまたはＣＤを効果的に検出するための方法、および同抗体を用いてＵＣおよびＣＤを診断するためのキットである。本発明者らによって得られた結果は、試料の採取源がヒト排泄物である場合にはＧＲＯ−１およびＲｅｇＩＶが好ましいマーカータンパク質であり、試料が血液である場合にはバニン−１、ＧＲＯ−１およびＭＭＰ−７が好ましいマーカータンパク質であることを示す。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１をコードするヒト遺伝子から発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた抗原−抗体結合反応によって、試料中のＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１タンパク質の発現レベルを測定することにより、ＵＣおよびＣＤを診断するための方法、ならびに同抗体を用いてＵＣおよびＣＤを診断するためのキットである。
【００２９】
本発明の更なる実施形態は、治療に対する患者の応答を決定するための方法、治療中の改善の速度を決定するための方法、および回復の予後を評価するための方法である。
【００３０】
本発明は、以下の記載、実施例および図面において詳細に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】排泄物標本のリアルタイム解析由来の、１０例のＩＢＳ症例および１０例のＩＢＳ症例の発現プロフィールを示す図である。７つの異なるマーカーは、ｘ軸上にプロットされ、ＰＣＲ解析の対応するデルタＣｔ値はｙ軸上にプロットされている（１＝ＳＬＣ６Ａ１４；２＝ＳＬＣ２６Ａ２；３＝ＧＲＯ１；４＝ＭＭＰ−７；５＝ＭＡＰ１７；６＝ＧＩＳＰ；７＝バニン−１）。
【図２】リアルタイムＰＣＲ解析由来の、排泄物および生検試料における発現プロフィールを示す図である。７つの異なるマーカーは、ｘ軸上にプロットされ、ＰＣＲ解析の対応するデルタＣｔ値はｙ軸上にプロットされている（１＝ＳＬＣ６Ａ１４；２＝ＳＬＣ２６Ａ２；３＝ＧＲＯ１；４＝ＭＭＰ−７；５＝ＭＡＰ１７；６＝ＧＩＳＰ；７＝バニン−１）。［ｂｄ＝生検由来；ｆｄ＝排泄物由来］
【図３】リアルタイム解析由来の、生検試料における発現プロフィールを示す図である。７つの異なるマーカーは、ｘ軸上にプロットされ、ＰＣＲ解析の対応するデルタＣｔ値はｙ軸上にプロットされている（１＝ＳＬＣ６Ａ１４；２＝ＳＬＣ２６Ａ２；３＝ＧＲＯ１；４＝ＭＭＰ−７；５＝ＭＡＰ１７；６＝ＧＩＳＰ；７＝バニン−１）。
【図４】分類アルゴリズムを用いた解析によって追跡された７つ全てのマーカーを用いた、１８人の非ＩＢＤ患者および６３人のＩＢＤ患者のリアルタイム解析の結果であるＲＯＣプロットを示す図である。０．９０３のＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、全てのマーカーはともに識別能力が高いことを示す。
【図５】分類アルゴリズムを用いた解析によって追跡された２つだけのマーカー（ＧＲＯ−１およびＲｅｇＩＶ）を用いた、１８人の非ＩＢＤ患者および６３人のＩＢＤ患者のリアルタイム解析の結果としてのＲＯＣプロットを示す図である。０．８９２のＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、これらのマーカーだけでも識別能力が高いことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明が開示および記載される前に、本発明が、目的を実行し、言及された目的物および利点、ならびに本明細書において固有の目的、目的物および利点を得るのに十分適合していることを当業者は容易に承認するであろうことを理解するべきである。本実施例、ならびに本明細書に記載された方法、手法、処置、分子、および特定の化合物は、現在、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲の限定としては意図されていない。当業者によって想起される、それらにおける変化および他の使用は、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神に包含される。
【００３３】
また、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態だけを記載することを目的としたものであり、限定することを意図していないことも理解されなければならない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を指示していなければ、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「配列（ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」への言及は、１を超えるこのような配列を含み、他も同様である。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、多数の用語に言及され、それらは以下の意味を有するように定義されている。
【００３５】
本明細書中で使用するとき、用語「相補的ＤＮＡプライマー」とは、本明細書に記載された条件下で、生物学的試料における逆転写酵素の存在下で新生ＤＮＡ鎖の合成を可能にする特定の方向でＲＮＡ鋳型（テンプレート）にアニーリングするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３６】
また、本明細書中で使用するとき、ＤＮＡ鎖が合成される「条件」は、逆転写酵素が逆転写酵素阻害薬物によって阻害されない場合、ＲＮＡ鋳型とＤＮＡプライマーがアニーリングし、オリゴヌクレオチドが合成されたＤＮＡ鎖に取り込まれるような量および温度でヌクレオチド、陽イオンおよび適切な緩衝剤が存在することを含む。例示的な条件は以下の実施例において記載される。記載された条件は、他の既知のＲＴ／ｃＤＮＡ合成プロトコールから最適化されている。一般に、他の条件は、当業者に周知であるプロトコールに基づいて、特定の逆転写酵素反応の最適化のために規定され得ることは知られている。
【００３７】
本明細書中で使用するとき、用語「プライマー対」とは、２つのプライマーを指し、センスおよびアンチセンス配列からなる二本鎖ＤＮＡ分子上のそれらのそれぞれの方向に対して、一方はフォワードの名称を有し、他方はリバースの名称を有する。その結果、本明細書に記載される増幅条件下、フォワード・プライマーはセンス配列にアニーリングし、その配列を増幅させる準備をし、リバース・プライマーはアンチセンス配列にアニーリングし、その配列を増幅させる準備をする。プライマーは、（プライマーの二量体形成を最小にするために）反応において他のプライマーと最小の相補性を有すること、および増幅方法、好ましくはＰＣＲに適切な反応温度の範囲であるＴｍ値を有することに基づいて、増幅反応における使用のために選択することができる。さらに、プライマーは、ＲＮＡ鋳型の特定の領域とアニーリングするように選択することができ、それにより、得られたＤＮＡ増幅産物は、長さにして１００〜５００塩基対、最も好ましくは長さにして約３００塩基対の大きさに及ぶ。
【００３８】
本明細書中で使用するとき、増幅されたＤＮＡを「検出すること」または増幅されたＤＮＡの「検出」とは、逆転写酵素がアッセイ混合物に添加された逆転写酵素阻害剤薬物に抵抗性である場合にだけ合成される、増幅されたＤＮＡ鎖の存在を定性的または定量的に決定することを指す。合成されたＤＮＡの増幅は、当該技術分野において知られているＤＮＡを検出するための任意の方法によって検出することができる。例えば、増幅されたＤＮＡの検出は、サザン・ブロット・ハイブリダイゼーション・アッセイによって、臭化エチジウム染色されたアガロース・ゲル上で特定の分子量のＤＮＡ増幅産物の視覚化によって、オートラジオグラフィーまたはシンチレーション測定による、合成されたＤＮＡ鎖への放射線標識されたヌクレオチドの取り込みの測定によって行うことができる。
【００３９】
本発明の方法では、ＰＣＲ増幅は、全てのＰＣＲ試薬、ならびに適切な遺伝子特異的なプライマーおよび熱安定性ポリメラーゼ酵素の存在下で標的核酸を含む試料をプレインキュベートすることによって達成される。得られる反応混合物は、プライマー伸長生成物の形成および増幅を可能にする条件下で周期的に加熱される。
【００４０】
ＰＣＲに必要とされる試薬は、当業者に知られ、一般には、標的核酸の保存領域にハイブリダイズさせるのに標的核酸の保存領域に十分に相補的である少なくとも２つのオリゴヌクレオチド・プライマー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、熱安定性重合試薬および重合試薬に対して場合によって必要な共同因子を含む。好ましいヌクレオシド三リン酸は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰであり、まとめてｄＮＴＰと呼ぶ。ヌクレオシド三リン酸は市販されている。
【００４１】
プライマーには、標的核酸にアニーリングし、適切な条件下で、すなわち、ヌクレオシド三リン酸、重合試薬、適切な温度、ｐＨおよび緩衝液の存在下で核酸合成の開始点として作用することができる天然に存在するかまたは合成的に生成されるオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは、標的核酸にハイブリダイズするのに標的核酸に十分に相補的な配列を有し、重合試薬の存在下で伸長産物の合成を準備するために、十分な長さであり、典型的には１０〜６０ヌクレオチドである。また、プライマーは、当業者に周知である方法によって自動合成によって合成的に生成することができる。
【００４２】
プライマーのための設計検討は当該技術分野において周知である。プライマーは、増幅されるべき特異的核酸の鎖の配列に実質的に相補的であるように選択され、それにより、１つのプライマーから合成された伸長産物が、その相補体から分離されると、他のプライマーの伸長産物に対する鋳型として機能を果たすことができる。好ましくは、プライマーは、標的領域と正確に相補的である。本明細書、実施例および特許請求の範囲に与えられたプライマー対は、本発明の範囲から逸脱することなしに、マーカー遺伝子に対する特異性を示す機能的に同等なプライマーによって置き換えられることが強調される。
【００４３】
本発明者らは、生検材料について記載されるＵＣとＣＤとを区別することができるかどうかを決定するために、リアルタイムＰＣＲを用いた解析のために３３個のＵＣおよび２４個のＣＤの排泄物試料（糞便試料）を回収した。驚くべきことに、本発明者らは、これらのマーカーの発現プロフィールが、排泄物標本のＵＣとＣＤについても実質的に同じであることを見出した。対照試料として、いくつかのＩＢＳ症例を用いた。これらは、ＩＢＤの２つの主要な形態として遺伝子の異なる発現パターンを示した。本発明者らは、６３例のＩＢＤ症例に対して、合計１８例のＩＢＳ症例において解析した。図１の結果は、１０例のＩＢＳ症例と１０例のＩＢＤ症例についてのＩＢＳとＩＢＤの発現プロフィールにおける明確な相違を示す。
【００４４】
別の驚くべき事実は、生検におけるＵＣについて上方制御された遺伝子が排泄物試料において、ここでは下方制御されたということであった（マーカー６、またある程度はマーカー５）。また、マーカー２（ＳＬＣ２６Ａ２）は、元々はＵＣにおいて下方制御されたが、ここでは、マーカー１（ＳＬＣ１４Ａ６）と比較して上方制御されたことが分かった。図２では、３人のＩＢＳ患者、３人のＵＣ患者および３人のＣＤ患者の排泄物および生検試料の発現プロフィールが示されている。
【００４５】
ＩＢＳ患者の症例では、遺伝子の発現プロフィールは、異なる標本間では変化しない。しかしながら、ＵＣ症例におけるプロフィールを比較すると、特にマーカー２、５および６の反対の発現の観点から２つの曲線の反対傾向を観察することができる。また、ＣＤについては、発現パターンは、生検において変化する（図３を参照されたい）。
【００４６】
溶質担体（ＳＬＣ, solute carrier）タンパク質は、エネルギー依存性輸送分子の非常に大きなファミリーを構成し、栄養素輸送における重要な生理学的役割を有し、薬物吸収を高めるためのメカニズムとして利用され得る。しかしながら、高解像度の結晶構造がないため、分子レベルでこれらのタンパク質を理解するには制限がある。
【００４７】
全体で、腎臓結石を患っている１〜２％の成人、および６〜８％の小児が、尿中のシスチンが高濃度になる、アミノ酸の輸送欠陥であるシスチン尿症を有する。溶質担体ファミリー３、シスチン、塩基性および中性アミノ酸輸送体、アミノ酸輸送隊のシステムと関連したタンパク質をコードするメンバー１（ＳＬＣ３Ａ１）、および溶質担体ファミリー７、メンバー９（ＳＬＣ７Ａ９）の２つの遺伝子が関係していた。これらの両方の溶質担体は、最終的には尿路感染症、および結局は腎不全をもたらす場合がある結石形成に関与すると考えられる。
【００４８】
ここで、本発明者らは、ＩＢＤにおいて発現が有意に変更する２つの既知の溶質担体（ＳＬＣ６Ａ１４およびＳＬＣ２６Ａ２）を同定している。
【００４９】
ＣＸＣケモカイン成長関連癌遺伝子−アルファ（Ｇｒｏ−アルファ、またはＧＲＯ１としても知られている）は、サイトカインと説明されており、それ自体、炎症の局所領域の多数の細胞型の移動応答を改変することができる。さらに、ヒトの炎症性角膜において過剰発現されることも報告され（Ｓｐａｎｄａｕら、２００３年）、加えて、消化管の炎症を示すように化学的に誘導されたラットは、ＧＲＯ１レベルの上方制御を示すことも示されている（Ｈｉｒａｔａら、２００１年）。ｃＤＮＡマイクロアレイ・アプローチを用いて、Ｈｅｌｌｅｒらは、１９９７年に、関節リウマチおよび炎症性腸疾患におけるケモカインＧｒｏアルファの新たな関与を報告している。Ｋｅｉｉｃｈｉらは２００６年に、ＩＢＤの患者において増殖関連癌遺伝子（ＧＲＯ）−αの血中濃度の上昇を報告した。Ｉｓａａｃｓらは１９９２年に、ＵＣにおけるＧＲＯ１の発現はＣＤで見られる発現よりも高いことが報告されているが、ここでは、ＧＲＯ１発現レベルに関して、ＵＣ対ＣＤの逆相関があることが示された。最後に、Ｌａｗｒｅｎｃｅらは２００１年に、ＵＣにおいて上方制御されるＧＲＯ１の同定について報告しているが、この研究の設計では、解析前に生検試料が貯蔵されるために、したがって、二人以上の患者においてＧＲＯ１が上方制御されたかどうかを知ることができなかった。
【００５０】
マトリライシン（またはマトリックス・メタロプロテイナーゼ−７）は、黄体退行しているラットの子宮で最初に発見された。これは、子宮メタロプロテイナーゼ、推定のメタロプロテイナーゼ（Ｐｕｍｐ−１）、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）としても知られている。それは、いずれも細胞外マトリックスの巨大分子のほとんどを分解することができる１５種のＭＭＰファミリーの最小のメンバー（２８ｋＤａ）である。このファミリーは、簡単には以下のように概説される。全てのメンバーは、システインでブロックされた活性部位の亜鉛を有する酵素原の形態で生じる亜鉛メタロプロテイナーゼである。マトリライシンは、マトリックスの多種多様なゼラチン、プロテオグリカン、および糖タンパク質を分解させることができ、コラゲナーゼなどの他のいくつかのＭＭＰを活性化することができる（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ、１９９６年に概説されている）。
【００５１】
マトリライシンは、様々なタイプの癌、例えば結腸癌、胃癌、前立腺癌、および脳癌において頻繁に発現される。これまでの研究によれば、マトリライシンは結腸癌の進行および転移において重要な役割を果たすことが示唆されている。近年、Ｎｅｗｅｌｌらは２００２年に、ＵＣ関連の新生組織形成の様々な段階でマトリライシン発現が増加することを報告している。しかしながら、この研究は、このような発現の増加がＵＣの結果であるのか、またはむしろ新生組織形成の存在によるものなのかを決定していない。
【００５２】
膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）は、またはＤＤ９６としても知られているが、元々は癌腫において上方制御されるものとして同定され、細胞複製および腫瘍増殖の調節において潜在的な役割を有する。また、より新しい所見によれば、低分子ＰＤＺＫ１結合タンパク質について新たな名称ＳＰＡＰとなるＰＤＺＫ１を制御することによって、肝臓におけるスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩの表面発現において役割を果たすことが示された（ＰＤＺＫ１および血漿高密度リポタンパク質レベルの調節因子として、低分子ＰＤＺＫ１結合タンパク質、ＤＤ９６／ＭＡＰ−１７の同一性；Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３、２７８（３１）、ｐ２８５２８−３２）。
【００５３】
ＲｅｇＩＶは分泌性タンパク質であり、膵臓、肝臓および胃腸粘膜の再生、増殖および分化に機能的に関与しているＲｅｇ多重遺伝子ファミリーのメンバーである。ＲｅｇＩＶは、特に、消化管の悪性度において上方制御され、胃および胃癌腫（結腸直腸癌腫、結腸腺癌）の腸および神経内分泌分化と関連している；（ＲｅｇＩＶは、結腸腺癌における上皮細胞増殖因子受容体／Ａｋｔ／Ａｐ−１シグナル経路を活性化する；Ｂｉｓｈｎｕｐｒｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００６年、１３０（１）、ｐ１３７−４９）。
【００５４】
パンテテイナーゼ（ＥＣ３．５．１．）は遍在的な酵素であり、インビトロでパントテン酸（ビタミンＢ５）をリサイクルし、システアミン、有効な抗酸化剤を生成することが示されている。この酵素は、バニン−１遺伝子でコードされ、マウス組織で広く発現される。バニン−１は、ＧＰＩアンカーパンテテイナーゼであり、従って外酵素である。バニン／パンテテイナーゼは、恐らくは酸化的ストレスに対する応答の観点で、いくつかの免疫機能の制御に関与する可能性があることが示唆されている（Ｐｉｔａｒｉら、２０００年）。
【００５５】
転写されたｍＲＮＡの性質および量を解析するための方法は、いくつかの実験室ハンドブック（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）に記載され、当業者に周知である。これらの方法は、リボヌクレアーゼ保護、プライマー伸長、ノ・ザン・ブロッティング、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション、および慣用のまたはリアルタイムＰＣＲを含む。
【００５６】
伝統的には、生成された特定のｍＲＮＡの量、したがって遺伝子の活性化状態はノ−ザン・ブロッティングによって測定されている。試料から単離された総ＲＮＡは、アガロース・ゲル電気泳動によって分離され、対象遺伝子に特異的な相補的ＤＮＡプローブでプロービングされる。従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、解析されるべき細胞または組織から単離された総ＲＮＡは第１鎖ｃＤＮＡに逆転写され（ＲＴ−ＰＣＲ）、次にそれを鋳型として使用して、標的の特異的オリゴヌクレオチド・プライマーを用いて二本鎖のアンプリコンを増幅する。両方の技術では、検出は、蛍光色素または放射性同位体などの検出可能な標識に基づいている。また、ＤＮＡチップまたはマイクロ・アレイとして知られる最近開発された技術は、相補的な標的の特異的プライマーへの標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション、未結合ＤＮＡの洗い出し、および結合した標的ＤＮＡの定量に基づいている。ハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブおよびプライマーは、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列、またはマーカー遺伝子に対応する翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計されてもよい。発現したＲＮＡの量の変化を決定するための便利な定量的ハイブリダイゼーション法は、ＷＯ２００２／０５５７３４に記載されている。
【００５７】
好ましくは、「マーカー遺伝子発現」は、定量的リアルタイムＰＣＲとも呼ばれるリアルタイムＰＣＲを用いて定量されてもよい。この方法はポリメラーゼ連鎖反応の一般的パターンに従うが、標的ＤＮＡの増幅領域は、蛍光色素、例えば、二本鎖ＤＮＡとインタカレートするＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの蛍光色素、または相補的ＤＮＡとハイブリダイズしたときに蛍光を発する修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、各ラウンドの増幅後に定量される。しばしば、リアルタイムＰＣＲは、少量のｍＲＮＡを定量するために逆転写と組み合わせられる。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００または７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓなどのコンピュータソフトウェアによってデータを解析し、いくつかの試料間の相対的な遺伝子発現、または標準曲線に基づいたｍＲＮＡのコピー数を計算することができる。通常、相対的な定量（ＲＱ）を使用して、野生型の発現レベルと変異した対立遺伝子の発現レベルを比較し、または種々の組織における遺伝子の発現レベルを比較する。ＲＱは、基底または較正の試料（比較結果の基準として使用される試料）と同じ配列と比較した、試験試料の標的遺伝子の発現における変化を決定する。較正試料は、経時的試験における時間ゼロでの未処理の対照または試料であり得る。内因性または内部対照を用いることによって、各反応に添加されたｃＤＮＡの量の相違についてｃＤＮＡ標的の定量化を正規化することができる。典型的には、ハウスキーピング遺伝子、例えばβ−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびリボソームＲＮＡは、それらの発現レベルが比較的安定であるため、内因性対照として使用される。試料および内因性対照の反復反応は、統計的有意性を確保するために必要とされる。
【００５８】
タンパク質特異的な抗体は、好ましくは、動物で抗原タンパク質の免疫処置を行うことによって得られる抗血清から精製される。より好ましくは、タンパク質特異的な抗体は、ウサギで抗原タンパク質の免疫処置を行うことによって得られる血清から精製されるポリクローナル抗体である。
【００５９】
タンパク質を特異的に認識する抗体を合成するために、始めにタンパク質を得る。このタンパク質は、既知のアミノ酸配列を用いて合成するか、遺伝子工学手法によって組換えタンパク質型で産生させることができる。例えば、組換えタンパク質は、ＮＩＨプログラムＧｅｎＢａｎｋデータベースに記載された遺伝子の塩基配列を用いて、組換えタンパク質の形態でタンパク質を発現する発現ベクターを調製するステップ、発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換することによって形質転換体を得て、組換えタンパク質を生成させるステップ、および形質転換体を培養してヒト組換えタンパク質を単離／精製するステップを含む方法によって調製することができる。
【００６０】
本発明に含まれるタンパク質に対して特異的な抗体を用いた抗原−抗体結合反応によってＩＢＤ（例えば、ＵＣおよびＣＤ）を診断することは、試料中のこれらのタンパク質の発現を決定することによって行うことができる。発現レベルは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、およびポリアクリルアミドゲル上でのウェスタン・ブロッティングまたはイムノブロッティング解析、ならびに免疫組織化学的アッセイを含む、当該技術分野において知られている技術によって検出することができる。
【００６１】
試料（標本）として、組織、体液、最も好ましくは血液および排泄物が、好ましくは用いられる。
【００６２】
本発明の一実施形態は、患者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と過敏性腸症候群（ＩＢＳ）とを区別するのに使用する方法であって、少なくとも２つのマーカーの発現レベルが、前記患者から採取された試料において決定され、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質（次の表１参照）を含む群から選択される方法である。
【００６３】
【表１】
【００６４】
本発明の別の実施形態は、炎症性腸疾患が指示される場合、潰瘍性大腸炎とクローン病との区別が、前記患者から採取された試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定することによって行われ、前記マーカーは上記表１に示される群から選択される方法である。
【００６５】
さらに、本発明の実施形態によれば、疾患活性が監視され、潰瘍性大腸炎またはクローン病の活動期と非活動期との識別が、前記少なくとも１つのマーカー、すなわち遺伝子またはその断片の対応するタンパク質の発現パターンに基づいてなされる。好ましくはＳＬＣ６Ａ１４およびＧＲＯ−１が用いられ、またはその替りにもしくはそれと共にＲｅｇＩＶおよびバニン−１が用いられる。
【００６６】
上記方法では、前記試料は、好ましくは糞便試料、血液、血漿、血清および生検試料であり、最も好ましくは糞便試料または血液試料である。
【００６７】
好ましくは、ＩＢＳとＩＢＤとを識別するために、最初に糞便試料において決定が行われる。ＩＢＤが指示される場合、ＵＣとＣＤとを識別するために、更なる解析が生検試料で行われる。患者の疾患の進行または回復を監視するために、糞便試料および生検試料の両方の解析を繰り返すことができる。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、発現レベルは、前記少なくとも２つのタンパク質またはそれらの断片を同定することができる少なくとも２つの抗体を用いて、前記試料の少なくとも一部を前記少なくとも２つの抗体と接触させるステップおよび接触させた試料と抗体の反応の程度を監視するステップによって決定される。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、接触段階および監視段階は、試料からタンパク質を抽出し、アッセイを行って、前記試料中における、列挙したタンパク質の少なくとも２つの量を決定することによって実行される。
【００７０】
好ましくは、抗原−抗体結合反応は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、ウェスタン・ブロッティング、イムノブロッティング解析、または免疫組織化学的アッセイからなる群から選択されるいずれか１つの技術によって検出される。
【００７１】
あるいは、接触段階および監視段階は、患者試料と抗体を免疫組織化学的に反応させ、試料中の反応物を検出することによって実行される。
【００７２】
本発明によれば、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルである。
【００７３】
本発明の別の実施形態は、患者における炎症性腸疾患と過敏性腸症候群との区別における使用に適したキットであって、上記表１に示されたタンパク質を含む群から選択される少なくとも２つのタンパク質またはタンパク質断片を同定することができる少なくとも２つの抗体、および抗体と試料との反応の程度を検出するための手段を含むキットである。
【００７４】
本発明の別の実施形態は、潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別するのに適したキットであって、好ましくは、上記表１に示されたタンパク質を含む群から選択される少なくとも２つのタンパク質またはタンパク質断片を同定することができる少なくとも２つの抗体、および抗体とタンパク質との反応の程度を体液中で直接的に検出することを含み、上記抗体が固体マトリックスに結合され、さらに使用のための指示書を含むキットである。
【００７５】
本発明の実施形態にかかるキットでは、潰瘍性大腸炎またはクローン病を患っている患者が、活動型の前記疾患を患っているか、受動型の前記疾患を患っているかを決定するために、前記少なくとも２つのタンパク質の発現パターンが標準的なパターンと比較される。
【００７６】
さらに、キットは、既知量の対照として提供されるタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを含む。
【００７７】
本発明の別の実施形態によれば、キットは、競合イムノアッセイにおける使用に適しており、固相をさらに含み、タンパク質、タンパク質断片またはペプチド断片が固相に結合される。前記固相は、好ましくは１または複数のニトロセルロース、セルロース、ガラス、プラスチック、マイクロタイター・プレートおよびウェル、例えばマイクロタイター・ウェルを含む。
【００７８】
好ましい実施形態によれば、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１タンパク質に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ技術は、
１）試料と対照群でコーティングされたリアクター内に特異的抗体を入れて、抗原−抗体反応を誘導するステップ、
２）二次抗体−標識コンジュゲートおよび標識基質の発色基質溶液を用いて抗原−抗体反応生成物を検出するステップ、および
３）試料の検出結果を対照群の検出結果と比較するステップ
を通じて行われる。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ、生物学的マイクロチップまたは自動化マイクロアレイシステムなどの既知の技術を用いて、大量の試料を解析することができる。生物学的マイクロチップは、生物学的マイクロチップ上に特異的な抗体タンパク質を固定することによって、抗体タンパク質と個体から回収した試料の反応を引き起こして、特異的な抗体タンパク質に対する抗原を検出することができる。
【００８０】
また、本発明は、選択された少なくとも２つの遺伝子と特異的に反応する抗体を用いて、これらの遺伝子の少なくとも２つの組み合わせを含む、ＵＣおよびＣＤを診断するためのキットも提供する。
【００８１】
本発明にかかる診断キットは、固相または担体、例えばウィッキング・メンブレンを含む。このようなウィッキング・メンブレンに適した材料の例には、限定されないが、ナイロン、ポリエステル、セルロース、ポリスルホン、ジフッ化ポリビニリデン、酢酸セルロース、ポリウレタン、ガラスファイバー、ニトロセルロースなどが挙げられる。また、固相は、マイクロキャリア、パーティクル、メンブレン、ストリップ、ペーパー、フィルム、パールまたはプレート、例えばマイクロタイター・プレートの形態であってもよい。
【００８２】
診断キットは、抗原−抗体結合反応によって抗体タンパク質の抗原を定量的および定性的に解析することによりＵＣおよびＣＤを診断することができる。抗原−抗体結合反応は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチ・アッセイ、ポリアクリルアミド・ゲル上のウェスタン・ブロッティング、およびイムノブロッティング解析を含む当該技術分野において一般に知られている技術によって検出することができる。例えば、診断キットは、組換えモノクローナル抗体タンパク質でコーティングされた９６ウェルマイクロタイター・プレートを用いたＥＬＩＳＡで使用されるように提供され得る。別の例は、排泄物試料または血液試料用の診断用ディップスティックの使用である。
【００８３】
本発明にかかる診断キットに含まれる対照は、正の対照および負の対照を含む。
【００８４】
種々の試料の診断に使用される抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、現在、当該技術分野において周知である方法によって作ることができる。例えば、実施例２または３の抽出物に対するポリクローナル抗体は、ウサギなどの動物を免疫化し、次に従来の慣例に従って抗体を精製することによって生成することができ、一方、前記抽出物に対するモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）の方法に従い、周知の慣例に従って、マウスなどの動物を免疫化し、その脾臓から脾臓細胞を抽出し、それらをマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作り、ハイブリドーマをスクリーニングおよびサブクローニングすることによって作ることができる。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるイムノアッセイは、ＥＬＩＳＡサンドイッチ・タイプである。より好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡサンドイッチ・イムノアッセイは、タンパク質の定量化における試料循環脂質の妨害を減少させるための膵臓性コレステロール・エステラーゼを含む特定の緩衝液（浄化緩衝液（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ））を用いた試料の前処理を伴う。別の好ましい実施形態では、イムノアッセイはウェスタン・ブロット・アッセイ（内部対照を用いることが特に好ましい）である。
【００８６】
二次抗体標識基質として、発色を誘導する既知の標識基質が、好ましくは用いられ、本発明に有用な標識基質の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、コロイド金、フルオレセイン、例えばポリＬ−リジン−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはローダミン−Ｂ−イソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、および色素が挙げられる。本発明では、例えば、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）が用いられる。
【００８７】
好ましくは、使用される色原体は発色を伴う標識基質に従って変化し、その使用可能な例には、３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）が挙げられる。
【００８８】
より好ましくは、色原体は緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．５）に溶解された状態で提供される。ＴＭＢなどの色原体は、二次抗体コンジュゲートの標識基質として使用されるＨＲＰによって分解され、発色する沈殿物を生成する。発色する沈殿物の沈殿レベルは肉眼で観察され、それによってタンパク質抗原の存在を決定する。
【００８９】
好ましくは、洗浄溶液はリン酸緩衝溶液、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ ２０を含み、より好ましくは０．０２Ｍリン酸緩衝溶液、０．１３Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む緩衝溶液である。抗原−抗体結合反応後、適量の洗浄溶液は、二次抗体と抗原−抗体コンジュゲートの反応を受けたリアクター内に供給される。洗浄溶液を用いた洗浄は、３〜６回繰り返して行われる。好ましくは、０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液はブロッキング溶液として使用され、好ましくは、２Ｎ硫酸溶液は酵素反応の停止溶液として使用される。
【００９０】
ここでは、診断キットを用いて、標本試料中のＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１抗原を検出することによって、初期段階のＵＣおよびＣＤを診断する方法が記載される。陽性および陰性対照群の抗体および標本試料はそれぞれ反応し、洗浄溶液で洗浄される。次に、基質との反応によって色を生じる標識基質で標識された二次抗体コンジュゲートを得られた生成物に添加し、洗浄溶液で再び洗浄される。その後、基質を含む溶液を得られた生成物に添加され、発色を誘導する。次に、吸光度４５０ｎｍを測定する。ここで、標準抗原溶液Ａの平均吸光度は、０．０００以上であり、０．２００以下でなければならない。標準抗原溶液Ｆの平均吸光度は、１．２００以上であり、３．０００以下でなければならない。標準抗原溶液ＡとＦの吸光度値の平均値は、カットオフ値として設定され、正または負の試料として試料を決定するために用いられる。試料の吸光度が標準抗原溶液Ｆの吸光度よりも大きい場合、試料を希釈し、次にその吸光度を再度測定する。カットオフ値を上回る吸光度を有する試料を正であるとして特定し、カットオフ値を下回る吸光度を有する試料を負であるとして特定する。
【００９１】
患者の血液または排泄物（生検）を用いた新規な免疫学的診断ツールである、本発明にかかるＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１に対するヒト特異的抗体を含むＵＣ／ＣＤ診断キットは、高い正確度と再現性を有していることが確かめられた。従来、内視鏡検査、組織学、病歴およびＰ−ＡＮＣＡ抗体の組合せがＩＢＤの診断に使用されるが、しかしながら正確性があまり高くない（Ｂｏｓｓｕｙｔ，Ｘ．、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２ ２００６）。しかしながら、本発明にかかるＵＣおよびＣＤの早期診断についての試験は、約９５〜９７％の診断正確度を示し、従来の試験よりも高い統計的有意性である。したがって、本発明にかかる診断方法およびキットは、高い正確度と再現性のために、ＵＣおよびＣＤの早期診断、ならびにＩＢＳの診断に非常に好都合に使用することができる。
【実施例】
【００９２】
ここで、本発明は、いずれにおいても本明細書に記載される特定の実施形態に範囲を限定することなしに、以下の実施例によって詳細に例証される。
［実施例１］
【００９３】
組織回収および保存
ＵＣ、ＣＤまたはＩＢＳを患っている患者、および健常なボランティアから結腸組織生検、排泄物試料および血液試料を採取した。
【００９４】
１．１ ＲＮＡ作業について：
ＵＣ、ＣＤまたはＩＢＳを患っている患者（各々、５〜１０人の患者）から排泄物試料を採取した。排泄物試料をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と１：１の比で混合し、使用するまでＲＴで維持した。
【００９５】
１．２ タンパク質作業について：
ＵＣ、ＣＤまたはＩＢＳを患っている患者から排泄物試料を採取した。使用するまで−２０℃で排泄物試料を直接凍結した。あるいは、適切な緩衝液と１：１の比で試料を混合した。
［実施例２］
【００９６】
リアルタイムＰＣＲ解析用の排泄物試料からのＲＮＡ抽出
２．１ ＲＮＡ単離：
全ての患者の排泄物試料からの総ＲＮＡは、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｍｏｔｏｒ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて、製造業者のプロトコールに従って（Ｋｉｍｂｌｅ／Ｋｏｎｔｅｓ、Ｋｉｍｂｌｅ Ｇｌａｓｓ Ｉｎｃ．）、最初に生検試料をホモジナイズすることによって単離された。ホモジネートから、総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを用いて、製造業者のガイドラインに従って（Ｑｉａｇｅｎ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ）単離された。
【００９７】
２．２ ｃＤＮＡ合成：
２μｇの各ＲＮＡ試料は、１０ｐＭのオリゴ−ｄＴ−プライマーＶＮ−Ｔ２０（５’−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＮ Ｖ−３’）を用いて第１鎖のｃＤＮＡ合成に使用された。緩衝液、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、ならびに酵素の逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給され、反応は製造業者のガイドラインに従って行われた。酵素を除いた第１鎖合成の反応混合物は、ＰＣＲ機器（ＨｙｂｉｄのＰＣＲスプリント）中で１０分間、６５℃でプレインキュベートされ、氷上で冷却され、次に酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを添加し、ＰＣＲ機器中で１．５時間、４２℃でインキュベートした。
【００９８】
２．３ 排泄物試料由来のｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析：
リアルタイムＰＣＲ解析は、各排泄物試料由来の１：１０に希釈した第１鎖ｃＤＮＡ材料とＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを用いて、製造業者の推奨に従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ＰＣＲ機器で行われた。プライマーは、７つのマーカー遺伝子と内部対照を増幅するように設計され、大きさにして１０６〜１６０ｂｐの範囲の断片を得た。（４００ｂｐを超える断片は、確実なシグナルをほとんど与えない傾向にあるので、小さな断片が必要である）。リアルタイムＰＣＲ解析で使用するために提供されているソフトウェア（ＳＤＳ ４．０；相対定量アッセイ）を用いて、いわゆる「デルタＣｔ」値が、分析された各排泄物試料に対する全てのマーカーについて得られた。
【００９９】
このタイプの分析については、指示された断片サイズを与える特異的なリアルタイムＰＣＲプライマーが使用された。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
次に、各マーカーについてのデルタＣｔ値を各マーカーに対してプロットし、グラフを解析することによって発現プロフィールを決定した（結果を参照されたい）。
【０１０２】
実験に使用されたフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーを表３に示す。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
ＲＮＡデータは、ＧＲＯ−１およびＲｅｇＩＶが排泄物のＲＮＡレベルでＩＢＤとＩＢＳとを区別するための良好な組み合わせであることを示す（例えば、図５を参照されたい）。さらに、血液試料からのＲＮＡデータは、バニン−１が良好な区別の可能性を有することを示す。マーカーＳＬＣ２６Ａ２、ＭＡＰ−１７およびバニン−１が、ＲＮＡレベルで血液において十分に検出可能である。マーカーＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７およびＲｅｇＩＶ．ＳＬＣ１４Ａ６は検出可能であったが、ＲＮＡレベルで血液において発現された場合に低レベルであった。
【０１０５】
ＭＭＰ−７、ＲｅｇＩＶおよびＧＲＯ−１が分泌性タンパク質であるという事実から、本発明者らは、タンパク質レベルでの発現が検出するにはより容易であり、これは、血液のＲＮＡデータの成績を確認するために使用され得ると結論付ける。
【０１０６】
血液のＲＮＡについて、１つのマーカー、すなわちバニン−１のみを用いたＩＢＤとＩＢＳとの区別が、すでに信頼に足るものであったことに留意すべきである。ＡＵＣは０．８６７であった。
［実施例３］
【０１０７】
タンパク質抽出
３．１ 生検試料からのタンパク質抽出
得られた固定された生検試料を遠心分離し、固定剤を除去し、ＰＢＳで洗浄しなければならない。次に、抽出緩衝液（１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８；１ｍＭのＤＴＴ；０．５ｍＭのＰＭＳＦ）を添加し、製造業者のプロトコールに従って、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて試料をホモジナイズした。その後、０．１〜０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加し、混合物を５分間４℃でインキュベートして細胞を溶解した。５分４℃の遠心分離後、上清（＝抽出物）を新しいチューブに移し、抽出物を使用するまで、−８０℃で急激に凍結した後に保存した。
【０１０８】
３．２ 排泄物試料からのタンパク質抽出
抽出緩衝液（１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８；１ｍＭのＤＴＴ；０．５ｍＭのＰＭＳＦ）およびガラスビーズを排泄物試料に添加し、完全にボルテックスした。その後、０．１〜０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加し、５分間４℃でインキュベートして細胞を溶解した。５分間、４℃の遠心分離後、上清（＝抽出物）を新しいチューブに移し、抽出物を使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０９】
３．３ 血液からのタンパク質抽出
凍結された血清に同量の２×抽出緩衝液（２００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８；２ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＰＭＳＦ）＋０．２〜０．４のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加し、混合物を５分間４℃でインキュベートして細胞を溶解した。５分間、４℃の遠心分離後、上清（＝抽出物）を新しいチューブに移し、抽出物を急激に凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１０】
血液または血清からタンパク質を抽出する代わりに、血清を直接用いて、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることができる。
［実施例４］
【０１１１】
ポリクローナル抗体を用いた標本試料のウェスタン・ブロット解析
各々の患者および標本試料について、タンパク質抽出物（１０μｇの総タンパク質／レーンに標準化される）を、１２または１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって８回分離し、電気ブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたセミドライ・ブロッティングによってポリジフッ化ビニリデンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ；０．８ｍＡ／ｃｍ↑２、６０分間；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移された。次に、プロットＩＤ１〜７のタンパク質およびベータ−チューブリンに対する特異的抗体との反応のために、メンブレンを８片に切った。抗体をブロッティング緩衝液に希釈した。その後、メンブレンを洗浄し、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ検出試薬とともにインキュベートし、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ともにＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に曝した。ＲｅｇＩＶおよびＭＭＰ−７に対して指向された一次抗体はＡｂｃａｍから入手され、ＧＲＯ−１はＲＤＳから得られ、ならびにＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＭＡＰ−１７およびバニン−１は商業的供給者によって合成された。タンパク質含有量は、アルファ−チューブリンに対する抗体を用いた並行ハイブリダイゼーションによって正規化された。全てのウェスタン・ブロットは、時間の長さを変えてフィルムに曝され、亜飽和レベルの強度を生じるフィルムだけが濃度的および統計的評価のために選択された。直線性は、様々な量の材料および複数回のフィルム露光を用いることによって独立した実験において確認された（データは示さず）。
【０１１２】
また、正の対照として、プロットＩＤ１〜７の組換えタンパク質（抗体として同じ供給源から入手される）を同じ方法で解析した。
［実施例５］
【０１１３】
マーカータンパク質に対して生じさせたポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ解析
第一に、ウェルを試料でコーティングした。第二に、７つのタンパク質であるプロットＩＤ ＮＯ１〜７に対する特異的なポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡプレートウェルをコーティングした。第三のステップは、試料における特異的な抗原−抗体結合の存在の検出であった。
【０１１４】
５．１ 試料によるウェルのコーティング
結腸生検、排泄物試料および血液試料から得たタンパク質抽出物を標本試料として用いた。カットオフ値を測定するための標準曲線を得るために、標準抗原溶液１〜７を、それぞれ、０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、３２０ｎｇ／ｍｌおよび６４０ｎｇ／ｍｌの種々の濃度の希釈物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧを用いて調製した。
【０１１５】
１００μｌの各標本タンパク質試料をそれぞれの９６ウェルＥＬＩＳＡ平底プレートに分配し、３７℃で４時間反応させ、洗浄緩衝溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４を含むＰＢＳ）で４回洗浄した。ここで、上記で調製された標準抗原溶液を正の対照群として使用し、正常なウサギ血清を負の対照群として使用した。
【０１１６】
５．２ ポリクローナル抗体の添加
標本試料でコーティングされた各ウェルにプロットＩＤ１〜７のタンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体を入れ、蓋で覆い、４℃で１６〜１８時間放置した。ポリクローナル抗体は、５μｇ／ｍｌの濃度で０．５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈させ、希釈された溶液の１００μｌを各ウェルに添加した。対照群として、上記タンパク質に影響されない正常なウサギ血清を炭酸塩緩衝溶液で５００倍に希釈し、各ウェルに分配した（１００ｐｌ／ウェル）。
【０１１７】
次に、プレートのウェルを洗浄緩衝溶液で４回洗浄した。非特異的なタンパク質結合部位をブロックするために、ブロッキング溶液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４））を各ウェル（３００ｐｌ／ウェル）に分配し、３７℃で２時間放置した。
【０１１８】
５．３ 抗原−抗体複合体の検出
１０，０００倍希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体の１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間放置し、洗浄緩衝溶液で４回洗浄した。その後、基質として１ｍｇの３．３’，５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を１０ｍｌのクエン酸塩緩衝溶液（ｐＨ５．０）に溶解し、２μｌの３５％過酸化水素をそれに添加し、それにより基質溶液を調製した。１００μｌの調製された基質溶液を各ウェルに分配し、光に曝さずに室温で１５分間反応させた。その後、５０μｌの２ＮのＨ２ＳＯ４溶液を添加し、反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１９】
プロットＩＤ１〜７のタンパク質のうちの１つを用いて試験された各標本試料について、抗原による吸光度は、試料の吸光度から、正の対照群としてのタンパク質のみ、および負の対照群としてのＰＢＳでコーティングしたウェルの吸光度を差し引くことによって得られる残り物として推定された。同じようにして、標準溶液の吸光度値を計算した後、各タンパク質についての標準抗原溶液Ａ〜Ｆの吸光度値の平均値をカットオフ値として設定した。カットオフ値を上回る吸光度を有する試料を正として同定し、カットオフ値を下回る吸光度を有する試料を負として同定した。
【０１２０】
カットオフ値に基づいて、それぞれの試料の吸光度値は、それらが正であるかまたは負であるかを決定するために比較された。
【０１２１】
本発明は、本発明者らに現在知られている最良の態様を構成する好ましい実施形態に関して記載されるが、当業者に明確となるであろう様々な変更および修飾は、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載される発明の範囲から逸脱せずに行うことができることは理解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多重遺伝子アプローチを用いた炎症性腸疾患の診断に使用する方法に関する。より詳細には、本発明は、少なくとも１つの特定のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現を、例えば前記マーカー遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを用いて決定するか、または対応するタンパク質の発現を、例えば前記特定のマーカー遺伝子（単数または複数）によってコードされるタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて決定することによって、炎症性腸症候群（ＩＢＳ, inflammatory bowel disease）から、炎症性腸疾患（ＩＢＤ, inflammatory bowel syndrome）を診断および／または区別するのに使用をする方法およびキットに関する。改善された正確度および再現性により、これらの疾患の早期診断および区別において、この診断方法および対応するキットを有利に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、慢性再発性腸炎の状態を表す。疾患病因の現在の理解は、多様な環境および遺伝因子の複雑な相互作用を示唆する。それは、欧州を起源とする集団においてかなりの罹患率を引き起こし、２つの主要な形態、すなわち、クローン病（ＣＤ, Cronhn's disease）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ, ulcerative coliteis）の合計した有病率は１５０〜２５０／１００００である。ＩＢＤの両形態は、成人期早期の最高発生率を有するが、いずれの段階でも発症する可能性がある。それらは、およそ等しい程度で男女に影響を及ぼす。ＩＢＤの発症についての環境的危険因子ははっきりと明確にされていない。最も特徴付けられた因子は喫煙であり、明確でない理由で、クローン病を発症する危険性を明確に増加させるが、潰瘍性大腸炎に対しては保護している。
【０００３】
現在、いずれの状態に対しても治療法がないため、疾患管理は、患者と医師の両方にとって長期のコミットメントである。およそ３０％のＩＢＤ患者は、患者の生存期間中に外科的処置を受け、長期間のＩＢＤを有する患者は、結腸直腸癌を発症する危険がかなりある。１０人のＩＢＤ患者のうち３人は、かなりの副作用を引き起こす高投薬量を使用する場合でさえ、現在利用可能な最良の薬物療法にも応答しない。
【０００４】
潰瘍性大腸炎は、典型的には、血性下痢および便意切迫の症状を引き起こす。炎症は直腸を冒し、近接結腸の一部、または全近接結腸に連続的に拡張し得る。組織学的試験を行うと、結腸粘膜の表層に限定されている慢性炎症性細胞の浸潤が明らかになる。肉芽腫は特徴ではない。クローン病は、ややより多形性である。クローン病は、貫壁性炎症の非連続的な病変によって病理学的に特徴付けられ、それらは、口から肛門の胃腸管のいずれの部分も冒し得るが、最も一般的には回盲部を冒す。肉芽種は組織学的な顕著な特徴であるが、臨床的特徴は、腸罹患部位に依存してやや変化し易い。結腸が炎症を起こしている場合、その症状は、潰瘍性大腸炎の症状を正確に模倣し得る。
【０００５】
初期段階でＵＣを結腸ＣＤから臨床的に区別する可能性が、患者と医師の両方に多大な利益を与えることは明らかである。それは、正確な治療処方計画の設計を可能にし、不要な薬物の使用を妨げ、治療費を削減する。
【０００６】
炎症性腸症候群、すなわちＩＢＳは、腸壁の平滑筋が、ストレスなどの誘因に対して、またはコーヒーにさえ、過敏となり、腫脹、吐き気、嘔吐および便秘または下痢を引き起こす胃腸障害でもある。残念なことに、多くの症状はＩＢＤの症状と類似しているため、ＩＢＳは、多くの場合、誤診される。
【０００７】
米国だけでＩＢＳがおよそ５００万件の症例がある。より重篤なＩＢＤ症例からＩＢＳを区別することができれば、ＩＢＤであることが疑われるＩＢＳ患者による医師への不必要な訪問数を減少させることになる。また、医師が最も適切なタイプの処置を選択する手助けともなる。
【０００８】
特許文献は、ＩＢＤの異なる形態を相互に識別するため、詳細には、ＵＣとＣＤとを区別するために利用可能な方法が、上記に示した様々な検査手順の例を別にすれば、抗体に基づく方法に集中してきたことを示す。
【０００９】
例えば、ＷＯ０３／０３６２６２は、クローン病に対するマーカーとして排泄物の抗サッカロマイセス・セレヴィシエ抗体（ＡＳＣＡ, anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies）の存在を用いて、ＵＣおよびＩＢＳなどの他の胃腸病からＣＤを区別するための方法およびキットが提供されることを報告している。キットは、ヒト排泄物試料中の総内因性ＡＳＣＡを測定するための、ヒト免疫グロビンに特異的な抗体を利用する酵素統合イムノアッセイまたは他のイムノアッセイを含む。
【００１０】
ＷＯ０１／５８９２７は、幹部組織におけるｈＴＭに対する自己抗原応答と関連した疾患、および特にＵＣを検出するための診断方法を記載する。
【００１１】
別の集中的に研究された抗体アプローチ（米国特許第５，６９１，１５１号、第５，８３０，６７５号および第６，０３３，８６４号参照）は、好中球に対する自己抗体（異型核周囲の抗好中球細胞質抗体）Ｐ−ＡＮＣＡ（atypical perinuclear anti-neutrophil cytoplasimc antibodies)である。それらは主にＵＣ（５０〜６７％）に見出されるが、さらにＣＤ（６〜１５％）にも見出される。ＡＮＣＡおよびＡＳＣＡの組み合わせは、不確定な結腸炎の患者において良好な手助けとなると考えられる。しかし、注目すべき所見は、不確定な結腸炎を有する患者の約５０％が血清反応陰性の患者であるということである。これは、彼らはＡＳＣＡとＡＮＣＡの抗体を作らず、したがって、平均して１０年間は診断することができないことを意味する（Ｂｏｓｓｕｙｔ Ｘ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００６，５２：２，１７１−１８１）。
【００１２】
ＷＯ２００４／００１０７３は、ＵＣに対する診断マーカーとして本発明において言及されている７つの遺伝子を記載する。ＲＮＡレベルでのこれらのマーカーの発現は、結腸からの粘膜生検において決定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ０３／０３６２６２
【特許文献２】ＷＯ０１／５８９２７
【特許文献３】米国特許第５，６９１，１５１号、
【特許文献４】米国特許第５，８３０，６７５号
【特許文献５】米国特許第６，０３３，８６４号
【特許文献６】ＷＯ２００４／００１０７３
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】KS Bishnupuri LQ, N Murmu, C W Houchen, S Anant, B K Dieckgraefe. Reg IV activates the epidermal growth factor receptor/Akt/AP-1 signaling pathway in colon adenocarcinomas. Gastroenterology 2006; 130: 137-49.
【非特許文献２】Bossuyt X. Serologic Markers in Inflammatory Bowel Disease. Clin Chem. 2006; 52: 171 -181
【非特許文献３】Heller et al., Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays, Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18; 94(6): 2150-5.
【非特許文献４】Hirata I, Murano M, Nitta M, Sasaki S, Toshina K, Maemura K, Katsu K (2001 ). Estimation of mucosal inflammatory mediators in rat DSS-induced colitis. Possible role of PGE(2) in protection against mucosal damage. Digestion. 63 Suppl 1: 73-80
【非特許文献５】Isaacs KL, Sartor RB, Haskill S (1992). Cytokine messenger RNA profiles in inflammatory bowel disease mucosa detected by polymerase chain reaction amplification. Gastroenterology. 103: 1587-95
【非特許文献６】Keiichi Mitsuyama OT, Nobuo Tomiyasu, Koseku Takaki, Asuka Suzuki, Junya Masuds Hiroshi Yamasaki, Atsushi Toyonaga, Michio Sata. Increased Circulating Concentrations of Growth-Related Oncogene (GRO)-α in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Digestive Diseases and Sciences 2006; 51: 173-77
【非特許文献７】Kohler and Milstein (Nature (1975) 256:495)
【非特許文献８】Lawrance IC, Fiocchi C, Chakravarti S (2001 ). Ulcerative colitis and Crohn's disease: distinctive gene expression profiles and novel susceptibility candidate genes. Hum Mol Genet. 10: 445-56.
【非特許文献９】Newell KJ et al., Matrilysin (matrix metalloproteinase-7) expression in ulcerative colitis-related tumorigenesis, Mol Carcinog. 2002 Jun;34(2): 59-63.
【非特許文献１０】Pitari G et al., Pantetheinase activity of membrane-bound Vanin-1: lack of free cysteamine in tissues of Vanin-1 deficient mice, FEBS Lett. 2000 Oct 20; 483(2- 3): 149-54
【非特許文献１１】Silver DL, Wang N, Vogel S. Identification of Small PDZK1-associated Protein, DD96/MAP17, as a Regulator of PDZK1 and Plasma High Density Lipoprotein Levels. The Journal of Biological Chemistry 2003;278:28528-532.
【非特許文献１２】Spandau et al., High expression of chemokines Gro-alpha (CXCL-1 ), IL-8 (CXCL- 8), and MCP-1 (CCL-2) in inflamed human corneas in vivo, Ophthalmol. 2003 Jun; 121 (6): 825-31.
【非特許文献１３】Woessner JF Jr, Regulation of matrilysin in the rat uterus, Biochem Cell Biol. 1996; 74(6): 777-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
胃腸障害を報告する患者の正確、迅速かつ信頼できるスクリーニングを行い、ＩＢＤ患者と非ＩＢＤ患者、例えばＩＢＳを患っている患者とを区別するための改善された方法に関する必要性が残されている。患者および病院の両方の観点から、とりわけ、患者が回腸結腸内視鏡検査に送られる前に、最初のスクリーニングを行うことができるならば、それが望ましいであろう。
【００１６】
とりわけ、ＩＢＤ患者における潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別することに関連して、改善された潰瘍性大腸炎の診断も必要である。
【００１７】
本発明の１つの目的は、これらの用途に供する方法およびキットを利用可能にすることである。１つの特定の目的は、疾患の早期段階で信頼性のある診断を達成できるようにする方法およびキットを利用可能にすることである。別の目的は、治療に対する応答を追跡し、治療を受けている患者において改善を確認する、信頼性があり、なお簡便であり、侵襲の少ない方法の方法を利用可能にすることである。
【００１８】
別の目的は、通常使用される生検または回腸結腸内視鏡検査と対照的に、非侵襲的であるかまたは最小限に侵襲的である試料採取技術を用いて、第１のスクリーニングを行うことを可能にすることである。また、バリウム注腸検査はも、その検査が患者に与える非常な不快さと緊張により、侵襲的手法として分類されるべきである。臨床像が非常に類似し得る、ＩＢＤとＩＢＳとを区別するため、および困難な症例におけるＣＤとＵＣとを区別するための方法およびキットを利用可能にすることも目的である。
【００１９】
本発明の根底にある更なる目的、ならびに本発明によって与えられる解決および関連した利点は、本明細書、実施例および特許請求の範囲の検討に基づいて当業者に明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、驚くべきことに人体から採取された試料、好ましくは患者の排泄物もしくは血液から採取された試料、または腸の炎症部分から得られた生検試料において遺伝子の発現プロフィールが検査される多重遺伝子アプローチによって、ＩＢＤとＩＢＳとの区別、および、患者がＩＢＤを患っていることが決定されている症例では、ＵＣとＣＤとの更なる識別が可能となることを見出した。
【００２１】
本発明は、共同で、単独でまたは部分集合的に、ＩＢＤとＩＢＳとを識別するための基礎を形成する潜在的なマーカー遺伝子の同定に基づいている。
【００２２】
実験的に確認されている、本発明の一実施形態は、排泄物または血液からの試料を用いて、患者がＩＢＤを患っているかどうかを正確かつ簡便に決定するのに、および生検を用いた追跡調査解析で、患者がＵＣに冒されているか、ＣＤに冒されているかを決定するのに、いくつかの特異的遺伝子および対応するタンパク質の発現レベルの定量化を利用することができることである。
【００２３】
より具体的には、７つの異なるマーカーの発現レベルを定量するための遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドまたは抗体を用いて、単独でまたはその部分集合で上記マーカーの検出を可能にする方法が提供される。オリゴヌクレオチドまたは抗体は、対応する遺伝子配列またはマーカータンパク質を特異的に認識するように設計される。生物学的試料中の前記７つのマーカー遺伝子またはそのサブセットの発現状態を検出および監視するためのアッセイおよびキットが提供される。マーカー遺伝子（括弧内は受託番号）は以下の通りである：ＳＬＣ６Ａ１４（ＮＭ ００７２３１）；ＳＬＣ２６Ａ２（ＮＭ ０００１１２）；ＧＲＯ−１（ＮＭ ００１５１１）；ＭＭＰ−７（ＢＣ００３６３５）；ＭＡＰ−１７（ＮＭ ００５７６４）；ＲｅｇＩＶ（ＢＣ０１７０８９）、およびバニン−１（ＮＭ ００４６６６）。
【００２４】
本発明者らによって得られた結果は、血液試料中のＲＮＡを解析する場合にはバニン−１が好ましいマーカー遺伝子であることを示す。また、マーカーＳＬＣ２６Ａ２、ＭＡＰ−１７も血液における有用性を示す。
【００２５】
アッセイは、好ましくは、ＰＣＲ法に基づいてＲＮＡを定量するための方法およびキットである。
【００２６】
あるいは、アッセイは、上記のマーカータンパク質を検出するための、培養しない、抗体に基づくアッセイである。
【００２７】
したがって、本発明の別の実施形態は、人体から採取された試料中において、ヒト遺伝子ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１によって発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、初期段階のＵＣまたはＣＤを効果的に検出するための方法、および同抗体を用いてＵＣおよびＣＤを診断するためのキットである。本発明者らによって得られた結果は、試料の採取源がヒト排泄物である場合にはＧＲＯ−１およびＲｅｇＩＶが好ましいマーカータンパク質であり、試料が血液である場合にはバニン−１、ＧＲＯ−１およびＭＭＰ−７が好ましいマーカータンパク質であることを示す。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１をコードするヒト遺伝子から発現されたタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた抗原−抗体結合反応によって、試料中のＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１タンパク質の発現レベルを測定することにより、ＵＣおよびＣＤを診断するための方法、ならびに同抗体を用いてＵＣおよびＣＤを診断するためのキットである。
【００２９】
本発明の更なる実施形態は、治療に対する患者の応答を決定するための方法、治療中の改善の速度を決定するための方法、および回復の予後を評価するための方法である。
【００３０】
本発明は、以下の記載、実施例および図面において詳細に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】排泄物標本のリアルタイム解析由来の、１０例のＩＢＳ症例および１０例のＩＢＳ症例の発現プロフィールを示す図である。７つの異なるマーカーは、ｘ軸上にプロットされ、ＰＣＲ解析の対応するデルタＣｔ値はｙ軸上にプロットされている（１＝ＳＬＣ６Ａ１４；２＝ＳＬＣ２６Ａ２；３＝ＧＲＯ１；４＝ＭＭＰ−７；５＝ＭＡＰ１７；６＝ＧＩＳＰ；７＝バニン−１）。
【図２】リアルタイムＰＣＲ解析由来の、排泄物および生検試料における発現プロフィールを示す図である。７つの異なるマーカーは、ｘ軸上にプロットされ、ＰＣＲ解析の対応するデルタＣｔ値はｙ軸上にプロットされている（１＝ＳＬＣ６Ａ１４；２＝ＳＬＣ２６Ａ２；３＝ＧＲＯ１；４＝ＭＭＰ−７；５＝ＭＡＰ１７；６＝ＧＩＳＰ；７＝バニン−１）。［ｂｄ＝生検由来；ｆｄ＝排泄物由来］
【図３】リアルタイム解析由来の、生検試料における発現プロフィールを示す図である。７つの異なるマーカーは、ｘ軸上にプロットされ、ＰＣＲ解析の対応するデルタＣｔ値はｙ軸上にプロットされている（１＝ＳＬＣ６Ａ１４；２＝ＳＬＣ２６Ａ２；３＝ＧＲＯ１；４＝ＭＭＰ−７；５＝ＭＡＰ１７；６＝ＧＩＳＰ；７＝バニン−１）。
【図４】分類アルゴリズムを用いた解析によって追跡された７つ全てのマーカーを用いた、１８人の非ＩＢＤ患者および６３人のＩＢＤ患者のリアルタイム解析の結果であるＲＯＣプロットを示す図である。０．９０３のＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、全てのマーカーはともに識別能力が高いことを示す。
【図５】分類アルゴリズムを用いた解析によって追跡された２つだけのマーカー（ＧＲＯ−１およびＲｅｇＩＶ）を用いた、１８人の非ＩＢＤ患者および６３人のＩＢＤ患者のリアルタイム解析の結果としてのＲＯＣプロットを示す図である。０．８９２のＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）は、これらのマーカーだけでも識別能力が高いことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明が開示および記載される前に、本発明が、目的を実行し、言及された目的物および利点、ならびに本明細書において固有の目的、目的物および利点を得るのに十分適合していることを当業者は容易に承認するであろうことを理解するべきである。本実施例、ならびに本明細書に記載された方法、手法、処置、分子、および特定の化合物は、現在、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲の限定としては意図されていない。当業者によって想起される、それらにおける変化および他の使用は、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神に包含される。
【００３３】
また、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態だけを記載することを目的としたものであり、限定することを意図していないことも理解されなければならない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を指示していなければ、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「配列（ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」への言及は、１を超えるこのような配列を含み、他も同様である。
【００３４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、多数の用語に言及され、それらは以下の意味を有するように定義されている。
【００３５】
本明細書中で使用するとき、用語「相補的ＤＮＡプライマー」とは、本明細書に記載された条件下で、生物学的試料における逆転写酵素の存在下で新生ＤＮＡ鎖の合成を可能にする特定の方向でＲＮＡ鋳型（テンプレート）にアニーリングするオリゴヌクレオチドを意味する。
【００３６】
また、本明細書中で使用するとき、ＤＮＡ鎖が合成される「条件」は、逆転写酵素が逆転写酵素阻害薬物によって阻害されない場合、ＲＮＡ鋳型とＤＮＡプライマーがアニーリングし、オリゴヌクレオチドが合成されたＤＮＡ鎖に取り込まれるような量および温度でヌクレオチド、陽イオンおよび適切な緩衝剤が存在することを含む。例示的な条件は以下の実施例において記載される。記載された条件は、他の既知のＲＴ／ｃＤＮＡ合成プロトコールから最適化されている。一般に、他の条件は、当業者に周知であるプロトコールに基づいて、特定の逆転写酵素反応の最適化のために規定され得ることは知られている。
【００３７】
本明細書中で使用するとき、用語「プライマー対」とは、２つのプライマーを指し、センスおよびアンチセンス配列からなる二本鎖ＤＮＡ分子上のそれらのそれぞれの方向に対して、一方はフォワードの名称を有し、他方はリバースの名称を有する。その結果、本明細書に記載される増幅条件下、フォワード・プライマーはセンス配列にアニーリングし、その配列を増幅させる準備をし、リバース・プライマーはアンチセンス配列にアニーリングし、その配列を増幅させる準備をする。プライマーは、（プライマーの二量体形成を最小にするために）反応において他のプライマーと最小の相補性を有すること、および増幅方法、好ましくはＰＣＲに適切な反応温度の範囲であるＴｍ値を有することに基づいて、増幅反応における使用のために選択することができる。さらに、プライマーは、ＲＮＡ鋳型の特定の領域とアニーリングするように選択することができ、それにより、得られたＤＮＡ増幅産物は、長さにして１００〜５００塩基対、最も好ましくは長さにして約３００塩基対の大きさに及ぶ。
【００３８】
本明細書中で使用するとき、増幅されたＤＮＡを「検出すること」または増幅されたＤＮＡの「検出」とは、逆転写酵素がアッセイ混合物に添加された逆転写酵素阻害剤薬物に抵抗性である場合にだけ合成される、増幅されたＤＮＡ鎖の存在を定性的または定量的に決定することを指す。合成されたＤＮＡの増幅は、当該技術分野において知られているＤＮＡを検出するための任意の方法によって検出することができる。例えば、増幅されたＤＮＡの検出は、サザン・ブロット・ハイブリダイゼーション・アッセイによって、臭化エチジウム染色されたアガロース・ゲル上で特定の分子量のＤＮＡ増幅産物の視覚化によって、オートラジオグラフィーまたはシンチレーション測定による、合成されたＤＮＡ鎖への放射線標識されたヌクレオチドの取り込みの測定によって行うことができる。
【００３９】
本発明の方法では、ＰＣＲ増幅は、全てのＰＣＲ試薬、ならびに適切な遺伝子特異的なプライマーおよび熱安定性ポリメラーゼ酵素の存在下で標的核酸を含む試料をプレインキュベートすることによって達成される。得られる反応混合物は、プライマー伸長生成物の形成および増幅を可能にする条件下で周期的に加熱される。
【００４０】
ＰＣＲに必要とされる試薬は、当業者に知られ、一般には、標的核酸の保存領域にハイブリダイズさせるのに標的核酸の保存領域に十分に相補的である少なくとも２つのオリゴヌクレオチド・プライマー、４種の異なるヌクレオシド三リン酸、熱安定性重合試薬および重合試薬に対して場合によって必要な共同因子を含む。好ましいヌクレオシド三リン酸は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰであり、まとめてｄＮＴＰと呼ぶ。ヌクレオシド三リン酸は市販されている。
【００４１】
プライマーには、標的核酸にアニーリングし、適切な条件下で、すなわち、ヌクレオシド三リン酸、重合試薬、適切な温度、ｐＨおよび緩衝液の存在下で核酸合成の開始点として作用することができる天然に存在するかまたは合成的に生成されるオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは、標的核酸にハイブリダイズするのに標的核酸に十分に相補的な配列を有し、重合試薬の存在下で伸長産物の合成を準備するために、十分な長さであり、典型的には１０〜６０ヌクレオチドである。また、プライマーは、当業者に周知である方法によって自動合成によって合成的に生成することができる。
【００４２】
プライマーのための設計検討は当該技術分野において周知である。プライマーは、増幅されるべき特異的核酸の鎖の配列に実質的に相補的であるように選択され、それにより、１つのプライマーから合成された伸長産物が、その相補体から分離されると、他のプライマーの伸長産物に対する鋳型として機能を果たすことができる。好ましくは、プライマーは、標的領域と正確に相補的である。本明細書、実施例および特許請求の範囲に与えられたプライマー対は、本発明の範囲から逸脱することなしに、マーカー遺伝子に対する特異性を示す機能的に同等なプライマーによって置き換えられることが強調される。
【００４３】
本発明者らは、生検材料について記載されるＵＣとＣＤとを区別することができるかどうかを決定するために、リアルタイムＰＣＲを用いた解析のために３３個のＵＣおよび２４個のＣＤの排泄物試料（糞便試料）を回収した。驚くべきことに、本発明者らは、これらのマーカーの発現プロフィールが、排泄物標本のＵＣとＣＤについても実質的に同じであることを見出した。対照試料として、いくつかのＩＢＳ症例を用いた。これらは、ＩＢＤの２つの主要な形態として遺伝子の異なる発現パターンを示した。本発明者らは、６３例のＩＢＤ症例に対して、合計１８例のＩＢＳ症例において解析した。図１の結果は、１０例のＩＢＳ症例と１０例のＩＢＤ症例についてのＩＢＳとＩＢＤの発現プロフィールにおける明確な相違を示す。
【００４４】
別の驚くべき事実は、生検におけるＵＣについて上方制御された遺伝子が排泄物試料において、ここでは下方制御されたということであった（マーカー６、またある程度はマーカー５）。また、マーカー２（ＳＬＣ２６Ａ２）は、元々はＵＣにおいて下方制御されたが、ここでは、マーカー１（ＳＬＣ１４Ａ６）と比較して上方制御されたことが分かった。図２では、３人のＩＢＳ患者、３人のＵＣ患者および３人のＣＤ患者の排泄物および生検試料の発現プロフィールが示されている。
【００４５】
ＩＢＳ患者の症例では、遺伝子の発現プロフィールは、異なる標本間では変化しない。しかしながら、ＵＣ症例におけるプロフィールを比較すると、特にマーカー２、５および６の反対の発現の観点から２つの曲線の反対傾向を観察することができる。また、ＣＤについては、発現パターンは、生検において変化する（図３を参照されたい）。
【００４６】
溶質担体（ＳＬＣ, solute carrier）タンパク質は、エネルギー依存性輸送分子の非常に大きなファミリーを構成し、栄養素輸送における重要な生理学的役割を有し、薬物吸収を高めるためのメカニズムとして利用され得る。しかしながら、高解像度の結晶構造がないため、分子レベルでこれらのタンパク質を理解するには制限がある。
【００４７】
全体で、腎臓結石を患っている１〜２％の成人、および６〜８％の小児が、尿中のシスチンが高濃度になる、アミノ酸の輸送欠陥であるシスチン尿症を有する。溶質担体ファミリー３、シスチン、塩基性および中性アミノ酸輸送体、アミノ酸輸送隊のシステムと関連したタンパク質をコードするメンバー１（ＳＬＣ３Ａ１）、および溶質担体ファミリー７、メンバー９（ＳＬＣ７Ａ９）の２つの遺伝子が関係していた。これらの両方の溶質担体は、最終的には尿路感染症、および結局は腎不全をもたらす場合がある結石形成に関与すると考えられる。
【００４８】
ここで、本発明者らは、ＩＢＤにおいて発現が有意に変更する２つの既知の溶質担体（ＳＬＣ６Ａ１４およびＳＬＣ２６Ａ２）を同定している。
【００４９】
ＣＸＣケモカイン成長関連癌遺伝子−アルファ（Ｇｒｏ−アルファ、またはＧＲＯ１としても知られている）は、サイトカインと説明されており、それ自体、炎症の局所領域の多数の細胞型の移動応答を改変することができる。さらに、ヒトの炎症性角膜において過剰発現されることも報告され（Ｓｐａｎｄａｕら、２００３年）、加えて、消化管の炎症を示すように化学的に誘導されたラットは、ＧＲＯ１レベルの上方制御を示すことも示されている（Ｈｉｒａｔａら、２００１年）。ｃＤＮＡマイクロアレイ・アプローチを用いて、Ｈｅｌｌｅｒらは、１９９７年に、関節リウマチおよび炎症性腸疾患におけるケモカインＧｒｏアルファの新たな関与を報告している。Ｋｅｉｉｃｈｉらは２００６年に、ＩＢＤの患者において増殖関連癌遺伝子（ＧＲＯ）−αの血中濃度の上昇を報告した。Ｉｓａａｃｓらは１９９２年に、ＵＣにおけるＧＲＯ１の発現はＣＤで見られる発現よりも高いことが報告されているが、ここでは、ＧＲＯ１発現レベルに関して、ＵＣ対ＣＤの逆相関があることが示された。最後に、Ｌａｗｒｅｎｃｅらは２００１年に、ＵＣにおいて上方制御されるＧＲＯ１の同定について報告しているが、この研究の設計では、解析前に生検試料が貯蔵されるために、したがって、二人以上の患者においてＧＲＯ１が上方制御されたかどうかを知ることができなかった。
【００５０】
マトリライシン（またはマトリックス・メタロプロテイナーゼ−７）は、黄体退行しているラットの子宮で最初に発見された。これは、子宮メタロプロテイナーゼ、推定のメタロプロテイナーゼ（Ｐｕｍｐ−１）、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ−７）としても知られている。それは、いずれも細胞外マトリックスの巨大分子のほとんどを分解することができる１５種のＭＭＰファミリーの最小のメンバー（２８ｋＤａ）である。このファミリーは、簡単には以下のように概説される。全てのメンバーは、システインでブロックされた活性部位の亜鉛を有する酵素原の形態で生じる亜鉛メタロプロテイナーゼである。マトリライシンは、マトリックスの多種多様なゼラチン、プロテオグリカン、および糖タンパク質を分解させることができ、コラゲナーゼなどの他のいくつかのＭＭＰを活性化することができる（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ、１９９６年に概説されている）。
【００５１】
マトリライシンは、様々なタイプの癌、例えば結腸癌、胃癌、前立腺癌、および脳癌において頻繁に発現される。これまでの研究によれば、マトリライシンは結腸癌の進行および転移において重要な役割を果たすことが示唆されている。近年、Ｎｅｗｅｌｌらは２００２年に、ＵＣ関連の新生組織形成の様々な段階でマトリライシン発現が増加することを報告している。しかしながら、この研究は、このような発現の増加がＵＣの結果であるのか、またはむしろ新生組織形成の存在によるものなのかを決定していない。
【００５２】
膜結合型タンパク質１７（ＭＡＰ−１７）は、またはＤＤ９６としても知られているが、元々は癌腫において上方制御されるものとして同定され、細胞複製および腫瘍増殖の調節において潜在的な役割を有する。また、より新しい所見によれば、低分子ＰＤＺＫ１結合タンパク質について新たな名称ＳＰＡＰとなるＰＤＺＫ１を制御することによって、肝臓におけるスカベンジャー受容体クラスＢタイプＩの表面発現において役割を果たすことが示された（ＰＤＺＫ１および血漿高密度リポタンパク質レベルの調節因子として、低分子ＰＤＺＫ１結合タンパク質、ＤＤ９６／ＭＡＰ−１７の同一性；Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３、２７８（３１）、ｐ２８５２８−３２）。
【００５３】
ＲｅｇＩＶは分泌性タンパク質であり、膵臓、肝臓および胃腸粘膜の再生、増殖および分化に機能的に関与しているＲｅｇ多重遺伝子ファミリーのメンバーである。ＲｅｇＩＶは、特に、消化管の悪性度において上方制御され、胃および胃癌腫（結腸直腸癌腫、結腸腺癌）の腸および神経内分泌分化と関連している；（ＲｅｇＩＶは、結腸腺癌における上皮細胞増殖因子受容体／Ａｋｔ／Ａｐ−１シグナル経路を活性化する；Ｂｉｓｈｎｕｐｒｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００６年、１３０（１）、ｐ１３７−４９）。
【００５４】
パンテテイナーゼ（ＥＣ３．５．１．）は遍在的な酵素であり、インビトロでパントテン酸（ビタミンＢ５）をリサイクルし、システアミン、有効な抗酸化剤を生成することが示されている。この酵素は、バニン−１遺伝子でコードされ、マウス組織で広く発現される。バニン−１は、ＧＰＩアンカーパンテテイナーゼであり、従って外酵素である。バニン／パンテテイナーゼは、恐らくは酸化的ストレスに対する応答の観点で、いくつかの免疫機能の制御に関与する可能性があることが示唆されている（Ｐｉｔａｒｉら、２０００年）。
【００５５】
転写されたｍＲＮＡの性質および量を解析するための方法は、いくつかの実験室ハンドブック（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）に記載され、当業者に周知である。これらの方法は、リボヌクレアーゼ保護、プライマー伸長、ノ・ザン・ブロッティング、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション、および慣用のまたはリアルタイムＰＣＲを含む。
【００５６】
伝統的には、生成された特定のｍＲＮＡの量、したがって遺伝子の活性化状態はノ−ザン・ブロッティングによって測定されている。試料から単離された総ＲＮＡは、アガロース・ゲル電気泳動によって分離され、対象遺伝子に特異的な相補的ＤＮＡプローブでプロービングされる。従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、解析されるべき細胞または組織から単離された総ＲＮＡは第１鎖ｃＤＮＡに逆転写され（ＲＴ−ＰＣＲ）、次にそれを鋳型として使用して、標的の特異的オリゴヌクレオチド・プライマーを用いて二本鎖のアンプリコンを増幅する。両方の技術では、検出は、蛍光色素または放射性同位体などの検出可能な標識に基づいている。また、ＤＮＡチップまたはマイクロ・アレイとして知られる最近開発された技術は、相補的な標的の特異的プライマーへの標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション、未結合ＤＮＡの洗い出し、および結合した標的ＤＮＡの定量に基づいている。ハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブおよびプライマーは、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列、またはマーカー遺伝子に対応する翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計されてもよい。発現したＲＮＡの量の変化を決定するための便利な定量的ハイブリダイゼーション法は、ＷＯ２００２／０５５７３４に記載されている。
【００５７】
好ましくは、「マーカー遺伝子発現」は、定量的リアルタイムＰＣＲとも呼ばれるリアルタイムＰＣＲを用いて定量されてもよい。この方法はポリメラーゼ連鎖反応の一般的パターンに従うが、標的ＤＮＡの増幅領域は、蛍光色素、例えば、二本鎖ＤＮＡとインタカレートするＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの蛍光色素、または相補的ＤＮＡとハイブリダイズしたときに蛍光を発する修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、各ラウンドの増幅後に定量される。しばしば、リアルタイムＰＣＲは、少量のｍＲＮＡを定量するために逆転写と組み合わせられる。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００または７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓなどのコンピュータソフトウェアによってデータを解析し、いくつかの試料間の相対的な遺伝子発現、または標準曲線に基づいたｍＲＮＡのコピー数を計算することができる。通常、相対的な定量（ＲＱ）を使用して、野生型の発現レベルと変異した対立遺伝子の発現レベルを比較し、または種々の組織における遺伝子の発現レベルを比較する。ＲＱは、基底または較正の試料（比較結果の基準として使用される試料）と同じ配列と比較した、試験試料の標的遺伝子の発現における変化を決定する。較正試料は、経時的試験における時間ゼロでの未処理の対照または試料であり得る。内因性または内部対照を用いることによって、各反応に添加されたｃＤＮＡの量の相違についてｃＤＮＡ標的の定量化を正規化することができる。典型的には、ハウスキーピング遺伝子、例えばβ−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびリボソームＲＮＡは、それらの発現レベルが比較的安定であるため、内因性対照として使用される。試料および内因性対照の反復反応は、統計的有意性を確保するために必要とされる。
【００５８】
タンパク質特異的な抗体は、好ましくは、動物で抗原タンパク質の免疫処置を行うことによって得られる抗血清から精製される。より好ましくは、タンパク質特異的な抗体は、ウサギで抗原タンパク質の免疫処置を行うことによって得られる血清から精製されるポリクローナル抗体である。
【００５９】
タンパク質を特異的に認識する抗体を合成するために、始めにタンパク質を得る。このタンパク質は、既知のアミノ酸配列を用いて合成するか、遺伝子工学手法によって組換えタンパク質型で産生させることができる。例えば、組換えタンパク質は、ＮＩＨプログラムＧｅｎＢａｎｋデータベースに記載された遺伝子の塩基配列を用いて、組換えタンパク質の形態でタンパク質を発現する発現ベクターを調製するステップ、発現ベクターでＥ．ｃｏｌｉを形質転換することによって形質転換体を得て、組換えタンパク質を生成させるステップ、および形質転換体を培養してヒト組換えタンパク質を単離／精製するステップを含む方法によって調製することができる。
【００６０】
本発明に含まれるタンパク質に対して特異的な抗体を用いた抗原−抗体結合反応によってＩＢＤ（例えば、ＵＣおよびＣＤ）を診断することは、試料中のこれらのタンパク質の発現を決定することによって行うことができる。発現レベルは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、およびポリアクリルアミドゲル上でのウェスタン・ブロッティングまたはイムノブロッティング解析、ならびに免疫組織化学的アッセイを含む、当該技術分野において知られている技術によって検出することができる。
【００６１】
試料（標本）として、組織、体液、最も好ましくは血液および排泄物が、好ましくは用いられる。
【００６２】
本発明の一実施形態は、患者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と過敏性腸症候群（ＩＢＳ）とを区別するのに使用する方法であって、少なくとも２つのマーカーの発現レベルが、前記患者から採取された試料において決定され、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質（次の表１参照）を含む群から選択される方法である。
【００６３】
【表１】
【００６４】
本発明の別の実施形態は、炎症性腸疾患が指示される場合、潰瘍性大腸炎とクローン病との区別が、前記患者から採取された試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定することによって行われ、前記マーカーは上記表１に示される群から選択される方法である。
【００６５】
さらに、本発明の実施形態によれば、疾患活性が監視され、潰瘍性大腸炎またはクローン病の活動期と非活動期との識別が、前記少なくとも１つのマーカー、すなわち遺伝子またはその断片の対応するタンパク質の発現パターンに基づいてなされる。好ましくはＳＬＣ６Ａ１４およびＧＲＯ−１が用いられ、またはその替りにもしくはそれと共にＲｅｇＩＶおよびバニン−１が用いられる。
【００６６】
上記方法では、前記試料は、好ましくは糞便試料、血液、血漿、血清および生検試料であり、最も好ましくは糞便試料または血液試料である。
【００６７】
好ましくは、ＩＢＳとＩＢＤとを識別するために、最初に糞便試料において決定が行われる。ＩＢＤが指示される場合、ＵＣとＣＤとを識別するために、更なる解析が生検試料で行われる。患者の疾患の進行または回復を監視するために、糞便試料および生検試料の両方の解析を繰り返すことができる。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、発現レベルは、前記少なくとも２つのタンパク質またはそれらの断片を同定することができる少なくとも２つの抗体を用いて、前記試料の少なくとも一部を前記少なくとも２つの抗体と接触させるステップおよび接触させた試料と抗体の反応の程度を監視するステップによって決定される。
【００６９】
本発明の実施形態によれば、接触段階および監視段階は、試料からタンパク質を抽出し、アッセイを行って、前記試料中における、列挙したタンパク質の少なくとも２つの量を決定することによって実行される。
【００７０】
好ましくは、抗原−抗体結合反応は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、ウェスタン・ブロッティング、イムノブロッティング解析、または免疫組織化学的アッセイからなる群から選択されるいずれか１つの技術によって検出される。
【００７１】
あるいは、接触段階および監視段階は、患者試料と抗体を免疫組織化学的に反応させ、試料中の反応物を検出することによって実行される。
【００７２】
本発明によれば、抗体はポリクローナルまたはモノクローナルである。
【００７３】
本発明の別の実施形態は、患者における炎症性腸疾患と過敏性腸症候群との区別における使用に適したキットであって、上記表１に示されたタンパク質を含む群から選択される少なくとも２つのタンパク質またはタンパク質断片を同定することができる少なくとも２つの抗体、および抗体と試料との反応の程度を検出するための手段を含むキットである。
【００７４】
本発明の別の実施形態は、潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別するのに適したキットであって、好ましくは、上記表１に示されたタンパク質を含む群から選択される少なくとも２つのタンパク質またはタンパク質断片を同定することができる少なくとも２つの抗体、および抗体とタンパク質との反応の程度を体液中で直接的に検出することを含み、上記抗体が固体マトリックスに結合され、さらに使用のための指示書を含むキットである。
【００７５】
本発明の実施形態にかかるキットでは、潰瘍性大腸炎またはクローン病を患っている患者が、活動型の前記疾患を患っているか、受動型の前記疾患を患っているかを決定するために、前記少なくとも２つのタンパク質の発現パターンが標準的なパターンと比較される。
【００７６】
さらに、キットは、既知量の対照として提供されるタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを含む。
【００７７】
本発明の別の実施形態によれば、キットは、競合イムノアッセイにおける使用に適しており、固相をさらに含み、タンパク質、タンパク質断片またはペプチド断片が固相に結合される。前記固相は、好ましくは１または複数のニトロセルロース、セルロース、ガラス、プラスチック、マイクロタイター・プレートおよびウェル、例えばマイクロタイター・ウェルを含む。
【００７８】
好ましい実施形態によれば、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１タンパク質に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ技術は、
１）試料と対照群でコーティングされたリアクター内に特異的抗体を入れて、抗原−抗体反応を誘導するステップ、
２）二次抗体−標識コンジュゲートおよび標識基質の発色基質溶液を用いて抗原−抗体反応生成物を検出するステップ、および
３）試料の検出結果を対照群の検出結果と比較するステップ
を通じて行われる。
【００７９】
ＥＬＩＳＡ、生物学的マイクロチップまたは自動化マイクロアレイシステムなどの既知の技術を用いて、大量の試料を解析することができる。生物学的マイクロチップは、生物学的マイクロチップ上に特異的な抗体タンパク質を固定することによって、抗体タンパク質と個体から回収した試料の反応を引き起こして、特異的な抗体タンパク質に対する抗原を検出することができる。
【００８０】
また、本発明は、選択された少なくとも２つの遺伝子と特異的に反応する抗体を用いて、これらの遺伝子の少なくとも２つの組み合わせを含む、ＵＣおよびＣＤを診断するためのキットも提供する。
【００８１】
本発明にかかる診断キットは、固相または担体、例えばウィッキング・メンブレンを含む。このようなウィッキング・メンブレンに適した材料の例には、限定されないが、ナイロン、ポリエステル、セルロース、ポリスルホン、ジフッ化ポリビニリデン、酢酸セルロース、ポリウレタン、ガラスファイバー、ニトロセルロースなどが挙げられる。また、固相は、マイクロキャリア、パーティクル、メンブレン、ストリップ、ペーパー、フィルム、パールまたはプレート、例えばマイクロタイター・プレートの形態であってもよい。
【００８２】
診断キットは、抗原−抗体結合反応によって抗体タンパク質の抗原を定量的および定性的に解析することによりＵＣおよびＣＤを診断することができる。抗原−抗体結合反応は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチ・アッセイ、ポリアクリルアミド・ゲル上のウェスタン・ブロッティング、およびイムノブロッティング解析を含む当該技術分野において一般に知られている技術によって検出することができる。例えば、診断キットは、組換えモノクローナル抗体タンパク質でコーティングされた９６ウェルマイクロタイター・プレートを用いたＥＬＩＳＡで使用されるように提供され得る。別の例は、排泄物試料または血液試料用の診断用ディップスティックの使用である。
【００８３】
本発明にかかる診断キットに含まれる対照は、正の対照および負の対照を含む。
【００８４】
種々の試料の診断に使用される抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、現在、当該技術分野において周知である方法によって作ることができる。例えば、実施例２または３の抽出物に対するポリクローナル抗体は、ウサギなどの動物を免疫化し、次に従来の慣例に従って抗体を精製することによって生成することができ、一方、前記抽出物に対するモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）の方法に従い、周知の慣例に従って、マウスなどの動物を免疫化し、その脾臓から脾臓細胞を抽出し、それらをマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作り、ハイブリドーマをスクリーニングおよびサブクローニングすることによって作ることができる。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるイムノアッセイは、ＥＬＩＳＡサンドイッチ・タイプである。より好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡサンドイッチ・イムノアッセイは、タンパク質の定量化における試料循環脂質の妨害を減少させるための膵臓性コレステロール・エステラーゼを含む特定の緩衝液（浄化緩衝液（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ））を用いた試料の前処理を伴う。別の好ましい実施形態では、イムノアッセイはウェスタン・ブロット・アッセイ（内部対照を用いることが特に好ましい）である。
【００８６】
二次抗体標識基質として、発色を誘導する既知の標識基質が、好ましくは用いられ、本発明に有用な標識基質の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、コロイド金、フルオレセイン、例えばポリＬ−リジン−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはローダミン−Ｂ−イソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、および色素が挙げられる。本発明では、例えば、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）が用いられる。
【００８７】
好ましくは、使用される色原体は発色を伴う標識基質に従って変化し、その使用可能な例には、３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）が挙げられる。
【００８８】
より好ましくは、色原体は緩衝溶液（０．１Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．５）に溶解された状態で提供される。ＴＭＢなどの色原体は、二次抗体コンジュゲートの標識基質として使用されるＨＲＰによって分解され、発色する沈殿物を生成する。発色する沈殿物の沈殿レベルは肉眼で観察され、それによってタンパク質抗原の存在を決定する。
【００８９】
好ましくは、洗浄溶液はリン酸緩衝溶液、ＮａＣｌ、およびＴｗｅｅｎ ２０を含み、より好ましくは０．０２Ｍリン酸緩衝溶液、０．１３Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む緩衝溶液である。抗原−抗体結合反応後、適量の洗浄溶液は、二次抗体と抗原−抗体コンジュゲートの反応を受けたリアクター内に供給される。洗浄溶液を用いた洗浄は、３〜６回繰り返して行われる。好ましくは、０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液はブロッキング溶液として使用され、好ましくは、２Ｎ硫酸溶液は酵素反応の停止溶液として使用される。
【００９０】
ここでは、診断キットを用いて、標本試料中のＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１抗原を検出することによって、初期段階のＵＣおよびＣＤを診断する方法が記載される。陽性および陰性対照群の抗体および標本試料はそれぞれ反応し、洗浄溶液で洗浄される。次に、基質との反応によって色を生じる標識基質で標識された二次抗体コンジュゲートを得られた生成物に添加し、洗浄溶液で再び洗浄される。その後、基質を含む溶液を得られた生成物に添加され、発色を誘導する。次に、吸光度４５０ｎｍを測定する。ここで、標準抗原溶液Ａの平均吸光度は、０．０００以上であり、０．２００以下でなければならない。標準抗原溶液Ｆの平均吸光度は、１．２００以上であり、３．０００以下でなければならない。標準抗原溶液ＡとＦの吸光度値の平均値は、カットオフ値として設定され、正または負の試料として試料を決定するために用いられる。試料の吸光度が標準抗原溶液Ｆの吸光度よりも大きい場合、試料を希釈し、次にその吸光度を再度測定する。カットオフ値を上回る吸光度を有する試料を正であるとして特定し、カットオフ値を下回る吸光度を有する試料を負であるとして特定する。
【００９１】
患者の血液または排泄物（生検）を用いた新規な免疫学的診断ツールである、本発明にかかるＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７、ＭＡＰ−１７、ＲｅｇＩＶおよびバニン−１に対するヒト特異的抗体を含むＵＣ／ＣＤ診断キットは、高い正確度と再現性を有していることが確かめられた。従来、内視鏡検査、組織学、病歴およびＰ−ＡＮＣＡ抗体の組合せがＩＢＤの診断に使用されるが、しかしながら正確性があまり高くない（Ｂｏｓｓｕｙｔ，Ｘ．、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２ ２００６）。しかしながら、本発明にかかるＵＣおよびＣＤの早期診断についての試験は、約９５〜９７％の診断正確度を示し、従来の試験よりも高い統計的有意性である。したがって、本発明にかかる診断方法およびキットは、高い正確度と再現性のために、ＵＣおよびＣＤの早期診断、ならびにＩＢＳの診断に非常に好都合に使用することができる。
【実施例】
【００９２】
ここで、本発明は、いずれにおいても本明細書に記載される特定の実施形態に範囲を限定することなしに、以下の実施例によって詳細に例証される。
［実施例１］
【００９３】
組織回収および保存
ＵＣ、ＣＤまたはＩＢＳを患っている患者、および健常なボランティアから結腸組織生検、排泄物試料および血液試料を採取した。
【００９４】
１．１ ＲＮＡ作業について：
ＵＣ、ＣＤまたはＩＢＳを患っている患者（各々、５〜１０人の患者）から排泄物試料を採取した。排泄物試料をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と１：１の比で混合し、使用するまでＲＴで維持した。
【００９５】
１．２ タンパク質作業について：
ＵＣ、ＣＤまたはＩＢＳを患っている患者から排泄物試料を採取した。使用するまで−２０℃で排泄物試料を直接凍結した。あるいは、適切な緩衝液と１：１の比で試料を混合した。
［実施例２］
【００９６】
リアルタイムＰＣＲ解析用の排泄物試料からのＲＮＡ抽出
２．１ ＲＮＡ単離：
全ての患者の排泄物試料からの総ＲＮＡは、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｍｏｔｏｒ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて、製造業者のプロトコールに従って（Ｋｉｍｂｌｅ／Ｋｏｎｔｅｓ、Ｋｉｍｂｌｅ Ｇｌａｓｓ Ｉｎｃ．）、最初に生検試料をホモジナイズすることによって単離された。ホモジネートから、総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを用いて、製造業者のガイドラインに従って（Ｑｉａｇｅｎ Ｎｏｒｄｉｃ ＡＢ）単離された。
【００９７】
２．２ ｃＤＮＡ合成：
２μｇの各ＲＮＡ試料は、１０ｐＭのオリゴ−ｄＴ−プライマーＶＮ−Ｔ２０（５’−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＮ Ｖ−３’）を用いて第１鎖のｃＤＮＡ合成に使用された。緩衝液、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、ならびに酵素の逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給され、反応は製造業者のガイドラインに従って行われた。酵素を除いた第１鎖合成の反応混合物は、ＰＣＲ機器（ＨｙｂｉｄのＰＣＲスプリント）中で１０分間、６５℃でプレインキュベートされ、氷上で冷却され、次に酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを添加し、ＰＣＲ機器中で１．５時間、４２℃でインキュベートした。
【００９８】
２．３ 排泄物試料由来のｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析：
リアルタイムＰＣＲ解析は、各排泄物試料由来の１：１０に希釈した第１鎖ｃＤＮＡ材料とＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを用いて、製造業者の推奨に従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ＰＣＲ機器で行われた。プライマーは、７つのマーカー遺伝子と内部対照を増幅するように設計され、大きさにして１０６〜１６０ｂｐの範囲の断片を得た。（４００ｂｐを超える断片は、確実なシグナルをほとんど与えない傾向にあるので、小さな断片が必要である）。リアルタイムＰＣＲ解析で使用するために提供されているソフトウェア（ＳＤＳ ４．０；相対定量アッセイ）を用いて、いわゆる「デルタＣｔ」値が、分析された各排泄物試料に対する全てのマーカーについて得られた。
【００９９】
このタイプの分析については、指示された断片サイズを与える特異的なリアルタイムＰＣＲプライマーが使用された。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
次に、各マーカーについてのデルタＣｔ値を各マーカーに対してプロットし、グラフを解析することによって発現プロフィールを決定した（結果を参照されたい）。
【０１０２】
実験に使用されたフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーを表３に示す。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
ＲＮＡデータは、ＧＲＯ−１およびＲｅｇＩＶが排泄物のＲＮＡレベルでＩＢＤとＩＢＳとを区別するための良好な組み合わせであることを示す（例えば、図５を参照されたい）。さらに、血液試料からのＲＮＡデータは、バニン−１が良好な区別の可能性を有することを示す。マーカーＳＬＣ２６Ａ２、ＭＡＰ−１７およびバニン−１が、ＲＮＡレベルで血液において十分に検出可能である。マーカーＧＲＯ−１、ＭＭＰ−７およびＲｅｇＩＶ．ＳＬＣ１４Ａ６は検出可能であったが、ＲＮＡレベルで血液において発現された場合に低レベルであった。
【０１０５】
ＭＭＰ−７、ＲｅｇＩＶおよびＧＲＯ−１が分泌性タンパク質であるという事実から、本発明者らは、タンパク質レベルでの発現が検出するにはより容易であり、これは、血液のＲＮＡデータの成績を確認するために使用され得ると結論付ける。
【０１０６】
血液のＲＮＡについて、１つのマーカー、すなわちバニン−１のみを用いたＩＢＤとＩＢＳとの区別が、すでに信頼に足るものであったことに留意すべきである。ＡＵＣは０．８６７であった。
［実施例３］
【０１０７】
タンパク質抽出
３．１ 生検試料からのタンパク質抽出
得られた固定された生検試料を遠心分離し、固定剤を除去し、ＰＢＳで洗浄しなければならない。次に、抽出緩衝液（１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８；１ｍＭのＤＴＴ；０．５ｍＭのＰＭＳＦ）を添加し、製造業者のプロトコールに従って、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて試料をホモジナイズした。その後、０．１〜０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加し、混合物を５分間４℃でインキュベートして細胞を溶解した。５分４℃の遠心分離後、上清（＝抽出物）を新しいチューブに移し、抽出物を使用するまで、−８０℃で急激に凍結した後に保存した。
【０１０８】
３．２ 排泄物試料からのタンパク質抽出
抽出緩衝液（１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８；１ｍＭのＤＴＴ；０．５ｍＭのＰＭＳＦ）およびガラスビーズを排泄物試料に添加し、完全にボルテックスした。その後、０．１〜０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加し、５分間４℃でインキュベートして細胞を溶解した。５分間、４℃の遠心分離後、上清（＝抽出物）を新しいチューブに移し、抽出物を使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０９】
３．３ 血液からのタンパク質抽出
凍結された血清に同量の２×抽出緩衝液（２００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８；２ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＰＭＳＦ）＋０．２〜０．４のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を添加し、混合物を５分間４℃でインキュベートして細胞を溶解した。５分間、４℃の遠心分離後、上清（＝抽出物）を新しいチューブに移し、抽出物を急激に凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１１０】
血液または血清からタンパク質を抽出する代わりに、血清を直接用いて、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングすることができる。
［実施例４］
【０１１１】
ポリクローナル抗体を用いた標本試料のウェスタン・ブロット解析
各々の患者および標本試料について、タンパク質抽出物（１０μｇの総タンパク質／レーンに標準化される）を、１２または１５％の変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって８回分離し、電気ブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたセミドライ・ブロッティングによってポリジフッ化ビニリデンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ；０．８ｍＡ／ｃｍ↑２、６０分間；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移された。次に、プロットＩＤ１〜７のタンパク質およびベータ−チューブリンに対する特異的抗体との反応のために、メンブレンを８片に切った。抗体をブロッティング緩衝液に希釈した。その後、メンブレンを洗浄し、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ検出試薬とともにインキュベートし、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ともにＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に曝した。ＲｅｇＩＶおよびＭＭＰ−７に対して指向された一次抗体はＡｂｃａｍから入手され、ＧＲＯ−１はＲＤＳから得られ、ならびにＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ２６Ａ２、ＭＡＰ−１７およびバニン−１は商業的供給者によって合成された。タンパク質含有量は、アルファ−チューブリンに対する抗体を用いた並行ハイブリダイゼーションによって正規化された。全てのウェスタン・ブロットは、時間の長さを変えてフィルムに曝され、亜飽和レベルの強度を生じるフィルムだけが濃度的および統計的評価のために選択された。直線性は、様々な量の材料および複数回のフィルム露光を用いることによって独立した実験において確認された（データは示さず）。
【０１１２】
また、正の対照として、プロットＩＤ１〜７の組換えタンパク質（抗体として同じ供給源から入手される）を同じ方法で解析した。
［実施例５］
【０１１３】
マーカータンパク質に対して生じさせたポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ解析
第一に、ウェルを試料でコーティングした。第二に、７つのタンパク質であるプロットＩＤ ＮＯ１〜７に対する特異的なポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡプレートウェルをコーティングした。第三のステップは、試料における特異的な抗原−抗体結合の存在の検出であった。
【０１１４】
５．１ 試料によるウェルのコーティング
結腸生検、排泄物試料および血液試料から得たタンパク質抽出物を標本試料として用いた。カットオフ値を測定するための標準曲線を得るために、標準抗原溶液１〜７を、それぞれ、０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、３２０ｎｇ／ｍｌおよび６４０ｎｇ／ｍｌの種々の濃度の希釈物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧを用いて調製した。
【０１１５】
１００μｌの各標本タンパク質試料をそれぞれの９６ウェルＥＬＩＳＡ平底プレートに分配し、３７℃で４時間反応させ、洗浄緩衝溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４を含むＰＢＳ）で４回洗浄した。ここで、上記で調製された標準抗原溶液を正の対照群として使用し、正常なウサギ血清を負の対照群として使用した。
【０１１６】
５．２ ポリクローナル抗体の添加
標本試料でコーティングされた各ウェルにプロットＩＤ１〜７のタンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体を入れ、蓋で覆い、４℃で１６〜１８時間放置した。ポリクローナル抗体は、５μｇ／ｍｌの濃度で０．５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈させ、希釈された溶液の１００μｌを各ウェルに添加した。対照群として、上記タンパク質に影響されない正常なウサギ血清を炭酸塩緩衝溶液で５００倍に希釈し、各ウェルに分配した（１００ｐｌ／ウェル）。
【０１１７】
次に、プレートのウェルを洗浄緩衝溶液で４回洗浄した。非特異的なタンパク質結合部位をブロックするために、ブロッキング溶液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４））を各ウェル（３００ｐｌ／ウェル）に分配し、３７℃で２時間放置した。
【０１１８】
５．３ 抗原−抗体複合体の検出
１０，０００倍希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体の１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間放置し、洗浄緩衝溶液で４回洗浄した。その後、基質として１ｍｇの３．３’，５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を１０ｍｌのクエン酸塩緩衝溶液（ｐＨ５．０）に溶解し、２μｌの３５％過酸化水素をそれに添加し、それにより基質溶液を調製した。１００μｌの調製された基質溶液を各ウェルに分配し、光に曝さずに室温で１５分間反応させた。その後、５０μｌの２ＮのＨ２ＳＯ４溶液を添加し、反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１９】
プロットＩＤ１〜７のタンパク質のうちの１つを用いて試験された各標本試料について、抗原による吸光度は、試料の吸光度から、正の対照群としてのタンパク質のみ、および負の対照群としてのＰＢＳでコーティングしたウェルの吸光度を差し引くことによって得られる残り物として推定された。同じようにして、標準溶液の吸光度値を計算した後、各タンパク質についての標準抗原溶液Ａ〜Ｆの吸光度値の平均値をカットオフ値として設定した。カットオフ値を上回る吸光度を有する試料を正として同定し、カットオフ値を下回る吸光度を有する試料を負として同定した。
【０１２０】
カットオフ値に基づいて、それぞれの試料の吸光度値は、それらが正であるかまたは負であるかを決定するために比較された。
【０１２１】
本発明は、本発明者らに現在知られている最良の態様を構成する好ましい実施形態に関して記載されるが、当業者に明確となるであろう様々な変更および修飾は、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載される発明の範囲から逸脱せずに行うことができることは理解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と過敏性腸症候群（ＩＢＳ）とを区別するのに使用する方法であって、少なくとも２つのマーカーの発現レベルが、前記患者から採取された試料において決定され、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表１】
を含む群から選択される方法。
【請求項２】
前記試料が、糞便試料、血液、血漿、血清および生検試料のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が糞便試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が血液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも２つのマーカーの少なくとも１つがバニン−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と過敏性腸症候群（ＩＢＳ）とを区別するのに使用する方法であって、ＩＢＤが指示される場合、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）との区別が、前記患者から採取した試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定することにより行われ、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表２】
を含む群から選択される方法。
【請求項７】
前記少なくとも２つのマーカーの発現パターンに基づいて、潰瘍性大腸炎またはクローン病の活動期と非活動期との識別がなされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、糞便試料、血液、血漿、血清および生検試料のうちの１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が糞便試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子の前記発現パターンがＰＣＲを用いて決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現レベルが、前記少なくとも２つのタンパク質またはそれらの断片を同定することができる少なくとも２つの抗体を用いて、前記試料の少なくとも一部を前記少なくとも２つの抗体と接触させるステップおよび前記接触させた試料と前記抗体の反応の程度を監視するステップによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触ステップおよび監視ステップが、前記試料からタンパク質を抽出し、アッセイを行って、前記試料中における、列挙した前記タンパク質のうちの少なくとも２つの量を決定することによって実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原−抗体の結合反応が、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、ウェスタン・ブロッティング、イムノブロッティング解析または免疫組織化学法からなる群から選択されるいずれか１つの技術によって検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現レベルが、前記少なくとも２つのタンパク質またはそれらの断片を同定することができる少なくとも２つの抗体を用いて、前記試料の少なくとも一部を前記少なくとも２つの抗体と接触させるステップおよび前記接触させた試料と前記抗体の反応の程度を監視するステップによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触ステップおよび監視ステップが、前記試料からタンパク質を抽出し、アッセイを行って、前記試料中における、列挙した前記タンパク質のうちの少なくとも２つの量を決定することによって実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原−抗体の結合反応が、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、ウェスタン・ブロッティング、イムノブロッティング解析または免疫組織化学法からなる群から選択されるいずれか１つの技術によって検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触ステップおよび監視ステップが、前記患者試料と前記抗体を免疫組織化学的に反応させ、その後、前記試料中の反応物を検出することによって実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
炎症性腸疾患の治療に対する患者の応答を監視する方法であって、前記患者から採取した試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表３】
を含む群から選択される方法。
【請求項２０】
試料が前記治療の過程中に採取され、前記発現パターンが比較される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性腸疾患の重度を決定する方法であって、前記患者から採取した試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表４】
を含む群から選択される方法。
【請求項２２】
下記のタンパク質：
【表５】
を含む群から選択される少なくとも２つのタンパク質またはタンパク質断片を同定することができる少なくとも２つの抗体、および前記抗体と試料との反応の程度を検出するための手段を含むキット。
【請求項２３】
患者における炎症性腸疾患と過敏性腸症候群とを区別するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
患者における潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
潰瘍性大腸炎またはクローン病を患っている患者が、活動型の前記疾患を患っているか、受動型の前記疾患を患っているかを決定するために、前記少なくとも２つのタンパク質の発現パターンが標準パターンと比較される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
タンパク質、タンパク質断片、またはペプチドが、既知量の対照として提供される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
疾患の重度を決定するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２８】
治療に対する患者の応答を決定するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２９】
前記キットが競合イムノアッセイの使用に適合され、さらに固相を含み、前記タンパク質、タンパク質断片またはペプチド断片が前記固相に結合される、請求項２２に記載のキット。
【請求項３０】
キットが競合イムノアッセイの使用に適合され、さらに固相を含み、前記タンパク質、タンパク質断片またはペプチド断片が前記固相に結合され、前記固体マトリックスがニトロセルロース、セルロース、ガラス、プラスチック、マイクロタイター・プレートおよびウェルの中から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項１】
患者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と過敏性腸症候群（ＩＢＳ）とを区別するのに使用する方法であって、少なくとも２つのマーカーの発現レベルが、前記患者から採取された試料において決定され、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表１】
を含む群から選択される方法。
【請求項２】
前記試料が、糞便試料、血液、血漿、血清および生検試料のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が糞便試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が血液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも２つのマーカーの少なくとも１つがバニン−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と過敏性腸症候群（ＩＢＳ）とを区別するのに使用する方法であって、ＩＢＤが指示される場合、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とクローン病（ＣＤ）との区別が、前記患者から採取した試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定することにより行われ、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表２】
を含む群から選択される方法。
【請求項７】
前記少なくとも２つのマーカーの発現パターンに基づいて、潰瘍性大腸炎またはクローン病の活動期と非活動期との識別がなされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、糞便試料、血液、血漿、血清および生検試料のうちの１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が糞便試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液試料である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのマーカー遺伝子の前記発現パターンがＰＣＲを用いて決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現レベルが、前記少なくとも２つのタンパク質またはそれらの断片を同定することができる少なくとも２つの抗体を用いて、前記試料の少なくとも一部を前記少なくとも２つの抗体と接触させるステップおよび前記接触させた試料と前記抗体の反応の程度を監視するステップによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触ステップおよび監視ステップが、前記試料からタンパク質を抽出し、アッセイを行って、前記試料中における、列挙した前記タンパク質のうちの少なくとも２つの量を決定することによって実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原−抗体の結合反応が、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、ウェスタン・ブロッティング、イムノブロッティング解析または免疫組織化学法からなる群から選択されるいずれか１つの技術によって検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現レベルが、前記少なくとも２つのタンパク質またはそれらの断片を同定することができる少なくとも２つの抗体を用いて、前記試料の少なくとも一部を前記少なくとも２つの抗体と接触させるステップおよび前記接触させた試料と前記抗体の反応の程度を監視するステップによって決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触ステップおよび監視ステップが、前記試料からタンパク質を抽出し、アッセイを行って、前記試料中における、列挙した前記タンパク質のうちの少なくとも２つの量を決定することによって実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原−抗体の結合反応が、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ・アッセイ、ウェスタン・ブロッティング、イムノブロッティング解析または免疫組織化学法からなる群から選択されるいずれか１つの技術によって検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触ステップおよび監視ステップが、前記患者試料と前記抗体を免疫組織化学的に反応させ、その後、前記試料中の反応物を検出することによって実行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
炎症性腸疾患の治療に対する患者の応答を監視する方法であって、前記患者から採取した試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表３】
を含む群から選択される方法。
【請求項２０】
試料が前記治療の過程中に採取され、前記発現パターンが比較される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症性腸疾患の重度を決定する方法であって、前記患者から採取した試料中の少なくとも２つのマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記マーカーが下記の遺伝子およびそれらの対応するタンパク質：
【表４】
を含む群から選択される方法。
【請求項２２】
下記のタンパク質：
【表５】
を含む群から選択される少なくとも２つのタンパク質またはタンパク質断片を同定することができる少なくとも２つの抗体、および前記抗体と試料との反応の程度を検出するための手段を含むキット。
【請求項２３】
患者における炎症性腸疾患と過敏性腸症候群とを区別するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
患者における潰瘍性大腸炎とクローン病とを区別するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
潰瘍性大腸炎またはクローン病を患っている患者が、活動型の前記疾患を患っているか、受動型の前記疾患を患っているかを決定するために、前記少なくとも２つのタンパク質の発現パターンが標準パターンと比較される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
タンパク質、タンパク質断片、またはペプチドが、既知量の対照として提供される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
疾患の重度を決定するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２８】
治療に対する患者の応答を決定するために前記キットを用いるための使用説明書を含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２９】
前記キットが競合イムノアッセイの使用に適合され、さらに固相を含み、前記タンパク質、タンパク質断片またはペプチド断片が前記固相に結合される、請求項２２に記載のキット。
【請求項３０】
キットが競合イムノアッセイの使用に適合され、さらに固相を含み、前記タンパク質、タンパク質断片またはペプチド断片が前記固相に結合され、前記固体マトリックスがニトロセルロース、セルロース、ガラス、プラスチック、マイクロタイター・プレートおよびウェルの中から選択される、請求項２２に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５０７５０９（Ｐ２０１１−５０７５０９Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９３５３（Ｐ２０１０−５３９３５３）
【出願日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５１０５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８２２９８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５１０１７３３１７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５１０５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８２２９８
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５１０１７３３１７）
【Ｆターム（参考）】
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