Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ遺伝子、遺伝子産物およびそれらの酵素反応を用いた糖含有グリセロリン脂質の製造法
【課題】
Ｍ．ｆａｅｒｍｅｎｔａｎｓの膜成分である糖含有グリセロリン脂質（ＧＧＰＬ）を大腸菌で発現させた酵素によって反応させて、製造する。
【解決手段】
Ｍ．ｆａｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノム情報から可能性のある遺伝子ｍｆ１とｍｆ３を選択して、クローニングして、コドンの組み合わせを大腸菌型に変換した。これらの改変遺伝子ををＥ．ｃｏｌｉで発現させ、さらに細胞破砕物を調製して、基質を加えて酵素反応を行い、糖含有グリセロリン脂質を得ることに成功した。
Ｍ．ｆａｅｒｍｅｎｔａｎｓの膜成分である糖含有グリセロリン脂質（ＧＧＰＬ）を大腸菌で発現させた酵素によって反応させて、製造する。
【解決手段】
Ｍ．ｆａｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノム情報から可能性のある遺伝子ｍｆ１とｍｆ３を選択して、クローニングして、コドンの組み合わせを大腸菌型に変換した。これらの改変遺伝子ををＥ．ｃｏｌｉで発現させ、さらに細胞破砕物を調製して、基質を加えて酵素反応を行い、糖含有グリセロリン脂質を得ることに成功した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの機能未知遺伝子とそれから発現される酵素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性疾患は炎症、間接症状など多彩な臨床症状に基づいて分類された疾患群の総称である。しかし、病因が明らかとなっていないため、根治的な治療にはつながっていない。一方、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのもつ糖含有グリセロリン脂質が関節リウマチ患者の約40%の滑膜細胞に存在することが見出された。M．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの糖含有グリセロリン脂質は、（Ｇｌｙｃｏｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｏｌｉｐｉｄ（GGPL））はＭ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓがもつ主要抗原の一つである。
GGPL類を用いることにより、病因の特定および病因特異的な治療が可能になるのではないかと考えられた。すなわちGGPL類を用いたワクチンによる治療、あるいは、抗GGPLを用いた血清診断などが考えられる。
【０００３】
GGPLを得るにはＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの培養菌体からの抽出、あるいは化学合成法が考えられる。菌体からの抽出法は、本菌の培養がきわめて困難で、生育度が低く、高密な培養液を得ることができず、菌体量の確保が困難である。大量培養するには、不向きな微生物であり工業化は困難である。
【０００４】
ＧＧＰＬｓは異なる構造の６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）および6’-O-(3’’-phosphocholine-2’’-amino-1’’phospho-1’’,3’’-propanediol)-a-D-glucopyranosyl-(1’3)-1,2-diacyl-2n-glycerol（ＧＧＰＬ−ＩＩＩ）が松田ら（特許文献１）により単離されている。
【０００５】
ＧＧＰＬ類の生産法として、抽出法、化学合成法（特許文献１）、酵素法の３法があげられる。抽出法は培養したＭ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌体からＧＧＰＬ類を抽出する方法であるが、マイコプラズマは栄養要求性が複雑であり、多くの菌体を得られないことから商業的生産法として不適である。化学合成法では、合成が多段階であること、光学異性体であることなどで、収率が低いなどの問題がある。酵素法は穏やかな条件で生産可能であること、反応が特異的でより高い収率が期待されるが、ＧＧＰＬ類合成酵素は未だ報告されていない。
【０００６】
既報の化学合成法は合成ステップが多段階であること、さらに光学異性体の選択が必要で、収率がきわめて悪いという不利な点を抱えている。すなわち治療や予防目的にGGPLを使うための十分な量を確保するには、多大なコストが必要だという欠点があった。
【０００７】
この改善策として、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノム解析を行い、ＧＧＰＬ類の生合成酵素を探索し、その遺伝子を大腸菌など培養が容易な微生物に遺伝子操作で遺伝子導入を行い、大腸菌を用いて、大腸菌にはないＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのＧＧＰＬ類を生産する手段が考えられた。
そこで、本発明では、ゲノム解析から得られた情報を元にGGPL類の合成に関わると予想した遺伝子ｍｆ１およびｍｆ３をそれぞれクローニングし、大腸菌用ベクターに導入して、それらの遺伝子産物としての酵素を大腸菌に作らせ、酵素法にてGGPL類を生産することを目指した。
【特許文献１】特許公開平７−３０４７８９
【非特許文献１】Kawahito Y, Ichinose S, Sano H, et al. (2008) Mycoplasmafermentans glycolipid-antigen as a pathogen of rheumatoid arthritis. BiochemBiophys Res Commun. 369:561-566
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
解決しようとする問題点は、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノムにおいてＧＧＰＬ類を生合成する酵素が判っていないことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノム解析で得たＤＮＡ配列情報から、ＧＧＰＬ類の生合成に必要と考えられる遺伝子を候補として、そのＤＮＡ配列を大腸菌型のコドンの組み合わせに遺伝子工学的に置換して、大腸菌に形質転換し、大腸菌おいて酵素発現を行い、その酵素活性を得ることを最も主要な特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
もともとの微生物であるＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの培養では、高価な組成物を用いた培養液を用いても生育量が低いのでＧＧＰＬ類を得るには、高いコストを要する。また化学合成法では、光学異性体でありＧＧＰＬを得るには、高いコストを要する。しかし、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ遺伝子を大腸菌で発現させて、それらの酵素を用いた反応法によってＧＧＰＬ類をより安価に生産することができる。生産されたＧＧＰＬ類は、ワクチン原料や検査薬原料および医療用製品の原料とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの糖含有グリセロリン脂質を得るという目的を、その生合成遺伝子をクローニングしコドン改変を行い、大腸菌に導入して発現させた酵素を用いることによって、低コストで安定的に生産することを実現した。
【実施例１】
【００１２】
ｍｆ１遺伝子の発現
（１）供試菌株、プラスミド、培地
ゲノムＤＮＡ供与菌として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ１８株を使用した。発現ベクターおよび形質転換体の構築には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０とＢＬ２１−ＡＩ株をインビトロジェンより購入して使用した。クローニングベクターとしてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ、発現ベクター構築にはｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯおよびｐＤＥＳＴ１４ベクター（いずれもインビトロジェン）を使用した。培養にはＬＢ培地を用いて行った。形質転換体選択薬剤として、Ｋａｎａｍｙｃｉｎは５０マイクロｇ／ｍｌ、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎは５０マイクロｇ／ｍｌで使用した。
【００１３】
（２）ｍｆ１遺伝子発現ベクターの構築
Ｍ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ１８株ゲノムを用いてｍｆ１遺伝子を増幅した。用いた一組のプライマーの配列は、Ｍ１Ｆ（５‘−ＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＡＴＧＡ−３’）（配列表７）およびＭ１Ｒ (５’−ＣＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’)（配列表８）とした。組成はプライマー各２５ｐｍｏｌ、それぞれ０．２ｍＭのｄＮＴＰ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４、酵素に添付の１０ｘ ＰＣＲ用緩衝液５マイクロリットル、ＫＯＤ ｐｌｕｓ(ＴＯＹＯＢＯ) １．０ ｕｎｉｔ、全量を５０マイクロリットルとした。増幅条件は９４度２分を１サイクル、９４度１５秒５５℃３０秒６８℃１分／１ｋｂを２５サイクル、６８℃８分を１サイクルとした。アガロース電気泳動にて増幅が単一バンドであることを確認後、ＳＵＰＲＥＣ−ＰＣＲ (ＴａＫａＲａ)で精製した。精製した増幅産物はＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキットを用い、添付の説明書にしたがってクローニングした。クローニングの宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０を用いた。培地はＬＢ培地、抗生物質はカナマイシンを終濃度で５０マイクロｇ／ｍｌとなるように添加した。クローニング後プラスミド抽出を行い、クローニングした配列が目的のものと同じであることを確認した。
【００１４】
マイコプラズマ属菌のゲノムにおいて、トリプトファンコドンとして用いられているＴＧＡコドンは、他の生物において一般的には終止コドンである。そこで、ＴＧＡをＴＧＧにコドン改変することで、一般的なトリプトファンコドンとした。コドン改変には、ＤｐｎＩ法を用いた。コドン改変プライマーとして、５組設計した。配列は以下の通りである。Ｍ１‐Ａ１４７Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣ−３’)（配列表９）、Ｍ１‐Ａ１４７Ｇ‐Ｒ(５’−ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧ−３’) （配列表１０）、Ｍ１‐Ａ２２８Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＧＴＡＧＡＣＴＧｇＧＡＡＡＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣ−３’) （配列表１１）、Ｍ１‐Ａ２２８Ｇ‐Ｒ(５’−ＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＴＣｃＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＣＴＧ−３’) （配列表１２）、Ｍ１‐Ａ４２０Ｇ‐Ｆ(５’−ＧＡＴＡＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧ−３’) （配列表１３）、Ｍ１‐Ａ４２０Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＴＧＡＡＴＡＴＣ−３’)（配列表１４）、Ｍ１‐Ａ４５３Ｇ‐Ｆ(５’−ＧＣＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣ−３’)（配列表１５）、Ｍ１‐Ａ４５３Ｇ‐Ｒ(５’−ＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣ−３’)（配列表１６）、Ｍ１‐Ａ６８１Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＴＡＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＴＧｇＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧ−３’)（配列表１７）、Ｍ１‐Ａ６８１Ｇ‐Ｒ(５’−ＣＡＧＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴｃＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＡＧ−３’)（配列表１８）。次に、発現ベクターを構築した。構築には、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン）を使用した。コドン改変したｍｆ１遺伝子を導入したベクターｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ／ｍｆ１Ａ‐Ｇから、プライマーＭ１ＥＮＴ‐Ｆ（５’− ＣＡＣＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣ−３’）（配列表１９）およびＭ１Ｒを用いて５‘末端にＣＡＣＣの４塩基が付加したｍｆ１断片を増幅した。アガロース電気泳動にて増幅が単一バンドであることを確認し、ＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（ＴａＫａＲａ）にて精製した。精製物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングされた配列が目的のものであることを確認後、ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（インビトロジェン）を用いてｐＤＥＳＴ１４に組換えた。構築した発現ベクターをｐＤＥＳＴ１４ｍｆ１ｗとした。
【００１５】
（４）ｍｆ１発現の確認
Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ１ｗを培養した菌液を本培養液に５％接種した。３０℃で培養し、ＯＤ６００＝０．４の時点でＬ−ａｒａｂｉｎｏｓｅを終濃度０．２％になるよう添加し、誘導処理を行った。誘導処理５時間後、培養液を４℃、７０００ｘｇ、２０分間遠心分離し、菌体を回収した。湿菌体の２倍重量の直径０．１ｍｍのガラスビーズ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、懸濁した。マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕した。破砕液を４℃、１５０００ｘｇ、５分間遠心分離した上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１）。誘導処理を行った試料にのみ、予想サイズと一致するバンドが確認された。
【００１６】
（５）６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）の生成試験
大腸菌細胞破砕液を遠心分離した上清を粗酵素として、ＧＧＰＬ−Ｉ生成試験を行った。反応式は図２のごとく示される。反応液の組成は、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ Ｒｅｄｅｃｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、６ｍＭ アルファ‐グルコピラノシル‐（１‘‐３）‐１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロール、０．１ｍＭ ＣＤＰ−ｃｈｏｌｉｎｅに粗酵素液を２０マイクロリットル添加し、全量を１００マイクロリットルとした。反応は３７℃、１６時間行った。反応後、クロロホルム：メタノール＝２：１の溶液を４００マイクロリットル添加し、反応停止およびＧＧＰＬ−Ｉ抽出を行った。十分撹拌後、１５０００ｘｇ、５分間遠心分離を行い、クロロホルム／メタノール層を回収し、乾燥させた。
【００１７】
（６）ＧＧＰＬ−Ｉ生成確認
生成の確認は質量分析にて行った。オートフレックスＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（ブルカーダルトニクス社）を用いた。乾燥試料をクロロホルム：メタノール＝２：１溶液５００マイクロリットルにて溶解し、さらにメタノールで１００倍希釈した。マトリックス溶液は、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ ０．００２５ｇを９９０マイクロリットルのメタノールで溶解したDHB溶液にＴＦＡ−Ｎａ０．００１２５ｇを１ｍｌのメタノールで溶解したＴＦＡ−Ｎａ溶液１０マイクロリットルを加えて調製した。希釈した試料１マイクロリットルおよびマトリックス溶液１マイクロリットルを測定に供した。質量分析の結果、ＧＧＰＬ−Ｉに対応するピークが検出された（図３）。以上の結果より、ｍｆ１産物がＧＧＰＬ−Ｉ生成反応を触媒することが分かった。
【実施例２】
【００１８】
グリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターの構築と発現
（１）供試菌株、使用したプラスミド、培地など
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ−１８より取得したゲノムＤＮＡを使用した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩはインビトロジェンより購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０は発現ベクターの構築に使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ−２１ＡＩは酵素生産の宿主とした。大腸菌の培養にはＬＢ培地を用いた。ＤＮＡ断片の増幅にはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡）を用いた。発現ベクターは、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン）にて構築し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ／ＴＯＰＯベクター、ｐＤＥＳＴ１４ベクター、ＬＲｃｌｏｎａｓｅ（インビトロジェン）を使用した。いずれも添付の説明書に従って用いた。酵素遺伝子への点変異導入のため、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ）を用いた。塩基配列はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて解析した。ＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよびＫａｎａｍｙｃｉｎは５０マイクロg／ｍｌの濃度で適時使用した。
【００１９】
（２）マイコプラズマ由来グリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターの構築
Ｍ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＰＧ−１８ゲノムを鋳型とし、ＰＣＲによりグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｍｆ３を増幅した。プライマーはＭ３Ｆ（配列表２０）（５‘−ＡＴＧＡＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’）、Ｍ３Ｒ（配列表２１）（５’−ＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴ−３‘）を用いた。増幅断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いてクローニングし、ｐＢｌｕｎｔＩＩｍｆ３を得た。マイコプラズマのゲノムでは、ｏｐａｌコドンＴＧＡがトリプトファンコドンとして用いられているため、異種微生物を用いて発現させる際には、一般的なトリプトファンコドンであるＴＧＧへと点変異を導入する必要がある。そこで、制限酵素ＤｐｎＩを用いた部位特異的点変異導入法（非特許文献２）によりｍｆ３に含まれる５ヶ所のＴＧＡコドンをＴＧＧへと点変異導入し、ｐＢｌｕｎｔＩＩｍｆ３ｗを構築した。点変異導入には４組のプライマーを設計した（図４）。５点目は９番目の塩基のため、エントリークローン構築の際に用いるプライマーに変異点を設計して導入した。変異鎖伸長反応は、９４℃５分１サイクル、９４℃、５５℃、６８℃１５サイクル、６８℃１サイクルとした。エントリークローン構築のためプライマーＭ３＿ＥＮＴ＿Ｆ（５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧ−３’）およびＭ３Ｒを用い、ｐＢｌｕｎｔＩＩｍｆ３ｗを鋳型として変異型ｍｆ３遺伝子、ｍｆ３ｗを増幅した。Ｍ３＿ＥＮＴ＿Ｆプライマーの５’末端にはＴＯＰＯクローニングの際に必要となるＣＡＣＣの配列が付与するように設計した。増幅したｍｆ３ｗをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へＴＯＰＯ−ｃｌｏｎｉｎｇし、ｐＥＮＴＲｍｆ３ｗを得た。さらに、ｐＥＮＴＲｍｆ３ｗからｐＤＥＳＴ１４へＬＲｃｌｏｎａｓｅ（インビトロジェン）を用いて組換え、ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗを構築した。
【非特許文献２】Sambook J, Russell W (2001) In vitro mutagenesis usingdouble-stranded DNA templates: selection of mutants with DpnI In: MolecularCloning, vol. 2. New York, Cold Spring Harbor, pp 13.19-13.25）
【００２０】
形質転換
ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩに形質転換し、形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗを得た。
【００２１】
Ｍｆ３の発現および発現確認
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗを培養し、ＯＤ６００＝０．４の時点でＬ−Ａｒａｂｉｎｏｓｅ（終濃度０．２％）を加え、発現誘導を行った。誘導後５時間の培養液を回収し、４℃、１５０００ｇ、５分間遠心分離により菌体を得た。直径０．１ｍｍのガラスビーズおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）を加えて懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械）にて破砕した。破砕液を４℃、１５０００ｇ、５分間遠心分離し、上清を粗酵素とした。発現確認のため粗酵素を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。コントロールとして発現誘導を行っていない菌体から同様に調製した粗酵素液を用いた。
【００２２】
（３）グリコシルトランスフェラーゼ活性の確認
基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロールおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを購入して使用した。反応はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（終濃度５０ｍＭ、ｐＨ７．０）とｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（終濃度０．５ｍＭ）、および、ＵＤＰ−グルコース（終濃度０．５ｍＭ）を混合し、３７℃で１６時間反応を行った。反応液にクロロホルムおよびメタノールを２：１で混合した溶液を反応液の４倍量加え、脂質抽出を行った。４℃、１５０００ｇ、５分間遠心分離を行い、有機溶媒層を回収して乾固したものを質量分析に供した。質量分析はオートフレックスＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（ブルカーダルトニクス）を用いた。マトリックス溶液は、ＤＨＢ溶液９９０マイクロリットルとＴＦＡ−Ｎａ溶液１０マイクロリットルを混合して用いた。ＤＨＢ溶液は、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ０．００２５ｇを９９０μｌのメタノールで溶解し、ＴＦＡ−Ｎａ溶液はＴＦＡ−Ｎａ０．００１２５ｇを１ｍｌのメタノールで溶解して調製した。
【００２３】
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＩ＿ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗにおけるＭｆ３の発現の検出
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、誘導処理した粗酵素にのみＭｆ３予想サイズと同じ約４４ｋＤａのバンドが検出された。（図５）この結果より、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗにおいてＭｆ３が発現していることが示唆された。
【００２４】
（２）Ｍｆ３活性の測定
ｍｆ３ｗ遺伝子産物Mf3の反応は、図６のごとく示される。反応試料の質量分析結果を図７に示した。誘導処理をした菌体から調製した粗酵素を用いた反応試料中にグルコピラノシルジアシルグリセロールに相当する７５３ｍ／ｚのピークが検出された。一方、コントロール（誘導処理していない菌体から調整した粗酵素を用いた反応試料）には検出されなかった。以上のことから、Ｍｆ３はＵＤＰ−グルコースからジパルミトイルグリセロールへのグルコース転移活性を有することが分かった。
【実施例３】
【００２５】
ｍｆ１ｗ遺伝子産物大腸菌細胞破砕液上清そしてｍｆ３ｗ遺伝子産物を含んだ大腸菌細胞破砕液上清を同じ相の中で実施して、基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロール、CDP-コリンおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを使用し、糖含有グリセロリン脂質である６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を37℃で16時間反応させた。予想される反応式は図７で示される。反応後の液を分析したところ、GGPL-1の生成を確認することができた（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓに特異的な膜成分である糖含有グリセロリン脂質を純度良く低コストで得ることができるので、ワクチン、検査試薬原料、抗マイコプラズマ抗体活性化薬など種々用途が開ける。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】大腸菌で発現したｍｆ１ｗ遺伝子産物を示す写真である。（実施例１）
【図２】ｍｆ１ｗ遺伝子産物の反応式を示す図である。（実施例１）
【図３】質量分析によるGGLP-1生成の証拠を示すチャートである。（実施例１）
【図４】４種のプライマーの配列を示したもの。（実施例２）
【図５】大腸菌で発現したｍｆ３ｗ遺伝子産物を示す写真である。（実施例２）
【図６】ｍｆ3ｗ遺伝子産物の反応式を示す図である。（実施例２）
【図７】質量分析によるGGLP-1生成の証拠を示すチャートである。（実施例２）
【図８】ｍｆ１ｗおよびｍｆ３ｗ遺伝子産物を同時に入れた反応系の図である。（実施例３）
【図９】ｍｆ１ｗおよびｍｆ３ｗ遺伝子産物を同時に入れた反応系でのGGPL-1生産の確認（実施例３）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの機能未知遺伝子とそれから発現される酵素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性疾患は炎症、間接症状など多彩な臨床症状に基づいて分類された疾患群の総称である。しかし、病因が明らかとなっていないため、根治的な治療にはつながっていない。一方、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのもつ糖含有グリセロリン脂質が関節リウマチ患者の約40%の滑膜細胞に存在することが見出された。M．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの糖含有グリセロリン脂質は、（Ｇｌｙｃｏｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｏｌｉｐｉｄ（GGPL））はＭ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓがもつ主要抗原の一つである。
GGPL類を用いることにより、病因の特定および病因特異的な治療が可能になるのではないかと考えられた。すなわちGGPL類を用いたワクチンによる治療、あるいは、抗GGPLを用いた血清診断などが考えられる。
【０００３】
GGPLを得るにはＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの培養菌体からの抽出、あるいは化学合成法が考えられる。菌体からの抽出法は、本菌の培養がきわめて困難で、生育度が低く、高密な培養液を得ることができず、菌体量の確保が困難である。大量培養するには、不向きな微生物であり工業化は困難である。
【０００４】
ＧＧＰＬｓは異なる構造の６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）および6’-O-(3’’-phosphocholine-2’’-amino-1’’phospho-1’’,3’’-propanediol)-a-D-glucopyranosyl-(1’3)-1,2-diacyl-2n-glycerol（ＧＧＰＬ−ＩＩＩ）が松田ら（特許文献１）により単離されている。
【０００５】
ＧＧＰＬ類の生産法として、抽出法、化学合成法（特許文献１）、酵素法の３法があげられる。抽出法は培養したＭ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌体からＧＧＰＬ類を抽出する方法であるが、マイコプラズマは栄養要求性が複雑であり、多くの菌体を得られないことから商業的生産法として不適である。化学合成法では、合成が多段階であること、光学異性体であることなどで、収率が低いなどの問題がある。酵素法は穏やかな条件で生産可能であること、反応が特異的でより高い収率が期待されるが、ＧＧＰＬ類合成酵素は未だ報告されていない。
【０００６】
既報の化学合成法は合成ステップが多段階であること、さらに光学異性体の選択が必要で、収率がきわめて悪いという不利な点を抱えている。すなわち治療や予防目的にGGPLを使うための十分な量を確保するには、多大なコストが必要だという欠点があった。
【０００７】
この改善策として、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノム解析を行い、ＧＧＰＬ類の生合成酵素を探索し、その遺伝子を大腸菌など培養が容易な微生物に遺伝子操作で遺伝子導入を行い、大腸菌を用いて、大腸菌にはないＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのＧＧＰＬ類を生産する手段が考えられた。
そこで、本発明では、ゲノム解析から得られた情報を元にGGPL類の合成に関わると予想した遺伝子ｍｆ１およびｍｆ３をそれぞれクローニングし、大腸菌用ベクターに導入して、それらの遺伝子産物としての酵素を大腸菌に作らせ、酵素法にてGGPL類を生産することを目指した。
【特許文献１】特許公開平７−３０４７８９
【非特許文献１】Kawahito Y, Ichinose S, Sano H, et al. (2008) Mycoplasmafermentans glycolipid-antigen as a pathogen of rheumatoid arthritis. BiochemBiophys Res Commun. 369:561-566
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
解決しようとする問題点は、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノムにおいてＧＧＰＬ類を生合成する酵素が判っていないことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲノム解析で得たＤＮＡ配列情報から、ＧＧＰＬ類の生合成に必要と考えられる遺伝子を候補として、そのＤＮＡ配列を大腸菌型のコドンの組み合わせに遺伝子工学的に置換して、大腸菌に形質転換し、大腸菌おいて酵素発現を行い、その酵素活性を得ることを最も主要な特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
もともとの微生物であるＭ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの培養では、高価な組成物を用いた培養液を用いても生育量が低いのでＧＧＰＬ類を得るには、高いコストを要する。また化学合成法では、光学異性体でありＧＧＰＬを得るには、高いコストを要する。しかし、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ遺伝子を大腸菌で発現させて、それらの酵素を用いた反応法によってＧＧＰＬ類をより安価に生産することができる。生産されたＧＧＰＬ類は、ワクチン原料や検査薬原料および医療用製品の原料とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの糖含有グリセロリン脂質を得るという目的を、その生合成遺伝子をクローニングしコドン改変を行い、大腸菌に導入して発現させた酵素を用いることによって、低コストで安定的に生産することを実現した。
【実施例１】
【００１２】
ｍｆ１遺伝子の発現
（１）供試菌株、プラスミド、培地
ゲノムＤＮＡ供与菌として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ１８株を使用した。発現ベクターおよび形質転換体の構築には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０とＢＬ２１−ＡＩ株をインビトロジェンより購入して使用した。クローニングベクターとしてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ、発現ベクター構築にはｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯおよびｐＤＥＳＴ１４ベクター（いずれもインビトロジェン）を使用した。培養にはＬＢ培地を用いて行った。形質転換体選択薬剤として、Ｋａｎａｍｙｃｉｎは５０マイクロｇ／ｍｌ、Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎは５０マイクロｇ／ｍｌで使用した。
【００１３】
（２）ｍｆ１遺伝子発現ベクターの構築
Ｍ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ１８株ゲノムを用いてｍｆ１遺伝子を増幅した。用いた一組のプライマーの配列は、Ｍ１Ｆ（５‘−ＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＡＴＧＡ−３’）（配列表７）およびＭ１Ｒ (５’−ＣＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’)（配列表８）とした。組成はプライマー各２５ｐｍｏｌ、それぞれ０．２ｍＭのｄＮＴＰ，１ｍＭ ＭｇＳＯ４、酵素に添付の１０ｘ ＰＣＲ用緩衝液５マイクロリットル、ＫＯＤ ｐｌｕｓ(ＴＯＹＯＢＯ) １．０ ｕｎｉｔ、全量を５０マイクロリットルとした。増幅条件は９４度２分を１サイクル、９４度１５秒５５℃３０秒６８℃１分／１ｋｂを２５サイクル、６８℃８分を１サイクルとした。アガロース電気泳動にて増幅が単一バンドであることを確認後、ＳＵＰＲＥＣ−ＰＣＲ (ＴａＫａＲａ)で精製した。精製した増幅産物はＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキットを用い、添付の説明書にしたがってクローニングした。クローニングの宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０を用いた。培地はＬＢ培地、抗生物質はカナマイシンを終濃度で５０マイクロｇ／ｍｌとなるように添加した。クローニング後プラスミド抽出を行い、クローニングした配列が目的のものと同じであることを確認した。
【００１４】
マイコプラズマ属菌のゲノムにおいて、トリプトファンコドンとして用いられているＴＧＡコドンは、他の生物において一般的には終止コドンである。そこで、ＴＧＡをＴＧＧにコドン改変することで、一般的なトリプトファンコドンとした。コドン改変には、ＤｐｎＩ法を用いた。コドン改変プライマーとして、５組設計した。配列は以下の通りである。Ｍ１‐Ａ１４７Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣ−３’)（配列表９）、Ｍ１‐Ａ１４７Ｇ‐Ｒ(５’−ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＣＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＧ−３’) （配列表１０）、Ｍ１‐Ａ２２８Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＧＴＡＧＡＣＴＧｇＧＡＡＡＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣ−３’) （配列表１１）、Ｍ１‐Ａ２２８Ｇ‐Ｒ(５’−ＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＴＣｃＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＣＴＧ−３’) （配列表１２）、Ｍ１‐Ａ４２０Ｇ‐Ｆ(５’−ＧＡＴＡＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧ−３’) （配列表１３）、Ｍ１‐Ａ４２０Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＴＧＡＡＴＡＴＣ−３’)（配列表１４）、Ｍ１‐Ａ４５３Ｇ‐Ｆ(５’−ＧＣＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣ−３’)（配列表１５）、Ｍ１‐Ａ４５３Ｇ‐Ｒ(５’−ＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣ−３’)（配列表１６）、Ｍ１‐Ａ６８１Ｇ‐Ｆ(５’−ＣＴＡＴＧＧＴＣＣＡＡＡＴＴＧｇＡＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧ−３’)（配列表１７）、Ｍ１‐Ａ６８１Ｇ‐Ｒ(５’−ＣＡＧＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＣＴｃＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＡＧ−３’)（配列表１８）。次に、発現ベクターを構築した。構築には、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン）を使用した。コドン改変したｍｆ１遺伝子を導入したベクターｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ／ｍｆ１Ａ‐Ｇから、プライマーＭ１ＥＮＴ‐Ｆ（５’− ＣＡＣＣＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣ−３’）（配列表１９）およびＭ１Ｒを用いて５‘末端にＣＡＣＣの４塩基が付加したｍｆ１断片を増幅した。アガロース電気泳動にて増幅が単一バンドであることを確認し、ＳＵＰＲＥＣ ＰＣＲ（ＴａＫａＲａ）にて精製した。精製物をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングした。クローニングされた配列が目的のものであることを確認後、ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（インビトロジェン）を用いてｐＤＥＳＴ１４に組換えた。構築した発現ベクターをｐＤＥＳＴ１４ｍｆ１ｗとした。
【００１５】
（４）ｍｆ１発現の確認
Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎを含むＬＢ培地でＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ１ｗを培養した菌液を本培養液に５％接種した。３０℃で培養し、ＯＤ６００＝０．４の時点でＬ−ａｒａｂｉｎｏｓｅを終濃度０．２％になるよう添加し、誘導処理を行った。誘導処理５時間後、培養液を４℃、７０００ｘｇ、２０分間遠心分離し、菌体を回収した。湿菌体の２倍重量の直径０．１ｍｍのガラスビーズ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、懸濁した。マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕した。破砕液を４℃、１５０００ｘｇ、５分間遠心分離した上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１）。誘導処理を行った試料にのみ、予想サイズと一致するバンドが確認された。
【００１６】
（５）６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）の生成試験
大腸菌細胞破砕液を遠心分離した上清を粗酵素として、ＧＧＰＬ−Ｉ生成試験を行った。反応式は図２のごとく示される。反応液の組成は、１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ Ｒｅｄｅｃｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、６ｍＭ アルファ‐グルコピラノシル‐（１‘‐３）‐１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロール、０．１ｍＭ ＣＤＰ−ｃｈｏｌｉｎｅに粗酵素液を２０マイクロリットル添加し、全量を１００マイクロリットルとした。反応は３７℃、１６時間行った。反応後、クロロホルム：メタノール＝２：１の溶液を４００マイクロリットル添加し、反応停止およびＧＧＰＬ−Ｉ抽出を行った。十分撹拌後、１５０００ｘｇ、５分間遠心分離を行い、クロロホルム／メタノール層を回収し、乾燥させた。
【００１７】
（６）ＧＧＰＬ−Ｉ生成確認
生成の確認は質量分析にて行った。オートフレックスＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（ブルカーダルトニクス社）を用いた。乾燥試料をクロロホルム：メタノール＝２：１溶液５００マイクロリットルにて溶解し、さらにメタノールで１００倍希釈した。マトリックス溶液は、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ ０．００２５ｇを９９０マイクロリットルのメタノールで溶解したDHB溶液にＴＦＡ−Ｎａ０．００１２５ｇを１ｍｌのメタノールで溶解したＴＦＡ−Ｎａ溶液１０マイクロリットルを加えて調製した。希釈した試料１マイクロリットルおよびマトリックス溶液１マイクロリットルを測定に供した。質量分析の結果、ＧＧＰＬ−Ｉに対応するピークが検出された（図３）。以上の結果より、ｍｆ１産物がＧＧＰＬ−Ｉ生成反応を触媒することが分かった。
【実施例２】
【００１８】
グリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターの構築と発現
（１）供試菌株、使用したプラスミド、培地など
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ ＰＧ−１８より取得したゲノムＤＮＡを使用した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩはインビトロジェンより購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０は発現ベクターの構築に使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ−２１ＡＩは酵素生産の宿主とした。大腸菌の培養にはＬＢ培地を用いた。ＤＮＡ断片の増幅にはＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡）を用いた。発現ベクターは、Ｇａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン）にて構築し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ／ＴＯＰＯベクター、ｐＤＥＳＴ１４ベクター、ＬＲｃｌｏｎａｓｅ（インビトロジェン）を使用した。いずれも添付の説明書に従って用いた。酵素遺伝子への点変異導入のため、ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ）を用いた。塩基配列はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて解析した。ＣａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよびＫａｎａｍｙｃｉｎは５０マイクロg／ｍｌの濃度で適時使用した。
【００１９】
（２）マイコプラズマ由来グリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターの構築
Ｍ． ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＰＧ−１８ゲノムを鋳型とし、ＰＣＲによりグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ｍｆ３を増幅した。プライマーはＭ３Ｆ（配列表２０）（５‘−ＡＴＧＡＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＧ−３’）、Ｍ３Ｒ（配列表２１）（５’−ＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＧＴＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴ−３‘）を用いた。増幅断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いてクローニングし、ｐＢｌｕｎｔＩＩｍｆ３を得た。マイコプラズマのゲノムでは、ｏｐａｌコドンＴＧＡがトリプトファンコドンとして用いられているため、異種微生物を用いて発現させる際には、一般的なトリプトファンコドンであるＴＧＧへと点変異を導入する必要がある。そこで、制限酵素ＤｐｎＩを用いた部位特異的点変異導入法（非特許文献２）によりｍｆ３に含まれる５ヶ所のＴＧＡコドンをＴＧＧへと点変異導入し、ｐＢｌｕｎｔＩＩｍｆ３ｗを構築した。点変異導入には４組のプライマーを設計した（図４）。５点目は９番目の塩基のため、エントリークローン構築の際に用いるプライマーに変異点を設計して導入した。変異鎖伸長反応は、９４℃５分１サイクル、９４℃、５５℃、６８℃１５サイクル、６８℃１サイクルとした。エントリークローン構築のためプライマーＭ３＿ＥＮＴ＿Ｆ（５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧ−３’）およびＭ３Ｒを用い、ｐＢｌｕｎｔＩＩｍｆ３ｗを鋳型として変異型ｍｆ３遺伝子、ｍｆ３ｗを増幅した。Ｍ３＿ＥＮＴ＿Ｆプライマーの５’末端にはＴＯＰＯクローニングの際に必要となるＣＡＣＣの配列が付与するように設計した。増幅したｍｆ３ｗをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へＴＯＰＯ−ｃｌｏｎｉｎｇし、ｐＥＮＴＲｍｆ３ｗを得た。さらに、ｐＥＮＴＲｍｆ３ｗからｐＤＥＳＴ１４へＬＲｃｌｏｎａｓｅ（インビトロジェン）を用いて組換え、ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗを構築した。
【非特許文献２】Sambook J, Russell W (2001) In vitro mutagenesis usingdouble-stranded DNA templates: selection of mutants with DpnI In: MolecularCloning, vol. 2. New York, Cold Spring Harbor, pp 13.19-13.25）
【００２０】
形質転換
ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩに形質転換し、形質転換体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗを得た。
【００２１】
Ｍｆ３の発現および発現確認
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗを培養し、ＯＤ６００＝０．４の時点でＬ−Ａｒａｂｉｎｏｓｅ（終濃度０．２％）を加え、発現誘導を行った。誘導後５時間の培養液を回収し、４℃、１５０００ｇ、５分間遠心分離により菌体を得た。直径０．１ｍｍのガラスビーズおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）を加えて懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械）にて破砕した。破砕液を４℃、１５０００ｇ、５分間遠心分離し、上清を粗酵素とした。発現確認のため粗酵素を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。コントロールとして発現誘導を行っていない菌体から同様に調製した粗酵素液を用いた。
【００２２】
（３）グリコシルトランスフェラーゼ活性の確認
基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロールおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを購入して使用した。反応はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（終濃度５０ｍＭ、ｐＨ７．０）とｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（終濃度０．５ｍＭ）、および、ＵＤＰ−グルコース（終濃度０．５ｍＭ）を混合し、３７℃で１６時間反応を行った。反応液にクロロホルムおよびメタノールを２：１で混合した溶液を反応液の４倍量加え、脂質抽出を行った。４℃、１５０００ｇ、５分間遠心分離を行い、有機溶媒層を回収して乾固したものを質量分析に供した。質量分析はオートフレックスＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ（ブルカーダルトニクス）を用いた。マトリックス溶液は、ＤＨＢ溶液９９０マイクロリットルとＴＦＡ−Ｎａ溶液１０マイクロリットルを混合して用いた。ＤＨＢ溶液は、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｅｎｚｏｎｉｃ ａｃｉｄ０．００２５ｇを９９０μｌのメタノールで溶解し、ＴＦＡ−Ｎａ溶液はＴＦＡ−Ｎａ０．００１２５ｇを１ｍｌのメタノールで溶解して調製した。
【００２３】
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＩ＿ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗにおけるＭｆ３の発現の検出
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、誘導処理した粗酵素にのみＭｆ３予想サイズと同じ約４４ｋＤａのバンドが検出された。（図５）この結果より、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ／ｐＤＥＳＴ１４ｍｆ３ｗにおいてＭｆ３が発現していることが示唆された。
【００２４】
（２）Ｍｆ３活性の測定
ｍｆ３ｗ遺伝子産物Mf3の反応は、図６のごとく示される。反応試料の質量分析結果を図７に示した。誘導処理をした菌体から調製した粗酵素を用いた反応試料中にグルコピラノシルジアシルグリセロールに相当する７５３ｍ／ｚのピークが検出された。一方、コントロール（誘導処理していない菌体から調整した粗酵素を用いた反応試料）には検出されなかった。以上のことから、Ｍｆ３はＵＤＰ−グルコースからジパルミトイルグリセロールへのグルコース転移活性を有することが分かった。
【実施例３】
【００２５】
ｍｆ１ｗ遺伝子産物大腸菌細胞破砕液上清そしてｍｆ３ｗ遺伝子産物を含んだ大腸菌細胞破砕液上清を同じ相の中で実施して、基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロール、CDP-コリンおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを使用し、糖含有グリセロリン脂質である６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を37℃で16時間反応させた。予想される反応式は図７で示される。反応後の液を分析したところ、GGPL-1の生成を確認することができた（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓに特異的な膜成分である糖含有グリセロリン脂質を純度良く低コストで得ることができるので、ワクチン、検査試薬原料、抗マイコプラズマ抗体活性化薬など種々用途が開ける。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】大腸菌で発現したｍｆ１ｗ遺伝子産物を示す写真である。（実施例１）
【図２】ｍｆ１ｗ遺伝子産物の反応式を示す図である。（実施例１）
【図３】質量分析によるGGLP-1生成の証拠を示すチャートである。（実施例１）
【図４】４種のプライマーの配列を示したもの。（実施例２）
【図５】大腸菌で発現したｍｆ３ｗ遺伝子産物を示す写真である。（実施例２）
【図６】ｍｆ3ｗ遺伝子産物の反応式を示す図である。（実施例２）
【図７】質量分析によるGGLP-1生成の証拠を示すチャートである。（実施例２）
【図８】ｍｆ１ｗおよびｍｆ３ｗ遺伝子産物を同時に入れた反応系の図である。（実施例３）
【図９】ｍｆ１ｗおよびｍｆ３ｗ遺伝子産物を同時に入れた反応系でのGGPL-1生産の確認（実施例３）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ遺伝子ｍｆ１（配列１）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌を用いて遺伝子ｍ１の遺伝子産物を発現させること、および遺伝子産物であるＣｈｏｌｉｎｅｐｈｏｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する酵素。
【請求項２】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ遺伝子ｍｆ３（配列2）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌を用いて遺伝子ｍｆ３の遺伝子産物を発現させること、および遺伝子産物である、糖転移反応によりジアシルグリセロールに糖を付加し、グルコピラノシルジアシルグリセロールを生成する、マイコプラズマ由来の糖転移酵素。
【請求項３】
請求項１においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのｍｆ１遺伝子の塩基配列のＴＧＡをＴＧＧにコドン改変した遺伝子ｍｆ１ｗ（配列3）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６０１）を用いて発現させる方法。
【請求項４】
請求項２においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのｍｆ３遺伝子の塩基配列のＴＧＡをＴＧＧにコドン改変した遺伝子ｍｆ３ｗ（配列4）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６００）を用いて発現させる方法。
【請求項５】
請求項１の遺伝子ｍｆ１遺伝子産物および請求項３のｍｆ１ｗ遺伝子産物であるＣｈｏｌｉｎｅｐｈｏｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する酵素（配列5）を用いて、基質をアルファ‐グルコピラノシル‐（１‘‐３）‐１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロールおよびＣＤＰ−ｃｈｏｌｉｎｅとし、反応物として糖含有グリセロリン脂質６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を得る製造方法。
【請求項６】
請求項２の遺伝子ｍｆ３の遺伝子産物および請求項３のｍｆ３ｗ遺伝子産物であるである酵素（配列6）グリコシルトランスフェラーゼを用いて、基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロールおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを使用し、反応物として６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を得る製造方法。
【請求項７】
請求項４の反応および請求項５の反応を同じ相の中で実施して、基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロール、CDP-コリンおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを使用し、糖含有グリセロリン脂質である６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を得る製造法。
【請求項１】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ遺伝子ｍｆ１（配列１）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌を用いて遺伝子ｍ１の遺伝子産物を発現させること、および遺伝子産物であるＣｈｏｌｉｎｅｐｈｏｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する酵素。
【請求項２】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ遺伝子ｍｆ３（配列2）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌を用いて遺伝子ｍｆ３の遺伝子産物を発現させること、および遺伝子産物である、糖転移反応によりジアシルグリセロールに糖を付加し、グルコピラノシルジアシルグリセロールを生成する、マイコプラズマ由来の糖転移酵素。
【請求項３】
請求項１においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのｍｆ１遺伝子の塩基配列のＴＧＡをＴＧＧにコドン改変した遺伝子ｍｆ１ｗ（配列3）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６０１）を用いて発現させる方法。
【請求項４】
請求項２においてＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのｍｆ３遺伝子の塩基配列のＴＧＡをＴＧＧにコドン改変した遺伝子ｍｆ３ｗ（配列4）を大腸菌用発現ベクターに導入し、その大腸菌（ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６００）を用いて発現させる方法。
【請求項５】
請求項１の遺伝子ｍｆ１遺伝子産物および請求項３のｍｆ１ｗ遺伝子産物であるＣｈｏｌｉｎｅｐｈｏｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ活性を有する酵素（配列5）を用いて、基質をアルファ‐グルコピラノシル‐（１‘‐３）‐１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロールおよびＣＤＰ−ｃｈｏｌｉｎｅとし、反応物として糖含有グリセロリン脂質６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を得る製造方法。
【請求項６】
請求項２の遺伝子ｍｆ３の遺伝子産物および請求項３のｍｆ３ｗ遺伝子産物であるである酵素（配列6）グリコシルトランスフェラーゼを用いて、基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロールおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを使用し、反応物として６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を得る製造方法。
【請求項７】
請求項４の反応および請求項５の反応を同じ相の中で実施して、基質として、１，２−ジパルミトイルグリセロール、CDP-コリンおよびＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅを使用し、糖含有グリセロリン脂質である６‘−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ−ａ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１’３）−１，２−ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＧＧＰＬ−Ｉ）を得る製造法。
【図１】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−６３４４５（Ｐ２０１０−６３４４５Ａ）
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３５７８３（Ｐ２００８−２３５７８３）
【出願日】平成２０年９月１３日（２００８．９．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月２７日 社団法人日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００８年度（平成２０年度）大会」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年８月２７日 社団法人日本生物工学会主催の「平成２０年度日本生物工学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５０３２１５９６３）有限会社Ａ−ＨＩＴＢｉｏ (1)
【出願人】（５９３０１３０７４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１３日（２００８．９．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月２７日 社団法人日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００８年度（平成２０年度）大会」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年８月２７日 社団法人日本生物工学会主催の「平成２０年度日本生物工学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５０３２１５９６３）有限会社Ａ−ＨＩＴＢｉｏ (1)
【出願人】（５９３０１３０７４）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]