ＴＲＩＦバイアスを誘発するための方法
本発明は、ＴＬＲ４受容体複合体を介してＴＲＩＦバイアスシグナルを誘発するための合成リピッドＡ模倣物、特にＡＰＧ化合物ＣＲＸ５４７の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲ４受容体複合体を介してＴＲＩＦバイアスシグナルを誘発するための合成リピッドＡ模倣物、特にＡＰＧ化合物ＣＲＸ５４７の使用に関する。
【０００２】
本出願は、米国仮特許出願第６１/１４０２２６号(２００８年１２月２３日出願)の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（37 C.F.R.1.71(E) 37 C.F.R.1.71(E)に従う著作権通知）
本特許書類の開示内容の一部は著作権保護を受ける材料を含む。著作権者はその特許文献または特許開示内容をいずれかの者によってファクシミリによって再生されることに対して、それが米国特許商標庁のファイルまたは記録において現れるので異議はないが、それ以外はすべての著作権をどのような場合でも保持する。
【０００４】
（連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載）
この発明の態様は、国立アレルギー・感染症研究所との契約番号HHSN266200400008C/N01-AI-40008に従って米国政府の支援によってなされている。米国政府はこの発明に対して特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ペプチドグリカン（ＴＬＲ２），ＣｐＧ ＤＮＡ（ＴＬＲ９），ウイルスＲＮＡ（ＴＬＲ３/７/８）、細菌フラジェリン（ＴＬＲ５）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４）を含む、保存的微生物モチーフを認識するパターン認識受容体である。特に、ＴＬＲ４はリガンド結合細胞外ロイシンリッチ領域反復ドメインおよび細胞質中のToll-/IL-1Rホモロジードメイン（細胞内のシグナル伝達アダプターを促す）(Nahori et al., 2005)により特徴づけられる。リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、フィブロネクチン、また、ＲＳＶ、タキソールおよびワクチンアジュバントモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）の融合蛋白を含む、ＴＬＲ４のいくつかのリガンドが記載されている。ＴＬＲ４の活性化に関連する２つの主要なシグナル伝達経路、つまりＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的経路、が記載されている。
【０００６】
最近、他のＴＬＲ４アンタゴニストと比べた場合、サルモネラミネソタの細胞壁由来の精製された解毒糖脂質の誘導体であるＴＬＲ４リガンドＭＰＬがＴＲＩＦ依存的シグナルおよびＭｙＤ８８依存的シグナルに対するバイアスを示すことが報告されており、ＭＰＬが、ＰＩ３キナーゼ経路などの追加的下流シグナル経路を誘発することでＭｙＤ８８依存的炎症性経路の能動的抑制を誘発するであろうと想定された(Mata-Haro et. al. 2007)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nahori et al., 2005
【非特許文献２】Mata-Haro et. al. 2007
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
アミノアルキルグルコサミニド４‐リン酸（ＡＧＰ）の選ばれた異性体を投与することを含む相対的ＴＲＩＦバイアス反応を誘発する方法を提供する。本明細書に開示の合成リピッドＡ模倣物によるＴＲＩＦ依存的シグナルの選択的誘発は、炎症性サイトカイン/ケモカインの誘発に関連する毒性の副作用の危険性を緩和する一方で、免疫反応を選択的に変化させるワクチンアジュバントまたは免疫調節物質の開発を可能にする。
【０００９】
本発明は、ＴＬＲ４受容体複合体を介してＴＲＩＦバイアスシグナルを誘発するための合成リピッドＡ模倣物、特にＡＰＧ化合物ＣＲＸ５４７の使用に関する。ＣＲＸ５４７はＡＧＰ ＣＲＸ５２７のジアステレオマーである。用語「ＴＲＩＦバイアス」とは、他の化合物（例えば、ＣＲＸ５２７）のＭｙＤ８８依存的シグナル伝達と比較して、化合物（例えば、ＣＲＸ５４７）のＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の低減を言う。好ましい一実施形態において、ＴＲＩＦバイアスは低減したＭｙＤ８８シグナル伝達を提供し、ＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を維持または増加する。他の好ましい一実施形態において、本発明はin vitroで樹状細胞からの有意なレベルのＴｈ１細胞媒介性免疫を指向するサイトカインであるＩＬ−１２を誘発するとともに、大幅に少ない炎症性メディエーターであるＩＬ−２３（炎症性メディエーターのＩＬ−１７とＴＮＦαを産生するＴｈ１７Ｔ細胞の維持を促するサイトカイン）を誘発することによって、ＴＲＩＦバイアスを示す（Wilson et. al.2007）。Ｔｈ１７Ｔ細胞は関節炎、炎症性腸疾患、および多発性硬化症を含めた炎症性自己免疫疾患の発症に結び付けられていた(McGeachy et. al. 2007)。
【００１０】
本発明のいくつかの実施態様を簡単に記載する。
【００１１】
Ｌ−セリルＡＧＰ ＣＲＸ５２７を含有する組成物により誘発されるＭｙＤ８８依存的シグナル伝達のポテンシャルを有意に低減しながら、ＴＬＲ４受容体複合体を介して有意なＴＲＩＦ依存的シグナルを誘発する方法であって、該組成物中のＬ−セリルＡＧＰのＤ−セリル誘導体を置換することを含む、上記方法。
【００１２】
ＴＲＩＦ依存的サイトカインを誘発し、リピッドＡ模倣物アジュバント組成物によりヒト細胞内に誘発されるＭｙＤ８８依存的サイトカインのレベルを低減する方法であって、ヒト細胞にＣＲＸ５４７を投与することを含む、上記方法。
【００１３】
ＣＲＸ５２７の合成Ｄ−セリル誘導体をヒトに投与することを含む、Ｌ−セリルＡＧＰ ＣＲＸ５２７により誘発されたレベルと比べてヒト細胞中のＩＬ−１２ｐ７０とＩＬ−２３をより低いレベルに誘発する方法。
【００１４】
ＣＲＸ５２７により誘発されたＩＲＦ３と同等か高いレベルであるが、有意に低いレベルのNF-κB活性を活性化する方法であって、５２７のＤ−セリルジアステレオマーを投与することを含む、上記方法。
【００１５】
第二合成リピッドＡであるＣＲＸ５４７を投与することを含む、第一リピッドＡ模倣物によるＭｙＤ８８依存的サイトカイン誘発を抑制する方法。
【００１６】
ヒト細胞内での有益なＴＲＩＦ依存的シグナル伝達のアジュバント組成物誘発を向上させる方法であり、アジュバント組成物はＣＲＸ５４７ではないＡＧＰを含有しており、該方法はアジュバント組成物にＣＲＸ５４７を組み込むことを含む、上記方法。
【００１７】
ヒトの免疫反応の向上に使用するＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べてＴＲＩＦ依存的サイトカインは増加し、ＭｙＤ８８依存的サイトカインは減少する、上記組成物。
【００１８】
ヒトで免疫反応を起こすのに使用するＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べて、NF-κB 活性は減少するが、しかし、同等か高いレベルのＩＲＦ３が認められる、上記組成物。
【００１９】
ヒトで免疫反応を起こすのに使用するＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べてＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３のレベルは減少する、上記組成物。
【００２０】
ヒトの免疫反応の起こす際に抗原と合わせて使用するリピッドＡ模倣物アジュバントであり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物アジュバントと比べてＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３のレベルは減少する、上記アジュバント。
【００２１】
本明細書で説明される方法のいずれかにおいて使用するためのＣＲＸ５４７およびＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７ならびにエステル連結脂肪アシル鎖、ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７をもつアミノアルキルグルコサミニド４‐リン酸塩。
【図２】ヒトＰＢＭＣにおける（Ａ）ＭｙＤ８８依存的および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカインおよびケモカインの誘発についての、S. minn. Re595 LPSとリピッドＡ模倣物、ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７の比較。
【図３】S. minn. Re595 LPS, ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７を用いたヒトの単球由来樹状細胞の処理による（Ａ）ＩＬ−１２ｐ７０および（Ｂ）ＩＬ−２３の誘発。
【図４】ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８−ＤＮ）およびＴＲＩＦ（ＴＲＩＦ−ＤＮ）のドミナントネガティブ構築物を発現するプラスミドの形質移入によるヒトマクロファージ細胞株における（Ａ）ＭｙＤ８８および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカインの誘発の抑制。
【図５】エンドサイトーシス阻害剤であるジナソアの存在下でＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、およびＬＰＳによる誘発される（Ａ）ＭｙＤ８８依存的（ＭＩＰ−１α）および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的（ＲＡＮＴＥＳ）サイトカイン/ケモカイン。
【図６】画像ストリームゲーティング法。
【図７】ヒト単球細胞（ＭＭ６）はＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７のいずれかで５分、１５分、３０分、または１２０分間処理し、NFкBの核移行は核染料（ＤＲＡＫ−５）と転写因子の共局在として定量化した。
【図８】huTLR4/huMd-2/huCD14形質移入ＨＥＫ２９３細胞がS. minn. Re595 LPS、ＣＲＸ−５２７、およびＣＲＸ−５４７で処理された時のNF-κB誘導性プロモータ活性の比較。
【図９】ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の存在下での、ＣＲＸ−５２７ならびにＬＰＳによる（Ａ）ＭｙＤ８８依存的および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン誘導の抑制。
【図１０】（Ａ）ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の追加によるＣＲＸ−５２７誘発性 TNFαの抑制（Ｂ）シルド回帰分析はＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の両方のEC50と類似するＣＲＸ−５４７親和性（０．３３ｎＭ）の推定値をもたらす。
【図１１】ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の存在下でのＣＲＸ−５２７およびＬＰＳ ＭｙＤ８８依存性（ＴＮＦα）サイトカイン誘発の抑制。
【図１２】ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の存在下でのＣＲＸ−５２７−誘発性NFкBの核移行の抑制。
【図１３】シグナル伝達活性およびケモカイン誘導に対するＣＲＸ−５２７/ＣＲＸ−５４７の安定性増強修飾の効果。ＬとＤの異性体対ＣＲＸ−５２７/ＣＲＸ−５４７および１ａ/１ｂによる、（Ａ） huTLR4/huMD-2/huCD14-形質移入ＨＥＫ２９３細胞におけるNFкB シグナル伝達と（Ｂ）ヒト単球細胞（ＭＭ６）におけるＭｙＤ８８依存的（ＭＩＰ−１β）誘発の比較。
【図１４】ＣＲＸ−５２７で処理されたヒト一次、ＰＢＭＣ由来単球のウェスタンブロット分析であって、ＴＲＩＦのホスホＩＲＦ３下流の活性化の動態およびレベルの類似、ならびにＣＲＸ−５４７で刺激された細胞よりもＭｙＤ８８のＩＲＡＫ１下流の方がより大きな分解を示す。
【図１５】ＣＲＸ−５２７で処理されたＭＭ６細胞のウェスタンブロット分析であって、ＣＲＸ−５４７で刺激された細胞よりもＭｙＤ８８のＩＲＡＫ４下流の方がより大きな分解を示す。
【図１６】ＬとＤの異性体対、化合物２ａおよび２ｂによる（Ａ） huTLR4/huMD-2/huCD14-形質移入ＨＥＫ２９３細胞におけるNFкB シグナル伝達と（Ｂ）ヒト単球細胞（ＭＭ６）におけるＭｙＤ８８依存的（ＭＩＰ−１β）誘発の比較。
【図１７】ヒト(上段）かマウス（下段）ＴＬＲ４/ＭＤ−２/ＣＤ１４のいずれかで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、およびＬＰＳよるNFкB−依存的プロモータ活性の誘発。
【図１８】同系のヒト/マウスＴＬＲ４/ＭＤ−２またはキメラ 組み合わせ（huTLR4/muMD2またはmuTLR4/huMD-2）のいずれかで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞におけるNFкB−依存的プロモータ活性の誘発。
【図１９】示されたアゴニストで処理されたラビットの体重変化。
【図２０】示されたアゴニストで処理されたラビットの接種後の体温。
【図２１】示されたアゴニストで処理されたDraizeによる注射部位反応。
【図２２】示されたアゴニストを作用させたラビットの注射部位病理組織検査。示されたアゴニストで処理されたラビットの体重変化。
【図２３】0.01uMのＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７で処理後のヒトＰＢＭＣ由来単球における（Ａ）ＭｙＤ８８依存的、および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子発現の誘発。
【図２４】ＣＲＸ−５４７（２ロット）およびＣＲＸ−５２７（実験は一度実施）で試験したＢＡＬＢ/ｃマウスからのＰＢＭＣ。
【図２５】ＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂによるＴＲＩＦ依存的（ＩＰ−１０）の誘発。
【図２６】ＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂによるＭｙＤ８８依存的（ＴＮＦα）サイトカイン/ケモカインの誘発。
【図２７】ＡＧＰおよびそれらのＤ異性体で刺激した４時間後のＴＮＦαレベル。
【図２８】ＡＧＰおよびそれらのＤ異性体で刺激した４時間後のＩＰ−１０レベル。
【図２９】ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＲＸ−５４７およびＣＲＸ−５２７刺激後のシグナル伝達タンパク質のウェスタンブロット分析。
【図３０】安定的に形質移入されたＲＡＷ２６４．７細胞。
【図３１】ＬとＤの異性体で刺激した２０時間後のＩＰ−１０産生（siRNA 細胞株は各試験において無関係な対照と比較）。
【図３２】ＬとＤの異性体で刺激した２０時間後のＩＰ−１０産生（siRNA 細胞株は各試験において無関係な対照と比較）
【図３３】ＬとＤの異性体による刺激の２０時間後のＴＮＦα産生。
【図３４】ＬとＤの異性体による刺激の２０時間後のＴＮＦα産生。
【図３５】ＴＮＦα産生のためにＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂで４時間刺激したＲＡＷ２６４．７ｓｉＲＮＡ細胞株。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
序論
リピッドＡは、膜結合ＴＬＲ/ＭＤ−２ＴＬＲ４受容体複合体に結合しているＬＰＳ分子内の活性、疎水性構造モチーフである。リピッドＡはバクテリア種の間でかなりのばらつきがある。個々のグラム陰性菌は表面上でリピッドＡの構造を調節することが出来き、程度は異なっても炎症になる（Bishop et al. 5071-80; Guo et al. 189-988）。アシル鎖の数と長さおよびリン酸化のパターンの変化が極めて強力なアゴニストからアンタゴニストまでのリピッドＡ分子の活性を変化させることが示されている。（Hawkins, 2002 30067 /id, Stover at al, Seydel et. al. 2000）。ほとんどのＬＰＳ種の毒性はＴＬＲ４受容体複合体に関するリピッドＡ部分との相互作用により決定される（Baker et al. 1992）。アシル鎖の数、長さ、および配置、ならびに荷電基の数および位置における差異はリピッドＡに対する免疫学的応答のレベルと性格の両方に有意に影響することが示されている（Teghanemt et al. 2005, Stover et. al. 2004, Schromm et al. 1998）。さらに、単糖、リピッドＡ模倣物、アミノアルキルグルコサミニド4リン酸塩（ＡＧＰ）とＴＬＲ４アゴニストおよびアンタゴニスト活性とを合わせたライブラリーの設計と合成も記載されている（Stover et al. 4440-49;Persing et al. S32-S37;Johnson et al. 2273-78）。
【００２４】
上記のように、２つの主要なシグナル伝達経路はＴＬＲ４アゴニストによるＴＬＲ４活性化、ＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的経路に沿って記載されている。ＭｙＤ８８依存的シグナルは、２つのＴｏｌｌ/インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプタータンパク質、Ｍａｌ/ＴＩＲＡＰおよびＭｙＤ８８をＴＬＲ４のＴＩＲドメインに連続的または同時的に結合することに依存している（Fitzgeral et. al. 2001）。ＴＲＩＦ依存的シグナルは、ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質、ＴＲＡＭ/ＴＩＣＡＭ−２およびＴＲＩＦ/ＴＩＣＡＭ−１がＴＬＲ４−ＴＩＲドメインに連続的または同時的に結合をすることを要求する（Rowe et al. 6299-304;Yamamoto et al. 1144-50）。２つの経路とも先天および適応免疫の連結に関係している（Kawai et. al. 2001, Kaisho et al. 2001）。
【００２５】
リピッドＡ−レセプター相互作用の下流、特定のＴＬＲ４依存的シグナル伝達経路、（ＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的経路）は受容体結合に対する細胞応答を決定する。ＭｙＤ８８依存的シグナルは、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターの合成と分泌により特徴づけされる炎症反応を促す（Huang et. al. 2004）。ＭｙＤ８８依存的経路を介するシグナルは、初期のNF-κB 活性化および腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカイン、インターロイキン（ＩＬ）−１β およびＭＩＰ−１αなどのケモカインの放出を誘発する。
【００２６】
ＴＲＩＦ依存的シグナルは、１型ＩＦＮなどの免疫仲介物質、一部のＩＬ−１２ファミリーメンバーおよび樹状細胞成熟を誘発しＴ−細胞成熟に影響するケモカインの産生を促す。ＴＲＩＦ依存的経路を介したシグナルは、ＭｙＤ８８経路を介するシグナルよりもNF-κB の活性化(Hoebe et al. 743-48)を低下させ、遅らせ、しかしより維持しながら、インターフェロン調節因子である（ＩＲＦ）−３およびＩＲＦ−７の活性化と核移行を誘発する(Kawai et al. 5887-94)。ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７の活性化はＩＦＮβの転写および続く細胞外放出を駆動する。次にＩＦＮ−α/β受容体へのＩＦＮβのオートクリンまたはパラクリン結合は、ＪＡＫ/ＳＴＡＴ経路を活性化することでＩＦＮαとＩＦＮβ、ならびに、インターフェロン誘導性タンパク質―１０（ＩＰ−１０）、活性化正常Ｔ細胞における発現および分泌調節性（ＲＡＮＴＥＳ）、およびマクロファージ走化性タンパク質‐１（ＭＣＰ−１）などのＩＦＮ−誘導性ケモカインの発現が高まる(Yamamoto et. al. 2003, Kawai et. al. 2001, Serbina et. al. 2003)。
【００２７】
大部分のＡＧＰはＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的経路を介して情報伝達する。近年、特異で興味深いＤ−セリルＡＧＰ、ＣＲＸ−５４７がＴＲＩＦ依存的経路を介して大部分を情報伝達することが示された。このことは、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的経路を刺激する立体異性体であるＬ−セリルＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７とは対照的である。ＴＲＩＦ依存的経路がＩ型インターフェロンの産生を生じる一方で、ＭｙＤ８８経路が炎症性サイトカインの誘発と関連するのでＴＲＩＦ経路の使用およびＭｙＤ８８経路の回避が、例えば、アジュバントとして使用される時のＴＬＲ４アゴニストの有効性および安全性の両方に影響し得る。ＭｙＤ８８依存的シグナルの相対的減少が安全性改善（炎症の誘発低下）し、従って、Ｌ−セリル異性体と比較してＤ−セリル異性体の治療係数を向上させる一方で、ＴＲＩＦシグナルの相対的な増加は増強された細胞媒介性免疫を生じ得る。
【００２８】
用語
別途説明されないかぎり、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、この開示が属する技術分野の技術者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。分子生物学における一般的な用語の定義は、Oxford University Press, 1994に出版されたBenjamin Lewin, Genes V(ISBN 0-19-854287-9); Blackwell Science Ltd., 1994に出版されたKendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology(ISBN 0-632-02182-9);およびVCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)により出版されたRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Referenceに見出されうる。
【００２９】
単数形「1つの(a)」、「ある(an)」、および「その(the)」は、文脈において特記されない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、用語「または」は、文脈において特記されない限り、「および」を含むものとして使用される。用語「複数」は２つまたはそれ以上をいう。核酸またはポリペプチドについて与えられる場合、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値は近似であり、説明のために提供されることが、さらに理解されるべきである。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して行なわれた数値限定は近似を示している。従って、濃度が少なくとも（例えば）２００ｐｇとされた場合、濃度は少なくとも近似的に（または「約」または「〜」）２００ｐｇであると理解されることを意図している。
【００３０】
ここに記載のものと類似または同等の方法及び物質が、この開示において実用的または試験的であることが可能ではあるが、適切な方法および物質が以下に記載されている。「含む」とは「含有する」を意味する。従って、その状況が他のことを要求していない限り、用語「含む（comprises）」、および「含む（comprise）」と「含んでいる（comprising）」などの変法は明示された化合物または組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）、もしくは、いかなる他の化合物、組成物、ステップ、もしくはそれらの群を排除することなく、ステップ、または化合物もしくはステップの群が含まれることを意味するものと理解されるべきである。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定な例を示すのに使用される。従って、略語「ｅ．ｇ．」は、「例えば（for example）」と同じである。
【００３１】
「リピッドＡ模倣物」は、ＴＬＲ４受容体（例えば、ＭＰＬとＡＧＰ）を介して、ＴＲＩＦ情報伝達および/またはＭｙＤ８８情報伝達を誘発するＴＬＲ４リガンドである。
【００３２】
「ＴＲＩＦバイアス」とは、一の化合物によるＭｙＤ８８依存的シグナル伝達のレベルが、他の化合物によるものよりも低いことをいう。
【００３３】
本開示の様々な実施形態の審査を容易にするために、以下の説明を提供する。さらなる用語と説明を本開示の文脈において提供することもできる。
【００３４】
アミノアルキルグルコサミニド４‐ホスフェート
簡単に述べると、セリルＡＧＰ ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７は、リピッドＡの還元性糖類がアミノアルキルＬ−またはＤ−セレンベース単位で置換され、かつ、１０炭素の正常な脂肪アシル鎖を含む３つの（Ｒ）−３−ｎアルカノイルオキシテトラデカノイル残基を有する、リピッドＡ模倣物のクラスである。ＡＧＰは、ヒドロキシルとアミノ基の化学的識別および（Ｒ）−３−ｎアルカノイルオキシテトラデカノイル残基の連続的導入ができる高度な収束手法により以前に記載されているように調製する。(Bazin et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008 18, 5350; Johnson et al Bioorg. Med. Chem. Lett 9 1999 2273; Patent PublicationWO 04/005308を参照)。セリルＡＧＰはシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（純度 >95%）で精製し、標準的な分析法でトリアルキルアンモニウム塩として分析する。
【化１】
【００３５】
また、図１にはＣＲＸ５２７とＣＲＸ５４７が示されており、以前に合成され記載がされている(U.S. Patent No. 6,113,918; Examples 15 and 16, and WO 2006/012425 WO 2006/016997を参照)。ＣＲＸ５３７の場合に比べて、ＣＲＸ５４７の構造的な相違がアグリコンカルボキシル基の位置に影響を与える。この差異が荷電カルボキシル基のＴＬＲ４受容体複合体との相互作用に影響を与え得る。ＬＰＳ模倣物がＭＤ２を介してＴＬＲ４受容体複合体との相互作用をすることが以前に示され(Ohto et. al. 2007)、従って、ＣＲＸ５４７とＣＲＸ５２７のジアステレオマ間の差異がＭＤ−２またはＴＬＤ４をともないカルボキシル基、リピッドＡリン酸バイオアイソスターの相互作用を阻害する可能性がある。次に、受容体の二量体化、またはそれに代えてＭｙＤ８８と下流シグナルの結合を推進する細胞内コンフォメーション変化を阻害するかもしれない。おそらくは、この阻害または変化はＴＲＩＦ依存的シグナルを排除しない。
【００３６】
最近公表されたヒトTR4/MD-2/lipidIVa (Ohto et al. (2007) Science. 316:1632) およびヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２／Ｅｒｉｔｏｒａｎ受容体の結晶構造は、リピッドＡ模倣物の還元性糖類の１つにおけるある位置のリン酸基がリピッドＡのためのＭＤ２疎水性結合ポケットの出口近くにある荷電基と相互作用をすることを示唆している。第２ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体と合わせＴＬＲ４／ＭＤ−２二量体化の構造モデル(Kim et al. 906-17;Walsh et al. 1245-54) は、ＭＤ−２/リピッドＡ複合体の表面がダイマーパートナーのＴＬＲ４と相互作用し得ることを示唆する。シグナル伝達の差異を誘発し得る偏左右異性ＣＲＸ５４７が阻害する可能性がある一方でＣＲＸ５２７の生物的等配電子体カルボキシル基がこれらの相互作用を維持し得る。
【００３７】
試験をしてみるとＭＰＬはＣＲＸ５４７と同様のＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的シグナルのパターンを示し、同時に、ＭＰＬはＣＲＸ５４７における構造的な変化に影響を受ける同じ位置でのリン酸を欠失する。従って、ＭＰＬとＣＲＸ５４７は、実質的なＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の非存在化でＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を誘発する共通の機序を共有し得る。
【００３８】
材料および方法
本明細書に記載された材料および方法は、後述する実施例の実施において有用である。
【００３９】
細胞株および試薬
ヒトＴＬＲ４、ＭＤ−２、およびＣＤ１４発現ＨＥＫ２９３細胞株、NF-κB/LacZリポーター・プラスミド、ドミナントネガティブＭｙＤ８８発現（pDeNy-hMyD88）および ドミナントネガティブＴＲＩＦ発現（pDeNy-hTRIF）プラスミド、LyoVecトランスフェクション試薬およびS. minnesota 由来のウルトラピュアRe595 LPS は InvivoGenから得ることができる。ヒト単球／マクロファージ細胞株、ＴＨＰ−１はＡＴＣＣから得ることができる。ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬はRocheから得ることができる。InvivoGen (San Diego, CA)から得たHEK293-hTLR4/hMD2/hCD14細胞は、 RPMI 1640 (ATCC) の中で10% FBS (Hyclone)、10 μg/mL ブラスチシジン、50 μg/mL HygroGold (InvivoGen)とを使って培養する。ＴＨＰ−１細胞はＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ）の中で10% FBS (Hyclone)、100 U/mL ペニシリン/100 ug/mLストレプトマイシン（Sigma）とを使い培養する。
【００４０】
初代ヒト細胞培養
末梢血単核球（PBMC）はフィコール・ハイパック1.077 勾配を介して健康なドナーの血液から単離し、アゴニストで処理され、かつ、述べたように単球溶媒 (RPMI 1640 (ATCC)、１０％ヒトＡＢ血清(Lonza/BioWhittaker), 100 U/mL ペニシリン/100 ug/mL ストレプトマイシン（Sigma）、50 uM 2-メルカプトエタノール (Sigma) 内で付着単球を単離するのに使われる(Stover et al. 4440-49;Kawai et al. 5887-94;Gervassi et al. 7231-39)。単球由来マクロファージは、アゴニストを作用させる前に３日目と５日目に溶媒を交換し50 ng/mL rhM-CSF (R&D Systems) を用いて単球溶媒中で付着単球を５日間インキュベートして産生した。単球由来樹状細胞は、３日目と６日目に溶媒を交換し 10 ng/mL rhGM-CSFおよび10 ng/mL rhIL-4 (R&D Systems)を用いて単球溶媒中で付着単球を７日間インキュベートして産生した。
【００４１】
NFkB核移行
指数増殖におけるMonoMac6細胞は、示された時間にて、２％グリセロール媒体で希釈したＡＧＰの濃度を上昇させて刺激した。直ちに固定化した細胞（２％パラホルマリンで一晩）は、膜透過処理液緩衝液 (PBS, 2%FBS, 0.1% TritonX)中で一次抗体であるanti-NFκB(p65) (SantaCruz Biotechnology, SantaCruz, CA)およびanti-IRF3 (BD Biosciences, San Jose, CA)で染色し、その後、二次抗体であるanti-Rabbit FITC (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), anti-mouse PE (BD Biosciences, San Jose, CA)で染色した。核染色 DRAQ5 (Alexis Biochemicals (San Diego, CA) )を用いたシグナル伝達たんぱく質の局在化の類似度スコアは、すでに述べたように核移行の画像ストリーム解析に使用される（George, 2006 32669 /id）。最小限の３，０００個の細胞が各試験の条件で採取され解析される。
【００４２】
ドミナントネガティブMyD88およびTRIF
１２ウェルプレート(5 × 105 cells/well)中にＴＨＰ−１細胞を播種し、マクロファージへと分化させるために100 U/mL ペニシリン/100 ug/mL ストレプトマイシン(Sigma)、 20 ng/mL phorbol mystyric acid (PMA) (InvivoGen) を使い、 0.5 mL RPMI 1640 (ATCC) 中でインキュベートした。ＴＨＰ−１が分化した後、溶媒を5 ng/mL PMA でＴＨＰ−１溶媒に変更し、ならびに、細胞は、４８時間、pDeNy-hMyD88/LacZ、またはpUNO-mcs (control)/LacZ プラスミドおよびＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬の0.5 μg/well で一過的に形質移入した。溶媒は新鮮な溶媒に交換して、その後１４時間表示した濃度のＴＬＲ４アゴニストで刺激した。回収した上清はLuminexプラットフォームを用いて、マルチプレックスサンドイッチELISA (R&D Systems) によりサイトカインのレベルをアッセイした。対照ウェルは Invivogen LacZ Quantitationキットを用いて、トランスフェクション効率をアッセイした。
【００４３】
MyD88およびTRIF (MAL/TRAM)のsiRNAノックダウン
指数増殖するRAW264.7 細胞は、タンパク質ノックダウンのためのshRNA 配列、Zeocin抵抗性遺伝子およびＧＦＰコード配列 (InVivoGen, San Diego, CA)を含む、psiRNA-mTICAM1, psiRNA-mMyD88,またはpsiRNA-LUC (無関係な対照) プラスミドを使い、Optimem (Roche, Indianaopolis IN) の既存の方法によりＦｕＧＥＮＥ６で安定的に形質移入した。選択した後のトランスフェクション効率は、画像ストリームを用いてGFP陽性細胞の割合で決定する。
【００４４】
HEK293トランスフェクション
１２ウェルプレート（4 x 105 cells/well)中にHEK293-hTLR4/hMD2/hCD14細胞を播種し、４０％〜６０％コンフルエントになるまで（２〜３日間）培養した。細胞を、５か所のNF-κB部位 (pNiFty2-SEA-InvivoGen; San Diego, CA)およびチミジンキナーゼプロモータ駆動ルシフェラーゼ (Promega)を構成的に発現するトランスフェクション コントロールプラスミドを用いて、遺伝子組換えＥＬＡＭプロモータの制御下で分泌されたヒト胎児アルカリホスファターゼを発現する NF-Bレポーター構築物の100 ngを使用して２４時間、形質移入した。プラスミドは、QiagenのEndofree Maxiprepプラスミドキットで調製された。トランスフェクション後、細胞は１４時間、ＴＬＲ４アゴニストで刺激し清澄した上清は、 NF-кB活性化を定量するＳＥＡＰ活性についてアッセイして(SEAP Reporter Assay Kit-InvivoGen)、NF-кB活性化およびルシフェラーゼ活性 (Promega)および供給されたプロトコールに従ってトランスフェクション効率を基準化する。
【００４５】
エンドサイトーシスに対するＣＲＸ−５４７シグナル伝達の依存性：ジナソア阻害
分化したＴＨＰ−１マクロファージ (20 ng/mL PMAを用いて48-ウェルプレート内に5E5/ウェル)は、無血清ＴＨＰ−１溶媒中で６０分間エンドサイトーシスに対する低分子阻害剤であるジナソア10 uMで予め処理した。アゴニストの指定濃度で８時間、刺激する前に溶媒は０．４５ｍＬのＴＨＰ−１溶媒に変更する。上清は採取され、Luminexプラットフォームを用いてマルチプレックスサンドイッチELISA (R&D Systems) によりサイトカイン/ケモカイン解析の前に８０℃で貯蔵される。
【００４６】
ウェスタンブロット法
ウェスタンブロットおよびリン酸―ウェスタンブロットタンパク質解析では、細胞はCell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) と併せた Protease Inhibitor Cocktail (Sigma, St. Louism MO)で溶解する。標準的な方法を使ってPVDF膜 (Millipore) 上でウェスタンブロットを実施する。バンドはECL Advance Western Blot kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ)で検出する。二次Anti-Rabbit HRP抗体はKPL, (Gaithersburg, MD)から得ることができる。Anti-β actin, anti-IRF-3, anti-phospho-IRF-3 (Ser396)およびanti-IRAK1抗体は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から得ることができる。
【００４７】
マウスの血清サイトカイン/ケモカインの誘発
実験開始時の年齢は７週から９週である雌のBALB/cまたはC57Bl/6マウスをCharles River Laboratories, USAから入手した。賦形剤 (0.2%グリセロール) に200 uL のアゴニストまたは賦形剤単独でマウスに腹腔内注射した。血清試料は注射２時間または６時間後に取り出され、Luminexプラットフォームを用いて、マルチプレックスサンドイッチELISA (Invitrogen) によりサイトカイン/ケモカインの誘発に関する試験をした。Public Health ServiceおよびInstitutional Animal Care and Use Committee at GlaxoSmithKline Biologicals, Hamilton, Montanaが確立したガイドラインに従ってすべての動物を用いる。
【００４８】
ウサギを用いた毒性試験
３匹のウサギの群(NZW−Western Oregon Rabbit Company, Philomath, OR)は０日、７日、１４日目に１ｍＬの希釈したＡＧＰ，またはＭＰＬコントロールをＩＭで接種した。ＡＧＰの２つの投与が評価される。体重、体温、臨床症状およびDraizeスコア について全ての動物をモニターする。これらの動物は最終投与後一週間で屠殺する。血液学分析と臨床化学検査のため処理前、第２回接種後２日目、および犠牲にした時に血液を採取する。注射部位および主要臓器の病理組織検査を標準的な治療法で実施する。Public Health ServiceおよびInstitutional Animal Care and Use Committee at GlaxoSmithKline Biologicals, Hamilton, Montanaが確立したガイドラインに従ってすべての動物を用いる。
【実施例】
【００４９】
実施例１
Ｌ−異性体（ＣＲＸ５２７）との比較における合成リピッドＡ模倣物（ＣＲＸ５４７）のＤ−異性体投与による類似したレベルのＴＲＩＦ依存的サイトカイン、一方さらに低いレベルのＭｙＤ８８依存的サイトカイン
ヒトの新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)からのサイトカイン誘発に対するS. minnesota Re595 LPS, CRX-547およびCRX-527の影響を比較した場合、ＣＲＸ−５２７とＬＰＳは類似したレベルのサイトカインTNFα およびケモカインMIP-1α （図２Ａ）を誘発する。または、ＣＲＸ−５４７は有意に低いレベルのTNFαとMIP-1αを誘発するが、ケモカインＩＴ−１０とＲＡＮＴＥＳは同程度であった（図２Ｂ）。
【００５０】
TNFαとMIP-1αの発現はＴＬＲ４アダプターであるＭｙＤ８８を介したシグナル伝達に依存する一方でＩＰ−１０とＲＡＮＴＥＳの発現はＴＬＲ４アダプターであるTRIF/TICAM-1を介したシグナル伝達に依存する(Hoebe et al, Kawai et al)。ヒトの新鮮な全血、培養ヒト単球、ヒト単球由来マクロファージ、およびヒト単球由来樹状細胞における同じ組み合わせのＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発についてアゴニストを比較した場合、類似のパターンが認められる（データを示さず）。
【００５１】
実施例２
ＣＲＸ−５４７は、単球由来樹状細胞におけるより低いレベルのＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３を誘発する。
【００５２】
炎症性サイトカインの誘発および樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、アジュバントワクチンを投与する間、強い免疫反応を高めることに寄与する。従って、ヒトＤＣにＩＬ−１２ｐ７０を誘発するＣＲＸ５２７とＣＲＸ−５４７の能力を比較する。ＩＬ−１２ｐ７０の誘発はTh1ヘルパーT細胞系列の発達を促し、細胞媒介性免疫応答を促す(Goriely, Neurath, and Goldman 81-86;Gutcher and Becher 1119-27)。IL-12p70 の発現がＭｙＤ８８およびＴＲＩＦシグナル依存であると示されたので(Goriely, Neurath, and Goldman 81-86)、ＣＲＸ５４７処理に対するＤＣ応答が消失するか否かが確認される。ＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと比較した場合有意に減少しているが、ＣＲＸ−５４７はヒト単球由来ＤＣからのＩＬ−１２ｐ７０応答を誘発し得る（Error!Reference source not found.３Ａ）。
【００５３】
または、ＤＣにおける炎症性メディエーターであるＩＬ−２３の発現は全面的にＭｙＤ８８依存的である (Re and Strominger 37692-99;Goriely, Neurath, and Goldman 81-86)。樹状細胞のＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７処理によるＩＬ−２３の誘発を比較した場合、ＩＬ−２３発現は事実上ＣＲＸ−５４７処理細胞におけるベースラインまで下がる（Error!Reference source not found.３Ｂ）。
【００５４】
実施例３
サイトカイン誘発のＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存性
ドミナントネガティブ変異体構築物の発現がＭｙＤ８８を介するシグナル伝達を抑制するのに使われる場合、ＭｙＤ８８依存的サイトカインであるTNFαのＣＲＸ−５２７での誘発は有意に減少し、ＴＲＩＦ依存的サイトカインであるＲＡＮＴＥＳの誘発はほんの僅か減少する一方で、ＭｙＤ８８依存的サイトカインのＣＲＸ−５４７誘発はＭｙＤ８８のノックダウンにより影響を受けない（[066]４Ａ）。
【００５５】
または、ＴＲＩＦの発現を同様の方法を用いてノックダウンさせた場合に、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の両方によるＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発は同様の程度減少する（[066]４Ｂ）。
【００５６】
また、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７のMyD88/TRIF シグナル伝達特異性は、エンドサイトーシス依存性により区別し得る。最近、２つのグループ(Kagan et al. 361-68;Tanimura et al. 94-99)が、ＴＬＲ４受容体複合体の内部移行後にＴＬＲ４のＴＲＩＦ依存的シスシグナル伝達下流がエンドソーム／リソソームから開始される一方でＴＬＲ４のＭｙＤ８８依存的シスシグナル伝達下流は細胞膜から開始することを報告した。Kaganらは、エンドサイトーシス阻害剤のDynasoreを使ってＭｙＤ８８依存的サイトカインではなくＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発が抑制されることを示した。従って、以下に示されるようにDynasoreは、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７によるサイトカイン/ケモカイン誘発のＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存性を比較するのに使われる。
【００５７】
Dynasoreを用いたエンドサイトーシスの抑制によりヒトＰＢＭＣ由来マクロファージにおけるＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦ依存的ＲＡＮＴＥＳ誘発を抑制する一方で、未処理細胞と比べてＭｙＤ８８依存的MIP-1αの誘発は僅かに増加する。これらの結果は、ＴＬＲ４の下流のＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦ依存的サイトカイン誘発は、エンドサイトーシス後の同様のシグナル伝達機序により起こることを示唆している。
【００５８】
実施例４
ＣＲＸ−５４７はＣＲＸ−５２７と比べた場合、有意に低いレベルのNFκB の核移行および転写活性の誘発し、同等かまたはそれ以上に高いレベルのＩＲＦ−３核移行を誘発する。
【００５９】
TNFαおよびIL-1βを含めた多くの炎症性サイトカインの発現は、NFκBの活性化および核移行に依存する。ＴＬＲ４受容体複合体のＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的シグナル伝達下流の両方が、転写因子であるNFκBの活性化および核移行を誘発する。しかしながら、ＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を介してNFκB活性化が後で誘発され、かつ、それはＭｙＤ８８依存的シグナル伝達を介する活性化と比べてかなり低い程度である(Yamamoto et. al. 2002)。
【００６０】
インターフェロン応答因子−３（ＩＲＦ−３）は、ＴＲＩＦ依存的ＴＬＲ４シグナル伝達経路の下流で活性化する転写因子である(Yamamoto et al. 640-43)。ＩＲＦ−３リン酸化により、ＩＲＦ−３の二量体化、核移行、ならびにＩ型インターフェロン(IFNβ)およびインターフェロン誘導性遺伝子の転写の誘発を生じる(Honda, Takaoka, and Taniguchi 349-60;Tailor, Tamura, and Ozato 134-40)。画像ストリームは、ラベルした転写因子と核特異的染料（ＤＲＡＫ−４）で染色された細胞核の共局在の定量化によりNFκBとIRF-3の両方の核移行を測定できる(Beum et al. 90-99;George et al. 117-29;Arechiga et al. 7800-04)。
【００６１】
ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７により開始したシグナルを比較するために、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７の処理によるNFκBおよびIRF-3の核移行の誘発は、画像ストリーム解析を用いてヒト単球細胞株であるMonoMac6 (MM6) において比較した。Error!Reference source not found.６は、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７で刺激されたＭＭ６細胞のゲーティングストラテジーを示す。
【００６２】
ＣＲＸ−５４７と比べると、ＣＲＸ−５２７はより初期のNFκB 核移行（刺激後、早ければ５分後）を誘発する。ＣＲＸ−５４７活性で誘発されるNFκB 核移行は、ある特定閾値（この場合は５０%前後）以上には決して達しない一方で、ＣＲＸ−５２７による刺激では３０分でほぼ１００％のNFκBが核移行する（Error!Reference source not found.７）。ＡＧＰのいずれも投与量依存的に機能するように見える。ＣＲＸ−５３７であるかＣＲＸ−５４７であるかの刺激に関わらず、高いバックグラウンドレベルのIRF3核移行が存在し、これはＴＲＩＦを介したシグナル伝達を示唆する（データは示さず）。初期のNFκB活性はＭｙＤ８８シグナル伝達パターンを示しているので、このデータはＣＲＸ−５２７はＭｙＤ８８を介して情報伝達するがＣＲＸ−５４７はＭｙＤ８８シグナル伝達の誘発において作用が弱いことを示す。
【００６３】
ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７での核移行の差異が転写活性化の上昇と言い換えられることを確認するために、ヒトTLR4, MD-2, CD14およびNFкBレポタープラスミドで形質移入したHEK293 細胞内でのＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７誘発NFκB活性化を比較する。核移行アッセイにあるようにＣＲＸ−５２７およびＬＰＳは、ＣＲＸ−５４７と比べて NF-κB プロモータの有意に高い活性化を誘発することが示されている（（Error!Reference source not found.８）。
【００６４】
実施例５
ＣＲＸ−５４７はＣＲＸ−５２７によるＭｙＤ８８依存的サイトカイン誘発を抑制する。
【００６５】
ＣＲＸ−５２７は、サイトカインおよびケモカインを誘発する転写因子の活性化に導くTLR4/MD2受容体複合体を介して情報伝達する。固定濃度のＣＲＸ−５２７またはＬＰＳを添加する前に、ＣＲＸ−５４７の濃度を高めて一次ヒト付着単球に添加した場合、ＭｙＤ８８依存的サイトカインであるTNFαの誘発は抑制される一方で、ＴＲＩＦ依存的ケモカインであるＭＣＰ−１の誘発は、より高い濃度のＣＲＸ−５４７にて相加的に増大する（Error!Reference source not found.）。TNFα 誘発を抑制するのに必要なＣＲＸ−５４７の濃度はＣＲＸ−５２７およびＬＰＳの固定濃度と同じ範囲にあり、これはＣＲＸ−５４７がＴＬＲ４複合体への結合についてＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと競合し得るが、結合時のＴＲＩＦ経路を介したシグナル伝達を主として誘発することを示唆する。
【００６６】
ＣＲＸ−５４７は、単球細胞におけるＴＬＲ４のＭｙＤ８８依存的サイトカイン/ケモカイン下流の誘発に対して、ＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと比較して部分的アゴニストであるように見えるので、単球細胞をＣＲＸ−５２７で処理した場合にＣＲＸ−５４７を含ませることはサイトカイン/ケモカイン誘発を抑制し得るし、ＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦ選択的シグナル伝達の作用メカニズムについて洞察を与える。この目的のために、一次ヒト単球をＣＲＸ−５４７の増加濃度下でＣＲＸ−５２７の用量範囲内で処理する。
【００６７】
得られる用量反応曲線は４−パラメーターロジスティック方程式に適合する。図１０Ａは、ＣＲＸ−５２７誘発TNFαについての容量反応曲線に対する 0 uM、0.000016 uM、0.004 uM、および0.1 uMのCRX-547の効果を示す。
【００６８】
部分的アゴニストとして予測されていたように、ＣＲＸ−５４７の濃度の増加により、TNFα誘導曲線をＸ軸に沿ってシフトする一方で、当該曲線の基礎レベル（下位の漸近線）が、ＣＲＸ−５２７の非存在下におけるＣＲＸ−５４７の反応レベルまで増加する。ＣＲＸ−５４７の濃度の対数に対してのＣＲＸ−５４７の各濃度についての対数 EC50 移動（ＤＲ−１）をプロットする（Ｓｃｈｉｌｄ回帰）と、ＣＲＸ−５４７およびＣＲＸ−５２７の用量応答曲線から計算したＣＲＸ−５４７についてのEC50 と、計算による親和性(Kbapp)とを比較することができる。この値は、ＣＲＸ−５４７の親和性がＣＲＸ−５４７のとＣＲＸ−５２７の両方のEC50 値に近づくことを確認し、ＣＲＸ−５４７はＴＬＦ４受容体複合体での結合とＭｙＤ８８依存的シグナル（TNFα 誘発を生む）について効果的にＣＲＸ−５２７と競合することを示唆している（図１０Ｂ）。
【００６９】
同様に、図１１は、ＣＲＸ−５２７またはＬＰＳの固定濃度を添加するとともに、ＣＲＸ−５４７の濃度を高めて一次ヒト付着単球に添加した場合、ＭｙＤ８８依存的サイトカインであるTNFαの誘発は抑制されることを示している。TNFαの誘発を抑制するのに必要とされるＣＲＸ−５４７の濃度はＣＲＸ−５２７およびＬＰＳの固定濃度(100 nM)と同じ範囲 (IC50CRX-527: 48±30 nM/IC50LPS: 18±12) であり、これはＣＲＸ−５４７がＴＬＲ４複合体との結合においてＣＲＸ−５２７とＬＰＳと競合することを示す。
【００７０】
ＣＲＸ−５４７が、一定のＣＲＸ−５２７で処理された細胞におけるNFκB核移行を拮抗するかを決定するために、ＣＲＸ−５４７の投与を増やしつつＭＭ６細胞を２０分、３５分および２時間刺激する（図１２）。同時にＡＧＰが添加された時にはＣＲＸ−５４７は、最大値の投与量のＣＲＸ−５２７で誘発されたNFκB核移行を拮抗した。ＣＲＸ−５４７が一定であり、ＣＲＸ−５２７でスパイクされた場合、ＣＲＸ−５２７刺激はＣＲＸ−５４７単独でのNFκB核移行の最大作用を克服できる。このデータは、ＣＲＸ−５４７とＣＲＸ−５２７はＴＬＲ４受容体複合体での結合について競合しＭｙＤ８８依存的シグナル伝達を抑制することを示す。
【００７１】
実施例６
ヒトＴＬＲ４の明らかなＴＲＩＦバイアスアゴニズムを持つＣＲＸ−５４７の類似体
ＡＧＰファミリーの中の類似体を評価するために、類似パターンのサイトカイン/ケモカイン誘発について、化合物を試験する。エステル連結二次アシル鎖を持つ、セリルＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７のＬとＤの異性体対を、エーテル連結二次アシル鎖、化合物１ａおよび１ｂ（Error!Reference source not found.１に示す化合物）、リード候補ＡＧＰの潜在的安定性強化修飾を持つセリル類縁体と比較した。興味深いことに、１ｂにおいて、分子を修飾してエステル結合二次アシル鎖ではなくエーテル結合二次アシル鎖を有することにより、、ＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の誘発についてＬ異性体に比べてＤ異性体において実質的な有効性を回復する（図１３）。エーテル結合Ｄ異性体によるＭｙＤ８８有効性救済の機序的な根拠は不明である。
【００７２】
実施例７
ＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７で、またはＣＲＸ−５２７もしくはＣＲＸ−５４７で刺激されたＭＭ６で刺激された一次ヒト単球のリン酸―ウェスタンブロット解析
セリン/トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫ−１の分解はＭｙＤ８８依存的ＴＬＲ４シグナル伝達の下流で起こる一方で、ＴＲＩＦ依存的ＴＬＲ４シグナル伝達はＩＲＦ−３活性化を起こす(Yamamoto et al. 6668-72;Yamamoto et al. 640-43)。一次ヒト単球は示された時間、ＣＲＸ−５４７かＣＲＸ−５２７のいずれかで刺激され、細胞分解溶解物をＭｙＤ８８経路―活性化キナーゼ、ＩＲＡＫ−１およびＴＲＩＦ経路―活性化転写因子ＩＲＦ−３（リン酸―ＩＲＦ−３および総ＩＲＦ−３）のレベルについて、ウェスタンブロットにて解析する。β−アクチンの値はローディング対照として使用される。ＣＲＸ−５２７で刺激した単球はＩＲＡＫ−１が急激に減少する一方で、ＣＲＸ−５４７で刺激した細胞ではこのタンパク質の分解の遅れ、減少が示された（Error!Reference source not found.４）。
【００７３】
ＴＬＲ４連結後のＭｙＤ８８対ＴＲＩＦシグナル伝達におけるＭＡＰＫシグナル伝達分子の役割は複雑である。なぜなら、ｐ３８が両方の経路に関係しているからである。しかしながら、ｐ３８リン酸化のＴＲＩＦ経路のインディケータとしての役割は文献に示されている。ＬＰＳ刺激の後のｐ３８のリン酸化はＴＲＩＦ-/- マウス由来のマクロファージ内で減少する一方で、ＴＲＩＦ+/+ マクロファージはｐ３８の持続性リン酸化を示し、これはＴＬＲ４連結後のＴＲＩＦがｐ３８のリン酸化状態の維持に役割をはたすことを示唆した(Thomas et al. 31119-30)。ｐ３８のリン酸化状態がＣＲＸ−５２７対ＣＲＸ−５４７での刺激後に異なることを決定するために、ＭＭ６細胞からの細胞分解溶解物をウェスタンブロット解析する。活性化の類似した動態を示したが、ＣＲＸ−５４７と比較した場合のＣＲＸ−５２７の刺激はｐ３８のリン酸化状態を僅かに増加させる（図１５）。
【００７４】
ＭＡＰＫ経路および下流の転写因子はＴＬＲアゴニストにより別個に調節される。ＩＲＡＫ４およびIκBαの分解はＴＬＲ４シグナル伝達後のＭｙＤ８８を示す一方で、ＴＲＩＦ媒介性ＴＬＲ４シグナル伝達はＩＲＦ３活性化を起こす(Yamamoto et al. 6668-72;Yamamoto et al. 640-43)。ＭＭ６は示された時間、ＣＲＸ−５２７かＣＲＸ−５２７(10ng/ml) のいずれかにより刺激される。細胞分解溶解物は採取されβ−アクチンをローディング対照として使用してＭｙＤ８８経路タンパク質、リン酸―IκBα、総IκBα、ＩＲＡＫ４，およびＴＲＩＦ経路タンパク質、リン酸−ｐ３８、総ＩＲＦ３およびリン酸ＩＲＦ３のウェスタンブロット解析が実施される。ＣＲＸ−５２７で刺激したＭＭ６細胞では総IκBαおよびＩＲＡＫ４が急激に減少した一方で、ＣＲＸ−５４７で刺激した細胞はＭｙＤ８８誘発シグナル伝達タンパク質両方の分解は遅れるか、少ない。ＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達タンパク質、リン酸―ｐ３８、総ｐ３８、ＩＲＦ３およびリンーＩＲＦ３においては、これらの２つのＡＧＰの違いは僅かであると認められる。
【００７５】
実施例８
マウスにおけるＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的シグナル伝達の評価
一次ヒト細胞の結果とは対照的に ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈投与した後ＣＲＸ−５４７はマウス血清中に同様のレベルのＭｙＤ８８依存的サイトカインを誘発する。この反応がＢＡＬＢ／ｃマウスに特異的でないことを確認するために、Ｃ５７／ＢＬ／６マウスにおいて血清サイトカイン誘発の同様の試験を実施する（Error!Reference source not found.）。ＢＡＬＢ／ｃマウスに認められる場合と比べて、選択したサイトカインについてＣＲＸ−５４７による相対的な誘発は僅かに小さいが（示していない）、動態（投与後２時間または６時間で誘発）およびサイトカイン誘発の強度はＭｙＤ８８依存的 (TNFα, IL-10) およびＴＲＩＦ依存的(RANTES, IP-10, MIG) サイトカイン/ケモカインについてはＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７と類似している。さらに、関心がもたれているものは、試験されたＭｙＤ８８依存的サイトカインの誘発が投与後６時間よりも２時間において常に高い値である一方で、ＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発は各アゴニストの６時間で高く、これは二つの経路を介したサイトカインの誘発の異なる動態を示唆する。この現象は、多くのＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発について従来から認められている初期のIFNβ誘発およびオートクリン／パラクリン活性の必要性(Perry et al. 407-22)、または、エンドサイトーシスの必要性によるＴＲＩＦ依存的シグナルの遅れ(Kagan et al. 361-68)で説明できる。
【００７６】
ＬおよびＤ異性体ＡＧＰによるin vitroにおけるＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン/サイトカイン誘発を試験したいくつかの実施例（下記の実施例１２-１４を参照）。マウスPBMCでのサイトカイン誘発、マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7でのサイトカイン誘発、および muTLR4/muMD2―形質移入HEK293細胞での NFкB活性誘発を含む各ケースにおいて、セリルＡＧＰのＤ異性体は、本明細書に開示されたヒト系で示されたのと同じＴＲＩＦシグナル伝達バイアスは示さない。
【００７７】
実施例９
ＣＲＸ−５４７シグナル伝達の種特異性（マウス対ヒト）についての受容体の基礎
ＴＲＩＦバイアス状態でのシグナル伝達について、ＣＲＸ−５４７、ＣＲＸ−５２７のＤ異性体での２つのＡＧＰ異性体における異なるシグナル伝達パターンが注目される一方で、ＣＲＸ−５２７はＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的経路の両方を介して情報伝達する。研究の初期の段階では、ヒトの細胞で認められマウスでは認められないのでＣＲＸ−５４７ＴＲＩＦバイアスシグナル伝達は種依存的と思われた。この明かな相違を取り上げるために、ヒトおよびマウスのTLR4-、MD-2-、および CD14-形質移入HEK293細胞ならびにこれらの組み合せを用いて受容体/共受容体の必要性ならびにＡＧＰシグナルについての受容体の種特異性を試験する。
【００７８】
huTLR4、huMD-2、およびhuCD14で形質移入された、ならびにＣＲＸ−５４７で刺激されているHEK293細胞はＣＲＸ−５２７とＬＰＳと比べてNFκBリポータ活性を少なく誘発する一方で、muTLR4-、muMD-2-、およびmuCD14-形質移入HEK293細胞におけるＣＲＸ−５４７により誘発される活性レベルはＣＲＸ−５２７およびＬＰＳに類似してる（Error!Reference source not found.）。ＣＲＸ−５４７によるシグナルの誘発について、この解析はマウスＴＬＲ４受容体複合体を好むことを示す。この種特異性の理由がＴＬＲ４自身なのか別の補助受容体成分なのかをはっきりするために、解析にはヒトおよびマウスＴＬＲ４受容体成分の組み合せを発現するＨＥＫ２９３細胞を含める。
【００７９】
Error!Reference source not found.８に示すように、ヒトＨＥＫ２９３細胞がＴＬＲ４およびマウスＭＤ−２の組み合せで形質移入された場合、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の間にプロモータ活性の誘導についての大きな相対差が残ることは、この相違がヒトＴＬＲ４でのＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の相互作用における相違からくることを示唆する。ＨＥＫ２９３細胞がマウスＴＬＲ４とヒトＭＤ−２との組み合せで形質移入された場合、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７が類似のレベルのプロモータ活性を誘発していることは、活性の差がＡＧＰ/ＴＬＲ４接触面での相互作用の相違からきていることを示唆する。これらの結果は、アシル鎖の長さおよびＭｕｒｏｉらが認めた分子のＭＤ−２との相互作用の差を発生させた組成物における修飾の影響とは異なる(Muroi, M and Tanamoto, K. (2006). J. Biol. Chem. 281. p5484-5491)。
【００８０】
注目すべきは、活性のレベルは同系の受容体成分を有する複合体が存在する時(huTLR4/huMD2, muTLR4/muMD2)よりもキメラ複合体(huTLR4/muMD2, muTLR4/huTLR4)において全体的により低いということであり、これは、種間キメラがこの系では最適に機能していないことを示唆する。ＣＲＸ−５４７の意図する種特異性に寄与する特定の残基を解明するにはさらなる生化学的解析が必要となる。
【００８１】
実施例１０
筋肉内投与によるリード候補ＡＧＰを使ったウサギ毒性試験
ＣＲＸ−５２７、５２４、５４７および化合物１の毒性は、ＡＧＰのみを筋肉内投与したウサギで評価する。３匹のウサギの群に、０日目、７日目、１４日目に１ｍＬの希釈ＡＧＰ，またはＭＰＬ対照をＩＭにてワクチン接種した。高用量（25 μg）と低用量（5 μg）の２つのＡＧＰを評価した。体重、体温、臨床症状およびDraizeスコア について全ての動物をモニターする。これらの動物は最終投与後一週間で犠牲にする。血液学分析と臨床化学検査のため処理前、第２回接種後２日目、および犠牲にした時に血液を採取する。注射部位および主要臓器の病理組織検査を実施する。
【００８２】
第２回目と第３回目のワクチン接種した間のＭＰＬ群を除いて、全ての動物は試験の期間を通して体重増加を示した（図１９）。賦形剤対照群含めてワクチン摂取後の温度変化± 〜1°Cが見られる（図２０）。ウサギの体温は正常な範囲にある。賦形剤対照群を含めたすべての群について Draize scoreで最小注射部位反応が見られ、ワクチン接種の回数が増えるに従い反応は減少した（図２１）。ＣＲＸ−５２４を除き、アジュバント高投与群のすべてで針痕に沿った筋肉が白色に変色した個所および注射部位にて病変が見られる。ＣＲＸ−５２７および化合物１に病変が認められるが低用量のＣＲＸ−５２４または−５４７の治療群はこの限りでない。
【００８３】
血液学分析では、低用量および高用量のＣＲＸ−５２７ならびに低用量のＣＲＸ−５２４と化合物１を投与したウサギで９日目 (2 days post-2°) に顆粒球増加症の傾向が認められ、これは２１日目(7 days post-3°)までに消失する。ＡＧＰは好中球を引き寄せることが知られている。ワクチン接種後の臨床化学的値が注目される傾向は認めなかった。
【００８４】
筋病変がみられない低用量のＣＲＸ−５４７を例外として、主に好塩基球およびマクロファージ筋炎を含む注射部位での炎症は、全ての処置群において唯一偶発所見でない（図2225）。高用量のＣＲＸ−５２７において筋炎が最も一貫して最大である。さらに、直近の２回の注射による注射部位と筋炎が一致しており、これは炎症反応の一過的な特性を示す（データは示さず）。
【００８５】
ＣＲＸ−５４７は高用量でのみ最小毒性であり、ＣＲＸ−５２４、−５２７および化合物１は低パワー (n=3 ウサギ/群)で中程度の毒性であるような全体的な印象である。病理所見は一過性である。
【００８６】
実施例１１
ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７処理に反応するサイトカイン遺伝子発現
ヒト細胞におけるサイトカイン/ケモカイン分泌の誘発についてＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７を比べるために、そしてさらに観察された相違点の原因となるシグナル伝達機序を解明するために、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７により誘発された遺伝子発現をマイクロアレイ技術を使い評価した。最初の実験は、qPCRを使ったＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン遺伝子誘発の時間経過解析を含む。この解析は、両方のアゴニストについてＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子の誘発は処理後１-２時間で検出可能となり、処理後３時間で確固としたレベルへ上昇し、処理後６時間でベースラインレベル近傍へ下降することを示している（データは示さず）。ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカインの両方の誘発については処理後３時間で最高値となる傾向があり、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的誘発の間の実質的な動態的差異は遺伝子発現のレベルでは動作しないことを示唆する。動態的パターンの１つの例外はIFNβ誘発であるが、これはＣＲＸ−５４７かＣＲＸ−５２７処理かのいずれかで１時間処理後すでに最高値を示す状態にあり、その後低下する。
【００８７】
本解析においてＣＲＸ−５４７と比べてＣＲＸ−５２７はより大きなＭｙＤ８８依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子発現を誘発するのみでなく、より大きなＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子発現を誘発する。この現象は、ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン分泌での２つのアゴニストが類似しているサイトカイン/ケモカインタンパク質分泌について認められるパターンと相関しない。このデータは、他の因子がＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７により誘発されてＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン分泌のレベルに影響を与えていることを示唆する。１つの可能性として、ＣＲＸ−５２７と比べてＣＲＸ−５４７処理が誘発するより大きなＴＲＩＦ依存的遺伝子mRNA 安定性がある。この遺伝子のレベルは処理後６時間でほぼベースラインまで減少しているが（データは示さず）、３時間から６時間のmRNAのレベルはまだ試験が終了していない。
【００８８】
in vitroマウス系
実施例１２ in vitroサイトカイン誘発
上述のとおり、より少ないＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦバイアスが、マウスのＰＢＭＣを用いるサイトカイン誘発実験、マウスの細胞株(RAW264.7)およびＨＥＫ２９３形質移入試験（データは示さず）において示唆される。拡張した投与範囲を使い、エステル連結脂肪アシル鎖ではなくエーテルを用いる追加のＬおよびＤ異性体対、化合物１ａおよび１ｂを試験してRAW264.7細胞におけるＣＲＸ−５４７およびＣＲＸ−５２７によるサイトカインのさらなる比較を提供する（図１）。さらに、種特異性の現象に対するより大きな機序の理解を取得するために、キメラヒト/マウスＴＬＲ４受容体複合体で形質移入された細胞においてＣＲＸ−５４７により誘発されたシグナル伝達を比較した。さらに、そのような種―特異的ＴＬＲ４アンタゴニスト/アゴニスト活性が、リピッドＩＶａである４つの一次アシル鎖のみの大腸菌からのリピッドＡ前駆体について報告されており(Muroi, Ohnishi, and Tanamoto 3546-50;Muroi and Tanamoto 5484-91)、この活性はマウスでのＴＬＲ４補助受容体MD-2の構造上の違いに起因した。
【００８９】
マウス血液由来のＰＢＭＣがＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７で処理した後にＭｙＤ８８サイトカインの同様なプロファイルを有するかを調べるために、市販されているＢＡＬＢ/ｃマウスからの血液をＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７を用いて試験をする（図２４）。試験を行った２群間ではレベルは同様と思われる。
【００９０】
マウス細胞においてＬおよびＤ異性体間の効力の共通性をより比較し確認するために、RAW264.7（マクロファージ）細胞を、ＭｙＤ８８(TNFα) およびＴＲＩＦ依存的(IP-10)産生のためにアッセイしたＣＲＸ−５２７，ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂならびに上清を用いてより広い投与範囲で刺激した。この範囲ではＣＲＸ−５４７よりもＣＲＸ−５２７がTNFαおよびIP-10の産生を誘発する能力がより高い。このマウス細胞株については、ＴＲＩＦおよびＭｙＤ８８依存的サイトカインの両方に対するＣＲＸ−５４７の誘発はＣＲＸ−５２７に比べて能力が低い。このデータは、ヒト細胞株におけるＭｙＤ８８依存的サイトカインの誘発についてＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の活性の差異は一般的にマウス細胞株に比べてかなり大きいのであるが、ＣＲＸ−５４７の種特異的活性は明確ではなく、このことは、ＣＲＸ−５４７のマウスとヒトのＴＬＲ４/ＭＤ２受容体複合体との相互作用において主要な差異が存在することを示唆している。
【００９１】
化合物１ａおよび１ｂはマウスとヒトの細胞株において同じレベルのＴＲＩＦおよびＭｙＤ８８依存的サイトカインを誘発するが、アグリコンセリル基のＬ異性体からＤ異性体までの変化と合わせたエステル連結脂肪酸鎖からエーテル連結脂肪酸鎖まで変化がヒト細胞中のＤ異性体の活性を救済するを示唆している。ＡＧＰ上の荷電基の相対的位置をこれらの修飾の両方が変えるので、この差異は分子のＴＬＲ４/ＭＤ２受容体複合体との相互作用における差異と関連し得る。
【００９２】
ＴＬＲ４刺激の後のＭｙＤ８８依存的シグナル伝達がＴＲＩＦ依存的シグナルよりも先であり、かつ、ＭｙＤ８８とＴＲＩＦの両方がNFκB経路の活性化により下流TNFα産生を誘発し得るために、ＬおよびＤ異性体で刺激した後のサイトカイン産生について初期の時点を試験をする。刺激を４時間した後、ＣＲＸ−５２７の方がRAW264.7細胞でのTNFαおよび IP-10産生を誘発する能力が僅かに高いように見える（図２７と２８）。
【００９３】
実施例１３ マウスRAW264.7細胞のウェスタンブロット解析
RAW264.7細胞でのＴＲＩＦ対ＭｙＤ８８における主要なタンパク質シグナル伝達分子のリン酸化（活性化）状態を測るために、細胞は予備活性化（10 -7M PMAを用いて）し10ng/mlのＡＧＰで刺激した。細胞分解溶解物は、０、１５ｍ、３０ｍ、４５ｍ、６０ｍ、１２０ｍ、２４０ｍで調製した。ＭＭ６細胞の結果と同様に、ＣＲＸ−５４７と比べてIκBα の分解がＣＲＸ−５２７での刺激の後は早く進んだ(Error!Reference source not found.17)。驚くべきことに、ＣＲＸ−５４７の刺激はより高いIκBαリン酸化とＩＲＦ３リン酸化をもたらす。これらの細胞の増加した反応性は単球細胞の成熟状態を向上させると知られるＰＭＡでの予備活性化によると思われ、ＣＲＸ−５４７はリン酸―IκBαおよびリン酸―IRF3の発現を誘発する。ＩＲＦ３はＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達を経て誘発される。また、総ＩＲＦ３タンパク質の量はＣＲＸ−５４７で処理された細胞においてより高い。（注記：実験回数は一回であり、負荷コントロール(βactin)は不均一な負荷の可能性を示唆する。）
実施例１４ ＲＮＡ干渉解析
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＴＬＲ２，ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８のＴＬＲシグナル伝達経路に含まれる特異的遺伝子の発現を破壊するのに利用される。RAW264.7 siRNA細胞株は市販されているプラスミド (Invivogen)を使って調製される。このプラスミドはZeocin選択マーカー、ＧＦＰをコードする配列およびノックダウン用のshRNAをコードする配列を含む。細胞が一度効率的に形質移入すると、安定した細胞株が抗生物質選択を経て生じる。培養物の精度は、培養系内のＧＦＰ+細胞で決定される。また、無関係なプラスミドも対照として安定的に細胞を形質移入するのに使われる。図３０は、同系のsiRNAの安定的な形質移入体においてのＭｙＤ８８とＴＲＩＦのノックダウンを示す。図３０Ａは、サイトカイン−再生実験の前にＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが３つのすべての細胞株において９６％以上であることを示す。図３０Ｂは、ＬＰＳでの刺激が無関係の対照と比べてタンパク質のレベルが低下しているのでＭｙＤ８８とＴＲＩＦについて首尾よくノックダウンした証拠を示す。
【００９４】
ＬおよびＤ異性体による刺激の後、ＴＲＩＦまたはＭｙＤ８８がサイトカイン応答に必要であるかを測定するために、安定的に形質移入した siRNA細胞株を２０時間（ＭＭ６力価アッセイに類似するアッセイで）または４時間（ＭｙＤ８８誘発サイトカイン応答を捉えるため）刺激し、細胞の上清はTNFα (MyD88)およびIP-10 (TRIF)についてアッセイした。刺激後の２０時間において、無関係な対照であるＬＵＣ細胞株は、wt RAW264.7細胞が以前に示したものと類似のＩＰ−１０誘発パターンを示す。ＴＲＩＦノックダウン細胞において、ＩＰ−１０レベルが無関係な対照で認められた応答と同じ用量応答にならないことは、ＴＲＩＦはＡＧＰ刺激の後、効率的なＩＰ−１０応答を必要としていることを示唆する。ＴＲＩＦが無傷の場合（ＭｙＤ８８ノックダウン細胞株において）、ＩＰ−１０レベルは用量反応を示し、総ケモカインは無関係な対照（ＬＵＣ）を超えて上昇する。他のアッセイ系（ヒトおよびマウス系を含む）は、ＬとＤ異性体の両方ともがＴＲＩＦ媒介性サイトカインを誘発するに効率的であるという仮説を支持する。
ＭｙＤ８８（TNFαの初期放出）およびＴＲＩＦ（NFκBの遅延活性化によるTNFαの遅延放出）の両方でコントロールされるTNFαにおいて、ＣＲＸ−５２７はＣＲＸ−５４７と比べて、無関係な対照においてより能力がある（図３１）。ＭｙＤ８８またはＴＲＩＦのいずれかがノックダウンしている場合、ＣＲＸ−５４７を超えるＣＲＸ−５２７の効力の増加が認められる。TNFαがＭｙＤ８８とＴＲＩＦの両方で誘発するので、２０時間の時点ではＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７の刺激の後のシグナル経路間を十分に区別できない。総合すると、このデータは試験された時間枠内でTNFαはＭｙＤ８８を必要としないか、または、ＭｙＤ８８のsiRNAのノックダウンがTNFαを抑制するのに十分でないという２つの可能性を示唆する。ＴＲＩＦシグナル単独がTNFαを誘発できるとう仮説はある程度裏付けられ、つまり、この誘発はＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達によるものである得る。従って、TNFα誘発はＭｙＤ８８とＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達の両方によるものである得る。化合物１ａおよびＣＲＸ−６７９は両方のアッセイ系において２０時間で同等の反応性を持つ。
【００９５】
ＭｙＤ８８のTNFα産生の要件をより良く区別するために、siRNAノックダウン細胞株をＡＧＰ刺激を４時間した後、TNFαの産生に関して試験した（図３５）。刺激後の４時間でＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７は無関係な対照細胞株（ＬＵＣ）においてTNFαを同様に誘発することを示した。力価の差異およびTNFα産生のピークは、TNFα産生がＭｙＤ８８の誘発に限定されるＴＲＩＦのノックダウン細胞において増強された。ＭｙＤ８８のノックダウンは２つのＡＧＰ間の同様なレベルのTNFα産生を生じる。総合すると、このデータはＡＧＰによる刺激の後のTNFα産生の誘発を早期に行うＭｙＤ８８の要件を示している。さらに、ＣＲＸ−５２７は同一投与量のＣＲＸ−５４７よりもTNFαを誘発する能力が強い。化合物１ａおよび１ｂは同様なサイトカインのパターンを生じる。RAW264.7細胞を用いて刺激した４時間後のＩＰ−１０レベルは非常に低いので siRNA 細部株はＩＰ−１０レベルについてアッセイしなかった。
【００９６】
参考文献
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲ４受容体複合体を介してＴＲＩＦバイアスシグナルを誘発するための合成リピッドＡ模倣物、特にＡＰＧ化合物ＣＲＸ５４７の使用に関する。
【０００２】
本出願は、米国仮特許出願第６１/１４０２２６号(２００８年１２月２３日出願)の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（37 C.F.R.1.71(E) 37 C.F.R.1.71(E)に従う著作権通知）
本特許書類の開示内容の一部は著作権保護を受ける材料を含む。著作権者はその特許文献または特許開示内容をいずれかの者によってファクシミリによって再生されることに対して、それが米国特許商標庁のファイルまたは記録において現れるので異議はないが、それ以外はすべての著作権をどのような場合でも保持する。
【０００４】
（連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載）
この発明の態様は、国立アレルギー・感染症研究所との契約番号HHSN266200400008C/N01-AI-40008に従って米国政府の支援によってなされている。米国政府はこの発明に対して特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ペプチドグリカン（ＴＬＲ２），ＣｐＧ ＤＮＡ（ＴＬＲ９），ウイルスＲＮＡ（ＴＬＲ３/７/８）、細菌フラジェリン（ＴＬＲ５）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４）を含む、保存的微生物モチーフを認識するパターン認識受容体である。特に、ＴＬＲ４はリガンド結合細胞外ロイシンリッチ領域反復ドメインおよび細胞質中のToll-/IL-1Rホモロジードメイン（細胞内のシグナル伝達アダプターを促す）(Nahori et al., 2005)により特徴づけられる。リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、フィブロネクチン、また、ＲＳＶ、タキソールおよびワクチンアジュバントモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）の融合蛋白を含む、ＴＬＲ４のいくつかのリガンドが記載されている。ＴＬＲ４の活性化に関連する２つの主要なシグナル伝達経路、つまりＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的経路、が記載されている。
【０００６】
最近、他のＴＬＲ４アンタゴニストと比べた場合、サルモネラミネソタの細胞壁由来の精製された解毒糖脂質の誘導体であるＴＬＲ４リガンドＭＰＬがＴＲＩＦ依存的シグナルおよびＭｙＤ８８依存的シグナルに対するバイアスを示すことが報告されており、ＭＰＬが、ＰＩ３キナーゼ経路などの追加的下流シグナル経路を誘発することでＭｙＤ８８依存的炎症性経路の能動的抑制を誘発するであろうと想定された(Mata-Haro et. al. 2007)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nahori et al., 2005
【非特許文献２】Mata-Haro et. al. 2007
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
アミノアルキルグルコサミニド４‐リン酸（ＡＧＰ）の選ばれた異性体を投与することを含む相対的ＴＲＩＦバイアス反応を誘発する方法を提供する。本明細書に開示の合成リピッドＡ模倣物によるＴＲＩＦ依存的シグナルの選択的誘発は、炎症性サイトカイン/ケモカインの誘発に関連する毒性の副作用の危険性を緩和する一方で、免疫反応を選択的に変化させるワクチンアジュバントまたは免疫調節物質の開発を可能にする。
【０００９】
本発明は、ＴＬＲ４受容体複合体を介してＴＲＩＦバイアスシグナルを誘発するための合成リピッドＡ模倣物、特にＡＰＧ化合物ＣＲＸ５４７の使用に関する。ＣＲＸ５４７はＡＧＰ ＣＲＸ５２７のジアステレオマーである。用語「ＴＲＩＦバイアス」とは、他の化合物（例えば、ＣＲＸ５２７）のＭｙＤ８８依存的シグナル伝達と比較して、化合物（例えば、ＣＲＸ５４７）のＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の低減を言う。好ましい一実施形態において、ＴＲＩＦバイアスは低減したＭｙＤ８８シグナル伝達を提供し、ＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を維持または増加する。他の好ましい一実施形態において、本発明はin vitroで樹状細胞からの有意なレベルのＴｈ１細胞媒介性免疫を指向するサイトカインであるＩＬ−１２を誘発するとともに、大幅に少ない炎症性メディエーターであるＩＬ−２３（炎症性メディエーターのＩＬ−１７とＴＮＦαを産生するＴｈ１７Ｔ細胞の維持を促するサイトカイン）を誘発することによって、ＴＲＩＦバイアスを示す（Wilson et. al.2007）。Ｔｈ１７Ｔ細胞は関節炎、炎症性腸疾患、および多発性硬化症を含めた炎症性自己免疫疾患の発症に結び付けられていた(McGeachy et. al. 2007)。
【００１０】
本発明のいくつかの実施態様を簡単に記載する。
【００１１】
Ｌ−セリルＡＧＰ ＣＲＸ５２７を含有する組成物により誘発されるＭｙＤ８８依存的シグナル伝達のポテンシャルを有意に低減しながら、ＴＬＲ４受容体複合体を介して有意なＴＲＩＦ依存的シグナルを誘発する方法であって、該組成物中のＬ−セリルＡＧＰのＤ−セリル誘導体を置換することを含む、上記方法。
【００１２】
ＴＲＩＦ依存的サイトカインを誘発し、リピッドＡ模倣物アジュバント組成物によりヒト細胞内に誘発されるＭｙＤ８８依存的サイトカインのレベルを低減する方法であって、ヒト細胞にＣＲＸ５４７を投与することを含む、上記方法。
【００１３】
ＣＲＸ５２７の合成Ｄ−セリル誘導体をヒトに投与することを含む、Ｌ−セリルＡＧＰ ＣＲＸ５２７により誘発されたレベルと比べてヒト細胞中のＩＬ−１２ｐ７０とＩＬ−２３をより低いレベルに誘発する方法。
【００１４】
ＣＲＸ５２７により誘発されたＩＲＦ３と同等か高いレベルであるが、有意に低いレベルのNF-κB活性を活性化する方法であって、５２７のＤ−セリルジアステレオマーを投与することを含む、上記方法。
【００１５】
第二合成リピッドＡであるＣＲＸ５４７を投与することを含む、第一リピッドＡ模倣物によるＭｙＤ８８依存的サイトカイン誘発を抑制する方法。
【００１６】
ヒト細胞内での有益なＴＲＩＦ依存的シグナル伝達のアジュバント組成物誘発を向上させる方法であり、アジュバント組成物はＣＲＸ５４７ではないＡＧＰを含有しており、該方法はアジュバント組成物にＣＲＸ５４７を組み込むことを含む、上記方法。
【００１７】
ヒトの免疫反応の向上に使用するＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べてＴＲＩＦ依存的サイトカインは増加し、ＭｙＤ８８依存的サイトカインは減少する、上記組成物。
【００１８】
ヒトで免疫反応を起こすのに使用するＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べて、NF-κB 活性は減少するが、しかし、同等か高いレベルのＩＲＦ３が認められる、上記組成物。
【００１９】
ヒトで免疫反応を起こすのに使用するＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べてＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３のレベルは減少する、上記組成物。
【００２０】
ヒトの免疫反応の起こす際に抗原と合わせて使用するリピッドＡ模倣物アジュバントであり、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物アジュバントと比べてＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３のレベルは減少する、上記アジュバント。
【００２１】
本明細書で説明される方法のいずれかにおいて使用するためのＣＲＸ５４７およびＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７ならびにエステル連結脂肪アシル鎖、ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７をもつアミノアルキルグルコサミニド４‐リン酸塩。
【図２】ヒトＰＢＭＣにおける（Ａ）ＭｙＤ８８依存的および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカインおよびケモカインの誘発についての、S. minn. Re595 LPSとリピッドＡ模倣物、ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７の比較。
【図３】S. minn. Re595 LPS, ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７を用いたヒトの単球由来樹状細胞の処理による（Ａ）ＩＬ−１２ｐ７０および（Ｂ）ＩＬ−２３の誘発。
【図４】ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８−ＤＮ）およびＴＲＩＦ（ＴＲＩＦ−ＤＮ）のドミナントネガティブ構築物を発現するプラスミドの形質移入によるヒトマクロファージ細胞株における（Ａ）ＭｙＤ８８および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカインの誘発の抑制。
【図５】エンドサイトーシス阻害剤であるジナソアの存在下でＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、およびＬＰＳによる誘発される（Ａ）ＭｙＤ８８依存的（ＭＩＰ−１α）および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的（ＲＡＮＴＥＳ）サイトカイン/ケモカイン。
【図６】画像ストリームゲーティング法。
【図７】ヒト単球細胞（ＭＭ６）はＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７のいずれかで５分、１５分、３０分、または１２０分間処理し、NFкBの核移行は核染料（ＤＲＡＫ−５）と転写因子の共局在として定量化した。
【図８】huTLR4/huMd-2/huCD14形質移入ＨＥＫ２９３細胞がS. minn. Re595 LPS、ＣＲＸ−５２７、およびＣＲＸ−５４７で処理された時のNF-κB誘導性プロモータ活性の比較。
【図９】ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の存在下での、ＣＲＸ−５２７ならびにＬＰＳによる（Ａ）ＭｙＤ８８依存的および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン誘導の抑制。
【図１０】（Ａ）ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の追加によるＣＲＸ−５２７誘発性 TNFαの抑制（Ｂ）シルド回帰分析はＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の両方のEC50と類似するＣＲＸ−５４７親和性（０．３３ｎＭ）の推定値をもたらす。
【図１１】ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の存在下でのＣＲＸ−５２７およびＬＰＳ ＭｙＤ８８依存性（ＴＮＦα）サイトカイン誘発の抑制。
【図１２】ＣＲＸ−５４７の濃度上昇の存在下でのＣＲＸ−５２７−誘発性NFкBの核移行の抑制。
【図１３】シグナル伝達活性およびケモカイン誘導に対するＣＲＸ−５２７/ＣＲＸ−５４７の安定性増強修飾の効果。ＬとＤの異性体対ＣＲＸ−５２７/ＣＲＸ−５４７および１ａ/１ｂによる、（Ａ） huTLR4/huMD-2/huCD14-形質移入ＨＥＫ２９３細胞におけるNFкB シグナル伝達と（Ｂ）ヒト単球細胞（ＭＭ６）におけるＭｙＤ８８依存的（ＭＩＰ−１β）誘発の比較。
【図１４】ＣＲＸ−５２７で処理されたヒト一次、ＰＢＭＣ由来単球のウェスタンブロット分析であって、ＴＲＩＦのホスホＩＲＦ３下流の活性化の動態およびレベルの類似、ならびにＣＲＸ−５４７で刺激された細胞よりもＭｙＤ８８のＩＲＡＫ１下流の方がより大きな分解を示す。
【図１５】ＣＲＸ−５２７で処理されたＭＭ６細胞のウェスタンブロット分析であって、ＣＲＸ−５４７で刺激された細胞よりもＭｙＤ８８のＩＲＡＫ４下流の方がより大きな分解を示す。
【図１６】ＬとＤの異性体対、化合物２ａおよび２ｂによる（Ａ） huTLR4/huMD-2/huCD14-形質移入ＨＥＫ２９３細胞におけるNFкB シグナル伝達と（Ｂ）ヒト単球細胞（ＭＭ６）におけるＭｙＤ８８依存的（ＭＩＰ−１β）誘発の比較。
【図１７】ヒト(上段）かマウス（下段）ＴＬＲ４/ＭＤ−２/ＣＤ１４のいずれかで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞におけるＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、およびＬＰＳよるNFкB−依存的プロモータ活性の誘発。
【図１８】同系のヒト/マウスＴＬＲ４/ＭＤ−２またはキメラ 組み合わせ（huTLR4/muMD2またはmuTLR4/huMD-2）のいずれかで形質移入されたＨＥＫ２９３細胞におけるNFкB−依存的プロモータ活性の誘発。
【図１９】示されたアゴニストで処理されたラビットの体重変化。
【図２０】示されたアゴニストで処理されたラビットの接種後の体温。
【図２１】示されたアゴニストで処理されたDraizeによる注射部位反応。
【図２２】示されたアゴニストを作用させたラビットの注射部位病理組織検査。示されたアゴニストで処理されたラビットの体重変化。
【図２３】0.01uMのＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７で処理後のヒトＰＢＭＣ由来単球における（Ａ）ＭｙＤ８８依存的、および（Ｂ）ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子発現の誘発。
【図２４】ＣＲＸ−５４７（２ロット）およびＣＲＸ−５２７（実験は一度実施）で試験したＢＡＬＢ/ｃマウスからのＰＢＭＣ。
【図２５】ＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂによるＴＲＩＦ依存的（ＩＰ−１０）の誘発。
【図２６】ＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂによるＭｙＤ８８依存的（ＴＮＦα）サイトカイン/ケモカインの誘発。
【図２７】ＡＧＰおよびそれらのＤ異性体で刺激した４時間後のＴＮＦαレベル。
【図２８】ＡＧＰおよびそれらのＤ異性体で刺激した４時間後のＩＰ−１０レベル。
【図２９】ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＲＸ−５４７およびＣＲＸ−５２７刺激後のシグナル伝達タンパク質のウェスタンブロット分析。
【図３０】安定的に形質移入されたＲＡＷ２６４．７細胞。
【図３１】ＬとＤの異性体で刺激した２０時間後のＩＰ−１０産生（siRNA 細胞株は各試験において無関係な対照と比較）。
【図３２】ＬとＤの異性体で刺激した２０時間後のＩＰ−１０産生（siRNA 細胞株は各試験において無関係な対照と比較）
【図３３】ＬとＤの異性体による刺激の２０時間後のＴＮＦα産生。
【図３４】ＬとＤの異性体による刺激の２０時間後のＴＮＦα産生。
【図３５】ＴＮＦα産生のためにＣＲＸ−５２７、ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂで４時間刺激したＲＡＷ２６４．７ｓｉＲＮＡ細胞株。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
序論
リピッドＡは、膜結合ＴＬＲ/ＭＤ−２ＴＬＲ４受容体複合体に結合しているＬＰＳ分子内の活性、疎水性構造モチーフである。リピッドＡはバクテリア種の間でかなりのばらつきがある。個々のグラム陰性菌は表面上でリピッドＡの構造を調節することが出来き、程度は異なっても炎症になる（Bishop et al. 5071-80; Guo et al. 189-988）。アシル鎖の数と長さおよびリン酸化のパターンの変化が極めて強力なアゴニストからアンタゴニストまでのリピッドＡ分子の活性を変化させることが示されている。（Hawkins, 2002 30067 /id, Stover at al, Seydel et. al. 2000）。ほとんどのＬＰＳ種の毒性はＴＬＲ４受容体複合体に関するリピッドＡ部分との相互作用により決定される（Baker et al. 1992）。アシル鎖の数、長さ、および配置、ならびに荷電基の数および位置における差異はリピッドＡに対する免疫学的応答のレベルと性格の両方に有意に影響することが示されている（Teghanemt et al. 2005, Stover et. al. 2004, Schromm et al. 1998）。さらに、単糖、リピッドＡ模倣物、アミノアルキルグルコサミニド4リン酸塩（ＡＧＰ）とＴＬＲ４アゴニストおよびアンタゴニスト活性とを合わせたライブラリーの設計と合成も記載されている（Stover et al. 4440-49;Persing et al. S32-S37;Johnson et al. 2273-78）。
【００２４】
上記のように、２つの主要なシグナル伝達経路はＴＬＲ４アゴニストによるＴＬＲ４活性化、ＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的経路に沿って記載されている。ＭｙＤ８８依存的シグナルは、２つのＴｏｌｌ/インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプタータンパク質、Ｍａｌ/ＴＩＲＡＰおよびＭｙＤ８８をＴＬＲ４のＴＩＲドメインに連続的または同時的に結合することに依存している（Fitzgeral et. al. 2001）。ＴＲＩＦ依存的シグナルは、ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質、ＴＲＡＭ/ＴＩＣＡＭ−２およびＴＲＩＦ/ＴＩＣＡＭ−１がＴＬＲ４−ＴＩＲドメインに連続的または同時的に結合をすることを要求する（Rowe et al. 6299-304;Yamamoto et al. 1144-50）。２つの経路とも先天および適応免疫の連結に関係している（Kawai et. al. 2001, Kaisho et al. 2001）。
【００２５】
リピッドＡ−レセプター相互作用の下流、特定のＴＬＲ４依存的シグナル伝達経路、（ＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的経路）は受容体結合に対する細胞応答を決定する。ＭｙＤ８８依存的シグナルは、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターの合成と分泌により特徴づけされる炎症反応を促す（Huang et. al. 2004）。ＭｙＤ８８依存的経路を介するシグナルは、初期のNF-κB 活性化および腫瘍壊死因子-α（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカイン、インターロイキン（ＩＬ）−１β およびＭＩＰ−１αなどのケモカインの放出を誘発する。
【００２６】
ＴＲＩＦ依存的シグナルは、１型ＩＦＮなどの免疫仲介物質、一部のＩＬ−１２ファミリーメンバーおよび樹状細胞成熟を誘発しＴ−細胞成熟に影響するケモカインの産生を促す。ＴＲＩＦ依存的経路を介したシグナルは、ＭｙＤ８８経路を介するシグナルよりもNF-κB の活性化(Hoebe et al. 743-48)を低下させ、遅らせ、しかしより維持しながら、インターフェロン調節因子である（ＩＲＦ）−３およびＩＲＦ−７の活性化と核移行を誘発する(Kawai et al. 5887-94)。ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７の活性化はＩＦＮβの転写および続く細胞外放出を駆動する。次にＩＦＮ−α/β受容体へのＩＦＮβのオートクリンまたはパラクリン結合は、ＪＡＫ/ＳＴＡＴ経路を活性化することでＩＦＮαとＩＦＮβ、ならびに、インターフェロン誘導性タンパク質―１０（ＩＰ−１０）、活性化正常Ｔ細胞における発現および分泌調節性（ＲＡＮＴＥＳ）、およびマクロファージ走化性タンパク質‐１（ＭＣＰ−１）などのＩＦＮ−誘導性ケモカインの発現が高まる(Yamamoto et. al. 2003, Kawai et. al. 2001, Serbina et. al. 2003)。
【００２７】
大部分のＡＧＰはＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的経路を介して情報伝達する。近年、特異で興味深いＤ−セリルＡＧＰ、ＣＲＸ−５４７がＴＲＩＦ依存的経路を介して大部分を情報伝達することが示された。このことは、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的経路を刺激する立体異性体であるＬ−セリルＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７とは対照的である。ＴＲＩＦ依存的経路がＩ型インターフェロンの産生を生じる一方で、ＭｙＤ８８経路が炎症性サイトカインの誘発と関連するのでＴＲＩＦ経路の使用およびＭｙＤ８８経路の回避が、例えば、アジュバントとして使用される時のＴＬＲ４アゴニストの有効性および安全性の両方に影響し得る。ＭｙＤ８８依存的シグナルの相対的減少が安全性改善（炎症の誘発低下）し、従って、Ｌ−セリル異性体と比較してＤ−セリル異性体の治療係数を向上させる一方で、ＴＲＩＦシグナルの相対的な増加は増強された細胞媒介性免疫を生じ得る。
【００２８】
用語
別途説明されないかぎり、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、この開示が属する技術分野の技術者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。分子生物学における一般的な用語の定義は、Oxford University Press, 1994に出版されたBenjamin Lewin, Genes V(ISBN 0-19-854287-9); Blackwell Science Ltd., 1994に出版されたKendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology(ISBN 0-632-02182-9);およびVCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)により出版されたRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Referenceに見出されうる。
【００２９】
単数形「1つの(a)」、「ある(an)」、および「その(the)」は、文脈において特記されない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、用語「または」は、文脈において特記されない限り、「および」を含むものとして使用される。用語「複数」は２つまたはそれ以上をいう。核酸またはポリペプチドについて与えられる場合、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値は近似であり、説明のために提供されることが、さらに理解されるべきである。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して行なわれた数値限定は近似を示している。従って、濃度が少なくとも（例えば）２００ｐｇとされた場合、濃度は少なくとも近似的に（または「約」または「〜」）２００ｐｇであると理解されることを意図している。
【００３０】
ここに記載のものと類似または同等の方法及び物質が、この開示において実用的または試験的であることが可能ではあるが、適切な方法および物質が以下に記載されている。「含む」とは「含有する」を意味する。従って、その状況が他のことを要求していない限り、用語「含む（comprises）」、および「含む（comprise）」と「含んでいる（comprising）」などの変法は明示された化合物または組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）、もしくは、いかなる他の化合物、組成物、ステップ、もしくはそれらの群を排除することなく、ステップ、または化合物もしくはステップの群が含まれることを意味するものと理解されるべきである。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定な例を示すのに使用される。従って、略語「ｅ．ｇ．」は、「例えば（for example）」と同じである。
【００３１】
「リピッドＡ模倣物」は、ＴＬＲ４受容体（例えば、ＭＰＬとＡＧＰ）を介して、ＴＲＩＦ情報伝達および/またはＭｙＤ８８情報伝達を誘発するＴＬＲ４リガンドである。
【００３２】
「ＴＲＩＦバイアス」とは、一の化合物によるＭｙＤ８８依存的シグナル伝達のレベルが、他の化合物によるものよりも低いことをいう。
【００３３】
本開示の様々な実施形態の審査を容易にするために、以下の説明を提供する。さらなる用語と説明を本開示の文脈において提供することもできる。
【００３４】
アミノアルキルグルコサミニド４‐ホスフェート
簡単に述べると、セリルＡＧＰ ＣＲＸ５２７およびＣＲＸ５４７は、リピッドＡの還元性糖類がアミノアルキルＬ−またはＤ−セレンベース単位で置換され、かつ、１０炭素の正常な脂肪アシル鎖を含む３つの（Ｒ）−３−ｎアルカノイルオキシテトラデカノイル残基を有する、リピッドＡ模倣物のクラスである。ＡＧＰは、ヒドロキシルとアミノ基の化学的識別および（Ｒ）−３−ｎアルカノイルオキシテトラデカノイル残基の連続的導入ができる高度な収束手法により以前に記載されているように調製する。(Bazin et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008 18, 5350; Johnson et al Bioorg. Med. Chem. Lett 9 1999 2273; Patent PublicationWO 04/005308を参照)。セリルＡＧＰはシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（純度 >95%）で精製し、標準的な分析法でトリアルキルアンモニウム塩として分析する。
【化１】
【００３５】
また、図１にはＣＲＸ５２７とＣＲＸ５４７が示されており、以前に合成され記載がされている(U.S. Patent No. 6,113,918; Examples 15 and 16, and WO 2006/012425 WO 2006/016997を参照)。ＣＲＸ５３７の場合に比べて、ＣＲＸ５４７の構造的な相違がアグリコンカルボキシル基の位置に影響を与える。この差異が荷電カルボキシル基のＴＬＲ４受容体複合体との相互作用に影響を与え得る。ＬＰＳ模倣物がＭＤ２を介してＴＬＲ４受容体複合体との相互作用をすることが以前に示され(Ohto et. al. 2007)、従って、ＣＲＸ５４７とＣＲＸ５２７のジアステレオマ間の差異がＭＤ−２またはＴＬＤ４をともないカルボキシル基、リピッドＡリン酸バイオアイソスターの相互作用を阻害する可能性がある。次に、受容体の二量体化、またはそれに代えてＭｙＤ８８と下流シグナルの結合を推進する細胞内コンフォメーション変化を阻害するかもしれない。おそらくは、この阻害または変化はＴＲＩＦ依存的シグナルを排除しない。
【００３６】
最近公表されたヒトTR4/MD-2/lipidIVa (Ohto et al. (2007) Science. 316:1632) およびヒトＴＬＲ４／ＭＤ−２／Ｅｒｉｔｏｒａｎ受容体の結晶構造は、リピッドＡ模倣物の還元性糖類の１つにおけるある位置のリン酸基がリピッドＡのためのＭＤ２疎水性結合ポケットの出口近くにある荷電基と相互作用をすることを示唆している。第２ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体と合わせＴＬＲ４／ＭＤ−２二量体化の構造モデル(Kim et al. 906-17;Walsh et al. 1245-54) は、ＭＤ−２/リピッドＡ複合体の表面がダイマーパートナーのＴＬＲ４と相互作用し得ることを示唆する。シグナル伝達の差異を誘発し得る偏左右異性ＣＲＸ５４７が阻害する可能性がある一方でＣＲＸ５２７の生物的等配電子体カルボキシル基がこれらの相互作用を維持し得る。
【００３７】
試験をしてみるとＭＰＬはＣＲＸ５４７と同様のＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的シグナルのパターンを示し、同時に、ＭＰＬはＣＲＸ５４７における構造的な変化に影響を受ける同じ位置でのリン酸を欠失する。従って、ＭＰＬとＣＲＸ５４７は、実質的なＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の非存在化でＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を誘発する共通の機序を共有し得る。
【００３８】
材料および方法
本明細書に記載された材料および方法は、後述する実施例の実施において有用である。
【００３９】
細胞株および試薬
ヒトＴＬＲ４、ＭＤ−２、およびＣＤ１４発現ＨＥＫ２９３細胞株、NF-κB/LacZリポーター・プラスミド、ドミナントネガティブＭｙＤ８８発現（pDeNy-hMyD88）および ドミナントネガティブＴＲＩＦ発現（pDeNy-hTRIF）プラスミド、LyoVecトランスフェクション試薬およびS. minnesota 由来のウルトラピュアRe595 LPS は InvivoGenから得ることができる。ヒト単球／マクロファージ細胞株、ＴＨＰ−１はＡＴＣＣから得ることができる。ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬はRocheから得ることができる。InvivoGen (San Diego, CA)から得たHEK293-hTLR4/hMD2/hCD14細胞は、 RPMI 1640 (ATCC) の中で10% FBS (Hyclone)、10 μg/mL ブラスチシジン、50 μg/mL HygroGold (InvivoGen)とを使って培養する。ＴＨＰ−１細胞はＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ）の中で10% FBS (Hyclone)、100 U/mL ペニシリン/100 ug/mLストレプトマイシン（Sigma）とを使い培養する。
【００４０】
初代ヒト細胞培養
末梢血単核球（PBMC）はフィコール・ハイパック1.077 勾配を介して健康なドナーの血液から単離し、アゴニストで処理され、かつ、述べたように単球溶媒 (RPMI 1640 (ATCC)、１０％ヒトＡＢ血清(Lonza/BioWhittaker), 100 U/mL ペニシリン/100 ug/mL ストレプトマイシン（Sigma）、50 uM 2-メルカプトエタノール (Sigma) 内で付着単球を単離するのに使われる(Stover et al. 4440-49;Kawai et al. 5887-94;Gervassi et al. 7231-39)。単球由来マクロファージは、アゴニストを作用させる前に３日目と５日目に溶媒を交換し50 ng/mL rhM-CSF (R&D Systems) を用いて単球溶媒中で付着単球を５日間インキュベートして産生した。単球由来樹状細胞は、３日目と６日目に溶媒を交換し 10 ng/mL rhGM-CSFおよび10 ng/mL rhIL-4 (R&D Systems)を用いて単球溶媒中で付着単球を７日間インキュベートして産生した。
【００４１】
NFkB核移行
指数増殖におけるMonoMac6細胞は、示された時間にて、２％グリセロール媒体で希釈したＡＧＰの濃度を上昇させて刺激した。直ちに固定化した細胞（２％パラホルマリンで一晩）は、膜透過処理液緩衝液 (PBS, 2%FBS, 0.1% TritonX)中で一次抗体であるanti-NFκB(p65) (SantaCruz Biotechnology, SantaCruz, CA)およびanti-IRF3 (BD Biosciences, San Jose, CA)で染色し、その後、二次抗体であるanti-Rabbit FITC (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), anti-mouse PE (BD Biosciences, San Jose, CA)で染色した。核染色 DRAQ5 (Alexis Biochemicals (San Diego, CA) )を用いたシグナル伝達たんぱく質の局在化の類似度スコアは、すでに述べたように核移行の画像ストリーム解析に使用される（George, 2006 32669 /id）。最小限の３，０００個の細胞が各試験の条件で採取され解析される。
【００４２】
ドミナントネガティブMyD88およびTRIF
１２ウェルプレート(5 × 105 cells/well)中にＴＨＰ−１細胞を播種し、マクロファージへと分化させるために100 U/mL ペニシリン/100 ug/mL ストレプトマイシン(Sigma)、 20 ng/mL phorbol mystyric acid (PMA) (InvivoGen) を使い、 0.5 mL RPMI 1640 (ATCC) 中でインキュベートした。ＴＨＰ−１が分化した後、溶媒を5 ng/mL PMA でＴＨＰ−１溶媒に変更し、ならびに、細胞は、４８時間、pDeNy-hMyD88/LacZ、またはpUNO-mcs (control)/LacZ プラスミドおよびＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬の0.5 μg/well で一過的に形質移入した。溶媒は新鮮な溶媒に交換して、その後１４時間表示した濃度のＴＬＲ４アゴニストで刺激した。回収した上清はLuminexプラットフォームを用いて、マルチプレックスサンドイッチELISA (R&D Systems) によりサイトカインのレベルをアッセイした。対照ウェルは Invivogen LacZ Quantitationキットを用いて、トランスフェクション効率をアッセイした。
【００４３】
MyD88およびTRIF (MAL/TRAM)のsiRNAノックダウン
指数増殖するRAW264.7 細胞は、タンパク質ノックダウンのためのshRNA 配列、Zeocin抵抗性遺伝子およびＧＦＰコード配列 (InVivoGen, San Diego, CA)を含む、psiRNA-mTICAM1, psiRNA-mMyD88,またはpsiRNA-LUC (無関係な対照) プラスミドを使い、Optimem (Roche, Indianaopolis IN) の既存の方法によりＦｕＧＥＮＥ６で安定的に形質移入した。選択した後のトランスフェクション効率は、画像ストリームを用いてGFP陽性細胞の割合で決定する。
【００４４】
HEK293トランスフェクション
１２ウェルプレート（4 x 105 cells/well)中にHEK293-hTLR4/hMD2/hCD14細胞を播種し、４０％〜６０％コンフルエントになるまで（２〜３日間）培養した。細胞を、５か所のNF-κB部位 (pNiFty2-SEA-InvivoGen; San Diego, CA)およびチミジンキナーゼプロモータ駆動ルシフェラーゼ (Promega)を構成的に発現するトランスフェクション コントロールプラスミドを用いて、遺伝子組換えＥＬＡＭプロモータの制御下で分泌されたヒト胎児アルカリホスファターゼを発現する NF-Bレポーター構築物の100 ngを使用して２４時間、形質移入した。プラスミドは、QiagenのEndofree Maxiprepプラスミドキットで調製された。トランスフェクション後、細胞は１４時間、ＴＬＲ４アゴニストで刺激し清澄した上清は、 NF-кB活性化を定量するＳＥＡＰ活性についてアッセイして(SEAP Reporter Assay Kit-InvivoGen)、NF-кB活性化およびルシフェラーゼ活性 (Promega)および供給されたプロトコールに従ってトランスフェクション効率を基準化する。
【００４５】
エンドサイトーシスに対するＣＲＸ−５４７シグナル伝達の依存性：ジナソア阻害
分化したＴＨＰ−１マクロファージ (20 ng/mL PMAを用いて48-ウェルプレート内に5E5/ウェル)は、無血清ＴＨＰ−１溶媒中で６０分間エンドサイトーシスに対する低分子阻害剤であるジナソア10 uMで予め処理した。アゴニストの指定濃度で８時間、刺激する前に溶媒は０．４５ｍＬのＴＨＰ−１溶媒に変更する。上清は採取され、Luminexプラットフォームを用いてマルチプレックスサンドイッチELISA (R&D Systems) によりサイトカイン/ケモカイン解析の前に８０℃で貯蔵される。
【００４６】
ウェスタンブロット法
ウェスタンブロットおよびリン酸―ウェスタンブロットタンパク質解析では、細胞はCell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) と併せた Protease Inhibitor Cocktail (Sigma, St. Louism MO)で溶解する。標準的な方法を使ってPVDF膜 (Millipore) 上でウェスタンブロットを実施する。バンドはECL Advance Western Blot kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ)で検出する。二次Anti-Rabbit HRP抗体はKPL, (Gaithersburg, MD)から得ることができる。Anti-β actin, anti-IRF-3, anti-phospho-IRF-3 (Ser396)およびanti-IRAK1抗体は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から得ることができる。
【００４７】
マウスの血清サイトカイン/ケモカインの誘発
実験開始時の年齢は７週から９週である雌のBALB/cまたはC57Bl/6マウスをCharles River Laboratories, USAから入手した。賦形剤 (0.2%グリセロール) に200 uL のアゴニストまたは賦形剤単独でマウスに腹腔内注射した。血清試料は注射２時間または６時間後に取り出され、Luminexプラットフォームを用いて、マルチプレックスサンドイッチELISA (Invitrogen) によりサイトカイン/ケモカインの誘発に関する試験をした。Public Health ServiceおよびInstitutional Animal Care and Use Committee at GlaxoSmithKline Biologicals, Hamilton, Montanaが確立したガイドラインに従ってすべての動物を用いる。
【００４８】
ウサギを用いた毒性試験
３匹のウサギの群(NZW−Western Oregon Rabbit Company, Philomath, OR)は０日、７日、１４日目に１ｍＬの希釈したＡＧＰ，またはＭＰＬコントロールをＩＭで接種した。ＡＧＰの２つの投与が評価される。体重、体温、臨床症状およびDraizeスコア について全ての動物をモニターする。これらの動物は最終投与後一週間で屠殺する。血液学分析と臨床化学検査のため処理前、第２回接種後２日目、および犠牲にした時に血液を採取する。注射部位および主要臓器の病理組織検査を標準的な治療法で実施する。Public Health ServiceおよびInstitutional Animal Care and Use Committee at GlaxoSmithKline Biologicals, Hamilton, Montanaが確立したガイドラインに従ってすべての動物を用いる。
【実施例】
【００４９】
実施例１
Ｌ−異性体（ＣＲＸ５２７）との比較における合成リピッドＡ模倣物（ＣＲＸ５４７）のＤ−異性体投与による類似したレベルのＴＲＩＦ依存的サイトカイン、一方さらに低いレベルのＭｙＤ８８依存的サイトカイン
ヒトの新鮮な末梢血単核細胞(PBMC)からのサイトカイン誘発に対するS. minnesota Re595 LPS, CRX-547およびCRX-527の影響を比較した場合、ＣＲＸ−５２７とＬＰＳは類似したレベルのサイトカインTNFα およびケモカインMIP-1α （図２Ａ）を誘発する。または、ＣＲＸ−５４７は有意に低いレベルのTNFαとMIP-1αを誘発するが、ケモカインＩＴ−１０とＲＡＮＴＥＳは同程度であった（図２Ｂ）。
【００５０】
TNFαとMIP-1αの発現はＴＬＲ４アダプターであるＭｙＤ８８を介したシグナル伝達に依存する一方でＩＰ−１０とＲＡＮＴＥＳの発現はＴＬＲ４アダプターであるTRIF/TICAM-1を介したシグナル伝達に依存する(Hoebe et al, Kawai et al)。ヒトの新鮮な全血、培養ヒト単球、ヒト単球由来マクロファージ、およびヒト単球由来樹状細胞における同じ組み合わせのＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発についてアゴニストを比較した場合、類似のパターンが認められる（データを示さず）。
【００５１】
実施例２
ＣＲＸ−５４７は、単球由来樹状細胞におけるより低いレベルのＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−２３を誘発する。
【００５２】
炎症性サイトカインの誘発および樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、アジュバントワクチンを投与する間、強い免疫反応を高めることに寄与する。従って、ヒトＤＣにＩＬ−１２ｐ７０を誘発するＣＲＸ５２７とＣＲＸ−５４７の能力を比較する。ＩＬ−１２ｐ７０の誘発はTh1ヘルパーT細胞系列の発達を促し、細胞媒介性免疫応答を促す(Goriely, Neurath, and Goldman 81-86;Gutcher and Becher 1119-27)。IL-12p70 の発現がＭｙＤ８８およびＴＲＩＦシグナル依存であると示されたので(Goriely, Neurath, and Goldman 81-86)、ＣＲＸ５４７処理に対するＤＣ応答が消失するか否かが確認される。ＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと比較した場合有意に減少しているが、ＣＲＸ−５４７はヒト単球由来ＤＣからのＩＬ−１２ｐ７０応答を誘発し得る（Error!Reference source not found.３Ａ）。
【００５３】
または、ＤＣにおける炎症性メディエーターであるＩＬ−２３の発現は全面的にＭｙＤ８８依存的である (Re and Strominger 37692-99;Goriely, Neurath, and Goldman 81-86)。樹状細胞のＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７処理によるＩＬ−２３の誘発を比較した場合、ＩＬ−２３発現は事実上ＣＲＸ−５４７処理細胞におけるベースラインまで下がる（Error!Reference source not found.３Ｂ）。
【００５４】
実施例３
サイトカイン誘発のＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存性
ドミナントネガティブ変異体構築物の発現がＭｙＤ８８を介するシグナル伝達を抑制するのに使われる場合、ＭｙＤ８８依存的サイトカインであるTNFαのＣＲＸ−５２７での誘発は有意に減少し、ＴＲＩＦ依存的サイトカインであるＲＡＮＴＥＳの誘発はほんの僅か減少する一方で、ＭｙＤ８８依存的サイトカインのＣＲＸ−５４７誘発はＭｙＤ８８のノックダウンにより影響を受けない（[066]４Ａ）。
【００５５】
または、ＴＲＩＦの発現を同様の方法を用いてノックダウンさせた場合に、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の両方によるＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発は同様の程度減少する（[066]４Ｂ）。
【００５６】
また、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７のMyD88/TRIF シグナル伝達特異性は、エンドサイトーシス依存性により区別し得る。最近、２つのグループ(Kagan et al. 361-68;Tanimura et al. 94-99)が、ＴＬＲ４受容体複合体の内部移行後にＴＬＲ４のＴＲＩＦ依存的シスシグナル伝達下流がエンドソーム／リソソームから開始される一方でＴＬＲ４のＭｙＤ８８依存的シスシグナル伝達下流は細胞膜から開始することを報告した。Kaganらは、エンドサイトーシス阻害剤のDynasoreを使ってＭｙＤ８８依存的サイトカインではなくＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発が抑制されることを示した。従って、以下に示されるようにDynasoreは、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７によるサイトカイン/ケモカイン誘発のＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存性を比較するのに使われる。
【００５７】
Dynasoreを用いたエンドサイトーシスの抑制によりヒトＰＢＭＣ由来マクロファージにおけるＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦ依存的ＲＡＮＴＥＳ誘発を抑制する一方で、未処理細胞と比べてＭｙＤ８８依存的MIP-1αの誘発は僅かに増加する。これらの結果は、ＴＬＲ４の下流のＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦ依存的サイトカイン誘発は、エンドサイトーシス後の同様のシグナル伝達機序により起こることを示唆している。
【００５８】
実施例４
ＣＲＸ−５４７はＣＲＸ−５２７と比べた場合、有意に低いレベルのNFκB の核移行および転写活性の誘発し、同等かまたはそれ以上に高いレベルのＩＲＦ−３核移行を誘発する。
【００５９】
TNFαおよびIL-1βを含めた多くの炎症性サイトカインの発現は、NFκBの活性化および核移行に依存する。ＴＬＲ４受容体複合体のＭｙＤ８８依存的およびＴＲＩＦ依存的シグナル伝達下流の両方が、転写因子であるNFκBの活性化および核移行を誘発する。しかしながら、ＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を介してNFκB活性化が後で誘発され、かつ、それはＭｙＤ８８依存的シグナル伝達を介する活性化と比べてかなり低い程度である(Yamamoto et. al. 2002)。
【００６０】
インターフェロン応答因子−３（ＩＲＦ−３）は、ＴＲＩＦ依存的ＴＬＲ４シグナル伝達経路の下流で活性化する転写因子である(Yamamoto et al. 640-43)。ＩＲＦ−３リン酸化により、ＩＲＦ−３の二量体化、核移行、ならびにＩ型インターフェロン(IFNβ)およびインターフェロン誘導性遺伝子の転写の誘発を生じる(Honda, Takaoka, and Taniguchi 349-60;Tailor, Tamura, and Ozato 134-40)。画像ストリームは、ラベルした転写因子と核特異的染料（ＤＲＡＫ−４）で染色された細胞核の共局在の定量化によりNFκBとIRF-3の両方の核移行を測定できる(Beum et al. 90-99;George et al. 117-29;Arechiga et al. 7800-04)。
【００６１】
ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７により開始したシグナルを比較するために、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７の処理によるNFκBおよびIRF-3の核移行の誘発は、画像ストリーム解析を用いてヒト単球細胞株であるMonoMac6 (MM6) において比較した。Error!Reference source not found.６は、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７で刺激されたＭＭ６細胞のゲーティングストラテジーを示す。
【００６２】
ＣＲＸ−５４７と比べると、ＣＲＸ−５２７はより初期のNFκB 核移行（刺激後、早ければ５分後）を誘発する。ＣＲＸ−５４７活性で誘発されるNFκB 核移行は、ある特定閾値（この場合は５０%前後）以上には決して達しない一方で、ＣＲＸ−５２７による刺激では３０分でほぼ１００％のNFκBが核移行する（Error!Reference source not found.７）。ＡＧＰのいずれも投与量依存的に機能するように見える。ＣＲＸ−５３７であるかＣＲＸ−５４７であるかの刺激に関わらず、高いバックグラウンドレベルのIRF3核移行が存在し、これはＴＲＩＦを介したシグナル伝達を示唆する（データは示さず）。初期のNFκB活性はＭｙＤ８８シグナル伝達パターンを示しているので、このデータはＣＲＸ−５２７はＭｙＤ８８を介して情報伝達するがＣＲＸ−５４７はＭｙＤ８８シグナル伝達の誘発において作用が弱いことを示す。
【００６３】
ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７での核移行の差異が転写活性化の上昇と言い換えられることを確認するために、ヒトTLR4, MD-2, CD14およびNFкBレポタープラスミドで形質移入したHEK293 細胞内でのＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７誘発NFκB活性化を比較する。核移行アッセイにあるようにＣＲＸ−５２７およびＬＰＳは、ＣＲＸ−５４７と比べて NF-κB プロモータの有意に高い活性化を誘発することが示されている（（Error!Reference source not found.８）。
【００６４】
実施例５
ＣＲＸ−５４７はＣＲＸ−５２７によるＭｙＤ８８依存的サイトカイン誘発を抑制する。
【００６５】
ＣＲＸ−５２７は、サイトカインおよびケモカインを誘発する転写因子の活性化に導くTLR4/MD2受容体複合体を介して情報伝達する。固定濃度のＣＲＸ−５２７またはＬＰＳを添加する前に、ＣＲＸ−５４７の濃度を高めて一次ヒト付着単球に添加した場合、ＭｙＤ８８依存的サイトカインであるTNFαの誘発は抑制される一方で、ＴＲＩＦ依存的ケモカインであるＭＣＰ−１の誘発は、より高い濃度のＣＲＸ−５４７にて相加的に増大する（Error!Reference source not found.）。TNFα 誘発を抑制するのに必要なＣＲＸ−５４７の濃度はＣＲＸ−５２７およびＬＰＳの固定濃度と同じ範囲にあり、これはＣＲＸ−５４７がＴＬＲ４複合体への結合についてＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと競合し得るが、結合時のＴＲＩＦ経路を介したシグナル伝達を主として誘発することを示唆する。
【００６６】
ＣＲＸ−５４７は、単球細胞におけるＴＬＲ４のＭｙＤ８８依存的サイトカイン/ケモカイン下流の誘発に対して、ＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと比較して部分的アゴニストであるように見えるので、単球細胞をＣＲＸ−５２７で処理した場合にＣＲＸ−５４７を含ませることはサイトカイン/ケモカイン誘発を抑制し得るし、ＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦ選択的シグナル伝達の作用メカニズムについて洞察を与える。この目的のために、一次ヒト単球をＣＲＸ−５４７の増加濃度下でＣＲＸ−５２７の用量範囲内で処理する。
【００６７】
得られる用量反応曲線は４−パラメーターロジスティック方程式に適合する。図１０Ａは、ＣＲＸ−５２７誘発TNFαについての容量反応曲線に対する 0 uM、0.000016 uM、0.004 uM、および0.1 uMのCRX-547の効果を示す。
【００６８】
部分的アゴニストとして予測されていたように、ＣＲＸ−５４７の濃度の増加により、TNFα誘導曲線をＸ軸に沿ってシフトする一方で、当該曲線の基礎レベル（下位の漸近線）が、ＣＲＸ−５２７の非存在下におけるＣＲＸ−５４７の反応レベルまで増加する。ＣＲＸ−５４７の濃度の対数に対してのＣＲＸ−５４７の各濃度についての対数 EC50 移動（ＤＲ−１）をプロットする（Ｓｃｈｉｌｄ回帰）と、ＣＲＸ−５４７およびＣＲＸ−５２７の用量応答曲線から計算したＣＲＸ−５４７についてのEC50 と、計算による親和性(Kbapp)とを比較することができる。この値は、ＣＲＸ−５４７の親和性がＣＲＸ−５４７のとＣＲＸ−５２７の両方のEC50 値に近づくことを確認し、ＣＲＸ−５４７はＴＬＦ４受容体複合体での結合とＭｙＤ８８依存的シグナル（TNFα 誘発を生む）について効果的にＣＲＸ−５２７と競合することを示唆している（図１０Ｂ）。
【００６９】
同様に、図１１は、ＣＲＸ−５２７またはＬＰＳの固定濃度を添加するとともに、ＣＲＸ−５４７の濃度を高めて一次ヒト付着単球に添加した場合、ＭｙＤ８８依存的サイトカインであるTNFαの誘発は抑制されることを示している。TNFαの誘発を抑制するのに必要とされるＣＲＸ−５４７の濃度はＣＲＸ−５２７およびＬＰＳの固定濃度(100 nM)と同じ範囲 (IC50CRX-527: 48±30 nM/IC50LPS: 18±12) であり、これはＣＲＸ−５４７がＴＬＲ４複合体との結合においてＣＲＸ−５２７とＬＰＳと競合することを示す。
【００７０】
ＣＲＸ−５４７が、一定のＣＲＸ−５２７で処理された細胞におけるNFκB核移行を拮抗するかを決定するために、ＣＲＸ−５４７の投与を増やしつつＭＭ６細胞を２０分、３５分および２時間刺激する（図１２）。同時にＡＧＰが添加された時にはＣＲＸ−５４７は、最大値の投与量のＣＲＸ−５２７で誘発されたNFκB核移行を拮抗した。ＣＲＸ−５４７が一定であり、ＣＲＸ−５２７でスパイクされた場合、ＣＲＸ−５２７刺激はＣＲＸ−５４７単独でのNFκB核移行の最大作用を克服できる。このデータは、ＣＲＸ−５４７とＣＲＸ−５２７はＴＬＲ４受容体複合体での結合について競合しＭｙＤ８８依存的シグナル伝達を抑制することを示す。
【００７１】
実施例６
ヒトＴＬＲ４の明らかなＴＲＩＦバイアスアゴニズムを持つＣＲＸ−５４７の類似体
ＡＧＰファミリーの中の類似体を評価するために、類似パターンのサイトカイン/ケモカイン誘発について、化合物を試験する。エステル連結二次アシル鎖を持つ、セリルＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７のＬとＤの異性体対を、エーテル連結二次アシル鎖、化合物１ａおよび１ｂ（Error!Reference source not found.１に示す化合物）、リード候補ＡＧＰの潜在的安定性強化修飾を持つセリル類縁体と比較した。興味深いことに、１ｂにおいて、分子を修飾してエステル結合二次アシル鎖ではなくエーテル結合二次アシル鎖を有することにより、、ＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の誘発についてＬ異性体に比べてＤ異性体において実質的な有効性を回復する（図１３）。エーテル結合Ｄ異性体によるＭｙＤ８８有効性救済の機序的な根拠は不明である。
【００７２】
実施例７
ＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７で、またはＣＲＸ−５２７もしくはＣＲＸ−５４７で刺激されたＭＭ６で刺激された一次ヒト単球のリン酸―ウェスタンブロット解析
セリン/トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫ−１の分解はＭｙＤ８８依存的ＴＬＲ４シグナル伝達の下流で起こる一方で、ＴＲＩＦ依存的ＴＬＲ４シグナル伝達はＩＲＦ−３活性化を起こす(Yamamoto et al. 6668-72;Yamamoto et al. 640-43)。一次ヒト単球は示された時間、ＣＲＸ−５４７かＣＲＸ−５２７のいずれかで刺激され、細胞分解溶解物をＭｙＤ８８経路―活性化キナーゼ、ＩＲＡＫ−１およびＴＲＩＦ経路―活性化転写因子ＩＲＦ−３（リン酸―ＩＲＦ−３および総ＩＲＦ−３）のレベルについて、ウェスタンブロットにて解析する。β−アクチンの値はローディング対照として使用される。ＣＲＸ−５２７で刺激した単球はＩＲＡＫ−１が急激に減少する一方で、ＣＲＸ−５４７で刺激した細胞ではこのタンパク質の分解の遅れ、減少が示された（Error!Reference source not found.４）。
【００７３】
ＴＬＲ４連結後のＭｙＤ８８対ＴＲＩＦシグナル伝達におけるＭＡＰＫシグナル伝達分子の役割は複雑である。なぜなら、ｐ３８が両方の経路に関係しているからである。しかしながら、ｐ３８リン酸化のＴＲＩＦ経路のインディケータとしての役割は文献に示されている。ＬＰＳ刺激の後のｐ３８のリン酸化はＴＲＩＦ-/- マウス由来のマクロファージ内で減少する一方で、ＴＲＩＦ+/+ マクロファージはｐ３８の持続性リン酸化を示し、これはＴＬＲ４連結後のＴＲＩＦがｐ３８のリン酸化状態の維持に役割をはたすことを示唆した(Thomas et al. 31119-30)。ｐ３８のリン酸化状態がＣＲＸ−５２７対ＣＲＸ−５４７での刺激後に異なることを決定するために、ＭＭ６細胞からの細胞分解溶解物をウェスタンブロット解析する。活性化の類似した動態を示したが、ＣＲＸ−５４７と比較した場合のＣＲＸ−５２７の刺激はｐ３８のリン酸化状態を僅かに増加させる（図１５）。
【００７４】
ＭＡＰＫ経路および下流の転写因子はＴＬＲアゴニストにより別個に調節される。ＩＲＡＫ４およびIκBαの分解はＴＬＲ４シグナル伝達後のＭｙＤ８８を示す一方で、ＴＲＩＦ媒介性ＴＬＲ４シグナル伝達はＩＲＦ３活性化を起こす(Yamamoto et al. 6668-72;Yamamoto et al. 640-43)。ＭＭ６は示された時間、ＣＲＸ−５２７かＣＲＸ−５２７(10ng/ml) のいずれかにより刺激される。細胞分解溶解物は採取されβ−アクチンをローディング対照として使用してＭｙＤ８８経路タンパク質、リン酸―IκBα、総IκBα、ＩＲＡＫ４，およびＴＲＩＦ経路タンパク質、リン酸−ｐ３８、総ＩＲＦ３およびリン酸ＩＲＦ３のウェスタンブロット解析が実施される。ＣＲＸ−５２７で刺激したＭＭ６細胞では総IκBαおよびＩＲＡＫ４が急激に減少した一方で、ＣＲＸ−５４７で刺激した細胞はＭｙＤ８８誘発シグナル伝達タンパク質両方の分解は遅れるか、少ない。ＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達タンパク質、リン酸―ｐ３８、総ｐ３８、ＩＲＦ３およびリンーＩＲＦ３においては、これらの２つのＡＧＰの違いは僅かであると認められる。
【００７５】
実施例８
マウスにおけるＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的シグナル伝達の評価
一次ヒト細胞の結果とは対照的に ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈投与した後ＣＲＸ−５４７はマウス血清中に同様のレベルのＭｙＤ８８依存的サイトカインを誘発する。この反応がＢＡＬＢ／ｃマウスに特異的でないことを確認するために、Ｃ５７／ＢＬ／６マウスにおいて血清サイトカイン誘発の同様の試験を実施する（Error!Reference source not found.）。ＢＡＬＢ／ｃマウスに認められる場合と比べて、選択したサイトカインについてＣＲＸ−５４７による相対的な誘発は僅かに小さいが（示していない）、動態（投与後２時間または６時間で誘発）およびサイトカイン誘発の強度はＭｙＤ８８依存的 (TNFα, IL-10) およびＴＲＩＦ依存的(RANTES, IP-10, MIG) サイトカイン/ケモカインについてはＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７と類似している。さらに、関心がもたれているものは、試験されたＭｙＤ８８依存的サイトカインの誘発が投与後６時間よりも２時間において常に高い値である一方で、ＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発は各アゴニストの６時間で高く、これは二つの経路を介したサイトカインの誘発の異なる動態を示唆する。この現象は、多くのＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発について従来から認められている初期のIFNβ誘発およびオートクリン／パラクリン活性の必要性(Perry et al. 407-22)、または、エンドサイトーシスの必要性によるＴＲＩＦ依存的シグナルの遅れ(Kagan et al. 361-68)で説明できる。
【００７６】
ＬおよびＤ異性体ＡＧＰによるin vitroにおけるＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン/サイトカイン誘発を試験したいくつかの実施例（下記の実施例１２-１４を参照）。マウスPBMCでのサイトカイン誘発、マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7でのサイトカイン誘発、および muTLR4/muMD2―形質移入HEK293細胞での NFкB活性誘発を含む各ケースにおいて、セリルＡＧＰのＤ異性体は、本明細書に開示されたヒト系で示されたのと同じＴＲＩＦシグナル伝達バイアスは示さない。
【００７７】
実施例９
ＣＲＸ−５４７シグナル伝達の種特異性（マウス対ヒト）についての受容体の基礎
ＴＲＩＦバイアス状態でのシグナル伝達について、ＣＲＸ−５４７、ＣＲＸ−５２７のＤ異性体での２つのＡＧＰ異性体における異なるシグナル伝達パターンが注目される一方で、ＣＲＸ−５２７はＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的経路の両方を介して情報伝達する。研究の初期の段階では、ヒトの細胞で認められマウスでは認められないのでＣＲＸ−５４７ＴＲＩＦバイアスシグナル伝達は種依存的と思われた。この明かな相違を取り上げるために、ヒトおよびマウスのTLR4-、MD-2-、および CD14-形質移入HEK293細胞ならびにこれらの組み合せを用いて受容体/共受容体の必要性ならびにＡＧＰシグナルについての受容体の種特異性を試験する。
【００７８】
huTLR4、huMD-2、およびhuCD14で形質移入された、ならびにＣＲＸ−５４７で刺激されているHEK293細胞はＣＲＸ−５２７とＬＰＳと比べてNFκBリポータ活性を少なく誘発する一方で、muTLR4-、muMD-2-、およびmuCD14-形質移入HEK293細胞におけるＣＲＸ−５４７により誘発される活性レベルはＣＲＸ−５２７およびＬＰＳに類似してる（Error!Reference source not found.）。ＣＲＸ−５４７によるシグナルの誘発について、この解析はマウスＴＬＲ４受容体複合体を好むことを示す。この種特異性の理由がＴＬＲ４自身なのか別の補助受容体成分なのかをはっきりするために、解析にはヒトおよびマウスＴＬＲ４受容体成分の組み合せを発現するＨＥＫ２９３細胞を含める。
【００７９】
Error!Reference source not found.８に示すように、ヒトＨＥＫ２９３細胞がＴＬＲ４およびマウスＭＤ−２の組み合せで形質移入された場合、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の間にプロモータ活性の誘導についての大きな相対差が残ることは、この相違がヒトＴＬＲ４でのＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の相互作用における相違からくることを示唆する。ＨＥＫ２９３細胞がマウスＴＬＲ４とヒトＭＤ−２との組み合せで形質移入された場合、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７が類似のレベルのプロモータ活性を誘発していることは、活性の差がＡＧＰ/ＴＬＲ４接触面での相互作用の相違からきていることを示唆する。これらの結果は、アシル鎖の長さおよびＭｕｒｏｉらが認めた分子のＭＤ−２との相互作用の差を発生させた組成物における修飾の影響とは異なる(Muroi, M and Tanamoto, K. (2006). J. Biol. Chem. 281. p5484-5491)。
【００８０】
注目すべきは、活性のレベルは同系の受容体成分を有する複合体が存在する時(huTLR4/huMD2, muTLR4/muMD2)よりもキメラ複合体(huTLR4/muMD2, muTLR4/huTLR4)において全体的により低いということであり、これは、種間キメラがこの系では最適に機能していないことを示唆する。ＣＲＸ−５４７の意図する種特異性に寄与する特定の残基を解明するにはさらなる生化学的解析が必要となる。
【００８１】
実施例１０
筋肉内投与によるリード候補ＡＧＰを使ったウサギ毒性試験
ＣＲＸ−５２７、５２４、５４７および化合物１の毒性は、ＡＧＰのみを筋肉内投与したウサギで評価する。３匹のウサギの群に、０日目、７日目、１４日目に１ｍＬの希釈ＡＧＰ，またはＭＰＬ対照をＩＭにてワクチン接種した。高用量（25 μg）と低用量（5 μg）の２つのＡＧＰを評価した。体重、体温、臨床症状およびDraizeスコア について全ての動物をモニターする。これらの動物は最終投与後一週間で犠牲にする。血液学分析と臨床化学検査のため処理前、第２回接種後２日目、および犠牲にした時に血液を採取する。注射部位および主要臓器の病理組織検査を実施する。
【００８２】
第２回目と第３回目のワクチン接種した間のＭＰＬ群を除いて、全ての動物は試験の期間を通して体重増加を示した（図１９）。賦形剤対照群含めてワクチン摂取後の温度変化± 〜1°Cが見られる（図２０）。ウサギの体温は正常な範囲にある。賦形剤対照群を含めたすべての群について Draize scoreで最小注射部位反応が見られ、ワクチン接種の回数が増えるに従い反応は減少した（図２１）。ＣＲＸ−５２４を除き、アジュバント高投与群のすべてで針痕に沿った筋肉が白色に変色した個所および注射部位にて病変が見られる。ＣＲＸ−５２７および化合物１に病変が認められるが低用量のＣＲＸ−５２４または−５４７の治療群はこの限りでない。
【００８３】
血液学分析では、低用量および高用量のＣＲＸ−５２７ならびに低用量のＣＲＸ−５２４と化合物１を投与したウサギで９日目 (2 days post-2°) に顆粒球増加症の傾向が認められ、これは２１日目(7 days post-3°)までに消失する。ＡＧＰは好中球を引き寄せることが知られている。ワクチン接種後の臨床化学的値が注目される傾向は認めなかった。
【００８４】
筋病変がみられない低用量のＣＲＸ−５４７を例外として、主に好塩基球およびマクロファージ筋炎を含む注射部位での炎症は、全ての処置群において唯一偶発所見でない（図2225）。高用量のＣＲＸ−５２７において筋炎が最も一貫して最大である。さらに、直近の２回の注射による注射部位と筋炎が一致しており、これは炎症反応の一過的な特性を示す（データは示さず）。
【００８５】
ＣＲＸ−５４７は高用量でのみ最小毒性であり、ＣＲＸ−５２４、−５２７および化合物１は低パワー (n=3 ウサギ/群)で中程度の毒性であるような全体的な印象である。病理所見は一過性である。
【００８６】
実施例１１
ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７処理に反応するサイトカイン遺伝子発現
ヒト細胞におけるサイトカイン/ケモカイン分泌の誘発についてＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７を比べるために、そしてさらに観察された相違点の原因となるシグナル伝達機序を解明するために、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７により誘発された遺伝子発現をマイクロアレイ技術を使い評価した。最初の実験は、qPCRを使ったＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン遺伝子誘発の時間経過解析を含む。この解析は、両方のアゴニストについてＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子の誘発は処理後１-２時間で検出可能となり、処理後３時間で確固としたレベルへ上昇し、処理後６時間でベースラインレベル近傍へ下降することを示している（データは示さず）。ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカインの両方の誘発については処理後３時間で最高値となる傾向があり、ＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的誘発の間の実質的な動態的差異は遺伝子発現のレベルでは動作しないことを示唆する。動態的パターンの１つの例外はIFNβ誘発であるが、これはＣＲＸ−５４７かＣＲＸ−５２７処理かのいずれかで１時間処理後すでに最高値を示す状態にあり、その後低下する。
【００８７】
本解析においてＣＲＸ−５４７と比べてＣＲＸ−５２７はより大きなＭｙＤ８８依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子発現を誘発するのみでなく、より大きなＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン遺伝子発現を誘発する。この現象は、ＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン分泌での２つのアゴニストが類似しているサイトカイン/ケモカインタンパク質分泌について認められるパターンと相関しない。このデータは、他の因子がＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７により誘発されてＴＲＩＦ依存的サイトカイン/ケモカイン分泌のレベルに影響を与えていることを示唆する。１つの可能性として、ＣＲＸ−５２７と比べてＣＲＸ−５４７処理が誘発するより大きなＴＲＩＦ依存的遺伝子mRNA 安定性がある。この遺伝子のレベルは処理後６時間でほぼベースラインまで減少しているが（データは示さず）、３時間から６時間のmRNAのレベルはまだ試験が終了していない。
【００８８】
in vitroマウス系
実施例１２ in vitroサイトカイン誘発
上述のとおり、より少ないＣＲＸ−５４７によるＴＲＩＦバイアスが、マウスのＰＢＭＣを用いるサイトカイン誘発実験、マウスの細胞株(RAW264.7)およびＨＥＫ２９３形質移入試験（データは示さず）において示唆される。拡張した投与範囲を使い、エステル連結脂肪アシル鎖ではなくエーテルを用いる追加のＬおよびＤ異性体対、化合物１ａおよび１ｂを試験してRAW264.7細胞におけるＣＲＸ−５４７およびＣＲＸ−５２７によるサイトカインのさらなる比較を提供する（図１）。さらに、種特異性の現象に対するより大きな機序の理解を取得するために、キメラヒト/マウスＴＬＲ４受容体複合体で形質移入された細胞においてＣＲＸ−５４７により誘発されたシグナル伝達を比較した。さらに、そのような種―特異的ＴＬＲ４アンタゴニスト/アゴニスト活性が、リピッドＩＶａである４つの一次アシル鎖のみの大腸菌からのリピッドＡ前駆体について報告されており(Muroi, Ohnishi, and Tanamoto 3546-50;Muroi and Tanamoto 5484-91)、この活性はマウスでのＴＬＲ４補助受容体MD-2の構造上の違いに起因した。
【００８９】
マウス血液由来のＰＢＭＣがＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７で処理した後にＭｙＤ８８サイトカインの同様なプロファイルを有するかを調べるために、市販されているＢＡＬＢ/ｃマウスからの血液をＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７を用いて試験をする（図２４）。試験を行った２群間ではレベルは同様と思われる。
【００９０】
マウス細胞においてＬおよびＤ異性体間の効力の共通性をより比較し確認するために、RAW264.7（マクロファージ）細胞を、ＭｙＤ８８(TNFα) およびＴＲＩＦ依存的(IP-10)産生のためにアッセイしたＣＲＸ−５２７，ＣＲＸ−５４７、化合物１ａおよび１ｂならびに上清を用いてより広い投与範囲で刺激した。この範囲ではＣＲＸ−５４７よりもＣＲＸ−５２７がTNFαおよびIP-10の産生を誘発する能力がより高い。このマウス細胞株については、ＴＲＩＦおよびＭｙＤ８８依存的サイトカインの両方に対するＣＲＸ−５４７の誘発はＣＲＸ−５２７に比べて能力が低い。このデータは、ヒト細胞株におけるＭｙＤ８８依存的サイトカインの誘発についてＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の活性の差異は一般的にマウス細胞株に比べてかなり大きいのであるが、ＣＲＸ−５４７の種特異的活性は明確ではなく、このことは、ＣＲＸ−５４７のマウスとヒトのＴＬＲ４/ＭＤ２受容体複合体との相互作用において主要な差異が存在することを示唆している。
【００９１】
化合物１ａおよび１ｂはマウスとヒトの細胞株において同じレベルのＴＲＩＦおよびＭｙＤ８８依存的サイトカインを誘発するが、アグリコンセリル基のＬ異性体からＤ異性体までの変化と合わせたエステル連結脂肪酸鎖からエーテル連結脂肪酸鎖まで変化がヒト細胞中のＤ異性体の活性を救済するを示唆している。ＡＧＰ上の荷電基の相対的位置をこれらの修飾の両方が変えるので、この差異は分子のＴＬＲ４/ＭＤ２受容体複合体との相互作用における差異と関連し得る。
【００９２】
ＴＬＲ４刺激の後のＭｙＤ８８依存的シグナル伝達がＴＲＩＦ依存的シグナルよりも先であり、かつ、ＭｙＤ８８とＴＲＩＦの両方がNFκB経路の活性化により下流TNFα産生を誘発し得るために、ＬおよびＤ異性体で刺激した後のサイトカイン産生について初期の時点を試験をする。刺激を４時間した後、ＣＲＸ−５２７の方がRAW264.7細胞でのTNFαおよび IP-10産生を誘発する能力が僅かに高いように見える（図２７と２８）。
【００９３】
実施例１３ マウスRAW264.7細胞のウェスタンブロット解析
RAW264.7細胞でのＴＲＩＦ対ＭｙＤ８８における主要なタンパク質シグナル伝達分子のリン酸化（活性化）状態を測るために、細胞は予備活性化（10 -7M PMAを用いて）し10ng/mlのＡＧＰで刺激した。細胞分解溶解物は、０、１５ｍ、３０ｍ、４５ｍ、６０ｍ、１２０ｍ、２４０ｍで調製した。ＭＭ６細胞の結果と同様に、ＣＲＸ−５４７と比べてIκBα の分解がＣＲＸ−５２７での刺激の後は早く進んだ(Error!Reference source not found.17)。驚くべきことに、ＣＲＸ−５４７の刺激はより高いIκBαリン酸化とＩＲＦ３リン酸化をもたらす。これらの細胞の増加した反応性は単球細胞の成熟状態を向上させると知られるＰＭＡでの予備活性化によると思われ、ＣＲＸ−５４７はリン酸―IκBαおよびリン酸―IRF3の発現を誘発する。ＩＲＦ３はＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達を経て誘発される。また、総ＩＲＦ３タンパク質の量はＣＲＸ−５４７で処理された細胞においてより高い。（注記：実験回数は一回であり、負荷コントロール(βactin)は不均一な負荷の可能性を示唆する。）
実施例１４ ＲＮＡ干渉解析
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＴＬＲ２，ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８のＴＬＲシグナル伝達経路に含まれる特異的遺伝子の発現を破壊するのに利用される。RAW264.7 siRNA細胞株は市販されているプラスミド (Invivogen)を使って調製される。このプラスミドはZeocin選択マーカー、ＧＦＰをコードする配列およびノックダウン用のshRNAをコードする配列を含む。細胞が一度効率的に形質移入すると、安定した細胞株が抗生物質選択を経て生じる。培養物の精度は、培養系内のＧＦＰ+細胞で決定される。また、無関係なプラスミドも対照として安定的に細胞を形質移入するのに使われる。図３０は、同系のsiRNAの安定的な形質移入体においてのＭｙＤ８８とＴＲＩＦのノックダウンを示す。図３０Ａは、サイトカイン−再生実験の前にＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが３つのすべての細胞株において９６％以上であることを示す。図３０Ｂは、ＬＰＳでの刺激が無関係の対照と比べてタンパク質のレベルが低下しているのでＭｙＤ８８とＴＲＩＦについて首尾よくノックダウンした証拠を示す。
【００９４】
ＬおよびＤ異性体による刺激の後、ＴＲＩＦまたはＭｙＤ８８がサイトカイン応答に必要であるかを測定するために、安定的に形質移入した siRNA細胞株を２０時間（ＭＭ６力価アッセイに類似するアッセイで）または４時間（ＭｙＤ８８誘発サイトカイン応答を捉えるため）刺激し、細胞の上清はTNFα (MyD88)およびIP-10 (TRIF)についてアッセイした。刺激後の２０時間において、無関係な対照であるＬＵＣ細胞株は、wt RAW264.7細胞が以前に示したものと類似のＩＰ−１０誘発パターンを示す。ＴＲＩＦノックダウン細胞において、ＩＰ−１０レベルが無関係な対照で認められた応答と同じ用量応答にならないことは、ＴＲＩＦはＡＧＰ刺激の後、効率的なＩＰ−１０応答を必要としていることを示唆する。ＴＲＩＦが無傷の場合（ＭｙＤ８８ノックダウン細胞株において）、ＩＰ−１０レベルは用量反応を示し、総ケモカインは無関係な対照（ＬＵＣ）を超えて上昇する。他のアッセイ系（ヒトおよびマウス系を含む）は、ＬとＤ異性体の両方ともがＴＲＩＦ媒介性サイトカインを誘発するに効率的であるという仮説を支持する。
ＭｙＤ８８（TNFαの初期放出）およびＴＲＩＦ（NFκBの遅延活性化によるTNFαの遅延放出）の両方でコントロールされるTNFαにおいて、ＣＲＸ−５２７はＣＲＸ−５４７と比べて、無関係な対照においてより能力がある（図３１）。ＭｙＤ８８またはＴＲＩＦのいずれかがノックダウンしている場合、ＣＲＸ−５４７を超えるＣＲＸ−５２７の効力の増加が認められる。TNFαがＭｙＤ８８とＴＲＩＦの両方で誘発するので、２０時間の時点ではＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７の刺激の後のシグナル経路間を十分に区別できない。総合すると、このデータは試験された時間枠内でTNFαはＭｙＤ８８を必要としないか、または、ＭｙＤ８８のsiRNAのノックダウンがTNFαを抑制するのに十分でないという２つの可能性を示唆する。ＴＲＩＦシグナル単独がTNFαを誘発できるとう仮説はある程度裏付けられ、つまり、この誘発はＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達によるものである得る。従って、TNFα誘発はＭｙＤ８８とＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達の両方によるものである得る。化合物１ａおよびＣＲＸ−６７９は両方のアッセイ系において２０時間で同等の反応性を持つ。
【００９５】
ＭｙＤ８８のTNFα産生の要件をより良く区別するために、siRNAノックダウン細胞株をＡＧＰ刺激を４時間した後、TNFαの産生に関して試験した（図３５）。刺激後の４時間でＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７は無関係な対照細胞株（ＬＵＣ）においてTNFαを同様に誘発することを示した。力価の差異およびTNFα産生のピークは、TNFα産生がＭｙＤ８８の誘発に限定されるＴＲＩＦのノックダウン細胞において増強された。ＭｙＤ８８のノックダウンは２つのＡＧＰ間の同様なレベルのTNFα産生を生じる。総合すると、このデータはＡＧＰによる刺激の後のTNFα産生の誘発を早期に行うＭｙＤ８８の要件を示している。さらに、ＣＲＸ−５２７は同一投与量のＣＲＸ−５４７よりもTNFαを誘発する能力が強い。化合物１ａおよび１ｂは同様なサイトカインのパターンを生じる。RAW264.7細胞を用いて刺激した４時間後のＩＰ−１０レベルは非常に低いので siRNA 細部株はＩＰ−１０レベルについてアッセイしなかった。
【００９６】
参考文献
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物をヒトに投与することを含む、ＣＲＸ５４７含まないリピッドＡ模倣物組成物をヒトに投与した場合に誘発されるＭｙＤ８８依存的サイトカインのレベルを減少させる方法。
【請求項２】
ＣＲＸ５４７をリピッドＡアジュバント組成物へ組み込むことを含む、より低いレベルのIL-12p70およびIL-23の誘発が可能なヒトリピッドＡ模倣物アジュバント組成物を製造する方法。
【請求項３】
ＣＲＸ５２７により誘発されるNF-κB活性のレベルおよびＩＲＦ−３レベルと比較した場合に、有意に低いレベルのNF-κB活性、および同等か、またはより高いレベルのＩＲＦ３をヒト系において誘発する方法であって、該方法がＣＲＸ５４７を投与することを含む、上記方法。
【請求項４】
第二合成リピッドＡ模倣物を第一のリピッドＡ模倣物と共に投与することを含む、該第一のリピッドＡ模倣物によるＭｙＤ８８依存的サイトカイン誘発を抑制する方法であって、該第二リピッドＡ模倣物がＣＲＸ５４７である、上記方法。
【請求項５】
合成リピッドＡ模倣物を投与することを含む、ＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を選択的に誘発する方法。
【請求項６】
ＴＬＲ４受容体複合体を介する有意なＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を誘発する一方で、ＡＧＰ ＣＲＸ５２７を含む組成物により誘発されるＭｙＤ８８依存的シグナル伝達のポテンシャルを有意に低減する方法であって、該方法が該組成物内のＣＲＸ５４７をＣＲＸ５２７に置換することを含む、上記方法。
【請求項７】
ヒト細胞にＣＲＸ５４７に投与することを含む、ＣＲＸ５２７により誘発されるレベルと比較してより低いレベルのIL-12p70およびIL-23をヒト細胞に誘発する方法。
【請求項８】
ＣＲＸ５４７を投与することを含む、ヒト細胞においてＣＲＸ５２７により誘発した同等か、またはより高いレベルのＩＲＦ３ではあるが、より低いレベルのNF-κB活性を有意に活性する方法。
【請求項９】
アジュバント組成物にＣＲＸ５４７を組み入れるステップを含む、リピッドＡ模倣物アジュバント組成物の治療係数を向上させる方法。
【請求項１０】
アジュバント組成物がＣＲＸ５４７ではない少なくとも１つのＡＧＰを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトにおけるリピッドＡ模倣物に対するＴＲＩＦバイアス応答を誘発するためのＣＲＸ５４７の使用。
【請求項１２】
ヒトにおけるリピッドＡ模倣物に対するＴＲＩＦバイアス応答の誘発において使用するためのＣＲＸ５４７。
【請求項１３】
ヒトにおけるＴＲＩＦバイアス応答の誘発において使用するためのＣＲＸ５４７。
【請求項１４】
ヒトにおける免疫反応を向上させるのに使用するためのＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であって、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比較して、ＴＲＩＦ依存的サイトカインが増加し、ＭｙＤ８８依存的サイトカインは減少する、上記組成物。
【請求項１５】
ヒトにおいて免疫反応を向上させるのに使用するためのＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であって、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比較して、NF-κB活性は減少するが、同等またはより高いレベルのＩＲＦ３が認められる、上記組成物。
【請求項１６】
ヒトにおいて免疫反応を向上させるのに使用するためのＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であって、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べて、IL-12p70およびIL-23のレベルは低下する、上記組成物。
【請求項１７】
ヒトにおいて免疫反応を向上させるのに使用するための、ＣＲＸ５４７であって、該免疫反応においてＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べてIL-12p70およびIL-23レベルは低下する、上記ＣＲＸ５４７。
【請求項１８】
ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物がＣＲＸ５２７を含む、請求項１７に記載のＣＲＸ５４７。
【請求項１９】
抗原をさらに含むＣＲＸ５４７を含む、請求項１８に記載のリピッドＡ模倣物組成物。
【請求項１】
ＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物をヒトに投与することを含む、ＣＲＸ５４７含まないリピッドＡ模倣物組成物をヒトに投与した場合に誘発されるＭｙＤ８８依存的サイトカインのレベルを減少させる方法。
【請求項２】
ＣＲＸ５４７をリピッドＡアジュバント組成物へ組み込むことを含む、より低いレベルのIL-12p70およびIL-23の誘発が可能なヒトリピッドＡ模倣物アジュバント組成物を製造する方法。
【請求項３】
ＣＲＸ５２７により誘発されるNF-κB活性のレベルおよびＩＲＦ−３レベルと比較した場合に、有意に低いレベルのNF-κB活性、および同等か、またはより高いレベルのＩＲＦ３をヒト系において誘発する方法であって、該方法がＣＲＸ５４７を投与することを含む、上記方法。
【請求項４】
第二合成リピッドＡ模倣物を第一のリピッドＡ模倣物と共に投与することを含む、該第一のリピッドＡ模倣物によるＭｙＤ８８依存的サイトカイン誘発を抑制する方法であって、該第二リピッドＡ模倣物がＣＲＸ５４７である、上記方法。
【請求項５】
合成リピッドＡ模倣物を投与することを含む、ＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を選択的に誘発する方法。
【請求項６】
ＴＬＲ４受容体複合体を介する有意なＴＲＩＦ依存的シグナル伝達を誘発する一方で、ＡＧＰ ＣＲＸ５２７を含む組成物により誘発されるＭｙＤ８８依存的シグナル伝達のポテンシャルを有意に低減する方法であって、該方法が該組成物内のＣＲＸ５４７をＣＲＸ５２７に置換することを含む、上記方法。
【請求項７】
ヒト細胞にＣＲＸ５４７に投与することを含む、ＣＲＸ５２７により誘発されるレベルと比較してより低いレベルのIL-12p70およびIL-23をヒト細胞に誘発する方法。
【請求項８】
ＣＲＸ５４７を投与することを含む、ヒト細胞においてＣＲＸ５２７により誘発した同等か、またはより高いレベルのＩＲＦ３ではあるが、より低いレベルのNF-κB活性を有意に活性する方法。
【請求項９】
アジュバント組成物にＣＲＸ５４７を組み入れるステップを含む、リピッドＡ模倣物アジュバント組成物の治療係数を向上させる方法。
【請求項１０】
アジュバント組成物がＣＲＸ５４７ではない少なくとも１つのＡＧＰを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトにおけるリピッドＡ模倣物に対するＴＲＩＦバイアス応答を誘発するためのＣＲＸ５４７の使用。
【請求項１２】
ヒトにおけるリピッドＡ模倣物に対するＴＲＩＦバイアス応答の誘発において使用するためのＣＲＸ５４７。
【請求項１３】
ヒトにおけるＴＲＩＦバイアス応答の誘発において使用するためのＣＲＸ５４７。
【請求項１４】
ヒトにおける免疫反応を向上させるのに使用するためのＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であって、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比較して、ＴＲＩＦ依存的サイトカインが増加し、ＭｙＤ８８依存的サイトカインは減少する、上記組成物。
【請求項１５】
ヒトにおいて免疫反応を向上させるのに使用するためのＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であって、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比較して、NF-κB活性は減少するが、同等またはより高いレベルのＩＲＦ３が認められる、上記組成物。
【請求項１６】
ヒトにおいて免疫反応を向上させるのに使用するためのＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物であって、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べて、IL-12p70およびIL-23のレベルは低下する、上記組成物。
【請求項１７】
ヒトにおいて免疫反応を向上させるのに使用するための、ＣＲＸ５４７であって、該免疫反応においてＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物と比べてIL-12p70およびIL-23レベルは低下する、上記ＣＲＸ５４７。
【請求項１８】
ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物がＣＲＸ５２７を含む、請求項１７に記載のＣＲＸ５４７。
【請求項１９】
抗原をさらに含むＣＲＸ５４７を含む、請求項１８に記載のリピッドＡ模倣物組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公表番号】特表２０１２−５１３４７８（Ｐ２０１２−５１３４７８Ａ）
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４３６８３（Ｐ２０１１−５４３６８３）
【出願日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９４６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５５４５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月１４日（２０１２．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２３日（２００９．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９４６５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５５４５
【国際公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]