修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドであって、それらの鎖のそれぞれに末端領域を有し、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、少なくとも３２℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、２〜４つの修飾基を含んで、それらの各々は、かつそれぞれ異なる末端領域、好ましくは、末端ヌクレオチドに共有結合的に結合され、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式置換基であり、前記修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼドメインに結合することができ、概して、２０００ｎＭ以下の濃度で、ＰＣＲまたは他のプライマー依存ＤＮＡ増幅反応に含まれる時、ミスプライミングの抑制、３’末端ミスマッチに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の３’末端に対するポリメラーゼ選択性の増加、反復間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の抑制、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチド、ならびにこのような修飾された二本鎖オリゴヌクレオチオを含む増幅反応混合物および増幅反応、このような修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドを含む増幅アッセイおよびキット。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含む、プライマー依存ＤＮＡ増幅反応用の反応混合物において、前記反応混合物は、少なくとも１つのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、改善点は、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、１〜４つの修飾基を含み、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分である、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤を、増幅の開始前の前記反応混合物に含めることを含み、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である、前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度に対する濃度で含まれるが、ただし、前記添加剤が、任意の標的配列のプライマーまたは検出プローブである場合、少なくとも３つの修飾基を含むものとする、反応混合物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの修飾基は、２〜４つの修飾基である、請求項１に記載の増幅反応混合物。
【請求項３】
前記２〜４つの修飾基は、３つの修飾基である、請求項２に記載の増幅反応混合物。
【請求項４】
前記添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、前記第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖と、を含む、請求項３に記載の増幅反応混合物。
【請求項５】
前記２〜４つの修飾基は、４つの修飾基である、請求項２に記載の増幅反応混合物。
【請求項６】
前記修飾基は、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の末端ヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項１〜５のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項７】
前記修飾基は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）である、請求項１〜６のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、請求項２に記載の増幅反応混合物。
【請求項９】
前記混合物は、３本の鎖から成る、請求項８に記載の増幅反応混合物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、天然のヌクレオチドから成る、請求項１〜９のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ＤＮＡである、請求項１〜９のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブではない、請求項１〜３および５〜１１のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の前記濃度は、１０００ｎＭ以下である、請求項１〜１２のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１４】
逆転写酵素をさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、１〜４つの一本鎖オーバーハングを含む、請求項１に記載の増幅反応混合物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、ハイブリッド形成されない時、ステムループ構造を形成する少なくとも１本の鎖を含む、請求項１５に記載の増幅反応混合物。
【請求項１７】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するための方法であって、前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を請求項１に記載の増幅反応混合物と接触させることと、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度を有するプライマー依存ＤＮＡ増幅反応に、前記反応混合物を供することと、を含む、方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を前記反応混合物と接触させることは、一本鎖形態の前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を前記反応混合物に添加することから成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を得るために、逆転写ＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの修飾因子は、２〜４つの修飾因子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記プライマーアニーリング温度から、前記プライマーアニーリング温度より多くても５℃低い温度までの範囲にある融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記アニーリング温度より高い融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記添加剤は、３つの修飾基を有し、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、前記第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖とを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物は、前記プライマーアニーリング温度から、前記プライマーアニーリング温度より多くても５℃低い温度までの範囲にあるＴｍを有する、二本鎖オリゴヌクレオチドを有する第１の添加剤と、前記プライマーアニーリング温度より高いＴｍを有する、二本鎖オリゴヌクレオチドを有する第２の添加剤と、を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
各添加剤は、３〜４つの修飾基を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマー依存増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応である、請求項１７〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記プライマー依存増幅は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応である、請求項１７〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列は、ＲＮＡ標的配列から逆転写される、請求項１７〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
請求項１７〜２９のいずれかに記載の増幅と、増幅中にリアルタイムで、もしくは増幅後のエンドポイントのいずれかでの、前記反応の一本鎖産物、前記反応の二本鎖産物、または両方の蛍光検出とを含む増幅アッセイであって、前記反応の二本鎖産物は、蛍光ＤＮＡ色素によって検出されるか、前記反応の一本鎖産物は、少なくとも１つの蛍光的に標識されたハイブリッド形成プローブによって検出されるか、または両方である、増幅アッセイ。
【請求項３１】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅する試薬のキットであって、請求項１〜１６のいずれかに記載の反応混合物のための前記試薬を含む、キット。
【請求項３２】
逆転写酵素をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ＤＮＡ色素をさらに含む、請求項３１または請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの標的配列のための蛍光的に標識された検出プローブをさらに含む、請求項３１〜３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
鎖のそれぞれに末端領域を有し、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、２〜４つの修飾基を含む、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分であり、前記修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼドメインを阻害することができる、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである、請求項３５に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記修飾基は、末端ヌクレオチドに結合される、請求項３５または請求項３６に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３５〜３７のいずれかに記載の２つの修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物。
【請求項３９】
前記２つの二本鎖オリゴヌクレオチドは、３本の鎖を含む、請求項３８に記載の混合物。
【請求項４０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性である、請求項１に記載の増幅反応混合物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図９Ｅ】

【図９Ｆ】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１６Ｄ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１７Ｄ】

【図１７Ｅ】

【図１７Ｆ】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図１９Ｄ】

【図２０】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２３Ｃ】

【図２３Ｄ】

【図２３Ｅ】

【図１２】

【公表番号】特表２０１２−５２００８０（Ｐ２０１２−５２００８０Ａ）
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５４２０６（Ｐ２０１１−５５４２０６）
【出願日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２７０１１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０５０７４
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５０１４４２３４５）ブランディーズ・ユニバーシティ (4)
【Ｆターム（参考）】