Ｔ細胞受容体機能調節剤及びそのスクリーニング方法
【課題】本発明は、Ｔ細胞の活性化及び発生分化を調節するメカニズムを解析し、それを担う因子を同定すること、及び獲得免疫系における新たな機序の医薬やそのスクリーニング方法等を提供することを課題とする。
【解決手段】ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤や獲得免疫系の異常により引き起こされる疾患の予防・治療剤等、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含むＴ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法等。
【解決手段】ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤や獲得免疫系の異常により引き起こされる疾患の予防・治療剤等、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含むＴ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴ細胞受容体機能調節剤、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）（例えば、ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８）は、哺乳動物において、ユビキタスに発現し、そして広範で多様な機能（免疫調節及び免疫活性化が挙げられる）を調節する（非特許文献１、２）。ＭＡＰＫ活性の異常は、種々の免疫媒介性病理学的状態（例えば、慢性関節リウマチ及び炎症性腸疾患）と関連していることが知られている（非特許文献３、４）。ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、及びＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）を介した、保存されたカスケードにより、活性化される。ＭＡＰ３Ｋファミリーの多くのメンバー（ＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ２、ＭＥＫＫ３、ＭＥＫＫ４、ＡＳＫ１、ＴＡＫ１及びＴｐｌ２が挙げられる）が同定されている（非特許文献５）。しかし、特定のシグナル伝達経路及び生理学的プロセスにおけるこれらの具体的な機能は、十分には解明されていない。
【０００３】
一部のＭＡＰ３Ｋは、自然免疫細胞のＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）刺激に対する応答及び炎症性サイトカインに対する応答を、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）活性及びＪＮＫ活性を制御することにより、調節することが知られている（非特許文献６、７）。例えば、ＴＡＫ１は、ＴＮＦα、ＩＬ−１及びＬＰＳ刺激後に、ＩＫＫ及びＪＮＫを活性化することが報告されている（非特許文献８〜１０）。しかし、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫのＴＬＲ８による活性化は、ＴＡＫ１非依存性であり（非特許文献１１）、そしてＩＬ−１によるＩＫＫ活性化は、ＴＡＫ１欠損細胞では完全には阻害されなかった（非特許文献９、１０）。このことは、ＩＫＫ及びＪＮＫ活性化の、ＴＡＫ１非依存性のメカニズムの存在を示唆している。これは、他のＭＡＰ３Ｋ（例えば、ＭＥＫＫ２又はＭＥＫＫ３）により媒介され得る。実際、ＭＥＫＫ３欠損ＭＥＦ(mouse embryo fibroblast)細胞では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化に遅延がある（非特許文献１２、１３）。さらに、ＭＥＫＫ２ノックダウンＭＥＦは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１刺激後にＮＦ−κＢ活性化の遅延相(late phase)を誘導できなかった（非特許文献１４）。
炎症性応答及び自然免疫応答におけるＭＥＫＫ２及びＭＥＫＫ３の、確証されたこのような役割とは対照的に、獲得免疫におけるこれらの役割は、それほど明らかではなく、そして幾分議論の的となっている。
【０００４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、獲得免疫応答の最も中枢に位置する。ＴＣＲによる抗原認識は、複数の細胞内シグナル伝達経路（カスケード）を誘導する。そのうちの一つは、ＩＫＫを介して転写因子ＮＦ−κＢを活性化する。転写因子ＮＦ−κＢの活性化は、獲得免疫応答におけるＴ細胞の増殖や分化に重要である。プロテインキナーゼＣθ（ＰＫＣθ）、足場蛋白であるＣＡＲＭＡ１（ＣＡＲＤ１１とも称される）、ＣＡＲＤ(caspase recruitment domain)をもつ蛋白Ｂｃｌ１０、およびパラカスパーゼ（カスパーゼ関連プロテアーゼ）であるＭＡＬＴ１が関与しているシグナル伝達経路は、ＴＣＲとＩＫＫ複合体を結びつける必須の中間経路であることが明らかにされつつある（非特許文献１５）。しかし、シグナル伝達経路の活性化を開始するＴＣＲ近傍の現象はほとんど明らかにされていない。このシグナル伝達経路の態様をさらに解明することにより、免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供することが切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dong, C., Davis, R. J., and Flavell, R. A. (2002). MAP kinases in the immune response. Annu. Rev. Immunol. 20, 55-72.
【非特許文献２】Raman, M., Chen, W., and Cobb, M. H. (2007). Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene 26, 3100-3112.
【非特許文献３】Hollenbach, E., Neumann, M., Vieth, M., Roessner, A., Malfertheiner, P., and Naumann, M. (2004). Inhibition of p38 MAP kinase- and RICK/NF-kB-signaling suppresses inflammatory bowel disease. FASEB J. 18, 1550-1552.
【非特許文献４】Johnson, G. L., and Lapadat, R. (2002). Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science 298, 1911-1912.
【非特許文献５】Cuevas, B. D., Abell, A. N., and Johnson, G. L. (2007). Role of mitogen-activated protein kinase kinase kinases in signal integration. Oncogene 26, 3159-3171.
【非特許文献６】Hacker, H., and Karin, M. (2006). Regulation and function of IKK and IKK-related kinases. Sci. STKE 2006, re13.
【非特許文献７】Schulze-Luehrmann, J., and Ghosh, S. (2006). Antigen-receptor signaling to nuclear factor k B. Immunity 25, 701-715.
【非特許文献８】Adhikari, A., Xu, M., and Chen, Z. J. (2007). Ubiquitin-mediated activation of TAK1 and IKK. Oncogene 26, 3214-3226.
【非特許文献９】Sato, S., Sanjo, H., Takeda, K., Ninomiya-Tsuji, J., Yamamoto, M., Kawai, T., Matsumoto, K., Takeuchi, O., and Akira, S. (2005). Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 6, 1087-1095.
【非特許文献１０】Shim, J. H., Xiao, C., Paschal, A. E., Bailey, S. T., Rao, P., Hayden, M. S., Lee, K. Y., Bussey, C., Steckel, M., Tanaka, N., et al. (2005). TAK1, but not TAB1 or TAB2, plays an essential role in multiple signaling pathways in vivo. Genes Dev. 19, 2668-2681.
【非特許文献１１】Qin, J., Yao, J., Cui, G., Xiao, H., Kim, T. W., Fraczek, J., Wightman, P., Sato, S., Akira, S., Puel, A., et al. (2006). TLR8-mediated NF-kB and JNK activation are TAK1-independent and MEKK3-dependent. J. Biol. Chem. 281, 21013-21021.
【非特許文献１２】Huang, Q., Yang, J., Lin, Y., Walker, C., Cheng, J., Liu, Z. G., and Su, B. (2004). Differential regulation of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor signaling by MEKK3. Nat. Immunol. 5, 98-103.
【非特許文献１３】Yang, J., Boerm, M., McCarty, M., Bucana, C., Fidler, I. J., Zhuang, Y., and Su, B. (2000). Mekk3 is essential for early embryonic cardiovascular development. Nat. Genet. 24, 309-313.
【非特許文献１４】Schmidt, C., Peng, B., Li, Z., Sclabas, G. M., Fujioka, S., Niu, J., Schmidt-Supprian, M., Evans, D. B., Abbruzzese, J. L., and Chiao, P. J. (2003). Mechanisms of proinflammatory cytokine-induced biphasic NF-kB activation. Mol. Cell 12, 1287-1300.
【非特許文献１５】Thome M, (2004) CARMA1, BCL-10 and MALT1 in lymphocyte development and activation. Nature reviews. Immunology 348-359.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、獲得免疫系において、Ｔ細胞の活性化及び発生分化を調節するメカニズムをさらに解析し、このメカニズムを担う因子を同定すること、並びに得られた知見に基づいて新たな機序の医薬やそのスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、ＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウトマウスにおいてＴ細胞の発生分化や機能が著しく障害され、獲得免疫応答が不全であることを見出した。さらにＭＥＫＫ３が、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０およびＭＡＬＴ１からなるマクロ分子複合体、特にＣＡＲＭＡ１と効率的に相互作用すること等から、ＭＥＫＫ３がＴ細胞受容体媒介シグナル伝達に欠くことができない分子であり、Ｔ細胞の発生分化及び機能を調節し得ること、免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子として有用であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の発明等を提供する。
［１］ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
［２］ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質である、上記［１］記載の剤。
［３］ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質である、上記［１］記載の剤。
［４］医薬である、上記［１］記載の剤。
［５］獲得免疫の異常により引き起こされる疾患の予防・治療剤である、上記［４］記載の剤。
［６］Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療剤である、上記［４］記載の剤。
［７］Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患が、免疫不全症候群（複合免疫不全症、もしくはこれに伴う重篤な感染症など）からなる群より選択される、上記［６］記載の剤。
［８］Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療剤である、上記［４］記載の剤。
［９］Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患が、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ・多発性硬化症・多発性筋炎・重症筋無力症、ギランバレー症候群、全身性エリテマトーデス等）からなる群より選択される、上記［８］記載の剤。
［１０］被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１１］以下の工程を含む、上記［１０］記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を亢進し得る物質として選択する工程。
［１２］以下の工程を含む、上記［１０］記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を抑制し得る物質として選択する工程。
［１３］生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
［１４］ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定用試薬を含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
［１５］ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
［１６］ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１７］生体試料における、ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
［１８］被検物質がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１９］ＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＴ細胞受容体機能調節剤（以下、ＴＣＲ機能調節剤とも称する）は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し、新たなメカニズムの免疫疾患予防・治療剤等として有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでＴ細胞受容体の機能を調節し得る物質を得ることができるので、免疫調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究等に有用である。
本発明の動物は、Ｔ細胞受容体の機能の解析、Ｔ細胞受容体機能の異常により引き起こされる各種疾患の予防・治療剤の開発等に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＭＥＫＫ３のＴ細胞特異的遺伝子ターゲティングを説明する模式図である。（Ａ）コンディショナルターゲティングベクターの構築。ＭＥＫＫ３遺伝子のエキソン１１及び１２を含むゲノム断片を欠失させた。エキソン１１は、キナーゼ活性に必要不可欠なＡＴＰ結合部位（Ｋ３９１）をコードする。１つのｌｏｘＰ部位を、イントロン１０の中に導入し、ネオマイシン耐性遺伝子カセットに隣接する２つのｌｏｘＰ部位をイントロン１２の中に導入した。（Ｂ）ＭＥＫＫ３遺伝子型を、以下のプライマー対：Ｐ１−CTCCTGGGTCAAGGTGCCTTCGGCAGGGTCTACTTGTGCT（配列番号８）及びＰ２−AACTGGATCTCACACTCCAGAGCACTCACCTCCTAGAGA（配列番号９）（ｆｌｏｘアレルに関して）、又はＰ３−TCAGAATGATCTAATGTTTGTGAGCAGCTT（配列番号１０）及びＰ４−TCACTATGCTGACCAGCTGGCCTCACAGTGCACAGA（配列番号１１）（Δ−アレルに関して）、を用いたＰＣＲにより解析した。ゲノムＤＮＡを、全胸腺細胞（Ｔｈｙ）、ＣＤ５ポジティブ脾細胞（Ｓｐｌ）、ＣＤ４ポジティブ（ＣＤ４＋）、又はＣＤ８ポジティブ（ＣＤ８＋）脾細胞より単離した。（Ｃ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウスのＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞由来のＭＥＫＫ３タンパク質のウエスタンブロット解析。
【図２】図２は、ＭＥＫＫ３が、正常なＴ細胞の発生分化に必要不可欠なことを示した図である。（Ａ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）の胸腺（Ｔｈｙ）、脾臓（Ｓｐｌ）、及び末梢血（ＰＢ）由来のリンパ球のフローサイトメトリーの結果。各ボックスの数は、集団の割合を示す。（Ｂ）胸腺細胞（Ｔｈｙ）又は脾細胞（Ｓｐｌ）の細胞数。Ｐは、細胞数の有意差を示す（ｎ＝８）。
【図３】図３は、Ｔ−ＫＯマウス由来の末梢Ｔ細胞（ＭＥＫＫ３欠損を有する末梢Ｔ細胞）が活性化された表現型を有することを説明する図である。（Ａ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｓｐｌ ＣＤ４＋）でのＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌ発現についてフローサイトメトリーを行なった結果。典型的な２つのデータを示す。各ボックスにおける数は、集団の割合を示す。（Ｂ）細胞を２４時間、所定濃度の抗ＣＤ３ Ａｂ又は抗ＣＤ３ Ａｂと抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した後のＣＤ４＋脾細胞のサイトカイン産生を測定した結果。有意差を、Ｐ値として示す（ｎ＝４）。（Ｃ）脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現についてフローサイトメトリーを行なった結果。（Ｄ）ＰＩ染色後に、自発的細胞死を、フローサイトメトリーにより評価した。胸腺（Ｔｈｙ）、ＣＤ４＋脾細胞（Ｓｐｌ ＣＤ４＋）、又はＣＤ８＋脾細胞（Ｓｐｌ ＣＤ８＋）由来の細胞を、所定時間、刺激することなく培養した。これらの実験では、有意差は観察されなかった（ｎ＝４）。（Ｅ）Ｃｏｎ．Ａ及びＣｏｎ．Ａ阻害剤であるα−メチル−Ｄ−マンノシドを用いて、活性化によって誘導される細胞死を測定した。精製したＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞を用いた。これらの実験では、有意差は観察されなかった（ｎ＝４）。
【図４】図４は、ＭＥＫＫ３がＴＣＲ媒介性の細胞応答に必要であることを説明する図である。（Ａ及びＢ）ＴＣＲ刺激により誘導される細胞増殖（Ａ）及びサイトカイン産生（Ｂ）。Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を、所定濃度（μｇ／ｍｌ）の抗ＣＤ３ Ａｂでコーティングしたプレート中で、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂあり（ＣＤ３／ＣＤ２８）又はなし（ＣＤ３）で、４８時間培養した。ＩＬ−２又はＩＦＮ−γのレベルを、２４時間培養した後の培養上清を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、決定した。データを、三連の培養物の平均±標準偏差として示す（ｎ＝３）。有意差を、Ｐ値として示す。（Ｃ）活性化マーカーとしてのＣＤ２５発現のフローサイトメトリー解析の結果。精製したＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を、抗ＣＤ３ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）プラス抗ＣＤ２８ Ａｂ（２μｇ／ｍｌ）で、処理しなかったか（−）又は４８時間刺激し（＋）、ＣＤ２５に対するＡｂで染色した。
【図５】図５は、ＭＥＫＫ３が末梢Ｔ細胞におけるＴＣＲ媒介性の細胞応答に必要であることを説明する図である。（Ａ及びＢ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来の精製したＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋脾臓Ｔ細胞の、細胞増殖（Ａ）及びサイトカイン産生（Ｂ）について調べた結果を示す。細胞を、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４の抗体を用いてそれぞれ染色した後に直接的に選別し、そして１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ Ａｂコーティングプレート中で、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂとともに（ＣＤ３／ＣＤ２８）又は１００ｎｇのＰＭＡ及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂをプラスして（ＰＭＡ／ＣＤ２８）、４８時間培養した。ＩＬ−２又はＩＦＮ−γのレベルを、２４時間培養した上清を用いるＥＬＩＳＡにより決定した。データを、三連の培養物の平均±標準偏差として示す（ｎ＝１０）。有意差を、Ｐ値として示す。（Ｃ及びＤ）エフェクターＴ細胞を解析した結果。ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘマウス由来の脾細胞を、Ｃｒｅ及びＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｒｅ）又は単にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｍｏｃｋ；偽感染）をコードするレトロウイルスを用いて、後述の（材料及び方法）に記載のようにしてトランスインフェクトした。細胞増殖（Ｃ）及びサイトカイン産生（Ｄ）を、それぞれ（Ａ）及び（Ｂ）と同様に解析した。データは、２つの実験のうちの代表の三連の培養物からの結果である。（Ｅ）エフェクターＴ細胞のサイトカイン応答を調べた結果。細胞を、（Ｃ、Ｄ）と同様に調製した。刺激物質としてのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−７）は、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【図６】図６は、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ刺激により誘導される、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、及びｐ３８の活性化（ＭＡＰＫ活性化）に必要であることを説明する図である。（Ａ）ＭＡＰＫのイムノブロット解析の結果。Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来の精製したＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を、５分間刺激した。（Ｂ）未刺激の（ナイーブな）ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞（野生型マウス由来、Ｔ−ＫＯマウス由来）のＮＦ−κＢ活性を、ＥＭＳＡにより解析した結果。（Ｃ）ＴＣＲ刺激に応答するＩκＢαリン酸化について調べた結果。
【図７】図７は、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介シグナル伝達において、ポジティブにＴＡＫ１及びその後のＮＦ−κＢ活性化を調節することを説明する図である。（Ａ）インビトロＭＥＫＫ３キナーゼアッセイの結果。細胞溶解物（２×１０７）を、所定の遺伝子型のＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞から調製した。リン酸化状態を、抗ホスホ−セリン及びスレオニン（Ｐ−ＳＴ）Ａｂにより検出した。基質として、ＭＫＫ６又はＭＥＫＫ３それ自体を用いた。（Ｂ）ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との誘導可能な相互作用を調べた結果。（Ａ）における細胞溶解物と同一の細胞溶解物を、抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂにより免疫沈降し、抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂにより検出した。（Ｃ）ｓｈＲＮＡのＭＥＫＫ３タンパク質発現に対する影響を調べた結果。ＭＥＫＫ３−ノックダウン（ＭＥＫＫ３−ｋｄ）及びコントロール（ｃｔｌ−ｋｄ）について調べた。（Ｄ）ＭＥＫＫ３ノックダウン細胞におけるＴＣＲ誘導ＩκＢαリン酸化及びＩＫＫ活性化について調べた結果。全細胞溶解物（ＷＣＬ）中のＩκＢαリン酸化を、抗ホスホＩκＢαにより検出した。ＩＫＫキナーゼ活性に関して、ＩＫＫを免疫沈降し、そのキナーゼ活性を、基質としてのＩＫＫβ Ａｂ又はＩκＢα−ＧＳＴのリン酸化により評価し、それぞれ抗ホスホＩＫＫβ Ａｂ又は抗ホスホＩκＢα Ａｂにより検出した。（Ｅ）ＭＥＫＫ３ノックダウンのＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、及びＴＡＫ１の複合体の形成に対する影響を調べた結果。細胞溶解物（２×１０７）を抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂにより免疫沈降し、抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂ、抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂ、抗ＴＡＫ１ Ａｂ、抗ＭＡＬＴ１ ｍＡｂ、及び抗Ｂｃｌ１０ ｍＡｂにより検出した。下側パネルは、全細胞溶解物（ＷＣＬ）のブロット像である。（Ｆ）ＴＡＫ１キナーゼアッセイの結果を示す。ＴＣＲ刺激により誘導されるＴＡＫ１活性化を、基質としてのＩＫＫβ−ＧＳＴ又はＴＡＫ１それ自体に対するインビトロリン酸化活性により決定し、抗ホスホＩＫＫβ Ａｂ又は抗ホスホ−セリン及びスレオニン（Ｐ−ＳＴ）Ａｂにより検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１２】
（ＴＣＲ機能調節剤）
本発明はＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、ＴＣＲ機能調節剤を提供する。
ＭＥＫＫ３の発現とは、ＭＥＫＫ３遺伝子から転写、翻訳を経て蛋白質が生成される過程を意味し、該蛋白質は、機能的な状態でその作用部位に局在する。
【００１３】
ＭＥＫＫ３の機能とは、ＭＥＫＫ３（蛋白質）が有する生物学的機能（活性）をいい、例えば、ＭＥＫＫ３が有する蛋白質キナーゼ活性（セリン／スレオニンキナーゼ活性）や、Ｔ細胞受容体媒介シグナル伝達（ＴＣＲ媒介シグナル伝達）に関与する他の分子（例えば、後述するが、アダプター分子であるＣＡＲＭＡ１等）との相互作用、等をいう。「相互作用」とは分子同士の直接的な結合、又は他の分子を介する間接的な結合をいう。該結合は共有結合又は非共有結合であり得るが、非共有結合が好ましい。非共有結合としては、水素結合、静電結合、ファン・デル・ワールス力、疎水結合等が挙げられる。
【００１４】
Ｔ細胞受容体機能（ＴＣＲ機能）とは、Ｔ細胞受容体からの刺激を細胞内へ伝達し、Ｔ細胞の機能的変化を誘導し得る作用、或いはその誘導過程に存在する種々の反応を誘導し得る作用をいう。一連の誘導過程をシグナル伝達、あるいはシグナルカスケードとも称する。Ｔ細胞受容体からの刺激としては、抗原や抗原ミミック等による刺激が挙げられる。抗原（ペプチド、脂質等）は、通常ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ）上に提示され、抗原とＭＨＣ分子との複合体がＴ細胞受容体により認識される。また抗原ミミックとしては、Ｔ細胞受容体やＴ細胞受容体複合体を構成する分子（ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖等）に対する抗体等が挙げられるが、これに限定されない。Ｔ細胞の機能的変化としては、Ｔ細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロンγ等）産生、細胞障害活性）、発生分化、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。Ｔ細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、Ｔ細胞受容体からのシグナル伝達に関与する分子の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、ＲＡＦＴへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【００１５】
Ｔ細胞受容体からのシグナル伝達には、ＮＦ−ＡＴの活性化へ至る経路と、ＮＦ−κＢの活性化へ至る経路があり、活性化されたこれらの転写因子が標的遺伝子の発現をコントロールする。ＰＫＣθはＣＡＲＭＡ−１／Ｂｃｌ１０／ＭＡＬＴ１のマクロ分子複合体と協調して、ＮＦ−κＢの活性化へ関与する（非特許文献１５）。
【００１６】
後述の実施例等で示されるように、ＴＣＲ媒介シグナル伝達後にＭＥＫＫ３がアダプター分子であるＣＡＲＭＡ−１と相互作用し、そしてポジティブにキナーゼＴＡＫ１を調節し、ＩＫＫを活性化し、続いてＮＦ−κＢの活性化を引き起こす。
【００１７】
本発明のＴＣＲ機能調節剤の一実施態様では、該調節剤に含められる、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質であり得る。
ＭＥＫＫ３の発現を促進する物質は、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書で使用される場合、ＭＥＫＫ３の発現の促進としては、ＭＥＫＫ３自体の補充をも含むものとする。
【００１８】
ＭＥＫＫ３の機能を促進する物質は、ＭＥＫＫ３に結合し、該蛋白質を修飾（リン酸化等）し、或いは該蛋白質の安定性を増加させること等により、上述のＭＥＫＫ３の機能（例えば、他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）を促進する作用を有する化合物をいう。
【００１９】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）ＭＥＫＫ３；
（ｉｉ）ＭＥＫＫ３をコードする核酸。
【００２０】
本発明の剤に含められる、ＭＥＫＫ３としては、任意の哺乳動物のＭＥＫＫ３を用いることが出来る。
【００２１】
哺乳動物としては、具体的にはヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることが出来る。
【００２２】
哺乳動物のＭＥＫＫ３としては野生型のＭＥＫＫ３が好ましく、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＭＥＫＫ３等が挙げられる。ＭＥＫＫ３は、哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、本発明においてはそのようなＭＥＫＫ３もまた本発明の剤に含めることができる。用いるＭＥＫＫ３の由来は、本発明の剤や医薬、スクリーニング方法の対象となる動物の種類に応じて適宜選択される。
さらに、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同一のアミノ酸配列からなるＭＥＫＫ３も本発明の範囲内である。「実質的に同一のアミノ酸配列を有するＭＥＫＫ３」としては、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同質の活性を有するＭＥＫＫ３等が挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）等の同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている(例えば、Bowieら,Science, 247: 1306-1310 (1990)を参照)。
【００２３】
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２４】
「実質的に同質の活性」とは、例えば、ＭＥＫＫ３の機能（活性）が性質的に野生型ＭＥＫＫ３と同質であることを示す。したがって、その機能（活性）の程度や蛋白質の分子量等の量的要素は異なっていてもよい。ここにいうＭＥＫＫ３の機能（活性）としては、上述の機能（他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）のほか、Ｔ細胞受容体を介したＴ細胞の機能的変化（上述）が挙げられる。該機能の測定は、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞にＭＥＫＫ３を強制発現させ、該細胞のＴ細胞受容体からの刺激に対する応答（細胞増殖、サイトカイン産生等）の変化を測定することにより行うことができる。
【００２５】
また、本発明において用いられるＭＥＫＫ３は、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同質の活性を有する蛋白質をも含む。該蛋白質としては、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列に、更に１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜２５０個程度、より好ましくは１〜１００個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同質の活性を有する蛋白質が挙げられる。付加されるアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば蛋白質の検出や精製等を容易にならしめるためのタグや、蛋白質の細胞内への導入を容易にならしめるためのProtein Transduction Domain（ＰＴＤ）等のアミノ酸配列を挙げることが出来る。より具体的には、タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光蛋白質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を挙げることが出来る。また、ＰＴＤとしては、ＡＮＴＥＮＮＡＰＥＤＩＡ、ＨＩＶ／ＴＡＴ、ＨＳＶ／ＶＰ−２２等の細胞通過ドメイン、７〜１１個のポリアルギニン等を挙げることが出来る。アミノ酸が付加される位置は、当該蛋白質の活性を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列の末端（Ｎ末端又はＣ末端）である。
【００２６】
本発明で用いられるＭＥＫＫ３は必要に応じて修飾されていてもよい。該修飾としては、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００２７】
ＭＥＫＫ３は所望により自体公知の方法によって塩として用いることができる。塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
【００２８】
ＭＥＫＫ３は、該ＭＥＫＫ３を発現する細胞から回収され得る蛋白質、又は組換え蛋白質であり得る。ＭＥＫＫ３は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）天然のＭＥＫＫ３発現細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）からＭＥＫＫ３を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＭＥＫＫ３発現ベクター（後述）を導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生されるＭＥＫＫ３を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりＭＥＫＫ３を合成してもよい。ＭＥＫＫ３は、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ＭＥＫＫ３抗体の使用等の特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法等により適宜精製される。
【００２９】
ＭＥＫＫ３は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＭＥＫＫ３を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチド（蛋白質）を製造することができる。
【００３０】
ＭＥＫＫ３発現ベクターを導入して得られる形質転換体よりＭＥＫＫ３を産生・回収する方法としては、例えば以下のようにして実施される。
ＭＥＫＫ３発現ベクターはＭＥＫＫ３をコードする核酸を含有する。ＭＥＫＫ３をコードする核酸としては、ＭＥＫＫ３をコードするｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、染色体ＤＮＡ等が挙げられ、より具体的には、例えば配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する核酸等が挙げられる。ＭＥＫＫ３をコードする核酸は、哺乳動物の種類等によってその配列が異なる場合があり、本発明においてはそのような核酸もまた用いることができる。用いるＭＥＫＫ３をコードする核酸の由来は、取得を所望するＭＥＫＫ３の種類に応じて適宜選択される。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。ＭＥＫＫ３をコードする核酸は、該核酸の一部分を有する合成プライマーと、該核酸を有する染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。
【００３１】
ＭＥＫＫ３をコードする核酸を含有する発現ベクターは、クローン化された該核酸を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、用いる宿主に応じて適切なベクター（プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等）を選択することが出来る。また、プロモーターも、用いる宿主に対応して、適切なものを選択することが出来る。
【００３２】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)等）、酵母（サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（サル細胞（ＣＯＳ−７等）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ細胞等）等）等が用いられる。
【００３３】
ＭＥＫＫ３をコードする核酸を含有する発現ベクターを、自体公知の方法に従って宿主へ導入することにより、ＭＥＫＫ３を発現可能な形質転換体を製造することが出来る。
【００３４】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができ、形質転換体の細胞内又は細胞外にＭＥＫＫ３を生成させることができる。更に、前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ＭＥＫＫ３を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
【００３５】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質としてＭＥＫＫ３をコードする核酸を用いる場合、該核酸としては上述と同様のものを用いることが出来る。
【００３６】
ＭＥＫＫ３をコードする核酸は、適切な発現ベクターに含まれた態様で用いられることが好ましい。即ち、該核酸は適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結され得る。
【００３７】
また、Ｔ細胞受容体機能を効果的に調節するため、該発現ベクターは適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能なものが用いられる。該発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられるが、ヒト等の哺乳動物のＴ細胞への適用に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００３８】
使用されるプロモーターとしては、適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得る限り特に限定されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター；β−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター；Ｌｃｋプロモーター、ＣＤ２プロモーター等のＴ細胞特異的プロモーター等が挙げられる。
【００３９】
該発現ベクターは、好ましくはＭＥＫＫ３をコードする領域の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光蛋白質をコードする遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【００４０】
本発明のＴＣＲ機能調節剤の一実施態様では、該調節剤に含められる、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質であり得る。
ＭＥＫＫ３の発現を抑制する物質は、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００４１】
ＭＥＫＫ３の機能を抑制する物質は、ＭＥＫＫ３に結合したり、該蛋白質を修飾したり、或いは該蛋白質の安定性を低下させたりすること等により、上述のＭＥＫＫ３の機能（例えば、他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）を抑制する作用を有する化合物をいう。
【００４２】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）ＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体、又はＭＥＫＫ３のドミナントネガティブ変異体、或いはこれらをコードする核酸。
【００４３】
目的核酸の標的領域と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。ここで「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。
【００４４】
ＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸（以下、「アンチセンスＭＥＫＫ３」ともいう）は、クローン化された、あるいは決定されたＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸はＭＥＫＫ３遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスＭＥＫＫ３は、ＭＥＫＫ３をコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
【００４５】
アンチセンスＭＥＫＫ３の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてＭＥＫＫ３への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、ＭＥＫＫ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ又は初期転写産物）の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、ＭＥＫＫ３をコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
さらに、アンチセンスＭＥＫＫ３は、ＭＥＫＫ３をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、ＭＥＫＫ３をコードする二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００４６】
アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用する等の剤形の工夫によっても克服できる。
【００４７】
ＭＥＫＫ３をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスＭＥＫＫ３に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)]。
【００４８】
ＭＥＫＫ３をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスＭＥＫＫ３に包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来[Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザイムの代替技術として広く利用されている。ｓｉＲＮＡの大きさは、ＲＮＡｉを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、１５ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上であり得る。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００４９】
上述のＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、ＭＥＫＫ３遺伝子の発現又は機能を抑制する物質として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に、ＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
【００５０】
ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体は、ＭＥＫＫ３に結合することにより、ＭＥＫＫ３の機能（例えば、他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）を抑制し得る。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体の結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００５１】
例えば、ポリクローナル抗体は、ＭＥＫＫ３あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ(Keyhole Limpet Hemocyanin)等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスター等の哺乳動物が挙げられる。
【００５２】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスにＭＥＫＫ３あるいはそのフラグメントを市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８等）を細胞融合してＭＥＫＫ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法[J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)]でも電圧パルス法[Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)]であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清又は動物の腹水から取得できる。
【００５３】
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、上記抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）， Vol.6, No.10, 1988」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
【００５４】
ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体は、より効果的にＭＥＫＫ３の機能を抑制するために、ＭＥＫＫ３の機能性部位（他の蛋白質との相互作用に関与する部位、キナーゼ活性部位等）を特異的に認識し、当該部位が担う機能の低下をもたらすような抗体が選択され得る。
【００５５】
ＭＥＫＫ３のドミナントネガティブ変異体とは、ＭＥＫＫ３に対する変異の導入によりその機能（活性）が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、ＭＥＫＫ３と競合することで間接的にその機能（活性）を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、ＭＥＫＫ３をコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位（他の分子との相互作用に関与する部位、キナーゼ活性部位等）における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＲや公知の変異導入試薬を用いる自体公知の方法により作製できる。
【００５６】
上述のＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体や、ＭＥＫＫ３のドミナントネガティブ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸も、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質として好ましい。該核酸は、適切な発現ベクター（例えば、適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能な発現ベクター）中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に機能的に連結された態様で提供され得る。
【００５７】
本発明の剤は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５８】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００５９】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入等）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００６０】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム；ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオールエオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオールエオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
【００６１】
また、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が蛋白質である場合、該蛋白質の細胞内への導入効率を高めるために、本発明の組成物は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト（ナカライテスク社製）、プロベクチン（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）等を用いることが出来る。
【００６２】
実施例で後述するが、本発明ではＭＥＫＫ３と相互作用し得るＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子としてＣＡＲＭＡ１が同定された。ＭＥＫＫ３はＣＡＲＭＡ１との相互作用を介してＢｃｌ１０及びＭＡＬＴ１と協調してＮＦ−κＢの活性化に寄与し得る。従ってＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節する物質はＴＣＲ機能調節剤として有用である。
【００６３】
本発明の剤の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として０．０００１〜約５０００ｍｇ／ｋｇである。
【００６４】
本発明の剤は、例えば、医薬または研究用試薬として有用である。例えば、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の予防・治療剤として、あるいは当該疾患の研究用試薬として使用され得る。
Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患としては、例えば獲得免疫の異常により引き起こされる疾患が挙げられる。
【００６５】
詳細には、本発明の剤が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を促進する物質を含有する場合、ならびに有効成分としてＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を亢進する物質を含有する場合、該物質は、Ｔ細胞受容体シグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３より下流の経路（例えばＮＦ−κＢ活性化）を増強し得るので、本発明は、例えば、Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患としては、例えば、Ｔ細胞の不活化（抗原に対するＴ細胞応答の低下、Ｔ細胞数の低下等）により引き起こされる免疫不全疾患であり得る。該疾患としては、原発性免疫不全症（例えば、重症複合免疫不全症、Bloom症候群、DiGeirge症候群、ataxia-telangiectasia、ＰＮＰ欠損症、Wiskott-Aldrich症候群、突発性ＣＤ４＋Ｔ細胞減少症、ＡＤＡ欠損症、慢性皮膚粘膜カンジダ症、Duncan症候群（ＥＢウイルスに対する特異的免疫不全）等）、続発性免疫不全状態（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アナジー（Ｔ細胞不応答）、感染症（麻疹、結核）サルコイドーシス、リンパ系悪性腫瘍、薬剤（副腎皮質ホルモン、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン等）老化、栄養障害等）等が挙げられる。
【００６６】
また、本発明の剤が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を抑制する物質を含有する場合、ならびに有効成分としてＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を抑制する物質を含有する場合、該物質は、Ｔ細胞受容体シグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３より下流の経路（例えばＮＦ−κＢ活性化）を抑制し得るので、本発明は、例えば、Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患としては、例えば、Ｔ細胞の異常な活性化（抗原に対するＴ細胞応答の上昇、Ｔ細胞数の上昇等）により引き起こされる免疫不全疾患であり得る。該疾患としては、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性血球減少症、重症筋無力症、強皮症、多発性筋炎、続発性アディソン病、不妊症、自己免疫性糸球体腎炎、シェーグレン病、脈管炎、自己免疫性脊髄炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病等）、アレルギー疾患（例えばＩ型アレルギー疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、じんま疹、アトピー性皮膚炎）、ＩＩ型アレルギー疾患（例えば、グッドパスチャー症候群、溶血性血小板紫斑症）、ＩＩＩ型アレルギー疾患（例えば、全身性血管炎、クリオグロブリン血症、血清症、ウイルス性肝炎、アレルギー性肺胞炎）、ＩＶ型アレルギー疾患（例えば、接触性皮膚炎、臓器移植拒絶反応、結核病変、サルコイドーシス、薬疹）等）、移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）、乾癬（炎症性角化症）、円形脱毛症、扁平苔癬、Ｔリンパ腫（皮膚Ｔ細胞リンパ腫白斑等）等が挙げられる。
【００６７】
獲得免疫の異常により引き起こされる疾患としては、上記ＴＣＲ機能の低下に伴う疾患あるいはＴＣＲ機能の亢進に伴う疾患として例示された各種疾患が挙げられる。
【００６８】
さらに、本発明の剤が研究用試薬である場合、例えば、実験動物におけるＴ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の誘発剤として使用され得る。詳細には、本発明の研究用試薬が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を促進する物質を含有する場合、例えば、Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の誘発に使用され得る。本発明の研究用試薬が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を抑制する物質を含有する場合、例えば、Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の誘発に使用され得る。
【００６９】
（Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得る物質は、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る。従って、本発明は、被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、及び当該物質を有効成分として含有してなる剤を提供する。
【００７０】
スクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００７１】
本発明のスクリーニング方法は、被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行なわれ得る。
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節（促進又は抑制）し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節（促進又は抑制）し得る被検物質を選択する工程；
（ｃ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を亢進し得る物質として得、或いはＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を抑制し得る物質として得る工程。
【００７２】
ＭＥＫＫ３の発現を調節し得る物質を選択する場合、上記方法の工程（ａ）では、被検物質とＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量と比較する。
【００７３】
ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞とは、ＭＥＫＫ３遺伝子の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＭＥＫＫ３遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞であり得、一方、ＭＥＫＫ３遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞は、上述した動物細胞、好ましくは上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００７４】
ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株等を使用できる。ＭＥＫＫ３発現細胞としてはＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞等のリンパ球等が挙げられるが、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、Ｔ細胞及びＴ細胞由来の細胞株を用いることが好ましい。
【００７５】
ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域は、ＭＥＫＫ３遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＭＥＫＫ３遺伝子の転写を制御する能力を有する領域等が挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００７６】
ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＭＥＫＫ３遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＭＥＫＫ３遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞が好ましい。また、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、Ｔ細胞及びＴ細胞由来の細胞株を用いることがより好ましい。
【００７７】
ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類等に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地等である。培養条件もまた、用いられる細胞の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００７８】
具体的な手順は以下のとおりである。
先ず、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類等を考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞として、ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、ＭＥＫＫ３遺伝子の産物、例えば、転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（ポリペプチド）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法(Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980))、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法等が使用できる。一方、ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞として、ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００７９】
次いで、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量が、被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００８０】
上記方法の工程（ｂ）では、工程（ａ）の結果に基づき、ＭＥＫＫ３の発現を調節（促進又は抑制）し得る被検物質が選択される。
【００８１】
ＭＥＫＫ３の機能を調節し得る物質を選択する場合、上記方法の工程（ａ）では、被検物質の存在下でＭＥＫＫ３の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被検物質の不在下におけるＭＥＫＫ３の機能（活性）と比較する。
【００８２】
ＭＥＫＫ３の機能として、ＭＥＫＫ３とＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子（例えばアダプター分子であるＣＡＲＭＡ１等の蛋白質、以下、単に結合対とも称する）との相互作用を測定する場合、本発明のスクリーニング方法は、被検物質がＭＥＫＫ３及びその結合対（例、ＣＡＲＭＡ１）と相互作用し得るか否かを評価することにより行なわれ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ１）〜（ｃ１）を含み得る：
（ａ１）被検物質、ならびにＭＥＫＫ３及びその結合対を接触させる工程；
（ｂ１）被検物質を接触させた場合におけるＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を測定し、該複合体量を被検物質を接触させない場合の複合体量と比較する工程；
（ｃ１）上記（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を調節する被検物質を選択する工程。
【００８３】
上記方法の工程（ａ１）では、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体の形成が可能であるアッセイ系において、被検物質、ＭＥＫＫ３及びその結合対が接触される。その結合対としては、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＴＡＫ１、ＩＫＫ等が挙げられ、ＣＡＲＭＡ１が好ましい。なお、ＭＥＫＫ３及びその結合対の一方又は双方は、それらの複合体の検出を容易にするため標識されていてもよい。標識としては、例えば、標識用物質（例、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質）による標識の他、レポーター遺伝子によりコードされ得る蛋白質との融合が挙げられる。また、本アッセイ系では、ＭＥＫＫ３及び／又はその結合対等を含む細胞ホモジネート（例、ＭＥＫＫ３発現ベクター及び／又はＭＥＫＫ３結合対の発現ベクターをトランスフェクトした細胞のホモジネート）も使用することができる。
【００８４】
上記方法の工程（ｂ１）では、先ず、被検物質を接触させた場合における複合体量が測定される。複合体量の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、免疫学的手法（例、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴を利用する相互作用解析法（例、ＢｉａｃｏｒｅＴＭの使用）が挙げられる。
【００８５】
次いで、被検物質を接触させた場合の複合体量が、被検物質を接触させない場合の複合体量と比較される。複合体量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない場合の複合体量は、被検物質を接触させた場合の複合体量の測定に対し、事前に測定した複合体量であっても、同時に測定した複合体量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した複合体量であることが好ましい。
【００８６】
上記方法の工程（ｃ１）では、複合体量を調節する被検物質が選択される。例えば、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を増加させる（複合体の形成を促進する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の亢進が所望される疾患の予防・治療等に有用であり、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を減少させる（複合体の形成を抑制する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の抑制が所望される疾患の予防・治療等に有用である。
【００８７】
また、ＭＥＫＫ３の機能を調節し得る物質を選択するためのスクリーニングを細胞内で行なうこともできる。この場合のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ２）〜（ｃ２）を含み得る：
（ａ２）被検物質とＭＥＫＫ３発現細胞とを接触させる工程；
（ｂ２）被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の機能レベルを測定し、該機能レベルを、被検物質を接触させない対照細胞における機能レベルと比較する工程；
（ｃ２）上記（ｂ２）の比較結果に基づいて、ＭＥＫＫ３の機能レベルを調節する被検物質を選択する工程。
ここで、ＭＥＫＫ３の機能とは、例えば、ＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子（即ち結合対、例えばＣＡＲＭＡ１）との相互作用する能力、ＭＥＫＫ３が有するタンパク質キナーゼ活性が挙げられる。
【００８８】
ＭＥＫＫ３の機能として、結合対と相互作用する能力に基づいたスクリーニングは例えば以下のようにして行なう。
【００８９】
上記方法の工程（ａ２）及び（ｂ２）において被検物質を接触させるＭＥＫＫ３発現細胞は、ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が測定可能な細胞であって、該細胞と被検物質とを接触させ、被検物質を接触させた細胞における相互作用を測定し、これを被検物質を接触させない対照細胞における相互作用と比較する。
【００９０】
用いられる細胞としては、目的とする相互作用を測定可能な細胞であれば特に限定されず、ＭＥＫＫ３及び結合対を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。該細胞は、ＭＥＫＫ３及びその相互作用対象分子を、天然に発現しているものであっても遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。該相互作用を測定可能な細胞は、動物細胞、例えば上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００９１】
ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用を測定可能な細胞としては、上述のＭＥＫＫ３を天然で発現している細胞と同様の細胞を用いることが出来るが、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、Ｔ細胞及びＴ細胞由来の細胞株を用いることが好ましい。ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が細胞の活性化等に依存する場合は、細胞を適切に処理することにより活性化させてもよい。例えば、Ｔ細胞を用いる場合、抗原や抗原ミミックにより該細胞は刺激され得る。
【００９２】
ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。
【００９３】
次に先ず、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が測定される。相互作用の測定は、用いた細胞や結合対の種類等を考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＭＥＫＫ３に対する抗体等により細胞の抽出液からＭＥＫＫ３が免疫沈降され、ＭＥＫＫ３と共に沈殿した結合対が、自体公知の方法（例えばウェスタンブロッティング法、マススペクトル法等）により定量される。
【００９４】
次いで、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が、被検物質を接触させない対照細胞における該相互作用と比較される。相互作用の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用は、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用の測定に対し、事前に測定した相互作用であっても、同時に測定した相互作用であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した相互作用であることが好ましい。
【００９５】
結合対としては、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＴＡＫ１、ＩＫＫ等が挙げられ、ＣＡＲＭＡ１が好ましい。即ち、本発明のＴＣＲ機能を調節し得る物質のスクリーニング方法の好ましい一実施態様はＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む。
【００９６】
ＭＥＫＫ３の機能として、ＭＥＫＫ３のタンパク質キナーゼ活性を測定する場合、ＭＥＫＫ３を適切な基質（例えばＭＫＫ６、ＭＫＫ６、ＩＫＫβ等）と反応させて、キナーゼ活性が直接測定され得る。この場合、当該キナーゼ活性に関与し得る部位（例えばキナーゼドメイン）を含むＭＥＫＫ３のフラグメントを用いてもよい。
【００９７】
工程（ｂ）では、工程（ａ）の結果に基づき、ＭＥＫＫ３の機能を調節（促進又は抑制）し得る被検物質が選択される。
【００９８】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で選択されたＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質がＴ細胞受容体機能を亢進し得る物質として、或いはＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質がＴ細胞受容体機能を抑制し得る物質として獲得される。
【００９９】
ＭＥＫＫ３の発現量を増加させる（発現を促進する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の抑制が所望される疾患の予防・治療等に有用であり、ＭＥＫＫ３の発現量を減少させる（発現を抑制する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の亢進が所望される疾患の予防・治療等に有用である。
【０１００】
更に工程（ｂ）と（ｃ）の間に、工程（ｂ’）として工程（ｂ）で選択された物質がＴ細胞受容体機能を調節し得るか確認し、該効果が確認された物質を工程（ｃ）においてＴ細胞受容体機能を調節し得る物質として得ることも出来る。これにより、より高い効率で目的とする物質を獲得することが出来る。
【０１０１】
工程（ｂ’）においては、例えば、工程（ｂ）で選択された物質（候補物質）とＴ細胞（Ｔ細胞由来の細胞株を含む）とを接触させ、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を測定し、該機能を候補物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能と比較する。
【０１０２】
Ｔ細胞に対する候補物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、測定されるＴ細胞受容体機能の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。このとき、Ｔ細胞は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【０１０３】
次に先ず、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能が測定される。Ｔ細胞受容体機能として、Ｔ細胞受容体からの刺激により誘導されるＴ細胞の機能的変化やその誘導過程の反応が測定される。Ｔ細胞の機能的変化としては、Ｔ細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ等）産生、細胞障害活性、分化）、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。Ｔ細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードに関与する分子（タンパク質等）の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、ＲＡＦＴへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【０１０４】
上述のように、ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＴＡＫ１やＩＫＫの上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得る。従って、候補物質がＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３の機能を選択的に調節し得ることを確認する目的で、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいてＭＥＫＫ３より下流で機能する分子（例えば、ＴＡＫ１、ＩＫＫ、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＮＦ−κＢ、ＩκＢ等）の修飾、分子間相互作用、細胞内局在の変化等を測定してもよい。或いは、ＮＦ−κＢの標的遺伝子の発現の変化を測定してもよい。
【０１０５】
Ｔ細胞受容体機能の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、細胞増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、サイトカイン産生はＥＬＩＳＡ法等により、細胞障害活性は５１Ｃｒ放出アッセイ等により、Ｔ細胞分化（例えばＴｈ１やＴｈ２への分化）はサイトカイン遺伝子発現パターン変化の測定により、アポトーシスは染色体ＤＮＡの断片化の測定により、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化はウェスタンブロッティング法等により、タンパク質の分解はウェスタンブロッティング法等により、分子間相互作用は免疫沈降法等により、細胞内局在の変化は免疫染色により、ＲＡＦＴへの局在化は密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法等により、遺伝子発現の変化はＲＴ−ＰＣＲやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【０１０６】
次いで、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能が、候補物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能と比較される。Ｔ細胞受容体機能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。候補物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能は、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、候補物質によるＴ細胞受容体機能の調節作用が確認される。
【０１０７】
本発明のスクリーニング方法はまた、被検物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能を調節する被検物質が選択され得る。
【０１０８】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質はＴ細胞受容体機能を亢進し得るので、Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。また、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質はＴ細胞受容体機能を抑制し得るので、Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。従って、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を指標として、種々の免疫疾患の予防・治療剤等の医薬、又は研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。
【０１０９】
（ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症または発症リスクの判定方法）
上述の様に、ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードに深く関与し、ＴＣＲ機能を調節している。従って、本発明は、動物由来の生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定することを含む、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【０１１０】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物由来の生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現量又は機能に基づきＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクを評価する工程。
【０１１１】
上記方法の工程（ａ）では、生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能が測定される。生体試料は動物、好ましくは哺乳動物由来であれば特に限定されないが、ヒトが由来の試料が最も好ましい。生体試料は、ＭＥＫＫ３を発現している組織又は細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む試料（例えば、血液）、あるいは該試料から分離された細胞であり得るが、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクを判定する目的より、生体試料は、Ｔ細胞またはそれを含む試料が好ましい。また、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定は、上述のスクリーニング方法と同様に行われ得る。
【０１１２】
測定されるＭＥＫＫ３の機能としては、ＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子（即ち結合対、例えばＣＡＲＭＡ１）と相互作用する能力が挙げられる。即ち、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症または発症リスクの判定方法の好ましい一実施態様は、ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を測定することを含む。
【０１１３】
工程（ｂ）では、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能に基づき、生体試料が由来する動物がＴＣＲ機能の異常に伴う疾患に罹患しているか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。
詳細には、先ず、測定されたＭＥＫＫ３の発現量又は機能が、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患に罹患していない動物（例えば、正常動物）由来の生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【０１１４】
次いで、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の比較結果より、生体試料が由来する動物がＴＣＲ機能の異常に伴う疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した動物では、当該疾患に関連する遺伝子の発現又は機能の変化がしばしば観察されることが知られている。また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現又は機能の変化がしばしば観察されることが知られている。実際に、後述の実施例に示すように、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を有する動物においては、胸腺細胞及び末梢Ｔ細胞の数の減少が確認された。従って、ＭＥＫＫ３の発現又は機能が低下している場合には、ＴＣＲ機能の低下に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。また、本明細書中に開示された知見より、ＭＥＫＫ３の発現又は機能が亢進している場合には、ＴＣＲ機能の亢進に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。
【０１１５】
本発明はまた、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定用試薬を含む、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断剤を提供する。本発明の診断剤を用いれば、上記判定方法により、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクを容易に判定することが出来る。
【０１１６】
ＭＥＫＫ３の発現量の測定用試薬は、ＭＥＫＫ３の発現を測定可能である限り特に限定されないが、例えば、ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体、ＭＥＫＫ３遺伝子転写産物に対する核酸プローブ、またはＭＥＫＫ３遺伝子転写産物を増幅可能な複数のプライマーを含むものであり得る。これらは、標識用物質で標識されていても標識されていなくともよい。標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断剤は、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質等が挙げられる。
【０１１７】
ＭＥＫＫ３遺伝子転写産物に対する核酸プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写産物を検出可能である限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【０１１８】
ＭＥＫＫ３遺伝子を増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、検出可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。検出可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、ＩＲＡＫ−４遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。ＭＥＫＫ３遺伝子転写産物を定量可能な試薬がプライマーである場合、本発明の診断薬は、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【０１１９】
ＭＥＫＫ３の機能の測定用試薬は、ＭＥＫＫ３の機能を測定可能である限り特に限定されない。例えば、免疫沈降法及びウエスタンブロット法によりＭＥＫＫ３とその結合対との相互作用を測定する場合、該試薬として、ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体及び相互作用対象分子を特異的に認識する抗体、プロテインＡ結合ビーズ等を挙げることが出来る。また、ＭＥＫＫ３のタンパク質キナーゼ活性を測定する場合、該試薬として、該キナーゼの基質（例えばＭＫＫ６、ＭＫＫ６、ＩＫＫβ等）を挙げることが出来る。
【０１２０】
本発明の上記判定方法及び診断剤は、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の有無、あるいは該疾患に罹患する可能性の判定を可能とする。従って、本発明は、例えば、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の容易且つ早期の発見等に有用である。
【０１２１】
（ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞を用いる、ＴＣＲ機能を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、ＭＥＫＫ３はＣＡＲＭＡ１と相互作用し、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＩＫＫやＴＡＫ１の上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得る。従って、被検物質がＭＥＫＫ３の機能的欠損を有する動物又は細胞におけるＴＣＲ機能を調節（例えば亢進）し得るか否かを評価することにより、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を補うこと等により、ＴＣＲ機能を調節（例えば亢進）し得る物質をスクリーニングすることが出来る。
【０１２２】
ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損とは、ＭＥＫＫ３遺伝子が本来有する正常な機能が十分に発揮できない状態をいい、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子が全く発現していない状態、またはＭＥＫＫ３遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、あるいはＭＥＫＫ３遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、または遺伝子変異等によりＭＥＫＫ３遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にＭＥＫＫ３遺伝子産物の機能が低下した状態が挙げられる。
【０１２３】
ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞は、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有する動物からＴ細胞を単離する事により得ることが可能である。ＭＥＫＫ３の無発現変異は、ほぼ胎生期（Ｅ）１１日で死に至ることが報告されている（Yang, J., et al., (2000). Mekk3 is essential for early embryonic cardiovascular development. Nat. Genet. 24, 309-313.）ので、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有する動物としてＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物を用いることができる。
【０１２４】
本発明の動物の種は、ヒトを除く動物である限り特に限定されないが、哺乳動物および鳥類が好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。鳥類としては、例えばニワトリが挙げられる。
【０１２５】
本発明のコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、例えば下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法により製造できる。
（ａ）ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞を提供する工程；
（ｂ）前記胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程；
（ｃ）前記キメラ胚を動物に移植し、キメラ動物を得る工程；
（ｄ）前記キメラ動物を交配させ、ＭＥＫＫ３遺伝子欠損ヘテロ接合体を得る工程。
【０１２６】
前記工程（ａ）において、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子の相同組換えを誘導し得るターゲティングベクターを胚性幹細胞に導入して得られる。
【０１２７】
ターゲティングベクターを胚性幹細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法／リポソーム法、エレクトロポレーション法などがあげられる。ターゲティングベクターが胚性幹細胞中に導入されると、当該細胞中でＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡの相同組換えが生じる。
【０１２８】
ターゲティングベクターが導入される胚性幹細胞としては、任意の動物の胚盤胞から分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することにより樹立してもよいが、市販または所定の機関より既存の胚性幹細胞を入手できる。既存のマウス胚性幹細胞としては、例えば、ＥＳ−Ｄ３細胞、ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞、Ｂｒｕｃｅ−４ ＥＳ細胞、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞、Ｅ１４細胞、ＲＷ−４細胞、Ｂｒｕｃｅ−４ ＥＳ細胞などがあげられる。また、胚性幹細胞としては、マウス胚性幹細胞以外に、ミンク、ハムスター、ブタ、ウシ、マーモセット、アカゲザル等の哺乳動物由来のものなどが樹立されているので、これらを用いることもできる。
【０１２９】
ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡで相同組換えが生じた動物細胞を選別するため、ターゲティングベクター導入後の動物細胞がスクリーニングされる。例えば、ポジティブ選別、ネガティブ選別等により選別を行った後に、遺伝子型に基づくスクリーニング（例えば、ＰＣＲ法、サザンブロット法）を行う。
【０１３０】
胚性幹細胞を用いる場合には、好ましくは、組換え胚性幹細胞の核型分析がさらに行なわれる。核型分析では、選別された組換え胚性幹細胞において染色体異常がないことが確認される。核型分析は、自体公知の方法により行うことができる。なお、胚性幹細胞の核型は、ターゲティングベクターの導入前に予め確認しておくことが好ましい。
【０１３１】
本発明で用いられるターゲティングベクターは、２以上のリコンビナーゼ標的配列を含むことが好ましい。２以上のリコンビナーゼ標的配列は、同一または反対の配向性 (orientation)で配置することができる。
【０１３２】
リコンビナーゼ標的配列としては、当該分野で公知の配列、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列を使用することができる。
【０１３３】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用する好ましいターゲティングベクターの例は、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド、および選択マーカーを含み、Ｃｒｅ認識配列（例えば、ｆｌｏｘ）を少なくとも３箇所に含む。Ｃｒｅ認識配列は、コンディショナルノックアウトで欠失させる部位を両側から挟む態様で配置される。
【０１３４】
第一および第二のポリヌクレオチドは、ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。第一および第二のポリヌクレオチドはそれぞれ、ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡの異なる領域に対応する。
【０１３５】
また、第一または第二のポリヌクレオチドは、コンディショナルノックアウトにより、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を引き起こすように選択される。かかる領域は、当業者であれば適宜決定できるが、例えば、第一および第二のポリヌクレオチドは、１以上のエキソン、またはプロモーター領域もしくはエンハンサー領域の少なくとも一部を欠失するよう選択される。
【０１３６】
第一および第二のポリヌクレオチドの長さは、ゲノムＤＮＡの相同組換えが生じる長さである限り特に限定されない。一般論として、ターゲティングベクターによってゲノムＤＮＡの相同組換えが効率よく起こるためには、相同領域が長いほどよい。一方、ターゲティングベクターの種類によって、挿入可能なＤＮＡの長さは一定に制限される。したがって、これらを考慮すると、第一および第二のポリヌクレオチドの長さは、例えば０．５ｋｂ〜２０ｋｂ、好ましくは１ｋｂ〜１０ｋｂである。
【０１３７】
一実施形態では、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドと、第二のポリヌクレオチドとの間（換言すれば、内側）に選択マーカーが含まれる。この場合、選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカーが好ましい。ポジティブ選択マーカーは、その遺伝子を有する細胞のみを所定の条件下で生存および／又は増殖可能にする産物をコードする遺伝子であり、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などがあげられる。
【０１３８】
別の実施形態では、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドと、第二のポリヌクレオチドとの外側に選択マーカーが含まれる。この場合、選択マーカーとしては、ネガティブ選択マーカーが好ましい。ネガティブ選択マーカーは、非ターゲティング染色体部位に組み込まれたＤＮＡ挿入物を有する細胞に対して毒性に作用する遺伝子であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子などがあげられる。
【０１３９】
本発明で用いられるターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、または両方を含むことができる。
【０１４０】
ターゲティングベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のpBluscript (Stratagene社製)、pZErO 1.1 (Invitrogen社)、pGEM-1 (Promega社)等が使用可能である。
【０１４１】
本発明のターゲティングベクターは、自体公知の方法により製造できる。例えば、本発明のターゲティングベクターは、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドならびに該選択マーカーをベクターに挿入することにより製造できる。なお、このようなターゲティングベクターを作製するにあたっては、最初に、ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡ断片を単離する必要があるが、ゲノムＤＮＡ断片は、相同組換えの際に効率良く組換えが生じるよう、作製しようとするＥＳ細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離することが好ましい。また、相同組換えの効率をさらに上げるために、ＥＳ細胞が由来する同一種の動物のうち同じ系統の動物から、ゲノムＤＮＡを単離することがより好ましい。
【０１４２】
前記工程（ｂ）において、胚が由来する動物種は、本発明のノックアウト動物種と同様であり得、また、導入される胚性幹細胞が由来する動物種と同一であることが好ましい。胚としては、例えば胚盤胞、８細胞期胚などがあげられる。胚はホルモン剤（例えばＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させること等により得ることができる。胚性幹細胞を胚に導入する方法としては、マイクロマニピュレーション法、凝集法などがあげられる。
【０１４３】
前記工程（ｃ）において、キメラ胚が動物の子宮に移入され得る。キメラ胚が移植される動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮等により去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が導入された動物は、妊娠し、キメラ動物を出産する。
【０１４４】
次いで、出生した動物がキメラ動物か否かが確認される。出生した動物がキメラ動物であるか否かは自体公知の方法により確認でき、例えば、体色や被毛色で判別できる。また、判別のために、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法を行ってもよい。
【０１４５】
前記工程（ｄ）において、工程（ｃ）で得られたキメラ動物を成熟した後にＴ細胞においてリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物と交配させる。Ｔ細胞特異的にリコンビナーゼを発現トランスジェニック動物としては、例えば、Ｔ細胞特異的Ｌｃｋプロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するＬｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスが報告されている（Takahama, Y., et al., (1998). Functional competence of T cells in the absence of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins caused by T cell-specific disruption of the Pig-a gene. Eur. J. Immunol. 28, 2159-2166.）。
工程（ｄ）で得られたＭＥＫＫ３遺伝子欠損へテロ接合体同士を交配させることによりコンディショナルにＭＥＫＫ３遺伝子欠損を有するホモ接合体を得ることができる。
【０１４６】
得られたトランスジェニックマウスのＭＥＫＫ３遺伝子における欠失は、自体公知の方法により確認できる。例えば、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法を行ってもよい。
【０１４７】
本発明のノックアウト動物、胚性幹細胞、ターゲティングベクターの作製の詳細については、例えば、下記文献を参照のこと。
１．別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 「ジーンターデティングの最新技術」（2000年、羊土社）コンディショナルターゲティング法p.115-120
２．バイオマニュアルシリーズ８ 「ジーンターゲティング」−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（1995年、羊土社）p.71-77
３．Sambrookら, Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 第3版, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, 2001年, 4.82-4.85
４．Robertson E. J. in Teratocarcinomas and embryonic stem cells-a practical approach, ed. Robertson, E. J. (IRL Press, Oxford), 1987: pp.108-112
５．Dynecki, S. M.ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A.L. (Oxford Univ. Press), 2000: pp.68-73
６．Dynecki, S. M. ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A. L. (Oxford Univ. Press), 2000: pp.75-81
【０１４８】
かくして作製されたＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物から自体公知の方法によってＴ細胞が単離され得る。得られたＴ細胞は、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を有する。
ＭＥＫＫ３の機能的欠損を有するＴ細胞を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み得る：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節（亢進等）し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴＣＲ機能を調節（亢進等）し得る物質を選択する工程；
【０１４９】
例えば工程（ａ）において、被検物質とＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞とを接触させ、被検物質を接触させた細胞におけるＴＣＲ機能を測定し、該機能を被検物質を接触させない対照細胞におけるＴＣＲ機能と比較する。
【０１５０】
Ｔ細胞に対する被検物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、測定されるＴ細胞受容体機能の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。Ｔ細胞は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【０１５１】
次に先ず、被検物質を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ機能が測定される。ここでＴＣＲ機能として、Ｔ細胞受容体からの刺激により誘導されるＴ細胞の機能的変化やその誘導過程の反応が測定される。Ｔ細胞の機能的変化としては、Ｔ細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ等）産生、細胞障害活性、分化）、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。Ｔ細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードに関与する分子（タンパク質等）の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、ＲＡＦＴへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【０１５２】
上述のように、ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＴＡＫ１やＩＫＫの上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得る。従って、被検物質がＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３の機能を選択的に調節し得ることを確認する目的で、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいてＭＥＫＫ３より下流で機能する分子（例えば、ＰＫＣθ、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＮＦ−κＢ、ＩκＢ等）の修飾、分子間相互作用、細胞内局在の変化等を測定してもよい。或いは、ＮＦ−κＢの標的遺伝子の発現の変化を測定してもよい。
【０１５３】
Ｔ細胞受容体機能の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、細胞増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、サイトカイン産生はＥＬＩＳＡ法等により、細胞障害活性は５１Ｃｒ放出アッセイ等により、分化はサイトカイン遺伝子発現パターン変化の測定により、アポトーシスは染色体ＤＮＡの断片化の測定により、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化はウェスタンブロッティング法等により、タンパク質の分解はウェスタンブロッティング法等により、分子間相互作用は免疫沈降法等により、細胞内局在の変化は免疫染色により、ＲＡＦＴへの局在化は密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法等により、遺伝子発現の変化はＲＴ−ＰＣＲやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【０１５４】
次いで、被検物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能が、被検物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能と比較される。Ｔ細胞受容体機能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能は、被検物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、被検物質によるＴ細胞受容体機能を調節作用が確認される。
【０１５５】
上記方法の工程（ｂ）では、（ａ）の結果に基づき、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節（促進等）し得る物質が選択される。
【０１５６】
ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＴＡＫ１やＩＫＫの上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得るので、本発明のスクリーニング方法により得られるＴ細胞受容体機能を促進し得る物質は、例えばＴ細胞受容体からのシグナルカスケードのうち、特にＮＦ−κＢの活性化に至る経路においてＭＥＫＫ３よりも下流において作用する等して、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を迂回してＴ細胞受容体シグナリングを活性化させる物質であり得る。
【０１５７】
本発明のスクリーニング方法により得られるＴ細胞受容体機能を調節（促進等）し得る物質はＴ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。当該予防・治療薬は、Ｔ細胞受容体機能の低下がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損によるものである場合に、特に有効であり得る。
【実施例】
【０１５８】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【０１５９】
（方法・材料）
１．試薬
ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＩκＢα、及びＢｃｌ１０に対する抗体（Ａｂ）を、Santa Cruzより購入し、抗ホスホＥＲＫ Ａｂ、抗ホスホＪＮＫ Ａｂ、抗ホスホｐ３８ Ａｂ、抗ホスホＩＫＫβ Ａｂ、抗ホスホＩκＢα Ａｂ、及び抗ＴＡＫ１ Ａｂを、Cell Signaling Technologyより、抗ＧＡＰＤＨ Ａｂ、抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂ及び抗ＩＫＫβ Ａｂを、Abcamより、ＭＥＫＫ３のＮ末端に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂ）をBDより、そして抗ＨｉｓＸ６ ｍＡｂをQIAGENより入手した。免疫沈降用の抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂを、既報に従って調製した（Shinohara, H. et al., (2005). PKC β regulates BCR-mediated IKK activation by facilitating the interaction between TAK1 and CARMA1. J. Exp. Med. 202, 1423-1431.）。Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＣＲ刺激には、既報（Yamasaki, S. et al., (2001). Docking protein Gab2 is phosphorylated by ZAP-70 and negatively regulates T cell receptor signaling by recruitment of inhibitory molecules. J. Biol. Chem. 276, 45175-45183.）と同様、Ｃ３０５（抗ＴＣＲ ｍＡｂ）及びＯＫＴ３（抗ＣＤ３ε ｍＡｂ）を用いた。
【０１６０】
２．フローサイトメトリー
リンパ球を、５週齢〜８週齢のマウスの胸腺、脾臓、及び末梢血より分離した。フローサイトメトリー用のＡｂを、eBioscienceより購入した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD)で解析した。細胞生存を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により評価した。
【０１６１】
３．細胞培養
Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium（ＩＭＤＭ）で培養した。ＣＤ８＋細胞を磁気ビーズでＡｕｔｏＭＡＣＳ(Miltenyi Biotec)を用いて除去した後、ＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）胸腺細胞又はＣＤ４＋脾臓細胞を、抗ＣＤ４磁気ビーズにより精製した。ＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋脾臓細胞を、ＣＤ４、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌ染色後に、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ(BD)により直接選別した。単離したＴ細胞を、BD Bioscience製の１０μｇ／ｍｌの固相化抗ＣＤ３ Ａｂ（２Ｃ１１）及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂ（３７．５１）で、１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ(SIGMA)及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂで、又は２０ｎｇ／ｍｌの組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ−２若しくはｒｍＩＬ−７(Peprotech)で刺激した。Ｔ細胞増殖を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８ (Dojindo Labs)により、製造元により記載されたようにして決定し、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産生を、酵素結合免疫吸着アッセイを利用したBD-Pharmingen社のキットを用いて、製造元のプロトコールに従って解析した。
【０１６２】
４．レトロウイルストランスインフェクション
Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰレトロウイルスベクター（東京大学、T. Kitamura氏から供与）にクローン化した。パッケージング細胞ＥｃｏＰａｃｋ２(BD Biosciences)を、ＦｕＧＥＮＥ６により、製造元(Roche)のプロトコールに従ってトランスフェクトした。レトロウイルスを含む培養上清を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。１０μｇ／ｍｌの２Ｃ１１（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）及び５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激して２４時間後に単離したＣＤ４＋脾細胞に、上記パッケージングにより得られたレトロウイルスを、スピン感染（３０００ｒｐｍで２時間遠心分離）により感染させた。感染したＧＦＰ＋細胞を選別しエフェクターＴ細胞として用いた。該細胞を更に２日間〜３日間、ｒｍＩＬ−２を含有する培養液で培養した（Wan, Y. et al., (2006). The kinase TAK1 integrates antigen and cytokine receptor signaling for T cell development, survival and function. Nat. Immunol. 7, 851-858.）。
【０１６３】
５．活性化によって誘導される細胞死
ＣＤ４＋脾細胞を、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ．Ａ；SIGMA）とともに、４８時間培養した。Ｃｏｎ．ＡはＴ細胞活性化作用を有している。Ｃｏｎ．Ａの活性を阻害するために、細胞を、α−メチル−Ｄ−マンノシド（１０ｍｇ／ｍｌの濃度）で１時間処理した。死細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ (Cedarlane)を用いる密度遠心分離により除去した後、細胞を、２ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−２を含有するフレッシュな培地中に再懸濁し、そして２Ｃ１１コーティングプレート中で培養した。細胞の生存率を、ＰＩでの染色後にＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで確かめた。
【０１６４】
６．生化学的解析
イムノブロッティング及びキナーゼアッセイを、既報の標準的なプロトコール（Shinoharaら、２００５、上述）を用いて行った。簡単に言えば、細胞を、１０μｇ／ｍｌの２Ｃ１１とともに２０分間氷上でインキュベートし、次いで、５０μｇ／ｍｌのヤギ抗ハムスターＩｇＧ(Cappel)で、５分間、３７℃にて刺激した。刺激後、細胞を、１％ＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解し、清澄な細胞溶解物を、５×ＳＤＳサンプル緩衝液と共に煮沸した。５×１０５個−２×１０６個の細胞に相当するサンプルを、電気泳動的にＰＶＤＦ膜に移し、適切なＡｂでブロットした。ＩκＢαリン酸化に関して、細胞を５μｇ／ｍｌのＣｏｎ．Ａ又は抗ＣＤ３（データは示さず）で１８時間、ＭＡＰキナーゼアッセイ(Sun, Z. et al., (2000). PKC-θ is required for TCR-induced NF-κB activation in mature but not immature T lymphocytes. Nature 404, 402-407.)と同様にして処理した後、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を調製して、２％ＦＢＳとともに５時間培養した。ＭＥＫＫ３キナーゼアッセイに関して、２×１０７個のＣＤ４＋脾細胞を、１％ＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解した。清澄化したライセートを、１μｇ抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂで免疫沈降し、続いて４０μｌのプロテインＧ−セファロースと共にインキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、キナーゼ緩衝液で２回洗浄した。免疫沈降物を、１００μＭ ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液中に再懸濁した。Ｈｉｓタグ化ＭＫＫ６（全長）を、製造元(QIAGEN)の取扱説明書通りに精製し、キナーゼ反応混合物に基質として添加した。３０℃で３０分インキュベートした後、この反応を、ＳＤＳサンプル緩衝液を添加し、続いて５分間煮沸することにより終了させた。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に関して、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、既報通りに解析した（Shinoharaら、２００５、上述）。簡単に言えば、Ｔ細胞（２×１０６）の核抽出物を精製し、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合部位に対して特異的なプローブ又はＯｃｔ−１に対して特異的なプローブ（5’-tgtcgaatgcaaatcactagaa-3’；配列番号３）と共にインキュベートし、電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１６５】
７．低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）設計及びベクター
レトロベクターｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６及び設計したオリゴヌクレオチドを、TAKARAから入手した。
ｈｕ−ＭＥＫＫ３標的部位５５４の低分子ヘアピン型ＲＮＡをコードする挿入二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを以下のように設計した；
Ｆ−gatccgcaacctcttgatctacatttagtgctcctggttgaatgtagatcaagaggttgcttttttat（配列番号４）、
Ｒ−cgataaaaaagcaacctcttgatctacattcaaccaggagcactaaatgtagatcaagaggttgcg（配列番号５）、
ネガティブコントロールに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド；
Ｆ−gatccgtcttaatcgcgtataaggctagtgctcctggttggccttatacgcgattaagacttttttat（配列番号６）、
Ｒ−cgataaaaaagtcttaatcgcgtataaggccaaccaggagcactagccttatacgcgattaagacg（配列番号７）。
レトロウイルスを、汎親和性パッケージング細胞ＧＰ２(Clontech)へのトランスフェクションにより生成した。安定なサイレンシングのために、感染したＪｕｒｋａｔ細胞を、２ｍｇ／ｍｌの濃度のネオマイシンで５日間培養した。
【０１６６】
８．統計解析
データは、平均±標準偏差として示す。統計解析は、Student’s t検定を用いて行い、そしてMicrosoft Excel Softwareを用いて解析した。
【０１６７】
実施例１ ノックアウトマウスの作成
ＭＥＫＫ３の無発現変異は、ほぼ胎生期（Ｅ）１１日で死に至る。従って、Ｔ細胞におけるＭＥＫＫ３の本質的な機能を調査するために、図１Ａに示されたようにＣｒｅリコンビナーゼによりＡＴＰ結合部位（Ｋ３９１）を欠失させるように設計したターゲティングベクターを構築した。
ターゲティングベクターを、Ｃ５７ＢＬ／６由来のＢｒｕｃｅ−４ ＥＳ細胞(Harvard Medical School, CBR Institute for Biomedical Research, K. Rajewsky氏により提供された)中にエレクトロポレーションにより導入した。プローブ（図１Ａに図示）を用いたサザンブロットにより相同組換えされたことを確認し、ネオマイシン耐性クローンをスクリーニングした。正確にターゲティングされたクローンに、一過的にｐＭＣ１−Ｃｒｅ（K. Rajewsky, the CBR Institute for Biomedical Research, Harvard Medical School）をトランスフェクトし、ｌｏｘＰ隣接ネオマイシン耐性遺伝子カセットを欠失させた。ネオマイシンに対して感受性になった子孫クローンを、サザンブロット解析に供し、２つのｌｏｘＰ部位が隣接したエキソン１１及び１２を保持するもの（ｆｌｏｘアレル）を検出した。標的化されたクローンを、サザンブロット解析により同定し、そしてＣ５７ＢＬ／６ブラストシストにマイクロインジェクションし、キメラを作出した。キメラ雄マウスとＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交配すると、生殖系列にｆｌｏｘアレルが伝達された。Ｆｌｏｘ遺伝子型を有するマウスを、ＣｒｅトランスジーンをＬｃｋプロモーターの制御下で保有するトランスジェニックマウス系統（Ｌｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス；Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンド）と繁殖させた（Takahama, Y., et al., (1998). Functional competence of T cells in the absence of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins caused by T cell-specific disruption of the Pig-a gene. Eur. J. Immunol. 28, 2159-2166.）。次いで、これを交雑させてＴ細胞特異的ＭＥＫＫ３−欠損マウス（Ｌｃｋ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス；本明細書では、Ｔ−ＫＯマウスと呼ばれる）を作出した。得られたマウスはＳＰＦ条件下で飼育した。全ての実験は、ＲＩＫＥＮの動物研究委員会によるガイドラインを遵守して行った。
ゲノムＰＣＲにより、胸腺細胞及び脾臓Ｔ細胞において、ｌｏｘＰ部位に隣接するＭＥＫＫ３のエキソン１１及び１２を含むｆｌｏｘアレルが、効率的に欠失したことが示された（図１Ｂ）。ＭＥＫＫ３の欠失を、ＭＥＫＫ３のＮ末端に対するモノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロットによりさらに確認した。ＭＥＫＫ３タンパク質は、実質的に検出されなかった（図１Ｃ）。
【０１６８】
実施例２ Ｔ細胞の発生分化におけるＭＥＫＫ３の役割
Ｔ細胞発生分化におけるＭＥＫＫ３の役割を調べるために、先ずＴ−ＫＯマウスにおけるＴ細胞集団のＦＡＣＳ解析を行った。Ｌｃｋ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３＋／＋由来のＴ細胞とＬＣＫ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／＋マウスとの間に、表現型の差異はなかったので（データは示さず）、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３＋／＋マウスを、野生型（ｗｔ）コントロールマウスとして使用した。Ｔ−ＫＯマウスは、野生型コントロールマウスと比べて、ＣＤ４及びＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）胸腺細胞の割合の増加及びダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞の割合の減少を示した（図２Ａ）。Ｔ−ＫＯにおける全胸腺細胞、ＤＰ、ＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）、及びＣＤ８ ＳＰ胸腺細胞の数は、それぞれ野生型に比べて４０％〜６０％にまで有意に減少した（図２Ｂ）。しかし、胸腺細胞の成熟度を示すマーカー（ＣＤ５、ＣＤ６９及びＣＤ２４が挙げられる）の発現は、Ｔ−ＫＯマウス由来のＤＰ又はＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において、根本的には変化しなかった（データは示さず）。Ｔ−ＫＯマウスの脾臓においては、ＣＤ４＋のＴ細胞の数及びＣＤ８＋のＴ細胞の数は、コントロールマウスと比較して、約５０％及び６０％減少した（図２Ａ及び図２Ｂ）。Ｔ−ＫＯマウスの血液中のＴ細胞の割合は、顕著に減少した（図２Ａ）。
【０１６９】
実施例３ Ｔ−ＫＯマウス由来の末梢Ｔ細胞（ＭＥＫＫ３欠損を有する末梢Ｔ細胞）
Ｔ−ＫＯの末梢Ｔ細胞の数は減少したが、多少のＣＤ４＋Ｔ細胞が出現した。ＭＥＫＫ３欠損が末梢Ｔ細胞の恒常性状態に影響するかを決定するために、表面マーカーＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞からの発現を解析した。ＣＤ４４はＴ細胞の活性化に伴いその発現量が増加し、ＣＤ６２ＬはＴ細胞の活性化に伴いダウンレギュレートされる。図３Ａに示されるように、活性化された表現型の細胞（ＣＤ４４の発現がより高くＣＤ６２Ｌの発現がより低い）の割合は、野生型脾臓ＣＤ４＋細胞と比較して、Ｔ−ＫＯ末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞において、再現可能に高かった（図３Ａ）。抗ＣＤ３ Ａｂ（抗ＣＤ２８ Ａｂ共存下又は非存在下）により誘導されるＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生も、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋細胞の方が、野生型由来のものより高かった（図３Ｂ）。
Ｔ細胞においてＴＡＫ１を欠くマウスでは、活性化表現型を有する末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加していることが報告されている（Wanら、２００６、上述）。これらのＴＡＫ１欠損マウスは、天然に生ずる調節性Ｔ細胞（「ｎＴｒｅｇ細胞」）の発生分化にも重大な欠損を有するので、この活性化された表現型は、ｎＴｒｅｇ細胞によるＴ細胞抑制の損失に起因していた。Ｔ−ＫＯマウスの場合において観察された活性化表現型がＴＡＫ１欠損マウス同様ｎＴｒｅｇ細胞によるＴ細胞抑制の損失に起因するものであるのか否かを調べる為、Ｔｒｅｇ細胞の表面マーカーとしてのＣＤ２５の発現を解析した。ＣＤ２５＋細胞の頻度は、野生型由来又はＴ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞試料では、有意に変化しなかった（図３Ｃ）。
ＳＰ胸腺細胞及び末梢Ｔ細胞の数の減少は、これらの変異体Ｔ細胞における生存欠損に由来し得る。しかし、図３Ｄに示されるように、胸腺細胞及び脾臓Ｔ細胞の培養液中での生存能力は、野生型とＴ−ＫＯマウス（ＭＥＫＫ３欠損）との間で有意差はなかった。さらに、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞における活性化により誘導された細胞死においても、野生型との有意差はなかった（図３Ｅ）。
【０１７０】
実施例４ ＴＣＲ媒介性の細胞応答に対するＭＥＫＫ３の役割
成熟ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において、Ｔ−ＫＯ由来の細胞は、抗ＣＤ３ Ａｂ（抗ＣＤ２８ Ａｂ共存下又は非共存下）刺激による細胞増殖及びサイトカイン産生（ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）の減少を示した（図４Ａ及び図４Ｂ）。更に、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞では、抗ＣＤ３ Ａｂ刺激しても、野生型由来の細胞におけるほど、ＣＤ２５（活性化されたＴ細胞の表面マーカー）の発現が誘導されなかった（図４Ｃ）。
Ｔ−ＫＯ ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞の応答性の低減を示すこれらのデータは、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた実施例３のデータ（図３Ｂ）と矛盾するように考えられる。活性化されたＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−末梢Ｔ細胞は、ナイーブなＴ細胞（ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋）と比較して、より多くのサイトカインを産生することが知られているので(Sallusto, F., et al., (2004). Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 22, 745-763.)、Ｔ−ＫＯマウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン産生の増強は、これらの変異体マウスにおけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−Ｔ細胞の割合の増加を反映しているものと考えられた。この可能性を調べるために、２つのアプローチをとった。第一に、ＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を、野生型及びＴ−ＫＯマウスより選別し、抗ＣＤ３ Ａｂ／抗ＣＤ２８ Ａｂ、又はＰＭＡ／抗ＣＤ２８ Ａｂでの刺激後のサイトカイン産生を測定した。Ｔ−ＫＯ ＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞は、増殖及びサイトカイン産生（ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）の低減を示した（図５Ａ及び図５Ｂ）。第二に、成熟末梢Ｔ細胞がＭＥＫＫ３の非存在下では正常に発生分化し得ないという障害を避けるために、ＭＥＫＫ３を、ＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来の活性化した末梢Ｔ細胞中で、レトロウイルス媒介性Ｃｒｅ発現により、欠損させた。抗ＣＤ３ Ａｂ／抗ＣＤ２８ Ａｂ刺激後の細胞増殖及びサイトカイン産生は、Ｃｒｅ発現エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞において有意に低減した（図５Ｃ及び図５Ｄ）。従って、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介性の増殖並びにＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生をポジティブに調節すると結論した。
【０１７１】
実施例５ Ｔ細胞サイトカイン応答におけるＭＥＫＫ３の役割
サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）は、Ｔ細胞増殖及びエフェクターＴ細胞の生存を促進し得る（Vella, A. T., et al., (1998). Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815.）。末梢Ｔ細胞のサイトカイン応答においてＭＥＫＫ３が必要であることを評価するために、ＩＬ−２又はＩＬ−７に応答するＴ細胞増殖を調べた。ＩＬ−２又はＩＬ−７に応答するＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来のＣｒｅ発現細胞の増殖が、偽感染エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、有意に低減した（図５Ｅ）。これらの結果は、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介性の応答のみならず、末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン誘導性の応答にも寄与することを示唆する。
【０１７２】
実施例６ 胸腺細胞におけるＴＣＲ刺激により誘導される、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、及びｐ３８活性化におけるＭＥＫＫ３の役割
ＭＥＫＫ３は、ＴＣＲ媒介性の細胞応答に必要であることが実証されたので、更に、ＭＥＫＫ３を欠損することがＴＣＲ媒介性のシグナル伝達にどのような影響を与えるのかを調べた。ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８の活性化を、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞におけるリン酸化状態により評価した（図６Ａ）。抗ＣＤ３ Ａｂ刺激の後、ＥＲＫではなくＪＮＫ及びｐ３８の活性化がＴ−ＫＯマウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において欠如していた。次に、本発明者らは、ＮＦ−κＢ活性を、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞でのＤＮＡ結合活性を測定することにより調べた。既報（Liu, H. H., et al., (2006). Essential role of TAK1 in thymocyte development and activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 11677-11682.）、ＮＦ−κＢは、野生型マウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において活性であった。対照的に、この活性は、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞では大幅に減少した（図６Ｂ）。更に、野生型マウス由来の細胞では、ＴＣＲ刺激は、ＩκＢαリン酸化を誘導する一方、Ｔ−ＫＯマウス由来の細胞では、誘導されたホスホ−ＩκＢαは検出不能であった（図６Ｃ）。従って、ＭＥＫＫ３は、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞におけるＮＦ−κＢ、ＪＮＫ及びｐ３８を活性化するＴＣＲ媒介シグナル伝達を調節することが示された。
【０１７３】
実施例７ ＴＣＲ媒介シグナル伝達におけるＴＡＫ１及びこれに続くＮＦ−κＢ活性化におけるＭＥＫＫ３の役割
ＭＥＫＫ３がＴＣＲ媒介シグナル伝達にどのように関与するかを述べる前に、内因性ＭＥＫＫ３が、抗ＣＤ３ Ａｂ刺激の後、一次Ｔ細胞において実際に活性化されるかを調べた。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＭＥＫＫ３を免疫沈降し、免疫沈降物のインビトロのキナーゼ活性を測定した。基質として、ＭＫＫ６又はＭＥＫＫ３それ自体を用いた。図７Ａに示されるように、ＭＥＫＫ３は、ＴＣＲ刺激に応答して活性化された。
ＰＭＡは、直接的にＰＫＣの活性化を誘導するので、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２＋末梢Ｔ細胞におけるＰＭＡ／ＣＤ２８媒介細胞応答の欠如は、ＭＥＫＫ３が、ＰＫＣの下流で作用し得ることを示唆する（図５Ａ及び図５Ｂ）。アダプタータンパク質ＣＡＲＭＡ１は、ＴＣＲ媒介ＮＦ−κＢ及びＪＮＫ活性化経路におけるＰＫＣの直接的な下流標的であることが公知である。ＣＡＲＭＡ１は、ＴＣＲ刺激の後のＩＫＫ及びＪＮＫの活性化を可能にするマクロ分子複合体のオーガナイザーとして機能すると考えられている（Thome, M. (2004). CARMA1, BCL-10 and MALT1 in lymphocyte development and activation. Nat. Rev. Immunol. 4, 348-359.）。従って、まず、ＭＥＫＫ３が、このマクロ分子複合体と会合するのかを調べた。図７Ｂに示されるように、一次Ｔ細胞における内因性ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との間の効率的な相互作用が、ＴＣＲ刺激の後に観察された。このことは、ＭＥＫＫ３が、マクロ分子複合体に動員され、これにより、ＴＣＲ媒介シグナル伝達を背景にＩＫＫ及びＪＮＫ活性化に関与し得ることを示唆する。
ＭＥＫＫ３がＴＣＲ媒介ＮＦ−κＢ活性化を調節するメカニズムに対する洞察を更に得るために、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を設計し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてＭＥＫＫ３発現をノックダウンした（ＭＥＫＫ３−ｋｄ）。ＭＥＫＫ３タンパク質発現は、効率的にかつ安定に抑制された（図７Ｃ）。ＭＥＫＫ３をノックダウンすることがＴＣＲ媒介性のＮＦ−κＢ活性化にどのような影響を与えるのかを調べるために、この細胞を抗ＣＤ３ Ａｂで刺激した。ＩＫＫ活性化は、ＭＥＫＫ３−ｋｄにおいて著しく減少した。このことは、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介性のＮＦ−κＢ活性化に必要であることが、Ｊｕｒｋａｔモデル系において再現されたことを示す（図７Ｄ）。
【０１７４】
Ｂｃｌ１０及びＴＡＫ１は、ＴＣＲ刺激の後、直接的にであれ間接的にであれ、ＣＡＲＭＡ１と会合することが公知である（Sun, L., et al., (2004). The TRAF6 ubiquitin ligase and TAK1 kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1 in T lymphocytes. Mol. Cell 14, 289-301.；Thome, M., and Weil, R. (2007). Post-translational modifications regulate distinct functions of CARMA1 and BCL10. Trends. Immunol. 28, 281-288.）。これらの会合は、ＮＦ−κＢのＴＣＲ誘導性活性化に必要であると考えられるので（Sun, L.ら、2004、上述；Thome, M., 及びWeil, R.、2007、上述）、Ｊｕｒｋａｔモデル系を用いて、ＣＡＲＭＡ１とＢｃｌ１０及びＴＡＫ１との会合が、ＭＥＫＫ３ノックダウンにより影響されるかを試験した。図７Ｅに示されるように、Ｂｃｌ１０及びＴＡＫ１とＣＡＲＭＡ１との誘導可能な会合は、ＭＥＫＫ３−ｋｄ細胞において実質的に減少した。このことは、ＭＥＫＫ３が、直接的にであれ間接的にであれ、マクロ分子複合体の形成に関与していることを示唆する。更に、ＭＥＫＫ３のノックダウンにより、ＴＡＫ１活性化が減じた（図７Ｆ）。ＴＡＫ１がＩＫＫをリン酸化する直接的な原因キナーゼであると考えられるので、ＴＡＫ１活性化欠如により、部分的に、ＭＥＫＫ３の非存在下でのＮＦ−κＢの活性化欠如が説明され得る。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：マウスのＭＥＫＫ３遺伝子
配列番号２：マウスのＭＥＫＫ３蛋白質
配列番号３：Ｏｃｔ−１に対する特異的プローブ
配列番号４：ｓｈＲＮＡ（ｈｕ−ＭＥＫＫ３）
配列番号５：ｓｈＲＮＡ（ｈｕ−ＭＥＫＫ３）
配列番号６：ｓｈＲＮＡ（ネガティブコントロール）
配列番号７：ｓｈＲＮＡ（ネガティブコントロール）
配列番号８：ＰＣＲプライマー（ｆｌｏｘアレル用）
配列番号９：ＰＣＲプライマー（ｆｌｏｘアレル用）
配列番号１０：ＰＣＲプライマー（Δ−アレル用）
配列番号１１：ＰＣＲプライマー（Δ−アレル用）
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明のＴ細胞受容体機能調節剤（以下、ＴＣＲ機能調節剤とも称する）は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し、新たなメカニズムの免疫疾患予防・治療剤等として有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでＴ細胞受容体の機能を調節し得る物質を得ることができるので、免疫調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究等に有用である。
本発明の動物は、Ｔ細胞受容体の機能の解析、Ｔ細胞受容体機能の異常により引き起こされる各種疾患の予防・治療剤の開発等に有用であり得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴ細胞受容体機能調節剤、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）（例えば、ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８）は、哺乳動物において、ユビキタスに発現し、そして広範で多様な機能（免疫調節及び免疫活性化が挙げられる）を調節する（非特許文献１、２）。ＭＡＰＫ活性の異常は、種々の免疫媒介性病理学的状態（例えば、慢性関節リウマチ及び炎症性腸疾患）と関連していることが知られている（非特許文献３、４）。ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、及びＭＡＰＫＫキナーゼ（ＭＡＰ３Ｋ）を介した、保存されたカスケードにより、活性化される。ＭＡＰ３Ｋファミリーの多くのメンバー（ＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ２、ＭＥＫＫ３、ＭＥＫＫ４、ＡＳＫ１、ＴＡＫ１及びＴｐｌ２が挙げられる）が同定されている（非特許文献５）。しかし、特定のシグナル伝達経路及び生理学的プロセスにおけるこれらの具体的な機能は、十分には解明されていない。
【０００３】
一部のＭＡＰ３Ｋは、自然免疫細胞のＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）刺激に対する応答及び炎症性サイトカインに対する応答を、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）活性及びＪＮＫ活性を制御することにより、調節することが知られている（非特許文献６、７）。例えば、ＴＡＫ１は、ＴＮＦα、ＩＬ−１及びＬＰＳ刺激後に、ＩＫＫ及びＪＮＫを活性化することが報告されている（非特許文献８〜１０）。しかし、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫのＴＬＲ８による活性化は、ＴＡＫ１非依存性であり（非特許文献１１）、そしてＩＬ−１によるＩＫＫ活性化は、ＴＡＫ１欠損細胞では完全には阻害されなかった（非特許文献９、１０）。このことは、ＩＫＫ及びＪＮＫ活性化の、ＴＡＫ１非依存性のメカニズムの存在を示唆している。これは、他のＭＡＰ３Ｋ（例えば、ＭＥＫＫ２又はＭＥＫＫ３）により媒介され得る。実際、ＭＥＫＫ３欠損ＭＥＦ(mouse embryo fibroblast)細胞では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢ及びＪＮＫの活性化に遅延がある（非特許文献１２、１３）。さらに、ＭＥＫＫ２ノックダウンＭＥＦは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１刺激後にＮＦ−κＢ活性化の遅延相(late phase)を誘導できなかった（非特許文献１４）。
炎症性応答及び自然免疫応答におけるＭＥＫＫ２及びＭＥＫＫ３の、確証されたこのような役割とは対照的に、獲得免疫におけるこれらの役割は、それほど明らかではなく、そして幾分議論の的となっている。
【０００４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、獲得免疫応答の最も中枢に位置する。ＴＣＲによる抗原認識は、複数の細胞内シグナル伝達経路（カスケード）を誘導する。そのうちの一つは、ＩＫＫを介して転写因子ＮＦ−κＢを活性化する。転写因子ＮＦ−κＢの活性化は、獲得免疫応答におけるＴ細胞の増殖や分化に重要である。プロテインキナーゼＣθ（ＰＫＣθ）、足場蛋白であるＣＡＲＭＡ１（ＣＡＲＤ１１とも称される）、ＣＡＲＤ(caspase recruitment domain)をもつ蛋白Ｂｃｌ１０、およびパラカスパーゼ（カスパーゼ関連プロテアーゼ）であるＭＡＬＴ１が関与しているシグナル伝達経路は、ＴＣＲとＩＫＫ複合体を結びつける必須の中間経路であることが明らかにされつつある（非特許文献１５）。しかし、シグナル伝達経路の活性化を開始するＴＣＲ近傍の現象はほとんど明らかにされていない。このシグナル伝達経路の態様をさらに解明することにより、免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供することが切望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dong, C., Davis, R. J., and Flavell, R. A. (2002). MAP kinases in the immune response. Annu. Rev. Immunol. 20, 55-72.
【非特許文献２】Raman, M., Chen, W., and Cobb, M. H. (2007). Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene 26, 3100-3112.
【非特許文献３】Hollenbach, E., Neumann, M., Vieth, M., Roessner, A., Malfertheiner, P., and Naumann, M. (2004). Inhibition of p38 MAP kinase- and RICK/NF-kB-signaling suppresses inflammatory bowel disease. FASEB J. 18, 1550-1552.
【非特許文献４】Johnson, G. L., and Lapadat, R. (2002). Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science 298, 1911-1912.
【非特許文献５】Cuevas, B. D., Abell, A. N., and Johnson, G. L. (2007). Role of mitogen-activated protein kinase kinase kinases in signal integration. Oncogene 26, 3159-3171.
【非特許文献６】Hacker, H., and Karin, M. (2006). Regulation and function of IKK and IKK-related kinases. Sci. STKE 2006, re13.
【非特許文献７】Schulze-Luehrmann, J., and Ghosh, S. (2006). Antigen-receptor signaling to nuclear factor k B. Immunity 25, 701-715.
【非特許文献８】Adhikari, A., Xu, M., and Chen, Z. J. (2007). Ubiquitin-mediated activation of TAK1 and IKK. Oncogene 26, 3214-3226.
【非特許文献９】Sato, S., Sanjo, H., Takeda, K., Ninomiya-Tsuji, J., Yamamoto, M., Kawai, T., Matsumoto, K., Takeuchi, O., and Akira, S. (2005). Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 6, 1087-1095.
【非特許文献１０】Shim, J. H., Xiao, C., Paschal, A. E., Bailey, S. T., Rao, P., Hayden, M. S., Lee, K. Y., Bussey, C., Steckel, M., Tanaka, N., et al. (2005). TAK1, but not TAB1 or TAB2, plays an essential role in multiple signaling pathways in vivo. Genes Dev. 19, 2668-2681.
【非特許文献１１】Qin, J., Yao, J., Cui, G., Xiao, H., Kim, T. W., Fraczek, J., Wightman, P., Sato, S., Akira, S., Puel, A., et al. (2006). TLR8-mediated NF-kB and JNK activation are TAK1-independent and MEKK3-dependent. J. Biol. Chem. 281, 21013-21021.
【非特許文献１２】Huang, Q., Yang, J., Lin, Y., Walker, C., Cheng, J., Liu, Z. G., and Su, B. (2004). Differential regulation of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor signaling by MEKK3. Nat. Immunol. 5, 98-103.
【非特許文献１３】Yang, J., Boerm, M., McCarty, M., Bucana, C., Fidler, I. J., Zhuang, Y., and Su, B. (2000). Mekk3 is essential for early embryonic cardiovascular development. Nat. Genet. 24, 309-313.
【非特許文献１４】Schmidt, C., Peng, B., Li, Z., Sclabas, G. M., Fujioka, S., Niu, J., Schmidt-Supprian, M., Evans, D. B., Abbruzzese, J. L., and Chiao, P. J. (2003). Mechanisms of proinflammatory cytokine-induced biphasic NF-kB activation. Mol. Cell 12, 1287-1300.
【非特許文献１５】Thome M, (2004) CARMA1, BCL-10 and MALT1 in lymphocyte development and activation. Nature reviews. Immunology 348-359.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、獲得免疫系において、Ｔ細胞の活性化及び発生分化を調節するメカニズムをさらに解析し、このメカニズムを担う因子を同定すること、並びに得られた知見に基づいて新たな機序の医薬やそのスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、ＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウトマウスにおいてＴ細胞の発生分化や機能が著しく障害され、獲得免疫応答が不全であることを見出した。さらにＭＥＫＫ３が、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０およびＭＡＬＴ１からなるマクロ分子複合体、特にＣＡＲＭＡ１と効率的に相互作用すること等から、ＭＥＫＫ３がＴ細胞受容体媒介シグナル伝達に欠くことができない分子であり、Ｔ細胞の発生分化及び機能を調節し得ること、免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子として有用であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の発明等を提供する。
［１］ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
［２］ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質である、上記［１］記載の剤。
［３］ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質である、上記［１］記載の剤。
［４］医薬である、上記［１］記載の剤。
［５］獲得免疫の異常により引き起こされる疾患の予防・治療剤である、上記［４］記載の剤。
［６］Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療剤である、上記［４］記載の剤。
［７］Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患が、免疫不全症候群（複合免疫不全症、もしくはこれに伴う重篤な感染症など）からなる群より選択される、上記［６］記載の剤。
［８］Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療剤である、上記［４］記載の剤。
［９］Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患が、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ・多発性硬化症・多発性筋炎・重症筋無力症、ギランバレー症候群、全身性エリテマトーデス等）からなる群より選択される、上記［８］記載の剤。
［１０］被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１１］以下の工程を含む、上記［１０］記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を亢進し得る物質として選択する工程。
［１２］以下の工程を含む、上記［１０］記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を抑制し得る物質として選択する工程。
［１３］生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
［１４］ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定用試薬を含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
［１５］ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
［１６］ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１７］生体試料における、ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
［１８］被検物質がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１９］ＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＴ細胞受容体機能調節剤（以下、ＴＣＲ機能調節剤とも称する）は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し、新たなメカニズムの免疫疾患予防・治療剤等として有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでＴ細胞受容体の機能を調節し得る物質を得ることができるので、免疫調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究等に有用である。
本発明の動物は、Ｔ細胞受容体の機能の解析、Ｔ細胞受容体機能の異常により引き起こされる各種疾患の予防・治療剤の開発等に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＭＥＫＫ３のＴ細胞特異的遺伝子ターゲティングを説明する模式図である。（Ａ）コンディショナルターゲティングベクターの構築。ＭＥＫＫ３遺伝子のエキソン１１及び１２を含むゲノム断片を欠失させた。エキソン１１は、キナーゼ活性に必要不可欠なＡＴＰ結合部位（Ｋ３９１）をコードする。１つのｌｏｘＰ部位を、イントロン１０の中に導入し、ネオマイシン耐性遺伝子カセットに隣接する２つのｌｏｘＰ部位をイントロン１２の中に導入した。（Ｂ）ＭＥＫＫ３遺伝子型を、以下のプライマー対：Ｐ１−CTCCTGGGTCAAGGTGCCTTCGGCAGGGTCTACTTGTGCT（配列番号８）及びＰ２−AACTGGATCTCACACTCCAGAGCACTCACCTCCTAGAGA（配列番号９）（ｆｌｏｘアレルに関して）、又はＰ３−TCAGAATGATCTAATGTTTGTGAGCAGCTT（配列番号１０）及びＰ４−TCACTATGCTGACCAGCTGGCCTCACAGTGCACAGA（配列番号１１）（Δ−アレルに関して）、を用いたＰＣＲにより解析した。ゲノムＤＮＡを、全胸腺細胞（Ｔｈｙ）、ＣＤ５ポジティブ脾細胞（Ｓｐｌ）、ＣＤ４ポジティブ（ＣＤ４＋）、又はＣＤ８ポジティブ（ＣＤ８＋）脾細胞より単離した。（Ｃ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウスのＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞由来のＭＥＫＫ３タンパク質のウエスタンブロット解析。
【図２】図２は、ＭＥＫＫ３が、正常なＴ細胞の発生分化に必要不可欠なことを示した図である。（Ａ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）の胸腺（Ｔｈｙ）、脾臓（Ｓｐｌ）、及び末梢血（ＰＢ）由来のリンパ球のフローサイトメトリーの結果。各ボックスの数は、集団の割合を示す。（Ｂ）胸腺細胞（Ｔｈｙ）又は脾細胞（Ｓｐｌ）の細胞数。Ｐは、細胞数の有意差を示す（ｎ＝８）。
【図３】図３は、Ｔ−ＫＯマウス由来の末梢Ｔ細胞（ＭＥＫＫ３欠損を有する末梢Ｔ細胞）が活性化された表現型を有することを説明する図である。（Ａ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｓｐｌ ＣＤ４＋）でのＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌ発現についてフローサイトメトリーを行なった結果。典型的な２つのデータを示す。各ボックスにおける数は、集団の割合を示す。（Ｂ）細胞を２４時間、所定濃度の抗ＣＤ３ Ａｂ又は抗ＣＤ３ Ａｂと抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激した後のＣＤ４＋脾細胞のサイトカイン産生を測定した結果。有意差を、Ｐ値として示す（ｎ＝４）。（Ｃ）脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現についてフローサイトメトリーを行なった結果。（Ｄ）ＰＩ染色後に、自発的細胞死を、フローサイトメトリーにより評価した。胸腺（Ｔｈｙ）、ＣＤ４＋脾細胞（Ｓｐｌ ＣＤ４＋）、又はＣＤ８＋脾細胞（Ｓｐｌ ＣＤ８＋）由来の細胞を、所定時間、刺激することなく培養した。これらの実験では、有意差は観察されなかった（ｎ＝４）。（Ｅ）Ｃｏｎ．Ａ及びＣｏｎ．Ａ阻害剤であるα−メチル−Ｄ−マンノシドを用いて、活性化によって誘導される細胞死を測定した。精製したＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞を用いた。これらの実験では、有意差は観察されなかった（ｎ＝４）。
【図４】図４は、ＭＥＫＫ３がＴＣＲ媒介性の細胞応答に必要であることを説明する図である。（Ａ及びＢ）ＴＣＲ刺激により誘導される細胞増殖（Ａ）及びサイトカイン産生（Ｂ）。Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を、所定濃度（μｇ／ｍｌ）の抗ＣＤ３ Ａｂでコーティングしたプレート中で、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂあり（ＣＤ３／ＣＤ２８）又はなし（ＣＤ３）で、４８時間培養した。ＩＬ−２又はＩＦＮ−γのレベルを、２４時間培養した後の培養上清を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、決定した。データを、三連の培養物の平均±標準偏差として示す（ｎ＝３）。有意差を、Ｐ値として示す。（Ｃ）活性化マーカーとしてのＣＤ２５発現のフローサイトメトリー解析の結果。精製したＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を、抗ＣＤ３ Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）プラス抗ＣＤ２８ Ａｂ（２μｇ／ｍｌ）で、処理しなかったか（−）又は４８時間刺激し（＋）、ＣＤ２５に対するＡｂで染色した。
【図５】図５は、ＭＥＫＫ３が末梢Ｔ細胞におけるＴＣＲ媒介性の細胞応答に必要であることを説明する図である。（Ａ及びＢ）Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来の精製したＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋脾臓Ｔ細胞の、細胞増殖（Ａ）及びサイトカイン産生（Ｂ）について調べた結果を示す。細胞を、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４の抗体を用いてそれぞれ染色した後に直接的に選別し、そして１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ Ａｂコーティングプレート中で、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂとともに（ＣＤ３／ＣＤ２８）又は１００ｎｇのＰＭＡ及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂをプラスして（ＰＭＡ／ＣＤ２８）、４８時間培養した。ＩＬ−２又はＩＦＮ−γのレベルを、２４時間培養した上清を用いるＥＬＩＳＡにより決定した。データを、三連の培養物の平均±標準偏差として示す（ｎ＝１０）。有意差を、Ｐ値として示す。（Ｃ及びＤ）エフェクターＴ細胞を解析した結果。ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘマウス由来の脾細胞を、Ｃｒｅ及びＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｒｅ）又は単にＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ｍｏｃｋ；偽感染）をコードするレトロウイルスを用いて、後述の（材料及び方法）に記載のようにしてトランスインフェクトした。細胞増殖（Ｃ）及びサイトカイン産生（Ｄ）を、それぞれ（Ａ）及び（Ｂ）と同様に解析した。データは、２つの実験のうちの代表の三連の培養物からの結果である。（Ｅ）エフェクターＴ細胞のサイトカイン応答を調べた結果。細胞を、（Ｃ、Ｄ）と同様に調製した。刺激物質としてのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−７）は、２０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【図６】図６は、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ刺激により誘導される、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、及びｐ３８の活性化（ＭＡＰＫ活性化）に必要であることを説明する図である。（Ａ）ＭＡＰＫのイムノブロット解析の結果。Ｌｃｋ−Ｃｒｅ／野生型（ｗｔ）マウス及びＬｃｋ−Ｃｒｅ／ＭＥＫＫ３Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ（Ｔ−ＫＯ）マウス由来の精製したＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を、５分間刺激した。（Ｂ）未刺激の（ナイーブな）ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞（野生型マウス由来、Ｔ−ＫＯマウス由来）のＮＦ−κＢ活性を、ＥＭＳＡにより解析した結果。（Ｃ）ＴＣＲ刺激に応答するＩκＢαリン酸化について調べた結果。
【図７】図７は、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介シグナル伝達において、ポジティブにＴＡＫ１及びその後のＮＦ−κＢ活性化を調節することを説明する図である。（Ａ）インビトロＭＥＫＫ３キナーゼアッセイの結果。細胞溶解物（２×１０７）を、所定の遺伝子型のＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞から調製した。リン酸化状態を、抗ホスホ−セリン及びスレオニン（Ｐ−ＳＴ）Ａｂにより検出した。基質として、ＭＫＫ６又はＭＥＫＫ３それ自体を用いた。（Ｂ）ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との誘導可能な相互作用を調べた結果。（Ａ）における細胞溶解物と同一の細胞溶解物を、抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂにより免疫沈降し、抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂにより検出した。（Ｃ）ｓｈＲＮＡのＭＥＫＫ３タンパク質発現に対する影響を調べた結果。ＭＥＫＫ３−ノックダウン（ＭＥＫＫ３−ｋｄ）及びコントロール（ｃｔｌ−ｋｄ）について調べた。（Ｄ）ＭＥＫＫ３ノックダウン細胞におけるＴＣＲ誘導ＩκＢαリン酸化及びＩＫＫ活性化について調べた結果。全細胞溶解物（ＷＣＬ）中のＩκＢαリン酸化を、抗ホスホＩκＢαにより検出した。ＩＫＫキナーゼ活性に関して、ＩＫＫを免疫沈降し、そのキナーゼ活性を、基質としてのＩＫＫβ Ａｂ又はＩκＢα−ＧＳＴのリン酸化により評価し、それぞれ抗ホスホＩＫＫβ Ａｂ又は抗ホスホＩκＢα Ａｂにより検出した。（Ｅ）ＭＥＫＫ３ノックダウンのＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、及びＴＡＫ１の複合体の形成に対する影響を調べた結果。細胞溶解物（２×１０７）を抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂにより免疫沈降し、抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂ、抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂ、抗ＴＡＫ１ Ａｂ、抗ＭＡＬＴ１ ｍＡｂ、及び抗Ｂｃｌ１０ ｍＡｂにより検出した。下側パネルは、全細胞溶解物（ＷＣＬ）のブロット像である。（Ｆ）ＴＡＫ１キナーゼアッセイの結果を示す。ＴＣＲ刺激により誘導されるＴＡＫ１活性化を、基質としてのＩＫＫβ−ＧＳＴ又はＴＡＫ１それ自体に対するインビトロリン酸化活性により決定し、抗ホスホＩＫＫβ Ａｂ又は抗ホスホ−セリン及びスレオニン（Ｐ−ＳＴ）Ａｂにより検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１２】
（ＴＣＲ機能調節剤）
本発明はＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、ＴＣＲ機能調節剤を提供する。
ＭＥＫＫ３の発現とは、ＭＥＫＫ３遺伝子から転写、翻訳を経て蛋白質が生成される過程を意味し、該蛋白質は、機能的な状態でその作用部位に局在する。
【００１３】
ＭＥＫＫ３の機能とは、ＭＥＫＫ３（蛋白質）が有する生物学的機能（活性）をいい、例えば、ＭＥＫＫ３が有する蛋白質キナーゼ活性（セリン／スレオニンキナーゼ活性）や、Ｔ細胞受容体媒介シグナル伝達（ＴＣＲ媒介シグナル伝達）に関与する他の分子（例えば、後述するが、アダプター分子であるＣＡＲＭＡ１等）との相互作用、等をいう。「相互作用」とは分子同士の直接的な結合、又は他の分子を介する間接的な結合をいう。該結合は共有結合又は非共有結合であり得るが、非共有結合が好ましい。非共有結合としては、水素結合、静電結合、ファン・デル・ワールス力、疎水結合等が挙げられる。
【００１４】
Ｔ細胞受容体機能（ＴＣＲ機能）とは、Ｔ細胞受容体からの刺激を細胞内へ伝達し、Ｔ細胞の機能的変化を誘導し得る作用、或いはその誘導過程に存在する種々の反応を誘導し得る作用をいう。一連の誘導過程をシグナル伝達、あるいはシグナルカスケードとも称する。Ｔ細胞受容体からの刺激としては、抗原や抗原ミミック等による刺激が挙げられる。抗原（ペプチド、脂質等）は、通常ＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ）上に提示され、抗原とＭＨＣ分子との複合体がＴ細胞受容体により認識される。また抗原ミミックとしては、Ｔ細胞受容体やＴ細胞受容体複合体を構成する分子（ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖等）に対する抗体等が挙げられるが、これに限定されない。Ｔ細胞の機能的変化としては、Ｔ細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロンγ等）産生、細胞障害活性）、発生分化、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。Ｔ細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、Ｔ細胞受容体からのシグナル伝達に関与する分子の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、ＲＡＦＴへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【００１５】
Ｔ細胞受容体からのシグナル伝達には、ＮＦ−ＡＴの活性化へ至る経路と、ＮＦ−κＢの活性化へ至る経路があり、活性化されたこれらの転写因子が標的遺伝子の発現をコントロールする。ＰＫＣθはＣＡＲＭＡ−１／Ｂｃｌ１０／ＭＡＬＴ１のマクロ分子複合体と協調して、ＮＦ−κＢの活性化へ関与する（非特許文献１５）。
【００１６】
後述の実施例等で示されるように、ＴＣＲ媒介シグナル伝達後にＭＥＫＫ３がアダプター分子であるＣＡＲＭＡ−１と相互作用し、そしてポジティブにキナーゼＴＡＫ１を調節し、ＩＫＫを活性化し、続いてＮＦ−κＢの活性化を引き起こす。
【００１７】
本発明のＴＣＲ機能調節剤の一実施態様では、該調節剤に含められる、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質であり得る。
ＭＥＫＫ３の発現を促進する物質は、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書で使用される場合、ＭＥＫＫ３の発現の促進としては、ＭＥＫＫ３自体の補充をも含むものとする。
【００１８】
ＭＥＫＫ３の機能を促進する物質は、ＭＥＫＫ３に結合し、該蛋白質を修飾（リン酸化等）し、或いは該蛋白質の安定性を増加させること等により、上述のＭＥＫＫ３の機能（例えば、他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）を促進する作用を有する化合物をいう。
【００１９】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）ＭＥＫＫ３；
（ｉｉ）ＭＥＫＫ３をコードする核酸。
【００２０】
本発明の剤に含められる、ＭＥＫＫ３としては、任意の哺乳動物のＭＥＫＫ３を用いることが出来る。
【００２１】
哺乳動物としては、具体的にはヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることが出来る。
【００２２】
哺乳動物のＭＥＫＫ３としては野生型のＭＥＫＫ３が好ましく、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＭＥＫＫ３等が挙げられる。ＭＥＫＫ３は、哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、本発明においてはそのようなＭＥＫＫ３もまた本発明の剤に含めることができる。用いるＭＥＫＫ３の由来は、本発明の剤や医薬、スクリーニング方法の対象となる動物の種類に応じて適宜選択される。
さらに、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同一のアミノ酸配列からなるＭＥＫＫ３も本発明の範囲内である。「実質的に同一のアミノ酸配列を有するＭＥＫＫ３」としては、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同質の活性を有するＭＥＫＫ３等が挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）等の同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている(例えば、Bowieら,Science, 247: 1306-1310 (1990)を参照)。
【００２３】
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altschulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２４】
「実質的に同質の活性」とは、例えば、ＭＥＫＫ３の機能（活性）が性質的に野生型ＭＥＫＫ３と同質であることを示す。したがって、その機能（活性）の程度や蛋白質の分子量等の量的要素は異なっていてもよい。ここにいうＭＥＫＫ３の機能（活性）としては、上述の機能（他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）のほか、Ｔ細胞受容体を介したＴ細胞の機能的変化（上述）が挙げられる。該機能の測定は、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞にＭＥＫＫ３を強制発現させ、該細胞のＴ細胞受容体からの刺激に対する応答（細胞増殖、サイトカイン産生等）の変化を測定することにより行うことができる。
【００２５】
また、本発明において用いられるＭＥＫＫ３は、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同質の活性を有する蛋白質をも含む。該蛋白質としては、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列に、更に１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜２５０個程度、より好ましくは１〜１００個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、野生型ＭＥＫＫ３と実質的に同質の活性を有する蛋白質が挙げられる。付加されるアミノ酸配列は特に限定されないが、例えば蛋白質の検出や精製等を容易にならしめるためのタグや、蛋白質の細胞内への導入を容易にならしめるためのProtein Transduction Domain（ＰＴＤ）等のアミノ酸配列を挙げることが出来る。より具体的には、タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光蛋白質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を挙げることが出来る。また、ＰＴＤとしては、ＡＮＴＥＮＮＡＰＥＤＩＡ、ＨＩＶ／ＴＡＴ、ＨＳＶ／ＶＰ−２２等の細胞通過ドメイン、７〜１１個のポリアルギニン等を挙げることが出来る。アミノ酸が付加される位置は、当該蛋白質の活性を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは、野生型ＭＥＫＫ３のアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列の末端（Ｎ末端又はＣ末端）である。
【００２６】
本発明で用いられるＭＥＫＫ３は必要に応じて修飾されていてもよい。該修飾としては、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００２７】
ＭＥＫＫ３は所望により自体公知の方法によって塩として用いることができる。塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
【００２８】
ＭＥＫＫ３は、該ＭＥＫＫ３を発現する細胞から回収され得る蛋白質、又は組換え蛋白質であり得る。ＭＥＫＫ３は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）天然のＭＥＫＫ３発現細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）からＭＥＫＫ３を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）にＭＥＫＫ３発現ベクター（後述）を導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生されるＭＥＫＫ３を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系によりＭＥＫＫ３を合成してもよい。ＭＥＫＫ３は、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ＭＥＫＫ３抗体の使用等の特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法等により適宜精製される。
【００２９】
ＭＥＫＫ３は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＭＥＫＫ３を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチド（蛋白質）を製造することができる。
【００３０】
ＭＥＫＫ３発現ベクターを導入して得られる形質転換体よりＭＥＫＫ３を産生・回収する方法としては、例えば以下のようにして実施される。
ＭＥＫＫ３発現ベクターはＭＥＫＫ３をコードする核酸を含有する。ＭＥＫＫ３をコードする核酸としては、ＭＥＫＫ３をコードするｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、染色体ＤＮＡ等が挙げられ、より具体的には、例えば配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する核酸等が挙げられる。ＭＥＫＫ３をコードする核酸は、哺乳動物の種類等によってその配列が異なる場合があり、本発明においてはそのような核酸もまた用いることができる。用いるＭＥＫＫ３をコードする核酸の由来は、取得を所望するＭＥＫＫ３の種類に応じて適宜選択される。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。ＭＥＫＫ３をコードする核酸は、該核酸の一部分を有する合成プライマーと、該核酸を有する染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。
【００３１】
ＭＥＫＫ３をコードする核酸を含有する発現ベクターは、クローン化された該核酸を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、用いる宿主に応じて適切なベクター（プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等）を選択することが出来る。また、プロモーターも、用いる宿主に対応して、適切なものを選択することが出来る。
【００３２】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)等）、酵母（サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（サル細胞（ＣＯＳ−７等）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ細胞等）等）等が用いられる。
【００３３】
ＭＥＫＫ３をコードする核酸を含有する発現ベクターを、自体公知の方法に従って宿主へ導入することにより、ＭＥＫＫ３を発現可能な形質転換体を製造することが出来る。
【００３４】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができ、形質転換体の細胞内又は細胞外にＭＥＫＫ３を生成させることができる。更に、前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ＭＥＫＫ３を自体公知の方法に従って分離精製することができる。
【００３５】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質としてＭＥＫＫ３をコードする核酸を用いる場合、該核酸としては上述と同様のものを用いることが出来る。
【００３６】
ＭＥＫＫ３をコードする核酸は、適切な発現ベクターに含まれた態様で用いられることが好ましい。即ち、該核酸は適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結され得る。
【００３７】
また、Ｔ細胞受容体機能を効果的に調節するため、該発現ベクターは適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能なものが用いられる。該発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられるが、ヒト等の哺乳動物のＴ細胞への適用に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００３８】
使用されるプロモーターとしては、適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得る限り特に限定されず、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター；β−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター；Ｌｃｋプロモーター、ＣＤ２プロモーター等のＴ細胞特異的プロモーター等が挙げられる。
【００３９】
該発現ベクターは、好ましくはＭＥＫＫ３をコードする領域の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光蛋白質をコードする遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【００４０】
本発明のＴＣＲ機能調節剤の一実施態様では、該調節剤に含められる、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質であり得る。
ＭＥＫＫ３の発現を抑制する物質は、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００４１】
ＭＥＫＫ３の機能を抑制する物質は、ＭＥＫＫ３に結合したり、該蛋白質を修飾したり、或いは該蛋白質の安定性を低下させたりすること等により、上述のＭＥＫＫ３の機能（例えば、他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）を抑制する作用を有する化合物をいう。
【００４２】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）ＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体、又はＭＥＫＫ３のドミナントネガティブ変異体、或いはこれらをコードする核酸。
【００４３】
目的核酸の標的領域と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。ここで「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。
【００４４】
ＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸（以下、「アンチセンスＭＥＫＫ３」ともいう）は、クローン化された、あるいは決定されたＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸はＭＥＫＫ３遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスＭＥＫＫ３は、ＭＥＫＫ３をコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
【００４５】
アンチセンスＭＥＫＫ３の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてＭＥＫＫ３への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、ＭＥＫＫ３をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ又は初期転写産物）の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、ＭＥＫＫ３をコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
さらに、アンチセンスＭＥＫＫ３は、ＭＥＫＫ３をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、ＭＥＫＫ３をコードする二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００４６】
アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用する等の剤形の工夫によっても克服できる。
【００４７】
ＭＥＫＫ３をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスＭＥＫＫ３に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)]。
【００４８】
ＭＥＫＫ３をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンスＭＥＫＫ３に包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来[Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザイムの代替技術として広く利用されている。ｓｉＲＮＡの大きさは、ＲＮＡｉを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、１５ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上であり得る。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００４９】
上述のＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、ＭＥＫＫ３遺伝子の発現又は機能を抑制する物質として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に、ＭＥＫＫ３をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
【００５０】
ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体は、ＭＥＫＫ３に結合することにより、ＭＥＫＫ３の機能（例えば、他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）を抑制し得る。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体の結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００５１】
例えば、ポリクローナル抗体は、ＭＥＫＫ３あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ(Keyhole Limpet Hemocyanin)等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスター等の哺乳動物が挙げられる。
【００５２】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスにＭＥＫＫ３あるいはそのフラグメントを市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８等）を細胞融合してＭＥＫＫ３を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法[J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)]でも電圧パルス法[Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)]であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清又は動物の腹水から取得できる。
【００５３】
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、上記抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）， Vol.6, No.10, 1988」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平４−５０４３６５号公報、国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
【００５４】
ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体は、より効果的にＭＥＫＫ３の機能を抑制するために、ＭＥＫＫ３の機能性部位（他の蛋白質との相互作用に関与する部位、キナーゼ活性部位等）を特異的に認識し、当該部位が担う機能の低下をもたらすような抗体が選択され得る。
【００５５】
ＭＥＫＫ３のドミナントネガティブ変異体とは、ＭＥＫＫ３に対する変異の導入によりその機能（活性）が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、ＭＥＫＫ３と競合することで間接的にその機能（活性）を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、ＭＥＫＫ３をコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位（他の分子との相互作用に関与する部位、キナーゼ活性部位等）における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＲや公知の変異導入試薬を用いる自体公知の方法により作製できる。
【００５６】
上述のＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体や、ＭＥＫＫ３のドミナントネガティブ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸も、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質として好ましい。該核酸は、適切な発現ベクター（例えば、適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能な発現ベクター）中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に機能的に連結された態様で提供され得る。
【００５７】
本発明の剤は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５８】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００５９】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入等）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００６０】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム；ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオールエオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオールエオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
【００６１】
また、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が蛋白質である場合、該蛋白質の細胞内への導入効率を高めるために、本発明の組成物は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト（ナカライテスク社製）、プロベクチン（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）等を用いることが出来る。
【００６２】
実施例で後述するが、本発明ではＭＥＫＫ３と相互作用し得るＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子としてＣＡＲＭＡ１が同定された。ＭＥＫＫ３はＣＡＲＭＡ１との相互作用を介してＢｃｌ１０及びＭＡＬＴ１と協調してＮＦ−κＢの活性化に寄与し得る。従ってＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節する物質はＴＣＲ機能調節剤として有用である。
【００６３】
本発明の剤の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として０．０００１〜約５０００ｍｇ／ｋｇである。
【００６４】
本発明の剤は、例えば、医薬または研究用試薬として有用である。例えば、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の予防・治療剤として、あるいは当該疾患の研究用試薬として使用され得る。
Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患としては、例えば獲得免疫の異常により引き起こされる疾患が挙げられる。
【００６５】
詳細には、本発明の剤が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を促進する物質を含有する場合、ならびに有効成分としてＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を亢進する物質を含有する場合、該物質は、Ｔ細胞受容体シグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３より下流の経路（例えばＮＦ−κＢ活性化）を増強し得るので、本発明は、例えば、Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患としては、例えば、Ｔ細胞の不活化（抗原に対するＴ細胞応答の低下、Ｔ細胞数の低下等）により引き起こされる免疫不全疾患であり得る。該疾患としては、原発性免疫不全症（例えば、重症複合免疫不全症、Bloom症候群、DiGeirge症候群、ataxia-telangiectasia、ＰＮＰ欠損症、Wiskott-Aldrich症候群、突発性ＣＤ４＋Ｔ細胞減少症、ＡＤＡ欠損症、慢性皮膚粘膜カンジダ症、Duncan症候群（ＥＢウイルスに対する特異的免疫不全）等）、続発性免疫不全状態（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アナジー（Ｔ細胞不応答）、感染症（麻疹、結核）サルコイドーシス、リンパ系悪性腫瘍、薬剤（副腎皮質ホルモン、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン等）老化、栄養障害等）等が挙げられる。
【００６６】
また、本発明の剤が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を抑制する物質を含有する場合、ならびに有効成分としてＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を抑制する物質を含有する場合、該物質は、Ｔ細胞受容体シグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３より下流の経路（例えばＮＦ−κＢ活性化）を抑制し得るので、本発明は、例えば、Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患としては、例えば、Ｔ細胞の異常な活性化（抗原に対するＴ細胞応答の上昇、Ｔ細胞数の上昇等）により引き起こされる免疫不全疾患であり得る。該疾患としては、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性血球減少症、重症筋無力症、強皮症、多発性筋炎、続発性アディソン病、不妊症、自己免疫性糸球体腎炎、シェーグレン病、脈管炎、自己免疫性脊髄炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病等）、アレルギー疾患（例えばＩ型アレルギー疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、じんま疹、アトピー性皮膚炎）、ＩＩ型アレルギー疾患（例えば、グッドパスチャー症候群、溶血性血小板紫斑症）、ＩＩＩ型アレルギー疾患（例えば、全身性血管炎、クリオグロブリン血症、血清症、ウイルス性肝炎、アレルギー性肺胞炎）、ＩＶ型アレルギー疾患（例えば、接触性皮膚炎、臓器移植拒絶反応、結核病変、サルコイドーシス、薬疹）等）、移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）、乾癬（炎症性角化症）、円形脱毛症、扁平苔癬、Ｔリンパ腫（皮膚Ｔ細胞リンパ腫白斑等）等が挙げられる。
【００６７】
獲得免疫の異常により引き起こされる疾患としては、上記ＴＣＲ機能の低下に伴う疾患あるいはＴＣＲ機能の亢進に伴う疾患として例示された各種疾患が挙げられる。
【００６８】
さらに、本発明の剤が研究用試薬である場合、例えば、実験動物におけるＴ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の誘発剤として使用され得る。詳細には、本発明の研究用試薬が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を促進する物質を含有する場合、例えば、Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の誘発に使用され得る。本発明の研究用試薬が、有効成分としてＭＥＫＫ３の発現または機能を抑制する物質を含有する場合、例えば、Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の誘発に使用され得る。
【００６９】
（Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得る物質は、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る。従って、本発明は、被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、及び当該物質を有効成分として含有してなる剤を提供する。
【００７０】
スクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００７１】
本発明のスクリーニング方法は、被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行なわれ得る。
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節（促進又は抑制）し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節（促進又は抑制）し得る被検物質を選択する工程；
（ｃ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を亢進し得る物質として得、或いはＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を抑制し得る物質として得る工程。
【００７２】
ＭＥＫＫ３の発現を調節し得る物質を選択する場合、上記方法の工程（ａ）では、被検物質とＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量と比較する。
【００７３】
ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞とは、ＭＥＫＫ３遺伝子の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＭＥＫＫ３遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞であり得、一方、ＭＥＫＫ３遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞は、上述した動物細胞、好ましくは上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００７４】
ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株等を使用できる。ＭＥＫＫ３発現細胞としてはＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞等のリンパ球等が挙げられるが、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、Ｔ細胞及びＴ細胞由来の細胞株を用いることが好ましい。
【００７５】
ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域は、ＭＥＫＫ３遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＭＥＫＫ３遺伝子の転写を制御する能力を有する領域等が挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００７６】
ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＭＥＫＫ３遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＭＥＫＫ３遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞が好ましい。また、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、Ｔ細胞及びＴ細胞由来の細胞株を用いることがより好ましい。
【００７７】
ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類等に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地等である。培養条件もまた、用いられる細胞の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００７８】
具体的な手順は以下のとおりである。
先ず、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類等を考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞として、ＭＥＫＫ３を天然に発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、ＭＥＫＫ３遺伝子の産物、例えば、転写産物（ｍＲＮＡ）又は翻訳産物（ポリペプチド）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法(Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980))、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法等が使用できる。一方、ＭＥＫＫ３の発現を測定可能な細胞として、ＭＥＫＫ３遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００７９】
次いで、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量が、被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００８０】
上記方法の工程（ｂ）では、工程（ａ）の結果に基づき、ＭＥＫＫ３の発現を調節（促進又は抑制）し得る被検物質が選択される。
【００８１】
ＭＥＫＫ３の機能を調節し得る物質を選択する場合、上記方法の工程（ａ）では、被検物質の存在下でＭＥＫＫ３の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被検物質の不在下におけるＭＥＫＫ３の機能（活性）と比較する。
【００８２】
ＭＥＫＫ３の機能として、ＭＥＫＫ３とＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子（例えばアダプター分子であるＣＡＲＭＡ１等の蛋白質、以下、単に結合対とも称する）との相互作用を測定する場合、本発明のスクリーニング方法は、被検物質がＭＥＫＫ３及びその結合対（例、ＣＡＲＭＡ１）と相互作用し得るか否かを評価することにより行なわれ得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ１）〜（ｃ１）を含み得る：
（ａ１）被検物質、ならびにＭＥＫＫ３及びその結合対を接触させる工程；
（ｂ１）被検物質を接触させた場合におけるＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を測定し、該複合体量を被検物質を接触させない場合の複合体量と比較する工程；
（ｃ１）上記（ｂ１）の比較結果に基づいて、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を調節する被検物質を選択する工程。
【００８３】
上記方法の工程（ａ１）では、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体の形成が可能であるアッセイ系において、被検物質、ＭＥＫＫ３及びその結合対が接触される。その結合対としては、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＴＡＫ１、ＩＫＫ等が挙げられ、ＣＡＲＭＡ１が好ましい。なお、ＭＥＫＫ３及びその結合対の一方又は双方は、それらの複合体の検出を容易にするため標識されていてもよい。標識としては、例えば、標識用物質（例、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質）による標識の他、レポーター遺伝子によりコードされ得る蛋白質との融合が挙げられる。また、本アッセイ系では、ＭＥＫＫ３及び／又はその結合対等を含む細胞ホモジネート（例、ＭＥＫＫ３発現ベクター及び／又はＭＥＫＫ３結合対の発現ベクターをトランスフェクトした細胞のホモジネート）も使用することができる。
【００８４】
上記方法の工程（ｂ１）では、先ず、被検物質を接触させた場合における複合体量が測定される。複合体量の測定は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、免疫学的手法（例、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴を利用する相互作用解析法（例、ＢｉａｃｏｒｅＴＭの使用）が挙げられる。
【００８５】
次いで、被検物質を接触させた場合の複合体量が、被検物質を接触させない場合の複合体量と比較される。複合体量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない場合の複合体量は、被検物質を接触させた場合の複合体量の測定に対し、事前に測定した複合体量であっても、同時に測定した複合体量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した複合体量であることが好ましい。
【００８６】
上記方法の工程（ｃ１）では、複合体量を調節する被検物質が選択される。例えば、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を増加させる（複合体の形成を促進する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の亢進が所望される疾患の予防・治療等に有用であり、ＭＥＫＫ３及びその結合対を含む複合体量を減少させる（複合体の形成を抑制する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の抑制が所望される疾患の予防・治療等に有用である。
【００８７】
また、ＭＥＫＫ３の機能を調節し得る物質を選択するためのスクリーニングを細胞内で行なうこともできる。この場合のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ２）〜（ｃ２）を含み得る：
（ａ２）被検物質とＭＥＫＫ３発現細胞とを接触させる工程；
（ｂ２）被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３の機能レベルを測定し、該機能レベルを、被検物質を接触させない対照細胞における機能レベルと比較する工程；
（ｃ２）上記（ｂ２）の比較結果に基づいて、ＭＥＫＫ３の機能レベルを調節する被検物質を選択する工程。
ここで、ＭＥＫＫ３の機能とは、例えば、ＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子（即ち結合対、例えばＣＡＲＭＡ１）との相互作用する能力、ＭＥＫＫ３が有するタンパク質キナーゼ活性が挙げられる。
【００８８】
ＭＥＫＫ３の機能として、結合対と相互作用する能力に基づいたスクリーニングは例えば以下のようにして行なう。
【００８９】
上記方法の工程（ａ２）及び（ｂ２）において被検物質を接触させるＭＥＫＫ３発現細胞は、ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が測定可能な細胞であって、該細胞と被検物質とを接触させ、被検物質を接触させた細胞における相互作用を測定し、これを被検物質を接触させない対照細胞における相互作用と比較する。
【００９０】
用いられる細胞としては、目的とする相互作用を測定可能な細胞であれば特に限定されず、ＭＥＫＫ３及び結合対を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。該細胞は、ＭＥＫＫ３及びその相互作用対象分子を、天然に発現しているものであっても遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。該相互作用を測定可能な細胞は、動物細胞、例えば上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００９１】
ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用を測定可能な細胞としては、上述のＭＥＫＫ３を天然で発現している細胞と同様の細胞を用いることが出来るが、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、Ｔ細胞及びＴ細胞由来の細胞株を用いることが好ましい。ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が細胞の活性化等に依存する場合は、細胞を適切に処理することにより活性化させてもよい。例えば、Ｔ細胞を用いる場合、抗原や抗原ミミックにより該細胞は刺激され得る。
【００９２】
ＭＥＫＫ３と結合対との相互作用を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。
【００９３】
次に先ず、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が測定される。相互作用の測定は、用いた細胞や結合対の種類等を考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＭＥＫＫ３に対する抗体等により細胞の抽出液からＭＥＫＫ３が免疫沈降され、ＭＥＫＫ３と共に沈殿した結合対が、自体公知の方法（例えばウェスタンブロッティング法、マススペクトル法等）により定量される。
【００９４】
次いで、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用が、被検物質を接触させない対照細胞における該相互作用と比較される。相互作用の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用は、被検物質を接触させた細胞におけるＭＥＫＫ３と結合対との相互作用の測定に対し、事前に測定した相互作用であっても、同時に測定した相互作用であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した相互作用であることが好ましい。
【００９５】
結合対としては、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＴＡＫ１、ＩＫＫ等が挙げられ、ＣＡＲＭＡ１が好ましい。即ち、本発明のＴＣＲ機能を調節し得る物質のスクリーニング方法の好ましい一実施態様はＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む。
【００９６】
ＭＥＫＫ３の機能として、ＭＥＫＫ３のタンパク質キナーゼ活性を測定する場合、ＭＥＫＫ３を適切な基質（例えばＭＫＫ６、ＭＫＫ６、ＩＫＫβ等）と反応させて、キナーゼ活性が直接測定され得る。この場合、当該キナーゼ活性に関与し得る部位（例えばキナーゼドメイン）を含むＭＥＫＫ３のフラグメントを用いてもよい。
【００９７】
工程（ｂ）では、工程（ａ）の結果に基づき、ＭＥＫＫ３の機能を調節（促進又は抑制）し得る被検物質が選択される。
【００９８】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で選択されたＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質がＴ細胞受容体機能を亢進し得る物質として、或いはＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質がＴ細胞受容体機能を抑制し得る物質として獲得される。
【００９９】
ＭＥＫＫ３の発現量を増加させる（発現を促進する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の抑制が所望される疾患の予防・治療等に有用であり、ＭＥＫＫ３の発現量を減少させる（発現を抑制する）被検物質は、Ｔ細胞受容体機能の亢進が所望される疾患の予防・治療等に有用である。
【０１００】
更に工程（ｂ）と（ｃ）の間に、工程（ｂ’）として工程（ｂ）で選択された物質がＴ細胞受容体機能を調節し得るか確認し、該効果が確認された物質を工程（ｃ）においてＴ細胞受容体機能を調節し得る物質として得ることも出来る。これにより、より高い効率で目的とする物質を獲得することが出来る。
【０１０１】
工程（ｂ’）においては、例えば、工程（ｂ）で選択された物質（候補物質）とＴ細胞（Ｔ細胞由来の細胞株を含む）とを接触させ、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を測定し、該機能を候補物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能と比較する。
【０１０２】
Ｔ細胞に対する候補物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、測定されるＴ細胞受容体機能の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。このとき、Ｔ細胞は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【０１０３】
次に先ず、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能が測定される。Ｔ細胞受容体機能として、Ｔ細胞受容体からの刺激により誘導されるＴ細胞の機能的変化やその誘導過程の反応が測定される。Ｔ細胞の機能的変化としては、Ｔ細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ等）産生、細胞障害活性、分化）、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。Ｔ細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードに関与する分子（タンパク質等）の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、ＲＡＦＴへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【０１０４】
上述のように、ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＴＡＫ１やＩＫＫの上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得る。従って、候補物質がＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３の機能を選択的に調節し得ることを確認する目的で、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいてＭＥＫＫ３より下流で機能する分子（例えば、ＴＡＫ１、ＩＫＫ、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＮＦ−κＢ、ＩκＢ等）の修飾、分子間相互作用、細胞内局在の変化等を測定してもよい。或いは、ＮＦ−κＢの標的遺伝子の発現の変化を測定してもよい。
【０１０５】
Ｔ細胞受容体機能の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、細胞増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、サイトカイン産生はＥＬＩＳＡ法等により、細胞障害活性は５１Ｃｒ放出アッセイ等により、Ｔ細胞分化（例えばＴｈ１やＴｈ２への分化）はサイトカイン遺伝子発現パターン変化の測定により、アポトーシスは染色体ＤＮＡの断片化の測定により、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化はウェスタンブロッティング法等により、タンパク質の分解はウェスタンブロッティング法等により、分子間相互作用は免疫沈降法等により、細胞内局在の変化は免疫染色により、ＲＡＦＴへの局在化は密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法等により、遺伝子発現の変化はＲＴ−ＰＣＲやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【０１０６】
次いで、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能が、候補物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能と比較される。Ｔ細胞受容体機能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。候補物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能は、候補物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、候補物質によるＴ細胞受容体機能の調節作用が確認される。
【０１０７】
本発明のスクリーニング方法はまた、被検物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能を調節する被検物質が選択され得る。
【０１０８】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質はＴ細胞受容体機能を亢進し得るので、Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。また、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質はＴ細胞受容体機能を抑制し得るので、Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。従って、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を指標として、種々の免疫疾患の予防・治療剤等の医薬、又は研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。
【０１０９】
（ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症または発症リスクの判定方法）
上述の様に、ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードに深く関与し、ＴＣＲ機能を調節している。従って、本発明は、動物由来の生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定することを含む、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【０１１０】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物由来の生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現量又は機能に基づきＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクを評価する工程。
【０１１１】
上記方法の工程（ａ）では、生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能が測定される。生体試料は動物、好ましくは哺乳動物由来であれば特に限定されないが、ヒトが由来の試料が最も好ましい。生体試料は、ＭＥＫＫ３を発現している組織又は細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む試料（例えば、血液）、あるいは該試料から分離された細胞であり得るが、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクを判定する目的より、生体試料は、Ｔ細胞またはそれを含む試料が好ましい。また、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定は、上述のスクリーニング方法と同様に行われ得る。
【０１１２】
測定されるＭＥＫＫ３の機能としては、ＴＣＲ媒介シグナル伝達に関与する他の分子（即ち結合対、例えばＣＡＲＭＡ１）と相互作用する能力が挙げられる。即ち、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症または発症リスクの判定方法の好ましい一実施態様は、ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を測定することを含む。
【０１１３】
工程（ｂ）では、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能に基づき、生体試料が由来する動物がＴＣＲ機能の異常に伴う疾患に罹患しているか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。
詳細には、先ず、測定されたＭＥＫＫ３の発現量又は機能が、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患に罹患していない動物（例えば、正常動物）由来の生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【０１１４】
次いで、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の比較結果より、生体試料が由来する動物がＴＣＲ機能の異常に伴う疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した動物では、当該疾患に関連する遺伝子の発現又は機能の変化がしばしば観察されることが知られている。また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現又は機能の変化がしばしば観察されることが知られている。実際に、後述の実施例に示すように、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を有する動物においては、胸腺細胞及び末梢Ｔ細胞の数の減少が確認された。従って、ＭＥＫＫ３の発現又は機能が低下している場合には、ＴＣＲ機能の低下に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。また、本明細書中に開示された知見より、ＭＥＫＫ３の発現又は機能が亢進している場合には、ＴＣＲ機能の亢進に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。
【０１１５】
本発明はまた、ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定用試薬を含む、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断剤を提供する。本発明の診断剤を用いれば、上記判定方法により、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の発症リスクを容易に判定することが出来る。
【０１１６】
ＭＥＫＫ３の発現量の測定用試薬は、ＭＥＫＫ３の発現を測定可能である限り特に限定されないが、例えば、ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体、ＭＥＫＫ３遺伝子転写産物に対する核酸プローブ、またはＭＥＫＫ３遺伝子転写産物を増幅可能な複数のプライマーを含むものであり得る。これらは、標識用物質で標識されていても標識されていなくともよい。標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断剤は、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質等が挙げられる。
【０１１７】
ＭＥＫＫ３遺伝子転写産物に対する核酸プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、ＭＥＫＫ３遺伝子の転写産物を検出可能である限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【０１１８】
ＭＥＫＫ３遺伝子を増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、検出可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。検出可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、ＩＲＡＫ−４遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。ＭＥＫＫ３遺伝子転写産物を定量可能な試薬がプライマーである場合、本発明の診断薬は、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【０１１９】
ＭＥＫＫ３の機能の測定用試薬は、ＭＥＫＫ３の機能を測定可能である限り特に限定されない。例えば、免疫沈降法及びウエスタンブロット法によりＭＥＫＫ３とその結合対との相互作用を測定する場合、該試薬として、ＭＥＫＫ３を特異的に認識する抗体及び相互作用対象分子を特異的に認識する抗体、プロテインＡ結合ビーズ等を挙げることが出来る。また、ＭＥＫＫ３のタンパク質キナーゼ活性を測定する場合、該試薬として、該キナーゼの基質（例えばＭＫＫ６、ＭＫＫ６、ＩＫＫβ等）を挙げることが出来る。
【０１２０】
本発明の上記判定方法及び診断剤は、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の有無、あるいは該疾患に罹患する可能性の判定を可能とする。従って、本発明は、例えば、ＴＣＲ機能の異常に伴う疾患の容易且つ早期の発見等に有用である。
【０１２１】
（ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞を用いる、ＴＣＲ機能を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、ＭＥＫＫ３はＣＡＲＭＡ１と相互作用し、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＩＫＫやＴＡＫ１の上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得る。従って、被検物質がＭＥＫＫ３の機能的欠損を有する動物又は細胞におけるＴＣＲ機能を調節（例えば亢進）し得るか否かを評価することにより、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を補うこと等により、ＴＣＲ機能を調節（例えば亢進）し得る物質をスクリーニングすることが出来る。
【０１２２】
ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損とは、ＭＥＫＫ３遺伝子が本来有する正常な機能が十分に発揮できない状態をいい、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子が全く発現していない状態、またはＭＥＫＫ３遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、あるいはＭＥＫＫ３遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、または遺伝子変異等によりＭＥＫＫ３遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にＭＥＫＫ３遺伝子産物の機能が低下した状態が挙げられる。
【０１２３】
ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞は、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有する動物からＴ細胞を単離する事により得ることが可能である。ＭＥＫＫ３の無発現変異は、ほぼ胎生期（Ｅ）１１日で死に至ることが報告されている（Yang, J., et al., (2000). Mekk3 is essential for early embryonic cardiovascular development. Nat. Genet. 24, 309-313.）ので、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有する動物としてＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物を用いることができる。
【０１２４】
本発明の動物の種は、ヒトを除く動物である限り特に限定されないが、哺乳動物および鳥類が好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。鳥類としては、例えばニワトリが挙げられる。
【０１２５】
本発明のコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、例えば下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法により製造できる。
（ａ）ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞を提供する工程；
（ｂ）前記胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程；
（ｃ）前記キメラ胚を動物に移植し、キメラ動物を得る工程；
（ｄ）前記キメラ動物を交配させ、ＭＥＫＫ３遺伝子欠損ヘテロ接合体を得る工程。
【０１２６】
前記工程（ａ）において、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、例えば、ＭＥＫＫ３遺伝子の相同組換えを誘導し得るターゲティングベクターを胚性幹細胞に導入して得られる。
【０１２７】
ターゲティングベクターを胚性幹細胞に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法／リポソーム法、エレクトロポレーション法などがあげられる。ターゲティングベクターが胚性幹細胞中に導入されると、当該細胞中でＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡの相同組換えが生じる。
【０１２８】
ターゲティングベクターが導入される胚性幹細胞としては、任意の動物の胚盤胞から分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することにより樹立してもよいが、市販または所定の機関より既存の胚性幹細胞を入手できる。既存のマウス胚性幹細胞としては、例えば、ＥＳ−Ｄ３細胞、ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞、Ｂｒｕｃｅ−４ ＥＳ細胞、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞、Ｅ１４細胞、ＲＷ−４細胞、Ｂｒｕｃｅ−４ ＥＳ細胞などがあげられる。また、胚性幹細胞としては、マウス胚性幹細胞以外に、ミンク、ハムスター、ブタ、ウシ、マーモセット、アカゲザル等の哺乳動物由来のものなどが樹立されているので、これらを用いることもできる。
【０１２９】
ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡで相同組換えが生じた動物細胞を選別するため、ターゲティングベクター導入後の動物細胞がスクリーニングされる。例えば、ポジティブ選別、ネガティブ選別等により選別を行った後に、遺伝子型に基づくスクリーニング（例えば、ＰＣＲ法、サザンブロット法）を行う。
【０１３０】
胚性幹細胞を用いる場合には、好ましくは、組換え胚性幹細胞の核型分析がさらに行なわれる。核型分析では、選別された組換え胚性幹細胞において染色体異常がないことが確認される。核型分析は、自体公知の方法により行うことができる。なお、胚性幹細胞の核型は、ターゲティングベクターの導入前に予め確認しておくことが好ましい。
【０１３１】
本発明で用いられるターゲティングベクターは、２以上のリコンビナーゼ標的配列を含むことが好ましい。２以上のリコンビナーゼ標的配列は、同一または反対の配向性 (orientation)で配置することができる。
【０１３２】
リコンビナーゼ標的配列としては、当該分野で公知の配列、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列を使用することができる。
【０１３３】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用する好ましいターゲティングベクターの例は、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド、および選択マーカーを含み、Ｃｒｅ認識配列（例えば、ｆｌｏｘ）を少なくとも３箇所に含む。Ｃｒｅ認識配列は、コンディショナルノックアウトで欠失させる部位を両側から挟む態様で配置される。
【０１３４】
第一および第二のポリヌクレオチドは、ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。第一および第二のポリヌクレオチドはそれぞれ、ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡの異なる領域に対応する。
【０１３５】
また、第一または第二のポリヌクレオチドは、コンディショナルノックアウトにより、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を引き起こすように選択される。かかる領域は、当業者であれば適宜決定できるが、例えば、第一および第二のポリヌクレオチドは、１以上のエキソン、またはプロモーター領域もしくはエンハンサー領域の少なくとも一部を欠失するよう選択される。
【０１３６】
第一および第二のポリヌクレオチドの長さは、ゲノムＤＮＡの相同組換えが生じる長さである限り特に限定されない。一般論として、ターゲティングベクターによってゲノムＤＮＡの相同組換えが効率よく起こるためには、相同領域が長いほどよい。一方、ターゲティングベクターの種類によって、挿入可能なＤＮＡの長さは一定に制限される。したがって、これらを考慮すると、第一および第二のポリヌクレオチドの長さは、例えば０．５ｋｂ〜２０ｋｂ、好ましくは１ｋｂ〜１０ｋｂである。
【０１３７】
一実施形態では、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドと、第二のポリヌクレオチドとの間（換言すれば、内側）に選択マーカーが含まれる。この場合、選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカーが好ましい。ポジティブ選択マーカーは、その遺伝子を有する細胞のみを所定の条件下で生存および／又は増殖可能にする産物をコードする遺伝子であり、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などがあげられる。
【０１３８】
別の実施形態では、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドと、第二のポリヌクレオチドとの外側に選択マーカーが含まれる。この場合、選択マーカーとしては、ネガティブ選択マーカーが好ましい。ネガティブ選択マーカーは、非ターゲティング染色体部位に組み込まれたＤＮＡ挿入物を有する細胞に対して毒性に作用する遺伝子であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子などがあげられる。
【０１３９】
本発明で用いられるターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、または両方を含むことができる。
【０１４０】
ターゲティングベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のpBluscript (Stratagene社製)、pZErO 1.1 (Invitrogen社)、pGEM-1 (Promega社)等が使用可能である。
【０１４１】
本発明のターゲティングベクターは、自体公知の方法により製造できる。例えば、本発明のターゲティングベクターは、ＭＥＫＫ３遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドならびに該選択マーカーをベクターに挿入することにより製造できる。なお、このようなターゲティングベクターを作製するにあたっては、最初に、ＭＥＫＫ３遺伝子を含むゲノムＤＮＡ断片を単離する必要があるが、ゲノムＤＮＡ断片は、相同組換えの際に効率良く組換えが生じるよう、作製しようとするＥＳ細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離することが好ましい。また、相同組換えの効率をさらに上げるために、ＥＳ細胞が由来する同一種の動物のうち同じ系統の動物から、ゲノムＤＮＡを単離することがより好ましい。
【０１４２】
前記工程（ｂ）において、胚が由来する動物種は、本発明のノックアウト動物種と同様であり得、また、導入される胚性幹細胞が由来する動物種と同一であることが好ましい。胚としては、例えば胚盤胞、８細胞期胚などがあげられる。胚はホルモン剤（例えばＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させること等により得ることができる。胚性幹細胞を胚に導入する方法としては、マイクロマニピュレーション法、凝集法などがあげられる。
【０１４３】
前記工程（ｃ）において、キメラ胚が動物の子宮に移入され得る。キメラ胚が移植される動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮等により去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が導入された動物は、妊娠し、キメラ動物を出産する。
【０１４４】
次いで、出生した動物がキメラ動物か否かが確認される。出生した動物がキメラ動物であるか否かは自体公知の方法により確認でき、例えば、体色や被毛色で判別できる。また、判別のために、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法を行ってもよい。
【０１４５】
前記工程（ｄ）において、工程（ｃ）で得られたキメラ動物を成熟した後にＴ細胞においてリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物と交配させる。Ｔ細胞特異的にリコンビナーゼを発現トランスジェニック動物としては、例えば、Ｔ細胞特異的Ｌｃｋプロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するＬｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスが報告されている（Takahama, Y., et al., (1998). Functional competence of T cells in the absence of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins caused by T cell-specific disruption of the Pig-a gene. Eur. J. Immunol. 28, 2159-2166.）。
工程（ｄ）で得られたＭＥＫＫ３遺伝子欠損へテロ接合体同士を交配させることによりコンディショナルにＭＥＫＫ３遺伝子欠損を有するホモ接合体を得ることができる。
【０１４６】
得られたトランスジェニックマウスのＭＥＫＫ３遺伝子における欠失は、自体公知の方法により確認できる。例えば、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法を行ってもよい。
【０１４７】
本発明のノックアウト動物、胚性幹細胞、ターゲティングベクターの作製の詳細については、例えば、下記文献を参照のこと。
１．別冊 実験医学 ザ・プロトコールシリーズ 「ジーンターデティングの最新技術」（2000年、羊土社）コンディショナルターゲティング法p.115-120
２．バイオマニュアルシリーズ８ 「ジーンターゲティング」−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（1995年、羊土社）p.71-77
３．Sambrookら, Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 第3版, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, 2001年, 4.82-4.85
４．Robertson E. J. in Teratocarcinomas and embryonic stem cells-a practical approach, ed. Robertson, E. J. (IRL Press, Oxford), 1987: pp.108-112
５．Dynecki, S. M.ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A.L. (Oxford Univ. Press), 2000: pp.68-73
６．Dynecki, S. M. ら, Gene Targeting -a practical approach, 2nd edition, ed. Joyner, A. L. (Oxford Univ. Press), 2000: pp.75-81
【０１４８】
かくして作製されたＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物から自体公知の方法によってＴ細胞が単離され得る。得られたＴ細胞は、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を有する。
ＭＥＫＫ３の機能的欠損を有するＴ細胞を用いる本発明のスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含み得る：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節（亢進等）し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴＣＲ機能を調節（亢進等）し得る物質を選択する工程；
【０１４９】
例えば工程（ａ）において、被検物質とＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞とを接触させ、被検物質を接触させた細胞におけるＴＣＲ機能を測定し、該機能を被検物質を接触させない対照細胞におけるＴＣＲ機能と比較する。
【０１５０】
Ｔ細胞に対する被検物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地）中で行われ得る。培養条件は、測定されるＴ細胞受容体機能の種類等に応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。Ｔ細胞は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【０１５１】
次に先ず、被検物質を接触させたＴ細胞におけるＴＣＲ機能が測定される。ここでＴＣＲ機能として、Ｔ細胞受容体からの刺激により誘導されるＴ細胞の機能的変化やその誘導過程の反応が測定される。Ｔ細胞の機能的変化としては、Ｔ細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ等）産生、細胞障害活性、分化）、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。Ｔ細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードに関与する分子（タンパク質等）の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、ＲＡＦＴへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【０１５２】
上述のように、ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＴＡＫ１やＩＫＫの上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得る。従って、被検物質がＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおけるＭＥＫＫ３の機能を選択的に調節し得ることを確認する目的で、Ｔ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいてＭＥＫＫ３より下流で機能する分子（例えば、ＰＫＣθ、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ１０、ＭＡＬＴ１、ＮＦ−κＢ、ＩκＢ等）の修飾、分子間相互作用、細胞内局在の変化等を測定してもよい。或いは、ＮＦ−κＢの標的遺伝子の発現の変化を測定してもよい。
【０１５３】
Ｔ細胞受容体機能の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、細胞増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、サイトカイン産生はＥＬＩＳＡ法等により、細胞障害活性は５１Ｃｒ放出アッセイ等により、分化はサイトカイン遺伝子発現パターン変化の測定により、アポトーシスは染色体ＤＮＡの断片化の測定により、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化はウェスタンブロッティング法等により、タンパク質の分解はウェスタンブロッティング法等により、分子間相互作用は免疫沈降法等により、細胞内局在の変化は免疫染色により、ＲＡＦＴへの局在化は密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法等により、遺伝子発現の変化はＲＴ−ＰＣＲやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【０１５４】
次いで、被検物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能が、被検物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能と比較される。Ｔ細胞受容体機能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるＴ細胞受容体機能は、被検物質を接触させたＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、被検物質によるＴ細胞受容体機能を調節作用が確認される。
【０１５５】
上記方法の工程（ｂ）では、（ａ）の結果に基づき、ＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節（促進等）し得る物質が選択される。
【０１５６】
ＭＥＫＫ３はＴ細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、ＴＡＫ１やＩＫＫの上流で機能し、ＮＦ−κＢの活性化に関与し得るので、本発明のスクリーニング方法により得られるＴ細胞受容体機能を促進し得る物質は、例えばＴ細胞受容体からのシグナルカスケードのうち、特にＮＦ−κＢの活性化に至る経路においてＭＥＫＫ３よりも下流において作用する等して、ＭＥＫＫ３の機能的欠損を迂回してＴ細胞受容体シグナリングを活性化させる物質であり得る。
【０１５７】
本発明のスクリーニング方法により得られるＴ細胞受容体機能を調節（促進等）し得る物質はＴ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。当該予防・治療薬は、Ｔ細胞受容体機能の低下がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損によるものである場合に、特に有効であり得る。
【実施例】
【０１５８】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【０１５９】
（方法・材料）
１．試薬
ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＩκＢα、及びＢｃｌ１０に対する抗体（Ａｂ）を、Santa Cruzより購入し、抗ホスホＥＲＫ Ａｂ、抗ホスホＪＮＫ Ａｂ、抗ホスホｐ３８ Ａｂ、抗ホスホＩＫＫβ Ａｂ、抗ホスホＩκＢα Ａｂ、及び抗ＴＡＫ１ Ａｂを、Cell Signaling Technologyより、抗ＧＡＰＤＨ Ａｂ、抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂ及び抗ＩＫＫβ Ａｂを、Abcamより、ＭＥＫＫ３のＮ末端に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂ）をBDより、そして抗ＨｉｓＸ６ ｍＡｂをQIAGENより入手した。免疫沈降用の抗ＣＡＲＭＡ１ Ａｂを、既報に従って調製した（Shinohara, H. et al., (2005). PKC β regulates BCR-mediated IKK activation by facilitating the interaction between TAK1 and CARMA1. J. Exp. Med. 202, 1423-1431.）。Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＣＲ刺激には、既報（Yamasaki, S. et al., (2001). Docking protein Gab2 is phosphorylated by ZAP-70 and negatively regulates T cell receptor signaling by recruitment of inhibitory molecules. J. Biol. Chem. 276, 45175-45183.）と同様、Ｃ３０５（抗ＴＣＲ ｍＡｂ）及びＯＫＴ３（抗ＣＤ３ε ｍＡｂ）を用いた。
【０１６０】
２．フローサイトメトリー
リンパ球を、５週齢〜８週齢のマウスの胸腺、脾臓、及び末梢血より分離した。フローサイトメトリー用のＡｂを、eBioscienceより購入した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ(BD)で解析した。細胞生存を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により評価した。
【０１６１】
３．細胞培養
Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium（ＩＭＤＭ）で培養した。ＣＤ８＋細胞を磁気ビーズでＡｕｔｏＭＡＣＳ(Miltenyi Biotec)を用いて除去した後、ＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）胸腺細胞又はＣＤ４＋脾臓細胞を、抗ＣＤ４磁気ビーズにより精製した。ＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋脾臓細胞を、ＣＤ４、ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌ染色後に、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ(BD)により直接選別した。単離したＴ細胞を、BD Bioscience製の１０μｇ／ｍｌの固相化抗ＣＤ３ Ａｂ（２Ｃ１１）及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂ（３７．５１）で、１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ(SIGMA)及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂで、又は２０ｎｇ／ｍｌの組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ−２若しくはｒｍＩＬ−７(Peprotech)で刺激した。Ｔ細胞増殖を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８ (Dojindo Labs)により、製造元により記載されたようにして決定し、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Bio-Rad)で測定した。ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産生を、酵素結合免疫吸着アッセイを利用したBD-Pharmingen社のキットを用いて、製造元のプロトコールに従って解析した。
【０１６２】
４．レトロウイルストランスインフェクション
Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰレトロウイルスベクター（東京大学、T. Kitamura氏から供与）にクローン化した。パッケージング細胞ＥｃｏＰａｃｋ２(BD Biosciences)を、ＦｕＧＥＮＥ６により、製造元(Roche)のプロトコールに従ってトランスフェクトした。レトロウイルスを含む培養上清を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。１０μｇ／ｍｌの２Ｃ１１（抗ＣＤ３ ｍＡｂ）及び５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ Ａｂで刺激して２４時間後に単離したＣＤ４＋脾細胞に、上記パッケージングにより得られたレトロウイルスを、スピン感染（３０００ｒｐｍで２時間遠心分離）により感染させた。感染したＧＦＰ＋細胞を選別しエフェクターＴ細胞として用いた。該細胞を更に２日間〜３日間、ｒｍＩＬ−２を含有する培養液で培養した（Wan, Y. et al., (2006). The kinase TAK1 integrates antigen and cytokine receptor signaling for T cell development, survival and function. Nat. Immunol. 7, 851-858.）。
【０１６３】
５．活性化によって誘導される細胞死
ＣＤ４＋脾細胞を、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ．Ａ；SIGMA）とともに、４８時間培養した。Ｃｏｎ．ＡはＴ細胞活性化作用を有している。Ｃｏｎ．Ａの活性を阻害するために、細胞を、α−メチル−Ｄ−マンノシド（１０ｍｇ／ｍｌの濃度）で１時間処理した。死細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ (Cedarlane)を用いる密度遠心分離により除去した後、細胞を、２ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−２を含有するフレッシュな培地中に再懸濁し、そして２Ｃ１１コーティングプレート中で培養した。細胞の生存率を、ＰＩでの染色後にＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで確かめた。
【０１６４】
６．生化学的解析
イムノブロッティング及びキナーゼアッセイを、既報の標準的なプロトコール（Shinoharaら、２００５、上述）を用いて行った。簡単に言えば、細胞を、１０μｇ／ｍｌの２Ｃ１１とともに２０分間氷上でインキュベートし、次いで、５０μｇ／ｍｌのヤギ抗ハムスターＩｇＧ(Cappel)で、５分間、３７℃にて刺激した。刺激後、細胞を、１％ＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解し、清澄な細胞溶解物を、５×ＳＤＳサンプル緩衝液と共に煮沸した。５×１０５個−２×１０６個の細胞に相当するサンプルを、電気泳動的にＰＶＤＦ膜に移し、適切なＡｂでブロットした。ＩκＢαリン酸化に関して、細胞を５μｇ／ｍｌのＣｏｎ．Ａ又は抗ＣＤ３（データは示さず）で１８時間、ＭＡＰキナーゼアッセイ(Sun, Z. et al., (2000). PKC-θ is required for TCR-induced NF-κB activation in mature but not immature T lymphocytes. Nature 404, 402-407.)と同様にして処理した後、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を調製して、２％ＦＢＳとともに５時間培養した。ＭＥＫＫ３キナーゼアッセイに関して、２×１０７個のＣＤ４＋脾細胞を、１％ＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解した。清澄化したライセートを、１μｇ抗ＭＥＫＫ３ ｍＡｂで免疫沈降し、続いて４０μｌのプロテインＧ−セファロースと共にインキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、キナーゼ緩衝液で２回洗浄した。免疫沈降物を、１００μＭ ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液中に再懸濁した。Ｈｉｓタグ化ＭＫＫ６（全長）を、製造元(QIAGEN)の取扱説明書通りに精製し、キナーゼ反応混合物に基質として添加した。３０℃で３０分インキュベートした後、この反応を、ＳＤＳサンプル緩衝液を添加し、続いて５分間煮沸することにより終了させた。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に関して、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を、既報通りに解析した（Shinoharaら、２００５、上述）。簡単に言えば、Ｔ細胞（２×１０６）の核抽出物を精製し、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合部位に対して特異的なプローブ又はＯｃｔ−１に対して特異的なプローブ（5’-tgtcgaatgcaaatcactagaa-3’；配列番号３）と共にインキュベートし、電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１６５】
７．低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）設計及びベクター
レトロベクターｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６及び設計したオリゴヌクレオチドを、TAKARAから入手した。
ｈｕ−ＭＥＫＫ３標的部位５５４の低分子ヘアピン型ＲＮＡをコードする挿入二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを以下のように設計した；
Ｆ−gatccgcaacctcttgatctacatttagtgctcctggttgaatgtagatcaagaggttgcttttttat（配列番号４）、
Ｒ−cgataaaaaagcaacctcttgatctacattcaaccaggagcactaaatgtagatcaagaggttgcg（配列番号５）、
ネガティブコントロールに対するｓｈＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド；
Ｆ−gatccgtcttaatcgcgtataaggctagtgctcctggttggccttatacgcgattaagacttttttat（配列番号６）、
Ｒ−cgataaaaaagtcttaatcgcgtataaggccaaccaggagcactagccttatacgcgattaagacg（配列番号７）。
レトロウイルスを、汎親和性パッケージング細胞ＧＰ２(Clontech)へのトランスフェクションにより生成した。安定なサイレンシングのために、感染したＪｕｒｋａｔ細胞を、２ｍｇ／ｍｌの濃度のネオマイシンで５日間培養した。
【０１６６】
８．統計解析
データは、平均±標準偏差として示す。統計解析は、Student’s t検定を用いて行い、そしてMicrosoft Excel Softwareを用いて解析した。
【０１６７】
実施例１ ノックアウトマウスの作成
ＭＥＫＫ３の無発現変異は、ほぼ胎生期（Ｅ）１１日で死に至る。従って、Ｔ細胞におけるＭＥＫＫ３の本質的な機能を調査するために、図１Ａに示されたようにＣｒｅリコンビナーゼによりＡＴＰ結合部位（Ｋ３９１）を欠失させるように設計したターゲティングベクターを構築した。
ターゲティングベクターを、Ｃ５７ＢＬ／６由来のＢｒｕｃｅ−４ ＥＳ細胞(Harvard Medical School, CBR Institute for Biomedical Research, K. Rajewsky氏により提供された)中にエレクトロポレーションにより導入した。プローブ（図１Ａに図示）を用いたサザンブロットにより相同組換えされたことを確認し、ネオマイシン耐性クローンをスクリーニングした。正確にターゲティングされたクローンに、一過的にｐＭＣ１−Ｃｒｅ（K. Rajewsky, the CBR Institute for Biomedical Research, Harvard Medical School）をトランスフェクトし、ｌｏｘＰ隣接ネオマイシン耐性遺伝子カセットを欠失させた。ネオマイシンに対して感受性になった子孫クローンを、サザンブロット解析に供し、２つのｌｏｘＰ部位が隣接したエキソン１１及び１２を保持するもの（ｆｌｏｘアレル）を検出した。標的化されたクローンを、サザンブロット解析により同定し、そしてＣ５７ＢＬ／６ブラストシストにマイクロインジェクションし、キメラを作出した。キメラ雄マウスとＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交配すると、生殖系列にｆｌｏｘアレルが伝達された。Ｆｌｏｘ遺伝子型を有するマウスを、ＣｒｅトランスジーンをＬｃｋプロモーターの制御下で保有するトランスジェニックマウス系統（Ｌｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス；Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンド）と繁殖させた（Takahama, Y., et al., (1998). Functional competence of T cells in the absence of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins caused by T cell-specific disruption of the Pig-a gene. Eur. J. Immunol. 28, 2159-2166.）。次いで、これを交雑させてＴ細胞特異的ＭＥＫＫ３−欠損マウス（Ｌｃｋ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス；本明細書では、Ｔ−ＫＯマウスと呼ばれる）を作出した。得られたマウスはＳＰＦ条件下で飼育した。全ての実験は、ＲＩＫＥＮの動物研究委員会によるガイドラインを遵守して行った。
ゲノムＰＣＲにより、胸腺細胞及び脾臓Ｔ細胞において、ｌｏｘＰ部位に隣接するＭＥＫＫ３のエキソン１１及び１２を含むｆｌｏｘアレルが、効率的に欠失したことが示された（図１Ｂ）。ＭＥＫＫ３の欠失を、ＭＥＫＫ３のＮ末端に対するモノクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロットによりさらに確認した。ＭＥＫＫ３タンパク質は、実質的に検出されなかった（図１Ｃ）。
【０１６８】
実施例２ Ｔ細胞の発生分化におけるＭＥＫＫ３の役割
Ｔ細胞発生分化におけるＭＥＫＫ３の役割を調べるために、先ずＴ−ＫＯマウスにおけるＴ細胞集団のＦＡＣＳ解析を行った。Ｌｃｋ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３＋／＋由来のＴ細胞とＬＣＫ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／＋マウスとの間に、表現型の差異はなかったので（データは示さず）、Ｌｃｋ−Ｃｒｅ−ＭＥＫＫ３＋／＋マウスを、野生型（ｗｔ）コントロールマウスとして使用した。Ｔ−ＫＯマウスは、野生型コントロールマウスと比べて、ＣＤ４及びＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）胸腺細胞の割合の増加及びダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞の割合の減少を示した（図２Ａ）。Ｔ−ＫＯにおける全胸腺細胞、ＤＰ、ＣＤ４シングルポジティブ（ＳＰ）、及びＣＤ８ ＳＰ胸腺細胞の数は、それぞれ野生型に比べて４０％〜６０％にまで有意に減少した（図２Ｂ）。しかし、胸腺細胞の成熟度を示すマーカー（ＣＤ５、ＣＤ６９及びＣＤ２４が挙げられる）の発現は、Ｔ−ＫＯマウス由来のＤＰ又はＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において、根本的には変化しなかった（データは示さず）。Ｔ−ＫＯマウスの脾臓においては、ＣＤ４＋のＴ細胞の数及びＣＤ８＋のＴ細胞の数は、コントロールマウスと比較して、約５０％及び６０％減少した（図２Ａ及び図２Ｂ）。Ｔ−ＫＯマウスの血液中のＴ細胞の割合は、顕著に減少した（図２Ａ）。
【０１６９】
実施例３ Ｔ−ＫＯマウス由来の末梢Ｔ細胞（ＭＥＫＫ３欠損を有する末梢Ｔ細胞）
Ｔ−ＫＯの末梢Ｔ細胞の数は減少したが、多少のＣＤ４＋Ｔ細胞が出現した。ＭＥＫＫ３欠損が末梢Ｔ細胞の恒常性状態に影響するかを決定するために、表面マーカーＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞からの発現を解析した。ＣＤ４４はＴ細胞の活性化に伴いその発現量が増加し、ＣＤ６２ＬはＴ細胞の活性化に伴いダウンレギュレートされる。図３Ａに示されるように、活性化された表現型の細胞（ＣＤ４４の発現がより高くＣＤ６２Ｌの発現がより低い）の割合は、野生型脾臓ＣＤ４＋細胞と比較して、Ｔ−ＫＯ末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞において、再現可能に高かった（図３Ａ）。抗ＣＤ３ Ａｂ（抗ＣＤ２８ Ａｂ共存下又は非存在下）により誘導されるＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生も、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋細胞の方が、野生型由来のものより高かった（図３Ｂ）。
Ｔ細胞においてＴＡＫ１を欠くマウスでは、活性化表現型を有する末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加していることが報告されている（Wanら、２００６、上述）。これらのＴＡＫ１欠損マウスは、天然に生ずる調節性Ｔ細胞（「ｎＴｒｅｇ細胞」）の発生分化にも重大な欠損を有するので、この活性化された表現型は、ｎＴｒｅｇ細胞によるＴ細胞抑制の損失に起因していた。Ｔ−ＫＯマウスの場合において観察された活性化表現型がＴＡＫ１欠損マウス同様ｎＴｒｅｇ細胞によるＴ細胞抑制の損失に起因するものであるのか否かを調べる為、Ｔｒｅｇ細胞の表面マーカーとしてのＣＤ２５の発現を解析した。ＣＤ２５＋細胞の頻度は、野生型由来又はＴ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞試料では、有意に変化しなかった（図３Ｃ）。
ＳＰ胸腺細胞及び末梢Ｔ細胞の数の減少は、これらの変異体Ｔ細胞における生存欠損に由来し得る。しかし、図３Ｄに示されるように、胸腺細胞及び脾臓Ｔ細胞の培養液中での生存能力は、野生型とＴ−ＫＯマウス（ＭＥＫＫ３欠損）との間で有意差はなかった。さらに、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞における活性化により誘導された細胞死においても、野生型との有意差はなかった（図３Ｅ）。
【０１７０】
実施例４ ＴＣＲ媒介性の細胞応答に対するＭＥＫＫ３の役割
成熟ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において、Ｔ−ＫＯ由来の細胞は、抗ＣＤ３ Ａｂ（抗ＣＤ２８ Ａｂ共存下又は非共存下）刺激による細胞増殖及びサイトカイン産生（ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）の減少を示した（図４Ａ及び図４Ｂ）。更に、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞では、抗ＣＤ３ Ａｂ刺激しても、野生型由来の細胞におけるほど、ＣＤ２５（活性化されたＴ細胞の表面マーカー）の発現が誘導されなかった（図４Ｃ）。
Ｔ−ＫＯ ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞の応答性の低減を示すこれらのデータは、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた実施例３のデータ（図３Ｂ）と矛盾するように考えられる。活性化されたＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−末梢Ｔ細胞は、ナイーブなＴ細胞（ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋）と比較して、より多くのサイトカインを産生することが知られているので(Sallusto, F., et al., (2004). Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 22, 745-763.)、Ｔ−ＫＯマウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン産生の増強は、これらの変異体マウスにおけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−Ｔ細胞の割合の増加を反映しているものと考えられた。この可能性を調べるために、２つのアプローチをとった。第一に、ＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブＴ細胞を、野生型及びＴ−ＫＯマウスより選別し、抗ＣＤ３ Ａｂ／抗ＣＤ２８ Ａｂ、又はＰＭＡ／抗ＣＤ２８ Ａｂでの刺激後のサイトカイン産生を測定した。Ｔ−ＫＯ ＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞は、増殖及びサイトカイン産生（ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）の低減を示した（図５Ａ及び図５Ｂ）。第二に、成熟末梢Ｔ細胞がＭＥＫＫ３の非存在下では正常に発生分化し得ないという障害を避けるために、ＭＥＫＫ３を、ＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来の活性化した末梢Ｔ細胞中で、レトロウイルス媒介性Ｃｒｅ発現により、欠損させた。抗ＣＤ３ Ａｂ／抗ＣＤ２８ Ａｂ刺激後の細胞増殖及びサイトカイン産生は、Ｃｒｅ発現エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞において有意に低減した（図５Ｃ及び図５Ｄ）。従って、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介性の増殖並びにＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生をポジティブに調節すると結論した。
【０１７１】
実施例５ Ｔ細胞サイトカイン応答におけるＭＥＫＫ３の役割
サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）は、Ｔ細胞増殖及びエフェクターＴ細胞の生存を促進し得る（Vella, A. T., et al., (1998). Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815.）。末梢Ｔ細胞のサイトカイン応答においてＭＥＫＫ３が必要であることを評価するために、ＩＬ−２又はＩＬ−７に応答するＴ細胞増殖を調べた。ＩＬ−２又はＩＬ−７に応答するＭＥＫＫ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス由来のＣｒｅ発現細胞の増殖が、偽感染エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、有意に低減した（図５Ｅ）。これらの結果は、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介性の応答のみならず、末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン誘導性の応答にも寄与することを示唆する。
【０１７２】
実施例６ 胸腺細胞におけるＴＣＲ刺激により誘導される、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、及びｐ３８活性化におけるＭＥＫＫ３の役割
ＭＥＫＫ３は、ＴＣＲ媒介性の細胞応答に必要であることが実証されたので、更に、ＭＥＫＫ３を欠損することがＴＣＲ媒介性のシグナル伝達にどのような影響を与えるのかを調べた。ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８の活性化を、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞におけるリン酸化状態により評価した（図６Ａ）。抗ＣＤ３ Ａｂ刺激の後、ＥＲＫではなくＪＮＫ及びｐ３８の活性化がＴ−ＫＯマウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において欠如していた。次に、本発明者らは、ＮＦ−κＢ活性を、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞でのＤＮＡ結合活性を測定することにより調べた。既報（Liu, H. H., et al., (2006). Essential role of TAK1 in thymocyte development and activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 11677-11682.）、ＮＦ−κＢは、野生型マウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞において活性であった。対照的に、この活性は、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞では大幅に減少した（図６Ｂ）。更に、野生型マウス由来の細胞では、ＴＣＲ刺激は、ＩκＢαリン酸化を誘導する一方、Ｔ−ＫＯマウス由来の細胞では、誘導されたホスホ−ＩκＢαは検出不能であった（図６Ｃ）。従って、ＭＥＫＫ３は、ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞におけるＮＦ−κＢ、ＪＮＫ及びｐ３８を活性化するＴＣＲ媒介シグナル伝達を調節することが示された。
【０１７３】
実施例７ ＴＣＲ媒介シグナル伝達におけるＴＡＫ１及びこれに続くＮＦ−κＢ活性化におけるＭＥＫＫ３の役割
ＭＥＫＫ３がＴＣＲ媒介シグナル伝達にどのように関与するかを述べる前に、内因性ＭＥＫＫ３が、抗ＣＤ３ Ａｂ刺激の後、一次Ｔ細胞において実際に活性化されるかを調べた。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＭＥＫＫ３を免疫沈降し、免疫沈降物のインビトロのキナーゼ活性を測定した。基質として、ＭＫＫ６又はＭＥＫＫ３それ自体を用いた。図７Ａに示されるように、ＭＥＫＫ３は、ＴＣＲ刺激に応答して活性化された。
ＰＭＡは、直接的にＰＫＣの活性化を誘導するので、Ｔ−ＫＯマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ４４−ＣＤ６２＋末梢Ｔ細胞におけるＰＭＡ／ＣＤ２８媒介細胞応答の欠如は、ＭＥＫＫ３が、ＰＫＣの下流で作用し得ることを示唆する（図５Ａ及び図５Ｂ）。アダプタータンパク質ＣＡＲＭＡ１は、ＴＣＲ媒介ＮＦ−κＢ及びＪＮＫ活性化経路におけるＰＫＣの直接的な下流標的であることが公知である。ＣＡＲＭＡ１は、ＴＣＲ刺激の後のＩＫＫ及びＪＮＫの活性化を可能にするマクロ分子複合体のオーガナイザーとして機能すると考えられている（Thome, M. (2004). CARMA1, BCL-10 and MALT1 in lymphocyte development and activation. Nat. Rev. Immunol. 4, 348-359.）。従って、まず、ＭＥＫＫ３が、このマクロ分子複合体と会合するのかを調べた。図７Ｂに示されるように、一次Ｔ細胞における内因性ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との間の効率的な相互作用が、ＴＣＲ刺激の後に観察された。このことは、ＭＥＫＫ３が、マクロ分子複合体に動員され、これにより、ＴＣＲ媒介シグナル伝達を背景にＩＫＫ及びＪＮＫ活性化に関与し得ることを示唆する。
ＭＥＫＫ３がＴＣＲ媒介ＮＦ−κＢ活性化を調節するメカニズムに対する洞察を更に得るために、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を設計し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてＭＥＫＫ３発現をノックダウンした（ＭＥＫＫ３−ｋｄ）。ＭＥＫＫ３タンパク質発現は、効率的にかつ安定に抑制された（図７Ｃ）。ＭＥＫＫ３をノックダウンすることがＴＣＲ媒介性のＮＦ−κＢ活性化にどのような影響を与えるのかを調べるために、この細胞を抗ＣＤ３ Ａｂで刺激した。ＩＫＫ活性化は、ＭＥＫＫ３−ｋｄにおいて著しく減少した。このことは、ＭＥＫＫ３が、ＴＣＲ媒介性のＮＦ−κＢ活性化に必要であることが、Ｊｕｒｋａｔモデル系において再現されたことを示す（図７Ｄ）。
【０１７４】
Ｂｃｌ１０及びＴＡＫ１は、ＴＣＲ刺激の後、直接的にであれ間接的にであれ、ＣＡＲＭＡ１と会合することが公知である（Sun, L., et al., (2004). The TRAF6 ubiquitin ligase and TAK1 kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1 in T lymphocytes. Mol. Cell 14, 289-301.；Thome, M., and Weil, R. (2007). Post-translational modifications regulate distinct functions of CARMA1 and BCL10. Trends. Immunol. 28, 281-288.）。これらの会合は、ＮＦ−κＢのＴＣＲ誘導性活性化に必要であると考えられるので（Sun, L.ら、2004、上述；Thome, M., 及びWeil, R.、2007、上述）、Ｊｕｒｋａｔモデル系を用いて、ＣＡＲＭＡ１とＢｃｌ１０及びＴＡＫ１との会合が、ＭＥＫＫ３ノックダウンにより影響されるかを試験した。図７Ｅに示されるように、Ｂｃｌ１０及びＴＡＫ１とＣＡＲＭＡ１との誘導可能な会合は、ＭＥＫＫ３−ｋｄ細胞において実質的に減少した。このことは、ＭＥＫＫ３が、直接的にであれ間接的にであれ、マクロ分子複合体の形成に関与していることを示唆する。更に、ＭＥＫＫ３のノックダウンにより、ＴＡＫ１活性化が減じた（図７Ｆ）。ＴＡＫ１がＩＫＫをリン酸化する直接的な原因キナーゼであると考えられるので、ＴＡＫ１活性化欠如により、部分的に、ＭＥＫＫ３の非存在下でのＮＦ−κＢの活性化欠如が説明され得る。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：マウスのＭＥＫＫ３遺伝子
配列番号２：マウスのＭＥＫＫ３蛋白質
配列番号３：Ｏｃｔ−１に対する特異的プローブ
配列番号４：ｓｈＲＮＡ（ｈｕ−ＭＥＫＫ３）
配列番号５：ｓｈＲＮＡ（ｈｕ−ＭＥＫＫ３）
配列番号６：ｓｈＲＮＡ（ネガティブコントロール）
配列番号７：ｓｈＲＮＡ（ネガティブコントロール）
配列番号８：ＰＣＲプライマー（ｆｌｏｘアレル用）
配列番号９：ＰＣＲプライマー（ｆｌｏｘアレル用）
配列番号１０：ＰＣＲプライマー（Δ−アレル用）
配列番号１１：ＰＣＲプライマー（Δ−アレル用）
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明のＴ細胞受容体機能調節剤（以下、ＴＣＲ機能調節剤とも称する）は、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し、新たなメカニズムの免疫疾患予防・治療剤等として有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでＴ細胞受容体の機能を調節し得る物質を得ることができるので、免疫調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究等に有用である。
本発明の動物は、Ｔ細胞受容体の機能の解析、Ｔ細胞受容体機能の異常により引き起こされる各種疾患の予防・治療剤の開発等に有用であり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
【請求項２】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項４】
医薬である、請求項１記載の剤。
【請求項５】
獲得免疫の異常により引き起こされる疾患の予防・治療剤である、請求項４記載の剤。
【請求項６】
Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療剤である、請求項４記載の剤。
【請求項７】
Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患が免疫不全症候群である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療剤である、請求項４記載の剤。
【請求項９】
Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患が、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項８記載の剤。
【請求項１０】
被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項１０記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を亢進し得る物質として選択する工程。
【請求項１２】
以下の工程を含む、請求項１０記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を抑制し得る物質として選択する工程。
【請求項１３】
生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項１４】
ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定用試薬を含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
【請求項１５】
ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
【請求項１６】
ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
生体試料における、ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項１８】
被検物質がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
ＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項１】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
【請求項２】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
ＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節する物質が、ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制する物質である、請求項１記載の剤。
【請求項４】
医薬である、請求項１記載の剤。
【請求項５】
獲得免疫の異常により引き起こされる疾患の予防・治療剤である、請求項４記載の剤。
【請求項６】
Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療剤である、請求項４記載の剤。
【請求項７】
Ｔ細胞受容体機能の低下に伴う疾患が免疫不全症候群である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療剤である、請求項４記載の剤。
【請求項９】
Ｔ細胞受容体機能の亢進に伴う疾患が、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病、自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項８記載の剤。
【請求項１０】
被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項１０記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を促進し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を亢進し得る物質として選択する工程。
【請求項１２】
以下の工程を含む、請求項１０記載の方法：
（ａ）被検物質がＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）ＭＥＫＫ３の発現又は機能を抑制し得る物質を、Ｔ細胞受容体機能を抑制し得る物質として選択する工程。
【請求項１３】
生体試料におけるＭＥＫＫ３の発現量又は機能を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項１４】
ＭＥＫＫ３の発現量又は機能の測定用試薬を含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
【請求項１５】
ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調節剤。
【請求項１６】
ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
生体試料における、ＭＥＫＫ３とＣＡＲＭＡ１との相互作用を測定することを含む、Ｔ細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項１８】
被検物質がＭＥＫＫ３遺伝子の機能的欠損を有するＴ細胞におけるＴ細胞受容体機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
ＭＥＫＫ３のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−２０８９５４（Ｐ２０１０−２０８９５４Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３９６８（Ｐ２００９−５３９６８）
【出願日】平成２１年３月６日（２００９．３．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年２月１７日ｈｔｔｐ：／／ｉｎｔｉｍｍ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｄｘｐ００７ｖ１を通じて発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月６日（２００９．３．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年２月１７日ｈｔｔｐ：／／ｉｎｔｉｍｍ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｄｘｐ００７ｖ１を通じて発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]