ＴＴＦ−１ｍＲＮＡの測定方法
【課題】再現性が良好で、多数検体処理に適し、検査コストを低減でき、その上増幅核酸の二次汚染を招き難い、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法を提供する。
【解決手段】ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ中の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、相補的な配列を有する第二のプライマー（第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において、増幅されたＲＮＡ産物量を、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブで経時的に測定することによる、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法。
【解決手段】ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ中の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、相補的な配列を有する第二のプライマー（第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において、増幅されたＲＮＡ産物量を、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブで経時的に測定することによる、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅法を利用したサイロイド・トランスクリプション・ファクター１（Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ−１、以下「ＴＴＦ−１」と略記する）ｍＲＮＡの測定方法に関する。より詳細に本発明は、４０から６０℃の範囲内で、一定温度（好ましくは４３℃）でＴＴＦ−１ｍＲＮＡの増幅・検出を行う方法と、かかる方法に好適に用いることができるオリゴヌクレオチド等に関するものである。本発明の方法及びオリゴヌクレオチド等は、分子生物学、生化学、医学分野などにおけるＴＴＦ−１ｍＲＮＡの研究や診療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫｘ２ファミリーに属する転写因子であるＴＴＦ−１は、癌のマーカータンパク質の一つとして利用されている。ＴＴＦ−１は、肺における初期形態形成や上皮細胞におけるサーファクタントタンパク質の発現に必須とされるタンパク質であるが、その発現場所が甲状腺、肺及び間脳に特異的であることによる。ＴＴＦ−１は腫瘍組織はもとより正常組織でも発現しており、腫瘍特異的マーカーではないが、上記の通り、臓器特異性が非常に高いタンパク質であるため、腫瘍組織におけるＴＴＦ−１の発現を調べることで、その腫瘍細胞の系統に関する情報を得ることが出来る。すなわち、腫瘍組織においてＴＴＦ−１の発現が認められれば、その腫瘍細胞は甲状腺癌、肺癌又はそれらの癌が転移したものと考えることができる。
【０００３】
ＴＴＦ−１を検出して癌の診断を行う手法として、免疫組織染色等の病理組織的診断が多用されてきたが、近年では、実施に際しての習熟が不要で、診断に供するサンプルの状態によらず安定した結果を期待し得る遺伝子検査（核酸増幅法）によりＴＴＦ−１を検出することが提案され、一部では実用化の試みがなされている。核酸増幅法が高感度であることはすでに知られており、特定の遺伝子を増幅するため高い特異性を得ることも可能である。一般に、核酸増幅法を利用した腫瘍マーカー遺伝子ｍＲＮＡの検出の際には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が広く用いられており、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡに対する適用も報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６参照）。
【０００４】
前記ＲＴ−ＰＣＲ法とは異なり、一定温度でＲＮＡのみを増幅するＮＡＳＢＡ法（特許文献１、特許文献２）やＴＭＡ法（特許文献３）等も知られている。これらＲＮＡ増幅方法では、増幅されるべきＲＮＡに対し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）を用いることで、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによって当該ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生成するものである。この生成するＲＮＡは、引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となるため、連鎖反応が生じる。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動や検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより、生成（増幅）されたＲＮＡを検出する。
【０００５】
一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法の中でも、いわゆるＴＲＣ法（特許文献４及び非特許文献７）は、簡便にＲＮＡを増幅し測定できる優れた方法である。この方法では、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変更するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、ＲＮＡの増幅を行い、蛍光特性の変化を測定するもので、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅及び測定を、同時かつ迅速、簡便に実施することが可能である。この方法では、増幅された核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するため、増幅された核酸を直接的に検出でき、また、複数のインターカレーター性蛍光色素を使用することで、複数の核酸を増幅後、個々に検出することができる。具体的には、測定されるべきＲＮＡに存在し、当該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る配列（特定塩基配列）に対して、（ａ）当該特定塩基配列の３’末端側に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、当該ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、（ｂ）（ａ）の逆転写反応によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成させ、（ｃ）（ｂ）で生成した１本鎖ＤＮＡの３’末端に相補的で、かつ、それ自身がその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、（ｄ）（ｃ）で生成した２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて転写産物（特定塩基配列のＲＮＡ）を生成させる、というものである。なお、（ｄ）で生成したＲＮＡ転写産物は特定塩基配列に由来するＲＮＡであるため、前記（ａ）の反応における鋳型となり、前記（ａ）の反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（ａ）から（ｄ）の反応が進行することでＲＮＡ増幅の連鎖反応が起きる。
【０００６】
ＴＲＣ法は、ＰＣＲ法のように反応液の温度を昇降させる必要がなく、またＲＮＡの逆転写と、その後のＤＮＡ増幅反応を分けて実施することがない、という特徴を有する。またさらに、増幅されたＲＮＡ転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させ、特定塩基配列または当該塩基配列に相補的な配列の増幅と同時に、当該増幅の様子を直接的に検出（モニタリング）することができるという特徴を有する。したがって、ＰＣＲ法や通常のＲＮＡ増幅法のように、増幅産物について別個にハイブリダイゼーション検出などを行なう必要がないため、結果を得るまでの時間を大幅に短縮可能であるという特徴を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献５】特開平７−５９５７２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｉａｎｇ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６，８４９−８５４（２００７）
【非特許文献２】Ｋｏｌｌａ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３６，２１３−２２５（２００７）
【非特許文献３】Ｔａｋａｎｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１８，７１５−７２０（２００７）
【非特許文献４】Ａｋａｇｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，９９，７８１−７８８（２００８）
【非特許文献５】Ｍｉａｓａｋｉ ＦＹ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，３１，７２４−７３０（２００８）
【非特許文献６】Ｋｏｎｄｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８９，７９１−７９９（２００９）
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，１２４７−１２５２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、例えば、腫瘍組織からＲＮＡを抽出後、（ａ）抽出したＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、及び、（ｂ）当該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し検出する工程、という二段階の工程（場合によってはさらに検出工程を別個に実施する必要がある）が必要であるため、操作の煩雑性や二次汚染の可能性がある。また、この二段階の工程を実施するのに通常２時間以上必要であり、複数の工程の実施による再現性不良、多数検体処理や検査コストの低減という面でも解決すべき課題がある。反応時間短縮のため、前記二工程を同時に行なうＯｎｅＳＴＥＰ ＲＴ−ＰＣＲ法も開発されているが、各工程を別個に行なうＲＴ−ＰＣＲ法に比べて検出感度の低下や非特異的な増幅産物が産生されやすいという課題が指摘されている。さらに、ＰＣＲ法による増幅では２本鎖ＤＮＡが増幅されるため、増幅対象サンプルに混入する染色体ＤＮＡも増幅する可能性がある。このような懸念を払拭して厳密にＲＮＡを増幅するためには、事前にＤＮａｓｅなどによる消化を行ない、染色体ＤＮＡを除いておく必要があり、操作の更なる煩雑化や再現性不良という課題を生じる。さらに、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、かかる操作が自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となる。
【００１０】
ＲＮＡのみを増幅する方法は、一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ＮＡＳＢＡ法やＴＭＡ法ではハイブリダイゼーション法などによる煩雑な検出操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であり、再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。ＮＡＳＢＡ法やＴＭＡ法では、結果が出るまでに通常９０分以上必要であり、迅速性という面で課題がある。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、場合によっては増幅工程前に予備加温（例えば、６５℃）が必要となる場合があるという課題もある。
【００１１】
ＴＲＣ法においては、前述した種々の特徴から、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法又はＴＭＡ法に比較して、簡便な操作により、良好な再現性を維持しつつ、迅速に実施可能で、しかもその自動化に際しては反応装置の省力化や低コスト化が容易に可能であるという特徴を有する。しかしながら、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡをＴＲＣ法にて増幅するためのプライマー配列についてはこれまで報告されていない。なお、反応の開始時に増幅工程を実施する一定の温度よりも高温にし、測定されるべきＲＮＡの高次構造を変性させる工程を実施するＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法又はＴＭＡ法などの核酸増幅法と異なり、ＴＲＣ法では、増幅反応を通じ、比較的低温の一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下でＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅し検出するため、ＲＴ−ＰＣＲ法のために開発されたプライマー等をＴＲＣ法で使用することはできない。つまり、一般にｍＲＮＡのような１本鎖ＲＮＡは高次構造を形成しやすいことが知られており、ＴＲＣ法のような反応条件下では、測定されるべきｍＲＮＡが高次構造を形成し、プライマー等との結合が阻害されると考えられるため、ＴＴＦ−１の高次構造フリー領域に結合するよう設計されたプライマー等がその実施には必要となる。加えて、ＴＲＣ法のように比較的低温で実施する核酸増幅法では、ＰＣＲ法のように高温で実施する増幅法と比較して、プライマーダイマーといった非特異産物が生産しやすいために、非特異産物の生成を低減できるように設計されたプライマー等が必須となる。このように、一定温度ＲＮＡ増幅し検出するＴＲＣ法によってＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを迅速、簡便、高感度に検出するためには、一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下においても結合効率が低下せず、かつＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの増幅、検出が可能なプライマー（オリゴヌクレオチド）等が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、前記課題を解決するためになされたもので、試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法において、前記測定方法が、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである：
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
かつ、前記第一及び第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、というものである。
【００１３】
また本発明は、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１６、２６、３１、４２、４７及び５２に示されたいずれかの塩基配列中または当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチド含むことを特徴とするものである。そして本発明は、かかるオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定試薬である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明でＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅、検出する対象となる試料は、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明は、ヒト細胞、ヒト組織、体液、血液、尿、便、リンパ液、乳管液又は腹腔や胸腔の洗浄液等を材料として、例えば特許文献５（特開平７−５９５７２号）等に記載された方法に従って調製した試料を使用し、当該試料を直接的に測定することで、当該試料の由来元であるヒト細胞や組織などに含まれるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を行なうものである。
【００１５】
本発明の特定塩基配列とは、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡのうち、後述する第一のプライマーとの相同領域の５’末端から後述する第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同な塩基配列をいう。すなわち、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ上で、第一のプライマーは特定塩基配列の５’末端から３’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相同的であり、第二のプライマーは特定塩基配列の３’末端から５’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相補的である。よって、本発明では前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。なお第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、当該部位は後述する切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。
【００１６】
本発明のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位である。種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が知られており、本発明においてはこれら種々のプロモーターが制限なく使用できるが、分子生物学的実験などで通常用いられているＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター又はＴ３プロモーターが好ましい。また前記配列に転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の相補的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。高ストリンジェントな条件の一例として、本発明の実施例に記載したような、核酸増幅反応液組成をあげることができる。また、本発明中の相同的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列の完全相補配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう相補的あるいは相同的な配列は、高ストリンジェントな条件においてハイブリダイゼーションの特異性及び効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能である。さらに、ハイブリダイゼーションの特異性及び効率に影響を与えない範囲で、１から数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いてもよい。
【００１８】
本発明のヌクレオチドもしくは核酸とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドをいい、ＲＮＡ及びＤＮＡの双方とそれらのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）、更にはそれらのポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。なお本発明のヌクレオチド又は核酸は、前記したものに対し、同様に機能する非天然のモノマー、蛍光分子又は放射性同位体等で標識された天然又は非天然のモノマー、又は、これら天然又は非天然のモノマーを含むオリゴマーまたはポリマーなどが付加されたものをも含む。
【００１９】
本発明のプライマーとは、核酸増幅反応において、鋳型となるＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいい、ＴＲＣ法において測定されるべきＲＮＡを念頭に、鎖長又は配列において特異的な生成物が得られるように、好ましくはプライマー自身がその鋳型に特異的な配列を含むよう設計する。プライマーの長さは、通常１５から１００塩基、好ましくは１５から３５塩基の鎖長を有するように設計されるが、当該鎖長に限られるものではない。
本発明の第一及び第二のプライマーは、本願発明に記載する塩基配列の範囲内で、少なくとも連続する１５塩基以上の任意の配列の中から選定することができる。すなわち、本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第一のプライマーは、配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号１７から２５に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。また本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第一のプライマーは、配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号２７から３０に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。
【００２０】
本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第二のプライマーは、配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号３２から４１に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。また本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第二のプライマーは、配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号４３から４６に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。
【００２１】
本発明はＴＲＣ法によりＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅する増幅法であるが、かかる増幅において使用する第一及び第二のプライマーの組み合わせとして、以下の組み合わせを例示することができる。
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
【００２２】
本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第一及び第二のプライマーのより好ましい組み合わせは、以下の通りである。
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１７から２５で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３２から４１で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２７から３０で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号４３から４６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
【００２３】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法では、好ましくは、ｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定核酸配列の５’末端部位で切断する。特定核酸配列の５’末端部位で切断することで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法が例示できる。なお、該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。そしてこのような目的で使用する切断用オリゴヌクレオチドとして、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号２から１４に示される配列に対して相同的なオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００２４】
標的ＲＮＡとは、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡをＴＲＣ法によって増幅した場合のＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、後述するインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとの相補的結合が可能である配列である。よって、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的又は相同的な配列である。インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとして、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号４７又は５２に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブが例示できる。中でも、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとしては、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号４８、４９、５０、５１、５３、５４又は５５のいずれかに示される配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブが好ましい。
【００２５】
以上に述べた、本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ測定方法における第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチド及びインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの組み合わせとして、以下のものが例示できる（インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの相補配列と、第一のプライマーの相同配列及び第二のプライマーの相補配列とは重複しないように設計する）。
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２から１０に記載のいずれかの配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号１６に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号２から１０に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号３１に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、そしてインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４７に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、という組み合わせ。
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１から１４に記載のいずれかの配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号２６に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１１から１４に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号４２に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５２に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、という組み合わせ。
【００２６】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ測定方法における第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチド及びインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブのより好ましい組み合わせとして、以下のものが例示できる（インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの相補配列と、第一のプライマーの相同配列及び第二のプライマーの相補配列とは重複しないように設計する）。
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１７に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４８、４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号３に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１８に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号４に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１９に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号５に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２０に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号６に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２１に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号７に示された記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２２に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号８に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２３に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２４に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１０に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２５に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２７に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１２に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２８に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１３に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２９に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１４に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号３０に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
【００２７】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法では、種々の酵素を使用する。具体的には、一本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、一本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素である。酵素としては、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用しても良いが、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用することで、使用する酵素の種類を減らすこともできる。例えば、一鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ Ｈ活性及び一本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素である、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素又はこれら酵素の誘導体を使用することが例示できる。このような酵素を使用する場合には、他にバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はこれらの誘導体を使用するのみで、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を実施し得る。もっとも、このような酵素を使用する場合であっても、必要に応じてＲＮａｓｅ Ｈ活性等を有する他の酵素を添加することができる。
【００２８】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法では、好ましくは試料に切断用オリゴヌクレオチドを添加し、逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性により特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として第一及び第二のプライマーの存在下で逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、逆転写酵素のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行なわれる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖は逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、ｃＤＮＡ部分が解離することによって第一のプライマーが当該ｃＤＮＡに結合する。引き続き、逆転写酵素のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で、かつ５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。当該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、第一及び第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００２９】
本発明においては、上記のような連鎖的なＲＮＡの増幅反応のために、前記各酵素が活性を発現するために必要な緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸及びリボヌクレオシド−三リン酸等を使用する。また反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は糖などを添加することもできる。また本発明は、上記のような酵素が活性を発現し得る、一定の温度で実施することができる。例えば、ＡＭＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すれば良い。中でも４０から６０℃の範囲で設定することが好ましく、さらには４３℃に設定することが好ましい。
【００３０】
増幅されたＲＮＡ転写産物の量は、電気泳動法、液体クロマトグラフィーを用いた方法又は検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法等の既知の測定法により測定することが可能である。しかし、これら方法では、特に増幅産物を反応容器等から取り出して測定することが必要であるため、二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の可能性を増加してしまう。そこで、本発明では、測定されるべき核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計したインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いることが好ましい。インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドで、末端、リン酸ジエステル部又は塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合されており、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基にグリコール酸やビオチンを付加する等の修飾をすることが特に好ましい（特許文献４及び非特許文献７参照）。インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド及びこれらの誘導体などが汎用されている。そして蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられ、例えばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加する。なお、オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させる等といった手法を採用することが可能である（特許文献４及び非特許文献７参照）。前記官能基の導入方法としても、例えば市販されているＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いれば良い。
【００３１】
本発明の一例として、５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５６）を有する第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ、切断用オリゴヌクレオチド、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬に試料を添加し、４３℃の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法が例示できる。この具体例では、蛍光強度を経時的に測定し、有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅及び測定をあわせて３０分以内に試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を完了することが可能である。また一例として、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが特定塩基配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出器によって経時的に測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、試料中に存在した特定塩基配列の量、即ち試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡのコピー数を算出することが可能である。
【００３２】
本発明は、試料と測定のために必要な全試薬を単一の容器に封入可能である。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを測定することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいればよく、試料を分注した後に密閉することが可能であるから、二次汚染等を引き起こす可能性を極めて低くできる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下で、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを１段階の操作で特異的で、かつ迅速・高感度に増幅し、また増幅産物を直接的に検出することができる。
【００３４】
本発明では、試料中の標的ＲＮＡ（ＴＴＦ−１遺伝子のｍＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を５’末端を有する２本鎖ＤＮＡが合成され、前記ＤＮＡを鋳型に多量の１本鎖ＲＮＡが生成され、さらに生成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することにより蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便、かつ迅速に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ測定方法は、核酸増幅及び測定の時間が３０分以内であり、これは既存のＲＴ−ＰＣＲ法（通常２時間以上）、ＮＡＳＢＡ法（９０分以上）、ＴＭＡ法（９０分以上）による測定よりも同等以上の迅速性を有する。
【００３５】
さらに、１段階操作でＴＴＦ−１遺伝子のｍＲＮＡを増幅・検出するためのオリゴヌクレオチドを提供すること、すなわちＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチド、及びＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ発現細胞の測定方法、ならびに定量試薬を生化学・分子生物学・医療分野などに提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＴＴＦ−１ ＲＮＡの検量線を示す。（ａ）表１のオリゴヌクレオチドの組み合わせ[２２]、（ｂ）組み合わせ[４８]、（ｃ）組み合わせ[６０]、（ｄ）組み合わせ[６４]、（ｅ）組み合わせ[８７]、（ｆ）組み合わせ[９８]、（ｇ）組み合わせ[１００]。縦軸は蛍光強度比が１．２を超えた時間（検出時間、分）であり、横軸は測定に用いた初期の標準ＲＮＡ量（コピー数）をｌｏｇで表したものである。また、各点から求めた線形一次曲線の式及びＲ２の値を記載してある。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例 １
後述の実施例で使用したＴＴＦ−１ ＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で行なった。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＴＴＦ−１の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００３３１７、２３５２塩基）のうち、３７４から１４５７番目の塩基（１０８４塩基）の２本鎖ＤＮＡをクローニングした。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写を実施した。引き続きＤＮａｓｅ Ｉ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。当該ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
実施例 ２
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。配列番号４８に記載の配列の５’末端から１１番目のＣ、配列番号４９に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号５０に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号５１に記載の配列の５’末端から１０番目のＧ、配列番号５３に記載の配列の５’末端から９番目のＧ、配列番号５４に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号５５に記載の配列の５’末端から１１番目のＴの位置にＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。前記アミノ基にインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号５４から５７、及び５９から６１）を調製した（非特許文献７参照）。
実施例 ３
表１に示す組み合わせのうち［１］から［１０９］に示す、切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ（以降ＩＮＡＦプローブと表記）を用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお表１のうち、配列番号１７から２５は配列番号１６の部分配列、配列番号２７から３０は配列番号２６の部分配列、配列番号３２から４１は配列番号３１の部分配列、配列番号４３から４６は配列番号４２の部分配列、配列番号４８から５１、及び５３は配列番号４７の部分配列、配列番号５３から５５は配列番号５２の部分配列である。
【００３９】
【表１】
【００４０】
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０３コピー／５μＬになるように希釈し、これをＲＮＡ試料として使用した。
（２）以下の組成の反応液２０．０μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４１】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１．０ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
１．０μＭ 第一のプライマー（当該プライマーには、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５６）が付加されている。）
１．０μＭ 第二のプライマー
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（当該オリゴヌクレオチドの３’末端の
水酸基はアミノ化されている。）
２０．０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ
６．０Ｕ リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１３．０％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μＬを添加した。
【００４２】
酵素液の組成（反応時（３０μＬ中）の最終濃度）
２．０％ ソルビトール
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス社製）
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００４３】
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、その時の時間を検出時間とした結果を表２に示した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
表１の組み合わせのうち、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１６の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号３１の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［６］から［１４］、［１７］から［２３］、［２９］から［５５］、［５８］から［７５］、）、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２６の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号４２の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［７６］から［８０］、［８４］から［８９］、［９４］から［１００］、［１０５］及び［１０６］）、
では、いずれも１０３コピー／５μＬの標準ＲＮＡを３０分以内に検出した。なお、コントロール試験区（標準ＲＮＡの代わりにＲＮＡ希釈液を反応液に添加して測定）では、反応開始から３０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。さらには、上記（ｉ）あるいは（ｉｉ）以外の組み合わせ（組み合わせ［１］から［５］、［１５］及び［１６］、［２４］から［２８］、［５６］及び［５７］、［８１］から［８３］、［９０］から［９３］、［１０１］から［１０４］、［１０７］から［１０９］）では、反応開始から３０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。
当該結果より、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１６に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３１に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２６に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号４２に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
のいずれかを用いてＲＮＡ増幅反応を行なうことにより、従来技術で最も汎用されるＲＴ−ＰＣＲ法によるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの検出方法（通常２時間以上）と比較してＴＴＦ−１ ＲＮＡを迅速に検出することが示された。
実施例 ４
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、実施例３よりも低濃度の標準ＲＮＡを測定した。
【００４６】
（１）実験方法
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、及びＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で実施した。
【００４７】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［１３］、［２０］から［２２］、［４６］、
［４８］、［６０］、［６４］、［７７］、［７９］、［８４］、［８７］、［８９］、［９８］、
及び［１００］を使用。
【００４８】
ＲＮＡ試料：
実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、
５０コピー／５μＬ、１０２コピー／５μＬ、及び１０３コピー／５μＬに希釈
したものを使用。
【００４９】
（２）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、５０コピー／５μＬの標準ＲＮＡを３０分以内に検出した。以上より、本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてＣＫ１９ ＲＮＡを増幅させることで、５０コピー／５μＬといった低濃度のＣＫ１９ ＲＮＡであっても迅速に検出できることが示された。
実施例 ５
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、様々な濃度の標準ＲＮＡを測定し、検出時間と初期標準ＲＮＡとの関係を確認した。
【００５２】
（１）実験方法
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で測定した。
【００５３】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、［２２］、［４８］、［６０］、［６４］、［８７］、
［９８］、及び［１００］を使用。
【００５４】
ＲＮＡ試料：
実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、
１０２コピー／５μＬ、１０３コピー／５μＬ、１０４コピー／５μＬ、及び
１０５コピー／５μＬに希釈したものを使用。
【００５５】
（２）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表４に、表４の結果を基に検量線を作成した結果を図１に示す。また、１０２コピー／５μＬのＲＮＡ試料を測定したときの反応開始後２０分後における蛍光強度比も合わせて表４に記載した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、酵素添加後１５分以内に測定した全ての濃度の標準ＲＮＡを検出した。また、検出時間を縦軸に、初期の標準ＲＮＡ濃度量（コピー数をｌｏｇで表したもの）を横軸にしてプロットしたところ、今回検討した全ての組み合わせにおいて、１０２コピーの低コピー領域から検出時間は初期ＲＮＡ量依存的であり、検量線は線形一次曲線で近似することができた。すなわち、未知試料について、本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を行ない、得られた検出時間を図１に示す検量線に当てはめることで、未知試料に含まれるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの量を推測可能であることが示された。
実施例 ６
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ヒトの肺腺癌由来の培養細胞抽出物中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの定量を行なった。
【００５８】
（１）培養細胞の入手
ヒト肺腺癌由来培養細胞（ＰＣ−３）は、Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ）より入手した（ＨＳＲＲＢ Ｎｏ．ＪＣＲＢ００７７）。
【００５９】
（２）培養細胞の培養
ＰＣ−３細胞の培養は、ＨＳＲＲＢのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｂｉｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｅｌｌｄａｔａ／ｊｃｒｂ００７７．ｈｔｍ）に記載の培地、培養条件に従い培養した。
【００６０】
（３）ＲＮＡの抽出
培養したＰＣ−３細胞は、細胞数を計測し、５ｃｅｌｌｓ、５０ｃｅｌｌｓ、５×１０２ｃｅｌｌｓ、５×１０３ｃｅｌｌｓになるように調製し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて、キット付属のマニュアルに従い、ＲＮＡの抽出を行なった。なお、ＲＮＡ抽出試料の量は５０μＬである。
【００６１】
（４）ＴＴＦ−１ ＲＮＡの測定
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３を同様の方法で測定した。
【００６２】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［２２］、［４８］、［６０］、［６４］、
［８７］、［９８］、及び［１００］を使用。
【００６３】
ＲＮＡ試料：
本実施例の（３）に記載のＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）記載のＲＮＡ希釈液
を用いて１０倍希釈後、そのうちの５μＬを使用した。
【００６４】
（５）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表５（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）に、また表５の検出時間と、実施例５で得られた検量線（図１）を基に各ＲＮＡ試料中に含まれるＴＴＦ−１ ＲＮＡ量を計算した結果を表６（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）に示す。
【００６５】
【表５】
【００６６】
【表６】
【００６７】
検量線から求められた各ＲＮＡ試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ量は、使用した培養ＰＣ−３細胞の細胞数にほぼ比例しており、本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＴＴＦ−１ ＲＮＡの増幅検出法が濃度依存的であることが示された。
実施例 ７
以下のようにして、甲状腺、肺抽出物を対象としてＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を実施した。
【００６８】
（１）抽出物の入手
正常甲状腺・正常肺・肺癌組織抽出物は、Ａｍｂｉｏｎ社から購入した。
【００６９】
（２）ＴＴＦ−１ ＲＮＡの測定
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３を同様の方法で測定した。
【００７０】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［２２］、［４８］、［６０］、［６４］、
［８７］、［９８］、及び［１００］を使用。
【００７１】
ＲＮＡ試料：
本実施例の（３）に記載のＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）記載のＲＮＡ希釈液
を用いて１テストあたり１００ｎｇのトータルＲＮＡが含まれるように希釈した。
【００７２】
（５）実験結果
全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせで、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを検出した。また、健常人の血液（全血）を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて単離を行ったリンパ球から抽出したＲＮＡ試料（５×１０６ｃｅｌｌ）を測定した場合は、いずれのオリゴヌクレオチドの組み合わせでも測定開始後３０分以内に検出すものはなかった。
【００７３】
ＴＴＦ−１が特異的に発現しているとされる甲状腺・肺組織における発現が確認できた。また、上記以外のサンプル（血液）で発現していないことを確認した。
実施例 ８
実施例６及び７で得られた核酸増幅反応後の試料に含まれる２本鎖ＤＮＡの塩基配列解析を実施した。塩基配列解析の結果、全ての試料において、使用したオリゴヌクレオチドの組み合わせによってＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの増幅が起きたときに相当する塩基配列を確認した。
【００７４】
つまり、本発明において増幅検出しているのはＴＴＦ−１ ＲＮＡであり、他の非特異的なＲＮＡは増幅検出していないことを示している。実施例６及び７に示したＲＮＡ抽出物には、ＴＴＦ−１ ＲＮＡの他に雑多なＲＮＡが混入しているが、本発明の測定方法はＴＴＦ−１ ＲＮＡのみを増幅検出しており、非常に特異性が高く、正確性に優れた測定方法といえる。
【００７５】
以上より、本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法は、未知試料中に含まれるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを特異的に、かつ迅速、高感度に測定可能であり、さらには、検量線を用いることで、定量を行なうことも可能であることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅法を利用したサイロイド・トランスクリプション・ファクター１（Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ−１、以下「ＴＴＦ−１」と略記する）ｍＲＮＡの測定方法に関する。より詳細に本発明は、４０から６０℃の範囲内で、一定温度（好ましくは４３℃）でＴＴＦ−１ｍＲＮＡの増幅・検出を行う方法と、かかる方法に好適に用いることができるオリゴヌクレオチド等に関するものである。本発明の方法及びオリゴヌクレオチド等は、分子生物学、生化学、医学分野などにおけるＴＴＦ−１ｍＲＮＡの研究や診療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫｘ２ファミリーに属する転写因子であるＴＴＦ−１は、癌のマーカータンパク質の一つとして利用されている。ＴＴＦ−１は、肺における初期形態形成や上皮細胞におけるサーファクタントタンパク質の発現に必須とされるタンパク質であるが、その発現場所が甲状腺、肺及び間脳に特異的であることによる。ＴＴＦ−１は腫瘍組織はもとより正常組織でも発現しており、腫瘍特異的マーカーではないが、上記の通り、臓器特異性が非常に高いタンパク質であるため、腫瘍組織におけるＴＴＦ−１の発現を調べることで、その腫瘍細胞の系統に関する情報を得ることが出来る。すなわち、腫瘍組織においてＴＴＦ−１の発現が認められれば、その腫瘍細胞は甲状腺癌、肺癌又はそれらの癌が転移したものと考えることができる。
【０００３】
ＴＴＦ−１を検出して癌の診断を行う手法として、免疫組織染色等の病理組織的診断が多用されてきたが、近年では、実施に際しての習熟が不要で、診断に供するサンプルの状態によらず安定した結果を期待し得る遺伝子検査（核酸増幅法）によりＴＴＦ−１を検出することが提案され、一部では実用化の試みがなされている。核酸増幅法が高感度であることはすでに知られており、特定の遺伝子を増幅するため高い特異性を得ることも可能である。一般に、核酸増幅法を利用した腫瘍マーカー遺伝子ｍＲＮＡの検出の際には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が広く用いられており、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡに対する適用も報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６参照）。
【０００４】
前記ＲＴ−ＰＣＲ法とは異なり、一定温度でＲＮＡのみを増幅するＮＡＳＢＡ法（特許文献１、特許文献２）やＴＭＡ法（特許文献３）等も知られている。これらＲＮＡ増幅方法では、増幅されるべきＲＮＡに対し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）を用いることで、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによって当該ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生成するものである。この生成するＲＮＡは、引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となるため、連鎖反応が生じる。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動や検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより、生成（増幅）されたＲＮＡを検出する。
【０００５】
一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法の中でも、いわゆるＴＲＣ法（特許文献４及び非特許文献７）は、簡便にＲＮＡを増幅し測定できる優れた方法である。この方法では、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変更するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、ＲＮＡの増幅を行い、蛍光特性の変化を測定するもので、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅及び測定を、同時かつ迅速、簡便に実施することが可能である。この方法では、増幅された核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するため、増幅された核酸を直接的に検出でき、また、複数のインターカレーター性蛍光色素を使用することで、複数の核酸を増幅後、個々に検出することができる。具体的には、測定されるべきＲＮＡに存在し、当該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る配列（特定塩基配列）に対して、（ａ）当該特定塩基配列の３’末端側に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、当該ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、（ｂ）（ａ）の逆転写反応によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成させ、（ｃ）（ｂ）で生成した１本鎖ＤＮＡの３’末端に相補的で、かつ、それ自身がその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、（ｄ）（ｃ）で生成した２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて転写産物（特定塩基配列のＲＮＡ）を生成させる、というものである。なお、（ｄ）で生成したＲＮＡ転写産物は特定塩基配列に由来するＲＮＡであるため、前記（ａ）の反応における鋳型となり、前記（ａ）の反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（ａ）から（ｄ）の反応が進行することでＲＮＡ増幅の連鎖反応が起きる。
【０００６】
ＴＲＣ法は、ＰＣＲ法のように反応液の温度を昇降させる必要がなく、またＲＮＡの逆転写と、その後のＤＮＡ増幅反応を分けて実施することがない、という特徴を有する。またさらに、増幅されたＲＮＡ転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させ、特定塩基配列または当該塩基配列に相補的な配列の増幅と同時に、当該増幅の様子を直接的に検出（モニタリング）することができるという特徴を有する。したがって、ＰＣＲ法や通常のＲＮＡ増幅法のように、増幅産物について別個にハイブリダイゼーション検出などを行なう必要がないため、結果を得るまでの時間を大幅に短縮可能であるという特徴を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献５】特開平７−５９５７２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｉａｎｇ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３６，８４９−８５４（２００７）
【非特許文献２】Ｋｏｌｌａ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３６，２１３−２２５（２００７）
【非特許文献３】Ｔａｋａｎｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１８，７１５−７２０（２００７）
【非特許文献４】Ａｋａｇｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，９９，７８１−７８８（２００８）
【非特許文献５】Ｍｉａｓａｋｉ ＦＹ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，３１，７２４−７３０（２００８）
【非特許文献６】Ｋｏｎｄｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８９，７９１−７９９（２００９）
【非特許文献７】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，１２４７−１２５２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、例えば、腫瘍組織からＲＮＡを抽出後、（ａ）抽出したＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、及び、（ｂ）当該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し検出する工程、という二段階の工程（場合によってはさらに検出工程を別個に実施する必要がある）が必要であるため、操作の煩雑性や二次汚染の可能性がある。また、この二段階の工程を実施するのに通常２時間以上必要であり、複数の工程の実施による再現性不良、多数検体処理や検査コストの低減という面でも解決すべき課題がある。反応時間短縮のため、前記二工程を同時に行なうＯｎｅＳＴＥＰ ＲＴ−ＰＣＲ法も開発されているが、各工程を別個に行なうＲＴ−ＰＣＲ法に比べて検出感度の低下や非特異的な増幅産物が産生されやすいという課題が指摘されている。さらに、ＰＣＲ法による増幅では２本鎖ＤＮＡが増幅されるため、増幅対象サンプルに混入する染色体ＤＮＡも増幅する可能性がある。このような懸念を払拭して厳密にＲＮＡを増幅するためには、事前にＤＮａｓｅなどによる消化を行ない、染色体ＤＮＡを除いておく必要があり、操作の更なる煩雑化や再現性不良という課題を生じる。さらに、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、かかる操作が自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となる。
【００１０】
ＲＮＡのみを増幅する方法は、一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ＮＡＳＢＡ法やＴＭＡ法ではハイブリダイゼーション法などによる煩雑な検出操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であり、再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。ＮＡＳＢＡ法やＴＭＡ法では、結果が出るまでに通常９０分以上必要であり、迅速性という面で課題がある。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、場合によっては増幅工程前に予備加温（例えば、６５℃）が必要となる場合があるという課題もある。
【００１１】
ＴＲＣ法においては、前述した種々の特徴から、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法又はＴＭＡ法に比較して、簡便な操作により、良好な再現性を維持しつつ、迅速に実施可能で、しかもその自動化に際しては反応装置の省力化や低コスト化が容易に可能であるという特徴を有する。しかしながら、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡをＴＲＣ法にて増幅するためのプライマー配列についてはこれまで報告されていない。なお、反応の開始時に増幅工程を実施する一定の温度よりも高温にし、測定されるべきＲＮＡの高次構造を変性させる工程を実施するＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法又はＴＭＡ法などの核酸増幅法と異なり、ＴＲＣ法では、増幅反応を通じ、比較的低温の一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下でＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅し検出するため、ＲＴ−ＰＣＲ法のために開発されたプライマー等をＴＲＣ法で使用することはできない。つまり、一般にｍＲＮＡのような１本鎖ＲＮＡは高次構造を形成しやすいことが知られており、ＴＲＣ法のような反応条件下では、測定されるべきｍＲＮＡが高次構造を形成し、プライマー等との結合が阻害されると考えられるため、ＴＴＦ−１の高次構造フリー領域に結合するよう設計されたプライマー等がその実施には必要となる。加えて、ＴＲＣ法のように比較的低温で実施する核酸増幅法では、ＰＣＲ法のように高温で実施する増幅法と比較して、プライマーダイマーといった非特異産物が生産しやすいために、非特異産物の生成を低減できるように設計されたプライマー等が必須となる。このように、一定温度ＲＮＡ増幅し検出するＴＲＣ法によってＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを迅速、簡便、高感度に検出するためには、一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下においても結合効率が低下せず、かつＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの増幅、検出が可能なプライマー（オリゴヌクレオチド）等が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、前記課題を解決するためになされたもので、試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法において、前記測定方法が、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである：
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
かつ、前記第一及び第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、というものである。
【００１３】
また本発明は、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１６、２６、３１、４２、４７及び５２に示されたいずれかの塩基配列中または当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチド含むことを特徴とするものである。そして本発明は、かかるオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定試薬である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明でＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅、検出する対象となる試料は、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明は、ヒト細胞、ヒト組織、体液、血液、尿、便、リンパ液、乳管液又は腹腔や胸腔の洗浄液等を材料として、例えば特許文献５（特開平７−５９５７２号）等に記載された方法に従って調製した試料を使用し、当該試料を直接的に測定することで、当該試料の由来元であるヒト細胞や組織などに含まれるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を行なうものである。
【００１５】
本発明の特定塩基配列とは、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡのうち、後述する第一のプライマーとの相同領域の５’末端から後述する第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同な塩基配列をいう。すなわち、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ上で、第一のプライマーは特定塩基配列の５’末端から３’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相同的であり、第二のプライマーは特定塩基配列の３’末端から５’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相補的である。よって、本発明では前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。なお第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、当該部位は後述する切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。
【００１６】
本発明のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位である。種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が知られており、本発明においてはこれら種々のプロモーターが制限なく使用できるが、分子生物学的実験などで通常用いられているＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター又はＴ３プロモーターが好ましい。また前記配列に転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の相補的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。高ストリンジェントな条件の一例として、本発明の実施例に記載したような、核酸増幅反応液組成をあげることができる。また、本発明中の相同的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列の完全相補配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう相補的あるいは相同的な配列は、高ストリンジェントな条件においてハイブリダイゼーションの特異性及び効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能である。さらに、ハイブリダイゼーションの特異性及び効率に影響を与えない範囲で、１から数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いてもよい。
【００１８】
本発明のヌクレオチドもしくは核酸とは、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドをいい、ＲＮＡ及びＤＮＡの双方とそれらのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）、更にはそれらのポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。なお本発明のヌクレオチド又は核酸は、前記したものに対し、同様に機能する非天然のモノマー、蛍光分子又は放射性同位体等で標識された天然又は非天然のモノマー、又は、これら天然又は非天然のモノマーを含むオリゴマーまたはポリマーなどが付加されたものをも含む。
【００１９】
本発明のプライマーとは、核酸増幅反応において、鋳型となるＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいい、ＴＲＣ法において測定されるべきＲＮＡを念頭に、鎖長又は配列において特異的な生成物が得られるように、好ましくはプライマー自身がその鋳型に特異的な配列を含むよう設計する。プライマーの長さは、通常１５から１００塩基、好ましくは１５から３５塩基の鎖長を有するように設計されるが、当該鎖長に限られるものではない。
本発明の第一及び第二のプライマーは、本願発明に記載する塩基配列の範囲内で、少なくとも連続する１５塩基以上の任意の配列の中から選定することができる。すなわち、本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第一のプライマーは、配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号１７から２５に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。また本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第一のプライマーは、配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号２７から３０に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。
【００２０】
本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第二のプライマーは、配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号３２から４１に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。また本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第二のプライマーは、配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは、配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列番号４３から４６に示されたオリゴヌクレオチド、を例示することができる。
【００２１】
本発明はＴＲＣ法によりＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅する増幅法であるが、かかる増幅において使用する第一及び第二のプライマーの組み合わせとして、以下の組み合わせを例示することができる。
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
【００２２】
本発明におけるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ検出のための第一及び第二のプライマーのより好ましい組み合わせは、以下の通りである。
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１７から２５で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３２から４１で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２７から３０で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号４３から４６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
【００２３】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法では、好ましくは、ｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定核酸配列の５’末端部位で切断する。特定核酸配列の５’末端部位で切断することで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法が例示できる。なお、該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。そしてこのような目的で使用する切断用オリゴヌクレオチドとして、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号２から１４に示される配列に対して相同的なオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００２４】
標的ＲＮＡとは、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡをＴＲＣ法によって増幅した場合のＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、後述するインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとの相補的結合が可能である配列である。よって、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的又は相同的な配列である。インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとして、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号４７又は５２に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブが例示できる。中でも、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとしては、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号４８、４９、５０、５１、５３、５４又は５５のいずれかに示される配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むプローブが好ましい。
【００２５】
以上に述べた、本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ測定方法における第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチド及びインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの組み合わせとして、以下のものが例示できる（インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの相補配列と、第一のプライマーの相同配列及び第二のプライマーの相補配列とは重複しないように設計する）。
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２から１０に記載のいずれかの配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号１６に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号２から１０に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号３１に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、そしてインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４７に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、という組み合わせ。
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１から１４に記載のいずれかの配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号２６に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１１から１４に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号４２に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５２に記載の配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、という組み合わせ。
【００２６】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ測定方法における第一のプライマー、第二のプライマー、切断用オリゴヌクレオチド及びインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブのより好ましい組み合わせとして、以下のものが例示できる（インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの相補配列と、第一のプライマーの相同配列及び第二のプライマーの相補配列とは重複しないように設計する）。
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１７に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４８、４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号３に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１８に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号４に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１９に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号５に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２０に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号６に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２１に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号７に示された記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２２に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４９、５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号８に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２３に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｖｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２４に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｉｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１０に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２５に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３２から４１に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５０、５１及び５３に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２７に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１２に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２８に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１３に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２９に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
（ｘｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１４に示された配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号３０に示された配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号４３から４６に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号５３から５５に示された配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、組み合わせ。
【００２７】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法では、種々の酵素を使用する。具体的には、一本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素、一本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素である。酵素としては、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用しても良いが、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用することで、使用する酵素の種類を減らすこともできる。例えば、一鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ Ｈ活性及び一本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素である、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素又はこれら酵素の誘導体を使用することが例示できる。このような酵素を使用する場合には、他にバクテリオファージ由来のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ又はこれらの誘導体を使用するのみで、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を実施し得る。もっとも、このような酵素を使用する場合であっても、必要に応じてＲＮａｓｅ Ｈ活性等を有する他の酵素を添加することができる。
【００２８】
本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法では、好ましくは試料に切断用オリゴヌクレオチドを添加し、逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性により特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として第一及び第二のプライマーの存在下で逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、逆転写酵素のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行なわれる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖は逆転写酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、ｃＤＮＡ部分が解離することによって第一のプライマーが当該ｃＤＮＡに結合する。引き続き、逆転写酵素のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で、かつ５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。当該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、第一及び第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
【００２９】
本発明においては、上記のような連鎖的なＲＮＡの増幅反応のために、前記各酵素が活性を発現するために必要な緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸及びリボヌクレオシド−三リン酸等を使用する。また反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は糖などを添加することもできる。また本発明は、上記のような酵素が活性を発現し得る、一定の温度で実施することができる。例えば、ＡＭＶ逆転写酵素及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、３５から６５℃の範囲で反応温度を設定すれば良い。中でも４０から６０℃の範囲で設定することが好ましく、さらには４３℃に設定することが好ましい。
【００３０】
増幅されたＲＮＡ転写産物の量は、電気泳動法、液体クロマトグラフィーを用いた方法又は検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法等の既知の測定法により測定することが可能である。しかし、これら方法では、特に増幅産物を反応容器等から取り出して測定することが必要であるため、二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の可能性を増加してしまう。そこで、本発明では、測定されるべき核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計したインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いることが好ましい。インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドで、末端、リン酸ジエステル部又は塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合されており、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基にグリコール酸やビオチンを付加する等の修飾をすることが特に好ましい（特許文献４及び非特許文献７参照）。インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド及びこれらの誘導体などが汎用されている。そして蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられ、例えばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加する。なお、オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させる等といった手法を採用することが可能である（特許文献４及び非特許文献７参照）。前記官能基の導入方法としても、例えば市販されているＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いれば良い。
【００３１】
本発明の一例として、５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５６）を有する第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ、切断用オリゴヌクレオチド、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬に試料を添加し、４３℃の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法が例示できる。この具体例では、蛍光強度を経時的に測定し、有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅及び測定をあわせて３０分以内に試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を完了することが可能である。また一例として、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが特定塩基配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出器によって経時的に測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、試料中に存在した特定塩基配列の量、即ち試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡのコピー数を算出することが可能である。
【００３２】
本発明は、試料と測定のために必要な全試薬を単一の容器に封入可能である。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを測定することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいればよく、試料を分注した後に密閉することが可能であるから、二次汚染等を引き起こす可能性を極めて低くできる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下で、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを１段階の操作で特異的で、かつ迅速・高感度に増幅し、また増幅産物を直接的に検出することができる。
【００３４】
本発明では、試料中の標的ＲＮＡ（ＴＴＦ−１遺伝子のｍＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を５’末端を有する２本鎖ＤＮＡが合成され、前記ＤＮＡを鋳型に多量の１本鎖ＲＮＡが生成され、さらに生成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することにより蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便、かつ迅速に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ測定方法は、核酸増幅及び測定の時間が３０分以内であり、これは既存のＲＴ−ＰＣＲ法（通常２時間以上）、ＮＡＳＢＡ法（９０分以上）、ＴＭＡ法（９０分以上）による測定よりも同等以上の迅速性を有する。
【００３５】
さらに、１段階操作でＴＴＦ−１遺伝子のｍＲＮＡを増幅・検出するためのオリゴヌクレオチドを提供すること、すなわちＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチド、及びＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ発現細胞の測定方法、ならびに定量試薬を生化学・分子生物学・医療分野などに提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＴＴＦ−１ ＲＮＡの検量線を示す。（ａ）表１のオリゴヌクレオチドの組み合わせ[２２]、（ｂ）組み合わせ[４８]、（ｃ）組み合わせ[６０]、（ｄ）組み合わせ[６４]、（ｅ）組み合わせ[８７]、（ｆ）組み合わせ[９８]、（ｇ）組み合わせ[１００]。縦軸は蛍光強度比が１．２を超えた時間（検出時間、分）であり、横軸は測定に用いた初期の標準ＲＮＡ量（コピー数）をｌｏｇで表したものである。また、各点から求めた線形一次曲線の式及びＲ２の値を記載してある。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例 １
後述の実施例で使用したＴＴＦ−１ ＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で行なった。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＴＴＦ−１の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００３３１７、２３５２塩基）のうち、３７４から１４５７番目の塩基（１０８４塩基）の２本鎖ＤＮＡをクローニングした。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写を実施した。引き続きＤＮａｓｅ Ｉ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。当該ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
実施例 ２
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。配列番号４８に記載の配列の５’末端から１１番目のＣ、配列番号４９に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号５０に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号５１に記載の配列の５’末端から１０番目のＧ、配列番号５３に記載の配列の５’末端から９番目のＧ、配列番号５４に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号５５に記載の配列の５’末端から１１番目のＴの位置にＬａｂｅｌ−ＯＮ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。前記アミノ基にインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号５４から５７、及び５９から６１）を調製した（非特許文献７参照）。
実施例 ３
表１に示す組み合わせのうち［１］から［１０９］に示す、切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ（以降ＩＮＡＦプローブと表記）を用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお表１のうち、配列番号１７から２５は配列番号１６の部分配列、配列番号２７から３０は配列番号２６の部分配列、配列番号３２から４１は配列番号３１の部分配列、配列番号４３から４６は配列番号４２の部分配列、配列番号４８から５１、及び５３は配列番号４７の部分配列、配列番号５３から５５は配列番号５２の部分配列である。
【００３９】
【表１】
【００４０】
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０３コピー／５μＬになるように希釈し、これをＲＮＡ試料として使用した。
（２）以下の組成の反応液２０．０μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗｉｔｈ ｄｏｍｅ ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４１】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ 塩化マグネシウム
１００ｍＭ 塩化カリウム
１．０ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
１．０μＭ 第一のプライマー（当該プライマーには、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号５６）が付加されている。）
１．０μＭ 第二のプライマー
０．１６μＭ 切断用オリゴヌクレオチド（当該オリゴヌクレオチドの３’末端の
水酸基はアミノ化されている。）
２０．０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ
６．０Ｕ リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１３．０％ ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μＬを添加した。
【００４２】
酵素液の組成（反応時（３０μＬ中）の最終濃度）
２．０％ ソルビトール
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス社製）
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００４３】
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、その時の時間を検出時間とした結果を表２に示した。
【００４４】
【表２】
【００４５】
表１の組み合わせのうち、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１６の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号３１の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［６］から［１４］、［１７］から［２３］、［２９］から［５５］、［５８］から［７５］、）、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２６の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号４２の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［７６］から［８０］、［８４］から［８９］、［９４］から［１００］、［１０５］及び［１０６］）、
では、いずれも１０３コピー／５μＬの標準ＲＮＡを３０分以内に検出した。なお、コントロール試験区（標準ＲＮＡの代わりにＲＮＡ希釈液を反応液に添加して測定）では、反応開始から３０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。さらには、上記（ｉ）あるいは（ｉｉ）以外の組み合わせ（組み合わせ［１］から［５］、［１５］及び［１６］、［２４］から［２８］、［５６］及び［５７］、［８１］から［８３］、［９０］から［９３］、［１０１］から［１０４］、［１０７］から［１０９］）では、反応開始から３０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。
当該結果より、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１６に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３１に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２６に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号４２に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
のいずれかを用いてＲＮＡ増幅反応を行なうことにより、従来技術で最も汎用されるＲＴ−ＰＣＲ法によるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの検出方法（通常２時間以上）と比較してＴＴＦ−１ ＲＮＡを迅速に検出することが示された。
実施例 ４
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、実施例３よりも低濃度の標準ＲＮＡを測定した。
【００４６】
（１）実験方法
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、及びＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で実施した。
【００４７】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［１３］、［２０］から［２２］、［４６］、
［４８］、［６０］、［６４］、［７７］、［７９］、［８４］、［８７］、［８９］、［９８］、
及び［１００］を使用。
【００４８】
ＲＮＡ試料：
実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、
５０コピー／５μＬ、１０２コピー／５μＬ、及び１０３コピー／５μＬに希釈
したものを使用。
【００４９】
（２）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、５０コピー／５μＬの標準ＲＮＡを３０分以内に検出した。以上より、本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてＣＫ１９ ＲＮＡを増幅させることで、５０コピー／５μＬといった低濃度のＣＫ１９ ＲＮＡであっても迅速に検出できることが示された。
実施例 ５
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、様々な濃度の標準ＲＮＡを測定し、検出時間と初期標準ＲＮＡとの関係を確認した。
【００５２】
（１）実験方法
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で測定した。
【００５３】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、［２２］、［４８］、［６０］、［６４］、［８７］、
［９８］、及び［１００］を使用。
【００５４】
ＲＮＡ試料：
実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、
１０２コピー／５μＬ、１０３コピー／５μＬ、１０４コピー／５μＬ、及び
１０５コピー／５μＬに希釈したものを使用。
【００５５】
（２）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表４に、表４の結果を基に検量線を作成した結果を図１に示す。また、１０２コピー／５μＬのＲＮＡ試料を測定したときの反応開始後２０分後における蛍光強度比も合わせて表４に記載した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、酵素添加後１５分以内に測定した全ての濃度の標準ＲＮＡを検出した。また、検出時間を縦軸に、初期の標準ＲＮＡ濃度量（コピー数をｌｏｇで表したもの）を横軸にしてプロットしたところ、今回検討した全ての組み合わせにおいて、１０２コピーの低コピー領域から検出時間は初期ＲＮＡ量依存的であり、検量線は線形一次曲線で近似することができた。すなわち、未知試料について、本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を行ない、得られた検出時間を図１に示す検量線に当てはめることで、未知試料に含まれるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの量を推測可能であることが示された。
実施例 ６
本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ヒトの肺腺癌由来の培養細胞抽出物中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの定量を行なった。
【００５８】
（１）培養細胞の入手
ヒト肺腺癌由来培養細胞（ＰＣ−３）は、Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ）より入手した（ＨＳＲＲＢ Ｎｏ．ＪＣＲＢ００７７）。
【００５９】
（２）培養細胞の培養
ＰＣ−３細胞の培養は、ＨＳＲＲＢのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｂｉｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｅｌｌｄａｔａ／ｊｃｒｂ００７７．ｈｔｍ）に記載の培地、培養条件に従い培養した。
【００６０】
（３）ＲＮＡの抽出
培養したＰＣ−３細胞は、細胞数を計測し、５ｃｅｌｌｓ、５０ｃｅｌｌｓ、５×１０２ｃｅｌｌｓ、５×１０３ｃｅｌｌｓになるように調製し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて、キット付属のマニュアルに従い、ＲＮＡの抽出を行なった。なお、ＲＮＡ抽出試料の量は５０μＬである。
【００６１】
（４）ＴＴＦ−１ ＲＮＡの測定
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３を同様の方法で測定した。
【００６２】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［２２］、［４８］、［６０］、［６４］、
［８７］、［９８］、及び［１００］を使用。
【００６３】
ＲＮＡ試料：
本実施例の（３）に記載のＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）記載のＲＮＡ希釈液
を用いて１０倍希釈後、そのうちの５μＬを使用した。
【００６４】
（５）実験結果
酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表５（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）に、また表５の検出時間と、実施例５で得られた検量線（図１）を基に各ＲＮＡ試料中に含まれるＴＴＦ−１ ＲＮＡ量を計算した結果を表６（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）に示す。
【００６５】
【表５】
【００６６】
【表６】
【００６７】
検量線から求められた各ＲＮＡ試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ量は、使用した培養ＰＣ−３細胞の細胞数にほぼ比例しており、本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＴＴＦ−１ ＲＮＡの増幅検出法が濃度依存的であることが示された。
実施例 ７
以下のようにして、甲状腺、肺抽出物を対象としてＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定を実施した。
【００６８】
（１）抽出物の入手
正常甲状腺・正常肺・肺癌組織抽出物は、Ａｍｂｉｏｎ社から購入した。
【００６９】
（２）ＴＴＦ−１ ＲＮＡの測定
オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３を同様の方法で測定した。
【００７０】
オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［２２］、［４８］、［６０］、［６４］、
［８７］、［９８］、及び［１００］を使用。
【００７１】
ＲＮＡ試料：
本実施例の（３）に記載のＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）記載のＲＮＡ希釈液
を用いて１テストあたり１００ｎｇのトータルＲＮＡが含まれるように希釈した。
【００７２】
（５）実験結果
全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせで、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを検出した。また、健常人の血液（全血）を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて単離を行ったリンパ球から抽出したＲＮＡ試料（５×１０６ｃｅｌｌ）を測定した場合は、いずれのオリゴヌクレオチドの組み合わせでも測定開始後３０分以内に検出すものはなかった。
【００７３】
ＴＴＦ−１が特異的に発現しているとされる甲状腺・肺組織における発現が確認できた。また、上記以外のサンプル（血液）で発現していないことを確認した。
実施例 ８
実施例６及び７で得られた核酸増幅反応後の試料に含まれる２本鎖ＤＮＡの塩基配列解析を実施した。塩基配列解析の結果、全ての試料において、使用したオリゴヌクレオチドの組み合わせによってＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの増幅が起きたときに相当する塩基配列を確認した。
【００７４】
つまり、本発明において増幅検出しているのはＴＴＦ−１ ＲＮＡであり、他の非特異的なＲＮＡは増幅検出していないことを示している。実施例６及び７に示したＲＮＡ抽出物には、ＴＴＦ−１ ＲＮＡの他に雑多なＲＮＡが混入しているが、本発明の測定方法はＴＴＦ−１ ＲＮＡのみを増幅検出しており、非常に特異性が高く、正確性に優れた測定方法といえる。
【００７５】
以上より、本発明のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法は、未知試料中に含まれるＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを特異的に、かつ迅速、高感度に測定可能であり、さらには、検量線を用いることで、定量を行なうことも可能であることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法において、前記測定方法が、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである：
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、及び
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、からなり、かつ、
前記第一及び第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、又は、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
【請求項２】
前記第一及び第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１７から２５で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３２から４１で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、又は
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２７から３０で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号４３から４６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
【請求項３】
前記（６）の工程（ＲＮＡ転写産物量を測定する工程）が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４７又は５２に示される配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４８、４９、５０、５１、５３、５４及び５５に示されるいずれかの配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
【請求項６】
前記（１）の工程（ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によって特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程）の前に、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、
（ｉ）前記特定塩基配列中の、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複した領域、及び当該部位から５’側に隣接する領域に対し相補的な配列を有する、切断用オリゴヌクレオチド、
及び、
（ｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素、
を用いて、前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を行なうことを特徴とする、請求項１から５に記載のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法。
【請求項７】
前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２から１４で示されるいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１６、２６、３１、４２、４７又は５２のいずれかに示される配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定試薬。
【請求項１】
試料中のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法において、前記測定方法が、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、及び特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである：
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、特定塩基配列、あるいは特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、及び
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、からなり、かつ、
前記第一及び第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、又は、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号４２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
【請求項２】
前記第一及び第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１７から２５で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３２から４１で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、又は
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２７から３０で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号４３から４６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
【請求項３】
前記（６）の工程（ＲＮＡ転写産物量を測定する工程）が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４７又は５２に示される配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４８、４９、５０、５１、５３、５４及び５５に示されるいずれかの配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
【請求項６】
前記（１）の工程（ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によって特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程）の前に、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、
（ｉ）前記特定塩基配列中の、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複した領域、及び当該部位から５’側に隣接する領域に対し相補的な配列を有する、切断用オリゴヌクレオチド、
及び、
（ｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素、
を用いて、前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を行なうことを特徴とする、請求項１から５に記載のＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定方法。
【請求項７】
前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号２から１４で示されるいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１６、２６、３１、４２、４７又は５２のいずれかに示される配列中の少なくとも連続した１５塩基からなる配列に対して相同的又は相補的な配列のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ＴＴＦ−１ ｍＲＮＡの測定試薬。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１３５８２２（Ｐ２０１１−１３５８２２Ａ）
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９８０６１（Ｐ２００９−２９８０６１）
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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