ＭＡＬＤＩマトリックス及びＭＡＬＤＩ方法
大気中のエアロゾル及びリアルタイムエアロゾルのＭＡＬＤＩ ＭＳ方法のリアルタイムエアロゾルマススペクトロメトリーの為のマトリックス。本発明は、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーのためのマトリックス物質に、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー、特にはエアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為のマトリックス組成物に、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法、特にはエアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法に、ＭＡＬＤＩマトリックス物質として特定の化合物を使用する方法に、及び気相コーティング方法においてＭＡＬＤＩマトリックス組成物を使用する方法に向けられる。本発明のマトリックス物質は、式（Ｉ）
に従う２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾール又はその互変異性型を含み、ここでＸはＮ、Ｓ又はＯであり、且つＲ１及びＲ２は水素原子、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから独立に選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、置換されていてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよい芳香族環構造を形成する。マトリックス組成物は好ましくは該マトリックス物質及びアルコールを含む。該アルコールはハロゲン化されていてもよい。該ＭＡＬＤＩ ＭＳ方法は、該分析物と該マトリックス物質又は該マトリックス組成物とを接触させること；該分析物の少なくとも一部をイオン化すること、及びマススペクトロメーター、例えばＴＯＦ−ＭＳを用いて該イオン化した成分を分離すること、を含む。好ましくは、バイオエアロゾルが、該気相中で該マトリックス物質と接触させられる。
に従う２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾール又はその互変異性型を含み、ここでＸはＮ、Ｓ又はＯであり、且つＲ１及びＲ２は水素原子、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから独立に選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、置換されていてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよい芳香族環構造を形成する。マトリックス組成物は好ましくは該マトリックス物質及びアルコールを含む。該アルコールはハロゲン化されていてもよい。該ＭＡＬＤＩ ＭＳ方法は、該分析物と該マトリックス物質又は該マトリックス組成物とを接触させること；該分析物の少なくとも一部をイオン化すること、及びマススペクトロメーター、例えばＴＯＦ−ＭＳを用いて該イオン化した成分を分離すること、を含む。好ましくは、バイオエアロゾルが、該気相中で該マトリックス物質と接触させられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法、特定の化合物をエアロゾルＭＡＬＤＩマトリックス物質として使用する方法、及び気相コーティング方法におけるＭＡＬＤＩマトリックス組成物の使用方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
マススペクトロメトリー（ＭＳ）におけるソフトイオン化技術としてのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）の導入は、生化学的に重要なポリマーを含む幅広い種類の高質量化合物の分析に革命をもたらした。ＭＡＬＤＩは、大きく、不揮発性であり且つ熱に不安定な化合物（典型的には４００〜３５００００Ｄａの分子量を有する）、例えばタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド及び合成ポリマーなど、からインタクトな気相イオンの生成を許す方法である。ＭＡＬＤＩ ＭＳ方法に従い、該不安定な分析物分子が該レーザービームにより直接に破壊されるのを防ぐ為に、マトリックスが用いられる。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ ＭＳのソフトイオン化技術は典型的には生体分子の分析を許す。ＭＡＬＤＩ ＭＳは例えば、微生物（の画分）の分析及び分類において用いられる。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析は２つのステップを含む。第一のステップは、該分析物をモル過剰のマトリックス物質と混合することにより試料を調製することを含む。ＭＡＬＤＩプロセスの第二のステップは、レーザー光の強烈な短パルスによる該固体試料のバルク部分の脱離を含む。該マトリックスは３つの目的に従事すると考えられている：分析物の互いからの分離、該分析物が脱離する為のレーザー光からのエネルギーの吸収、及びイオン化の促進。該レーザー光は、イオン化されるべき該マトリックス及び分析物試料の小断片を生じる。得られた気相イオンの分子質量が通常、電場内で該イオン化された分子を加速すること及び飛行時間（ＴＯＦ）検出器においてそれらの質量に基づき該分子を分離することにより決定される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、非常に少量の成分の検出を許す、非常に高感度の方法である。
【０００５】
適用されるマトリックス物質は通常、小さな有機酸である。一般に用いられるマトリックス物質は、３，５−ジメトキシ−４−ケイ皮酸（シナピン酸）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（α−シアノ又はα−マトリックス）及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を含む。典型的には、該マトリックス物質は、高度に精製された水及び他の有機化合物（普通はアセトニトリル（ＡＣＮ））の混合物中に溶解される。普通はいくつかの酸、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）など、も添加される。なぜなら、酸は、該分析物のマススペクトルに対する塩不純物の妨害影響を抑制することができるからである。加えて、該マトリックス溶液のｐＨの低下は通常、該試料の増加した性質、例えばシグナルの増加した数及び強度など、を結果する。
【０００６】
次に、該マトリックス溶液は、調査されるべき該分析物と混合される。該有機化合物（例えばＡＣＮ）は、該試料中の疎水性タンパク質が溶解するのを可能とする一方で、該水は親水性タンパク質が溶解するのを可能とする。慣用のＭＡＬＤＩ方法において、この溶液はＭＡＬＤＩプレート（通常はこの目的の為に設計された金属プレート）上にスポットされる。該溶媒が蒸発し、再結晶化したマトリックスだけを残し、該分析物タンパク質を該マトリックス結晶のいたるところに広げさせる。
【０００７】
一般に、エアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーにおいて、開発は２ラインの試料処理に従う、エアロゾル化の前にマトリックスを分析物と予備混合することによるもの又はエアロゾル粒子のリアルタイムの飛行中のコーティングによるもののいずれか。該飛行中マトリックスコーティングは、大気中のバイオエアロゾルのオンラインエアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを可能とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
リアルタイムエアロゾル単独粒子ＭＡＬＤＩの場合、該エアロゾルは、気相中でマトリックス物質により被覆される必要がある。それ故に、該マトリックス物質は十分に揮発性であるべきである。さらに十分な量のマトリックス物質が該エアロゾルに堆積されるべきである。従来技術において、エアロゾル、特にはバイオエアロゾルについてのＭＡＬＤＩ分析を実施するために、いくつかの試みがなされてきた。
【０００９】
国際公開第０２／０５２２４６号パンフレットは、例えば、エアロゾルについてのＭＡＬＤＩ ＭＳ方法を記載し、ここで該エアロゾルは、蒸発／濃縮又は昇華／濃縮によりＭＡＬＤＩマトリックスを備えられる。この文献に従い、ＭＡＬＤＩマトリックスにより覆われた乾燥したエアロゾルが、パルスレーザーによりイオン化されうる。次に、該イオン化成分がＴＯＦ ＭＳにより分析されうる。
【００１０】
バイオエアロゾル中に含まれる微生物を分析する為に、バクテリアの種に又はバクテリアの株さえに又は特定の発育型さえに特徴的なタンパク質が分析されるべきである。しかしながら、これらの特徴的タンパク質（例えば１〜２０ｋＤａの分子量範囲内のリボソームタンパク質など）のほとんどが、細胞膜により保護されており、そして従って、イオン化に容易に利用可能でない。それ故に、バイオエアロゾルはしばしば、例えばイオン化の前の細胞膜の部分的分解により、該タンパク質をイオン化にとって利用可能とするオンライン処理を要求する。伝統的には、慣用のＭＡＬＤＩにより、そのような処理は、水及びアセトニトリル中の酸及びＭＡＬＤＩマトリックス物質の溶解を含み、次に、該微生物分析物の添加及びその後該混合物の乾燥が続く。該酸が該細胞膜を部分的に分解し、それにより該特徴的タンパク質をイオン化にとって利用可能にする。この方法における重要なパラメータは、マトリックス及び酸対分析物の比並びに乾燥後の該マトリックスの結晶型である。
【００１１】
上記方法がリアルタイムのサンプリング及び分析にとってほとんど適さないことが明白である。なぜなら、該分析物の調製は多くのステップ及び時間を要するからである。さらに、本発明者らは、マトリックスの蒸発にとって必要な高温（＞８０℃）と組合された酸性条件の使用が、気相中のタンパク質粒子のＭＳ検出応答に対し悪影響を有することに気付いた。加えて、該マトリックス物質は、酸の存在下において又は水性の酸性条件下においてより速く分解する。
【００１２】
慣用のＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー装置は高い性能を有し、そしてそれ故に、例えば株レベルについてのバクテリアの同定にとって適する。しかしながら、オンラインエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの性能、特には１〜２０ｋＤａの分子質量範囲内のタンパク質のオンラインバイオエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの性能はまだ十分でない。
【００１３】
適当なＭＡＬＤＩマトリックス物質によるバイオエアロゾル、例えば微生物及び／又はタンパク質を含むエアロゾルなど、のコーティングは、生物学的物質を含む、バイオエアロゾルのオンラインでの特徴付けを許す。エアロゾルは、例えば国際公開第０２／０５２２４６号パンフレットに記載されるとおり、気相からエアロゾル上にマトリックス物質を凝縮することにより、該エアロゾルは該マトリックス物質により覆われうる。しかしながら、この方法は多くの利用可能なマトリックス物質にとって適さない。なぜなら、それらは非常に揮発性でなく及び／又は大気圧で熱的に安定でないからである。さらに、いくつかの既知の揮発性マトリックス物質、例えば３−ニトロベンジルアルコール及びピコリン酸など、は不満足なシグナル品質を与える。適当なＭＡＬＤＩマトリックス物質についての強いニーズがある。加えて、気相中で、好ましくは大気圧で、エアロゾルに適当なＭＡＬＤＩマトリックス物質のコーティングを備える為の改善された方法についての強いニーズがある。さらに、気相の微生物含有エアロゾルに十分な量のマトリックス物質を備えて、該特徴的タンパク質、特には１〜２０ｋＤａの範囲内のそれら、の高い応答を生じることは、課題のままである。
【００１４】
本発明の目的は、満足いくシグナル品質を有する、リアルタイムの／直接の、すなわち先のバイオエアロゾル収集無しの、エアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為のマトリックス物質及び調製技術についてのニーズを満たすことである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、エアロゾルについて、特にはバイオエアロゾルについて、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを実施することにおいて直面した問題を打破することである。
【００１６】
より特には、本発明はＭＡＬＤＩ分析物エアロゾル表面を、マトリックス物質の層によりコーティングする為に適する方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第一の局面において、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型を含む、ＭＡＬＤＩ ＭＳの為のマトリックス物質に向けられ、
ここで、ＸはＳ、Ｏ又はＮから選ばれ、且つＲ１及びＲ２は独立に、水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、１以上のヘテロ原子を含みうる、置換されていてもよい環構造を形成する。
【００１８】
本発明者らは、式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンがエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳにとって非常に適当なマトリックス物質であることを発見した。該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンマトリックス物質は、非常に優れたシグナル品質を与える。それにより、ＭＡＬＤＩ ＭＳについての分析物の要求される量は、著しく減少される。加えて、本発明の該マトリックス物質は、多くの慣用のマトリックス物質よりも、非常に揮発性であり、そしてそれ故に、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳにとってより適する。
【００１９】
Ｒ１及びＲ２は、水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから選ばれうる。これらの小さな側基は、該マトリックス物質の望ましい揮発性を保証する。アルコキシ基は、該マトリックス物質の揮発性を高めることができる。Ｒ１及びＲ２は、一緒になって、任意的に１以上のヘテロ原子を含む、１以上の任意的に置換された芳香族環構造（縮合環を含む）を形成することもできる。該１以上の芳香族環状構造は例えば、１つの芳香族の５、６又は７員の芳香族環を含みうる。
【００２０】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２は同じであり、そしてより好ましくはＲ１及びＲ２は両方ともメチル基である。Ｘは好ましくはＳである。
【００２１】
非常に良い結果が、Ｒ１及びＲ２がメチル基である２−メルカプト−４，５−ジアルキルチアゾールにより達成された。
【００２２】
式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンの２つの異なる互変異性型は、プロトンがチオール硫黄原子に結合しているもの及びプロトンが芳香族窒素原子に結合しているものである。これらの２つの互変異性型が以下に示される。
【化２】
【００２３】
リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳについて、エアロゾル上に該マトリックス物質を堆積させる為に、該マトリックス物質は該気相中に持ち込まれるべきである。好ましくは、該マトリックス物質は、大気圧下で該分析物に堆積される。該式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンは該気相中に持ち込まれうるが、本発明者らは、蒸発されうるマトリックス物質の量が、適用される蒸発熱による該物質の分解の故に、制限されることに気づいた。典型的には、該マトリックス物質は、約９０℃又はそれより高い温度で分解しはじめる。
【００２４】
該分解された物質の分析は、式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンの分解産物が、元の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンの結合物（conjugate）（２つの分子がチオール基を介して結合されている）を含むことを示した。該結合物は、−Ｃ−Ｓ−Ｃ−結合を通じて結合されているものもあり、他方で−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−結合を通じて結合されているものもある。
【００２５】
理論によりとらわれることを望まないで、本発明者らは、該−Ｃ−Ｓ−Ｃ−結合を有する該結合物が、Ｈ２Ｓの放出下で、２つの異なる２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンのチオール基の分子間反応により形成されると考える。さらに、本発明者らは、該−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−結合を有する結合物は、２つのプロトン及び２つの電子の放出下で、２つの異なる２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンのチオール基の酸化反応により形成されると考える。
【００２６】
本発明者らは、該マトリックス溶液にアルコールを添加することにより、該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン分子のチオール基を少なくとも部分的に保護することが可能であることを発見した。該アルコールは、該互変異性型のチオール硫黄原子の自由電子対（free electron pair）により水素結合を形成することができ、ここで該プロトンは、以下に示されるとおり芳香族窒素に結合される。
【化３】
【００２７】
結果として、該プロトンが該芳香族窒素原子に結合されている該互変異性型が好ましく、そして該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンは主にこの互変異性型で存在するであろう。加えて、該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン分子と該アルコール分子との間の水素結合の形成は、該マトリックス物質の揮発性を増すことができる。
【００２８】
従って、さらなる局面において、本発明は、式（Ｉ）に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型とアルコールとを含む、リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの為のマトリックス組成物に向けられる。このマトリックス組成物は、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳにとって特に有利である。なぜなら、それは、該エアロゾルに該マトリックス物質を堆積させる為に、該気相中に容易に持ち込まれうるからである。
【００２９】
好ましくは、該アルコールの分子量は比較的低い。適当なアルコールは例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールである。また、１より多いヒドロキシ基を有するアルコール、例えばグリコール、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール、グリセロール、ブタン−１，２−ジオール、ブタン−１，３−ジオール、ブタン−２，３−ジオール、ブタン−１，２，３−トリオール及びブタン−１，２，４−トリオールも適用されうる。
【００３０】
一般に、多価アルコール、例えばジオール及びトリオールなど、は、１価アルコールよりも揮発性が低いが、それらが水素架橋の形成にとって利用可能な追加のヒドロキシル基を有することにおける利点をそれらは有する。
【００３１】
さらに、該アルコール（特にはエタノール）は、関心のあるタンパク質にとって、イオン化に利用可能となるのに十分な程度に、細胞膜を分解することができる。すなわち、同時のアルコールの存在は、該微生物から特徴的なタンパク質を放出する為の放出剤として働く。
【００３２】
アルコールの存在の重要な利点は、２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンマトリックス物質が、適用される蒸発熱／昇華熱により分解されず又は少なくとも迅速には分解されないことである。アルコールとの組み合わせにおいて、本発明の該マトリックス物質は、その活性を、例えば１５０℃の加熱温度でさえ、アルコールの低濃度〜ゼロ濃度における数分又は数時間と比較して、著しく増加した時間、例えば少なくとも１０ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間維持することが発見された。
【００３３】
高い温度、例えば１００℃超の温度、好ましくは１２０℃超の温度、より好ましくは１５０℃超の温度など、の使用も、微生物から特徴的タンパク質を放出するのに寄与する、Ｈｏｒｎｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００４，１５（１０），１４４４−１４５４、を参照されたい。
【００３４】
本発明者らはさらに、ハロゲン化アルコールを適用することが有利であることを発見した。好ましいハロゲンは塩素であり、さらにより好ましいハロゲンはフッ素である。原理上、該アルコール中の一つのハロゲン置換がすでに有利な効果を与える。
【００３５】
好ましい実施態様において、少なくともα炭素原子が、１以上のハロゲン原子により置換される。そのようなハロゲン化アルコールの適当な例は、トリフルオロエタノール、ペンタフルオロプロパノール、及びヘキサフルオロイソプロパノールである。該アルコールが完全にハロゲン化されている、すなわち炭素に結合したすべての水素原子がハロゲン原子により置換されている実施態様がさらにより好ましい。完全にハロゲン化されたアルコールの例は、トリクロロメタノール、トリフルオロメタノール、パークロロエタノール、パーフルオロエタノール、パークロロプロパノール、パーフルオロプロパノール、パークロロブタノール、及びパーフルオロブタノールである。
【００３６】
ハロゲン置換物の高い電子吸引能力は、該アルコール分子のヒドロキシル基の電気陰性度を増大させる。これは、該アルコールと本発明の該２−メルカプト−４，５−ジアルキルチアゾール分子との間のより強力な水素結合をもたらす。それ故に、該プロトンが該芳香族窒素原子に結合している本発明の該マトリックス物質の該有利な互変異性型がさらにより好ましい。結果として、該リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の性能がさらに改善される。
【００３７】
該アルコールは好ましくは、飽和蒸気圧が、アルコールの種類に依存して、１５〜１００℃の温度範囲内にあると分かるような濃度で適用される。しかしながら、部分的に飽和したアルコール蒸気も用いられうる。
【００３８】
従って、本発明は、分析物を分析する為のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳ方法であって、
該エアロゾル分析物と上記で記載されたとおりのマトリックス物質とを接触させること；
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
該イオン化した成分を、ＭＳ検出器、例えば飛行時間検出器を用いて分離すること
を含む上記方法に向けられる。
【００３９】
該分析物と該マトリックス物質との接触の間、該マトリックス物質は、該エアロゾルに堆積することができ、そしてマトリックスコーティングを形成することができる。
【００４０】
該分析物が、該気相中で該マトリックス物質と接触されることが好ましい。昇華されうる本発明のマトリックス物質の量はアルコールの存在下において増加するので及びアルコールは該マトリックス物質の揮発性を増すことができるので、アルコールを有する組成物中で、式Ｉの該マトリックス化合物を使用することが好ましい。
【発明の効果】
【００４１】
本発明者らは、この方法に従い、該エアロゾル分析物が、マトリックス物質の均一であり均質である相を備えられることを発見した。これは、該分析物の表面における不均質性がＭＡＬＤＩ分析に悪影響を及ぼしうるので、有利である。それ故に、この方法は、エアロゾルについてのＭＡＬＤＩスペクトロメトリーのシグナル品質を著しく改善する。この改善は、バイオエアロゾルにとって、特徴的タンパク質のデリケートな分析の故に、特に有用である。該少なくとも部分的に飽和した雰囲気は有利に、本明細書において記載されたとおりの１以上のアルコールにより少なくとも部分的に飽和されうる。好ましくは、マトリックス含有エタノール溶液が、該装置の加熱されたゾーンへと、小滴として導入される。この利点は、該マススペクトロメーター中に一つの液体流があること及び該マトリックスの濃度がより精密に制御されうることである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実験の装置を示す図である。符号の説明については実施例１を参照されたい。
【図２】生理学的食塩溶液中で一晩保持されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルの日々の再現性を示す図である。
【図３】Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの芽胞（Ａ）及び細胞（Ｂ）の飛行中エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図４】（Ａ）Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ、（Ｂ）Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及び（Ｃ）Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの芽胞のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】２つのＢ．ｃｅｒｅｕｓ株の飛行中エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図６】１つのカルチャー内の個々のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ栄養細胞／クラスター化粒子の種々のフィンガープリントの例を示す図である。
【図７】標準化されたマトリックス条件を用いた、アガープレートで培養されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ栄養細胞のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ（リアルタイム）対一般のＭＡＬＤＩ（静的（static））の例を示す図である。
【図８】標準化されたマトリックス条件を用いて、アガープレートで培養されたＥ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ及びＥ．ｃｏｌｉのリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを示す図である。
【図９】（Ａ）６０００〜１２０００Ｄａの特徴的な広いバンドを有するＡｃＮＰＶウィルス、及び（Ｂ）１２４２−１２５７−１２７９Ｄａ並びに６４６０及び８６７５Ｄａ（（Ｂ−ａ）及び（Ｂ−ｂ）：拡大）での特徴的なシグナルクラスターを有するＣｐＧＶウィルスの、リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図１０】水中の参照コレラ毒素（６００ショット（shots）／粒子 合計された）及び、用水路の水（canal water）の６００ショット／粒子から選抜された１２の合計されたコレラ毒素含有ショットの、リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを示す図である。
【図１１】Ｊ５５８Ｂリンパ球及びジャーカットＴリンパ球細胞株のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
該オンラインエアロゾルサンプリングの間、該蒸気圧は好ましくは高く維持されるべきであり、これはアルコール又は水などの液体の追加蒸発により達成されうる。
【００４４】
いくつかの場合、揮発性酸を該被覆されたエアロゾル流に添加することが好ましい。好ましくは、揮発性有機酸（室温〜１００℃の温度で揮発性である）が用いられ、最も好ましくは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が用いられる。
【００４５】
該分析物及び好ましくは該分析物中の少なくとも１つの粒子は、微生物（バクテリア、菌類、藻類、原生動物及びウィルスを含む）及び／又はタンパク質（毒素を含む）、又は任意の他の生物学的物質、例えばリンパ球又は細胞組織など、を含みうる。
【００４６】
好ましくは、該少なくとも１つのエアロゾルは、少なくとも０．１μｍの、透過電子顕微鏡法により測定されたときの平均粒子サイズを有する。透過電子顕微鏡法により測定されたときの平均粒子サイズは、多くとも２０μｍであることが好ましい。従って、少なくとも１つのエアロゾル粒子が、０．３〜２０μｍの平均粒子サイズ、好ましくは０．５〜１５μｍの平均粒子サイズを有しうる。
【００４７】
好ましい実施態様において、該分析物は、本発明の方法の前に選抜に付されている。適当な選抜方法は、たとえば、国際公開第２００２／０５２２４６号パンフレット（引用することにより本明細書に組み込まれる）において記載されている。この方法に従い、バイオエアロゾル粒子は、特定の物質、例えばアミノ酸など、の存在が、適当な波長を照射されたときに特徴的な蛍光を誘発する特性に基づき選抜される。一般に、無機物質及び多くの有機物質は、この特徴を示さない。すなわち、バイオエアロゾル粒子は、バイオエアロゾル粒子中の特定の物質の蛍光に影響する励起レーザーにより選抜されることができ、その後、検出器が該蛍光バイオエアロゾル粒子を選抜し、そして第２のレーザーがトリガーされて、該選抜されたバイオエアロゾル粒子をイオン化する。
【００４８】
好ましくは、該選抜はサイズ選抜を含む。バクテリア及びウィルスを含むエアロゾル粒子のサイズは典型的には２０μｍより小さい。該エアロゾル粒子は、或る速さで該マススペクトロメーターの中央空間（the central space）に入るので、逐次的な（successive）エアロゾル粒子のサイズが、エアロゾル粒子により横切られた既知の距離（a known distance）の持続期間から決定されうる。該励起レーザービームを既知の相互の距離を有する２つの逐次のスポットへ向けることにより、上記持続期間及びそれ故に該エアロゾル粒子のサイズが、エアロゾル粒子により散乱され及び検出された光から決定されることができる。これは、特定のサイズ枠における生物学的物質の選択的イオン化を許す。それ故に、種々の物質の混合物から特定のサイズの生物学的物質（例えばバクテリアなど）を同定することが可能である。
【００４９】
本発明は、微生物（バクテリア、菌類、藻類、原生動物及びウィルスを含む）及び／又はタンパク質（毒素を含む）又は任意の他の生物学的物質、例えばリンパ球及び細胞組織、の分類を許す。種々の種が、それらのスペクトルの特徴に従い分類されうる。そのような分類は非常に特異的であり、且つ、種々の発達のステージ（stadia）における微生物を区別することさえ可能である。生物学的物質の該分類の為の方法は、種々の生物学的物質（例えば種々のバクテリア、種々の細胞、種々のウィルスなど）のＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルを得ること、該得られたＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルをＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルのライブラリーと比較すること；及び、該比較に基づき、該生物学的物質を分類することを含む。一つの粒子についての一つの測定だけに基づく、信頼できる分類を実施することが可能であると示された。これは、上記で記載された方法が、低濃度の生物学的粒子（bioparticles）を有する気体の試料分析のために用いられるときに特に有用である。
【００５０】
さらに、本発明は、特に粒子状の物質及び微生物に関する、気体又は液体、例えば水など、の品質を監視することを許す。
【００５１】
さらなる局面において、本発明は、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの為に、式（Ｉ）に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンをマトリックス物質として使用する方法に向けられる。
【００５２】
さらなる局面において、本発明は、ＭＡＬＤＩ ＭＳの為の気相マトリックスコーティング方法において、本明細書において定義されたとおりのマトリックス組成物を使用する方法に向けられる。
【００５３】
他の局面において、本発明は、分析物を分析する為のＭＡＬＤＩ ＭＳ方法であって、
該分析物と２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールマトリックス物質とを接触させること、
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
該イオン化した成分をＭＳ検出器を用いて分離すること
を含む上記方法に向けられる。
【００５４】
２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン及び同様の化合物は一般に、ＭＡＬＤＩ ＭＳの為のマトリックス物質として知られているが（例えば、Naxing, X. et al., 1997, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8:116-124 and Domin, M.A. et al., 1999, Rapid Comm. Mass Spectrom. 13:222-226; and 5-ethyl-2-mercaptothiazole as described in Raju, N.P. et al., 2001, Rapid Comm. Mass Spectrom. 15:1879-1884において記載されたとおりの２−メルカプトベンゾチアゾール及びその類似体など）、該特定の化合物２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールそれ自体は開示されていない。さらに、該マトリックス分子における小さな変化が、ＭＡＬＤＩ ＭＳにおけるマトリックスとしての化合物の適用可能性に対する大きな影響をもたらしうることが当技術分野で知られている。或る化合物がマトリックス分子として用いられうるかどうか及びどの特定の用途の為に或る化合物が用いられうるかは、基本的に予測不可能であると分かっている。実施例において示されるとおり、２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールは、生物学的マクロ分子、例えば微生物上に含まれるタンパク質及び炭水化物など、の検出にとって非常に適当であるマトリックス分子であることが分かった。この特定のマトリックス化合物のこの有用性は、微生物のスペクトルパラメーターに基づく、微生物の分類さえ可能にする。
【００５５】
本発明は今、以下の非限定的な実施例により、さらに説明されるであろう。
【実施例１】
【００５６】
実施例１−再現性
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むエアロゾルを分析する為に用いられた実験装置が、図１に示される。気相中のエアロゾル粒子は、エントランス室（entrance room）（１）中にＭＡＬＤＩ装置に入り、そして、液体（例えばアルコールなど）を含む任意的に加熱されたチューブ（２）へもたらされ、そして次に該マトリックス物質を含むチューブ（３）を通る。このチューブの第一の部分が加熱され、一方で第二の部分は加熱されず、その結果該マトリックス物質は該第二の部分で堆積し、そして、コーティングが該エアロゾル上に形成される。該被覆されたエアロゾルはドライヤー（４）及びエアロゾルビーム発生器（５）を通過し、その後該被覆されたエアロゾルはソース室（a source room）（６）へ入り、そこでそれらは散乱及びＵＶ光により検出される（７）。該エアロゾル中の関心のあるタンパク質が次に、イオン化レーザー（８）によりイオン化される。得られたイオンは、ＴＯＦチューブ（９）中でそれらの質量に基づき分離され、そして次に、検出器（１０）で検出される。該データの取得及び処理はパーソナルコーンピュータ（１１）により実施される。
【００５７】
該システム中の圧力は、エントランス室（１）、チューブ（２）及びチューブ（３）における約１００ｋＰａ（大気の）の一連のポンプにより、ソース室（６）およびＴＯＦチューブ（９）において１０−５ｋＰａへと減少する。該システムを通じた該流は、６００〜１０００ｍｌ／分の範囲にある。
マトリックス物質として２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールを用いた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むエアロゾルのリアルタイムＭＡＬＤＩエアロゾルＴＯＦスペクトルが記録された。
【００５８】
リアルタイム試料調製を含むオンラインエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ装置再現性が、図２において実証される。図２における比較可能な特徴的ピークパターン（すなわちＭＡＬＤＩフィンガープリント）は、一貫した日々の再現性を示す。図２により示された結果は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ及びＢ．ｃｅｒｅｕｓの栄養細胞及び芽胞によるいくつかの同一の実験により再現されており（データは示されていない）、これは該システムの再現性及び安定性が満足いくものであることを示す。
【実施例２】
【００５９】
実施例２−識別能力
本発明の識別能力（the distinguishing potential）が、実施例１の下で記載されたとおりであるが、いくつかのＢａｃｉｌｌｕｓ種、たとえばＢ．ｃｅｒｅｕｓ（２つの株）、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ及びＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉなど、による、同様の方法で得られた結果により実証された。それらの１６ＳｒＲＮＡ配列に従い、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを近縁種であると考えることが示唆される。試験されたバクテリア株の一つＢ．ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９は、１６ＳｒＤＮＡヌクレオチド配列における塩基対の置換及び類似性に基づき９９．６％のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにおける類似性を有する。上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からの栄養細胞及び芽胞のエアロゾルが、実施例１において記載されたとおりのマトリックス物質によりリアルタイムで覆われ、そしてエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳによりリアルタイムで分析された。
【００６０】
栄養細胞対芽胞
最初に、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの同じ種の芽胞細胞及び栄養細胞が測定された。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの芽胞細胞（Ａ）及び栄養細胞（Ｂ）の間の、図３において示されたとおりの得られた異なるＭＡＬＤＩフィンガープリントは、両者の間の明確な区別を示す。
【００６１】
近縁種
次に、該エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳの識別能力が、増殖依存性差異を防ぐために同じ増殖条件下で培養されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及びＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉの芽胞から得られた近縁種の結果により説明された。図４においてわかるとおり、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ（Ａ）、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（Ｂ）、及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｃ）の種は、非常に特徴的なスペクトルを示し、これはそれらを容易に区別するために用いられることができる。
【００６２】
図５において、増殖依存性差異を防ぐために同じ増殖条件下で培養された２つのＢ．ｃｅｒｅｕｓの結果により、該識別能力が実証される。２つのＢ．ｃｅｒｅｕｓ株の芽胞もまた、両方のスペクトルにおける異なるＭＡＬＤＩプロファイルにより実証されるとおり、互いに区別されうる。結果は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ，Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（２つの株を含む）などの近縁微生物が、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳと組み合わされた本発明の使用により、株レベルについてさえ、互いに区別されることができることを示す。
【００６３】
一つのバクテリア培養物内の一つの粒子レベルについての分離
一つの細胞または粒子レベルでの分離が、空気動力学的直径、蛍光又はマススペクトルフィンガープリントに基づき、細胞又は粒子をクラスター化することにより可能である。
【００６４】
本発明の使用により、十分なマススペクトルの情報が、フィンガープリントクラスタリング（fingerprint clustering）を適用するために１回のショットで入手可能である。１回のショット（single shots）は、個々の細胞、芽胞、クラスター化細胞、芽胞、タンパク質、ペプチド、増殖媒体又は他のバックグラウンド粒子でありうる。
【００６５】
図６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのマススペクトルフィンガープリントについてクラスター化された６のショット／粒子のデータを示す。
【実施例３】
【００６６】
実施例３−エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ対一般的ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ
エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳについて、一般のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳのサポートが、微生物のデータベースを作る為に重要である。両方の技術（すなわち知られていないマトリックス形態学（morphology）及び飛行におけるイオン化）の間の区別可能な違いにもかかわらず、比較可能なスペクトルが、一般のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ及びエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳの両方による本発明のマトリックスレシピが用いられるならば、得られた。図７は、１週間アガープレート上で培養されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの栄養細胞から得られ且つ両方の技術により記録されたスペクトルの例を示す。
【００６７】
同じピーククラスターが、両方のスペクトルにおいて４７１０、４８１６、７２４２、７３８５及び８２５９Ｄａで見られた。一般のＭＡＬＤＩとエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳとの間の良い類似性は、グラム陰性微生物、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉのｇｅｎｏｍｏｖａｒｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ並びにウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓウィルス（ＡｃＮＰＶ）及びＣｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓウィルス及びＭＳ２バクテリオファージなどを用いても確認された（データは示されていない）。
【実施例４】
【００６８】
実施例４−他の微生物の種
グラム陰性微生物
提示されたグラム陽性ｂａｃｉｌｌｕｓ種の次に、グラム陰性微生物、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉのｇｅｎｏｍｏｖａｒｓ（１１の種）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａなど、もまた図８において区別可能なスペクトルを与え、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａと比較したＥ．ｃｏｌｉの例を示す。
【００６９】
ウィルス
以下のウィルスが試験された：バクテリオファージＭＳ２及びバキュロウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓウィルス（ＡｃＮＰＶ）及びＣｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓウィルス。バクテリオファージＭＳ２は、ＲＮＡタイプウィルスを代表する。該バキュロウィルスは、二本差ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウィルスである。同一のスペクトルが、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ及び一般のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより得られた。ＭＳ２の場合、１３ｋＤａのキャプシドタンパク質の[Ｍ＋Ｈ]＋（ｍ／ｚ １３７２６）及び[Ｍ＋２Ｈ]＋２（ｍ／ｚ ６８６５）イオンシグナルが検出された（データは示されていない）。他のバクテリア種に特異的なバクテリオファージは典型的には、異なる分子量のキャプシドタンパク質を有し、そしてそれ故に、異なるＭＡＬＤＩシグナルを与える。
【００７０】
バキュロウィルスのスペクトル間の差異は明白である（図９を参照されたい）。ＡｃＮＰＶウィルス（Ａ）のエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルは、おそらく主要糖タンパク質エンベロープの一部である６０００〜１２０００Ｄａの特徴的な広いバンドを有する。ＣｐＧＶウィルス（Ｂ）は、１２４２−１２５７−１２７９Ｄａ及び６４６０及び８６７５Ｄａで特徴的なシグナルクラスターを示す。
【実施例５】
【００７１】
実施例５−液体試料分析
エアロゾル試料への本発明の直接の適用可能性の次に、液体試料、例えば水、体液及び血液など、も５０〜２００μｌの低量で取り扱われうる。該流体は、Ｍｅｉｎｈａｒｄ噴霧器を用いてエアロゾル化され、ろ過された空気（filtered air）のキャリアガスを有するエアロゾルを与える。生成されたエアロゾルは、本発明の使用方法によりリアルタイムで被覆され、そして、個々の粒子が、空気動力学的直径及び／又は蛍光及び／又はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳフィンガープリントの選抜により分析されうる。
【００７２】
用水路の水中の毒素
図１０は、用水路の水へ添加されたコレラ毒素（１００μｇ／ｍｌ）の結果を示す。該用水路の水は、０．２μｍフィルターによりろ過されて微生物の粒子を除去し、そして、６０μｌがエアロゾル化されそしてオンライン分析された。
【００７３】
コレラ毒素は、２４ｋＤａの分子質量を有するＡサブユニット及び１２ｋＤａのＢサブユニットからなる。水中及び添加された用水路の水中の参照のマススペクトルは、コレラ毒素のＢサブユニットの特徴的質量を示す。該用水路の水の場合、特徴的なコレラ毒素マススペクトルを有する１２の合計されたシングルショットのスペクトルが、用水路の水の６００ショット／粒子のバックグラウンドから選抜されたときに、コレラ毒素の存在を示すのに十分である。
【００７４】
Ｔリンパ球及びＢリンパ球
Ｔリンパ球及びＢリンパ球は、適用免疫応答の主要な細胞成分である。Ｔ細胞は、細胞により媒介される免疫に関与する一方で、Ｂ細胞は主に（抗体に関する）液性免疫に関与する。それらは、病原体を記憶して将来の感染の場合により早い抗体産生を可能とする記憶細胞を形成する。インタクトなＢリンパ球及びＴリンパ球を分析することの能力が、ＪｕｒｋａｔＴリンパ球及びＪ５５８Ｂリンパ球細胞について研究された。約５０μｌの少量が、Ｍｅｉｎｈａｒｄ噴霧器により導入された。図１１は、ＪｕｒｋａｔＴリンパ球及びＪ５５８Ｂリンパ球のエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ平均を合計したマススペクトルを示す。
【００７５】
結論
上記実施例は、生物学的起源の材料から区別可能なＭＳフィンガープリントを生成するための一般的能力を実証する。エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳと組み合わされた本発明は、種から株レベルの容易な区別の為の迅速且つ速成のツールであると分かった。本発明の試料マトリックス条件を用いる場合、ＭＡＬＤＩ結果は、一般のＭＡＬＤＩとほとんど同一であろう。これは、データベースを作成するために一般のＭＡＬＤＩの必要なサポートの利用可能性及びこれらのデータベースの解釈の為の使用を示す。一般のＭＡＬＤＩと比較したときの、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳと組み合わされた本発明は、バルク材料の代わりの一つの粒子レベルについての分析に起因して、天然の無機的又は生物学的バックグラウンドの存在により影響を受けない又はより少なく影響されるという、大きな利点を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法、特定の化合物をエアロゾルＭＡＬＤＩマトリックス物質として使用する方法、及び気相コーティング方法におけるＭＡＬＤＩマトリックス組成物の使用方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
マススペクトロメトリー（ＭＳ）におけるソフトイオン化技術としてのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）の導入は、生化学的に重要なポリマーを含む幅広い種類の高質量化合物の分析に革命をもたらした。ＭＡＬＤＩは、大きく、不揮発性であり且つ熱に不安定な化合物（典型的には４００〜３５００００Ｄａの分子量を有する）、例えばタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド及び合成ポリマーなど、からインタクトな気相イオンの生成を許す方法である。ＭＡＬＤＩ ＭＳ方法に従い、該不安定な分析物分子が該レーザービームにより直接に破壊されるのを防ぐ為に、マトリックスが用いられる。
【０００３】
ＭＡＬＤＩ ＭＳのソフトイオン化技術は典型的には生体分子の分析を許す。ＭＡＬＤＩ ＭＳは例えば、微生物（の画分）の分析及び分類において用いられる。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析は２つのステップを含む。第一のステップは、該分析物をモル過剰のマトリックス物質と混合することにより試料を調製することを含む。ＭＡＬＤＩプロセスの第二のステップは、レーザー光の強烈な短パルスによる該固体試料のバルク部分の脱離を含む。該マトリックスは３つの目的に従事すると考えられている：分析物の互いからの分離、該分析物が脱離する為のレーザー光からのエネルギーの吸収、及びイオン化の促進。該レーザー光は、イオン化されるべき該マトリックス及び分析物試料の小断片を生じる。得られた気相イオンの分子質量が通常、電場内で該イオン化された分子を加速すること及び飛行時間（ＴＯＦ）検出器においてそれらの質量に基づき該分子を分離することにより決定される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、非常に少量の成分の検出を許す、非常に高感度の方法である。
【０００５】
適用されるマトリックス物質は通常、小さな有機酸である。一般に用いられるマトリックス物質は、３，５−ジメトキシ−４−ケイ皮酸（シナピン酸）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（α−シアノ又はα−マトリックス）及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を含む。典型的には、該マトリックス物質は、高度に精製された水及び他の有機化合物（普通はアセトニトリル（ＡＣＮ））の混合物中に溶解される。普通はいくつかの酸、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）など、も添加される。なぜなら、酸は、該分析物のマススペクトルに対する塩不純物の妨害影響を抑制することができるからである。加えて、該マトリックス溶液のｐＨの低下は通常、該試料の増加した性質、例えばシグナルの増加した数及び強度など、を結果する。
【０００６】
次に、該マトリックス溶液は、調査されるべき該分析物と混合される。該有機化合物（例えばＡＣＮ）は、該試料中の疎水性タンパク質が溶解するのを可能とする一方で、該水は親水性タンパク質が溶解するのを可能とする。慣用のＭＡＬＤＩ方法において、この溶液はＭＡＬＤＩプレート（通常はこの目的の為に設計された金属プレート）上にスポットされる。該溶媒が蒸発し、再結晶化したマトリックスだけを残し、該分析物タンパク質を該マトリックス結晶のいたるところに広げさせる。
【０００７】
一般に、エアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーにおいて、開発は２ラインの試料処理に従う、エアロゾル化の前にマトリックスを分析物と予備混合することによるもの又はエアロゾル粒子のリアルタイムの飛行中のコーティングによるもののいずれか。該飛行中マトリックスコーティングは、大気中のバイオエアロゾルのオンラインエアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを可能とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
リアルタイムエアロゾル単独粒子ＭＡＬＤＩの場合、該エアロゾルは、気相中でマトリックス物質により被覆される必要がある。それ故に、該マトリックス物質は十分に揮発性であるべきである。さらに十分な量のマトリックス物質が該エアロゾルに堆積されるべきである。従来技術において、エアロゾル、特にはバイオエアロゾルについてのＭＡＬＤＩ分析を実施するために、いくつかの試みがなされてきた。
【０００９】
国際公開第０２／０５２２４６号パンフレットは、例えば、エアロゾルについてのＭＡＬＤＩ ＭＳ方法を記載し、ここで該エアロゾルは、蒸発／濃縮又は昇華／濃縮によりＭＡＬＤＩマトリックスを備えられる。この文献に従い、ＭＡＬＤＩマトリックスにより覆われた乾燥したエアロゾルが、パルスレーザーによりイオン化されうる。次に、該イオン化成分がＴＯＦ ＭＳにより分析されうる。
【００１０】
バイオエアロゾル中に含まれる微生物を分析する為に、バクテリアの種に又はバクテリアの株さえに又は特定の発育型さえに特徴的なタンパク質が分析されるべきである。しかしながら、これらの特徴的タンパク質（例えば１〜２０ｋＤａの分子量範囲内のリボソームタンパク質など）のほとんどが、細胞膜により保護されており、そして従って、イオン化に容易に利用可能でない。それ故に、バイオエアロゾルはしばしば、例えばイオン化の前の細胞膜の部分的分解により、該タンパク質をイオン化にとって利用可能とするオンライン処理を要求する。伝統的には、慣用のＭＡＬＤＩにより、そのような処理は、水及びアセトニトリル中の酸及びＭＡＬＤＩマトリックス物質の溶解を含み、次に、該微生物分析物の添加及びその後該混合物の乾燥が続く。該酸が該細胞膜を部分的に分解し、それにより該特徴的タンパク質をイオン化にとって利用可能にする。この方法における重要なパラメータは、マトリックス及び酸対分析物の比並びに乾燥後の該マトリックスの結晶型である。
【００１１】
上記方法がリアルタイムのサンプリング及び分析にとってほとんど適さないことが明白である。なぜなら、該分析物の調製は多くのステップ及び時間を要するからである。さらに、本発明者らは、マトリックスの蒸発にとって必要な高温（＞８０℃）と組合された酸性条件の使用が、気相中のタンパク質粒子のＭＳ検出応答に対し悪影響を有することに気付いた。加えて、該マトリックス物質は、酸の存在下において又は水性の酸性条件下においてより速く分解する。
【００１２】
慣用のＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー装置は高い性能を有し、そしてそれ故に、例えば株レベルについてのバクテリアの同定にとって適する。しかしながら、オンラインエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの性能、特には１〜２０ｋＤａの分子質量範囲内のタンパク質のオンラインバイオエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの性能はまだ十分でない。
【００１３】
適当なＭＡＬＤＩマトリックス物質によるバイオエアロゾル、例えば微生物及び／又はタンパク質を含むエアロゾルなど、のコーティングは、生物学的物質を含む、バイオエアロゾルのオンラインでの特徴付けを許す。エアロゾルは、例えば国際公開第０２／０５２２４６号パンフレットに記載されるとおり、気相からエアロゾル上にマトリックス物質を凝縮することにより、該エアロゾルは該マトリックス物質により覆われうる。しかしながら、この方法は多くの利用可能なマトリックス物質にとって適さない。なぜなら、それらは非常に揮発性でなく及び／又は大気圧で熱的に安定でないからである。さらに、いくつかの既知の揮発性マトリックス物質、例えば３−ニトロベンジルアルコール及びピコリン酸など、は不満足なシグナル品質を与える。適当なＭＡＬＤＩマトリックス物質についての強いニーズがある。加えて、気相中で、好ましくは大気圧で、エアロゾルに適当なＭＡＬＤＩマトリックス物質のコーティングを備える為の改善された方法についての強いニーズがある。さらに、気相の微生物含有エアロゾルに十分な量のマトリックス物質を備えて、該特徴的タンパク質、特には１〜２０ｋＤａの範囲内のそれら、の高い応答を生じることは、課題のままである。
【００１４】
本発明の目的は、満足いくシグナル品質を有する、リアルタイムの／直接の、すなわち先のバイオエアロゾル収集無しの、エアロゾルＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為のマトリックス物質及び調製技術についてのニーズを満たすことである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、エアロゾルについて、特にはバイオエアロゾルについて、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを実施することにおいて直面した問題を打破することである。
【００１６】
より特には、本発明はＭＡＬＤＩ分析物エアロゾル表面を、マトリックス物質の層によりコーティングする為に適する方法を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第一の局面において、本発明は、式（Ｉ）
【化１】
に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型を含む、ＭＡＬＤＩ ＭＳの為のマトリックス物質に向けられ、
ここで、ＸはＳ、Ｏ又はＮから選ばれ、且つＲ１及びＲ２は独立に、水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、１以上のヘテロ原子を含みうる、置換されていてもよい環構造を形成する。
【００１８】
本発明者らは、式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンがエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳにとって非常に適当なマトリックス物質であることを発見した。該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンマトリックス物質は、非常に優れたシグナル品質を与える。それにより、ＭＡＬＤＩ ＭＳについての分析物の要求される量は、著しく減少される。加えて、本発明の該マトリックス物質は、多くの慣用のマトリックス物質よりも、非常に揮発性であり、そしてそれ故に、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳにとってより適する。
【００１９】
Ｒ１及びＲ２は、水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから選ばれうる。これらの小さな側基は、該マトリックス物質の望ましい揮発性を保証する。アルコキシ基は、該マトリックス物質の揮発性を高めることができる。Ｒ１及びＲ２は、一緒になって、任意的に１以上のヘテロ原子を含む、１以上の任意的に置換された芳香族環構造（縮合環を含む）を形成することもできる。該１以上の芳香族環状構造は例えば、１つの芳香族の５、６又は７員の芳香族環を含みうる。
【００２０】
好ましくは、Ｒ１及びＲ２は同じであり、そしてより好ましくはＲ１及びＲ２は両方ともメチル基である。Ｘは好ましくはＳである。
【００２１】
非常に良い結果が、Ｒ１及びＲ２がメチル基である２−メルカプト−４，５−ジアルキルチアゾールにより達成された。
【００２２】
式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンの２つの異なる互変異性型は、プロトンがチオール硫黄原子に結合しているもの及びプロトンが芳香族窒素原子に結合しているものである。これらの２つの互変異性型が以下に示される。
【化２】
【００２３】
リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳについて、エアロゾル上に該マトリックス物質を堆積させる為に、該マトリックス物質は該気相中に持ち込まれるべきである。好ましくは、該マトリックス物質は、大気圧下で該分析物に堆積される。該式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンは該気相中に持ち込まれうるが、本発明者らは、蒸発されうるマトリックス物質の量が、適用される蒸発熱による該物質の分解の故に、制限されることに気づいた。典型的には、該マトリックス物質は、約９０℃又はそれより高い温度で分解しはじめる。
【００２４】
該分解された物質の分析は、式（Ｉ）の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンの分解産物が、元の２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンの結合物（conjugate）（２つの分子がチオール基を介して結合されている）を含むことを示した。該結合物は、−Ｃ−Ｓ−Ｃ−結合を通じて結合されているものもあり、他方で−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−結合を通じて結合されているものもある。
【００２５】
理論によりとらわれることを望まないで、本発明者らは、該−Ｃ−Ｓ−Ｃ−結合を有する該結合物が、Ｈ２Ｓの放出下で、２つの異なる２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンのチオール基の分子間反応により形成されると考える。さらに、本発明者らは、該−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−結合を有する結合物は、２つのプロトン及び２つの電子の放出下で、２つの異なる２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンのチオール基の酸化反応により形成されると考える。
【００２６】
本発明者らは、該マトリックス溶液にアルコールを添加することにより、該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン分子のチオール基を少なくとも部分的に保護することが可能であることを発見した。該アルコールは、該互変異性型のチオール硫黄原子の自由電子対（free electron pair）により水素結合を形成することができ、ここで該プロトンは、以下に示されるとおり芳香族窒素に結合される。
【化３】
【００２７】
結果として、該プロトンが該芳香族窒素原子に結合されている該互変異性型が好ましく、そして該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンは主にこの互変異性型で存在するであろう。加えて、該２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン分子と該アルコール分子との間の水素結合の形成は、該マトリックス物質の揮発性を増すことができる。
【００２８】
従って、さらなる局面において、本発明は、式（Ｉ）に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型とアルコールとを含む、リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの為のマトリックス組成物に向けられる。このマトリックス組成物は、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳにとって特に有利である。なぜなら、それは、該エアロゾルに該マトリックス物質を堆積させる為に、該気相中に容易に持ち込まれうるからである。
【００２９】
好ましくは、該アルコールの分子量は比較的低い。適当なアルコールは例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール、及びｔｅｒｔ−ブタノールである。また、１より多いヒドロキシ基を有するアルコール、例えばグリコール、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール、グリセロール、ブタン−１，２−ジオール、ブタン−１，３−ジオール、ブタン−２，３−ジオール、ブタン−１，２，３−トリオール及びブタン−１，２，４−トリオールも適用されうる。
【００３０】
一般に、多価アルコール、例えばジオール及びトリオールなど、は、１価アルコールよりも揮発性が低いが、それらが水素架橋の形成にとって利用可能な追加のヒドロキシル基を有することにおける利点をそれらは有する。
【００３１】
さらに、該アルコール（特にはエタノール）は、関心のあるタンパク質にとって、イオン化に利用可能となるのに十分な程度に、細胞膜を分解することができる。すなわち、同時のアルコールの存在は、該微生物から特徴的なタンパク質を放出する為の放出剤として働く。
【００３２】
アルコールの存在の重要な利点は、２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンマトリックス物質が、適用される蒸発熱／昇華熱により分解されず又は少なくとも迅速には分解されないことである。アルコールとの組み合わせにおいて、本発明の該マトリックス物質は、その活性を、例えば１５０℃の加熱温度でさえ、アルコールの低濃度〜ゼロ濃度における数分又は数時間と比較して、著しく増加した時間、例えば少なくとも１０ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間維持することが発見された。
【００３３】
高い温度、例えば１００℃超の温度、好ましくは１２０℃超の温度、より好ましくは１５０℃超の温度など、の使用も、微生物から特徴的タンパク質を放出するのに寄与する、Ｈｏｒｎｅｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００４，１５（１０），１４４４−１４５４、を参照されたい。
【００３４】
本発明者らはさらに、ハロゲン化アルコールを適用することが有利であることを発見した。好ましいハロゲンは塩素であり、さらにより好ましいハロゲンはフッ素である。原理上、該アルコール中の一つのハロゲン置換がすでに有利な効果を与える。
【００３５】
好ましい実施態様において、少なくともα炭素原子が、１以上のハロゲン原子により置換される。そのようなハロゲン化アルコールの適当な例は、トリフルオロエタノール、ペンタフルオロプロパノール、及びヘキサフルオロイソプロパノールである。該アルコールが完全にハロゲン化されている、すなわち炭素に結合したすべての水素原子がハロゲン原子により置換されている実施態様がさらにより好ましい。完全にハロゲン化されたアルコールの例は、トリクロロメタノール、トリフルオロメタノール、パークロロエタノール、パーフルオロエタノール、パークロロプロパノール、パーフルオロプロパノール、パークロロブタノール、及びパーフルオロブタノールである。
【００３６】
ハロゲン置換物の高い電子吸引能力は、該アルコール分子のヒドロキシル基の電気陰性度を増大させる。これは、該アルコールと本発明の該２−メルカプト−４，５−ジアルキルチアゾール分子との間のより強力な水素結合をもたらす。それ故に、該プロトンが該芳香族窒素原子に結合している本発明の該マトリックス物質の該有利な互変異性型がさらにより好ましい。結果として、該リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳ分析の性能がさらに改善される。
【００３７】
該アルコールは好ましくは、飽和蒸気圧が、アルコールの種類に依存して、１５〜１００℃の温度範囲内にあると分かるような濃度で適用される。しかしながら、部分的に飽和したアルコール蒸気も用いられうる。
【００３８】
従って、本発明は、分析物を分析する為のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳ方法であって、
該エアロゾル分析物と上記で記載されたとおりのマトリックス物質とを接触させること；
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
該イオン化した成分を、ＭＳ検出器、例えば飛行時間検出器を用いて分離すること
を含む上記方法に向けられる。
【００３９】
該分析物と該マトリックス物質との接触の間、該マトリックス物質は、該エアロゾルに堆積することができ、そしてマトリックスコーティングを形成することができる。
【００４０】
該分析物が、該気相中で該マトリックス物質と接触されることが好ましい。昇華されうる本発明のマトリックス物質の量はアルコールの存在下において増加するので及びアルコールは該マトリックス物質の揮発性を増すことができるので、アルコールを有する組成物中で、式Ｉの該マトリックス化合物を使用することが好ましい。
【発明の効果】
【００４１】
本発明者らは、この方法に従い、該エアロゾル分析物が、マトリックス物質の均一であり均質である相を備えられることを発見した。これは、該分析物の表面における不均質性がＭＡＬＤＩ分析に悪影響を及ぼしうるので、有利である。それ故に、この方法は、エアロゾルについてのＭＡＬＤＩスペクトロメトリーのシグナル品質を著しく改善する。この改善は、バイオエアロゾルにとって、特徴的タンパク質のデリケートな分析の故に、特に有用である。該少なくとも部分的に飽和した雰囲気は有利に、本明細書において記載されたとおりの１以上のアルコールにより少なくとも部分的に飽和されうる。好ましくは、マトリックス含有エタノール溶液が、該装置の加熱されたゾーンへと、小滴として導入される。この利点は、該マススペクトロメーター中に一つの液体流があること及び該マトリックスの濃度がより精密に制御されうることである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実験の装置を示す図である。符号の説明については実施例１を参照されたい。
【図２】生理学的食塩溶液中で一晩保持されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルの日々の再現性を示す図である。
【図３】Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの芽胞（Ａ）及び細胞（Ｂ）の飛行中エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図４】（Ａ）Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ、（Ｂ）Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及び（Ｃ）Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの芽胞のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】２つのＢ．ｃｅｒｅｕｓ株の飛行中エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図６】１つのカルチャー内の個々のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ栄養細胞／クラスター化粒子の種々のフィンガープリントの例を示す図である。
【図７】標準化されたマトリックス条件を用いた、アガープレートで培養されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ栄養細胞のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ（リアルタイム）対一般のＭＡＬＤＩ（静的（static））の例を示す図である。
【図８】標準化されたマトリックス条件を用いて、アガープレートで培養されたＥ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ及びＥ．ｃｏｌｉのリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを示す図である。
【図９】（Ａ）６０００〜１２０００Ｄａの特徴的な広いバンドを有するＡｃＮＰＶウィルス、及び（Ｂ）１２４２−１２５７−１２７９Ｄａ並びに６４６０及び８６７５Ｄａ（（Ｂ−ａ）及び（Ｂ−ｂ）：拡大）での特徴的なシグナルクラスターを有するＣｐＧＶウィルスの、リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【図１０】水中の参照コレラ毒素（６００ショット（shots）／粒子 合計された）及び、用水路の水（canal water）の６００ショット／粒子から選抜された１２の合計されたコレラ毒素含有ショットの、リアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを示す図である。
【図１１】Ｊ５５８Ｂリンパ球及びジャーカットＴリンパ球細胞株のリアルタイムエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
該オンラインエアロゾルサンプリングの間、該蒸気圧は好ましくは高く維持されるべきであり、これはアルコール又は水などの液体の追加蒸発により達成されうる。
【００４４】
いくつかの場合、揮発性酸を該被覆されたエアロゾル流に添加することが好ましい。好ましくは、揮発性有機酸（室温〜１００℃の温度で揮発性である）が用いられ、最も好ましくは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が用いられる。
【００４５】
該分析物及び好ましくは該分析物中の少なくとも１つの粒子は、微生物（バクテリア、菌類、藻類、原生動物及びウィルスを含む）及び／又はタンパク質（毒素を含む）、又は任意の他の生物学的物質、例えばリンパ球又は細胞組織など、を含みうる。
【００４６】
好ましくは、該少なくとも１つのエアロゾルは、少なくとも０．１μｍの、透過電子顕微鏡法により測定されたときの平均粒子サイズを有する。透過電子顕微鏡法により測定されたときの平均粒子サイズは、多くとも２０μｍであることが好ましい。従って、少なくとも１つのエアロゾル粒子が、０．３〜２０μｍの平均粒子サイズ、好ましくは０．５〜１５μｍの平均粒子サイズを有しうる。
【００４７】
好ましい実施態様において、該分析物は、本発明の方法の前に選抜に付されている。適当な選抜方法は、たとえば、国際公開第２００２／０５２２４６号パンフレット（引用することにより本明細書に組み込まれる）において記載されている。この方法に従い、バイオエアロゾル粒子は、特定の物質、例えばアミノ酸など、の存在が、適当な波長を照射されたときに特徴的な蛍光を誘発する特性に基づき選抜される。一般に、無機物質及び多くの有機物質は、この特徴を示さない。すなわち、バイオエアロゾル粒子は、バイオエアロゾル粒子中の特定の物質の蛍光に影響する励起レーザーにより選抜されることができ、その後、検出器が該蛍光バイオエアロゾル粒子を選抜し、そして第２のレーザーがトリガーされて、該選抜されたバイオエアロゾル粒子をイオン化する。
【００４８】
好ましくは、該選抜はサイズ選抜を含む。バクテリア及びウィルスを含むエアロゾル粒子のサイズは典型的には２０μｍより小さい。該エアロゾル粒子は、或る速さで該マススペクトロメーターの中央空間（the central space）に入るので、逐次的な（successive）エアロゾル粒子のサイズが、エアロゾル粒子により横切られた既知の距離（a known distance）の持続期間から決定されうる。該励起レーザービームを既知の相互の距離を有する２つの逐次のスポットへ向けることにより、上記持続期間及びそれ故に該エアロゾル粒子のサイズが、エアロゾル粒子により散乱され及び検出された光から決定されることができる。これは、特定のサイズ枠における生物学的物質の選択的イオン化を許す。それ故に、種々の物質の混合物から特定のサイズの生物学的物質（例えばバクテリアなど）を同定することが可能である。
【００４９】
本発明は、微生物（バクテリア、菌類、藻類、原生動物及びウィルスを含む）及び／又はタンパク質（毒素を含む）又は任意の他の生物学的物質、例えばリンパ球及び細胞組織、の分類を許す。種々の種が、それらのスペクトルの特徴に従い分類されうる。そのような分類は非常に特異的であり、且つ、種々の発達のステージ（stadia）における微生物を区別することさえ可能である。生物学的物質の該分類の為の方法は、種々の生物学的物質（例えば種々のバクテリア、種々の細胞、種々のウィルスなど）のＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルを得ること、該得られたＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルをＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルのライブラリーと比較すること；及び、該比較に基づき、該生物学的物質を分類することを含む。一つの粒子についての一つの測定だけに基づく、信頼できる分類を実施することが可能であると示された。これは、上記で記載された方法が、低濃度の生物学的粒子（bioparticles）を有する気体の試料分析のために用いられるときに特に有用である。
【００５０】
さらに、本発明は、特に粒子状の物質及び微生物に関する、気体又は液体、例えば水など、の品質を監視することを許す。
【００５１】
さらなる局面において、本発明は、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳの為に、式（Ｉ）に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーンをマトリックス物質として使用する方法に向けられる。
【００５２】
さらなる局面において、本発明は、ＭＡＬＤＩ ＭＳの為の気相マトリックスコーティング方法において、本明細書において定義されたとおりのマトリックス組成物を使用する方法に向けられる。
【００５３】
他の局面において、本発明は、分析物を分析する為のＭＡＬＤＩ ＭＳ方法であって、
該分析物と２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールマトリックス物質とを接触させること、
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
該イオン化した成分をＭＳ検出器を用いて分離すること
を含む上記方法に向けられる。
【００５４】
２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン及び同様の化合物は一般に、ＭＡＬＤＩ ＭＳの為のマトリックス物質として知られているが（例えば、Naxing, X. et al., 1997, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8:116-124 and Domin, M.A. et al., 1999, Rapid Comm. Mass Spectrom. 13:222-226; and 5-ethyl-2-mercaptothiazole as described in Raju, N.P. et al., 2001, Rapid Comm. Mass Spectrom. 15:1879-1884において記載されたとおりの２−メルカプトベンゾチアゾール及びその類似体など）、該特定の化合物２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールそれ自体は開示されていない。さらに、該マトリックス分子における小さな変化が、ＭＡＬＤＩ ＭＳにおけるマトリックスとしての化合物の適用可能性に対する大きな影響をもたらしうることが当技術分野で知られている。或る化合物がマトリックス分子として用いられうるかどうか及びどの特定の用途の為に或る化合物が用いられうるかは、基本的に予測不可能であると分かっている。実施例において示されるとおり、２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールは、生物学的マクロ分子、例えば微生物上に含まれるタンパク質及び炭水化物など、の検出にとって非常に適当であるマトリックス分子であることが分かった。この特定のマトリックス化合物のこの有用性は、微生物のスペクトルパラメーターに基づく、微生物の分類さえ可能にする。
【００５５】
本発明は今、以下の非限定的な実施例により、さらに説明されるであろう。
【実施例１】
【００５６】
実施例１−再現性
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むエアロゾルを分析する為に用いられた実験装置が、図１に示される。気相中のエアロゾル粒子は、エントランス室（entrance room）（１）中にＭＡＬＤＩ装置に入り、そして、液体（例えばアルコールなど）を含む任意的に加熱されたチューブ（２）へもたらされ、そして次に該マトリックス物質を含むチューブ（３）を通る。このチューブの第一の部分が加熱され、一方で第二の部分は加熱されず、その結果該マトリックス物質は該第二の部分で堆積し、そして、コーティングが該エアロゾル上に形成される。該被覆されたエアロゾルはドライヤー（４）及びエアロゾルビーム発生器（５）を通過し、その後該被覆されたエアロゾルはソース室（a source room）（６）へ入り、そこでそれらは散乱及びＵＶ光により検出される（７）。該エアロゾル中の関心のあるタンパク質が次に、イオン化レーザー（８）によりイオン化される。得られたイオンは、ＴＯＦチューブ（９）中でそれらの質量に基づき分離され、そして次に、検出器（１０）で検出される。該データの取得及び処理はパーソナルコーンピュータ（１１）により実施される。
【００５７】
該システム中の圧力は、エントランス室（１）、チューブ（２）及びチューブ（３）における約１００ｋＰａ（大気の）の一連のポンプにより、ソース室（６）およびＴＯＦチューブ（９）において１０−５ｋＰａへと減少する。該システムを通じた該流は、６００〜１０００ｍｌ／分の範囲にある。
マトリックス物質として２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールを用いた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むエアロゾルのリアルタイムＭＡＬＤＩエアロゾルＴＯＦスペクトルが記録された。
【００５８】
リアルタイム試料調製を含むオンラインエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ装置再現性が、図２において実証される。図２における比較可能な特徴的ピークパターン（すなわちＭＡＬＤＩフィンガープリント）は、一貫した日々の再現性を示す。図２により示された結果は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ及びＢ．ｃｅｒｅｕｓの栄養細胞及び芽胞によるいくつかの同一の実験により再現されており（データは示されていない）、これは該システムの再現性及び安定性が満足いくものであることを示す。
【実施例２】
【００５９】
実施例２−識別能力
本発明の識別能力（the distinguishing potential）が、実施例１の下で記載されたとおりであるが、いくつかのＢａｃｉｌｌｕｓ種、たとえばＢ．ｃｅｒｅｕｓ（２つの株）、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ及びＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉなど、による、同様の方法で得られた結果により実証された。それらの１６ＳｒＲＮＡ配列に従い、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを近縁種であると考えることが示唆される。試験されたバクテリア株の一つＢ．ｃｅｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４５７９は、１６ＳｒＤＮＡヌクレオチド配列における塩基対の置換及び類似性に基づき９９．６％のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにおける類似性を有する。上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からの栄養細胞及び芽胞のエアロゾルが、実施例１において記載されたとおりのマトリックス物質によりリアルタイムで覆われ、そしてエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳによりリアルタイムで分析された。
【００６０】
栄養細胞対芽胞
最初に、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの同じ種の芽胞細胞及び栄養細胞が測定された。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの芽胞細胞（Ａ）及び栄養細胞（Ｂ）の間の、図３において示されたとおりの得られた異なるＭＡＬＤＩフィンガープリントは、両者の間の明確な区別を示す。
【００６１】
近縁種
次に、該エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳの識別能力が、増殖依存性差異を防ぐために同じ増殖条件下で培養されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及びＢ．ｇｌｏｂｉｇｉｉの芽胞から得られた近縁種の結果により説明された。図４においてわかるとおり、Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ（Ａ）、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（Ｂ）、及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｃ）の種は、非常に特徴的なスペクトルを示し、これはそれらを容易に区別するために用いられることができる。
【００６２】
図５において、増殖依存性差異を防ぐために同じ増殖条件下で培養された２つのＢ．ｃｅｒｅｕｓの結果により、該識別能力が実証される。２つのＢ．ｃｅｒｅｕｓ株の芽胞もまた、両方のスペクトルにおける異なるＭＡＬＤＩプロファイルにより実証されるとおり、互いに区別されうる。結果は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ，Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ（２つの株を含む）などの近縁微生物が、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＭＳと組み合わされた本発明の使用により、株レベルについてさえ、互いに区別されることができることを示す。
【００６３】
一つのバクテリア培養物内の一つの粒子レベルについての分離
一つの細胞または粒子レベルでの分離が、空気動力学的直径、蛍光又はマススペクトルフィンガープリントに基づき、細胞又は粒子をクラスター化することにより可能である。
【００６４】
本発明の使用により、十分なマススペクトルの情報が、フィンガープリントクラスタリング（fingerprint clustering）を適用するために１回のショットで入手可能である。１回のショット（single shots）は、個々の細胞、芽胞、クラスター化細胞、芽胞、タンパク質、ペプチド、増殖媒体又は他のバックグラウンド粒子でありうる。
【００６５】
図６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのマススペクトルフィンガープリントについてクラスター化された６のショット／粒子のデータを示す。
【実施例３】
【００６６】
実施例３−エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ対一般的ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ
エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳについて、一般のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳのサポートが、微生物のデータベースを作る為に重要である。両方の技術（すなわち知られていないマトリックス形態学（morphology）及び飛行におけるイオン化）の間の区別可能な違いにもかかわらず、比較可能なスペクトルが、一般のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ及びエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳの両方による本発明のマトリックスレシピが用いられるならば、得られた。図７は、１週間アガープレート上で培養されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの栄養細胞から得られ且つ両方の技術により記録されたスペクトルの例を示す。
【００６７】
同じピーククラスターが、両方のスペクトルにおいて４７１０、４８１６、７２４２、７３８５及び８２５９Ｄａで見られた。一般のＭＡＬＤＩとエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳとの間の良い類似性は、グラム陰性微生物、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉのｇｅｎｏｍｏｖａｒｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ並びにウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓウィルス（ＡｃＮＰＶ）及びＣｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓウィルス及びＭＳ２バクテリオファージなどを用いても確認された（データは示されていない）。
【実施例４】
【００６８】
実施例４−他の微生物の種
グラム陰性微生物
提示されたグラム陽性ｂａｃｉｌｌｕｓ種の次に、グラム陰性微生物、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉのｇｅｎｏｍｏｖａｒｓ（１１の種）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ及びＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａなど、もまた図８において区別可能なスペクトルを与え、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａと比較したＥ．ｃｏｌｉの例を示す。
【００６９】
ウィルス
以下のウィルスが試験された：バクテリオファージＭＳ２及びバキュロウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓウィルス（ＡｃＮＰＶ）及びＣｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓウィルス。バクテリオファージＭＳ２は、ＲＮＡタイプウィルスを代表する。該バキュロウィルスは、二本差ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウィルスである。同一のスペクトルが、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ及び一般のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより得られた。ＭＳ２の場合、１３ｋＤａのキャプシドタンパク質の[Ｍ＋Ｈ]＋（ｍ／ｚ １３７２６）及び[Ｍ＋２Ｈ]＋２（ｍ／ｚ ６８６５）イオンシグナルが検出された（データは示されていない）。他のバクテリア種に特異的なバクテリオファージは典型的には、異なる分子量のキャプシドタンパク質を有し、そしてそれ故に、異なるＭＡＬＤＩシグナルを与える。
【００７０】
バキュロウィルスのスペクトル間の差異は明白である（図９を参照されたい）。ＡｃＮＰＶウィルス（Ａ）のエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳスペクトルは、おそらく主要糖タンパク質エンベロープの一部である６０００〜１２０００Ｄａの特徴的な広いバンドを有する。ＣｐＧＶウィルス（Ｂ）は、１２４２−１２５７−１２７９Ｄａ及び６４６０及び８６７５Ｄａで特徴的なシグナルクラスターを示す。
【実施例５】
【００７１】
実施例５−液体試料分析
エアロゾル試料への本発明の直接の適用可能性の次に、液体試料、例えば水、体液及び血液など、も５０〜２００μｌの低量で取り扱われうる。該流体は、Ｍｅｉｎｈａｒｄ噴霧器を用いてエアロゾル化され、ろ過された空気（filtered air）のキャリアガスを有するエアロゾルを与える。生成されたエアロゾルは、本発明の使用方法によりリアルタイムで被覆され、そして、個々の粒子が、空気動力学的直径及び／又は蛍光及び／又はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳフィンガープリントの選抜により分析されうる。
【００７２】
用水路の水中の毒素
図１０は、用水路の水へ添加されたコレラ毒素（１００μｇ／ｍｌ）の結果を示す。該用水路の水は、０．２μｍフィルターによりろ過されて微生物の粒子を除去し、そして、６０μｌがエアロゾル化されそしてオンライン分析された。
【００７３】
コレラ毒素は、２４ｋＤａの分子質量を有するＡサブユニット及び１２ｋＤａのＢサブユニットからなる。水中及び添加された用水路の水中の参照のマススペクトルは、コレラ毒素のＢサブユニットの特徴的質量を示す。該用水路の水の場合、特徴的なコレラ毒素マススペクトルを有する１２の合計されたシングルショットのスペクトルが、用水路の水の６００ショット／粒子のバックグラウンドから選抜されたときに、コレラ毒素の存在を示すのに十分である。
【００７４】
Ｔリンパ球及びＢリンパ球
Ｔリンパ球及びＢリンパ球は、適用免疫応答の主要な細胞成分である。Ｔ細胞は、細胞により媒介される免疫に関与する一方で、Ｂ細胞は主に（抗体に関する）液性免疫に関与する。それらは、病原体を記憶して将来の感染の場合により早い抗体産生を可能とする記憶細胞を形成する。インタクトなＢリンパ球及びＴリンパ球を分析することの能力が、ＪｕｒｋａｔＴリンパ球及びＪ５５８Ｂリンパ球細胞について研究された。約５０μｌの少量が、Ｍｅｉｎｈａｒｄ噴霧器により導入された。図１１は、ＪｕｒｋａｔＴリンパ球及びＪ５５８Ｂリンパ球のエアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ平均を合計したマススペクトルを示す。
【００７５】
結論
上記実施例は、生物学的起源の材料から区別可能なＭＳフィンガープリントを生成するための一般的能力を実証する。エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳと組み合わされた本発明は、種から株レベルの容易な区別の為の迅速且つ速成のツールであると分かった。本発明の試料マトリックス条件を用いる場合、ＭＡＬＤＩ結果は、一般のＭＡＬＤＩとほとんど同一であろう。これは、データベースを作成するために一般のＭＡＬＤＩの必要なサポートの利用可能性及びこれらのデータベースの解釈の為の使用を示す。一般のＭＡＬＤＩと比較したときの、エアロゾルＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳと組み合わされた本発明は、バルク材料の代わりの一つの粒子レベルについての分析に起因して、天然の無機的又は生物学的バックグラウンドの存在により影響を受けない又はより少なく影響されるという、大きな利点を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エアロゾル分析物を分析するためのＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法であって、
該エアロゾル分析物を、式（Ｉ）
に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型を含むＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為のマトリックス物質と接触させること、
ここで、ＸはＮ、Ｓ又はＯであり、且つＲ１及びＲ２は水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから独立に選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、置換されていてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよい芳香族環構造を形成する、
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
該イオン化した成分をマススペクトロメーター、例えば飛行時間マススペクトロメーターを用いて分離すること
を含む上記方法。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２がメチル基である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＸがＳである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該マトリックス物質がアルコールをも含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール及びｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該アルコールが、多価アルコール、例えばジオール又はトリオール、である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該アルコールがハロゲン化されている、例えば塩素化又はフッ素化されている、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該アルコールの少なくとも１つのα炭素原子が、少なくとも１つのハロゲン原子により置換されている、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該アルコールが完全にハロゲン化されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該接触が気相中で起こり、該気相がアルコールにより少なくとも部分的に飽和されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該少なくとも１つのエアロゾルが、透過電子顕微鏡法により測定されたときに、少なくとも０．１μｍ、好ましくは０．３〜２０μｍ、より好ましくは０．５〜１５μｍの平均粒子サイズを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該分析物が、生物学的物質、好ましくは微生物及び／又はタンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該分析物が、該マトリックス物質と接触させられる前に、粒子サイズ選抜に付されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的物質の分類の為の方法であって、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を用いて、種々の生物学的物質のＭＡＬＤＩマススペクトルを得ること；
得られたＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルを、ＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルのライブラリーと比較すること；そして、
該比較に基づき、該生物学的物質を分類すること
を含む、上記方法。
【請求項１６】
分析物を分析するためのＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法であって、
該分析物を２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールを含むマトリックス物質と接触させること；
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
飛行時間検出器を用いて該イオン化成分を分離すること
を含む、上記方法。
【請求項１７】
２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールを、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為のマトリックス物質として使用する方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）
に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型を含むマトリックス組成物を、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為の気相マトリックスコーティング方法において使用する方法、
ここで、ＸはＮ、Ｓ又はＯであり、且つＲ１及びＲ２は水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから独立に選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、置換されていてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよい芳香族環構造を形成する。
【請求項１９】
該マトリックス組成物がさらに、アルコール、好ましくはハロゲン化アルコールを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
エアロゾル分析物を分析するためのＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法であって、
該エアロゾル分析物を、式（Ｉ）
に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型を含むＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為のマトリックス物質と接触させること、
ここで、ＸはＮ、Ｓ又はＯであり、且つＲ１及びＲ２は水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから独立に選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、置換されていてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよい芳香族環構造を形成する、
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
該イオン化した成分をマススペクトロメーター、例えば飛行時間マススペクトロメーターを用いて分離すること
を含む上記方法。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が同じである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２がメチル基である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＸがＳである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該マトリックス物質がアルコールをも含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、イソブタノール及びｔｅｒｔ−ブタノールからなる群から選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該アルコールが、多価アルコール、例えばジオール又はトリオール、である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該アルコールがハロゲン化されている、例えば塩素化又はフッ素化されている、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該アルコールの少なくとも１つのα炭素原子が、少なくとも１つのハロゲン原子により置換されている、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該アルコールが完全にハロゲン化されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該接触が気相中で起こり、該気相がアルコールにより少なくとも部分的に飽和されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該少なくとも１つのエアロゾルが、透過電子顕微鏡法により測定されたときに、少なくとも０．１μｍ、好ましくは０．３〜２０μｍ、より好ましくは０．５〜１５μｍの平均粒子サイズを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該分析物が、生物学的物質、好ましくは微生物及び／又はタンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該分析物が、該マトリックス物質と接触させられる前に、粒子サイズ選抜に付されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的物質の分類の為の方法であって、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を用いて、種々の生物学的物質のＭＡＬＤＩマススペクトルを得ること；
得られたＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルを、ＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルのライブラリーと比較すること；そして、
該比較に基づき、該生物学的物質を分類すること
を含む、上記方法。
【請求項１６】
分析物を分析するためのＭＡＬＤＩマススペクトロメトリー方法であって、
該分析物を２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールを含むマトリックス物質と接触させること；
該分析物の少なくとも一部をイオン化すること；そして
飛行時間検出器を用いて該イオン化成分を分離すること
を含む、上記方法。
【請求項１７】
２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールを、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為のマトリックス物質として使用する方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）
に従う２−メルカプト−４，５−ジアルキルヘテロアレーン又はその互変異性型を含むマトリックス組成物を、ＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーの為の気相マトリックスコーティング方法において使用する方法、
ここで、ＸはＮ、Ｓ又はＯであり、且つＲ１及びＲ２は水素、メチル、メトキシ、エトキシ及びプロポキシから独立に選ばれ、又はＲ１及びＲ２は一緒になって、置換されていてもよく、１以上のヘテロ原子を含んでもよい芳香族環構造を形成する。
【請求項１９】
該マトリックス組成物がさらに、アルコール、好ましくはハロゲン化アルコールを含む、請求項１８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０３６０５（Ｐ２０１１−５０３６０５Ａ）
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３３９８０（Ｐ２０１０−５３３９８０）
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４１８０
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０２０１５７８４）ネーデルランドセ オルガニサティエ フォール トエゲパストナトールヴェテンシャッペリク オンデルゾエク ティエヌオー (41)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０７２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６４１８０
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５０２０１５７８４）ネーデルランドセ オルガニサティエ フォール トエゲパストナトールヴェテンシャッペリク オンデルゾエク ティエヌオー (41)
【Ｆターム（参考）】
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