Ｌ−アミノ酸生産菌及びＬ−アミノ酸の製造法
【課題】Ｌ−アミノ酸を効率良く生産することできる菌株、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりマンノースPSTをコードする遺伝子の発現が増強された、マンノースPST活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取することからなる。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりマンノースPSTをコードする遺伝子の発現が増強された、マンノースPST活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取することからなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にL−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸等のL-アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−リジンの製造法としては、例えば、特許文献１〜４に記載された方法を挙げることができる。一方、Ｌ−アルギニンの製造法としては、例えば、特許文献５、６または１４に記載された方法を挙げることができる。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように改変された微生物などが用いられている。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸の生産能を向上させる方法として、Ｌ−アミノ酸の取り込み系、又は排出系を改変する方法が知られている。例えば取り込み系に関しては、Ｌ−アミノ酸の細胞内への取り込み系を欠失又は低下させることにより、Ｌ−アミノ酸生産能を高める方法がある。例えば、gluABCDオペロン又はその一部を欠失させ、L-グルタミン酸の取り込みを欠失又は低下させる方法(例えば、特許文献７参照)等が知られている。
【０００４】
また、排出系を改変する方法としては、Ｌ−アミノ酸生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損または弱化させる方法、及びＬ−アミノ酸の排出系を強化する方法が知られている。前者の方法として、目的アミノ酸がＬ−グルタミン酸の場合に、α−ケトグルタレートパーミアーゼ遺伝子を変異又は破壊することにより、目的物質の中間体であるα-ケトグルタル酸の排出を弱化する方法(例えば、特許文献８参照)が知られている。
【０００５】
後者のＬ−アミノ酸の排出系を強化する方法としては、例えばL-リジン、Ｌ−アルギニン排出遺伝子(LysE)（例えば、非特許文献１参照）の発現を強化したコリネバクテリウム属微生物の菌株を用いたＬ−リジンの製造法（例えば、特許文献９参照）又はＬ−アルギニンの製造法（例えば、特許文献１０参照）が知られている。また、Ｌ−アミノ酸の排出に関与することが示唆されている遺伝子である、ｒｈｔＡ，Ｂ，Ｃ遺伝子（例えば、特許文献１１参照）又はｙｆｉＫ、ｙａｈＮ遺伝子等（例えば、特許文献１２参照）の発現を強化したエシェリヒア属細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法も報告されている。
【０００６】
上記に示したＬ−アミノ酸生合成経路の改変、及びＬ−アミノ酸の取込み、排出系の改変以外に、Ｌ−アミノ酸の生産能を向上させる方法の一つとして、原料である糖の取込み能力を改変することが挙げられる。糖を取り込む輸送体として、例えば、ホスホエノールピルビン酸：糖リン酸転移系（以下PTS：フォスフォトランスフェラーゼともいう。）が広く知られており、さらに、PTSは基質に依存しない共通系EI（ptsIによってコードされる）、HPr（ptsHによってコードされる）と基質特異的な構成成分EIIに分類される。グルコース特異的なEIIはptsG、crrによってコードされ、さらにcrr遺伝子はptsH、ptsIとオペロン構造を取ることが知られている。既に、ptsG遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸製造法（特許文献１３）やptsH、ptsI、crr遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸製造法（特許文献１４）が知られている。
【０００７】
上記で示したグルコースPTS以外にも、マンノースに特異的なフォスフォトランスフェラーゼ（PTS）をコードする遺伝子としてmanXYZが知られているが（非特許文献２）、現在までに、マンノースPTSをコードする遺伝子を増強し、アミノ酸の生産に利用している報告はない。
【特許文献１】欧州特許出願公開０８５７７８４号明細書
【特許文献２】特開平１１−１９２０８８号公報
【特許文献３】国際公開第００／５３７２６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ９６／１７９３０号パンフレット
【特許文献５】欧州特許出願公開０９９９２６７号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開１１７０３５８号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開１０３８９７０号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／００５９５９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９７／２３５９７号パンフレット
【特許文献１０】米国特許出願公開２００３−０１１３８９９号明細書
【特許文献１１】特開２０００−１８９１７７号公報
【特許文献１２】欧州特許出願公開１０１６７１０号明細書
【特許文献１３】国際公開第０３／０４６７０号明細書
【特許文献１４】国際公開第０３／０４６７４号明細書
【非特許文献１】ジャーナル・オヴ・モレキュラー・マイクロバイオロジー・バイオテクノロジー（J Mol Microbiol Biotechnol） 1999 Nov;1(2):327-36
【非特許文献２】モレキュラー・マイクロバイオロジ（MolecularMicrobiology）1998 27 (2),369-380
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、マンノースPTS活性を増強するように改変した腸内細菌科に属する微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTS活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２） 前記マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりマンノースPTSをコードする遺伝子の発現が増強された、腸内細菌科に属する微生物を用いた（１）に記載の製造法。
（３）上記マンノースPTSが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項または2に記載の製造法。
（Ａ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群より選ばれる一種又は二種以上のタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつマンノースPTS活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる一種又は二種以上のタンパク質
（４） 前記マンノースPTSをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造法：
（ａ）配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号1の塩基番号72〜2767の塩基配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンノースPTS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）記微生物がエシェリヒア属細菌、パントエア属細菌である（１）〜（４）のいずれかに記載の製造法。
（６） 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、L-アミノ酸、特にL-リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTS活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１４】
L-アミノ酸の種類は特に制限されないが、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリンの塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシンの脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリンのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリンの環式アミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファンの芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニンの含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１５】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
以下に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００１６】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内細菌科に属する微生物であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる。（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
【００１７】
本発明のエシェリヒア属細菌を得るために用いるエシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C.et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1） に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W311（ATCC27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１８】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００１９】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２０】
以下、腸内細菌科に属する微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法について述べる。
【００２１】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２２】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。またＬ−アミノ酸生産菌は、遺伝子組換えによって、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。
【００２３】
Ｌ−リジン生産能を有するＬ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000−189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。WC196株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にＡＥＣ(Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン)耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
【００２４】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇することによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。
【００２５】
例えば、以下のようにして、Ｌ−リジン生合成系の酵素をコードする遺伝子を宿主に導入することによって、Ｌ−リジン生産能を付与することができる。すなわち、Ｌ−リジン生合成系遺伝子をコードする遺伝子断片を、Ｌ−リジンの製造に用いる宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これで宿主を形質転換する。形質転換により宿主細胞内のＬ−リジン生合成系酵素コードする遺伝子のコピー数が上昇し発現量が増強する結果、これらの酵素の活性が増強される。
【００２６】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、宿主微生物中で発現することができる遺伝子であれば、特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子、コリネ型細菌由来の遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカムのいずれも全ゲノム配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリ K-12等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。
【００２７】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、腸内細菌科において自律複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228（宝バイオ社）、pMW119（ニッポンジーン社）、pUC19、pSTV29（宝バイオ社製）,RSF1010 （Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）,等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２８】
目的遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。目的遺伝子は、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。上記のようにして調製した組換えＤＮＡを微生物に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。このような方法により作成されたプラスミドとして、dapA、dapB及びLysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）が挙げられる。
【００２９】
また、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の発現増強は、目的遺伝子を微生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。またL−リジン生合成系遺伝子は、元々染色体上に存在する遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、染色体上の不要な領域あるいは欠損することによって、L-リジン収率が向上する遺伝子領域に導入してもよい。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内の目的遺伝子のコピー数が上昇する結果、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性が増強される。
【００３０】
Ｌ−リジン生合成系酵素の活性増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーターが強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、目的遺伝子の発現が強化されることによって酵素活性が増幅される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。
【００３１】
また、目的遺伝子の発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変することによっても達成される(Hamilton et al,; J Bacteriol. 1989 Sep;171(9):4617-22.)。 国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。目的遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することが出来る。発現調節配列の置換は、例えば、上述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
【００３２】
さらに、本発明のＬ−リジン生産菌は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、L-リジン生成に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイムがあり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO 95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【００３３】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Journal of biological Chemistry272:8611-8617（1997）。また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００３４】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する微生物に形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645、米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００３５】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素活性を増強する方法、酵素活性を低下させる方法は、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種にも同様に適用することができる。以下、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種方法について述べる。
【００３６】
本発明に用いられるＬ−グルタミン酸生産菌は、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を挙げることが出来る。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどをが挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。
【００３７】
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物としては、米国特許6,197,559号、6,331,419号明細書、欧州特許0999282号明細書に記載された微生物が例示できる。
【００３８】
また、さらに６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を用いてもよい。（欧州特許出願公開1352966号明細書）
【００３９】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する腸内細菌科に属する微生物としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させた微生物を用いてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００４０】
腸内細菌科に属する微生物の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、米国特許5,573,945米国特許6,197,559号明細書、米国特許6,331,419号明細書に記載されている。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した腸内細菌科に属する微生物としては、具体的には、
パントエア・アナナティス AJ13601 (FERM BP-7207)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410株（FERM BP-6617）
パントエア・アナナティス AJ13355 (FERM BP-6614)
エシェリヒア・コリ AJ12949 （FERM BP-4881）
等が挙げられる。
【００４１】
本発明に用いられるＬ−トリプトファン生産菌として好ましいものは、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強された細菌である。アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性を強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子を腸内細菌科に属する微生物に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。このような細菌としてより具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェリヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミドpGH5（国際公開第94/08031号パンフレット参照）を導入することによって得られる形質転換株が挙げられる。
【００４２】
また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入された細菌も、好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリが挙げられる（特開昭57-71397号公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
【００４３】
さらに、Ｌ−トリプトファン生産菌として、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有する菌株エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL B-12263〕株、及びトリプトファンオペロンを含むプラスミドpGX50を保持するAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕株（いずれも米国特許第 4,371,614号明細書参照）が挙げられる。
【００４４】
また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損した株、trpRに変異が導入された株も好適なＬ−トリプトファン生産菌である。（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）
【００４５】
L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい。（欧州特許763127号明細書参照）
【００４６】
本発明に用いられるＬ−スレオニン生産菌として好ましいものは、L-スレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコ−ドする遺伝子としては、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコ−ドされるアスパルトキナ−ゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナ−ゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンタ−ゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナ−ゼ活性が欠損したTDH６株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００４７】
L−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のL−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、L−スレオニン生産菌を構築するためには、L−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにL−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA,thrB,thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエ−タ−構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエ−ション領域のリ−ダ−配列あるいは、アテニュエ−タ−を除去することにより達成出来る。（国際公開第02/26993号パンフレット、Biotechnology Letters vol24,No.21,November 2002、国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００４８】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモ−タ−が存在するが、non−nativeのプロモ−タ−に置換してもよいし（WO 98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサ−およびプロモ−タ−により支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、L−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにエシェリヒア属細菌を改変するために、α−amino−β−hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても得られる。
【００４９】
このようにL−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピ−数が上昇しているか、あるいは強力なプロモ−タ−に連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピ−数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等で染色体上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００５０】
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、L−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。
【００５１】
L−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのL−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナ−ゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノ−ルピルビン酸シンタ−ゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００５２】
また、L−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、L−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にL−スレオニン耐性、L−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res Microbiol. 2003 Mar;154(2):123−35.)、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）yfiK,yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にL−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００５３】
L-スレオニン生産菌として、エシェリヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することも出来る。このVKPM B-3996株は、１９８７年１１月１９日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-3996 のもとに寄託されている。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D.Plasmid, 1986, 16, 161-167を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（国際公開第90/04636号パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００５４】
また、エシェリヒア・コリB-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)も例示することができる。B-5318株は、1987年11月19日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、ＰRプロモーターおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。
【００５５】
本発明に用いるＬ−ヒスチジン生産菌として好ましいものは、Ｌ−ヒスチジン生合成に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだベクターを導入したエシェリヒア・コリFERM-P5038,5048株 (特開昭56-005099)や、アミノ酸排出遺伝子Rhtを導入した菌株（欧州特許公開公報1016710）、スルファグアニジン、D,L-1,2,4-triazole-3-alanine、ストレプトマイシン耐性が付与されたエシェリヒア・コリ80株（VKPM B-7270 ロシア特許公報2119536号）等が挙げられる。
【００５６】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する微生物としては、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量を増強した微生物を用いてもよい。Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素としては、ATP フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、フォスフォリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ（hisI）、フォスフォリボシル-ATP ピロフォスフォヒドラーゼphosphoribosyＬ−ATP pyrophosphohydrolase（hisIE）、フォスフォリボシルフォルミミノー５−アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼphosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase（hisA）、アミドトランスフェラーゼamidotransferase (hisH）、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチヂノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ（hisD）等が挙げられる。
【００５７】
本発明のＬ−システイン生産菌として好ましいものは、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下した細菌（特開2003-169668号公報）や、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌（特開平11-155571号公報）が挙げられる。
【００５８】
本発明のＬ−プロリン生産菌として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）が挙げられる（特開2002−300874号公報）。
【００５９】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、tyrA,tyrRが欠損したAJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、yedA増幅株（国際公開第03/044192号パンフレット）が挙げられる。また、L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族共通の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）
【００６０】
Ｌ−アルギニン生産菌としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭５６−１０６５９８号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼ及び同酵素を保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ２３７株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ） にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ３８２株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ３８２株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の番号で寄託されている。
【００６１】
またＬ−アルギニン生産能を有する微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。中でもN-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である。（欧州出願公開1170361号明細書）
【００６２】
Ｌ−ロイシン生産菌としては、ｉｌｖＥ遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、ｔｙｒＢ遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増強させたエシェリヒア属細菌（特開2004-024259）4-アザロイシン又は5,5,5−トリフルオロロイシンに耐性を有する、エシェリヒア・コリH-9068株（ATCC21530）、エシェリヒア・コリH-9070株（FERM BP-4704）、エシェリヒア・コリH-9072株（FERM BP-4706）（米国特許第5,744,331号明細書）、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作されたエシェリヒア・コリ株（欧州特許第1067191号明細書）、β−２チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有するエシェリヒア・コリAJ11478株（米国特許第5,763,231号明細書）などを用いることもできる。
【００６３】
Ｌ−イソロイシン生産菌としては、Ｌ−イソロイシン生産能を有する６−ジメチルアミノプリン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−３０４９６９号公報）、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメート耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、チアイソロイシン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、ＤＬ−エチオニン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、アルギニンハイドロキサメートに耐性の変異株（特開平５−１３０８８２号公報）があり、組換え体エシェリヒア属細菌としては、Ｌ−イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強した菌株（特開平２−４５８号公報、特開平２−４２９８８号公報、特開平８−４７３９７号公報）等が挙げられる。
【００６４】
Ｌ−バリン生産菌としては、例えばエシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5,658,766）等が挙げられる。また、ＷＯ９６／０６９２６に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損する変異を有 するＬ−バリン生産菌、あるいは、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤの各遺伝子を発現し、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌も、本発明の親株として好適に使用することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（米国特許5,998,178号明細書））。また、オペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。上記のような、アテニュエーションが解除されるileS17変異を持つエシェリヒア・コリVL1970は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（RussianNational Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、VKPM B-4411の登録番号で寄託されている。
【００６５】
＜１−２＞マンノースPTSの活性増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、マンノースPTSの酵素活性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、先にマンノースPTSの酵素活性が上昇する改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。本発明におけるマンノースPTSとは、フォスフォエノールピルビン酸（以下PEPと呼ぶ）のリン酸基を糖に転移させ、同時にCytoplasmに取り込む活性を意味する。ここで糖とは、マンノースを意味するが、グルコース、フラクトース、アミノ糖であってもよい。（Molecular Microbiology (1998) 27(2),369-380）
【００６６】
マンノースPTSの酵素活性の増強は、Chenらの方法（Biochemistry 1998 37:8714-8723）により、in vitroでリン酸化活性を測定することにより確認できる。（EC 2.7.1.69 ）マンノースPTSをコードする遺伝子の発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。酵素活性の上昇については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、酵素活性の増強は、目的とするタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００６７】
マンノースPTSの酵素活性は、マンノースPTSをコードする後述するmanX、manY、manZ遺伝子の発現量を上昇するように改変することによって達成でき、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性manX、manY、manZ遺伝子の発現増強であってもよいし、manX、manY、manZ遺伝子を含むプラスミドの導入、染色体上のmanX、manY、manZ遺伝子増幅によるコピー数の上昇などによる外因性manX、manY、manZ遺伝子の発現増強であってもよい。manX、manY、manZ遺伝子はオペロン構造(以下manXYZオペロンと呼ぶ)を形成しており、manXYZオペロンの発現調節領域をより強力なものに改変すること、manXYZオペロンのコピー数を上昇することがより効果的である。
【００６８】
エシェリヒア・コリの全ゲノム配列は既に決定されており、(Science 277:1453-1462(1997))各遺伝子の機能とGenbank登録番号は以下の通りである。
【００６９】
【表１】
【００７０】
本発明のmanX、manY、manZ遺伝子とは、エシェリヒア属細菌のmanX、manY、manZ遺伝子、及びそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのmanX遺伝子としては、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、manY遺伝子は配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、manZ遺伝子は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を例示することができる。エシェリヒア・コリMG1655由来のｍanX,Y,Z遺伝子のGenebank Accession No.と配列番号１のコード領域を表１に示す。
【００７１】
manX、manY、manZ遺伝子ホモログとは、他の微生物由来で、エシェリヒア属細菌のmanX、manY、manZ遺伝子構造が高い類似性を示し、宿主に導入した際にL-アミノ酸の生産能を向上させ、マンノースPTS活性を示す遺伝子をいう。例えばmanX,Y,Zのホモログとしては、サルモネラ属、シゲレラ属、エルシニア等のGenbankに登録されているmanX、manY、manZ遺伝子が挙げられる。 さらに、manX,Y,Z遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌、バチルス属細菌からクローニングされるものであってもよい。また、表1に示すように、エシェリヒア属細菌のmanXYZと相同性が高ければ、異なる遺伝子名が付与されているものでもよい。例えば、マンノースPTSをコードする遺伝子は、配列番号５、配列番号６の合成オリゴヌクレオチドを用いてクローニング出来る。
【００７２】
また、本発明に用いるマンノースPTSをコードする遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるマンノースPTSタンパク質の機能、すなわちマンノースPTS活性が損なわれない限り、配列番号２、３、４のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、マンノースPTS活性が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe,Trp,Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu,Ile,Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln,Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys,Arg,His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp,Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser,Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、上記置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、マンノースPTSをコードする遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号５に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。
【００７３】
さらに、マンノースPTSをコードする遺伝子は、配列番号２、３、４のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ、マンノースPTSをコードする配列を用いることが出来る。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれマンノースPTSをコードする遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にマンノースPTSをコードする遺伝子は、マンノースPTSの機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したものあるいは削られているものでもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号６のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、Ｃ末端側50アミノ酸から5アミノ酸延長・削除したでもよい。
【００７４】
また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列に示す塩基配列を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。これらの遺伝子がマンノースPTS活性を有するタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子を適当な細胞で発現させ、マンノースの取り込み能が向上しているか、あるいはChenらの方法（Biochemistry 1998 37:8714-8723）により、in vitroでリン酸化活性を調べることにより、確かめることができる。
【００７５】
また、マンノースPTSをコードする遺伝子は配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含む塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマンノースPTS有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７６】
プローブとして、配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含むＤＮＡ、、または一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００７７】
マンノースPTSをコードする遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の上述のようなマンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、マンノースPTSをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００７８】
マンノースPTSをコードする遺伝子としてエシェリヒア・コリのmanX,Y,Z遺伝子を用いる場合、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号5及び6に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、manX,Y,Z遺伝子を取得することができる。他の腸内細菌科に属する微生物のマンノースPTSをコードする遺伝子も、その微生物において公知のmanX,Y,Z遺伝子もしくは他種の微生物のmanX,Y,Z遺伝子又は、マンノースPTSタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００７９】
次に、PCR法により増幅されたマンノースPTSをコードする遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV29(宝バイオ社より入手可)等が挙げられる。
【００８０】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。
【００８１】
一方、マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めることは、上述のようなマンノースPTSをコードする遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にマンノースPTSをコードする遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、染色体上に存在するmanXYZオペロンの横にタンデムに連結させてもよいし、染色体上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。manX、manY、manZ遺伝子はオペロン構造(以下manXYZオペロンと呼ぶ)を形成しており、manXYZオペロンのコピー数を上昇させるとより効果的である。
【００８２】
あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、マンノースPTSをコードする遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上に遺伝子が転移したことの確認は、マンノースPTSをコードする遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００８３】
さらに、マンノースPTSをコードする遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、染色体DNA上またはプラスミド上のmanXYZオペロンのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、manXYZオペロンの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、manXYZオペロンの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、manXYZオペロンのプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。manXYZオペロンのプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりマンノースPTSをコードする遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。
【００８４】
マンノースPTSタンパク質の活性を増強するために、マンノースPTS活性が上昇するような変異をmanX,Y,Z遺伝子に導入してもよい。manX,Y,Z遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が上昇するような変異としては、manXYZオペロンの転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、マンノースPTSの比活性が高くなるような遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００８５】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする製造法である。
【００８６】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトースを炭素源として用いることが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８７】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００８８】
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。
【００８９】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００９０】
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
［参考例１］リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築
＜１−１＞リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築
【００９１】
まずリジンデカルボキシラーゼ非産生株の構築を行った。破壊の方法は、WO2005/01075号記載のRedドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）と組合わせた方法で破壊を行った。リジンデカルボキシラーゼは、cadA遺伝子（Genbank Accession No. NP_418555. 配列番号42）、ldcC遺伝子（Genbank Accession No. NP_414728. 配列番号44）によってコードされている（国際公開WO96/17930号パンフレット参照）。ここで親株は、WC196株を用いた。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
【００９２】
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA、ldcC遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH， Gumport RI， Gardner JF.）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
【００９３】
（１）cadA遺伝子の破壊
【００９４】
PCRの鋳型としてPCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attＬ−Cm-attRを使用した。pMW118-attＬ−Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attＬ−cat-attRの順で挿入されている。（WO2005/01075号参照）attL配列を配列番号１１に、attR配列を配列番号１２に示す。
【００９５】
このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、目的遺伝子であるcadA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に有する配列番号４６及び４７に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。
【００９６】
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリWC196株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、 第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をWC196株の染色体に組み込むために必要である。
【００９７】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養したエシェリヒア・コリWC196株を、アンピシリン（20mg/L）とＬ−アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でＣｍ（クロラムフェニコール）(25mg/L)を含むＬ−寒天培地上で平板培養し、Ｃｍ耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むＬ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
【００９８】
クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のcadA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたcadA欠損株をWC196ΔcadA::att-cat株と名づけた。
【００９９】
次に、cadA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-tsを使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子(配列番号１３)、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子（配列番号１５）を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。pMW-intxis-ts導入により、染色体上のattL(配列番号１１)あるいはattR(配列番号１２)を認識して組換えを起こしattLとattRの間の遺伝子を切り出し、染色体上にはattLあるいはattR配列のみ残る構造になる。
【０１００】
上記で得られたWC196ΔcadA::att-cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、３０℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むＬ−寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、Ｌ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、att-cat、及びpMW-intxis-tsが脱落しているcadA破壊株であるクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAと名づけた。
【０１０１】
（２）WC196ΔcadA 株のldcC遺伝子の欠失
WC196ΔcadA 株におけるldcC遺伝子の欠失は、上記手法に則って、ldcC破壊用プライマーとして、配列番号４８、４９のプライマーを使用して行った。これによって、cadA ldcC破壊株であるWC196ΔcadAΔldcCを得た。
【０１０２】
（３）PCR鋳型及びヘルパープラスミドの調製
PCRの鋳型pMW118-attＬ−Cm-attR及びヘルパープラスミドpMW-intxis-tsは以下のように調製した。
【０１０３】
（３−１） pMW118-attＬ−Cm-attR
pMW118-attＬ−Cm-attRの構築は、pMW118-attＬ−Tc-attRを基にした。下記の四つのDNA断片を連結した。
【０１０４】
１）オリゴヌクレオチドP1及びP2（配列番号１７及び１８）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはBglII及びEcoRIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli W3350株（λプロファージを含む）の染色体の相当する配列をPCR増幅することにより得たattLを含むBglII-EcoRI DNA断片(120 bp)（配列番号１１）。
【０１０５】
２）オリゴヌクレオチドP3及びP4（配列番号１９及び２０）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはPstI及びHindIIIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli W3350株（λプロファージを含む）の染色体の相当する配列をPCR増幅することにより得たattRを含むPstI-HindIII DNAフラグメント(182 bp)（配列番号１２）。
【０１０６】
３）pMW118-ter_rrnBのラージBglII-HindIII断片(3916 bp)。pMW118-ter_rrnBは下記の三つの断片を連結することにより得られたものである。
pMW118をEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いでAatII制限エンドヌクレアーゼで切断することで得たpMW118のAatII-EcoRIpol断片を含むラージ断片(2359 bp)。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドP5及びP6（配列番号２１及び２２）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはAatII及びBglIIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、pUC19プラスミドの相当する配列をPCR増幅することにより得た、アンピシリン耐性(ApR)のbla遺伝子を含む、pUC19のAatII-BglIIスモール断片(1194bp)。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドP7及びP8（配列番号２３及び２４）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはBglII及びPstIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli MG1655株の染色体の相当する領域をPCR増幅することにより得た転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstIpolスモール断片(363 bp)。
【０１０９】
４）テトラサイクリン耐性遺伝子及び転写ターミネーターter_thrLをpMＬ−Tc-ter_thrLのスモールEcoRI-PstI断片(1388 bp)（配列番号２９）。pMＬ−Tc-ter_thrLは下記のように得られたものである。
【０１１０】
pMＬ−MSC(2001 #5)をXbaI及びBamHI制限エンドヌクレアーゼで切断し、そのラージ断片(3342 bp)を、ターミネーターter_thrLを含むXbaI-BamHI断片(68 bp)と連結した。XbaI-BamHI断片は、オリゴヌクレオチドP9及びP10（配列番号２５及び２６）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはXbaI及びBamHIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli MG1655株の染色体の相当する領域をPCR増幅することにより得た。この連結反応の産物をプラスミドpMＬ−ter_thrLとした。
【０１１１】
pMＬ−ter_thrLをKpnI及びXbaI制限エンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いで、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むpBR322のスモールEcoRI-Van91I断片(1317 bp)（EcoRI及びVan91I制限エンドヌクレアーゼでpBR322を、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理した。）と連結した。この連結反応の産物をプラスミドpMＬ−Tc-ter_thrLとした。
【０１１２】
以上のようにしてpMW118-attＬ−Tc-attRを得た。
pMW118-attＬ−Cm-attRは、pMW118-attＬ−Tc-attRのラージBamHI-XbaI断片(4413 bp)と、プロモーターPA2（T7ファージの初期プロモーター）、クロラムフェニコール耐性(CmR)のcat遺伝子、転写ターミネーターter_thrL及びattRを含むBglII-XbaI人工DNA断片(1162bp)とを連結して構築した。人工DNA断片（配列番号３０）は、下記のようにして得た。
【０１１３】
MＬ−MSC (2001 #5)をKpnI及びXbaI制限エンドヌクレアーゼで切断し、次いでプロモーターPA2（T7ファージの初期プロモーター）を含むスモールKpnI-XbaI断片(120 bp)と連結した。KpnI-XbaI断片は、オリゴヌクレオチドP11及びP12（配列番号２７及び２８）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはKpnI及びXbaIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、T7ファージDNAの相当する領域をPCR増幅することにより得た。この連結反応の産物をプラスミドpMＬ−PA2-MCSとした。
【０１１４】
pMＬ−PA2-MCSから、XbaI部位を除去した。得られた産物をプラスミドpMＬ−PA2-MCS(XbaI-)とした。
【０１１５】
プロモーターPA2（T7ファージの初期プロモーター）及びクロラムフェニコール耐性(CmR)のcat遺伝子を含む、pMＬ−PA2-MCS(XbaI-)のスモールBglII-HindIII断片(928 bp)を、転写ターミネーターter_thrLおよびattRを含む、pMW118-attＬ−Tc-attRのスモールHindIII-HindIII断片(234 bp)と連結した。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドP9及びP4（配列番号２５及び２０）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはHindIII及びXbaIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、連結反応混合物をPCR増幅することにより目的の人工DNA断片(1156 bp)を得た。
【０１１７】
（３−２） pMW-intxis-ts
最初に、λファージDNA（Fermentas）を鋳型として二つのDNA断片を増幅した。第一の断片は、nt 37168〜38046（配列番号３９）の領域からなり、cIレプレッサー、プロモーターPrm及びPr並びにcro遺伝子のリーダー配列を含むものであった。この断片は、オリゴヌクレオチドP1'及びP2'（配列番号３１及び３２）をプライマーとして用いた増幅により得た。第二の断片は、λファージのxis-int遺伝子を含む、nt 27801〜29100（配列番号４０）の領域からなるものであった。この断片は、オリゴヌクレオチドP3'及びP4'（配列番号３３及び３４）をプライマーとして用いた増幅により得た。全てのプライマーは、適切なエンドヌクレアーゼ認識部位を有していた。
【０１１８】
cIレプレッサーを含む、得られたPCR増幅断片を、ClaI制限エンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いで、EcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断した。第二のPCR増幅断片をEcoRI及びPstI制限エンドヌクレアーゼで切断した。一方、プラスミドpMWPlaclacI-tsを、BglIIエンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いでPstI制限エンドヌクレアーゼで切断した。pMWPlaclacI-tsのベクター断片をアガロースゲルから溶出し、切断したPCR増幅断片と連結した。
【０１１９】
プラスミドpMWPlaclacI-tsは、下記の部分からなるpMWPlaclacIの誘導体である。1) PlacUV5プロモーター及びバクテリオファージT7遺伝子10のRBSの制御下のlacI遺伝子を含むBglII-HindIII人工DNA断片、2) オリゴヌクレオチドP5'及びP6'（配列番号３５及び３６）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはAatII及びBglIIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、pUC19プラスミドの相当する領域をPCR増幅することにより得た、アンピシリン耐性(ApR)遺伝子を含むAatII-BglII断片、3) 組換えプラスミドpMW118-ter_rrnBのAatII-PvuI断片を含むAatII-HindIII断片。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、以下のようにして構築した。適切なエンドヌクレアーゼ認識部位を含むオリゴヌクレオチドP7'及びP8'（配列番号３７及び３８）をプライマーとして用いて、E. coli MG1655株の染色体の相当する領域をPCR増幅することにより、ターミネーターter_rrnBを含むPstI-HindIII断片を得た。連結の前に、pMW118及びter_rrnB断片（相補鎖、配列番号４１）を、PvuIまたはPstIでそれぞれ制限し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理してブラント端にし、次いで、AatIIまたはHindIIIエンドヌクレアーゼで切断した。pMWPlaclacI-ts変異体の構築には、プラスミドpMWPlaclacIのAatII-EcoRV断片を、pSC101レプリコンのpar、ori及びrepAts遺伝子を含むプラスミドpMAN997のAatII-EcoRV断片で置換した。
［実施例］
【実施例１】
【０１２０】
マンノースPTS活性増強用プラスミドの構築
<1-1> manXYZ増幅用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)の染色体の全塩基配列は既に明らかにされており（Science, 277, 1453-1474 (1997)）、この文献に報告されているmanXYZ遺伝子の塩基配列（Genbank Accession No.NP416331,416332,416333）に基づいて、５’プライマーとしてSse8387Iサイトを有した配列番号5の合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとしてXbaIサイトを有した配列番号６に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、制限酵素Sse8387I及びXbaIにて処理し、manXYZ遺伝子を含む遺伝子断片を得た。
【０１２１】
精製したＰＣＲ産物を、Sse8387I及びXbaIで消化したベクターpMW219（ニッポンジーン社製）に連結してmanXYZ増幅用プラスミドpM-manXYZを構築した。本プラスミドはmanXYZ遺伝子がlacプロモーターに正方向に連結しており、その制御下にある。また、pM-manXYZをSse8387I及びEcoRIで消化し、manXYZ遺伝子断片を回収、精製し、Sse8387I及びEcoRIで消化したベクターpSTV29（タカラ酒造社製）に連結してプラスミドpS-manXYZを構築した。
【０１２２】
＜1-2＞ptsG増幅用プラスミドの構築
上記manXYZ遺伝子と同様に、ptsG遺伝子発現用プラスミドの構築を行った。（配列番号50）５’プライマーとしてHindIIIサイトを有した配列番号７の合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとしてXbaIサイトを有した配列番号８に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、制限酵素HindIII及びXbaIにて処理し、ptsGを含む遺伝子断片を得た。精製したＰＣＲ産物を、HindIII及びXbaIで消化したベクターpMW219に連結してptsG増幅用プラスミドpM-ptsGを構築した。本プラスミドはptsG遺伝子がlacプロモーターに正方向に連結しており、その制御下にある。また、manXYZと同様に、pM-ptsGからptsG遺伝子断片を切り出し、ベクターpSTV29に連結してプラスミドpS-ptsGを構築した。
【実施例２】
【０１２３】
エシェリヒア属細菌L-リジン生産株でのmanXYZ増幅の効果
エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産株として、実施例１のWC196ΔldcCΔcadA株をdapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）pCABD2で形質転換したWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2）株を用いた。
【０１２４】
WC196ΔldcCΔcadA株を、実施例1で作製したmanXYZ増幅用プラスミドpM-manXYZとptsG増幅用プラスミドpM-ptsG、及び比較対照用プラスミドpMW219で形質転換し、カナマイシン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、manXYZ増幅用プラスミドpM-manXYZ導入株をWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-manXYZ）株、ptsG増幅用プラスミドpM-ptsG導入株をWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-ptsG）株、及び比較対照用プラスミドpMW219導入株をWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pMW219）株と名づけた。
【０１２５】
上記で作製した株を25 mg/Lのカナマイシンを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し、-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
【０１２６】
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、25 mg/Lのカナマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、25 mg/Lのカナマイシンを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において24時間培養した。培養後、培地中に蓄積したL-リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。
【０１２７】
２４時間目のOD、Ｌ−リジン蓄積を表１に示す。表1から分かるように、WC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-manXYZ）株は、manXYZ遺伝子を導入しないWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pMW219）株と比較して多量のL-リジンを蓄積した。また、ptsG遺伝子を導入したWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-ptsG）株と比較してもリジン蓄積量の向上が確認され、L-リジン生産におけるmanXYZ遺伝子の強化はptsG増強より効果があることが示唆された。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
［エシェリヒア属細菌 L-リジン生産培地］
グルコース 40g/L
硫酸アンモニウム 24g/L
リン酸２水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩 1.0g/L
硫酸鉄４・７水塩 0.01g/L
硫酸マンガン４・７水塩 0.01g/L
酵母エキス 2.0g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
【実施例３】
【０１３０】
エシェリヒア属細菌L-グルタミン酸生産株でのmanXYZ増幅の効果
エシェリヒア・コリのＬ−グルタミン酸生産株として、AJ12949株を用いた。AJ12949株はα―ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した菌株であり、平成５年１２月２８日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14039として寄託され、平成6年11月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-4881が付与されている。
【０１３１】
AJ12949株を、実施例1で作成したmanXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZと、比較対照用プラスミドpSTV29で形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、manXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZ導入株をAJ12949（pS-manXYZ）株、比較対照用プラスミドpSTV29導入株をAJ12949（pSTV29）株と名づけた。
【０１３２】
AJ12949（pS-manXYZ）株とAJ12949（pSTV29）株を20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注しグリセロールストックにして、-80℃に保存した。
【０１３３】
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において40時間培養した。培養後、培地中に蓄積したL-グルタミン酸の量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。
【０１３４】
４０時間目のOD、Ｌ−グルタミン酸蓄積を表２に示す。表２から分かるように、AJ12949（pS-manXYZ）株は、manXYZ遺伝子を導入しないAJ12949（pSTV29）株と比較して多量のグルタミン酸を蓄積した。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
［エシェリヒア属細菌 L-グルタミン酸生産培地］
グルコース 40g/L
硫酸アンモニウム 20g/L
リン酸２水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩 1.0g/L
硫酸鉄４・７水塩 0.01g/L
硫酸マンガン４・７水塩 0.01g/L
酵母エキス 2.0g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。また、培地温度が60℃以下となってから、予めフィルターDISMIC-25cs 0.2 mm filter (ADVANTEC)で滅菌したチアミン塩酸塩溶液を終濃度が0.01g/Lとなるように添加した。
【実施例４】
【０１３７】
エシェリヒア属細菌L-スレオニン生産株でのマンノースPTS増幅の効果
エシェリヒア属細菌L-スレオニン生産株でのmanXYZ増幅の効果
manXYZ増幅Ｌ−スレオニン生産菌の親株として、B-5318株を用いることが出来る。B-5318株は、1987年11月19日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。Ｌ−スレオニン生産菌からのmanXYZ増幅株の構築は、実施例１に記載のプラスミドを用いて行うことが出来る。
【０１３８】
B-5318株を、実施例1で用いたmanXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZと、比較対照用プラスミドpSTV29で形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、manXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZ導入株をB-5318（pS-manXYZ）株、比較対照用プラスミドpSTV29導入株をB-5318（pSTV29）株と名づけた。
【０１３９】
B-5318（pS-manXYZ）株とB-5318（pSTV29）株を20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注しグリセロールストックにして、-80℃に保存した。
【０１４０】
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において40時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−スレオニン量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
【０１４１】
40時間目のOD、Ｌ−スレオニン蓄積を表に示す。表から分かるように、B-5318（pS-manXYZ）株は、bglF遺伝子を導入しないB-5318（pSTV29）株と比較して多量のＬ−スレオニンを蓄積した。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
［エシェリヒア属細菌 L-スレオニン生産培地］
グルコース 60g/L
硫酸アンモニウム 16g/L
リン酸２水素カリウム 0.7g/L
硫酸マグネシウム・７水塩 .0g/L
硫酸鉄・７水塩 0.01g/L
硫酸マンガン・７水塩 0.01g/L
酵母エキス 0.5g/L
チアミン塩酸塩 0.2mg/L
L-イソロイシン 0.05g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。また、炭酸カルシウムは、180℃にて3時間乾熱滅菌した。培地温度が60℃以下となってから、予めフィルターDISMIC-25cs 0.2 mm filter (ADVANTEC)で滅菌したチアミン塩酸塩溶液を終濃度が0.2mg/Lとなるように添加した。
【実施例５】
【０１４４】
パントエア属細菌L-グルタミン酸生産株でのマンノースPTS増幅の効果
マンノースPTS増強Ｌ−グルタミン酸生産菌の親株として パントエア・アナナティスAJ13601株を用いることが出来る。なお、パントエア・アナナティスAJ13601株は経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号FERM P-17516として1999年8月18日に寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。Ｌ−グルタミン酸生産菌からのmanX,Y,Z増幅株の構築は、実施例１のプラスミドを用いて行うことが出来る。
【０１４５】
マンノースPTS増強株は、Ｌ−グルタミン酸生産培地で培養し、往復振とう培養装置で培養する。培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量を公知の方法により測定し、Ｌ−グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したマンノースPTS増強株を取得することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】pMW118-attＬ−Tc-attR及びpMW118-attＬ−Cm-attRの構造を示す。
【図２】pMW-intxis-tsの構造を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にL−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸等のL-アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−リジンの製造法としては、例えば、特許文献１〜４に記載された方法を挙げることができる。一方、Ｌ−アルギニンの製造法としては、例えば、特許文献５、６または１４に記載された方法を挙げることができる。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように改変された微生物などが用いられている。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸の生産能を向上させる方法として、Ｌ−アミノ酸の取り込み系、又は排出系を改変する方法が知られている。例えば取り込み系に関しては、Ｌ−アミノ酸の細胞内への取り込み系を欠失又は低下させることにより、Ｌ−アミノ酸生産能を高める方法がある。例えば、gluABCDオペロン又はその一部を欠失させ、L-グルタミン酸の取り込みを欠失又は低下させる方法(例えば、特許文献７参照)等が知られている。
【０００４】
また、排出系を改変する方法としては、Ｌ−アミノ酸生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損または弱化させる方法、及びＬ−アミノ酸の排出系を強化する方法が知られている。前者の方法として、目的アミノ酸がＬ−グルタミン酸の場合に、α−ケトグルタレートパーミアーゼ遺伝子を変異又は破壊することにより、目的物質の中間体であるα-ケトグルタル酸の排出を弱化する方法(例えば、特許文献８参照)が知られている。
【０００５】
後者のＬ−アミノ酸の排出系を強化する方法としては、例えばL-リジン、Ｌ−アルギニン排出遺伝子(LysE)（例えば、非特許文献１参照）の発現を強化したコリネバクテリウム属微生物の菌株を用いたＬ−リジンの製造法（例えば、特許文献９参照）又はＬ−アルギニンの製造法（例えば、特許文献１０参照）が知られている。また、Ｌ−アミノ酸の排出に関与することが示唆されている遺伝子である、ｒｈｔＡ，Ｂ，Ｃ遺伝子（例えば、特許文献１１参照）又はｙｆｉＫ、ｙａｈＮ遺伝子等（例えば、特許文献１２参照）の発現を強化したエシェリヒア属細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法も報告されている。
【０００６】
上記に示したＬ−アミノ酸生合成経路の改変、及びＬ−アミノ酸の取込み、排出系の改変以外に、Ｌ−アミノ酸の生産能を向上させる方法の一つとして、原料である糖の取込み能力を改変することが挙げられる。糖を取り込む輸送体として、例えば、ホスホエノールピルビン酸：糖リン酸転移系（以下PTS：フォスフォトランスフェラーゼともいう。）が広く知られており、さらに、PTSは基質に依存しない共通系EI（ptsIによってコードされる）、HPr（ptsHによってコードされる）と基質特異的な構成成分EIIに分類される。グルコース特異的なEIIはptsG、crrによってコードされ、さらにcrr遺伝子はptsH、ptsIとオペロン構造を取ることが知られている。既に、ptsG遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸製造法（特許文献１３）やptsH、ptsI、crr遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸製造法（特許文献１４）が知られている。
【０００７】
上記で示したグルコースPTS以外にも、マンノースに特異的なフォスフォトランスフェラーゼ（PTS）をコードする遺伝子としてmanXYZが知られているが（非特許文献２）、現在までに、マンノースPTSをコードする遺伝子を増強し、アミノ酸の生産に利用している報告はない。
【特許文献１】欧州特許出願公開０８５７７８４号明細書
【特許文献２】特開平１１−１９２０８８号公報
【特許文献３】国際公開第００／５３７２６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ９６／１７９３０号パンフレット
【特許文献５】欧州特許出願公開０９９９２６７号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開１１７０３５８号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開１０３８９７０号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／００５９５９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９７／２３５９７号パンフレット
【特許文献１０】米国特許出願公開２００３−０１１３８９９号明細書
【特許文献１１】特開２０００−１８９１７７号公報
【特許文献１２】欧州特許出願公開１０１６７１０号明細書
【特許文献１３】国際公開第０３／０４６７０号明細書
【特許文献１４】国際公開第０３／０４６７４号明細書
【非特許文献１】ジャーナル・オヴ・モレキュラー・マイクロバイオロジー・バイオテクノロジー（J Mol Microbiol Biotechnol） 1999 Nov;1(2):327-36
【非特許文献２】モレキュラー・マイクロバイオロジ（MolecularMicrobiology）1998 27 (2),369-380
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、マンノースPTS活性を増強するように改変した腸内細菌科に属する微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTS活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２） 前記マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりマンノースPTSをコードする遺伝子の発現が増強された、腸内細菌科に属する微生物を用いた（１）に記載の製造法。
（３）上記マンノースPTSが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項または2に記載の製造法。
（Ａ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群より選ばれる一種又は二種以上のタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつマンノースPTS活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる一種又は二種以上のタンパク質
（４） 前記マンノースPTSをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造法：
（ａ）配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号1の塩基番号72〜2767の塩基配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンノースPTS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）記微生物がエシェリヒア属細菌、パントエア属細菌である（１）〜（４）のいずれかに記載の製造法。
（６） 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、L-アミノ酸、特にL-リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTS活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１４】
L-アミノ酸の種類は特に制限されないが、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリンの塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシンの脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリンのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリンの環式アミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファンの芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニンの含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１５】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
以下に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００１６】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内細菌科に属する微生物であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる。（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。
【００１７】
本発明のエシェリヒア属細菌を得るために用いるエシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C.et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1029 table 1） に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W311（ATCC27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１８】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００１９】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２０】
以下、腸内細菌科に属する微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法について述べる。
【００２１】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２２】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。またＬ−アミノ酸生産菌は、遺伝子組換えによって、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。
【００２３】
Ｌ−リジン生産能を有するＬ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000−189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。WC196株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にＡＥＣ(Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン)耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
【００２４】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇することによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。
【００２５】
例えば、以下のようにして、Ｌ−リジン生合成系の酵素をコードする遺伝子を宿主に導入することによって、Ｌ−リジン生産能を付与することができる。すなわち、Ｌ−リジン生合成系遺伝子をコードする遺伝子断片を、Ｌ−リジンの製造に用いる宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これで宿主を形質転換する。形質転換により宿主細胞内のＬ−リジン生合成系酵素コードする遺伝子のコピー数が上昇し発現量が増強する結果、これらの酵素の活性が増強される。
【００２６】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、宿主微生物中で発現することができる遺伝子であれば、特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子、コリネ型細菌由来の遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカムのいずれも全ゲノム配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリ K-12等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。
【００２７】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、腸内細菌科において自律複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228（宝バイオ社）、pMW119（ニッポンジーン社）、pUC19、pSTV29（宝バイオ社製）,RSF1010 （Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）,等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００２８】
目的遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。目的遺伝子は、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。上記のようにして調製した組換えＤＮＡを微生物に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。このような方法により作成されたプラスミドとして、dapA、dapB及びLysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）が挙げられる。
【００２９】
また、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の発現増強は、目的遺伝子を微生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。またL−リジン生合成系遺伝子は、元々染色体上に存在する遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、染色体上の不要な領域あるいは欠損することによって、L-リジン収率が向上する遺伝子領域に導入してもよい。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内の目的遺伝子のコピー数が上昇する結果、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性が増強される。
【００３０】
Ｌ−リジン生合成系酵素の活性増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーターが強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、目的遺伝子の発現が強化されることによって酵素活性が増幅される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。
【００３１】
また、目的遺伝子の発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変することによっても達成される(Hamilton et al,; J Bacteriol. 1989 Sep;171(9):4617-22.)。 国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。目的遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することが出来る。発現調節配列の置換は、例えば、上述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
【００３２】
さらに、本発明のＬ−リジン生産菌は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、L-リジン生成に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイムがあり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO 95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【００３３】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Journal of biological Chemistry272:8611-8617（1997）。また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００３４】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する微生物に形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645、米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００３５】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素活性を増強する方法、酵素活性を低下させる方法は、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種にも同様に適用することができる。以下、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種方法について述べる。
【００３６】
本発明に用いられるＬ−グルタミン酸生産菌は、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を挙げることが出来る。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどをが挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。
【００３７】
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物としては、米国特許6,197,559号、6,331,419号明細書、欧州特許0999282号明細書に記載された微生物が例示できる。
【００３８】
また、さらに６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を用いてもよい。（欧州特許出願公開1352966号明細書）
【００３９】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する腸内細菌科に属する微生物としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させた微生物を用いてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００４０】
腸内細菌科に属する微生物の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、米国特許5,573,945米国特許6,197,559号明細書、米国特許6,331,419号明細書に記載されている。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した腸内細菌科に属する微生物としては、具体的には、
パントエア・アナナティス AJ13601 (FERM BP-7207)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410株（FERM BP-6617）
パントエア・アナナティス AJ13355 (FERM BP-6614)
エシェリヒア・コリ AJ12949 （FERM BP-4881）
等が挙げられる。
【００４１】
本発明に用いられるＬ−トリプトファン生産菌として好ましいものは、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強された細菌である。アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性を強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子を腸内細菌科に属する微生物に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。このような細菌としてより具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェリヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミドpGH5（国際公開第94/08031号パンフレット参照）を導入することによって得られる形質転換株が挙げられる。
【００４２】
また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入された細菌も、好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリが挙げられる（特開昭57-71397号公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
【００４３】
さらに、Ｌ−トリプトファン生産菌として、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有する菌株エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL B-12263〕株、及びトリプトファンオペロンを含むプラスミドpGX50を保持するAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕株（いずれも米国特許第 4,371,614号明細書参照）が挙げられる。
【００４４】
また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損した株、trpRに変異が導入された株も好適なＬ−トリプトファン生産菌である。（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）
【００４５】
L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい。（欧州特許763127号明細書参照）
【００４６】
本発明に用いられるＬ−スレオニン生産菌として好ましいものは、L-スレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコ−ドする遺伝子としては、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコ−ドされるアスパルトキナ−ゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナ−ゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンタ−ゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナ−ゼ活性が欠損したTDH６株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００４７】
L−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のL−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、L−スレオニン生産菌を構築するためには、L−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにL−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA,thrB,thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエ−タ−構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエ−ション領域のリ−ダ−配列あるいは、アテニュエ−タ−を除去することにより達成出来る。（国際公開第02/26993号パンフレット、Biotechnology Letters vol24,No.21,November 2002、国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００４８】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモ−タ−が存在するが、non−nativeのプロモ−タ−に置換してもよいし（WO 98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサ−およびプロモ−タ−により支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、L−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにエシェリヒア属細菌を改変するために、α−amino−β−hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても得られる。
【００４９】
このようにL−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピ−数が上昇しているか、あるいは強力なプロモ−タ−に連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピ−数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等で染色体上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００５０】
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、L−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。
【００５１】
L−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのL−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナ−ゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノ−ルピルビン酸シンタ−ゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００５２】
また、L−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、L−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にL−スレオニン耐性、L−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res Microbiol. 2003 Mar;154(2):123−35.)、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）yfiK,yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にL−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００５３】
L-スレオニン生産菌として、エシェリヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することも出来る。このVKPM B-3996株は、１９８７年１１月１９日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-3996 のもとに寄託されている。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D.Plasmid, 1986, 16, 161-167を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（国際公開第90/04636号パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００５４】
また、エシェリヒア・コリB-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)も例示することができる。B-5318株は、1987年11月19日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、ＰRプロモーターおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。
【００５５】
本発明に用いるＬ−ヒスチジン生産菌として好ましいものは、Ｌ−ヒスチジン生合成に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだベクターを導入したエシェリヒア・コリFERM-P5038,5048株 (特開昭56-005099)や、アミノ酸排出遺伝子Rhtを導入した菌株（欧州特許公開公報1016710）、スルファグアニジン、D,L-1,2,4-triazole-3-alanine、ストレプトマイシン耐性が付与されたエシェリヒア・コリ80株（VKPM B-7270 ロシア特許公報2119536号）等が挙げられる。
【００５６】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する微生物としては、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量を増強した微生物を用いてもよい。Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素としては、ATP フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、フォスフォリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ（hisI）、フォスフォリボシル-ATP ピロフォスフォヒドラーゼphosphoribosyＬ−ATP pyrophosphohydrolase（hisIE）、フォスフォリボシルフォルミミノー５−アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼphosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase（hisA）、アミドトランスフェラーゼamidotransferase (hisH）、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチヂノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ（hisD）等が挙げられる。
【００５７】
本発明のＬ−システイン生産菌として好ましいものは、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下した細菌（特開2003-169668号公報）や、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌（特開平11-155571号公報）が挙げられる。
【００５８】
本発明のＬ−プロリン生産菌として好ましいものは、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）が挙げられる（特開2002−300874号公報）。
【００５９】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、tyrA,tyrRが欠損したAJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、yedA増幅株（国際公開第03/044192号パンフレット）が挙げられる。また、L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族共通の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）
【００６０】
Ｌ−アルギニン生産菌としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭５６−１０６５９８号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼ及び同酵素を保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ２３７株（ロシア特許出願第２０００１１７６７７号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ） にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ３８２株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ３８２株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の番号で寄託されている。
【００６１】
またＬ−アルギニン生産能を有する微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。中でもN-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である。（欧州出願公開1170361号明細書）
【００６２】
Ｌ−ロイシン生産菌としては、ｉｌｖＥ遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、ｔｙｒＢ遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増強させたエシェリヒア属細菌（特開2004-024259）4-アザロイシン又は5,5,5−トリフルオロロイシンに耐性を有する、エシェリヒア・コリH-9068株（ATCC21530）、エシェリヒア・コリH-9070株（FERM BP-4704）、エシェリヒア・コリH-9072株（FERM BP-4706）（米国特許第5,744,331号明細書）、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作されたエシェリヒア・コリ株（欧州特許第1067191号明細書）、β−２チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有するエシェリヒア・コリAJ11478株（米国特許第5,763,231号明細書）などを用いることもできる。
【００６３】
Ｌ−イソロイシン生産菌としては、Ｌ−イソロイシン生産能を有する６−ジメチルアミノプリン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−３０４９６９号公報）、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメート耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、チアイソロイシン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、ＤＬ−エチオニン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、アルギニンハイドロキサメートに耐性の変異株（特開平５−１３０８８２号公報）があり、組換え体エシェリヒア属細菌としては、Ｌ−イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強した菌株（特開平２−４５８号公報、特開平２−４２９８８号公報、特開平８−４７３９７号公報）等が挙げられる。
【００６４】
Ｌ−バリン生産菌としては、例えばエシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5,658,766）等が挙げられる。また、ＷＯ９６／０６９２６に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損する変異を有 するＬ−バリン生産菌、あるいは、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤの各遺伝子を発現し、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌も、本発明の親株として好適に使用することができる。尚、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（米国特許5,998,178号明細書））。また、オペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。上記のような、アテニュエーションが解除されるileS17変異を持つエシェリヒア・コリVL1970は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（RussianNational Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、VKPM B-4411の登録番号で寄託されている。
【００６５】
＜１−２＞マンノースPTSの活性増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、マンノースPTSの酵素活性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、先にマンノースPTSの酵素活性が上昇する改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。本発明におけるマンノースPTSとは、フォスフォエノールピルビン酸（以下PEPと呼ぶ）のリン酸基を糖に転移させ、同時にCytoplasmに取り込む活性を意味する。ここで糖とは、マンノースを意味するが、グルコース、フラクトース、アミノ糖であってもよい。（Molecular Microbiology (1998) 27(2),369-380）
【００６６】
マンノースPTSの酵素活性の増強は、Chenらの方法（Biochemistry 1998 37:8714-8723）により、in vitroでリン酸化活性を測定することにより確認できる。（EC 2.7.1.69 ）マンノースPTSをコードする遺伝子の発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。酵素活性の上昇については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、酵素活性の増強は、目的とするタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００６７】
マンノースPTSの酵素活性は、マンノースPTSをコードする後述するmanX、manY、manZ遺伝子の発現量を上昇するように改変することによって達成でき、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性manX、manY、manZ遺伝子の発現増強であってもよいし、manX、manY、manZ遺伝子を含むプラスミドの導入、染色体上のmanX、manY、manZ遺伝子増幅によるコピー数の上昇などによる外因性manX、manY、manZ遺伝子の発現増強であってもよい。manX、manY、manZ遺伝子はオペロン構造(以下manXYZオペロンと呼ぶ)を形成しており、manXYZオペロンの発現調節領域をより強力なものに改変すること、manXYZオペロンのコピー数を上昇することがより効果的である。
【００６８】
エシェリヒア・コリの全ゲノム配列は既に決定されており、(Science 277:1453-1462(1997))各遺伝子の機能とGenbank登録番号は以下の通りである。
【００６９】
【表１】
【００７０】
本発明のmanX、manY、manZ遺伝子とは、エシェリヒア属細菌のmanX、manY、manZ遺伝子、及びそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのmanX遺伝子としては、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、manY遺伝子は配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、manZ遺伝子は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を例示することができる。エシェリヒア・コリMG1655由来のｍanX,Y,Z遺伝子のGenebank Accession No.と配列番号１のコード領域を表１に示す。
【００７１】
manX、manY、manZ遺伝子ホモログとは、他の微生物由来で、エシェリヒア属細菌のmanX、manY、manZ遺伝子構造が高い類似性を示し、宿主に導入した際にL-アミノ酸の生産能を向上させ、マンノースPTS活性を示す遺伝子をいう。例えばmanX,Y,Zのホモログとしては、サルモネラ属、シゲレラ属、エルシニア等のGenbankに登録されているmanX、manY、manZ遺伝子が挙げられる。 さらに、manX,Y,Z遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌、バチルス属細菌からクローニングされるものであってもよい。また、表1に示すように、エシェリヒア属細菌のmanXYZと相同性が高ければ、異なる遺伝子名が付与されているものでもよい。例えば、マンノースPTSをコードする遺伝子は、配列番号５、配列番号６の合成オリゴヌクレオチドを用いてクローニング出来る。
【００７２】
また、本発明に用いるマンノースPTSをコードする遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるマンノースPTSタンパク質の機能、すなわちマンノースPTS活性が損なわれない限り、配列番号２、３、４のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、マンノースPTS活性が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe,Trp,Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu,Ile,Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln,Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys,Arg,His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp,Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser,Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、上記置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、マンノースPTSをコードする遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号５に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。
【００７３】
さらに、マンノースPTSをコードする遺伝子は、配列番号２、３、４のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ、マンノースPTSをコードする配列を用いることが出来る。また、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれマンノースPTSをコードする遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にマンノースPTSをコードする遺伝子は、マンノースPTSの機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したものあるいは削られているものでもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号６のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、Ｃ末端側50アミノ酸から5アミノ酸延長・削除したでもよい。
【００７４】
また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列に示す塩基配列を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。これらの遺伝子がマンノースPTS活性を有するタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子を適当な細胞で発現させ、マンノースの取り込み能が向上しているか、あるいはChenらの方法（Biochemistry 1998 37:8714-8723）により、in vitroでリン酸化活性を調べることにより、確かめることができる。
【００７５】
また、マンノースPTSをコードする遺伝子は配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含む塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマンノースPTS有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７６】
プローブとして、配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含むＤＮＡ、、または一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００７７】
マンノースPTSをコードする遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の上述のようなマンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、マンノースPTSをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００７８】
マンノースPTSをコードする遺伝子としてエシェリヒア・コリのmanX,Y,Z遺伝子を用いる場合、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号5及び6に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、manX,Y,Z遺伝子を取得することができる。他の腸内細菌科に属する微生物のマンノースPTSをコードする遺伝子も、その微生物において公知のmanX,Y,Z遺伝子もしくは他種の微生物のmanX,Y,Z遺伝子又は、マンノースPTSタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００７９】
次に、PCR法により増幅されたマンノースPTSをコードする遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010, pBR322, pMW219（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV29(宝バイオ社より入手可)等が挙げられる。
【００８０】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。
【００８１】
一方、マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めることは、上述のようなマンノースPTSをコードする遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にマンノースPTSをコードする遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、染色体上に存在するmanXYZオペロンの横にタンデムに連結させてもよいし、染色体上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。manX、manY、manZ遺伝子はオペロン構造(以下manXYZオペロンと呼ぶ)を形成しており、manXYZオペロンのコピー数を上昇させるとより効果的である。
【００８２】
あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、マンノースPTSをコードする遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上に遺伝子が転移したことの確認は、マンノースPTSをコードする遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００８３】
さらに、マンノースPTSをコードする遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、染色体DNA上またはプラスミド上のmanXYZオペロンのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、manXYZオペロンの発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、manXYZオペロンの発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、manXYZオペロンのプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。manXYZオペロンのプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりマンノースPTSをコードする遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。
【００８４】
マンノースPTSタンパク質の活性を増強するために、マンノースPTS活性が上昇するような変異をmanX,Y,Z遺伝子に導入してもよい。manX,Y,Z遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が上昇するような変異としては、manXYZオペロンの転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、マンノースPTSの比活性が高くなるような遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００８５】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする製造法である。
【００８６】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトースを炭素源として用いることが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００８７】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００８８】
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。
【００８９】
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【００９０】
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
［参考例１］リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築
＜１−１＞リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築
【００９１】
まずリジンデカルボキシラーゼ非産生株の構築を行った。破壊の方法は、WO2005/01075号記載のRedドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）と組合わせた方法で破壊を行った。リジンデカルボキシラーゼは、cadA遺伝子（Genbank Accession No. NP_418555. 配列番号42）、ldcC遺伝子（Genbank Accession No. NP_414728. 配列番号44）によってコードされている（国際公開WO96/17930号パンフレット参照）。ここで親株は、WC196株を用いた。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
【００９２】
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA、ldcC遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH， Gumport RI， Gardner JF.）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
【００９３】
（１）cadA遺伝子の破壊
【００９４】
PCRの鋳型としてPCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attＬ−Cm-attRを使用した。pMW118-attＬ−Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attＬ−cat-attRの順で挿入されている。（WO2005/01075号参照）attL配列を配列番号１１に、attR配列を配列番号１２に示す。
【００９５】
このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、目的遺伝子であるcadA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に有する配列番号４６及び４７に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。
【００９６】
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリWC196株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、 第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をWC196株の染色体に組み込むために必要である。
【００９７】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養したエシェリヒア・コリWC196株を、アンピシリン（20mg/L）とＬ−アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でＣｍ（クロラムフェニコール）(25mg/L)を含むＬ−寒天培地上で平板培養し、Ｃｍ耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むＬ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
【００９８】
クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のcadA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたcadA欠損株をWC196ΔcadA::att-cat株と名づけた。
【００９９】
次に、cadA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-tsを使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子(配列番号１３)、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子（配列番号１５）を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。pMW-intxis-ts導入により、染色体上のattL(配列番号１１)あるいはattR(配列番号１２)を認識して組換えを起こしattLとattRの間の遺伝子を切り出し、染色体上にはattLあるいはattR配列のみ残る構造になる。
【０１００】
上記で得られたWC196ΔcadA::att-cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、３０℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むＬ−寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、Ｌ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、att-cat、及びpMW-intxis-tsが脱落しているcadA破壊株であるクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAと名づけた。
【０１０１】
（２）WC196ΔcadA 株のldcC遺伝子の欠失
WC196ΔcadA 株におけるldcC遺伝子の欠失は、上記手法に則って、ldcC破壊用プライマーとして、配列番号４８、４９のプライマーを使用して行った。これによって、cadA ldcC破壊株であるWC196ΔcadAΔldcCを得た。
【０１０２】
（３）PCR鋳型及びヘルパープラスミドの調製
PCRの鋳型pMW118-attＬ−Cm-attR及びヘルパープラスミドpMW-intxis-tsは以下のように調製した。
【０１０３】
（３−１） pMW118-attＬ−Cm-attR
pMW118-attＬ−Cm-attRの構築は、pMW118-attＬ−Tc-attRを基にした。下記の四つのDNA断片を連結した。
【０１０４】
１）オリゴヌクレオチドP1及びP2（配列番号１７及び１８）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはBglII及びEcoRIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli W3350株（λプロファージを含む）の染色体の相当する配列をPCR増幅することにより得たattLを含むBglII-EcoRI DNA断片(120 bp)（配列番号１１）。
【０１０５】
２）オリゴヌクレオチドP3及びP4（配列番号１９及び２０）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはPstI及びHindIIIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli W3350株（λプロファージを含む）の染色体の相当する配列をPCR増幅することにより得たattRを含むPstI-HindIII DNAフラグメント(182 bp)（配列番号１２）。
【０１０６】
３）pMW118-ter_rrnBのラージBglII-HindIII断片(3916 bp)。pMW118-ter_rrnBは下記の三つの断片を連結することにより得られたものである。
pMW118をEcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いでAatII制限エンドヌクレアーゼで切断することで得たpMW118のAatII-EcoRIpol断片を含むラージ断片(2359 bp)。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドP5及びP6（配列番号２１及び２２）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはAatII及びBglIIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、pUC19プラスミドの相当する配列をPCR増幅することにより得た、アンピシリン耐性(ApR)のbla遺伝子を含む、pUC19のAatII-BglIIスモール断片(1194bp)。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドP7及びP8（配列番号２３及び２４）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはBglII及びPstIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli MG1655株の染色体の相当する領域をPCR増幅することにより得た転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstIpolスモール断片(363 bp)。
【０１０９】
４）テトラサイクリン耐性遺伝子及び転写ターミネーターter_thrLをpMＬ−Tc-ter_thrLのスモールEcoRI-PstI断片(1388 bp)（配列番号２９）。pMＬ−Tc-ter_thrLは下記のように得られたものである。
【０１１０】
pMＬ−MSC(2001 #5)をXbaI及びBamHI制限エンドヌクレアーゼで切断し、そのラージ断片(3342 bp)を、ターミネーターter_thrLを含むXbaI-BamHI断片(68 bp)と連結した。XbaI-BamHI断片は、オリゴヌクレオチドP9及びP10（配列番号２５及び２６）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはXbaI及びBamHIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、E. coli MG1655株の染色体の相当する領域をPCR増幅することにより得た。この連結反応の産物をプラスミドpMＬ−ter_thrLとした。
【０１１１】
pMＬ−ter_thrLをKpnI及びXbaI制限エンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いで、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むpBR322のスモールEcoRI-Van91I断片(1317 bp)（EcoRI及びVan91I制限エンドヌクレアーゼでpBR322を、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理した。）と連結した。この連結反応の産物をプラスミドpMＬ−Tc-ter_thrLとした。
【０１１２】
以上のようにしてpMW118-attＬ−Tc-attRを得た。
pMW118-attＬ−Cm-attRは、pMW118-attＬ−Tc-attRのラージBamHI-XbaI断片(4413 bp)と、プロモーターPA2（T7ファージの初期プロモーター）、クロラムフェニコール耐性(CmR)のcat遺伝子、転写ターミネーターter_thrL及びattRを含むBglII-XbaI人工DNA断片(1162bp)とを連結して構築した。人工DNA断片（配列番号３０）は、下記のようにして得た。
【０１１３】
MＬ−MSC (2001 #5)をKpnI及びXbaI制限エンドヌクレアーゼで切断し、次いでプロモーターPA2（T7ファージの初期プロモーター）を含むスモールKpnI-XbaI断片(120 bp)と連結した。KpnI-XbaI断片は、オリゴヌクレオチドP11及びP12（配列番号２７及び２８）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはKpnI及びXbaIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、T7ファージDNAの相当する領域をPCR増幅することにより得た。この連結反応の産物をプラスミドpMＬ−PA2-MCSとした。
【０１１４】
pMＬ−PA2-MCSから、XbaI部位を除去した。得られた産物をプラスミドpMＬ−PA2-MCS(XbaI-)とした。
【０１１５】
プロモーターPA2（T7ファージの初期プロモーター）及びクロラムフェニコール耐性(CmR)のcat遺伝子を含む、pMＬ−PA2-MCS(XbaI-)のスモールBglII-HindIII断片(928 bp)を、転写ターミネーターter_thrLおよびattRを含む、pMW118-attＬ−Tc-attRのスモールHindIII-HindIII断片(234 bp)と連結した。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドP9及びP4（配列番号２５及び２０）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはHindIII及びXbaIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、連結反応混合物をPCR増幅することにより目的の人工DNA断片(1156 bp)を得た。
【０１１７】
（３−２） pMW-intxis-ts
最初に、λファージDNA（Fermentas）を鋳型として二つのDNA断片を増幅した。第一の断片は、nt 37168〜38046（配列番号３９）の領域からなり、cIレプレッサー、プロモーターPrm及びPr並びにcro遺伝子のリーダー配列を含むものであった。この断片は、オリゴヌクレオチドP1'及びP2'（配列番号３１及び３２）をプライマーとして用いた増幅により得た。第二の断片は、λファージのxis-int遺伝子を含む、nt 27801〜29100（配列番号４０）の領域からなるものであった。この断片は、オリゴヌクレオチドP3'及びP4'（配列番号３３及び３４）をプライマーとして用いた増幅により得た。全てのプライマーは、適切なエンドヌクレアーゼ認識部位を有していた。
【０１１８】
cIレプレッサーを含む、得られたPCR増幅断片を、ClaI制限エンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いで、EcoRI制限エンドヌクレアーゼで切断した。第二のPCR増幅断片をEcoRI及びPstI制限エンドヌクレアーゼで切断した。一方、プラスミドpMWPlaclacI-tsを、BglIIエンドヌクレアーゼで切断し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理し、次いでPstI制限エンドヌクレアーゼで切断した。pMWPlaclacI-tsのベクター断片をアガロースゲルから溶出し、切断したPCR増幅断片と連結した。
【０１１９】
プラスミドpMWPlaclacI-tsは、下記の部分からなるpMWPlaclacIの誘導体である。1) PlacUV5プロモーター及びバクテリオファージT7遺伝子10のRBSの制御下のlacI遺伝子を含むBglII-HindIII人工DNA断片、2) オリゴヌクレオチドP5'及びP6'（配列番号３５及び３６）をプライマーとして用いて（これらのプライマーはAatII及びBglIIエンドヌクレアーゼの認識部位を付加的に含む）、pUC19プラスミドの相当する領域をPCR増幅することにより得た、アンピシリン耐性(ApR)遺伝子を含むAatII-BglII断片、3) 組換えプラスミドpMW118-ter_rrnBのAatII-PvuI断片を含むAatII-HindIII断片。プラスミドpMW118-ter_rrnBは、以下のようにして構築した。適切なエンドヌクレアーゼ認識部位を含むオリゴヌクレオチドP7'及びP8'（配列番号３７及び３８）をプライマーとして用いて、E. coli MG1655株の染色体の相当する領域をPCR増幅することにより、ターミネーターter_rrnBを含むPstI-HindIII断片を得た。連結の前に、pMW118及びter_rrnB断片（相補鎖、配列番号４１）を、PvuIまたはPstIでそれぞれ制限し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片で処理してブラント端にし、次いで、AatIIまたはHindIIIエンドヌクレアーゼで切断した。pMWPlaclacI-ts変異体の構築には、プラスミドpMWPlaclacIのAatII-EcoRV断片を、pSC101レプリコンのpar、ori及びrepAts遺伝子を含むプラスミドpMAN997のAatII-EcoRV断片で置換した。
［実施例］
【実施例１】
【０１２０】
マンノースPTS活性増強用プラスミドの構築
<1-1> manXYZ増幅用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)の染色体の全塩基配列は既に明らかにされており（Science, 277, 1453-1474 (1997)）、この文献に報告されているmanXYZ遺伝子の塩基配列（Genbank Accession No.NP416331,416332,416333）に基づいて、５’プライマーとしてSse8387Iサイトを有した配列番号5の合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとしてXbaIサイトを有した配列番号６に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、制限酵素Sse8387I及びXbaIにて処理し、manXYZ遺伝子を含む遺伝子断片を得た。
【０１２１】
精製したＰＣＲ産物を、Sse8387I及びXbaIで消化したベクターpMW219（ニッポンジーン社製）に連結してmanXYZ増幅用プラスミドpM-manXYZを構築した。本プラスミドはmanXYZ遺伝子がlacプロモーターに正方向に連結しており、その制御下にある。また、pM-manXYZをSse8387I及びEcoRIで消化し、manXYZ遺伝子断片を回収、精製し、Sse8387I及びEcoRIで消化したベクターpSTV29（タカラ酒造社製）に連結してプラスミドpS-manXYZを構築した。
【０１２２】
＜1-2＞ptsG増幅用プラスミドの構築
上記manXYZ遺伝子と同様に、ptsG遺伝子発現用プラスミドの構築を行った。（配列番号50）５’プライマーとしてHindIIIサイトを有した配列番号７の合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとしてXbaIサイトを有した配列番号８に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行い、制限酵素HindIII及びXbaIにて処理し、ptsGを含む遺伝子断片を得た。精製したＰＣＲ産物を、HindIII及びXbaIで消化したベクターpMW219に連結してptsG増幅用プラスミドpM-ptsGを構築した。本プラスミドはptsG遺伝子がlacプロモーターに正方向に連結しており、その制御下にある。また、manXYZと同様に、pM-ptsGからptsG遺伝子断片を切り出し、ベクターpSTV29に連結してプラスミドpS-ptsGを構築した。
【実施例２】
【０１２３】
エシェリヒア属細菌L-リジン生産株でのmanXYZ増幅の効果
エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産株として、実施例１のWC196ΔldcCΔcadA株をdapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）pCABD2で形質転換したWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2）株を用いた。
【０１２４】
WC196ΔldcCΔcadA株を、実施例1で作製したmanXYZ増幅用プラスミドpM-manXYZとptsG増幅用プラスミドpM-ptsG、及び比較対照用プラスミドpMW219で形質転換し、カナマイシン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、manXYZ増幅用プラスミドpM-manXYZ導入株をWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-manXYZ）株、ptsG増幅用プラスミドpM-ptsG導入株をWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-ptsG）株、及び比較対照用プラスミドpMW219導入株をWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pMW219）株と名づけた。
【０１２５】
上記で作製した株を25 mg/Lのカナマイシンを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し、-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
【０１２６】
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、25 mg/Lのカナマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、25 mg/Lのカナマイシンを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において24時間培養した。培養後、培地中に蓄積したL-リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。
【０１２７】
２４時間目のOD、Ｌ−リジン蓄積を表１に示す。表1から分かるように、WC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-manXYZ）株は、manXYZ遺伝子を導入しないWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pMW219）株と比較して多量のL-リジンを蓄積した。また、ptsG遺伝子を導入したWC196ΔldcCΔcadA（pCABD2,pM-ptsG）株と比較してもリジン蓄積量の向上が確認され、L-リジン生産におけるmanXYZ遺伝子の強化はptsG増強より効果があることが示唆された。
【０１２８】
【表２】
【０１２９】
［エシェリヒア属細菌 L-リジン生産培地］
グルコース 40g/L
硫酸アンモニウム 24g/L
リン酸２水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩 1.0g/L
硫酸鉄４・７水塩 0.01g/L
硫酸マンガン４・７水塩 0.01g/L
酵母エキス 2.0g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
【実施例３】
【０１３０】
エシェリヒア属細菌L-グルタミン酸生産株でのmanXYZ増幅の効果
エシェリヒア・コリのＬ−グルタミン酸生産株として、AJ12949株を用いた。AJ12949株はα―ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した菌株であり、平成５年１２月２８日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14039として寄託され、平成6年11月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-4881が付与されている。
【０１３１】
AJ12949株を、実施例1で作成したmanXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZと、比較対照用プラスミドpSTV29で形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、manXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZ導入株をAJ12949（pS-manXYZ）株、比較対照用プラスミドpSTV29導入株をAJ12949（pSTV29）株と名づけた。
【０１３２】
AJ12949（pS-manXYZ）株とAJ12949（pSTV29）株を20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注しグリセロールストックにして、-80℃に保存した。
【０１３３】
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において40時間培養した。培養後、培地中に蓄積したL-グルタミン酸の量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。
【０１３４】
４０時間目のOD、Ｌ−グルタミン酸蓄積を表２に示す。表２から分かるように、AJ12949（pS-manXYZ）株は、manXYZ遺伝子を導入しないAJ12949（pSTV29）株と比較して多量のグルタミン酸を蓄積した。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
［エシェリヒア属細菌 L-グルタミン酸生産培地］
グルコース 40g/L
硫酸アンモニウム 20g/L
リン酸２水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩 1.0g/L
硫酸鉄４・７水塩 0.01g/L
硫酸マンガン４・７水塩 0.01g/L
酵母エキス 2.0g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。また、培地温度が60℃以下となってから、予めフィルターDISMIC-25cs 0.2 mm filter (ADVANTEC)で滅菌したチアミン塩酸塩溶液を終濃度が0.01g/Lとなるように添加した。
【実施例４】
【０１３７】
エシェリヒア属細菌L-スレオニン生産株でのマンノースPTS増幅の効果
エシェリヒア属細菌L-スレオニン生産株でのmanXYZ増幅の効果
manXYZ増幅Ｌ−スレオニン生産菌の親株として、B-5318株を用いることが出来る。B-5318株は、1987年11月19日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。Ｌ−スレオニン生産菌からのmanXYZ増幅株の構築は、実施例１に記載のプラスミドを用いて行うことが出来る。
【０１３８】
B-5318株を、実施例1で用いたmanXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZと、比較対照用プラスミドpSTV29で形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、manXYZ増幅用プラスミドpS-manXYZ導入株をB-5318（pS-manXYZ）株、比較対照用プラスミドpSTV29導入株をB-5318（pSTV29）株と名づけた。
【０１３９】
B-5318（pS-manXYZ）株とB-5318（pSTV29）株を20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注しグリセロールストックにして、-80℃に保存した。
【０１４０】
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500mL坂口フラスコの、20 mg/Lのクロラムフェニコールを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において40時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−スレオニン量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
【０１４１】
40時間目のOD、Ｌ−スレオニン蓄積を表に示す。表から分かるように、B-5318（pS-manXYZ）株は、bglF遺伝子を導入しないB-5318（pSTV29）株と比較して多量のＬ−スレオニンを蓄積した。
【０１４２】
【表４】
【０１４３】
［エシェリヒア属細菌 L-スレオニン生産培地］
グルコース 60g/L
硫酸アンモニウム 16g/L
リン酸２水素カリウム 0.7g/L
硫酸マグネシウム・７水塩 .0g/L
硫酸鉄・７水塩 0.01g/L
硫酸マンガン・７水塩 0.01g/L
酵母エキス 0.5g/L
チアミン塩酸塩 0.2mg/L
L-イソロイシン 0.05g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。また、炭酸カルシウムは、180℃にて3時間乾熱滅菌した。培地温度が60℃以下となってから、予めフィルターDISMIC-25cs 0.2 mm filter (ADVANTEC)で滅菌したチアミン塩酸塩溶液を終濃度が0.2mg/Lとなるように添加した。
【実施例５】
【０１４４】
パントエア属細菌L-グルタミン酸生産株でのマンノースPTS増幅の効果
マンノースPTS増強Ｌ−グルタミン酸生産菌の親株として パントエア・アナナティスAJ13601株を用いることが出来る。なお、パントエア・アナナティスAJ13601株は経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に受託番号FERM P-17516として1999年8月18日に寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。Ｌ−グルタミン酸生産菌からのmanX,Y,Z増幅株の構築は、実施例１のプラスミドを用いて行うことが出来る。
【０１４５】
マンノースPTS増強株は、Ｌ−グルタミン酸生産培地で培養し、往復振とう培養装置で培養する。培養後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量を公知の方法により測定し、Ｌ−グルタミン酸の蓄積が向上していることを確認する。このような方法でＬ−グルタミン酸生産能の向上したマンノースPTS増強株を取得することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】pMW118-attＬ−Tc-attR及びpMW118-attＬ−Cm-attRの構造を示す。
【図２】pMW-intxis-tsの構造を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTS活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりマンノースPTSをコードする遺伝子の発現が増強された腸内細菌科に属する微生物である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
上記マンノースPTSが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項または2に記載の製造法。
（Ａ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群より選ばれる一種又は二種以上のタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつマンノースPTS活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる一種又は二種以上のタンパク質
【請求項４】
前記マンノースPTSをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造法：
（ａ）配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号1の塩基番号72〜2767の塩基配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンノースPTS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記微生物がエシェリヒア属細菌、パントエア属細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、マンノースPTS活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記マンノースPTSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりマンノースPTSをコードする遺伝子の発現が増強された腸内細菌科に属する微生物である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
上記マンノースPTSが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項または2に記載の製造法。
（Ａ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群より選ばれる一種又は二種以上のタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号２、３、４に示すアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつマンノースPTS活性を有するタンパク質からなる群から選ばれる一種又は二種以上のタンパク質
【請求項４】
前記マンノースPTSをコードする遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造法：
（ａ）配列番号１の塩基番号72〜2767の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号1の塩基番号72〜2767の塩基配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マンノースPTS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記微生物がエシェリヒア属細菌、パントエア属細菌である請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−１１７０７７（Ｐ２００７−１１７０７７Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６０６７２（Ｐ２００５−３６０６７２）
【出願日】平成１７年１２月１４日（２００５．１２．１４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１４日（２００５．１２．１４）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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