ＭＤＳとｄｅｎｏｖｏＡＭＬの鑑別方法
【課題】骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または白血病化したＭＤＳと真正急性骨髄性白血病（de novo AML）との簡便な鑑別法を提供すること。
【解決手段】フローサイトメトリーにより、検体中のＣＤ４５弱陽性芽球について特定の細胞表面抗原の発現を分析することを特徴とする、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別方法。
【解決手段】フローサイトメトリーにより、検体中のＣＤ４５弱陽性芽球について特定の細胞表面抗原の発現を分析することを特徴とする、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄異形成症候群（Myelodysplastic syndromes:ＭＤＳ）または白血病化したＭＤＳと真正（de novo）の急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia；AML）との鑑別方法、及び前記方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo AML）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。
【０００３】
de novo AML及び白血病化ＭＤＳはいずれも、骨髄の造血幹細胞より前駆細胞にかけての未分化なクローン性腫瘍細胞の増殖が起こる白血病である。白血病細胞は正常な前駆細胞としての分化が止まっていたり、異常な分化を示したりする。これらは、腫瘍の増殖速度が速く、週日単位で臨床症状や検査結果等が変化する。そのため、臨床所見からは白血病化ＭＤＳかde novo AMLか判別がつかないが、白血病ＭＤＳとは異なりde novo AMLは薬剤に対する感受性が高く、速やかな治療が望まれている。
【０００４】
ＭＤＳは貧血等の症状をきっかけに発見（診断）される場合もあるが、症状に乏しい場合も多く、白血病化の後に初めて発見されることも多い。白血病化の後に初めて発見された場合、それがＭＤＳより移行した白血病化ＭＤＳなのか、そうでないde novo AMLなのかを鑑別することは困難であり、現状では患者の過去の医療記録等で原因不明の血球減少等があれば白血病化ＭＤＳであろうと推測しているに過ぎない（非特許文献１参照）。
【０００５】
最近の疫学調査の結果によれば、ＭＤＳの発症頻度は骨髄系腫瘍の中で最多である（非特許文献２参照）。しかしながら、多くの研究にもかかわらず、未だ有用な治療法は確立されておらず、白血病化ＭＤＳは治療に不応性のことが多い。一方de novo AMLでは治療に良く反応することが多い。したがって、白血病化ＭＤＳであるか、de novo AMLであるかを早期に鑑別することは、その患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。
【０００６】
ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別を行う方法として、ＭＤＳに特異的な遺伝子D1kの発現を検出することによる分子診断法（特許文献１参照）が開示されている。しかし、この方法は、遺伝子発現又は発現産物のレベルを指標とし、DNAマイクロアレイや二次元電気泳動を使用する複雑な方法であり、感度も低い。
【０００７】
近年、ヒト細胞表面抗原に対する多数のモノクローナル抗体の開発と、これらを用いたフローサイトメトリー（flow cytometry: FCM）により、造血器腫瘍細胞の検出、特に白血病の診断が可能となった。
【０００８】
ＦＣＭとは、個々に遊離した細胞を蛍光色素で染色した後に細い管を通過させる際、レーザー光線を当ててその細胞から発生する蛍光の強弱及び散乱光等の情報により、細胞の大きさ、相対的なタンパク量、抗原量、ＤＮＡ量等を測定する方法である。コンピュータを組合わせることにより、細胞の数と蛍光の強弱等の２つのパラメータによるヒストグラム、スキャッターグラム、３つのパラメータによる三次元表示等も行われる。浮遊細胞を測定するため、一度に多数の細胞の解析が可能である。
【０００９】
ＦＣＭで白血病細胞を分析する場合、白血病細胞が他の細胞とはっきり区別が出来る場合は問題が無いが、他の細胞のサイトグラムとオーバーラップして何処をゲーティングしてよいかわからない場合や、白血病細胞の数が減少している場合等は、白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原の発現が弱いという特徴を利用した、ＣＤ４５−ＳＳＣパラメータードットプロットを用いたゲート設定法（ＣＤ４５blast gating法）が普及してきている。ＣＤ４５blast gating法は、ＣＤ４５抗原が弱発現である分化レベルの未熟な急性白血病細胞と、ＣＤ４５抗原が強発現である正常成熟細胞とを明確に分離することができるため、精度の高い白血病細胞表面抗原解析を行うことができる（非特許文献３参照）が、このときＣＤ４５抗原に注目したのは、あくまでも白血病細胞を特定するために過ぎなかった。
【００１０】
さらに、ＣＤ４５以外の細胞表面抗原の発現パターンによって白血病細胞を検出する方法（特許文献２参照）も報告されている。
【００１１】
また発明者等は、ＭＤＳに特徴的なＣＤ４５陰性造血幹細胞（ＣＤ４５陰性芽球）の存在に注目し、骨髄異形成症候群の検出を行ってきていた（特許文献３、４参照）。しかし、確実な検出のためには、骨髄芽球を混入細胞と区別して検出しなければならず、さらに、ＣＤ４５陰性の骨髄芽球集団とＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団におけるＣＤ１３とＣＤ３３の発現量の比較を行う工程が必須であり、さまざまな抗体を用いて、且つ多数の手順を必要とし、臨床現場で実際使用できる方法ではなかった。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７４号公報
【特許文献２】特開２０００−２４１４２７号
【特許文献３】特開２００５−２２１３２３号
【特許文献４】特開２００６−４２６６５号
【非特許文献１】Smith MT, Linet MS, Morgan GJ. Causative agents in the etiology of myelodysplastic syndromes and the acute myeloid leukemias. In "The Myelodysplastic Syndromes: Pathobiology and Clinical Management" edited by Bennett JM.Publisher: Marcel Dekker, Inc., 2002 pp29-63
【非特許文献２】Aul C, Giagounidis A, Germing U. Epidemiological features ofmyelodysplastic syndromes: results from regional cancer serveys and hospital-based statistics. Int J Hematol. 2001; 73(4): 405-10
【非特許文献３】Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ＭＤＳとde novo AMLの簡便な鑑別法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、上述のＣＤ４５blast gating法におけるblast gate内の細胞集団の発現する細胞表面抗原を分析することにより、ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）とde novo AMLを鑑別できることを見出した。
【００１４】
ＣＤ４５blast gating法は、現在すでに白血病細胞の特定のために臨床の現場で使用されており、blast gate内の細胞集団はＣＤ４５弱陽性の芽球として抽出されるものである。今回、本発明者らは、このＣＤ４５弱陽性の芽球の発現する抗原に着目することにより、最多でも僅か３種類の抗体を用いてフローサイトメトリー（ＦＣＭ）による解析を行うだけでＭＤＳとde novo AMLを鑑別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）フローサイトメトリーにより、検体中のＣＤ４５弱陽性芽球について特定の細胞表面抗原の発現を分析することを特徴とする、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別方法。
（２）検体が、ＭＤＳまたはde novo AMLに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄液である、（１）に記載の方法。
（３）細胞表面抗原が、ＣＤ８０および／またはＣＤ４９ｄである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）ＣＤ８０が陽性であるか否かを判定する（３）に記載の方法。
（５）ＣＤ４９ｄが陰性であるか否かを判定する（３）に記載の方法。
（６）ＣＤ８０が陰性でありかつＣＤ４９ｄが陽性であるか否かを判定する（３）に記載の方法。
（７）以下の（ア）から（ウ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中の特定の細胞表面抗原の発現を分析する工程
（ウ）特定の細胞表面抗原の発現率によりＭＤＳとde novo AMLとを鑑別する工程。
（８）以下の（ア）から（エ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ８０の発現を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ４９ｄの発現を判定する工程
（エ）上記（イ）においてＣＤ８０陽性であるか、又は（ウ）においてＣＤ４９ｄ陰性であれば、de novo AMLではなくＭＤＳであると鑑別する工程。
（９）抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ８０抗体及び抗ＣＤ４９ｄ抗体を含む、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、白血病化ＭＤＳを含むＭＤＳとde novo AMLとの鑑別を速やかに行うことができる。白血病化MDSとde novo AMLとでは治療方針が異なるため、白血病の患者において両者の鑑別が速やかに行えれば、患者の予後推定、治療方針の決定等に非常に重要である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＭＤＳは、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）によって特徴づけられる症候群である。一方、de novo AMLは真正の急性骨髄性白血病である。ＭＤＳの病初期には芽球は少ないが、後に芽球が増加を始め白血病様となり、臨床所見では急性骨髄性白血病と区別がつかない状態へと移行する。本発明においては、この状態を白血病化ＭＤＳと称する。また、単にＭＤＳという場合、白血病化ＭＤＳを含むこともある。
【００１９】
本発明では、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＣＭ）により、試料中の芽球（ＭＤＳではＭＤＳ芽球、ＡＭＬでは白血病細胞）の細胞表面抗原を分析することにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。本発明によるMDSとde novo AMLの鑑別に用いられる試料として好適なものは、、ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかに罹患しているが、そのいずれに罹患しているのかは不明の状態である（ＭＤＳまたはde novo AMLに罹患していることが疑われる）患者から採取した検体であって芽球に富むもの、例えば、末梢血もしくは骨髄穿刺液等が挙げられる。
【００２０】
骨髄穿刺液、または末梢血の採取方法としては、患者への侵襲度の低い方法であればいかなる方法でも良い。例えば骨髄穿刺液の場合、局所麻酔の後、背中側の腸骨（骨盤骨）から骨盤穿刺針を用いて注射器で吸引する等、一般的な方法が用いられる。
【００２１】
検体採取時にはヘパリン等の抗凝固剤を加え、採取後速やかに用いることが好ましい。
【００２２】
しかし、末梢血はそのまま、骨髄穿刺液は１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊させ、４℃以下にて２４時間まで保存しておくことができる。また、４〜−８０℃、好ましくは−２０℃から−７０℃の低温条件下で２４時間以上保存しておくこともできる。保存に際しては、変性等を抑制するような保存剤や、腐敗を防止するための防腐剤等を必要に応じて添加しても良い。
【００２３】
採取した検体はそのまま用いることもできるが、検体中の芽球比率が低い場合には、適切な試薬を用いて芽球比率を高めてから、解析に用いることができる。芽球比率を高めるための適当な試薬としては、例えば、本願発明者らが開発した芽球精製法に基づき商品化されたBlastretriever（登録商標）試薬（日本抗体研究所、高崎）等が挙げられる。検体中の芽球比率はサイトスピン標本を顕微鏡下に観察する等の方法によって測定することができる。芽球比率が低いとは、検体中の芽球の比率が一定以下、例えば全血球に対して芽球が３０％以下であることをいう。芽球比率が一定以上ある検体について、定法により、混入赤血球の溶血作業をおこなう。
【００２４】
上記検体を用いて、ＦＣＭで、芽球の細胞表面抗原の発現を分析することにより、MDSとde novo AMLの鑑別を行う。具体的には、調製した検体を適当な蛍光標識を付けた抗ＣＤ４５抗体及び他の１種又は２種のヒト造血系細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体で染色後、ＦＣＭで解析を行う。
【００２５】
ＦＣＭの操作方法は公知の方法（例えば、野村和弘ら編「フローサイトメトリー〜手技と実際〜」1984年，蟹書房、河本圭司ら編「フローサイトメトリー入門」1989年，医学書院、河本圭司ら編「応用サイトメトリー」2000年，医学書院）に準じて行うことができる。また、ＦＣＭで用いる蛍光標識には、ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin）、ＡＰＣ(Allophycocyanin)、ＰｅｒＣＰ（peridin chlorophyll）、ＥＣＤ（phycoerythrin-Texas Red）、ＰＣ５（phycoerythrin-cyanin5.1）、ＰＣ７（phycoerythrin-cyanin7）等一般的に市販されている蛍光標識を用いることが出来、これらの組み合わせは自由に行うことができる。また、本発明に使用するモノクローナル抗体の詳しい作製方法については公知の方法（例えば、富山朔二ら編「単クローン抗体実験マニュアル」1987年，講談社、右田俊介ら翻訳「免疫化学実験法」1992年，西村書店）に準じて行うか、あるいは市販のものを用いることもできる。
【００２６】
ＦＣＭ解析の具体的な手順としては、まず、白血病細胞をＣＤ４５blast gating法におけるblast gate内の細胞集団（芽球）として抽出する。blast gate内の細胞集団は、ＣＤ４５弱陽性、すなわち白血病共通抗原であるＣＤ４５抗原の発現量が少なく、且つＳＳＣ（side scatter：側方散乱）が比較的低い細胞（芽球）の集団として同定される。本発明においては、blast gate内の細胞集団をＣＤ４５弱陽性芽球と称する。ＣＤ４５blast gating法は、前述の通り、現在すでに白血病細胞の特定のために臨床の現場で繁用されているため、当業者であれば、適宜実施することができる（非特許文献３：Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 1993）。
【００２７】
de novo AML患者から採取した検体におけるＣＤ４５弱陽性芽球のゲーティング例を図１に、ＭＤＳ患者から採取した検体におけるＣＤ４５弱陽性芽球のゲーティング例を図３に示す。まず側方散乱（side scatter:ＳＳＣ）と前方散乱（forward scatter:ＦＳＣ）で展開したドットプロット（サイトグラム）において、血小板や破砕細胞等を除外した所謂生細胞にゲートをかける。これは、解析対象の細胞を囲む最初の操作（ゲーティング）である。この細胞集団が図１左及び図３左のドットプロットにおいてＲ１と表示されたクラスターである。次に、Ｒ１に含まれる細胞を、ＰｅｒＣＰ標識ＣＤ４５抗体（ＣＤ４５-ＰｅｒＣＰ）とＳＳＣで展開した際に検出される、ＳＳＣが比較的低くかつＣＤ４５弱陽性（ＣＤ４５±）の細胞集団がＣＤ４５弱陽性芽球であり、図１右及び図３右のドットプロットにおいてＲ２と表示されたクラスター（blast gate）に該当する。ＦＣＭで得た情報からＲ１およびＲ２を満たす情報をコンピューター上で抽出し解析することにより、ＣＤ４５弱陽性の骨髄芽球集団（ＣＤ４５弱陽性芽球）を抽出できる。
【００２８】
次に、ＣＤ４５弱陽性芽球について、1種又は２種の特定のヒト造血系細胞表面抗原の発現を分析する。細胞表面抗原としては、ＣＤ８０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１及びＢ７−Ｈ２から選択される１種または２種の抗原の発現を分析する。好ましくはＣＤ８０とＣＤ４９ｄのいずれか一方又は両方について分析し、陰性又は陽性の判定を行う。
【００２９】
細胞表面抗原の発現は、ＣＤ４５弱陽性芽球の集団をＦＣＭに流し、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数を取ってヒストグラム解析を行うことにより分析する。発現が陰性のピークが左側に、陽性のピークがより右側に出現する。ＦＩＴＣ−conjugated IgGをコントロール（特定の細胞表面抗原に対する陰性コントロール抗体）とし、これと比較して検体のヒストグラム曲線が右側に位置していれば、陽性芽球が存在するということである。例えば、図２右のヒストグラムはde novo AMLの一症例をＣＤ４９ｄで解析した図であり、Ｍ１と記載している部分が陽性部分である。このように、ある細胞表面抗原についてのヒストグラムにおいて陽性芽球が認められる場合、当該抗原の発現が高度である、すなわち、陽性と判定することができる。陽性芽球の存在が認められない場合、または当該抗原の発現が低値である場合、陰性と判定することができる。
【００３０】
あるいは、ヒストグラム解析の結果は、特定の抗原の発現率として、より定量的に表現してもよい。まず、
コントロールで少なくとも９５％以上、より好ましくは９７%以上の細胞がおさまる蛍光強度を陰性とし、基準線を設定する。この基準線より右側に位置する細胞の細胞数の比率を陽性率と定義して、数値（％）で表すことができる。陽性および陰性の％は施設や使用抗体等の実験条件により多少の変動が予想されるが、一般的なフローサイトメトリーを行う際の判定基準に従って行うことができる。
【００３１】
細胞表面抗原として、ＣＤ８０及びＣＤ４９ｄについて分析する場合、MDSとde novo AMLの鑑別は次の表１に示された基準に従う。
【００３２】
【表１】
【００３３】
すなわち、ＣＤ８０が陽性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ（白血病化ＭＤＳ）又はＭＤＳである。あるいは、ＣＤ４９ｄが陰性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ又はＭＤＳである。このように、ＣＤ４５弱陽性芽球集団について1種類の細胞表面抗原の発現を分析するだけで鑑別可能である。ＣＤ８０が陰性である場合またはＣＤ４０ｄが陽性である場合は、ＣＤ８０とＣＤ４９ｄの両方について判定することにより、確実に鑑別することができる。例えば、ＣＤ８０が陰性であってもＣＤ４９ｄが陰性であればＭＤＳ／ＡＬ又はＭＤＳである。しかし、ＣＤ８０陰性かつＣＤ４９ｄ陽性の場合は判定不能である。以上より、de novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別を行うことができる。
【００３４】
ＣＤ８０陽性の定義として、BD PharMingen社(San Diego, CA, USA)の抗体を用いた本発明者らの検討ではＣＤ８０陽性率が５％以上の場合ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）と判定した。すなわち、ＣＤ８０陽性率が５％以上の場合、上記の表でＣＤ８０陽性（＋）となる。この％は使用抗体や使用機器などの実験条件で若干の変動が予想され、各実験施設において定義を行うことが出来る。
【００３５】
また、ＣＤ４９ｄ陰性の定義として、BD PharMingen社の抗体を用いた本発明者らの検討ではＣＤ４９ｄ陽性率が３５％以下の場合ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）と判定できた。すなわち、ＣＤ４９ｄ陽性率が３５％以下の場合、上記の表でＣＤ４９ｄ陰性となる。もしくは、ＣＤ４９ｄの発現率が、de novo AMLの検体に比べて低下している場合は、ＣＤ４９ｄ陰性と判断することも可能である。この％は使用抗体や使用機器などの実験条件で若干の変動が予想され、各実験施設において定義を行うことが出来る。
【００３６】
本発明はさらに、蛍光標識された特定の抗体を含む、ＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キットを提供する。抗体としては、上述のように、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１及びＢ７−Ｈ２等のヒト造血系細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いることができる。
【００３７】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
１．検体の採取
検体としては、ヒトの骨髄液または末梢血を用いた。これらの検体は、ＭＤＳまたはde novo AMLが疑われる患者に採取及び研究目的の使用について充分に説明を行い、同意を得られたあとに用いた。検体採取の際には抗凝固剤としてヘパリンを添加した。
２．検体の調製
末梢血はそのまま使用し、骨髄液（骨髄穿刺液）は10%FCS添加RPMI-1640で２〜３倍に希釈した。このとき、検体中の芽球比率が低い場合は、骨髄単核球を分離するFicoll-Hypaque 試薬 （Sigma）を用いるか、あるいは、Blastretriever（前述、登録商標）試薬を用いて芽球比率を高めた。
【００３９】
Blastretriever（登録商標）試薬を用いて芽球比率を高める方法は、試薬の使用説明書に準じて行う。すなわち、ガラス試験管にBlastretriever（登録商標）試薬を入れ、ヘパリン加末梢血あるいは３〜５倍に希釈したヘパリン加骨髄穿刺液を重層し、これを１０分間（550ｘｇ、室温）遠心分離し、中間層に残った細胞を回収した。
３．染色及び測定
検体を溶血剤（NH4Cl 8.26g、KHCO3 1.00g、EDTA?4NA／LWD 0.04g）を用いて室温にて5分間インキュベーションを行い、混入赤血球の溶血操作を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS：0.1％BSA、0.1％アジ化ナトリウム）にて細胞濃度を１×１０6／ｍｌに調製した。調製した検体を１００μｌずつＦＣＭ用チューブに分注し、以下の蛍光標識抗体で染色後、十分細胞を洗浄し余分な抗体を除去したのち、ＦＣＭでデータを収集した。
【００４０】
この実験例では、peridin chlorophyll （PerCP）で標識した抗ＣＤ４５抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）、fluorescein isothiocyanate（ＦＩＴＣ）標識ＣＤ８０抗体、あるいは、ＣＤ４９ｄ抗体で染色した。
【００４１】
ＦＣＭによる測定は、FACScan（Becton Dickinson）を用いて定法に従って解析した。本実験例では、PerCP/FITCについて２カラー分析を行った。（あるいは、標識としてさらに例えばPEを使用して３カラーで解析すれば一度に解析可能である。）
４．フローサイトメトリーによるＣＤ４５弱陽性芽球のＣＤ８０陽性あるいはＣＤ４９ｄ発現低下によるde novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別
次に、収集したＦＣＭデータをＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ４５弱陽性でＳＣＣは比較的低いところにクラスターをつくる細胞集団である骨髄芽球の細胞集団（ＣＤ４５弱陽性芽球）を確認し（ＣＤ４５ blast gate法）、その細胞集団のＣＤ８０、ＣＤ４９ｄの測定を行った。ヒストグラムで解析し、FITC-conjugated IgGをコントロールとし（図２、４：ヒストグラム細線）、それぞれの抗体で染色したもの（図２、４：ヒストグラム太線）と比較し陽性部分（Ｍ１）の陽性率を解析する。
【００４２】
ＣＤ８０が陽性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ（白血病化ＭＤＳ）又はＭＤＳである。また、ＣＤ８０が陰性であっても、ＣＤ４９ｄが陰性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ又はＭＤＳである。以上より、de novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別を行うことができる。
５．フローサイトメトリーにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別した結果
実際の症例において解析した例を図１〜図４に示す。
【００４３】
図１及び図２はde novo AMLの1症例のＦＣＭパターンである。
【００４４】
図１は、Ｒ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、ＣＤ４５陽性ＳＣＣ低値の部分（CD45 blast gating法によるＣＤ４５弱陽性：Ｒ２）に細胞集団（芽球）を認め、これらにつき解析を行ったものが図２である。図２左はblast gateをＣＤ８０でヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。Ｍ１は陽性部分を示すが、この症例ではＭ１部分に細胞がないのでＣＤ８０陰性であった。図２右はblast gateをＣＤ４９ｄでヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。この症例ではＭ１部分にＣＤ４９ｄ陽性細胞が多数認められる。つまり、de novo AMLにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析では、ＣＤ８０陽性細胞は認めず（陰性）、ＣＤ４９ｄ発現は高度（陽性）であった。
【００４５】
図３及び図４はＭＤＳの１症例のＦＣＭパターンである。
【００４６】
図３が、図１と同様にＲ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、ＣＤ４５陽性ＳＣＣ低値の部分（Ｒ２）にＣＤ４５弱陽性芽球集団を認め、これらにつき解析を行った。図４左はblast gateをＣＤ８０でヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。この症例ではＭ１部分にＣＤ８０陽性細胞が多数認められ、ＣＤ８０陽性であった。図４右はblast gateをＣＤ４９ｄでヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。この症例ではＭ１部分にＣＤ４９d陽性細胞はあるが、その陽性率はかなり低く、陰性であった。つまり、ＭＤＳにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析では、de novo AMLとは異なり、ＣＤ８０陽性細胞を認め、ＣＤ４９ｄ発現は低値（陰性）であった。
【００４７】
表２は従来の確定診断方法でde novo AML、ＭＤＳ／ＡＬ、ＭＤＳと診断されているサンプルを用いて、同様にＦＣＭパターンを展開し、ＣＤ４５弱陽性芽球のCD80、CD49dの抗原解析を行った結果である。CD80陽性あるいはCD49d陰性のどちらを満たせばMDS/AL型である。
【００４８】
【表２】
【００４９】
簡単に表の解説を行う。
【００５０】
従来の方法でde novo AML、ＭＤＳ/ＡＬ、ＭＤＳと診断された症例について、それぞれＣＤ８０抗原解析を行った総症例のうち、ＭＤＳ/ＡＬ型症例と判断された数を「ＣＤ８０解析例」に示した（ＭＤＳ/ＡＬ型症例数／解析症例数）。
【００５１】
同様にＣＤ４９ｄ抗原解析を行った総症例数のうち、ＭＤＳ/ＡＬ型症例と判断された数を「ＣＤ４９ｄ」解析例に示した。
【００５２】
また、「本発明での診断」と記載した部分には、本発明の方法であるＣＤ８０またはＣＤ４９ｄいずれか、もしくは両方で診断した数を記載しており、ＣＤ８０とＣＤ４９ｄ解析例の合計を記載しているものではない。
【００５３】
結果
1. 従来方法でde novo AMLと診断された症例
ＣＤ８０を測定した３７例中、ＣＤ８０陽性細胞が認められたものはなかったため、ＭＤＳ／ＡＬ型は１例もないと判断した。
【００５４】
ＣＤ４９ｄを測定した１４例中、全てＣＤ４９ｄの発現が高度であったため、ＭＤＳ／ＡＬ型は１例もないと判断した。
【００５５】
de novo AML３７症例中、ＣＤ８０あるいはＣＤ４９ｄのどちらかの測定でＭＤＳ／ＡＬ型ではないと３７症例（１００％）判断できた。
【００５６】
２. 従来方法でＭＤＳ／ＡＬと診断された症例
ＣＤ８０を測定した１９例中、ＣＤ８０陽性の７例について、ＣＤ８０測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００５７】
ＣＤ４９ｄを測定した１５例中、ＣＤ４９ｄの発現が低値（陰性）の４例について、ＣＤ４９ｄ測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００５８】
ＭＤＳ／ＡＬ ２７症例中、ＣＤ８０あるいはＣＤ４９ｄのどちらかで診断できたＭＤＳ／ＡＬ型は１１症例（４０．７％）であった。
【００５９】
３. 従来方法でＭＤＳと診断された症例
ＣＤ８０を測定した１４例中、ＣＤ８０陽性細胞を認めた６例について、ＣＤ８０測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００６０】
ＣＤ４９ｄを測定した１６例中、ＣＤ４９ｄの発現が低値（陰性）であった４例について、ＣＤ４９ｄ測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００６１】
ＭＤＳ１７症例中、ＣＤ８０あるいはＣＤ４９ｄのどちらかで診断できたＭＤＳ／ＡＬ型は９症例（５２．９％）であった。
【００６２】
ＣＤ８０とＣＤ４９ｄの両者を測定した１３例中、８例（６１．５％）でＭＤＳ／ＡＬ型であった。
【００６３】
以上の結果から、本法でde novo AMLを誤ってＭＤＳ／ＡＬと診断する確率は０％であり、ＭＤＳ／ＡＬの約４０％以上で正確に診断できた。また、ＭＤＳに関しても約６０％以上で正確に診断できた。この確率は、臨床検査として十分用い得る数値である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、白血病の患者において簡便にＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。白血病化ＭＤＳは治療に不応性であるが、de novo AMLでは治療に良く反応するため、この両者を鑑別することは患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。本発明の鑑別方法を用いることにより、診断の初期に白血病化ＭＤＳとde novo AMLを鑑別し、適切な治療戦略の構築が可能となる。また、本発明の鑑別方法をその他の診断方法と組み合わせて用いると鑑別をさらに確実なものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】de novo AMLの一症例のサイトグラム：左はＦＳＣとＳＳＣで展開したサイトグラム（ドットプロット）であり、右の図はＲ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開したものである。
【図２】図１で抽出されたＣＤ４５弱陽性の芽球の集団（Ｒ２、blast gate）についての抗原ヒストグラム解析：左はＣＤ８０で解析した図であり、右はＣＤ４９ｄで解析した図である。
【図３】ＭＤＳの一症例のサイトグラム：左はＦＳＣとＳＳＣで展開したサイトグラム（ドットプロット）であり、右の図はＲ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開したものである。
【図４】図３で抽出されたＣＤ４５弱陽性の芽球の集団（Ｒ２、blast gate）についての抗原ヒストグラム解析：左はＣＤ８０で解析した図であり、右はＣＤ４９ｄで解析した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄異形成症候群（Myelodysplastic syndromes:ＭＤＳ）または白血病化したＭＤＳと真正（de novo）の急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia；AML）との鑑別方法、及び前記方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo AML）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。
【０００３】
de novo AML及び白血病化ＭＤＳはいずれも、骨髄の造血幹細胞より前駆細胞にかけての未分化なクローン性腫瘍細胞の増殖が起こる白血病である。白血病細胞は正常な前駆細胞としての分化が止まっていたり、異常な分化を示したりする。これらは、腫瘍の増殖速度が速く、週日単位で臨床症状や検査結果等が変化する。そのため、臨床所見からは白血病化ＭＤＳかde novo AMLか判別がつかないが、白血病ＭＤＳとは異なりde novo AMLは薬剤に対する感受性が高く、速やかな治療が望まれている。
【０００４】
ＭＤＳは貧血等の症状をきっかけに発見（診断）される場合もあるが、症状に乏しい場合も多く、白血病化の後に初めて発見されることも多い。白血病化の後に初めて発見された場合、それがＭＤＳより移行した白血病化ＭＤＳなのか、そうでないde novo AMLなのかを鑑別することは困難であり、現状では患者の過去の医療記録等で原因不明の血球減少等があれば白血病化ＭＤＳであろうと推測しているに過ぎない（非特許文献１参照）。
【０００５】
最近の疫学調査の結果によれば、ＭＤＳの発症頻度は骨髄系腫瘍の中で最多である（非特許文献２参照）。しかしながら、多くの研究にもかかわらず、未だ有用な治療法は確立されておらず、白血病化ＭＤＳは治療に不応性のことが多い。一方de novo AMLでは治療に良く反応することが多い。したがって、白血病化ＭＤＳであるか、de novo AMLであるかを早期に鑑別することは、その患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。
【０００６】
ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別を行う方法として、ＭＤＳに特異的な遺伝子D1kの発現を検出することによる分子診断法（特許文献１参照）が開示されている。しかし、この方法は、遺伝子発現又は発現産物のレベルを指標とし、DNAマイクロアレイや二次元電気泳動を使用する複雑な方法であり、感度も低い。
【０００７】
近年、ヒト細胞表面抗原に対する多数のモノクローナル抗体の開発と、これらを用いたフローサイトメトリー（flow cytometry: FCM）により、造血器腫瘍細胞の検出、特に白血病の診断が可能となった。
【０００８】
ＦＣＭとは、個々に遊離した細胞を蛍光色素で染色した後に細い管を通過させる際、レーザー光線を当ててその細胞から発生する蛍光の強弱及び散乱光等の情報により、細胞の大きさ、相対的なタンパク量、抗原量、ＤＮＡ量等を測定する方法である。コンピュータを組合わせることにより、細胞の数と蛍光の強弱等の２つのパラメータによるヒストグラム、スキャッターグラム、３つのパラメータによる三次元表示等も行われる。浮遊細胞を測定するため、一度に多数の細胞の解析が可能である。
【０００９】
ＦＣＭで白血病細胞を分析する場合、白血病細胞が他の細胞とはっきり区別が出来る場合は問題が無いが、他の細胞のサイトグラムとオーバーラップして何処をゲーティングしてよいかわからない場合や、白血病細胞の数が減少している場合等は、白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原の発現が弱いという特徴を利用した、ＣＤ４５−ＳＳＣパラメータードットプロットを用いたゲート設定法（ＣＤ４５blast gating法）が普及してきている。ＣＤ４５blast gating法は、ＣＤ４５抗原が弱発現である分化レベルの未熟な急性白血病細胞と、ＣＤ４５抗原が強発現である正常成熟細胞とを明確に分離することができるため、精度の高い白血病細胞表面抗原解析を行うことができる（非特許文献３参照）が、このときＣＤ４５抗原に注目したのは、あくまでも白血病細胞を特定するために過ぎなかった。
【００１０】
さらに、ＣＤ４５以外の細胞表面抗原の発現パターンによって白血病細胞を検出する方法（特許文献２参照）も報告されている。
【００１１】
また発明者等は、ＭＤＳに特徴的なＣＤ４５陰性造血幹細胞（ＣＤ４５陰性芽球）の存在に注目し、骨髄異形成症候群の検出を行ってきていた（特許文献３、４参照）。しかし、確実な検出のためには、骨髄芽球を混入細胞と区別して検出しなければならず、さらに、ＣＤ４５陰性の骨髄芽球集団とＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団におけるＣＤ１３とＣＤ３３の発現量の比較を行う工程が必須であり、さまざまな抗体を用いて、且つ多数の手順を必要とし、臨床現場で実際使用できる方法ではなかった。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７４号公報
【特許文献２】特開２０００−２４１４２７号
【特許文献３】特開２００５−２２１３２３号
【特許文献４】特開２００６−４２６６５号
【非特許文献１】Smith MT, Linet MS, Morgan GJ. Causative agents in the etiology of myelodysplastic syndromes and the acute myeloid leukemias. In "The Myelodysplastic Syndromes: Pathobiology and Clinical Management" edited by Bennett JM.Publisher: Marcel Dekker, Inc., 2002 pp29-63
【非特許文献２】Aul C, Giagounidis A, Germing U. Epidemiological features ofmyelodysplastic syndromes: results from regional cancer serveys and hospital-based statistics. Int J Hematol. 2001; 73(4): 405-10
【非特許文献３】Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ＭＤＳとde novo AMLの簡便な鑑別法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、上述のＣＤ４５blast gating法におけるblast gate内の細胞集団の発現する細胞表面抗原を分析することにより、ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）とde novo AMLを鑑別できることを見出した。
【００１４】
ＣＤ４５blast gating法は、現在すでに白血病細胞の特定のために臨床の現場で使用されており、blast gate内の細胞集団はＣＤ４５弱陽性の芽球として抽出されるものである。今回、本発明者らは、このＣＤ４５弱陽性の芽球の発現する抗原に着目することにより、最多でも僅か３種類の抗体を用いてフローサイトメトリー（ＦＣＭ）による解析を行うだけでＭＤＳとde novo AMLを鑑別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）フローサイトメトリーにより、検体中のＣＤ４５弱陽性芽球について特定の細胞表面抗原の発現を分析することを特徴とする、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別方法。
（２）検体が、ＭＤＳまたはde novo AMLに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄液である、（１）に記載の方法。
（３）細胞表面抗原が、ＣＤ８０および／またはＣＤ４９ｄである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）ＣＤ８０が陽性であるか否かを判定する（３）に記載の方法。
（５）ＣＤ４９ｄが陰性であるか否かを判定する（３）に記載の方法。
（６）ＣＤ８０が陰性でありかつＣＤ４９ｄが陽性であるか否かを判定する（３）に記載の方法。
（７）以下の（ア）から（ウ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中の特定の細胞表面抗原の発現を分析する工程
（ウ）特定の細胞表面抗原の発現率によりＭＤＳとde novo AMLとを鑑別する工程。
（８）以下の（ア）から（エ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ８０の発現を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ４９ｄの発現を判定する工程
（エ）上記（イ）においてＣＤ８０陽性であるか、又は（ウ）においてＣＤ４９ｄ陰性であれば、de novo AMLではなくＭＤＳであると鑑別する工程。
（９）抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ８０抗体及び抗ＣＤ４９ｄ抗体を含む、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、白血病化ＭＤＳを含むＭＤＳとde novo AMLとの鑑別を速やかに行うことができる。白血病化MDSとde novo AMLとでは治療方針が異なるため、白血病の患者において両者の鑑別が速やかに行えれば、患者の予後推定、治療方針の決定等に非常に重要である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＭＤＳは、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）によって特徴づけられる症候群である。一方、de novo AMLは真正の急性骨髄性白血病である。ＭＤＳの病初期には芽球は少ないが、後に芽球が増加を始め白血病様となり、臨床所見では急性骨髄性白血病と区別がつかない状態へと移行する。本発明においては、この状態を白血病化ＭＤＳと称する。また、単にＭＤＳという場合、白血病化ＭＤＳを含むこともある。
【００１９】
本発明では、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー（ＦＣＭ）により、試料中の芽球（ＭＤＳではＭＤＳ芽球、ＡＭＬでは白血病細胞）の細胞表面抗原を分析することにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。本発明によるMDSとde novo AMLの鑑別に用いられる試料として好適なものは、、ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかに罹患しているが、そのいずれに罹患しているのかは不明の状態である（ＭＤＳまたはde novo AMLに罹患していることが疑われる）患者から採取した検体であって芽球に富むもの、例えば、末梢血もしくは骨髄穿刺液等が挙げられる。
【００２０】
骨髄穿刺液、または末梢血の採取方法としては、患者への侵襲度の低い方法であればいかなる方法でも良い。例えば骨髄穿刺液の場合、局所麻酔の後、背中側の腸骨（骨盤骨）から骨盤穿刺針を用いて注射器で吸引する等、一般的な方法が用いられる。
【００２１】
検体採取時にはヘパリン等の抗凝固剤を加え、採取後速やかに用いることが好ましい。
【００２２】
しかし、末梢血はそのまま、骨髄穿刺液は１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊させ、４℃以下にて２４時間まで保存しておくことができる。また、４〜−８０℃、好ましくは−２０℃から−７０℃の低温条件下で２４時間以上保存しておくこともできる。保存に際しては、変性等を抑制するような保存剤や、腐敗を防止するための防腐剤等を必要に応じて添加しても良い。
【００２３】
採取した検体はそのまま用いることもできるが、検体中の芽球比率が低い場合には、適切な試薬を用いて芽球比率を高めてから、解析に用いることができる。芽球比率を高めるための適当な試薬としては、例えば、本願発明者らが開発した芽球精製法に基づき商品化されたBlastretriever（登録商標）試薬（日本抗体研究所、高崎）等が挙げられる。検体中の芽球比率はサイトスピン標本を顕微鏡下に観察する等の方法によって測定することができる。芽球比率が低いとは、検体中の芽球の比率が一定以下、例えば全血球に対して芽球が３０％以下であることをいう。芽球比率が一定以上ある検体について、定法により、混入赤血球の溶血作業をおこなう。
【００２４】
上記検体を用いて、ＦＣＭで、芽球の細胞表面抗原の発現を分析することにより、MDSとde novo AMLの鑑別を行う。具体的には、調製した検体を適当な蛍光標識を付けた抗ＣＤ４５抗体及び他の１種又は２種のヒト造血系細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体で染色後、ＦＣＭで解析を行う。
【００２５】
ＦＣＭの操作方法は公知の方法（例えば、野村和弘ら編「フローサイトメトリー〜手技と実際〜」1984年，蟹書房、河本圭司ら編「フローサイトメトリー入門」1989年，医学書院、河本圭司ら編「応用サイトメトリー」2000年，医学書院）に準じて行うことができる。また、ＦＣＭで用いる蛍光標識には、ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin）、ＡＰＣ(Allophycocyanin)、ＰｅｒＣＰ（peridin chlorophyll）、ＥＣＤ（phycoerythrin-Texas Red）、ＰＣ５（phycoerythrin-cyanin5.1）、ＰＣ７（phycoerythrin-cyanin7）等一般的に市販されている蛍光標識を用いることが出来、これらの組み合わせは自由に行うことができる。また、本発明に使用するモノクローナル抗体の詳しい作製方法については公知の方法（例えば、富山朔二ら編「単クローン抗体実験マニュアル」1987年，講談社、右田俊介ら翻訳「免疫化学実験法」1992年，西村書店）に準じて行うか、あるいは市販のものを用いることもできる。
【００２６】
ＦＣＭ解析の具体的な手順としては、まず、白血病細胞をＣＤ４５blast gating法におけるblast gate内の細胞集団（芽球）として抽出する。blast gate内の細胞集団は、ＣＤ４５弱陽性、すなわち白血病共通抗原であるＣＤ４５抗原の発現量が少なく、且つＳＳＣ（side scatter：側方散乱）が比較的低い細胞（芽球）の集団として同定される。本発明においては、blast gate内の細胞集団をＣＤ４５弱陽性芽球と称する。ＣＤ４５blast gating法は、前述の通り、現在すでに白血病細胞の特定のために臨床の現場で繁用されているため、当業者であれば、適宜実施することができる（非特許文献３：Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 1993）。
【００２７】
de novo AML患者から採取した検体におけるＣＤ４５弱陽性芽球のゲーティング例を図１に、ＭＤＳ患者から採取した検体におけるＣＤ４５弱陽性芽球のゲーティング例を図３に示す。まず側方散乱（side scatter:ＳＳＣ）と前方散乱（forward scatter:ＦＳＣ）で展開したドットプロット（サイトグラム）において、血小板や破砕細胞等を除外した所謂生細胞にゲートをかける。これは、解析対象の細胞を囲む最初の操作（ゲーティング）である。この細胞集団が図１左及び図３左のドットプロットにおいてＲ１と表示されたクラスターである。次に、Ｒ１に含まれる細胞を、ＰｅｒＣＰ標識ＣＤ４５抗体（ＣＤ４５-ＰｅｒＣＰ）とＳＳＣで展開した際に検出される、ＳＳＣが比較的低くかつＣＤ４５弱陽性（ＣＤ４５±）の細胞集団がＣＤ４５弱陽性芽球であり、図１右及び図３右のドットプロットにおいてＲ２と表示されたクラスター（blast gate）に該当する。ＦＣＭで得た情報からＲ１およびＲ２を満たす情報をコンピューター上で抽出し解析することにより、ＣＤ４５弱陽性の骨髄芽球集団（ＣＤ４５弱陽性芽球）を抽出できる。
【００２８】
次に、ＣＤ４５弱陽性芽球について、1種又は２種の特定のヒト造血系細胞表面抗原の発現を分析する。細胞表面抗原としては、ＣＤ８０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１及びＢ７−Ｈ２から選択される１種または２種の抗原の発現を分析する。好ましくはＣＤ８０とＣＤ４９ｄのいずれか一方又は両方について分析し、陰性又は陽性の判定を行う。
【００２９】
細胞表面抗原の発現は、ＣＤ４５弱陽性芽球の集団をＦＣＭに流し、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数を取ってヒストグラム解析を行うことにより分析する。発現が陰性のピークが左側に、陽性のピークがより右側に出現する。ＦＩＴＣ−conjugated IgGをコントロール（特定の細胞表面抗原に対する陰性コントロール抗体）とし、これと比較して検体のヒストグラム曲線が右側に位置していれば、陽性芽球が存在するということである。例えば、図２右のヒストグラムはde novo AMLの一症例をＣＤ４９ｄで解析した図であり、Ｍ１と記載している部分が陽性部分である。このように、ある細胞表面抗原についてのヒストグラムにおいて陽性芽球が認められる場合、当該抗原の発現が高度である、すなわち、陽性と判定することができる。陽性芽球の存在が認められない場合、または当該抗原の発現が低値である場合、陰性と判定することができる。
【００３０】
あるいは、ヒストグラム解析の結果は、特定の抗原の発現率として、より定量的に表現してもよい。まず、
コントロールで少なくとも９５％以上、より好ましくは９７%以上の細胞がおさまる蛍光強度を陰性とし、基準線を設定する。この基準線より右側に位置する細胞の細胞数の比率を陽性率と定義して、数値（％）で表すことができる。陽性および陰性の％は施設や使用抗体等の実験条件により多少の変動が予想されるが、一般的なフローサイトメトリーを行う際の判定基準に従って行うことができる。
【００３１】
細胞表面抗原として、ＣＤ８０及びＣＤ４９ｄについて分析する場合、MDSとde novo AMLの鑑別は次の表１に示された基準に従う。
【００３２】
【表１】
【００３３】
すなわち、ＣＤ８０が陽性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ（白血病化ＭＤＳ）又はＭＤＳである。あるいは、ＣＤ４９ｄが陰性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ又はＭＤＳである。このように、ＣＤ４５弱陽性芽球集団について1種類の細胞表面抗原の発現を分析するだけで鑑別可能である。ＣＤ８０が陰性である場合またはＣＤ４０ｄが陽性である場合は、ＣＤ８０とＣＤ４９ｄの両方について判定することにより、確実に鑑別することができる。例えば、ＣＤ８０が陰性であってもＣＤ４９ｄが陰性であればＭＤＳ／ＡＬ又はＭＤＳである。しかし、ＣＤ８０陰性かつＣＤ４９ｄ陽性の場合は判定不能である。以上より、de novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別を行うことができる。
【００３４】
ＣＤ８０陽性の定義として、BD PharMingen社(San Diego, CA, USA)の抗体を用いた本発明者らの検討ではＣＤ８０陽性率が５％以上の場合ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）と判定した。すなわち、ＣＤ８０陽性率が５％以上の場合、上記の表でＣＤ８０陽性（＋）となる。この％は使用抗体や使用機器などの実験条件で若干の変動が予想され、各実験施設において定義を行うことが出来る。
【００３５】
また、ＣＤ４９ｄ陰性の定義として、BD PharMingen社の抗体を用いた本発明者らの検討ではＣＤ４９ｄ陽性率が３５％以下の場合ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）と判定できた。すなわち、ＣＤ４９ｄ陽性率が３５％以下の場合、上記の表でＣＤ４９ｄ陰性となる。もしくは、ＣＤ４９ｄの発現率が、de novo AMLの検体に比べて低下している場合は、ＣＤ４９ｄ陰性と判断することも可能である。この％は使用抗体や使用機器などの実験条件で若干の変動が予想され、各実験施設において定義を行うことが出来る。
【００３６】
本発明はさらに、蛍光標識された特定の抗体を含む、ＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キットを提供する。抗体としては、上述のように、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１及びＢ７−Ｈ２等のヒト造血系細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いることができる。
【００３７】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
１．検体の採取
検体としては、ヒトの骨髄液または末梢血を用いた。これらの検体は、ＭＤＳまたはde novo AMLが疑われる患者に採取及び研究目的の使用について充分に説明を行い、同意を得られたあとに用いた。検体採取の際には抗凝固剤としてヘパリンを添加した。
２．検体の調製
末梢血はそのまま使用し、骨髄液（骨髄穿刺液）は10%FCS添加RPMI-1640で２〜３倍に希釈した。このとき、検体中の芽球比率が低い場合は、骨髄単核球を分離するFicoll-Hypaque 試薬 （Sigma）を用いるか、あるいは、Blastretriever（前述、登録商標）試薬を用いて芽球比率を高めた。
【００３９】
Blastretriever（登録商標）試薬を用いて芽球比率を高める方法は、試薬の使用説明書に準じて行う。すなわち、ガラス試験管にBlastretriever（登録商標）試薬を入れ、ヘパリン加末梢血あるいは３〜５倍に希釈したヘパリン加骨髄穿刺液を重層し、これを１０分間（550ｘｇ、室温）遠心分離し、中間層に残った細胞を回収した。
３．染色及び測定
検体を溶血剤（NH4Cl 8.26g、KHCO3 1.00g、EDTA?4NA／LWD 0.04g）を用いて室温にて5分間インキュベーションを行い、混入赤血球の溶血操作を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS：0.1％BSA、0.1％アジ化ナトリウム）にて細胞濃度を１×１０6／ｍｌに調製した。調製した検体を１００μｌずつＦＣＭ用チューブに分注し、以下の蛍光標識抗体で染色後、十分細胞を洗浄し余分な抗体を除去したのち、ＦＣＭでデータを収集した。
【００４０】
この実験例では、peridin chlorophyll （PerCP）で標識した抗ＣＤ４５抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）、fluorescein isothiocyanate（ＦＩＴＣ）標識ＣＤ８０抗体、あるいは、ＣＤ４９ｄ抗体で染色した。
【００４１】
ＦＣＭによる測定は、FACScan（Becton Dickinson）を用いて定法に従って解析した。本実験例では、PerCP/FITCについて２カラー分析を行った。（あるいは、標識としてさらに例えばPEを使用して３カラーで解析すれば一度に解析可能である。）
４．フローサイトメトリーによるＣＤ４５弱陽性芽球のＣＤ８０陽性あるいはＣＤ４９ｄ発現低下によるde novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別
次に、収集したＦＣＭデータをＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ４５弱陽性でＳＣＣは比較的低いところにクラスターをつくる細胞集団である骨髄芽球の細胞集団（ＣＤ４５弱陽性芽球）を確認し（ＣＤ４５ blast gate法）、その細胞集団のＣＤ８０、ＣＤ４９ｄの測定を行った。ヒストグラムで解析し、FITC-conjugated IgGをコントロールとし（図２、４：ヒストグラム細線）、それぞれの抗体で染色したもの（図２、４：ヒストグラム太線）と比較し陽性部分（Ｍ１）の陽性率を解析する。
【００４２】
ＣＤ８０が陽性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ（白血病化ＭＤＳ）又はＭＤＳである。また、ＣＤ８０が陰性であっても、ＣＤ４９ｄが陰性であれば、ＭＤＳ／ＡＬ又はＭＤＳである。以上より、de novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別を行うことができる。
５．フローサイトメトリーにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別した結果
実際の症例において解析した例を図１〜図４に示す。
【００４３】
図１及び図２はde novo AMLの1症例のＦＣＭパターンである。
【００４４】
図１は、Ｒ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、ＣＤ４５陽性ＳＣＣ低値の部分（CD45 blast gating法によるＣＤ４５弱陽性：Ｒ２）に細胞集団（芽球）を認め、これらにつき解析を行ったものが図２である。図２左はblast gateをＣＤ８０でヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。Ｍ１は陽性部分を示すが、この症例ではＭ１部分に細胞がないのでＣＤ８０陰性であった。図２右はblast gateをＣＤ４９ｄでヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。この症例ではＭ１部分にＣＤ４９ｄ陽性細胞が多数認められる。つまり、de novo AMLにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析では、ＣＤ８０陽性細胞は認めず（陰性）、ＣＤ４９ｄ発現は高度（陽性）であった。
【００４５】
図３及び図４はＭＤＳの１症例のＦＣＭパターンである。
【００４６】
図３が、図１と同様にＲ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、ＣＤ４５陽性ＳＣＣ低値の部分（Ｒ２）にＣＤ４５弱陽性芽球集団を認め、これらにつき解析を行った。図４左はblast gateをＣＤ８０でヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。この症例ではＭ１部分にＣＤ８０陽性細胞が多数認められ、ＣＤ８０陽性であった。図４右はblast gateをＣＤ４９ｄでヒストグラム解析した図であり、コントロールが細線であり、検体は太線で示す。この症例ではＭ１部分にＣＤ４９d陽性細胞はあるが、その陽性率はかなり低く、陰性であった。つまり、ＭＤＳにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析では、de novo AMLとは異なり、ＣＤ８０陽性細胞を認め、ＣＤ４９ｄ発現は低値（陰性）であった。
【００４７】
表２は従来の確定診断方法でde novo AML、ＭＤＳ／ＡＬ、ＭＤＳと診断されているサンプルを用いて、同様にＦＣＭパターンを展開し、ＣＤ４５弱陽性芽球のCD80、CD49dの抗原解析を行った結果である。CD80陽性あるいはCD49d陰性のどちらを満たせばMDS/AL型である。
【００４８】
【表２】
【００４９】
簡単に表の解説を行う。
【００５０】
従来の方法でde novo AML、ＭＤＳ/ＡＬ、ＭＤＳと診断された症例について、それぞれＣＤ８０抗原解析を行った総症例のうち、ＭＤＳ/ＡＬ型症例と判断された数を「ＣＤ８０解析例」に示した（ＭＤＳ/ＡＬ型症例数／解析症例数）。
【００５１】
同様にＣＤ４９ｄ抗原解析を行った総症例数のうち、ＭＤＳ/ＡＬ型症例と判断された数を「ＣＤ４９ｄ」解析例に示した。
【００５２】
また、「本発明での診断」と記載した部分には、本発明の方法であるＣＤ８０またはＣＤ４９ｄいずれか、もしくは両方で診断した数を記載しており、ＣＤ８０とＣＤ４９ｄ解析例の合計を記載しているものではない。
【００５３】
結果
1. 従来方法でde novo AMLと診断された症例
ＣＤ８０を測定した３７例中、ＣＤ８０陽性細胞が認められたものはなかったため、ＭＤＳ／ＡＬ型は１例もないと判断した。
【００５４】
ＣＤ４９ｄを測定した１４例中、全てＣＤ４９ｄの発現が高度であったため、ＭＤＳ／ＡＬ型は１例もないと判断した。
【００５５】
de novo AML３７症例中、ＣＤ８０あるいはＣＤ４９ｄのどちらかの測定でＭＤＳ／ＡＬ型ではないと３７症例（１００％）判断できた。
【００５６】
２. 従来方法でＭＤＳ／ＡＬと診断された症例
ＣＤ８０を測定した１９例中、ＣＤ８０陽性の７例について、ＣＤ８０測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００５７】
ＣＤ４９ｄを測定した１５例中、ＣＤ４９ｄの発現が低値（陰性）の４例について、ＣＤ４９ｄ測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００５８】
ＭＤＳ／ＡＬ ２７症例中、ＣＤ８０あるいはＣＤ４９ｄのどちらかで診断できたＭＤＳ／ＡＬ型は１１症例（４０．７％）であった。
【００５９】
３. 従来方法でＭＤＳと診断された症例
ＣＤ８０を測定した１４例中、ＣＤ８０陽性細胞を認めた６例について、ＣＤ８０測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００６０】
ＣＤ４９ｄを測定した１６例中、ＣＤ４９ｄの発現が低値（陰性）であった４例について、ＣＤ４９ｄ測定のみでＭＤＳ／ＡＬ型であると判断した。
【００６１】
ＭＤＳ１７症例中、ＣＤ８０あるいはＣＤ４９ｄのどちらかで診断できたＭＤＳ／ＡＬ型は９症例（５２．９％）であった。
【００６２】
ＣＤ８０とＣＤ４９ｄの両者を測定した１３例中、８例（６１．５％）でＭＤＳ／ＡＬ型であった。
【００６３】
以上の結果から、本法でde novo AMLを誤ってＭＤＳ／ＡＬと診断する確率は０％であり、ＭＤＳ／ＡＬの約４０％以上で正確に診断できた。また、ＭＤＳに関しても約６０％以上で正確に診断できた。この確率は、臨床検査として十分用い得る数値である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、白血病の患者において簡便にＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。白血病化ＭＤＳは治療に不応性であるが、de novo AMLでは治療に良く反応するため、この両者を鑑別することは患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。本発明の鑑別方法を用いることにより、診断の初期に白血病化ＭＤＳとde novo AMLを鑑別し、適切な治療戦略の構築が可能となる。また、本発明の鑑別方法をその他の診断方法と組み合わせて用いると鑑別をさらに確実なものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】de novo AMLの一症例のサイトグラム：左はＦＳＣとＳＳＣで展開したサイトグラム（ドットプロット）であり、右の図はＲ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開したものである。
【図２】図１で抽出されたＣＤ４５弱陽性の芽球の集団（Ｒ２、blast gate）についての抗原ヒストグラム解析：左はＣＤ８０で解析した図であり、右はＣＤ４９ｄで解析した図である。
【図３】ＭＤＳの一症例のサイトグラム：左はＦＳＣとＳＳＣで展開したサイトグラム（ドットプロット）であり、右の図はＲ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開したものである。
【図４】図３で抽出されたＣＤ４５弱陽性の芽球の集団（Ｒ２、blast gate）についての抗原ヒストグラム解析：左はＣＤ８０で解析した図であり、右はＣＤ４９ｄで解析した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーにより、検体中のＣＤ４５弱陽性芽球について特定の細胞表面抗原の発現を分析することを特徴とする、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別方法。
【請求項２】
検体が、ＭＤＳまたはde novo AMLに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞表面抗原が、ＣＤ８０および／またはＣＤ４９ｄである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ８０が陽性であるか否かを判定する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ４９ｄが陰性であるか否かを判定する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ８０が陰性でありかつＣＤ４９ｄが陽性であるか否かを判定する請求項３に記載の方法。
【請求項７】
以下の（ア）から（ウ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中の特定の細胞表面抗原の発現を分析する工程
（ウ）特定の細胞表面抗原の発現率によりＭＤＳとde novo AMLとを鑑別する工程。
【請求項８】
以下の（ア）から（エ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ８０の発現を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ４９ｄの発現を判定する工程
（エ）上記（イ）においてＣＤ８０陽性であるか、又は（ウ）においてＣＤ４９ｄ陰性であれば、de novo AMLではなくＭＤＳであると鑑別する工程。
【請求項９】
抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ８０抗体及び抗ＣＤ４９ｄ抗体を含む、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。
【請求項１】
フローサイトメトリーにより、検体中のＣＤ４５弱陽性芽球について特定の細胞表面抗原の発現を分析することを特徴とする、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別方法。
【請求項２】
検体が、ＭＤＳまたはde novo AMLに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞表面抗原が、ＣＤ８０および／またはＣＤ４９ｄである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ８０が陽性であるか否かを判定する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ４９ｄが陰性であるか否かを判定する請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ８０が陰性でありかつＣＤ４９ｄが陽性であるか否かを判定する請求項３に記載の方法。
【請求項７】
以下の（ア）から（ウ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中の特定の細胞表面抗原の発現を分析する工程
（ウ）特定の細胞表面抗原の発現率によりＭＤＳとde novo AMLとを鑑別する工程。
【請求項８】
以下の（ア）から（エ）の工程を含む、ＭＤＳとde novo AMLとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５弱陽性芽球を抽出する工程
（イ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ８０の発現を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５弱陽性芽球中のＣＤ４９ｄの発現を判定する工程
（エ）上記（イ）においてＣＤ８０陽性であるか、又は（ウ）においてＣＤ４９ｄ陰性であれば、de novo AMLではなくＭＤＳであると鑑別する工程。
【請求項９】
抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ８０抗体及び抗ＣＤ４９ｄ抗体を含む、ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−５１７１１（Ｐ２００８−５１７１１Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２２９５８４（Ｐ２００６−２２９５８４）
【出願日】平成１８年８月２５日（２００６．８．２５）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２５日（２００６．８．２５）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
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