ＲＮＡｉ法を用いた有用アルカロイド生合成中間体の生産法
アルカロイドを産生する植物細胞、植物組織または植物体においてＲＮＡｉ法を用いて、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の発現を阻害することを含む、アルカロイド生合成中間体の生産方法および該方法に用いるＲＮＡｉ遺伝子を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有用アルカロイド生合成中間体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカロイドは、植物に含まれる塩基性含窒素化合物の総称である。アルカロイドはその主要骨格に応じて、キノリン系、イソキノリン系、インドール系、トロパン系、キサンチン系アルカロイドなどに分類される。アルカロイドのなかには薬学的に有用なものが多く、たとえばコデインおよびモルヒネの鎮痛作用や商業的価値はよく知られている。ノスカピンは鎮咳作用化合物として有用である。パパベリンは平滑筋弛緩剤および脳血管拡張薬である。ベルベリンは、抗菌性、抗マラリア性および解熱性化合物として用いられてきた。
【０００３】
イソキノリンアルカロイドは、イソキノリンを基本骨格とするアルカロイドの総称であり、分布も広く、構造も多様である。イソキノリンアルカロイドには例えば、モルヒネ（ｍｏｒｐｈｉｎｅ）型（モルヒネなど）、プロトベルベリン（ｐｒｏｔｏｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）型（ベルベリンなど）、ベンゾフェナンスリジン（ｂｅｎｚｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ）型（サングイナリンなど）のアルカロイドが含まれる。イソキノリンアルカロイドを産生する植物としては、ケシ科（パパベラセアエ（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ））、メギ科（ベルベリダセアエ（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ））、キンポウゲ科（ラナンキュラセアエ（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ））、ツヅラフジ科（メニスペルマセアエ（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ））、ミカン科（ルタセアエ（Ｒｕｔａｃｅａｅ））などが挙げられる。
【０００４】
イソキノリンアルカロイド生合成経路の中間体としては、レチクリンが多数の薬学的生成物への重要な前駆体として注目されてきた。例えば、特許文献１には、ケシにランダムに突然変異を導入し、レチクリン含量の高い植物体を選抜することを含む、レチクリンを製造する方法が開示されている。しかしこの方法は無作為に作成した突然変異体の中からレチクリン含量の高いものを選抜し、その植物体からレチクリンを抽出するという工程を含むため、煩雑なものであった（特許文献１を参照）。
【０００５】
ベルベリン架橋酵素は、イソキノリンアルカロイド生合成経路の酵素の１つであり、レチクリンを基質とする。ベルベリン架橋酵素の発現を遺伝子操作を用いて低下させることにより、その基質であるレチクリン含量を増加させようとする試みがなされてきた。これらの試みは、アンチセンス法により、ベルベリン架橋酵素の発現を特異的に阻害しようとするものであった。しかし、その結果としてベルベリン架橋酵素の発現は阻害され、アルカロイド含量が全般的に著しく低下したものの、レチクリンのような中間代謝産物の特異的な蓄積は観察されなかった（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【０００６】
近年、アンチセンス法のほかに、遺伝子発現の抑制法としてＲＮＡｉ法が利用されている。ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の細胞内への導入によって、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象である。ＲＮＡｉは様々な生物種における遺伝子機能解析に用いられている。例えば、非特許文献３では、ステロイド合成系に関与する酵素を特異的にＲＮＡｉによって阻害することにより、該酵素の基質となる中間体が蓄積することが報告された。しかし、この文献によると、目的の中間体から別の物質への変換がかなり起こっており、中間体を特異的に蓄積させるまでには至っていない。これはステロイドが細胞膜の必須成分であり細胞成長と関係しているため、完全には代謝経路の遮断が起こらないためと考えられる。また、この文献では植物細胞の成長が阻害されたことが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
【０００７】
ＲＮＡｉ法に用いられるＲＮＡｉ用ベクターは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を植物体内で発現させることを目的として作製されるものである。ＲＮＡｉベクターは、その構造に基づき、おおまかに２種類に分類される。
【０００８】
一つは、別々に作製したセンスＲＮＡを発現するプラスミドと、アンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドの組み合わせである。これら２つのプラスミドを、混合して細胞に形質転換し、細胞内で、ｄｓＲＮＡを形成させる。もう一つは、ヘアピン構造をとるＲＮＡを発現するプラスミドである。後者については、線虫、ショウジョウバエ、植物、トリパノソーマなどで報告がある。植物については、導入遺伝子のヘアピン構造の中間にイントロンを導入したものとしないものの遺伝子抑制効力を比較した研究がある。この研究においては、イントロンを持った導入遺伝子のほうがより強力な発現抑制を引き起こすという結果が報告されている。
【０００９】
これまでに、本発明者らは、内在遺伝子と８０％程度の相同性をもつ１００塩基対程度のｄｓＲＮＡを発現させることにより、遺伝子抑制が起こることを観察している。この際ｄｓＲＮＡは、細胞内でＲＮａｓｅによって分解を受け、約２０塩基対のｓｉＲＮＡとなり、ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣと呼ばれる複合体に組み込まれ、この複合体が標的ｍＲＮＡを分解すると考えられている。動物細胞においては、約２０塩基対のｓｉＲＮＡを導入することにより遺伝子発現の抑制がおこることが報告されている。
【特許文献１】特表２００２−５０８９４７号公報
【非特許文献１】サング−ウン・パーク（Ｓａｎｇ−Ｕｎ Ｐａｒｋ）他著、「プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」第１２８巻、２００２年２月、ｐ．６９６−７０６
【非特許文献２】サング−ウン・パーク（Ｓａｎｇ−Ｕｎ Ｐａｒｋ）他著、「プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第５１巻、２００３年、ｐ．１５３−１６４
【非特許文献３】セリン・バーガー（Ｃｅｌｉｎｅ Ｂｕｒｇｅｒ）他著、「ジャーナル・オブ・エクペリメンタル・ボタニー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ）」第５４巻、第３８８号、２００３年７月、ｐ．１６７５−１６８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、特定のアルカロイド生合成中間体の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アルカロイドを産生する植物細胞、植物組織または植物体においてＲＮＡｉ法を用いて、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の発現を阻害することを含む、アルカロイド生合成中間体の生産方法を提供する。
【００１２】
具体的には、後述のＲＮＡｉ遺伝子を用いて目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の発現を阻害して、代謝の流れを遮断することにより、目的のアルカロイド生合成中間体が植物細胞内に蓄積する。
【００１３】
本発明はまた、上記方法によって生産されたアルカロイド生合成中間体を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、上記方法に用いられる、
ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、
ａ）目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列、および、
ｂ）該正方向配列に相補的な逆方向配列
を含む遺伝子を提供する。本明細書においてこの遺伝子を「ＲＮＡｉ遺伝子」と称する。
【００１５】
また、本発明は上記方法に用いられる、以下のＡおよびＢの遺伝子を含む遺伝子の組合せを提供する：
Ａ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列を含む遺伝子、および、
Ｂ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子。
本明細書においてこの遺伝子の組合せを「ＲＮＡｉ遺伝子の組合せ」と称する。
【００１６】
「目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列」とは、生産しようとするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列に対して相同性を有する配列であって、その長さが約１００ｂｐ以上であり、ベクターなどのコンストラクトにおいて転写と同じ方向に挿入された配列のことを指す。
【００１７】
ここで、「酵素の全体または一部をコードする配列」には、該酵素をコードする遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列も含まれる。
【００１８】
「該正方向配列に相補的な逆方向配列」とは、上記の「目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列」に対して相補性を有する配列のことをいう。即ち、ベクターなどのコンストラクトにおいて転写と逆方向に挿入された正方向配列と相同性を有する配列を指す。
【００１９】
ＲＮＡｉ遺伝子においては該正方向配列と逆方向配列はともにプロモーターの下流に位置する必要があるが、正方向配列と逆方向配列のどちらを上流に位置させてもよい。
【００２０】
好ましくは、ＲＮＡｉ遺伝子においては、該正方向配列と逆方向配列の間にスペーサー配列を介在させる。スペーサーを介在させることによって、正方向配列と逆方向配列（以下両配列の繰り返しをインバーテッドリピートと称する）の対合を容易にする空間が生じる。スペーサー配列は特に限定されないが、通常数百ｂｐ〜１ｋｂの長さの配列、例えばイントロン配列が好適に用いられる。
【００２１】
正方向配列、スペーサー配列、および逆方向配列を含むＲＮＡｉ遺伝子を植物細胞内で発現させることにより、植物細胞においてアルカロイド生合成酵素の発現が抑制される。
【００２２】
該正方向配列、スペーサー配列および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含むＤＮＡは、植物細胞においてプロモーターにより誘導されてｍＲＮＡへと転写される。正方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡ部分と逆方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡ部分は、相補的であるため互いに水素結合により結合する。好ましくはかかるＲＮＡはスペーサー配列を介してヘアピン構造の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。このｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ、即ち、標的であるアルカロイド生合成遺伝子の発現の抑制を引き起こすと考えられる。
【００２３】
ＲＮＡｉ遺伝子の組合せを用いる場合は、プロモーターの下流に正方向配列を含むベクター（センスベクターとも呼ばれる）と、プロモーターの下流に逆方向配列を含むベクター（アンチセンスベクター）の両方を植物に導入する。該正方向配列および逆方向配列は、植物細胞においてプロモーターにより誘導されてｍＲＮＡへと転写され、正方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡと逆方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡが、互いに水素結合により結合して二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。このｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ、即ち、標的であるアルカロイド生合成遺伝子の発現の抑制を引き起こすと考えられる。
【００２４】
このようにして、ＲＮＡｉ遺伝子あるいはＲＮＡｉ遺伝子の組合せを用いることにより、二本鎖ＲＮＡが生じる結果、標的アルカロイド生合成遺伝子の発現が阻害され、該酵素の基質であるアルカロイド生合成中間体が細胞内に特異的に蓄積する。
【００２５】
「目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列」は先に定義したように、必ずしも遺伝子のコード領域に含まれる必要はなく、５’ＵＴＲ領域や３’ＵＴＲ領域に位置する配列あるいはプロモーター領域でもよい。ＲＮＡｉはこのような非コード領域の配列を用いることによっても起こる現象である。
【００２６】
さらに本発明は上述したような遺伝子を含むベクターおよび該ベクターにより形質転換された植物細胞または植物組織あるいは植物体を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
これまでの研究では、生合成経路の最終産物の蓄積の抑制は報告されている。しかし、本発明のように中間代謝産物の特異的な蓄積を可能とし、中間体を大量に生産する、あるいは、さらに、新規な反応経路を追加することにより、新たな化合物を生産させようとする観点は無かった。また、かかる観点があったとしても、現実的には、そのようなことを可能とする技術はなかった。今回ＲＮＡｉ法によって、生合成経路の中間代謝産物が蓄積することが明らかになった。本発明は、様々な代謝系において、重要な代謝産物を蓄積させる可能性を示唆しており、その応用範囲は極めて広い。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、イソキノリンアルカロイド生合成経路と生合成酵素を示す図である。
【図２】図２は、インドールアルカロイド生合成経路と生合成酵素を示す図である。
【図３】図３は、中間体レチクリンから派生する化合物を示す図である。
【図４】図４は、中間体ストリクトシジンから派生する化合物を示す図である。
【図５】図５は、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）遺伝子に対するｄｓＲＮＡ発現ベクター、ｐＡＲＴ２７−ＢＢＥｉｒ構築の手順を示す図である。
【図６】図６は、ハナビシソウＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体におけるレチクリン（ｍ／ｚ ３３０）の蓄積のＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図７】図７は、コントロールおよびＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体における、ＢＢＥ酵素活性を示す図である。
【図８】図８は、コントロールおよびＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体における、ＢＢＥ酵素反応をＬＣ／ＭＳ解析した結果を示す図である。
【図９】図９は、コントロールおよびＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体における、レチクリンと、サンギナリンの含量を示す図である。
【図１０】図１０は、ＢＢＥの阻害により、レチクリンからスコウレリンの反応が遮断されることを示す模式図である。
【符号の説明】
【００２９】
１ ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
２ コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
３ Ｎ−メチル−コクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼ
４ ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）
５ グルコシダーゼＩ／ＩＩ
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明において標的とされる植物、即ちｄｓＲＮＡを導入される植物は、アルカロイド生合成経路を有する植物であれば特に限定されない。アルカロイド生合成経路としてはイソキノリンアルカロイド生合成経路が好適であるが、その他にもインドールアルカロイド生合成経路などが好適な標的となりうる。
【００３１】
具体的には、アルカロイド生合成経路を有する植物には以下のものが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ベルベリンを産生する植物、例えば、オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｃｏｐｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｆｒａｎｃｈ，Ｃｏｐｔｉｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｈｓｉａｏ等）、キハダ（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ ａｍｕｒｅｎｓｅ）、メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ属）、ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ヒイラギナンテン（Ｍａｈｏｎｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）およびアキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｍｉｎｕｓ）、モルヒネやコデイン、パパベリンを産生する植物、例えば、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ Ｌｉｎｎ）、アツミゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｅｔｉｇｅｒｕｍ ＤＣ）およびハカマオニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、モルヒネを生産しないが、類縁のアルカロイドを産生する植物、例えば、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ Ｌｉｎｎ）およびヒナゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｒｈｏｅａｓ）、サングイナリンを産生する植物、例えば、ハナビシソウ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、サングイナリア（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉｎｅ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ Ｌ．）、コリダリンを産生する植物、例えば、エンゴサク（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ属植物、例えば、Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｂｕｌｂｏｓａ ＤＣ．，Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｔｅｒｎａｔａ Ｎａｋａｉ，Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｎａｋａｉｉ Ｉｓｈｉｄｏｙａ，Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ Ｐｅｒｓｏｎ）、コロンバミンを産生する植物、例えば、コロンボ（Ｊａｔｅｏｒｈｉｚａ ｃｏｌｕｍｂａＭｉｅｒｓ）、セファランチン（ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ）を産生する植物、例えば、タマサキツヅラフジ（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ ｃａｐｈａｒａｎｔｈａ）、シノメニン（ｓｉｎｏｍｅｎｉｎｅ）を産生する植物、例えば、オオツヅラフジ（Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ ａｃｕｔｕｍ Ｒｅｈｄｅｒ ｅｔ Ｗｉｌｓｏｎ）、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）を産生する植物、例えば、トコン（Ｃｅｐｈａｅｌｉｓ ｉｐｅｃａｃｕａｎｈａ）など。
【００３２】
上記の植物の中ではイソキノリンアルカロイドを合成する植物が好適に用いられ、なかでもサングイナリンやベルベリンを産生する植物、例えば、ハナビシソウ、オウレン、キハダ、メギ、ナンテン、ヒイラギナンテンおよびアキカラマツが好ましく、特にハナビシソウが好ましい。
【００３３】
ＲＮＡｉ遺伝子を導入される標的植物の起源と、導入するＲＮＡｉ遺伝子の起源は、同じであっても異なっていてもよい。標的遺伝子と導入遺伝子の相同性を考慮すると、同じ植物種由来のものが特に好ましい。
【００３４】
本発明の方法においては、目的とする生合成中間体を基質とする酵素をＲＮＡｉによる阻害の標的となる酵素とする。かかる酵素としては、例えば、イソキノリンアルカロイド合成系経路（図１を参照）のベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼが挙げられる。
【００３５】
これらの酵素をＲＮＡｉにより阻害するとその基質であるアルカロイド生合成中間体が蓄積する。具体的には、ベルベリン架橋酵素を阻害するとレチクリン、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを阻害するとノルコクラウリン、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼを阻害するとコクラウリン、そしてＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼを阻害するとＮ−メチルコクラウリンがそれぞれ蓄積する。
【００３６】
イソキノリンアルカロイド生合成経路の酵素以外では例えば、インドールアルカロイド生合成経路（図２を参照）のグリコシダーゼＩ／ＩＩを標的とすると、その基質であるストリクトシジンが蓄積する。
【００３７】
好ましくは本発明の方法により生産されるアルカロイド生合成中間体は、レチクリン、ノルコクラウリン、コクラウリンおよびＮ−メチルコクラウリンからなる群から選択され、特に好ましくはレチクリンである。
【００３８】
レチクリンを製造するには、標的酵素はベルベリン架橋酵素であり、その結果レチクリンが蓄積する。レチクリンの前駆体であるノルコクラウリン、コクラウリンおよびＮ−メチルコクラウリン（図１を参照）、ならびにレチクリンは、図３に示す様々なイソキノリンアルカロイドの前駆体として有用である。また、ストリクトシジンも図４に示す様々なインドールアルカロイドの前駆体として有用である。
【００３９】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす遺伝子は好ましくは、ベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される酵素をコードする配列またはその一部である。ＲＮＡｉを引き起こすためのｄｓＲＮＡの長さは特に限定されないが、少なくとも２３塩基以上、好ましくは１００塩基対から２キロベースであり、最も好ましくは１００塩基対〜８００塩基対である。
【００４０】
本発明においてＲＮＡｉを引き起こす遺伝子の発現を誘導するプロモーターとしては、植物へ導入した際に目的とする遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定されない。かかるプロモーターは当業者によく知られており、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、および、誘導性プロモーター、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターやテトラサイクリンリプレッサー／オペレーター制御系などが挙げられる。
【００４１】
本発明において、正方向配列および逆方向配列と、標的の生合成酵素をコードする遺伝子の配列との相同性は、１００％である必要はない。遺伝子の突然変異、多型、又は進化上の分岐による配列の変動は容認される。標的遺伝子に対する挿入、欠失、及び一塩基点突然変異を有するｄｓＲＮＡ鎖もまた、ＲＮＡｉに有効である。具体的には、ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有するものが好適である。
【００４２】
また、正方向配列と逆方向配列は、転写された後に二本鎖ＲＮＡを形成し得るものであればよい。効率的にｄｓＲＮＡを形成するためには、両者の相補性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００４３】
本発明において標的とする植物へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。それぞれの方法に適したベクターの調製、形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １００：１５０３，１９９５）。
【００４４】
例えば、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ ＳＫ：Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｅｄｓ）ｐｐ．６６−７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １００：１５０３，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７，１９９１）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ：Ｐｌａｎｔ Ｊ ６：２７１，１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、当該技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００４５】
本発明において、植物にＲＮＡｉ遺伝子を導入する際に用いるベクターは、遺伝子導入手段に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、アグロバクテリウムによる遺伝子導入法を用いる場合は、バイナリーベクター、例えば、ｐＡＲＴ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等が好適に用いられる。
【００４６】
本発明のベクターの作成方法としては、特に限定されず、当業者に周知のいかなる方法を用いてもよい。本発明のベクターにおいては、３’末端側へターミネーターが挿入されるが、ターミネーターとしては公知のものがいずれも好適に用いられ、例えば、ＯＣＳターミネーター、ｎｏｓターミネーター、３５Ｓターミネーターなどが挙げられる。
【００４７】
本明細書中、塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３，１９９０）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【実施例】
【００４８】
以下に本発明を特定の実施例に言及して記載するがこれは本発明を例示する目的のものであり、限定する意図のものではない。
【００４９】
（実施例の概要）
アルカロイド生合成遺伝子に対して特異的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を合成する発現ベクターを構築し、その高い抑制効果により、標的遺伝子の発現および酵素活性を効果的に抑制し、中間体が蓄積生産できることを実証した。
【００５０】
具体的には、重要な医薬品であるイソキノリンアルカロイドの生合成中間体を、同アルカロイドを生産する植物細胞の代謝経路を二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法により遮断することにより、生産する方法を開示する。本実施例では、ベンゾフェナンスリジンアルカロイドを生産するハナビシソウ細胞に、その生合成経路の酵素の１つであるベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）の配列の一部に対応するｄｓＲＮＡを発現するベクターを導入した。その結果、かかるアルカロイド生合成系が遮断され、植物細胞における生合成中間体レチクリンの生産が可能となった。
【００５１】
（実施例についての具体的説明）
形質転換が可能なイソキノリンアルカロイド生産性植物ハナビシソウから単離されている生合成酵素ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）遺伝子（配列番号１）に対して既知の配列情報によりプライマーを設計し、ＢＢＥのｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡをもとにｄｓＲＮＡを形成するようなＢＢＥｄｓＲＮＡ発現ベクターを構築した。ついで、同ベクターをハナビシソウ細胞に導入し、ＢＢＥｄｓＲＮＡを発現する形質転換体を得、ベルベリン架橋酵素の基質である生合成中間体であるレチクリンを蓄積する形質転換ハナビシソウ細胞を確立した。
【００５２】
（実験材料および方法）
コンストラクトの作製には、インバーテッドリピート作成用ベクターとして広く用いられているｐＫＡＮＮＩＢＡＬおよびｐＡＲＴ２７を用いた。ｐＫＡＮＮＩＢＡＬは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、その下流に両端に複数の制限酵素サイトをもつイントロン領域、さらにその下流にＯＣＳターミネーターを有する。イントロンの両端に、正方向および逆方向配列を挿入する。かかる配列は、植物体内でｍＲＮＡへと転写され、スプライシングされる。該ＲＮＡは、インバーテッドリピート、すなわち、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。なお、本発明は、必ずしも、このベクターの使用に限定されるものではない。
【００５３】
ハナビシソウＢＢＥ遺伝子の単離
データベースにすでに登録されている配列をもとに、３’ａｒｍ（本明細書において逆方向配列と称される部分）にＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、５’ａｒｍ（本明細書において正方向配列と称される部分）にＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉの制限酵素サイトを持つハナビシソウＢＢＥ遺伝子のほぼ全長約１ｋｂ断片をＰＣＲによりハナビシソウ培養細胞ｃＤＮＡから単離した。
【００５４】
用いたプライマーを以下に示す。
ＢＢＥ−３’ａｒｍ−フォワード（ＦＭ）：ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＴＴ ＣＧＧ ＡＣＴ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＣＣ
（配列番号２）
リバース（ＲＶ）：ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＧ
（配列番号３）
５’ａｒｍ−フォワード（ＦＭ）：ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＴ ＣＧＧ ＡＣＴ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＣＣ
（配列番号４）
リバース（ＲＶ）：ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＧ
（配列番号５）
【００５５】
こうして単離した遺伝子をプラスミドｐＴ７ Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングしたのち、ＳＩＭＡＤＺＵ ＤＳＱ−２０００Ｌにより塩基配列を確認した。
【００５６】
ｄｓＲＮＡ発現ベクターの作製（図５）
３’ａｒｍの挿入
ＢＢＥ−３’ａｒｍ−ＦＷとＲＶのプラーマーペアにより得られたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅにサブクローニングし、配列確認したのち、ＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断した。ベクターｐＫＡＮＮＩＢＡＬも同様に、ＢａｍＨ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで制限酵素で処理した。これらＤＮＡを電気泳動後、フェノール処理、クロロフォルム抽出、エタノール沈殿し、１０μｌのＴＥに溶解させたのち、ライゲーション反応を行ない、ＸＬ１−Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。挿入の確認は制限酵素処理、およびＯＣＳターミネーター配列に対するＡＳ１を用いたシーケンシングによりおこなった。
【００５７】
５’ａｒｍの挿入
ＢＢＥ５’ａｒｍ ＦＷとＲＶのプライマーペアにより得られたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅにサブクローニングし、配列確認したのち、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切断した。タンデムな挿入を防ぐため断片にアルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＣＩＡＰ）を加えて脱リン酸処理した。ＣＩＡＰを失活させるため、６５℃で３０分インキュベートした。その後エタノール沈殿により制限酵素を失活させ、２０μｌのＴＥに溶解した。先に、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬに３’ａｒｍを導入したベクターを同様にＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切断したのち、ライゲーション反応をおこない、ＸＬ１−Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。挿入の確認は制限酵素処理およびＯＣＳターミネーターに対するＡＳ１プライマー、３５Ｓプロモーターに対する−Ｓ１プライマー（３５Ｓｐｒｏ−Ｓ１，ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＴＴ（配列番号６）を用いたシーケンシングによりおこなった。得られたＢＢＥの３’および５’ａｒｍが挿入されたプラスミドをｐＫＡＮＮＩＢＡＬ−ＢＢＥｉｒと称する。
【００５８】
バイナリ−ベクターｐＡＲＴ２７への導入
ｐＡＲＴ２７ベクターを制限酵素ＮｏｔＩおよびアルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＣＩＡＰ）で処理した。また、先に作製したｐＫＡＮＮＩＢＡＬ−ＢＢＥｉｒをＮｏｔＩ処理することにより、インサートを調製した。こうして得られたベクターおよびインサートのそれぞれの反応液をフェノール抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈殿したのち、２０μｌＴＥバッファーに溶解させ、ライゲーションをおこなった。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、制限酵素処理し、目的とするインサートが挿入されていることを確認した。さらに、プライマーとして３５Ｓｐｒｏ−Ｓ１を用いた塩基配列決定をおこない、目的とするｄｓＲＮＡを発現するベクターｐＡＲＴ−２７−ＢＢＥｉｒが作製されていることを確認した。
【００５９】
アグロバクテリウムへの導入
こうして作製したｐＡＲＴ２７−ＢＢＥｉｒをエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株へ導入した。形質転換は、出現してきたコロニーよりＰｒｏｍｅｇａ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓを用いてプラスミド抽出し、制限酵素処理により確認した。
【００６０】
ハナビシソウ細胞の形質転換
構築した発現ベクターの導入はＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：３６７−３７２（２００１）７）に記載の方法に準じて行なった。ハナビシソウ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の種子（カネコ種苗株式会社）をミラクロスに包み、１％オスバンで１分、７０％エタノールで１分、１％アンチホルミンで１４分除菌し、滅菌水で５分ずつ３回洗浄した。こうして除菌された種子を植物体用培地に播種し、２５℃で培養した。発芽後２〜３週間後の植物体の、葉および葉柄をメスで切断し、５ｍｍ〜１ｃｍの切片を得た。次に２昼夜２５℃で振とう培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｐＡＲＴ２７導入用（コントロール）およびｐＡＲＴ２７−ＢＢＥｉｒ導入用）を共存培養用培地で５倍希釈してシャーレに入れ、そこに植物体切片を１０分浸した。その後植物体切片をキムタオルにのせ、培養液を除き、ろ紙をひいた共存用寒天培地に移植した。２日後植物体切片を選抜用寒天培地（アセトシリンゴン１００μＭ、ナフタレン酢酸１０μＭ、ベンジルアデニン１μＭ、ショ糖３％を含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地）で共存培養した。その後セフォタキシム２００μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシン２０μｇ／ｍｌ、ナフタレン酢酸１０μＭ、ベンジルアデニン１μＭ、ショ糖３％を含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地で選抜培養した。３週間ごとに培地を交換し、生育してくる細胞を選抜した。
【００６１】
形質転換体の確認
形質転換体の確認は、導入した遺伝子の存在をゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ解析した。
【００６２】
アルカロイドの分析
細胞からのアルカロイドの抽出は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：３６７−３７２（２００１）７に記載のように行なった。具体的には細胞１ｇに対し、０．０１Ｎ ＨＣｌで酸性化したメタノール４ｍｌを用いて一晩抽出し、その上清を遠心により分離した。その抽出物を島津製作所社ＨＰＬＣ ＳＣＬ−１０システム（移動相：５０ｍＭ酒石酸／１０ｍＭ ＳＤＳ：アセトニトリル：メタノール＝４：４：１、流速１．２ｍｌ／分，カラムＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０）を用いて解析した。また、それぞれのアルカロイドの同定は、島津製作所社製液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ／ＭＳ−２０１０（移動相：水：アセトニトリル：メタノール：酢酸＝３９１：４００：１００：９、流速０．５ｍｌ／分，カラムＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０）を用い行なった（図６）。
【００６３】
ＢＢＥ酵素活性の測定
コントロールおよびＢＢＥ−ｄｓＲＮＡを導入したハナビシソウ形質転換体におけるＢＢＥの活性測定を以下のように行った。まず、新鮮重１ｇの培養細胞に、２ｍｌのグリシン緩衝液（５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ８．９）を加え、氷上にて磨砕した。次いで、細胞抽出液をＰＤ−１０カラムにて脱塩した後、５００μｌの粗酵素液あたり、１ｍＭ相当となるように基質であるレチクリンを加え、３０℃にて反応させた。一定時間後、１０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて反応を停止させ、ＬＣ−ＭＳにてＢＢＥの代謝産物であるスコウレリンの生成を定量した（図７）。
【００６４】
結果
ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡを導入したハナビシソウ形質転換体は、選抜後２ヶ月ほどでカルス化が観察され、その後、液体培地にて培養を行なった。コントロール（ｐＡＲＴ２７導入株）で１９ライン、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡを導入したものでは２０ラインの形質転換体を得た。これらコントロールとＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株では表現型の違いが観察された。コントロールの細胞では細胞が赤色を帯びているのに対し、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株では白い細胞が多く観察された。実際にＨＰＬＣによりアルカロイド組成の変化を解析した結果、図６に示すように、ＢＢＥｄｓＲＮＡを導入した形質転換体において、顕著なレチクリンの蓄積（新鮮物１ｇ当たり約１．５ｍｇ）が認められた。
【００６５】
ＢＢＥ酵素活性については、コントロールと比較して、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株（図中、ＢＢＥｉｒと示す）において顕著なＢＢＥ活性の低下が認められた。即ち、コントロールでは基質であるレチクリンが完全にスコウレリンに変換されているのに対し、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株ではスコウレリンへの転換はほとんど認められなかった（図７）。ＢＢＥ活性のタイムコースを測定し、その活性の定量を行った結果、コントロール株Ｃ２３の活性は、１．８５±０．３３ｐｋａｔ／ｍｇタンパク質であるのに対して、ＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株Ｂ１４では、０．０５６±０．０５１ｐｋａｔ／ｍｇタンパク質であった。即ち、ＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株ではコントロール株の約３％程度にまでＢＢＥ活性が低下していることが認められた（図８）。
【００６６】
なお、コントロール株とＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株のレチクリンおよびサンギナリン含量を調べたところ、図９に示すように、コントロールと比較して、ＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株では総じてレチクリン含量が高かった。
【００６７】
一方、ハナビシソウの根培養物にアンチセンスＢＢＥ ＲＮＡ発現ベクターを導入した場合には、赤色色素が薄くなり、アルカロイド含量が全般的に著しく低下したという報告がなされているものの、本発明のような中間代謝産物の蓄積は観察されなかった（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２８，６９６−７０６（２００２）およびＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５１：１５３−１６４（２００３））。Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５１：１５３−１６４（２００３）の結果によると、アンチセンス法における抑制によっても、０．６ｐｋａｔ／ｍｇタンパク質程度の活性が残存しており、そのために代謝経路の遮断が不十分になったものと考えられる。
【００６８】
これらの知見により、ＲＮＡｉ法が代謝系の遮断に極めて効果的であり、ＲＮＡｉ法を用いた効果的な遺伝子発現抑制によって、はじめて中間代謝産物の蓄積を可能とする代謝反応の抑制が可能になったと考えられる。
【００６９】
このように，ＢＢＥに対するｄｓＲＮＡの発現によって、その反応の基質となるレチクリンの蓄積が誘導されたことは、代謝系の遮断によって、様々な中間代謝産物の蓄積が可能となることを示唆している。
【００７０】
アルカロイドの生合成経路の解明は進んでおり、生合成経路に関する酵素のいくつかは単離され、またその配列も知られている。
アルカロイド生合成経路についての情報は、例えば（Ｐ．Ｊ．Ｆａｃｃｈｉｎｉ，Ａｌｋａｌｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１，５２：２９−６６を参照されたい。また、ＫＥＧＧ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｈｔｍｌも参照されたい）から、また各酵素の配列についての情報は（例えば、ＤＤＢＪ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ，およびＧｅｎｂａｎｋＴＭ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ／ｄｅｂｇｅｔ．ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌから得ることができる。
したがって、本実施例と同様にして他のアルカロイド生合成中間体を植物体中に蓄積させることが可能である。
【００７１】
例えば、図１に示すイソキノリンアルカロイド生合成系においては、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（１）（ｇｂ：０２９８１１）を抑制することにより、ノルコクラウリンが、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（２）（ｇｂ：ＡＢ０６１８６３、ｇｂｕ：ＡＹ２１７３３４）を抑制することにより、コクラウリンが、また、コクラウリン３’−ヒドロキシラーゼ（３）（ｇｂ：ＡＦ０１４８０１，ｇｂ：ＡＢ０２５０３０）を抑制することによりＮ−メチルコクラウリンが蓄積される。さらに、図２に示すインドールアルカロイド生合成系においては、グルコシダーゼＩ／ＩＩ（５）（ｇｂ：ＡＦ１１２８８８）を抑制することによって、ストリクトシジンが蓄積される。これらの酵素の配列については、いずれも上記のデータバンクから得られる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によりｄｓＲＮＡを用いたＲＮＡｉ法が、イソキノリンアルカロイドを含む有用物質生産経路の遮断に有効であることが明らかになり、有用代謝産物中間体の生産が初めて可能となった。本発明により確立した細胞株は、さらに、新しい生合成系の導入による新規な関連化合物生産の材料として、また、化学的変換の材料として、重要な医薬用アルカロイドを含む多様な関連化合物の生産開発に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は有用アルカロイド生合成中間体の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカロイドは、植物に含まれる塩基性含窒素化合物の総称である。アルカロイドはその主要骨格に応じて、キノリン系、イソキノリン系、インドール系、トロパン系、キサンチン系アルカロイドなどに分類される。アルカロイドのなかには薬学的に有用なものが多く、たとえばコデインおよびモルヒネの鎮痛作用や商業的価値はよく知られている。ノスカピンは鎮咳作用化合物として有用である。パパベリンは平滑筋弛緩剤および脳血管拡張薬である。ベルベリンは、抗菌性、抗マラリア性および解熱性化合物として用いられてきた。
【０００３】
イソキノリンアルカロイドは、イソキノリンを基本骨格とするアルカロイドの総称であり、分布も広く、構造も多様である。イソキノリンアルカロイドには例えば、モルヒネ（ｍｏｒｐｈｉｎｅ）型（モルヒネなど）、プロトベルベリン（ｐｒｏｔｏｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）型（ベルベリンなど）、ベンゾフェナンスリジン（ｂｅｎｚｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ）型（サングイナリンなど）のアルカロイドが含まれる。イソキノリンアルカロイドを産生する植物としては、ケシ科（パパベラセアエ（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ））、メギ科（ベルベリダセアエ（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ））、キンポウゲ科（ラナンキュラセアエ（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ））、ツヅラフジ科（メニスペルマセアエ（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ））、ミカン科（ルタセアエ（Ｒｕｔａｃｅａｅ））などが挙げられる。
【０００４】
イソキノリンアルカロイド生合成経路の中間体としては、レチクリンが多数の薬学的生成物への重要な前駆体として注目されてきた。例えば、特許文献１には、ケシにランダムに突然変異を導入し、レチクリン含量の高い植物体を選抜することを含む、レチクリンを製造する方法が開示されている。しかしこの方法は無作為に作成した突然変異体の中からレチクリン含量の高いものを選抜し、その植物体からレチクリンを抽出するという工程を含むため、煩雑なものであった（特許文献１を参照）。
【０００５】
ベルベリン架橋酵素は、イソキノリンアルカロイド生合成経路の酵素の１つであり、レチクリンを基質とする。ベルベリン架橋酵素の発現を遺伝子操作を用いて低下させることにより、その基質であるレチクリン含量を増加させようとする試みがなされてきた。これらの試みは、アンチセンス法により、ベルベリン架橋酵素の発現を特異的に阻害しようとするものであった。しかし、その結果としてベルベリン架橋酵素の発現は阻害され、アルカロイド含量が全般的に著しく低下したものの、レチクリンのような中間代謝産物の特異的な蓄積は観察されなかった（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【０００６】
近年、アンチセンス法のほかに、遺伝子発現の抑制法としてＲＮＡｉ法が利用されている。ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ｄｓＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の細胞内への導入によって、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象である。ＲＮＡｉは様々な生物種における遺伝子機能解析に用いられている。例えば、非特許文献３では、ステロイド合成系に関与する酵素を特異的にＲＮＡｉによって阻害することにより、該酵素の基質となる中間体が蓄積することが報告された。しかし、この文献によると、目的の中間体から別の物質への変換がかなり起こっており、中間体を特異的に蓄積させるまでには至っていない。これはステロイドが細胞膜の必須成分であり細胞成長と関係しているため、完全には代謝経路の遮断が起こらないためと考えられる。また、この文献では植物細胞の成長が阻害されたことが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。
【０００７】
ＲＮＡｉ法に用いられるＲＮＡｉ用ベクターは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を植物体内で発現させることを目的として作製されるものである。ＲＮＡｉベクターは、その構造に基づき、おおまかに２種類に分類される。
【０００８】
一つは、別々に作製したセンスＲＮＡを発現するプラスミドと、アンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドの組み合わせである。これら２つのプラスミドを、混合して細胞に形質転換し、細胞内で、ｄｓＲＮＡを形成させる。もう一つは、ヘアピン構造をとるＲＮＡを発現するプラスミドである。後者については、線虫、ショウジョウバエ、植物、トリパノソーマなどで報告がある。植物については、導入遺伝子のヘアピン構造の中間にイントロンを導入したものとしないものの遺伝子抑制効力を比較した研究がある。この研究においては、イントロンを持った導入遺伝子のほうがより強力な発現抑制を引き起こすという結果が報告されている。
【０００９】
これまでに、本発明者らは、内在遺伝子と８０％程度の相同性をもつ１００塩基対程度のｄｓＲＮＡを発現させることにより、遺伝子抑制が起こることを観察している。この際ｄｓＲＮＡは、細胞内でＲＮａｓｅによって分解を受け、約２０塩基対のｓｉＲＮＡとなり、ｓｉＲＮＡがＲＩＳＣと呼ばれる複合体に組み込まれ、この複合体が標的ｍＲＮＡを分解すると考えられている。動物細胞においては、約２０塩基対のｓｉＲＮＡを導入することにより遺伝子発現の抑制がおこることが報告されている。
【特許文献１】特表２００２−５０８９４７号公報
【非特許文献１】サング−ウン・パーク（Ｓａｎｇ−Ｕｎ Ｐａｒｋ）他著、「プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」第１２８巻、２００２年２月、ｐ．６９６−７０６
【非特許文献２】サング−ウン・パーク（Ｓａｎｇ−Ｕｎ Ｐａｒｋ）他著、「プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第５１巻、２００３年、ｐ．１５３−１６４
【非特許文献３】セリン・バーガー（Ｃｅｌｉｎｅ Ｂｕｒｇｅｒ）他著、「ジャーナル・オブ・エクペリメンタル・ボタニー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ）」第５４巻、第３８８号、２００３年７月、ｐ．１６７５−１６８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、特定のアルカロイド生合成中間体の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アルカロイドを産生する植物細胞、植物組織または植物体においてＲＮＡｉ法を用いて、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の発現を阻害することを含む、アルカロイド生合成中間体の生産方法を提供する。
【００１２】
具体的には、後述のＲＮＡｉ遺伝子を用いて目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の発現を阻害して、代謝の流れを遮断することにより、目的のアルカロイド生合成中間体が植物細胞内に蓄積する。
【００１３】
本発明はまた、上記方法によって生産されたアルカロイド生合成中間体を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、上記方法に用いられる、
ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、
ａ）目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列、および、
ｂ）該正方向配列に相補的な逆方向配列
を含む遺伝子を提供する。本明細書においてこの遺伝子を「ＲＮＡｉ遺伝子」と称する。
【００１５】
また、本発明は上記方法に用いられる、以下のＡおよびＢの遺伝子を含む遺伝子の組合せを提供する：
Ａ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列を含む遺伝子、および、
Ｂ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子。
本明細書においてこの遺伝子の組合せを「ＲＮＡｉ遺伝子の組合せ」と称する。
【００１６】
「目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列」とは、生産しようとするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列に対して相同性を有する配列であって、その長さが約１００ｂｐ以上であり、ベクターなどのコンストラクトにおいて転写と同じ方向に挿入された配列のことを指す。
【００１７】
ここで、「酵素の全体または一部をコードする配列」には、該酵素をコードする遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列も含まれる。
【００１８】
「該正方向配列に相補的な逆方向配列」とは、上記の「目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列」に対して相補性を有する配列のことをいう。即ち、ベクターなどのコンストラクトにおいて転写と逆方向に挿入された正方向配列と相同性を有する配列を指す。
【００１９】
ＲＮＡｉ遺伝子においては該正方向配列と逆方向配列はともにプロモーターの下流に位置する必要があるが、正方向配列と逆方向配列のどちらを上流に位置させてもよい。
【００２０】
好ましくは、ＲＮＡｉ遺伝子においては、該正方向配列と逆方向配列の間にスペーサー配列を介在させる。スペーサーを介在させることによって、正方向配列と逆方向配列（以下両配列の繰り返しをインバーテッドリピートと称する）の対合を容易にする空間が生じる。スペーサー配列は特に限定されないが、通常数百ｂｐ〜１ｋｂの長さの配列、例えばイントロン配列が好適に用いられる。
【００２１】
正方向配列、スペーサー配列、および逆方向配列を含むＲＮＡｉ遺伝子を植物細胞内で発現させることにより、植物細胞においてアルカロイド生合成酵素の発現が抑制される。
【００２２】
該正方向配列、スペーサー配列および、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含むＤＮＡは、植物細胞においてプロモーターにより誘導されてｍＲＮＡへと転写される。正方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡ部分と逆方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡ部分は、相補的であるため互いに水素結合により結合する。好ましくはかかるＲＮＡはスペーサー配列を介してヘアピン構造の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。このｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ、即ち、標的であるアルカロイド生合成遺伝子の発現の抑制を引き起こすと考えられる。
【００２３】
ＲＮＡｉ遺伝子の組合せを用いる場合は、プロモーターの下流に正方向配列を含むベクター（センスベクターとも呼ばれる）と、プロモーターの下流に逆方向配列を含むベクター（アンチセンスベクター）の両方を植物に導入する。該正方向配列および逆方向配列は、植物細胞においてプロモーターにより誘導されてｍＲＮＡへと転写され、正方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡと逆方向配列から転写された一本鎖ＲＮＡが、互いに水素結合により結合して二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。このｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ、即ち、標的であるアルカロイド生合成遺伝子の発現の抑制を引き起こすと考えられる。
【００２４】
このようにして、ＲＮＡｉ遺伝子あるいはＲＮＡｉ遺伝子の組合せを用いることにより、二本鎖ＲＮＡが生じる結果、標的アルカロイド生合成遺伝子の発現が阻害され、該酵素の基質であるアルカロイド生合成中間体が細胞内に特異的に蓄積する。
【００２５】
「目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列」は先に定義したように、必ずしも遺伝子のコード領域に含まれる必要はなく、５’ＵＴＲ領域や３’ＵＴＲ領域に位置する配列あるいはプロモーター領域でもよい。ＲＮＡｉはこのような非コード領域の配列を用いることによっても起こる現象である。
【００２６】
さらに本発明は上述したような遺伝子を含むベクターおよび該ベクターにより形質転換された植物細胞または植物組織あるいは植物体を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
これまでの研究では、生合成経路の最終産物の蓄積の抑制は報告されている。しかし、本発明のように中間代謝産物の特異的な蓄積を可能とし、中間体を大量に生産する、あるいは、さらに、新規な反応経路を追加することにより、新たな化合物を生産させようとする観点は無かった。また、かかる観点があったとしても、現実的には、そのようなことを可能とする技術はなかった。今回ＲＮＡｉ法によって、生合成経路の中間代謝産物が蓄積することが明らかになった。本発明は、様々な代謝系において、重要な代謝産物を蓄積させる可能性を示唆しており、その応用範囲は極めて広い。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、イソキノリンアルカロイド生合成経路と生合成酵素を示す図である。
【図２】図２は、インドールアルカロイド生合成経路と生合成酵素を示す図である。
【図３】図３は、中間体レチクリンから派生する化合物を示す図である。
【図４】図４は、中間体ストリクトシジンから派生する化合物を示す図である。
【図５】図５は、ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）遺伝子に対するｄｓＲＮＡ発現ベクター、ｐＡＲＴ２７−ＢＢＥｉｒ構築の手順を示す図である。
【図６】図６は、ハナビシソウＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体におけるレチクリン（ｍ／ｚ ３３０）の蓄積のＬＣ／ＭＳ解析を示す図である。
【図７】図７は、コントロールおよびＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体における、ＢＢＥ酵素活性を示す図である。
【図８】図８は、コントロールおよびＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体における、ＢＢＥ酵素反応をＬＣ／ＭＳ解析した結果を示す図である。
【図９】図９は、コントロールおよびＢＢＥｄｓＲＮＡ形質転換体における、レチクリンと、サンギナリンの含量を示す図である。
【図１０】図１０は、ＢＢＥの阻害により、レチクリンからスコウレリンの反応が遮断されることを示す模式図である。
【符号の説明】
【００２９】
１ ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
２ コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ
３ Ｎ−メチル−コクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼ
４ ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）
５ グルコシダーゼＩ／ＩＩ
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明において標的とされる植物、即ちｄｓＲＮＡを導入される植物は、アルカロイド生合成経路を有する植物であれば特に限定されない。アルカロイド生合成経路としてはイソキノリンアルカロイド生合成経路が好適であるが、その他にもインドールアルカロイド生合成経路などが好適な標的となりうる。
【００３１】
具体的には、アルカロイド生合成経路を有する植物には以下のものが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ベルベリンを産生する植物、例えば、オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ，Ｃｏｐｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｆｒａｎｃｈ，Ｃｏｐｔｉｓ ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｃ．Ｙ．Ｃｈｅｎｇ ｅｔ Ｈｓｉａｏ等）、キハダ（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ ａｍｕｒｅｎｓｅ）、メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ属）、ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ヒイラギナンテン（Ｍａｈｏｎｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）およびアキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｍｉｎｕｓ）、モルヒネやコデイン、パパベリンを産生する植物、例えば、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ Ｌｉｎｎ）、アツミゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｅｔｉｇｅｒｕｍ ＤＣ）およびハカマオニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、モルヒネを生産しないが、類縁のアルカロイドを産生する植物、例えば、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ Ｌｉｎｎ）およびヒナゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｒｈｏｅａｓ）、サングイナリンを産生する植物、例えば、ハナビシソウ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、サングイナリア（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉｎｅ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ Ｌ．）、コリダリンを産生する植物、例えば、エンゴサク（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ属植物、例えば、Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｂｕｌｂｏｓａ ＤＣ．，Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｔｅｒｎａｔａ Ｎａｋａｉ，Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｎａｋａｉｉ Ｉｓｈｉｄｏｙａ，Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ Ｐｅｒｓｏｎ）、コロンバミンを産生する植物、例えば、コロンボ（Ｊａｔｅｏｒｈｉｚａ ｃｏｌｕｍｂａＭｉｅｒｓ）、セファランチン（ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ）を産生する植物、例えば、タマサキツヅラフジ（Ｓｔｅｐｈａｎｉａ ｃａｐｈａｒａｎｔｈａ）、シノメニン（ｓｉｎｏｍｅｎｉｎｅ）を産生する植物、例えば、オオツヅラフジ（Ｓｉｎｏｍｅｎｉｕｍ ａｃｕｔｕｍ Ｒｅｈｄｅｒ ｅｔ Ｗｉｌｓｏｎ）、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）を産生する植物、例えば、トコン（Ｃｅｐｈａｅｌｉｓ ｉｐｅｃａｃｕａｎｈａ）など。
【００３２】
上記の植物の中ではイソキノリンアルカロイドを合成する植物が好適に用いられ、なかでもサングイナリンやベルベリンを産生する植物、例えば、ハナビシソウ、オウレン、キハダ、メギ、ナンテン、ヒイラギナンテンおよびアキカラマツが好ましく、特にハナビシソウが好ましい。
【００３３】
ＲＮＡｉ遺伝子を導入される標的植物の起源と、導入するＲＮＡｉ遺伝子の起源は、同じであっても異なっていてもよい。標的遺伝子と導入遺伝子の相同性を考慮すると、同じ植物種由来のものが特に好ましい。
【００３４】
本発明の方法においては、目的とする生合成中間体を基質とする酵素をＲＮＡｉによる阻害の標的となる酵素とする。かかる酵素としては、例えば、イソキノリンアルカロイド合成系経路（図１を参照）のベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼが挙げられる。
【００３５】
これらの酵素をＲＮＡｉにより阻害するとその基質であるアルカロイド生合成中間体が蓄積する。具体的には、ベルベリン架橋酵素を阻害するとレチクリン、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを阻害するとノルコクラウリン、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼを阻害するとコクラウリン、そしてＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼを阻害するとＮ−メチルコクラウリンがそれぞれ蓄積する。
【００３６】
イソキノリンアルカロイド生合成経路の酵素以外では例えば、インドールアルカロイド生合成経路（図２を参照）のグリコシダーゼＩ／ＩＩを標的とすると、その基質であるストリクトシジンが蓄積する。
【００３７】
好ましくは本発明の方法により生産されるアルカロイド生合成中間体は、レチクリン、ノルコクラウリン、コクラウリンおよびＮ−メチルコクラウリンからなる群から選択され、特に好ましくはレチクリンである。
【００３８】
レチクリンを製造するには、標的酵素はベルベリン架橋酵素であり、その結果レチクリンが蓄積する。レチクリンの前駆体であるノルコクラウリン、コクラウリンおよびＮ−メチルコクラウリン（図１を参照）、ならびにレチクリンは、図３に示す様々なイソキノリンアルカロイドの前駆体として有用である。また、ストリクトシジンも図４に示す様々なインドールアルカロイドの前駆体として有用である。
【００３９】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす遺伝子は好ましくは、ベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される酵素をコードする配列またはその一部である。ＲＮＡｉを引き起こすためのｄｓＲＮＡの長さは特に限定されないが、少なくとも２３塩基以上、好ましくは１００塩基対から２キロベースであり、最も好ましくは１００塩基対〜８００塩基対である。
【００４０】
本発明においてＲＮＡｉを引き起こす遺伝子の発現を誘導するプロモーターとしては、植物へ導入した際に目的とする遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定されない。かかるプロモーターは当業者によく知られており、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、および、誘導性プロモーター、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターやテトラサイクリンリプレッサー／オペレーター制御系などが挙げられる。
【００４１】
本発明において、正方向配列および逆方向配列と、標的の生合成酵素をコードする遺伝子の配列との相同性は、１００％である必要はない。遺伝子の突然変異、多型、又は進化上の分岐による配列の変動は容認される。標的遺伝子に対する挿入、欠失、及び一塩基点突然変異を有するｄｓＲＮＡ鎖もまた、ＲＮＡｉに有効である。具体的には、ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有するものが好適である。
【００４２】
また、正方向配列と逆方向配列は、転写された後に二本鎖ＲＮＡを形成し得るものであればよい。効率的にｄｓＲＮＡを形成するためには、両者の相補性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００４３】
本発明において標的とする植物へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。それぞれの方法に適したベクターの調製、形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １００：１５０３，１９９５）。
【００４４】
例えば、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ ＳＫ：Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｅｄｓ）ｐｐ．６６−７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ：Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １００：１５０３，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７，１９９１）、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ：Ｐｌａｎｔ Ｊ ６：２７１，１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、当該技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００４５】
本発明において、植物にＲＮＡｉ遺伝子を導入する際に用いるベクターは、遺伝子導入手段に応じて適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、アグロバクテリウムによる遺伝子導入法を用いる場合は、バイナリーベクター、例えば、ｐＡＲＴ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等が好適に用いられる。
【００４６】
本発明のベクターの作成方法としては、特に限定されず、当業者に周知のいかなる方法を用いてもよい。本発明のベクターにおいては、３’末端側へターミネーターが挿入されるが、ターミネーターとしては公知のものがいずれも好適に用いられ、例えば、ＯＣＳターミネーター、ｎｏｓターミネーター、３５Ｓターミネーターなどが挙げられる。
【００４７】
本明細書中、塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３，１９９０）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【実施例】
【００４８】
以下に本発明を特定の実施例に言及して記載するがこれは本発明を例示する目的のものであり、限定する意図のものではない。
【００４９】
（実施例の概要）
アルカロイド生合成遺伝子に対して特異的な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を合成する発現ベクターを構築し、その高い抑制効果により、標的遺伝子の発現および酵素活性を効果的に抑制し、中間体が蓄積生産できることを実証した。
【００５０】
具体的には、重要な医薬品であるイソキノリンアルカロイドの生合成中間体を、同アルカロイドを生産する植物細胞の代謝経路を二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法により遮断することにより、生産する方法を開示する。本実施例では、ベンゾフェナンスリジンアルカロイドを生産するハナビシソウ細胞に、その生合成経路の酵素の１つであるベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）の配列の一部に対応するｄｓＲＮＡを発現するベクターを導入した。その結果、かかるアルカロイド生合成系が遮断され、植物細胞における生合成中間体レチクリンの生産が可能となった。
【００５１】
（実施例についての具体的説明）
形質転換が可能なイソキノリンアルカロイド生産性植物ハナビシソウから単離されている生合成酵素ベルベリン架橋酵素（ＢＢＥ）遺伝子（配列番号１）に対して既知の配列情報によりプライマーを設計し、ＢＢＥのｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡをもとにｄｓＲＮＡを形成するようなＢＢＥｄｓＲＮＡ発現ベクターを構築した。ついで、同ベクターをハナビシソウ細胞に導入し、ＢＢＥｄｓＲＮＡを発現する形質転換体を得、ベルベリン架橋酵素の基質である生合成中間体であるレチクリンを蓄積する形質転換ハナビシソウ細胞を確立した。
【００５２】
（実験材料および方法）
コンストラクトの作製には、インバーテッドリピート作成用ベクターとして広く用いられているｐＫＡＮＮＩＢＡＬおよびｐＡＲＴ２７を用いた。ｐＫＡＮＮＩＢＡＬは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、その下流に両端に複数の制限酵素サイトをもつイントロン領域、さらにその下流にＯＣＳターミネーターを有する。イントロンの両端に、正方向および逆方向配列を挿入する。かかる配列は、植物体内でｍＲＮＡへと転写され、スプライシングされる。該ＲＮＡは、インバーテッドリピート、すなわち、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。なお、本発明は、必ずしも、このベクターの使用に限定されるものではない。
【００５３】
ハナビシソウＢＢＥ遺伝子の単離
データベースにすでに登録されている配列をもとに、３’ａｒｍ（本明細書において逆方向配列と称される部分）にＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、５’ａｒｍ（本明細書において正方向配列と称される部分）にＥｃｏＲ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉの制限酵素サイトを持つハナビシソウＢＢＥ遺伝子のほぼ全長約１ｋｂ断片をＰＣＲによりハナビシソウ培養細胞ｃＤＮＡから単離した。
【００５４】
用いたプライマーを以下に示す。
ＢＢＥ−３’ａｒｍ−フォワード（ＦＭ）：ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＴＴ ＣＧＧ ＡＣＴ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＣＣ
（配列番号２）
リバース（ＲＶ）：ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＧ
（配列番号３）
５’ａｒｍ−フォワード（ＦＭ）：ＡＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＴＴ ＣＧＧ ＡＣＴ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＣＣ
（配列番号４）
リバース（ＲＶ）：ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＧＧ
（配列番号５）
【００５５】
こうして単離した遺伝子をプラスミドｐＴ７ Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングしたのち、ＳＩＭＡＤＺＵ ＤＳＱ−２０００Ｌにより塩基配列を確認した。
【００５６】
ｄｓＲＮＡ発現ベクターの作製（図５）
３’ａｒｍの挿入
ＢＢＥ−３’ａｒｍ−ＦＷとＲＶのプラーマーペアにより得られたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅにサブクローニングし、配列確認したのち、ＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断した。ベクターｐＫＡＮＮＩＢＡＬも同様に、ＢａｍＨ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで制限酵素で処理した。これらＤＮＡを電気泳動後、フェノール処理、クロロフォルム抽出、エタノール沈殿し、１０μｌのＴＥに溶解させたのち、ライゲーション反応を行ない、ＸＬ１−Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。挿入の確認は制限酵素処理、およびＯＣＳターミネーター配列に対するＡＳ１を用いたシーケンシングによりおこなった。
【００５７】
５’ａｒｍの挿入
ＢＢＥ５’ａｒｍ ＦＷとＲＶのプライマーペアにより得られたＰＣＲ産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅにサブクローニングし、配列確認したのち、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切断した。タンデムな挿入を防ぐため断片にアルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＣＩＡＰ）を加えて脱リン酸処理した。ＣＩＡＰを失活させるため、６５℃で３０分インキュベートした。その後エタノール沈殿により制限酵素を失活させ、２０μｌのＴＥに溶解した。先に、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬに３’ａｒｍを導入したベクターを同様にＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切断したのち、ライゲーション反応をおこない、ＸＬ１−Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。挿入の確認は制限酵素処理およびＯＣＳターミネーターに対するＡＳ１プライマー、３５Ｓプロモーターに対する−Ｓ１プライマー（３５Ｓｐｒｏ−Ｓ１，ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＴＴ（配列番号６）を用いたシーケンシングによりおこなった。得られたＢＢＥの３’および５’ａｒｍが挿入されたプラスミドをｐＫＡＮＮＩＢＡＬ−ＢＢＥｉｒと称する。
【００５８】
バイナリ−ベクターｐＡＲＴ２７への導入
ｐＡＲＴ２７ベクターを制限酵素ＮｏｔＩおよびアルカリフォスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＣＩＡＰ）で処理した。また、先に作製したｐＫＡＮＮＩＢＡＬ−ＢＢＥｉｒをＮｏｔＩ処理することにより、インサートを調製した。こうして得られたベクターおよびインサートのそれぞれの反応液をフェノール抽出、クロロフォルム抽出、エタノール沈殿したのち、２０μｌＴＥバッファーに溶解させ、ライゲーションをおこなった。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、制限酵素処理し、目的とするインサートが挿入されていることを確認した。さらに、プライマーとして３５Ｓｐｒｏ−Ｓ１を用いた塩基配列決定をおこない、目的とするｄｓＲＮＡを発現するベクターｐＡＲＴ−２７−ＢＢＥｉｒが作製されていることを確認した。
【００５９】
アグロバクテリウムへの導入
こうして作製したｐＡＲＴ２７−ＢＢＥｉｒをエレクトロポーレーション法によりアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株へ導入した。形質転換は、出現してきたコロニーよりＰｒｏｍｅｇａ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓを用いてプラスミド抽出し、制限酵素処理により確認した。
【００６０】
ハナビシソウ細胞の形質転換
構築した発現ベクターの導入はＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：３６７−３７２（２００１）７）に記載の方法に準じて行なった。ハナビシソウ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の種子（カネコ種苗株式会社）をミラクロスに包み、１％オスバンで１分、７０％エタノールで１分、１％アンチホルミンで１４分除菌し、滅菌水で５分ずつ３回洗浄した。こうして除菌された種子を植物体用培地に播種し、２５℃で培養した。発芽後２〜３週間後の植物体の、葉および葉柄をメスで切断し、５ｍｍ〜１ｃｍの切片を得た。次に２昼夜２５℃で振とう培養したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｐＡＲＴ２７導入用（コントロール）およびｐＡＲＴ２７−ＢＢＥｉｒ導入用）を共存培養用培地で５倍希釈してシャーレに入れ、そこに植物体切片を１０分浸した。その後植物体切片をキムタオルにのせ、培養液を除き、ろ紙をひいた共存用寒天培地に移植した。２日後植物体切片を選抜用寒天培地（アセトシリンゴン１００μＭ、ナフタレン酢酸１０μＭ、ベンジルアデニン１μＭ、ショ糖３％を含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地）で共存培養した。その後セフォタキシム２００μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシン２０μｇ／ｍｌ、ナフタレン酢酸１０μＭ、ベンジルアデニン１μＭ、ショ糖３％を含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地で選抜培養した。３週間ごとに培地を交換し、生育してくる細胞を選抜した。
【００６１】
形質転換体の確認
形質転換体の確認は、導入した遺伝子の存在をゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ解析した。
【００６２】
アルカロイドの分析
細胞からのアルカロイドの抽出は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：３６７−３７２（２００１）７に記載のように行なった。具体的には細胞１ｇに対し、０．０１Ｎ ＨＣｌで酸性化したメタノール４ｍｌを用いて一晩抽出し、その上清を遠心により分離した。その抽出物を島津製作所社ＨＰＬＣ ＳＣＬ−１０システム（移動相：５０ｍＭ酒石酸／１０ｍＭ ＳＤＳ：アセトニトリル：メタノール＝４：４：１、流速１．２ｍｌ／分，カラムＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０）を用いて解析した。また、それぞれのアルカロイドの同定は、島津製作所社製液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣ／ＭＳ−２０１０（移動相：水：アセトニトリル：メタノール：酢酸＝３９１：４００：１００：９、流速０．５ｍｌ／分，カラムＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０）を用い行なった（図６）。
【００６３】
ＢＢＥ酵素活性の測定
コントロールおよびＢＢＥ−ｄｓＲＮＡを導入したハナビシソウ形質転換体におけるＢＢＥの活性測定を以下のように行った。まず、新鮮重１ｇの培養細胞に、２ｍｌのグリシン緩衝液（５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ８．９）を加え、氷上にて磨砕した。次いで、細胞抽出液をＰＤ−１０カラムにて脱塩した後、５００μｌの粗酵素液あたり、１ｍＭ相当となるように基質であるレチクリンを加え、３０℃にて反応させた。一定時間後、１０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて反応を停止させ、ＬＣ−ＭＳにてＢＢＥの代謝産物であるスコウレリンの生成を定量した（図７）。
【００６４】
結果
ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡを導入したハナビシソウ形質転換体は、選抜後２ヶ月ほどでカルス化が観察され、その後、液体培地にて培養を行なった。コントロール（ｐＡＲＴ２７導入株）で１９ライン、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡを導入したものでは２０ラインの形質転換体を得た。これらコントロールとＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株では表現型の違いが観察された。コントロールの細胞では細胞が赤色を帯びているのに対し、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株では白い細胞が多く観察された。実際にＨＰＬＣによりアルカロイド組成の変化を解析した結果、図６に示すように、ＢＢＥｄｓＲＮＡを導入した形質転換体において、顕著なレチクリンの蓄積（新鮮物１ｇ当たり約１．５ｍｇ）が認められた。
【００６５】
ＢＢＥ酵素活性については、コントロールと比較して、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株（図中、ＢＢＥｉｒと示す）において顕著なＢＢＥ活性の低下が認められた。即ち、コントロールでは基質であるレチクリンが完全にスコウレリンに変換されているのに対し、ＢＢＥ−ｄｓＲＮＡ導入株ではスコウレリンへの転換はほとんど認められなかった（図７）。ＢＢＥ活性のタイムコースを測定し、その活性の定量を行った結果、コントロール株Ｃ２３の活性は、１．８５±０．３３ｐｋａｔ／ｍｇタンパク質であるのに対して、ＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株Ｂ１４では、０．０５６±０．０５１ｐｋａｔ／ｍｇタンパク質であった。即ち、ＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株ではコントロール株の約３％程度にまでＢＢＥ活性が低下していることが認められた（図８）。
【００６６】
なお、コントロール株とＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株のレチクリンおよびサンギナリン含量を調べたところ、図９に示すように、コントロールと比較して、ＢＢＥ ｄｓＲＮＡ導入株では総じてレチクリン含量が高かった。
【００６７】
一方、ハナビシソウの根培養物にアンチセンスＢＢＥ ＲＮＡ発現ベクターを導入した場合には、赤色色素が薄くなり、アルカロイド含量が全般的に著しく低下したという報告がなされているものの、本発明のような中間代謝産物の蓄積は観察されなかった（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２８，６９６−７０６（２００２）およびＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５１：１５３−１６４（２００３））。Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５１：１５３−１６４（２００３）の結果によると、アンチセンス法における抑制によっても、０．６ｐｋａｔ／ｍｇタンパク質程度の活性が残存しており、そのために代謝経路の遮断が不十分になったものと考えられる。
【００６８】
これらの知見により、ＲＮＡｉ法が代謝系の遮断に極めて効果的であり、ＲＮＡｉ法を用いた効果的な遺伝子発現抑制によって、はじめて中間代謝産物の蓄積を可能とする代謝反応の抑制が可能になったと考えられる。
【００６９】
このように，ＢＢＥに対するｄｓＲＮＡの発現によって、その反応の基質となるレチクリンの蓄積が誘導されたことは、代謝系の遮断によって、様々な中間代謝産物の蓄積が可能となることを示唆している。
【００７０】
アルカロイドの生合成経路の解明は進んでおり、生合成経路に関する酵素のいくつかは単離され、またその配列も知られている。
アルカロイド生合成経路についての情報は、例えば（Ｐ．Ｊ．Ｆａｃｃｈｉｎｉ，Ａｌｋａｌｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１，５２：２９−６６を参照されたい。また、ＫＥＧＧ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｈｔｍｌも参照されたい）から、また各酵素の配列についての情報は（例えば、ＤＤＢＪ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ，およびＧｅｎｂａｎｋＴＭ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ／ｄｅｂｇｅｔ．ｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌから得ることができる。
したがって、本実施例と同様にして他のアルカロイド生合成中間体を植物体中に蓄積させることが可能である。
【００７１】
例えば、図１に示すイソキノリンアルカロイド生合成系においては、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（１）（ｇｂ：０２９８１１）を抑制することにより、ノルコクラウリンが、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（２）（ｇｂ：ＡＢ０６１８６３、ｇｂｕ：ＡＹ２１７３３４）を抑制することにより、コクラウリンが、また、コクラウリン３’−ヒドロキシラーゼ（３）（ｇｂ：ＡＦ０１４８０１，ｇｂ：ＡＢ０２５０３０）を抑制することによりＮ−メチルコクラウリンが蓄積される。さらに、図２に示すインドールアルカロイド生合成系においては、グルコシダーゼＩ／ＩＩ（５）（ｇｂ：ＡＦ１１２８８８）を抑制することによって、ストリクトシジンが蓄積される。これらの酵素の配列については、いずれも上記のデータバンクから得られる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によりｄｓＲＮＡを用いたＲＮＡｉ法が、イソキノリンアルカロイドを含む有用物質生産経路の遮断に有効であることが明らかになり、有用代謝産物中間体の生産が初めて可能となった。本発明により確立した細胞株は、さらに、新しい生合成系の導入による新規な関連化合物生産の材料として、また、化学的変換の材料として、重要な医薬用アルカロイドを含む多様な関連化合物の生産開発に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカロイドを産生する植物細胞、植物組織または植物体においてＲＮＡｉ法を用いて、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の発現を阻害することを含む、アルカロイド生合成中間体の生産方法。
【請求項２】
該アルカロイドがイソキノリンアルカロイドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該酵素が、ベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該酵素が、ベルベリン架橋酵素である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該アルカロイド生合成中間体がレチクリン、ノルコクラウリン、コクラウリンおよびＮ−メチルコクラウリンからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該アルカロイド生合成中間体がレチクリンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法によって生産されたアルカロイド生合成中間体。
【請求項８】
ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、
ａ）目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列、および、
ｂ）該正方向配列に相補的な逆方向配列
を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法に用いられる遺伝子。
【請求項９】
以下のＡおよびＢの遺伝子を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法に用いられる遺伝子の組合せ：
Ａ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列を含む遺伝子、および、
Ｂ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子。
【請求項１０】
該酵素が、ベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される請求項８に記載の遺伝子。
【請求項１１】
該酵素がベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される請求項９に記載の遺伝子の組合せ。
【請求項１２】
請求項８または１０に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項９または１１に記載の正方向配列を含む遺伝子を含むベクターおよび該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子を含むベクターの組合せ。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターまたは請求項１３に記載のベクターの組合せにより形質転換された植物細胞または植物組織あるいは植物体。
【請求項１５】
植物がイソキノリンアルカロイド生産性植物である請求項１４に記載の植物細胞または植物組織あるいは植物体。
【請求項１６】
植物がハナビシソウである請求項１５に記載の植物細胞または植物組織あるいは植物体。
【請求項１】
アルカロイドを産生する植物細胞、植物組織または植物体においてＲＮＡｉ法を用いて、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の発現を阻害することを含む、アルカロイド生合成中間体の生産方法。
【請求項２】
該アルカロイドがイソキノリンアルカロイドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該酵素が、ベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該酵素が、ベルベリン架橋酵素である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該アルカロイド生合成中間体がレチクリン、ノルコクラウリン、コクラウリンおよびＮ−メチルコクラウリンからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該アルカロイド生合成中間体がレチクリンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法によって生産されたアルカロイド生合成中間体。
【請求項８】
ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、
ａ）目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列、および、
ｂ）該正方向配列に相補的な逆方向配列
を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法に用いられる遺伝子。
【請求項９】
以下のＡおよびＢの遺伝子を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法に用いられる遺伝子の組合せ：
Ａ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、目的とするアルカロイド生合成中間体を基質とする酵素の全体または一部をコードする配列と相同的な正方向配列を含む遺伝子、および、
Ｂ．ｉ）プロモーター、および、
ｉｉ）プロモーターの下流に、該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子。
【請求項１０】
該酵素が、ベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される請求項８に記載の遺伝子。
【請求項１１】
該酵素がベルベリン架橋酵素、ノルコクラウリン−６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼおよびＮ−メチルコクラウリン−３’−ヒドロキシラーゼからなる群から選択される請求項９に記載の遺伝子の組合せ。
【請求項１２】
請求項８または１０に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項９または１１に記載の正方向配列を含む遺伝子を含むベクターおよび該正方向配列に相補的な逆方向配列を含む遺伝子を含むベクターの組合せ。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターまたは請求項１３に記載のベクターの組合せにより形質転換された植物細胞または植物組織あるいは植物体。
【請求項１５】
植物がイソキノリンアルカロイド生産性植物である請求項１４に記載の植物細胞または植物組織あるいは植物体。
【請求項１６】
植物がハナビシソウである請求項１５に記載の植物細胞または植物組織あるいは植物体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３３０５
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４３８４（Ｐ２００５−５１４３８４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３４４９
【国際出願日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１４年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構業務委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３４４９
【国際出願日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１４年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構業務委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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