ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するためのプローブ
【課題】ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位遺伝子多型検査を迅速、正確、かつ安価に行うための方法及び試薬を提供する。
【解決手段】特定の配列で示されるプローブを用いる。
【解決手段】特定の配列で示されるプローブを用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の多型を検出するためのプローブ、ならびに、該プローブを用いた多型の検出方法および多型を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＤＲ１（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１）は薬物輸送に関与するＰ糖タンパク質をコードしている遺伝子である。
【０００３】
ＭＤＲ１には様々な遺伝子多型が存在することが報告されており、なおかつこれらの多型の中には薬物代謝に関与するものがあることもわかっている（非特許文献１、非特許文献２）。ＭＤＲ１の遺伝子多型の中では特にＥｘｏｎ２１の２６７７位およびＥｘｏｎ２６の３４３５位についての研究が盛んに行われている。
【０００４】
ＭＤＲ１の遺伝子多型は人種間で差があることが知られている（非特許文献１）。そのため、人種間での薬物代謝の差を研究するためには各人種のＭＤＲ１遺伝子多型を多数検査する必要がある。そのような大規模調査には、迅速かつ正確なＭＤＲ１遺伝子多型検査方法を用いることが望ましい。
【０００５】
遺伝子多型の検出法としてはシークエンス法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などが用いられる。しかしこれらは検査に時間を要する上に、核酸増幅産物によるキャリーオーバーコンタミネーションの危険性が考えられるため、大規模検査には不適当である。
【０００６】
他に、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用した方法として蛍光標識された２本のプローブを用いての検出法も行われている（非特許文献３）。しかし、複数のプローブを使用する方法はコストが高くなりやすいという欠点があり、特に多数の検査を必要とする場合はより安価な検査法が望まれる。
【０００７】
上記のような問題点を解決する方法として、末端が蛍光標識されたプローブ１本を用いた遺伝子多型の検出法が存在し、ＭＤＲ１遺伝子多型の検出にも用いられている（特許文献１、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許３４３７８１６号
【特許文献２】特許４４５４３６６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｎｂａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｊｐｎ １２８，３９５−４０４，２００６
【非特許文献２】Ｃｈｏｗｂａｙ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ ３７，３２７−３７８，２００５
【非特許文献３】Ｋｏｍｏｔｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ２１，１２６−１３２，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記従来のＭＤＲ１遺伝子多型検査における問題点を解決しようとするものであり、その目的はＭＤＲ１遺伝子の３４３５位遺伝子多型検査を迅速、正確、かつ安価に行うための方法及び試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位およびその周辺の塩基配列に特異的に結合する１本の核酸プローブを用いることにより従来技術よりも正確に３４３５位の遺伝子多型を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１２】
［項１］
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出するためのプローブであって、配列番号１で示される塩基配列を有するプローブ。
［項２］
検出可能な標識物質により標識化された、項１に記載のプローブ。
［項３］
検出可能な標識物質が蛍光色素である、項２に記載のプローブ。
［項４］
末端のシトシンが標識化された、項２または３に記載のプローブ。
［項５］
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
［項６］
項５に記載の方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、前記プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴う蛍光強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
［項７］
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、項５または６に記載の方法。
［項８］
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、項７に記載の方法。
［項９］
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、項７または８に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
［項１０］
項５または６に記載のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法に用いるための遺伝子多型検出キットであって、項１〜４のいずれかに記載のプローブを含む遺伝子多型検出キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４２５位の多型検査を迅速、正確かつ簡便に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】比較例１の結果と実施例１の結果を重ね合わせた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態の一つは、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出するためのプローブであって、配列番号１で示される塩基配列からなるプローブである。
【００１６】
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位およびその周辺配列は配列番号４で示される。ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位は配列番号４で示される塩基配列の１７６番目の塩基に該当する。３４３５位はＣまたはＴの塩基であり、メジャーアリルはＣ、マイナーアリルはＴであることがわかっている。配列番号４は３４３５位がメジャーアリルである場合の塩基配列を示している。
【００１７】
本発明のプローブは、被検核酸に対して特異的に結合するように設計されており、融解曲線分析に適している。
非特許文献３に開示されている方法は、検出に２本以上のプローブを要し本発明とは全く異なる原理で被検核酸を検出する方法であるから、該方法に用いられているプローブを本発明に直接転用することは出来ないし、参考にすることも出来ない。
【００１８】
配列番号１で示される本発明のプローブは、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、なおかつ３４３５位がマイナーアリルである場合に完全に相補的となる。
【００１９】
本発明のプローブは、配列番号１に示される核酸配列が好ましいが、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を含む１０塩基以上３０塩基以下の核酸配列またはこれに相補的な核酸配列であれば、特に限定されない。
【００２０】
本発明のプローブは、標識物質で標識化された標識化プローブであってもよい。好ましくは、蛍光色素によって標識された核酸プローブ、さらに好ましくは、末端が蛍光色素によって標識された核酸プローブを使用できる。
【００２１】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識物質は、制限されないが、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例として、例えば、前記蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００２２】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２３】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００２４】
本発明のプローブは、前述のように、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４２５位の多型検出に使用することができる。この変異の検出方法は、何ら制限されず、被検核酸と前記プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。
【００２５】
本発明の実施形態の一つは、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４２５位の多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含むことを特徴とする方法である。
薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４３５位の多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【００２６】
本発明の多型検出方法によれば、配列番号１で示される塩基配列を有するプローブを使用することで、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４３５位の多型を検出できる。
【００２７】
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００２８】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前記試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。これらの増幅産物を、本発明における被検核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜３００塩基である。
【００２９】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料、口腔拭い液、咽頭拭い液等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３０】
本発明の方法で用いる融解曲線分析について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００３１】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。
前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。標識化プローブにおける標識物質は、例えば、前述のとおりである。
好ましい標識物質は、蛍光色素である。標識物質に蛍光色素を用いた場合、上記方法において、前記プローブに付加した蛍光色素のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行い、この工程における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定することができる。
【００３２】
前述のように、被検核酸が、鋳型核酸から核酸増幅法により増幅させた増幅産物である場合、前記工程（１）は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から核酸を増幅する工程を含んでも良い。言い換えれば、前記工程（１）における被検核酸は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物であっても良い。
【００３３】
前記プライマー対としては、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位周辺領域の本発明プローブがハイブリダイズ可能な領域が特異的に増幅されるものであれば、特に制限されない。前記増幅領域は、例えば、前記プローブがハイブリダイズする領域のみでもよいし、前記ハイブリダイズ領域を含む領域であってもよい。
【００３４】
具体的には、例えば、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーが例示できる。
（Ｆ）塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
【００３５】
前記核酸増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００３６】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００３７】
本発明プローブが含まれる反応系でＭＤＲ１遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＭＤＲ１遺伝子またはその増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＭＤＲ１遺伝子またはその増幅産物と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００３８】
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＭＤＲ１遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００３９】
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００４０】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製、商標）を用いることが好ましい。
【００４１】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績製、登録商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。
【００４２】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００４３】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μＬ、Ｂ液およびＣ液各５μＬおよび滅菌水１０μＬをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μＬを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μＬ、Ｄ液１００μＬを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μＬ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔 ３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μＬ キャリアーＤＮＡ
【００４４】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μＬの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍＬのエッペンチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μＬ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μＬ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μＬの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００４５】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成速度とは単位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。ＤＮＡ合成速度は、市販品であれば該市販品の説明書等に記載されている値、説明書等に記載がない場合は文献等に記載されている値を指すものとする。これらの方法で特定できない場合は、以下の方法で求めることができる。
【００４６】
ＤＮＡ合成速度の測定法
ＤＮＡポリメラーゼの反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），８ｍＭ塩化マグネシウム、７．５ｍＭ ジチオスレイトール、１００ μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＣｉ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（５０ｍＭ 水酸化ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ フィコール、０．０５％ ブロモフェノールブルー）を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求める。
【００４７】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、以下の説明によって何ら制限されることはない。
【００４８】
まず、例えば全血からゲノムＤＮＡを単離する。単離は、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて行うことができる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、標識化プローブとして、例えば、ＱＰｒｏｂｅを添加する。
【００４９】
前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述する増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、前記工程（２）とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００５０】
前記プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００５１】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５２】
ＰＣＲのプライマーの配列は、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅できるものであれば特に制限されず、前述のように、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜４０ｍｅｒ）に設定できる。
【００５３】
本発明の検出方法に使用するプライマーセットとしては、例えば、前述の本発明のプライマーセットがあげられる。なお、本発明のプライマーセットの用途は、本発明の検出方法には制限されず、また、本発明の検出方法に使用するプライマーセットも、本発明のプライマーセットには限定されない。
【００５４】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００５５】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００５６】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００５７】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜１μｍｏｌ／Ｌである。
【００５８】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５９】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００６０】
目的の塩基部位における遺伝子型（野生型、変異型など）の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００６１】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６２】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６４】
〔実施例１：精製したヒトゲノムからのＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の検出〕
（１）試料の調製
既にＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がメジャーホモ（Ｃ／Ｃ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＭ）、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がヘテロ（Ｃ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＨ）、そしてＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がマイナーホモ（Ｔ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下Ｈｍ）を試料とし、陰性コントロール（ＮＣ）として１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００６５】
試薬
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １．３μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １．３μｇ
ＤＭＳＯ ０．９８μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．４Ｕ
試料 ４μｌ
【００６６】
核酸増幅および融解曲線分析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００６７】
結果
図１は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。ＨＭは５５℃付近にピークが現れており、Ｈｍは６２〜６３℃にピークが現れている。そしてＨＨはその両方の温度でピークが現れている。本実施例で用いた配列番号１のプローブは末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識されている。このプローブは相補的な配列の核酸と結合している間は蛍光が消光しており、逆にプローブが単独で遊離している間は蛍光が発光しているという特徴を有する。配列番号１のプローブはマイナーホモのＭＤＲ１遺伝子３４３５位を含む核酸と最も強く結合し、メジャーホモのＭＤＲ１遺伝子３４３５位を含む核酸とは一塩基のミスマッチが生じているため、より弱く結合する。従って、図１の５５℃付近でのピークは被検核酸中のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がメジャーアリル（Ｃ／Ｃ）であることを示しており、６２〜６３℃のピークは被検核酸中のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がマイナーアリルであることを示している。そしてその両方のピークを発した被検核酸はメジャーアリルとマイナーアリルの両方を有するヘテロであることを示している。
以上より、本発明プローブを用いることでＭＤＲ１遺伝子の３４３５位多型を容易に識別できることが示された。
【００６８】
〔実施例２：全血希釈液からのＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の検出〕
（１）試料の調製
全血１０μｌに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を９０μｌ加えて、希釈倍率１０倍の全血希釈液を調製した。この全血希釈液を試料とした。検出系は１０μｌであり、試料は１μｌを供するため、検出系での全血の終濃度は１％となる。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記全血希釈液に下記試薬を添加して、下記条件によりＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００６９】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １μｇ
ＤＭＳＯ ０．７５μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７０】
核酸増幅および融解曲線分析
実施例１と同じ。
【００７１】
結果
図２は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。図２から明らかなように、本発明プローブを用いることによって全血の希釈液からでもＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の多型を検出することができる。
【００７２】
〔比較例１：既存発明プローブとの検出能比較〕
（１）試料の調製
（２）核酸増幅および融解曲線分析
いずれも実施例１と同じである。
【００７３】
試薬（１）
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製し、試薬（１）とした。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １．３μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １．３μｇ
ＤＭＳＯ ０．９８μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．４Ｕ
試料 ４μｌ
【００７４】
試薬（２）
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製し、試薬（２）とした。なお、本比較例で用いた配列番号５で示される核酸プローブは特許文献２の配列番号５で示される核酸プローブであり、該核酸プローブの３’末端はＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識されている。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号５、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １．３μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １．３μｇ
ＤＭＳＯ ０．９８μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．４Ｕ
試料 ４μｌ
【００７５】
結果
図３は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。実線は本発明プローブである配列番号１で示される核酸プローブによる検出結果を、破線は配列番号５で示される核酸プローブによる検出結果を示している。
実線と破線とを比較した結果、以下の二点で本発明プローブの方が優れていると言える。
まず第一点は、本発明プローブの方が蛍光微分値が高いことである。上述したとおり、末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識されたプローブは被検核酸と結合すると消光し、解離すると発光するという性質を示す。従って、蛍光微分値すなわち蛍光変化が大きいということは被検核酸への結合の有無を判別しやすいということを示している。以上から、本発明プローブと配列番号５で示される既存発明プローブとを比較したとき、本発明プローブの方が被検核酸の検出結果が明瞭に現れることを示唆している。
第二点は、本発明プローブの方がヘテロタイプを識別しやすいことである。図３のＨＨを示す実線と破線を比較すると、実線の方が二つのピークの高さがより均等に近い形状である。ヘテロタイプを検出する場合に二つのピークの高さ、すなわち蛍光微分値が離れていたり、あるいはピークの変曲点付近が緩やかであったりすると、特に機械による自動検出を行っている場合に、その波形がヘテロを示すものであると認識され難くなる。このような性質を示す核酸プローブを用いて検出を行うことは、多型の誤診断を誘発する可能性があるため、本発明のように融解曲線分析を利用して遺伝子多型の診断を行う場合は、用いられる核酸プローブはヘテロタイプであることを示す二つのピークの蛍光微分値がなるべく近くなる性質を持った核酸プローブであることが好ましい。以上の理由から、本発明プローブの方が既存発明プローブよりも誤診断の可能性が少ないことは明らかである。
以上二点の理由から、既存発明プローブよりも本発明プローブの方がＭＤＲ１の３４３５位多型検査に好ましい核酸プローブであると言える。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明を薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の多型検査および薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の多型検査試薬開発に適用することで、迅速、確実かつ簡便なＭＤＲ１多型検査を行うことができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の多型を検出するためのプローブ、ならびに、該プローブを用いた多型の検出方法および多型を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＤＲ１（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１）は薬物輸送に関与するＰ糖タンパク質をコードしている遺伝子である。
【０００３】
ＭＤＲ１には様々な遺伝子多型が存在することが報告されており、なおかつこれらの多型の中には薬物代謝に関与するものがあることもわかっている（非特許文献１、非特許文献２）。ＭＤＲ１の遺伝子多型の中では特にＥｘｏｎ２１の２６７７位およびＥｘｏｎ２６の３４３５位についての研究が盛んに行われている。
【０００４】
ＭＤＲ１の遺伝子多型は人種間で差があることが知られている（非特許文献１）。そのため、人種間での薬物代謝の差を研究するためには各人種のＭＤＲ１遺伝子多型を多数検査する必要がある。そのような大規模調査には、迅速かつ正確なＭＤＲ１遺伝子多型検査方法を用いることが望ましい。
【０００５】
遺伝子多型の検出法としてはシークエンス法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などが用いられる。しかしこれらは検査に時間を要する上に、核酸増幅産物によるキャリーオーバーコンタミネーションの危険性が考えられるため、大規模検査には不適当である。
【０００６】
他に、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用した方法として蛍光標識された２本のプローブを用いての検出法も行われている（非特許文献３）。しかし、複数のプローブを使用する方法はコストが高くなりやすいという欠点があり、特に多数の検査を必要とする場合はより安価な検査法が望まれる。
【０００７】
上記のような問題点を解決する方法として、末端が蛍光標識されたプローブ１本を用いた遺伝子多型の検出法が存在し、ＭＤＲ１遺伝子多型の検出にも用いられている（特許文献１、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許３４３７８１６号
【特許文献２】特許４４５４３６６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｎｂａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｊｐｎ １２８，３９５−４０４，２００６
【非特許文献２】Ｃｈｏｗｂａｙ Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ ３７，３２７−３７８，２００５
【非特許文献３】Ｋｏｍｏｔｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ２１，１２６−１３２，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記従来のＭＤＲ１遺伝子多型検査における問題点を解決しようとするものであり、その目的はＭＤＲ１遺伝子の３４３５位遺伝子多型検査を迅速、正確、かつ安価に行うための方法及び試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位およびその周辺の塩基配列に特異的に結合する１本の核酸プローブを用いることにより従来技術よりも正確に３４３５位の遺伝子多型を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１２】
［項１］
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出するためのプローブであって、配列番号１で示される塩基配列を有するプローブ。
［項２］
検出可能な標識物質により標識化された、項１に記載のプローブ。
［項３］
検出可能な標識物質が蛍光色素である、項２に記載のプローブ。
［項４］
末端のシトシンが標識化された、項２または３に記載のプローブ。
［項５］
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
［項６］
項５に記載の方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、前記プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴う蛍光強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
［項７］
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、項５または６に記載の方法。
［項８］
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、項７に記載の方法。
［項９］
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、項７または８に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
［項１０］
項５または６に記載のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法に用いるための遺伝子多型検出キットであって、項１〜４のいずれかに記載のプローブを含む遺伝子多型検出キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４２５位の多型検査を迅速、正確かつ簡便に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】比較例１の結果と実施例１の結果を重ね合わせた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態の一つは、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出するためのプローブであって、配列番号１で示される塩基配列からなるプローブである。
【００１６】
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位およびその周辺配列は配列番号４で示される。ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位は配列番号４で示される塩基配列の１７６番目の塩基に該当する。３４３５位はＣまたはＴの塩基であり、メジャーアリルはＣ、マイナーアリルはＴであることがわかっている。配列番号４は３４３５位がメジャーアリルである場合の塩基配列を示している。
【００１７】
本発明のプローブは、被検核酸に対して特異的に結合するように設計されており、融解曲線分析に適している。
非特許文献３に開示されている方法は、検出に２本以上のプローブを要し本発明とは全く異なる原理で被検核酸を検出する方法であるから、該方法に用いられているプローブを本発明に直接転用することは出来ないし、参考にすることも出来ない。
【００１８】
配列番号１で示される本発明のプローブは、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、なおかつ３４３５位がマイナーアリルである場合に完全に相補的となる。
【００１９】
本発明のプローブは、配列番号１に示される核酸配列が好ましいが、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を含む１０塩基以上３０塩基以下の核酸配列またはこれに相補的な核酸配列であれば、特に限定されない。
【００２０】
本発明のプローブは、標識物質で標識化された標識化プローブであってもよい。好ましくは、蛍光色素によって標識された核酸プローブ、さらに好ましくは、末端が蛍光色素によって標識された核酸プローブを使用できる。
【００２１】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識物質は、制限されないが、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例として、例えば、前記蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００２２】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２３】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００２４】
本発明のプローブは、前述のように、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４２５位の多型検出に使用することができる。この変異の検出方法は、何ら制限されず、被検核酸と前記プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。
【００２５】
本発明の実施形態の一つは、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４２５位の多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含むことを特徴とする方法である。
薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４３５位の多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【００２６】
本発明の多型検出方法によれば、配列番号１で示される塩基配列を有するプローブを使用することで、薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の３４３５位の多型を検出できる。
【００２７】
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００２８】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前記試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。これらの増幅産物を、本発明における被検核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜３００塩基である。
【００２９】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料、口腔拭い液、咽頭拭い液等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３０】
本発明の方法で用いる融解曲線分析について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００３１】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。
前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。標識化プローブにおける標識物質は、例えば、前述のとおりである。
好ましい標識物質は、蛍光色素である。標識物質に蛍光色素を用いた場合、上記方法において、前記プローブに付加した蛍光色素のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行い、この工程における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定することができる。
【００３２】
前述のように、被検核酸が、鋳型核酸から核酸増幅法により増幅させた増幅産物である場合、前記工程（１）は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から核酸を増幅する工程を含んでも良い。言い換えれば、前記工程（１）における被検核酸は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物であっても良い。
【００３３】
前記プライマー対としては、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位周辺領域の本発明プローブがハイブリダイズ可能な領域が特異的に増幅されるものであれば、特に制限されない。前記増幅領域は、例えば、前記プローブがハイブリダイズする領域のみでもよいし、前記ハイブリダイズ領域を含む領域であってもよい。
【００３４】
具体的には、例えば、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーが例示できる。
（Ｆ）塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
【００３５】
前記核酸増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００３６】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００３７】
本発明プローブが含まれる反応系でＭＤＲ１遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＭＤＲ１遺伝子またはその増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＭＤＲ１遺伝子またはその増幅産物と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００３８】
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＭＤＲ１遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００３９】
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００４０】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製、商標）を用いることが好ましい。
【００４１】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績製、登録商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。
【００４２】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００４３】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μＬ、Ｂ液およびＣ液各５μＬおよび滅菌水１０μＬをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μＬを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μＬ、Ｄ液１００μＬを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μＬ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔 ３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μＬ キャリアーＤＮＡ
【００４４】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μＬの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍＬのエッペンチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μＬ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μＬ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μＬの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００４５】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成速度とは単位時間当たりのＤＮＡの合成数をいう。ＤＮＡ合成速度は、市販品であれば該市販品の説明書等に記載されている値、説明書等に記載がない場合は文献等に記載されている値を指すものとする。これらの方法で特定できない場合は、以下の方法で求めることができる。
【００４６】
ＤＮＡ合成速度の測定法
ＤＮＡポリメラーゼの反応液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），８ｍＭ塩化マグネシウム、７．５ｍＭ ジチオスレイトール、１００ μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＣｉ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を、プライマーをアニーリングさせたＭ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液（５０ｍＭ 水酸化ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ フィコール、０．０５％ ブロモフェノールブルー）を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルしたλ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによって、ＤＮＡ合成速度を求める。
【００４７】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、以下の説明によって何ら制限されることはない。
【００４８】
まず、例えば全血からゲノムＤＮＡを単離する。単離は、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて行うことができる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、標識化プローブとして、例えば、ＱＰｒｏｂｅを添加する。
【００４９】
前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述する増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、前記工程（２）とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００５０】
前記プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００５１】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５２】
ＰＣＲのプライマーの配列は、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅できるものであれば特に制限されず、前述のように、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜４０ｍｅｒ）に設定できる。
【００５３】
本発明の検出方法に使用するプライマーセットとしては、例えば、前述の本発明のプライマーセットがあげられる。なお、本発明のプライマーセットの用途は、本発明の検出方法には制限されず、また、本発明の検出方法に使用するプライマーセットも、本発明のプライマーセットには限定されない。
【００５４】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００５５】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００５６】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００５７】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜１μｍｏｌ／Ｌである。
【００５８】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５９】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００６０】
目的の塩基部位における遺伝子型（野生型、変異型など）の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００６１】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６２】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【実施例】
【００６３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６４】
〔実施例１：精製したヒトゲノムからのＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の検出〕
（１）試料の調製
既にＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がメジャーホモ（Ｃ／Ｃ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＭ）、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がヘテロ（Ｃ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下ＨＨ）、そしてＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がマイナーホモ（Ｔ／Ｔ）であることが判明している精製されたヒトゲノム（以下Ｈｍ）を試料とし、陰性コントロール（ＮＣ）として１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００６５】
試薬
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １．３μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １．３μｇ
ＤＭＳＯ ０．９８μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．４Ｕ
試料 ４μｌ
【００６６】
核酸増幅および融解曲線分析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００６７】
結果
図１は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。ＨＭは５５℃付近にピークが現れており、Ｈｍは６２〜６３℃にピークが現れている。そしてＨＨはその両方の温度でピークが現れている。本実施例で用いた配列番号１のプローブは末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識されている。このプローブは相補的な配列の核酸と結合している間は蛍光が消光しており、逆にプローブが単独で遊離している間は蛍光が発光しているという特徴を有する。配列番号１のプローブはマイナーホモのＭＤＲ１遺伝子３４３５位を含む核酸と最も強く結合し、メジャーホモのＭＤＲ１遺伝子３４３５位を含む核酸とは一塩基のミスマッチが生じているため、より弱く結合する。従って、図１の５５℃付近でのピークは被検核酸中のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がメジャーアリル（Ｃ／Ｃ）であることを示しており、６２〜６３℃のピークは被検核酸中のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位がマイナーアリルであることを示している。そしてその両方のピークを発した被検核酸はメジャーアリルとマイナーアリルの両方を有するヘテロであることを示している。
以上より、本発明プローブを用いることでＭＤＲ１遺伝子の３４３５位多型を容易に識別できることが示された。
【００６８】
〔実施例２：全血希釈液からのＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の検出〕
（１）試料の調製
全血１０μｌに１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を９０μｌ加えて、希釈倍率１０倍の全血希釈液を調製した。この全血希釈液を試料とした。検出系は１０μｌであり、試料は１μｌを供するため、検出系での全血の終濃度は１％となる。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記全血希釈液に下記試薬を添加して、下記条件によりＭＤＲ１遺伝子の３４３５位を検出した。核酸増幅および融解曲線分析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００６９】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １μｇ
ＤＭＳＯ ０．７５μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７０】
核酸増幅および融解曲線分析
実施例１と同じ。
【００７１】
結果
図２は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。図２から明らかなように、本発明プローブを用いることによって全血の希釈液からでもＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の多型を検出することができる。
【００７２】
〔比較例１：既存発明プローブとの検出能比較〕
（１）試料の調製
（２）核酸増幅および融解曲線分析
いずれも実施例１と同じである。
【００７３】
試薬（１）
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製し、試薬（１）とした。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １．３μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １．３μｇ
ＤＭＳＯ ０．９８μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．４Ｕ
試料 ４μｌ
【００７４】
試薬（２）
以下の試薬を含む１３．２μｌ溶液を調製し、試薬（２）とした。なお、本比較例で用いた配列番号５で示される核酸プローブは特許文献２の配列番号５で示される核酸プローブであり、該核酸プローブの３’末端はＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識されている。
核酸プライマー（配列番号２） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号３） ２５０ｎＭ
核酸プローブ（配列番号５、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ４００ｎＭ
×１０緩衝液 １．３μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ １．３μｇ
ＤＭＳＯ ０．９８μＬ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．４Ｕ
試料 ４μｌ
【００７５】
結果
図３は、融解曲線における温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した結果を表した図である。実線は本発明プローブである配列番号１で示される核酸プローブによる検出結果を、破線は配列番号５で示される核酸プローブによる検出結果を示している。
実線と破線とを比較した結果、以下の二点で本発明プローブの方が優れていると言える。
まず第一点は、本発明プローブの方が蛍光微分値が高いことである。上述したとおり、末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬで標識されたプローブは被検核酸と結合すると消光し、解離すると発光するという性質を示す。従って、蛍光微分値すなわち蛍光変化が大きいということは被検核酸への結合の有無を判別しやすいということを示している。以上から、本発明プローブと配列番号５で示される既存発明プローブとを比較したとき、本発明プローブの方が被検核酸の検出結果が明瞭に現れることを示唆している。
第二点は、本発明プローブの方がヘテロタイプを識別しやすいことである。図３のＨＨを示す実線と破線を比較すると、実線の方が二つのピークの高さがより均等に近い形状である。ヘテロタイプを検出する場合に二つのピークの高さ、すなわち蛍光微分値が離れていたり、あるいはピークの変曲点付近が緩やかであったりすると、特に機械による自動検出を行っている場合に、その波形がヘテロを示すものであると認識され難くなる。このような性質を示す核酸プローブを用いて検出を行うことは、多型の誤診断を誘発する可能性があるため、本発明のように融解曲線分析を利用して遺伝子多型の診断を行う場合は、用いられる核酸プローブはヘテロタイプであることを示す二つのピークの蛍光微分値がなるべく近くなる性質を持った核酸プローブであることが好ましい。以上の理由から、本発明プローブの方が既存発明プローブよりも誤診断の可能性が少ないことは明らかである。
以上二点の理由から、既存発明プローブよりも本発明プローブの方がＭＤＲ１の３４３５位多型検査に好ましい核酸プローブであると言える。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明を薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の多型検査および薬物代謝に関与する遺伝子ＭＤＲ１の多型検査試薬開発に適用することで、迅速、確実かつ簡便なＭＤＲ１多型検査を行うことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出するためのプローブであって、配列番号１で示される塩基配列を有するプローブ。
【請求項２】
検出可能な標識物質により標識化された、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
検出可能な標識物質が蛍光色素である、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
末端のシトシンが標識化された、請求項２または３に記載のプローブ。
【請求項５】
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と請求項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と請求項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、前記プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴う蛍光強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【請求項７】
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、請求項７または８に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
請求項５または６に記載のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法に用いるための遺伝子多型検出キットであって、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブを含む遺伝子多型検出キット。
【請求項１】
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出するためのプローブであって、配列番号１で示される塩基配列を有するプローブ。
【請求項２】
検出可能な標識物質により標識化された、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
検出可能な標識物質が蛍光色素である、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
末端のシトシンが標識化された、請求項２または３に記載のプローブ。
【請求項５】
ＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と請求項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、２６０ｎｍの吸光度測定または前記プローブに付加した標識のシグナル強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴うシグナル強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と請求項１〜４のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら、前記プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う工程。
（３）工程（２）における、温度変化に伴う蛍光強度の変動から、前記被検核酸における変異の有無を決定する工程
【請求項７】
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、請求項７または８に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
請求項５または６に記載のＭＤＲ１遺伝子の３４３５位の遺伝子多型を検出する方法に用いるための遺伝子多型検出キットであって、請求項１〜４のいずれかに記載のプローブを含む遺伝子多型検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−７４８２４（Ｐ２０１３−７４８２４Ａ）
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１５９６４（Ｐ２０１１−２１５９６４）
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月３０日（２０１１．９．３０）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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