ＰＤＥ１０の細胞に基づくアッセイおよび配列
【課題】 ＰＤＥ１０の細胞に基づくアッセイおよび配列
【解決手段】 本発明は、細胞内ホスホジエステラーゼ１０Ａ活性を阻害する剤をスクリーニングする方法であって、剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてアデニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてグアニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、細胞におけるｃＡＭＰ生成およびｃＧＭＰ生成を測定し、そしてｃＡＭＰ ＥＣ２００およびｃＧＭＰ ＥＣ２００を計算することを含み、ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が、同一のアッセイ条件下でのパパベリンの投与によって生じる比に匹敵する場合、該剤をＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定する、前記方法を特徴とする。やはり特徴とされるのは、ラットＰＤＥ１０Ａポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列である。
【解決手段】 本発明は、細胞内ホスホジエステラーゼ１０Ａ活性を阻害する剤をスクリーニングする方法であって、剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてアデニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてグアニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、細胞におけるｃＡＭＰ生成およびｃＧＭＰ生成を測定し、そしてｃＡＭＰ ＥＣ２００およびｃＧＭＰ ＥＣ２００を計算することを含み、ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が、同一のアッセイ条件下でのパパベリンの投与によって生じる比に匹敵する場合、該剤をＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定する、前記方法を特徴とする。やはり特徴とされるのは、ラットＰＤＥ１０Ａポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列である。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を調節する剤を同定する方法、並びにラットＰＤＥ１０Ａのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を提供する。
【従来の技術】
【０００２】
環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ類（ＰＤＥ類）は、二次メッセンジャー、ｃＡＭＰ（環状アデノシン３’５’−一リン酸）およびｃＧＭＰ（環状グアニン３’５’−一リン酸）の加水分解を触媒し、そして非常に多様なシグナル伝達経路において、制御上、中枢の役割を果たす（Ｂｅａｖｏ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５：７２５−４８， １９９５）。例えば、ＰＤＥ類は、視覚（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４：１３０−３４， １９９３）、嗅覚（Ｙａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：９６７７−８１， １９９５）、血小板凝集（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２３：３７１−７７， １９９７）、アルドステロン合成（ＭａｃＦａｒｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１３６−４２， １９９１）、インスリン分泌（Ｚｈａｏら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０２：８６９−７３， １９９８）、Ｔ細胞活性化（Ｌｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８４８−５１， １９９９）、および平滑筋弛緩（Ｂｏｏｌｅｌｌら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ． ８：４７−５２， １９９６； Ｂａｌｌａｒｄら， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５９：２１６４−７１， １９９８）に関与する過程を仲介する。
【０００３】
ＰＤＥ類は、１１の主要なファミリーに細分される酵素のスーパーファミリーを形成する（Ｂｅａｖｏ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５：７２５−４８， １９９５； Ｂｅａｖｏら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６：３９９−０５， １９９４； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：８９９１−９６， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：５７０−７７， １９９８； Ｈａｙａｓｈｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０：７５１−５６， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−５８， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−６４， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７６， １９９９；およびＦａｗｃｅｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）。
【０００４】
各ＰＤＥファミリーは、ユニークな酵素的特性および薬理学的プロフィールによって、機能的に区別される。さらに、各ファミリーは、異なる組織、細胞、および細胞下発現パターンを示す（Ｂｅａｖｏら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６：３９９−４０５， １９９４； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：８９９１−９６， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：５０７−７７， １９９８； Ｈａｙａｓｈｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０：７５１−５６， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−５８， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−６４， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７６， １９９９； Ｆａｗｃｅｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００； Ｂｏｏｌｅｌｌら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ． ８：４７−５２， １９９６； Ｂａｌｌａｒｄら， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５９：２１６４−７１， １９９８； Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ９：１６１−６７， １９９８；およびＴｏｒｐｈｙら， Ｐｕｌｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １２：１３１−３５， １９９９）。したがって、ＰＤＥ酵素の１つのファミリーまたはサブファミリーの活性を選択的に制御する化合物を投与することによって、細胞または組織特異的方式で、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰシグナル伝達経路を制御することが可能である。
【０００５】
ＰＤＥ１０は、一次アミノ酸配列および異なる酵素活性に基づいて、ユニークなＰＤＥと同定される。ＥＳＴデータベースの相同性スクリーニングによって、ＰＤＥ１０Ａがホスホジエステラーゼ、ＰＤＥ１０ファミリーの第一のメンバーであることが明らかになった（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８４３８−１８４４５， １９９９； Ｌｏｕｇｈｎｅｙら， Ｇｅｎｅ ２３４：１０９−１１７， １９９９）。ヒト、ラット、およびネズミ相同体がクローニングされており、そしてラットおよびヒト遺伝子両方に関して、Ｎ末端スプライシング変異体が同定されている（Ｋｏｔｅｒａら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２６１：５５１−５５７， １９９９； Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６６：１１１８−１１２７， １９９９； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７０７６， １９９９）；種に渡り、高い度合いの相同性がある。ＰＤＥ１０Ａは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを、それぞれ、ＡＭＰおよびＧＭＰに加水分解する。ｃＡＭＰに対するＰＤＥ１０Ａの親和性（Ｋｍ＝０．０５μＭ）は、ｃＧＭＰに対するもの（Ｋｍ＝３μＭ）より高い。しかし、ｃＧＭＰに対するＶｍａｘは、ｃＡＭＰに対するものよりおよそ５倍高く、このことから、ＰＤＥ１０Ａが、ｃＡＭＰに阻害される、ユニークなｃＧＭＰアーゼであることが示唆されている（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８４３８−１８４４５， １９９９）。
【０００６】
ＰＤＥ１０Ａは、哺乳動物において、他のＰＤＥファミリーに比較し、ユニークに局在している。ＰＤＥ１０ＡのメッセンジャーＲＮＡは、精巣および脳でのみ、高く発現される（ＬａｎｆｅａｒおよびＲｏｂａｓ、ＥＰ ０９６７２８４； Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６６：１１１８−１１２７， １９９９； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７０７６， １９９９； Ｌｏｕｇｈｎｅｙら， Ｇｅｎｅ ２３４：１０９−１１７， １９９９）。当初の研究は、脳内では、線条体（尾状核および被殻）、側坐核、および嗅結節で、発現が最高であることを示した（ＬａｎｆｅａｒおよびＲｏｂａｓ、上記）。したがって、ＰＤＥ１０Ａ選択的調節を用いて、これらの脳領域において、環状ヌクレオチドのレベルを調節することが可能である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を選択的に調節する剤を同定する方法、並びにラットＰＤＥ１０Ａのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を提供する。
１つの側面において、本発明は、細胞内ホスホジエステラーゼ１０Ａ活性を阻害する剤をスクリーニングする方法であって、剤を線条体中型有棘ニューロン（ｓｔｒｉａｔａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｓｐｉｎｙ ｎｅｕｒｏｎｓ）に投与し、そしてアデニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてグアニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、それぞれ、ｃＡＭＰ生成およびｃＧＭＰ生成を測定し、そしてそれぞれ、ｃＡＭＰ ＥＣ２００およびｃＧＭＰ ＥＣ２００を計算することを含み、ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が、同一のアッセイ条件下でのパパベリンの投与によって生じる比に匹敵する場合、該剤をＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定する、前記方法を特徴とする。
【０００８】
好ましくは、線条体中型有棘ニューロンは、初代培養ニューロンとして調製され、アデニル酸シクラーゼはフォルスコリンによって活性化され、グアニル酸シクラーゼはニトロプルシド・ナトリウムによって活性化され、そしてｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００比は１．７５−５．２５の範囲、より好ましくは、３．０−４．０の範囲にある。好ましくは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの濃度は、シンチレーション近接アッセイによって測定される。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを評価するのに用いるニューロンが、別個の試料中にあることが好ましい。さらに、剤がまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されることが好ましい。あるいは、剤は、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定される。
【０００９】
別の側面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離または精製ポリペプチドを特徴とする。
関連する側面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列、および／または配列番号１のコード配列を含む、単離または精製ポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１０】
本発明はまた、配列番号１のコード配列を含むベクター、および配列番号１のコード配列を発現する宿主細胞も特徴とする。
さらに、本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を調節する剤を同定する方法であって、剤を、配列番号２を含むラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドと接触させ、そして該ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの活性を測定することを含み、剤の存在下および剤の非存在下での該ＰＤＥ１０Ａポリペプチド活性間の相違が、該剤がＰＤＥ１０Ａ活性を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００１１】
本発明にやはり特徴とされるのは、ＰＤＥ１０Ａ活性を調節する剤を同定する方法であって、剤を、配列番号１のコード配列を発現する宿主細胞と接触させ、そして配列番号１に発現されるＰＤＥ１０Ａポリペプチドの活性を測定することを含み、剤の存在下および剤の非存在下での該ＰＤＥ１０Ａポリペプチド活性間の相違が、該剤がＰＤＥ１０Ａ活性を調節することを示す、前記方法である。
【００１２】
当業者は、本明細書において、本発明を記載する説明および付随する請求項で用いられる用語を、完全に理解するであろう。にもかかわらず、本明細書に別に提供されない限り、以下の用語は、直後に記載されるとおりである。
【００１３】
「ＰＤＥ１０Ａ活性を増加させる剤」は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの生物学的活性を増強するかまたは模倣する分子を指す。こうした剤（すなわちアゴニスト）は、細胞に存在するＰＤＥ１０Ａの量を増加させることによるか、またはＰＤＥ１０Ａポリペプチドの触媒活性を増加させることにより、ＰＤＥ１０Ａの活性を増加させる、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子、あるいは他の化合物または組成物いずれかを含む可能性がある。
【００１４】
「ＰＤＥ１０Ａ活性を減少させる剤」は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの生物学的活性を阻害するかまたは減弱する分子を指す。こうした剤（すなわちアンタゴニスト）は、細胞に存在するＰＤＥ１０Ａポリペプチドの量を減少させることによるか、またはＰＤＥ１０Ａポリペプチドの触媒活性を減少させることにより、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの活性を減少させる、抗ＰＤＥ１０Ａ抗体などのタンパク質、核酸、炭水化物、小分子、あるいは他の化合物または組成物いずれかを含む可能性がある。
【００１５】
「対立遺伝子変異体」は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする遺伝子の代替型である。対立遺伝子変異体は、核酸配列中の少なくとも１つの突然変異から生じる可能性があり、そして改変ｍＲＮＡ、あるいは構造または機能が改変されているかまたは改変されていないポリペプチドを生じる可能性がある。遺伝子は、その天然存在型の対立遺伝子変異体をまったく持たないか、１つ、または多く持つ可能性がある。対立遺伝子変異体を生じさせる一般的な突然変異変化は、一般的に、ヌクレオチドの天然発生欠失、付加、または置換の結果であるとみなされる。これらの種類の変化は各々、単独で、または他と組み合わせて、既定の配列で、一回または多数回、生じる可能性がある。
【００１６】
ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする「改変」核酸配列は、欠失、挿入、または異なるヌクレオチドでの置換を持つ配列を含み、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの少なくとも１つの機能上の特性を持つポリペプチドを生じる。この定義内に含まれるのは、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、容易に検出可能である可能性も、または検出可能でない可能性もある多型である。コードされるタンパク質もまた、「改変されて」いる可能性があり、そしてサイレント変化を生じ、そして既知のＰＤＥ１０Ａポリペプチドに機能上、実質的に同等であるＰＤＥ１０Ａポリペプチドを生じる、１以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含む可能性がある。ＰＤＥ１０Ａポリペプチドが、例えば触媒または免疫学的活性において、機能上、実質的に同等である限り、残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行ってもよい。
【００１７】
「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産生に関する。これは、一般的に、当該技術分野に公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。
ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００値は、パパベリン値の５０％以下で異なる場合、パパベリンによって産生されるものに「匹敵」する。
【００１８】
既定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む「組成物」は、乾燥処方または水性溶液を含んでもよい。
「保存的アミノ酸置換」は、行われた場合、元来のタンパク質の特性に最も少なく干渉する、すなわちタンパク質の構造および特に機能が保存され、そしてこうした置換によって有意に変化しない置換である。保存的アミノ酸置換の例には、以下が含まれる：ＧｌｙまたはＳｅｒで置換されるＡｌａ；ＨｉｓまたはＬｙｓで置換されるＡｒｇ；Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓで置換されるＡｓｎ；ＡｓｎまたはＧｌｕで置換されるＡｓｐ；ＡｌａまたはＳｅｒで置換されるＣｙｓ；Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓで置換されるＧｌｎ；Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓで置換されるＧｌｕ；Ａｌａで置換されるＧｌｙ；Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕで置換されるＨｉｓ；ＬｅｕまたはＶａｌで置換されるＩｌｅ；ＩｌｅまたはＶａｌで置換されるＬｅｕ；Ａｒｇ、Ｇｌｎ，またはＧｌｕで置換されるＬｙｓ；ＬｅｕまたはＩｌｅで置換されるＭｅｔ；Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒで置換されるＰｈｅ；ＣｙｓまたはＴｈｒで置換されるＳｅｒ；ＳｅｒまたはＶａｌで置換されるＴｈｒ；ＰｈｅまたはＴｙｒで置換されるＴｒｐ；Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐで置換されるＴｙｒ；およびＩｌｅ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒで置換されるＶａｌ。保存的アミノ酸置換は、一般的に、（ａ）例えばベータシートまたはアルファらせんコンホメーションとしての、置換領域においてポリペプチド主鎖の同一のまたは本質的に同一の構造、（ｂ）置換部位での、分子の同一のまたは本質的に同一の荷電または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の同一のまたは本質的に同一の大きさ（ｂｕｌｋ）を維持する。
【００１９】
用語「誘導体」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の化学的修飾を指す。ポリヌクレオチド配列の化学的修飾は、例えば、アルキル、アシル、ヒドロキシル、またはアミノ基による水素の置換を含む可能性がある。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、由来するポリペプチドの少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持する、グリコシル化、ペグ化、または他のいずれかの過程によって修飾されたものである。
【００２０】
「断片」は、親配列と配列が同一であるが、親配列より長さが短い、ＰＤＥ１０ＡポリペプチドまたはＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのユニークな部分である。プローブ、プライマー、抗原、療法分子として、または他の目的のため用いる断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０、または少なくとも５００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってもよい。断片は、分子の特定の領域を優先的に選択しても、または欠いていてもよい。
【００２１】
用語「同一性」は、相補性の度合いを指す。部分的類似性または完全同一性がある可能性がある。用語「同一性」を、用語「類似性」で代用することが可能である。同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する、部分的相補配列は、「実質的に類似」と称される。完全相補配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、減少したストリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、およびそれらに匹敵するもの）を用いて、調べることが可能である。実質的に類似の配列またはハイブリダイゼーションプローブは、減少したストリンジェンシーの条件下で、完全類似（同一）配列の標的配列への結合に競合し、そして該結合を阻害するであろう。これは、減少したストリンジェンシーの条件が、非特異的結合を許すということではない。むしろ、減少したストリンジェンシーの条件は、２つの配列の互いへの結合が、特異的な（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は、部分的な度合いの相補性（例えば約３０％未満の類似性または同一性）さえ欠く第二の標的配列の使用によって、試験することが可能である。非特異的結合の非存在下では、実質的に類似の配列またはプローブは、第二の非相補標的配列にハイブリダイズしないであろう。
【００２２】
ポリヌクレオチド配列に適用されるような、句「同一性パーセント」および「同一性％」は、標準化アルゴリズムを用いて並列された、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間での残基マッチの割合を指す。２つの配列間の並列を最適化するため、こうしたアルゴリズムは、標準化され、そして再現可能な方式で、比較される配列中にギャップを挿入し、そしてそれによって２つの配列のより意義のある比較を達成することが可能である。ポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）バージョン３．１２ｅ配列並列プログラムに取り込まれるような、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いて、決定することが可能である。このプログラムは、分子生物学的解析プログラムの組である、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）の一部である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３， １９８９およびＨｉｇｇｉｎｓら， ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９， １９９２に記載される。同一性パーセントは、並列ポリヌクレオチド配列対間の「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖに報告される。あるいは、一般的に用いられ、そして無料で入手可能な配列比較アルゴリズムの組が、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）基本的局所並列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０， １９９０）に提供され、これはＮＣＢＩ、メリーランド州ベセスダ、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／を含む、いくつかの供給源から入手可能である。ＢＬＳＡＴソフトウェア組は、既知のポリヌクレオチド配列を、多様なデータベース由来の他のポリヌクレオチド配列と並列するのに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、多様な配列解析プログラムを含む。やはり入手可能なのは、２つのヌクレオチド配列の直接対比較に用いられる、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールである。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで評価し、そして対話式に用いることが可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎおよびｂｌａｓｔｐ両方に用いることが可能である（以下に論じられる）。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的に、ギャップおよび他のパラメーターをデフォルト設定にして用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するため、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスいずれか、４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．９（１９９９年５月７日）と共にｂｌａｓｔｎを用いることが可能である。同一性パーセントは、例えば特定の配列番号によって定義されるような全定義配列の長さに渡って測定することが可能であるし、あるいは、より短い長さに渡って、例えばより長い定義される配列から取った断片、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、または少なくとも２００の連続するヌクレオチドの断片の長さに渡って測定することが可能である。こうした長さは例のみであり、そして本明細書に示される配列に開示されるいかなる断片長を用いて、同一性パーセントを測定することが可能な長さを説明することも可能である。高い度合いの同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず、遺伝暗号の縮重のため、類似のアミノ酸配列をコードする可能性がある。核酸配列の変化は、この縮重を用いて行い、すべて同一のまたは実質的に同一のＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする、本発明に含まれる多数の核酸配列を産生することが可能であることが理解される。
【００２３】
ポリペプチド配列に適用されるような、句「同一性パーセント」および「同一性％」は、標準化アルゴリズムを用いて並列された、少なくとも２つのポリペプチド配列間の残基マッチの割合を指す。ポリペプチド配列並列法は公知である。いくつかの並列法は、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる。上により詳細に説明される、こうした保存的置換は、一般的に置換部位での疎水性および酸性度を保持し、したがってポリペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチド配列間の同一性パーセントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）配列並列プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）に取り込まれるような、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いて、決定することが可能である。デフォルト残基加重表として、ＰＡＭ２５０マトリックスを選択する。ポリヌクレオチド並列と同様に、同一性パーセントは、並列ポリペプチド配列対間の「パーセント類似性」として、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００２４】
あるいは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア組を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列の対比較のため、デフォルトパラメーターに設定されたｂｌａｓｔｐと共に、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．９（１９９９年５月７日）を用いることが可能である。こうしたデフォルトパラメーターは、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス、スコア＝５０、およびワード長＝３を用いる可能性がある。同一性パーセントは、例えば特定の配列番号によって定義されるような全定義ポリペプチド配列の長さに渡って測定することが可能であるし、あるいは、より短い長さに渡って、例えばより長い定義される配列から取った断片、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１００の連続する残基の断片の長さに渡って測定することが可能である。こうした長さは例のみであり、そして図および配列表を含む、本明細書に示される配列に支持されるいかなる断片長を用いて、同一性パーセントを測定することが可能な長さを記載することも可能である。
【００２５】
「宿主」により、異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされ、そして該ポリヌクレオチドを発現することが可能なトランスジェニック細胞（例えば哺乳動物、細菌、昆虫細胞）または動物（例えば非ヒト哺乳動物）を意味する。
【００２６】
「異種」ポリヌクレオチドは、異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）であるか、または非天然存在であるか、あるいは宿主細胞のゲノムに非天然に配置されるものである。
「ハイブリダイゼーション」は、ポリヌクレオチド鎖が、定義されるハイブリダイゼーション条件下で、塩基対形成を通じて、相補鎖とアニーリングする過程を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が、高い度合いの同一性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容的アニーリング条件下で形成され、そして「洗浄」工程後もハイブリダイズしたままである。洗浄工程は、ハイブリダイゼーション過程のストリンジェンシーを決定するのに特に重要であり、よりストリンジェントな条件は、非特異的結合、すなわち完全にマッチしない核酸鎖の対間の結合を、より可能にしない。核酸配列のアニーリングの許容的条件は、当業者によって日常的に決定可能であり、そしてハイブリダイゼーション実験間で一定である可能性があるが、洗浄条件は、望ましいストリンジェンシー、そしてしたがってハイブリダイゼーション特異性を達成するため、実験間で異なる可能性がある。許容的アニーリング条件は、例えば、約６ｘＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および約１００ｐｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡの存在下で、６８℃で生じる。
【００２７】
一般的に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的に、洗浄工程を行う温度に関連して表す。一般的に、こうした洗浄温度は、定義されるイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より、約５から２０℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（定義されるイオン強度およびｐＨ下）である。核酸ハイブリダイゼーションに関するＴｍおよび条件を計算する等式は公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州プレーンビューに見出すことが可能であり；特にＶｏｌ．２， 第９章を参照されたい。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの高ストリンジェンシー条件は、約０．２−１．０ｘＳＳＣおよび約０．１％ ＳＤＳの存在下、約１時間での約５５−６８℃の洗浄条件を含む。
【００２９】
一般的に、ハイブリダイゼーション反応は、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行うことが可能である。ＳＳＣ濃度は、約０．１から２ｘＳＳＣまで多様であってもよく、ＳＤＳは約０．１％で存在する。典型的には、ブロッキング試薬を用いて、非特異的ハイブリダイゼーションをブロッキングする。こうしたブロッキング試薬には、例えば、約１００−２００ｐｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡが含まれる。約３５−５０％ ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶媒もまた、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの特定の条件下で用いることが可能である。これらの洗浄条件の有用な変動は、一般の当業者に容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェンシー条件下で、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し、ヌクレオチドおよびそのコードするポリペプチドが類似の役割を持つことを強く示す。
【００３０】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補塩基間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間で形成される複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液に存在する配列間で形成されるか、または溶液に存在する１つの核酸配列および固体支持体（例えば紙、膜、フィルター、チップ、ピンまたはガラススライド）上に固定される別の核酸配列の間で形成される可能性がある。
【００３１】
「単離または精製」により、「人の手によって」天然状態から変化したことを意味する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に存在する場合、その元来の環境から変化したおよび／または除去されたとき、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離または精製」されている。例えば、「単離または精製」ポリヌクレオチドは、天然に関連する他のポリヌクレオチドから分離されている。例えば、通常、コード配列と関連しているイントロン配列が除去されているｃＤＮＡ配列は、「単離または精製」されている。「単離または精製」ポリヌクレオチド配列は、一過性または安定発現のため、培養中の宿主細胞または全生物に導入され、そしてそれでもなお「単離および精製」されていることが可能である。これは、ポリヌクレオチドがその天然存在型または環境にないであろうためである。しかし、ｃＤＮＡライブラリーのメンバーとしてのポリヌクレオチド配列は、「単離または精製」に意味されるものから排除される。「単離または精製」ポリペプチドは、天然に関連する、少なくとも１つの細胞構成要素から分離されている。好ましくは、ポリペプチドは、他の構成要素を少なくとも６０％含まず、より好ましくは、少なくとも７５％含まず、そして最も好ましくは、少なくとも９０％含まない。
【００３２】
「調節」により、増加または減少（完全除去を含む）を意味する。
「機能可能であるように連結された」は、第一の核酸配列が、第二の核酸配列と機能する関連に置かれる状況を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の転写を制御するよう機能する場合、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に、機能可能であるように連結されたＤＮＡ配列は、ごく近接してまたは連続して、そして２つのタンパク質コード領域を連結することが必要である場合、同一読み枠にある可能性がある。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」は、一般的に、制限なしに、一本鎖、二本鎖、および三本鎖配列、センスまたはアンチセンス鎖、ヌクレオチド類似体を用いて生成された配列、ＲＮＡおよびＤＮＡを含むハイブリッド分子、並びに修飾塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡを含む、いかなるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、ＲＮＡ様、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡまたはゲノム）、またはＤＮＡ様配列も指す。ポリヌクレオチドは、天然存在であってもまたは合成であってもよい。
【００３４】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、あるいはこれらのいずれかの断片を指し、そして天然存在または合成分子を指す。該用語は、翻訳後プロセシングなどの天然過程によって、または当該技術分野に公知の化学的修飾によって、修飾されたアミノ酸配列を含む（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ニューヨーク州ニューヨーク， 第２版， １９９３； Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｊｏｈｎｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州ニューヨーク， １９８３； Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８２：６２６−４６， １９９０；およびＲａｔｔａｎら， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２， １９９２を参照されたい）。既知の修飾には、限定されるわけではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体、あるいはホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、シスチンまたはピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などの、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ仲介付加が含まれる。
【００３５】
「ＰＤＥ１０Ａ活性」により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕの、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰのＰＤＥ１０Ａ仲介加水分解を意味する。
「選択的」ＰＤＥ１０Ａ阻害剤により、他のＰＤＥ類の阻害に関して観察されるより、少なくとも１０倍低いＩＣ５０で、ＰＤＥ１０Ａ活性を阻害する剤を意味する。
【００３６】
「置換」は、それぞれ、１以上のアミノ酸またはヌクレオチドの、異なるアミノ酸またはヌクレオチドでの置換を指す。
アデニル酸シクラーゼまたはグアニル酸シクラーゼを「最大以下」に活性化することは、化合物の最大有効濃度によって生じる値の、約１０−５０％、好ましくは、約２０−２５％である、それぞれ、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの増加を達成する濃度の化合物を投与することを意味する。
【００３７】
「形質転換」または「トランスフェクション」は、異種ＤＮＡがレシピエント細胞に進入し、そして該細胞が該異種ＤＮＡを発現することを可能にする、遺伝的修飾過程を説明する。形質転換は、当該技術分野に公知の多様な方法にしたがって、原核または真核宿主細胞で起こることが可能である。方法は、形質転換される宿主細胞の種類に基づいて選択され、そして限定されるわけではないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、および粒子銃を含む。用語「形質転換細胞」または「トランスフェクション細胞」は、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部として複製することが可能である安定形質転換細胞と共に、限定される期間、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを発現する、一過性形質転換またはトランスフェクション細胞を含む。こうした形質転換またはトランスフェクション細胞はすべて、「トランスジェニック」と称される。
【００３８】
特定の核酸配列の「変異体」は、デフォルトパラメーターに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．９と共にｂｌａｓｔｎを用いて、核酸配列の１つの特定の長さに渡って、特定の核酸配列に少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列と定義される。こうした配列は、特定の定義される長さに渡って、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、またはそれ以上の配列同一性を示す可能性がある。変異体は、例えば、「対立遺伝子」（上に定義されるとおり）、「スプライシング」、「種」、または「多型」変異体と記載することが可能である。スプライシング変異体は、参照分子に有意な同一性を有する可能性があるが、一般的に、ｍＲＮＡプロセシング中のエクソンの選択的スプライシングのため、より多いかまたはより少ない数のポリヌクレオチドを有するであろう。対応するポリペプチドは、さらなる機能ドメインを持つか、または参照分子に存在するドメインを欠く可能性がある。種変異体は、１つの種から別のもので異なるポリヌクレオチド配列である。生じるポリペプチドは、一般的に、互いに比較して、有意なアミノ酸同一性を有するであろう。多型変異体は、既定の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中の変異である。多型変異体はまた、ポリヌクレオチド配列が一ヌクレオチド塩基異なる、「一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）を含む可能性もある。ＳＮＰの存在は、例えば、特定の集団、疾患状態、または疾患状態の性向（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）を示す可能性がある。
【００３９】
本発明の他の特徴および利点は、続く詳細な説明および請求項から明らかであろう。本発明は、特定の態様と関連して記載されるが、実施することが可能である他の変化および修飾もまた、本発明の一部であり、そしてまた、付随する請求項の範囲内でもあることが理解されるであろう。本明細書は、一般的に、本発明の原理にしたがう、本発明のいかなる同等物、変形、使用、または適応も含むよう意図され、既知のまたは当該技術分野内で習慣的な実施の範囲内であり、そして過度の実験なしに確かめることが可能である、本開示からの逸脱を含む。核酸およびポリペプチドを作成し、そして使用することに関するさらなる手引きは、分子生物学、タンパク質科学、および免疫学の標準的教科書に見られる（例えばＤａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク， １９８６； Ｈａｍｅｓら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＩＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓを参照されたい）。本明細書に言及されるすべての刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【発明の実施の形態】
【００４０】
本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を阻害する剤を細胞レベルで同定するため、線条体中型有棘ニューロンを用いた、細胞に基づくスクリーニングアッセイを提供する。線条体中型有棘ニューロンにおいて高レベルのＰＤＥ１０Ａが確認されたことを考慮すると（以下の実施例１にさらに記載されるとおり）、これらの細胞は、ＰＤＥ１０Ａ活性の阻害剤を同定する、細胞に基づくアッセイで使用するための、優れた候補である。こうした阻害剤は、例えば、米国仮出願６０／２８５，１４８にさらに記載されるように、運動または気分、不安、精神病、薬剤嗜癖、および症状欠損認知の障害を治療するのに有用である。本発明はまた、ラットＰＤＥ１０Ａポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も特徴とする。
ＰＤＥ１０Ａ阻害剤を同定する、細胞に基づくアッセイ
本発明の細胞に基づくアッセイは、以下の実施例にさらに記載される、２つの発見に由来する。第一に、パパベリンは、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤である。そして第二に、線条体中型有棘ニューロンへのパパベリンの投与は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルにユニークな変化プロフィールを生じる。このユニークなプロフィールは、線条体中型有棘ニューロンの環状ヌクレオチドに同一の組み合わせの変化を生じる他の剤もまた、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定されることを示す。
【００４１】
アッセイを行うため、哺乳動物線条体中型有棘ニューロンを用いる。この細胞は、初代培養として調製することが可能である（例えばＶｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ７：２１３−２２， １９９５を参照されたい）。あるいは、線条体中型有棘ニューロン不死化細胞株を用いることが可能である（Ｅｈｌｉｃｈら， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １６７：２１５−２６， ２００１； ＣａｔｔａｎｅｏおよびＣｏｎｔｉ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ． ５３：２２３−３４， １９９８； Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５：６７６−８８， １９９５）。
【００４２】
初代細胞培養では、ニューロンは、哺乳動物胚（例えばＥ１７ラットまたはマウス胚）から脳を切除し、該組織を単細胞懸濁物に解離させ、そしてマルチウェルプレートなどの適切な容器に、細胞を蒔くことによって、調製する。望ましい場合、調製中の線条体中型有棘ニューロンの存在は、ＧＡＢＡ免疫反応性を試験することによって、決定することが可能であり（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら、上記）、そしてＰＤＥ１０Ａの発現は、例えば、ウェスタンブロットまたはＲＮアーゼ保護アッセイによって、確認することが可能である（以下の実施例３を参照されたい）。
【００４３】
アッセイプロトコルの１つの例は以下のとおりである。ｉｎ ｖｉｔｒｏで４−５日の線条体中型有棘ニューロン（例えばラット）の初代細胞培養を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、そして３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌデキストロース、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝生理食塩水中で、およそ１時間プレインキュベーションする。その後、同一緩衝液中で、試験剤を細胞と、３７℃でおよそ２０分間インキュベーションする。
【００４４】
ｃＡＭＰの変化に関して試験するため、ニューロン培養はまた、アデニル酸シクラーゼを刺激する化合物の最大以下の濃度（例えば１μＭフォルスコリン）ともインキュベーションする。ｃＧＭＰの変化に関して試験するため、ニューロン培養は、グアニル酸シクラーゼを刺激する化合物の最大以下の濃度（例えば１００μＭニトロプルシド・ナトリウム（ＳＮＰ））とインキュベーションする。環状ヌクレオチドの生成を刺激する化合物の最大以下の濃度は、最大有効濃度の１０−５０％、好ましくは、２０−２５％を生成する濃度である。化合物は、試験剤インキュベーション中、または試験剤インキュベーションに続く期間（例えば１−５分間）、投与してもよい。
【００４５】
細胞を溶解し、そして標準法を用いて、細胞溶解物中の適切なｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルを測定する。例えば、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルは、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）キット（それぞれ、カタログ番号ＲＰＡ ５４０およびＲＰＡ ５５９、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて測定することが可能である。ＥＣ２００値を決定することが可能であるように、多様な濃度で試験剤を研究する。ＥＣ２００は、試験剤で処理されていない細胞由来の溶解物中で測定されるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのレベルに比較した際、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰレベルを２００％増加させる試験剤の濃度と定義される。理想的には、細胞の別個の試料を用いて、シクラーゼを刺激し、そして環状ヌクレオチドレベルを評価する。しかし、アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼの刺激は、単一試料の細胞中で行ってもよく、細胞溶解物を２つの試料に分割し、そしてその後、これらの２つの溶解物中で、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを別個に測定してもよい。
【００４６】
線条体中型有棘ニューロンおよび上述の典型的なアッセイ条件を用いる際、試験剤が、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの増加を引き起こし、ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が１．７５−５．２５、好ましくは２．５−４．５、より好ましくは３．０−４．０の範囲である場合に、試験剤はＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定される。特定の細胞またはアッセイ条件が上記と異なる場合、剤がＰＤＥ１０Ａ阻害剤であることを示すｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の範囲は、適切な条件下で、パパベリンを陽性対照として試験することによって、決定することが可能である。剤は、パパベリンに関する値と匹敵する（すなわち相違が５０％以下である）ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比を生じる場合、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定される。
【００４７】
本発明のアッセイ法は、別の標準的細胞調製プロトコル（ＭｉｓｇｅｌｄおよびＤｉｅｔｚｅｌ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４９２：１４９−５７， １９８９； ＳｈｉおよびＲａｙｐｏｒｔ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １４：４５４８−６０， １９９４； ＭａｏおよびＷａｎｇ， Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ． Ｒｅｓ． ８６：１２５−３７， ２００１； Ｓｎｙｄｅｒら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０：４４８０−８８， ２０００）、環状ヌクレオチド形成を刺激する別の標準法（Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎら， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８４：２２３−２８， １９９８； ＧｌａｓｓおよびＦｅｌｄｅｒ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：５３２７−３３， １９９７）、および／または環状ヌクレオチド検出の別の標準法（ＶｉｌｌｅｇａｓおよびＢｒｕｎｔｏｎ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３５：１０２−３， １９９６； Ｃｏｒｂｉｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５９：７４−８２， １９８８）を用いることが可能である。
【００４８】
本発明の細胞に基づくアッセイは、ＰＤＥ１０Ａ阻害に関して、先行する情報がまったく知られていない試験剤に対して行ってもよいが、細胞に基づくアッセイは、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定される剤が、細胞レベルでもやはりＰＤＥ１０Ａを阻害することを確認する二次アッセイとして用いることが好ましい。好ましくは、剤は、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏプレスクリーニングの代替法として、剤はまた、細胞に基づくアッセイで同定された後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と確認することも可能である。
【００４９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、剤は、ＰＤＥ１０Ａ以外のＰＤＥ類阻害のＩＣ５０が、ＰＤＥ１０Ａ阻害のＩＣ５０より、少なくとも１０倍大きい場合、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されるであろう。匹敵するＩＣ５０値を達成するため、ＰＤＥアッセイはすべて、各酵素に関する環状ヌクレオチドのＫｍに同等に比例する環状ヌクレオチド基質濃度で行う。ＰＤＥ１０Ａ選択的調節因子を同定するスクリーニングの１つの種類は、組織から単離された天然酵素、あるいはトランスフェクションされた宿主細胞、例えばＳｆ９昆虫細胞（Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）、酵母細胞（Ｌｏｕｇｈｎｅｙら、米国特許第５，９３２，４６５号）、またはＣＯＳ−７細胞（Ｙｕａｓａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：３１４６９−７９， ２０００）から単離された組換え酵素を用いる。好ましくは、ＰＤＥ１０Ａ酵素は、ヒト（例えばＬｏｕｇｈｎｅｙら、米国特許第５，９３２，４６５号、Ｌａｎｆｅａｒら、ＥＰ ９６７２８４）、マウス（例えばＬａｎｆｅａｒら、ＥＰ ９６７２９４）、またはラット（例えば配列番号２）である。
【００５０】
ＰＤＥ１０Ａ活性は、例えば、適切な基質、［３Ｈ］ｃＡＭＰまたは［３Ｈ］ｃＧＭＰの加水分解速度として測定される。この活性は、例えば、ＳＰＡに基づく方法（Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００； Ｐｈｉｌｌｉｐｓら， ＷＯ ００／４０７３３、およびＴｈｏｍｐｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８：５２２８， １９７９（製品コードＴＲＫＱ７０９０／７１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ’ｌ Ｌｔｄ．， 英国バックハムシャーを用いて修飾されるようなもの））によって測定される。簡潔には、ＰＤＥ１０Ａ酵素を含む試料を、一部（例えば１／４から１／２）が３Ｈ標識（Ａｍｅｒｓｈａｍ）されている、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）と接触させる。反応は、例えば、マイクロタイタープレート（例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ（登録商標）プレート、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バージニア州シャンティリー）中で行い、そして過剰な非標識環状ヌクレオチドを含むケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加によって終結させる。ビーズを暗所で安定させた後、マイクロタイタープレート読み取り装置（例えばＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）、Ｐａｃｋａｒｄ、コネティカット州メリデン）によって読み取る。
【００５１】
ＰＤＥ１０Ａ活性はまた、３２Ｐ−ｃＡＭＰまたは３２Ｐ−ｃＧＭＰから放出される３２Ｐ−リン酸の検出によって（例えばＬｏｕｇｈｎｅｙら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：７９６−８０６， １９９６、およびＬｏｕｇｈｎｅｙ、米国特許第５，９３２，４６５号に記載されるとおり）、あるいはＰＤＥ基質、ｃＧＭＰまたはｃＡＭＰ、およびその加水分解産物間を区別する抗体を用いて（例えばＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ技術、ＮＥＮ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ボストンを用いて）、アッセイすることも可能である。
【００５２】
ＰＤＥ１０Ａ触媒活性をアッセイする代替法として、剤が、例えば、翻訳後修飾（例えばリン酸化）、アロステリックリガンド結合の修飾（例えばＧＡＦドメイン（Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）を介して）を介して、あるいはＰＤＥ１０Ａ自体に触媒またはアロステリック制御部位で結合することによって、ＰＤＥ１０Ａ触媒活性を間接的に調節する場合、剤をＰＤＥ１０Ａ陽性調節因子または陰性調節因子（アンタゴニスト）と同定することが可能である。ＰＤＥ１０Ａリン酸化およびアロステリックリガンド結合を決定する方法は、文献に記載されている（例えばＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：３０６７１−７９， １９９５およびＣｏｒｂｉｎら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：２７６０−６７， ２０００を参照されたい）。
【００５３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングおよび細胞に基づく本発明のアッセイに用いられる試験剤は、個々に選択してもよいし、または化合物ライブラリーから得てもよい。こうした剤には、ペプチド、Ｄおよび／またはＬ配置アミノ酸で作成されるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリー、リンペプチド、抗体、並びに小有機および無機化合物が含まれる。ライブラリーには、生物学的ライブラリー、天然化合物ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に耐性であり、なお生理活性を保持する、新規の非ペプチド主鎖を持つ分子のライブラリー）（例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８−８５， １９９４を参照されたい）、空間的にアドレス呼び出し可能な平行固相または溶液相ライブラリー、デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法が含まれる。
【００５４】
分子ライブラリーの合成法の例は、当該技術分野において、例えばＤｅＷｉｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０：６９０９， １９９３； Ｅｒｄら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：１１４２２， １９９４； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８， １９９４； Ｃｈｏら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６１：１３０３， １９９５； Ｃａｒｒｅｌｌら， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１， １９９４；およびＧａｌｌｏｐら， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３， １９９４に見出すことが可能である。
【００５５】
化合物ライブラリーは、溶液中に（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３：４１２−４２１， １９９２）、またはビーズ上に（Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４１， １９９１）、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６， １９９３）、細菌または胞子上に（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上に（Ｃｕｌｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：１８６５−１８６９， １９９２）、またはファージ上に（Ｓｃｏｔｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６， １９９０； Ｃｗｉｒｌａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：６３７８−６３８２， １９９０； Ｆｅｌｉｃｉ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０， １９９１； Ｌａｄｎｅｒ、上記）、存在していてもよい。
ラットＰＤＥ１０Ａのヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列
本発明は、例えば図１Ｂ（配列番号２）に示されるような、単離または精製ラットＰＤＥ１０Ａ配列を含む。
【００５６】
本発明はまた、例えば図１Ａに示されるような、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするヌクレオチドコード配列も含む。
ラットＰＤＥ１０Ａをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用し、そしてプロモーターおよび制御要素などの上流配列を検出するため、当該技術分野に知られるＰＣＲに基づく多様な方法を使用して、伸長することが可能である。例えば、使用することが可能な１つの方法、制限部位ＰＣＲは、クローニングベクター内のゲノムＤＮＡから、未知の配列を増幅するのに、普遍的および入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを用いる（例えばＳａｒｋａｒ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２， １９９３を参照されたい）。別の方法、逆ＰＣＲは、環状化テンプレートから未知の配列を増幅するのに、異なる方向で伸長するプライマーを用いる。テンプレートは、既知の遺伝子座および周囲配列を含む制限断片に由来する（例えばＴｒｉｇｌｉａら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６， １９８８を参照されたい）。第三の方法、捕捉ＰＣＲは、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を伴う（例えばＬａｇｅｒｓｔｒｏｍら， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． １：１１１−１１９， １９９１を参照されたい）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、多数の制限酵素消化および連結を用いて、操作された二本鎖配列を、未知の配列の領域に挿入することが可能である。
【００５７】
本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞中で、ラットＰＤＥ１０Ａの発現を指示する組換えＤＮＡ分子にクローニングすることが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、限定されるわけではないが、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現の修飾を含む、多様な目的のため、ＰＤＥ１０Ａコード配列を改変するために、当該技術分野に一般的に知られる方法を用いて、操作することが可能である。
【００５８】
ランダム断片化、並びに遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てによるＤＮＡシャッフリングを用いて、ヌクレオチド配列を操作することが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を生成し、グリコシル化パターンを改変し、コドン優先性を変化させ、スプライシング変異体を生じるなどの突然変異を導入することが可能である。別の態様において、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列を、当該技術分野に公知の化学的方法を用いて、すべてまたは部分的に合成することが可能である（例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５−２２３， １９８０；およびＨｏｒｎら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５−２３２， １９８０を参照されたい）。あるいは、ラットＰＤＥ１０Ａ自体またはその断片を、化学的方法を用いて合成することが可能である。例えば、多様な固相技術を用いて、ペプチド合成を行うことが可能である（例えばＲｏｂｅｒｇｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４， １９９５を参照されたい）。自動化合成は、ＡＢＩ ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネティカット州ノーウォーク）を用いて達成することが可能である。さらに、ラットＰＤＥ１０Ａのアミノ酸配列またはそのいずれかの部分は、直接合成中、改変して、そして／または他のタンパク質またはそのいずれかの部分由来の配列と組み合わせて、変異ポリペプチドを産生することが可能である。ペプチドは、分離用高性能液体クロマトグラフィーによって、実質的に精製することが可能である（例えばＣｈｉｅｚおよびＲｅｇｎｉｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１， １９９０を参照されたい）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸解析によって、または配列決定によって、確認することが可能である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， ニューヨーク州ニューヨーク １９８４を参照されたい）。
発現ベクターおよび宿主細胞
生物学的に活性があるラットＰＤＥ１０Ａを発現させるため、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち適切な宿主中での挿入コード配列の転写および翻訳調節に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。これらの要素には、エンハンサー、恒常性および誘導性プロモーターなどの制御配列、並びにベクターおよび／またはラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチド配列由来の５’および３’非翻訳領域が含まれる。こうした要素は、その強度および特異性が異なる可能性がある。特定の開始シグナルもまた用いて、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することが可能である。こうしたシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列、例えばコザック配列が含まれる。ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列、並びにその開始コドンおよび上流制御配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要とされない可能性がある。しかし、コード配列またはその断片のみが挿入される場合、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルが、ベクターに提供されるべきである。外因性翻訳要素および開始コドンは、天然および合成両方の多様な起源のものであってもよい。発現効率は、用いる特定の宿主細胞系に適したエンハンサーの包含によって、増進することが可能である（例えばＳｃｈａｒｆら， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２， １９９４を参照されたい）。当業者に公知の方法を用いて、本開示に照らし、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列、並びに適切な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州プレーンビュー， 第４， ８，および１６−１７章， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク， 第９， １３，および１６章， １９９５を参照されたい）。多様な発現ベクター／宿主系を利用して、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列を含ませそして発現させることが可能である。これらには、限定されるわけではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクター（例えばエピソーム、染色体要素）で形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、パポナウイルス（ｐａｐｏｎａｖｉｒｕｓ）、ワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、およびレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ））に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＣａＭＶ、またはタバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＴＭＶ）、細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が含まれる。本発明は、使用される宿主細胞によって制限されない。
【００５９】
細菌系において、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチド配列に意図される使用に応じて、いくつかのクローニングおよび発現ベクターを選択することが可能である。例えば、ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、および増殖は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）またはｐＳｐｏｒｔ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）などの多機能大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ベクターを用いて、達成することが可能である。ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列を、ベクターのマルチクローニングサイトに連結すると、ｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能になる。さらに、これらのベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシ配列決定、ヘルパーファージを用いた一本鎖レスキュー、およびクローニングされた配列における入れ子欠失の生成に有用である可能性がある（例えばＶａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９， １９８９を参照されたい）。例えば抗体産生のため、多量のＰＤＥ１０Ａポリペプチドが必要とされる場合、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの高レベル発現を指示するベクターを用いてもよい。例えば、強い誘導性Ｔ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを用いてもよい。
【００６０】
組換えタンパク質発現は、宿主細胞が、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれている遺伝的背景を提供することによって、宿主細菌中で最大にすることが可能である（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎら， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：１１９−２８， １９９０）。あるいは、ポリヌクレオチド配列を改変して特定の宿主細胞、例えば大腸菌の優先的なコドン利用を提供することが可能である（Ｗａｄａら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−１８， １９９２）。
【００６１】
酵母発現系において、アルファ因子、アルコール酸化酵素、またはＰＧＨプロモーターなどの恒常性または誘導性プロモーターを含む、いくつかのベクターは、例えば、酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で用いることが可能である。さらに、こうしたベクターは、発現されたタンパク質の分泌または細胞内保持いずれかを指示し、そして安定した増殖のため、宿主ゲノムへの異質の配列の組込みを可能にする（例えばＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５； Ｂｉｔｔｅｒら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４， １９８７；およびＳｃｏｒｅｒら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４， １９９４を参照されたい）。植物系もまた、ラットＰＤＥ１０Ａ発現に用いることが可能である。ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガ・リーダー配列と組み合わせて用いられる、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターによって駆動することが可能である（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１， １９８７）。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを用いることが可能である（例えばＣｏｒｕｚｚｉら， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０， １９８４； Ｂｒｏｇｌｉｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３， １９８４；およびＷｉｎｔｅｒら， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５， １９９１を参照されたい）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体仲介トランスフェクションによって、植物細胞に導入することが可能である（例えばＴｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， ニューヨーク州ニューヨーク， ｐｐ．１９１−１９６， １９９２を参照されたい）。
【００６２】
哺乳動物細胞において、ウイルスに基づくいくつかの発現系を利用することが可能である。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列からなる、アデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結することが可能である。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入を用いて、感染した宿主細胞においてラットＰＤＥ１０Ａを発現する、感染性ウイルスを得ることが可能である（例えばＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９， １９８４を参照されたい）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることが可能である。ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターもまた、高レベルタンパク質発現に用いることが可能である。
【００６３】
ＨＡＣ、ＢＡＣ、またはＹＡＣもまた、プラスミドに含まれそしてプラスミドから発現されることが可能なＤＮＡの巨大断片を搬送するのに使用することが可能である。例えば、療法目的のため、約６ｋｂから１０ＭｂのＨＡＣを構築し、そして慣用的な搬送法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞）を介して搬送する（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５， １９９７を参照されたい）。哺乳動物系における組換えタンパク質の長期間の産生には、細胞株中のラットＰＤＥ１０Ａの安定発現が好ましい。例えば、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列は、同一または別個のベクター上に、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を含んでもよい発現ベクターを用いて、細胞株に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に、栄養強化培地中で、約１から２日間、増殖させてもよい。選択可能マーカーの目的は、選択剤への耐性を与えることであり、そしてこのマーカーの存在は、導入配列の発現に成功した細胞の増殖および回収を可能にする。安定形質転換細胞の耐性クローンは、細胞種に適した組織培養技術を用いて、増殖させることが可能である。
【００６４】
本発明はまた、本明細書に記載される核酸配列が、逆方向でベクターにクローニングされるが、制御配列に機能可能であるように連結され、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にするベクターも含む。したがって、コード領域および非コード領域両方を含む、本明細書に記載される核酸分子配列のすべて、または一部に対して、アンチセンス転写物を産生することが可能である。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関連して上に記載されるパラメーター各々にしたがう。
【００６５】
いかなる数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収してもよい。これらには、限定されるわけではないが、それぞれ、ＴＫ−およびＡＰＲ−細胞において使用するための、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）チミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる（例えばＷｉｇｌｅｒら， Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２， １９９７； Ｌｏｗｙら， Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３， １９８０を参照されたい）。また、代謝拮抗剤、抗生物質、または除草剤耐性を、選択の基礎として用いることが可能である。例えば、Ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与え；Ｎｅｏはアミノ配糖体、ネオマイシンおよびＧ−４１８への耐性を与え；そしてＡｌｓおよびＰａｔは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼへの耐性を与える（例えばＷｉｇｌｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０， １９８０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４， １９８１を参照されたい）。代謝産物への細胞要求を改変する、さらなる選択可能遺伝子、例えばＴｒｐＢおよびＨｉｓＤが記載されている（例えばＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７−８０５１， １９８８を参照されたい）。視覚的マーカー、例えばアントシアニン類、緑色蛍光タンパク質類（ＧＦＰ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、β−グルクロニダーゼおよびその基質β−グルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンを用いることが可能である。これらのマーカーは、形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性または安定タンパク質発現の量を定量化するためにも用いることが可能である（例えばＲｈｏｄｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１， １９９５を参照されたい）。マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在することを示唆するが、遺伝子の存在および発現を確認する必要はない可能性がある。例えば、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定することが可能である。あるいは、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの調節下で、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列と共に、タンデムに置くことが可能である。誘導または選択に反応したマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデムなＰＤＥ１０Ａ配列の発現もまた示す。
【００６６】
一般的に、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする核酸配列を含み、そしてラットＰＤＥ１０Ａを発現する宿主細胞は、当業者に知られる多様な方法によって、同定することが可能である。これらの方法には、限定されるわけではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、およびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が含まれ、これは、核酸またはタンパク質配列の検出および／または定量化のための、膜、溶液、またはチップに基づく技術を含む。
【００６７】
特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体いずれかを用いて、ＰＤＥ１０Ａの発現を検出し、そして測定するための免疫学的方法が、当該技術分野に知られる。こうした技術の例には、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。これらおよび他のアッセイは、当該技術分野に公知である（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， ミネソタ州セントポール、第ＩＶ項， １９９０； Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ニューヨーク州ニューヨーク， １９９７；およびＰｏｕｎｄ， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー州トトワ， １９９８を参照されたい）。非常に多様な標識およびコンジュゲート化技術が当業者に知られ、そしてこうした技術を、多様な核酸およびアミノ酸アッセイで用いることが可能である。
【００６８】
ラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産生する手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識化ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が含まれる。
【００６９】
あるいは、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列またはその断片いずれかを、ｍＲＮＡプローブを産生するため、ベクターにクローニングすることが可能である。こうしたベクターは、当該技術分野に知られ、商業的に入手可能であり、そしてＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識化ヌクレオチドを添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するのに用いることが可能である。これらの方法は、多様な商業的に入手可能なキット（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ； Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン；およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、オハイオ州クリーブランド）を用いて行うことが可能である。検出を容易にするために用いてもよい、適切なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質、または色素産生剤と共に、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００７０】
ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で、培養することが可能である。形質転換細胞によって産生されたタンパク質は、用いた配列および／またはベクターに応じて、分泌される可能性もまたは細胞内に保持される可能性もある。当業者に理解されるであろうように、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通じて、ラットＰＤＥ１０Ａの分泌を指示するシグナル配列を含むよう、設計することが可能である。さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力、または発現されたタンパク質を望ましい様式でプロセシングする能力に関して、選択することが可能である。ポリペプチドのこうした修飾には、限定されるわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれる。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」型を切断する翻訳後プロセシングもまた、タンパク質標的化、フォールディング、および／または活性を特定するのに用いることが可能である。
【００７１】
翻訳後活性の特定の細胞機構および特徴的機構を有する、異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８）が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手可能であり、そして異質のタンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択することが可能である。本発明の別の態様において、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする、天然、修飾、または組換え核酸配列を、異種配列に連結し、前述の宿主系いずれかにおいて、融合タンパク質の翻訳を生じることが可能である。例えば、商業的に入手可能な抗体によって認識することが可能な異種部分を含む、キメラＰＤＥ１０Ａタンパク質は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチド活性の調節因子に関して、ペプチドライブラリーをスクリーニングするのを容易にすることが可能である。異種タンパク質およびペプチド部分はまた、商業的に入手可能なアフィニティーマトリックスを用いて、融合タンパク質の精製を容易にすることも可能である。こうした部分には、限定されるわけではないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、および赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれる。ＧＳＴ、ＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、および６−Ｈｉｓは、それぞれ、固定化グルタチオン、マルトース、フェニルアルシンオキシド、カルモジュリン、および金属キレート樹脂上での同族（ｃｏｇｎａｔｅ）融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、および赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する、商業的に入手可能なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。融合タンパク質はまた、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドコード配列および異種タンパク質配列の間に位置するタンパク質分解切断部位を含むよう設計して、精製後、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドを異種部分から切断することが可能であるようにすることも可能である。融合タンパク質発現および精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５、上記、第１０章）に論じられる。多様な商業的に入手可能なキットもまた、融合タンパク質の発現および精製を容易にするのに用いることが可能である。
【００７２】
本発明のさらなる態様において、放射標識ラットＰＤＥ１０Ａの合成は、ＴＮＴウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ（ｗｈｅａｔ）胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで達成することが可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーターと、機能可能であるように関連しているタンパク質コード配列の、転写および翻訳をカップリングする。翻訳は、放射標識アミノ酸、例えば３５Ｓ−メチオニンの存在下で行う。
【００７３】
ラットＰＤＥ１０Ａの断片は、組換え手段によってのみでなく、固相技術を用いた直接ペプチド合成によっても、産生することが可能である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記、ｐｐ．５５−６０を参照されたい）。タンパク質合成は、手動技術によって、または自動化によって、行うことが可能である。自動化合成は、例えば、ＡＢＩ（登録商標）４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、達成することが可能である。ラットＰＤＥ１０Ａの多様な断片を別個に合成し、そしてその後、組み合わせて、全長分子を産生することが可能である。
核酸アレイ
本発明は、図１Ａに提供される配列情報に基づく、核酸分子のアレイまたはマイクロアレイなどの核酸検出キットをさらに提供する。
【００７４】
本明細書において、アレイまたはマイクロアレイは、紙、ナイロン、または他の種類の膜、フィルター、チップ、ガラススライド、あるいは他の適切な固体支持体いずれかの上で合成された、別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアレイを指す。１つの態様において、Ｃｈｅｅら、米国特許第５，８３７，８３２号、Ｃｈｅｅら、ＷＯ ９５／１１９９５、Ｌｏｃｋｈａｒｔら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：１６７５−８０， １９９６、Ｓｃｈｅｎａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１９， １９９６に記載される方法にしたがって、マイクロアレイを調製し、そして用いる。他のアレイは、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号、およびＢａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒら、ＷＯ ９５／２５１１６に記載される方法によって産生する。
【実施例】
【００７５】
実施例１：ＰＤＥ１０Ａ発現パターン
ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡは、脳内で、線条体、側坐核、および嗅結節において、先に報告されている（ＬａｎｆｅａｒおよびＲｏｂａｓ、ＥＰ ０９６７２８４）。以下の実験は、これらの知見を確認し、そしてマウスおよびラットにおけるＰＤＥ１０Ａ発現をさらに性質決定する。
【００７６】
脳切片作成
迅速な断頭後、マウスおよびラット脳を収集し、ドライアイス上、イソペンタン中で凍結し、そしてＨａｃｋｅｒ−Ｂｒｉｇｈｔクリオスタット（Ｈａｃｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニュージャージー州フェアフィールド）上で２０μｍの切片に切断した。すべてのレベルのマウスおよびラット脳由来の切片を、あらかじめＶｅｃｔａｂｏｎｄＴＭ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）で被覆したスライド上に融解マウントし、４％パラホルムアルデヒド溶液中で固定し、エタノール中で脱水し、そして使用するまで、気密容器中、４℃で、乾燥剤と共に保存した。
【００７７】
メッセンジャーＲＮＡプローブ生成
マウスＰＤＥ１０Ａ ｃＤＮＡから単離した９１４塩基対断片（塩基対３８０−１２９４に対応する）を含むプラスミドＤＮＡを大腸菌（ＤＨ５α）に挿入し、この菌を懸濁培養で増殖させた。プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）で抽出し、そして使用するまで保存した。アンチセンスプローブ用に、プラスミドをＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化した。センスプローブ用に、プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で直線化した。その後、テンプレートＤＮＡを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして転写し、そしてＭａｘｉｓｃｒｉｐｔＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）を用いて、３３Ｐ−ＵＴＰで標識した。アンチセンスプローブはＴ７ポリメラーゼで生成し、そしてセンスプローブはＳＰ６ポリメラーゼで生成した。Ｇ５０ ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＴＭカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、最終標識化リボプローブを調製し、そして商業的なハイブリダイゼーション緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で希釈した。
【００７８】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
スライドにマウントした脳切片を、プロテイナーゼＫ（１μｇ／ｍｌ）中で５分間インキュベーションし、ＲＮアーゼ不含水中でリンスし、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリエチルアミン（ＴＥＡ）に懸濁し、そして０．２５％無水酢酸を５分間添加することによって、アセチル化した。３３Ｐを含む１０−２５μｌ／切片の体積で、スライドにマウントした切片にプローブを適用した（切片あたり０．５−１ｘ１０６ｃｐｍ）。対照として、少数のマウス脳切片を、ハイブリダイゼーション前に、ＲＮアーゼＡ（２０μｇ／ｍｌ）で前処理した。切片は、５０℃で、湿気のある環境中、一晩インキュベーションし、そしてその後、２ｘＳＳＣ中でリンスし、ＲＮアーゼＡで処理して、一本鎖ＲＮＡを分解し、標準的な一連の洗浄で洗浄し、そして一連の段階のエタノール溶液中で脱水した。生じたスライドを、標準的Ｘ線カセット中で、β−マックスフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に並置し、そして５−１０日間曝露した。
【００７９】
フィルム曝露後、安全光条件下、４３℃で、水で１：１に希釈したＫｏｄａｋ（登録商標）ＮＴＢ−２乳剤（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、ニューヨーク州ロチェスター）に、スライドを浸した。スライドを空気乾燥させ、そして完全な暗所で、−２０℃で保存しながら、２週間曝露した。スライドを、Ｋｏｄａｋ（登録商標）Ｄ−１９現像液およびＫｏｄａｋ（登録商標）固定液中で、１９℃で現像した。１％トルイジンブルーで対比染色し、アルコール中で脱水し、そしてカバーグラスを置いた。
【００８０】
ＰＤＥ１０Ａ特異的抗体
免疫細胞化学研究のため、ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドに対して向けられる抗体を生成した。Ｃ末端Ｈｉｓタグを含む、全長ラットＰＤＥ１０Ａ配列（図１Ｂ、配列番号２）は、先に報告される方法（Ｆａｗｃｅｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）にしたがって、Ｓｆ９昆虫細胞中で発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー、緩衝液交換、および陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた３工程精製によって、９５％純粋であり、質量分析によって決定されるように９７Ｋｄの予測される適切な分子量を有し、そしてｃＧＭＰ加水分解活性を有する最終産物を得た。精製ＰＤＥ１０Ａを用いて、マウスを免疫感作し、そして標準的プロトコルを用いて、クローン性ハイブリドーマを調製した。２４Ｆ３．Ｆ１１と称される抗体を使用のため選択した。
【００８１】
ヒトおよびラットＰＤＥ１０Ａに対するモノクローナル２４Ｆ３．Ｆ１１抗体の親和性は、ヒトＰＤＥ１０Ａを発現するＳｆ９細胞株およびラットＰＤＥ１０Ａを発現するＳｆ９細胞株由来の細胞溶解物を用いて試験した。モノクローナル２４Ｆ３．Ｆ１１抗体は、ラットおよびヒト組換えＰＤＥ１０Ａを認識する。組換え細胞と共に、対照Ｓｆ９細胞由来の溶解物を、ゲル電気泳動に供した。その後、ゲルのブロットを２４Ｆ３．Ｆ１１抗体とインキュベーションし、そしてブロットへの２４Ｆ３．Ｆ１１抗体の結合を測定した。組換えタンパク質を発現しないＳｆ９細胞由来の溶解物を含むレーンでは、ＰＤＥ１０Ａ免疫反応性は観察されなかった。
【００８２】
ＰＤＥ１０Ａに対する２４Ｆ３．Ｆ１１抗体の特異性を、他の１０のＰＤＥ遺伝子ファミリー由来のＰＤＥ類に比較した。２４Ｆ３．Ｆ１１抗体は、他のＰＤＥいずれとも交差反応しなかった。
【００８３】
免疫細胞化学およびウェスタンブロット
ラット脳の異なる領域におけるＰＤＥ１０Ａの発現は、２４Ｆ３．Ｆ１１抗体でのウェスタンブロッティングおよび免疫細胞化学によって決定した。ウェスタンブロット解析のため、ラットを断頭によって屠殺し、そして脳を迅速に取り出し、そして氷上で冷却した。異なる脳領域を同定し、そして標準的技術を用いて、顕微解剖した。脳切片を、ガラス／ガラス・ホモジナイザー中、１０体積の緩衝液（２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０）中でホモジナイズした。溶解物を４０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ・ハンブルグ、モデル５４１７Ｒ）で遠心分離し、そして標準的プロトコルを用いて、上清をウェスタンブロット解析に供した。
【００８４】
免疫細胞化学のため、ラット脳を、１０％緩衝化ホルマリン（ｐＨ７．０）中で、２４時間、液浸固定し、そしてその後、パラフィンに包埋した。切片（６μｍ）は脱パラフィン処理し、そして蒸留水中で水和した。クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて、９６℃で２０分間加熱し、マスク化したエピトープを回収した。切片を、２４Ｆ３．Ｆ１１抗体（１．２μｇ／ｍｌ）と、室温で６０分間インキュベーションした。対照として、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体および飽和濃度（ウェスタンブロットによって決定されるようなもの）のＰＤＥ１０Ａをあらかじめ吸収させた２４Ｆ３．Ｆ１１抗体を、複製切片上で平行してインキュベーションした。陽性染色は、アビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合体を用いて検出し、そしてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて視覚化した。ＩｇＧ１およびあらかじめ吸収したＦ１１対照では、反応産物は観察されなかった。
【００８５】
ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡ局在
ＰＤＥ１０Ａアンチセンス標識化マウス脳切片のオートラジオグラフは、非常に特異的なハイブリダイゼーションシグナルを示した。濃い標識化が３つの領域：背側線条体（尾状核および被殻）、腹側線条体（側坐核）、および嗅結節のみで見られた。線条体および側坐核内では、ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡは、これらの構造に見られるすべてのニューロンの約９５％に相当する、線条体中型有棘ニューロンで、高く発現されていた。歯状回および海馬のＣＡ層で、そして小脳の顆粒細胞層で、より低い密度の標識化が見られた。マウスに比較し、ラット脳の標識化パターンに、有意な相違は見られなかった。
【００８６】
ＰＤＥ１０Ａのｉｎ ｓｉｔｕ標識化は特異的であった。ハイブリダイゼーション前にＲＮアーゼＡで前処理したマウス脳切片は、標識のいかなる可視の取り込みも持たなかった。
【００８７】
ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡ局在領域および高ドーパミン受容体発現と古典的に関連付けられている領域の間には、非常に優れた一致があった。この類似性は、細胞下位置決定およびフィルムオートラジオグラフィーに比較して増加した分解能を提供する、乳剤オートラジオグラフによって、さらに支持された。銀粒子の濃い取り込みが、線条体、側坐核、および嗅結節全体で見られ、そしてこれら３つの領域のニューロン細胞体の大部分に被っているのが見られた。さらに、低いが測定可能なレベルのドーパミン受容体を発現する領域もまた、粒子沈着を示し、その相対ＤＡ受容体密度と大まかに一致していた。これらには、特に、正中前前頭皮質および前前頭皮質溝（ｍｅｄｉａｌ ａｎｄ ｓｕｌｃａｌ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ）と共に、歯状回および海馬のＣＡ層が含まれた。しかし、濃いドーパミンＤ１受容体発現の領域である、黒質網様部には粒子集積は見られなかった。
【００８８】
ＰＤＥ１０Ａタンパク質局在
ｍＲＮＡレベルと一致して、高ベルのＰＤＥ１０Ａタンパク質が、線条体（尾状核および被殻）、側坐核、および嗅結節で示された。ＰＤＥ１０Ａタンパク質は、ニューロン細胞体で、そして神経網全体で観察された。さらに、内包、淡蒼球、脳脚内核（ｅｎｔｏｐｅｄｕｎｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ）、および黒質を含む、線条体中型有棘ニューロンが突出する脳領域に、高レベルのＰＤＥ１０Ａタンパク質が観察されたが、ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡは観察されなかった。これらの領域にＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡが存在しないことを考慮すると、高レベルのＰＤＥ１０Ａタンパク質は、線条体中型有棘ニューロンの軸索および終末から生じているにちがいない。
実施例２：ＰＤＥ１０Ａ選択的調節因子に関するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
パパベリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定された。他の遺伝子ファミリー由来のＰＤＥ類に比較して、ＰＤＥ１０Ａを阻害する能力に関して、パパベリンを試験した。ヒトＰＤＥ２、３、および５は海綿体から単離し、ヒトＰＤＥ１は心室から単離し、そしてヒトＰＤＥ４は骨格筋から単離した（Ｂｏｏｌｅｌｌら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：７−５２， １９９６）。ホスホジエステラーゼ７−１１は、先に記載されるように、ＳＦ９細胞にトランスフェクションした全長組換えクローンから生成した（Ｆｉｓｈｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２４６：５７０−５７７， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−１５５６４， １９９８ｂ； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， ＰＮＡＳ ９６：７０７１−７０７６， １９９９； Ｆａｗｃｅｔｔら， ＰＮＡＳ ９７：３７０２−３７０７， ２０００）。酵素は、Ｂｏｏｌｅｌｌら、上記に記載されるように、細胞溶解物の可溶性分画からのＦＰＬＣによって精製した。
【００８９】
ＰＤＥ活性は、先に記載されるような、ＳＰＡに基づく方法を用いて測定した（Ｆａｗｃｅｔｔら、２０００）。多様な阻害剤濃度の存在下で、固定量のＰＤＥ１０Ａ酵素を用いて、アッセイを行った。アッセイに用いた環状ヌクレオチド基質（非標識対［３Ｈ］標識が３：１の比のｃＧＭＰまたはｃＡＭＰ）は、Ｋｍ濃度の１／３であり、異なるＰＤＥ類に関する阻害剤ＩＣ５０値の比較を可能にした。最終アッセイ体積は、アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）で１００μｌに調整した。
【００９０】
酵素の添加によって反応を開始した。試料を３０℃で３０−６０分間インキュベーションして、＜３０％の基質代謝回転を与え、そして３ｍＭの適切な非標識化環状ヌクレオチドを含む、５０μｌケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で終結させた。プレートを再封印し、そして２０分間震蘯し；その後、３０分間、ビーズを暗所で安定させ、そしてその後、ＴｏｐＣｏｕｎｔプレート読み取り装置（Ｐａｃｋａｒｄ、コネティカット州メリデン）上で計測した。放射能単位は、非阻害対照（１００％）に比較して、活性パーセントに変換した。ＩＣ５０値は、「Ｆｉｔ Ｃｕｒｖｅ」Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を用いて得た。
【００９１】
パパベリンは、ＰＤＥ１０Ａの競合阻害剤と同定され、ＩＣ５０値は１７ｎＭであった。パパベリンは、試験した他のＰＤＥ類すべてに対して、かなり効力が劣り（表１）、ＰＤＥ１０Ａへの選択性が立証された。
【００９２】
表１．多様なＰＤＥ遺伝子ファミリーのパパベリン阻害
【００９３】
【表１】
【００９４】
実施例３：初代線条体中型有棘ニューロン−パパベリンの影響
パパベリンがＰＤＥ１０Ａを阻害する特異性を考慮して、パパベリンを培養初代線条体中型有棘ニューロンに投与し、選択的ＰＤＥ１０Ａ阻害が、これらの細胞における環状ヌクレオチド代謝に対するユニークな影響を有するかどうか決定した。パパベリンの影響を、他のＰＤＥ阻害剤、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ロリプラム、およびザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）（すべてＳｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイスから入手可能なＰＤＥ阻害剤）の投与から生じる影響と比較した。
【００９５】
線条体培養は、先に記載されるように調製した（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ７：２１３−２２２， １９９５）。簡潔には、Ｅ１７ラットから線条体（尾状核および被殻）を切除し、解離させて単細胞懸濁物を生じ、そしてポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン（カタログ番号３５４６５７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）で被覆した９６ウェルプレート中に、５ｘ１０４ニューロン／ウェルの密度で蒔いた。細胞を、Ｂ２７補足剤（カタログ番号１７５０４−０１０、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）およびヒト組換え脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）（カタログ番号２４８−ＢＤ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（カタログ番号２１１０３−０４９、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で蒔いた。線条体中型有棘ニューロンは、先に記載されるようなＧＡＢＡ免疫反応性プロトコルによって確認されるように、これらの培養中の細胞の５０−６０％を構成した（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら、１９９５、上記）。これらの培養中のＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡの発現は、以下にさらに記載されるように、ＲＮアーゼ保護アッセイによって確認した。
【００９６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでおよそ４日置いた後、線条体細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄し、そしてＣａ２＋／Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌデキストロース、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中で、１時間プレインキュベーションした。その後、線条体細胞をＰＤＥ阻害剤の１つに曝露し、そして３７℃で２０分間インキュベーションした。ｃＧＭＰを測定する際、ニューロンは、ＰＤＥ阻害剤と２０分間インキュベーションした後、ニトロプルシド・ナトリウム（ＳＮＰ）（１００μＭ）で２分間刺激した。ｃＡＭＰを測定する際、ニューロンは、２０分間の阻害剤インキュベーションの間、フォルスコリン（１μＭ）で刺激した。これらのＳＮＰおよびフォルスコリン濃度は、最大反応（１０００μＭ ＳＮＰおよび１０μＭフォルスコリンは、それぞれ、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの最大増加を生じた）のおよそ２０−２５％を生じる、最大以下の濃度として選択した。
【００９７】
ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ ＳＰＡ系（それぞれ、ＡｍｅｒｓｈａｍコードＲＰＡ ５４０およびＲＰＡ ５５９）を用いて、細胞溶解物中のｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ濃度それぞれを検出した。ＳＰＡ直接スクリーニングアッセイ緩衝液（０．０１％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢酸）および緩衝液Ａ（１３３ｍｇ／ｍｌドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）の９：１の組み合わせを用いて細胞を溶解し、そして溶解物をドライアイス上で凍結した。
【００９８】
ＳＮＰまたはフォルスコリンによって刺激されていない細胞において、パパベリンは、線条体培養中のｃＡＭＰまたはｃＧＭＰレベルいずれにも影響を与えなかった。ＰＤＥ阻害剤の非存在下で、フォルスコリン（１μＭ）およびＳＮＰ（１００μＭ）の最大以下の濃度は、基底ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰより２−３倍の増加を引き起こした。パパベリンは、ＳＮＰ誘導ｃＧＭＰ集積に、濃度依存増加を引き起こし、ＥＣ２００（２倍増加を生じる阻害剤の濃度）値は、１１．７μＭであった（表２）。最大効果は、１００μＭパパベリンで観察され；ｃＧＭＰレベルは、ＳＮＰのみで刺激された培養より５倍上昇した。パパベリンはまた、フォルスコリン刺激培養において、ｃＡＭＰ集積の増加も引き起こし、ＥＣ２００は、３８．３であった（表２）。したがって、パパベリンは、ｃＧＭＰ ＥＣ２００／ｃＡＭＰ ＥＣ２００の比によって決定されるように、ｃＧＭＰよりｃＡＭＰの増加を促進する際、３．３倍、より有効でなかった（表２）。
【００９９】
対照的に、非選択的ＰＤＥ阻害剤、ＩＢＭＸは、ＳＮＰまたはフォルスコリン刺激培養において、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ集積両方で、濃度依存（３−１００μＭの範囲）増加を引き起こし、ＥＣ２００値は、それぞれ、１９および３０μＭであった。選択的ＰＤＥ４阻害剤、ロリプラムは、２．５μＭのＥＣ２００値でフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ集積を増加させ、そしてｃＧＭＰ集積速度を倍にするのに、１０倍高い濃度を必要とした。ｃＧＭＰ優先ＰＤＥ阻害剤、ザプリナストは、９８μＭの濃度で、これらのニューロンにおけるｃＡＭＰレベルを倍にした。しかし、この化合物１００μＭは、ｃＧＭＰのレベルをまったく倍にしなかった。各ＰＤＥ阻害剤のｃＧＭＰ ＥＣ２００／ｃＡＭＰ ＥＣ２００の比の比較は表２に示され、そしてＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤（パパベリンに代表されるようなもの）が、線条体中型有棘ニューロンにおける環状ヌクレオチド制御にユニークな影響を有することを立証する。
【０１００】
表２．ＰＤＥ阻害剤の比較
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
ＲＮアーゼ保護アッセイ
ＲＮＡは、先に記載されるように、５．７Ｍ塩化セシウム勾配を通じて、２０℃、１５０，０００ｘｇで２１時間遠心分離することによって、ラット線条体中型有棘ニューロンの初代培養から調製した（Ｉｒｅｄａｌｅ ＰＡら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０：１１０３−１１１０， １９９６）。ＲＮＡペレットを０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２に再懸濁し、そしてエタノール中で沈殿した。ＲＮＡ濃度は、分光測定によって測定した。ＰＤＥ１０Ａリボプローブは、マウスｃＤＮＡから単離した９１４ｂｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ １１０５０７の塩基対３８０−１２９４に対応する）のＰＣＲ増幅によって調製した。この断片をその後、ｐＧＥＭ３Ｚｆにクローニングした。ベクターを直線化し、そしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、［３２Ｐ］標識化アンチセンスリボプローブを合成した。
【０１０３】
ＲＮアーゼ保護アッセイは、ＲＰＡＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。簡潔には、５μｇの総細胞ＲＮＡを［３２Ｐ］標識化ＰＤＥ１０Ａリボプローブ（およそ１０５ｃｐｍ／試料）と、４２℃で一晩、ハイブリダイズさせた。翌日、試料を、ＲＮアーゼＡおよびＴ１と、３７℃で３０分間インキュベーションし、そしてその後、保護された二本鎖ＲＮＡ断片を沈殿させ、そして尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。このアッセイの結果により、ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡが、線条体中型有棘ニューロンの初代培養中に、高レベルで存在することが確認された。
実施例４：ラットＰＤＥ１０Ａのクローニングおよび配列決定
ヒトＰＤＥ１０Ａのタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０２０５９３）を用いて、基本的局所並列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２１５， ４０３−４１０， １９９０）を用い、非ヒトＥＳＴを含む米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの選択されたサブセットを検索した。１つのラットＥＳＴ（Ｈ３２７３４）によって予測されるアミノ酸配列は、ヒトタンパク質の内部部分に相同であった。さらに、このＥＳＴの核酸配列は、マウスＰＤＥ１０Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１１０５０７）のものに非常に相同であった。我々はこのＥＳＴ情報に加え、５’および３’ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）技術を用いて、ラット脳ＲＮＡの真の５’および３’配列を同定し、これをその後、完全ラットＰＤＥ１０Ａ ｃＤＮＡを単離するのに用いた。
【０１０４】
５’ＲＡＣＥは、製造者の推奨にしたがい、５’ＲＡＣＥキット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡは、遺伝子特異的３’プライマー１３５８（表３）、スプレーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット脳由来の１μｇの総ＲＮＡ、およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて生成した。第一周期ＰＣＲは、入れ子３’遺伝子特異的プライマー１３５７（表３）およびキットの５’アダプタープライマー（短縮（ａｂｒｉｄｇｅｄ）アンカープライマー（ＡＡＰ））を用いて行った。周期条件には、最初の９４℃、２分間の変性、その後、９４℃、４５秒間の変性、５４℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、３分間の伸長の３５周期に加え、最後の７２℃、１０分間の伸長が含まれた（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）。
【０１０５】
上述の周期条件を用いて、入れ子遺伝子特異的プライマー１３５６（表３）およびキットの５’アダプタープライマー（短縮普遍的増幅プライマー（ＡＵＡＰ））と共に、第一周期のＰＣＲ産物（１μｌ）を第二周期のＰＣＲのテンプレートとして用いた。６つの別個のＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲル上の電気泳動によって同定した。これらのバンドは、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて個々に単離し、ｐＣＲ４ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングし、そしてＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。コロニーは、上述のように、ベクター特異的プライマー１３６９および１３７０（表３）を用いたＰＣＲによってスクリーニングし、そして各バンド由来の多数の陽性クローンを配列決定した。
【０１０６】
すべての配列を並列し、ラットＰＤＥ１０Ａの５’端のコンセンサス配列を生じた。３’ＲＡＣＥは、製造者の指示にしたがい、３’ＲＡＣＥキット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡは、３’アダプタープライマー（ＡＰ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素を用いて、２μｇラット脳総ＲＮＡから生成した。第一周期のＰＣＲは、遺伝子特異的５’プライマー１３７５（表３）およびキットの３’ＡＰを用いて行った。周期条件は、上述のとおりであった。同一の周期条件を用いて、入れ子プライマー１３７６（表３）および３’ＡＵＡＰと共に、第一周期ＰＣＲ産物（１μｌ）を第二周期のＰＣＲのテンプレートとして用いた。ほぼ期待される大きさである４つの別個のＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル上での電気泳動によって同定した。上述のように、これらのバンドを単離し、そしてサブクローニングし、そしてコロニーをスクリーニングした。陽性クローンは、１つのＰＣＲ産物から同定された。これらのクローンのうち６つ由来の配列を並列し、ラットＰＤＥ１０Ａの３’端のコンセンサス配列を生じた。
【０１０７】
全長ラットＰＤＥ１０Ａ ｃＤＮＡを単離するため、第一鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）系（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、総ラット脳ＲＮＡから、３つ組で生成した。５’プライマー１３８０および３’プライマー１４０７（表３）は、上述のように生成されたラット５’および３’配列情報から設計し、そしてクローニングを容易にするため、隣接するＳａｌＩ制限部位を含むように操作した。ＰＣＲは、高忠実度ＰＣＲ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｒｏｃｈｅ）、スイス・バーゼル）を用いて行った。周期条件は、最初の９４℃、２分間の変性、その後、９４℃、４５秒間の変性、４８℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、３．５分間の伸長の４周期、その後、９４℃、４５秒間の変性、５５℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、３．５分間の伸長の３５周期に加え、最後の７２℃、１０分間の伸長であった（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。３つの第一鎖ｃＤＮＡテンプレート各々に関して、別個のＰＣＲ反応を行った。
【０１０８】
各ＰＣＲ反応由来のおよそ２．３ｋｂのバンドを、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル単離し、そしてＰＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、そして上述のように形質転換した。正しいクローンは、ラットＰＤＥ１０特異的プライマー１３８５および１３８６（表３）並びにＳａｌＩ制限消化を用いたコロニーＰＣＲによって、同定した。別個の逆転写ＰＣＲ反応各々由来の多数のクローンを配列決定し、そしてすべての配列を並列し、コンセンサスを決定した。２つのエラー不含クローン（ｐＮＢ１４２６およびｐＮＢ１４２７）を同定し、そして配列決定した。ラットＰＤＥ１０Ａのポリヌクレオチド配列（配列番号１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号２）は、それぞれ、図１Ａおよび図１Ｂに示される。
【０１０９】
表３．ラットＰＤＥ１０Ａをクローニングするためのプライマー配列
【０１１０】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１Ａは、ラットＰＤＥ１０Ａ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド配列を示す。図１Ｂは、ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を調節する剤を同定する方法、並びにラットＰＤＥ１０Ａのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を提供する。
【従来の技術】
【０００２】
環状ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ類（ＰＤＥ類）は、二次メッセンジャー、ｃＡＭＰ（環状アデノシン３’５’−一リン酸）およびｃＧＭＰ（環状グアニン３’５’−一リン酸）の加水分解を触媒し、そして非常に多様なシグナル伝達経路において、制御上、中枢の役割を果たす（Ｂｅａｖｏ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５：７２５−４８， １９９５）。例えば、ＰＤＥ類は、視覚（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４：１３０−３４， １９９３）、嗅覚（Ｙａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：９６７７−８１， １９９５）、血小板凝集（Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２３：３７１−７７， １９９７）、アルドステロン合成（ＭａｃＦａｒｌａｎｄら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１３６−４２， １９９１）、インスリン分泌（Ｚｈａｏら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０２：８６９−７３， １９９８）、Ｔ細胞活性化（Ｌｉら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８４８−５１， １９９９）、および平滑筋弛緩（Ｂｏｏｌｅｌｌら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ． ８：４７−５２， １９９６； Ｂａｌｌａｒｄら， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５９：２１６４−７１， １９９８）に関与する過程を仲介する。
【０００３】
ＰＤＥ類は、１１の主要なファミリーに細分される酵素のスーパーファミリーを形成する（Ｂｅａｖｏ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５：７２５−４８， １９９５； Ｂｅａｖｏら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６：３９９−０５， １９９４； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：８９９１−９６， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：５７０−７７， １９９８； Ｈａｙａｓｈｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０：７５１−５６， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−５８， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−６４， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７６， １９９９；およびＦａｗｃｅｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）。
【０００４】
各ＰＤＥファミリーは、ユニークな酵素的特性および薬理学的プロフィールによって、機能的に区別される。さらに、各ファミリーは、異なる組織、細胞、および細胞下発現パターンを示す（Ｂｅａｖｏら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６：３９９−４０５， １９９４； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：８９９１−９６， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：５０７−７７， １９９８； Ｈａｙａｓｈｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０：７５１−５６， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−５８， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−６４， １９９８； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７６， １９９９； Ｆａｗｃｅｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００； Ｂｏｏｌｅｌｌら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔ． Ｒｅｓ． ８：４７−５２， １９９６； Ｂａｌｌａｒｄら， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １５９：２１６４−７１， １９９８； Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ９：１６１−６７， １９９８；およびＴｏｒｐｈｙら， Ｐｕｌｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １２：１３１−３５， １９９９）。したがって、ＰＤＥ酵素の１つのファミリーまたはサブファミリーの活性を選択的に制御する化合物を投与することによって、細胞または組織特異的方式で、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰシグナル伝達経路を制御することが可能である。
【０００５】
ＰＤＥ１０は、一次アミノ酸配列および異なる酵素活性に基づいて、ユニークなＰＤＥと同定される。ＥＳＴデータベースの相同性スクリーニングによって、ＰＤＥ１０Ａがホスホジエステラーゼ、ＰＤＥ１０ファミリーの第一のメンバーであることが明らかになった（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８４３８−１８４４５， １９９９； Ｌｏｕｇｈｎｅｙら， Ｇｅｎｅ ２３４：１０９−１１７， １９９９）。ヒト、ラット、およびネズミ相同体がクローニングされており、そしてラットおよびヒト遺伝子両方に関して、Ｎ末端スプライシング変異体が同定されている（Ｋｏｔｅｒａら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２６１：５５１−５５７， １９９９； Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６６：１１１８−１１２７， １９９９； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７０７６， １９９９）；種に渡り、高い度合いの相同性がある。ＰＤＥ１０Ａは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを、それぞれ、ＡＭＰおよびＧＭＰに加水分解する。ｃＡＭＰに対するＰＤＥ１０Ａの親和性（Ｋｍ＝０．０５μＭ）は、ｃＧＭＰに対するもの（Ｋｍ＝３μＭ）より高い。しかし、ｃＧＭＰに対するＶｍａｘは、ｃＡＭＰに対するものよりおよそ５倍高く、このことから、ＰＤＥ１０Ａが、ｃＡＭＰに阻害される、ユニークなｃＧＭＰアーゼであることが示唆されている（Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８４３８−１８４４５， １９９９）。
【０００６】
ＰＤＥ１０Ａは、哺乳動物において、他のＰＤＥファミリーに比較し、ユニークに局在している。ＰＤＥ１０ＡのメッセンジャーＲＮＡは、精巣および脳でのみ、高く発現される（ＬａｎｆｅａｒおよびＲｏｂａｓ、ＥＰ ０９６７２８４； Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６６：１１１８−１１２７， １９９９； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７０７６， １９９９； Ｌｏｕｇｈｎｅｙら， Ｇｅｎｅ ２３４：１０９−１１７， １９９９）。当初の研究は、脳内では、線条体（尾状核および被殻）、側坐核、および嗅結節で、発現が最高であることを示した（ＬａｎｆｅａｒおよびＲｏｂａｓ、上記）。したがって、ＰＤＥ１０Ａ選択的調節を用いて、これらの脳領域において、環状ヌクレオチドのレベルを調節することが可能である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を選択的に調節する剤を同定する方法、並びにラットＰＤＥ１０Ａのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を提供する。
１つの側面において、本発明は、細胞内ホスホジエステラーゼ１０Ａ活性を阻害する剤をスクリーニングする方法であって、剤を線条体中型有棘ニューロン（ｓｔｒｉａｔａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｓｐｉｎｙ ｎｅｕｒｏｎｓ）に投与し、そしてアデニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてグアニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し、それぞれ、ｃＡＭＰ生成およびｃＧＭＰ生成を測定し、そしてそれぞれ、ｃＡＭＰ ＥＣ２００およびｃＧＭＰ ＥＣ２００を計算することを含み、ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が、同一のアッセイ条件下でのパパベリンの投与によって生じる比に匹敵する場合、該剤をＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定する、前記方法を特徴とする。
【０００８】
好ましくは、線条体中型有棘ニューロンは、初代培養ニューロンとして調製され、アデニル酸シクラーゼはフォルスコリンによって活性化され、グアニル酸シクラーゼはニトロプルシド・ナトリウムによって活性化され、そしてｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００比は１．７５−５．２５の範囲、より好ましくは、３．０−４．０の範囲にある。好ましくは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの濃度は、シンチレーション近接アッセイによって測定される。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを評価するのに用いるニューロンが、別個の試料中にあることが好ましい。さらに、剤がまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されることが好ましい。あるいは、剤は、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定される。
【０００９】
別の側面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、単離または精製ポリペプチドを特徴とする。
関連する側面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードする核酸配列、および／または配列番号１のコード配列を含む、単離または精製ポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１０】
本発明はまた、配列番号１のコード配列を含むベクター、および配列番号１のコード配列を発現する宿主細胞も特徴とする。
さらに、本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を調節する剤を同定する方法であって、剤を、配列番号２を含むラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドと接触させ、そして該ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの活性を測定することを含み、剤の存在下および剤の非存在下での該ＰＤＥ１０Ａポリペプチド活性間の相違が、該剤がＰＤＥ１０Ａ活性を調節することを示す、前記方法を提供する。
【００１１】
本発明にやはり特徴とされるのは、ＰＤＥ１０Ａ活性を調節する剤を同定する方法であって、剤を、配列番号１のコード配列を発現する宿主細胞と接触させ、そして配列番号１に発現されるＰＤＥ１０Ａポリペプチドの活性を測定することを含み、剤の存在下および剤の非存在下での該ＰＤＥ１０Ａポリペプチド活性間の相違が、該剤がＰＤＥ１０Ａ活性を調節することを示す、前記方法である。
【００１２】
当業者は、本明細書において、本発明を記載する説明および付随する請求項で用いられる用語を、完全に理解するであろう。にもかかわらず、本明細書に別に提供されない限り、以下の用語は、直後に記載されるとおりである。
【００１３】
「ＰＤＥ１０Ａ活性を増加させる剤」は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの生物学的活性を増強するかまたは模倣する分子を指す。こうした剤（すなわちアゴニスト）は、細胞に存在するＰＤＥ１０Ａの量を増加させることによるか、またはＰＤＥ１０Ａポリペプチドの触媒活性を増加させることにより、ＰＤＥ１０Ａの活性を増加させる、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子、あるいは他の化合物または組成物いずれかを含む可能性がある。
【００１４】
「ＰＤＥ１０Ａ活性を減少させる剤」は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの生物学的活性を阻害するかまたは減弱する分子を指す。こうした剤（すなわちアンタゴニスト）は、細胞に存在するＰＤＥ１０Ａポリペプチドの量を減少させることによるか、またはＰＤＥ１０Ａポリペプチドの触媒活性を減少させることにより、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの活性を減少させる、抗ＰＤＥ１０Ａ抗体などのタンパク質、核酸、炭水化物、小分子、あるいは他の化合物または組成物いずれかを含む可能性がある。
【００１５】
「対立遺伝子変異体」は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする遺伝子の代替型である。対立遺伝子変異体は、核酸配列中の少なくとも１つの突然変異から生じる可能性があり、そして改変ｍＲＮＡ、あるいは構造または機能が改変されているかまたは改変されていないポリペプチドを生じる可能性がある。遺伝子は、その天然存在型の対立遺伝子変異体をまったく持たないか、１つ、または多く持つ可能性がある。対立遺伝子変異体を生じさせる一般的な突然変異変化は、一般的に、ヌクレオチドの天然発生欠失、付加、または置換の結果であるとみなされる。これらの種類の変化は各々、単独で、または他と組み合わせて、既定の配列で、一回または多数回、生じる可能性がある。
【００１６】
ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする「改変」核酸配列は、欠失、挿入、または異なるヌクレオチドでの置換を持つ配列を含み、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの少なくとも１つの機能上の特性を持つポリペプチドを生じる。この定義内に含まれるのは、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、容易に検出可能である可能性も、または検出可能でない可能性もある多型である。コードされるタンパク質もまた、「改変されて」いる可能性があり、そしてサイレント変化を生じ、そして既知のＰＤＥ１０Ａポリペプチドに機能上、実質的に同等であるＰＤＥ１０Ａポリペプチドを生じる、１以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含む可能性がある。ＰＤＥ１０Ａポリペプチドが、例えば触媒または免疫学的活性において、機能上、実質的に同等である限り、残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行ってもよい。
【００１７】
「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産生に関する。これは、一般的に、当該技術分野に公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行う。
ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００値は、パパベリン値の５０％以下で異なる場合、パパベリンによって産生されるものに「匹敵」する。
【００１８】
既定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む「組成物」は、乾燥処方または水性溶液を含んでもよい。
「保存的アミノ酸置換」は、行われた場合、元来のタンパク質の特性に最も少なく干渉する、すなわちタンパク質の構造および特に機能が保存され、そしてこうした置換によって有意に変化しない置換である。保存的アミノ酸置換の例には、以下が含まれる：ＧｌｙまたはＳｅｒで置換されるＡｌａ；ＨｉｓまたはＬｙｓで置換されるＡｒｇ；Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓで置換されるＡｓｎ；ＡｓｎまたはＧｌｕで置換されるＡｓｐ；ＡｌａまたはＳｅｒで置換されるＣｙｓ；Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＨｉｓで置換されるＧｌｎ；Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＨｉｓで置換されるＧｌｕ；Ａｌａで置換されるＧｌｙ；Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕで置換されるＨｉｓ；ＬｅｕまたはＶａｌで置換されるＩｌｅ；ＩｌｅまたはＶａｌで置換されるＬｅｕ；Ａｒｇ、Ｇｌｎ，またはＧｌｕで置換されるＬｙｓ；ＬｅｕまたはＩｌｅで置換されるＭｅｔ；Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒで置換されるＰｈｅ；ＣｙｓまたはＴｈｒで置換されるＳｅｒ；ＳｅｒまたはＶａｌで置換されるＴｈｒ；ＰｈｅまたはＴｙｒで置換されるＴｒｐ；Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐで置換されるＴｙｒ；およびＩｌｅ、Ｌｅｕ、またはＴｈｒで置換されるＶａｌ。保存的アミノ酸置換は、一般的に、（ａ）例えばベータシートまたはアルファらせんコンホメーションとしての、置換領域においてポリペプチド主鎖の同一のまたは本質的に同一の構造、（ｂ）置換部位での、分子の同一のまたは本質的に同一の荷電または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の同一のまたは本質的に同一の大きさ（ｂｕｌｋ）を維持する。
【００１９】
用語「誘導体」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の化学的修飾を指す。ポリヌクレオチド配列の化学的修飾は、例えば、アルキル、アシル、ヒドロキシル、またはアミノ基による水素の置換を含む可能性がある。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、由来するポリペプチドの少なくとも１つの生物学的または免疫学的機能を保持する、グリコシル化、ペグ化、または他のいずれかの過程によって修飾されたものである。
【００２０】
「断片」は、親配列と配列が同一であるが、親配列より長さが短い、ＰＤＥ１０ＡポリペプチドまたはＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのユニークな部分である。プローブ、プライマー、抗原、療法分子として、または他の目的のため用いる断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０、または少なくとも５００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってもよい。断片は、分子の特定の領域を優先的に選択しても、または欠いていてもよい。
【００２１】
用語「同一性」は、相補性の度合いを指す。部分的類似性または完全同一性がある可能性がある。用語「同一性」を、用語「類似性」で代用することが可能である。同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する、部分的相補配列は、「実質的に類似」と称される。完全相補配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、減少したストリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、およびそれらに匹敵するもの）を用いて、調べることが可能である。実質的に類似の配列またはハイブリダイゼーションプローブは、減少したストリンジェンシーの条件下で、完全類似（同一）配列の標的配列への結合に競合し、そして該結合を阻害するであろう。これは、減少したストリンジェンシーの条件が、非特異的結合を許すということではない。むしろ、減少したストリンジェンシーの条件は、２つの配列の互いへの結合が、特異的な（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は、部分的な度合いの相補性（例えば約３０％未満の類似性または同一性）さえ欠く第二の標的配列の使用によって、試験することが可能である。非特異的結合の非存在下では、実質的に類似の配列またはプローブは、第二の非相補標的配列にハイブリダイズしないであろう。
【００２２】
ポリヌクレオチド配列に適用されるような、句「同一性パーセント」および「同一性％」は、標準化アルゴリズムを用いて並列された、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間での残基マッチの割合を指す。２つの配列間の並列を最適化するため、こうしたアルゴリズムは、標準化され、そして再現可能な方式で、比較される配列中にギャップを挿入し、そしてそれによって２つの配列のより意義のある比較を達成することが可能である。ポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）バージョン３．１２ｅ配列並列プログラムに取り込まれるような、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いて、決定することが可能である。このプログラムは、分子生物学的解析プログラムの組である、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）の一部である。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３， １９８９およびＨｉｇｇｉｎｓら， ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９， １９９２に記載される。同一性パーセントは、並列ポリヌクレオチド配列対間の「類似性パーセント」としてＣＬＵＳＴＡＬ Ｖに報告される。あるいは、一般的に用いられ、そして無料で入手可能な配列比較アルゴリズムの組が、米国バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）基本的局所並列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０， １９９０）に提供され、これはＮＣＢＩ、メリーランド州ベセスダ、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／を含む、いくつかの供給源から入手可能である。ＢＬＳＡＴソフトウェア組は、既知のポリヌクレオチド配列を、多様なデータベース由来の他のポリヌクレオチド配列と並列するのに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、多様な配列解析プログラムを含む。やはり入手可能なのは、２つのヌクレオチド配列の直接対比較に用いられる、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールである。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで評価し、そして対話式に用いることが可能である。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎおよびｂｌａｓｔｐ両方に用いることが可能である（以下に論じられる）。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的に、ギャップおよび他のパラメーターをデフォルト設定にして用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するため、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスいずれか、４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．９（１９９９年５月７日）と共にｂｌａｓｔｎを用いることが可能である。同一性パーセントは、例えば特定の配列番号によって定義されるような全定義配列の長さに渡って測定することが可能であるし、あるいは、より短い長さに渡って、例えばより長い定義される配列から取った断片、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも１００、または少なくとも２００の連続するヌクレオチドの断片の長さに渡って測定することが可能である。こうした長さは例のみであり、そして本明細書に示される配列に開示されるいかなる断片長を用いて、同一性パーセントを測定することが可能な長さを説明することも可能である。高い度合いの同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず、遺伝暗号の縮重のため、類似のアミノ酸配列をコードする可能性がある。核酸配列の変化は、この縮重を用いて行い、すべて同一のまたは実質的に同一のＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする、本発明に含まれる多数の核酸配列を産生することが可能であることが理解される。
【００２３】
ポリペプチド配列に適用されるような、句「同一性パーセント」および「同一性％」は、標準化アルゴリズムを用いて並列された、少なくとも２つのポリペプチド配列間の残基マッチの割合を指す。ポリペプチド配列並列法は公知である。いくつかの並列法は、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる。上により詳細に説明される、こうした保存的置換は、一般的に置換部位での疎水性および酸性度を保持し、したがってポリペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチド配列間の同一性パーセントは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）配列並列プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）に取り込まれるような、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトパラメーターを用いて、決定することが可能である。デフォルト残基加重表として、ＰＡＭ２５０マトリックスを選択する。ポリヌクレオチド並列と同様に、同一性パーセントは、並列ポリペプチド配列対間の「パーセント類似性」として、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって報告される。
【００２４】
あるいは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア組を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列の対比較のため、デフォルトパラメーターに設定されたｂｌａｓｔｐと共に、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．９（１９９９年５月７日）を用いることが可能である。こうしたデフォルトパラメーターは、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス、スコア＝５０、およびワード長＝３を用いる可能性がある。同一性パーセントは、例えば特定の配列番号によって定義されるような全定義ポリペプチド配列の長さに渡って測定することが可能であるし、あるいは、より短い長さに渡って、例えばより長い定義される配列から取った断片、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１００の連続する残基の断片の長さに渡って測定することが可能である。こうした長さは例のみであり、そして図および配列表を含む、本明細書に示される配列に支持されるいかなる断片長を用いて、同一性パーセントを測定することが可能な長さを記載することも可能である。
【００２５】
「宿主」により、異種ポリヌクレオチドでトランスフェクションされ、そして該ポリヌクレオチドを発現することが可能なトランスジェニック細胞（例えば哺乳動物、細菌、昆虫細胞）または動物（例えば非ヒト哺乳動物）を意味する。
【００２６】
「異種」ポリヌクレオチドは、異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）であるか、または非天然存在であるか、あるいは宿主細胞のゲノムに非天然に配置されるものである。
「ハイブリダイゼーション」は、ポリヌクレオチド鎖が、定義されるハイブリダイゼーション条件下で、塩基対形成を通じて、相補鎖とアニーリングする過程を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が、高い度合いの同一性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容的アニーリング条件下で形成され、そして「洗浄」工程後もハイブリダイズしたままである。洗浄工程は、ハイブリダイゼーション過程のストリンジェンシーを決定するのに特に重要であり、よりストリンジェントな条件は、非特異的結合、すなわち完全にマッチしない核酸鎖の対間の結合を、より可能にしない。核酸配列のアニーリングの許容的条件は、当業者によって日常的に決定可能であり、そしてハイブリダイゼーション実験間で一定である可能性があるが、洗浄条件は、望ましいストリンジェンシー、そしてしたがってハイブリダイゼーション特異性を達成するため、実験間で異なる可能性がある。許容的アニーリング条件は、例えば、約６ｘＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および約１００ｐｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡの存在下で、６８℃で生じる。
【００２７】
一般的に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、部分的に、洗浄工程を行う温度に関連して表す。一般的に、こうした洗浄温度は、定義されるイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より、約５から２０℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（定義されるイオン強度およびｐＨ下）である。核酸ハイブリダイゼーションに関するＴｍおよび条件を計算する等式は公知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州プレーンビューに見出すことが可能であり；特にＶｏｌ．２， 第９章を参照されたい。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの高ストリンジェンシー条件は、約０．２−１．０ｘＳＳＣおよび約０．１％ ＳＤＳの存在下、約１時間での約５５−６８℃の洗浄条件を含む。
【００２９】
一般的に、ハイブリダイゼーション反応は、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度で行うことが可能である。ＳＳＣ濃度は、約０．１から２ｘＳＳＣまで多様であってもよく、ＳＤＳは約０．１％で存在する。典型的には、ブロッキング試薬を用いて、非特異的ハイブリダイゼーションをブロッキングする。こうしたブロッキング試薬には、例えば、約１００−２００ｐｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡが含まれる。約３５−５０％ ｖ／ｖの濃度のホルムアミドなどの有機溶媒もまた、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションなどの特定の条件下で用いることが可能である。これらの洗浄条件の有用な変動は、一般の当業者に容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェンシー条件下で、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し、ヌクレオチドおよびそのコードするポリペプチドが類似の役割を持つことを強く示す。
【００３０】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補塩基間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間で形成される複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液に存在する配列間で形成されるか、または溶液に存在する１つの核酸配列および固体支持体（例えば紙、膜、フィルター、チップ、ピンまたはガラススライド）上に固定される別の核酸配列の間で形成される可能性がある。
【００３１】
「単離または精製」により、「人の手によって」天然状態から変化したことを意味する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に存在する場合、その元来の環境から変化したおよび／または除去されたとき、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離または精製」されている。例えば、「単離または精製」ポリヌクレオチドは、天然に関連する他のポリヌクレオチドから分離されている。例えば、通常、コード配列と関連しているイントロン配列が除去されているｃＤＮＡ配列は、「単離または精製」されている。「単離または精製」ポリヌクレオチド配列は、一過性または安定発現のため、培養中の宿主細胞または全生物に導入され、そしてそれでもなお「単離および精製」されていることが可能である。これは、ポリヌクレオチドがその天然存在型または環境にないであろうためである。しかし、ｃＤＮＡライブラリーのメンバーとしてのポリヌクレオチド配列は、「単離または精製」に意味されるものから排除される。「単離または精製」ポリペプチドは、天然に関連する、少なくとも１つの細胞構成要素から分離されている。好ましくは、ポリペプチドは、他の構成要素を少なくとも６０％含まず、より好ましくは、少なくとも７５％含まず、そして最も好ましくは、少なくとも９０％含まない。
【００３２】
「調節」により、増加または減少（完全除去を含む）を意味する。
「機能可能であるように連結された」は、第一の核酸配列が、第二の核酸配列と機能する関連に置かれる状況を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の転写を制御するよう機能する場合、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に、機能可能であるように連結されたＤＮＡ配列は、ごく近接してまたは連続して、そして２つのタンパク質コード領域を連結することが必要である場合、同一読み枠にある可能性がある。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」は、一般的に、制限なしに、一本鎖、二本鎖、および三本鎖配列、センスまたはアンチセンス鎖、ヌクレオチド類似体を用いて生成された配列、ＲＮＡおよびＤＮＡを含むハイブリッド分子、並びに修飾塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡを含む、いかなるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、ＲＮＡ様、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡまたはゲノム）、またはＤＮＡ様配列も指す。ポリヌクレオチドは、天然存在であってもまたは合成であってもよい。
【００３４】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、あるいはこれらのいずれかの断片を指し、そして天然存在または合成分子を指す。該用語は、翻訳後プロセシングなどの天然過程によって、または当該技術分野に公知の化学的修飾によって、修飾されたアミノ酸配列を含む（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ニューヨーク州ニューヨーク， 第２版， １９９３； Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｊｏｈｎｓｏｎ監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州ニューヨーク， １９８３； Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８２：６２６−４６， １９９０；およびＲａｔｔａｎら， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２， １９９２を参照されたい）。既知の修飾には、限定されるわけではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体、あるいはホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、シスチンまたはピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン化などの、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ仲介付加が含まれる。
【００３５】
「ＰＤＥ１０Ａ活性」により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕの、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰのＰＤＥ１０Ａ仲介加水分解を意味する。
「選択的」ＰＤＥ１０Ａ阻害剤により、他のＰＤＥ類の阻害に関して観察されるより、少なくとも１０倍低いＩＣ５０で、ＰＤＥ１０Ａ活性を阻害する剤を意味する。
【００３６】
「置換」は、それぞれ、１以上のアミノ酸またはヌクレオチドの、異なるアミノ酸またはヌクレオチドでの置換を指す。
アデニル酸シクラーゼまたはグアニル酸シクラーゼを「最大以下」に活性化することは、化合物の最大有効濃度によって生じる値の、約１０−５０％、好ましくは、約２０−２５％である、それぞれ、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの増加を達成する濃度の化合物を投与することを意味する。
【００３７】
「形質転換」または「トランスフェクション」は、異種ＤＮＡがレシピエント細胞に進入し、そして該細胞が該異種ＤＮＡを発現することを可能にする、遺伝的修飾過程を説明する。形質転換は、当該技術分野に公知の多様な方法にしたがって、原核または真核宿主細胞で起こることが可能である。方法は、形質転換される宿主細胞の種類に基づいて選択され、そして限定されるわけではないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、および粒子銃を含む。用語「形質転換細胞」または「トランスフェクション細胞」は、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部として複製することが可能である安定形質転換細胞と共に、限定される期間、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを発現する、一過性形質転換またはトランスフェクション細胞を含む。こうした形質転換またはトランスフェクション細胞はすべて、「トランスジェニック」と称される。
【００３８】
特定の核酸配列の「変異体」は、デフォルトパラメーターに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツール、バージョン２．０．９と共にｂｌａｓｔｎを用いて、核酸配列の１つの特定の長さに渡って、特定の核酸配列に少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列と定義される。こうした配列は、特定の定義される長さに渡って、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、またはそれ以上の配列同一性を示す可能性がある。変異体は、例えば、「対立遺伝子」（上に定義されるとおり）、「スプライシング」、「種」、または「多型」変異体と記載することが可能である。スプライシング変異体は、参照分子に有意な同一性を有する可能性があるが、一般的に、ｍＲＮＡプロセシング中のエクソンの選択的スプライシングのため、より多いかまたはより少ない数のポリヌクレオチドを有するであろう。対応するポリペプチドは、さらなる機能ドメインを持つか、または参照分子に存在するドメインを欠く可能性がある。種変異体は、１つの種から別のもので異なるポリヌクレオチド配列である。生じるポリペプチドは、一般的に、互いに比較して、有意なアミノ酸同一性を有するであろう。多型変異体は、既定の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中の変異である。多型変異体はまた、ポリヌクレオチド配列が一ヌクレオチド塩基異なる、「一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）を含む可能性もある。ＳＮＰの存在は、例えば、特定の集団、疾患状態、または疾患状態の性向（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ）を示す可能性がある。
【００３９】
本発明の他の特徴および利点は、続く詳細な説明および請求項から明らかであろう。本発明は、特定の態様と関連して記載されるが、実施することが可能である他の変化および修飾もまた、本発明の一部であり、そしてまた、付随する請求項の範囲内でもあることが理解されるであろう。本明細書は、一般的に、本発明の原理にしたがう、本発明のいかなる同等物、変形、使用、または適応も含むよう意図され、既知のまたは当該技術分野内で習慣的な実施の範囲内であり、そして過度の実験なしに確かめることが可能である、本開示からの逸脱を含む。核酸およびポリペプチドを作成し、そして使用することに関するさらなる手引きは、分子生物学、タンパク質科学、および免疫学の標準的教科書に見られる（例えばＤａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ．， ニューヨーク州ニューヨーク， １９８６； Ｈａｍｅｓら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＩＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓを参照されたい）。本明細書に言及されるすべての刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【発明の実施の形態】
【００４０】
本発明は、ＰＤＥ１０Ａ活性を阻害する剤を細胞レベルで同定するため、線条体中型有棘ニューロンを用いた、細胞に基づくスクリーニングアッセイを提供する。線条体中型有棘ニューロンにおいて高レベルのＰＤＥ１０Ａが確認されたことを考慮すると（以下の実施例１にさらに記載されるとおり）、これらの細胞は、ＰＤＥ１０Ａ活性の阻害剤を同定する、細胞に基づくアッセイで使用するための、優れた候補である。こうした阻害剤は、例えば、米国仮出願６０／２８５，１４８にさらに記載されるように、運動または気分、不安、精神病、薬剤嗜癖、および症状欠損認知の障害を治療するのに有用である。本発明はまた、ラットＰＤＥ１０Ａポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も特徴とする。
ＰＤＥ１０Ａ阻害剤を同定する、細胞に基づくアッセイ
本発明の細胞に基づくアッセイは、以下の実施例にさらに記載される、２つの発見に由来する。第一に、パパベリンは、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤である。そして第二に、線条体中型有棘ニューロンへのパパベリンの投与は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルにユニークな変化プロフィールを生じる。このユニークなプロフィールは、線条体中型有棘ニューロンの環状ヌクレオチドに同一の組み合わせの変化を生じる他の剤もまた、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定されることを示す。
【００４１】
アッセイを行うため、哺乳動物線条体中型有棘ニューロンを用いる。この細胞は、初代培養として調製することが可能である（例えばＶｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ７：２１３−２２， １９９５を参照されたい）。あるいは、線条体中型有棘ニューロン不死化細胞株を用いることが可能である（Ｅｈｌｉｃｈら， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １６７：２１５−２６， ２００１； ＣａｔｔａｎｅｏおよびＣｏｎｔｉ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ． ５３：２２３−３４， １９９８； Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５：６７６−８８， １９９５）。
【００４２】
初代細胞培養では、ニューロンは、哺乳動物胚（例えばＥ１７ラットまたはマウス胚）から脳を切除し、該組織を単細胞懸濁物に解離させ、そしてマルチウェルプレートなどの適切な容器に、細胞を蒔くことによって、調製する。望ましい場合、調製中の線条体中型有棘ニューロンの存在は、ＧＡＢＡ免疫反応性を試験することによって、決定することが可能であり（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら、上記）、そしてＰＤＥ１０Ａの発現は、例えば、ウェスタンブロットまたはＲＮアーゼ保護アッセイによって、確認することが可能である（以下の実施例３を参照されたい）。
【００４３】
アッセイプロトコルの１つの例は以下のとおりである。ｉｎ ｖｉｔｒｏで４−５日の線条体中型有棘ニューロン（例えばラット）の初代細胞培養を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、そして３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌデキストロース、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝生理食塩水中で、およそ１時間プレインキュベーションする。その後、同一緩衝液中で、試験剤を細胞と、３７℃でおよそ２０分間インキュベーションする。
【００４４】
ｃＡＭＰの変化に関して試験するため、ニューロン培養はまた、アデニル酸シクラーゼを刺激する化合物の最大以下の濃度（例えば１μＭフォルスコリン）ともインキュベーションする。ｃＧＭＰの変化に関して試験するため、ニューロン培養は、グアニル酸シクラーゼを刺激する化合物の最大以下の濃度（例えば１００μＭニトロプルシド・ナトリウム（ＳＮＰ））とインキュベーションする。環状ヌクレオチドの生成を刺激する化合物の最大以下の濃度は、最大有効濃度の１０−５０％、好ましくは、２０−２５％を生成する濃度である。化合物は、試験剤インキュベーション中、または試験剤インキュベーションに続く期間（例えば１−５分間）、投与してもよい。
【００４５】
細胞を溶解し、そして標準法を用いて、細胞溶解物中の適切なｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルを測定する。例えば、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルは、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）キット（それぞれ、カタログ番号ＲＰＡ ５４０およびＲＰＡ ５５９、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて測定することが可能である。ＥＣ２００値を決定することが可能であるように、多様な濃度で試験剤を研究する。ＥＣ２００は、試験剤で処理されていない細胞由来の溶解物中で測定されるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰのレベルに比較した際、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰレベルを２００％増加させる試験剤の濃度と定義される。理想的には、細胞の別個の試料を用いて、シクラーゼを刺激し、そして環状ヌクレオチドレベルを評価する。しかし、アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼの刺激は、単一試料の細胞中で行ってもよく、細胞溶解物を２つの試料に分割し、そしてその後、これらの２つの溶解物中で、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを別個に測定してもよい。
【００４６】
線条体中型有棘ニューロンおよび上述の典型的なアッセイ条件を用いる際、試験剤が、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの増加を引き起こし、ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が１．７５−５．２５、好ましくは２．５−４．５、より好ましくは３．０−４．０の範囲である場合に、試験剤はＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定される。特定の細胞またはアッセイ条件が上記と異なる場合、剤がＰＤＥ１０Ａ阻害剤であることを示すｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の範囲は、適切な条件下で、パパベリンを陽性対照として試験することによって、決定することが可能である。剤は、パパベリンに関する値と匹敵する（すなわち相違が５０％以下である）ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比を生じる場合、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定される。
【００４７】
本発明のアッセイ法は、別の標準的細胞調製プロトコル（ＭｉｓｇｅｌｄおよびＤｉｅｔｚｅｌ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４９２：１４９−５７， １９８９； ＳｈｉおよびＲａｙｐｏｒｔ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １４：４５４８−６０， １９９４； ＭａｏおよびＷａｎｇ， Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ． Ｒｅｓ． ８６：１２５−３７， ２００１； Ｓｎｙｄｅｒら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０：４４８０−８８， ２０００）、環状ヌクレオチド形成を刺激する別の標準法（Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎら， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８４：２２３−２８， １９９８； ＧｌａｓｓおよびＦｅｌｄｅｒ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：５３２７−３３， １９９７）、および／または環状ヌクレオチド検出の別の標準法（ＶｉｌｌｅｇａｓおよびＢｒｕｎｔｏｎ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３５：１０２−３， １９９６； Ｃｏｒｂｉｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５９：７４−８２， １９８８）を用いることが可能である。
【００４８】
本発明の細胞に基づくアッセイは、ＰＤＥ１０Ａ阻害に関して、先行する情報がまったく知られていない試験剤に対して行ってもよいが、細胞に基づくアッセイは、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定される剤が、細胞レベルでもやはりＰＤＥ１０Ａを阻害することを確認する二次アッセイとして用いることが好ましい。好ましくは、剤は、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏプレスクリーニングの代替法として、剤はまた、細胞に基づくアッセイで同定された後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって、ＰＤＥ１０Ａ阻害剤と確認することも可能である。
【００４９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、剤は、ＰＤＥ１０Ａ以外のＰＤＥ類阻害のＩＣ５０が、ＰＤＥ１０Ａ阻害のＩＣ５０より、少なくとも１０倍大きい場合、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されるであろう。匹敵するＩＣ５０値を達成するため、ＰＤＥアッセイはすべて、各酵素に関する環状ヌクレオチドのＫｍに同等に比例する環状ヌクレオチド基質濃度で行う。ＰＤＥ１０Ａ選択的調節因子を同定するスクリーニングの１つの種類は、組織から単離された天然酵素、あるいはトランスフェクションされた宿主細胞、例えばＳｆ９昆虫細胞（Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）、酵母細胞（Ｌｏｕｇｈｎｅｙら、米国特許第５，９３２，４６５号）、またはＣＯＳ−７細胞（Ｙｕａｓａ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：３１４６９−７９， ２０００）から単離された組換え酵素を用いる。好ましくは、ＰＤＥ１０Ａ酵素は、ヒト（例えばＬｏｕｇｈｎｅｙら、米国特許第５，９３２，４６５号、Ｌａｎｆｅａｒら、ＥＰ ９６７２８４）、マウス（例えばＬａｎｆｅａｒら、ＥＰ ９６７２９４）、またはラット（例えば配列番号２）である。
【００５０】
ＰＤＥ１０Ａ活性は、例えば、適切な基質、［３Ｈ］ｃＡＭＰまたは［３Ｈ］ｃＧＭＰの加水分解速度として測定される。この活性は、例えば、ＳＰＡに基づく方法（Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００； Ｐｈｉｌｌｉｐｓら， ＷＯ ００／４０７３３、およびＴｈｏｍｐｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８：５２２８， １９７９（製品コードＴＲＫＱ７０９０／７１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ’ｌ Ｌｔｄ．， 英国バックハムシャーを用いて修飾されるようなもの））によって測定される。簡潔には、ＰＤＥ１０Ａ酵素を含む試料を、一部（例えば１／４から１／２）が３Ｈ標識（Ａｍｅｒｓｈａｍ）されている、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）と接触させる。反応は、例えば、マイクロタイタープレート（例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ（登録商標）プレート、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バージニア州シャンティリー）中で行い、そして過剰な非標識環状ヌクレオチドを含むケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加によって終結させる。ビーズを暗所で安定させた後、マイクロタイタープレート読み取り装置（例えばＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）、Ｐａｃｋａｒｄ、コネティカット州メリデン）によって読み取る。
【００５１】
ＰＤＥ１０Ａ活性はまた、３２Ｐ−ｃＡＭＰまたは３２Ｐ−ｃＧＭＰから放出される３２Ｐ−リン酸の検出によって（例えばＬｏｕｇｈｎｅｙら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：７９６−８０６， １９９６、およびＬｏｕｇｈｎｅｙ、米国特許第５，９３２，４６５号に記載されるとおり）、あるいはＰＤＥ基質、ｃＧＭＰまたはｃＡＭＰ、およびその加水分解産物間を区別する抗体を用いて（例えばＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ技術、ＮＥＮ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ボストンを用いて）、アッセイすることも可能である。
【００５２】
ＰＤＥ１０Ａ触媒活性をアッセイする代替法として、剤が、例えば、翻訳後修飾（例えばリン酸化）、アロステリックリガンド結合の修飾（例えばＧＡＦドメイン（Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）を介して）を介して、あるいはＰＤＥ１０Ａ自体に触媒またはアロステリック制御部位で結合することによって、ＰＤＥ１０Ａ触媒活性を間接的に調節する場合、剤をＰＤＥ１０Ａ陽性調節因子または陰性調節因子（アンタゴニスト）と同定することが可能である。ＰＤＥ１０Ａリン酸化およびアロステリックリガンド結合を決定する方法は、文献に記載されている（例えばＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：３０６７１−７９， １９９５およびＣｏｒｂｉｎら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：２７６０−６７， ２０００を参照されたい）。
【００５３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクリーニングおよび細胞に基づく本発明のアッセイに用いられる試験剤は、個々に選択してもよいし、または化合物ライブラリーから得てもよい。こうした剤には、ペプチド、Ｄおよび／またはＬ配置アミノ酸で作成されるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリー、リンペプチド、抗体、並びに小有機および無機化合物が含まれる。ライブラリーには、生物学的ライブラリー、天然化合物ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に耐性であり、なお生理活性を保持する、新規の非ペプチド主鎖を持つ分子のライブラリー）（例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８−８５， １９９４を参照されたい）、空間的にアドレス呼び出し可能な平行固相または溶液相ライブラリー、デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法が含まれる。
【００５４】
分子ライブラリーの合成法の例は、当該技術分野において、例えばＤｅＷｉｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０：６９０９， １９９３； Ｅｒｄら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：１１４２２， １９９４； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８， １９９４； Ｃｈｏら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６１：１３０３， １９９５； Ｃａｒｒｅｌｌら， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１， １９９４；およびＧａｌｌｏｐら， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３， １９９４に見出すことが可能である。
【００５５】
化合物ライブラリーは、溶液中に（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３：４１２−４２１， １９９２）、またはビーズ上に（Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４１， １９９１）、チップ上に（Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６， １９９３）、細菌または胞子上に（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上に（Ｃｕｌｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：１８６５−１８６９， １９９２）、またはファージ上に（Ｓｃｏｔｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６， １９９０； Ｃｗｉｒｌａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：６３７８−６３８２， １９９０； Ｆｅｌｉｃｉ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０， １９９１； Ｌａｄｎｅｒ、上記）、存在していてもよい。
ラットＰＤＥ１０Ａのヌクレオチドコード配列およびアミノ酸配列
本発明は、例えば図１Ｂ（配列番号２）に示されるような、単離または精製ラットＰＤＥ１０Ａ配列を含む。
【００５６】
本発明はまた、例えば図１Ａに示されるような、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするヌクレオチドコード配列も含む。
ラットＰＤＥ１０Ａをコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用し、そしてプロモーターおよび制御要素などの上流配列を検出するため、当該技術分野に知られるＰＣＲに基づく多様な方法を使用して、伸長することが可能である。例えば、使用することが可能な１つの方法、制限部位ＰＣＲは、クローニングベクター内のゲノムＤＮＡから、未知の配列を増幅するのに、普遍的および入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを用いる（例えばＳａｒｋａｒ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２， １９９３を参照されたい）。別の方法、逆ＰＣＲは、環状化テンプレートから未知の配列を増幅するのに、異なる方向で伸長するプライマーを用いる。テンプレートは、既知の遺伝子座および周囲配列を含む制限断片に由来する（例えばＴｒｉｇｌｉａら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６， １９８８を参照されたい）。第三の方法、捕捉ＰＣＲは、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を伴う（例えばＬａｇｅｒｓｔｒｏｍら， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． １：１１１−１１９， １９９１を参照されたい）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、多数の制限酵素消化および連結を用いて、操作された二本鎖配列を、未知の配列の領域に挿入することが可能である。
【００５７】
本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞中で、ラットＰＤＥ１０Ａの発現を指示する組換えＤＮＡ分子にクローニングすることが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、限定されるわけではないが、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現の修飾を含む、多様な目的のため、ＰＤＥ１０Ａコード配列を改変するために、当該技術分野に一般的に知られる方法を用いて、操作することが可能である。
【００５８】
ランダム断片化、並びに遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てによるＤＮＡシャッフリングを用いて、ヌクレオチド配列を操作することが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を生成し、グリコシル化パターンを改変し、コドン優先性を変化させ、スプライシング変異体を生じるなどの突然変異を導入することが可能である。別の態様において、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列を、当該技術分野に公知の化学的方法を用いて、すべてまたは部分的に合成することが可能である（例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５−２２３， １９８０；およびＨｏｒｎら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５−２３２， １９８０を参照されたい）。あるいは、ラットＰＤＥ１０Ａ自体またはその断片を、化学的方法を用いて合成することが可能である。例えば、多様な固相技術を用いて、ペプチド合成を行うことが可能である（例えばＲｏｂｅｒｇｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４， １９９５を参照されたい）。自動化合成は、ＡＢＩ ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネティカット州ノーウォーク）を用いて達成することが可能である。さらに、ラットＰＤＥ１０Ａのアミノ酸配列またはそのいずれかの部分は、直接合成中、改変して、そして／または他のタンパク質またはそのいずれかの部分由来の配列と組み合わせて、変異ポリペプチドを産生することが可能である。ペプチドは、分離用高性能液体クロマトグラフィーによって、実質的に精製することが可能である（例えばＣｈｉｅｚおよびＲｅｇｎｉｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１， １９９０を参照されたい）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸解析によって、または配列決定によって、確認することが可能である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， ニューヨーク州ニューヨーク １９８４を参照されたい）。
発現ベクターおよび宿主細胞
生物学的に活性があるラットＰＤＥ１０Ａを発現させるため、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち適切な宿主中での挿入コード配列の転写および翻訳調節に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。これらの要素には、エンハンサー、恒常性および誘導性プロモーターなどの制御配列、並びにベクターおよび／またはラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチド配列由来の５’および３’非翻訳領域が含まれる。こうした要素は、その強度および特異性が異なる可能性がある。特定の開始シグナルもまた用いて、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することが可能である。こうしたシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列、例えばコザック配列が含まれる。ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列、並びにその開始コドンおよび上流制御配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要とされない可能性がある。しかし、コード配列またはその断片のみが挿入される場合、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルが、ベクターに提供されるべきである。外因性翻訳要素および開始コドンは、天然および合成両方の多様な起源のものであってもよい。発現効率は、用いる特定の宿主細胞系に適したエンハンサーの包含によって、増進することが可能である（例えばＳｃｈａｒｆら， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２， １９９４を参照されたい）。当業者に公知の方法を用いて、本開示に照らし、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列、並びに適切な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク州プレーンビュー， 第４， ８，および１６−１７章， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク州ニューヨーク， 第９， １３，および１６章， １９９５を参照されたい）。多様な発現ベクター／宿主系を利用して、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列を含ませそして発現させることが可能である。これらには、限定されるわけではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクター（例えばエピソーム、染色体要素）で形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、パポナウイルス（ｐａｐｏｎａｖｉｒｕｓ）、ワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、およびレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ））に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＣａＭＶ、またはタバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＴＭＶ）、細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が含まれる。本発明は、使用される宿主細胞によって制限されない。
【００５９】
細菌系において、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチド配列に意図される使用に応じて、いくつかのクローニングおよび発現ベクターを選択することが可能である。例えば、ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、および増殖は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）またはｐＳｐｏｒｔ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）などの多機能大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ベクターを用いて、達成することが可能である。ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列を、ベクターのマルチクローニングサイトに連結すると、ｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能になる。さらに、これらのベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシ配列決定、ヘルパーファージを用いた一本鎖レスキュー、およびクローニングされた配列における入れ子欠失の生成に有用である可能性がある（例えばＶａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９， １９８９を参照されたい）。例えば抗体産生のため、多量のＰＤＥ１０Ａポリペプチドが必要とされる場合、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドの高レベル発現を指示するベクターを用いてもよい。例えば、強い誘導性Ｔ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを用いてもよい。
【００６０】
組換えタンパク質発現は、宿主細胞が、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれている遺伝的背景を提供することによって、宿主細菌中で最大にすることが可能である（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎら， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：１１９−２８， １９９０）。あるいは、ポリヌクレオチド配列を改変して特定の宿主細胞、例えば大腸菌の優先的なコドン利用を提供することが可能である（Ｗａｄａら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−１８， １９９２）。
【００６１】
酵母発現系において、アルファ因子、アルコール酸化酵素、またはＰＧＨプロモーターなどの恒常性または誘導性プロモーターを含む、いくつかのベクターは、例えば、酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で用いることが可能である。さらに、こうしたベクターは、発現されたタンパク質の分泌または細胞内保持いずれかを指示し、そして安定した増殖のため、宿主ゲノムへの異質の配列の組込みを可能にする（例えばＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５； Ｂｉｔｔｅｒら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４， １９８７；およびＳｃｏｒｅｒら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４， １９９４を参照されたい）。植物系もまた、ラットＰＤＥ１０Ａ発現に用いることが可能である。ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガ・リーダー配列と組み合わせて用いられる、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターによって駆動することが可能である（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１， １９８７）。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを用いることが可能である（例えばＣｏｒｕｚｚｉら， ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０， １９８４； Ｂｒｏｇｌｉｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３， １９８４；およびＷｉｎｔｅｒら， Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５， １９９１を参照されたい）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体仲介トランスフェクションによって、植物細胞に導入することが可能である（例えばＴｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， ニューヨーク州ニューヨーク， ｐｐ．１９１−１９６， １９９２を参照されたい）。
【００６２】
哺乳動物細胞において、ウイルスに基づくいくつかの発現系を利用することが可能である。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列からなる、アデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結することが可能である。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入を用いて、感染した宿主細胞においてラットＰＤＥ１０Ａを発現する、感染性ウイルスを得ることが可能である（例えばＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９， １９８４を参照されたい）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることが可能である。ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターもまた、高レベルタンパク質発現に用いることが可能である。
【００６３】
ＨＡＣ、ＢＡＣ、またはＹＡＣもまた、プラスミドに含まれそしてプラスミドから発現されることが可能なＤＮＡの巨大断片を搬送するのに使用することが可能である。例えば、療法目的のため、約６ｋｂから１０ＭｂのＨＡＣを構築し、そして慣用的な搬送法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞）を介して搬送する（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５， １９９７を参照されたい）。哺乳動物系における組換えタンパク質の長期間の産生には、細胞株中のラットＰＤＥ１０Ａの安定発現が好ましい。例えば、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列は、同一または別個のベクター上に、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素および選択可能マーカー遺伝子を含んでもよい発現ベクターを用いて、細胞株に形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に、栄養強化培地中で、約１から２日間、増殖させてもよい。選択可能マーカーの目的は、選択剤への耐性を与えることであり、そしてこのマーカーの存在は、導入配列の発現に成功した細胞の増殖および回収を可能にする。安定形質転換細胞の耐性クローンは、細胞種に適した組織培養技術を用いて、増殖させることが可能である。
【００６４】
本発明はまた、本明細書に記載される核酸配列が、逆方向でベクターにクローニングされるが、制御配列に機能可能であるように連結され、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にするベクターも含む。したがって、コード領域および非コード領域両方を含む、本明細書に記載される核酸分子配列のすべて、または一部に対して、アンチセンス転写物を産生することが可能である。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関連して上に記載されるパラメーター各々にしたがう。
【００６５】
いかなる数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収してもよい。これらには、限定されるわけではないが、それぞれ、ＴＫ−およびＡＰＲ−細胞において使用するための、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）チミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる（例えばＷｉｇｌｅｒら， Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２， １９９７； Ｌｏｗｙら， Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３， １９８０を参照されたい）。また、代謝拮抗剤、抗生物質、または除草剤耐性を、選択の基礎として用いることが可能である。例えば、Ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与え；Ｎｅｏはアミノ配糖体、ネオマイシンおよびＧ−４１８への耐性を与え；そしてＡｌｓおよびＰａｔは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼへの耐性を与える（例えばＷｉｇｌｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０， １９８０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４， １９８１を参照されたい）。代謝産物への細胞要求を改変する、さらなる選択可能遺伝子、例えばＴｒｐＢおよびＨｉｓＤが記載されている（例えばＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７−８０５１， １９８８を参照されたい）。視覚的マーカー、例えばアントシアニン類、緑色蛍光タンパク質類（ＧＦＰ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、β−グルクロニダーゼおよびその基質β−グルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンを用いることが可能である。これらのマーカーは、形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性または安定タンパク質発現の量を定量化するためにも用いることが可能である（例えばＲｈｏｄｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−１３１， １９９５を参照されたい）。マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在することを示唆するが、遺伝子の存在および発現を確認する必要はない可能性がある。例えば、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定することが可能である。あるいは、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの調節下で、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする配列と共に、タンデムに置くことが可能である。誘導または選択に反応したマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデムなＰＤＥ１０Ａ配列の発現もまた示す。
【００６６】
一般的に、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする核酸配列を含み、そしてラットＰＤＥ１０Ａを発現する宿主細胞は、当業者に知られる多様な方法によって、同定することが可能である。これらの方法には、限定されるわけではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、およびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が含まれ、これは、核酸またはタンパク質配列の検出および／または定量化のための、膜、溶液、またはチップに基づく技術を含む。
【００６７】
特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体いずれかを用いて、ＰＤＥ１０Ａの発現を検出し、そして測定するための免疫学的方法が、当該技術分野に知られる。こうした技術の例には、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれる。これらおよび他のアッセイは、当該技術分野に公知である（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ， Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， ミネソタ州セントポール、第ＩＶ項， １９９０； Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ニューヨーク州ニューヨーク， １９９７；およびＰｏｕｎｄ， Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ニュージャージー州トトワ， １９９８を参照されたい）。非常に多様な標識およびコンジュゲート化技術が当業者に知られ、そしてこうした技術を、多様な核酸およびアミノ酸アッセイで用いることが可能である。
【００６８】
ラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産生する手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識化ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅が含まれる。
【００６９】
あるいは、ラットＰＤＥ１０Ａをコードする配列またはその断片いずれかを、ｍＲＮＡプローブを産生するため、ベクターにクローニングすることが可能である。こうしたベクターは、当該技術分野に知られ、商業的に入手可能であり、そしてＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識化ヌクレオチドを添加することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するのに用いることが可能である。これらの方法は、多様な商業的に入手可能なキット（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ； Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン；およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、オハイオ州クリーブランド）を用いて行うことが可能である。検出を容易にするために用いてもよい、適切なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質、または色素産生剤と共に、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００７０】
ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で、培養することが可能である。形質転換細胞によって産生されたタンパク質は、用いた配列および／またはベクターに応じて、分泌される可能性もまたは細胞内に保持される可能性もある。当業者に理解されるであろうように、ラットＰＤＥ１０Ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通じて、ラットＰＤＥ１０Ａの分泌を指示するシグナル配列を含むよう、設計することが可能である。さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力、または発現されたタンパク質を望ましい様式でプロセシングする能力に関して、選択することが可能である。ポリペプチドのこうした修飾には、限定されるわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれる。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」型を切断する翻訳後プロセシングもまた、タンパク質標的化、フォールディング、および／または活性を特定するのに用いることが可能である。
【００７１】
翻訳後活性の特定の細胞機構および特徴的機構を有する、異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８）が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）から入手可能であり、そして異質のタンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択することが可能である。本発明の別の態様において、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドをコードする、天然、修飾、または組換え核酸配列を、異種配列に連結し、前述の宿主系いずれかにおいて、融合タンパク質の翻訳を生じることが可能である。例えば、商業的に入手可能な抗体によって認識することが可能な異種部分を含む、キメラＰＤＥ１０Ａタンパク質は、ＰＤＥ１０Ａポリペプチド活性の調節因子に関して、ペプチドライブラリーをスクリーニングするのを容易にすることが可能である。異種タンパク質およびペプチド部分はまた、商業的に入手可能なアフィニティーマトリックスを用いて、融合タンパク質の精製を容易にすることも可能である。こうした部分には、限定されるわけではないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、および赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれる。ＧＳＴ、ＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、および６−Ｈｉｓは、それぞれ、固定化グルタチオン、マルトース、フェニルアルシンオキシド、カルモジュリン、および金属キレート樹脂上での同族（ｃｏｇｎａｔｅ）融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、および赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する、商業的に入手可能なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。融合タンパク質はまた、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドコード配列および異種タンパク質配列の間に位置するタンパク質分解切断部位を含むよう設計して、精製後、ＰＤＥ１０Ａポリペプチドを異種部分から切断することが可能であるようにすることも可能である。融合タンパク質発現および精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５、上記、第１０章）に論じられる。多様な商業的に入手可能なキットもまた、融合タンパク質の発現および精製を容易にするのに用いることが可能である。
【００７２】
本発明のさらなる態様において、放射標識ラットＰＤＥ１０Ａの合成は、ＴＮＴウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ（ｗｈｅａｔ）胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで達成することが可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーターと、機能可能であるように関連しているタンパク質コード配列の、転写および翻訳をカップリングする。翻訳は、放射標識アミノ酸、例えば３５Ｓ−メチオニンの存在下で行う。
【００７３】
ラットＰＤＥ１０Ａの断片は、組換え手段によってのみでなく、固相技術を用いた直接ペプチド合成によっても、産生することが可能である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記、ｐｐ．５５−６０を参照されたい）。タンパク質合成は、手動技術によって、または自動化によって、行うことが可能である。自動化合成は、例えば、ＡＢＩ（登録商標）４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、達成することが可能である。ラットＰＤＥ１０Ａの多様な断片を別個に合成し、そしてその後、組み合わせて、全長分子を産生することが可能である。
核酸アレイ
本発明は、図１Ａに提供される配列情報に基づく、核酸分子のアレイまたはマイクロアレイなどの核酸検出キットをさらに提供する。
【００７４】
本明細書において、アレイまたはマイクロアレイは、紙、ナイロン、または他の種類の膜、フィルター、チップ、ガラススライド、あるいは他の適切な固体支持体いずれかの上で合成された、別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアレイを指す。１つの態様において、Ｃｈｅｅら、米国特許第５，８３７，８３２号、Ｃｈｅｅら、ＷＯ ９５／１１９９５、Ｌｏｃｋｈａｒｔら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：１６７５−８０， １９９６、Ｓｃｈｅｎａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１９， １９９６に記載される方法にしたがって、マイクロアレイを調製し、そして用いる。他のアレイは、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第５，８０７，５２２号、およびＢａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒら、ＷＯ ９５／２５１１６に記載される方法によって産生する。
【実施例】
【００７５】
実施例１：ＰＤＥ１０Ａ発現パターン
ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡは、脳内で、線条体、側坐核、および嗅結節において、先に報告されている（ＬａｎｆｅａｒおよびＲｏｂａｓ、ＥＰ ０９６７２８４）。以下の実験は、これらの知見を確認し、そしてマウスおよびラットにおけるＰＤＥ１０Ａ発現をさらに性質決定する。
【００７６】
脳切片作成
迅速な断頭後、マウスおよびラット脳を収集し、ドライアイス上、イソペンタン中で凍結し、そしてＨａｃｋｅｒ−Ｂｒｉｇｈｔクリオスタット（Ｈａｃｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニュージャージー州フェアフィールド）上で２０μｍの切片に切断した。すべてのレベルのマウスおよびラット脳由来の切片を、あらかじめＶｅｃｔａｂｏｎｄＴＭ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）で被覆したスライド上に融解マウントし、４％パラホルムアルデヒド溶液中で固定し、エタノール中で脱水し、そして使用するまで、気密容器中、４℃で、乾燥剤と共に保存した。
【００７７】
メッセンジャーＲＮＡプローブ生成
マウスＰＤＥ１０Ａ ｃＤＮＡから単離した９１４塩基対断片（塩基対３８０−１２９４に対応する）を含むプラスミドＤＮＡを大腸菌（ＤＨ５α）に挿入し、この菌を懸濁培養で増殖させた。プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）で抽出し、そして使用するまで保存した。アンチセンスプローブ用に、プラスミドをＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼで直線化した。センスプローブ用に、プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で直線化した。その後、テンプレートＤＮＡを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして転写し、そしてＭａｘｉｓｃｒｉｐｔＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースティン）を用いて、３３Ｐ−ＵＴＰで標識した。アンチセンスプローブはＴ７ポリメラーゼで生成し、そしてセンスプローブはＳＰ６ポリメラーゼで生成した。Ｇ５０ ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＴＭカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、最終標識化リボプローブを調製し、そして商業的なハイブリダイゼーション緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で希釈した。
【００７８】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
スライドにマウントした脳切片を、プロテイナーゼＫ（１μｇ／ｍｌ）中で５分間インキュベーションし、ＲＮアーゼ不含水中でリンスし、ｐＨ８．０の０．１Ｍトリエチルアミン（ＴＥＡ）に懸濁し、そして０．２５％無水酢酸を５分間添加することによって、アセチル化した。３３Ｐを含む１０−２５μｌ／切片の体積で、スライドにマウントした切片にプローブを適用した（切片あたり０．５−１ｘ１０６ｃｐｍ）。対照として、少数のマウス脳切片を、ハイブリダイゼーション前に、ＲＮアーゼＡ（２０μｇ／ｍｌ）で前処理した。切片は、５０℃で、湿気のある環境中、一晩インキュベーションし、そしてその後、２ｘＳＳＣ中でリンスし、ＲＮアーゼＡで処理して、一本鎖ＲＮＡを分解し、標準的な一連の洗浄で洗浄し、そして一連の段階のエタノール溶液中で脱水した。生じたスライドを、標準的Ｘ線カセット中で、β−マックスフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に並置し、そして５−１０日間曝露した。
【００７９】
フィルム曝露後、安全光条件下、４３℃で、水で１：１に希釈したＫｏｄａｋ（登録商標）ＮＴＢ−２乳剤（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、ニューヨーク州ロチェスター）に、スライドを浸した。スライドを空気乾燥させ、そして完全な暗所で、−２０℃で保存しながら、２週間曝露した。スライドを、Ｋｏｄａｋ（登録商標）Ｄ−１９現像液およびＫｏｄａｋ（登録商標）固定液中で、１９℃で現像した。１％トルイジンブルーで対比染色し、アルコール中で脱水し、そしてカバーグラスを置いた。
【００８０】
ＰＤＥ１０Ａ特異的抗体
免疫細胞化学研究のため、ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチドに対して向けられる抗体を生成した。Ｃ末端Ｈｉｓタグを含む、全長ラットＰＤＥ１０Ａ配列（図１Ｂ、配列番号２）は、先に報告される方法（Ｆａｗｃｅｔｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３７０２−０７， ２０００）にしたがって、Ｓｆ９昆虫細胞中で発現させた。Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー、緩衝液交換、および陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた３工程精製によって、９５％純粋であり、質量分析によって決定されるように９７Ｋｄの予測される適切な分子量を有し、そしてｃＧＭＰ加水分解活性を有する最終産物を得た。精製ＰＤＥ１０Ａを用いて、マウスを免疫感作し、そして標準的プロトコルを用いて、クローン性ハイブリドーマを調製した。２４Ｆ３．Ｆ１１と称される抗体を使用のため選択した。
【００８１】
ヒトおよびラットＰＤＥ１０Ａに対するモノクローナル２４Ｆ３．Ｆ１１抗体の親和性は、ヒトＰＤＥ１０Ａを発現するＳｆ９細胞株およびラットＰＤＥ１０Ａを発現するＳｆ９細胞株由来の細胞溶解物を用いて試験した。モノクローナル２４Ｆ３．Ｆ１１抗体は、ラットおよびヒト組換えＰＤＥ１０Ａを認識する。組換え細胞と共に、対照Ｓｆ９細胞由来の溶解物を、ゲル電気泳動に供した。その後、ゲルのブロットを２４Ｆ３．Ｆ１１抗体とインキュベーションし、そしてブロットへの２４Ｆ３．Ｆ１１抗体の結合を測定した。組換えタンパク質を発現しないＳｆ９細胞由来の溶解物を含むレーンでは、ＰＤＥ１０Ａ免疫反応性は観察されなかった。
【００８２】
ＰＤＥ１０Ａに対する２４Ｆ３．Ｆ１１抗体の特異性を、他の１０のＰＤＥ遺伝子ファミリー由来のＰＤＥ類に比較した。２４Ｆ３．Ｆ１１抗体は、他のＰＤＥいずれとも交差反応しなかった。
【００８３】
免疫細胞化学およびウェスタンブロット
ラット脳の異なる領域におけるＰＤＥ１０Ａの発現は、２４Ｆ３．Ｆ１１抗体でのウェスタンブロッティングおよび免疫細胞化学によって決定した。ウェスタンブロット解析のため、ラットを断頭によって屠殺し、そして脳を迅速に取り出し、そして氷上で冷却した。異なる脳領域を同定し、そして標準的技術を用いて、顕微解剖した。脳切片を、ガラス／ガラス・ホモジナイザー中、１０体積の緩衝液（２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０）中でホモジナイズした。溶解物を４０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ・ハンブルグ、モデル５４１７Ｒ）で遠心分離し、そして標準的プロトコルを用いて、上清をウェスタンブロット解析に供した。
【００８４】
免疫細胞化学のため、ラット脳を、１０％緩衝化ホルマリン（ｐＨ７．０）中で、２４時間、液浸固定し、そしてその後、パラフィンに包埋した。切片（６μｍ）は脱パラフィン処理し、そして蒸留水中で水和した。クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて、９６℃で２０分間加熱し、マスク化したエピトープを回収した。切片を、２４Ｆ３．Ｆ１１抗体（１．２μｇ／ｍｌ）と、室温で６０分間インキュベーションした。対照として、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体および飽和濃度（ウェスタンブロットによって決定されるようなもの）のＰＤＥ１０Ａをあらかじめ吸収させた２４Ｆ３．Ｆ１１抗体を、複製切片上で平行してインキュベーションした。陽性染色は、アビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合体を用いて検出し、そしてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて視覚化した。ＩｇＧ１およびあらかじめ吸収したＦ１１対照では、反応産物は観察されなかった。
【００８５】
ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡ局在
ＰＤＥ１０Ａアンチセンス標識化マウス脳切片のオートラジオグラフは、非常に特異的なハイブリダイゼーションシグナルを示した。濃い標識化が３つの領域：背側線条体（尾状核および被殻）、腹側線条体（側坐核）、および嗅結節のみで見られた。線条体および側坐核内では、ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡは、これらの構造に見られるすべてのニューロンの約９５％に相当する、線条体中型有棘ニューロンで、高く発現されていた。歯状回および海馬のＣＡ層で、そして小脳の顆粒細胞層で、より低い密度の標識化が見られた。マウスに比較し、ラット脳の標識化パターンに、有意な相違は見られなかった。
【００８６】
ＰＤＥ１０Ａのｉｎ ｓｉｔｕ標識化は特異的であった。ハイブリダイゼーション前にＲＮアーゼＡで前処理したマウス脳切片は、標識のいかなる可視の取り込みも持たなかった。
【００８７】
ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡ局在領域および高ドーパミン受容体発現と古典的に関連付けられている領域の間には、非常に優れた一致があった。この類似性は、細胞下位置決定およびフィルムオートラジオグラフィーに比較して増加した分解能を提供する、乳剤オートラジオグラフによって、さらに支持された。銀粒子の濃い取り込みが、線条体、側坐核、および嗅結節全体で見られ、そしてこれら３つの領域のニューロン細胞体の大部分に被っているのが見られた。さらに、低いが測定可能なレベルのドーパミン受容体を発現する領域もまた、粒子沈着を示し、その相対ＤＡ受容体密度と大まかに一致していた。これらには、特に、正中前前頭皮質および前前頭皮質溝（ｍｅｄｉａｌ ａｎｄ ｓｕｌｃａｌ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ）と共に、歯状回および海馬のＣＡ層が含まれた。しかし、濃いドーパミンＤ１受容体発現の領域である、黒質網様部には粒子集積は見られなかった。
【００８８】
ＰＤＥ１０Ａタンパク質局在
ｍＲＮＡレベルと一致して、高ベルのＰＤＥ１０Ａタンパク質が、線条体（尾状核および被殻）、側坐核、および嗅結節で示された。ＰＤＥ１０Ａタンパク質は、ニューロン細胞体で、そして神経網全体で観察された。さらに、内包、淡蒼球、脳脚内核（ｅｎｔｏｐｅｄｕｎｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ）、および黒質を含む、線条体中型有棘ニューロンが突出する脳領域に、高レベルのＰＤＥ１０Ａタンパク質が観察されたが、ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡは観察されなかった。これらの領域にＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡが存在しないことを考慮すると、高レベルのＰＤＥ１０Ａタンパク質は、線条体中型有棘ニューロンの軸索および終末から生じているにちがいない。
実施例２：ＰＤＥ１０Ａ選択的調節因子に関するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
パパベリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によって、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定された。他の遺伝子ファミリー由来のＰＤＥ類に比較して、ＰＤＥ１０Ａを阻害する能力に関して、パパベリンを試験した。ヒトＰＤＥ２、３、および５は海綿体から単離し、ヒトＰＤＥ１は心室から単離し、そしてヒトＰＤＥ４は骨格筋から単離した（Ｂｏｏｌｅｌｌら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：７−５２， １９９６）。ホスホジエステラーゼ７−１１は、先に記載されるように、ＳＦ９細胞にトランスフェクションした全長組換えクローンから生成した（Ｆｉｓｈｅｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２４６：５７０−５７７， １９９８； Ｆｉｓｈｅｒら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−１５５６４， １９９８ｂ； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇら， ＰＮＡＳ ９６：７０７１−７０７６， １９９９； Ｆａｗｃｅｔｔら， ＰＮＡＳ ９７：３７０２−３７０７， ２０００）。酵素は、Ｂｏｏｌｅｌｌら、上記に記載されるように、細胞溶解物の可溶性分画からのＦＰＬＣによって精製した。
【００８９】
ＰＤＥ活性は、先に記載されるような、ＳＰＡに基づく方法を用いて測定した（Ｆａｗｃｅｔｔら、２０００）。多様な阻害剤濃度の存在下で、固定量のＰＤＥ１０Ａ酵素を用いて、アッセイを行った。アッセイに用いた環状ヌクレオチド基質（非標識対［３Ｈ］標識が３：１の比のｃＧＭＰまたはｃＡＭＰ）は、Ｋｍ濃度の１／３であり、異なるＰＤＥ類に関する阻害剤ＩＣ５０値の比較を可能にした。最終アッセイ体積は、アッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）で１００μｌに調整した。
【００９０】
酵素の添加によって反応を開始した。試料を３０℃で３０−６０分間インキュベーションして、＜３０％の基質代謝回転を与え、そして３ｍＭの適切な非標識化環状ヌクレオチドを含む、５０μｌケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で終結させた。プレートを再封印し、そして２０分間震蘯し；その後、３０分間、ビーズを暗所で安定させ、そしてその後、ＴｏｐＣｏｕｎｔプレート読み取り装置（Ｐａｃｋａｒｄ、コネティカット州メリデン）上で計測した。放射能単位は、非阻害対照（１００％）に比較して、活性パーセントに変換した。ＩＣ５０値は、「Ｆｉｔ Ｃｕｒｖｅ」Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を用いて得た。
【００９１】
パパベリンは、ＰＤＥ１０Ａの競合阻害剤と同定され、ＩＣ５０値は１７ｎＭであった。パパベリンは、試験した他のＰＤＥ類すべてに対して、かなり効力が劣り（表１）、ＰＤＥ１０Ａへの選択性が立証された。
【００９２】
表１．多様なＰＤＥ遺伝子ファミリーのパパベリン阻害
【００９３】
【表１】
【００９４】
実施例３：初代線条体中型有棘ニューロン−パパベリンの影響
パパベリンがＰＤＥ１０Ａを阻害する特異性を考慮して、パパベリンを培養初代線条体中型有棘ニューロンに投与し、選択的ＰＤＥ１０Ａ阻害が、これらの細胞における環状ヌクレオチド代謝に対するユニークな影響を有するかどうか決定した。パパベリンの影響を、他のＰＤＥ阻害剤、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ロリプラム、およびザプリナスト（ｚａｐｒｉｎａｓｔ）（すべてＳｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイスから入手可能なＰＤＥ阻害剤）の投与から生じる影響と比較した。
【００９５】
線条体培養は、先に記載されるように調製した（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ７：２１３−２２２， １９９５）。簡潔には、Ｅ１７ラットから線条体（尾状核および被殻）を切除し、解離させて単細胞懸濁物を生じ、そしてポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン（カタログ番号３５４６５７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）で被覆した９６ウェルプレート中に、５ｘ１０４ニューロン／ウェルの密度で蒔いた。細胞を、Ｂ２７補足剤（カタログ番号１７５０４−０１０、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）およびヒト組換え脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）（カタログ番号２４８−ＢＤ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（カタログ番号２１１０３−０４９、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で蒔いた。線条体中型有棘ニューロンは、先に記載されるようなＧＡＢＡ免疫反応性プロトコルによって確認されるように、これらの培養中の細胞の５０−６０％を構成した（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａら、１９９５、上記）。これらの培養中のＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡの発現は、以下にさらに記載されるように、ＲＮアーゼ保護アッセイによって確認した。
【００９６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでおよそ４日置いた後、線条体細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄し、そしてＣａ２＋／Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝生理食塩水、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌデキストロース、および５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液中で、１時間プレインキュベーションした。その後、線条体細胞をＰＤＥ阻害剤の１つに曝露し、そして３７℃で２０分間インキュベーションした。ｃＧＭＰを測定する際、ニューロンは、ＰＤＥ阻害剤と２０分間インキュベーションした後、ニトロプルシド・ナトリウム（ＳＮＰ）（１００μＭ）で２分間刺激した。ｃＡＭＰを測定する際、ニューロンは、２０分間の阻害剤インキュベーションの間、フォルスコリン（１μＭ）で刺激した。これらのＳＮＰおよびフォルスコリン濃度は、最大反応（１０００μＭ ＳＮＰおよび１０μＭフォルスコリンは、それぞれ、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの最大増加を生じた）のおよそ２０−２５％を生じる、最大以下の濃度として選択した。
【００９７】
ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ ＳＰＡ系（それぞれ、ＡｍｅｒｓｈａｍコードＲＰＡ ５４０およびＲＰＡ ５５９）を用いて、細胞溶解物中のｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ濃度それぞれを検出した。ＳＰＡ直接スクリーニングアッセイ緩衝液（０．０１％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢酸）および緩衝液Ａ（１３３ｍｇ／ｍｌドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）の９：１の組み合わせを用いて細胞を溶解し、そして溶解物をドライアイス上で凍結した。
【００９８】
ＳＮＰまたはフォルスコリンによって刺激されていない細胞において、パパベリンは、線条体培養中のｃＡＭＰまたはｃＧＭＰレベルいずれにも影響を与えなかった。ＰＤＥ阻害剤の非存在下で、フォルスコリン（１μＭ）およびＳＮＰ（１００μＭ）の最大以下の濃度は、基底ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰより２−３倍の増加を引き起こした。パパベリンは、ＳＮＰ誘導ｃＧＭＰ集積に、濃度依存増加を引き起こし、ＥＣ２００（２倍増加を生じる阻害剤の濃度）値は、１１．７μＭであった（表２）。最大効果は、１００μＭパパベリンで観察され；ｃＧＭＰレベルは、ＳＮＰのみで刺激された培養より５倍上昇した。パパベリンはまた、フォルスコリン刺激培養において、ｃＡＭＰ集積の増加も引き起こし、ＥＣ２００は、３８．３であった（表２）。したがって、パパベリンは、ｃＧＭＰ ＥＣ２００／ｃＡＭＰ ＥＣ２００の比によって決定されるように、ｃＧＭＰよりｃＡＭＰの増加を促進する際、３．３倍、より有効でなかった（表２）。
【００９９】
対照的に、非選択的ＰＤＥ阻害剤、ＩＢＭＸは、ＳＮＰまたはフォルスコリン刺激培養において、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ集積両方で、濃度依存（３−１００μＭの範囲）増加を引き起こし、ＥＣ２００値は、それぞれ、１９および３０μＭであった。選択的ＰＤＥ４阻害剤、ロリプラムは、２．５μＭのＥＣ２００値でフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ集積を増加させ、そしてｃＧＭＰ集積速度を倍にするのに、１０倍高い濃度を必要とした。ｃＧＭＰ優先ＰＤＥ阻害剤、ザプリナストは、９８μＭの濃度で、これらのニューロンにおけるｃＡＭＰレベルを倍にした。しかし、この化合物１００μＭは、ｃＧＭＰのレベルをまったく倍にしなかった。各ＰＤＥ阻害剤のｃＧＭＰ ＥＣ２００／ｃＡＭＰ ＥＣ２００の比の比較は表２に示され、そしてＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤（パパベリンに代表されるようなもの）が、線条体中型有棘ニューロンにおける環状ヌクレオチド制御にユニークな影響を有することを立証する。
【０１００】
表２．ＰＤＥ阻害剤の比較
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
ＲＮアーゼ保護アッセイ
ＲＮＡは、先に記載されるように、５．７Ｍ塩化セシウム勾配を通じて、２０℃、１５０，０００ｘｇで２１時間遠心分離することによって、ラット線条体中型有棘ニューロンの初代培養から調製した（Ｉｒｅｄａｌｅ ＰＡら， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０：１１０３−１１１０， １９９６）。ＲＮＡペレットを０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２に再懸濁し、そしてエタノール中で沈殿した。ＲＮＡ濃度は、分光測定によって測定した。ＰＤＥ１０Ａリボプローブは、マウスｃＤＮＡから単離した９１４ｂｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ １１０５０７の塩基対３８０−１２９４に対応する）のＰＣＲ増幅によって調製した。この断片をその後、ｐＧＥＭ３Ｚｆにクローニングした。ベクターを直線化し、そしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、［３２Ｐ］標識化アンチセンスリボプローブを合成した。
【０１０３】
ＲＮアーゼ保護アッセイは、ＲＰＡＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。簡潔には、５μｇの総細胞ＲＮＡを［３２Ｐ］標識化ＰＤＥ１０Ａリボプローブ（およそ１０５ｃｐｍ／試料）と、４２℃で一晩、ハイブリダイズさせた。翌日、試料を、ＲＮアーゼＡおよびＴ１と、３７℃で３０分間インキュベーションし、そしてその後、保護された二本鎖ＲＮＡ断片を沈殿させ、そして尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。このアッセイの結果により、ＰＤＥ１０Ａ ｍＲＮＡが、線条体中型有棘ニューロンの初代培養中に、高レベルで存在することが確認された。
実施例４：ラットＰＤＥ１０Ａのクローニングおよび配列決定
ヒトＰＤＥ１０Ａのタンパク質コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０２０５９３）を用いて、基本的局所並列検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． ２１５， ４０３−４１０， １９９０）を用い、非ヒトＥＳＴを含む米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの選択されたサブセットを検索した。１つのラットＥＳＴ（Ｈ３２７３４）によって予測されるアミノ酸配列は、ヒトタンパク質の内部部分に相同であった。さらに、このＥＳＴの核酸配列は、マウスＰＤＥ１０Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１１０５０７）のものに非常に相同であった。我々はこのＥＳＴ情報に加え、５’および３’ｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）技術を用いて、ラット脳ＲＮＡの真の５’および３’配列を同定し、これをその後、完全ラットＰＤＥ１０Ａ ｃＤＮＡを単離するのに用いた。
【０１０４】
５’ＲＡＣＥは、製造者の推奨にしたがい、５’ＲＡＣＥキット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡは、遺伝子特異的３’プライマー１３５８（表３）、スプレーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット脳由来の１μｇの総ＲＮＡ、およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて生成した。第一周期ＰＣＲは、入れ子３’遺伝子特異的プライマー１３５７（表３）およびキットの５’アダプタープライマー（短縮（ａｂｒｉｄｇｅｄ）アンカープライマー（ＡＡＰ））を用いて行った。周期条件には、最初の９４℃、２分間の変性、その後、９４℃、４５秒間の変性、５４℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、３分間の伸長の３５周期に加え、最後の７２℃、１０分間の伸長が含まれた（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）。
【０１０５】
上述の周期条件を用いて、入れ子遺伝子特異的プライマー１３５６（表３）およびキットの５’アダプタープライマー（短縮普遍的増幅プライマー（ＡＵＡＰ））と共に、第一周期のＰＣＲ産物（１μｌ）を第二周期のＰＣＲのテンプレートとして用いた。６つの別個のＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲル上の電気泳動によって同定した。これらのバンドは、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて個々に単離し、ｐＣＲ４ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）にクローニングし、そしてＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。コロニーは、上述のように、ベクター特異的プライマー１３６９および１３７０（表３）を用いたＰＣＲによってスクリーニングし、そして各バンド由来の多数の陽性クローンを配列決定した。
【０１０６】
すべての配列を並列し、ラットＰＤＥ１０Ａの５’端のコンセンサス配列を生じた。３’ＲＡＣＥは、製造者の指示にしたがい、３’ＲＡＣＥキット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて行った。第一鎖ｃＤＮＡは、３’アダプタープライマー（ＡＰ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素を用いて、２μｇラット脳総ＲＮＡから生成した。第一周期のＰＣＲは、遺伝子特異的５’プライマー１３７５（表３）およびキットの３’ＡＰを用いて行った。周期条件は、上述のとおりであった。同一の周期条件を用いて、入れ子プライマー１３７６（表３）および３’ＡＵＡＰと共に、第一周期ＰＣＲ産物（１μｌ）を第二周期のＰＣＲのテンプレートとして用いた。ほぼ期待される大きさである４つの別個のＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル上での電気泳動によって同定した。上述のように、これらのバンドを単離し、そしてサブクローニングし、そしてコロニーをスクリーニングした。陽性クローンは、１つのＰＣＲ産物から同定された。これらのクローンのうち６つ由来の配列を並列し、ラットＰＤＥ１０Ａの３’端のコンセンサス配列を生じた。
【０１０７】
全長ラットＰＤＥ１０Ａ ｃＤＮＡを単離するため、第一鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）系（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、総ラット脳ＲＮＡから、３つ組で生成した。５’プライマー１３８０および３’プライマー１４０７（表３）は、上述のように生成されたラット５’および３’配列情報から設計し、そしてクローニングを容易にするため、隣接するＳａｌＩ制限部位を含むように操作した。ＰＣＲは、高忠実度ＰＣＲ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｒｏｃｈｅ）、スイス・バーゼル）を用いて行った。周期条件は、最初の９４℃、２分間の変性、その後、９４℃、４５秒間の変性、４８℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、３．５分間の伸長の４周期、その後、９４℃、４５秒間の変性、５５℃、３０秒間のアニーリング、７２℃、３．５分間の伸長の３５周期に加え、最後の７２℃、１０分間の伸長であった（Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。３つの第一鎖ｃＤＮＡテンプレート各々に関して、別個のＰＣＲ反応を行った。
【０１０８】
各ＰＣＲ反応由来のおよそ２．３ｋｂのバンドを、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル単離し、そしてＰＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、そして上述のように形質転換した。正しいクローンは、ラットＰＤＥ１０特異的プライマー１３８５および１３８６（表３）並びにＳａｌＩ制限消化を用いたコロニーＰＣＲによって、同定した。別個の逆転写ＰＣＲ反応各々由来の多数のクローンを配列決定し、そしてすべての配列を並列し、コンセンサスを決定した。２つのエラー不含クローン（ｐＮＢ１４２６およびｐＮＢ１４２７）を同定し、そして配列決定した。ラットＰＤＥ１０Ａのポリヌクレオチド配列（配列番号１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号２）は、それぞれ、図１Ａおよび図１Ｂに示される。
【０１０９】
表３．ラットＰＤＥ１０Ａをクローニングするためのプライマー配列
【０１１０】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１Ａは、ラットＰＤＥ１０Ａ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド配列を示す。図１Ｂは、ラットＰＤＥ１０Ａポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内ホスホジエステラーゼ１０Ａ活性を阻害する剤をスクリーニングする方法であって：
ｉ）剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてアデニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し；
ｉｉ）剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてグアニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し；
ｉｉｉ）工程（ｉ）の細胞においてｃＡＭＰ生成を、そして工程（ｉｉ）の細胞においてｃＧＭＰ生成を測定し；
ｉｖ）工程（ｉ）に関してｃＡＭＰ ＥＣ２００を、そして工程（ｉｉ）に関してｃＧＭＰ ＥＣ２００を計算することを含み；
ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が、同一のアッセイ条件下でのパパベリンの投与によって生じる比に匹敵する場合、該剤をＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定する
前記方法。
【請求項２】
前記線条体中型有棘ニューロンが、初代培養ニューロンとして調製される、請求項１の方法。
【請求項３】
アデニル酸シクラーゼがフォルスコリンによって活性化され、グアニル酸シクラーゼがニトロプルシド・ナトリウムによって活性化され、そしてｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００比が１．７５−５．２５の範囲にある、請求項２の方法。
【請求項４】
前記ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００比が３．０−４．０の範囲にある、請求項３の方法。
【請求項５】
ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの濃度が、シンチレーション近接アッセイによって測定される、請求項１の方法。
【請求項６】
工程（ｉ）および（ｉｉ）の前に、前記剤が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されている、請求項１の方法。
【請求項７】
前記剤が、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されている、請求項１の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）および（ｉｉ）のニューロンが、別個の試料中にある、請求項１の方法。
【請求項１】
細胞内ホスホジエステラーゼ１０Ａ活性を阻害する剤をスクリーニングする方法であって：
ｉ）剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてアデニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し；
ｉｉ）剤を線条体中型有棘ニューロンに投与し、そしてグアニル酸シクラーゼを最大以下に活性化し；
ｉｉｉ）工程（ｉ）の細胞においてｃＡＭＰ生成を、そして工程（ｉｉ）の細胞においてｃＧＭＰ生成を測定し；
ｉｖ）工程（ｉ）に関してｃＡＭＰ ＥＣ２００を、そして工程（ｉｉ）に関してｃＧＭＰ ＥＣ２００を計算することを含み；
ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００の比が、同一のアッセイ条件下でのパパベリンの投与によって生じる比に匹敵する場合、該剤をＰＤＥ１０Ａ阻害剤と同定する
前記方法。
【請求項２】
前記線条体中型有棘ニューロンが、初代培養ニューロンとして調製される、請求項１の方法。
【請求項３】
アデニル酸シクラーゼがフォルスコリンによって活性化され、グアニル酸シクラーゼがニトロプルシド・ナトリウムによって活性化され、そしてｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００比が１．７５−５．２５の範囲にある、請求項２の方法。
【請求項４】
前記ｃＡＭＰ ＥＣ２００／ｃＧＭＰ ＥＣ２００比が３．０−４．０の範囲にある、請求項３の方法。
【請求項５】
ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの濃度が、シンチレーション近接アッセイによって測定される、請求項１の方法。
【請求項６】
工程（ｉ）および（ｉｉ）の前に、前記剤が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されている、請求項１の方法。
【請求項７】
前記剤が、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、ＰＤＥ１０Ａ選択的阻害剤と同定されている、請求項１の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）および（ｉｉ）のニューロンが、別個の試料中にある、請求項１の方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−６３３７（Ｐ２００６−６３３７Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２１７４３５（Ｐ２００５−２１７４３５）
【出願日】平成１７年７月２７日（２００５．７．２７）
【分割の表示】特願２００２−２１７７１８（Ｐ２００２−２１７７１８）の分割
【原出願日】平成１４年７月２６日（２００２．７．２６）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２７日（２００５．７．２７）
【分割の表示】特願２００２−２１７７１８（Ｐ２００２−２１７７１８）の分割
【原出願日】平成１４年７月２６日（２００２．７．２６）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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