ＴＬＲ３のグリコシル化部位ムテインおよび使用方法
ＴＬＲ３のグリコシル化部位ムテイン、該ムテインをコードする核酸、および細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲ３のグリコシル化部位ムテイン、該ムテインをコードする核酸、および細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症状態と関連する病理は、医療における重大な課題を表し、そして苦しく、衰弱させ、かつ致死的であり得る。例えば、敗血症および敗血症関連の状態は、２８〜５０％の死亡率を伴い米国で毎年７５万以上の人々を冒し、年間２１５，０００例の死亡をもたらす（非特許文献１；非特許文献２）。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）クローン病および潰瘍性大腸炎のような他の炎症状態は、米国で年あたり百万以上の人々を冒している（非特許文献３）。
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息および肺感染症のような肺機能を冒す炎症性の肺の状態もまた、米国でかなりの数の人々を冒している。例えばＣＯＰＤは推定で一千万の成人の米国人を冒し、そして該罹患率は上昇している（非特許文献４）。これらの炎症状態と関連する病理およびこれらの状態の増悪は、重大な健康および経済的影響を有する。
【０００４】
喘息およびＣＯＰＤのような肺疾患の増悪は症状の悪化および肺機能の低下を特徴とする。ウイルス感染症は多くの肺疾患の増悪を伴い（非特許文献５；非特許文献６）、そして増悪の主因であると考えられる。ウイルス感染後の肺での炎症前サイトカインの分泌は、多様な肺疾患での炎症応答の促進における決定的に重要な段階を表す（非特許文献７；非特許文献８）。
【０００５】
宿主免疫系による微生物抗原の認識は自然免疫受容体により媒介され、その活性化は炎症応答の開始の重要な段階を表す。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、外来抗原に対する免疫応答の媒介において決定的に重要な役割を演じる自然免疫受容体の１ファミリーを表す。例えばＴＬＲ３は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡならびに合成ｄｓ ＲＮＡアナログ、ポリリボイノシン−リボシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）を認識する哺乳動物パターン認識受容体である（非特許文献９）。さらに、ＴＬＲ３は壊死細胞から遊離されるｍＲＮＡのような内因性リガンドを認識することが示され（非特許文献１０）、炎症部位での壊死細胞死がＴＬＲ３の活性化に寄与しうることを示す。完全長ヒトＴＬＲ３のアミノ酸配列およびコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１および配列番号２に示す。
【０００６】
ｄｓウイルスＲＮＡアナログポリ（Ｉ：Ｃ）若しくは内因性ｍＲＮＡリガンドによるＴＬＲ３の活性化は、炎症前サイトカインおよびケモカインの分泌を誘導する（ＴＬＲ３活性化が感染関連の炎症の間に疾患の転帰を調節することを示す知見）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＬＲ３連結は、ウイルス感染（非特許文献１１）、若しくは炎症と関連する壊死（非特許文献１０）の情況で起こると考えられる。全体として、これらのデータは、ＴＬＲ３の連結が、自然免疫に寄与すると考えられる多数の炎症性サイトカインの産生をもたらすリン酸化および転写活性化事象のカスケードを開始することを示す（非特許文献１２により総説される）。さらに、これらのデータは、持続的ＴＬＲ３活性化が、感染に関連する炎症性疾患の調節で重要な一成分であり得ることを示唆する。公表されたデータは、炎症前サイトカインの過剰産生を、全身性炎症応答症候群、感染に関連する急性サイトカインストーム（非特許文献１３により総説される）、ならびに関節リウマチ（非特許文献１４により総説される）および炎症性腸疾患（非特許文献１５により総説される）のような免疫媒介性の慢性状態と関連付ける知見により示されるとおり、この仮説に裏付けを与える。
【０００７】
重要なことに、ＴＬＲ３活性が、炎症性腸疾患の症状、敗血症、サイトカイン、ケモカインおよび成長因子媒介性の肺の病状、ならびに肺組織への増大された炎症細胞浸潤から生じる肺の炎症状態のような状態でもまた重大な役割を演じていることが明らかになりつつある。しかしながら、ＴＬＲ３グリコシル化がＴＬＲ３活性およびＴＬＲ３活性に媒介される状態に対し何の影響（あれば）を有するか不明であった。
【０００８】
従って、ＴＬＲ３活性に対するＴＬＲ３グリコシル化の影響を理解し、かつ、ＴＬＲ３活性を効果的に調節する組成物および方法を開発するのにこの方法を活用する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｎａｔａｎｓｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２６：１９２７−１９３１（１９９８）
【非特許文献２】Ａｎｇｕｓら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２９：１３０３−１３１０（２００１）
【非特許文献３】Ｈａｎａｕｅｒら、Ｒｅｖ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．３：８１−９２（２００３）
【非特許文献４】Ｍａｐｅｌら、Ｍａｎａｇ．Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ １７：６１−６６（２００４）
【非特許文献５】Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５２：Ｓ４６−５２（１９９５）
【非特許文献６】Ｂａｎｄｉら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：６９−７５（２００３）
【非特許文献７】Ｇｅｒｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：７３１−７３７（２００３）
【非特許文献８】Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．９：１０４−１１０（２００３）
【非特許文献９】Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２−２３８（２００１）
【非特許文献１０】Ｋａｒｉｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：１２５４２−１２５５０（２００４）
【非特許文献１１】Ｔａｂｅｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：３５１６−３５２１（２００４）
【非特許文献１２】ＴａｋｅｄａとＡｋｉｒａ、Ｊ．Ｄｅｒｍ．Ｓｃｉ．３４：７３−８２（２００４）
【非特許文献１３】Ｖａｎ Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６：３７９−４１４（２００３）
【非特許文献１４】Ｍｉｏｓｓｅｃら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１６：２１８−２２２（２００４）
【非特許文献１５】ＯｇａｔａとＨｉｂｉ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．９：１１０７−１１１３（２００３）
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明の一局面は、配列番号６のアミノ酸配列に対する最低７５％の同一性をもつアミノ酸配列、およびアミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内の最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。
【００１０】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号６の位置Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６の３アミノ酸残基内に最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。
【００１１】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８若しくは配列番号２０を含んでなるペプチド鎖である。
【００１２】
本発明の別の局面は、細胞中のＴＬＲ３グリコシル化を低下させることを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法である。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
本明細で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００１４】
「ホモログ」という用語は、参照配列に対する４０％と１００％の間の配列同一性を有するタンパク質配列を意味している。ｈＴＬＲ３のホモログは、既知のｈＴＬＲ３配列に対する４０％と１００％の間の配列同一性を有する他の種からのペプチド鎖を包含する。「ＴＬＲ３ホモログ」および「ＴＬＲ３」という用語は本明細および請求の範囲を通じて互換性に使用する。
【００１５】
本明細書で使用されるところの「ペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合により連結された最低２個の天然に存在する若しくは存在しないアミノ酸残基を含んでなる分子を意味している。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「ＴＬＲ３活性」という用語は、細胞表面ＴＬＲ３ホモログへのリガンド結合の結果として発生する、または最低１種のＴＬＲ３ホモログペプチド鎖により全体として若しくは部分的に媒介されるいかなる活性も指す。
【００１７】
本発明の組成物および方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方で細胞中のＴＬＲ３ホモログの活性の調節において有用である。とりわけ、本発明の組成物および方法は、ｉｎ ｖｉｖｏのＴＬＲ３依存性のシグナリング、ならびに、炎症性腸疾患の症状、敗血症、サイトカイン、ケモカインおよび成長因子媒介性の肺の病状、ならびに肺組織への増大された炎症細胞浸潤から生じる肺の炎症状態のような状態でのＴＬＲ３活性と関連する生物学的過程を減弱するのに使用し得る。
【００１８】
本発明の一局面は、配列番号６のアミノ酸配列に対する最低７５％の同一性をもつアミノ酸配列、およびアミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内の最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。２ペプチド鎖間の同一性パーセントは、低複雑配列のフィルタリング（ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）をオフにしたＢＬＡＳＴＰ ２．２．１２［２００５年８月７日］アルゴリズムのデフォルトの設定を使用しかつＢＬＡＳＴＰクエリ配列として配列番号６を使用するアライメントにより決定し得る。配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０のアミノ酸配列はこうしたペプチド鎖を例示する。こうしたペプチド鎖は、突然変異誘発された成熟形態のＥＣＤ ＴＬＲ３ホモログに加えて付加的な配列を含んでもよい。こうした付加的な配列は、例えば、ホモログの天然のシグナルペプチドのようなシグナルペプチド若しくは天然の細胞内および膜貫通ドメインでありうる。当業者は、アフィニティー標識配列、またはＴＬＲの活性、機能若しくは精製を容易にする他の配列のような、他のこうした付加的な配列を認識するであろう。
【００１９】
こうしたペプチド鎖は、ＴＬＲ３ホモログと配列番号６の間の同一性パーセントを上述されたとおり決定すること、配列番号６に対する最低７５％の同一性をもつホモログを選択すること、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置を同定すること、および同定された位置の３残基内に最低１個の突然変異を導入することにより容易に作成しうる。重要なことに、中核のコンセンサスグリコシル化部位モチーフは３アミノ酸残基Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフである。こうした突然変異は置換、欠失若しくは挿入であることができ、そして当該技術分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発技術を使用して生成し得る。こうしたペプチド鎖は、アミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内に存在しない、ＴＬＲ３ホモログに組み込まれた付加的な突然変異もまた含みうる。
【００２０】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号６の位置Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６の３アミノ酸残基内に最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０のアミノ酸配列はこうしたペプチド鎖を例示する。こうした突然変異は置換、欠失若しくは挿入であることができ、そして当該技術分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発技術を使用して生成し得る。こうしたペプチド鎖は上で論考されたところの付加的な配列もまた含みうる。
【００２１】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８若しくは配列番号２０を含んでなるペプチド鎖である。こうしたペプチド鎖は上で論考されたところの付加的な配列もまた含みうる。
【００２２】
一態様において、本発明は本発明のペプチド鎖をコードする核酸を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７若しくは配列番号１９の核酸配列を含んでなる核酸を提供する。
【００２４】
本発明の核酸は、当業者により既知のｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ技術を使用して作成しうる。こうした核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含みうる。加えて、こうした核酸は付加的な核酸配列を含みうるか、若しくは別の分類の分子に複合しうる。例えば、こうした核酸は、ベクター核酸に挿入されうるか、または該核酸によりコードされるペプチド鎖の発現を生じさせるために細胞若しくは系に供給されうる。こうした細胞若しくは系は、真核生物細胞、原核生物細胞、古細菌細胞、若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合転写および翻訳系のような細胞を含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ）でありうる。ペプチド鎖発現、核酸をベクターに導入する、および核酸を細胞に供給するための技術、ならびに核酸によりコードされるペプチド鎖の発現に適する細胞若しくは系は、当業者に公知である。
【００２５】
本発明の別の局面は、遺伝子不活性化若しくは転写物ターゲッティング（例えばｓｉＲＮＡ）のような技術を使用して細胞中のＴＬＲ３グリコシル化を低下させることを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法である。ＴＬＲ３グリコシル化は、例えば、ツニカマイシンのようなＴＬＲ３グリコシル化を阻害する小分子を細胞に提供すること、それがもはやグリコシル化され得ないようにグリコシル化部位が改変されているＴＬＲ３ホモログを提供すること、細胞中で解糖酵素を過剰発現すること、および細胞中のグリコシラーゼの発現を低下若しくは不活性化することにより、低下させうる。抗体分子若しくは抗体フラグメントもまたＴＬＲ３グリコシル化および活性を低下させるのに使用しうる。こうした抗体分子若しくはフラグメントは、配列番号６の残基Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６を含有する細胞表面ＴＬＲ３の領域に結合することにより、リガンド若しくは受容体の多量体化を阻害しうる。本発明の方法において、ＴＬＲ３ホモログのＮ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化双方を、ＴＬＲ３グリコシル化を低下させるために標的としうる。
【００２６】
本発明の一局面は、細胞にツニカマイシンを提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法である。ツニカマイシンは、培地（約０．２ないし０．５μｇ／ｍｌの濃度で）を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで、若しくは例えば静脈内注入を介してｉｎ ｖｉｖｏで細胞に提供し得る。当業者は、ツニカマイシンをｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に提供し得る多くの他の方法および経路を認識するであろう。
【００２７】
別の態様において、本発明は、本発明のペプチド鎖を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法を提供する。ペプチド鎖は、例えば細胞を取り囲む液体若しくは組織に該ペプチド鎖を供給すること、該ペプチド鎖を発現する外因性核酸を細胞に導入すること、該ペプチド鎖の細胞中への微小注入、またはペプチド鎖を含有する第二の細胞若しくは小胞と細胞を融合することにより、細胞に提供しうる。当業者は、ペプチド鎖を細胞に提供する他の手段を認識するであろう。
【００２８】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法を提供する。本発明の核酸は、ウイルス、プラスミド、細胞若しくは小胞ベクター、微小注入、天然に存在する核酸の取込みすなわち受容能、細胞に進入することが可能な分子への複合の使用により、または核酸を細胞に導入しうる当業者に既知のいずれかの他の技術により、細胞に提供しうる。
【００２９】
本発明の別の態様において、核酸はトランスフェクションにより細胞に提供される。核酸の細胞へのトランスフェクションは、電気穿孔法、化学的ショック、リポフェクション、小胞融合、および当業者により既知の他の技術のような多様な技術により達成しうる。
【００３０】
本発明は今や以下の特定の制限しない実施例に関して記述されるであろう。
【実施例１】
【００３１】
ｈＴＬＲ３細胞外ドメインのグリコシル化
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ）番号：ＣＲＬ−１５７３ＴＭ）で組換え発現したｈＴＬＲ３の精製した可溶性ＥＣＤで実施した質量分析は、イオン化ｈＴＬＲ３ ＥＣＤフラグメント種間の高程度の電荷の不均一性（図１Ａ）および１１０ｋＤの平均イオンフラグメント質量を示した。Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化に特異的なデグリコシダーゼの混合物での組換え発現したｈＴＬＲ３ ＥＣＤの処理、次いで質量分析は、デグリコシダーゼ処理が平均イオンフラグメント質量を９４ｋＤに低下させたことを示した（図１Ｂ）。加えて、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮアーゼ）、Ｏ−グリコシルダーゼＤＳ、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）、若しくはこれらの酵素の全部を含有するカクテルとのｈＴＬＲ３ ＥＣＤのインキュベーションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたｈＴＬＲ３ ＥＣＤの糖タンパク質特異的染色を減少させた。一緒に、これらの結果は、ｈＴＬＲ３ ＥＣＤがＮおよびＯ双方でグリコシル化されることを示す。
【００３２】
質量分析および糖タンパク質特異的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためのｈＴＬＲ３ ＥＣＤは後に続くとおり調製した。最初に、完全長のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＴＬＲ３タンパク質（配列番号２）をコードしかつ受託番号Ｕ８８８７９に同一のｃＤＮＡ（配列番号１）をｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。次に、ｈＴＬＲ３ ＥＣＤ（配列番号３）をコードしかつ完全長ｈＴＬＲ３のアミノ酸１−７０３（配列番号４）よりなるｃＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。このｃＤＮＡフラグメントは、ｐｃＤＮＡ３．１に、インフレームでかつヘキサヒスチジンアフィニティー標識をコードするｃＤＮＡの５’側にクローン化した。生じるプラスミドは、Ｃ末端ヘキサヒスチジン標識を含んでなる組換えｈＴＬＲ３ ＥＣＤをコードする。
【００３３】
このプラスミドによりコードされるｈＴＬＲ３ ＥＣＤを、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞により発現、プロセシングおよび分泌させた。細胞は標準的方法を使用してトランスフェクトしかつ培養した。カルボキシ末端ヘキサヒスチジンアフィニティー標識をもつ組換えｈＴＬＲ３ ＥＣＤを、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して細胞培養物上清から精製し、そして標準的方法を使用するイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。この方法により製造したｈＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質の大部分は、翻訳後タンパク質分解性プロセシングおよび分泌により、最初の２６個のアミノ末端シグナルペプチド残基を欠くと予測される。精製されたｈＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質は完全長ｈＴＬＲ３（配列番号２）のアミノ酸残基２７ないし７０３（配列番号６）を含んだ。
【００３４】
精製した組換えｈＴＬＲ３ ＥＣＤの質量分析を後に続くとおり実施した。最初に、サンプルをＮａｎｏｓｅｐＴＭ遠心濃縮装置（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州イーストヒルズ）で濃縮し、Ｃ−１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して脱塩し、そして５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸で溶出した。１μＬの各サンプルをその後、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するアセトニトリル／水（５０：５０）中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸中のマトリックスと共結晶した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験をその後、標準的方法を使用して実施し、そしてＡＢＩ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ ＳＴＲ質量分析計を使用して記録した。グリコシル化を検査するため、１μｇの精製したｈＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質を、Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼおよびシアリダーゼの混合物と３７℃で２４時間インキュベートした。このインキュベーションの生成物をその後、上述されたところのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法により分析した。
【００３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離および糖タンパク質特異的可視化のための精製したｈＴＬＲ３ ＥＣＤの調製は後に続くとおり実施した。最初に、組換え発現したｈＴＬＲ３ ＥＣＤ単独、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮアーゼ）とインキュベートしたｈＴＬＲ３ ＥＣＤ、Ｏ−グリコシダーゼＤＳ、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）とインキュベートしたｈＴＬＲ３ ＥＣＤ、若しくはこれらの酵素の全部およびｈＴＬＲ３ ＥＣＤを含有するカクテルを含有するサンプルを調製した。等量のｈＴＬＲ３ ＥＣＤを含有するサンプルをその後、標準的方法を使用して４〜１２％勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして、糖タンパク質特異的ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）で糖タンパク質を可視化した。
【実施例２】
【００３６】
細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対するＮ−グリコシル化の影響
これらの実験では、ＨＥＫ２９３細胞に標準的方法により一過性にトランスフェクトしたｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）レポーター遺伝子構築物を使用して、ＴＬＲ３シグナル伝達をアッセイした。このレポーター構築物は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結したＮＦ−κＢ応答ＤＮＡ配列を含んだ。ポリ（Ｉ：Ｃ）リガンドによるＴＬＲ３の活性化はＮＦ−κＢ活性を増大させ、そしてルシフェラーゼレポーター遺伝子のようなＮＦ−κＢ応答性遺伝子の活性化をもたらす。ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ウミシイタケ由来のルシフェラーゼタンパク質を構成的に産生する対照ベクターｐＨＲＬ−ＴＫと一過性にコトランスフェクトした。完全長ｈＴＬＲ３をコードするｃＤＮＡもまた、標準的方法を使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞に一過性にコトランスフェクトした。
【００３７】
トランスフェクション後に、細胞を図２に示されるとおり非毒性用量のツニカマイシンで処理した。ツニカマイシンは、グリコシル化の間にペプチド鎖に結合される最初の糖残基であるＮ−アセチルグルコサミンの結合を阻害することにより、Ｎ結合グリコシル化を阻害する。処理した若しくは対照のＨＥＫ２９３細胞をその後、図２に示されるとおり、１０μｇ／ｍｌのｈＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）とインキュベートした。
【００３８】
処理後、ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅおよびｐＨＲＬ−ＴＫから発現されたルシフェラーゼを、標準的方法を使用してアッセイした。データは、ｐＨＲＬ−ＴＫのルシフェラーゼ活性に対し正規化したｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性に等しい「ルシフェラーゼ比」として表した。結果は９個の個別のサンプルから収集したデータの散布図として提示し、そして３回の独立に実施した同一の実験を代表する。
【実施例３】
【００３９】
細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対するｈＴＬＲ３ ＥＣＤのＮ−グリコシル化阻害の影響
驚くべきことに、配列番号２のｈＴＬＲ３配列内の多くの可能な部位の２個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ２４７およびＮ４１３が、ｈＴＬＲ３シグナル伝達で決定的に重要な役割を演じることが見出された（図３Ｃ）。加えて、配列番号２中の２個の他の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ２５２およびＮ６６２もまたｈＴＬＲのシグナル伝達で重要な役割を演じることが見出された（図３Ｂおよび４）。配列番号２中の位置Ｎ２４７、Ｎ２５２、Ｎ４１３およびＮ６６２は、それぞれ、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７およびＮ６３６に同等である。
【００４０】
ｈＴＬＲ３ ＥＣＤは、多様なＴＬＲ３ホモログ中のＮ−グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの存在（図３Ａ）に基づき、数個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有する。これらの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位のうち５個のみが、標準的ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントにより評価されるとおり、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）およびハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＴＬＲ３ホモログの間で保存された（図３Ａ）。配列番号２中の該５個の保存された部位は、Ｎ５７、Ｎ１９６、Ｎ２４７、Ｎ２７５およびＮ４１３であった。配列番号２中の４個の他の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、検査した多様なＴＬＲ３ホモログ間で変動した（図３Ａ）。これら４個の保存されていないが他の潜在的なＮ−グリコシル化部位は、配列番号２のＮ２５２、Ｎ２６５、Ｎ２９１、Ｎ５０７、Ｎ６３６およびＮ６６２であった。
【００４１】
ｈＴＬＲ３ ＥＣＤ中のこれらの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位内のアスパラギン残基を、標準的方法を使用してアラニン残基に個別に変異させた（図３および図４）。いずれかのＴＬＲ３ホモログ中のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化モチーフに対する一致を含有しないｈＴＬＲ３ ＥＣＤ中に存在する４個の付加的なアスパラギン残基もまた、対照として変異させた。これらの残基は完全長ｈＴＬＲ３（配列番号２）のＮ７０、Ｎ１２４およびＮ３８８であった。全部の突然変異誘発は、突然変異誘発させたＥＣＤをもつ完全長のプロセシングされかつ分泌されるｈＴＬＲ３を生じさせるために、完全長ｈＴＬＲ３をコードするｃＤＮＡで実施した。配列番号２中の変異させた位置を、アラニン置換の位置の同定により図中で示す（例えば、Ｎ７０はＮ７０がアラニン残基で置換されたことを意味している）。
【００４２】
上述された変異体ｈＴＬＲ３ ｃＤＮＡ構築物をコードしかつ発現するプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に個別にトランスフェクトした。個別の変異体ｈＴＬＲ３分子をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を、ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターおよびｐＨＲＬ−ＴＫルシフェラーゼ対照ベクターでもまた同時にトランスフェクトした。トランスフェクションおよび細胞培養は標準的方法を使用して実施した。
【００４３】
トランスフェクトしたおよび対照のＨＥＫ２９３細胞をその後、示されるとおり１０μｇ／ｍｌ（図３Ｂおよび図４）若しくは２．５μｇ／ｍｌ（図３Ｃ）のｈＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）とインキュベートして、ｈＴＬＲ３シグナル伝達に対する多様なｈＴＬＲ３突然変異の影響を評価した。処置後、ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅおよびｐＨＲＬ−ＴＫから発現されたルシフェラーゼを標準的方法を使用してアッセイした。データは上述されたところの「ルシフェラーゼ比」として表した。結果は６個の個別のサンプルから収集したデータの散布図として提示する。
【００４４】
本発明は今や完全に記述されたので、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなく、多くの変更および改変をそれに対しなし得ることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図（Ａ）はｈＴＬＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示し、また、図（Ｂ）はデグリコシダーゼで処理したｈＴＬＲ３ ＥＣＤのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【図２】ＨＥＫ２９３細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対するツニカマイシンでのＮ−グリコシル化の影響を示す。
【図３】細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達の活性化に対するｈＴＬＲ３（配列番号２）中のＮ２４７、Ｎ２５２若しくはＮ４１３の突然変異誘発によるＥＣＤのＮ−グリコシル化の影響を示す。図（Ａ）は選択したｈＴＬＲ３ホモログからの可能なＮ−グリコシル化部位のアライメントであり；図（Ｂ）および（Ｃ）は、１０μｇ／ｍｌ（Ｂ）若しくは２．５μｇ／ｍｌ（Ｃ）のｈＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）で指定されたｈＴＬＲ３変異体で実施したｈＴＬＲ３活性化アッセイである。
【図４】細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対する、ｈＴＬＲ（配列番号２）のＮ２４７、Ｎ２５２若しくはＮ６６２の突然変異誘発によるｈＴＬＲ３ ＥＣＤのＮ−グリコシル化の影響を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲ３のグリコシル化部位ムテイン、該ムテインをコードする核酸、および細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症状態と関連する病理は、医療における重大な課題を表し、そして苦しく、衰弱させ、かつ致死的であり得る。例えば、敗血症および敗血症関連の状態は、２８〜５０％の死亡率を伴い米国で毎年７５万以上の人々を冒し、年間２１５，０００例の死亡をもたらす（非特許文献１；非特許文献２）。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）クローン病および潰瘍性大腸炎のような他の炎症状態は、米国で年あたり百万以上の人々を冒している（非特許文献３）。
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息および肺感染症のような肺機能を冒す炎症性の肺の状態もまた、米国でかなりの数の人々を冒している。例えばＣＯＰＤは推定で一千万の成人の米国人を冒し、そして該罹患率は上昇している（非特許文献４）。これらの炎症状態と関連する病理およびこれらの状態の増悪は、重大な健康および経済的影響を有する。
【０００４】
喘息およびＣＯＰＤのような肺疾患の増悪は症状の悪化および肺機能の低下を特徴とする。ウイルス感染症は多くの肺疾患の増悪を伴い（非特許文献５；非特許文献６）、そして増悪の主因であると考えられる。ウイルス感染後の肺での炎症前サイトカインの分泌は、多様な肺疾患での炎症応答の促進における決定的に重要な段階を表す（非特許文献７；非特許文献８）。
【０００５】
宿主免疫系による微生物抗原の認識は自然免疫受容体により媒介され、その活性化は炎症応答の開始の重要な段階を表す。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、外来抗原に対する免疫応答の媒介において決定的に重要な役割を演じる自然免疫受容体の１ファミリーを表す。例えばＴＬＲ３は、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡならびに合成ｄｓ ＲＮＡアナログ、ポリリボイノシン−リボシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）を認識する哺乳動物パターン認識受容体である（非特許文献９）。さらに、ＴＬＲ３は壊死細胞から遊離されるｍＲＮＡのような内因性リガンドを認識することが示され（非特許文献１０）、炎症部位での壊死細胞死がＴＬＲ３の活性化に寄与しうることを示す。完全長ヒトＴＬＲ３のアミノ酸配列およびコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１および配列番号２に示す。
【０００６】
ｄｓウイルスＲＮＡアナログポリ（Ｉ：Ｃ）若しくは内因性ｍＲＮＡリガンドによるＴＬＲ３の活性化は、炎症前サイトカインおよびケモカインの分泌を誘導する（ＴＬＲ３活性化が感染関連の炎症の間に疾患の転帰を調節することを示す知見）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＬＲ３連結は、ウイルス感染（非特許文献１１）、若しくは炎症と関連する壊死（非特許文献１０）の情況で起こると考えられる。全体として、これらのデータは、ＴＬＲ３の連結が、自然免疫に寄与すると考えられる多数の炎症性サイトカインの産生をもたらすリン酸化および転写活性化事象のカスケードを開始することを示す（非特許文献１２により総説される）。さらに、これらのデータは、持続的ＴＬＲ３活性化が、感染に関連する炎症性疾患の調節で重要な一成分であり得ることを示唆する。公表されたデータは、炎症前サイトカインの過剰産生を、全身性炎症応答症候群、感染に関連する急性サイトカインストーム（非特許文献１３により総説される）、ならびに関節リウマチ（非特許文献１４により総説される）および炎症性腸疾患（非特許文献１５により総説される）のような免疫媒介性の慢性状態と関連付ける知見により示されるとおり、この仮説に裏付けを与える。
【０００７】
重要なことに、ＴＬＲ３活性が、炎症性腸疾患の症状、敗血症、サイトカイン、ケモカインおよび成長因子媒介性の肺の病状、ならびに肺組織への増大された炎症細胞浸潤から生じる肺の炎症状態のような状態でもまた重大な役割を演じていることが明らかになりつつある。しかしながら、ＴＬＲ３グリコシル化がＴＬＲ３活性およびＴＬＲ３活性に媒介される状態に対し何の影響（あれば）を有するか不明であった。
【０００８】
従って、ＴＬＲ３活性に対するＴＬＲ３グリコシル化の影響を理解し、かつ、ＴＬＲ３活性を効果的に調節する組成物および方法を開発するのにこの方法を活用する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｎａｔａｎｓｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２６：１９２７−１９３１（１９９８）
【非特許文献２】Ａｎｇｕｓら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２９：１３０３−１３１０（２００１）
【非特許文献３】Ｈａｎａｕｅｒら、Ｒｅｖ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．３：８１−９２（２００３）
【非特許文献４】Ｍａｐｅｌら、Ｍａｎａｇ．Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ １７：６１−６６（２００４）
【非特許文献５】Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５２：Ｓ４６−５２（１９９５）
【非特許文献６】Ｂａｎｄｉら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：６９−７５（２００３）
【非特許文献７】Ｇｅｒｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：７３１−７３７（２００３）
【非特許文献８】Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｕｌｍ．Ｍｅｄ．９：１０４−１１０（２００３）
【非特許文献９】Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４１３：７３２−２３８（２００１）
【非特許文献１０】Ｋａｒｉｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：１２５４２−１２５５０（２００４）
【非特許文献１１】Ｔａｂｅｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：３５１６−３５２１（２００４）
【非特許文献１２】ＴａｋｅｄａとＡｋｉｒａ、Ｊ．Ｄｅｒｍ．Ｓｃｉ．３４：７３−８２（２００４）
【非特許文献１３】Ｖａｎ Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６：３７９−４１４（２００３）
【非特許文献１４】Ｍｉｏｓｓｅｃら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１６：２１８−２２２（２００４）
【非特許文献１５】ＯｇａｔａとＨｉｂｉ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．９：１１０７−１１１３（２００３）
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明の一局面は、配列番号６のアミノ酸配列に対する最低７５％の同一性をもつアミノ酸配列、およびアミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内の最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。
【００１０】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号６の位置Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６の３アミノ酸残基内に最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。
【００１１】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８若しくは配列番号２０を含んでなるペプチド鎖である。
【００１２】
本発明の別の局面は、細胞中のＴＬＲ３グリコシル化を低下させることを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法である。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
本明細で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００１４】
「ホモログ」という用語は、参照配列に対する４０％と１００％の間の配列同一性を有するタンパク質配列を意味している。ｈＴＬＲ３のホモログは、既知のｈＴＬＲ３配列に対する４０％と１００％の間の配列同一性を有する他の種からのペプチド鎖を包含する。「ＴＬＲ３ホモログ」および「ＴＬＲ３」という用語は本明細および請求の範囲を通じて互換性に使用する。
【００１５】
本明細書で使用されるところの「ペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合により連結された最低２個の天然に存在する若しくは存在しないアミノ酸残基を含んでなる分子を意味している。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「ＴＬＲ３活性」という用語は、細胞表面ＴＬＲ３ホモログへのリガンド結合の結果として発生する、または最低１種のＴＬＲ３ホモログペプチド鎖により全体として若しくは部分的に媒介されるいかなる活性も指す。
【００１７】
本発明の組成物および方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方で細胞中のＴＬＲ３ホモログの活性の調節において有用である。とりわけ、本発明の組成物および方法は、ｉｎ ｖｉｖｏのＴＬＲ３依存性のシグナリング、ならびに、炎症性腸疾患の症状、敗血症、サイトカイン、ケモカインおよび成長因子媒介性の肺の病状、ならびに肺組織への増大された炎症細胞浸潤から生じる肺の炎症状態のような状態でのＴＬＲ３活性と関連する生物学的過程を減弱するのに使用し得る。
【００１８】
本発明の一局面は、配列番号６のアミノ酸配列に対する最低７５％の同一性をもつアミノ酸配列、およびアミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内の最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。２ペプチド鎖間の同一性パーセントは、低複雑配列のフィルタリング（ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）をオフにしたＢＬＡＳＴＰ ２．２．１２［２００５年８月７日］アルゴリズムのデフォルトの設定を使用しかつＢＬＡＳＴＰクエリ配列として配列番号６を使用するアライメントにより決定し得る。配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０のアミノ酸配列はこうしたペプチド鎖を例示する。こうしたペプチド鎖は、突然変異誘発された成熟形態のＥＣＤ ＴＬＲ３ホモログに加えて付加的な配列を含んでもよい。こうした付加的な配列は、例えば、ホモログの天然のシグナルペプチドのようなシグナルペプチド若しくは天然の細胞内および膜貫通ドメインでありうる。当業者は、アフィニティー標識配列、またはＴＬＲの活性、機能若しくは精製を容易にする他の配列のような、他のこうした付加的な配列を認識するであろう。
【００１９】
こうしたペプチド鎖は、ＴＬＲ３ホモログと配列番号６の間の同一性パーセントを上述されたとおり決定すること、配列番号６に対する最低７５％の同一性をもつホモログを選択すること、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置を同定すること、および同定された位置の３残基内に最低１個の突然変異を導入することにより容易に作成しうる。重要なことに、中核のコンセンサスグリコシル化部位モチーフは３アミノ酸残基Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフである。こうした突然変異は置換、欠失若しくは挿入であることができ、そして当該技術分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発技術を使用して生成し得る。こうしたペプチド鎖は、アミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内に存在しない、ＴＬＲ３ホモログに組み込まれた付加的な突然変異もまた含みうる。
【００２０】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号６の位置Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６の３アミノ酸残基内に最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖である。配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０のアミノ酸配列はこうしたペプチド鎖を例示する。こうした突然変異は置換、欠失若しくは挿入であることができ、そして当該技術分野で公知のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発技術を使用して生成し得る。こうしたペプチド鎖は上で論考されたところの付加的な配列もまた含みうる。
【００２１】
本発明の別の局面は、アミノ酸配列、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８若しくは配列番号２０を含んでなるペプチド鎖である。こうしたペプチド鎖は上で論考されたところの付加的な配列もまた含みうる。
【００２２】
一態様において、本発明は本発明のペプチド鎖をコードする核酸を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７若しくは配列番号１９の核酸配列を含んでなる核酸を提供する。
【００２４】
本発明の核酸は、当業者により既知のｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ技術を使用して作成しうる。こうした核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含みうる。加えて、こうした核酸は付加的な核酸配列を含みうるか、若しくは別の分類の分子に複合しうる。例えば、こうした核酸は、ベクター核酸に挿入されうるか、または該核酸によりコードされるペプチド鎖の発現を生じさせるために細胞若しくは系に供給されうる。こうした細胞若しくは系は、真核生物細胞、原核生物細胞、古細菌細胞、若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合転写および翻訳系のような細胞を含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ）でありうる。ペプチド鎖発現、核酸をベクターに導入する、および核酸を細胞に供給するための技術、ならびに核酸によりコードされるペプチド鎖の発現に適する細胞若しくは系は、当業者に公知である。
【００２５】
本発明の別の局面は、遺伝子不活性化若しくは転写物ターゲッティング（例えばｓｉＲＮＡ）のような技術を使用して細胞中のＴＬＲ３グリコシル化を低下させることを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法である。ＴＬＲ３グリコシル化は、例えば、ツニカマイシンのようなＴＬＲ３グリコシル化を阻害する小分子を細胞に提供すること、それがもはやグリコシル化され得ないようにグリコシル化部位が改変されているＴＬＲ３ホモログを提供すること、細胞中で解糖酵素を過剰発現すること、および細胞中のグリコシラーゼの発現を低下若しくは不活性化することにより、低下させうる。抗体分子若しくは抗体フラグメントもまたＴＬＲ３グリコシル化および活性を低下させるのに使用しうる。こうした抗体分子若しくはフラグメントは、配列番号６の残基Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６を含有する細胞表面ＴＬＲ３の領域に結合することにより、リガンド若しくは受容体の多量体化を阻害しうる。本発明の方法において、ＴＬＲ３ホモログのＮ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化双方を、ＴＬＲ３グリコシル化を低下させるために標的としうる。
【００２６】
本発明の一局面は、細胞にツニカマイシンを提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法である。ツニカマイシンは、培地（約０．２ないし０．５μｇ／ｍｌの濃度で）を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで、若しくは例えば静脈内注入を介してｉｎ ｖｉｖｏで細胞に提供し得る。当業者は、ツニカマイシンをｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に提供し得る多くの他の方法および経路を認識するであろう。
【００２７】
別の態様において、本発明は、本発明のペプチド鎖を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法を提供する。ペプチド鎖は、例えば細胞を取り囲む液体若しくは組織に該ペプチド鎖を供給すること、該ペプチド鎖を発現する外因性核酸を細胞に導入すること、該ペプチド鎖の細胞中への微小注入、またはペプチド鎖を含有する第二の細胞若しくは小胞と細胞を融合することにより、細胞に提供しうる。当業者は、ペプチド鎖を細胞に提供する他の手段を認識するであろう。
【００２８】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法を提供する。本発明の核酸は、ウイルス、プラスミド、細胞若しくは小胞ベクター、微小注入、天然に存在する核酸の取込みすなわち受容能、細胞に進入することが可能な分子への複合の使用により、または核酸を細胞に導入しうる当業者に既知のいずれかの他の技術により、細胞に提供しうる。
【００２９】
本発明の別の態様において、核酸はトランスフェクションにより細胞に提供される。核酸の細胞へのトランスフェクションは、電気穿孔法、化学的ショック、リポフェクション、小胞融合、および当業者により既知の他の技術のような多様な技術により達成しうる。
【００３０】
本発明は今や以下の特定の制限しない実施例に関して記述されるであろう。
【実施例１】
【００３１】
ｈＴＬＲ３細胞外ドメインのグリコシル化
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（Ｒ）番号：ＣＲＬ−１５７３ＴＭ）で組換え発現したｈＴＬＲ３の精製した可溶性ＥＣＤで実施した質量分析は、イオン化ｈＴＬＲ３ ＥＣＤフラグメント種間の高程度の電荷の不均一性（図１Ａ）および１１０ｋＤの平均イオンフラグメント質量を示した。Ｏ結合およびＮ結合グリコシル化に特異的なデグリコシダーゼの混合物での組換え発現したｈＴＬＲ３ ＥＣＤの処理、次いで質量分析は、デグリコシダーゼ処理が平均イオンフラグメント質量を９４ｋＤに低下させたことを示した（図１Ｂ）。加えて、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮアーゼ）、Ｏ−グリコシルダーゼＤＳ、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）、若しくはこれらの酵素の全部を含有するカクテルとのｈＴＬＲ３ ＥＣＤのインキュベーションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたｈＴＬＲ３ ＥＣＤの糖タンパク質特異的染色を減少させた。一緒に、これらの結果は、ｈＴＬＲ３ ＥＣＤがＮおよびＯ双方でグリコシル化されることを示す。
【００３２】
質量分析および糖タンパク質特異的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためのｈＴＬＲ３ ＥＣＤは後に続くとおり調製した。最初に、完全長のヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＴＬＲ３タンパク質（配列番号２）をコードしかつ受託番号Ｕ８８８７９に同一のｃＤＮＡ（配列番号１）をｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。次に、ｈＴＬＲ３ ＥＣＤ（配列番号３）をコードしかつ完全長ｈＴＬＲ３のアミノ酸１−７０３（配列番号４）よりなるｃＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。このｃＤＮＡフラグメントは、ｐｃＤＮＡ３．１に、インフレームでかつヘキサヒスチジンアフィニティー標識をコードするｃＤＮＡの５’側にクローン化した。生じるプラスミドは、Ｃ末端ヘキサヒスチジン標識を含んでなる組換えｈＴＬＲ３ ＥＣＤをコードする。
【００３３】
このプラスミドによりコードされるｈＴＬＲ３ ＥＣＤを、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞により発現、プロセシングおよび分泌させた。細胞は標準的方法を使用してトランスフェクトしかつ培養した。カルボキシ末端ヘキサヒスチジンアフィニティー標識をもつ組換えｈＴＬＲ３ ＥＣＤを、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して細胞培養物上清から精製し、そして標準的方法を使用するイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。この方法により製造したｈＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質の大部分は、翻訳後タンパク質分解性プロセシングおよび分泌により、最初の２６個のアミノ末端シグナルペプチド残基を欠くと予測される。精製されたｈＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質は完全長ｈＴＬＲ３（配列番号２）のアミノ酸残基２７ないし７０３（配列番号６）を含んだ。
【００３４】
精製した組換えｈＴＬＲ３ ＥＣＤの質量分析を後に続くとおり実施した。最初に、サンプルをＮａｎｏｓｅｐＴＭ遠心濃縮装置（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州イーストヒルズ）で濃縮し、Ｃ−１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して脱塩し、そして５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸で溶出した。１μＬの各サンプルをその後、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するアセトニトリル／水（５０：５０）中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸中のマトリックスと共結晶した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験をその後、標準的方法を使用して実施し、そしてＡＢＩ Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ ＳＴＲ質量分析計を使用して記録した。グリコシル化を検査するため、１μｇの精製したｈＴＬＲ３ ＥＣＤタンパク質を、Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼおよびシアリダーゼの混合物と３７℃で２４時間インキュベートした。このインキュベーションの生成物をその後、上述されたところのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光法により分析した。
【００３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離および糖タンパク質特異的可視化のための精製したｈＴＬＲ３ ＥＣＤの調製は後に続くとおり実施した。最初に、組換え発現したｈＴＬＲ３ ＥＣＤ単独、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮアーゼ）とインキュベートしたｈＴＬＲ３ ＥＣＤ、Ｏ−グリコシダーゼＤＳ、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）とインキュベートしたｈＴＬＲ３ ＥＣＤ、若しくはこれらの酵素の全部およびｈＴＬＲ３ ＥＣＤを含有するカクテルを含有するサンプルを調製した。等量のｈＴＬＲ３ ＥＣＤを含有するサンプルをその後、標準的方法を使用して４〜１２％勾配ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして、糖タンパク質特異的ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）で糖タンパク質を可視化した。
【実施例２】
【００３６】
細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対するＮ−グリコシル化の影響
これらの実験では、ＨＥＫ２９３細胞に標準的方法により一過性にトランスフェクトしたｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）レポーター遺伝子構築物を使用して、ＴＬＲ３シグナル伝達をアッセイした。このレポーター構築物は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結したＮＦ−κＢ応答ＤＮＡ配列を含んだ。ポリ（Ｉ：Ｃ）リガンドによるＴＬＲ３の活性化はＮＦ−κＢ活性を増大させ、そしてルシフェラーゼレポーター遺伝子のようなＮＦ−κＢ応答性遺伝子の活性化をもたらす。ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ウミシイタケ由来のルシフェラーゼタンパク質を構成的に産生する対照ベクターｐＨＲＬ−ＴＫと一過性にコトランスフェクトした。完全長ｈＴＬＲ３をコードするｃＤＮＡもまた、標準的方法を使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞に一過性にコトランスフェクトした。
【００３７】
トランスフェクション後に、細胞を図２に示されるとおり非毒性用量のツニカマイシンで処理した。ツニカマイシンは、グリコシル化の間にペプチド鎖に結合される最初の糖残基であるＮ−アセチルグルコサミンの結合を阻害することにより、Ｎ結合グリコシル化を阻害する。処理した若しくは対照のＨＥＫ２９３細胞をその後、図２に示されるとおり、１０μｇ／ｍｌのｈＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）とインキュベートした。
【００３８】
処理後、ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅおよびｐＨＲＬ−ＴＫから発現されたルシフェラーゼを、標準的方法を使用してアッセイした。データは、ｐＨＲＬ−ＴＫのルシフェラーゼ活性に対し正規化したｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性に等しい「ルシフェラーゼ比」として表した。結果は９個の個別のサンプルから収集したデータの散布図として提示し、そして３回の独立に実施した同一の実験を代表する。
【実施例３】
【００３９】
細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対するｈＴＬＲ３ ＥＣＤのＮ−グリコシル化阻害の影響
驚くべきことに、配列番号２のｈＴＬＲ３配列内の多くの可能な部位の２個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ２４７およびＮ４１３が、ｈＴＬＲ３シグナル伝達で決定的に重要な役割を演じることが見出された（図３Ｃ）。加えて、配列番号２中の２個の他の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、Ｎ２５２およびＮ６６２もまたｈＴＬＲのシグナル伝達で重要な役割を演じることが見出された（図３Ｂおよび４）。配列番号２中の位置Ｎ２４７、Ｎ２５２、Ｎ４１３およびＮ６６２は、それぞれ、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７およびＮ６３６に同等である。
【００４０】
ｈＴＬＲ３ ＥＣＤは、多様なＴＬＲ３ホモログ中のＮ−グリコシル化モチーフＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの存在（図３Ａ）に基づき、数個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を有する。これらの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位のうち５個のみが、標準的ＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントにより評価されるとおり、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）およびハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＴＬＲ３ホモログの間で保存された（図３Ａ）。配列番号２中の該５個の保存された部位は、Ｎ５７、Ｎ１９６、Ｎ２４７、Ｎ２７５およびＮ４１３であった。配列番号２中の４個の他の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、検査した多様なＴＬＲ３ホモログ間で変動した（図３Ａ）。これら４個の保存されていないが他の潜在的なＮ−グリコシル化部位は、配列番号２のＮ２５２、Ｎ２６５、Ｎ２９１、Ｎ５０７、Ｎ６３６およびＮ６６２であった。
【００４１】
ｈＴＬＲ３ ＥＣＤ中のこれらの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位内のアスパラギン残基を、標準的方法を使用してアラニン残基に個別に変異させた（図３および図４）。いずれかのＴＬＲ３ホモログ中のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／ＴｈｒのＮ−グリコシル化モチーフに対する一致を含有しないｈＴＬＲ３ ＥＣＤ中に存在する４個の付加的なアスパラギン残基もまた、対照として変異させた。これらの残基は完全長ｈＴＬＲ３（配列番号２）のＮ７０、Ｎ１２４およびＮ３８８であった。全部の突然変異誘発は、突然変異誘発させたＥＣＤをもつ完全長のプロセシングされかつ分泌されるｈＴＬＲ３を生じさせるために、完全長ｈＴＬＲ３をコードするｃＤＮＡで実施した。配列番号２中の変異させた位置を、アラニン置換の位置の同定により図中で示す（例えば、Ｎ７０はＮ７０がアラニン残基で置換されたことを意味している）。
【００４２】
上述された変異体ｈＴＬＲ３ ｃＤＮＡ構築物をコードしかつ発現するプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に個別にトランスフェクトした。個別の変異体ｈＴＬＲ３分子をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を、ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターおよびｐＨＲＬ−ＴＫルシフェラーゼ対照ベクターでもまた同時にトランスフェクトした。トランスフェクションおよび細胞培養は標準的方法を使用して実施した。
【００４３】
トランスフェクトしたおよび対照のＨＥＫ２９３細胞をその後、示されるとおり１０μｇ／ｍｌ（図３Ｂおよび図４）若しくは２．５μｇ／ｍｌ（図３Ｃ）のｈＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）とインキュベートして、ｈＴＬＲ３シグナル伝達に対する多様なｈＴＬＲ３突然変異の影響を評価した。処置後、ｐＮＦ−κＢ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅおよびｐＨＲＬ−ＴＫから発現されたルシフェラーゼを標準的方法を使用してアッセイした。データは上述されたところの「ルシフェラーゼ比」として表した。結果は６個の個別のサンプルから収集したデータの散布図として提示する。
【００４４】
本発明は今や完全に記述されたので、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなく、多くの変更および改変をそれに対しなし得ることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図（Ａ）はｈＴＬＲ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示し、また、図（Ｂ）はデグリコシダーゼで処理したｈＴＬＲ３ ＥＣＤのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【図２】ＨＥＫ２９３細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対するツニカマイシンでのＮ−グリコシル化の影響を示す。
【図３】細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達の活性化に対するｈＴＬＲ３（配列番号２）中のＮ２４７、Ｎ２５２若しくはＮ４１３の突然変異誘発によるＥＣＤのＮ−グリコシル化の影響を示す。図（Ａ）は選択したｈＴＬＲ３ホモログからの可能なＮ−グリコシル化部位のアライメントであり；図（Ｂ）および（Ｃ）は、１０μｇ／ｍｌ（Ｂ）若しくは２．５μｇ／ｍｌ（Ｃ）のｈＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）で指定されたｈＴＬＲ３変異体で実施したｈＴＬＲ３活性化アッセイである。
【図４】細胞中のｈＴＬＲ３シグナル伝達のポリ（Ｉ：Ｃ）誘発性の活性化に対する、ｈＴＬＲ（配列番号２）のＮ２４７、Ｎ２５２若しくはＮ６６２の突然変異誘発によるｈＴＬＲ３ ＥＣＤのＮ−グリコシル化の影響を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６のアミノ酸配列に対する最低７５％の同一性をもつアミノ酸配列、およびアミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内の最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖。
【請求項２】
アミノ酸配列、配列番号６の位置Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６の３アミノ酸残基内に最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖。
【請求項３】
アミノ酸配列、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８若しくは配列番号２０を含んでなるペプチド鎖。
【請求項４】
請求項１、２若しくは３に記載のペプチド鎖をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７若しくは配列番号１９の核酸配列を含んでなる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
細胞中でのＴＬＲ３グリコシル化を低下させることを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項７】
細胞にツニカマイシンを提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項８】
細胞の外側のツニカマイシン濃度が約０．２μｇ／ｍｌないし０．５μｇ／ｍｌである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１、２若しくは３に記載のペプチド鎖を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の核酸を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項１１】
核酸がトランスフェクションにより細胞に提供される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
配列番号６のアミノ酸配列に対する最低７５％の同一性をもつアミノ酸配列、およびアミノ酸配列、配列番号６のＮ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６に整列する位置の３アミノ酸残基内の最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖。
【請求項２】
アミノ酸配列、配列番号６の位置Ｎ２２１、Ｎ２２６、Ｎ３８７若しくはＮ６３６の３アミノ酸残基内に最低１個の突然変異を含んでなるペプチド鎖。
【請求項３】
アミノ酸配列、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８若しくは配列番号２０を含んでなるペプチド鎖。
【請求項４】
請求項１、２若しくは３に記載のペプチド鎖をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７若しくは配列番号１９の核酸配列を含んでなる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
細胞中でのＴＬＲ３グリコシル化を低下させることを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項７】
細胞にツニカマイシンを提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項８】
細胞の外側のツニカマイシン濃度が約０．２μｇ／ｍｌないし０．５μｇ／ｍｌである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１、２若しくは３に記載のペプチド鎖を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の核酸を細胞に提供することを含んでなる、細胞中のＴＬＲ３活性の調節方法。
【請求項１１】
核酸がトランスフェクションにより細胞に提供される、請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５１５５１１（Ｐ２００９−５１５５１１Ａ）
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８２０８（Ｐ２００８−５３８２０８）
【出願日】平成１８年１０月３０日（２００６．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０３５７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５１２０１
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月３０日（２００６．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６０３５７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５１２０１
【国際公開日】平成１９年５月３日（２００７．５．３）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
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