Ｔ細胞の不応答性を調節する方法
【課題】細胞表面受容体ＣＤ２を介して不応答性Ｔ細胞を阻害または刺激することを含む抗原特異的Ｔ細胞不応答性を調節する方法を得る。
【解決手段】臓器または骨髄移植および自己免疫疾患における抗原に対する免疫反応を阻害することが望ましい状況において治療的に有用なＣＤ２表面受容体を介する不応答性Ｔ細胞の刺激を阻害する物質、および抗原に対する免疫反応を刺激するのに治療的に有用なＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質とＴ細胞を接触させることによってＴ細胞の不応答性を逆転させる方法を開発する。
【解決手段】臓器または骨髄移植および自己免疫疾患における抗原に対する免疫反応を阻害することが望ましい状況において治療的に有用なＣＤ２表面受容体を介する不応答性Ｔ細胞の刺激を阻害する物質、および抗原に対する免疫反応を刺激するのに治療的に有用なＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質とＴ細胞を接触させることによってＴ細胞の不応答性を逆転させる方法を開発する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原特異的Ｔ細胞の不応答性を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異的Ｔ細胞応答には、Ｔ細胞の細胞表面受容体と抗原提示細胞のリガンドとの間の多重相互作用が必要である。その第一の相互作用は、Ｔ細胞リセプター（受容体）／ＣＤ３複合体と主要組織適合性遺伝子複合体分子との間の相互作用であり、これは、Ｔ細胞受容体に抗原ペプチドを提示してＴ細胞中に抗原特異的シグナルをトリガー（誘発）する。この抗原特異的シグナルに加えて、Ｔ細胞応答には第二の共刺激シグナル（costimulatory signal）が必要である。共刺激シグナルは、細胞表面受容体ＣＤ28を通じてＴ細胞を刺激することによってＴ細胞中に生成させることができる（Harding、F.A.、Nature、356巻、607〜609頁、1992年）。ＣＤ28に対するリガンドは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に確認されている。ＣＤ28のリガンドとしては、Ｂ７−１およびＢ７−２などのＢ７ファミリーのタンパク質のメンバーがある（Freedman、A.S.ら、J.Immunol.、137巻、3260〜3267頁、1987年；Freeman、G.J.ら、J.Immunol.、143巻、2714〜2722頁、1989年；Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、174巻、625〜631頁、1991年；Freeman、G.J.ら、Science、262巻、909〜911頁、1993年；Azuma、M.ら、Nature、366巻、76〜79頁、1993年；Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、178巻、2185〜2192頁、1993年)。またこれらＢ７タンパク質類は、ＣＤ28に類縁のＣＴＬＡ４と呼称される、Ｔ細胞上の他の表面受容体と結合することも報告されているが、共刺激におけるＣＴＬＡ４の役割はまだ明らかになっていない（Linsley、P.S.、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年）。
【０００３】
共刺激シグナルがない場合に抗原特異的シグナルがＴ細胞に送達されてもＴ細胞応答を誘導することなくＴ細胞アネルギーと呼ばれる不応答の状態を誘導することが実証されている（Schwartz、R.H.、Science、248巻、1349頁、1990年；およびJenkins、M.K.ら、J.Immunol.、140巻、3324頁、1988年参照）。この現象に基づいて、抗原に対するＴ細胞の不応答を誘導する治療法すなわちＴ細胞における共刺激シグナルを遮断する方法が提案されている。例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質は、Ｂ７−１とＢ７−２の両者に結合してこれらのＣＤ28との相互作用を遮断するが、同種異系移植片および異種移植片に対する拒絶反応を抑制するのに使用されている（例えばTurka、L.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、89巻、11102〜11105頁、1992年；およびLenschow、D.J.ら、Science、257巻、789〜792頁、1992年参照）。あるいは、細胞（例えば腫瘍細胞）上の抗原に対するＴ細胞応答を刺激する治療法も提案されている。例えば、その表面にＣＤ28リガンドのＢ７−１を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、Ｔ細胞内の共刺激シグナルをトリガーすることが見出されている（例えば、Chen、L.ら、Cell、71巻、1093〜1102頁、1992年；Townsend、S.E.およびAllison、J.P.、Science、259巻、368〜370頁、1993年；ならびにBaskar、S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、90巻、5687〜5690頁、1993年参照）。
【０００４】
抗原特異的相互作用と共刺激相互作用に加えて、Ｔ細胞の他の多くの細胞表面受容体は、Ｔ細胞の活性化においてアクセサリー機能をはたすと考えられている（Clark、E.A.およびLedbetter、J.A.、Nature、367巻、425〜428頁、1994年に総説が記載されている）。このような細胞表面受容体の例としては、ＭＨＣクラスII抗原と相互作用するＣＤ４；ＭＨＣクラスI抗原と相互作用するＣＤ８；ＣＤ40Ｌ（gp39）と相互作用するＣＤ40；ＬＦＡ−１と相互作用するＩＣＡＭ−１；およびＬＦＡ−３（ＣＤ58としても知られている）と相互作用するＣＤ２（Selvaraj、P.ら、Nature、326巻、400〜403頁、1987年）がある。またＣＤ２は、ＣＤ48およびＣＤ59とも相互作用を行うが、ヒトのＬＦＡ−３との相互作用よりアフィニティが小さい（Arulanandam、A.R.ら、J.Exp.Med.、177巻、1439〜1450頁、1993年；およびSandrin、M.S.ら、J.Immunol.、151巻、4606〜4613頁、1993年）。
ＣＤ２は、胸腺細胞と成熟Ｔ細胞で発現される相対分子質量が50,000〜58,000の糖タンパク質である。ＣＤ２はヒツジの赤血球に結合し、これはＴ細胞Ｅロゼット形成の現象をもたらす特性である。Ｔ細胞のＣＤ２とＡＰＣのＬＦＡ−３との間の相互作用によって、Ｔ細胞の抗原認識が容易になり、その結果、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激される（例えば、Bierer、B.ら、J.Exp.Med.、168巻、1145頁、1988年；Moingeon、P.ら、Nature、339巻、312頁、1989年；Koyasu、S.らProc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、2603頁、1990年；Selvaraj、P.ら、Nature、326巻、400頁、1987年；およびBierer、B.ら、J.Immunol.、140巻、3358頁、1988年参照)。
この作用は、ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用によって仲介される、Ｔ細胞とＡＰＣ間の接着の強化に少なくとも一部は関与している。さらに、ＡＰＣなしで抗ＣＤ２抗体類の適当な組合わせを用いて、in vitroでＴ細胞を刺激してＴ細胞を増殖させＩＬ−２を分泌させることができることが実証されている［例えば、Meuer、S.ら、Cell、36巻、897頁、1984年；Feterson、A.ら、Nature、329巻、842頁、1987年；Yang、Y.S.ら、J.Immunol.、137巻、1097頁、1986年；およびW.Knappら編集（Oxford、1989年）「Leucocyte Typing IV, White cell differentiation antigens」270頁のS.C.Meuerの報告参照］。例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ２抗体Ｔ11.3と、他の２種の抗ＣＤ２抗体のうちの１種すなわちＴ11.2またはＴ11.1との組合わせを用いて活性化することができる。Ｔ11.3エピトープは「ネオ−エピトープ（neo-epitope）」であり、静止Ｔ細胞のＣＤ２上には現れず、Ｔ細胞が活性化されるとＣＤ２上には現れる（Meuer、S.ら、Cell、36巻、897頁、1984年）。ＣＤ２を用いるin vitro培養試験は、この表面受容体がＴ細胞−ＡＰＣの接着とＴ細胞の活性化に関与していることを示したが、ＣＤ２のどんな生理学的役割が、抗原に対するＴ細胞の応答に役立っているかは、これらの試験からは分からない。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第4,816,397号
【特許文献２】ヨーロッパ特許願公開第EP171496号
【特許文献３】ヨーロッパ特許願公開第0173494号
【特許文献４】英国特許第GB2177096B号
【特許文献５】ＰＣＴ特許願公開第WO92/06193号
【特許文献６】ＥＰ第0239400号
【特許文献７】米国特許第5,116,964号
【特許文献８】国際特許願公開第WO89/10938号
【特許文献９】国際特許願公開第WO90/08187号
【特許文献１０】国際特許願公開第WO92/16622号
【特許文献１１】米国特許第4,816,567号
【非特許文献１】Harding、F.A.、Nature、356巻、607〜609頁、1992年
【非特許文献２】Freedman、A.S.ら、J.Immunol.、137巻、3260〜3267頁、1987年
【非特許文献３】Freeman、G.J.ら、J.Immunol.、143巻、2714〜2722頁、1989年
【非特許文献４】Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、174巻、625〜631頁、1991年
【非特許文献５】Freeman、G.J.ら、Science、262巻、909〜911頁、1993年
【非特許文献６】Azuma、M.ら、Nature、366巻、76〜79頁、1993年
【非特許文献７】Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、178巻、2185〜2192頁、1993年
【非特許文献８】Linsley、P.S.ら、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年
【非特許文献９】Schwartz、R.H.ら、Science、248巻、1349頁、1990年
【非特許文献１０】Jenkins、M.K.ら、J.Immunol.、140巻、3324頁、1988年
【非特許文献１１】Turka、L.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、89巻、11102〜11105頁、1992年
【非特許文献１２】Lenschow、D.J.ら、Science、257巻、789〜792頁、1992年
【非特許文献１３】Chen、L.ら、Cell、71巻、1093〜1102頁、1992年；Townsend、S.E.およびAllison、J.P.、Science、259巻、368〜370頁、1993年
【非特許文献１４】Baskar、S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、90巻、5687〜5690頁、1993年
【非特許文献１５】Clark、E.A.およびLedbetter、J.A.、Nature、367巻、425〜428頁、1994年
【非特許文献１６】Arulanandam、A.R.ら、J.Exp.Med.、177巻、1439〜1450頁、1993年
【非特許文献１７】Sandrin、M.S.ら、J.Immunol.、151巻、4606〜4613頁、1993年
【非特許文献１８】Bierer、B.ら、J.Exp.Med.、168巻、1145頁、1988年
【非特許文献１９】Moingeon、P.ら、Nature、339巻、312頁、1989年
【非特許文献２０】Koyasu、S.らProc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、2603頁、1990年
【非特許文献２１】Selvaraj、P.ら、Nature、326巻、400頁、1987年
【非特許文献２２】Bierer、B.ら、J.Immunol.、140巻、3358頁、1988年
【非特許文献２３】W.Knappら編集（Oxford、1989年）「Leucocyte Typing IV, White cell differentiation antigens」270頁のS.C.Meuerの報告
【非特許文献２４】Sanchez-Madrid、F.、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982
【非特許文献２５】Kato、K.ら、Eur.J.Immunol.、23巻、1412頁、1993年
【非特許文献２６】Deckert、M.ら、Eur.J.Immunol.、22巻、2943〜2947頁、1992年
【非特許文献２７】Kozbarら、Immunol. Today、４巻、72頁、1983年
【非特許文献２８】Allen R.編集、Bliss Inc.発行の「Cancer Therapy」、77〜96頁のColeらの報告（1985年）「Monoclonal Antibodies」
【非特許文献２９】Wardら、Nature、341巻、544〜546頁、1989年
【非特許文献３０】Huseら、Science、246巻、1275〜1281頁、1989年
【非特許文献３１】McCaffertyら、Nature、348巻、552〜554頁、1990年
【非特許文献３２】Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、81巻、6851頁、1985年
【非特許文献３３】Takedaら、Nature、314巻、452頁、1985年
【非特許文献３４】Tengら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、80巻、7308〜7312頁、1983年
【非特許文献３５】Kozborら、Immunology Today、４巻、7279頁、1983年
【非特許文献３６】Olssonら、Meth. Enzymol.、92巻、３〜16頁、1982年
【非特許文献３７】Tanら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、162〜166頁、1990年
【非特許文献３８】DuncanおよびWinter、Nature、332巻、738〜740頁、1988年
【非特許文献３９】Canfield、S.M.およびS.L.Morrison、J.Exp.Med.、173巻、1483〜1491頁、1991年
【非特許文献４０】Lund、J.ら、J.Immunol.、147巻、2657〜2662頁、1991年
【非特許文献４１】Pepinsky、R.B.ら、J.Biol.Chem.、266巻、18244〜18249頁、1991年
【非特許文献４２】Seed、B.およびAruffo、A.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、3365〜3369頁、1987年
【非特許文献４３】Wallner、B.P.ら、J.Exp.Med.、166巻、923〜932頁、1987年
【非特許文献４４】Seed、B.、Nature、329巻、840〜842頁、1987年
【非特許文献４５】Korinek、Vら、Immunogenetics、33巻、108〜112頁、1991年
【非特許文献４６】Sawada、R.ら、DNA Cell.Biol.、９巻、213〜220頁、1990年
【非特許文献４７】Capon、D.J.ら、Nature、337巻、525〜531頁、1989年
【非特許文献４８】Howard、F.D.ら、J.Exp.Med.、176巻、139〜145頁、1992年
【非特許文献４９】Strejanら、J.Neuroimmunol.、７巻、27頁、1984年
【非特許文献５０】Damle、N.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、78巻、5096〜5100頁、1981年
【非特許文献５１】Hathcock、K.S.、Science、262巻、905〜907頁、1993年
【非特許文献５２】Linsleyら、J.Exp.Med.、173巻、721〜730頁、1991年
【非特許文献５３】Aruffo、A.およびSeed、B.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、8573〜8577頁、1987年
【非特許文献５４】Dariavach、P.ら、Eur.J.Immunol.、18巻、1901〜1905頁、1988年
【非特許文献５５】Sambrookらの、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）
【非特許文献５６】Eglitis,M.A.ら（1985）、Science 23:1395-1398
【非特許文献５７】Danos,O.およびMulligan,R.（1988）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464
【非特許文献５８】Markowitz,D.ら（1988）、J.Virol.62:1120-1124
【非特許文献５９】Rosenfeld,M.A.ら（1992）、Cell 68:143-155
【非特許文献６０】Tratschin,J.D.ら（1985）、Mol.Cell.Biol.5:3251-3260
【非特許文献６１】Kanfmanら、EMBO 6,187-195(1987)
【非特許文献６２】Meuer,S.C.ら（1984）、Cell 36:897-906
【非特許文献６３】Yang,S.Y.ら（1986）、J.Immunol.137:1097-1100
【非特許文献６４】J.Goronzyら（1987）、Methods Enzymol.150:333
【非特許文献６５】C.D.Gimmiら（1993）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6586
【非特許文献６６】R.I.Toddら、Hum.Immunol.10:23（1984）
【非特許文献６７】E.Clarkら、Leukocyte Typing中、A.Bernardら編、（Springer-Verlang,Berlin Heidelberg,1984、339頁
【非特許文献６８】C.S.Abramsonら（1981）、J.Immunol.126:83
【非特許文献６９】B.Dorkenら、Leucocyte Typing IV White cell differentiation antigens, W.Knappら編（Oxford,1989）、99頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は抗原特異的Ｔ細胞の不応答性を調節する方法に関する。本発明には、細胞表面受容体を通じて不応答性Ｔ細胞を阻害または刺激することによって、Ｔ細胞の不応答性を維持または逆転させる方法が含まれる。抗原に対し不応答性にされた抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ２などの細胞表面受容体を通じて刺激することによって、抗原に対する応答能を回復できることが発見されたのである。したがって、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞不応答性（Ｔ細胞アネルギーとも呼称される）を逆転させる際のＣＤ２の機能的役割を開示するものである。
【０００７】
本発明の一実施態様では、アネルギー化されたＴ細胞（anergized T cell）を、ＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子と接触させることによってＴ細胞アネルギーが維持される。ＣＤ２阻害因子としては、ＣＤ２とＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３、ＣＤ48またはＣＤ59）の間の相互作用を阻害する因子がある。このような因子としては、阻止抗体類、可溶型のＣＤ２とＣＤ２リガンド類、ペプチド類および小分子類がある。あるいは、ＣＤ２阻害因子は細胞内で作用して、ＣＤ２を通じてＴ細胞内でトリガーされる細胞内シグナルを阻害する。本発明の他の実施態様では、アネルギー化されたＴ細胞を、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激する因子と接触させることによってＴ細胞アネルギーが逆転される。ＣＤ２刺激因子としては、その表面にＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３、ＣＤ48またはＣＤ59）を発現する細胞、多価型のＣＤ２リガンドおよび刺激性抗ＣＤ２抗体がある。あるいは、ＣＤ２刺激因子は細胞内で作用してＣＤ２を通じてシグナルをトリガーしてもよい。
【０００８】
本発明の方法は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞不応答性を維持するかまたは抗原特異的Ｔ細胞不応答性を回復して抗原特異的免疫応答を調節することが望ましい状況の場合の治療に有用である。例えば、臓器または骨髄の移植を受けた被験者には、ＣＤ２を介する刺激を阻害することによって、Ｔ細胞不応答性を維持して移植片拒絶反応を阻害することが必要である。さらに、Ｔ細胞の不応答性は、自己免疫疾患が見られる被験者におけるＣＤ２刺激を遮断することによって維持され、自己免疫疾患の症状を軽減することができる。これらの症例では、ＣＤ２阻害因子は、Ｔ細胞不応答性を維持するのに充分な量でかつ充分な期間にわたって被験者に投与される。あるいは、腫瘍をもっている被験者には腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激するために、またはワクチンを受けている被験者にはそのワクチンの効力を高めるために、Ｔ細胞不応答性を逆転させることができる。例えば、細胞（例えば腫瘍細胞）はＣＤ２リガンドを発現するよう修飾することができ、またはＣＤ２刺激因子を、腫瘍をもっている被験者もしくは腫瘍の再発を防止するため外科手術で腫瘍を除去した被験者に投与することができる。さらに、抗原特異的応答性は、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激することによって、アネルギー化Ｔ細胞をin vitroで回復させることができる。この場合、in vitroで生成された応答性Ｔ細胞を被験者に投与することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は抗原特異的Ｔ細胞の不応答性の調節方法に関する。「Ｔ細胞不応答性」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞が不応答性になった抗原（または抗原部分）に対してＴ細胞が暴露されたときのＴ細胞の増殖、リンホカインの分泌またはＴ細胞によるエフェクター機能の誘導の低下もしくは欠除を意味する。「Ｔ細胞不応答性」と「Ｔ細胞アネルギー」の用語は本明細書では相互に交換可能に使用される。本発明の方法は、in vitroまたはin vivoで抗原に対するＴ細胞の不応答性を維持または逆転させる手段を提供するものである。不応答性Ｔ細胞は、例えば共刺激シグナルなしで抗原に暴露されることによってＴ細胞不応答性またはＴ細胞アネルギーが誘導された細胞である。Ｔ細胞不応答性の誘導はＴ細胞アネルギーの状態の初期樹立を意味する。Ｔ細胞アネルギーは、例えば、共刺激シグナルなしで、例えば抗原提示細胞のＭＨＣ関連抗原ペプチドで、Ｔ細胞内に抗原特異的シグナルをトリガーすることによって誘導することができる。したがって、本発明の方法は、アネルギーＴ細胞（すなわち、不応答性またはアネルギーがすでに誘導されているか樹立されている細胞）の抗原特異的Ｔ細胞不応答性を調節するのに特に有用である。「調節」という用語は、不応答状態の維持（すなわち継続しているＴ細胞アネルギー）および不応答状態の逆転（すなわちＴ細胞応答性の回復）の両者の維持を含むものとする。
【００１０】
本発明の方法は、アネルギー化Ｔ細胞を阻害または刺激する因子を使用してＴ細胞のアネルギーを維持するかまたは逆転させる。本発明は、少なくともその発明の一部は、例えば共刺激シグナルなしで抗原特異的シグナルを受けることによって抗原に対し不応答性になったＴ細胞を刺激して、抗原に対して応答する性能を回復させることができるという発見に基づいている。アネルギー化Ｔ細胞の抗原特異的応答性は、該Ｔ細胞を、抗原の存在下、ＣＤ２などの表面受容体を通じて刺激することによって回復させることができる。したがって本発明の一実施態様では、Ｔ細胞の不応答性は、アネルギー化Ｔ細胞を、ＣＤ２を介するＴ細胞の刺激を阻害する因子と接触させることによって維持される。これとは対照的に、Ｔ細胞不応答性を逆転させる方法では、アネルギー化Ｔ細胞を、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激する因子と接触させる。これらの方法は各々、以下の文節で詳細に考察する。
I．Ｔ細胞の不応答性を維持する方法
【００１１】
本発明の一態様は、Ｔ細胞アネルギーが誘導されそして抗原に対する不応答性状態を保持することが望ましいという治療状況に特に有用なＴ細胞不応答性を維持する方法に関する。このような治療状況の例としては、臓器および骨髄の移植片などの同種異系または異種の細胞または組織の受容者（レシピエント）および自己免疫疾患が見られる被験者がある。これらの状況の場合、治療計画は、治療すべき被験者に抗原特異的Ｔ細胞不応答性の状態を誘導することであった。例えば因子ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いて、Ｔ細胞内の共刺激シグナルを阻害することによって、抗原特異的Ｔ細胞不応答性を被験者に誘導することができる（例えば、Turka、L.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、89巻、11102〜11105頁、1992年；およびLenschow、D.J.ら、Science、257巻、789〜792頁、1992年参照）。
【００１２】
本発明のこの実施態様では、抗原に対するＴ細胞の不応答性は、Ｔ細胞を、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子と接触させることによって維持される。ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子は、前記定義のようなＴ細胞不応答性が維持される限り、ＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を完全に遮断することもあり、またはＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を部分的に阻害することもある。一実施態様では、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子（本明細書ではＣＤ２阻害因子と呼ぶ）は、ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用を遮断することによって作用する。その因子は、ＣＤ２とそのリガンドすなわちＬＦＡ−３（ＣＤ58）との相互作用を阻害することが好ましい。あるいはその因子は、ＣＤ２と他のリガンド例えばＣＤ48またはＣＤ59との相互作用を阻害する。ＣＤ２とＣＤ２リガンドの間の相互作用を遮断または阻害するのに使用できる因子としては、ＣＤ２またはＣＤ２リガンドに結合する抗体類（例えば阻止抗体類）；ＣＤ２リガンドとの結合能を保持している可溶型のＣＤ２（例えばトランスメンブラン（貫膜）ドメインと細胞質ドメインを欠いている先端切断形の分子、または可溶型の融合タンパク質、例えば免疫グロブリン融合タンパク質）；ＣＤ２との結合能を保持している可溶型のＣＤ２リガンド（例えばトランスメンブランドメインと細胞質ドメインを欠いている先端切断形の分子または可溶性融合タンパク質例えば免疫グロブリン融合タンパク質）；ＣＤ２とＣＤ２リガンドの相互作用を阻害するペプチド類；ならびにＣＤ２とＣＤ２リガンドの相互作用を阻害する低分子がある。あるいは、ＣＤ２阻害因子は、細胞内で作用して、ＣＤ２経由でトリガーされる細胞内シグナルを阻害してもよい。これらのＣＤ２阻害因子は各々、以下に詳細に説明する。
Ａ．阻止抗体類
【００１３】
一実施態様で、ＣＤ２阻害因子は、ＣＤ２に結合する抗体（すなわち抗ＣＤ２抗体）またはＣＤ２リガンドに結合する抗体（すなわち抗ＣＤ２リガンド抗体）であり、これら抗体はＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を実質的に遮断または阻害する（すなわち阻止抗体）。抗ＣＤ２阻止抗体は当該技術分野で報告されており（例えばＴＳ２／18；例えばSanchez-Madrid、F.、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982年参照）かつ市販されている（例えば米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー所在のBecton Dickinson社から入手できるanti-Leu５）。
抗ＣＤ２リガンド抗体類としては、抗ＬＦＡ−３抗体類、抗ＣＤ48抗体類および抗ＣＤ59抗体類がある。ＣＤ２とＬＦＡ−３の相互作用を実質的に遮断または阻害するために使用できる抗ＬＦＡ−３抗体類は当該技術分野で公知である（例えばＴＳ２／９がある。例えばSanchez-Madrid、F.、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982年参照）。抗ＣＤ48阻止抗体類（例えばSandrin、M.S.、J.Immunol.、151巻、4606頁、1993年；およびKato、K.ら、Eur.J.Immunol.、23巻、1412頁、1993年参照）および抗ＣＤ59阻止抗体類（例えばDeckert、M.ら、Eur.J.Immunol.、22巻、2943〜2947頁、1992年参照）も当該技術分野で公知である。
【００１４】
さらに、ＣＤ２またはＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３）に対する抗体類は通常の方法で製造することができる。抗体類はポリクローナル抗体でもよいがむしろモノクローナル抗体の方が好ましい。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体は当該技術分野で公知の標準的方法で製造することができる。例えば哺乳類（例えばマウス、ハムスターまたはウサギ）は、抗原（例えばＣＤ２またはＣＤ２リガンド）によって免疫することができ、例えば精製タンパク質、組換えタンパク質もしくはそのペプチドフラグメント、またはその抗原を発現して（例えば細胞表面にＣＤ２もしくはＣＤ２リガンドを発現して）その哺乳類に抗原に対する抗体反応を引き起こす細胞で免疫することができる。あるいは、抗原を発現する組織または全臓器も抗体を誘導するのに使用できる。免疫化の経過は、血漿中または血清中の抗体価を検出することによって監視することができる。標準的ＥＬＩＳＡ法やその他の免疫検定法を抗原とともに用いて抗体のレベルを評価することができる。免疫後、抗血清を得、次に所望によりその血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を製造するためには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から採取し、次いで標準の体細胞融合法で骨髄腫細胞と融合させ、次にこれら細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を得る。このような技術は当該技術分野で公知である。例えばKohlerとMilsteinが最初に開発したハイブリドーマ法（Nature、256巻、495〜497頁、1975年）と、その外の方法、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbarら、Immunol. Today、４巻、72頁、1983年）およびヒトモノクローナル抗体類を製造するＥＢＶ−ハイブリドーマ法［Allen R.編集、Bliss Inc.発行の「Cancer Therapy」、77〜96頁のColeらの報告（1985年）「Monoclonal Antibodies」］を使用することができる。ハイブリドーマ細胞を、免疫化学的に抗原と特異的に反応する抗体の産生についてスクリーニングし、次いでモノクローナル抗体を単離することができる。
【００１５】
ＣＤ２またはＣＤ２リガンドに反応する特異的抗体類または抗体フラグメント類の他の製造方法は、細菌中に発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーを抗原（またはその一部）によってスクリーニングする方法である。例えば、完全Ｆａｂフラグメント類、ＶＨ領域類、ＦＶ領域類および一本鎖抗体類は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌中に発現させることができる（例えばWardら、Nature、341巻、544〜546頁、1989年；Huseら、Science、246巻、1275〜1281頁、1989年；およびMcCaffertyら、Nature、348巻、552〜554頁、1990年参照）。あるいは、抗体またはそのフラグメントを製造するため、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスを用いることができる。
【００１６】
「抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、所望の機能特性、例えばＣＤ２とＣＤ２リガンドとの相互作用を阻害する性能を保持する抗体のフラグメントを含むものとする。抗体類は通常の方法を用いてフラグメントにすることができ、これらのフラグメントは、完全な抗体について先に述べたのと同じ方法で、その有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ab')２フラグメントは抗体をペプシンで処理することによって製造することができる。得られたＦ(ab')２フラグメントは、処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆab'フラグメントを産生することができる。
【００１７】
用語「抗体」はさらに、所望の機能特性、例えばＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害する性能を保持する抗体の誘導体を含むものとする。抗体誘導体としては、キメラ分子類、ヒト化分子類、エフェクター機能を低下させた分子類および二重特異性分子類がある。ヒト以外の動物で産生した抗体またはそのフラグメントは、ヒト被験者に投与すると、種々の程度で外来物として認識される可能性があり、そのヒト被験者中にその抗体に対する免疫応答が生成する。この問題を最小にするか、なくする一つの方法は、キメラまたはヒト化の抗体誘導体すなわち非ヒト抗体由来の部分およびヒト抗体由来の部分を含んでなる抗体分子を製造する方法である。キメラ抗体分子は、例えばマウス、ラットなどの種の抗体由来の可変領域をヒトの定常領域とともに含有していてもよい。キメラ抗体の各種製造方法は報告されている（例えば、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、81巻、6851頁、1985年；Takedaら、Nature、314巻、452頁、1985年；Cabillyらの米国特許第4,816,567号；Bossらの米国特許第4,816,397号；Tanaguchiらのヨーロッパ特許願公開第EP171496号、同第0173494号および英国特許第GB2177096B号参照）。さらなる変形例では、ヒト化抗体は、非ヒト起源の可変領域の超可変領域だけを有し、その抗体の可変領域の残りの部分、特に抗原結合領域の保存フレームワーク領域はヒト起源のものである。このようなヒト化抗体は当該技術分野で公知のいくつもの方法のいずれかで製造することができ（例えば、Tengら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、80巻、7308〜7312頁、1983年；Kozborら、Immunology Today、４巻、7279頁、1983年；Olssonら、Meth. Enzymol.、92巻、３〜16頁、1982年参照）、好ましくはＰＣＴ特許願公開第WO92/06193号またはＥＰ第0239400号の教示にしたがって製造される。ヒト化抗体は、例えば英国ミドルセックス州ツイッケンハム、ホリーロード２に所在のScotgen Limited社が商業的に製造している。
【００１８】
治療に用いる場合、抗体の製剤は補体と結合できず、かつ他のエフェクター機能も誘導できないことが好ましい。補体結合は、補体を結合できない抗体アイソタイプを用いるか、または余り好ましくはないが補体結合を阻害する薬剤とともに補体結合抗体を用いるなどして、抗体のＦＣ部分を欠落させることにより防止することができる。あるいは、補体を活性化するのに重要なＦＣ領域内のアミノ酸残基（例えば、Tanら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、162〜166頁、1990年；ならびにDuncanおよびWinter、Nature、332巻、738〜740頁、1988年を参照）を変異させて完全な抗体の補体活性化能を低下させるかまたは除去することができる。同様に、完全抗体を使用する場合、ＦＣ領域がＦＣ受容体に結合するのに重要なＦＣ領域内のアミノ酸残基（例えば、Canfield、S.M.およびS.L.Morrison、J.Exp.Med.、173巻、1483〜1491頁、1991年；およびLund、J.ら、J.Immunol.、147巻、2657〜2662頁、1991年参照）も変異させて、ＦＣ受容体の結合を減少させるかまたは除去することができる。
【００１９】
ＣＤ２またはＣＤ２リガンドに結合する抗体の遮断活性または阻害活性は通常の方法によって評価することができる。例えば、活性化Ｔ細胞の増殖および／または活性化Ｔ細胞によるリンホカインの分泌、を阻害する上記抗体の性能は、in vitroのＴ細胞培養系で測定することができる（例えばSanchez-Madrid、F.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982年参照）。あるいは、Ｔ細胞Ｅロゼット形成検定法を用いて、ＣＤ２のヒツジ赤血球との結合の阻害を評価することができる（適切な検定法は、Pepinsky、R.B.ら、J.Biol.Chem.、266巻、18244〜18249頁、1991年に記載されている）。
Ｂ．可溶型の受容体類とリガンド類
【００２０】
本発明の他の方法では、その結合特異性を保持している可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドであるＣＤ２阻害因子が用いられる。可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドを用いて、細胞の表面におけるＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を競合的に阻害することができる。可溶型のＣＤ２リガンド例えばＣＤ48、ＣＤ59または好ましくはＬＦＡ−３（ＣＤ58）を用いて、ＣＤ２を介してＴ細胞刺激を阻害することができる。
【００２１】
一つの実施態様では、可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは、先端切断型の分子であり、その分子の細胞外領域またはその機能部分を含有している。ＣＤ２リガンドとの結合能を保持しているＣＤ２の細胞外領域の一部分を使用することができる。同様に、ＣＤ２に結合する性能を保持しているＣＤ２リガンドの細胞外領域の一部分も使用できる。可溶性の先端切断型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは標準の組換えＤＮＡ法を用いて得ることができる。例えば、分子の細胞外領域またはその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターを、宿主細胞が該細胞外領域を発現し分泌するのに適した形態で宿主細胞中に導入し、次に培養培地から細胞外領域（またはその一部）を単離することによって得ることができる。
【００２２】
組換え先端切断型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列に基づいて、標準の方法によって設計することができる。ヒトＣＤ２をコードするヌクレオチド配列は、Seed、B.およびAruffo、A.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、3365〜3369頁、1987年に開示されている。二つの型のＬＦＡ−３分子が、典型的なトランスメンブランタンパク質を含めて報告されている。トランスメンブラン型のＬＦＡ−３をコードするヌクレオチド配列は、Wallner、B.P.ら、J.Exp.Med.、166巻、923〜932頁、1987年に記載されている。第二の形態は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）連結タンパク質である。この型のＬＦＡ−３をコードするヌクレオチド配列は、Seed、B.、Nature、329巻、840〜842頁、1987年に開示されている。上記ＧＰＩ連結型のＬＦＡ−３は、リン脂質のテール（尾部）によって細胞膜に固定されている。したがって可溶型のＬＦＡ−３は、例えばこのタンパク質の細胞外領域を組換え発現させるか、またはＧＰＩ連結型のリン脂質テールを（例えばホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣを用いて）この連結型のＬＦＡ−３を発現する細胞の表面から切断して可溶型のＬＦＡを放出させることによって得ることができる。他のＣＤ２リガンドであるＣＤ48は典型的なトランスメンブランタンパク質である。ＣＤ48をコードするヌクレオチド配列は、Korinek、Vら、Immunogenetics、33巻、108〜112頁、1991年に記載されている。ＧＰＩ連結型のＬＦＡ−３と同様に、他のＣＤ２リガンドであるＣＤ59は、ホスファチジルイノシトールで固定されたメンブランタンパク質である。したがってＣＤ59は、ホスホリパーゼで処理することによって、このリガンドを発現する細胞の表面から切り取り可溶型のＣＤ59を得ることができる。あるいは、ＣＤ59の細胞外領域は組換え法によって発現させることもできる。ヒトＣＤ59をコードするヌクレオチド配列は、Sawada、R.ら、DNA Cell.Biol.、９巻、213〜220頁、1990年に開示されている。
【００２３】
本発明の方法に用いる他の可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは融合タンパク質である。用語「融合タンパク質」は、本明細書で用いる場合、連続アミノ酸配列の第一タンパク質由来の第一ポリペプチドと、第二タンパク質由来の第二ポリペプチドとで構成されたタンパク質を意味する。融合タンパク質は、第一ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、第二ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にインフレーム（読み取り枠内）で結合し、次いでこれらヌクレオチド配列を（例えば宿主細胞中に導入する組換え発現ベクターを用いて）発現させて融合タンパク質を産生する標準的組換えＤＮＡ法で製造することができる。好ましい融合タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖の定常部（例えばＩｇＧ１などのヒト免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域）に連結されたＣＤ２またはＣＤ２リガンドの細胞外領域または機能部分を含有する免疫グロブリン融合タンパク質である。免疫グロブリン融合タンパク質は、例えばCapon、D.J.ら、Nature、337巻、525〜531頁、1989年およびCapronとLaskyの米国特許第5,116,964号の教示にしたがって製造することができる。
【００２４】
本明細書に記載の方法に用いる他の可溶型のＣＤ２リガンドとしてはミセルに組込まれたＧＰＩ連結ＣＤ２リガンドがある。メンブランに固定するためホスファチジルイノシトールの脂質テールを含有するＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３またはＣＤ59）はＧＰＩ連結型として単離してミセル中に組込むことができる。したがってＬＦＡ−３またはＣＤ59を含有するミセルは、ＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害するのに用いることができる。ＬＦＡ−３またはＣＤ59を含有するミセルは国際特許願公開第WO89/10938号に記載されているようにして製造することができる。
【００２５】
本発明の他の実施態様では、可溶型のＣＤ２リガンドは多価型のリガンドであり例えば二量体（ダイマー）、三量体（トリマー）または四量体（テトラマー）である。ＬＦＡ−３の多量体（マルチマー）は、Ｔ細胞Ｅロゼット形成検定法で、ＬＦＡ−３／ＣＤ２相互作用を遮断または阻害する活性が高いことが報告されている（Pepinsky、R.B.ら、J.Biol.Chem.、266巻、18244〜18249頁、1991年参照）。またＣＤ２リガンドのモノマーも、Pepinskyらの前掲文献に記載されているようにして化学的に架橋させて多量体を製造することができる。
Ｃ．ペプチド類と低分子類
【００２６】
Ｔ細胞の不応答性を維持するのに用いるＣＤ２阻害因子としてはさらに、ＣＤ２とＣＤ２リガンドの相互作用を阻害または実質的に遮断するペプチド類と低分子類がある。例えば、受容体またはリガンドとの結合能を保持し、かつメンブラン結合受容体とリガンドとの相互作用を阻害する、ＣＤ２またはＣＤ２リガンドのペプチドフラグメントは本発明の方法に使用することができる。ＬＦＡ−３結合領域を含有するＣＤ２のペプチドフラグメントは国際特許願公開第WO90/08187号に開示されている。あるいは、国際特許願公開第WO92/16622号に開示されているようなＣＤ２結合領域を含有するＬＦＡ−３のペプチドフラグメントも使用できる。他の適切なペプチドを製造し、そのペプチドの、例えばin vitroＴ細胞培養系における活性化Ｔ細胞の増殖および／または活性化Ｔ細胞によるリンホカインの分泌を阻害するペプチドの性能について、またはペプチドがＴ細胞Ｅロゼット形成を阻害する性能について調べることにより、ＣＤ２／ＣＤ２リガンド相互作用を阻害する性能を検定することができる。
【００２７】
また本発明には、ＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害してＴ細胞の不応答性を維持する低分子類の使用が含まれる。例えば、ＣＤ２のＬＦＡ−３結合領域またはＬＦＡ−３のＣＤ２結合領域（既述）を含有するペプチドの構造によく似た低分子類が使用できる。ペプチドのアミノ酸配列に基づいてこのような「ペプチド様物質」を設計する方法は当該技術分野で公知である。あるいは、in vitroＴ細胞培養系またはＴ細胞Ｅロゼット形成検定法を用いてＣＤ２／ＣＤ２リガンド相互作用を阻害する低分子類を選別することができる。
Ｄ．細胞内ＣＤ２阻害因子類
【００２８】
細胞外で作用してＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害する因子の代わりに、ＣＤ２阻害因子は、細胞内で作用して、ＣＤ２表面受容体を通じてＴ細胞内でトリガーされる細胞内シグナルを阻害するものであってもよい。Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体を経由する細胞内シグナリングは、ＣＤ３複合体を通じて特にＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ zeta chain）によって仲介される（Howard、F.D.ら、J.Exp.Med.、176巻、139〜145頁、1992年参照）。このシグナルトランスダクション経路によって誘導される細胞内シグナルとしては、プロテイントリプシンキナーゼ活性、プロテインキナーゼＣ活性および細胞内の細胞質ゾル遊離カルシウムの増大がある。したがって、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激することによって誘導されるこれら細胞内シグナルの一つ以上を阻害する因子は、ＣＤ２阻害因子として使用してＴ細胞不応答性を維持することができる。
【００２９】
さらに、ＣＤ２を介する刺激によってＴ細胞アネルギーを逆転させると、トリプシンキナーゼＪＡＫ−３とＣＤ２の結合およびＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化が付随して起こる（実施例６参照）。したがってＴ細胞アネルギーを保持するため、ＪＡＫ−３活性を阻害してもよい。したがって、ＣＤ２阻害因子には、ＪＡＫ−３キナードの細胞内活性を阻害する因子でもよく、例えばＪＡＫ−３キナーゼとＣＤ２の結合を阻害しおよび／またはＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化を阻害する因子がある。
Ｅ．Ｔ11.3ネオ−エピトープの露出の阻害
【００３０】
以上述べた、Ｔ細胞の不応答性を維持する方法において、ＣＤ２表面受容体のＴ11.3ネオ−エピトープの露出を阻害することも必要であろう。「Ｔ11.3ネオ−エピトープ」は、ＣＤ２分子上のエピトープであり、Ｔ11.3抗体によって認識される（すなわちこの抗体が結合する）。Ｔ細胞アネルギーの誘導は、アネルギー化Ｔ細胞のＣＤ２上のＴ11.3ネオ−エピトープのダウンモジュレーション（すなわち発現の低下または欠除）が関連していることが見出された。同様にＴ細胞アネルギーの逆転は、ＣＤ２のＴ11.3エピトープの再露出に関連していることも見出された（実施例５参照）。Ｔ細胞の不応答性を維持するには、Ｔ細胞のＣＤ２内のＴ11.3ネオ−エピトープの露出を阻害することが必要であろう。アネルギー化Ｔ細胞のＴ11.3ネオ−エピトープの露出を刺激することが見出された因子はＩＬ−２などのＴ細胞成長因子である。したがってＴ細胞の不応答性を維持するために、Ｔ細胞成長因子の産生または機能を阻害する因子を用いることができる。Ｔ細胞のアネルギーを維持するのに用いる好ましい因子はＩＬ−２の産生または機能を阻害する。したがって、ＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を阻害する第一因子とともに、ＩＬ−２の機能を阻害する第二因子、例えば抗ＩＬ−２抗体または抗ＩＬ−２受容体抗体をＴ細胞に接触させることが必要である。
Ｆ．ＣＤ２阻害因子（物質）の使用
【００３１】
ＣＤ２阻害因子は、臓器または骨髄の移植に対する拒絶反応を抑制し、骨髄移植時の移植片対宿主病を抑制し、または被験者の自己免疫疾患を治療するなどの治療目的のため被験者に投与することができる。したがって、本発明は、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子を被験者に投与する、抗原に対するＴ細胞不応答性を被験者に維持する方法を提供するものである。「被験者（対象）」という用語には、免疫応答を起こすことができる生きている生物例えば哺乳類が含まれるものとする。被験者の例としては、ヒト、サル類、イヌ類、ネコ類、マウス類、ラット類およびこれらの遺伝子導入（トランスジェニック）種がある。
【００３２】
ＣＤ２阻害因子は、被験者にＴ細胞不応答性を維持するのに充分な量と時間でin vivoで医薬として投与するのに適した生物学的に適合した形態で被験者に投与される。「in vivoで投与するのに適した生物学的に適合した形態」という用語は、ＣＤ２阻害因子の治療作用が毒作用よりまさった状態で投与される該因子の形態を意味する。本明細書で述べるＣＤ２阻害因子の投与は、治療上有効な量の因子を単独でまたは医薬として許容される担体中に含有する医薬形態で行う投与である。ＣＤ２阻害因子の治療上有効な量の投与とは、所望の効果（例えばＴ細胞不応答性の維持）を達成するのに必要な投与と期間における有効量と定義する。例えば、ＣＤ２阻害因子の治療上有効な量は、個体の病状、年齢、性別および体重のような要因ならびに個体に所望の応答を起こす因子の性能によって変化することがある。投与計画は最適の治療応答を提供するため調節することができる。例えば、いくつかの分割した投与量を毎日投与してもよく、または治療状態の緊急性によって指示されるように比例して投与量を減らしてもよい。
【００３３】
ＣＤ２阻害因子は便利な方法で投与することができ、便利な投与方法は、例えば注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮塗布または直腸投与による方法である。投与経路によって、活性化合物は、その化合物を不活性にすることがある酵素、酸および他の自然条件の作用から保護するためある種の物質でコーティングしてもよい。
【００３４】
非経口投与以外の方法でＣＤ２阻害因子を投与するには、該因子の不活性化を防止するためある種の物質で該因子をコーティングするかまたはその物質を該因子とともに投与することが必要な場合がある。例えば、ＣＤ２阻害因子は、適当な担体または希釈剤中に入れて個体に投与してもよく、酵素阻害剤とともに投与してもよく、またはリポソームのような適当な担体中に入れて投与してもよい。医薬として許容される希釈剤としては食塩水と緩衝水溶液がある。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）およびトラジロール（trasylol）がある。リポソームとしては、通常のリポソームのみならず水中油中水型エマルジョンがある（Strejanら、J.Neuroimmunol.、７巻、27頁、1984年）。
【００３５】
また活性化合物は非経口または腹腔内で投与してもよい。また分散液は、グリセリン、液状ポリエチレングリコール類およびその混合物ならびに油で製造することができる。貯蔵と使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防止するため保存剤を含有していてもよい。
【００３６】
注射用に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは滅菌水性分散液、および滅菌された注射用の溶液、または分散液を必要に応じて調製するのに用いる滅菌粉末がある。いずれの場合も医薬組成物は、滅菌されていなければならずかつ容易に注射できる程度に流体でなければならない。この医薬組成物は製造と貯蔵の条件下で安定でなければならずかつ細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。担体は溶媒または分散媒体でもよく、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物が挙げられる。例えば、レシチンのようなコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤を使用することによって適正な流動性を維持することができる。微生物の作用は、各種の抗菌剤と抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合、上記組成物は、等張剤を含有していることが好ましく、例えば糖類、マンニトールとソルビトールのような多価アルコール類、塩化ナトリウムが挙げられる。注射用組成物の吸収期間は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤を組成物に含有させることによって延長することができる。
【００３７】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物（例えばＣＤ２阻害因子）を、適当な溶媒中で、必要に応じて上記成分の一つまたはこれら成分の混合物と混合し次いでろ過滅菌を行うことによって製造することができる。一般に分散液は、ベイシック分散媒体（basic dispersion medium）と上記成分の中の必要な他の成分を混合することによって製造される。滅菌注射溶液を調製するのに用いる滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分（例えばＣＤ２阻害因子）＋所望の追加成分の粉末が、その予め滅菌ろ過された溶液から得られる減圧乾燥法と凍結乾燥法である。
【００３８】
活性化合物が上記のように適切に保護されている場合、薬剤は、例えば不活性希釈剤または吸収可能な食用担体とともに経口投与することができる。「医薬として許容される担体」という用語には、本明細書で使用する場合、すべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤と吸収遅延剤などが含まれる。医薬として活性な物質に対してこのような媒体と薬剤を用いることは当該技術分野で公知である。通常の媒体または薬剤が活性化合物と非相容性である場合を除いて、治療組成物にこれら媒体または薬剤を使用することが検討される。補助活性化合物も医薬組成物に混合できる。
【００３９】
投与が容易で投与量が均一であるように、投与単位剤形（dosage unit form）で非経口組成物を配合することが特に有利である。投与単位剤形という用語は本明細書で使用する場合、治療すべき哺乳類の被検体に対して一回投与量として適切な物理的に区分された単位を意味し、各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療効果を生じるよう計算して予め決定された量の活性化合物を含有している。本発明の投与単位剤形の処方は、（ａ）活性化合物の特有の特性と達成すべき特別な治療効果および（ｂ）個体の感受性を治療するための、このような活性化合物を配合する当該技術分野に固有の制限によって指示、決定される。
【００４０】
ＣＤ２阻害因子の投与のタイミングは、被験者に対する他の治療剤の投与と整合させることができる。例えば、被験者のＴ細胞共刺激シグナルを阻害する因子（例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ）を被験者に投与することによってＴ細胞不応答性が誘導された被験者に、ＣＤ２阻害因子を、Ｔ細胞共刺激シグナルを阻害する因子と同時にまたはＴ細胞共刺激シグナルを阻害する因子に続いて投与することができる。さらに、ＣＤ２阻害因子がin vivoで有効レベルで維持される場合、ＣＤ２阻害因子は、Ｔ細胞共刺激シグナルを阻害する因子を投与する前に投与してもよい。あるいは、ＣＤ２阻害因子は、抗原に対する免疫応答を阻害するために使用される、他の通常の治療処置に対する補助剤として投与することができる。例えばＣＤ２阻害因子は、サイクロスポリンＡまたはＦＫ506などの免疫抑制剤の投与を含む治療計画の一部分として投与することができる。
【００４１】
本発明の一実施態様では、Ｔ細胞不応答性は同種異系細胞または異種細胞上の抗原に対して維持される。したがって、本発明の方法は、同種異系細胞または異種細胞の受容者、例えば臓器移植受容者または骨髄移植受容者である被験者を治療するのに用いることができる。したがって本発明の方法は、移植された組織に対する拒絶反応を抑制し、被験者の移植片対宿主病を抑制するのに有用である。
【００４２】
本発明の他の実施態様では、Ｔ細胞不応答性が自己抗原に対して維持される。したがって本発明の方法は、自己免疫疾患または不適当なもしくは異常な免疫応答に関連する障害がみられる被験者を治療するのに用いることができる。自己免疫疾患または不適当なもしくは異常な免疫応答に関連する障害の例としては、リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、乾せん性関節炎、乾せん、らい反転反応、紅斑結節らい（erythema nodosam leprasum）、自己免疫ぶどう膜炎、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側進行性感音難聴（idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss）、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少性、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティヴンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔せん、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性若年型糖尿病、シェーグレン症候群関連のドライアイ、後部ぶどう膜炎および間質性肺線維症（interstitial lung fibrosis）がある。したがって本発明の方法は、自己免疫疾患および不適当なもしくは異常な免疫応答に関連する障害の症状を軽減するのに有用である。
II．Ｔ細胞不応答性を誘導し維持する方法
【００４３】
別の実施態様で、本発明はＴ細胞不応答性を誘導し維持する方法を提供する。この実施態様では、Ｔ細胞に、ＣＤ28またはＣＴＬＡ４を介するＴ細胞刺激を阻害する第一因子およびＣＤ２を介するＴ細胞刺激を阻害する第二因子を接触させる。第一因子は、Ｔ細胞の共刺激シグナルを阻害しその結果Ｔ細胞アネルギーを誘導するために与えられる。第二因子は、不応答性Ｔ細胞中にＴ細胞アネルギーを維持するために与えられる。ＣＤ２を介する刺激を阻害するために使用できる因子（すなわち第二因子）としては先に述べたＣＤ２阻害因子がある。Ｔ細胞不応答性を誘導するために使用できる因子（すなわち第一因子、本明細書ではＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子と呼ぶ）としては、ＣＤ28またはＣＴＬＡ４とＣＤ28リガンドまたはＣＴＬＡ４リガンドとの相互作用を実質的に遮断または阻害する因子が挙げられる。適切なＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子の例としては、ＣＤ28、ＣＴＬＡ４、ＣＤ28リガンドまたはＣＴＬＡ４リガンドに結合する阻止抗体（例えばＢ７−１またはＢ７−２）；可溶型のＣＤ28、ＣＴＬＡ４、ＣＤ28リガンドまたはＣＴＬＡ４リガンド；およびＣＤ28／ＣＴＬＡ４とＣＤ28リガンドもしくはＣＴＬＡ４リガンドとの間の相互作用を阻害する低分子類がある。あるいは、ＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子は、細胞内で作用して、ＣＤ28またはＣＴＬＡ４経由でＴ細胞内でトリガーされる細胞内シグナルを阻害することができる。
【００４４】
Ｔ細胞不応答性を誘導するのに用いるＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子は、ＣＤ２阻害因子について先に述べたのと同様にして製造することができる。ＣＤ28、Ｂ７−１またはＢ７−２に結合する阻止抗体は当該技術分野で報告されており（例えばDamle、N.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、78巻、5096〜5100頁、1981年；Freedman、A.S.、J.Immunol.、137巻、3260〜3267頁、1987年；およびHathcock、K.S.、Science、262巻、905〜907頁、1993年参照）、既述した標準法によって製造することができる。可溶型のＣＤ28、ＣＴＬＡ４とＢ７−１も当該技術分野で報告されており（例えばLinsleyら、J.Exp.Med.、173巻、721〜730頁、1991年；およびLinsley、P.S.ら、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年参照）、既述した標準法で製造することができる。ヒトのＣＤ28、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−１およびＢ７−２のヌクレオチド配列は当該技術分野で利用可能である（ＣＤ28：Aruffo、A.およびSeed、B.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、8573〜8577頁、1987年；ＣＴＬＡ４：Dariavach、P.ら、Eur.J.Immunol.、18巻、1901〜1905頁、1988年；Ｂ７−１：Freeman、G.L.ら、J.Immunol.、143巻、2714〜2722頁、1989年；Ｂ７−２：Freeman、G.J.ら、Science、262巻、909〜911頁、1993年およびAzuma、M.ら、Nature、366巻、76〜79頁、1993年）。好ましいＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子は、Linsley、P.S.ら、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年に記載されているようなＣＴＬＡ４Ｉｇの融合タンパク質である。
【００４５】
Ｔ細胞の不応答性を誘導し維持するため、Ｔ細胞を、ＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子とＣＤ２阻害因子に同時にまたは順次接触させてもよい。順次接触させる場合は、Ｔ細胞をまずＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子に接触させ次いでＣＤ２阻害因子に接触させることが好ましい。
【００４６】
またこの方法は、例えば臓器移植、骨髄移植および自己免疫疾患などの場合に抗原特異的免疫応答を阻害することが望ましい場合、治療的に有用である。治療を目的とする場合、ＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子およびＣＤ２阻害因子を患者に投与してＴ細胞の不応答性を誘導させ維持する。これらの因子は同時にまたは続けて患者に投与することができる。投与経路、投与する医薬組成物、投与のタイミングと量および投与などに関して配慮すべき事項は、ＣＤ２阻害因子について先に述べたのと同様である。
III．Ｔ細胞の応答性を復活する方法
【００４７】
本発明はさらに、アネルギー化Ｔ細胞の抗原に対する応答性を復活する方法（すなわちアネルギーを逆転する方法）を提供するものである。この方法により処理された、アネルギー化Ｔ細胞は、その後の抗原および共刺激分子による刺激に対する応答能（例えば増殖とＩＬ−２分泌の性能）が回復する。この方法は、アネルギー化Ｔ細胞による、抗原に対する免疫応答を促進することが望ましい治療状態の場合に有用である。この状態の例は、腫瘍が存在することによってＴ細胞が腫瘍抗原に対して不応答性になった担腫瘍患者である。
【００４８】
一実施態様では、抗原に対するＴ細胞の応答性は、抗原の存在下、アネルギー化Ｔ細胞を、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する因子と接触させることによって回復する。この方法は、Ｔ細胞の応答性を（アネルギー化される前のＴ細胞の応答性に比べて）充分にまたは一部分回復させ、Ｔ細胞に抗原および共刺激分子によるその後の刺激に対して応答させる（すなわち増殖とＩＬ−２の分泌）手段を提供するものである。ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する因子は本明細書ではＣＤ２刺激因子と呼称する。Ｔ細胞の応答性を回復させるためには、ＣＤ２刺激因子はその表面にＣＤ２リガンドを発現する細胞でもよい。あるいは、ＣＤ２刺激因子は可溶性刺激型のＣＤ２リガンド（例えば多価型またはミセル型）でもよい。さらに、ＣＤ２刺激因子は、少なくとも１個の抗ＣＤ２抗体またはその組合わせでもよい。また本発明の方法に有用なＣＤ２刺激因子は、細胞内で作用して、ＣＤ２でトリガーされる細胞内シグナルを刺激する因子でもよい。
Ａ．ＣＤ２リガンド発現細胞
【００４９】
抗原に対するＴ細胞の応答性を回復させる方法において、ＣＤ２刺激物質の１つの具体例は細胞表面にＣＤ２リガンドを発現している細胞である。好ましくは、ＣＤ２リガンドはＬＦＡ−３（ＣＤ５８）である。あるいはまた、ＣＤ２リガンドはＣＤ４８またはＣＤ５９でもよい。すなわち、不応答性Ｔ細胞を、細胞表面にＣＤ２リガンド（例えば、ＬＦＡ−３）と抗原とを発現している細胞と接触させることにより、抗原に対するＴ細胞の応答性を回復させることができる。天然にＣＤ２リガンドを発現していない細胞を修飾してＣＤ２リガンドを発現させることができる。例えば、構成的に腫瘍抗原を発現しているがＬＦＡ−３を発現していない腫瘍細胞を修飾してＬＦＡ−３を発現させることができる。腫瘍細胞を修飾してＣＤ４８またはＣＤ５９を発現させることもできる。あるいはまた、細胞は、Ｔ細胞アネルギーを逆転させるには不十分な量のＣＤ２リガンドをその表面に発現している場合がある。そのような場合、細胞表面上のＣＤ２リガンドの発現レベルを増加させてもよい。細胞表面上にＣＤ２リガンドが発現されるような方法で、細胞を「ＣＤ２リガンドを発現するように修飾する」。修飾前に、細胞は、ＣＤ２リガンドを発現することができなくてもよく、ＣＤ２リガンドを発現することができるが発現していなくてもよく、また不十分な量のＣＤ２リガンドを発現していてもよい。したがって、多くの技術のいずれか、例えば、ＣＤリガンドをコードする核酸を細胞に導入するか、ＣＤ２リガンドを細胞表面にカップリングさせるか、または細胞表面におけるＣＤ２リガンドの発現を刺激（促進）することによって、細胞を修飾し、ＣＤ２リガンドを発現させることができる。
【００５０】
ＣＤ２リガンドを発現させるための好ましい細胞修飾法は、細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現させるのに適した形の、ＬＦＡ−３のようなＣＤ２リガンドをコードする核酸を細胞内に導入するものである。エレクトロポーレーション（電気穿孔法）、カルシウム−ホスフェート沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルスベクターによる感染を含む、核酸を哺乳動物細胞中に導入するのに有用な種々の技術（一般にはトランスフェクションと呼ばれる）の１つによって、ＣＤ２リガンドをコードする核酸（例えば、組換え発現ベクター）を宿主細胞中に導入することができる。適切な哺乳動物細胞のトランスフェクション法はSambrookらの、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）や他の実験書に記載されている。導入される核酸としては、例えば、ＣＤ２リガンドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ、ＣＤ２リガンドをコードするセンス鎖ＲＮＡ、またはＣＤ２リガンドをコードするｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターが考えられる。用いるｃＤＮＡとしては、ヒトＬＦＡ−３の貫膜形（Wallner,B.P.ら(1987)の、 J.Exp.Med.166:923-932に開示）およびヒトＬＦＡ−３のＧＰＩ連結型（Seed,B.（1987）の、Nature 329:840-842に開示）のｃＤＮＡが好ましい。あるいはまた、ヒトＣＤ４８（Korinek,V.ら（1991）の、Immunogenetics 33:108-112に開示）およびヒトＣＤ５９（Sawada,R.ら（1990）の、DNA Cell Biol.9:213-220に開示）のｃＤＮＡも使用することができる。さらに、細胞を修飾して複数のＣＤ２リガンドを発現させることができる。細胞上に発現させることができるＬＦＡ−３（両方の形）、ＣＤ４８、およびＣＤ５９の種々の組み合せは当業者には明らかであろう。
【００５１】
細胞内に導入されるＣＤ２リガンドをコードする核酸は、細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現させるのに適した形をしている。この核酸は、必要なコード配列、およびプロモーター、エンハンサー、ならびにポリアデニル化シグナルを含み得る遺伝子の転写と翻訳に必要な調節配列、およびＮ−末端シグナル配列を包含する、腫瘍細胞表面に該分子を移動させるのに必要な配列を含んでいる。この核酸が組換え発現ベクター中のｃＤＮＡである場合は、ｃＤＮＡの転写および／または翻訳の調節機能はウイルス配列によって提供されることが多い。普通に用いられるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスならびにシミアンウイルス４０、およびレトロウイルスＬＴＲ由来のものが含まれる。ｃＤＮＡに結合させる調節配列は、例えば、金属チオネインプロモーターまたはグルココルチコイド応答性プロモーターのような誘導プロモーターを用いることにより、構成的または誘導的な転写を生じるように選択する。
【００５２】
細胞（例えば、腫瘍細胞）中にＣＤ２リガンドをコードする核酸を導入するための好ましいアプローチでは、ＣＤ２リガンドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターを用いる。使用可能なウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター（Eglitis,M.A.ら（1985）の、 Science 23:1395-1398；Danos,O.およびMulligan,R.（1988）の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464；およびMarkowitz,D.ら（1988）の、J.Virol.62:1120-1124）、アデノウイルスベクター（Rosenfeld,M.A.ら（1992）の、Cell 68:143-155）、およびアデノ関連ウイルスベクター（Tratschin,J.D.ら（1985）の、Mol.Cell.Biol.5:3251-3260）が含まれる。腫瘍細胞のウイルスベクターによる感染では、大部分の細胞が核酸を受け取るため、核酸を受け取った細胞を選別する必要がなく、また、例えば、ウイルスベクター中に含まれるｃＤＮＡによって、ウイルスベクター中にコードされている分子が、ウイルスベクター核酸を取り込んでいる細胞内に効率的に発現する。
【００５３】
あるいはまた、ＣＤ２リガンドは、ＣＤ２リガンドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含むプラスミド発現ベクターを用いて、細胞上に発現させることができる。適切なプラスミド発現ベクターにはＣＤＭ８（Seed,B.の、Nature 329,840（1984）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kanfmanらの、EMBO 6,187-195(1987)）が含まれる。通常、ほんのわずかな細胞（約１０５個中約１個）しか、そのゲノム中にトランスフェトされたプラスミドＤＮＡを組み込まないので、トランスフェトされた細胞を選別するために、選択マーカーをコードする核酸を、目的とする核酸と共に細胞内にトランスフェクトするのが有利である。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートのような薬剤に対する耐性をもたらすものが含まれる。選択マーカーは目的とする遺伝子と同じプラスミドに導入してもよく、別のプラスミドに導入してもよい。適切な選択マーカーを用いてトランスフェクション細胞を選択した後、細胞を免疫蛍光染色することによって細胞表面における共刺激分子の発現を確認することができる。例えば、ＣＤ２リガンド応答性の蛍光標識モノクローナル抗体かまたはＣＤ２リガンドと結合する蛍光標識可溶性受容体（例えば、可溶性ＣＤ２）を用いて細胞を染色してもよい。ＬＦＡ−３を検出するのに使用できる抗体は、Sanchez-Madrid,F.（1982）の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7489（例えば、ＴＳ２／９）に開示されており、ＣＤ４８抗体を検出するのに使用できる抗体はSandrin,M.S.（1993）の、J.Immunol.151:4606およびKatoら（1993）の、Eur.J.Immunol. 23:1412に開示されており、また、ＣＤ５９を検出するのに使用できる抗体はDeckert,M.ら（1992）の、Eur.J.Immunol.22:2943-2947に開示されている。
【００５４】
細胞（例えば、腫瘍細胞）のトランスフェクションにより、大きな割合の細胞が修飾され、細胞表面上のＣＤ２リガンドの効率的な発現が達成される場合、例えば、ウイルス発現ベクターを用いた場合には、さらに単離やサブクローニングを行うことなく細胞を使用してもよい。あるいはまた、トランスフェクション細胞の均一なポピュレーションは、限界希釈によって単一のトランスフェクション細胞を単離し、次いで標準技術によってこの単一細胞を膨張させて細胞のクローナルポピュレーションとすることによって製造することができる。
【００５５】
ＣＤ２リガンドをコードする核酸を細胞中に導入する代わりに、細胞表面のＣＤ２リガンドの発現を誘導したり、発現レベルを増大させるように細胞を修飾することもできる。ＣＤ２リガンドの発現を刺激する物質を用いて、細胞表面のＣＤ２リガンドの発現を誘導するかまたは増大させることができる。例えば、in vitroの培養培地中でこの物質と細胞を接触させることができる。ＣＤ２リガンドの発現を刺激する物質は、例えば、ＣＤ２リガンド遺伝子の転写を増大させるか、ＣＤ２リガンドｍＲＮＡの翻訳を増大させるか、またはＣＤ２リガンドの細胞表面への移動もしくは安定性を増すことによって作用してもよい。腫瘍細胞表面のＣＤ２リガンドの発現を誘導するかまたは増大させるのに使用できる別の物質は、ＣＤ２リガンドをコードする遺伝子の転写をアップレギュレーション（促進的調節）する転写因子をコードする核酸である。この核酸を既述のごとく細胞内にトランスフェクトすることにより、ＣＤ２リガンド遺伝子の転写を増大させ、ＣＤ２リガンドの細胞表面レベルを増大させることができる。
【００５６】
あるいはまた、細胞表面にＣＤ２リガンドをカップリングさせることによって細胞（例えば、腫瘍細胞）を修飾し、ＣＤ２リガンドを発現させることができる。例えば、ＣＤ２リガンド蛋白を生産し単離することができる発現系と標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤ２リガンドを得ることができる。あるいはまた、ＣＤ２リガンドは、標準的蛋白精製技術を用いてＣＤ２リガンドを発現する細胞から単離することができる。次いで、単離したＣＤ２リガンドを細胞表面にカップリングさせる。用語「カップリングされた」または「カップリング」とは、ＣＤ２リガンドが細胞表面に存在し、Ｔ細胞におけるＣＤ２を介するシグナルを誘発し得るようにＣＤ２リガンドを細胞と結合させる化学的、酵素的、もしくは他の方法をいう。例えば、市販の架橋試薬（例えば、Pierce、Rockford IL）を用いて、ＣＤ２リガンドを細胞表面に化学的に架橋させることができる。別のアプローチとして、ＬＦＡ−３やＣＤ５９のようなＣＤ２リガンドのＧＰＩ連結型の脂質末尾を細胞膜内に挿入することによって、該分子を細胞表面にカップリングさせることができる。さらなる別のアプローチには、細胞上の、ＣＤ２リガンドと細胞表面分子の両方に結合する二特異抗体を介してＣＤ２リガンドを細胞にカップリングさせることが含まれる。細胞表面にカップリングしたときにＴ細胞におけるＣＤ２を介するシグナルを誘発する能力を保持しているＣＤ２リガンドのフラグメント、突然変異体または変異体を使用することもできる。
Ｂ．可溶性の刺激型のＣＤ２リガンド
【００５７】
本発明の他の態様において、Ｔ細胞の応答性を回復するのに用いるＣＤ２刺激物質は可溶性の刺激型のＣＤ２リガンドである。可溶性のＣＤ２リガンドは、適切な抗ＣＤ２抗体と一緒になって、ＣＤ２を介してシグナルを誘発することが示されている。ある態様において、可溶性の刺激型のＣＤ２リガンドは、ＣＤ２リガンドの多価形、例えば、ダイマー、トリマー、またはテトラマーである。ＬＦＡ−３のマルチマーは、適切な抗ＣＤ２抗体（例えば、Ｔ１１．３抗体）と一緒になってin vitroにおけるＴ細胞の活性化を誘発することが示されている（Pepinsky,R.B.ら（1991）の、J.Biol.Chem.266:18244-18249参照）。したがって、ＣＤ２を介してＴ細胞の活性化を刺激するＣＤ２リガンドのマルチマーをＣＤ２刺激物質として用いることができる。好ましくは、ＣＤ２リガンドの多価形は、Ｔ１１．３エピトープと結合する抗ＣＤ２抗体（例えば、Ｔ１１．３抗体）と組み合わせて使用される。Pepinskyら（既述）の記載の従って、ＣＤ２リガンドのモノマーを化学的に架橋し、マルチマーを形成させることができる。
【００５８】
さらに別の態様において、可溶性の刺激型のＣＤ２リガンドは、ミセル中に取り込まれたＧＰＩ連結ＣＤ２リガンドである。膜中に固定するためのホスファチジルイノシトール脂質末尾を含むＣＤ２リガンド（例えば、ＬＦＡ−３またはＣＤ５９）をＧＰＩ連結型として分離し、ミセル中に取り込ませることができる。ＬＦＡ−３またはＣＤ５９を含有するミセルはWO89/10938の記載に従って製造することができる。適切な抗ＣＤ２抗体（例えば、Ｔ１１．３抗体）と結合したＣＤ２リガンドのミセル形を用いて、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激することができる（WO89/10938参照）。
Ｃ．刺激型の抗ＣＤ２抗体
【００５９】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質の別の具体例は少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体である。刺激型の抗ＣＤ２抗体は当該技術分野で開示されている。好ましくは、抗ＣＤ２抗体によるＣＤ２を介する刺激は、少なくとも２つの異なる抗ＣＤ２抗体を組み合わせて用いることによって達成される。既に報告されている抗ＣＤ２抗体の刺激性混合物には以下のものが含まれる：Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Meuer,S.C.ら（1984）の、Cell 36:897-906）、および９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）（Yang,S.Y.ら（1986）の、J.Immunol.137:1097-1100）。これらの抗体と同じエピトープに結合する他の抗体を使用することもできる。さらなる刺激型抗ＣＤ２抗体または抗体混合物は標準的技術によって製造し、確認することができる。例えば、刺激型抗体または抗体混合物は、in vitroのＴ細胞培養系において抗原提示細胞の非存在下でＴ細胞の増殖を刺激する抗体（単一または複数）の能力に基づいて確認することができる。
Ｄ．細胞内ＣＤ２刺激物質
【００６０】
細胞外で作用し、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激する物質に代わって、ある種のＣＤ２刺激物質は細胞内で作用し、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発された細胞内シグナルを刺激することができる。既述したように、Ｔ細胞上のＣＤ２表面受容体を介した細胞内シグナリングにはＣＤ３コンプレックスが関与するが、このシグナリングはプロテインチロシンキナーゼ活性、プロテインキナーゼＣ活性を誘導し、細胞内のサイトゾル遊離カルシウムを生じさせる。したがって、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激することによって誘導された１つまたはそれ以上のこの細胞内シグナルを刺激する物質は、Ｔ細胞の応答性を回復するためのＣＤ２刺激物質として用いることができる。
【００６１】
さらに、既述したように、Ｔ細胞アネルギーの逆転には、チロシンキナーゼＪＡＫ−３とＣＤ２の会合およびＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化が伴う（実施例６参照）。したがって、細胞内ＣＤ２刺激物質は、ＪＡＫ−３キナーゼの細胞内活性を刺激する物質、例えば、ＪＡＫ−３キナーゼとＣＤ２との会合を刺激し、そして／またはＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化を刺激する物質であり得る。
Ｅ．不応答性Ｔ細胞のプライミング
【００６２】
アネルギー化Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させるのに加えて、Ｔ細胞の抗原特異的応答性を回復するにはＣＤ２を介して刺激するためにＴ細胞を「プライム」する必要があろう。本明細書において、Ｔ細胞を「プライムする」なる用語は、Ｔ細胞に、次の刺激（例えば、ＣＤ２を介する）に対する準備をさせる、Ｔ細胞の処理を表す。したがって、ＣＤ２表面受容体を介して刺激するために、まず最初にアネルギー化Ｔ細胞を、Ｔ細胞をプライムする物質と接触させることができる。ＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする物質の具体例はＴ細胞成長因子、好ましくはＩＬ−２である。アネルギー化Ｔ細胞をプライムするのに使用できる他のＴ細胞成長因子にはＩＬ−４およびＩＬ−７が含まれる。これら３種類のリンホカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−７）のそれぞれの受容体は、共通のシグナリングサブユニット、ＩＬ−２ γ鎖を利用し、したがって、類似した細胞内シグナルを誘発する。細胞内シグナリングにＩＬ−２受容体γ鎖を利用する受容体と結合する他のサイトカイン、または細胞内で作用してＩＬ−２受容体γ鎖シグナリング経路を刺激する物質を用いてＴ細胞をプライムすることができる。
【００６３】
あるいはまた、不応答性Ｔ細胞をプライムする物質は、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上へのＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激する物質である。したがって、ＣＤ２上のＴ１１．３エピトープの露出はＴ細胞プライミングを評価するのに用いることができる。Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３エピトープの露出は、Ｔ細胞に結合するＴ１１．３抗体の能力を測定することによって（例えば、フローサイトメトリーによって）評価することができる。ＣＤ２上のＴ１１．３ネオ−エピトープを露出するのに使用することができる好ましい物質はＩＬ−２である。 本発明のこの態様によれば、不応答性Ｔ細胞を、ＣＤ２刺激物質と接触させる前にＴ細胞をプライムする物質と接触させることができる。例えば、Ｔ細胞をＩＬ−２中で培養し、ＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムし、次いでＣＤ２リガンドを発現している細胞かまたは刺激型抗ＣＤ２抗体で刺激することができる。
Ｆ．ＣＤ２刺激物質の使用
【００６４】
抗原に対するＴ細胞の応答性を回復するための本発明の方法は、治療目的に用いることができる。例えば、この抗原は腫瘍細胞上に発現した抗原であり得るし、また、この方法は抗腫瘍応答性を増強するのに使用することができる。あるいはまた、この方法を用いて、ウイルス、細菌、寄生虫、およびカビのような病原物質に対する応答性を増強するか、またはそのような病原性物質に対するワクチンの効力を増強することができる。例えば、ＣＤ２刺激物質は、病原性物質に感染した対象に投与するか、またはワクチン抗原に対するＴ細胞の応答性を増強するためにワクチンと一緒に投与することができる。Ｔ細胞はin vitroの培養において抗原に対して不応答性になる傾向があるため、in vitroのＴ細胞培養を含む治療的処理の補助としてこの方法を用いることができる。したがって、本発明の方法を用いて、治療的に用いられるin vitro培養Ｔ細胞の抗原応答性を増大させることができる。
【００６５】
アネルギー化Ｔ細胞の抗原特異的応答性は、in vivoまたはex vivo（生体外）のいずれかにおいてアネルギー化Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させることによって回復させることができる。抗原特異的Ｔ細胞を、好ましくは抗原存在下でＣＤ２刺激物質と接触させる。例えば、in vitroにおいて、抗原発現細胞の存在下で培養中、Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させるか、または抗原が内在性に存在するかまたは抗原がＣＤ２刺激物質と一緒に投与されるin vivoにおいて、Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させる。さらにin vitroまたはin vivoのいずれかでＣＤ２を介して刺激するために、Ｔ細胞をプライムする物質とＴ細胞を接触させることができる。例えば、Ｔ細胞をin vitroでＩＬ−２とインキュベーションするか、またはＩＬ−２を、対象に対して全身投与することができる。
【００６６】
ＣＤ２刺激物質の投与経路、投与するための医薬組成物、投与のタイミングと用量、および投与のための他の考慮すべき事項は、ＣＤ２阻害物質に関して既述した通りであるか、またはそれらを容易に変更することができる。ＣＤ２阻害物質について既述した組成物に加えて、さらにＣＤ２刺激物質をアジュバントと投与することができる。アジュバントはその最も広い意味で使用され、インターフェロンのようなあらゆる免疫刺激化合物が含まれる。本発明において予定されているアジュバントには、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤、レソルシノールが含まれる。ＣＤ２刺激物質を別の治療剤（例えばワクチン）と一緒に投与する場合は、両治療剤の最大の効力を得るために、ＣＤ２刺激物質のタイミングと用量を、他の物質を投与するタイミングと用量と調和させることができる。
ＩＶ．抗原に対するＴ細胞の応答を回復させる方法
【００６７】
本発明の方法に従ってＣＤ２を介して刺激される抗原特異的なアネルギー化Ｔ細胞は、共刺激シグナルを誘発する刺激と共に抗原にばく露されると、抗原応答能を回復する。したがって、本発明はさらに、抗原の存在下で、Ｔ細胞を、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質と接触させることにより、抗原不応答性Ｔ細胞の、抗原に対する応答を回復させる方法を提供するものである。さらに、Ｔ細胞を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第二物質と接触させる。この方法を治療的に用いて腫瘍を保有する対象における抗腫瘍反応を増強させることができる。あるいはまた、抗原に対する応答を回復させる方法を、病原性物質（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、またはカビ）に対する免疫反応を刺激し、病原性物質に対するワクチンの効力を刺激するような治療目的に用いることができる。
【００６８】
この方法に用いる第一物質の例としては、先に詳述したＣＤ２刺激物質がある。この方法に用いる第二物質の例には、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現している細胞（例えば、ＣＤ２リガンドにおいて既述したＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように修飾された細胞）、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドの刺激形（例えば、多価形）、またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ４と結合する刺激抗体（例えば、Harding,F.A.（1992）の、Nature 356:607-609に記載の刺激抗ＣＤ２８抗体）が含まれる。
【００６９】
好ましい態様においては、第一物質は細胞表面上のＣＤ２リガンドであり、第二物質は同じかまたは別の細胞表面上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドである。好ましいＣＤ２リガンドはＬＦＡ−３である。あるいはまた、ＣＤ２リガンドはＣＤ４８またはＣＤ５９であり得る。好ましいＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドは、Ｂ７−１およびＢ７−２である。既述の方法によって細胞を修飾し、ＣＤ２リガンドおよび／またはＣＤ２８／ＣＴＬＡ４リガンドを発現させることができる。例えば、ＣＤ２リガンドおよび／またはＣＤ２８／ＣＴＬＡ４リガンドをコードする核酸を、細胞表面上にリガンド（単一または複数）を発現させるのに適切な形で細胞中に導入することができる。あるいはまた、ＣＤ２および／またはＣＤ２８／ＣＴＬＡ４リガンドを細胞上に誘導するか、または細胞表面にカップリングさせることができる。
【００７０】
抗原に対するＴ細胞の応答性を回復させるには、ＣＤ２を介して刺激するためにＴ細胞をプライムする第三物質とＴ細胞を接触させる必要があろう。Ｔ細胞をプライムするための物質は既述の通りである。Ｔ細胞をプライムし、Ｔ細胞上のＣＤ２のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激するための好ましい物質はＩＬ−２である。ＣＤ２を介して刺激するためにＴ細胞をプライムする物質とＴ細胞を接触させ、次いで、Ｔ細胞を、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激する物質と接触させる。in vitroまたはin vivoのいずれかでＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする物質とＴ細胞を接触させる。例えば、Ｔ細胞を対象から得、in vitroでＩＬ−２中で培養し、次いでこれを対象に再投与するか、または対象にＩＬ−２を全身投与することができる。
【００７１】
本発明の好ましい態様は、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように腫瘍細胞を修飾することを特徴とする、腫瘍を有する対象の腫瘍特異的Ｔ細胞応答を回復させる方法を提供することである。好ましくは、腫瘍細胞表面にＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現させるのに適した形の、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドをコードする少なくとも１つの核酸を腫瘍細胞中に導入することによって、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するようにＴ細胞を修飾することができる。腫瘍細胞はin vivoまたはex vivoで修飾することができる。例えば、腫瘍細胞表面にＣＤ２リガンドを発現するように腫瘍細胞を修飾するのに適した形のＣＤ２リガンドをコードする組換え型ウイルスに腫瘍細胞を感染させることによって、in vivoでＣＤ２リガンドを発現させることができる。あるいはまた、腫瘍細胞を対象から取り出し、ex vivoで修飾してＣＤ２リガンドを発現させ、次いで対象に再投与することができる。ex vivoで修飾する場合、両リガンド（すなわち、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンド）を発現するようにＴ細胞試料を修飾するか、あるいはまた、ＣＤ２リガンドを発現するようにある腫瘍細胞試料を修飾し、次いでＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように第二腫瘍細胞試料を修飾することができる。次に、この２つの腫瘍細胞試料を、同時にかまたは連続的に対象に投与することができる。ＣＤ２リガンドを発現している腫瘍細胞試料を最初に投与して腫瘍特異的応答性を回復させ、次いでＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現している腫瘍細胞試料を投与して腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激することは有利であろう。
【００７２】
腫瘍特異的Ｔ細胞はin vivoまたはex vivoのいずれかで刺激することもできる。例えば、Ｔ細胞は、in vivoで腫瘍細胞を修飾するか、または修飾した腫瘍細胞（または他のＣＤ２刺激物質）を対象に投与することによってin vivoで刺激することができる。あるいはまた、Ｔ細胞を対象から得、ex vivoで刺激し（例えば、ＬＦＡ−３保持腫瘍細胞かまたは腫瘍細胞と抗ＣＤ２抗体を用いて）、次いで、対象に再投与することができる。in vitroで刺激したＴ細胞を最初にin vitroでＩＬ−２と培養してＴ細胞をプライムするか、またはＩＬ−２を対象に全身投与し、ＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムすることができる。
【００７３】
したがって、本発明は、修飾される前はＣＤ２リガンドを発現していない腫瘍細胞であって、修飾によってＣＤ２リガンドを発現する腫瘍細胞をも提供するものである。好ましくは、腫瘍細胞はＬＦＡ−３を発現するように修飾される。本発明は、修飾される前はＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現していない腫瘍細胞であって、修飾によってＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現する腫瘍細胞をも提供する。修飾によってＬＦＡ−３およびＢ７−１またはＢ７−２を発現するＴ細胞が好ましい。既述のごとく、ＣＤ２リガンド、および所望によりＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するようにＴ細胞を修飾することができる。修飾された腫瘍細胞は、医薬として投与するのに適した組成物中に取り込ませることができる。例えば、腫瘍細胞を、医薬的に許容される担体または希釈剤（例えば、滅菌生理食塩水溶液）に入れて、投与することができる。腫瘍細胞は、腫瘍細胞を所望の部位に輸送する適切な経路、例えば、静脈内、筋肉内、または腹腔内注射によって投与することができる。
【００７４】
以下の実施例において、本発明をさらに説明するが、これによって本発明が限定されると解釈すべきではない。本明細書中に引用された全ての引用文献、および公開された特許ならびに特許出願の内容は本明細書の一部を構成する。
【実施例】
【００７５】
実施例１：Ｔ細胞における共刺激シグナル阻害によるＴ細胞の不応答性の誘導
実施例において、アロ抗原のＨＬＡ−ＤＲ７に特異的な２種類のヘルパーＴ細胞クローン（ＴＣ−１、ＴＣ−２）を使用した。これらのクローンは、ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２８＋であり、標準的方法（J.Goronzyら（1987）の、Methods Enzymol.150:333に記載）を用いて作製した。ある実験では、これらＴ細胞クローンを、トランスフェクションによってＨＬＡ−ＤＲ７および／または他の細胞表面分子を発現しているＮＩＨ−３Ｔ３またはＣＯＳ細胞で刺激した。本明細書では、これらのトランスフェクトされた細胞を、人工的アロ抗原提示細胞（アロ−ＡＰＣ）と呼ぶ。トランスフェクション前には、これら細胞はＴ細胞の増殖やＩＬ−２の産生を刺激することはできない。トランスフェクタントは以下のようにその表面に発現している分子によって表され、ＨＬＡ−ＤＲ７のみを発現している細胞はｔ−ＤＲ７と、ＨＬＡ−ＤＲ７とＢ７−１の両方を発現している細胞はｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１と、また、ＨＬＡ−ＤＲ７とＩＣＡＭ−１を発現している細胞はｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１などというように呼ばれる。他の実験では、ＨＬＡ−ＤＲ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を一緒に発現するＨＬＡ−ＤＲ７ホモ接合体のリンパ芽球様細胞系でＴ細胞クローンを刺激する。この細胞系はＬＢＬ−ＤＲ７と呼ばれる。Ｔ細胞の応答は、標準的技術によってＴ細胞の増殖またはＩＬ−２の産生を測定することによってアッセイされた。この２クローンの結果は本質的に同等であった。ＴＣ−１の結果のみを示す。
【００７６】
最初の一連の実験において、ＴＣ−１は、ｔ−ＤＲ７、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７のいずれかと７２時間一緒に培養した。ＴＣ−１とアロ−ＡＰＣまたはＬＢＬ−ＤＲ７は１：１の最適比で培養された（２．５×１０４個／ウェル）。７２時間の一次培養後、ＴＣ−１細胞を、人工的アロ−ＡＰＣからパーコールグラジエント遠心によって、およびＬＢＬ−ＤＲ７からフィコール分離によって分離し、徹底的に洗浄し、ＩＬ−２を含まない培地中で２４時間培養した。次いで各ポピュレーションを、二次刺激物質の人工的アロ−ＡＰＣ（ｔ−ＤＲ７、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７、ｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１）、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞、またはＩＬ−２によって再チャレンジした。人工的アロ−ＡＰＣおよびＬＢＬ−ＤＲ７細胞を、３７℃で２時間２０μｇ／ｍＬのマイトマイシン−Ｃ（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）で処理し、徹底的に洗浄した。ある実験では、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞を９６００ｒａｄで照射した。ある培養（図１に示す）には、抗Ｂ７−１（１３３）ｍＡｂとＣＴＬＡ−Ｉｇ融合蛋白を１０μｇ／ｍＬで加えた。組換え型ヒトＩＬ−２（Collaborative Biomedical Products, Bedford,MA）を１００ＩＵ／ｍＬで用いた。増殖は、７２時間のインキュベーションの最後の１６時間における［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ）（DuPont,Boston,MA）の取り込みによって測定した。ＩＬ−２の蓄積は、培養開始後２４時間で採取した上清において、酵素免疫測定法（Biosource,Camarillo,CA）によって測定した。結果は７回の実験の結果を表している。結果を図１に示す。なお、黒棒は人工的アロ−ＡＰＣに対するＴＣ−１細胞の応答を示し、斜線の棒はＬＢＬ−ＤＲ７に対する応答を示し、白抜きの棒は外因性組換え型ヒトＩＬ−２に対する応答を示す。
【００７７】
ＴＣ−１のｔ−ＤＲ７との一次培養によって、ＴＣ−１がアロ−ＡＰＣまたはＬＢＬ−ＤＲ７による再チャレンジに応答しないことによって示される、Ｔ細胞の不応答性（すなわち、アネルギー）が誘導された（図１、Ａ参照）。この実験から、共刺激シグナルの非存在下（例えば、Ｂ７−１に対する結合の非存在下）のＴＣ−１における抗原刺激シグナルの刺激によってＴ細胞の不応答性が誘導されることが確認された。これに対して、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７のいずれかを用いる一次培養は、有意な二次増殖反応とＩＬ−２の蓄積をもたらした（図１、ＢおよびＣ参照）。一次培養中のＬＢＬ−ＤＲ７細胞に対する抗Ｂ７−１ ｍＡｂ（A.S.Freedmanら（1987）の、J.Immunol.137:3260に記載）の添加は、増殖とＩＬ−２の蓄積を低下させたが、再チャレンジに対する不応答性は誘導しなかった（図１、Ｄ参照）。これは、抗Ｂ７−１抗体が、他のＢ７ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−２）とＴ細胞上のその受容体（例えば、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）との相互作用を阻害することができないことによる。しかしながら、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ存在下におけるＬＢＬ−ＤＲ７との一次培養（C.D.Gimmiら（1993）の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6586）はアネルギーをもたらした（図１、Ｅ参照）。これは、ＣＴＬＡ４Ｉｇが、すべてのＢ７ファミリーのメンバーとＴ細胞上のその受容体との相互作用を阻害することができることによる。すべての場合において、アネルギー化細胞と非アネルギー化細胞は外因性ＩＬ−２と同様に応答した。ＣＴＬＡ４−ＩｇによってブロックされないＬＢＬ−ＤＲ７細胞上に発現される他のすべての表面分子はＣＴＬＡ４Ｉｇ存在下でアネルギーの誘導を防止できなかったことから、これらの結果は、アロ抗原特異的アネルギーを誘導するには、Ｂ７ファミリーの共刺激分子をブロックすることが必要十分であることを示している。さらに、アネルギー誘導後に、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞上に発現したＢ７ファミリーのメンバーと他の非Ｂ７共刺激分子はいずれもこの状態を逆転させることができないようである。
実施例２：Ｂ７−１またはＩＣＡＭ−１によるＴ細胞の刺激はＴ細胞の不応答性を逆転させない
【００７８】
二番目の一連の実験において、アネルギー化ＴＣ−１細胞をＩＬ−２中で３〜２１日間培養し、ＩＬ−２が特異的アロ抗原に対する応答性を回復させることができるかどうかを検討した。ＴＣ−１細胞を最初にｔ−ＤＲ７と共に一次培養してアネルギー化し（実施例１の記載に従って）、次いでＩＬ−２で３〜２１日間インキュベーションした。ＩＬ−２でインキュベーションした後、ＴＣ−１細胞をアロ−ＡＰＣまたはＬＢＬ−ＤＲ７で再チャレンジした（図２に示した時間間隔で）。図２に示す結果は、５回の実験の代表例である。ＩＬ−２でインキュベーションした後２１日までのどの時点においても、ｔ−ＤＲ７、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１、またはｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１による再チャレンジを、広範囲の刺激物質：反応体比で行っても、応答性の回復はみられなかった（図２参照）。これに対して、少なくとも７日間のＩＬ−２培養後において、ＬＢＬ−ＤＲ７による再チャレンジによってＩＬ−２の有意な蓄積と関連する増殖反応が誘導された（図２参照）。これらの実験は、持続的なＩＬ−２培養後に、ＬＢＬ−ＤＲ７と培養することによってＴＣ−１のアロ抗原特異的応答性を回復することができるが、Ｂ７−１とＩＣＡＭ−１（アロ−ＡＰＣ上）はいずれも共刺激をもたらすには十分ではないようであることを示している。コントロール実験において、ＴＣ−１応答は抗ＤＲ ｍＡｂによって阻害され（R.I.Toddら（1984）の、Hum.Immunol.10:23（1984）に記載）、また、Ｔ細胞の増殖またはＩＬ−２の蓄積は、異なるＤＲハプロタイプとそれぞれホモ接合体である２つの他のＬＢＬ（ＬＢＬ−ＤＲ１およびＬＢＬ−ＤＲ８）によって誘導されなかったことから、このＴＣ−１反応がアロ抗原特異的であることが示された。
実施例３：ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用のブロックによるＴ細胞不応答性の維持
【００７９】
第３の一連の実験において、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞の、ＴＣ−１のアロ抗原特異的応答性を回復する能力について検討した。ＬＢＬ−ＤＲ７培養上清の存在下でｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１で再チャレンジしても応答性は回復しなかったことから、ＬＢＬ−ＤＲ７の効果に対する分泌された可溶性因子関与はみられなかった。これに対して、パラホルムアルデヒド固定細胞、マイトマイシン−Ｃ処理細胞、または照射ＬＢＬ−ＤＲ７細胞は同じ増殖反応を誘導し、観察されたＬＢＬ−ＤＲ７細胞によるアネルギーの逆転に細胞表面分子が関与したことが示唆された。ＡＰＣ上に発現した種々の細胞表面分子に対するｍＡｂまたは融合蛋白のブロッキングによって、既知の細胞表面分子がＬＢＬ−ＤＲ７細胞による応答性の回復をもたらすかどうかについて検討した。ｔ−ＤＲ７アロ−ＡＰＣによるアネルギー誘導後にＩＬ−２中で少なくとも７日間培養し、単独でかまたは以下のｍＡｂまたは融合蛋白のそれぞれ１つの存在下で、ＬＢＬ−ＤＲ７でＴＣ−１細胞を再チャレンジした：抗ＤＲ（９−４９）（R.I.Toddら（1984）の、Hum.Immunol.10:23に記載）、抗ＬＦＡ−１（ＴＳ１／２２）（F.Sanchez-Madridら（1982）の、Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:7489に記載）、抗ＬＦＡ−３（ＴＳ２／９）（F.Sanchez-Madridら（1982）の、Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:7489に記載）、抗Ｂ７−１（１３３）（A.S.Freedmanら（1987）の、Immunol.137:3260に記載）、ＢＢ−１（E.Clarkらの、Leukocyte Typing中、A.Bernardら編、（Springer-Verlang,Berlin Heidelberg,1984）、339頁に記載）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（C.D.Gimmiら（1993）の、Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:6586に記載）、抗ＣＤ２４（ＢＡ−１、１：１００腹水）（C.S.Abramsonら（1981）の、J.Immunol.126:83）、抗ＣＤ４０（ＪＲＧ１２）、および抗ＣＤ７２（Ｊ３−１０９，ＢＵ−４０、１：１００腹水）（B.Dorkenらの、Leucocyte Typing IV White cell differentiation antigens, W.Knappら編（Oxford,1989）、99頁に記載）。すべての（精製）ｍＡｂと融合蛋白は１０μｇ／ｍＬで使用した。増殖は実施例１の記載に従って測定した。結果を図３に示すが、これは４回の実験を代表するものである。
【００８０】
３つのｍＡｂ、すなわち、抗ＤＲ、抗ＬＦＡ−１、および抗ＬＦＡ−３のみがＴ細胞の不応答性を逆転させるＬＢＬ−ＤＲ７の能力を阻害した（すなわち、Ｔ細胞の不応答性の維持）（図３参照）。Ｂ７ファミリーのメンバー、およびＣＤ２４、ＣＤ４０ならびにＣＤ７２を含む他の細胞表面分子はいずれも、これら分子と結合するｍＡｂまたは融合蛋白に増殖反応を阻害する能力がないことから明らかなように、アネルギーを逆転させるのに重要でないようである。観察されたＬＢＬ−ＤＲ７介在性増殖の抗ＤＲによる阻害は、Ｔ細胞による抗原認識の阻害による。Ｔ細胞の不応答性は、抗原提示細胞上のＬＦＡ−３とアネルギー化Ｔ細胞の相互作用が阻害される時に維持されるため（例えば、抗ＬＦＡ−３抗体を用いてブロックすることによって）、観察された抗ＬＦＡ−３によるＬＢＬ−ＤＲ７介在性増殖の阻害は、ＬＦＡ−３がアネルギーの逆転に関与することと一致している。観察された抗ＬＦＡ−１ ｍＡｂによるＬＢＬ−ＤＲ７介在性増殖の阻害は、ＬＦＡ−１リガンドもアネルギーの逆転に関与し得ることを示唆している。ｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１細胞は持続的なＩＬ−２培養後のアネルギー化細胞の増殖を回復させないことから、ＩＣＡＭ−１はアネルギーの逆転に関与するＬＦＡ−３リガンドではないようである。しかしながら、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３を含む他のＬＦＡ−１リガンド、ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用に加えて、アネルギーの逆転に関与することも考えられる。
実施例４：ＬＦＡ−３を用いる刺激によるＴ細胞の不応答性の逆転
【００８１】
ＬＦＡ−３およびアロ抗原が樹立されたアロ抗原特異的クローン性アネルギー状態を逆転させることができるかどうかを直接試験するために、ＣＯＳ細胞をトランスフェクトさせ、ＤＲ７のみ（ＣＯＳ−ＤＲ７）、Ｂ７−１およびＢ７−２単独（ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２）、またはＬＦＡ−３のみ（ＣＯＳ−ＬＦＡ−３）を発現させるか、または１つまたはそれ以上のこれら分子と一緒にＤＲ７を発現させた（ＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２、ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、およびＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２）。ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７β（ＤＲＢ１＊０７０１）鎖（ＣＯＳ−ＤＲ７）、Ｂ７−１およびＢ７−２（ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２）、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７β、Ｂ７−１およびＢ７−２（ＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２）、ＬＦＡ−３（ＣＯＳ−ＬＦＡ−３）、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７βおよびＬＦＡ−３（ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３）、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７β、ＬＦＡ−３、Ｂ７−１およびＢ７−２（ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２）、またはｐＣＤＮＡＩベクターのみ（ＣＯＳ−ｍｏｃｋ）のいずれかをコードするｃＤＮＡでＣＯＳ細胞をトランスフェクトした。ＤＲ７およびＬＦＡ−３の発現は、それぞれ９−４９およびＴＳ２／９ｍＡｂと、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇを用いて評価し、Ｂ７−１とＢ７−２の発現はビオチニル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、次いでフィコエリスリン結合ストレプトアビジンを用いて評価した。ＬＦＡ−３とＤＲ７の共発現はＴＳ２／９、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇおよびフィコエリスリン結合９−４９を用いて評価し、トランスフェクトされた細胞の５０〜７２％に検出可能であった。ＤＲ７とＢ７−１／Ｂ７−２の共発現は、ＦＩＴＣ結合９−４９とビオチニル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、次いでフィコエリスリン結合ストレプトアビジンを用いて評価し、トランスフェクトされた細胞の４０〜５０％に検出可能であった。使用前に、トランスフェクトされたＣＯＳは実施例１の記載に従ってマイトマイシン−Ｃで処理された。ｔ−ＤＲ７でアネルギーを誘発し、次いで組換え型ヒトＩＬ−２中で培養した後、ＴＣ−１細胞（２．５×１０４ 細胞／ウェル）を、２×１０４ 個／ウェルの各タイプのＣＯＳ−トランスフェクタントで再チャレンジした。増殖およびＩＬ−２の蓄積は実施例１の記載に従って測定した。結果を図４に示すが、これはＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、ＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２、およびＣＯＳ−ｍｏｃｋを用いた３回の実験と、ＣＯＳ−ＤＲ７、ＣＯＳ−ＬＦＡ−３、ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２、およびＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２トランスフェクタントを用いた２回の実験の結果を表している。ＣＯＳ−ＤＲ７、ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２、ＣＯＳ−ＬＦＡ−３、およびＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２によるチャレンジは増殖やＩＬ−２の蓄積を誘導しなかった。これに対して、ＤＲ７とＬＦＡ−３を共発現するトランスフェクタント（ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、およびＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２）は増殖とＩＬ−２の蓄積を同レベルで誘導し、ＬＦＡ−３共刺激の存在下でアロ抗原に対する応答性が回復することを示した。
【００８２】
ＬＦＡ−３による刺激がアネルギーを逆転させ、アロ抗原特異的応答性を完全に回復させるかどうかを検討するため、ＴＣ−１細胞をアネルギー化し、ＩＬ−２中で培養し、ＬＢＬ−ＤＲ７、ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、またはＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２のいずれかと７２時間一緒に培養した。次いで、これをＬＢＬ−ＤＲ７からフィコール分離によって、およびＣＯＳトランスフェクタントからパーコールグラジエント遠心によって分離し、示した刺激物質で再チャレンジした。図５に示した結果は、ＬＢＬ−ＤＲ７刺激物質で再チャレンジしたときの５回の実験と、ＣＯＳトランスフェクタントを刺激物質として再チャレンジしたときの３回の実験の結果を表している。ＩＬ−２およびＬＢＬ−ＤＲ７またはＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３で連続的に培養した後にあらかじめアネルギー化されたＴＣ−１細胞はｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１、ｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１、およびＬＢＬ−ＤＲ７と反応した（図５、上段と中段参照）。これに対して、ＩＬ−２培養後にＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２を使用しても再チャレンジに対する応答はみられなかった（図５、下段参照）。すべての例において、ＴＣ−１細胞は外因性ＩＬ−２に対して同様の増殖を示した（図５）。このことは、ＩＬ−２中で少なくとも７日間アネルギー化ＴＣ−１を培養た後のＬＦＡ−３による刺激とアロ抗原の提示は、あらかじめ与えた不十分な共刺激シグナルの存在下でアロ抗原への応答性を回復させ、アロ抗原特異的アネルギーを逆転させるに十分であることを示している。
実施例５：ＩＬ−２中の培養によるアネルギー化Ｔ細胞上のＣＤ２ネオ−エピトープＴ１１．３の再発現
【００８３】
ＴＣ−１によるＣＤ２エピトープＴ１１．１およびＴ１１．２（ＣＤ２）、およびＴ１１．３（ＣＤ２Ｒ）の発現は、種々の培養条件下で、フローサイトメトリーによって試験した。アネルギー誘導の前後、および７日間のＩＬ−２との培養後のＴＣ−１細胞を、ＣＤ２分子のＴ１１．１、Ｔ１１．２、またはＴ１１．３エピトープに対する抗体、またはアイソタイプが一致した適切なコントロールで染色し、フローサイトメトリー分析（EPICS Elite Flow cytometer;Coulter）によって分析した。結果を図６に示す。図中、黒のピークはアイソタイプの一致したｍＡｂを用いた染色を示し、白いピークはＴ１１．１、Ｔ１１．２、またはＴ１１．３エピトープのいずれかに対するｍＡｂを用いた染色を示す。データは３回の実験の結果を表している。応答状態において、ＴＣ−１細胞はＴ１１．１、Ｔ１１．２、およびＴ１１．３エピトープを発現する。ｔ−ＤＲ７との培養によりＴＣ−１にアネルギーを誘発した（実施例１の記載に従って）後も、ＴＣ−１細胞はまだＴ１１．１とＴ１１．２を発現しているが、Ｔ１１．３（ＣＤ２Ｒ）の発現はもはや検出されない。ＩＬ−２と７日間の培養した後、明確にＴＣ−１細胞がアロ抗原とＬＦＡ−３の共刺激に対する応答性を回復した時に、Ｔ１１．３エピトープが再び発現する（図６参照）。さらに、非アネルギーＴＣ−１細胞はＴ１１．１またはＴ１１．２ｍＡｂとＴ１１．３とのマイトジェニックな（細胞分裂促進性の）組み合せによって増殖するが、アネルギー化ＴＣ−１細胞は増殖しない。７日間のＩＬ−２培養後、Ｔ１１．３エピトープの再発現に伴って、エネルギーＴＣ−１細胞は抗ＣＤ２ ｍＡｂのマイトジェニックな組み合せ（例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２ｍＡｂのいずれかとＴ１１．３）に対する応答性を回復する。アネルギー誘導後にＴＣ−１細胞に検出可能なＴ１１．３エピトープがみられないことは、単にＴ細胞増殖がみられないことによるものではなく、アネルギーの誘導に直接関与していた。
実施例６：Ｔ細胞のアネルギーの逆転におけるＣＤ２とＪＡＫ−３キナーゼとの関連
【００８４】
ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７細胞のいずれかで非アネルギー化ＴＣ−１細胞を刺激することによって、チロシンキナーゼＪＡＫ−１およびＪＡＫ−３のチロシンリン酸化が生じた。Ｔ細胞アネルギーの逆転におけるＪＡＫキナーゼの役割について試験するため、あらかじめアネルギー化したＴＣ−１細胞を種々の刺激物質でチャレンジし、次いでＪＡＫキナーゼによるリン酸化、およびＣＤ２との関連について試験した。非アネルギー化Ｔ細胞とは反対に、あらかじめアネルギー化したＴ細胞は、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７のいずれかでチャレンジしてもＪＡＫ−１またはＪＡＫ−３キナーゼのチロシンリン酸化を示さなかった。しかしながら、Ｔ細胞をＩＬ−２中で７日間培養した後に細胞をＬＢＬ−ＤＲ７で再チャレンジすると、ＪＡＫ−１およびＪＡＫ−３キナーゼの有意なリン酸化を生じた。ＩＬ−２培養後のこの期間は、Ｔ細胞がアロ抗原およびＬＦＡ−３刺激に対する応答性を回復する時間と一致する。この時点でＣＤ２にＪＡＫキナーゼファミリーのメンバーのいずれかとの関連がみられるかを検討するため、ＴＣ−１細胞溶解物をＣＤ２に対するモノクローナル抗体Ｔ１１．１、Ｔ１１．２、またはＴ１１．３で免疫沈降させ、免疫沈降物細胞を標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動した。ゲル上の蛋白をフィルターに移し、次いで共通抗ＪＡＫキナーゼ抗血清（Ｒ８０）またはＪＡＫ−３特異的抗血清を用いて免疫ブロティングを行った。この免疫ブロティング実験の結果を図７に示す。この実験によって、Ｔ細胞アネルギーの逆転において、ＣＤ２のＴ１１．３発現形と１１６ｋＤのＪＡＫキナーゼには関連があることが明らかとなった（図７、左欄参照）。さらに、この１１６ｋＤのＪＡＫキナーゼはＪＡＫ−３キナーゼに特異的な抗血清を用いる免疫ブロッティングによってＪＡＫキナーゼであることが確認された（図７、右欄参照）。
等価物
【００８５】
当業者は、本明細書に記載の発明の特定の態様に対する多くの等価物は、認識するかまたはごく普通の実験法を用いるだけで確認することができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】一次刺激を受けた後、人工抗原提示細胞またはリンパ芽球様細胞系による再チャレンジ（攻撃）に応答して起こるＴ細胞の増殖とＩＬ−２の産生を示す一連の棒グラフである。
【図２】ＩＬ−２中での培養および人工抗原提示細胞またはリンパ芽球様細胞系による刺激で起こる、アネルギー化Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図３】ＩＬ−２中での培養、およびリンパ芽球様細胞系の細胞表面分子に対する抗体の存在下でのリンパ芽球様細胞系による刺激で起こる、アネルギー化Ｔ細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図４】ＩＬ−２中での培養および人工抗原提示細胞による刺激で起こる、アネルギー化Ｔ細胞の増殖とアネルギー化Ｔ細胞によるＩＬ−２産生とを示す棒グラフである。
【図５】一次刺激、ＩＬ−２内での増殖、二次刺激および人工抗原提示細胞もしくはリンパ芽球様細胞系による再チャレンジで起こる、Ｔ細胞の増殖とＩＬ−２産生を示す一連の棒グラフである。
【図６】ＴＣ−１細胞、アネルギー化ＴＣ−１細胞、およびＩＬ−２内で培養された後のアネルギー化ＴＣ−１細胞でのＣＤ２エピトープ類すなわちＴ11.1、Ｔ11.2およびＴ11.3の発現を示す一連のグラフである。
【図７】抗ＣＤ２抗体（Ｔ11.1、Ｔ11.2またはＴ11.3）で免疫沈澱させ次いでＪＡＫキナーゼ特異的抗血清（Ｒ80）（左側パネル）またはＪＡＫ−３キナーゼ特異的抗血清（右側パネル）で免疫ブロットさせたＴ細胞タンパク質の免疫ブロットフィルターの写真であり、Ｔ11.3発現型のＣＤ２とＪＡＫ−３キナーゼの会合を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原特異的Ｔ細胞の不応答性を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異的Ｔ細胞応答には、Ｔ細胞の細胞表面受容体と抗原提示細胞のリガンドとの間の多重相互作用が必要である。その第一の相互作用は、Ｔ細胞リセプター（受容体）／ＣＤ３複合体と主要組織適合性遺伝子複合体分子との間の相互作用であり、これは、Ｔ細胞受容体に抗原ペプチドを提示してＴ細胞中に抗原特異的シグナルをトリガー（誘発）する。この抗原特異的シグナルに加えて、Ｔ細胞応答には第二の共刺激シグナル（costimulatory signal）が必要である。共刺激シグナルは、細胞表面受容体ＣＤ28を通じてＴ細胞を刺激することによってＴ細胞中に生成させることができる（Harding、F.A.、Nature、356巻、607〜609頁、1992年）。ＣＤ28に対するリガンドは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に確認されている。ＣＤ28のリガンドとしては、Ｂ７−１およびＢ７−２などのＢ７ファミリーのタンパク質のメンバーがある（Freedman、A.S.ら、J.Immunol.、137巻、3260〜3267頁、1987年；Freeman、G.J.ら、J.Immunol.、143巻、2714〜2722頁、1989年；Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、174巻、625〜631頁、1991年；Freeman、G.J.ら、Science、262巻、909〜911頁、1993年；Azuma、M.ら、Nature、366巻、76〜79頁、1993年；Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、178巻、2185〜2192頁、1993年)。またこれらＢ７タンパク質類は、ＣＤ28に類縁のＣＴＬＡ４と呼称される、Ｔ細胞上の他の表面受容体と結合することも報告されているが、共刺激におけるＣＴＬＡ４の役割はまだ明らかになっていない（Linsley、P.S.、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年）。
【０００３】
共刺激シグナルがない場合に抗原特異的シグナルがＴ細胞に送達されてもＴ細胞応答を誘導することなくＴ細胞アネルギーと呼ばれる不応答の状態を誘導することが実証されている（Schwartz、R.H.、Science、248巻、1349頁、1990年；およびJenkins、M.K.ら、J.Immunol.、140巻、3324頁、1988年参照）。この現象に基づいて、抗原に対するＴ細胞の不応答を誘導する治療法すなわちＴ細胞における共刺激シグナルを遮断する方法が提案されている。例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質は、Ｂ７−１とＢ７−２の両者に結合してこれらのＣＤ28との相互作用を遮断するが、同種異系移植片および異種移植片に対する拒絶反応を抑制するのに使用されている（例えばTurka、L.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、89巻、11102〜11105頁、1992年；およびLenschow、D.J.ら、Science、257巻、789〜792頁、1992年参照）。あるいは、細胞（例えば腫瘍細胞）上の抗原に対するＴ細胞応答を刺激する治療法も提案されている。例えば、その表面にＣＤ28リガンドのＢ７−１を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、Ｔ細胞内の共刺激シグナルをトリガーすることが見出されている（例えば、Chen、L.ら、Cell、71巻、1093〜1102頁、1992年；Townsend、S.E.およびAllison、J.P.、Science、259巻、368〜370頁、1993年；ならびにBaskar、S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、90巻、5687〜5690頁、1993年参照）。
【０００４】
抗原特異的相互作用と共刺激相互作用に加えて、Ｔ細胞の他の多くの細胞表面受容体は、Ｔ細胞の活性化においてアクセサリー機能をはたすと考えられている（Clark、E.A.およびLedbetter、J.A.、Nature、367巻、425〜428頁、1994年に総説が記載されている）。このような細胞表面受容体の例としては、ＭＨＣクラスII抗原と相互作用するＣＤ４；ＭＨＣクラスI抗原と相互作用するＣＤ８；ＣＤ40Ｌ（gp39）と相互作用するＣＤ40；ＬＦＡ−１と相互作用するＩＣＡＭ−１；およびＬＦＡ−３（ＣＤ58としても知られている）と相互作用するＣＤ２（Selvaraj、P.ら、Nature、326巻、400〜403頁、1987年）がある。またＣＤ２は、ＣＤ48およびＣＤ59とも相互作用を行うが、ヒトのＬＦＡ−３との相互作用よりアフィニティが小さい（Arulanandam、A.R.ら、J.Exp.Med.、177巻、1439〜1450頁、1993年；およびSandrin、M.S.ら、J.Immunol.、151巻、4606〜4613頁、1993年）。
ＣＤ２は、胸腺細胞と成熟Ｔ細胞で発現される相対分子質量が50,000〜58,000の糖タンパク質である。ＣＤ２はヒツジの赤血球に結合し、これはＴ細胞Ｅロゼット形成の現象をもたらす特性である。Ｔ細胞のＣＤ２とＡＰＣのＬＦＡ−３との間の相互作用によって、Ｔ細胞の抗原認識が容易になり、その結果、抗原特異的Ｔ細胞応答が刺激される（例えば、Bierer、B.ら、J.Exp.Med.、168巻、1145頁、1988年；Moingeon、P.ら、Nature、339巻、312頁、1989年；Koyasu、S.らProc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、2603頁、1990年；Selvaraj、P.ら、Nature、326巻、400頁、1987年；およびBierer、B.ら、J.Immunol.、140巻、3358頁、1988年参照)。
この作用は、ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用によって仲介される、Ｔ細胞とＡＰＣ間の接着の強化に少なくとも一部は関与している。さらに、ＡＰＣなしで抗ＣＤ２抗体類の適当な組合わせを用いて、in vitroでＴ細胞を刺激してＴ細胞を増殖させＩＬ−２を分泌させることができることが実証されている［例えば、Meuer、S.ら、Cell、36巻、897頁、1984年；Feterson、A.ら、Nature、329巻、842頁、1987年；Yang、Y.S.ら、J.Immunol.、137巻、1097頁、1986年；およびW.Knappら編集（Oxford、1989年）「Leucocyte Typing IV, White cell differentiation antigens」270頁のS.C.Meuerの報告参照］。例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ２抗体Ｔ11.3と、他の２種の抗ＣＤ２抗体のうちの１種すなわちＴ11.2またはＴ11.1との組合わせを用いて活性化することができる。Ｔ11.3エピトープは「ネオ−エピトープ（neo-epitope）」であり、静止Ｔ細胞のＣＤ２上には現れず、Ｔ細胞が活性化されるとＣＤ２上には現れる（Meuer、S.ら、Cell、36巻、897頁、1984年）。ＣＤ２を用いるin vitro培養試験は、この表面受容体がＴ細胞−ＡＰＣの接着とＴ細胞の活性化に関与していることを示したが、ＣＤ２のどんな生理学的役割が、抗原に対するＴ細胞の応答に役立っているかは、これらの試験からは分からない。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第4,816,397号
【特許文献２】ヨーロッパ特許願公開第EP171496号
【特許文献３】ヨーロッパ特許願公開第0173494号
【特許文献４】英国特許第GB2177096B号
【特許文献５】ＰＣＴ特許願公開第WO92/06193号
【特許文献６】ＥＰ第0239400号
【特許文献７】米国特許第5,116,964号
【特許文献８】国際特許願公開第WO89/10938号
【特許文献９】国際特許願公開第WO90/08187号
【特許文献１０】国際特許願公開第WO92/16622号
【特許文献１１】米国特許第4,816,567号
【非特許文献１】Harding、F.A.、Nature、356巻、607〜609頁、1992年
【非特許文献２】Freedman、A.S.ら、J.Immunol.、137巻、3260〜3267頁、1987年
【非特許文献３】Freeman、G.J.ら、J.Immunol.、143巻、2714〜2722頁、1989年
【非特許文献４】Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、174巻、625〜631頁、1991年
【非特許文献５】Freeman、G.J.ら、Science、262巻、909〜911頁、1993年
【非特許文献６】Azuma、M.ら、Nature、366巻、76〜79頁、1993年
【非特許文献７】Freeman、G.J.ら、J.Exp.Med.、178巻、2185〜2192頁、1993年
【非特許文献８】Linsley、P.S.ら、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年
【非特許文献９】Schwartz、R.H.ら、Science、248巻、1349頁、1990年
【非特許文献１０】Jenkins、M.K.ら、J.Immunol.、140巻、3324頁、1988年
【非特許文献１１】Turka、L.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、89巻、11102〜11105頁、1992年
【非特許文献１２】Lenschow、D.J.ら、Science、257巻、789〜792頁、1992年
【非特許文献１３】Chen、L.ら、Cell、71巻、1093〜1102頁、1992年；Townsend、S.E.およびAllison、J.P.、Science、259巻、368〜370頁、1993年
【非特許文献１４】Baskar、S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、90巻、5687〜5690頁、1993年
【非特許文献１５】Clark、E.A.およびLedbetter、J.A.、Nature、367巻、425〜428頁、1994年
【非特許文献１６】Arulanandam、A.R.ら、J.Exp.Med.、177巻、1439〜1450頁、1993年
【非特許文献１７】Sandrin、M.S.ら、J.Immunol.、151巻、4606〜4613頁、1993年
【非特許文献１８】Bierer、B.ら、J.Exp.Med.、168巻、1145頁、1988年
【非特許文献１９】Moingeon、P.ら、Nature、339巻、312頁、1989年
【非特許文献２０】Koyasu、S.らProc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、2603頁、1990年
【非特許文献２１】Selvaraj、P.ら、Nature、326巻、400頁、1987年
【非特許文献２２】Bierer、B.ら、J.Immunol.、140巻、3358頁、1988年
【非特許文献２３】W.Knappら編集（Oxford、1989年）「Leucocyte Typing IV, White cell differentiation antigens」270頁のS.C.Meuerの報告
【非特許文献２４】Sanchez-Madrid、F.、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982
【非特許文献２５】Kato、K.ら、Eur.J.Immunol.、23巻、1412頁、1993年
【非特許文献２６】Deckert、M.ら、Eur.J.Immunol.、22巻、2943〜2947頁、1992年
【非特許文献２７】Kozbarら、Immunol. Today、４巻、72頁、1983年
【非特許文献２８】Allen R.編集、Bliss Inc.発行の「Cancer Therapy」、77〜96頁のColeらの報告（1985年）「Monoclonal Antibodies」
【非特許文献２９】Wardら、Nature、341巻、544〜546頁、1989年
【非特許文献３０】Huseら、Science、246巻、1275〜1281頁、1989年
【非特許文献３１】McCaffertyら、Nature、348巻、552〜554頁、1990年
【非特許文献３２】Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、81巻、6851頁、1985年
【非特許文献３３】Takedaら、Nature、314巻、452頁、1985年
【非特許文献３４】Tengら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、80巻、7308〜7312頁、1983年
【非特許文献３５】Kozborら、Immunology Today、４巻、7279頁、1983年
【非特許文献３６】Olssonら、Meth. Enzymol.、92巻、３〜16頁、1982年
【非特許文献３７】Tanら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、162〜166頁、1990年
【非特許文献３８】DuncanおよびWinter、Nature、332巻、738〜740頁、1988年
【非特許文献３９】Canfield、S.M.およびS.L.Morrison、J.Exp.Med.、173巻、1483〜1491頁、1991年
【非特許文献４０】Lund、J.ら、J.Immunol.、147巻、2657〜2662頁、1991年
【非特許文献４１】Pepinsky、R.B.ら、J.Biol.Chem.、266巻、18244〜18249頁、1991年
【非特許文献４２】Seed、B.およびAruffo、A.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、3365〜3369頁、1987年
【非特許文献４３】Wallner、B.P.ら、J.Exp.Med.、166巻、923〜932頁、1987年
【非特許文献４４】Seed、B.、Nature、329巻、840〜842頁、1987年
【非特許文献４５】Korinek、Vら、Immunogenetics、33巻、108〜112頁、1991年
【非特許文献４６】Sawada、R.ら、DNA Cell.Biol.、９巻、213〜220頁、1990年
【非特許文献４７】Capon、D.J.ら、Nature、337巻、525〜531頁、1989年
【非特許文献４８】Howard、F.D.ら、J.Exp.Med.、176巻、139〜145頁、1992年
【非特許文献４９】Strejanら、J.Neuroimmunol.、７巻、27頁、1984年
【非特許文献５０】Damle、N.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、78巻、5096〜5100頁、1981年
【非特許文献５１】Hathcock、K.S.、Science、262巻、905〜907頁、1993年
【非特許文献５２】Linsleyら、J.Exp.Med.、173巻、721〜730頁、1991年
【非特許文献５３】Aruffo、A.およびSeed、B.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、8573〜8577頁、1987年
【非特許文献５４】Dariavach、P.ら、Eur.J.Immunol.、18巻、1901〜1905頁、1988年
【非特許文献５５】Sambrookらの、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）
【非特許文献５６】Eglitis,M.A.ら（1985）、Science 23:1395-1398
【非特許文献５７】Danos,O.およびMulligan,R.（1988）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464
【非特許文献５８】Markowitz,D.ら（1988）、J.Virol.62:1120-1124
【非特許文献５９】Rosenfeld,M.A.ら（1992）、Cell 68:143-155
【非特許文献６０】Tratschin,J.D.ら（1985）、Mol.Cell.Biol.5:3251-3260
【非特許文献６１】Kanfmanら、EMBO 6,187-195(1987)
【非特許文献６２】Meuer,S.C.ら（1984）、Cell 36:897-906
【非特許文献６３】Yang,S.Y.ら（1986）、J.Immunol.137:1097-1100
【非特許文献６４】J.Goronzyら（1987）、Methods Enzymol.150:333
【非特許文献６５】C.D.Gimmiら（1993）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6586
【非特許文献６６】R.I.Toddら、Hum.Immunol.10:23（1984）
【非特許文献６７】E.Clarkら、Leukocyte Typing中、A.Bernardら編、（Springer-Verlang,Berlin Heidelberg,1984、339頁
【非特許文献６８】C.S.Abramsonら（1981）、J.Immunol.126:83
【非特許文献６９】B.Dorkenら、Leucocyte Typing IV White cell differentiation antigens, W.Knappら編（Oxford,1989）、99頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は抗原特異的Ｔ細胞の不応答性を調節する方法に関する。本発明には、細胞表面受容体を通じて不応答性Ｔ細胞を阻害または刺激することによって、Ｔ細胞の不応答性を維持または逆転させる方法が含まれる。抗原に対し不応答性にされた抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ２などの細胞表面受容体を通じて刺激することによって、抗原に対する応答能を回復できることが発見されたのである。したがって、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞不応答性（Ｔ細胞アネルギーとも呼称される）を逆転させる際のＣＤ２の機能的役割を開示するものである。
【０００７】
本発明の一実施態様では、アネルギー化されたＴ細胞（anergized T cell）を、ＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子と接触させることによってＴ細胞アネルギーが維持される。ＣＤ２阻害因子としては、ＣＤ２とＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３、ＣＤ48またはＣＤ59）の間の相互作用を阻害する因子がある。このような因子としては、阻止抗体類、可溶型のＣＤ２とＣＤ２リガンド類、ペプチド類および小分子類がある。あるいは、ＣＤ２阻害因子は細胞内で作用して、ＣＤ２を通じてＴ細胞内でトリガーされる細胞内シグナルを阻害する。本発明の他の実施態様では、アネルギー化されたＴ細胞を、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激する因子と接触させることによってＴ細胞アネルギーが逆転される。ＣＤ２刺激因子としては、その表面にＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３、ＣＤ48またはＣＤ59）を発現する細胞、多価型のＣＤ２リガンドおよび刺激性抗ＣＤ２抗体がある。あるいは、ＣＤ２刺激因子は細胞内で作用してＣＤ２を通じてシグナルをトリガーしてもよい。
【０００８】
本発明の方法は、例えば、抗原特異的Ｔ細胞不応答性を維持するかまたは抗原特異的Ｔ細胞不応答性を回復して抗原特異的免疫応答を調節することが望ましい状況の場合の治療に有用である。例えば、臓器または骨髄の移植を受けた被験者には、ＣＤ２を介する刺激を阻害することによって、Ｔ細胞不応答性を維持して移植片拒絶反応を阻害することが必要である。さらに、Ｔ細胞の不応答性は、自己免疫疾患が見られる被験者におけるＣＤ２刺激を遮断することによって維持され、自己免疫疾患の症状を軽減することができる。これらの症例では、ＣＤ２阻害因子は、Ｔ細胞不応答性を維持するのに充分な量でかつ充分な期間にわたって被験者に投与される。あるいは、腫瘍をもっている被験者には腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激するために、またはワクチンを受けている被験者にはそのワクチンの効力を高めるために、Ｔ細胞不応答性を逆転させることができる。例えば、細胞（例えば腫瘍細胞）はＣＤ２リガンドを発現するよう修飾することができ、またはＣＤ２刺激因子を、腫瘍をもっている被験者もしくは腫瘍の再発を防止するため外科手術で腫瘍を除去した被験者に投与することができる。さらに、抗原特異的応答性は、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激することによって、アネルギー化Ｔ細胞をin vitroで回復させることができる。この場合、in vitroで生成された応答性Ｔ細胞を被験者に投与することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は抗原特異的Ｔ細胞の不応答性の調節方法に関する。「Ｔ細胞不応答性」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞が不応答性になった抗原（または抗原部分）に対してＴ細胞が暴露されたときのＴ細胞の増殖、リンホカインの分泌またはＴ細胞によるエフェクター機能の誘導の低下もしくは欠除を意味する。「Ｔ細胞不応答性」と「Ｔ細胞アネルギー」の用語は本明細書では相互に交換可能に使用される。本発明の方法は、in vitroまたはin vivoで抗原に対するＴ細胞の不応答性を維持または逆転させる手段を提供するものである。不応答性Ｔ細胞は、例えば共刺激シグナルなしで抗原に暴露されることによってＴ細胞不応答性またはＴ細胞アネルギーが誘導された細胞である。Ｔ細胞不応答性の誘導はＴ細胞アネルギーの状態の初期樹立を意味する。Ｔ細胞アネルギーは、例えば、共刺激シグナルなしで、例えば抗原提示細胞のＭＨＣ関連抗原ペプチドで、Ｔ細胞内に抗原特異的シグナルをトリガーすることによって誘導することができる。したがって、本発明の方法は、アネルギーＴ細胞（すなわち、不応答性またはアネルギーがすでに誘導されているか樹立されている細胞）の抗原特異的Ｔ細胞不応答性を調節するのに特に有用である。「調節」という用語は、不応答状態の維持（すなわち継続しているＴ細胞アネルギー）および不応答状態の逆転（すなわちＴ細胞応答性の回復）の両者の維持を含むものとする。
【００１０】
本発明の方法は、アネルギー化Ｔ細胞を阻害または刺激する因子を使用してＴ細胞のアネルギーを維持するかまたは逆転させる。本発明は、少なくともその発明の一部は、例えば共刺激シグナルなしで抗原特異的シグナルを受けることによって抗原に対し不応答性になったＴ細胞を刺激して、抗原に対して応答する性能を回復させることができるという発見に基づいている。アネルギー化Ｔ細胞の抗原特異的応答性は、該Ｔ細胞を、抗原の存在下、ＣＤ２などの表面受容体を通じて刺激することによって回復させることができる。したがって本発明の一実施態様では、Ｔ細胞の不応答性は、アネルギー化Ｔ細胞を、ＣＤ２を介するＴ細胞の刺激を阻害する因子と接触させることによって維持される。これとは対照的に、Ｔ細胞不応答性を逆転させる方法では、アネルギー化Ｔ細胞を、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激する因子と接触させる。これらの方法は各々、以下の文節で詳細に考察する。
I．Ｔ細胞の不応答性を維持する方法
【００１１】
本発明の一態様は、Ｔ細胞アネルギーが誘導されそして抗原に対する不応答性状態を保持することが望ましいという治療状況に特に有用なＴ細胞不応答性を維持する方法に関する。このような治療状況の例としては、臓器および骨髄の移植片などの同種異系または異種の細胞または組織の受容者（レシピエント）および自己免疫疾患が見られる被験者がある。これらの状況の場合、治療計画は、治療すべき被験者に抗原特異的Ｔ細胞不応答性の状態を誘導することであった。例えば因子ＣＴＬＡ４Ｉｇを用いて、Ｔ細胞内の共刺激シグナルを阻害することによって、抗原特異的Ｔ細胞不応答性を被験者に誘導することができる（例えば、Turka、L.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、89巻、11102〜11105頁、1992年；およびLenschow、D.J.ら、Science、257巻、789〜792頁、1992年参照）。
【００１２】
本発明のこの実施態様では、抗原に対するＴ細胞の不応答性は、Ｔ細胞を、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子と接触させることによって維持される。ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子は、前記定義のようなＴ細胞不応答性が維持される限り、ＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を完全に遮断することもあり、またはＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を部分的に阻害することもある。一実施態様では、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子（本明細書ではＣＤ２阻害因子と呼ぶ）は、ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用を遮断することによって作用する。その因子は、ＣＤ２とそのリガンドすなわちＬＦＡ−３（ＣＤ58）との相互作用を阻害することが好ましい。あるいはその因子は、ＣＤ２と他のリガンド例えばＣＤ48またはＣＤ59との相互作用を阻害する。ＣＤ２とＣＤ２リガンドの間の相互作用を遮断または阻害するのに使用できる因子としては、ＣＤ２またはＣＤ２リガンドに結合する抗体類（例えば阻止抗体類）；ＣＤ２リガンドとの結合能を保持している可溶型のＣＤ２（例えばトランスメンブラン（貫膜）ドメインと細胞質ドメインを欠いている先端切断形の分子、または可溶型の融合タンパク質、例えば免疫グロブリン融合タンパク質）；ＣＤ２との結合能を保持している可溶型のＣＤ２リガンド（例えばトランスメンブランドメインと細胞質ドメインを欠いている先端切断形の分子または可溶性融合タンパク質例えば免疫グロブリン融合タンパク質）；ＣＤ２とＣＤ２リガンドの相互作用を阻害するペプチド類；ならびにＣＤ２とＣＤ２リガンドの相互作用を阻害する低分子がある。あるいは、ＣＤ２阻害因子は、細胞内で作用して、ＣＤ２経由でトリガーされる細胞内シグナルを阻害してもよい。これらのＣＤ２阻害因子は各々、以下に詳細に説明する。
Ａ．阻止抗体類
【００１３】
一実施態様で、ＣＤ２阻害因子は、ＣＤ２に結合する抗体（すなわち抗ＣＤ２抗体）またはＣＤ２リガンドに結合する抗体（すなわち抗ＣＤ２リガンド抗体）であり、これら抗体はＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を実質的に遮断または阻害する（すなわち阻止抗体）。抗ＣＤ２阻止抗体は当該技術分野で報告されており（例えばＴＳ２／18；例えばSanchez-Madrid、F.、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982年参照）かつ市販されている（例えば米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー所在のBecton Dickinson社から入手できるanti-Leu５）。
抗ＣＤ２リガンド抗体類としては、抗ＬＦＡ−３抗体類、抗ＣＤ48抗体類および抗ＣＤ59抗体類がある。ＣＤ２とＬＦＡ−３の相互作用を実質的に遮断または阻害するために使用できる抗ＬＦＡ−３抗体類は当該技術分野で公知である（例えばＴＳ２／９がある。例えばSanchez-Madrid、F.、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982年参照）。抗ＣＤ48阻止抗体類（例えばSandrin、M.S.、J.Immunol.、151巻、4606頁、1993年；およびKato、K.ら、Eur.J.Immunol.、23巻、1412頁、1993年参照）および抗ＣＤ59阻止抗体類（例えばDeckert、M.ら、Eur.J.Immunol.、22巻、2943〜2947頁、1992年参照）も当該技術分野で公知である。
【００１４】
さらに、ＣＤ２またはＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３）に対する抗体類は通常の方法で製造することができる。抗体類はポリクローナル抗体でもよいがむしろモノクローナル抗体の方が好ましい。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体は当該技術分野で公知の標準的方法で製造することができる。例えば哺乳類（例えばマウス、ハムスターまたはウサギ）は、抗原（例えばＣＤ２またはＣＤ２リガンド）によって免疫することができ、例えば精製タンパク質、組換えタンパク質もしくはそのペプチドフラグメント、またはその抗原を発現して（例えば細胞表面にＣＤ２もしくはＣＤ２リガンドを発現して）その哺乳類に抗原に対する抗体反応を引き起こす細胞で免疫することができる。あるいは、抗原を発現する組織または全臓器も抗体を誘導するのに使用できる。免疫化の経過は、血漿中または血清中の抗体価を検出することによって監視することができる。標準的ＥＬＩＳＡ法やその他の免疫検定法を抗原とともに用いて抗体のレベルを評価することができる。免疫後、抗血清を得、次に所望によりその血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を製造するためには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から採取し、次いで標準の体細胞融合法で骨髄腫細胞と融合させ、次にこれら細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を得る。このような技術は当該技術分野で公知である。例えばKohlerとMilsteinが最初に開発したハイブリドーマ法（Nature、256巻、495〜497頁、1975年）と、その外の方法、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbarら、Immunol. Today、４巻、72頁、1983年）およびヒトモノクローナル抗体類を製造するＥＢＶ−ハイブリドーマ法［Allen R.編集、Bliss Inc.発行の「Cancer Therapy」、77〜96頁のColeらの報告（1985年）「Monoclonal Antibodies」］を使用することができる。ハイブリドーマ細胞を、免疫化学的に抗原と特異的に反応する抗体の産生についてスクリーニングし、次いでモノクローナル抗体を単離することができる。
【００１５】
ＣＤ２またはＣＤ２リガンドに反応する特異的抗体類または抗体フラグメント類の他の製造方法は、細菌中に発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーを抗原（またはその一部）によってスクリーニングする方法である。例えば、完全Ｆａｂフラグメント類、ＶＨ領域類、ＦＶ領域類および一本鎖抗体類は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌中に発現させることができる（例えばWardら、Nature、341巻、544〜546頁、1989年；Huseら、Science、246巻、1275〜1281頁、1989年；およびMcCaffertyら、Nature、348巻、552〜554頁、1990年参照）。あるいは、抗体またはそのフラグメントを製造するため、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスを用いることができる。
【００１６】
「抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、所望の機能特性、例えばＣＤ２とＣＤ２リガンドとの相互作用を阻害する性能を保持する抗体のフラグメントを含むものとする。抗体類は通常の方法を用いてフラグメントにすることができ、これらのフラグメントは、完全な抗体について先に述べたのと同じ方法で、その有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ab')２フラグメントは抗体をペプシンで処理することによって製造することができる。得られたＦ(ab')２フラグメントは、処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆab'フラグメントを産生することができる。
【００１７】
用語「抗体」はさらに、所望の機能特性、例えばＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害する性能を保持する抗体の誘導体を含むものとする。抗体誘導体としては、キメラ分子類、ヒト化分子類、エフェクター機能を低下させた分子類および二重特異性分子類がある。ヒト以外の動物で産生した抗体またはそのフラグメントは、ヒト被験者に投与すると、種々の程度で外来物として認識される可能性があり、そのヒト被験者中にその抗体に対する免疫応答が生成する。この問題を最小にするか、なくする一つの方法は、キメラまたはヒト化の抗体誘導体すなわち非ヒト抗体由来の部分およびヒト抗体由来の部分を含んでなる抗体分子を製造する方法である。キメラ抗体分子は、例えばマウス、ラットなどの種の抗体由来の可変領域をヒトの定常領域とともに含有していてもよい。キメラ抗体の各種製造方法は報告されている（例えば、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、81巻、6851頁、1985年；Takedaら、Nature、314巻、452頁、1985年；Cabillyらの米国特許第4,816,567号；Bossらの米国特許第4,816,397号；Tanaguchiらのヨーロッパ特許願公開第EP171496号、同第0173494号および英国特許第GB2177096B号参照）。さらなる変形例では、ヒト化抗体は、非ヒト起源の可変領域の超可変領域だけを有し、その抗体の可変領域の残りの部分、特に抗原結合領域の保存フレームワーク領域はヒト起源のものである。このようなヒト化抗体は当該技術分野で公知のいくつもの方法のいずれかで製造することができ（例えば、Tengら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、80巻、7308〜7312頁、1983年；Kozborら、Immunology Today、４巻、7279頁、1983年；Olssonら、Meth. Enzymol.、92巻、３〜16頁、1982年参照）、好ましくはＰＣＴ特許願公開第WO92/06193号またはＥＰ第0239400号の教示にしたがって製造される。ヒト化抗体は、例えば英国ミドルセックス州ツイッケンハム、ホリーロード２に所在のScotgen Limited社が商業的に製造している。
【００１８】
治療に用いる場合、抗体の製剤は補体と結合できず、かつ他のエフェクター機能も誘導できないことが好ましい。補体結合は、補体を結合できない抗体アイソタイプを用いるか、または余り好ましくはないが補体結合を阻害する薬剤とともに補体結合抗体を用いるなどして、抗体のＦＣ部分を欠落させることにより防止することができる。あるいは、補体を活性化するのに重要なＦＣ領域内のアミノ酸残基（例えば、Tanら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、87巻、162〜166頁、1990年；ならびにDuncanおよびWinter、Nature、332巻、738〜740頁、1988年を参照）を変異させて完全な抗体の補体活性化能を低下させるかまたは除去することができる。同様に、完全抗体を使用する場合、ＦＣ領域がＦＣ受容体に結合するのに重要なＦＣ領域内のアミノ酸残基（例えば、Canfield、S.M.およびS.L.Morrison、J.Exp.Med.、173巻、1483〜1491頁、1991年；およびLund、J.ら、J.Immunol.、147巻、2657〜2662頁、1991年参照）も変異させて、ＦＣ受容体の結合を減少させるかまたは除去することができる。
【００１９】
ＣＤ２またはＣＤ２リガンドに結合する抗体の遮断活性または阻害活性は通常の方法によって評価することができる。例えば、活性化Ｔ細胞の増殖および／または活性化Ｔ細胞によるリンホカインの分泌、を阻害する上記抗体の性能は、in vitroのＴ細胞培養系で測定することができる（例えばSanchez-Madrid、F.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、79巻、7489頁、1982年参照）。あるいは、Ｔ細胞Ｅロゼット形成検定法を用いて、ＣＤ２のヒツジ赤血球との結合の阻害を評価することができる（適切な検定法は、Pepinsky、R.B.ら、J.Biol.Chem.、266巻、18244〜18249頁、1991年に記載されている）。
Ｂ．可溶型の受容体類とリガンド類
【００２０】
本発明の他の方法では、その結合特異性を保持している可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドであるＣＤ２阻害因子が用いられる。可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドを用いて、細胞の表面におけるＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を競合的に阻害することができる。可溶型のＣＤ２リガンド例えばＣＤ48、ＣＤ59または好ましくはＬＦＡ−３（ＣＤ58）を用いて、ＣＤ２を介してＴ細胞刺激を阻害することができる。
【００２１】
一つの実施態様では、可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは、先端切断型の分子であり、その分子の細胞外領域またはその機能部分を含有している。ＣＤ２リガンドとの結合能を保持しているＣＤ２の細胞外領域の一部分を使用することができる。同様に、ＣＤ２に結合する性能を保持しているＣＤ２リガンドの細胞外領域の一部分も使用できる。可溶性の先端切断型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは標準の組換えＤＮＡ法を用いて得ることができる。例えば、分子の細胞外領域またはその機能部分をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターを、宿主細胞が該細胞外領域を発現し分泌するのに適した形態で宿主細胞中に導入し、次に培養培地から細胞外領域（またはその一部）を単離することによって得ることができる。
【００２２】
組換え先端切断型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列に基づいて、標準の方法によって設計することができる。ヒトＣＤ２をコードするヌクレオチド配列は、Seed、B.およびAruffo、A.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、3365〜3369頁、1987年に開示されている。二つの型のＬＦＡ−３分子が、典型的なトランスメンブランタンパク質を含めて報告されている。トランスメンブラン型のＬＦＡ−３をコードするヌクレオチド配列は、Wallner、B.P.ら、J.Exp.Med.、166巻、923〜932頁、1987年に記載されている。第二の形態は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）連結タンパク質である。この型のＬＦＡ−３をコードするヌクレオチド配列は、Seed、B.、Nature、329巻、840〜842頁、1987年に開示されている。上記ＧＰＩ連結型のＬＦＡ−３は、リン脂質のテール（尾部）によって細胞膜に固定されている。したがって可溶型のＬＦＡ−３は、例えばこのタンパク質の細胞外領域を組換え発現させるか、またはＧＰＩ連結型のリン脂質テールを（例えばホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣを用いて）この連結型のＬＦＡ−３を発現する細胞の表面から切断して可溶型のＬＦＡを放出させることによって得ることができる。他のＣＤ２リガンドであるＣＤ48は典型的なトランスメンブランタンパク質である。ＣＤ48をコードするヌクレオチド配列は、Korinek、Vら、Immunogenetics、33巻、108〜112頁、1991年に記載されている。ＧＰＩ連結型のＬＦＡ−３と同様に、他のＣＤ２リガンドであるＣＤ59は、ホスファチジルイノシトールで固定されたメンブランタンパク質である。したがってＣＤ59は、ホスホリパーゼで処理することによって、このリガンドを発現する細胞の表面から切り取り可溶型のＣＤ59を得ることができる。あるいは、ＣＤ59の細胞外領域は組換え法によって発現させることもできる。ヒトＣＤ59をコードするヌクレオチド配列は、Sawada、R.ら、DNA Cell.Biol.、９巻、213〜220頁、1990年に開示されている。
【００２３】
本発明の方法に用いる他の可溶型のＣＤ２またはＣＤ２リガンドは融合タンパク質である。用語「融合タンパク質」は、本明細書で用いる場合、連続アミノ酸配列の第一タンパク質由来の第一ポリペプチドと、第二タンパク質由来の第二ポリペプチドとで構成されたタンパク質を意味する。融合タンパク質は、第一ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、第二ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にインフレーム（読み取り枠内）で結合し、次いでこれらヌクレオチド配列を（例えば宿主細胞中に導入する組換え発現ベクターを用いて）発現させて融合タンパク質を産生する標準的組換えＤＮＡ法で製造することができる。好ましい融合タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖の定常部（例えばＩｇＧ１などのヒト免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域）に連結されたＣＤ２またはＣＤ２リガンドの細胞外領域または機能部分を含有する免疫グロブリン融合タンパク質である。免疫グロブリン融合タンパク質は、例えばCapon、D.J.ら、Nature、337巻、525〜531頁、1989年およびCapronとLaskyの米国特許第5,116,964号の教示にしたがって製造することができる。
【００２４】
本明細書に記載の方法に用いる他の可溶型のＣＤ２リガンドとしてはミセルに組込まれたＧＰＩ連結ＣＤ２リガンドがある。メンブランに固定するためホスファチジルイノシトールの脂質テールを含有するＣＤ２リガンド（例えばＬＦＡ−３またはＣＤ59）はＧＰＩ連結型として単離してミセル中に組込むことができる。したがってＬＦＡ−３またはＣＤ59を含有するミセルは、ＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害するのに用いることができる。ＬＦＡ−３またはＣＤ59を含有するミセルは国際特許願公開第WO89/10938号に記載されているようにして製造することができる。
【００２５】
本発明の他の実施態様では、可溶型のＣＤ２リガンドは多価型のリガンドであり例えば二量体（ダイマー）、三量体（トリマー）または四量体（テトラマー）である。ＬＦＡ−３の多量体（マルチマー）は、Ｔ細胞Ｅロゼット形成検定法で、ＬＦＡ−３／ＣＤ２相互作用を遮断または阻害する活性が高いことが報告されている（Pepinsky、R.B.ら、J.Biol.Chem.、266巻、18244〜18249頁、1991年参照）。またＣＤ２リガンドのモノマーも、Pepinskyらの前掲文献に記載されているようにして化学的に架橋させて多量体を製造することができる。
Ｃ．ペプチド類と低分子類
【００２６】
Ｔ細胞の不応答性を維持するのに用いるＣＤ２阻害因子としてはさらに、ＣＤ２とＣＤ２リガンドの相互作用を阻害または実質的に遮断するペプチド類と低分子類がある。例えば、受容体またはリガンドとの結合能を保持し、かつメンブラン結合受容体とリガンドとの相互作用を阻害する、ＣＤ２またはＣＤ２リガンドのペプチドフラグメントは本発明の方法に使用することができる。ＬＦＡ−３結合領域を含有するＣＤ２のペプチドフラグメントは国際特許願公開第WO90/08187号に開示されている。あるいは、国際特許願公開第WO92/16622号に開示されているようなＣＤ２結合領域を含有するＬＦＡ−３のペプチドフラグメントも使用できる。他の適切なペプチドを製造し、そのペプチドの、例えばin vitroＴ細胞培養系における活性化Ｔ細胞の増殖および／または活性化Ｔ細胞によるリンホカインの分泌を阻害するペプチドの性能について、またはペプチドがＴ細胞Ｅロゼット形成を阻害する性能について調べることにより、ＣＤ２／ＣＤ２リガンド相互作用を阻害する性能を検定することができる。
【００２７】
また本発明には、ＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害してＴ細胞の不応答性を維持する低分子類の使用が含まれる。例えば、ＣＤ２のＬＦＡ−３結合領域またはＬＦＡ−３のＣＤ２結合領域（既述）を含有するペプチドの構造によく似た低分子類が使用できる。ペプチドのアミノ酸配列に基づいてこのような「ペプチド様物質」を設計する方法は当該技術分野で公知である。あるいは、in vitroＴ細胞培養系またはＴ細胞Ｅロゼット形成検定法を用いてＣＤ２／ＣＤ２リガンド相互作用を阻害する低分子類を選別することができる。
Ｄ．細胞内ＣＤ２阻害因子類
【００２８】
細胞外で作用してＣＤ２とＣＤ２リガンド間の相互作用を阻害する因子の代わりに、ＣＤ２阻害因子は、細胞内で作用して、ＣＤ２表面受容体を通じてＴ細胞内でトリガーされる細胞内シグナルを阻害するものであってもよい。Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体を経由する細胞内シグナリングは、ＣＤ３複合体を通じて特にＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ zeta chain）によって仲介される（Howard、F.D.ら、J.Exp.Med.、176巻、139〜145頁、1992年参照）。このシグナルトランスダクション経路によって誘導される細胞内シグナルとしては、プロテイントリプシンキナーゼ活性、プロテインキナーゼＣ活性および細胞内の細胞質ゾル遊離カルシウムの増大がある。したがって、ＣＤ２を通じてＴ細胞を刺激することによって誘導されるこれら細胞内シグナルの一つ以上を阻害する因子は、ＣＤ２阻害因子として使用してＴ細胞不応答性を維持することができる。
【００２９】
さらに、ＣＤ２を介する刺激によってＴ細胞アネルギーを逆転させると、トリプシンキナーゼＪＡＫ−３とＣＤ２の結合およびＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化が付随して起こる（実施例６参照）。したがってＴ細胞アネルギーを保持するため、ＪＡＫ−３活性を阻害してもよい。したがって、ＣＤ２阻害因子には、ＪＡＫ−３キナードの細胞内活性を阻害する因子でもよく、例えばＪＡＫ−３キナーゼとＣＤ２の結合を阻害しおよび／またはＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化を阻害する因子がある。
Ｅ．Ｔ11.3ネオ−エピトープの露出の阻害
【００３０】
以上述べた、Ｔ細胞の不応答性を維持する方法において、ＣＤ２表面受容体のＴ11.3ネオ−エピトープの露出を阻害することも必要であろう。「Ｔ11.3ネオ−エピトープ」は、ＣＤ２分子上のエピトープであり、Ｔ11.3抗体によって認識される（すなわちこの抗体が結合する）。Ｔ細胞アネルギーの誘導は、アネルギー化Ｔ細胞のＣＤ２上のＴ11.3ネオ−エピトープのダウンモジュレーション（すなわち発現の低下または欠除）が関連していることが見出された。同様にＴ細胞アネルギーの逆転は、ＣＤ２のＴ11.3エピトープの再露出に関連していることも見出された（実施例５参照）。Ｔ細胞の不応答性を維持するには、Ｔ細胞のＣＤ２内のＴ11.3ネオ−エピトープの露出を阻害することが必要であろう。アネルギー化Ｔ細胞のＴ11.3ネオ−エピトープの露出を刺激することが見出された因子はＩＬ−２などのＴ細胞成長因子である。したがってＴ細胞の不応答性を維持するために、Ｔ細胞成長因子の産生または機能を阻害する因子を用いることができる。Ｔ細胞のアネルギーを維持するのに用いる好ましい因子はＩＬ−２の産生または機能を阻害する。したがって、ＣＤ２を介してＴ細胞の刺激を阻害する第一因子とともに、ＩＬ−２の機能を阻害する第二因子、例えば抗ＩＬ−２抗体または抗ＩＬ−２受容体抗体をＴ細胞に接触させることが必要である。
Ｆ．ＣＤ２阻害因子（物質）の使用
【００３１】
ＣＤ２阻害因子は、臓器または骨髄の移植に対する拒絶反応を抑制し、骨髄移植時の移植片対宿主病を抑制し、または被験者の自己免疫疾患を治療するなどの治療目的のため被験者に投与することができる。したがって、本発明は、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞の刺激を阻害する因子を被験者に投与する、抗原に対するＴ細胞不応答性を被験者に維持する方法を提供するものである。「被験者（対象）」という用語には、免疫応答を起こすことができる生きている生物例えば哺乳類が含まれるものとする。被験者の例としては、ヒト、サル類、イヌ類、ネコ類、マウス類、ラット類およびこれらの遺伝子導入（トランスジェニック）種がある。
【００３２】
ＣＤ２阻害因子は、被験者にＴ細胞不応答性を維持するのに充分な量と時間でin vivoで医薬として投与するのに適した生物学的に適合した形態で被験者に投与される。「in vivoで投与するのに適した生物学的に適合した形態」という用語は、ＣＤ２阻害因子の治療作用が毒作用よりまさった状態で投与される該因子の形態を意味する。本明細書で述べるＣＤ２阻害因子の投与は、治療上有効な量の因子を単独でまたは医薬として許容される担体中に含有する医薬形態で行う投与である。ＣＤ２阻害因子の治療上有効な量の投与とは、所望の効果（例えばＴ細胞不応答性の維持）を達成するのに必要な投与と期間における有効量と定義する。例えば、ＣＤ２阻害因子の治療上有効な量は、個体の病状、年齢、性別および体重のような要因ならびに個体に所望の応答を起こす因子の性能によって変化することがある。投与計画は最適の治療応答を提供するため調節することができる。例えば、いくつかの分割した投与量を毎日投与してもよく、または治療状態の緊急性によって指示されるように比例して投与量を減らしてもよい。
【００３３】
ＣＤ２阻害因子は便利な方法で投与することができ、便利な投与方法は、例えば注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮塗布または直腸投与による方法である。投与経路によって、活性化合物は、その化合物を不活性にすることがある酵素、酸および他の自然条件の作用から保護するためある種の物質でコーティングしてもよい。
【００３４】
非経口投与以外の方法でＣＤ２阻害因子を投与するには、該因子の不活性化を防止するためある種の物質で該因子をコーティングするかまたはその物質を該因子とともに投与することが必要な場合がある。例えば、ＣＤ２阻害因子は、適当な担体または希釈剤中に入れて個体に投与してもよく、酵素阻害剤とともに投与してもよく、またはリポソームのような適当な担体中に入れて投与してもよい。医薬として許容される希釈剤としては食塩水と緩衝水溶液がある。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）およびトラジロール（trasylol）がある。リポソームとしては、通常のリポソームのみならず水中油中水型エマルジョンがある（Strejanら、J.Neuroimmunol.、７巻、27頁、1984年）。
【００３５】
また活性化合物は非経口または腹腔内で投与してもよい。また分散液は、グリセリン、液状ポリエチレングリコール類およびその混合物ならびに油で製造することができる。貯蔵と使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防止するため保存剤を含有していてもよい。
【００３６】
注射用に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは滅菌水性分散液、および滅菌された注射用の溶液、または分散液を必要に応じて調製するのに用いる滅菌粉末がある。いずれの場合も医薬組成物は、滅菌されていなければならずかつ容易に注射できる程度に流体でなければならない。この医薬組成物は製造と貯蔵の条件下で安定でなければならずかつ細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。担体は溶媒または分散媒体でもよく、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適切な混合物が挙げられる。例えば、レシチンのようなコーティングを用いることにより、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、および界面活性剤を使用することによって適正な流動性を維持することができる。微生物の作用は、各種の抗菌剤と抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合、上記組成物は、等張剤を含有していることが好ましく、例えば糖類、マンニトールとソルビトールのような多価アルコール類、塩化ナトリウムが挙げられる。注射用組成物の吸収期間は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤を組成物に含有させることによって延長することができる。
【００３７】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物（例えばＣＤ２阻害因子）を、適当な溶媒中で、必要に応じて上記成分の一つまたはこれら成分の混合物と混合し次いでろ過滅菌を行うことによって製造することができる。一般に分散液は、ベイシック分散媒体（basic dispersion medium）と上記成分の中の必要な他の成分を混合することによって製造される。滅菌注射溶液を調製するのに用いる滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分（例えばＣＤ２阻害因子）＋所望の追加成分の粉末が、その予め滅菌ろ過された溶液から得られる減圧乾燥法と凍結乾燥法である。
【００３８】
活性化合物が上記のように適切に保護されている場合、薬剤は、例えば不活性希釈剤または吸収可能な食用担体とともに経口投与することができる。「医薬として許容される担体」という用語には、本明細書で使用する場合、すべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤と吸収遅延剤などが含まれる。医薬として活性な物質に対してこのような媒体と薬剤を用いることは当該技術分野で公知である。通常の媒体または薬剤が活性化合物と非相容性である場合を除いて、治療組成物にこれら媒体または薬剤を使用することが検討される。補助活性化合物も医薬組成物に混合できる。
【００３９】
投与が容易で投与量が均一であるように、投与単位剤形（dosage unit form）で非経口組成物を配合することが特に有利である。投与単位剤形という用語は本明細書で使用する場合、治療すべき哺乳類の被検体に対して一回投与量として適切な物理的に区分された単位を意味し、各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療効果を生じるよう計算して予め決定された量の活性化合物を含有している。本発明の投与単位剤形の処方は、（ａ）活性化合物の特有の特性と達成すべき特別な治療効果および（ｂ）個体の感受性を治療するための、このような活性化合物を配合する当該技術分野に固有の制限によって指示、決定される。
【００４０】
ＣＤ２阻害因子の投与のタイミングは、被験者に対する他の治療剤の投与と整合させることができる。例えば、被験者のＴ細胞共刺激シグナルを阻害する因子（例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ）を被験者に投与することによってＴ細胞不応答性が誘導された被験者に、ＣＤ２阻害因子を、Ｔ細胞共刺激シグナルを阻害する因子と同時にまたはＴ細胞共刺激シグナルを阻害する因子に続いて投与することができる。さらに、ＣＤ２阻害因子がin vivoで有効レベルで維持される場合、ＣＤ２阻害因子は、Ｔ細胞共刺激シグナルを阻害する因子を投与する前に投与してもよい。あるいは、ＣＤ２阻害因子は、抗原に対する免疫応答を阻害するために使用される、他の通常の治療処置に対する補助剤として投与することができる。例えばＣＤ２阻害因子は、サイクロスポリンＡまたはＦＫ506などの免疫抑制剤の投与を含む治療計画の一部分として投与することができる。
【００４１】
本発明の一実施態様では、Ｔ細胞不応答性は同種異系細胞または異種細胞上の抗原に対して維持される。したがって、本発明の方法は、同種異系細胞または異種細胞の受容者、例えば臓器移植受容者または骨髄移植受容者である被験者を治療するのに用いることができる。したがって本発明の方法は、移植された組織に対する拒絶反応を抑制し、被験者の移植片対宿主病を抑制するのに有用である。
【００４２】
本発明の他の実施態様では、Ｔ細胞不応答性が自己抗原に対して維持される。したがって本発明の方法は、自己免疫疾患または不適当なもしくは異常な免疫応答に関連する障害がみられる被験者を治療するのに用いることができる。自己免疫疾患または不適当なもしくは異常な免疫応答に関連する障害の例としては、リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、乾せん性関節炎、乾せん、らい反転反応、紅斑結節らい（erythema nodosam leprasum）、自己免疫ぶどう膜炎、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側進行性感音難聴（idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss）、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血、特発性血小板減少性、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティヴンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔せん、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、原発性若年型糖尿病、シェーグレン症候群関連のドライアイ、後部ぶどう膜炎および間質性肺線維症（interstitial lung fibrosis）がある。したがって本発明の方法は、自己免疫疾患および不適当なもしくは異常な免疫応答に関連する障害の症状を軽減するのに有用である。
II．Ｔ細胞不応答性を誘導し維持する方法
【００４３】
別の実施態様で、本発明はＴ細胞不応答性を誘導し維持する方法を提供する。この実施態様では、Ｔ細胞に、ＣＤ28またはＣＴＬＡ４を介するＴ細胞刺激を阻害する第一因子およびＣＤ２を介するＴ細胞刺激を阻害する第二因子を接触させる。第一因子は、Ｔ細胞の共刺激シグナルを阻害しその結果Ｔ細胞アネルギーを誘導するために与えられる。第二因子は、不応答性Ｔ細胞中にＴ細胞アネルギーを維持するために与えられる。ＣＤ２を介する刺激を阻害するために使用できる因子（すなわち第二因子）としては先に述べたＣＤ２阻害因子がある。Ｔ細胞不応答性を誘導するために使用できる因子（すなわち第一因子、本明細書ではＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子と呼ぶ）としては、ＣＤ28またはＣＴＬＡ４とＣＤ28リガンドまたはＣＴＬＡ４リガンドとの相互作用を実質的に遮断または阻害する因子が挙げられる。適切なＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子の例としては、ＣＤ28、ＣＴＬＡ４、ＣＤ28リガンドまたはＣＴＬＡ４リガンドに結合する阻止抗体（例えばＢ７−１またはＢ７−２）；可溶型のＣＤ28、ＣＴＬＡ４、ＣＤ28リガンドまたはＣＴＬＡ４リガンド；およびＣＤ28／ＣＴＬＡ４とＣＤ28リガンドもしくはＣＴＬＡ４リガンドとの間の相互作用を阻害する低分子類がある。あるいは、ＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子は、細胞内で作用して、ＣＤ28またはＣＴＬＡ４経由でＴ細胞内でトリガーされる細胞内シグナルを阻害することができる。
【００４４】
Ｔ細胞不応答性を誘導するのに用いるＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子は、ＣＤ２阻害因子について先に述べたのと同様にして製造することができる。ＣＤ28、Ｂ７−１またはＢ７−２に結合する阻止抗体は当該技術分野で報告されており（例えばDamle、N.K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA、78巻、5096〜5100頁、1981年；Freedman、A.S.、J.Immunol.、137巻、3260〜3267頁、1987年；およびHathcock、K.S.、Science、262巻、905〜907頁、1993年参照）、既述した標準法によって製造することができる。可溶型のＣＤ28、ＣＴＬＡ４とＢ７−１も当該技術分野で報告されており（例えばLinsleyら、J.Exp.Med.、173巻、721〜730頁、1991年；およびLinsley、P.S.ら、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年参照）、既述した標準法で製造することができる。ヒトのＣＤ28、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−１およびＢ７−２のヌクレオチド配列は当該技術分野で利用可能である（ＣＤ28：Aruffo、A.およびSeed、B.、Proc.Natul.Acad.Sci. USA、84巻、8573〜8577頁、1987年；ＣＴＬＡ４：Dariavach、P.ら、Eur.J.Immunol.、18巻、1901〜1905頁、1988年；Ｂ７−１：Freeman、G.L.ら、J.Immunol.、143巻、2714〜2722頁、1989年；Ｂ７−２：Freeman、G.J.ら、Science、262巻、909〜911頁、1993年およびAzuma、M.ら、Nature、366巻、76〜79頁、1993年）。好ましいＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子は、Linsley、P.S.ら、J.Exp.Med.、174巻、561〜569頁、1991年に記載されているようなＣＴＬＡ４Ｉｇの融合タンパク質である。
【００４５】
Ｔ細胞の不応答性を誘導し維持するため、Ｔ細胞を、ＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子とＣＤ２阻害因子に同時にまたは順次接触させてもよい。順次接触させる場合は、Ｔ細胞をまずＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子に接触させ次いでＣＤ２阻害因子に接触させることが好ましい。
【００４６】
またこの方法は、例えば臓器移植、骨髄移植および自己免疫疾患などの場合に抗原特異的免疫応答を阻害することが望ましい場合、治療的に有用である。治療を目的とする場合、ＣＤ28／ＣＴＬＡ４阻害因子およびＣＤ２阻害因子を患者に投与してＴ細胞の不応答性を誘導させ維持する。これらの因子は同時にまたは続けて患者に投与することができる。投与経路、投与する医薬組成物、投与のタイミングと量および投与などに関して配慮すべき事項は、ＣＤ２阻害因子について先に述べたのと同様である。
III．Ｔ細胞の応答性を復活する方法
【００４７】
本発明はさらに、アネルギー化Ｔ細胞の抗原に対する応答性を復活する方法（すなわちアネルギーを逆転する方法）を提供するものである。この方法により処理された、アネルギー化Ｔ細胞は、その後の抗原および共刺激分子による刺激に対する応答能（例えば増殖とＩＬ−２分泌の性能）が回復する。この方法は、アネルギー化Ｔ細胞による、抗原に対する免疫応答を促進することが望ましい治療状態の場合に有用である。この状態の例は、腫瘍が存在することによってＴ細胞が腫瘍抗原に対して不応答性になった担腫瘍患者である。
【００４８】
一実施態様では、抗原に対するＴ細胞の応答性は、抗原の存在下、アネルギー化Ｔ細胞を、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する因子と接触させることによって回復する。この方法は、Ｔ細胞の応答性を（アネルギー化される前のＴ細胞の応答性に比べて）充分にまたは一部分回復させ、Ｔ細胞に抗原および共刺激分子によるその後の刺激に対して応答させる（すなわち増殖とＩＬ−２の分泌）手段を提供するものである。ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する因子は本明細書ではＣＤ２刺激因子と呼称する。Ｔ細胞の応答性を回復させるためには、ＣＤ２刺激因子はその表面にＣＤ２リガンドを発現する細胞でもよい。あるいは、ＣＤ２刺激因子は可溶性刺激型のＣＤ２リガンド（例えば多価型またはミセル型）でもよい。さらに、ＣＤ２刺激因子は、少なくとも１個の抗ＣＤ２抗体またはその組合わせでもよい。また本発明の方法に有用なＣＤ２刺激因子は、細胞内で作用して、ＣＤ２でトリガーされる細胞内シグナルを刺激する因子でもよい。
Ａ．ＣＤ２リガンド発現細胞
【００４９】
抗原に対するＴ細胞の応答性を回復させる方法において、ＣＤ２刺激物質の１つの具体例は細胞表面にＣＤ２リガンドを発現している細胞である。好ましくは、ＣＤ２リガンドはＬＦＡ−３（ＣＤ５８）である。あるいはまた、ＣＤ２リガンドはＣＤ４８またはＣＤ５９でもよい。すなわち、不応答性Ｔ細胞を、細胞表面にＣＤ２リガンド（例えば、ＬＦＡ−３）と抗原とを発現している細胞と接触させることにより、抗原に対するＴ細胞の応答性を回復させることができる。天然にＣＤ２リガンドを発現していない細胞を修飾してＣＤ２リガンドを発現させることができる。例えば、構成的に腫瘍抗原を発現しているがＬＦＡ−３を発現していない腫瘍細胞を修飾してＬＦＡ−３を発現させることができる。腫瘍細胞を修飾してＣＤ４８またはＣＤ５９を発現させることもできる。あるいはまた、細胞は、Ｔ細胞アネルギーを逆転させるには不十分な量のＣＤ２リガンドをその表面に発現している場合がある。そのような場合、細胞表面上のＣＤ２リガンドの発現レベルを増加させてもよい。細胞表面上にＣＤ２リガンドが発現されるような方法で、細胞を「ＣＤ２リガンドを発現するように修飾する」。修飾前に、細胞は、ＣＤ２リガンドを発現することができなくてもよく、ＣＤ２リガンドを発現することができるが発現していなくてもよく、また不十分な量のＣＤ２リガンドを発現していてもよい。したがって、多くの技術のいずれか、例えば、ＣＤリガンドをコードする核酸を細胞に導入するか、ＣＤ２リガンドを細胞表面にカップリングさせるか、または細胞表面におけるＣＤ２リガンドの発現を刺激（促進）することによって、細胞を修飾し、ＣＤ２リガンドを発現させることができる。
【００５０】
ＣＤ２リガンドを発現させるための好ましい細胞修飾法は、細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現させるのに適した形の、ＬＦＡ−３のようなＣＤ２リガンドをコードする核酸を細胞内に導入するものである。エレクトロポーレーション（電気穿孔法）、カルシウム−ホスフェート沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルスベクターによる感染を含む、核酸を哺乳動物細胞中に導入するのに有用な種々の技術（一般にはトランスフェクションと呼ばれる）の１つによって、ＣＤ２リガンドをコードする核酸（例えば、組換え発現ベクター）を宿主細胞中に導入することができる。適切な哺乳動物細胞のトランスフェクション法はSambrookらの、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）や他の実験書に記載されている。導入される核酸としては、例えば、ＣＤ２リガンドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ、ＣＤ２リガンドをコードするセンス鎖ＲＮＡ、またはＣＤ２リガンドをコードするｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターが考えられる。用いるｃＤＮＡとしては、ヒトＬＦＡ−３の貫膜形（Wallner,B.P.ら(1987)の、 J.Exp.Med.166:923-932に開示）およびヒトＬＦＡ−３のＧＰＩ連結型（Seed,B.（1987）の、Nature 329:840-842に開示）のｃＤＮＡが好ましい。あるいはまた、ヒトＣＤ４８（Korinek,V.ら（1991）の、Immunogenetics 33:108-112に開示）およびヒトＣＤ５９（Sawada,R.ら（1990）の、DNA Cell Biol.9:213-220に開示）のｃＤＮＡも使用することができる。さらに、細胞を修飾して複数のＣＤ２リガンドを発現させることができる。細胞上に発現させることができるＬＦＡ−３（両方の形）、ＣＤ４８、およびＣＤ５９の種々の組み合せは当業者には明らかであろう。
【００５１】
細胞内に導入されるＣＤ２リガンドをコードする核酸は、細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現させるのに適した形をしている。この核酸は、必要なコード配列、およびプロモーター、エンハンサー、ならびにポリアデニル化シグナルを含み得る遺伝子の転写と翻訳に必要な調節配列、およびＮ−末端シグナル配列を包含する、腫瘍細胞表面に該分子を移動させるのに必要な配列を含んでいる。この核酸が組換え発現ベクター中のｃＤＮＡである場合は、ｃＤＮＡの転写および／または翻訳の調節機能はウイルス配列によって提供されることが多い。普通に用いられるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスならびにシミアンウイルス４０、およびレトロウイルスＬＴＲ由来のものが含まれる。ｃＤＮＡに結合させる調節配列は、例えば、金属チオネインプロモーターまたはグルココルチコイド応答性プロモーターのような誘導プロモーターを用いることにより、構成的または誘導的な転写を生じるように選択する。
【００５２】
細胞（例えば、腫瘍細胞）中にＣＤ２リガンドをコードする核酸を導入するための好ましいアプローチでは、ＣＤ２リガンドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターを用いる。使用可能なウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター（Eglitis,M.A.ら（1985）の、 Science 23:1395-1398；Danos,O.およびMulligan,R.（1988）の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464；およびMarkowitz,D.ら（1988）の、J.Virol.62:1120-1124）、アデノウイルスベクター（Rosenfeld,M.A.ら（1992）の、Cell 68:143-155）、およびアデノ関連ウイルスベクター（Tratschin,J.D.ら（1985）の、Mol.Cell.Biol.5:3251-3260）が含まれる。腫瘍細胞のウイルスベクターによる感染では、大部分の細胞が核酸を受け取るため、核酸を受け取った細胞を選別する必要がなく、また、例えば、ウイルスベクター中に含まれるｃＤＮＡによって、ウイルスベクター中にコードされている分子が、ウイルスベクター核酸を取り込んでいる細胞内に効率的に発現する。
【００５３】
あるいはまた、ＣＤ２リガンドは、ＣＤ２リガンドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含むプラスミド発現ベクターを用いて、細胞上に発現させることができる。適切なプラスミド発現ベクターにはＣＤＭ８（Seed,B.の、Nature 329,840（1984）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kanfmanらの、EMBO 6,187-195(1987)）が含まれる。通常、ほんのわずかな細胞（約１０５個中約１個）しか、そのゲノム中にトランスフェトされたプラスミドＤＮＡを組み込まないので、トランスフェトされた細胞を選別するために、選択マーカーをコードする核酸を、目的とする核酸と共に細胞内にトランスフェクトするのが有利である。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートのような薬剤に対する耐性をもたらすものが含まれる。選択マーカーは目的とする遺伝子と同じプラスミドに導入してもよく、別のプラスミドに導入してもよい。適切な選択マーカーを用いてトランスフェクション細胞を選択した後、細胞を免疫蛍光染色することによって細胞表面における共刺激分子の発現を確認することができる。例えば、ＣＤ２リガンド応答性の蛍光標識モノクローナル抗体かまたはＣＤ２リガンドと結合する蛍光標識可溶性受容体（例えば、可溶性ＣＤ２）を用いて細胞を染色してもよい。ＬＦＡ−３を検出するのに使用できる抗体は、Sanchez-Madrid,F.（1982）の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7489（例えば、ＴＳ２／９）に開示されており、ＣＤ４８抗体を検出するのに使用できる抗体はSandrin,M.S.（1993）の、J.Immunol.151:4606およびKatoら（1993）の、Eur.J.Immunol. 23:1412に開示されており、また、ＣＤ５９を検出するのに使用できる抗体はDeckert,M.ら（1992）の、Eur.J.Immunol.22:2943-2947に開示されている。
【００５４】
細胞（例えば、腫瘍細胞）のトランスフェクションにより、大きな割合の細胞が修飾され、細胞表面上のＣＤ２リガンドの効率的な発現が達成される場合、例えば、ウイルス発現ベクターを用いた場合には、さらに単離やサブクローニングを行うことなく細胞を使用してもよい。あるいはまた、トランスフェクション細胞の均一なポピュレーションは、限界希釈によって単一のトランスフェクション細胞を単離し、次いで標準技術によってこの単一細胞を膨張させて細胞のクローナルポピュレーションとすることによって製造することができる。
【００５５】
ＣＤ２リガンドをコードする核酸を細胞中に導入する代わりに、細胞表面のＣＤ２リガンドの発現を誘導したり、発現レベルを増大させるように細胞を修飾することもできる。ＣＤ２リガンドの発現を刺激する物質を用いて、細胞表面のＣＤ２リガンドの発現を誘導するかまたは増大させることができる。例えば、in vitroの培養培地中でこの物質と細胞を接触させることができる。ＣＤ２リガンドの発現を刺激する物質は、例えば、ＣＤ２リガンド遺伝子の転写を増大させるか、ＣＤ２リガンドｍＲＮＡの翻訳を増大させるか、またはＣＤ２リガンドの細胞表面への移動もしくは安定性を増すことによって作用してもよい。腫瘍細胞表面のＣＤ２リガンドの発現を誘導するかまたは増大させるのに使用できる別の物質は、ＣＤ２リガンドをコードする遺伝子の転写をアップレギュレーション（促進的調節）する転写因子をコードする核酸である。この核酸を既述のごとく細胞内にトランスフェクトすることにより、ＣＤ２リガンド遺伝子の転写を増大させ、ＣＤ２リガンドの細胞表面レベルを増大させることができる。
【００５６】
あるいはまた、細胞表面にＣＤ２リガンドをカップリングさせることによって細胞（例えば、腫瘍細胞）を修飾し、ＣＤ２リガンドを発現させることができる。例えば、ＣＤ２リガンド蛋白を生産し単離することができる発現系と標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤ２リガンドを得ることができる。あるいはまた、ＣＤ２リガンドは、標準的蛋白精製技術を用いてＣＤ２リガンドを発現する細胞から単離することができる。次いで、単離したＣＤ２リガンドを細胞表面にカップリングさせる。用語「カップリングされた」または「カップリング」とは、ＣＤ２リガンドが細胞表面に存在し、Ｔ細胞におけるＣＤ２を介するシグナルを誘発し得るようにＣＤ２リガンドを細胞と結合させる化学的、酵素的、もしくは他の方法をいう。例えば、市販の架橋試薬（例えば、Pierce、Rockford IL）を用いて、ＣＤ２リガンドを細胞表面に化学的に架橋させることができる。別のアプローチとして、ＬＦＡ−３やＣＤ５９のようなＣＤ２リガンドのＧＰＩ連結型の脂質末尾を細胞膜内に挿入することによって、該分子を細胞表面にカップリングさせることができる。さらなる別のアプローチには、細胞上の、ＣＤ２リガンドと細胞表面分子の両方に結合する二特異抗体を介してＣＤ２リガンドを細胞にカップリングさせることが含まれる。細胞表面にカップリングしたときにＴ細胞におけるＣＤ２を介するシグナルを誘発する能力を保持しているＣＤ２リガンドのフラグメント、突然変異体または変異体を使用することもできる。
Ｂ．可溶性の刺激型のＣＤ２リガンド
【００５７】
本発明の他の態様において、Ｔ細胞の応答性を回復するのに用いるＣＤ２刺激物質は可溶性の刺激型のＣＤ２リガンドである。可溶性のＣＤ２リガンドは、適切な抗ＣＤ２抗体と一緒になって、ＣＤ２を介してシグナルを誘発することが示されている。ある態様において、可溶性の刺激型のＣＤ２リガンドは、ＣＤ２リガンドの多価形、例えば、ダイマー、トリマー、またはテトラマーである。ＬＦＡ−３のマルチマーは、適切な抗ＣＤ２抗体（例えば、Ｔ１１．３抗体）と一緒になってin vitroにおけるＴ細胞の活性化を誘発することが示されている（Pepinsky,R.B.ら（1991）の、J.Biol.Chem.266:18244-18249参照）。したがって、ＣＤ２を介してＴ細胞の活性化を刺激するＣＤ２リガンドのマルチマーをＣＤ２刺激物質として用いることができる。好ましくは、ＣＤ２リガンドの多価形は、Ｔ１１．３エピトープと結合する抗ＣＤ２抗体（例えば、Ｔ１１．３抗体）と組み合わせて使用される。Pepinskyら（既述）の記載の従って、ＣＤ２リガンドのモノマーを化学的に架橋し、マルチマーを形成させることができる。
【００５８】
さらに別の態様において、可溶性の刺激型のＣＤ２リガンドは、ミセル中に取り込まれたＧＰＩ連結ＣＤ２リガンドである。膜中に固定するためのホスファチジルイノシトール脂質末尾を含むＣＤ２リガンド（例えば、ＬＦＡ−３またはＣＤ５９）をＧＰＩ連結型として分離し、ミセル中に取り込ませることができる。ＬＦＡ−３またはＣＤ５９を含有するミセルはWO89/10938の記載に従って製造することができる。適切な抗ＣＤ２抗体（例えば、Ｔ１１．３抗体）と結合したＣＤ２リガンドのミセル形を用いて、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激することができる（WO89/10938参照）。
Ｃ．刺激型の抗ＣＤ２抗体
【００５９】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質の別の具体例は少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体である。刺激型の抗ＣＤ２抗体は当該技術分野で開示されている。好ましくは、抗ＣＤ２抗体によるＣＤ２を介する刺激は、少なくとも２つの異なる抗ＣＤ２抗体を組み合わせて用いることによって達成される。既に報告されている抗ＣＤ２抗体の刺激性混合物には以下のものが含まれる：Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Meuer,S.C.ら（1984）の、Cell 36:897-906）、および９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）（Yang,S.Y.ら（1986）の、J.Immunol.137:1097-1100）。これらの抗体と同じエピトープに結合する他の抗体を使用することもできる。さらなる刺激型抗ＣＤ２抗体または抗体混合物は標準的技術によって製造し、確認することができる。例えば、刺激型抗体または抗体混合物は、in vitroのＴ細胞培養系において抗原提示細胞の非存在下でＴ細胞の増殖を刺激する抗体（単一または複数）の能力に基づいて確認することができる。
Ｄ．細胞内ＣＤ２刺激物質
【００６０】
細胞外で作用し、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激する物質に代わって、ある種のＣＤ２刺激物質は細胞内で作用し、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発された細胞内シグナルを刺激することができる。既述したように、Ｔ細胞上のＣＤ２表面受容体を介した細胞内シグナリングにはＣＤ３コンプレックスが関与するが、このシグナリングはプロテインチロシンキナーゼ活性、プロテインキナーゼＣ活性を誘導し、細胞内のサイトゾル遊離カルシウムを生じさせる。したがって、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激することによって誘導された１つまたはそれ以上のこの細胞内シグナルを刺激する物質は、Ｔ細胞の応答性を回復するためのＣＤ２刺激物質として用いることができる。
【００６１】
さらに、既述したように、Ｔ細胞アネルギーの逆転には、チロシンキナーゼＪＡＫ−３とＣＤ２の会合およびＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化が伴う（実施例６参照）。したがって、細胞内ＣＤ２刺激物質は、ＪＡＫ−３キナーゼの細胞内活性を刺激する物質、例えば、ＪＡＫ−３キナーゼとＣＤ２との会合を刺激し、そして／またはＪＡＫ−３キナーゼのリン酸化を刺激する物質であり得る。
Ｅ．不応答性Ｔ細胞のプライミング
【００６２】
アネルギー化Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させるのに加えて、Ｔ細胞の抗原特異的応答性を回復するにはＣＤ２を介して刺激するためにＴ細胞を「プライム」する必要があろう。本明細書において、Ｔ細胞を「プライムする」なる用語は、Ｔ細胞に、次の刺激（例えば、ＣＤ２を介する）に対する準備をさせる、Ｔ細胞の処理を表す。したがって、ＣＤ２表面受容体を介して刺激するために、まず最初にアネルギー化Ｔ細胞を、Ｔ細胞をプライムする物質と接触させることができる。ＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする物質の具体例はＴ細胞成長因子、好ましくはＩＬ−２である。アネルギー化Ｔ細胞をプライムするのに使用できる他のＴ細胞成長因子にはＩＬ−４およびＩＬ−７が含まれる。これら３種類のリンホカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−７）のそれぞれの受容体は、共通のシグナリングサブユニット、ＩＬ−２ γ鎖を利用し、したがって、類似した細胞内シグナルを誘発する。細胞内シグナリングにＩＬ−２受容体γ鎖を利用する受容体と結合する他のサイトカイン、または細胞内で作用してＩＬ−２受容体γ鎖シグナリング経路を刺激する物質を用いてＴ細胞をプライムすることができる。
【００６３】
あるいはまた、不応答性Ｔ細胞をプライムする物質は、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上へのＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激する物質である。したがって、ＣＤ２上のＴ１１．３エピトープの露出はＴ細胞プライミングを評価するのに用いることができる。Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３エピトープの露出は、Ｔ細胞に結合するＴ１１．３抗体の能力を測定することによって（例えば、フローサイトメトリーによって）評価することができる。ＣＤ２上のＴ１１．３ネオ−エピトープを露出するのに使用することができる好ましい物質はＩＬ−２である。 本発明のこの態様によれば、不応答性Ｔ細胞を、ＣＤ２刺激物質と接触させる前にＴ細胞をプライムする物質と接触させることができる。例えば、Ｔ細胞をＩＬ−２中で培養し、ＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムし、次いでＣＤ２リガンドを発現している細胞かまたは刺激型抗ＣＤ２抗体で刺激することができる。
Ｆ．ＣＤ２刺激物質の使用
【００６４】
抗原に対するＴ細胞の応答性を回復するための本発明の方法は、治療目的に用いることができる。例えば、この抗原は腫瘍細胞上に発現した抗原であり得るし、また、この方法は抗腫瘍応答性を増強するのに使用することができる。あるいはまた、この方法を用いて、ウイルス、細菌、寄生虫、およびカビのような病原物質に対する応答性を増強するか、またはそのような病原性物質に対するワクチンの効力を増強することができる。例えば、ＣＤ２刺激物質は、病原性物質に感染した対象に投与するか、またはワクチン抗原に対するＴ細胞の応答性を増強するためにワクチンと一緒に投与することができる。Ｔ細胞はin vitroの培養において抗原に対して不応答性になる傾向があるため、in vitroのＴ細胞培養を含む治療的処理の補助としてこの方法を用いることができる。したがって、本発明の方法を用いて、治療的に用いられるin vitro培養Ｔ細胞の抗原応答性を増大させることができる。
【００６５】
アネルギー化Ｔ細胞の抗原特異的応答性は、in vivoまたはex vivo（生体外）のいずれかにおいてアネルギー化Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させることによって回復させることができる。抗原特異的Ｔ細胞を、好ましくは抗原存在下でＣＤ２刺激物質と接触させる。例えば、in vitroにおいて、抗原発現細胞の存在下で培養中、Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させるか、または抗原が内在性に存在するかまたは抗原がＣＤ２刺激物質と一緒に投与されるin vivoにおいて、Ｔ細胞をＣＤ２刺激物質と接触させる。さらにin vitroまたはin vivoのいずれかでＣＤ２を介して刺激するために、Ｔ細胞をプライムする物質とＴ細胞を接触させることができる。例えば、Ｔ細胞をin vitroでＩＬ−２とインキュベーションするか、またはＩＬ−２を、対象に対して全身投与することができる。
【００６６】
ＣＤ２刺激物質の投与経路、投与するための医薬組成物、投与のタイミングと用量、および投与のための他の考慮すべき事項は、ＣＤ２阻害物質に関して既述した通りであるか、またはそれらを容易に変更することができる。ＣＤ２阻害物質について既述した組成物に加えて、さらにＣＤ２刺激物質をアジュバントと投与することができる。アジュバントはその最も広い意味で使用され、インターフェロンのようなあらゆる免疫刺激化合物が含まれる。本発明において予定されているアジュバントには、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤、レソルシノールが含まれる。ＣＤ２刺激物質を別の治療剤（例えばワクチン）と一緒に投与する場合は、両治療剤の最大の効力を得るために、ＣＤ２刺激物質のタイミングと用量を、他の物質を投与するタイミングと用量と調和させることができる。
ＩＶ．抗原に対するＴ細胞の応答を回復させる方法
【００６７】
本発明の方法に従ってＣＤ２を介して刺激される抗原特異的なアネルギー化Ｔ細胞は、共刺激シグナルを誘発する刺激と共に抗原にばく露されると、抗原応答能を回復する。したがって、本発明はさらに、抗原の存在下で、Ｔ細胞を、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質と接触させることにより、抗原不応答性Ｔ細胞の、抗原に対する応答を回復させる方法を提供するものである。さらに、Ｔ細胞を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第二物質と接触させる。この方法を治療的に用いて腫瘍を保有する対象における抗腫瘍反応を増強させることができる。あるいはまた、抗原に対する応答を回復させる方法を、病原性物質（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、またはカビ）に対する免疫反応を刺激し、病原性物質に対するワクチンの効力を刺激するような治療目的に用いることができる。
【００６８】
この方法に用いる第一物質の例としては、先に詳述したＣＤ２刺激物質がある。この方法に用いる第二物質の例には、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現している細胞（例えば、ＣＤ２リガンドにおいて既述したＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように修飾された細胞）、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドの刺激形（例えば、多価形）、またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ４と結合する刺激抗体（例えば、Harding,F.A.（1992）の、Nature 356:607-609に記載の刺激抗ＣＤ２８抗体）が含まれる。
【００６９】
好ましい態様においては、第一物質は細胞表面上のＣＤ２リガンドであり、第二物質は同じかまたは別の細胞表面上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドである。好ましいＣＤ２リガンドはＬＦＡ−３である。あるいはまた、ＣＤ２リガンドはＣＤ４８またはＣＤ５９であり得る。好ましいＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドは、Ｂ７−１およびＢ７−２である。既述の方法によって細胞を修飾し、ＣＤ２リガンドおよび／またはＣＤ２８／ＣＴＬＡ４リガンドを発現させることができる。例えば、ＣＤ２リガンドおよび／またはＣＤ２８／ＣＴＬＡ４リガンドをコードする核酸を、細胞表面上にリガンド（単一または複数）を発現させるのに適切な形で細胞中に導入することができる。あるいはまた、ＣＤ２および／またはＣＤ２８／ＣＴＬＡ４リガンドを細胞上に誘導するか、または細胞表面にカップリングさせることができる。
【００７０】
抗原に対するＴ細胞の応答性を回復させるには、ＣＤ２を介して刺激するためにＴ細胞をプライムする第三物質とＴ細胞を接触させる必要があろう。Ｔ細胞をプライムするための物質は既述の通りである。Ｔ細胞をプライムし、Ｔ細胞上のＣＤ２のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激するための好ましい物質はＩＬ−２である。ＣＤ２を介して刺激するためにＴ細胞をプライムする物質とＴ細胞を接触させ、次いで、Ｔ細胞を、ＣＤ２を介してＴ細胞を刺激する物質と接触させる。in vitroまたはin vivoのいずれかでＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする物質とＴ細胞を接触させる。例えば、Ｔ細胞を対象から得、in vitroでＩＬ−２中で培養し、次いでこれを対象に再投与するか、または対象にＩＬ−２を全身投与することができる。
【００７１】
本発明の好ましい態様は、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように腫瘍細胞を修飾することを特徴とする、腫瘍を有する対象の腫瘍特異的Ｔ細胞応答を回復させる方法を提供することである。好ましくは、腫瘍細胞表面にＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現させるのに適した形の、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドをコードする少なくとも１つの核酸を腫瘍細胞中に導入することによって、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するようにＴ細胞を修飾することができる。腫瘍細胞はin vivoまたはex vivoで修飾することができる。例えば、腫瘍細胞表面にＣＤ２リガンドを発現するように腫瘍細胞を修飾するのに適した形のＣＤ２リガンドをコードする組換え型ウイルスに腫瘍細胞を感染させることによって、in vivoでＣＤ２リガンドを発現させることができる。あるいはまた、腫瘍細胞を対象から取り出し、ex vivoで修飾してＣＤ２リガンドを発現させ、次いで対象に再投与することができる。ex vivoで修飾する場合、両リガンド（すなわち、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンド）を発現するようにＴ細胞試料を修飾するか、あるいはまた、ＣＤ２リガンドを発現するようにある腫瘍細胞試料を修飾し、次いでＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように第二腫瘍細胞試料を修飾することができる。次に、この２つの腫瘍細胞試料を、同時にかまたは連続的に対象に投与することができる。ＣＤ２リガンドを発現している腫瘍細胞試料を最初に投与して腫瘍特異的応答性を回復させ、次いでＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現している腫瘍細胞試料を投与して腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激することは有利であろう。
【００７２】
腫瘍特異的Ｔ細胞はin vivoまたはex vivoのいずれかで刺激することもできる。例えば、Ｔ細胞は、in vivoで腫瘍細胞を修飾するか、または修飾した腫瘍細胞（または他のＣＤ２刺激物質）を対象に投与することによってin vivoで刺激することができる。あるいはまた、Ｔ細胞を対象から得、ex vivoで刺激し（例えば、ＬＦＡ−３保持腫瘍細胞かまたは腫瘍細胞と抗ＣＤ２抗体を用いて）、次いで、対象に再投与することができる。in vitroで刺激したＴ細胞を最初にin vitroでＩＬ−２と培養してＴ細胞をプライムするか、またはＩＬ−２を対象に全身投与し、ＣＤ２を介する刺激に対してＴ細胞をプライムすることができる。
【００７３】
したがって、本発明は、修飾される前はＣＤ２リガンドを発現していない腫瘍細胞であって、修飾によってＣＤ２リガンドを発現する腫瘍細胞をも提供するものである。好ましくは、腫瘍細胞はＬＦＡ−３を発現するように修飾される。本発明は、修飾される前はＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現していない腫瘍細胞であって、修飾によってＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現する腫瘍細胞をも提供する。修飾によってＬＦＡ−３およびＢ７−１またはＢ７−２を発現するＴ細胞が好ましい。既述のごとく、ＣＤ２リガンド、および所望によりＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するようにＴ細胞を修飾することができる。修飾された腫瘍細胞は、医薬として投与するのに適した組成物中に取り込ませることができる。例えば、腫瘍細胞を、医薬的に許容される担体または希釈剤（例えば、滅菌生理食塩水溶液）に入れて、投与することができる。腫瘍細胞は、腫瘍細胞を所望の部位に輸送する適切な経路、例えば、静脈内、筋肉内、または腹腔内注射によって投与することができる。
【００７４】
以下の実施例において、本発明をさらに説明するが、これによって本発明が限定されると解釈すべきではない。本明細書中に引用された全ての引用文献、および公開された特許ならびに特許出願の内容は本明細書の一部を構成する。
【実施例】
【００７５】
実施例１：Ｔ細胞における共刺激シグナル阻害によるＴ細胞の不応答性の誘導
実施例において、アロ抗原のＨＬＡ−ＤＲ７に特異的な２種類のヘルパーＴ細胞クローン（ＴＣ−１、ＴＣ−２）を使用した。これらのクローンは、ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２８＋であり、標準的方法（J.Goronzyら（1987）の、Methods Enzymol.150:333に記載）を用いて作製した。ある実験では、これらＴ細胞クローンを、トランスフェクションによってＨＬＡ−ＤＲ７および／または他の細胞表面分子を発現しているＮＩＨ−３Ｔ３またはＣＯＳ細胞で刺激した。本明細書では、これらのトランスフェクトされた細胞を、人工的アロ抗原提示細胞（アロ−ＡＰＣ）と呼ぶ。トランスフェクション前には、これら細胞はＴ細胞の増殖やＩＬ−２の産生を刺激することはできない。トランスフェクタントは以下のようにその表面に発現している分子によって表され、ＨＬＡ−ＤＲ７のみを発現している細胞はｔ−ＤＲ７と、ＨＬＡ−ＤＲ７とＢ７−１の両方を発現している細胞はｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１と、また、ＨＬＡ−ＤＲ７とＩＣＡＭ−１を発現している細胞はｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１などというように呼ばれる。他の実験では、ＨＬＡ−ＤＲ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を一緒に発現するＨＬＡ−ＤＲ７ホモ接合体のリンパ芽球様細胞系でＴ細胞クローンを刺激する。この細胞系はＬＢＬ−ＤＲ７と呼ばれる。Ｔ細胞の応答は、標準的技術によってＴ細胞の増殖またはＩＬ−２の産生を測定することによってアッセイされた。この２クローンの結果は本質的に同等であった。ＴＣ−１の結果のみを示す。
【００７６】
最初の一連の実験において、ＴＣ−１は、ｔ−ＤＲ７、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７のいずれかと７２時間一緒に培養した。ＴＣ−１とアロ−ＡＰＣまたはＬＢＬ−ＤＲ７は１：１の最適比で培養された（２．５×１０４個／ウェル）。７２時間の一次培養後、ＴＣ−１細胞を、人工的アロ−ＡＰＣからパーコールグラジエント遠心によって、およびＬＢＬ−ＤＲ７からフィコール分離によって分離し、徹底的に洗浄し、ＩＬ−２を含まない培地中で２４時間培養した。次いで各ポピュレーションを、二次刺激物質の人工的アロ−ＡＰＣ（ｔ−ＤＲ７、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７、ｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１）、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞、またはＩＬ−２によって再チャレンジした。人工的アロ−ＡＰＣおよびＬＢＬ−ＤＲ７細胞を、３７℃で２時間２０μｇ／ｍＬのマイトマイシン−Ｃ（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）で処理し、徹底的に洗浄した。ある実験では、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞を９６００ｒａｄで照射した。ある培養（図１に示す）には、抗Ｂ７−１（１３３）ｍＡｂとＣＴＬＡ−Ｉｇ融合蛋白を１０μｇ／ｍＬで加えた。組換え型ヒトＩＬ−２（Collaborative Biomedical Products, Bedford,MA）を１００ＩＵ／ｍＬで用いた。増殖は、７２時間のインキュベーションの最後の１６時間における［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ）（DuPont,Boston,MA）の取り込みによって測定した。ＩＬ−２の蓄積は、培養開始後２４時間で採取した上清において、酵素免疫測定法（Biosource,Camarillo,CA）によって測定した。結果は７回の実験の結果を表している。結果を図１に示す。なお、黒棒は人工的アロ−ＡＰＣに対するＴＣ−１細胞の応答を示し、斜線の棒はＬＢＬ−ＤＲ７に対する応答を示し、白抜きの棒は外因性組換え型ヒトＩＬ−２に対する応答を示す。
【００７７】
ＴＣ−１のｔ−ＤＲ７との一次培養によって、ＴＣ−１がアロ−ＡＰＣまたはＬＢＬ−ＤＲ７による再チャレンジに応答しないことによって示される、Ｔ細胞の不応答性（すなわち、アネルギー）が誘導された（図１、Ａ参照）。この実験から、共刺激シグナルの非存在下（例えば、Ｂ７−１に対する結合の非存在下）のＴＣ−１における抗原刺激シグナルの刺激によってＴ細胞の不応答性が誘導されることが確認された。これに対して、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７のいずれかを用いる一次培養は、有意な二次増殖反応とＩＬ−２の蓄積をもたらした（図１、ＢおよびＣ参照）。一次培養中のＬＢＬ−ＤＲ７細胞に対する抗Ｂ７−１ ｍＡｂ（A.S.Freedmanら（1987）の、J.Immunol.137:3260に記載）の添加は、増殖とＩＬ−２の蓄積を低下させたが、再チャレンジに対する不応答性は誘導しなかった（図１、Ｄ参照）。これは、抗Ｂ７−１抗体が、他のＢ７ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−２）とＴ細胞上のその受容体（例えば、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）との相互作用を阻害することができないことによる。しかしながら、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ存在下におけるＬＢＬ−ＤＲ７との一次培養（C.D.Gimmiら（1993）の、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6586）はアネルギーをもたらした（図１、Ｅ参照）。これは、ＣＴＬＡ４Ｉｇが、すべてのＢ７ファミリーのメンバーとＴ細胞上のその受容体との相互作用を阻害することができることによる。すべての場合において、アネルギー化細胞と非アネルギー化細胞は外因性ＩＬ−２と同様に応答した。ＣＴＬＡ４−ＩｇによってブロックされないＬＢＬ−ＤＲ７細胞上に発現される他のすべての表面分子はＣＴＬＡ４Ｉｇ存在下でアネルギーの誘導を防止できなかったことから、これらの結果は、アロ抗原特異的アネルギーを誘導するには、Ｂ７ファミリーの共刺激分子をブロックすることが必要十分であることを示している。さらに、アネルギー誘導後に、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞上に発現したＢ７ファミリーのメンバーと他の非Ｂ７共刺激分子はいずれもこの状態を逆転させることができないようである。
実施例２：Ｂ７−１またはＩＣＡＭ−１によるＴ細胞の刺激はＴ細胞の不応答性を逆転させない
【００７８】
二番目の一連の実験において、アネルギー化ＴＣ−１細胞をＩＬ−２中で３〜２１日間培養し、ＩＬ−２が特異的アロ抗原に対する応答性を回復させることができるかどうかを検討した。ＴＣ−１細胞を最初にｔ−ＤＲ７と共に一次培養してアネルギー化し（実施例１の記載に従って）、次いでＩＬ−２で３〜２１日間インキュベーションした。ＩＬ−２でインキュベーションした後、ＴＣ−１細胞をアロ−ＡＰＣまたはＬＢＬ−ＤＲ７で再チャレンジした（図２に示した時間間隔で）。図２に示す結果は、５回の実験の代表例である。ＩＬ−２でインキュベーションした後２１日までのどの時点においても、ｔ−ＤＲ７、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１、またはｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１による再チャレンジを、広範囲の刺激物質：反応体比で行っても、応答性の回復はみられなかった（図２参照）。これに対して、少なくとも７日間のＩＬ−２培養後において、ＬＢＬ−ＤＲ７による再チャレンジによってＩＬ−２の有意な蓄積と関連する増殖反応が誘導された（図２参照）。これらの実験は、持続的なＩＬ−２培養後に、ＬＢＬ−ＤＲ７と培養することによってＴＣ−１のアロ抗原特異的応答性を回復することができるが、Ｂ７−１とＩＣＡＭ−１（アロ−ＡＰＣ上）はいずれも共刺激をもたらすには十分ではないようであることを示している。コントロール実験において、ＴＣ−１応答は抗ＤＲ ｍＡｂによって阻害され（R.I.Toddら（1984）の、Hum.Immunol.10:23（1984）に記載）、また、Ｔ細胞の増殖またはＩＬ−２の蓄積は、異なるＤＲハプロタイプとそれぞれホモ接合体である２つの他のＬＢＬ（ＬＢＬ−ＤＲ１およびＬＢＬ−ＤＲ８）によって誘導されなかったことから、このＴＣ−１反応がアロ抗原特異的であることが示された。
実施例３：ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用のブロックによるＴ細胞不応答性の維持
【００７９】
第３の一連の実験において、ＬＢＬ−ＤＲ７細胞の、ＴＣ−１のアロ抗原特異的応答性を回復する能力について検討した。ＬＢＬ−ＤＲ７培養上清の存在下でｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１で再チャレンジしても応答性は回復しなかったことから、ＬＢＬ−ＤＲ７の効果に対する分泌された可溶性因子関与はみられなかった。これに対して、パラホルムアルデヒド固定細胞、マイトマイシン−Ｃ処理細胞、または照射ＬＢＬ−ＤＲ７細胞は同じ増殖反応を誘導し、観察されたＬＢＬ−ＤＲ７細胞によるアネルギーの逆転に細胞表面分子が関与したことが示唆された。ＡＰＣ上に発現した種々の細胞表面分子に対するｍＡｂまたは融合蛋白のブロッキングによって、既知の細胞表面分子がＬＢＬ−ＤＲ７細胞による応答性の回復をもたらすかどうかについて検討した。ｔ−ＤＲ７アロ−ＡＰＣによるアネルギー誘導後にＩＬ−２中で少なくとも７日間培養し、単独でかまたは以下のｍＡｂまたは融合蛋白のそれぞれ１つの存在下で、ＬＢＬ−ＤＲ７でＴＣ−１細胞を再チャレンジした：抗ＤＲ（９−４９）（R.I.Toddら（1984）の、Hum.Immunol.10:23に記載）、抗ＬＦＡ−１（ＴＳ１／２２）（F.Sanchez-Madridら（1982）の、Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:7489に記載）、抗ＬＦＡ−３（ＴＳ２／９）（F.Sanchez-Madridら（1982）の、Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:7489に記載）、抗Ｂ７−１（１３３）（A.S.Freedmanら（1987）の、Immunol.137:3260に記載）、ＢＢ−１（E.Clarkらの、Leukocyte Typing中、A.Bernardら編、（Springer-Verlang,Berlin Heidelberg,1984）、339頁に記載）、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（C.D.Gimmiら（1993）の、Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:6586に記載）、抗ＣＤ２４（ＢＡ−１、１：１００腹水）（C.S.Abramsonら（1981）の、J.Immunol.126:83）、抗ＣＤ４０（ＪＲＧ１２）、および抗ＣＤ７２（Ｊ３−１０９，ＢＵ−４０、１：１００腹水）（B.Dorkenらの、Leucocyte Typing IV White cell differentiation antigens, W.Knappら編（Oxford,1989）、99頁に記載）。すべての（精製）ｍＡｂと融合蛋白は１０μｇ／ｍＬで使用した。増殖は実施例１の記載に従って測定した。結果を図３に示すが、これは４回の実験を代表するものである。
【００８０】
３つのｍＡｂ、すなわち、抗ＤＲ、抗ＬＦＡ−１、および抗ＬＦＡ−３のみがＴ細胞の不応答性を逆転させるＬＢＬ−ＤＲ７の能力を阻害した（すなわち、Ｔ細胞の不応答性の維持）（図３参照）。Ｂ７ファミリーのメンバー、およびＣＤ２４、ＣＤ４０ならびにＣＤ７２を含む他の細胞表面分子はいずれも、これら分子と結合するｍＡｂまたは融合蛋白に増殖反応を阻害する能力がないことから明らかなように、アネルギーを逆転させるのに重要でないようである。観察されたＬＢＬ−ＤＲ７介在性増殖の抗ＤＲによる阻害は、Ｔ細胞による抗原認識の阻害による。Ｔ細胞の不応答性は、抗原提示細胞上のＬＦＡ−３とアネルギー化Ｔ細胞の相互作用が阻害される時に維持されるため（例えば、抗ＬＦＡ−３抗体を用いてブロックすることによって）、観察された抗ＬＦＡ−３によるＬＢＬ−ＤＲ７介在性増殖の阻害は、ＬＦＡ−３がアネルギーの逆転に関与することと一致している。観察された抗ＬＦＡ−１ ｍＡｂによるＬＢＬ−ＤＲ７介在性増殖の阻害は、ＬＦＡ−１リガンドもアネルギーの逆転に関与し得ることを示唆している。ｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１細胞は持続的なＩＬ−２培養後のアネルギー化細胞の増殖を回復させないことから、ＩＣＡＭ−１はアネルギーの逆転に関与するＬＦＡ−３リガンドではないようである。しかしながら、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３を含む他のＬＦＡ−１リガンド、ＣＤ２／ＬＦＡ−３相互作用に加えて、アネルギーの逆転に関与することも考えられる。
実施例４：ＬＦＡ−３を用いる刺激によるＴ細胞の不応答性の逆転
【００８１】
ＬＦＡ−３およびアロ抗原が樹立されたアロ抗原特異的クローン性アネルギー状態を逆転させることができるかどうかを直接試験するために、ＣＯＳ細胞をトランスフェクトさせ、ＤＲ７のみ（ＣＯＳ−ＤＲ７）、Ｂ７−１およびＢ７−２単独（ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２）、またはＬＦＡ−３のみ（ＣＯＳ−ＬＦＡ−３）を発現させるか、または１つまたはそれ以上のこれら分子と一緒にＤＲ７を発現させた（ＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２、ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、およびＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２）。ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７β（ＤＲＢ１＊０７０１）鎖（ＣＯＳ−ＤＲ７）、Ｂ７−１およびＢ７−２（ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２）、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７β、Ｂ７−１およびＢ７−２（ＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２）、ＬＦＡ−３（ＣＯＳ−ＬＦＡ−３）、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７βおよびＬＦＡ−３（ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３）、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＤＲ７β、ＬＦＡ−３、Ｂ７−１およびＢ７−２（ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２）、またはｐＣＤＮＡＩベクターのみ（ＣＯＳ−ｍｏｃｋ）のいずれかをコードするｃＤＮＡでＣＯＳ細胞をトランスフェクトした。ＤＲ７およびＬＦＡ−３の発現は、それぞれ９−４９およびＴＳ２／９ｍＡｂと、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇを用いて評価し、Ｂ７−１とＢ７−２の発現はビオチニル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、次いでフィコエリスリン結合ストレプトアビジンを用いて評価した。ＬＦＡ−３とＤＲ７の共発現はＴＳ２／９、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇおよびフィコエリスリン結合９−４９を用いて評価し、トランスフェクトされた細胞の５０〜７２％に検出可能であった。ＤＲ７とＢ７−１／Ｂ７−２の共発現は、ＦＩＴＣ結合９−４９とビオチニル化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、次いでフィコエリスリン結合ストレプトアビジンを用いて評価し、トランスフェクトされた細胞の４０〜５０％に検出可能であった。使用前に、トランスフェクトされたＣＯＳは実施例１の記載に従ってマイトマイシン−Ｃで処理された。ｔ−ＤＲ７でアネルギーを誘発し、次いで組換え型ヒトＩＬ−２中で培養した後、ＴＣ−１細胞（２．５×１０４ 細胞／ウェル）を、２×１０４ 個／ウェルの各タイプのＣＯＳ−トランスフェクタントで再チャレンジした。増殖およびＩＬ−２の蓄積は実施例１の記載に従って測定した。結果を図４に示すが、これはＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、ＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２、およびＣＯＳ−ｍｏｃｋを用いた３回の実験と、ＣＯＳ−ＤＲ７、ＣＯＳ−ＬＦＡ−３、ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２、およびＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２トランスフェクタントを用いた２回の実験の結果を表している。ＣＯＳ−ＤＲ７、ＣＯＳ−Ｂ７−１／Ｂ７−２、ＣＯＳ−ＬＦＡ−３、およびＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２によるチャレンジは増殖やＩＬ−２の蓄積を誘導しなかった。これに対して、ＤＲ７とＬＦＡ−３を共発現するトランスフェクタント（ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、およびＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３／Ｂ７−１／Ｂ７−２）は増殖とＩＬ−２の蓄積を同レベルで誘導し、ＬＦＡ−３共刺激の存在下でアロ抗原に対する応答性が回復することを示した。
【００８２】
ＬＦＡ−３による刺激がアネルギーを逆転させ、アロ抗原特異的応答性を完全に回復させるかどうかを検討するため、ＴＣ−１細胞をアネルギー化し、ＩＬ−２中で培養し、ＬＢＬ−ＤＲ７、ＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３、またはＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２のいずれかと７２時間一緒に培養した。次いで、これをＬＢＬ−ＤＲ７からフィコール分離によって、およびＣＯＳトランスフェクタントからパーコールグラジエント遠心によって分離し、示した刺激物質で再チャレンジした。図５に示した結果は、ＬＢＬ−ＤＲ７刺激物質で再チャレンジしたときの５回の実験と、ＣＯＳトランスフェクタントを刺激物質として再チャレンジしたときの３回の実験の結果を表している。ＩＬ−２およびＬＢＬ−ＤＲ７またはＣＯＳ−ＤＲ７／ＬＦＡ−３で連続的に培養した後にあらかじめアネルギー化されたＴＣ−１細胞はｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１、ｔ−ＤＲ７／ＩＣＡＭ−１、およびＬＢＬ−ＤＲ７と反応した（図５、上段と中段参照）。これに対して、ＩＬ−２培養後にＣＯＳ−ＤＲ７／Ｂ７−１／Ｂ７−２を使用しても再チャレンジに対する応答はみられなかった（図５、下段参照）。すべての例において、ＴＣ−１細胞は外因性ＩＬ−２に対して同様の増殖を示した（図５）。このことは、ＩＬ−２中で少なくとも７日間アネルギー化ＴＣ−１を培養た後のＬＦＡ−３による刺激とアロ抗原の提示は、あらかじめ与えた不十分な共刺激シグナルの存在下でアロ抗原への応答性を回復させ、アロ抗原特異的アネルギーを逆転させるに十分であることを示している。
実施例５：ＩＬ−２中の培養によるアネルギー化Ｔ細胞上のＣＤ２ネオ−エピトープＴ１１．３の再発現
【００８３】
ＴＣ−１によるＣＤ２エピトープＴ１１．１およびＴ１１．２（ＣＤ２）、およびＴ１１．３（ＣＤ２Ｒ）の発現は、種々の培養条件下で、フローサイトメトリーによって試験した。アネルギー誘導の前後、および７日間のＩＬ−２との培養後のＴＣ−１細胞を、ＣＤ２分子のＴ１１．１、Ｔ１１．２、またはＴ１１．３エピトープに対する抗体、またはアイソタイプが一致した適切なコントロールで染色し、フローサイトメトリー分析（EPICS Elite Flow cytometer;Coulter）によって分析した。結果を図６に示す。図中、黒のピークはアイソタイプの一致したｍＡｂを用いた染色を示し、白いピークはＴ１１．１、Ｔ１１．２、またはＴ１１．３エピトープのいずれかに対するｍＡｂを用いた染色を示す。データは３回の実験の結果を表している。応答状態において、ＴＣ−１細胞はＴ１１．１、Ｔ１１．２、およびＴ１１．３エピトープを発現する。ｔ−ＤＲ７との培養によりＴＣ−１にアネルギーを誘発した（実施例１の記載に従って）後も、ＴＣ−１細胞はまだＴ１１．１とＴ１１．２を発現しているが、Ｔ１１．３（ＣＤ２Ｒ）の発現はもはや検出されない。ＩＬ−２と７日間の培養した後、明確にＴＣ−１細胞がアロ抗原とＬＦＡ−３の共刺激に対する応答性を回復した時に、Ｔ１１．３エピトープが再び発現する（図６参照）。さらに、非アネルギーＴＣ−１細胞はＴ１１．１またはＴ１１．２ｍＡｂとＴ１１．３とのマイトジェニックな（細胞分裂促進性の）組み合せによって増殖するが、アネルギー化ＴＣ−１細胞は増殖しない。７日間のＩＬ−２培養後、Ｔ１１．３エピトープの再発現に伴って、エネルギーＴＣ−１細胞は抗ＣＤ２ ｍＡｂのマイトジェニックな組み合せ（例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２ｍＡｂのいずれかとＴ１１．３）に対する応答性を回復する。アネルギー誘導後にＴＣ−１細胞に検出可能なＴ１１．３エピトープがみられないことは、単にＴ細胞増殖がみられないことによるものではなく、アネルギーの誘導に直接関与していた。
実施例６：Ｔ細胞のアネルギーの逆転におけるＣＤ２とＪＡＫ−３キナーゼとの関連
【００８４】
ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７細胞のいずれかで非アネルギー化ＴＣ−１細胞を刺激することによって、チロシンキナーゼＪＡＫ−１およびＪＡＫ−３のチロシンリン酸化が生じた。Ｔ細胞アネルギーの逆転におけるＪＡＫキナーゼの役割について試験するため、あらかじめアネルギー化したＴＣ−１細胞を種々の刺激物質でチャレンジし、次いでＪＡＫキナーゼによるリン酸化、およびＣＤ２との関連について試験した。非アネルギー化Ｔ細胞とは反対に、あらかじめアネルギー化したＴ細胞は、ｔ−ＤＲ７／Ｂ７−１またはＬＢＬ−ＤＲ７のいずれかでチャレンジしてもＪＡＫ−１またはＪＡＫ−３キナーゼのチロシンリン酸化を示さなかった。しかしながら、Ｔ細胞をＩＬ−２中で７日間培養した後に細胞をＬＢＬ−ＤＲ７で再チャレンジすると、ＪＡＫ−１およびＪＡＫ−３キナーゼの有意なリン酸化を生じた。ＩＬ−２培養後のこの期間は、Ｔ細胞がアロ抗原およびＬＦＡ−３刺激に対する応答性を回復する時間と一致する。この時点でＣＤ２にＪＡＫキナーゼファミリーのメンバーのいずれかとの関連がみられるかを検討するため、ＴＣ−１細胞溶解物をＣＤ２に対するモノクローナル抗体Ｔ１１．１、Ｔ１１．２、またはＴ１１．３で免疫沈降させ、免疫沈降物細胞を標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動した。ゲル上の蛋白をフィルターに移し、次いで共通抗ＪＡＫキナーゼ抗血清（Ｒ８０）またはＪＡＫ−３特異的抗血清を用いて免疫ブロティングを行った。この免疫ブロティング実験の結果を図７に示す。この実験によって、Ｔ細胞アネルギーの逆転において、ＣＤ２のＴ１１．３発現形と１１６ｋＤのＪＡＫキナーゼには関連があることが明らかとなった（図７、左欄参照）。さらに、この１１６ｋＤのＪＡＫキナーゼはＪＡＫ−３キナーゼに特異的な抗血清を用いる免疫ブロッティングによってＪＡＫキナーゼであることが確認された（図７、右欄参照）。
等価物
【００８５】
当業者は、本明細書に記載の発明の特定の態様に対する多くの等価物は、認識するかまたはごく普通の実験法を用いるだけで確認することができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】一次刺激を受けた後、人工抗原提示細胞またはリンパ芽球様細胞系による再チャレンジ（攻撃）に応答して起こるＴ細胞の増殖とＩＬ−２の産生を示す一連の棒グラフである。
【図２】ＩＬ−２中での培養および人工抗原提示細胞またはリンパ芽球様細胞系による刺激で起こる、アネルギー化Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図３】ＩＬ−２中での培養、およびリンパ芽球様細胞系の細胞表面分子に対する抗体の存在下でのリンパ芽球様細胞系による刺激で起こる、アネルギー化Ｔ細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図４】ＩＬ−２中での培養および人工抗原提示細胞による刺激で起こる、アネルギー化Ｔ細胞の増殖とアネルギー化Ｔ細胞によるＩＬ−２産生とを示す棒グラフである。
【図５】一次刺激、ＩＬ−２内での増殖、二次刺激および人工抗原提示細胞もしくはリンパ芽球様細胞系による再チャレンジで起こる、Ｔ細胞の増殖とＩＬ−２産生を示す一連の棒グラフである。
【図６】ＴＣ−１細胞、アネルギー化ＴＣ−１細胞、およびＩＬ−２内で培養された後のアネルギー化ＴＣ−１細胞でのＣＤ２エピトープ類すなわちＴ11.1、Ｔ11.2およびＴ11.3の発現を示す一連のグラフである。
【図７】抗ＣＤ２抗体（Ｔ11.1、Ｔ11.2またはＴ11.3）で免疫沈澱させ次いでＪＡＫキナーゼ特異的抗血清（Ｒ80）（左側パネル）またはＪＡＫ−３キナーゼ特異的抗血清（右側パネル）で免疫ブロットさせたＴ細胞タンパク質の免疫ブロットフィルターの写真であり、Ｔ11.3発現型のＣＤ２とＪＡＫ−３キナーゼの会合を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の刺激を阻害する物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする抗原に対するＴ細胞の不応答性を維持する方法。
【請求項２】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドの相互作用をブロックするものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の活性化を阻害する物質が細胞内で作用し、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害するものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
物質が細胞内で作用し、チロシンキナーゼ、ＪＡＫ−３の活性を阻害するものである請求項６の方法。
【請求項８】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞活性を阻害する物質を対象に投与することを特徴とする対象の抗原に対するＴ細胞の不応答性を維持する方法。
【請求項９】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックするものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害するＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害するものである請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
物質が細胞内で作用し、チロシンキナーゼ、ＪＡＫ−３の活性を阻害するものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらにＴ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を阻害する第二物質を対象に投与することを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
第二物質がＴ細胞成長因子の産生または機能を阻害する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞成長因子がＩＬ−２である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象がアロジェネイック（同種異系）またはゼノジェネイック（異種）な細胞のレシピエントであり、抗原が同種異系または異種細胞表面上に存在している請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、自己免疫疾患または不適切であるかまたは異常な免疫応答が関与している障害に罹患している請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する第一物質と、ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する第二物質を対象に投与することを特徴とする、対象の抗原に対するＴ細胞の不応答性を誘導し、維持する方法。
【請求項２１】
第一物質がＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体とＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドとの相互作用をブロックするものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドがＢ７−１およびＢ７−２からなる群から選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第一物質が抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｂ７−１抗体、および抗Ｂ７−２抗体からなる群から選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
第一物質が可溶性のＣＤ２８蛋白、可溶性のＣＴＬＡ４蛋白、可溶性のＢ７−１蛋白、および可溶性のＢ７−２蛋白からなる群から選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
第一物質がＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する第二物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックするものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第二物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第二物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
第二物質がＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害するものである請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
第二物質が細胞内で作用し、チロシンキナーゼ、ＪＡＫ−３の活性を阻害するものである請求項３０の方法。
【請求項３２】
さらに、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を阻害する第三物質を対象に投与することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
第三物質がＴ細胞成長因子の産生または機能を阻害するものである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｔ細胞成長因子がＩＬ−２である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗原が同種異系または異種細胞表面上に存在しており、対象が同種または異種細胞のレシピエントである請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
抗原が自己抗原である請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
抗原存在下で、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする抗原に対して不応答性のＴ細胞の抗原に対する不応答性を回復させる方法。
【請求項３８】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質がＣＤ２リガンドである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＣＤ２リガンドが抗原を発現している細胞表面上に存在する請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２リガンドをコードする核酸分子を細胞中に導入することによって、ＣＤ２リガンドを細胞表面上に発現させる請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
細胞が腫瘍細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質が少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体である請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体がＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープに結合する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激する第二物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
第二物質がＩＬ−２またはＩＬ−４である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｔ細胞が第一物質と接触する前にＩＬ−２またはＩＬ−４と接触する請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質、およびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第二物質を、抗原の存在下でＴ細胞と接触させることを特徴とする、抗原に対して不応答性のＴ細胞の抗原に対する応答を回復させる方法。
【請求項４９】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質がＣＤ２リガンドである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＣＤ２リガンドが抗原を発現している細胞表面上にある請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２リガンドをコードする核酸分子を細胞中に導入することによって、ＣＤ２リガンドを細胞表面上に発現させる請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
細胞が腫瘍細胞である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質が少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体である請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体がＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープと結合する請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第二物質がＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドである請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドが抗原を発現している細胞表面上に存在する請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドがＢ７−１またはＢ７−２である請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
細胞表面上にＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドをコードする核酸分子を細胞中に導入することによって、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを細胞表面上に発現させる請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
細胞が腫瘍細胞である請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
さらに、ＣＤ２表面受容体を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする第三物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
ＣＤ２表面受容体を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする第三物質がＴ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激するものである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
第三物質がＩＬ−２またはＩＬ−４である請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｔ細胞を、第一物質と接触させる前に、ＩＬ−２またはＩＬ−４と接触させる請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＣＤ２リガンドとＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように腫瘍細胞を修飾することを特徴とする腫瘍を有する対象のＴ細胞の腫瘍細胞に対する応答を刺激する方法。
【請求項６６】
腫瘍細胞表面上にＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ４リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ４リガンドをコードする少なくとも１つの核酸分子を腫瘍細胞中に導入することによって腫瘍細胞を修飾し、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８あるいはＣＴＬＡ４リガンドを発現させる請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
腫瘍細胞を対象から得、ex vivoで修飾して修飾された腫瘍細胞を形成し、さらに修飾された腫瘍細胞を対象に投与することを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
腫瘍細胞の第一試料を、ＣＤ２リガンドを発現させるように修飾して、修飾された腫瘍細胞の第一試料を形成させ、腫瘍細胞の第二試料を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現させるように修飾して、修飾された腫瘍細胞の第二試料を形成させる請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
修飾された腫瘍細胞の第一および第二試料を同時に対象に投与する請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
修飾された腫瘍細胞の第一および第二試料を同時に対象に投与する請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
さらに、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激する物質と対象のＴ細胞を接触させることを含む請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
該物質がＩＬ−２またはＩＬ−４である請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
Ｔ細胞を対象から得、ex vivoでＩＬ−２またはＩＬ−４と接触させ、対象にＴ細胞を再投与することを含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
修飾前にはＣＤ２リガンドを発現しておらず、修飾されてＣＤ２リガンドを発現する腫瘍細胞。
【請求項７５】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項７４に記載の腫瘍細胞。
【請求項７６】
修飾前にはＣＤ２リガンドまたは少なくとも１つのＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現しておらず、修飾されてＣＤ２リガンドまたは少なくとも１つのＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現する腫瘍細胞。
【請求項７７】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３であり、少なくとも１つのＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドがＢ７−１またはＢ７−２である請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の刺激を阻害する物質を対象に投与することを含む、対象の同種または異種細胞に対するＴ細胞の不応答性を維持する方法。
【請求項７９】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドの相互作用をブロックするものである請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドの相互作用をブロックする物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞活性化を阻害する物質が細胞内で作用することにより、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害する請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
対象が骨髄移植のレシピエントである請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
さらに、レシピエント中に移植される前に、ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の刺激を阻害する物質と骨髄細胞を接触させることを特徴とする請求項８４に記載の方法。
【請求項１】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の刺激を阻害する物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする抗原に対するＴ細胞の不応答性を維持する方法。
【請求項２】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドの相互作用をブロックするものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の活性化を阻害する物質が細胞内で作用し、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害するものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
物質が細胞内で作用し、チロシンキナーゼ、ＪＡＫ−３の活性を阻害するものである請求項６の方法。
【請求項８】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞活性を阻害する物質を対象に投与することを特徴とする対象の抗原に対するＴ細胞の不応答性を維持する方法。
【請求項９】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックするものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害するＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害するものである請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
物質が細胞内で作用し、チロシンキナーゼ、ＪＡＫ−３の活性を阻害するものである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらにＴ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を阻害する第二物質を対象に投与することを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
第二物質がＴ細胞成長因子の産生または機能を阻害する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞成長因子がＩＬ−２である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象がアロジェネイック（同種異系）またはゼノジェネイック（異種）な細胞のレシピエントであり、抗原が同種異系または異種細胞表面上に存在している請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
対象が、自己免疫疾患または不適切であるかまたは異常な免疫応答が関与している障害に罹患している請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する第一物質と、ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する第二物質を対象に投与することを特徴とする、対象の抗原に対するＴ細胞の不応答性を誘導し、維持する方法。
【請求項２１】
第一物質がＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体とＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドとの相互作用をブロックするものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドがＢ７−１およびＢ７−２からなる群から選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第一物質が抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｂ７−１抗体、および抗Ｂ７−２抗体からなる群から選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
第一物質が可溶性のＣＤ２８蛋白、可溶性のＣＴＬＡ４蛋白、可溶性のＢ７−１蛋白、および可溶性のＢ７−２蛋白からなる群から選ばれる請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
第一物質がＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する第二物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックするものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第二物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第二物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
第二物質がＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害するものである請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
第二物質が細胞内で作用し、チロシンキナーゼ、ＪＡＫ−３の活性を阻害するものである請求項３０の方法。
【請求項３２】
さらに、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を阻害する第三物質を対象に投与することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
第三物質がＴ細胞成長因子の産生または機能を阻害するものである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｔ細胞成長因子がＩＬ−２である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗原が同種異系または異種細胞表面上に存在しており、対象が同種または異種細胞のレシピエントである請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
抗原が自己抗原である請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
抗原存在下で、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする抗原に対して不応答性のＴ細胞の抗原に対する不応答性を回復させる方法。
【請求項３８】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質がＣＤ２リガンドである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＣＤ２リガンドが抗原を発現している細胞表面上に存在する請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２リガンドをコードする核酸分子を細胞中に導入することによって、ＣＤ２リガンドを細胞表面上に発現させる請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
細胞が腫瘍細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する物質が少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体である請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体がＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープに結合する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
さらに、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激する第二物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
第二物質がＩＬ−２またはＩＬ−４である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｔ細胞が第一物質と接触する前にＩＬ−２またはＩＬ−４と接触する請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質、およびＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第二物質を、抗原の存在下でＴ細胞と接触させることを特徴とする、抗原に対して不応答性のＴ細胞の抗原に対する応答を回復させる方法。
【請求項４９】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質がＣＤ２リガンドである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＣＤ２リガンドが抗原を発現している細胞表面上にある請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞表面上にＣＤ２リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２リガンドをコードする核酸分子を細胞中に導入することによって、ＣＤ２リガンドを細胞表面上に発現させる請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
細胞が腫瘍細胞である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第一物質が少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体である請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの抗ＣＤ２抗体がＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープと結合する請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４表面受容体を介してＴ細胞を刺激する第二物質がＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドである請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドが抗原を発現している細胞表面上に存在する請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドがＢ７−１またはＢ７−２である請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
細胞表面上にＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドをコードする核酸分子を細胞中に導入することによって、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを細胞表面上に発現させる請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
細胞が腫瘍細胞である請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
さらに、ＣＤ２表面受容体を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする第三物質とＴ細胞を接触させることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
ＣＤ２表面受容体を介する刺激に対してＴ細胞をプライムする第三物質がＴ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激するものである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
第三物質がＩＬ−２またはＩＬ−４である請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｔ細胞を、第一物質と接触させる前に、ＩＬ−２またはＩＬ−４と接触させる請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＣＤ２リガンドとＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現するように腫瘍細胞を修飾することを特徴とする腫瘍を有する対象のＴ細胞の腫瘍細胞に対する応答を刺激する方法。
【請求項６６】
腫瘍細胞表面上にＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ４リガンドを発現するのに適した形のＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ４リガンドをコードする少なくとも１つの核酸分子を腫瘍細胞中に導入することによって腫瘍細胞を修飾し、ＣＤ２リガンドおよびＣＤ２８あるいはＣＴＬＡ４リガンドを発現させる請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
腫瘍細胞を対象から得、ex vivoで修飾して修飾された腫瘍細胞を形成し、さらに修飾された腫瘍細胞を対象に投与することを含む請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
腫瘍細胞の第一試料を、ＣＤ２リガンドを発現させるように修飾して、修飾された腫瘍細胞の第一試料を形成させ、腫瘍細胞の第二試料を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現させるように修飾して、修飾された腫瘍細胞の第二試料を形成させる請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
修飾された腫瘍細胞の第一および第二試料を同時に対象に投与する請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
修飾された腫瘍細胞の第一および第二試料を同時に対象に投与する請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
さらに、Ｔ細胞のＣＤ２表面受容体上のＴ１１．３ネオ−エピトープの露出を刺激する物質と対象のＴ細胞を接触させることを含む請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
該物質がＩＬ−２またはＩＬ−４である請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
Ｔ細胞を対象から得、ex vivoでＩＬ−２またはＩＬ−４と接触させ、対象にＴ細胞を再投与することを含む請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
修飾前にはＣＤ２リガンドを発現しておらず、修飾されてＣＤ２リガンドを発現する腫瘍細胞。
【請求項７５】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項７４に記載の腫瘍細胞。
【請求項７６】
修飾前にはＣＤ２リガンドまたは少なくとも１つのＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現しておらず、修飾されてＣＤ２リガンドまたは少なくとも１つのＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドを発現する腫瘍細胞。
【請求項７７】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３であり、少なくとも１つのＣＤ２８またはＣＴＬＡ４リガンドがＢ７−１またはＢ７−２である請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の刺激を阻害する物質を対象に投与することを含む、対象の同種または異種細胞に対するＴ細胞の不応答性を維持する方法。
【請求項７９】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞刺激を阻害する物質がＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドの相互作用をブロックするものである請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＣＤ２リガンドがＬＦＡ−３である請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドとの相互作用をブロックする物質が抗ＣＤ２抗体および抗ＣＤ２リガンド抗体からなる群から選ばれる請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
ＣＤ２表面受容体とＣＤ２リガンドの相互作用をブロックする物質が可溶性のＣＤ２蛋白および可溶性のＣＤ２リガンド蛋白からなる群から選ばれる請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞活性化を阻害する物質が細胞内で作用することにより、ＣＤ２表面受容体を介してＴ細胞中に誘発される細胞内シグナルを阻害する請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
対象が骨髄移植のレシピエントである請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
さらに、レシピエント中に移植される前に、ＣＤ２表面受容体を介するＴ細胞の刺激を阻害する物質と骨髄細胞を接触させることを特徴とする請求項８４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−１２６４８１（Ｐ２００７−１２６４８１Ａ）
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８９４７（Ｐ２００７−２８９４７）
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【分割の表示】特願平７−５２３６３０の分割
【原出願日】平成７年３月８日（１９９５．３．８）
【出願人】（５９１１８３９９１）ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【分割の表示】特願平７−５２３６３０の分割
【原出願日】平成７年３月８日（１９９５．３．８）
【出願人】（５９１１８３９９１）ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ， ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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