Ｓ−アデノシルメチオニンの発酵的製造方法
【課題】先行技術と比較して高められたＳＡＭ製造を可能にする微生物株を提供する。
【解決手段】Ｓ−アデノシルメチオニンを分泌する微生物株において、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を高めることで解決される。
【解決手段】Ｓ−アデノシルメチオニンを分泌する微生物株において、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を高めることで解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンの発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は、代謝における非常に重要なメチル基供与体であり、そしてこれは鬱病、肝臓の病気及び関節炎の治療において医薬分野で使用されている。ＳＡＭの製造のための記載された方法は、前駆物質であるメチオニンの存在下に酵母を培養し（Schlenk及びDePalma、J. Biol. Chem. 229, 1037-1050 (1957)、Schlenk他、Enzymologia 29, 283-298 (1965)、Shiozaki他、J. Biotechnol. 4, 345-354 (1986)、Shiozaki他、Agric. Biol. Chem. 53, 3269-3274 (1989)）、そして形成されたＳＡＭを、引き続き細胞溶解物からの抽出後にクロマトグラフィーによる精製を行う（ＵＳ４５６２１４９号）ことを含む。酵母によるＳＡＭの製造に特徴的なことは、ＳＡＭが細胞内で産生され、そして蓄積されることである。ＳＡＭの更なる後処理を実施するためには、例えばＥＰ１６２３２３号（実施例２）又はＤＥ３３２９２１８号（実施例１）に記載されるように細胞をまず破砕しなければならない。化学的溶解法の他に、フレンチプレスもしくは高圧均質化による機械的方法又は熱的方法（ＥＰ１０９１００１号の実施例１に記載されている）も可能である。
【０００３】
酵母によるＳＡＭ製造に対して、先行技術において大腸菌（Ｅ．コリ）を用いた細菌によるＳＡＭ製造方法が記載され、そこでは細菌は産生されたＳＡＭをその細胞から培養培地へと排出する（ＥＰ１４５７５６９号Ａ１）。前記の発酵的なＳＡＭ製造方法は、現存の酵母法に対して明らかな利点を有する。それというのも、該方法は形成されたＳＡＭを培養上清へと選択的に分泌することを説明しており、それにより後の精製法の簡便化が可能となるからである。培養上清中にはごく僅かな物質のみが存在するだけなのは、ＳＡＭの分泌が第一の精製段階を担うからであり、これは更なる後処理を明らかに容易にするものである。前記の細胞外でのＳＡＭ製造のための方法ではＳＡＭ合成酵素が使用される。
【特許文献１】ＵＳ４５６２１４９号
【特許文献２】ＥＰ１６２３２３号
【特許文献３】ＤＥ３３２９２１８号
【特許文献４】ＥＰ１０９１００１号
【特許文献５】ＥＰ１４５７５６９号Ａ１
【非特許文献１】Schlenk及びDePalma、J. Biol. Chem. 229, 1037-1050 (1957)
【非特許文献２】Schlenk他、Enzymologia 29, 283-298 (1965)
【非特許文献３】Shiozaki他、J. Biotechnol. 4, 345-354 (1986)
【非特許文献４】Shiozaki他、Agric. Biol. Chem. 53, 3269-3274 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、先行技術と比較して高められたＳＡＭ製造を可能にする微生物株を提供することである。更なる課題は、本発明による微生物株を用いてＳＡＭを製造するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
最初に挙げられた課題は、Ｓ−アデノシルメチオニンを分泌する微生物株であって、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性が高められていることを特徴とする微生物株によって解決される。
【０００６】
本発明による微生物株は出発菌株から製造でき、そして該微生物株は出発菌株に対して高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有する。
【０００７】
有利には、微生物株が出発菌株に対して高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有する場合とは、その微生物株の細胞がｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物を有する野生型微生物株の細胞に対して、少なくとも２倍、有利には少なくとも５倍だけ高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有する場合である。ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性測定のための試験は、科学文献（Edgar及びBibi、J. Bacteriol. 179, 2274-2280）に記載されている。
【０００８】
Ｅ．コリのｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子は１９９６年にクロラムフェニコール排出タンパク質（Chloramphenicol-Export-Protein）Ｃｍｒとして同定された（Nilsen他、J. Bacteriol. 178, 3188-3193）。１９９７年には、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子は、広い基質スペクトルを有する多剤排出タンパク質ＭｄｆＡとして説明された（Edgar及びBibi、J. Bacteriol. 179, 2274-2280）。Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質は、ＭＦ（Ｓ）［メジャーファシリテーター（スーパーファミリー）］輸送体のファミリーに属し、そして例えばクロラムフェニコール又はエリスロマイシンのような親油性の非荷電の基質と同様に、例えば臭化エチジウム、ドキソルビシン又はベンズアルコニウムのような親油性の正に荷電した基質をもＨ＋イオンと引き替えに細胞外に排出する（Bibi他によるレビュー、J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 171-177 (2001)を参照のこと）。Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質が広い基質スペクトルを有するとはいえ、当業者には、Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）がＳＡＭ排出タンパク質として機能しうることは驚くべきことである。それというのも、ＳＡＭは今までに説明した基質とは構造的な共通点を有さないからである。更に、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）の核酸配列と同様に、Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質のアミノ酸配列も、従来公知の酵母及びヒト由来のＳＡＭ輸送遺伝子及びＳＡＭ輸送タンパク質とホモロジーを示さない。ある基質がＣｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質についての基質として機能しうるかどうかは、輸送体のメカニズムが十分に知られていない以上、予想不可能である。更に当業者には、本発明によるＳＡＭを有する微生物株において、強く親水性で正に荷電し、同時に細胞形質の分子が細胞外に輸送されることは全く意想外である。
【０００９】
従って本発明は、ＳＡＭの製造における排出タンパク質としてのｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の使用にも関する。
【００１０】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物（Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質）は配列番号１もしくは配列番号２によって特徴付けられている。本発明の範囲では、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とは、クロラムフェニコール排出活性又は多剤排出活性を有するタンパク質をコードし、かつアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ） ウィンスコンシン州マジソン在）により配列番号１に対して３０％より高い配列同一性を有する遺伝子とも解釈されるべきである。配列番号１に対して５０％より高い配列同一性が好ましい。配列番号１に対して７０％より高い配列同一性が特に好ましい。
【００１１】
同様に、Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質とは、クロラムフェニコール排出活性又は多剤排出活性を有し、かつアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ） ウィンスコンシン州マジソン在）により配列番号２に対して１５％より高い配列同一性を有するタンパク質と解釈されるべきである。配列番号２に対して３０％より高い配列同一性が好ましい。配列番号２に対して６０％より高い配列同一性が特に好ましい。
【００１２】
従って、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とは、配列番号１に示される配列からヌクレオチドの欠失、挿入又は置換によって導かれるが、それぞれの遺伝子産物の酵素活性が少なくとも維持されたままでなければならない、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のアレル変異体、特に機能的変異体をも表す。
【００１３】
本発明による微生物は、分子生物学の標準的手法により作成することができる。
【００１４】
出発菌株としては、原則的に、ＳＡＭに関する生合成経路を有し、組み換え法を利用でき、そして発酵によって培養可能な全ての微生物が適している。かかる微生物は、菌類、酵母又は細菌であってよい。真性細菌の系統発生的群の細菌であることが好ましい。腸内細菌科の微生物、特に大腸菌の種の微生物であることが特に好ましい。
【００１５】
本発明による微生物におけるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性増大は、例えばｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現強化によって達成される。この場合に、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のコピー数が微生物中で高められも、かつ／又は適当なプロモーターによってｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現が増大されていてもよい。発現強化とは、この場合、有利にはｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子が出発菌株よりも少なくとも２倍だけ強く発現することを意味する。ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の高められたコピー数とは、有利には、染色体及び／又はプラスミドにコードされるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のコピーを出発菌株と比較して付加的に少なくとも１コピー使用されることを意味する。
【００１６】
微生物におけるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のコピー数の増加は、当業者に公知の方法で実施することができる。こうして、例えばｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を、１細胞あたりに多コピー数を有するプラスミドベクター（例えばＥ．コリ用のｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４）中にクローニングして、微生物中に取り込ませることができる。選択的に、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を微生物の染色体中に多重に組み込むこともできる。組み込み法としては、溶原性バクテリオファージを有する公知のシステム、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みを用いることができる。
【００１７】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子をプラスミドベクター中にプロモーターの制御下にクローニングすることによってコピー数を増加させることが好ましい。ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子をｐＡＣＹＣ誘導体中にクローニングすることによりＥ．コリ中のコピー数を増加させることが特に好ましい。
【００１８】
プラスミドでコードされるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現のための制御領域としては、遺伝子の本来のプロモーター領域及びオペレーター領域を用いることができる。
【００１９】
しかしながらｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現強化は別のプロモーターによっても実施可能である。相応のプロモーター系、例えばＥ．コリにおいては、ｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモーター又は誘導可能なｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ−、ラムダ−、ａｒａ−又はｔｅｔ−プロモーターは当業者に公知である。かかる構築物は、自体公知のようにプラスミド又は染色体に使用することができる。
【００２０】
更に、発現強化は、翻訳開始シグナル、例えばリボソーム結合部位又は遺伝子の開始コドンが、最適化された配列でそれぞれの構築物に存在するか、又はコドン利用頻度に従って、稀なコドンを屡々存在するコドンと交換することによって達成できる。
【００２１】
前記の改変を有する微生物株は、本発明の有利な実施態様である。
【００２２】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のプラスミドベクター中へのクローニングは、例えば、完全なｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を表す特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応による特異的増幅と、それに引き続くベクターＤＮＡ断片とのライゲーションによって実施される。
【００２３】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のクローニングに好ましいベクターとしては、既に発現強化用のプロモーター、例えばＥ．コリのｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモーターを有するプラスミドが使用される。
【００２４】
更に、ＳＡＭの生合成強化が使用によりもたらされる遺伝子／アレル、例えばラット肝臓ＳＡＭ合成酵素（ＲＬＳＳ）アレル、ｍｅｔＫ遺伝子（ＥＰ０６４７７１２号Ａ１及びＥＰ１４５７５６９号Ａ１に記載される）又は複数のＳＡＭ合成酵素からなる組合せを有するベクターが特に好ましい。当然のように、多コピーのＳＡＭ合成酵素遺伝子を有するプラスミドを使用してもよい。かかるベクターは、任意の微生物株から、高いＳＡＭ過剰産生を伴う本発明による微生物株を直接的に製造することを可能にする。
【００２５】
従って、本発明は、ＳＡＭ合成酵素遺伝子並びにｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子をプロモーターの制御下に有するプラスミドにも関する。かかるプラスミドは、様々な生物のＳＡＭ合成酵素遺伝子からなる組合せ又は多コピーのＳＡＭ合成酵素遺伝子をも有してよい。
【００２６】
通常の形質転換法（例えばエレクトロポレーション）によって、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）含有遺伝子を微生物中に取り込み、そして例えば抗生物質耐性によってプラスミドを有するクローンを選択する。
【００２７】
従って本発明は、本発明による微生物株の製造方法において、出発菌株中に本発明によるプラスミドを取り込ませることを特徴とする方法にも関する。
【００２８】
本発明によるプラスミドによる形質転換のための菌株としては、同様にＳＡＭ産生を促進しうるアレル、例えば
− ＳＡＭ産生の改善にはたらくアレル、例えばＲＬＳＳ遺伝子又はｍｅｔＫ遺伝子（例えばＥＰ１４５７５６９号Ａ１に記載される）
− 又はメチオニン取り込みの改善にはたらく遺伝子、例えばＥ．コリ由来のｍｅｔＮＩＱオペロン（Merlin他、J. Bacteriol. 184, 5513-5517 (2002)；Gal他、J. Bacteriol. 184, 4930-4932 (2002)；Zhang他、Arch. Microbiol. 180, 88-100 (2003））
− 又は細胞形質のメチオニン合成の改善を促進する遺伝子、例えば改善されたホモセリン−スクシニル転移酵素遺伝子（ＪＰ２０００１３９４７１号Ａ、ＤＥ−Ａ−１０２４７４３７号、ＤＥ−Ａ−１０２４９６４２号）
を既に有する菌株が特に好ましい。
【００２９】
本発明による微生物株を用いたＳＡＭの製造は、発酵槽中で自体公知の方法に従って行われる。
【００３０】
従って、本発明は、ＳＡＭの製造方法において、本発明による微生物株を発酵培地中で発酵を行わせ、そしてその際に発酵培地中にＳＡＭを分泌させることを特徴とする方法にも関する。有利には、産生されたＳＡＭは発酵混合物から分離される。
【００３１】
微生物株の発酵槽中での培養は、連続培養、回分培養又は有利には流加回分培養として行われる。発酵の間に炭素源を連続的に計量供給することが特に好ましい。
【００３２】
炭素源としては、有利には糖類、糖アルコール又は有機酸が用いられる。特に有利には、本発明による方法において炭素源としてはグルコース、ラクトース又はグリセリンが使用される。
【００３３】
炭素源は、炭素源の含有量が発酵槽中で発酵の間に０．１〜５０ｇ／ｌの範囲に保持されることが保証される形で計量供給することが好ましい。０．５〜１０ｇ／ｌの範囲が特に好ましい。
【００３４】
窒素源としては、本発明による方法では、有利にはアンモニア、アンモニウム塩又はタンパク質加水分解物が使用される。アンモニアをｐＨ測定用の校正試薬として使用する場合には、発酵の間に規則的に前記の窒素源を後から計量供給する。
【００３５】
更なる培地添加剤として、リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄といった元素の塩と、微量に（つまりμＭの濃度で）モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルといった元素の塩を添加することができる。
【００３６】
更に、有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン（例えばＢ１、Ｂ１２）を培地に添加することができる。
【００３７】
複合栄養源としては、例えば酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉又は麦芽エキスを使用することができる。
【００３８】
更に、培地に、Ｌ−メチオニン又はＤ／Ｌ−メチオニンをＳＡＭ合成酵素のための特異的な前駆物質として、０．０５〜２５ｇ／ｌの濃度で添加することができる。Ｌ−メチオニン及び／又はＤ／Ｌ−メチオニンを１〜７ｇ／ｌの濃度で添加することが好ましい。
【００３９】
追加的に、特に有利な本発明による方法では、培地に、Ｌ−メチオニン又はＤ，Ｌ−メチオニンを培養の間に連続的に計量供給する。Ｌ−メチオニン又はＤ／Ｌ−メチオニンの連続的な計量供給は、１時間あたり０．０５ｇ〜１０ｇであることが好ましい。Ｌ−メチオニン又はＤ／Ｌ−メチオニンの連続的な計量供給は、１時間あたり０．１ｇ〜２ｇであることが特に好ましい。
【００４０】
中温性微生物のためのインキュベーション温度は、有利には１５〜４５℃、特に有利には３０〜３７℃である。
【００４１】
発酵は、有利には好気的な増殖条件下に実施される。発酵槽中の酸素化は、圧縮空気又は純粋な酸素によって行われる。
【００４２】
発酵培地のｐＨ値は、発酵の間に、５．０〜８．５のｐＨ範囲にあることが好ましく、特に７．０のｐＨ値が好ましい。
【００４３】
菌株のインキュベーションは、有利には好気的な培養条件下で、１６〜１５０時間の時間にわたって、それぞれの菌株に至適な増殖温度の範囲で行われる。特に培養時間は２０〜４８時間であることが好ましい。
【００４４】
培養培地からのＳＡＭの分離は、当業者に公知の方法、例えば培地の遠心分離による細胞分離、クロスフロー濾過によるタンパク質の分離、そして引き続いてのクロマトグラフィーによる生成物の精製、濃縮、配合及び錯化に従って行うことができる。
【００４５】
本発明による方法で製造されたＳＡＭの検出及び定量化は、例えばクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）によって行われる。
【００４６】
以下の実施例を用いて、本発明を更に詳説する。
【実施例】
【００４７】
実施例１：プラスミドｐＦＬ２４２の構築
ＧＡＰＤＨ−プロモーター−ＲＬＳＳ断片のクローニングのために、プラスミドｐＫＰ５０４を制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩを用いて直鎖化した。プラスミドｐＫＰ５０４の製造は、特許ＥＰ−Ａ−１４５７５６９号の実施例４に記載されている。引き続き、直鎖化されたプラスミドの脱リン酸化をアルカリ性ホスファターゼ（ロシュ社、マンハイム在）を用いて行った。引き続き、ライゲーションの前に、直鎖化されたベクターの精製を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）を使用して製造元の指示に従って実施した。ＧＡＰＤＨ−プロモーター−ＲＬＳＳ断片を、ＳＡＭ産生プラスミドｐＭＳＲＬＳＳｋ（ＥＰ１４５７５６９号Ａ１）から制限エンドヌクレアーゼＥｃｌ１３６ＩＩ及びＳｔｕＩを用いて単離した。該断片をアガロースゲル電気泳動を介して精製し、引き続きゲル抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、キアゲン社、ヒルデン在）した後に、ＧＡＰＤＨ−プロモーター−ＲＬＳＳ断片と、ＳｓｐＩで直鎖化されたベクターｐＫＰ５０４とのライゲーションをＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ社、マンハイム在）を用いて製造元の指示に従って実施した。
【００４８】
菌株ＤＨ５α（インビトロジェン社、カールスルーエ在）のＥ．コリ細胞を前記ライゲーション混合物で形質転換することは、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換混合物を、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４９】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）によるプラスミド単離に従って制限分析によって同定した。前記のようにして得られたプラスミドｐＦＬ２４２（図１）には、今や、Ｅ．コリ由来のｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモーターの制御下に更なる遺伝子をクローニングすることが可能である。本実施例の実施のために使用されたプラスミドｐＦＬ２４２は、２００５年２月１７日にＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、Ｄ−３８１４２ ブラウンシュバイク在）において番号ＤＳＭ１７１４２としてブタペスト条約に従って寄託された。
【００５０】
実施例２：プラスミドｐＦＬ２７４の構築
Ａ． ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の増幅
Ｅ．コリ由来のｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ｔａｑ−ＤＮＡ−ポリメラーゼを使用して、当業者に公知の通常の慣習に従って増幅させた。鋳型として、Ｅ．コリ野生型菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の染色体ＤＮＡを用いた。プライマーとしては、配列
【００５１】
【表１】
を有するオリゴヌクレオチドｃｍｒ ｆｏｒ（配列番号３）と、配列
【００５２】
【表２】
を有するオリゴヌクレオチドｃｍｒ ｒｅｖ（配列番号４）とを使用した。
【００５３】
ＰＣＲで得られた約１．３ｋｂ長を有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５４】
Ｂ． ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のベクターｐＦＬ２４２へのクローニング
該ＰＣＲ断片に、プライマーのｃｍｒ ｆｏｒとｃｍｒ ｒｅｖとを介して、制限エンドヌクレアーゼＳｔｕＩ及びＰａｃＩについての２つの切断部位を挿入した。精製されたＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＳｔｕＩ（ロシュ社、マンハイム在）及びＰａｃＩ（ニューイングランド・バイオラブス社、フランクフルトアムマイン在）によって、製造元が指示する条件下で切断し、アガロースゲルにより分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）を用いて製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。
【００５５】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のクローニングのために、ベクターｐＦＬ２４２を、制限酵素ＳｔｕＩ及びＰａｃＩによって製造元が指示する条件下に切断した。引き続き該プラスミドを、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ社、マンハイム在）での処理によって５′末端において脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）によって精製した。該ＰＣＲ断片と、切断され脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ社、マンハイム在）を使用して実施した。菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）のＥ．コリ細胞を前記ライゲーション混合物で形質転換することは、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換混合物を、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５６】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）によるプラスミド単離に従って制限分析によって同定し、そして欠損がないことを配列解析によって確認した。
【００５７】
前記のようにして得られたプラスミドｐＦＬ２７４（図２）においては、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子はＧＡＰＤＨ−プロモーターの制御下にある。
【００５８】
実施例３：Ｓ−アデノシルメチオニンの生産者の製造
実施例２に記載されたプラスミドｐＦＬ２７４を使用して、ＣａＣｌ２法によってＥ．コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の形質転換を行い、そして２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ−アガープレート上で選択した後に、該プラスミドを形質転換体のなかから再び単離し、制限エンドヌクレアーゼにより分解して調査した。前記の菌株をＷ３１１０／ｐＦＬ２７４と呼称し、該菌株はＳＡＭの製造のために適している。
【００５９】
実施例４：Ｓ−アデノシルメチオニンの発酵的製造
Ａ． ＳＡＭの製造
ＳＡＭの発酵的製造のために、菌株Ｗ３１１０／ｐＦＬ２７４を使用した。比較として、一方でプラスミド不含の野生型菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）を用い、そして他方で菌株Ｗ３１１０／ｐＭＳＲＬＳＳｋを用い、これらを同じ条件下で培養した。Ｗ３１１０／ｐＭＳＲＬＳＳｋは、実施例３と同様にＷ３１１０とプラスミドｐＭＳＲＬＳＳｋから製造した。培養のために以下の培地を使用した：１ｌの培地につき：ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ ０．１５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ ２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ、ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ ０．２５ｍｇ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ １．６ｍｇ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １２．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ、ＮａＣｌ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ、クエン酸三ナトリウム×２Ｈ２Ｏ １ｇ、グルコース １５ｇ、トリプトン １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ。
【００６０】
Ｗ３１１０／ｐＭＳＲＬＳＳｋとＷ３１１０／ｐＦＬ２７４の培養の場合には、培地に２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した。更に該培地は０．５ｇ／ｌのＬ−メチオニンの添加を含んでいる。製造培養のための前培養として、まず試験管中の３ｍｌの培地にそれぞれの菌株を接種し、そして３７℃及び１５０ｒｐｍにおいて１６時間振とう器でインキュベートした。前記のようにして準備された細胞を、最終的に、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中の同じ培地２０ｍｌに０．１のＯＤ６００（６００ｎｍでの吸光度）になるまで接種した。製造培養のインキュベーションは、３７℃及び１５０ｒｐｍにおいて振とう器で４８時間まで実施した。２４時間後と４８時間後に試料を採取し、培養培地の遠心分離によって細胞を分離した。 Ｂ． 製造されたＳＡＭの定量化
培養上清中に含まれるＳＡＭをＨＰＬＣによって定量化した。その際には、２５０＊４．６ｍｍのＤｅｖｅｌｏｓｉｌ ＲＰ−Ａｑｕｅｏｕｓ Ｃ３０カラム（５μｍ）（フェノメネックス社、アシャッフェンブルク在）を使用して、培養上清１０μＬを適用し、それを１ｌのＨ２Ｏあたり３ｍｌの８５％Ｈ３ＰＯ４からなる溶離剤を用いた定組成溶離によって室温で０．５ｍｌ／分の流速で分離し、波長２６０ｎｍでダイオードアレイ検出器によって定量化した。第１表は、それぞれの培養上清において得られたＳＡＭの含有量を示している。
【００６１】
第１表：
【００６２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、プラスミドｐＦＬ２４２を示す
【図２】図２は、プラスミドｐＦＬ２７４を示す
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニンの発酵的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は、代謝における非常に重要なメチル基供与体であり、そしてこれは鬱病、肝臓の病気及び関節炎の治療において医薬分野で使用されている。ＳＡＭの製造のための記載された方法は、前駆物質であるメチオニンの存在下に酵母を培養し（Schlenk及びDePalma、J. Biol. Chem. 229, 1037-1050 (1957)、Schlenk他、Enzymologia 29, 283-298 (1965)、Shiozaki他、J. Biotechnol. 4, 345-354 (1986)、Shiozaki他、Agric. Biol. Chem. 53, 3269-3274 (1989)）、そして形成されたＳＡＭを、引き続き細胞溶解物からの抽出後にクロマトグラフィーによる精製を行う（ＵＳ４５６２１４９号）ことを含む。酵母によるＳＡＭの製造に特徴的なことは、ＳＡＭが細胞内で産生され、そして蓄積されることである。ＳＡＭの更なる後処理を実施するためには、例えばＥＰ１６２３２３号（実施例２）又はＤＥ３３２９２１８号（実施例１）に記載されるように細胞をまず破砕しなければならない。化学的溶解法の他に、フレンチプレスもしくは高圧均質化による機械的方法又は熱的方法（ＥＰ１０９１００１号の実施例１に記載されている）も可能である。
【０００３】
酵母によるＳＡＭ製造に対して、先行技術において大腸菌（Ｅ．コリ）を用いた細菌によるＳＡＭ製造方法が記載され、そこでは細菌は産生されたＳＡＭをその細胞から培養培地へと排出する（ＥＰ１４５７５６９号Ａ１）。前記の発酵的なＳＡＭ製造方法は、現存の酵母法に対して明らかな利点を有する。それというのも、該方法は形成されたＳＡＭを培養上清へと選択的に分泌することを説明しており、それにより後の精製法の簡便化が可能となるからである。培養上清中にはごく僅かな物質のみが存在するだけなのは、ＳＡＭの分泌が第一の精製段階を担うからであり、これは更なる後処理を明らかに容易にするものである。前記の細胞外でのＳＡＭ製造のための方法ではＳＡＭ合成酵素が使用される。
【特許文献１】ＵＳ４５６２１４９号
【特許文献２】ＥＰ１６２３２３号
【特許文献３】ＤＥ３３２９２１８号
【特許文献４】ＥＰ１０９１００１号
【特許文献５】ＥＰ１４５７５６９号Ａ１
【非特許文献１】Schlenk及びDePalma、J. Biol. Chem. 229, 1037-1050 (1957)
【非特許文献２】Schlenk他、Enzymologia 29, 283-298 (1965)
【非特許文献３】Shiozaki他、J. Biotechnol. 4, 345-354 (1986)
【非特許文献４】Shiozaki他、Agric. Biol. Chem. 53, 3269-3274 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、先行技術と比較して高められたＳＡＭ製造を可能にする微生物株を提供することである。更なる課題は、本発明による微生物株を用いてＳＡＭを製造するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
最初に挙げられた課題は、Ｓ−アデノシルメチオニンを分泌する微生物株であって、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性が高められていることを特徴とする微生物株によって解決される。
【０００６】
本発明による微生物株は出発菌株から製造でき、そして該微生物株は出発菌株に対して高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有する。
【０００７】
有利には、微生物株が出発菌株に対して高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有する場合とは、その微生物株の細胞がｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物を有する野生型微生物株の細胞に対して、少なくとも２倍、有利には少なくとも５倍だけ高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有する場合である。ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性測定のための試験は、科学文献（Edgar及びBibi、J. Bacteriol. 179, 2274-2280）に記載されている。
【０００８】
Ｅ．コリのｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子は１９９６年にクロラムフェニコール排出タンパク質（Chloramphenicol-Export-Protein）Ｃｍｒとして同定された（Nilsen他、J. Bacteriol. 178, 3188-3193）。１９９７年には、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子は、広い基質スペクトルを有する多剤排出タンパク質ＭｄｆＡとして説明された（Edgar及びBibi、J. Bacteriol. 179, 2274-2280）。Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質は、ＭＦ（Ｓ）［メジャーファシリテーター（スーパーファミリー）］輸送体のファミリーに属し、そして例えばクロラムフェニコール又はエリスロマイシンのような親油性の非荷電の基質と同様に、例えば臭化エチジウム、ドキソルビシン又はベンズアルコニウムのような親油性の正に荷電した基質をもＨ＋イオンと引き替えに細胞外に排出する（Bibi他によるレビュー、J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 171-177 (2001)を参照のこと）。Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質が広い基質スペクトルを有するとはいえ、当業者には、Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）がＳＡＭ排出タンパク質として機能しうることは驚くべきことである。それというのも、ＳＡＭは今までに説明した基質とは構造的な共通点を有さないからである。更に、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）の核酸配列と同様に、Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質のアミノ酸配列も、従来公知の酵母及びヒト由来のＳＡＭ輸送遺伝子及びＳＡＭ輸送タンパク質とホモロジーを示さない。ある基質がＣｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質についての基質として機能しうるかどうかは、輸送体のメカニズムが十分に知られていない以上、予想不可能である。更に当業者には、本発明によるＳＡＭを有する微生物株において、強く親水性で正に荷電し、同時に細胞形質の分子が細胞外に輸送されることは全く意想外である。
【０００９】
従って本発明は、ＳＡＭの製造における排出タンパク質としてのｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の使用にも関する。
【００１０】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物（Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質）は配列番号１もしくは配列番号２によって特徴付けられている。本発明の範囲では、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とは、クロラムフェニコール排出活性又は多剤排出活性を有するタンパク質をコードし、かつアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ） ウィンスコンシン州マジソン在）により配列番号１に対して３０％より高い配列同一性を有する遺伝子とも解釈されるべきである。配列番号１に対して５０％より高い配列同一性が好ましい。配列番号１に対して７０％より高い配列同一性が特に好ましい。
【００１１】
同様に、Ｃｍｒ（ＭｄｆＡ）タンパク質とは、クロラムフェニコール排出活性又は多剤排出活性を有し、かつアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ） ウィンスコンシン州マジソン在）により配列番号２に対して１５％より高い配列同一性を有するタンパク質と解釈されるべきである。配列番号２に対して３０％より高い配列同一性が好ましい。配列番号２に対して６０％より高い配列同一性が特に好ましい。
【００１２】
従って、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とは、配列番号１に示される配列からヌクレオチドの欠失、挿入又は置換によって導かれるが、それぞれの遺伝子産物の酵素活性が少なくとも維持されたままでなければならない、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のアレル変異体、特に機能的変異体をも表す。
【００１３】
本発明による微生物は、分子生物学の標準的手法により作成することができる。
【００１４】
出発菌株としては、原則的に、ＳＡＭに関する生合成経路を有し、組み換え法を利用でき、そして発酵によって培養可能な全ての微生物が適している。かかる微生物は、菌類、酵母又は細菌であってよい。真性細菌の系統発生的群の細菌であることが好ましい。腸内細菌科の微生物、特に大腸菌の種の微生物であることが特に好ましい。
【００１５】
本発明による微生物におけるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性増大は、例えばｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現強化によって達成される。この場合に、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のコピー数が微生物中で高められも、かつ／又は適当なプロモーターによってｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現が増大されていてもよい。発現強化とは、この場合、有利にはｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子が出発菌株よりも少なくとも２倍だけ強く発現することを意味する。ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の高められたコピー数とは、有利には、染色体及び／又はプラスミドにコードされるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のコピーを出発菌株と比較して付加的に少なくとも１コピー使用されることを意味する。
【００１６】
微生物におけるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のコピー数の増加は、当業者に公知の方法で実施することができる。こうして、例えばｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を、１細胞あたりに多コピー数を有するプラスミドベクター（例えばＥ．コリ用のｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４）中にクローニングして、微生物中に取り込ませることができる。選択的に、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を微生物の染色体中に多重に組み込むこともできる。組み込み法としては、溶原性バクテリオファージを有する公知のシステム、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みを用いることができる。
【００１７】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子をプラスミドベクター中にプロモーターの制御下にクローニングすることによってコピー数を増加させることが好ましい。ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子をｐＡＣＹＣ誘導体中にクローニングすることによりＥ．コリ中のコピー数を増加させることが特に好ましい。
【００１８】
プラスミドでコードされるｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現のための制御領域としては、遺伝子の本来のプロモーター領域及びオペレーター領域を用いることができる。
【００１９】
しかしながらｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の発現強化は別のプロモーターによっても実施可能である。相応のプロモーター系、例えばＥ．コリにおいては、ｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモーター又は誘導可能なｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ−、ラムダ−、ａｒａ−又はｔｅｔ−プロモーターは当業者に公知である。かかる構築物は、自体公知のようにプラスミド又は染色体に使用することができる。
【００２０】
更に、発現強化は、翻訳開始シグナル、例えばリボソーム結合部位又は遺伝子の開始コドンが、最適化された配列でそれぞれの構築物に存在するか、又はコドン利用頻度に従って、稀なコドンを屡々存在するコドンと交換することによって達成できる。
【００２１】
前記の改変を有する微生物株は、本発明の有利な実施態様である。
【００２２】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のプラスミドベクター中へのクローニングは、例えば、完全なｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を表す特異的なプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応による特異的増幅と、それに引き続くベクターＤＮＡ断片とのライゲーションによって実施される。
【００２３】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のクローニングに好ましいベクターとしては、既に発現強化用のプロモーター、例えばＥ．コリのｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモーターを有するプラスミドが使用される。
【００２４】
更に、ＳＡＭの生合成強化が使用によりもたらされる遺伝子／アレル、例えばラット肝臓ＳＡＭ合成酵素（ＲＬＳＳ）アレル、ｍｅｔＫ遺伝子（ＥＰ０６４７７１２号Ａ１及びＥＰ１４５７５６９号Ａ１に記載される）又は複数のＳＡＭ合成酵素からなる組合せを有するベクターが特に好ましい。当然のように、多コピーのＳＡＭ合成酵素遺伝子を有するプラスミドを使用してもよい。かかるベクターは、任意の微生物株から、高いＳＡＭ過剰産生を伴う本発明による微生物株を直接的に製造することを可能にする。
【００２５】
従って、本発明は、ＳＡＭ合成酵素遺伝子並びにｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子をプロモーターの制御下に有するプラスミドにも関する。かかるプラスミドは、様々な生物のＳＡＭ合成酵素遺伝子からなる組合せ又は多コピーのＳＡＭ合成酵素遺伝子をも有してよい。
【００２６】
通常の形質転換法（例えばエレクトロポレーション）によって、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）含有遺伝子を微生物中に取り込み、そして例えば抗生物質耐性によってプラスミドを有するクローンを選択する。
【００２７】
従って本発明は、本発明による微生物株の製造方法において、出発菌株中に本発明によるプラスミドを取り込ませることを特徴とする方法にも関する。
【００２８】
本発明によるプラスミドによる形質転換のための菌株としては、同様にＳＡＭ産生を促進しうるアレル、例えば
− ＳＡＭ産生の改善にはたらくアレル、例えばＲＬＳＳ遺伝子又はｍｅｔＫ遺伝子（例えばＥＰ１４５７５６９号Ａ１に記載される）
− 又はメチオニン取り込みの改善にはたらく遺伝子、例えばＥ．コリ由来のｍｅｔＮＩＱオペロン（Merlin他、J. Bacteriol. 184, 5513-5517 (2002)；Gal他、J. Bacteriol. 184, 4930-4932 (2002)；Zhang他、Arch. Microbiol. 180, 88-100 (2003））
− 又は細胞形質のメチオニン合成の改善を促進する遺伝子、例えば改善されたホモセリン−スクシニル転移酵素遺伝子（ＪＰ２０００１３９４７１号Ａ、ＤＥ−Ａ−１０２４７４３７号、ＤＥ−Ａ−１０２４９６４２号）
を既に有する菌株が特に好ましい。
【００２９】
本発明による微生物株を用いたＳＡＭの製造は、発酵槽中で自体公知の方法に従って行われる。
【００３０】
従って、本発明は、ＳＡＭの製造方法において、本発明による微生物株を発酵培地中で発酵を行わせ、そしてその際に発酵培地中にＳＡＭを分泌させることを特徴とする方法にも関する。有利には、産生されたＳＡＭは発酵混合物から分離される。
【００３１】
微生物株の発酵槽中での培養は、連続培養、回分培養又は有利には流加回分培養として行われる。発酵の間に炭素源を連続的に計量供給することが特に好ましい。
【００３２】
炭素源としては、有利には糖類、糖アルコール又は有機酸が用いられる。特に有利には、本発明による方法において炭素源としてはグルコース、ラクトース又はグリセリンが使用される。
【００３３】
炭素源は、炭素源の含有量が発酵槽中で発酵の間に０．１〜５０ｇ／ｌの範囲に保持されることが保証される形で計量供給することが好ましい。０．５〜１０ｇ／ｌの範囲が特に好ましい。
【００３４】
窒素源としては、本発明による方法では、有利にはアンモニア、アンモニウム塩又はタンパク質加水分解物が使用される。アンモニアをｐＨ測定用の校正試薬として使用する場合には、発酵の間に規則的に前記の窒素源を後から計量供給する。
【００３５】
更なる培地添加剤として、リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄といった元素の塩と、微量に（つまりμＭの濃度で）モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルといった元素の塩を添加することができる。
【００３６】
更に、有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン（例えばＢ１、Ｂ１２）を培地に添加することができる。
【００３７】
複合栄養源としては、例えば酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉又は麦芽エキスを使用することができる。
【００３８】
更に、培地に、Ｌ−メチオニン又はＤ／Ｌ−メチオニンをＳＡＭ合成酵素のための特異的な前駆物質として、０．０５〜２５ｇ／ｌの濃度で添加することができる。Ｌ−メチオニン及び／又はＤ／Ｌ−メチオニンを１〜７ｇ／ｌの濃度で添加することが好ましい。
【００３９】
追加的に、特に有利な本発明による方法では、培地に、Ｌ−メチオニン又はＤ，Ｌ−メチオニンを培養の間に連続的に計量供給する。Ｌ−メチオニン又はＤ／Ｌ−メチオニンの連続的な計量供給は、１時間あたり０．０５ｇ〜１０ｇであることが好ましい。Ｌ−メチオニン又はＤ／Ｌ−メチオニンの連続的な計量供給は、１時間あたり０．１ｇ〜２ｇであることが特に好ましい。
【００４０】
中温性微生物のためのインキュベーション温度は、有利には１５〜４５℃、特に有利には３０〜３７℃である。
【００４１】
発酵は、有利には好気的な増殖条件下に実施される。発酵槽中の酸素化は、圧縮空気又は純粋な酸素によって行われる。
【００４２】
発酵培地のｐＨ値は、発酵の間に、５．０〜８．５のｐＨ範囲にあることが好ましく、特に７．０のｐＨ値が好ましい。
【００４３】
菌株のインキュベーションは、有利には好気的な培養条件下で、１６〜１５０時間の時間にわたって、それぞれの菌株に至適な増殖温度の範囲で行われる。特に培養時間は２０〜４８時間であることが好ましい。
【００４４】
培養培地からのＳＡＭの分離は、当業者に公知の方法、例えば培地の遠心分離による細胞分離、クロスフロー濾過によるタンパク質の分離、そして引き続いてのクロマトグラフィーによる生成物の精製、濃縮、配合及び錯化に従って行うことができる。
【００４５】
本発明による方法で製造されたＳＡＭの検出及び定量化は、例えばクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）によって行われる。
【００４６】
以下の実施例を用いて、本発明を更に詳説する。
【実施例】
【００４７】
実施例１：プラスミドｐＦＬ２４２の構築
ＧＡＰＤＨ−プロモーター−ＲＬＳＳ断片のクローニングのために、プラスミドｐＫＰ５０４を制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩを用いて直鎖化した。プラスミドｐＫＰ５０４の製造は、特許ＥＰ−Ａ−１４５７５６９号の実施例４に記載されている。引き続き、直鎖化されたプラスミドの脱リン酸化をアルカリ性ホスファターゼ（ロシュ社、マンハイム在）を用いて行った。引き続き、ライゲーションの前に、直鎖化されたベクターの精製を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）を使用して製造元の指示に従って実施した。ＧＡＰＤＨ−プロモーター−ＲＬＳＳ断片を、ＳＡＭ産生プラスミドｐＭＳＲＬＳＳｋ（ＥＰ１４５７５６９号Ａ１）から制限エンドヌクレアーゼＥｃｌ１３６ＩＩ及びＳｔｕＩを用いて単離した。該断片をアガロースゲル電気泳動を介して精製し、引き続きゲル抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、キアゲン社、ヒルデン在）した後に、ＧＡＰＤＨ−プロモーター−ＲＬＳＳ断片と、ＳｓｐＩで直鎖化されたベクターｐＫＰ５０４とのライゲーションをＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ社、マンハイム在）を用いて製造元の指示に従って実施した。
【００４８】
菌株ＤＨ５α（インビトロジェン社、カールスルーエ在）のＥ．コリ細胞を前記ライゲーション混合物で形質転換することは、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換混合物を、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４９】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）によるプラスミド単離に従って制限分析によって同定した。前記のようにして得られたプラスミドｐＦＬ２４２（図１）には、今や、Ｅ．コリ由来のｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモーターの制御下に更なる遺伝子をクローニングすることが可能である。本実施例の実施のために使用されたプラスミドｐＦＬ２４２は、２００５年２月１７日にＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション、Ｄ−３８１４２ ブラウンシュバイク在）において番号ＤＳＭ１７１４２としてブタペスト条約に従って寄託された。
【００５０】
実施例２：プラスミドｐＦＬ２７４の構築
Ａ． ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子の増幅
Ｅ．コリ由来のｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ｔａｑ−ＤＮＡ−ポリメラーゼを使用して、当業者に公知の通常の慣習に従って増幅させた。鋳型として、Ｅ．コリ野生型菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の染色体ＤＮＡを用いた。プライマーとしては、配列
【００５１】
【表１】
を有するオリゴヌクレオチドｃｍｒ ｆｏｒ（配列番号３）と、配列
【００５２】
【表２】
を有するオリゴヌクレオチドｃｍｒ ｒｅｖ（配列番号４）とを使用した。
【００５３】
ＰＣＲで得られた約１．３ｋｂ長を有するＤＮＡ断片を、引き続きＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）のＤＮＡ吸着カラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００５４】
Ｂ． ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のベクターｐＦＬ２４２へのクローニング
該ＰＣＲ断片に、プライマーのｃｍｒ ｆｏｒとｃｍｒ ｒｅｖとを介して、制限エンドヌクレアーゼＳｔｕＩ及びＰａｃＩについての２つの切断部位を挿入した。精製されたＰＣＲ断片を、制限エンドヌクレアーゼＳｔｕＩ（ロシュ社、マンハイム在）及びＰａｃＩ（ニューイングランド・バイオラブス社、フランクフルトアムマイン在）によって、製造元が指示する条件下で切断し、アガロースゲルにより分離し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）を用いて製造元の指示に従ってアガロースゲルから単離した。
【００５５】
ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子のクローニングのために、ベクターｐＦＬ２４２を、制限酵素ＳｔｕＩ及びＰａｃＩによって製造元が指示する条件下に切断した。引き続き該プラスミドを、アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ社、マンハイム在）での処理によって５′末端において脱リン酸化させ、次いで同様にそのＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）によって精製した。該ＰＣＲ断片と、切断され脱リン酸化されたベクターとのライゲーションを、製造元の指示に従ってＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ（ロシュ社、マンハイム在）を使用して実施した。菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）のＥ．コリ細胞を前記ライゲーション混合物で形質転換することは、エレクトロポレーションによって当業者に公知のように実施した。形質転換混合物を、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５６】
所望の形質転換体を、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社、ヒルデン在）によるプラスミド単離に従って制限分析によって同定し、そして欠損がないことを配列解析によって確認した。
【００５７】
前記のようにして得られたプラスミドｐＦＬ２７４（図２）においては、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子はＧＡＰＤＨ−プロモーターの制御下にある。
【００５８】
実施例３：Ｓ−アデノシルメチオニンの生産者の製造
実施例２に記載されたプラスミドｐＦＬ２７４を使用して、ＣａＣｌ２法によってＥ．コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）の形質転換を行い、そして２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ−アガープレート上で選択した後に、該プラスミドを形質転換体のなかから再び単離し、制限エンドヌクレアーゼにより分解して調査した。前記の菌株をＷ３１１０／ｐＦＬ２７４と呼称し、該菌株はＳＡＭの製造のために適している。
【００５９】
実施例４：Ｓ−アデノシルメチオニンの発酵的製造
Ａ． ＳＡＭの製造
ＳＡＭの発酵的製造のために、菌株Ｗ３１１０／ｐＦＬ２７４を使用した。比較として、一方でプラスミド不含の野生型菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）を用い、そして他方で菌株Ｗ３１１０／ｐＭＳＲＬＳＳｋを用い、これらを同じ条件下で培養した。Ｗ３１１０／ｐＭＳＲＬＳＳｋは、実施例３と同様にＷ３１１０とプラスミドｐＭＳＲＬＳＳｋから製造した。培養のために以下の培地を使用した：１ｌの培地につき：ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ ０．１５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ ２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ、ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ ０．２５ｍｇ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ １．６ｍｇ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．３ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １２．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ、ＮａＣｌ ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ、クエン酸三ナトリウム×２Ｈ２Ｏ １ｇ、グルコース １５ｇ、トリプトン １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ。
【００６０】
Ｗ３１１０／ｐＭＳＲＬＳＳｋとＷ３１１０／ｐＦＬ２７４の培養の場合には、培地に２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを添加した。更に該培地は０．５ｇ／ｌのＬ−メチオニンの添加を含んでいる。製造培養のための前培養として、まず試験管中の３ｍｌの培地にそれぞれの菌株を接種し、そして３７℃及び１５０ｒｐｍにおいて１６時間振とう器でインキュベートした。前記のようにして準備された細胞を、最終的に、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中の同じ培地２０ｍｌに０．１のＯＤ６００（６００ｎｍでの吸光度）になるまで接種した。製造培養のインキュベーションは、３７℃及び１５０ｒｐｍにおいて振とう器で４８時間まで実施した。２４時間後と４８時間後に試料を採取し、培養培地の遠心分離によって細胞を分離した。 Ｂ． 製造されたＳＡＭの定量化
培養上清中に含まれるＳＡＭをＨＰＬＣによって定量化した。その際には、２５０＊４．６ｍｍのＤｅｖｅｌｏｓｉｌ ＲＰ−Ａｑｕｅｏｕｓ Ｃ３０カラム（５μｍ）（フェノメネックス社、アシャッフェンブルク在）を使用して、培養上清１０μＬを適用し、それを１ｌのＨ２Ｏあたり３ｍｌの８５％Ｈ３ＰＯ４からなる溶離剤を用いた定組成溶離によって室温で０．５ｍｌ／分の流速で分離し、波長２６０ｎｍでダイオードアレイ検出器によって定量化した。第１表は、それぞれの培養上清において得られたＳＡＭの含有量を示している。
【００６１】
第１表：
【００６２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、プラスミドｐＦＬ２４２を示す
【図２】図２は、プラスミドｐＦＬ２７４を示す
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−アデノシルメチオニンを分泌する微生物株であって、高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株。
【請求項２】
請求項１記載の微生物株であって、その菌株の細胞が、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物を有する野性型の微生物株の細胞と比較して、少なくとも２倍、有利には少なくとも５倍だけ高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株。
【請求項３】
請求項１又は２記載の微生物株であって、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物が、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号２に対して１５％より高い配列同一性を有することを特徴とする微生物株。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載の微生物株であって、その菌株が、腸内細菌科の菌株、有利には大腸菌の種の菌株であることを特徴とする微生物株。
【請求項５】
プラスミドであって、そのプラスミドがＳＡＭ合成酵素遺伝子並びにｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とプロモーターとを有することを特徴とするプラスミド。
【請求項６】
請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物株の製造方法において、出発菌株へと請求項５記載のプラスミドを取り込ませることを特徴とする方法。
【請求項７】
ＳＡＭの製造方法において、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物株を発酵培地中で発酵を行わせ、そしてその際に発酵培地中にＳＡＭを分泌させることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、ＳＡＭを発酵培地から分離することを特徴とする方法。
【請求項９】
ＳＡＭの製造における排出タンパク質としての、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の使用。
【請求項１】
Ｓ−アデノシルメチオニンを分泌する微生物株であって、高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株。
【請求項２】
請求項１記載の微生物株であって、その菌株の細胞が、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物を有する野性型の微生物株の細胞と比較して、少なくとも２倍、有利には少なくとも５倍だけ高められたｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株。
【請求項３】
請求項１又は２記載の微生物株であって、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物が、配列番号２のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号２に対して１５％より高い配列同一性を有することを特徴とする微生物株。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載の微生物株であって、その菌株が、腸内細菌科の菌株、有利には大腸菌の種の菌株であることを特徴とする微生物株。
【請求項５】
プラスミドであって、そのプラスミドがＳＡＭ合成酵素遺伝子並びにｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子とプロモーターとを有することを特徴とするプラスミド。
【請求項６】
請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物株の製造方法において、出発菌株へと請求項５記載のプラスミドを取り込ませることを特徴とする方法。
【請求項７】
ＳＡＭの製造方法において、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物株を発酵培地中で発酵を行わせ、そしてその際に発酵培地中にＳＡＭを分泌させることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、ＳＡＭを発酵培地から分離することを特徴とする方法。
【請求項９】
ＳＡＭの製造における排出タンパク質としての、ｃｍｒ（ｍｄｆＡ）遺伝子産物の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２３８８８３（Ｐ２００６−２３８８８３Ａ）
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５６８５４（Ｐ２００６−５６８５４）
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（３９０００９００３）コンゾルテイウム フユール エレクトロケミツシエ インヅストリー ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング (17)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｕｅｒ ｅｌｅｋｔｒｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｚｉｅｌｓｔａｔｔｓｔｒａｓｓｅ ２０，Ｄ−８１３７９ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（３９０００９００３）コンゾルテイウム フユール エレクトロケミツシエ インヅストリー ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング (17)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｕｅｒ ｅｌｅｋｔｒｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｚｉｅｌｓｔａｔｔｓｔｒａｓｓｅ ２０，Ｄ−８１３７９ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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