IL−2レセプターのp55Tacタンパク質に特異的なキメラ免疫グロブリン
【課題】ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、さらに治療製剤および他の用途に適当である形態において容易に且つ経済的に生産される改良形のヒト化免疫グロブリン、およびそれを用いる治療用医薬組成物を提供すること。
【解決手段】少なくとも108M−1の親和性で抗原に結合可能であり、かつヒト受容体免疫グロブリン軽鎖および重鎖由来のフレームワーク領域、および供与体グロブリン由来のKabatらにより定義される相補性決定領域(CDR)を有するヒト化免疫グロブリンの生産方法に関する。この方法は、受容体免疫グロブリンの少なくとも1つの非CDRフレームワークアミノ酸を供与体免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸と置換する工程を包含し、この置換は所定の位置で行われる。
【解決手段】少なくとも108M−1の親和性で抗原に結合可能であり、かつヒト受容体免疫グロブリン軽鎖および重鎖由来のフレームワーク領域、および供与体グロブリン由来のKabatらにより定義される相補性決定領域(CDR)を有するヒト化免疫グロブリンの生産方法に関する。この方法は、受容体免疫グロブリンの少なくとも1つの非CDRフレームワークアミノ酸を供与体免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸と置換する工程を包含し、この置換は所定の位置で行われる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般に、新規治療薬を開発するための組換えDNA技術とモノクローナル抗体技術の組合せに関し、更に詳しくは、非免疫原性抗体の製造およびそれらの利用に関する。
【背景技術】
【0002】
哺乳類では、外来物質、即ち抗原、と特異的に相互作用する2つのタイプの細胞によって免疫応答が媒介される。それらの細胞タイプの1つであるB細胞は、抗体の生産を担う。第二の細胞クラスであるT細胞は、B細胞とT細胞を含む広範な他の造血細胞の両者の生体内機能を調節する様々な細胞サブセットを包含する。
【0003】
T細胞がこの調節に力を及ぼす1つの方法は、最初はT細胞増殖因子と命名されたインターロイキン−2(IL−2)として知られるリンホカインの生産を通してである。IL−2の主な機能はT細胞の刺激と維持であると思われる。実際、或る免疫学者はIL−2が全免疫応答の中心にあるだろうと考えている〔Farrar, J.ら、Immunol.Rev. 63:129−166(1982)参照、これは参考として本明細書に組み込まれる〕。
【0004】
その生物学的作用を及ぼすために、IL−2は特異的な高親和性膜レセプターと相互作用する〔Greene,W.、ら、Progress inHematology XIV, E.Brown編、Grune and Statton, New York (1986)、283〜頁〕。ヒトIL−2レセプターは複雑な多重鎖の糖タンパク質であり、1本の鎖はTacペプチドとして知られ約55kDのサイズである〔Leonard,W.ら、J.Biol.Chem. 260:1872(1985)参照、これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。このタンパク質をコードする遺伝子が単離されており、そして21アミノ酸のシグナルペプチドを含む272アミノ酸のペプチドを推定している〔Leonard, W.ら、Nature 311:626(1984)参照〕。p55
Tacタンパク質のN−末端の219アミノ酸は明らかに細胞外領域を含んで成る〔Leonard, W.ら、Science 230:633−639(1984)参照、これは参考として本明細書に組み込まれる〕。
【0005】
ヒトIL−2レセプターの構造と機能の解明のほとんどは、特異的反応性モノクローナル抗体の開発のためである。特に、抗−Tacとして知られるマウスモノクローナル抗体〔Uchiyamaら、J.Immunol.,126:1393(1981)〕は、IL−2レセプターがT細胞上だけでなく、単球−マクロファージ群、肝臓のクッパー細胞、皮膚のランゲルハンス細胞およびもちろん活性化されたT細胞上でも検出され得ることを示した。重要なことには、静止T細胞、B細胞または循環しているマクロファージは、典型的にはIL−2レセプターを提示しない〔Herrmannら、J.Exp.Med.162:1111(1985)〕。
【0006】
抗−Tacモノクローナル抗体は、IL−2相互作用を必要とするリンパ球機能を明らかにするためにも用いられており、そして細胞培養における細胞毒性およびサプレッサーTリンパ球の発生を含む様々なT細胞機能を抑制することが示されている。また、抗−Tacおよび他の抗体を用いた研究に基づき、様々な障害、特に成人T細胞白血病がT細胞による不適当なIL−2レセプター発現に関係づけられている。
【0007】
より最近になって、IL−2レセプターはT細胞介在性疾患に対する新規治療アプローチの理想的な標的であることが示された。IL−2レセプター特異的抗体、例えば抗−Tacモノクローナル抗体を単独でまたは免疫複合体(例えばリシンA鎖、同位体等との免疫複合体)として用いて、IL−2レセプターを有する細胞を効果的に除去できることが提唱されている。例えばそれらの薬剤は、理論上はIL−2レセプターを発現している白血病細胞、或る種のB細胞、または病気状態に関与する活性化されたT細胞を排除することができ、その上さらに必要とされる時には成熟正常T細胞およびそれらの前駆体の保持によって正常T細胞免疫応答を開始する能力を保証する。一般に、他のT細胞特異的薬剤の多くは本質的に全ての周辺のT細胞を破壊し得、このことは薬剤の治療効能を制限する。全体に、IL−2レセプターに特異的な適当なモノクローナル抗体の使用は、自己免疫疾患、器官移植および活性化されたT細胞による任意の望ましくない応答において療法的効用を有することができる。実際、例えば抗−Tac抗体を使って臨床試験が開始されている〔一般に、Waldman,T.ら、CancerRes. 45:625(1985)およびWaldman,T.,Science 232:727−732(1986)を参照のこと;これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0008】
不運にも、抗−Tacおよび他の非ヒトモノクローナル抗体の使用は、特に下記に説明されるような繰り返し治療摂生において、幾つかの欠点を有する。例えば、マウスモノクローナル抗体はヒト補体を十分に結合せず、そしてヒトにおいて使用すると他の重要な免疫グロブリン機能特性を欠く。
【0009】
おそらくより重要なのは、抗−Tacおよび他の非ヒトモノクローナル抗体が、ヒト患者に注入すると免疫原性となるであろう実質的長さのアミノ酸配列を含むことである。外来抗体の注入後、抗体に対して患者により惹起された免疫応答が非常に強力であり、最初の処置後の抗体の治療効用を本質的に排除しうることを多数の研究が示している。更に、様々な病気を処置するために増加する数の異なるマウスまたは他の抗原性(ヒトに対して)モノクローナル抗体が開発されることが期待され得るので、任意の異なる非ヒトモノクローナル抗体での第一または第二の処置後、無関係の治療のためでさえもその後の処置が無効または危険になり得る。
【0010】
いわゆる「キメラ抗体」(例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス可変領域)は幾らか好結果であることが判明したが、重要な免疫原性の問題が残っている。一般に、多数のヒト抗原と同じく、ヒトIL−2レセプターと反応するヒト免疫グロブリンの生産は、典型的なヒトモノクローナル抗体生産技術を使うことは非常に困難である。同様に、いわゆる「ヒト化された」抗体(例えばEPO公報No.0239400を参照のこと)を作製するために組換えDNA技術を使用することは、一部は予想不可能な結合親和性のためである不確かな結果を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
従って、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、さらに治療製剤および他の用途に適当である形態において容易に且つ経済的に生産される改良形のヒト化免疫グロブリン、例えばヒトIL−2レセプターに特異的なもの、に対する要求が存在する。本発明はそれらおよび他の要求を満たす。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、例えばT細胞により媒介されるヒト障害の処置において有用である新規組成物を提供し、該組成物は、IL−2レセプターへのヒトIL−2の結合を特異的に阻止することができそして/またはヒトIL−2レセプター上のp55 Tacタンパク質に結合することができるヒト化免疫グロブリンを含有する。該免疫グロブリンは、2対の軽鎖/重鎖複合体を有し、典型的には少なくとも1対がヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結されたマウス相補性決定領域を含んで成る鎖を有する。例えば、追加の天然由来のマウスアミノ酸残基を有するかまたは有しないマウス相補性決定領域を用いて、約108M−1よりも強力な親和力レベルにおいてヒトIL−2レセプターに結合することができるヒト化抗体を生産することができる。
【0013】
結合性断片または他の誘導体を包含する免疫グロブリンは、様々な組換えDNA技術により、トランスフェクトされた細胞、好ましくは不死化された真核細胞、例えばミエローマまたはハイブリドーマ細胞中での最大発現を使って生産することができる。ヒト様免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第一の配列と所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第二の配列を含んで成るポリヌクレオチドは、合成的にまたは適当なcDNAとゲノムDNAセグメントを結合することによって作製することができる。
【0014】
ヒト化免疫グロブリンは、実質的に純粋な形態で単独に、または細胞毒性物質、例えば放射性核種、リボソーム阻害タンパク質もしくは細胞表面において活性な細胞毒性物質と複合体化して、使用することができる。それらの化合物は全て、特にT細胞により媒介される障害を処置することにおいて有用であろう。ヒト化免疫グロブリンまたはそれらの複合体は、投与の形式に依存するであろう医薬上許容される剤形において調製することができる。
【0015】
本発明は、供与体免疫グロブリンからの1または複数の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリン鎖を設計するための新規方法も提供する。好ましい方法は、供与体免疫グロブリンのフレームワークまたは可変領域のアミノ酸配列をヒト免疫グロブリン鎖のコレクション中の対応する配列と比較し、そして該コレクションからより相同性の高い配列の1つをヒト免疫グロブリンとして選択することを含んで成る。ヒト免疫グロブリンまたは受容体免疫グロブリン配列は、典型的には少なくとも10〜20の免疫グロブリン鎖配列のコレクションから選択され、そして通常は該コレクション中のいずれかの配列の供与体免疫グロブリン配列に最も高い相同性を有するだろう。ヒト免疫グロブリンフレームワーク配列は、供与体免疫グロブリンフレームワーク配列に対して典型的には約65〜70%またはそれ以上の相同性を有するだろう。供与体免疫グロブリンは重鎖または軽鎖(または両方)のいずれであってもよく、そしてヒトコレクションは同じ種類の鎖を含有するだろう。ヒト化された軽鎖または重鎖を用いて、部分または全長のヒト定常領域および別のタンパク質を含むかまたは含まない、2対の軽鎖/重鎖を有する完全なヒト化免疫グロブリンまたは抗体を形成せしめることができる。
【0016】
本発明の別の態様によれば、上記の比較段階と共にまたは別々に、受容体免疫グロブリン中の追加のアミノ酸をCDR−供与体免疫グロブリン鎖からのアミノ酸と置き換えることができる。更に特定的には、供与体免疫グロブリンからのフレームワークアミノ酸による受容体免疫グロブリンのヒトフレームワークアミノ酸の更なる任意の置換は、次のような免疫グロブリン中の位置において行うことができる:
(a)受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がその位置に稀であり、そして供与体免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン中のその位置に普通である;
(b)該アミノ酸がCDRの1つのすぐ近くである;または
(C)該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約3Å以内にあり、そしてヒト化免疫グロブリンのCDRまたは抗原と相互作用することができると予想される。
【0017】
ヒト化免疫グロブリン鎖は、典型的には、CDRに加えて供与体免疫グロブリンからの少なくとも約3アミノ酸を含んで成り、通常は少なくともその1つが供与体免疫グロブリン中のCDRのすぐ近くであろう。3つの位置基準のうちのいずれか1つまたは全部を使うことにより重鎖および軽鎖を各々設計することができる。
【0018】
完全な抗体に結合される時、本発明のヒト化された軽鎖および重鎖はヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、そして供与体免疫グロブリンと実質的に同じ抗原(例えばエピトープを含むタンパク質または他の化合物)への親和力を保持しているだろう。それらの親和力レベルは約108M−1以上から様々に異なることができ、そして抗原への供与体免疫グロブリンのもとの親和力の約4倍以内であろう。
【0019】
本願発明は、少なくとも108M−1の親和性で抗原に結合可能であり、かつヒト受容体免疫グロブリン軽鎖および重鎖由来のフレームワーク領域、および供与体グロブリン由来のKabatら(”Sequences ofProteins of Immunological Interest”, Kabat,E.ら、U.S.Department of Health andHuman Services,(1983))により定義される相補性決定領域(CDR)を有するヒト化免疫グロブリンの生産方法に関する。この方法は、受容体免疫グロブリンの少なくとも1つの非CDRフレームワークアミノ酸を供与体免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸と置換する工程を包含する。この置換は以下の位置で行われる:
(a)受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置においてまれであり、そして供与体免疫グロブリンの対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン配列中のその位置において普通である、位置;または
(b)上記アミノ酸がヒト化免疫グロブリンの配列におけるCDRの1つの隣りである、位置;または
(c)上記アミノ酸が、ヒト化免疫グロブリンのCDRと相互作用し得る側鎖原子を有する、位置。
【0020】
ある実施態様では、上記置換は、重鎖の非CDR可変領域において行われる。
【0021】
ある実施態様では、上記抗原に対する上記ヒト化免疫グロブリンの親和性は、上記供与体免疫グロブリンの親和性の4倍以内である。
【0022】
本願発明はまた、上記の方法により得られるヒト化免疫グロブリンに関する。
【0023】
本願発明は、ヒト受容体免疫グロブリン由来の非CDRフレームワーク領域をコードする第1配列、および1つ以上のCDRをコードする第2配列を含むポリヌクレオチドに関する。上記ポリヌクレオチドは、上記免疫グロブリンに含まれる免疫グロブリン鎖をコードする。
【0024】
本願発明は、上記の単数ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた細胞株に関する。
【0025】
本願発明は、上記ヒト化免疫グロブリンの調製方法に関する。上記方法は、上記細胞株を培養する工程およびこの細胞培養培地からヒト化免疫グロブリンを単離する工程を包含する。
【0026】
本願発明は、T細胞媒介障害の治療のための医薬組成物に関する。この医薬組成物は、医薬上許容される剤形で処方された上記ヒト化免疫グロブリンまたはそれらの結合性断片を含有する。
【発明の効果】
【0027】
本願発明により、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、さらに治療製剤および他の用途に適当である形態において容易に且つ経済的に生産される改良形のヒト化免疫グロブリンが得られ、さらにそれを用いる治療用医薬組成物が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0028】
本発明の一態様によれば、所望のエピトープ、例えばヒトT細胞上のIL−2レセプター上のエピトープ、と特異的に反応するヒト化免疫グロブリンが提供される。それらの免疫グロブリンは、少なくとも約108M−1、好ましくは109M−1〜1010M−1またはそれ以上の結合親和力を有し、例えばヒトIL−2レセプターへのIL−2の結合を阻止することができる。ヒト化免疫グロブリンは、ヒト様フレームワークを有し、そしてp55 Tacタンパク質上のエピトープと特異的に反応する免疫グロブリン、典型的にはマウス免疫グロブリンからの相補性決定領域(CDR)を有することができる。本発明の免疫グロブリンは、経済的に大量に生産することができ、例えば、種々の技術によるヒト患者におけるT細胞介在性障害の処置において、用途を見出す。
【0029】
基本的な抗体構造単位は4量体を含むことが知られている。各4量体は全く同じ2対のポリペプチド鎖から成り、各対は1本の「軽」(約25kD)鎖と1本の「重」(約50−70kD)鎖を有する。各鎖のNH2−末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域で始まる。各鎖のCOOH−末端は、主にエフェクター機能を担う定常領域を限定する。
【0030】
軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α,δまたはεとして分類(および細分類)され、そしてそれぞれ IgG,IgM,IgA,IgDおよびIgE として抗体のイソタイプを限定する。軽鎖および重鎖中の可変および定常領域は、約12またはそれより多数のアミノ酸の“J”領域により連結され、重鎖は約12またはそれより多数のアミノ酸の“D”領域も含む〔一般に、Fundamental Immunology, Paul, W.編、第7章、第131−166頁、RavenPress, N.Y.(1984)を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0031】
各軽鎖/重鎖対の可変領域は抗原結合部位を形成する。鎖は全て、3つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域という同じ一般構造を示す〔“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”, Kabat,E..ら、U.S.Department of Health and Human Services, (1983);並びにChothiaおよびLesk, J.Mol.Biol., 196:901−917(1987)を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。KabatらおよびChothiaらにより定義されるこれらのCDRの位置は、例えばKabatらにより提供されるような、免疫グロブリン配列についての一貫した番号付けスキームを用いれば、同一の番号によって定義され得る。従って、当業者は、個々の免疫グロブリンのCDRの位置を容易に特定することができる。各対の二本鎖からのCDRは、フレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープヘの結合を可能にする。
【0032】
本明細書中で使用する「免疫グロブリン」なる用語は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる1または複数のポリペプチドから成るタンパク質について呼称する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ,λ,α,γ,δ,εおよびμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。免疫グロブリンは抗体の他に様々な形態で存在することができ、例えば、Fv,FabおよびF(ab)2並びに一本鎖を包含する〔例えば、Hustonら、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A., 85:5879−5883(1988)およびBirdら、Science,242:423−426(1988)。これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。〔一般に、Hoodら、“Immunology”,Benjamin, N.Y.,第2版(1984);並びにHunkapillerおよびHood,Nature,323:15−16(1986)を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0033】
キメラ抗体は、典型的には遺伝子操作によって軽鎖および重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから作製されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変(V)セグメントをヒト定常(C)セグメント、例えばγ1およびγ3に結合することができる。典型的な療法用キメラ抗体はマウス抗体からのVまたは抗原結合領域とヒト抗体からのCまたはエフェクター領域とから成るハイブリッドタンパク質である(例えば、A.T.C.C.登録番号CRL 9688は抗−Tacキメラ抗体を分泌する)が、他の哺乳動物種を使用することもできる。
【0034】
本明細書中で使用する「フレームワーク領域」なる用語は、Kabatら、前掲により定義されたように、単一種において異なる免疫グロブリン間で比較的保存される免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分について呼称する。本明細書中で使用する「ヒト様フレームワーク領域」なる用語は、各々存在する鎖においてヒト免疫グロブリン中のものと等しい少なくとも約70またはそれ以上のアミノ酸残基、典型的には75〜85またはそれ以上のアミノ酸残基を含んで成るフレームワーク領域である。
【0035】
本明細書中で使用する「ヒト化免疫グロブリン」なる用語は、ヒト様フレームワーク領域を含んで成る免疫グロブリンについて言及し、この場合、存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に相同であり、即ち少なくとも約85〜90%、好ましくは約95%が同一である。よって、おそらくCDRを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分が、1または複数の生来のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に相同である。例えば、ヒト化免疫グロブリンはマウス可変領域/ヒト定常領域キメラ抗体を包含しないだろう。
【0036】
本発明の別の一般的観点によれば、ヒト化された免疫グロブリン鎖を含んで成る抗体の親和力を増加させるために、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の限定された数のアミノ酸が受容体Igよりもむしろ供与体Ig中のそれらの位置のアミノ酸と同じであるように選択される基準も含まれる。
【0037】
本発明のこの観点は、(例としてCDRの入手源としてマウス抗体を使って)ヒト化抗体を生産する従来方法における親和力の低下の2つの原因が、下記のためであるというモデルに基づく:
(1)マウスCDRをヒトフレームワークと結合する時、CDRに密接したフレームワーク中のアミノ酸がマウスの代わりにヒトになる。理論に結び付けようとせずに、本発明者らは、それらの変更されたアミノ酸が供与体マウス抗体中とは異なる静電的または疎水的力を生じるため、それらがわずかにCDRを歪め、そして歪められたCDRは供与抗体中のCDRが行うのと同じくらい効果的な抗原との接触を行うことができないと考える;
(2)また、CDRに密接しているがその一部ではない(即ちまだフレームワークの一部である)元のマウス抗体中のアミノ酸は、親和力の原因である抗原との接触を行うことができる。全てのフレームワークアミノ酸がヒトにされるので、抗体がヒト化される時にそれらのアミノ酸は失われる。
【0038】
それらの問題を回避するため、および所望の抗原に対し非常に強力な親和力を有するヒト化抗体を生産するために、本発明はヒト化免疫グロブリンを設計するのに次の4つの基準を使用する。それらの基準を単独でまたは必要な時は組み合わせて使用し、所望の親和力または他の特徴を獲得することができる。
【0039】
基準I:受容体として、ヒト化しようとする供与体免疫グロブリンに非常に相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用するか、または多数のヒト抗体からの共通のフレームワークを使用すること。ここで、用語「多数の」とは、「少なくとも約10〜20の」を意味する。例えば、データバンク(例えばNational Biomedical Research FoundationProtein Identification Resource)中のヒト重鎖(軽鎖)可変領域に対するマウス重鎖(軽鎖)可変領域の配列の比較は、異なるヒト領域に対する相同性の程度が典型的には約40%から約60−70%まで大幅に異なることを示す。受容体免疫グロブリンとして、供与体免疫グロブリンの重鎖(それぞれ軽鎖)に最も相同であるヒト重鎖(それぞれ軽鎖)の1つを選択することにより、供与体免疫グロブリンから受容体免疫グロブリンに移る際にほとんどアミノ酸が変化しないであろう。よって、ヒト化免疫グロブリン鎖を含んで成るヒト化抗体の正確な全形状が供与抗体の形状と非常によく似ており、CDRを歪める見込みを減らすことができる。
【0040】
典型的には、重鎖フレームワークを提供するために、少なくとも約10〜20の別個のヒト重鎖の代表的コレクションの中の3〜5の最も相同な重鎖可変領域配列のうちの1つが受容体として選択され、軽鎖についても同様にして選択されるだろう。好ましくは、1〜3の最も相同な領域のうちの1つが使用されるだろう。選択された受容体免疫グロブリン鎖は、供与体免疫グロブリンに対してフレームワーク領域内が最も好ましくは少なくとも約65%の相同性を有するだろう。
【0041】
いかにして受容体免疫グロブリンを選択するかにかかわらず、受容体よりもむしろ供与体中のそれらの位置のアミノ酸と同じになるようにヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の少数のアミノ酸を選択することによって、より高い親和力を獲得することができる。好ましくは、それらの基準の1つを満足するほとんどまたは全てのアミノ酸位置において、供与体アミノ酸が実際に選択されるだろう。
【0042】
基準II:ヒト受容体免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が、普通でない〔即ち「まれである」;本明細書中で使用されるこの用語「まれである」とは、代表的なデータバンク中のヒト重鎖(それぞれ軽鎖)V領域配列の10%以下しかその位置に存在しないアミノ酸を示す〕場合、またはその位置の供与体アミノ酸がヒト配列に典型的である〔即ち「普通である」;本明細書中で使用されるこの用語「普通である」とは、代表的なデータバンク中の25%以上の配列に存在するアミノ酸を示す〕場合、受容体よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう。この基準は、ヒトフレームワーク中の普通でないアミノ酸が抗体構造を破壊しないことを保証するのに役立つ。更に、普通でないアミノ酸をたまたまヒト抗体に典型的である供与抗体からのアミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体を低免疫原性にすることができる。
【0043】
基準III:ヒト化免疫グロブリン鎖中の3つのCDRのすぐ近くの位置において、受容体アミノ酸よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう。それらのアミノ酸は、おそらく特にCDR中のアミノ酸と相互作用し、もし受容体から選択されれば供与体CDRを破壊しそして親和力を低下させるであろう。更に、近隣のアミノ酸は抗原と直接相互作用し〔Amitら、Science, 233,747−753(1986)、これは参考として本明細書中に組み込まれる〕、供与体からそれらのアミノ酸を選択することは元の抗体における親和力を提供する全ての抗原接触を維持するのに望ましいかもしれない。
【0044】
基準IV:典型的には元の供与抗体の3次元モデルは、CDRの外側の幾つかのアミノ酸がCDRに密接しておりそして水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用等によりCDR中のアミノ酸と相互作用する相当な確率を有することを示す。それらのアミノ酸位置では、受容体免疫グロブリンアミノ酸よりもむしろ供与体アミノ酸が選択され得る。この基準に従ったアミノ酸は、通常はCDR中の或る部位の約3Å単位内に側鎖原子を有し、そして確立された化学的力、例えば上記に列挙した力に従ってCDR原子と相互作用することができるような原子を含まなければならない。抗体などのタンパク質のモデルを作成するためのコンピュータープログラムが一般に利用可能であり、そして当業者に周知である〔Loewら、Int.J.Quant.Chem., Quant.Biol.Symp.,15:55−66(1988);Bruccoleriら、Science,233:755−758(1986)を参照のこと。これら全てが参考として本明細書中に組み込まれる〕。それらは本発明の部分を構成しない。実際、全ての抗体が類似の構造を有するので、Brookhaven Protein DataBankから入手可能である既知の抗体を必要であれば別の抗体の荒モデルとして利用することができる。商業的に入手可能であるコンピュータープログラムを用いてコンピューター画面にそれらのモデルを表示し、原子間の距離を算出し、そして種々のアミノ酸相互作用の可能性を評価することができる。
【0045】
ヒト化抗体は、ヒト療法において使用されるマウス抗体または或る場合にはキメラ抗体を上回る少なくとも3つの潜在的利点を有する:
1)エフェクター部分がヒトであるため、ヒト免疫系のその他の部分と良好に反応することができる〔例えば、補体依存性細胞障害作用(CDC)または抗体依存性細胞障害作用(ADCC)により、より効果的に標的細胞を破壊する〕。◇
2)ヒト免疫系は外来物としてヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を認識しないであろう。従ってそのような注入抗体に対する抗体応答は全体的に外来のマウス抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対するよりも小さいであろう。◇
3)注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりもずっと短いヒト循環中の半減期を有することが報告されている〔D.Shawら、J.Immuol.,138:4534−4538(1987)〕。注入されたヒト化抗体は、おそらく天然のヒト抗体により類似した半減期を有し、より少量または少頻度の用量を与えることを可能にするだろう。
【0046】
本発明は、EPA公報No.0239400に記載されたものに関して改善されたヒト化免疫グロブリン(例えば、ヒトIL−2レセプターに結合することができる)に特に向けられる。その出願明細書(その開示は本発明の範囲から除去される)は、或る種の免疫グロブリンについて、受容体抗体の軽鎖または重鎖可変領域中のCDR領域を異なる特異性の抗体からのCDRの類似部分(典型的には溶媒の影響を受けやすい部分)で置換することを記載している。また、その出願明細書は、或る種の免疫グロブリンについて、抗原結合部位から(溶媒に)影響されやすい残基を単に移動する可能性を記載しており、この残基は明らかに幾つかのフレームワーク領域を含むことができる〔特に、Amitら、Science,233:747−753(1986)に記載されたような抗原結合に関与することが既知である残基、またはおそらく鎖間相互作用に必須である残基−ただしそれらの選択については該出願明細書において不十分な指針しか与えられていない〕。例えば、本発明の好ましい態様は、全CDRアミノ酸およびCDRの1つ(または好ましくは各々)のすぐ近くのフレームワークアミノ酸を置換することを伴う。一般に、例えばコンホメーション(および普通はそれらの抗原結合特異性)を維持するためにCDRと連絡をとる任意のフレームワーク残基が、上記に詳細に記載された本発明の好ましい態様の範囲内に特に含まれる。
【0047】
1つの観点において、本発明は、所望のエピトープ、例えばヒトIL−2レセプター上のエピトープ、に結合することができる免疫グロブリン(例えば抗−Tac モノクローナル抗体)からの重鎖および/または軽鎖CDR(典型的には上述したような別のアミノ酸残基を有する)をコードする組換えDNAセグメントに向けられる。それらの領域をコードするDNAセグメントは、典型的にはヒト様フレームワーク領域をコードするDNAセグメントに結合されるだろう。例えば、発現時に抗−Tac重鎖および軽鎖超可変領域(ヒト様フレームワーク領域と共に)を含んで成るポリペプチド鎖をコードする好ましいDNA配列がそれぞれ図3と図4に示されている。コドン縮重および重要でないアミノ酸置換のため、後述するようにそれらの配列の代わりに他の配列を容易に用いることができる。
【0048】
前記DNAセグメントは、典型的には、ヒト化抗体のコード配列に作用可能に連結した発現調節DNA配列、例えば天然由来のまたは異種のプロモー夕ー領域、を更に含むだろう。好ましくは発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションせしめることができるベクター中の真核生物プロモーター系であろうが、原核生物宿主用の調節配列を用いることができる。ベクターが適当な宿主中に組み込まれれば、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適当な条件下で維持され、そして所望する時、軽鎖、重鎖、軽鎖/重鎖二量体もしくは完全な抗体、結合性断片または他の免疫グロブリン形態の収得および精製を行うことができる。
【0049】
ヒト定常領域DNA配列は、周知の方法に従って、種々のヒト細胞から、好ましくは不死化されたB細胞から単離することができる(Kabat、前掲およびWP 87/02671を参照のこと)。例えば、ヒトκ免疫グロブリン定常およびJ領域遺伝子および配列はHeiterら、Cell 22:197−207(1980)中に記載されており、そしてヒト免疫グロブリンCγ1遺伝子のヌクレオチド配列はEllisonら、Nucl.Acid Res. 10:4071(1982)中に記載されている(その両者は参考として本明細書中に組み込まれる)。本発明の免疫グロブリンを作製するためのCDRは、所望の抗原(例えばヒトIL−2レセプター)に結合することができるモノクローナル抗体から同様にして誘導され、そしてマウス、ラット、ウサギまたは抗体を生産することができる他の脊椎動物を含む任意の便利な哺乳動物起源において生産されるだろう。DNA配列の適当な起源細胞並びに免疫グロブリンの発現および分泌のための宿主細胞は、多数の入手源、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手することができる〔”Catalogue of CellLines and Hybridomas”、第5版(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0050】
本明細書中に特定的に記載のヒト化免疫グロブリンに加えて、他の「実質的に相同の」変更免疫グロブリンを容易に設計することができ、そして当業者に周知の様々な組換えDNA技術を使って製造することができる。例えば、IL−2レセプター免疫グロブリンについては、フレームワーク領域は幾つかのアミノ酸置換、末端および中間の付加および削除等により一次構造レベルで図3および図4の配列と異なることができる。更に、本発明のヒト化免疫グロブリンを基準として、種々の異なるヒトフレームワーク領域を単独でまたは組合せて用いることができる。一般に、遺伝子の修飾は種々の周知の技術、例えば部位特異的突然変異誘発〔Gillmanおよび Smith, Gene 8:81−97(1979)並びにRobertsら、Nature 328:731−734(1987)を参照のこと;この両者は参考として本明細書中に組み込まれる〕により容易に達成することができる。あるいは、一次抗体構造の一部分のみを含んで成るポリペプチド断片を製造することができ、この断片は1または複数の免疫グロブリン活性(例えば補体結合活性)を有する。また多数の遺伝子と同様、免疫グロブリン関連遺伝子は、各々が1または複数の別個の生物活性を有する別々の機能性領域を含むため、該遺伝子を別の遺伝子からの機能性領域(例えば酵素;1987年12月15日提出の一般譲渡されたU.S.S.N.132,387を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる)と融合させ、新規性質を有する融合タンパク質(例えば免疫毒素)を製造することができる。
【0051】
最終的に所望のヒト化抗体を発現することができる本発明の核酸配列は、様々な異なるポリヌクレオチド(ゲノムDNAまたはcDNA、RNA、合成オリゴヌクレオチド等)および成分(例えばV,J,DおよびC領域)から、そして様々な異なる技術により、形成せしめることができる。適当なゲノム配列を連結することが現在最も一般的な製造方法であるが、cDNA配列を使用してもよい〔ヨーロッパ特許公報No.0239400およびReichman,L.ら、Nature332:323−327(1987)を参照のこと。この両者は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0052】
前に述べたように、該DNA配列を発現調節配列に作用可能に連結した(即ち、機能を保証するように配置させた)後で該配列が宿主中で発現されるだろう。それらの発現ベクターは、典型的にはエピソームとしてまたは宿主染色体DNAの組込み部分として宿主中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のDNA配列により形質転換された細胞の検出を可能にするために選択マーカー、例えばテトラサイクリンまたはネオマイシン耐性遺伝子を含むだろう(例えば、米国特許第4,704,362号を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0053】
大腸菌(E. coli)は本発明のDNA配列をクローニングするのに特に有用な原核生物宿主である。使用に適当な他の微生物宿主としては、バシラス菌、例えばバシラス・サブチリス(Bacillus subtilis)、並びに他の腸内細菌、例えばサルモネラ菌(Salmonella)、セラチア菌(Serratia)および種々のシュードモナス菌(Pseudomonas)種が挙げられる。それらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合性である発現調節配列(例えば複製開始点)を含むであろう発現ベクターを作製することもできる。加えて、任意の数の種々の周知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージからのプロモーター系が存在するだろう。プロモーターは、典型的には所望によりオペレーター配列と共に発現を調節し、そして転写および翻訳を開始および終了させるためのリボソーム結合部位等を有するだろう。
【0054】
他の微生物、例えば酵母を発現に用いることもできる。サッカロミセス(Saccharomyces)は好ましい宿主であり、適当なベクターは、発現調節配列、例えば3−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖酵素プロモーターを包含するプロモーター、並びに所望により複製開始点、終結配列等を有する。
【0055】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養物を用いて本発明のポリペプチドを発現および生産せしめることもできる〔Winnacker,“From Genes toClones”、VCH Publishers, N.Y.,N.Y.(1987)を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。完全な免疫グロブリンを分泌することができる多数の適当な宿主細胞系が技術の現状において開発されているため実際は真核細胞が好ましい。そのような真核細胞としては、CHO細胞系、種々のCOS細胞系、HeLa細胞、ミエローマ細胞系等が挙げられるが、好ましくは形質転換されたB細胞またはハイブリドーマである。それらの細胞のための発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製開始点、プロモーター、エンハンサー〔Queen,C.ら、Immunol.Rev.89:49−68(1986);これは参考として本明細書中に組み込まれる〕、および必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含むことができる。好ましい発現調節配列は、エンハンサーを有するSV40〔MulliganおよびBerg,Science 209:1422−1427(1980)を参照のこと〕、免疫グロブリン遺伝子、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス等に由来するプロモーターである。
【0056】
着目のDNAセグメント(例えば、重鎖および軽鎖コード配列並びに発現調節配列)を含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存して異なる周知の方法により、宿主細胞中に移すことができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクション法が常用され、一方他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る〔一般には、Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press(1982)を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0057】
一度発現されれば、本発明の完全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を当業界の標準法、例えば硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等に従って精製することができる〔一般的には、Scopes,R.、ProteinPurification,Springer−Verlag,N.Y.(1982)を参照のこと〕。少なくとも約90〜95%均質の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、98〜99%またはそれ以上の均質が医薬用途に好ましい。部分的にまたは所望の時には均質まで精製されれば、療法的に(体外的を含む)またはアッセイ方法、免疫蛍光染色法等を開発しそして実施する際に該ポリペプチドを使用することができる〔一般的には、Immunological Methods、第IおよびII巻、LefkovitsおよびPernis編、AcademicPress,New York,N.Y.(1979および1981)を参照のこと〕。
【0058】
本発明において例示されるIL−2レセプター特異抗体は、典型的にはT細胞介在性の病気状態を処置することにおいて個々に用いられるだろう。通常、病気に関連する細胞がIL−2レセプターを有すると同定された場合、ヒトIL−2レセプターへのIL−2の結合を阻止することができるヒト化抗体が適当である(”Treating Human Malignancies andDisorders”と題するU.S.S.N.085,707を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる)。例えば、処置に適する典型的な病気状態として、器官移植、例えば心臓、肺、腎臓、肝臓等の移植を行う患者における移植拒絶反応および対宿主性移植片病が挙げられる。他の病気としては、自己免疫疾患、例えばI型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡および重症筋無力症が挙げられる。
【0059】
本発明のヒト化抗体は、別の抗体、特に病気の一因となる細胞上の別のマーカーと反応するヒトモノクローナル抗体と組合せて使用することもできる。例えば、適当なT細胞マーカーとしては、第一回国際白血球分化ワークショップ(First International Leukocyte Differentiation Workshop)、LeukocyteTyping,Bernardら編、Springer−Verlag,N.Y.(1984)(これは参考として本明細書中に組み込まれる)により命名されたいわゆる「分化のクラスター(Clusters of Differentiation)」中に分類されるものを挙げることができる。
【0060】
該抗体は、化学療法剤または免疫抑制剤と共に与えられる別々に投与される組成物として使用することができる。典型的には、そのような薬剤としては、シクロスポリンAまたはプリン類似体(例えばメトトレキセート、6−メルカプトプリン等)が挙げられるだろうが、当業者に周知である多数の他の薬剤(例えばシクロホスファミド、プレドニソン等)も使用することができる。
【0061】
本発明の好ましい医薬組成物は、免疫毒素における当該抗体の使用を含んで成る。免疫毒素は2つの成分により特徴づけられ、そして試験管内または生体内において選択細胞を殺すのに特に有用である。第一成分は、付着または吸収すると細胞に対して通常は致命的である細胞毒性物質である。「デリバリー賦形剤」として知られる第二成分は、毒性物質を特定の細胞タイプ、例えばガンを含む細胞に供給するための手段を提供する。この2成分は通常は様々な周知の化学的方法のいずれかによって一緒に化学的に結合される。例えば、細胞毒性物質がタンパク質でありそして第二成分が完全な免疫グロブリンである時、結合は異種二価性架橋剤、例えばSPDP、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等によることができる。種々の免疫毒素の製造が当業界で周知であり、例えば“Monoclonal Antibody−Toxin Conjugates:Aiming the Magic Bullet”、Thorpeら、Monoclonal Antibodies in Clitical Medicine,Academic Press,168−190(1982)中に見つけることができる。これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【0062】
様々な細胞毒性物質が免疫毒素における使用に適当である。細胞毒性物質としては、放射性核種、例えばヨウ素−131、イットリウム−90、レニウム−188およびビスマス−212;多数の化学療法剤、例えばビンデシン、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびシスプラチン;並びに細胞毒性タンパク質、例えば、リボソーム阻害タンパク質様アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、シュードモナス外毒素A、リシン、ジフテリア毒素、リシンA鎖等;または細胞表面で活性な物質、例えばホスホリパーゼ酵素(例えばホスホリパーゼC)を挙げることができる。〔1988年12月28日に提出された一般譲渡されたU.S.S.N.07/290,968;“Chimeric Toxins”、OlsnesおよびPhil,Parmac.Ther., 25:355−381(1982);並びに“Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy”、BaldwinおよびByers編、159−179,224−266頁、Academic Press(1985)を参照のこと。これら全てが参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0063】
免疫毒素のデリバリー成分は、本発明のヒト化免疫グロブリンを含むだろう。好ましくは完全な免疫グロブリンまたはそれらの結合性断片、例えばFabが使用される。典型的には、免疫毒素中の抗体はヒト IgMまたはIgG イソタイプのものであるだろう。しかし所望の時には他の哺乳動物定常領域を用いることもできる。
【0064】
本発明のヒト化抗体およびそれの医薬組成物は、特に非経口、即ち皮下、筋肉内または静脈内投与に有用である。非経口投与用組成物は、通常、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された抗体の溶液または混合物を含んで成るだろう。様々な水性担体、例えば水、緩衝化された水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等を使用することができる。それらの溶液は無菌であり、通常は粒状物質を含まない。それらの組成物は、常用される周知の滅菌技術により滅菌することができる。該組成物は、適切な生理的条件に必要である時は医薬上許容される補助物質、例えばpH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有することができる。それらの組成物中の抗体の濃度は広範囲に渡り異なることができ、即ち、少なくとも約0.5%未満から、通常は少なくとも約1%から、15〜20重量%ほどまでに及ぶことができ、そして液体の体積、粘度等に主として基づいて、選択された特定の投与形式に従って選択されるだろう。
【0065】
筋肉内注射用の典型的医薬組成物は、1mlの無菌緩衝液と50mgの抗体を含むように調製することができる。静脈点滴注入用の典型的医薬組成物は、250mlの無菌リンガー液と150mgの抗体を含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は当業者に既知であるかまたは明白であり、そして例えばRemington’s Pharmaceutical Science、第15版、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1980)中に詳細に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【0066】
本発明の抗体は貯蔵のために凍結乾燥することができ、そして使用前に適当な担体中で再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリンに関して効果的であることが示されており、当業界で既知の凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。凍結乾燥と再構成は様々な程度の抗体活性の低下をもたらし得ること(例えば従来の免疫グロブリンでは、IgM抗体は IgG抗体よりも大きな活性低下を有する傾向がある)、そして使用レベルを調整して埋め合わせなければならないことがあることは、当業者により明白であろう。
【0067】
本発明のヒト化抗体またはそれの混合物を含有する組成物は、予防および/または治療処置のために投与することができる。治療用途においては、組成物は、既に病気にかかっている患者に、病気を治癒するかまたは少なくとも部分的に緩和するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は「治療的有効量」と定義される。この用途に有効な量は、感染の重度および患者自身の免疫系の一般状態に依存するであろう。しかし通常は、用量あたり約1〜約200mgの抗体、より好ましくは患者あたり5〜25mgの用量が使用されるだろう。本発明の材料は通常は深刻な病気状態、即ち命にかかわるかまたはもしかすると命にかかわる状況において使用されるだろうことを念頭に置かなげればならない。そのような場合、本発明のヒト化抗体により達成される外来性物質の最小化および「外来物質」拒絶の低確率の点からみて、実質的過剰量の抗体を投与することが可能でありそして治療医により望ましいと感じられるかもしれない。
【0068】
予防用途においては、本発明の抗体またはそれの混合物を含有する組成物は、患者の抵抗性を高めるためにまだ病気状態でない患者に投与される。そのような量は「予防的有効量」として定義される。この用途の場合、正確な量は患者の健康状態および免疫の一般レベルに依存するが、通常は用量あたり0.1〜25mg、特に患者あたり0.5〜2.5mgであろう。好ましい予防用途は、腎臓移植拒絶の防止である。
【0069】
本発明のヒト化抗体は、更に試験管内において広範な用途を見い出すことができる。一例として、T細胞の型決定、特異的IL−2レセプターを有する細胞または該レセプターの断片の単離、ワクチンの調製等に模範的な抗体を利用することができる。
【0070】
診断目的に、抗体を標識してもよくまたは未標識であってもよい。未標識抗体は、ヒト化抗体と反応性である別の標識抗体(二次抗体)、例えばヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体と組合せて使用することができる。あるいは抗体を直接標識してもよい。様々な標識、例えば放射性核種、蛍光団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド(特にハプテン)、等を使用することができる。多数の型式のイムノアッセイが利用可能であり、そして当業者に周知である。
【0071】
細胞活性に対する保護もしくは検出または選択された抗原の存在の検出において問題の抗体を使用するためにキットを供給することもできる。本発明の問題の抗体組成物は、単独でまたは所望の細胞タイプに特異的な追加の抗体と共に、普通は1つの容器に凍結乾燥形態で提供することができる。抗体は標識もしくは毒素と接合されていても未接合であってもよく、緩衝液、例えばTris、リン酸塩、炭酸塩等の緩衝液、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク質、例えば血清アルブミン等、および使用説明書のセットと共にキット中に含まれる。一般にそれらの材料は活性抗体の量を基にして約5重量%未満、通常は抗体濃度を基にして少なくとも約0.001重量%の合計量において存在するだろう。しばしは、活性成分を希釈するための不活性増量剤または賦形剤を含めることが望ましく、この場合賦形剤は全組成の約1〜99重量%で存在することができる。キメラ抗体を結合することができる二次抗体をアッセイにおいて使用することができ、これは通常は別の容器中に存在するだろう。二次抗体は典型的には標識と接合され、上述の抗体製剤と同様にして製剤化される。
【0072】
次の実施例は例示の目的で与えられ、限定のためではない。
【実施例】
【0073】
(実験)
<ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の設計>
ヒト化抗体のフレームワークを提供するためにヒト抗体Euの配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat,E.ら、U.S.Dept.of Health and Human Services,1983)を使用した。というのは、抗−Tacの重鎖のアミノ酸配列がNational Biomedical FoundationProtein Identification Resource 中の他のいずれの重鎖配列よりもこの抗体の重鎖に相同性が高かったためである。
【0074】
ヒト化重鎖の配列を選択するために、抗−Tac重鎖配列(一般譲渡されたU.S.S.N.の186,862と223,037を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる)をEu重鎖配列と整列した(図1)。各位置において、その位置が次のカテゴリーのいずれか1つに入らない限り、Euアミノ酸をヒト化配列のために選択した。次のカテゴリーのいずれか1つに入る場合、抗−Tacアミノ酸を選択した。◇
(1)その位置が、Kabatら、前掲により定義されたような相補性決定領域(CDR)中にある(アミノ酸31−35,50−66,99−106);
(2)その位置ではEuアミノ酸がヒト重鎖配列にまれであり、一方抗−Tacアミノ酸がその位置でヒト重鎖配列に典型的であった(アミノ酸27,93,95,98,107−109,111);
(3)その位置が抗−Tac重鎖のアミノ酸配列中のCDRのすぐ近くであった(アミノ酸30と67);
(4)抗−Tac抗体の3次元モデルが、該アミノ酸が抗原結合部位に物理的に密接していることを示唆した(アミノ酸48と68)。
【0075】
幾つかのアミノ酸はそれらのカテゴリーのうちの複数に入るが、それらは1つのカテゴリーにのみ挙げてある。
【0076】
ヒト化軽鎖の配列を選択するために、抗−Tac軽鎖配列をEu軽鎖の配列と整列させた(図2)。その位置が同じくカテゴリー(1)〜(4)のうちの1つに入らない限り、Euアミノ酸を各位置において選択した(カテゴリー定義中の重鎖を軽鎖で置き換える):
(1)CDR(アミノ酸24−34,50−56,89−97)。◇
(2)Euよりも抗−Tacアミノ酸がより典型的である(アミノ酸48と63)。◇
(3)CDRに近い(アミノ酸なし;Euと抗−Tacはそれらの位置全てにおいて既に同じであった)。◇
(4)結合領域に3次元的に近接している可能性(アミノ酸60)。
【0077】
重鎖(図3)と軽鎖(図4)の実際のヌクレオチド配列は次のようにして選択した。
【0078】
(1)該ヌクレオチド配列は上述のようにして選択したアミノ酸配列をコードする。
【0079】
(2)それらのコード配列の5’側のヌクレオチド配列はリーダー(シグナル)配列、即ち MOPC 63抗体の軽鎖のリーダーおよびPCH 108A抗体の重鎖のリーダー(Kabatら、前掲)をコードする。それらのリーダー配列を抗体の典型として選択した。
【0080】
(3)コード配列の3’側のヌクレオチド配列は、抗−Tac配列の一部分であるマウス軽鎖J5セグメントおよびマウス重鎖J5セグメントに従う配列である。それらの配列はスプライス供与配列を含有するために含まれる。
【0081】
(4)配列の各末端には、Xba I部位での切断およびベクターの Xba I部位へのクローニングを可能にするための Xba I部位が存在する。
【0082】
<ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の作製>
重鎖を合成するために、Applies Biosystems 380B DNA合成装置を使って4つのオリゴヌクレオチド HES12,HES13,HES14,HES15(図5A)を合成した。それらのオリゴヌクレオチドの2つは、重鎖の各鎖の一部であり、そして各オリゴヌクレオチドはアニーリングを可能にするために約20ヌクレオチドが次のヌクレオチドとオーバーラップしている(図5B)。該オリゴヌクレオチドは一緒にすると、Xba I部位での切断を可能にするために各末端に幾つかの余分なヌクレオチドを有する完全なヒト化重鎖をカバーする。該オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製した。
【0083】
各オリゴヌクレオチドを、標準手順(Maniatis、前掲を参照のこと)によりATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化した。リン酸化したオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、それらを各々約3.75μMの濃度において40μlのTA(33mM Tris酢酸塩、pH7.9, 66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム)中に一緒に懸濁し、4分間95℃に加熱し、そして4℃にゆっくり冷却した。各オリゴヌクレオチドの反対鎖を合成することにより該オリゴヌクレオチドから完全な遺伝子を合成するために(図5B)、次の成分を100μlの最終容量において添加した:
10μl アニールしたオリゴヌクレオチド
各0.16mM デオキシリボヌクレオチド
0.5mM ATP
0.5mM DTT
100μg/ml BSA
3.5μg/ml T4 g43タンパク質(DNAポリメラーゼ)
25μg/ml T4 g44/62タンパク質
(ポリメラーゼ補助タンパク質)
25μg/ml 45タンパク質(ポリメラーゼ補助タンパク質)
【0084】
この混合物を37℃で30分間インキュベートした。次いで10uのT4 DNAリガーゼを添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。70℃で15分間反応液をインキュベートすることにより、ポリメラーゼとリガーゼを不活性化した。遺伝子をXba Iで消化するために、反応液に200μg/mlのBSAと1mMのDTTを含む50μlの2×TA、43μlの水、および5μl中の50uの Xba Iを添加した。反応液を37℃で3時間インキュベートし、そしてゲル上で泳動した。ゲルから431bpの Xba I断片を精製し、そして標準法によりプラスミドpUC19の Xba I部位中にクローニングした。4つのプラスミド単離物を精製し、ジデオキシ法を使って配列決定した。そのうちの1つが正しい配列を有した(図3)。
【0085】
軽鎖を合成するために、4つのオリゴヌクレオチドJFD1,JFD2,JFD3,JFD4(図6A)を合成した。それらのオリゴヌクレオチドの2つは、軽鎖の各鎖の一部であり、そして各オリゴヌクレオチドはアニーリングを可能にするために約20ヌクレオチドが次のヌクレオチドとオーバーラップしている(図6B)。該オリゴヌクレオチドは一緒にすると、Xba I部位での切断を可能にするために各末端に幾つかの余分なヌクレオチドを有する完全なヒト化軽鎖をカバーする。該オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製した。
【0086】
軽鎖遺伝子はそれらのオリゴヌクレオチドから2部分において合成した。JFD1とJFD2各々0.5μgを20μlのシークエナーゼ緩衝液(40mM Tris−HCl,pH7.5,20mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウム)中に混合し、70℃に3分間加熱し、そして該オリゴヌクレオチドをアニーリングさせるためにゆっくりと23℃まで放冷した。JFD3とJFD4も同様にして処理した。各反応液をDTT 10mMおよび各デオキシヌクレオチド0.5mMにし、6.5uのシークエナーゼ(USBiochemicals)を最終容量24μlにおいて添加し、そして37℃で1時間インキュベートして該ヌクレオチドの反応方向鎖を合成した。各反応液にXba IとHindIIIを添加してDNAを消化した(JFD2とJFD3がオーバーラップする領域の中、従って合成されたDNAの各々の中にHindIII部位が存在する;図6B)。反応液をポリアクリルアミドゲル上で泳動し、Xba I−HindIII断片を精製し、そして標準法によりpUC18中にクローニングした。各断片について数個のプラスミド単離物をジデオキシ法により配列決定し、そして正しいものを選択した。
【0087】
<ヒト化軽鎖および重鎖を発現させるためのプラスミドの作製>
重鎖Xba I断片が挿入されているpUC19プラスミドから該断片を単離し、そして標準法により正しい方向においてベクターpVγ1(一般に譲渡されたU.S.S.N223,037を参照のこと)のXba I部位に挿入し、プラスミドpHuGTAC1(図7)を作製した。このプラスミドは、適当な宿主細胞中にトランスフェクトすると高レベルの完全重鎖を発現するだろう。
【0088】
2つの軽鎖Xba I−HindIII断片が挿入されている各pUC18プラスミドからそれらの断片を単離した。ベクタープラスミドpVκ1(一般に譲渡されたU.S.S.N.223,037を参照のこと)をXba Iで切断し、標準法により脱リン酸しそして2断片を連結せしめた。所望の反応生成物は次のような環状形を有する:ベクター−Xba I−断片1−HindIII−断片2−Xba I−ベクター。数個のプラスミド単離物を制限マッピングと配列決定により分析し、この形態を有する1つのプラスミドを選択した。このプラスミドpHuLTAC(図8)は完全なヒト化軽鎖(図4)を含有し、適当な宿主細胞中にトランスフェクトすると高レベルの軽鎖を発現するだろう。
【0089】
<ヒト化抗体の合成および親和力>
プラスミドpHuGTAC1およびpHuLTACをマウスSp2/0細胞中にトランスフェクトし、そして該プラスミドを組み込んだ細胞を、プラスミド上のgptおよびhyg遺伝子(図7,8)により付与されるミコフェノール酸および/またはヒグロマイシンBに対する耐性に基づいて標準法により選択した。それらの細胞がIL−2レセプターに結合する抗体を分泌したことを確かめるために、細胞からの上清をIL−2レセプターを発現することが知られているHUT−102細胞と共にインキュベートした。洗浄後、細胞をフルオレセイン接合ヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄し、そしてFACSCANサイトフルオロメーター上で蛍光について分析した。結果(図9A)は、ヒト化抗体がそれらの細胞には結合するが、IL−2レセプターを発現しないJurkat T細胞には結合しない(図9D)ことを明らかに示す。対照として、もとのマウス抗−Tac抗体を用いてそれらの細胞を染色すると同様な結果を与えた(図9B、C)。
【0090】
更なる実験のために、ヒト化抗体を生産する細胞をマウスに注入し、そして生じた腹水を回収した。標準法に従ってAffigel−10支持体(Bio−RadLaboratories, Inc., Richmond,CA)上に調製されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のアフィニティーカラムに通過させることにより、腹水からヒト化抗体を実質上均質まで精製した。もとの抗−Tac抗体に比較してヒト化抗体の親和力を測定するために、競合的結合実験を行った。約5×105個のHUT−102細胞を既知量(10−40ng)の抗−Tac抗体とヒト化抗−Tac抗体と共に4℃で10分間インキュベートした。次いで細胞に100ngのビオチン化抗−Tacを添加し、そして4℃で30分間インキュベートした。この量の抗−Tacは細胞上の結合部位を飽和するのに十分であり、大過剰であってはならないことが予め決定されている。0.1%アジ化ナトリウムを含む2mlのリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS)で細胞を2回洗浄した。次いで250ngのフィコエリトリン接合アビジンと共に細胞を4℃で30分間インキュベートし、この接合アビジンは既に細胞に結合しているビオチン化抗−Tacに結合した。細胞を上記のように再び洗浄し、1%パラホルムアルデヒドを含むPBS中で固定し、そしてFACSCANサイトフルオロメーター上で蛍光分析した。
【0091】
第一段階における競合体としての抗−Tac抗体の使用量を増加していくと(10−40ng)、第二段階において細胞に結合することができたビオチン化抗−Tacの量を減少させ、従って最終段階において結合したフィコエリトリン接合アビジンの量を減少させ、こうして蛍光を減少させた(図10A)。当量(20ng)の抗−Tacおよび競合体として使ったヒト化抗−Tacは、蛍光をほぼ同じ程度に減少させた(図10B)。このことは、それらの抗体がほぼ同じ親和力(3〜4倍以内)を有することを示す。というのは、もし一方がずっと大きな親和力を有するなら、より有効にビオチン化抗−Tacと競争し、従って蛍光をもっと滅少させたであろうからである。
【0092】
<ヒト化抗体の生物学的性質>
ヒトの病気の処置における最適な使用のため、ヒト化抗体はIL−2レセプターを発現している体内のT細胞を破壊することができるべきである。抗体が標的細胞を破壊し得る1つの機構は、ADCCと略される抗体依存性細胞障害作用〔Fundamental Immunology, Paul,W.編、Raven Press,NewYork(1984),681頁〕であり、この場合抗体は、標的細胞と標的を溶解することができるマクロファージのようなエフェクター細胞との間に架橋を形成する。ヒト化抗体と元のマウス抗−Tac 抗体がADCCを媒介することができるかどうかを決定するために、標準法によりクロム放出アッセイを行った。詳しくは、IL−2レセプターを発現するヒト白血病HUT−102細胞を51Crと共にインキュベートし、それらにこの放射性核種を吸収させた。次いでHUT−102 細胞を過剰量の抗−Tacまたはヒト化抗−Tac抗体のいずれか一方と共にインキュベートした。次にヒト組換えIL−2との約20時間のインキュべーションによって活性化された通常の精製ヒト末梢血単核細胞である30:1または100:1の比のエフェクター細胞と共に4時間インキュベートした。標的HUT−102細胞の溶解を示す51Crの放出を測定し、そしてバックグラウンドを差し引いた(表1)。その結果は、どちらの比のエフェクター細胞においても、抗−Tacは有意な数の標的細胞を溶解しなかった(5%未満)が、一方ヒト化抗体は溶解した(20%より多く)ことを示す。従って、ヒト化抗体は、T細胞白血病または他のT細胞介在性の病気を治療することにおいて、おそらく元のマウス抗体よりも効果的であろう。
【0093】
【表1】
【0094】
上記から、本発明のヒト化免疫グロブリンが他の抗体の多数の利点を提供することは明らかであろう。例えば、抗−Tacマウスモノクローナル抗体と比較すると、本発明のヒト化IL−2レセプター免疫グロブリンは、より経済的に生産することができ、そして実質的に少ない外来アミノ酸配列を含むことができる。ヒト患者への注入後に抗原性となる可能性の減少は、上記の基準に従って設計された免疫グロブリンにとって有意な療法的改善を意味する。
【0095】
本発明を明確化および理解のために説明および実施例により幾分詳細に記載してきたが、上述の請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行い得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1】抗−Tac重鎖(上行)およびEu重鎖(下行)の配列の比較を示す図である。アミノ酸の1文字記号が用いられている。各行の最初のアミノ酸に左側に番号を付けてある。2つの配列中の同じアミノ酸は線でつながれている。3つのCDRには下線が付してある。ヒト化抗−Tac重鎖においてEuアミノ酸よりもむしろ抗−Tacアミノ酸が使用された他のアミノ酸位置は星印で示されている。
【図2】抗−Tac軽鎖(上行)およびEu軽鎖(下行)の配列の比較を示す図である。アミノ酸の1文字記号が用いられている。各行の最初のアミノ酸に左側に番号を付けてある。2つの配列中の同じアミノ酸は線でつながれている。3つのCDRには下線が付してある。ヒト化抗−Tac軽鎖においてEuアミノ酸よりもむしろ抗−Tacアミノ酸が使用された他のアミノ酸位置は星印で示されている。
【図3】ヒト化抗−Tac重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。タンパク質をコードする遺伝子の部分についての翻訳アミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に示されている。該遺伝子の始まりと終わりのヌクレオチドTCTAGAは Xba I 部位である。成熟重鎖配列はアミノ酸#20のQで始まる。
【図4】ヒト化抗−Tac軽鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。タンパク質をコードする遺伝子の部分についての翻訳アミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に示されている。該遺伝子の始まりと終わりのヌクレオチドTCTAGAはXba I 部位である。成熟軽鎖配列はアミノ酸#21のDで始まる。
【図5A】ヒト化抗−Tac重鎖遺伝子を合成するのに用いた、5’から3’方向に記載した4つのオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図5B】前記オリゴヌクレオチドの相対位置を示す図である。矢印は各オリゴヌクレオチドの3’方向を指している。
【図6A】ヒト化抗−Tac軽鎖遺伝子を合成するのに用いた、5’から3’方向に記載した4つのオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図6B】前記オリゴヌクレオチドの相対位置を示す図である。矢印は各オリゴヌクレオチドの3’方向を指している。JFD2とJFD3とのオーバーラップ中のHindIII部位の位置が示されている。
【図7】ヒト化抗−Tac重鎖を発現させるのに用いるプラスミドpHuGTAC1の略図である。関係する制限部位が示されており、そして重鎖のコード領域が箱として表示されている。免疫グロブリン(Ig)プロモーターからの転写方向が矢印により示されている。EH=重鎖エンハンサー、Hyg=ヒグロマイシン耐性遺伝子。
【図8】ヒト化抗−Tac軽鎖を発現させるのに用いるプラスミドpHuLTACの略図である。関係する制限部位が示されており、そして軽鎖のコード領域が箱として表示されている。Igプロモーターからの転写方向が矢印により示されている。
【図9】抗−Tac抗体またはヒト化抗−Tac抗体に次いで標識としてフルオレセイン接合ヤギ抗マウスIg抗体またはヤギ抗ヒトIg抗体でそれぞれ染色されたHut−102およびJurkat細胞のフルオロサイトメトリーを示す図である(A〜D)。各パネルにおいて、点線曲線は第一抗体が削除された時の結果を示し、実線曲線は記載された第一および第二(接合)抗体を含む時の結果を示す。
【図10A】指摘されるような0〜40ngの抗−Tac、次いでビオチン化抗−Tac、次にフィコエリトリン接合アビジンで染色されたHut−102細胞のフルオロサイトメトリーを示す図である。
【図10B】指摘の抗体、次いでビオチン化抗−Tac、次にフィコエリトリン接合アビジンで染色されたHut−102細胞のフルオロサイトメトリーを示す図である。
【技術分野】
【0001】
本発明は一般に、新規治療薬を開発するための組換えDNA技術とモノクローナル抗体技術の組合せに関し、更に詳しくは、非免疫原性抗体の製造およびそれらの利用に関する。
【背景技術】
【0002】
哺乳類では、外来物質、即ち抗原、と特異的に相互作用する2つのタイプの細胞によって免疫応答が媒介される。それらの細胞タイプの1つであるB細胞は、抗体の生産を担う。第二の細胞クラスであるT細胞は、B細胞とT細胞を含む広範な他の造血細胞の両者の生体内機能を調節する様々な細胞サブセットを包含する。
【0003】
T細胞がこの調節に力を及ぼす1つの方法は、最初はT細胞増殖因子と命名されたインターロイキン−2(IL−2)として知られるリンホカインの生産を通してである。IL−2の主な機能はT細胞の刺激と維持であると思われる。実際、或る免疫学者はIL−2が全免疫応答の中心にあるだろうと考えている〔Farrar, J.ら、Immunol.Rev. 63:129−166(1982)参照、これは参考として本明細書に組み込まれる〕。
【0004】
その生物学的作用を及ぼすために、IL−2は特異的な高親和性膜レセプターと相互作用する〔Greene,W.、ら、Progress inHematology XIV, E.Brown編、Grune and Statton, New York (1986)、283〜頁〕。ヒトIL−2レセプターは複雑な多重鎖の糖タンパク質であり、1本の鎖はTacペプチドとして知られ約55kDのサイズである〔Leonard,W.ら、J.Biol.Chem. 260:1872(1985)参照、これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。このタンパク質をコードする遺伝子が単離されており、そして21アミノ酸のシグナルペプチドを含む272アミノ酸のペプチドを推定している〔Leonard, W.ら、Nature 311:626(1984)参照〕。p55
Tacタンパク質のN−末端の219アミノ酸は明らかに細胞外領域を含んで成る〔Leonard, W.ら、Science 230:633−639(1984)参照、これは参考として本明細書に組み込まれる〕。
【0005】
ヒトIL−2レセプターの構造と機能の解明のほとんどは、特異的反応性モノクローナル抗体の開発のためである。特に、抗−Tacとして知られるマウスモノクローナル抗体〔Uchiyamaら、J.Immunol.,126:1393(1981)〕は、IL−2レセプターがT細胞上だけでなく、単球−マクロファージ群、肝臓のクッパー細胞、皮膚のランゲルハンス細胞およびもちろん活性化されたT細胞上でも検出され得ることを示した。重要なことには、静止T細胞、B細胞または循環しているマクロファージは、典型的にはIL−2レセプターを提示しない〔Herrmannら、J.Exp.Med.162:1111(1985)〕。
【0006】
抗−Tacモノクローナル抗体は、IL−2相互作用を必要とするリンパ球機能を明らかにするためにも用いられており、そして細胞培養における細胞毒性およびサプレッサーTリンパ球の発生を含む様々なT細胞機能を抑制することが示されている。また、抗−Tacおよび他の抗体を用いた研究に基づき、様々な障害、特に成人T細胞白血病がT細胞による不適当なIL−2レセプター発現に関係づけられている。
【0007】
より最近になって、IL−2レセプターはT細胞介在性疾患に対する新規治療アプローチの理想的な標的であることが示された。IL−2レセプター特異的抗体、例えば抗−Tacモノクローナル抗体を単独でまたは免疫複合体(例えばリシンA鎖、同位体等との免疫複合体)として用いて、IL−2レセプターを有する細胞を効果的に除去できることが提唱されている。例えばそれらの薬剤は、理論上はIL−2レセプターを発現している白血病細胞、或る種のB細胞、または病気状態に関与する活性化されたT細胞を排除することができ、その上さらに必要とされる時には成熟正常T細胞およびそれらの前駆体の保持によって正常T細胞免疫応答を開始する能力を保証する。一般に、他のT細胞特異的薬剤の多くは本質的に全ての周辺のT細胞を破壊し得、このことは薬剤の治療効能を制限する。全体に、IL−2レセプターに特異的な適当なモノクローナル抗体の使用は、自己免疫疾患、器官移植および活性化されたT細胞による任意の望ましくない応答において療法的効用を有することができる。実際、例えば抗−Tac抗体を使って臨床試験が開始されている〔一般に、Waldman,T.ら、CancerRes. 45:625(1985)およびWaldman,T.,Science 232:727−732(1986)を参照のこと;これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0008】
不運にも、抗−Tacおよび他の非ヒトモノクローナル抗体の使用は、特に下記に説明されるような繰り返し治療摂生において、幾つかの欠点を有する。例えば、マウスモノクローナル抗体はヒト補体を十分に結合せず、そしてヒトにおいて使用すると他の重要な免疫グロブリン機能特性を欠く。
【0009】
おそらくより重要なのは、抗−Tacおよび他の非ヒトモノクローナル抗体が、ヒト患者に注入すると免疫原性となるであろう実質的長さのアミノ酸配列を含むことである。外来抗体の注入後、抗体に対して患者により惹起された免疫応答が非常に強力であり、最初の処置後の抗体の治療効用を本質的に排除しうることを多数の研究が示している。更に、様々な病気を処置するために増加する数の異なるマウスまたは他の抗原性(ヒトに対して)モノクローナル抗体が開発されることが期待され得るので、任意の異なる非ヒトモノクローナル抗体での第一または第二の処置後、無関係の治療のためでさえもその後の処置が無効または危険になり得る。
【0010】
いわゆる「キメラ抗体」(例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス可変領域)は幾らか好結果であることが判明したが、重要な免疫原性の問題が残っている。一般に、多数のヒト抗原と同じく、ヒトIL−2レセプターと反応するヒト免疫グロブリンの生産は、典型的なヒトモノクローナル抗体生産技術を使うことは非常に困難である。同様に、いわゆる「ヒト化された」抗体(例えばEPO公報No.0239400を参照のこと)を作製するために組換えDNA技術を使用することは、一部は予想不可能な結合親和性のためである不確かな結果を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
従って、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、さらに治療製剤および他の用途に適当である形態において容易に且つ経済的に生産される改良形のヒト化免疫グロブリン、例えばヒトIL−2レセプターに特異的なもの、に対する要求が存在する。本発明はそれらおよび他の要求を満たす。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、例えばT細胞により媒介されるヒト障害の処置において有用である新規組成物を提供し、該組成物は、IL−2レセプターへのヒトIL−2の結合を特異的に阻止することができそして/またはヒトIL−2レセプター上のp55 Tacタンパク質に結合することができるヒト化免疫グロブリンを含有する。該免疫グロブリンは、2対の軽鎖/重鎖複合体を有し、典型的には少なくとも1対がヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結されたマウス相補性決定領域を含んで成る鎖を有する。例えば、追加の天然由来のマウスアミノ酸残基を有するかまたは有しないマウス相補性決定領域を用いて、約108M−1よりも強力な親和力レベルにおいてヒトIL−2レセプターに結合することができるヒト化抗体を生産することができる。
【0013】
結合性断片または他の誘導体を包含する免疫グロブリンは、様々な組換えDNA技術により、トランスフェクトされた細胞、好ましくは不死化された真核細胞、例えばミエローマまたはハイブリドーマ細胞中での最大発現を使って生産することができる。ヒト様免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第一の配列と所望の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第二の配列を含んで成るポリヌクレオチドは、合成的にまたは適当なcDNAとゲノムDNAセグメントを結合することによって作製することができる。
【0014】
ヒト化免疫グロブリンは、実質的に純粋な形態で単独に、または細胞毒性物質、例えば放射性核種、リボソーム阻害タンパク質もしくは細胞表面において活性な細胞毒性物質と複合体化して、使用することができる。それらの化合物は全て、特にT細胞により媒介される障害を処置することにおいて有用であろう。ヒト化免疫グロブリンまたはそれらの複合体は、投与の形式に依存するであろう医薬上許容される剤形において調製することができる。
【0015】
本発明は、供与体免疫グロブリンからの1または複数の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域を有するヒト化免疫グロブリン鎖を設計するための新規方法も提供する。好ましい方法は、供与体免疫グロブリンのフレームワークまたは可変領域のアミノ酸配列をヒト免疫グロブリン鎖のコレクション中の対応する配列と比較し、そして該コレクションからより相同性の高い配列の1つをヒト免疫グロブリンとして選択することを含んで成る。ヒト免疫グロブリンまたは受容体免疫グロブリン配列は、典型的には少なくとも10〜20の免疫グロブリン鎖配列のコレクションから選択され、そして通常は該コレクション中のいずれかの配列の供与体免疫グロブリン配列に最も高い相同性を有するだろう。ヒト免疫グロブリンフレームワーク配列は、供与体免疫グロブリンフレームワーク配列に対して典型的には約65〜70%またはそれ以上の相同性を有するだろう。供与体免疫グロブリンは重鎖または軽鎖(または両方)のいずれであってもよく、そしてヒトコレクションは同じ種類の鎖を含有するだろう。ヒト化された軽鎖または重鎖を用いて、部分または全長のヒト定常領域および別のタンパク質を含むかまたは含まない、2対の軽鎖/重鎖を有する完全なヒト化免疫グロブリンまたは抗体を形成せしめることができる。
【0016】
本発明の別の態様によれば、上記の比較段階と共にまたは別々に、受容体免疫グロブリン中の追加のアミノ酸をCDR−供与体免疫グロブリン鎖からのアミノ酸と置き換えることができる。更に特定的には、供与体免疫グロブリンからのフレームワークアミノ酸による受容体免疫グロブリンのヒトフレームワークアミノ酸の更なる任意の置換は、次のような免疫グロブリン中の位置において行うことができる:
(a)受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中の該アミノ酸がその位置に稀であり、そして供与体免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン中のその位置に普通である;
(b)該アミノ酸がCDRの1つのすぐ近くである;または
(C)該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約3Å以内にあり、そしてヒト化免疫グロブリンのCDRまたは抗原と相互作用することができると予想される。
【0017】
ヒト化免疫グロブリン鎖は、典型的には、CDRに加えて供与体免疫グロブリンからの少なくとも約3アミノ酸を含んで成り、通常は少なくともその1つが供与体免疫グロブリン中のCDRのすぐ近くであろう。3つの位置基準のうちのいずれか1つまたは全部を使うことにより重鎖および軽鎖を各々設計することができる。
【0018】
完全な抗体に結合される時、本発明のヒト化された軽鎖および重鎖はヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、そして供与体免疫グロブリンと実質的に同じ抗原(例えばエピトープを含むタンパク質または他の化合物)への親和力を保持しているだろう。それらの親和力レベルは約108M−1以上から様々に異なることができ、そして抗原への供与体免疫グロブリンのもとの親和力の約4倍以内であろう。
【0019】
本願発明は、少なくとも108M−1の親和性で抗原に結合可能であり、かつヒト受容体免疫グロブリン軽鎖および重鎖由来のフレームワーク領域、および供与体グロブリン由来のKabatら(”Sequences ofProteins of Immunological Interest”, Kabat,E.ら、U.S.Department of Health andHuman Services,(1983))により定義される相補性決定領域(CDR)を有するヒト化免疫グロブリンの生産方法に関する。この方法は、受容体免疫グロブリンの少なくとも1つの非CDRフレームワークアミノ酸を供与体免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸と置換する工程を包含する。この置換は以下の位置で行われる:
(a)受容体免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置においてまれであり、そして供与体免疫グロブリンの対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン配列中のその位置において普通である、位置;または
(b)上記アミノ酸がヒト化免疫グロブリンの配列におけるCDRの1つの隣りである、位置;または
(c)上記アミノ酸が、ヒト化免疫グロブリンのCDRと相互作用し得る側鎖原子を有する、位置。
【0020】
ある実施態様では、上記置換は、重鎖の非CDR可変領域において行われる。
【0021】
ある実施態様では、上記抗原に対する上記ヒト化免疫グロブリンの親和性は、上記供与体免疫グロブリンの親和性の4倍以内である。
【0022】
本願発明はまた、上記の方法により得られるヒト化免疫グロブリンに関する。
【0023】
本願発明は、ヒト受容体免疫グロブリン由来の非CDRフレームワーク領域をコードする第1配列、および1つ以上のCDRをコードする第2配列を含むポリヌクレオチドに関する。上記ポリヌクレオチドは、上記免疫グロブリンに含まれる免疫グロブリン鎖をコードする。
【0024】
本願発明は、上記の単数ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドによりトランスフェクトされた細胞株に関する。
【0025】
本願発明は、上記ヒト化免疫グロブリンの調製方法に関する。上記方法は、上記細胞株を培養する工程およびこの細胞培養培地からヒト化免疫グロブリンを単離する工程を包含する。
【0026】
本願発明は、T細胞媒介障害の治療のための医薬組成物に関する。この医薬組成物は、医薬上許容される剤形で処方された上記ヒト化免疫グロブリンまたはそれらの結合性断片を含有する。
【発明の効果】
【0027】
本願発明により、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、さらに治療製剤および他の用途に適当である形態において容易に且つ経済的に生産される改良形のヒト化免疫グロブリンが得られ、さらにそれを用いる治療用医薬組成物が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0028】
本発明の一態様によれば、所望のエピトープ、例えばヒトT細胞上のIL−2レセプター上のエピトープ、と特異的に反応するヒト化免疫グロブリンが提供される。それらの免疫グロブリンは、少なくとも約108M−1、好ましくは109M−1〜1010M−1またはそれ以上の結合親和力を有し、例えばヒトIL−2レセプターへのIL−2の結合を阻止することができる。ヒト化免疫グロブリンは、ヒト様フレームワークを有し、そしてp55 Tacタンパク質上のエピトープと特異的に反応する免疫グロブリン、典型的にはマウス免疫グロブリンからの相補性決定領域(CDR)を有することができる。本発明の免疫グロブリンは、経済的に大量に生産することができ、例えば、種々の技術によるヒト患者におけるT細胞介在性障害の処置において、用途を見出す。
【0029】
基本的な抗体構造単位は4量体を含むことが知られている。各4量体は全く同じ2対のポリペプチド鎖から成り、各対は1本の「軽」(約25kD)鎖と1本の「重」(約50−70kD)鎖を有する。各鎖のNH2−末端は、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域で始まる。各鎖のCOOH−末端は、主にエフェクター機能を担う定常領域を限定する。
【0030】
軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α,δまたはεとして分類(および細分類)され、そしてそれぞれ IgG,IgM,IgA,IgDおよびIgE として抗体のイソタイプを限定する。軽鎖および重鎖中の可変および定常領域は、約12またはそれより多数のアミノ酸の“J”領域により連結され、重鎖は約12またはそれより多数のアミノ酸の“D”領域も含む〔一般に、Fundamental Immunology, Paul, W.編、第7章、第131−166頁、RavenPress, N.Y.(1984)を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0031】
各軽鎖/重鎖対の可変領域は抗原結合部位を形成する。鎖は全て、3つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域という同じ一般構造を示す〔“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”, Kabat,E..ら、U.S.Department of Health and Human Services, (1983);並びにChothiaおよびLesk, J.Mol.Biol., 196:901−917(1987)を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。KabatらおよびChothiaらにより定義されるこれらのCDRの位置は、例えばKabatらにより提供されるような、免疫グロブリン配列についての一貫した番号付けスキームを用いれば、同一の番号によって定義され得る。従って、当業者は、個々の免疫グロブリンのCDRの位置を容易に特定することができる。各対の二本鎖からのCDRは、フレームワーク領域によって整列され、特異的エピトープヘの結合を可能にする。
【0032】
本明細書中で使用する「免疫グロブリン」なる用語は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる1または複数のポリペプチドから成るタンパク質について呼称する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ,λ,α,γ,δ,εおよびμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。免疫グロブリンは抗体の他に様々な形態で存在することができ、例えば、Fv,FabおよびF(ab)2並びに一本鎖を包含する〔例えば、Hustonら、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A., 85:5879−5883(1988)およびBirdら、Science,242:423−426(1988)。これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。〔一般に、Hoodら、“Immunology”,Benjamin, N.Y.,第2版(1984);並びにHunkapillerおよびHood,Nature,323:15−16(1986)を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0033】
キメラ抗体は、典型的には遺伝子操作によって軽鎖および重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから作製されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変(V)セグメントをヒト定常(C)セグメント、例えばγ1およびγ3に結合することができる。典型的な療法用キメラ抗体はマウス抗体からのVまたは抗原結合領域とヒト抗体からのCまたはエフェクター領域とから成るハイブリッドタンパク質である(例えば、A.T.C.C.登録番号CRL 9688は抗−Tacキメラ抗体を分泌する)が、他の哺乳動物種を使用することもできる。
【0034】
本明細書中で使用する「フレームワーク領域」なる用語は、Kabatら、前掲により定義されたように、単一種において異なる免疫グロブリン間で比較的保存される免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域の部分について呼称する。本明細書中で使用する「ヒト様フレームワーク領域」なる用語は、各々存在する鎖においてヒト免疫グロブリン中のものと等しい少なくとも約70またはそれ以上のアミノ酸残基、典型的には75〜85またはそれ以上のアミノ酸残基を含んで成るフレームワーク領域である。
【0035】
本明細書中で使用する「ヒト化免疫グロブリン」なる用語は、ヒト様フレームワーク領域を含んで成る免疫グロブリンについて言及し、この場合、存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に相同であり、即ち少なくとも約85〜90%、好ましくは約95%が同一である。よって、おそらくCDRを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分が、1または複数の生来のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に相同である。例えば、ヒト化免疫グロブリンはマウス可変領域/ヒト定常領域キメラ抗体を包含しないだろう。
【0036】
本発明の別の一般的観点によれば、ヒト化された免疫グロブリン鎖を含んで成る抗体の親和力を増加させるために、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の限定された数のアミノ酸が受容体Igよりもむしろ供与体Ig中のそれらの位置のアミノ酸と同じであるように選択される基準も含まれる。
【0037】
本発明のこの観点は、(例としてCDRの入手源としてマウス抗体を使って)ヒト化抗体を生産する従来方法における親和力の低下の2つの原因が、下記のためであるというモデルに基づく:
(1)マウスCDRをヒトフレームワークと結合する時、CDRに密接したフレームワーク中のアミノ酸がマウスの代わりにヒトになる。理論に結び付けようとせずに、本発明者らは、それらの変更されたアミノ酸が供与体マウス抗体中とは異なる静電的または疎水的力を生じるため、それらがわずかにCDRを歪め、そして歪められたCDRは供与抗体中のCDRが行うのと同じくらい効果的な抗原との接触を行うことができないと考える;
(2)また、CDRに密接しているがその一部ではない(即ちまだフレームワークの一部である)元のマウス抗体中のアミノ酸は、親和力の原因である抗原との接触を行うことができる。全てのフレームワークアミノ酸がヒトにされるので、抗体がヒト化される時にそれらのアミノ酸は失われる。
【0038】
それらの問題を回避するため、および所望の抗原に対し非常に強力な親和力を有するヒト化抗体を生産するために、本発明はヒト化免疫グロブリンを設計するのに次の4つの基準を使用する。それらの基準を単独でまたは必要な時は組み合わせて使用し、所望の親和力または他の特徴を獲得することができる。
【0039】
基準I:受容体として、ヒト化しようとする供与体免疫グロブリンに非常に相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用するか、または多数のヒト抗体からの共通のフレームワークを使用すること。ここで、用語「多数の」とは、「少なくとも約10〜20の」を意味する。例えば、データバンク(例えばNational Biomedical Research FoundationProtein Identification Resource)中のヒト重鎖(軽鎖)可変領域に対するマウス重鎖(軽鎖)可変領域の配列の比較は、異なるヒト領域に対する相同性の程度が典型的には約40%から約60−70%まで大幅に異なることを示す。受容体免疫グロブリンとして、供与体免疫グロブリンの重鎖(それぞれ軽鎖)に最も相同であるヒト重鎖(それぞれ軽鎖)の1つを選択することにより、供与体免疫グロブリンから受容体免疫グロブリンに移る際にほとんどアミノ酸が変化しないであろう。よって、ヒト化免疫グロブリン鎖を含んで成るヒト化抗体の正確な全形状が供与抗体の形状と非常によく似ており、CDRを歪める見込みを減らすことができる。
【0040】
典型的には、重鎖フレームワークを提供するために、少なくとも約10〜20の別個のヒト重鎖の代表的コレクションの中の3〜5の最も相同な重鎖可変領域配列のうちの1つが受容体として選択され、軽鎖についても同様にして選択されるだろう。好ましくは、1〜3の最も相同な領域のうちの1つが使用されるだろう。選択された受容体免疫グロブリン鎖は、供与体免疫グロブリンに対してフレームワーク領域内が最も好ましくは少なくとも約65%の相同性を有するだろう。
【0041】
いかにして受容体免疫グロブリンを選択するかにかかわらず、受容体よりもむしろ供与体中のそれらの位置のアミノ酸と同じになるようにヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の少数のアミノ酸を選択することによって、より高い親和力を獲得することができる。好ましくは、それらの基準の1つを満足するほとんどまたは全てのアミノ酸位置において、供与体アミノ酸が実際に選択されるだろう。
【0042】
基準II:ヒト受容体免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が、普通でない〔即ち「まれである」;本明細書中で使用されるこの用語「まれである」とは、代表的なデータバンク中のヒト重鎖(それぞれ軽鎖)V領域配列の10%以下しかその位置に存在しないアミノ酸を示す〕場合、またはその位置の供与体アミノ酸がヒト配列に典型的である〔即ち「普通である」;本明細書中で使用されるこの用語「普通である」とは、代表的なデータバンク中の25%以上の配列に存在するアミノ酸を示す〕場合、受容体よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう。この基準は、ヒトフレームワーク中の普通でないアミノ酸が抗体構造を破壊しないことを保証するのに役立つ。更に、普通でないアミノ酸をたまたまヒト抗体に典型的である供与抗体からのアミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体を低免疫原性にすることができる。
【0043】
基準III:ヒト化免疫グロブリン鎖中の3つのCDRのすぐ近くの位置において、受容体アミノ酸よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう。それらのアミノ酸は、おそらく特にCDR中のアミノ酸と相互作用し、もし受容体から選択されれば供与体CDRを破壊しそして親和力を低下させるであろう。更に、近隣のアミノ酸は抗原と直接相互作用し〔Amitら、Science, 233,747−753(1986)、これは参考として本明細書中に組み込まれる〕、供与体からそれらのアミノ酸を選択することは元の抗体における親和力を提供する全ての抗原接触を維持するのに望ましいかもしれない。
【0044】
基準IV:典型的には元の供与抗体の3次元モデルは、CDRの外側の幾つかのアミノ酸がCDRに密接しておりそして水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用等によりCDR中のアミノ酸と相互作用する相当な確率を有することを示す。それらのアミノ酸位置では、受容体免疫グロブリンアミノ酸よりもむしろ供与体アミノ酸が選択され得る。この基準に従ったアミノ酸は、通常はCDR中の或る部位の約3Å単位内に側鎖原子を有し、そして確立された化学的力、例えば上記に列挙した力に従ってCDR原子と相互作用することができるような原子を含まなければならない。抗体などのタンパク質のモデルを作成するためのコンピュータープログラムが一般に利用可能であり、そして当業者に周知である〔Loewら、Int.J.Quant.Chem., Quant.Biol.Symp.,15:55−66(1988);Bruccoleriら、Science,233:755−758(1986)を参照のこと。これら全てが参考として本明細書中に組み込まれる〕。それらは本発明の部分を構成しない。実際、全ての抗体が類似の構造を有するので、Brookhaven Protein DataBankから入手可能である既知の抗体を必要であれば別の抗体の荒モデルとして利用することができる。商業的に入手可能であるコンピュータープログラムを用いてコンピューター画面にそれらのモデルを表示し、原子間の距離を算出し、そして種々のアミノ酸相互作用の可能性を評価することができる。
【0045】
ヒト化抗体は、ヒト療法において使用されるマウス抗体または或る場合にはキメラ抗体を上回る少なくとも3つの潜在的利点を有する:
1)エフェクター部分がヒトであるため、ヒト免疫系のその他の部分と良好に反応することができる〔例えば、補体依存性細胞障害作用(CDC)または抗体依存性細胞障害作用(ADCC)により、より効果的に標的細胞を破壊する〕。◇
2)ヒト免疫系は外来物としてヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を認識しないであろう。従ってそのような注入抗体に対する抗体応答は全体的に外来のマウス抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対するよりも小さいであろう。◇
3)注入されたマウス抗体は、通常の抗体の半減期よりもずっと短いヒト循環中の半減期を有することが報告されている〔D.Shawら、J.Immuol.,138:4534−4538(1987)〕。注入されたヒト化抗体は、おそらく天然のヒト抗体により類似した半減期を有し、より少量または少頻度の用量を与えることを可能にするだろう。
【0046】
本発明は、EPA公報No.0239400に記載されたものに関して改善されたヒト化免疫グロブリン(例えば、ヒトIL−2レセプターに結合することができる)に特に向けられる。その出願明細書(その開示は本発明の範囲から除去される)は、或る種の免疫グロブリンについて、受容体抗体の軽鎖または重鎖可変領域中のCDR領域を異なる特異性の抗体からのCDRの類似部分(典型的には溶媒の影響を受けやすい部分)で置換することを記載している。また、その出願明細書は、或る種の免疫グロブリンについて、抗原結合部位から(溶媒に)影響されやすい残基を単に移動する可能性を記載しており、この残基は明らかに幾つかのフレームワーク領域を含むことができる〔特に、Amitら、Science,233:747−753(1986)に記載されたような抗原結合に関与することが既知である残基、またはおそらく鎖間相互作用に必須である残基−ただしそれらの選択については該出願明細書において不十分な指針しか与えられていない〕。例えば、本発明の好ましい態様は、全CDRアミノ酸およびCDRの1つ(または好ましくは各々)のすぐ近くのフレームワークアミノ酸を置換することを伴う。一般に、例えばコンホメーション(および普通はそれらの抗原結合特異性)を維持するためにCDRと連絡をとる任意のフレームワーク残基が、上記に詳細に記載された本発明の好ましい態様の範囲内に特に含まれる。
【0047】
1つの観点において、本発明は、所望のエピトープ、例えばヒトIL−2レセプター上のエピトープ、に結合することができる免疫グロブリン(例えば抗−Tac モノクローナル抗体)からの重鎖および/または軽鎖CDR(典型的には上述したような別のアミノ酸残基を有する)をコードする組換えDNAセグメントに向けられる。それらの領域をコードするDNAセグメントは、典型的にはヒト様フレームワーク領域をコードするDNAセグメントに結合されるだろう。例えば、発現時に抗−Tac重鎖および軽鎖超可変領域(ヒト様フレームワーク領域と共に)を含んで成るポリペプチド鎖をコードする好ましいDNA配列がそれぞれ図3と図4に示されている。コドン縮重および重要でないアミノ酸置換のため、後述するようにそれらの配列の代わりに他の配列を容易に用いることができる。
【0048】
前記DNAセグメントは、典型的には、ヒト化抗体のコード配列に作用可能に連結した発現調節DNA配列、例えば天然由来のまたは異種のプロモー夕ー領域、を更に含むだろう。好ましくは発現調節配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションせしめることができるベクター中の真核生物プロモーター系であろうが、原核生物宿主用の調節配列を用いることができる。ベクターが適当な宿主中に組み込まれれば、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適当な条件下で維持され、そして所望する時、軽鎖、重鎖、軽鎖/重鎖二量体もしくは完全な抗体、結合性断片または他の免疫グロブリン形態の収得および精製を行うことができる。
【0049】
ヒト定常領域DNA配列は、周知の方法に従って、種々のヒト細胞から、好ましくは不死化されたB細胞から単離することができる(Kabat、前掲およびWP 87/02671を参照のこと)。例えば、ヒトκ免疫グロブリン定常およびJ領域遺伝子および配列はHeiterら、Cell 22:197−207(1980)中に記載されており、そしてヒト免疫グロブリンCγ1遺伝子のヌクレオチド配列はEllisonら、Nucl.Acid Res. 10:4071(1982)中に記載されている(その両者は参考として本明細書中に組み込まれる)。本発明の免疫グロブリンを作製するためのCDRは、所望の抗原(例えばヒトIL−2レセプター)に結合することができるモノクローナル抗体から同様にして誘導され、そしてマウス、ラット、ウサギまたは抗体を生産することができる他の脊椎動物を含む任意の便利な哺乳動物起源において生産されるだろう。DNA配列の適当な起源細胞並びに免疫グロブリンの発現および分泌のための宿主細胞は、多数の入手源、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手することができる〔”Catalogue of CellLines and Hybridomas”、第5版(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0050】
本明細書中に特定的に記載のヒト化免疫グロブリンに加えて、他の「実質的に相同の」変更免疫グロブリンを容易に設計することができ、そして当業者に周知の様々な組換えDNA技術を使って製造することができる。例えば、IL−2レセプター免疫グロブリンについては、フレームワーク領域は幾つかのアミノ酸置換、末端および中間の付加および削除等により一次構造レベルで図3および図4の配列と異なることができる。更に、本発明のヒト化免疫グロブリンを基準として、種々の異なるヒトフレームワーク領域を単独でまたは組合せて用いることができる。一般に、遺伝子の修飾は種々の周知の技術、例えば部位特異的突然変異誘発〔Gillmanおよび Smith, Gene 8:81−97(1979)並びにRobertsら、Nature 328:731−734(1987)を参照のこと;この両者は参考として本明細書中に組み込まれる〕により容易に達成することができる。あるいは、一次抗体構造の一部分のみを含んで成るポリペプチド断片を製造することができ、この断片は1または複数の免疫グロブリン活性(例えば補体結合活性)を有する。また多数の遺伝子と同様、免疫グロブリン関連遺伝子は、各々が1または複数の別個の生物活性を有する別々の機能性領域を含むため、該遺伝子を別の遺伝子からの機能性領域(例えば酵素;1987年12月15日提出の一般譲渡されたU.S.S.N.132,387を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる)と融合させ、新規性質を有する融合タンパク質(例えば免疫毒素)を製造することができる。
【0051】
最終的に所望のヒト化抗体を発現することができる本発明の核酸配列は、様々な異なるポリヌクレオチド(ゲノムDNAまたはcDNA、RNA、合成オリゴヌクレオチド等)および成分(例えばV,J,DおよびC領域)から、そして様々な異なる技術により、形成せしめることができる。適当なゲノム配列を連結することが現在最も一般的な製造方法であるが、cDNA配列を使用してもよい〔ヨーロッパ特許公報No.0239400およびReichman,L.ら、Nature332:323−327(1987)を参照のこと。この両者は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0052】
前に述べたように、該DNA配列を発現調節配列に作用可能に連結した(即ち、機能を保証するように配置させた)後で該配列が宿主中で発現されるだろう。それらの発現ベクターは、典型的にはエピソームとしてまたは宿主染色体DNAの組込み部分として宿主中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のDNA配列により形質転換された細胞の検出を可能にするために選択マーカー、例えばテトラサイクリンまたはネオマイシン耐性遺伝子を含むだろう(例えば、米国特許第4,704,362号を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0053】
大腸菌(E. coli)は本発明のDNA配列をクローニングするのに特に有用な原核生物宿主である。使用に適当な他の微生物宿主としては、バシラス菌、例えばバシラス・サブチリス(Bacillus subtilis)、並びに他の腸内細菌、例えばサルモネラ菌(Salmonella)、セラチア菌(Serratia)および種々のシュードモナス菌(Pseudomonas)種が挙げられる。それらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合性である発現調節配列(例えば複製開始点)を含むであろう発現ベクターを作製することもできる。加えて、任意の数の種々の周知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージからのプロモーター系が存在するだろう。プロモーターは、典型的には所望によりオペレーター配列と共に発現を調節し、そして転写および翻訳を開始および終了させるためのリボソーム結合部位等を有するだろう。
【0054】
他の微生物、例えば酵母を発現に用いることもできる。サッカロミセス(Saccharomyces)は好ましい宿主であり、適当なベクターは、発現調節配列、例えば3−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖酵素プロモーターを包含するプロモーター、並びに所望により複製開始点、終結配列等を有する。
【0055】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養物を用いて本発明のポリペプチドを発現および生産せしめることもできる〔Winnacker,“From Genes toClones”、VCH Publishers, N.Y.,N.Y.(1987)を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。完全な免疫グロブリンを分泌することができる多数の適当な宿主細胞系が技術の現状において開発されているため実際は真核細胞が好ましい。そのような真核細胞としては、CHO細胞系、種々のCOS細胞系、HeLa細胞、ミエローマ細胞系等が挙げられるが、好ましくは形質転換されたB細胞またはハイブリドーマである。それらの細胞のための発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製開始点、プロモーター、エンハンサー〔Queen,C.ら、Immunol.Rev.89:49−68(1986);これは参考として本明細書中に組み込まれる〕、および必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列を含むことができる。好ましい発現調節配列は、エンハンサーを有するSV40〔MulliganおよびBerg,Science 209:1422−1427(1980)を参照のこと〕、免疫グロブリン遺伝子、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス等に由来するプロモーターである。
【0056】
着目のDNAセグメント(例えば、重鎖および軽鎖コード配列並びに発現調節配列)を含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存して異なる周知の方法により、宿主細胞中に移すことができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクション法が常用され、一方他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る〔一般には、Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press(1982)を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0057】
一度発現されれば、本発明の完全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を当業界の標準法、例えば硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等に従って精製することができる〔一般的には、Scopes,R.、ProteinPurification,Springer−Verlag,N.Y.(1982)を参照のこと〕。少なくとも約90〜95%均質の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、98〜99%またはそれ以上の均質が医薬用途に好ましい。部分的にまたは所望の時には均質まで精製されれば、療法的に(体外的を含む)またはアッセイ方法、免疫蛍光染色法等を開発しそして実施する際に該ポリペプチドを使用することができる〔一般的には、Immunological Methods、第IおよびII巻、LefkovitsおよびPernis編、AcademicPress,New York,N.Y.(1979および1981)を参照のこと〕。
【0058】
本発明において例示されるIL−2レセプター特異抗体は、典型的にはT細胞介在性の病気状態を処置することにおいて個々に用いられるだろう。通常、病気に関連する細胞がIL−2レセプターを有すると同定された場合、ヒトIL−2レセプターへのIL−2の結合を阻止することができるヒト化抗体が適当である(”Treating Human Malignancies andDisorders”と題するU.S.S.N.085,707を参照のこと;これは参考として本明細書中に組み込まれる)。例えば、処置に適する典型的な病気状態として、器官移植、例えば心臓、肺、腎臓、肝臓等の移植を行う患者における移植拒絶反応および対宿主性移植片病が挙げられる。他の病気としては、自己免疫疾患、例えばI型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡および重症筋無力症が挙げられる。
【0059】
本発明のヒト化抗体は、別の抗体、特に病気の一因となる細胞上の別のマーカーと反応するヒトモノクローナル抗体と組合せて使用することもできる。例えば、適当なT細胞マーカーとしては、第一回国際白血球分化ワークショップ(First International Leukocyte Differentiation Workshop)、LeukocyteTyping,Bernardら編、Springer−Verlag,N.Y.(1984)(これは参考として本明細書中に組み込まれる)により命名されたいわゆる「分化のクラスター(Clusters of Differentiation)」中に分類されるものを挙げることができる。
【0060】
該抗体は、化学療法剤または免疫抑制剤と共に与えられる別々に投与される組成物として使用することができる。典型的には、そのような薬剤としては、シクロスポリンAまたはプリン類似体(例えばメトトレキセート、6−メルカプトプリン等)が挙げられるだろうが、当業者に周知である多数の他の薬剤(例えばシクロホスファミド、プレドニソン等)も使用することができる。
【0061】
本発明の好ましい医薬組成物は、免疫毒素における当該抗体の使用を含んで成る。免疫毒素は2つの成分により特徴づけられ、そして試験管内または生体内において選択細胞を殺すのに特に有用である。第一成分は、付着または吸収すると細胞に対して通常は致命的である細胞毒性物質である。「デリバリー賦形剤」として知られる第二成分は、毒性物質を特定の細胞タイプ、例えばガンを含む細胞に供給するための手段を提供する。この2成分は通常は様々な周知の化学的方法のいずれかによって一緒に化学的に結合される。例えば、細胞毒性物質がタンパク質でありそして第二成分が完全な免疫グロブリンである時、結合は異種二価性架橋剤、例えばSPDP、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等によることができる。種々の免疫毒素の製造が当業界で周知であり、例えば“Monoclonal Antibody−Toxin Conjugates:Aiming the Magic Bullet”、Thorpeら、Monoclonal Antibodies in Clitical Medicine,Academic Press,168−190(1982)中に見つけることができる。これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【0062】
様々な細胞毒性物質が免疫毒素における使用に適当である。細胞毒性物質としては、放射性核種、例えばヨウ素−131、イットリウム−90、レニウム−188およびビスマス−212;多数の化学療法剤、例えばビンデシン、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびシスプラチン;並びに細胞毒性タンパク質、例えば、リボソーム阻害タンパク質様アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、シュードモナス外毒素A、リシン、ジフテリア毒素、リシンA鎖等;または細胞表面で活性な物質、例えばホスホリパーゼ酵素(例えばホスホリパーゼC)を挙げることができる。〔1988年12月28日に提出された一般譲渡されたU.S.S.N.07/290,968;“Chimeric Toxins”、OlsnesおよびPhil,Parmac.Ther., 25:355−381(1982);並びに“Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy”、BaldwinおよびByers編、159−179,224−266頁、Academic Press(1985)を参照のこと。これら全てが参考として本明細書中に組み込まれる〕。
【0063】
免疫毒素のデリバリー成分は、本発明のヒト化免疫グロブリンを含むだろう。好ましくは完全な免疫グロブリンまたはそれらの結合性断片、例えばFabが使用される。典型的には、免疫毒素中の抗体はヒト IgMまたはIgG イソタイプのものであるだろう。しかし所望の時には他の哺乳動物定常領域を用いることもできる。
【0064】
本発明のヒト化抗体およびそれの医薬組成物は、特に非経口、即ち皮下、筋肉内または静脈内投与に有用である。非経口投与用組成物は、通常、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された抗体の溶液または混合物を含んで成るだろう。様々な水性担体、例えば水、緩衝化された水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等を使用することができる。それらの溶液は無菌であり、通常は粒状物質を含まない。それらの組成物は、常用される周知の滅菌技術により滅菌することができる。該組成物は、適切な生理的条件に必要である時は医薬上許容される補助物質、例えばpH調整剤および緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有することができる。それらの組成物中の抗体の濃度は広範囲に渡り異なることができ、即ち、少なくとも約0.5%未満から、通常は少なくとも約1%から、15〜20重量%ほどまでに及ぶことができ、そして液体の体積、粘度等に主として基づいて、選択された特定の投与形式に従って選択されるだろう。
【0065】
筋肉内注射用の典型的医薬組成物は、1mlの無菌緩衝液と50mgの抗体を含むように調製することができる。静脈点滴注入用の典型的医薬組成物は、250mlの無菌リンガー液と150mgの抗体を含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は当業者に既知であるかまたは明白であり、そして例えばRemington’s Pharmaceutical Science、第15版、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1980)中に詳細に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【0066】
本発明の抗体は貯蔵のために凍結乾燥することができ、そして使用前に適当な担体中で再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリンに関して効果的であることが示されており、当業界で既知の凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。凍結乾燥と再構成は様々な程度の抗体活性の低下をもたらし得ること(例えば従来の免疫グロブリンでは、IgM抗体は IgG抗体よりも大きな活性低下を有する傾向がある)、そして使用レベルを調整して埋め合わせなければならないことがあることは、当業者により明白であろう。
【0067】
本発明のヒト化抗体またはそれの混合物を含有する組成物は、予防および/または治療処置のために投与することができる。治療用途においては、組成物は、既に病気にかかっている患者に、病気を治癒するかまたは少なくとも部分的に緩和するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は「治療的有効量」と定義される。この用途に有効な量は、感染の重度および患者自身の免疫系の一般状態に依存するであろう。しかし通常は、用量あたり約1〜約200mgの抗体、より好ましくは患者あたり5〜25mgの用量が使用されるだろう。本発明の材料は通常は深刻な病気状態、即ち命にかかわるかまたはもしかすると命にかかわる状況において使用されるだろうことを念頭に置かなげればならない。そのような場合、本発明のヒト化抗体により達成される外来性物質の最小化および「外来物質」拒絶の低確率の点からみて、実質的過剰量の抗体を投与することが可能でありそして治療医により望ましいと感じられるかもしれない。
【0068】
予防用途においては、本発明の抗体またはそれの混合物を含有する組成物は、患者の抵抗性を高めるためにまだ病気状態でない患者に投与される。そのような量は「予防的有効量」として定義される。この用途の場合、正確な量は患者の健康状態および免疫の一般レベルに依存するが、通常は用量あたり0.1〜25mg、特に患者あたり0.5〜2.5mgであろう。好ましい予防用途は、腎臓移植拒絶の防止である。
【0069】
本発明のヒト化抗体は、更に試験管内において広範な用途を見い出すことができる。一例として、T細胞の型決定、特異的IL−2レセプターを有する細胞または該レセプターの断片の単離、ワクチンの調製等に模範的な抗体を利用することができる。
【0070】
診断目的に、抗体を標識してもよくまたは未標識であってもよい。未標識抗体は、ヒト化抗体と反応性である別の標識抗体(二次抗体)、例えばヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体と組合せて使用することができる。あるいは抗体を直接標識してもよい。様々な標識、例えば放射性核種、蛍光団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガンド(特にハプテン)、等を使用することができる。多数の型式のイムノアッセイが利用可能であり、そして当業者に周知である。
【0071】
細胞活性に対する保護もしくは検出または選択された抗原の存在の検出において問題の抗体を使用するためにキットを供給することもできる。本発明の問題の抗体組成物は、単独でまたは所望の細胞タイプに特異的な追加の抗体と共に、普通は1つの容器に凍結乾燥形態で提供することができる。抗体は標識もしくは毒素と接合されていても未接合であってもよく、緩衝液、例えばTris、リン酸塩、炭酸塩等の緩衝液、安定剤、殺菌剤、不活性タンパク質、例えば血清アルブミン等、および使用説明書のセットと共にキット中に含まれる。一般にそれらの材料は活性抗体の量を基にして約5重量%未満、通常は抗体濃度を基にして少なくとも約0.001重量%の合計量において存在するだろう。しばしは、活性成分を希釈するための不活性増量剤または賦形剤を含めることが望ましく、この場合賦形剤は全組成の約1〜99重量%で存在することができる。キメラ抗体を結合することができる二次抗体をアッセイにおいて使用することができ、これは通常は別の容器中に存在するだろう。二次抗体は典型的には標識と接合され、上述の抗体製剤と同様にして製剤化される。
【0072】
次の実施例は例示の目的で与えられ、限定のためではない。
【実施例】
【0073】
(実験)
<ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の設計>
ヒト化抗体のフレームワークを提供するためにヒト抗体Euの配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat,E.ら、U.S.Dept.of Health and Human Services,1983)を使用した。というのは、抗−Tacの重鎖のアミノ酸配列がNational Biomedical FoundationProtein Identification Resource 中の他のいずれの重鎖配列よりもこの抗体の重鎖に相同性が高かったためである。
【0074】
ヒト化重鎖の配列を選択するために、抗−Tac重鎖配列(一般譲渡されたU.S.S.N.の186,862と223,037を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる)をEu重鎖配列と整列した(図1)。各位置において、その位置が次のカテゴリーのいずれか1つに入らない限り、Euアミノ酸をヒト化配列のために選択した。次のカテゴリーのいずれか1つに入る場合、抗−Tacアミノ酸を選択した。◇
(1)その位置が、Kabatら、前掲により定義されたような相補性決定領域(CDR)中にある(アミノ酸31−35,50−66,99−106);
(2)その位置ではEuアミノ酸がヒト重鎖配列にまれであり、一方抗−Tacアミノ酸がその位置でヒト重鎖配列に典型的であった(アミノ酸27,93,95,98,107−109,111);
(3)その位置が抗−Tac重鎖のアミノ酸配列中のCDRのすぐ近くであった(アミノ酸30と67);
(4)抗−Tac抗体の3次元モデルが、該アミノ酸が抗原結合部位に物理的に密接していることを示唆した(アミノ酸48と68)。
【0075】
幾つかのアミノ酸はそれらのカテゴリーのうちの複数に入るが、それらは1つのカテゴリーにのみ挙げてある。
【0076】
ヒト化軽鎖の配列を選択するために、抗−Tac軽鎖配列をEu軽鎖の配列と整列させた(図2)。その位置が同じくカテゴリー(1)〜(4)のうちの1つに入らない限り、Euアミノ酸を各位置において選択した(カテゴリー定義中の重鎖を軽鎖で置き換える):
(1)CDR(アミノ酸24−34,50−56,89−97)。◇
(2)Euよりも抗−Tacアミノ酸がより典型的である(アミノ酸48と63)。◇
(3)CDRに近い(アミノ酸なし;Euと抗−Tacはそれらの位置全てにおいて既に同じであった)。◇
(4)結合領域に3次元的に近接している可能性(アミノ酸60)。
【0077】
重鎖(図3)と軽鎖(図4)の実際のヌクレオチド配列は次のようにして選択した。
【0078】
(1)該ヌクレオチド配列は上述のようにして選択したアミノ酸配列をコードする。
【0079】
(2)それらのコード配列の5’側のヌクレオチド配列はリーダー(シグナル)配列、即ち MOPC 63抗体の軽鎖のリーダーおよびPCH 108A抗体の重鎖のリーダー(Kabatら、前掲)をコードする。それらのリーダー配列を抗体の典型として選択した。
【0080】
(3)コード配列の3’側のヌクレオチド配列は、抗−Tac配列の一部分であるマウス軽鎖J5セグメントおよびマウス重鎖J5セグメントに従う配列である。それらの配列はスプライス供与配列を含有するために含まれる。
【0081】
(4)配列の各末端には、Xba I部位での切断およびベクターの Xba I部位へのクローニングを可能にするための Xba I部位が存在する。
【0082】
<ヒト化軽鎖および重鎖遺伝子の作製>
重鎖を合成するために、Applies Biosystems 380B DNA合成装置を使って4つのオリゴヌクレオチド HES12,HES13,HES14,HES15(図5A)を合成した。それらのオリゴヌクレオチドの2つは、重鎖の各鎖の一部であり、そして各オリゴヌクレオチドはアニーリングを可能にするために約20ヌクレオチドが次のヌクレオチドとオーバーラップしている(図5B)。該オリゴヌクレオチドは一緒にすると、Xba I部位での切断を可能にするために各末端に幾つかの余分なヌクレオチドを有する完全なヒト化重鎖をカバーする。該オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製した。
【0083】
各オリゴヌクレオチドを、標準手順(Maniatis、前掲を参照のこと)によりATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化した。リン酸化したオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、それらを各々約3.75μMの濃度において40μlのTA(33mM Tris酢酸塩、pH7.9, 66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム)中に一緒に懸濁し、4分間95℃に加熱し、そして4℃にゆっくり冷却した。各オリゴヌクレオチドの反対鎖を合成することにより該オリゴヌクレオチドから完全な遺伝子を合成するために(図5B)、次の成分を100μlの最終容量において添加した:
10μl アニールしたオリゴヌクレオチド
各0.16mM デオキシリボヌクレオチド
0.5mM ATP
0.5mM DTT
100μg/ml BSA
3.5μg/ml T4 g43タンパク質(DNAポリメラーゼ)
25μg/ml T4 g44/62タンパク質
(ポリメラーゼ補助タンパク質)
25μg/ml 45タンパク質(ポリメラーゼ補助タンパク質)
【0084】
この混合物を37℃で30分間インキュベートした。次いで10uのT4 DNAリガーゼを添加し、そして37℃で30分間インキュベートした。70℃で15分間反応液をインキュベートすることにより、ポリメラーゼとリガーゼを不活性化した。遺伝子をXba Iで消化するために、反応液に200μg/mlのBSAと1mMのDTTを含む50μlの2×TA、43μlの水、および5μl中の50uの Xba Iを添加した。反応液を37℃で3時間インキュベートし、そしてゲル上で泳動した。ゲルから431bpの Xba I断片を精製し、そして標準法によりプラスミドpUC19の Xba I部位中にクローニングした。4つのプラスミド単離物を精製し、ジデオキシ法を使って配列決定した。そのうちの1つが正しい配列を有した(図3)。
【0085】
軽鎖を合成するために、4つのオリゴヌクレオチドJFD1,JFD2,JFD3,JFD4(図6A)を合成した。それらのオリゴヌクレオチドの2つは、軽鎖の各鎖の一部であり、そして各オリゴヌクレオチドはアニーリングを可能にするために約20ヌクレオチドが次のヌクレオチドとオーバーラップしている(図6B)。該オリゴヌクレオチドは一緒にすると、Xba I部位での切断を可能にするために各末端に幾つかの余分なヌクレオチドを有する完全なヒト化軽鎖をカバーする。該オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルから精製した。
【0086】
軽鎖遺伝子はそれらのオリゴヌクレオチドから2部分において合成した。JFD1とJFD2各々0.5μgを20μlのシークエナーゼ緩衝液(40mM Tris−HCl,pH7.5,20mM塩化マグネシウム、50mM塩化ナトリウム)中に混合し、70℃に3分間加熱し、そして該オリゴヌクレオチドをアニーリングさせるためにゆっくりと23℃まで放冷した。JFD3とJFD4も同様にして処理した。各反応液をDTT 10mMおよび各デオキシヌクレオチド0.5mMにし、6.5uのシークエナーゼ(USBiochemicals)を最終容量24μlにおいて添加し、そして37℃で1時間インキュベートして該ヌクレオチドの反応方向鎖を合成した。各反応液にXba IとHindIIIを添加してDNAを消化した(JFD2とJFD3がオーバーラップする領域の中、従って合成されたDNAの各々の中にHindIII部位が存在する;図6B)。反応液をポリアクリルアミドゲル上で泳動し、Xba I−HindIII断片を精製し、そして標準法によりpUC18中にクローニングした。各断片について数個のプラスミド単離物をジデオキシ法により配列決定し、そして正しいものを選択した。
【0087】
<ヒト化軽鎖および重鎖を発現させるためのプラスミドの作製>
重鎖Xba I断片が挿入されているpUC19プラスミドから該断片を単離し、そして標準法により正しい方向においてベクターpVγ1(一般に譲渡されたU.S.S.N223,037を参照のこと)のXba I部位に挿入し、プラスミドpHuGTAC1(図7)を作製した。このプラスミドは、適当な宿主細胞中にトランスフェクトすると高レベルの完全重鎖を発現するだろう。
【0088】
2つの軽鎖Xba I−HindIII断片が挿入されている各pUC18プラスミドからそれらの断片を単離した。ベクタープラスミドpVκ1(一般に譲渡されたU.S.S.N.223,037を参照のこと)をXba Iで切断し、標準法により脱リン酸しそして2断片を連結せしめた。所望の反応生成物は次のような環状形を有する:ベクター−Xba I−断片1−HindIII−断片2−Xba I−ベクター。数個のプラスミド単離物を制限マッピングと配列決定により分析し、この形態を有する1つのプラスミドを選択した。このプラスミドpHuLTAC(図8)は完全なヒト化軽鎖(図4)を含有し、適当な宿主細胞中にトランスフェクトすると高レベルの軽鎖を発現するだろう。
【0089】
<ヒト化抗体の合成および親和力>
プラスミドpHuGTAC1およびpHuLTACをマウスSp2/0細胞中にトランスフェクトし、そして該プラスミドを組み込んだ細胞を、プラスミド上のgptおよびhyg遺伝子(図7,8)により付与されるミコフェノール酸および/またはヒグロマイシンBに対する耐性に基づいて標準法により選択した。それらの細胞がIL−2レセプターに結合する抗体を分泌したことを確かめるために、細胞からの上清をIL−2レセプターを発現することが知られているHUT−102細胞と共にインキュベートした。洗浄後、細胞をフルオレセイン接合ヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄し、そしてFACSCANサイトフルオロメーター上で蛍光について分析した。結果(図9A)は、ヒト化抗体がそれらの細胞には結合するが、IL−2レセプターを発現しないJurkat T細胞には結合しない(図9D)ことを明らかに示す。対照として、もとのマウス抗−Tac抗体を用いてそれらの細胞を染色すると同様な結果を与えた(図9B、C)。
【0090】
更なる実験のために、ヒト化抗体を生産する細胞をマウスに注入し、そして生じた腹水を回収した。標準法に従ってAffigel−10支持体(Bio−RadLaboratories, Inc., Richmond,CA)上に調製されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のアフィニティーカラムに通過させることにより、腹水からヒト化抗体を実質上均質まで精製した。もとの抗−Tac抗体に比較してヒト化抗体の親和力を測定するために、競合的結合実験を行った。約5×105個のHUT−102細胞を既知量(10−40ng)の抗−Tac抗体とヒト化抗−Tac抗体と共に4℃で10分間インキュベートした。次いで細胞に100ngのビオチン化抗−Tacを添加し、そして4℃で30分間インキュベートした。この量の抗−Tacは細胞上の結合部位を飽和するのに十分であり、大過剰であってはならないことが予め決定されている。0.1%アジ化ナトリウムを含む2mlのリン酸塩緩衝化塩溶液(PBS)で細胞を2回洗浄した。次いで250ngのフィコエリトリン接合アビジンと共に細胞を4℃で30分間インキュベートし、この接合アビジンは既に細胞に結合しているビオチン化抗−Tacに結合した。細胞を上記のように再び洗浄し、1%パラホルムアルデヒドを含むPBS中で固定し、そしてFACSCANサイトフルオロメーター上で蛍光分析した。
【0091】
第一段階における競合体としての抗−Tac抗体の使用量を増加していくと(10−40ng)、第二段階において細胞に結合することができたビオチン化抗−Tacの量を減少させ、従って最終段階において結合したフィコエリトリン接合アビジンの量を減少させ、こうして蛍光を減少させた(図10A)。当量(20ng)の抗−Tacおよび競合体として使ったヒト化抗−Tacは、蛍光をほぼ同じ程度に減少させた(図10B)。このことは、それらの抗体がほぼ同じ親和力(3〜4倍以内)を有することを示す。というのは、もし一方がずっと大きな親和力を有するなら、より有効にビオチン化抗−Tacと競争し、従って蛍光をもっと滅少させたであろうからである。
【0092】
<ヒト化抗体の生物学的性質>
ヒトの病気の処置における最適な使用のため、ヒト化抗体はIL−2レセプターを発現している体内のT細胞を破壊することができるべきである。抗体が標的細胞を破壊し得る1つの機構は、ADCCと略される抗体依存性細胞障害作用〔Fundamental Immunology, Paul,W.編、Raven Press,NewYork(1984),681頁〕であり、この場合抗体は、標的細胞と標的を溶解することができるマクロファージのようなエフェクター細胞との間に架橋を形成する。ヒト化抗体と元のマウス抗−Tac 抗体がADCCを媒介することができるかどうかを決定するために、標準法によりクロム放出アッセイを行った。詳しくは、IL−2レセプターを発現するヒト白血病HUT−102細胞を51Crと共にインキュベートし、それらにこの放射性核種を吸収させた。次いでHUT−102 細胞を過剰量の抗−Tacまたはヒト化抗−Tac抗体のいずれか一方と共にインキュベートした。次にヒト組換えIL−2との約20時間のインキュべーションによって活性化された通常の精製ヒト末梢血単核細胞である30:1または100:1の比のエフェクター細胞と共に4時間インキュベートした。標的HUT−102細胞の溶解を示す51Crの放出を測定し、そしてバックグラウンドを差し引いた(表1)。その結果は、どちらの比のエフェクター細胞においても、抗−Tacは有意な数の標的細胞を溶解しなかった(5%未満)が、一方ヒト化抗体は溶解した(20%より多く)ことを示す。従って、ヒト化抗体は、T細胞白血病または他のT細胞介在性の病気を治療することにおいて、おそらく元のマウス抗体よりも効果的であろう。
【0093】
【表1】
【0094】
上記から、本発明のヒト化免疫グロブリンが他の抗体の多数の利点を提供することは明らかであろう。例えば、抗−Tacマウスモノクローナル抗体と比較すると、本発明のヒト化IL−2レセプター免疫グロブリンは、より経済的に生産することができ、そして実質的に少ない外来アミノ酸配列を含むことができる。ヒト患者への注入後に抗原性となる可能性の減少は、上記の基準に従って設計された免疫グロブリンにとって有意な療法的改善を意味する。
【0095】
本発明を明確化および理解のために説明および実施例により幾分詳細に記載してきたが、上述の請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行い得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1】抗−Tac重鎖(上行)およびEu重鎖(下行)の配列の比較を示す図である。アミノ酸の1文字記号が用いられている。各行の最初のアミノ酸に左側に番号を付けてある。2つの配列中の同じアミノ酸は線でつながれている。3つのCDRには下線が付してある。ヒト化抗−Tac重鎖においてEuアミノ酸よりもむしろ抗−Tacアミノ酸が使用された他のアミノ酸位置は星印で示されている。
【図2】抗−Tac軽鎖(上行)およびEu軽鎖(下行)の配列の比較を示す図である。アミノ酸の1文字記号が用いられている。各行の最初のアミノ酸に左側に番号を付けてある。2つの配列中の同じアミノ酸は線でつながれている。3つのCDRには下線が付してある。ヒト化抗−Tac軽鎖においてEuアミノ酸よりもむしろ抗−Tacアミノ酸が使用された他のアミノ酸位置は星印で示されている。
【図3】ヒト化抗−Tac重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。タンパク質をコードする遺伝子の部分についての翻訳アミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に示されている。該遺伝子の始まりと終わりのヌクレオチドTCTAGAは Xba I 部位である。成熟重鎖配列はアミノ酸#20のQで始まる。
【図4】ヒト化抗−Tac軽鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。タンパク質をコードする遺伝子の部分についての翻訳アミノ酸配列がヌクレオチド配列の下に示されている。該遺伝子の始まりと終わりのヌクレオチドTCTAGAはXba I 部位である。成熟軽鎖配列はアミノ酸#21のDで始まる。
【図5A】ヒト化抗−Tac重鎖遺伝子を合成するのに用いた、5’から3’方向に記載した4つのオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図5B】前記オリゴヌクレオチドの相対位置を示す図である。矢印は各オリゴヌクレオチドの3’方向を指している。
【図6A】ヒト化抗−Tac軽鎖遺伝子を合成するのに用いた、5’から3’方向に記載した4つのオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図6B】前記オリゴヌクレオチドの相対位置を示す図である。矢印は各オリゴヌクレオチドの3’方向を指している。JFD2とJFD3とのオーバーラップ中のHindIII部位の位置が示されている。
【図7】ヒト化抗−Tac重鎖を発現させるのに用いるプラスミドpHuGTAC1の略図である。関係する制限部位が示されており、そして重鎖のコード領域が箱として表示されている。免疫グロブリン(Ig)プロモーターからの転写方向が矢印により示されている。EH=重鎖エンハンサー、Hyg=ヒグロマイシン耐性遺伝子。
【図8】ヒト化抗−Tac軽鎖を発現させるのに用いるプラスミドpHuLTACの略図である。関係する制限部位が示されており、そして軽鎖のコード領域が箱として表示されている。Igプロモーターからの転写方向が矢印により示されている。
【図9】抗−Tac抗体またはヒト化抗−Tac抗体に次いで標識としてフルオレセイン接合ヤギ抗マウスIg抗体またはヤギ抗ヒトIg抗体でそれぞれ染色されたHut−102およびJurkat細胞のフルオロサイトメトリーを示す図である(A〜D)。各パネルにおいて、点線曲線は第一抗体が削除された時の結果を示し、実線曲線は記載された第一および第二(接合)抗体を含む時の結果を示す。
【図10A】指摘されるような0〜40ngの抗−Tac、次いでビオチン化抗−Tac、次にフィコエリトリン接合アビジンで染色されたHut−102細胞のフルオロサイトメトリーを示す図である。
【図10B】指摘の抗体、次いでビオチン化抗−Tac、次にフィコエリトリン接合アビジンで染色されたHut−102細胞のフルオロサイトメトリーを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原に結合可能なヒト化免疫グロブリンの生産方法であって、超可変領域の外側の少なくとも1つのアミノ酸を置換する工程を包含し、該アミノ酸置換が非ヒト供与体免疫グロブリンの非超可変領域由来であり、そして該ヒト化免疫グロブリンにおける超可変領域以外の可変領域アミノ酸配列が、受容体ヒト免疫グロブリン可変領域アミノ酸配列と同一の少なくとも70アミノ酸残基を含み、そして該超可変領域が該非ヒト供与体免疫グロブリン由来である、方法、ならびに実施例中に記載の方法。
【請求項1】
抗原に結合可能なヒト化免疫グロブリンの生産方法であって、超可変領域の外側の少なくとも1つのアミノ酸を置換する工程を包含し、該アミノ酸置換が非ヒト供与体免疫グロブリンの非超可変領域由来であり、そして該ヒト化免疫グロブリンにおける超可変領域以外の可変領域アミノ酸配列が、受容体ヒト免疫グロブリン可変領域アミノ酸配列と同一の少なくとも70アミノ酸残基を含み、そして該超可変領域が該非ヒト供与体免疫グロブリン由来である、方法、ならびに実施例中に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【公開番号】特開2007−145863(P2007−145863A)
【公開日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−53539(P2007−53539)
【出願日】平成19年3月2日(2007.3.2)
【分割の表示】特願2003−11706(P2003−11706)の分割
【原出願日】平成1年12月28日(1989.12.28)
【出願人】(500533422)ピーディーエル バイオファーマ,インコーポレイティド (18)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年3月2日(2007.3.2)
【分割の表示】特願2003−11706(P2003−11706)の分割
【原出願日】平成1年12月28日(1989.12.28)
【出願人】(500533422)ピーディーエル バイオファーマ,インコーポレイティド (18)
【Fターム(参考)】
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