Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬及び感染症治療薬
【課題】Ｔｈ２型アレルギー性疾患と細胞内寄生性病原体による感染症とに対する有効で副作用のない治療薬を提供する。
【解決手段】本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するので、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を有効に、副作用なく、予防又は治療することができる。
【解決手段】本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するので、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を有効に、副作用なく、予防又は治療することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬及び感染症治療薬に関するものであり、特にＴｈ２細胞により産生されるサイトカインにより惹起されるアレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬、又は、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられる感染症治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化は獲得免疫反応の進行における重要なプロセスである。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γの産生により細胞性免疫を促進し、産生されたＩＦＮ−γは細胞内寄生性病原体に対する生体防御作用又は抗アレルギー作用を有する。これに対して、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生し、これらは液性免疫作用を有するが、アレルギー性疾患を惹起し、また、マクロファージからの一酸化窒素産生を抑制する結果、細胞内寄生性病原体の増殖を促すことが知られている。
【０００３】
かかるＴｈ２サイトカインによって惹起されるＴｈ２型アレルギー性疾患としてよく知られているのは、ＩｇＥを介して起こるアレルギー性疾患であり、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎等が含まれる。Ｔｈ２細胞により産生されるＩＬ−４は、Ｂ細胞に働きＩｇＥを産生させる働きを持つ。ＩｇＥがアレルゲンを認識して肥満細胞を活性化すると肥満細胞より炎症を誘導する液性因子を放出することがアレルギー性の炎症反応につながると考えられており、ＩＬ−４はこの活性化された肥満細胞からも産生される。また、ＩＬ−５によって増殖・分化が制御されている好酸球は、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎等の炎症部位に強く浸潤し炎症反応を引き起こす。
【０００４】
現在、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の治療薬としては、ＩｇＥとＴｈ２サイトカインとによって活性化されたエフェクター細胞（肥満細胞など）から産生される様々な化学伝達物質を抑制することを目的としたアレルギー性疾患治療薬が主流となっている。
【０００５】
ところで、多くの要因がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化に影響を与える中でサイトカインが分化の決定要因であることがわかってきている。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は抗原とＩＬ−１２とで刺激されることによりＴｈ１細胞に分化する。さらに、ＩＬ−１８はＩＬ−１２が誘導したＴｈ１細胞に作用しＩＦＮ−γ産生を増大させる。これに対して、Ｔｈ２はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗原とＩＬ−４とで刺激することにより誘導される。このように、ＩＬ−４及びＩＬ−１２はＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞の分化を決定する重要な役割を果たす。
【０００６】
また、最近、ＩＬ−１２ファミリーの新規メンバーであるＩＬ−２３及びＩＬ−２７が特定されている。これらのサイトカインは、ヘテロ二量体であり、樹状細胞によって産生される。ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２ｐ３５関連タンパク質ｐ１９及びＩＬ−１２ｐ４０からなりメモリーＴ細胞の増殖を誘導する。ＩＬ−２７はＩＬ−１２ｐ４０関連タンパク質、ＥＢＶ誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）及び新たに発見されたＩＬ−１２ｐ３５関連タンパク質ｐ２８からなり（例えば、非特許文献１参照）、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導するが、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は誘導しない。
【０００７】
また、ＩＬ−１２ＲはＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−１２Ｒβ２からなり、ＩＬ−２３ＲはＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−２３Ｒと名づけられた新規な成分からなる。ＩＬ−１２Ｒβ２に相同的なこれまでそのリガンドが不明であったサイトカインレセプターＷＳＸ−１／Ｔ細胞サイトカインレセプター（ＴＣＣＲ）とｇｐ１３０とは、ＩＬ−２７の機能的シグナル変換レセプターを構成する（例えば、非特許文献２参照）。
【０００８】
ＩＬ−２７は、Ｔｈ１細胞の分化の主要な転写調節因子であるＴ−ｂｅｔの発現を誘導することが報告されており（例えば、非特許文献３参照）、これによりその後に続くＩＬ−１２Ｒβ２の発現を誘導する。それゆえ、ＩＬ−２７は、ＩＬ−１２Ｒのアップレギュレーションを介したＩＦＮ−γの誘導においてＩＬ−１２と相乗的に作用すると考えられている（例えば、非特許文献１、４〜６参照）。
【０００９】
ＩＬ−２７Ｒの１つのサブユニットであるＷＳＸ−１（例えば、非特許文献７参照）／ＴＣＣＲ（例えば、非特許文献８参照）が欠損したマウスの研究より、ＩＬ−２７はＴｈ１細胞の分化に必要であること及びＷＳＸ−１／ＴＣＣＲが欠損した（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、ＩＦＮ−γ産生が損なわれるために皮膚リーシュマニア症の原因となるリーシュマニアmajor（L.major）（例えば、非特許文献７、９参照）又はListeria monocytogenes（例えば、非特許文献８参照）のような細胞内病原体の感染を受けやすいことが示されている。
【００１０】
また、ＩＬ−２７／ＩＬ−２７Ｒの相互作用は、Ｔｈ１により仲介される炎症応答を一定の状況において阻害することが報告されている。Villarino et al.は、Toxoplasma gondii に感染した（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、過度に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の分化によって、致命的なＴｈ１応答を示すことを報告している（例えば、非特許文献１０参照）。Trypanosoma cruziによる感染もまた、（ＷＳＸ−１-/-）マウスにおいて、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを含む炎症性サイトカインの生産過剰により重度の肝臓損傷を誘導する（例えば、非特許文献１１参照）。それゆえ、ＩＬ−２７は細胞内寄生性病原体の感染によって誘導されたＴｈ１免疫応答の促進又は阻害によって、宿主抵抗性をコーディネートすると報告されている（例えば、非特許文献１２、１３参照）２２、２３）。
【００１１】
また、最近の研究は、Ｔｈ２を介した免疫応答により排除される特性が解明された蠕虫であるTrichuris muris(T.muris)で感染された（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、増大するＴｈ２サイトカイン産生による急速な寄生虫の排除を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１４参照）。さらに、（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、抗原による刺激（challenge）に応答して、気道過敏性（ＡＨＲ）の亢進、気道における杯細胞からのムチンの過剰産生と好酸球浸潤、及び、ＩｇＥ及びＴｈ２サイトカイン生産の増大による強い喘息の表現型を示すことが開示されている（例えば、非特許文献１５参照）。
【００１２】
また、最近ＩＬ−２７が、インターロイキン１７を産生するヘルパーＴ（Ｔｈ−１７）細胞の分化を阻害することにより炎症を抑制する能力を有することが示されている（例えば、非特許文献１６、１７参照）。
【非特許文献１】Pflanz, S., J.C.Timans, J.Cheung,R.Rosales,H.Kanzler, J.Gilbert, L.Hibbert, T.Churakova,M. Travis, E.Vaisberg,W.M.Blumenschein, J.D.Mattson, J.L.Wagner,W.To, S. Zurawski, T.K.McClanahan,D.M.Gorman, J.F.Bazan,R. deWaalMalefyt,D.Rennick, andR.A.Kastelein. 2002. IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naiveCD4(+) T cells. Immunity 16:779-790.
【非特許文献２】Pflanz, S., L.Hibbert, J.Mattson,R.Rosales, E.Vaisberg, J.F.Bazan, J.H. Phillips,T.K.McClanahan,R. deWaalMalefyt, andR.A.Kastelein. 2004.WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducing receptor for IL-27. J Immunol 172:2225-2231.
【非特許文献３】Szabo, S.J., S.T.Kim,G.L.Costa,X. Zhang,C.G. Fathman, and L.H.Glimcher. 2000.A novel transcription factor,T-bet, directs Th1 lineage commitment.Cell 100:655-669.
【非特許文献４】Hibbert, L., S. Pflanz,R.DeWaalMalefyt, andR.A.Kastelein. 2003. IL-27 and IFNalpha signal via Stat1 and Stat3 and induce T-Bet and IL-12Rbeta2 in naive T cells. J InterferonCytokineRes 23:513-522.
【非特許文献５】Kamiya, S., T.Owaki,N.Morishima, F. Fukai, J.Mizuguchi, and T.Yoshimoto. 2004.An indispensable role for STAT1 in IL-27-induced T-bet expression but not proliferation of naiveCD4+ T cells. J Immunol 173:3871-3877.
【非特許文献６】Takeda,A., S.Hamano,A.Yamanaka, T.Hanada, T. Ishibashi, T.W.Mak,A. Yoshimura, andH.Yoshida. 2003.Cutting edge: role of IL-27/WSX-1 signaling for induction ofT-bet through activation of STAT1 during initial Th1 commitment. J Immunol 170:4886-4890.
【非特許文献７】Yoshida,H., S.Hamano,G. Senaldi, T.Covey, R. Faggioni, S.Mu,M.Xia,A.C. Wakeham,H.Nishina, J. Potter,C.J. Saris, and T.W.Mak. 2001.WSX-1 is required for the initiation ofTh1 responses and resistance to L.major infection. Immunity 15:569-578.
【非特許文献８】Chen,Q.,N.Ghilardi,H.Wang,T.Baker,M.H.Xie,A.Gurney, I.S.Grewal, and F.J. de Sauvage. 2000.Development ofTh1-type immune responses requires the type I cytokine receptor TCCR.Nature 407:916-920.
【非特許文献９】Artis,D., L.M. Johnson,K. Joyce,C. Saris,A.Villarino,C.A.Hunter, and P. Scott. 2004. Cutting edge: early IL-4 production governs the requirement for IL-27-WSX-1 signaling in the development of protective Th1 cytokine responses following Leishmaniamajor infection. J Immunol 172:4672-4675.
【非特許文献１０】Villarino,A., L.Hibbert, L. Lieberman, E.Wilson, T.Mak,H.Yoshida,R.A.Kastelein, C. Saris, andC.A.Hunter. 2003. The IL-27R(WSX-1) is required to suppressT cell hyperactivity during infection. Immunity 19:645-655.
【非特許文献１１】Hamano, S.,K.Himeno,Y.Miyazaki,K. Ishii,A.Yamanaka,A. Takeda,M. Zhang,H. Hisaeda, T.W.Mak,A.Yoshimura, andH.Yoshida. 2003.WSX-1 is required for resistance to Trypanosoma cruzi infection by regulation of proinflammatory cytokine production. Immunity 19:657-667.
【非特許文献１２】Hunter,C.A. 2005.NewIL-12-familymembers: IL-23 and IL-27, cytokineswith divergent functions.Nat Rev Immunol 5:521-531.
【非特許文献１３】Hunter,C.A.,A.Villarino,D.Artis, and P. Scott. 2004. The role of IL-27 in the development of T-cell responses during parasitic infections. ImmunolRev 202:106-114.
【非特許文献１４】Artis,D.,A.Villarino,M. Silverman,W.He, E.M.Thornton, S.Mu, S. Summer, T.M. Covey, E.Huang,H.Yoshida,G.Koretzky,M.Goldschmidt,G.D.Wu, F. de Sauvage, H.R.Miller,C.J. Saris, P. Scott, andC.A.Hunter. 2004. The IL-27 receptor (WSX-1) is an inhibitor of innate and adaptive elements of type 2 immunity. J Immunol 173:5626-5634.
【非特許文献１５】Miyazaki,Y.,H. Inoue,M.Matsumura,K.Matsumoto, T.Nakano,M.Tsuda, S. Hamano,A.Yoshimura, andH.Yoshida. 2005. Exacerbation of experimental allergic asthma by augmentedTh2 responses inWSX-1-deficientmice. J Immunol 175:2401- 2407.
【非特許文献１６】Batten,M., J. Li, S.Yi,N.M.Kljavin,D.M.Danilenko, S. Lucas, J. Lee, F.J. de Sauvage, andN.Ghilardi. 2006. Interleukin 27 limits autoimmune encephalomyelitis by suppressing the development of interleukin 17-producing T cells.Nat Immunol 7:929- 936.
【非特許文献１７】Stumhofer, J.S.,A. Laurence, E.H.Wilson, E.Huang,C.M.Tato, L.M. Johnson,A.V.Villarino,Q.Huang,A.Yoshimura,D. Sehy, C.J. Saris, J.O'Shea J, L.Hennighausen,M. Ernst, andC.A.Hunter. 2006. Interleukin 27 negatively regulates the development of interleukin 17-producingThelper cells during chronic inflammation of the central nervous system.Nat Immunol 7:937-945.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、Ｔｈ２サイトカインによって惹起されるＴｈ２型アレルギー性疾患の治療薬としては、現在、ＩｇＥ抗体とＴｈ２サイトカインとによって活性化されたエフェクター細胞（肥満細胞など）から産生される様々な化学伝達物質を抑制することを目的としたものが主流となっており、Ｔｈ２サイトカイン自体の産生を抑制するＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬の開発は遅々として進んでいない。Ｔｈ２サイトカイン産生抑制剤としての新規アトピー性疾患治療薬の確立が期待される。
【００１４】
Ｔｈ２サイトカイン自体の産生を抑制する方法としては、ＩＬ−２の大量投与又はＩＬ−１２とＩＬ−１８との組合せ投与による感染防御・抗アレルギー作用が挙げられる。これによりＴｈ２反応の誘導は阻害され、逆にＴｈ１反応が誘導される。さらに、ＩＬ−１２とＩＬ−１８との生体内投与は様々な細胞に作用してＩＦＮ−γの産生を誘導する。その結果産生されたＩＦＮ−γは細胞内寄生性病原体の感染防御作用や抗アレルギー作用を発揮する。
【００１５】
しかし、ＩＬ−１２とＩＬ−１８との組合せ投与は、過剰なＩＦＮ−γの産生を誘導するため、これによる過度の炎症反応を惹起することで、肝臓毒等の副作用が強く、実際の治療には不適切である。
【００１６】
また、Ｔｈ１細胞から産生されたＩＦＮ−γは、Ｔｈ２サイトカインに拮抗してこれを抑制し抗アレルギー作用を発揮する。しかし、分極化した（樹立された）Ｔｈ２細胞からのＴｈ２サイトカインの産生を抑制する作用がないため、進行中のアレルギー性炎症を抑制することはできない。なお、ここで「分極化した」Ｔｈ２細胞とは、既にＴｈ２細胞に分化し、Ｔｈ２サイトカインを産生する能力を備えた細胞を意味し、「樹立された」Ｔｈ２細胞と同義である。
【００１７】
したがって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導の抑制及び、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生の抑制を利用した感染症とアレルギー性疾患に対する有効で副作用のない治療薬が求められている。
【００１８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔｈ２細胞により産生されるサイトカインにより惹起されるアレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬、又は、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられる感染症治療薬であって、Ｔｈ２細胞への分化誘導の抑制、及び、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生の抑制を利用した感染症とアレルギー性疾患に対する有効で副作用のない治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、上記課題を解決するために、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７（ＩＬ−２７）を含有することを特徴としている。
【００２０】
上記の構成によれば、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するので、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【００２１】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬では、上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患は、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、又は、アレルギー性結膜炎であることが好ましい。
【００２２】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞が樹立された個体を対象とすることが好ましい。
【００２３】
ＩＬ−２７が樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するため、進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患を抑制することができるというさらなる効果を奏する。
【００２４】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、経鼻投与剤、経皮投与剤、又は、点眼投与剤であることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る感染症治療薬は、上記課題を解決するために、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有することを特徴としている。
【００２６】
上記の構成によれば、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するので、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、以上のように、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するという構成を備えているので、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するため、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【００２８】
また、本発明に係る感染症治療薬は、以上のように、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するという構成を備えているので、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するので、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の実施の一形態について説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
〔Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬〕
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するものであれば特に限定されるものではない。
【００３１】
なお、ＩＬ−２７Ｒの１つのサブユニットであるＷＳＸ−１／ＴＣＣＲが欠損した（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、増大するＴｈ２サイトカイン産生による急速な寄生虫の排除を示すこと、及び、抗原による刺激に応答して、ＩｇＥ及びＴｈ２サイトカイン生産の増大による強い喘息の表現型を示すことが知られている。しかしながら、ＩＬ−２７Ｒは、ＷＳＸ−１／ＴＣＣＲとｇｐ１３０とからなるヘテロダイマーであり、片方のサブユニットが欠損するとＴｈ２サイトカインが増大するからといって、ＩＬ−２７がＴｈ２型アレルギーを抑制するといえるわけではない。
【００３２】
本明細書において、「Ｔｈ２型アレルギー性疾患」とは、アレルゲンによって誘導されたＴｈ２細胞から産生されるＴｈ２サイトカインによって惹起される疾患を意味する。その病態の本質はＴｈ２サイトカインによって誘導されたＩｇＥ抗体と、Ｔｈ２サイトカインによって活性化された好酸球、マスト細胞による炎症性変化である。
【００３３】
Ｔｈ２型アレルギー性疾患は、Ｔｈ２型応答によって発症するアレルギー性疾患であれば特に限定されるものではないが、例えば、Ｔｈ２型気管支喘息、Ｔｈ２型アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎等である。より具体的には例えば、Ｔｈ２細胞により産生されるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインにより発症し、気道過敏性（ＡＨＲ）の亢進、気道における杯細胞からのムチンの過剰産生及び好酸球浸潤を特徴とする気管支喘息、又は、眼瞼結膜への好酸球浸潤と肥満細胞の活性化とを伴ったアレルギー性結膜炎等を挙げることができる。
【００３４】
本発明者らは、後述する実施例において記載しているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で、例えば、卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的ナイーブＴ細胞を、ＯＶＡとＩＬ−４＋抗ＩＬ−１２抗体／抗ＩＦＮ−γ抗体で刺激して、Ｔｈ２細胞に分化を誘導する系に、ＩＬ−２７を添加すると、Ｔｈ２サイトカインの産生が抑制され、逆にＩＦＮ−γの産生が増強されることを実験的に確認した。さらに、樹立したＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞をＯＶＡで刺激することによって誘導されるＴｈ２サイトカイン産生に対しても、ＩＬ−２７を添加することによって、これを顕著に抑制できることをｉｎ ｖｉｔｒｏ系で実験的に確認した。このＩＬ−２７のＴｈ２細胞分化抑制と、Ｔｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生抑制との作用機序を解析した結果、ＩＬ−２７はＴｈ２細胞の誘導と維持に必須の核内転写因子ＧＡＴＡ−３の発現を抑制し、Ｔｈ１細胞の誘導と維持に必須の核内転写因子Ｔ−ｂｅｔの発現を増強することを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で確認した。このように、ＩＬ−２７は、驚くべきことに、Ｔｈ２細胞分化の条件下でさえ、Ｔ−ｂｅｔの発現を誘導してＩＦＮ−γを産生する。
【００３５】
また、ｉｎ ｖｉｖｏ系で、細胞内寄生性病原体でＴｈ２免疫応答を誘導することにより致死性を示す感染症に対し、ＩＬ−２７の生体内投与は、Ｔｈ２細胞分化の誘導を阻止し、逆にＴｈ１細胞分化を惹起することで、致死性を示す感染症の発病を抑制し、感染症を治癒させることを明らかにした。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ系で、アレルゲンで感作されたマウスにアレルゲンを点鼻することで発症するアレルギー性の気管支喘息に対しても、アレルゲンと共にＩＬ−２７を点鼻すると、分極化したＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制する結果、喘息の発症を抑制することを確認した。
【００３６】
本発明で用いるＩＬ−２７は、実際に投与される対象に対して上記生理活性を発現しうるものであれば特に制限させるものではなく、天然に生産されたものであってもよいし、遺伝子工学的に生産されたものであってもよいし、化学的に合成されたものであってもよい。例えば、Yoshimoto, T.,K.Okada,N.Morishima, S.Kamiya, T.Owaki,M.Asakawa,Y.Iwakura, F. Fukai, and J.Mizuguchi. 2004 J Immunol 173:2479-2485.に記載の方法を用いて好適に製造することができる。
【００３７】
本発明にかかるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の治療、予防、改善のために好適に用いることができる。本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬をＴｈ２型アレルギー性疾患の治療、予防、改善のために用いる場合には、その投与形態は、非経口的に経鼻、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、局所または皮下に投与するものであっても、経口的に投与するものであってもよい。治療対象となるアレルギー性疾患が、気道過敏性（ＡＨＲ）の亢進、気道における杯細胞からのムチンの過剰産生及び好酸球浸潤を特徴とする気管支喘息等である場合には、特に経鼻投与がより好適である。かかるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、選択される投与方法に応じて、ＩＬ−２７またはその薬学的に許容しうる有機酸または無機酸との付加塩を、薬学的に許容しうる担体とともに含有しうる。
【００３８】
非経口的に投与する場合、上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、例えば、注射剤、直腸投与剤、皮膚外用剤、吸入剤、点眼剤等とすることができる。また、経口的に投与する場合、上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、リポソーム、ゼラチンカプセル等の固形製剤や、シロップ剤等の液状製剤とすることができる。
【００３９】
固形製剤は、上記担体として、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤等を用いて、通常用いられる方法で製造することができる。ここで、上記賦形剤、結合剤および崩壊剤としては、通常用いられるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、乳糖、白糖等の糖誘導体；デンプン；デキストリン；結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩等を挙げることができる。また、上記滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩、ワックス、タルク等を挙げることができる。また、安定剤、矯味矯臭剤としても、通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４０】
液状製剤は、上記担体として、例えば、水；グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等の有機溶媒；これらと水との混合物等を用いて通常用いられる方法で製造することができる。また、液状製剤は、さらに、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００４１】
また、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の治療、予防、改善に用いられる場合、本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬の投与量、投与回数は、投与方法、投与対象の年齢および体重、投与対象の状態等によって異なるが、有効成分であるＩＬ−２７の量が、例えば、投与対象の体重１ｋｇに対し、１日当り下限として、１０μｇであることが好ましく、３０μｇであることがより好ましい。また、１日当り上限として、６０μｇであることが好ましく、５０μｇであることがより好ましい。
【００４２】
また、本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、有効成分としてＩＬ−２７を含有するものであればよいが、さらにその他の成分を含む薬学的組成物であってもよい。或いは、本発明に用いるＩＬ−２７は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
【００４３】
また、本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞がすでに樹立された個体に対しても有効である。すなわち、従来は、進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患を抑制するサイトカイン治療薬はなかったが、本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、上述したように、すでに樹立されたＴｈ２細胞からのサイトカイン産生を抑制することができる。このことは、樹立したＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞をＯＶＡで刺激することによって誘導されるＴｈ２サイトカイン産生に対しても、ＩＬ−２７を添加することによって、これを顕著に抑制できることをｉｎ ｖｉｔｒｏ系及びｉｎ ｖｉｖｏ系で実験的に確認している。
【００４４】
ここで、Ｔｈ２細胞がすでに樹立された個体とは、抗原による初回刺激により、Ｔｈ２サイトカインを産生できるＴｈ２細胞を有している個体であればよい。係る個体では、２回目以降の刺激により、Ｔｈ２細胞からのサイトカイン産生が誘導されるが、この時点で、本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬を投与することにより、サイトカインの産生を抑制し、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を治療又は改善することができる。また、Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬の投与時期は、Ｔｈ２細胞からサイトカインが産生されていればよく、すでにＴｈ２サイトカインが産生されＴｈ２型アレルギー性疾患が進行していても有効である。
【００４５】
なお、本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞の分化をも抑制するので、Ｔｈ２細胞が樹立される前に投与されても有効であることはいうまでもない。
【００４６】
〔感染症治療薬〕
また、本発明にかかる感染症治療薬は、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するものであれば特に限定されるものではない。
【００４７】
ここで、細胞内寄生性病原体に対する生体防御作用は、Ｔｈ１免疫応答により産生されたＩＦＮ−γによって行われるが、Ｔｈ２細胞から産生されたサイトカインは、上述したようにマクロファージからの一酸化窒素産生を抑制する結果、細胞内寄生性病原体の増殖を促すことが知られている。
【００４８】
例えば、細胞内寄生性病原体リーシュマニアに対して、抵抗性を有さないマウスの種であるＢＡＬＢ／ｃマウスを例に挙げて説明すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスはリーシュマニアに対して抵抗性を持たないためリーシュマニアへの感染は致死性である。これは、リーシュマニアに抵抗性を有するマウスの種では、感染に伴いＴｈ１細胞分化が誘導されてＩＦＮ−γが産生されるのに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、Ｔｈ１細胞分化ではなく、Ｔｈ２細胞分化が誘導されるためである。
【００４９】
本発明にかかる感染症治療薬は、このようにＴｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いることができる。
【００５０】
上述した例では、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ系で、細胞内寄生性病原体でＴｈ２免疫応答を誘導することにより致死性を示す感染症に対し、ＩＬ−２７の生体内投与は、Ｔｈ２細胞分化の誘導を阻止し、逆にＴｈ１細胞分化を惹起することで、致死性を示す感染症の発病を抑制し、感染症を治癒させることを明らかにした。
【００５１】
上記細胞内寄生性病原体としては、ライ菌等の細菌；リーシュマニア等の原虫等を挙げることができる。
【００５２】
なお、本発明にかかる感染症治療薬の有効成分であるＩＬ−２７、投与形態、投与量については、上記〔Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬〕の場合と同様であるのでここでは説明を省略する。
【００５３】
また、本発明に係る感染症治療薬は、有効成分としてＩＬ−２７を含有するものであればよいが、さらにその他の成分を含む薬学的組成物であってもよい。或いは、本発明に用いるＩＬ−２７は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
【実施例】
【００５４】
本発明について、実施例および図１〜５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
まず、本実施例において用いた、使用マウス、試薬等、各操作法について説明する。
【００５６】
＜使用マウス＞
Jackson Laboratoryから特定病原体未感染（ＳＰＦ：Specific pathogen-free）雌ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を購入した。Dr. D. Loh （Washington University, St. Louis, MO）から、ＯＶＡ３２３−３３９（ＯＶＡの３２３−３３９番目のアミノ酸からなるポリペプチド）を認識するαβＴＣＲのトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（ＤＯ１１．１０；遺伝的背景ＢＡＬＢ／ｃ）を入手した。ＩＬ−２７Ｔｇマウスは以下のようにして作製した。ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−９（Sigma Chemical Co.）中の、ＥＢＩ３が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーでｐ２８に柔軟に連結され、３ｘフラグタグされた一本鎖マウスＩＬ−２７のｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲにより増幅して、肝臓特異的ヒト血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）プロモーター及びウサギのβグロブリン遺伝子を含むｐＬＧ１−ＳＡＰベクターに挿入した。ＩＬ−２７Ｔｇマウスラインは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られた受精卵への上記ｃＤＮＡの前核のマイクロインジェクションによって作製した（Takayuki Yoshimoto, manuscript in preparation）。全てのマウスは兵庫医科大学（西宮、日本）の動物施設においてＳＰＦ条件下で飼育し、６〜１２週齢のものを使用した。
【００５７】
＜試薬等＞
組換えマウスＩＬ−１２及びＩＬ−１８は、それぞれ、Genetic Institute Inc.（Cambridge MA）及びMBL（名古屋、日本）から購入した。組換えマウスＩＬ−２７は、Yoshimoto, T.,K.Okada,N.Morishima, S.Kamiya, T.Owaki,M.Asakawa,Y.Iwakura, F. Fukai, and J.Mizuguchi. 2004 J Immunol 173:2479-2485.に記載の方法に従い、ＥＢＩ３が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーでｐ２８に柔軟に連結され、３ｘフラグタグされた一本鎖タンパク質として調製し精製した。Limulus amebocyte lysate method（和光純薬、東京、日本）を用いて決定したエンドトキシンレベルは１μｇのｒＩＬ−２７につき８ｐｇより低かった。組換えマウスＩＬ−４は、Yoshimoto, T.,K.Takeda, T.Tanaka,K.Ohkusu, S.Kashiwamura,H.Okamura, S.Akira, andK.Nakanishi. 1998. J Immunol 161:3400-3407.に記載の方法で作製された組換えバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ．ＩＬ−４）から得て精製した。精製された抗体〔抗マウスＣＤ２８抗体（３７．５１）、抗マウスＣＤ３抗体（２Ｃ１１）、抗マウスＩＬ−４抗体（１１Ｂ１１）、抗マウスＩＬ−１２ｐ４０抗体（Ｃ１７．８）及び抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２）〕を製造した。ＰＥ抗マウスＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体（ＭＥＬ−１４）、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１１Ｃ抗体、ＰＥ−ラット抗マウスＩＡ／Ｉ−Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２）、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍ−抗ＣＤ４抗体及びビオチンラット抗マウスＩｇＥ抗体（Ｒ３５１１８）はBD Bioscience（San Diego, CA）から購入した。ラット抗マウスＩｇＥ抗体（２３Ｇ３）はSouthern Biotechnology Associates Inc.（Birmingham, AL）から購入した。抗ＧＡＴＡ−３マウスモノクローナル抗体（ＨＧ３−３１）、抗Ｔ−ｂｅｔマウスモノクローナル抗体（３９Ｄ）及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｈ−１９６）はSanta Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）から購入した。
【００５８】
＜Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞の製造＞
２４ウェルプレートのウェルに、１０％ＦＢＳ、５０μＭ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加した全量で１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を充填し、７日間、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５／ｍｌ）を、２×１０４／ｍｌの抗原提示細胞（ＡＰＣ；Ohteki, T.,K. Suzue,C.Maki,T.Ota, and S.Koyasu. 2001. Nat Immunol2:1138-1143.に記載の方法で製造された照射・精製された脾樹状細胞）の存在下、ＩＬ−１２（１００ｐＭ）及びＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）で刺激した。Ｔｈ１細胞の誘導ために、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）及び抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）を培地にさらに添加した。Ｔｈ２細胞の誘導のためには、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体（２０μｇ／ｍｌ）＋抗ＩＦＮ−γ抗体（２０μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。合計量２０μｇ／ｍｌのＩＬ−１８及びＩＬ−２７の種々の組合せがＴｈ２細胞の初代培養に用いられた。
【００５９】
＜ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養＞
樹立したＴｈ２細胞を、再び、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び１×１０５／０．２ｍｌＡＰＣ（照射されたＴ細胞が枯渇したＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞）とともに、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルでＩＬ−２７の存在下（０−１００μｇ／ｍｌ）培養した。Ｌ．ｍａｊｏｒ感染マウス又はブェネズエラ糞線虫Ｌ３感染マウスからの、それぞれ、膝窩又は腸間膜のリンパ節細胞からのサイトカインの発生と測定のために、固相化された抗マウスＣＤ３抗体及び抗マウスＣＤ２８抗体（それぞれ５μｇ／ｍｌ）とともに、２×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで培養した。４８時間培養した後、上清を収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＦＮ−γ成分、ＩＬ−４成分、ＩＬ−５成分、及びＩＬ−１３成分について調べた。
【００６０】
＜フローサイトメトリー＞
ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ休止細胞の製造のために、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウスからの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞をMicroBeads（抗マウスＣＤ４抗体；クローンＲＭ４−５、Miltenyi Biotec、Bergisch-Gladbach、Germany）によって精製した。濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、染色バッファ中（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）で、最初に、１０μｇ／ｍｌの抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ抗体で３０ｍｉｎ、４℃で処理し、続いてＰＥ抗マウスＣＤ４抗体及びＦＩＴＣ抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体で、３０ｍｉｎ、４℃で処理した。染色したサンプルは、ＦＡＣＳ Aria（Becton Dickinson）で、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞に分離された。再分析の後、分離された細胞の純度は＞９８．５％であった。細胞内のサイトカインの染色のために、分極化したＴｈ２細胞（１×１０６／ｍｌ）を、５０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ＋０．５μＭイオノマイシンで、４ｈ、最後の２時間は、サイトカインの分泌を阻害するために、１μｇ／ｍｌのBrefeldinＡ（BD Biosciences）のパルスで再度刺激した。細胞はＣｙ−Ｃｈｒｏｍ−抗ＣＤ４抗体で染色し、続いてパラホルムアルデヒドの４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＢＳ溶液で固定し、細胞膜を氷のように冷たい１％ＦＣＳ＋０．１％サポニン含有ＰＢＳで透過性にした。得られた細胞はさらに、０．５μｇＰＥラット抗マウスＩＬ−４抗体＋０．５μｇＦＩＴＣラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体又はアイソタイプ対応コントロールＡｂｓ（BD Bioscience）で染色し、ＦＡＣＳＣCalibur（Becton Dickinson）によって、細胞質のＩＬ−４＋又はＩＦＮ−γ＋の比率について分析した。
【００６１】
＜Ｌ．ｍａｊｏｒの感染＞
Ｌ．ｍａｊｏｒ（ＷＨＯ株ＭＨＯＭ／ＳＵ／７３−５−ＡＳＫＨ）は、Ohkusu,K., T.Yoshimoto,K.Takeda, T.Ogura, S.Kashiwamura,Y. Iwakura, S.Akira,H.Okamura, andK.Nakanishi. 2000. Infect Immun 68:2449-2456.に記載の方法で、ｉｎ ｖｉｖｏで維持し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた。感染は、マウスの後ろ足の足蹠に、５×１０６の静止期のプロマスチゴートの皮下注射による接種によって行った。足蹠の病変を週１回ダイアルゲージキャリパーで測定し、感染していない足蹠の厚みと比較した。感染部位の所属リンパ節である膝窩リンパ節の寄生虫量はOhkusu,K., T.Yoshimoto,K.Takeda, T.Ogura, S.Kashiwamura,Y. Iwakura, S.Akira,H.Okamura, andK.Nakanishi. 2000. Infect Immun 68:2449-2456.に記載の方法により、決定した。
【００６２】
＜ブェネズエラ糞線虫の感染＞
ブェネズエラ糞線虫は、Sasaki,Y., T.Yoshimoto,H.Maruyama, T. Tegoshi,N.Ohta,N.Arizono, andK. Nakanishi. 2005. J ExpMed 202:607-616.に記載の方法により維持した。動物には、完全な感染を起こすために、５０００隻のブェネズエラ糞線虫Ｌ３を皮下接種した。マウス個体毎の感染の程度は、日１回、排泄される卵の数（ｇ糞毎の卵）を数えることによりモニターした。
【００６３】
＜ＯＶＡ−特異的な気管支喘息の発生と分析＞
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍ）との複合体とした５０μｇＯＶＡを第１日目に腹腔内に免疫し、第７、８及び９日目に５０μｌＰＢＳと混合したＯＶＡ５０μｇを経鼻投与した。対照群のマウスは、ＯＶＡで免疫されＰＢＳのみに暴露した。マウスは、以下に示すように、最後のＰＢＳ又はＯＶＡへの暴露の２４時間後に分析を行った。β−メタコリン（Ｍｃｈ）吸入に対するマウスにおけるＡＨＲの測定は、Ｐｕｌｍｏｓ−Ｉ（ＭＩＰＳ、大阪、日本）のハードウエア及びソフトウエアを用い、Sugimoto,T.,Y. Ishikawa,T.Yoshimoto,N.Hayashi, J. Fujimoto, andK.Nakanishi.2004. J ExpMed 199:535-545.、Ishikawa,Y., T.Yoshimoto, andK.Nakanishi. 2006. Int Immunol 18:847-855.に記載の方法で行った。気管支肺胞の洗浄（ＢＡＬ）は、１匹のマウス当たり、１．０ｍｌ ＰＢＳを用いて３回行い、回収した洗浄液中の合計細胞数を計測した。ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）を遠心後Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Baxter Healthcare Corp., Miami, FL）で染色し、形態学及び染色特性に基づいて区別した。組織学的分析のために、肺は右室を１０ｍｌＰＢＳに染み込ませることにより準備し、続いて１０％の緩衝化したホルマリン中で固定し、３μｍ切片を作成し、分解されやすくした過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ染色）により染色した。ＩＬ−１３産生の検出のために、肺は、Ishikawa,Y., T.Yoshimoto, andK.Nakanishi. 2006. Int Immunol 18:847-855.に記載されているように、最後のＰＢＳ又はＯＶＡへの暴露の２４時間後に取り出しホモジナイズ、遠心を行った。得られた上清は、ＥＬＩＺＡによりＩＬ−１３含有量について測定した。
【００６４】
＜ｉｎ ｖｉｖｏ処置＞
Ｌ．ｍａｊｏｒ実験のために、マウスに１日１回ＰＢＳバッファ、ＩＬ−２７（１μｇ／ｄａｙ）又はＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｄａｙ）及びＩＬ−１８（１μｇ／ｄａｙ）の組み合わせを７日間、腹腔内注射した。気道炎症の実験のために、７、８及び９日目に、ＯＶＡで免疫されたマウスに、５０μｌＰＢＳ中の５０μｇＯＶＡを単独で又はＩＬ−２７（０．２、１．５μｇ）とともに経鼻投与した。
【００６５】
＜ＥＬＩＺＡアッセイ＞
ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γのためのＥＬＩＺＡキット（R&D Systems Inc., Minneapolis, MN）を用いた。血清中のｍＭＣＰ−１レベルは、Moedum Scientific, Ltd.（Edinburgh, UK）から購入したｍＭＣＰ−１ＥＬＩＺＡキットを用いて測定した。血清中のＩｇＥレベルは、Yoshimoto, T.,H.Mizutani,H. Tsutsui,N.Noben-Trauth,K.Yamanaka,M. Tanaka, S.Izumi,H.Okamura,W.E. Paul, andK.Nakanishi. 2000.Nat Immunol 1:132-137.に記載のＥＬＩＺＡアッセイにより測定した。
【００６６】
ウエスタンブロッティング
ＧＡＴＡ−３及びＴ−ｂｅｔのタンパク質レベルは、ウエスタンブロットを用いて行った。ＧＡＴＡ−３発現を検出するために、細胞をＰＢＳで１度洗浄し、バッファＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ[ｐＨ７．８]、１０ｍＭ ＫＣＬ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ及び０．５％ＮＰ４０）中に再懸濁した。細胞核を沈殿させ（pelleted）、細胞質のタンパク質を注意深く取り出した。細胞核は、Adachi,O., T.Kawai,K. Takeda,M.Matsumoto,H. Tsutsui,M. Sakagami,K.Nakanishi, and S.Akira. 1998 Immunity 9:143-150.に記載のとおり、その後バッファＣ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ[ｐＨ７．８]、４２０ｍＭ ＫＣＬ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、及び、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁した。３０分、４℃で、ボルテックス及び攪拌後サンプルは遠心を行い、上清中のタンパク質は新しいバイアル瓶に移した。核抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロットは、ＧＡＴＡ−３に対するマウスモノクローナル抗体（ｈＧ１−３１、希釈１：２００）を用いて調べた。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼと複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（希釈１：２０００；Chemicon ）を、視覚化のために用いた。Ｔ−ｂｅｔ及びアクチンの発現を検出するために、全細胞の溶解物をOwaki, T.,M.Asakawa,N.Morishima,K.Hata, F. Fukai,M.Matsui, J.Mizuguchi, and T.Yoshimoto. 2005. J Immunol 175:2191-2200.に記載の方法により、ウエスタンブロット分析に供した。
【００６７】
＜統計値＞
実験群間の統計に基づく比較は、一組の学生のｔテストによった。全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（San Diego, CA, USA）により行った。Ｐ値＜０．０５は、顕著に相違すると考えた。
【００６８】
〔実施例１：ＩＬ−２７によるＴｈ２細胞分化の阻害〕
ＩＬ−２７がＴｈ２細胞の分極化を阻害するかを調べ、また、ＩＬ−２７がＩＬ−１８の作用を強める能力を調べた。まず、ＤＯ１１．１０マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡペプチド、ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１２＋抗ＩＦＮ−γで１週間刺激することによってＴｈ２細胞の分極化を誘導した。
【００６９】
具体的には、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５／ｍｌ）を、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び、２×１０４／ｍｌの照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓樹状細胞とともに、以下に示すＴｈ２条件又はＴｈ１条件の下、共存させるＩＬ−１８とＩＬ−２７との組合せ（合計量：２０μｇ／ｍｌ）（図１Ａ、Ｂ）又はＩＬ−２７の濃度（０−１００ｎｇ／ｍｌ）（図１Ｃ、Ｄ）を変化させて、全量１ｍｌのウェル中で７日間培養を行った。なお、培養には２４ウェルのウェルプレートを用いた。
＜Ｔｈ２条件＞：ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体（各々２０μｇ／ｍｌ）＋抗ＩＦＮ−γ抗体（各々２０μｇ／ｍｌ）
＜Ｔｈ１条件＞：ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）
上記初回刺激の後、細胞を洗浄し、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び、照射されたＴ細胞−洗浄したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓樹状細胞を、サイトカインの分泌を誘導するために、４８時間、いろいろな濃度のＩＬ−２７（０−１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で再び培養した（図１Ａ、Ｃ）。または、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下４時間再培養し、細胞質内のＩＬ−４及びＩＦＮ−γについて、ＦＡＣＳ分析を行った（図１Ｄ）。上清は収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γの含有量を調べた（図１Ａ、Ｃ）。図１Ｄ中の数字は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＩＬ−４産生細胞の割合又はＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ−γ産生細胞の割合を示す。上記初回刺激の５日後に、細胞核又は全細胞の溶解物を調製し、それぞれ、抗ＧＡＴＡ−３抗体又は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った（図１Ｂ）。結果は独立して行った３回の実験結果の幾何平均＋s.e.mで示す。
【００７０】
図１、Ａ及びＣに示すように得られたＴｈ２細胞は、ＯＶＡにより刺激されて多量のＩＬ−４及びＩＬ−１３を生産するがＩＦＮ−γは生産しなかった。また、図１、Ａ及びＢより、Ｌ−２７の添加は、ＧＡＴＡ−３のダウンレギュレーションにより、Ｔｈ２細胞の分化を著しく阻害することが示された。これに対して、図１、Ａ及びＢに示すように、ＩＬ−１８がＩＬ−１２と共にＴｈ２細胞の分化を強く阻害するとはいえ、ＩＬ−１８のみではＴｈ２細胞の分化を阻害しないことが判る。また、ＩＬ−１２ファミリーの他のメンバーＩＬ−２３はＴｈ２細胞の分化を阻害するそのような効果を有しないことが確認された（データは示さず）。図１Ｂに示されるように、Ｔｈ２細胞を分化する条件下で培養されたＴ細胞は、追加的にＩＬ−２７で刺激されると、ＧＡＴＡ−３のダウンレギュレーションの他にも、同時にＴ−ｂｅｔを発現した。興味深いことには、図１、Ｂ及びＣに示すように、ＩＬ−２７は用量依存的にＴｈ２細胞の分化を阻害し、逆にＴｈ１細胞の分化を誘導した。また、ＩＬ−２７のＴｈ２細胞の分極化への効果をＦＡＣＳ分析により調べた結果、Ｔｈ２細胞を分化する条件下で培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞の５７％及び０．５６％が、それぞれ、細胞質内のＩＬ−４産生細胞及びＩＦＮ−γ産生細胞の割合あることを見出した。ＩＬ−２７の添加は、用量依存的に細胞質内のＩＬ−４産生細胞の割合を（１７．５％まで）減少させ、細胞質内のＩＦＮ−γ産生細胞の割合を（６．７３％まで）増加させた（図１、Ｄ）。
【００７１】
〔実施例２：ＩＬ−２７による樹立されたＴｈ２細胞からのサイトカイン産生抑制〕
次にＩＬ−２７の、Ｔｈ２分極化細胞の抗原提示細胞誘発時のＴｈ２サイトカイン産生能力に対する阻害効果を調べた。
【００７２】
具体的には、Ｔｈ２条件下での上記〔実施例１〕記載の初回刺激の後、細胞を洗浄し、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び、照射されたＴ細胞を除去したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓樹状細胞を、サイトカインの分泌（図２Ａ）、並びに、ＧＡＴＡ−３及びＴ−ｂｅｔの発現（図２Ｂ）を誘導するために、４８時間、いろいろな濃度のＩＬ−２７（０−１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で再び培養した。結果は独立して行った３回の実験結果の幾何平均＋s.e.mで示す。
【００７３】
図２Ａに示すように、ＩＬ−２７は、ＩＬ−４に対する効果は顕著でないのに対し用量依存的に、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生を阻害した。また、これと一致して、図２Ｂに示すように、ＩＬ−２７は用量依存的にＧＡＴＡ−３の発現を減少させ、逆にＴｈ２細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現を誘導した。このように、ＩＬ−２７は、Ｔｈ２細胞の分化の阻害、及び、ＧＡＴＡ−３発現のダウンレギュレーションとＴ−ｂｅｔ発現のアップレギュレーションとによるＴｈ２サイトカインの産生の阻害により、Ｔｈ２応答に直接の阻害効果を示すことが判る。
【００７４】
〔実施例３：ＩＬ−２７によるＢＡＬＢ／ｃマウスのレーシュマニア症からの防御〕
図３Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＬ．ｍａｊｏｒに高度に抵抗性を示すのに対し、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染したＢＡＬＢ／ｃマウスは、足蹠腫脹により判断される進行性の病気にかかる。マウスの近交系の感染に対する抵抗性及び感受性は、本質的にそれぞれＩＦＮ−γ及びＩＬ−４を産生する能力と関連している。実際に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＬ．ｍａｊｏｒ感染に応答して主にＴｈ１応答を促進するのに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスはＴｈ２応答を促進する。すでに知られているように、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染しているＣ５７ＢＬ／６マウスはＩＦＮ−γを強く産生しＩＬ−４を殆ど産生しないのに対し、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスからの膝窩リンパ節細胞は、ＩＬ−４を強く産生し、ＩＦＮ−γは殆ど産生しない（図３Ｂ）。本発明者らが以前報告したように、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｄａｙ）及びＩＬ−１８（１μｇ／ｄａｙ）の混合物の感染最初の１週間の投与は、Ｔｈ１細胞の誘導により（図３Ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、足蹠腫脹から保護し、寄生虫の量を減少させた（図３Ｃ）。これに対して、ＩＬ−１８単独の投与は、かかる保護効果を示さなかった（データは示さず）。
【００７５】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｈ２細胞の生成に対するＩＬ−２７の阻害効果を調べるために、本発明者らは、ＩＬ−２７をＬ．ｍａｊｏｒを感染させた直後のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。
【００７６】
具体的には、実験１日目に、マウスに、静止期のプロマスチゴートを皮下接種した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群５匹）は、１日１回、（１）ＰＢＳ、（２）ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｄａｙ）＋ＩＬ−１８（１μｇ／ｄａｙ）又は（３）ＩＬ−２７（１μｇ／ｄａｙ）をプロマスチゴートの皮下接種後の７日間、腹腔内に注射した。週１回足蹠の測定を行い、足蹠の腫れを測定した。図３Ａに、足蹠の腫れの平均値＋s.e.m.を示す。図３Ａ中、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１は、ＰＢＳで処理された感染マウスの対応する値に対するものである。
【００７７】
感染７週後に、各群（各群につき５匹）のマウスからの膝窩リンパ節を取り出した。細胞懸濁液を固相化された抗マウスＣＤ３抗体及び抗マウスＣＤ２８抗体（それぞれ５μｇ／ｍｌ）とともに、２×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで培養した。４８時間培養した後、上清を収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＦＮ−γ成分及びＩＬ−４成分について調べた。
【００７８】
また、感染７週後に、所属リンパ節細胞１×１０３個中の寄生虫の量を決定した。サンプル間の統計的な差は、学生のｔテストによった。結果は３回独立して行った実験結果から得た。
【００７９】
図３Ａに示すように、感染最初の一週間におけるＩＬ−２７の投与（１μｇ／ｄａｙ）は、部分的にではあるが顕著にマウスを足蹠腫脹から防御し、図３Ｃに示すように寄生虫の量をかなり減少させた。本発明者らは、同時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８の刺激に対する膝窩リンパ節細胞のＩＬ−４及びＩＦＮ−γを産生する能力を測定した。図３Ｂに示すように、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染し、ＩＬ−２７を投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節細胞は、ＩＬ−４の産生が減少し、ＩＦＮ−γの産生が増加した。Ｌ．ｍａｊｏｒに感染したＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスは、大変異なる感染の過程を示すとしても、両者とも感染初期の間は類似する量のＩＬ−１２を産生することが報告されていた。このように、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスへのＩＬ−２７の投与は、Ｔｈ２応答の阻害及びＴｈ１応答の促進により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを進行性のレーシュマニア症から防御する。ＩＬ−２７により刺激されたＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現するようになり、内在性のＩＬ−１２による刺激のもとでＴｈ１細胞に分化するのではないかと考えられる。
【００８０】
〔実施例４：ＩＬ−２７遺伝子導入マウスにおけるブェネズエラ糞線虫誘導Ｔｈ２応答の阻害〕
腸管寄生線虫ブェネズエラ糞線虫の第３期の幼虫（Ｌ３）に感染したマウスは、血清中のＩｇＥレベル及び第１次のＴｈ２応答により小腸粘膜マスト細胞（ＭＭＣｓ）数が上昇する。感染したマウスは、２週間以内に寄生虫の排除を完了する。寄生虫の排除は小腸粘膜マスト細胞のレベルと密接に関連している。それゆえ、内在性のＩＬ−２７が、Ｔｈ２応答のダウンレギュレーション及びＴｈ１応答のアップレギュレーションにより寄生虫の感染を維持するかどうかを実験により調べた。
【００８１】
ＩＬ−２７を肝臓で過剰発現するＴｇマウスは、血清中のＩＬ−２７レベルを顕著に上昇させた（６〜８週齢で、０．８２１±０．６２７ｎｇ／ｍｌ；ｎ＝８）。野生のＣ５７ＢＬ／６マウス及び遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ／６のＩＬ−２７Ｔｇマウスに５０００隻のブェネズエラ糞線虫Ｌ３を接種し、毎日糞中の卵数（卵／ｇ糞）を数えた。
【００８２】
各群（各群につき５匹）のマウスからの腸間膜リンパ節を感染１１日後に取り出した。細胞懸濁液を固相化された抗マウスＣＤ３抗体及び抗マウスＣＤ２８抗体（それぞれ５μｇ／ｍｌ）とともに、２×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで培養した。４８時間培養した後、上清を収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＦＮ−γ成分及びＩＬ−４成分について調べた。結果は、３回独立して行った実験から得た結果の各群５匹の幾何平均＋s.e.m.である。
【００８３】
図４Ａに、ブェネズエラ糞線虫Ｌ３を接種した、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＩＬ−２７Ｔｇマウス（ＩＬ−２７Ｔｇ）（各群５匹）のｇ糞毎の卵数の経時的変化を、図４Ｂに血清ｍＭＣＰ−１レベルを、図４Ｃに血清ＩｇＥレベルを示す。図４Ｄに、リンパ節細胞で産生されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルを示す。なお、図４中ｎｄは検出限界以下を示す。
【００８４】
図４Ａに示すように、ブェネズエラ糞線虫を接種された野生型のマウスは、１１日目までに寄生虫の排除を完了した。これに対し、ＩＬ−２７Ｔｇマウスは、寄生虫卵の産生の顕著な延長を示し、ＩＬ−２７がＴｈ２応答を阻害することを示している。実際に、野生型のマウスでは、血清中のマウスマスト細胞プロテアーゼ１（ｍＭＣＰ−１）のレベルが上昇し、このことは、小腸ＭＭＣｓの活性化及びＩｇＥレベルと非常によい相関関係にある。これに対して、ＩＬ−２７Ｔｇマウスは、図４、Ｂ及びＣに示すように、かかる応答を示すことができなかった。ブェネズエラ糞線虫を接種した野生型マウスからのリンパ節細胞は、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８に応答して、大量のＩＬ−４及び少量のＩＦＮ−γを産生した（図４Ｄ）。これに対して、ブェネズエラ糞線虫を接種したＩＬ−２７Ｔｇマウスからのリンパ節細胞は、ＩＬ−４を産生することができず（図４Ｄ）、さらに、腸管寄生線虫を駆除する能力が乏しいことを実証した。興味深いことに、感染していないＩＬ−２７Ｔｇマウスからのリンパ節細胞は、未処理の野生型マウスからのリンパ節細胞より多量のＩＦＮ−γを産生した（図４Ｄ）。このことは、ＩＬ−２７の過剰の生産はＩＬ−１２Ｒβ２のアップレギュレーションによりＴｈ１の分化を増強することを示している。それゆえ、ＩＬ−２７Ｔｇマウスは、Ｔｈ１細胞の分化を増強し、Ｔｈ２細胞の分化を弱めることは明らかである。
【００８５】
〔実施例５：ＩＬ−２７の経鼻投与によるアレルギー性気道炎症に対する防御〕
ＩＬ−２７がＴｈ２細胞のＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生を阻害する著しい能力を有する（図２Ａ）ため、ＩＬ−２７のＴｈ２型アレルギー性疾患に対する治療的可能性を調べた。このために、実験的アレルギー性喘息モデルを確立した。
【００８６】
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群につき５匹）に、硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍ）との複合体とした５０μｇＯＶＡを第１日目に腹腔内に免疫した。７、８及び９日目に、ＯＶＡで免疫されたマウスに、５０μｌＰＢＳ中の５０μｇＯＶＡを単独で又はＩＬ−２７（０．２、１、５μｇ）とともに経鼻投与した。対照群はＯＶＡで免疫し、ＰＢＣのみに暴露した。抗原に対する最終的な暴露から２４時間後にアレルギー性気管支喘息の表現型を評価した。
【００８７】
図５Ａに吸入されたβメタコリン濃度の上昇に対するＡＨＲを全身の容積脈波として測定した結果を示す。図５Ａ中、縦軸（「change of sRAW」）はβメタコリン濃度０の時の気道抵抗に対する気道抵抗の変化の割合を示す。図５Ｂに各群のマウスからのＢＡＬＦの炎症細胞の割合を示す。図５Ｂ中、横軸は、左から順に、「マクロファージ」、「リンパ球」、「好中球」、「好酸球」を示す。図５Ｂ中細胞のパーセンテージは光学顕微鏡評価により決定された。データは絶対的な細胞数で表される。また、組織学的分析のために、肺は右室を１０ｍｌＰＢＳに染み込ませることにより準備し、続いて１０％の緩衝化したホルマリン中で固定し、３μｍ切片を作成し、分解されやすくした過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ染色）により染色した。図５Ｃに組織学的分析の結果を示す。倍率は×１００である。
【００８８】
次に肺はホモジナイズ、遠心を行った。得られた上清は、ＥＬＩＺＡによりＩＬ−１３含有量について測定した。図５Ｄにその結果を示す。図５Ｄ中、「ip」は腹腔内、「in」は経鼻を示す。結果は３回独立して行った実験から得た値を用い、各群５匹の幾何平均＋s.e.m.で表す。Ｐ＜０．０５はＯＶＡに感作されたマウス又はＯＶＡを投与されたマウスの対応する値に対するものである。
【００８９】
図５Ａに示すように、１週間前にＯＶＡで免疫され、３日間ＯＶＡを経鼻投与したＢＡＬＢ／ｃマウスは、βメタコリン（Ｍｃｈ）への暴露に対してＡＨＲの亢進を発症した。また、図５Ｂに示すように、肺の好酸球及び好中球の数を上昇させ、図５Ｃに示すように気道における粘膜の過剰生産を伴う杯(さかずき)細胞異形成を示した。最初の７日間にわたる１日１回のＩＬ−２７の腹腔内注射（１μｇ／ｄａｙ）とその後のＯＶＡによる免疫は、Ｍｃｈに対するＡＨＲの亢進を適度に減少させた（データは示さず）。しかし、ＯＶＡ刺激時のＩＬ−２７の経鼻投与は、用量依存的にＡＨＲの亢進（図５Ａ）、気道の好酸球性炎症（図５Ｂ）及び杯(さかずき)細胞異形成（図５Ｃ）を減らした。Ｔｈ２関連サイトカインの中で、ＩＬ−１３がＡＨＲの亢進、気道の好酸球増加及び粘膜分泌過多の誘導に重要な役割を果たしていると考えられている。また、図５Ｄに示すように、ＩＬ−２７の経鼻投与量と、肺のＩＬ−１３レベルとの関係から、ＩＬ−２７の経鼻投与が、用量依存的に肺のＩＬ−１３レベルを低減することが確認された。これらの結果は、ＯＶＡで免疫された動物へのＩＬ−２７の経鼻投与は、ＯＶＡで刺激されたＴｈ２分極化細胞からのＩＬ−１３産生を阻害しアレルギー性喘息の治療のための、治療方法を提供する。
【００９０】
以上のように、本発明者らは、ＩＬ−２７組換え体のｉｎ ｖｉｖｏでＴｈ２細胞への分化誘導を阻害する能力を調べ、ＩＬ−２７が、抗ＩＦＮ−γ抗体の存在下においてさえＴｈ２細胞の分化を阻害することを明らかにした（図１）。さらに、ＩＬ−２７の添加は、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの存在下においてさえも、ＧＡＴＡ−３の発現を顕著に阻害し、Ｔｈ２細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現を誘導する（図１）。このように、ＩＬ−２７は、直接Ｔｈ２細胞の分化を阻害し、逆にＩＦＮ−γを産生するＴｈ１への分化を誘導する。これと一致して、ＩＬ−２７を用いたＬ．ｍａｊｏｒ感染第１週目のｉｎ ｖｉｖｏでの治療は、ＢＡＬＢ／ｃマウスを足蹠腫脹から強力に保護し、Ｔｈ２細胞の阻害により寄生虫の感染を減少させる（図３）。さらに、ＩＬ−２７Ｔｇマウスの高度に増加したＩＬ−２７は、ブェネズエラ糞線虫の感染に対してＴｈ２応答を行うことができない（図４）。このようにＩＬ−２７は単独では、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｈ２細胞の分化を直接阻害する。ＩＬ−２７がＴｈ２細胞の分化を阻害する分子的なメカニズムは、ＧＡＴＡ−３のダウンレギュレーション及びＴ−ｂｅｔのアップレギュレーションにより説明することができる。いくぶん異なりｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−２７による動物の治療はＣＤ４＋Ｔ細胞にＩＬ−１２Ｒβ２を誘導するかもしれない。このように、ＩＬ−２７で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、内在性ＩＬ−１２の刺激の下、Ｔｈ１細胞に分化することができる。それゆえ、ＩＬ−２７はＴｈ２細胞の分化及びＴｈ２サイトカインの産生をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで直接阻害する。さらに、ＩＬ−２７は、内在性のＩＬ−１２の存在下で、少なくともＩＬ−２７遺伝子導入マウスにおいては、ＩＬ−１２Ｒβ２の誘導によりＴｈ１細胞の分化を誘導することが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、ＩＬ−２７を用いることで、Ｔｈ２細胞の分化誘導を阻害するとともに、すでに誘導されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制することにより、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の発症を制御することができる有効な治療薬を提供するものである。
【００９２】
従来、進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患を抑制するサイトカイン治療薬は存在しなかったが、本発明にかかる治療薬は、すでに確立した進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患に対しても有効である。また、有効成分であるＩＬ−２７及びその誘導体は、副作用のない治療薬である。さらに、ＩＬ−２７は、Ｔｈ２応答を抑制し、Ｔｈ１応答を惹起することで、細胞内寄生性病原体に対して治療的効果を発揮するとともに、ＩＬ−２７を応用したワクチンはこれらの感染症の発病を予防することが期待される。
【００９３】
それゆえ、本発明にかかるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬及び感染症治療薬は、製薬産業およびその関連産業において利用することができ、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】実施例１の結果を示す図であり、図１Ａは、ＯＶＡ特異的ＴＣＲを発現するＤＯ１１．１０ＴｇマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡと共にＴｈ２条件下で、ＩＬ−１８とＩＬ−２７との組合せで共存させて１週間刺激後、再びＯＶＡで刺激したときに産生されるＩＬ−４及びＩＬ−１３の量を示すグラフであり、図１Ｂは、初回刺激及び細胞洗浄後に、抗ＧＡＴＡ−３抗体又は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った結果を示す図であり、図１Ｃは、ＤＯ１１．１０ＴｇマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ２条件下で添加するＩＬ−２７の濃度（０−１００ｎｇ／ｍｌ）を変化させて初回刺激の後再び培養したときに産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γの量を示すグラフであり、図１Ｄは、ＩＬ−２７のＴｈ２細胞の分極化への効果をＦＡＣＳ分析により調べた結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図であり、図２Ａは、ＤＯ１１．１０ＴｇマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２条件下で誘導し、樹立したＴｈ２細胞を再び抗原刺激する時に、種々の濃度のＩＬ−２７を添加して産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の量を示すグラフであり、図２Ｂは、樹立したＴｈ２細胞を再び抗原と種々の濃度のＩＬ−２７で刺激するときに発現したＧＡＴＡ−３及びＴ−ｂｅｔのウエスタンブロット分析を行った結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図であり、図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｌ．ｍａｊｏｒ感染と同時に（１）ＰＢＳ、（２）ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８、（３）ＩＬ−２７を投与した後の足蹠の腫れの経時変化を示す図であり、図３Ｂは、図３Ａのマウス群の感染後７週間目の膝窩リンパ節細胞を刺激培養したときに産生されたＩＬ−４及びＩＦＮ−γの量を示すグラフであり、図３Ｃは、図３Ａのマウス群の感染後７週間目の膝窩リンパ節細胞中の寄生虫量を示すグラフである。
【図４】実施例４の結果を示す図であり、図４Ａは、ブェネズエラ糞線虫Ｌ３を接種した、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＩＬ−２７Ｔｇマウス（ＩＬ−２７Ｔｇ）のｇ糞毎の虫卵数の経時的変化を示すグラフであり、図４Ｂは血清ｍＭＣＰ−１レベルを示すグラフであり、図４Ｃは血清ＩｇＥレベルを示すグラフであり、図４Ｄは、リンパ節細胞で産生されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルを示すグラフである。
【図５】実施例４の結果を示す図であり、図５ＡはＯＶＡで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＯＶＡを単独で又はＩＬ−２７とともに経鼻投与したときの、吸入されたβメタコリン濃度の上昇に対するＡＨＲを全身の容積脈波として測定した結果を示すグラフであり、図５Ｂは、各群のマウスからのＢＡＬＦの炎症細胞の割合を示すグラフであり、図５Ｃは肺の組織学的分析の結果を示す図であり、図５ＤはＩＬ−２７の経鼻投与量と、肺のＩＬ−１３レベルとの関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬及び感染症治療薬に関するものであり、特にＴｈ２細胞により産生されるサイトカインにより惹起されるアレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬、又は、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられる感染症治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化は獲得免疫反応の進行における重要なプロセスである。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ−γの産生により細胞性免疫を促進し、産生されたＩＦＮ−γは細胞内寄生性病原体に対する生体防御作用又は抗アレルギー作用を有する。これに対して、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３を産生し、これらは液性免疫作用を有するが、アレルギー性疾患を惹起し、また、マクロファージからの一酸化窒素産生を抑制する結果、細胞内寄生性病原体の増殖を促すことが知られている。
【０００３】
かかるＴｈ２サイトカインによって惹起されるＴｈ２型アレルギー性疾患としてよく知られているのは、ＩｇＥを介して起こるアレルギー性疾患であり、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎等が含まれる。Ｔｈ２細胞により産生されるＩＬ−４は、Ｂ細胞に働きＩｇＥを産生させる働きを持つ。ＩｇＥがアレルゲンを認識して肥満細胞を活性化すると肥満細胞より炎症を誘導する液性因子を放出することがアレルギー性の炎症反応につながると考えられており、ＩＬ−４はこの活性化された肥満細胞からも産生される。また、ＩＬ−５によって増殖・分化が制御されている好酸球は、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎等の炎症部位に強く浸潤し炎症反応を引き起こす。
【０００４】
現在、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の治療薬としては、ＩｇＥとＴｈ２サイトカインとによって活性化されたエフェクター細胞（肥満細胞など）から産生される様々な化学伝達物質を抑制することを目的としたアレルギー性疾患治療薬が主流となっている。
【０００５】
ところで、多くの要因がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞への分化に影響を与える中でサイトカインが分化の決定要因であることがわかってきている。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は抗原とＩＬ−１２とで刺激されることによりＴｈ１細胞に分化する。さらに、ＩＬ−１８はＩＬ−１２が誘導したＴｈ１細胞に作用しＩＦＮ−γ産生を増大させる。これに対して、Ｔｈ２はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗原とＩＬ−４とで刺激することにより誘導される。このように、ＩＬ−４及びＩＬ−１２はＴｈ１細胞又はＴｈ２細胞の分化を決定する重要な役割を果たす。
【０００６】
また、最近、ＩＬ−１２ファミリーの新規メンバーであるＩＬ−２３及びＩＬ−２７が特定されている。これらのサイトカインは、ヘテロ二量体であり、樹状細胞によって産生される。ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２ｐ３５関連タンパク質ｐ１９及びＩＬ−１２ｐ４０からなりメモリーＴ細胞の増殖を誘導する。ＩＬ−２７はＩＬ−１２ｐ４０関連タンパク質、ＥＢＶ誘導遺伝子３（ＥＢＩ３）及び新たに発見されたＩＬ−１２ｐ３５関連タンパク質ｐ２８からなり（例えば、非特許文献１参照）、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導するが、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は誘導しない。
【０００７】
また、ＩＬ−１２ＲはＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−１２Ｒβ２からなり、ＩＬ−２３ＲはＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−２３Ｒと名づけられた新規な成分からなる。ＩＬ−１２Ｒβ２に相同的なこれまでそのリガンドが不明であったサイトカインレセプターＷＳＸ−１／Ｔ細胞サイトカインレセプター（ＴＣＣＲ）とｇｐ１３０とは、ＩＬ−２７の機能的シグナル変換レセプターを構成する（例えば、非特許文献２参照）。
【０００８】
ＩＬ−２７は、Ｔｈ１細胞の分化の主要な転写調節因子であるＴ−ｂｅｔの発現を誘導することが報告されており（例えば、非特許文献３参照）、これによりその後に続くＩＬ−１２Ｒβ２の発現を誘導する。それゆえ、ＩＬ−２７は、ＩＬ−１２Ｒのアップレギュレーションを介したＩＦＮ−γの誘導においてＩＬ−１２と相乗的に作用すると考えられている（例えば、非特許文献１、４〜６参照）。
【０００９】
ＩＬ−２７Ｒの１つのサブユニットであるＷＳＸ−１（例えば、非特許文献７参照）／ＴＣＣＲ（例えば、非特許文献８参照）が欠損したマウスの研究より、ＩＬ−２７はＴｈ１細胞の分化に必要であること及びＷＳＸ−１／ＴＣＣＲが欠損した（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、ＩＦＮ−γ産生が損なわれるために皮膚リーシュマニア症の原因となるリーシュマニアmajor（L.major）（例えば、非特許文献７、９参照）又はListeria monocytogenes（例えば、非特許文献８参照）のような細胞内病原体の感染を受けやすいことが示されている。
【００１０】
また、ＩＬ−２７／ＩＬ−２７Ｒの相互作用は、Ｔｈ１により仲介される炎症応答を一定の状況において阻害することが報告されている。Villarino et al.は、Toxoplasma gondii に感染した（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、過度に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の分化によって、致命的なＴｈ１応答を示すことを報告している（例えば、非特許文献１０参照）。Trypanosoma cruziによる感染もまた、（ＷＳＸ−１-/-）マウスにおいて、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを含む炎症性サイトカインの生産過剰により重度の肝臓損傷を誘導する（例えば、非特許文献１１参照）。それゆえ、ＩＬ−２７は細胞内寄生性病原体の感染によって誘導されたＴｈ１免疫応答の促進又は阻害によって、宿主抵抗性をコーディネートすると報告されている（例えば、非特許文献１２、１３参照）２２、２３）。
【００１１】
また、最近の研究は、Ｔｈ２を介した免疫応答により排除される特性が解明された蠕虫であるTrichuris muris(T.muris)で感染された（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、増大するＴｈ２サイトカイン産生による急速な寄生虫の排除を示すことが報告されている（例えば、非特許文献１４参照）。さらに、（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、抗原による刺激（challenge）に応答して、気道過敏性（ＡＨＲ）の亢進、気道における杯細胞からのムチンの過剰産生と好酸球浸潤、及び、ＩｇＥ及びＴｈ２サイトカイン生産の増大による強い喘息の表現型を示すことが開示されている（例えば、非特許文献１５参照）。
【００１２】
また、最近ＩＬ−２７が、インターロイキン１７を産生するヘルパーＴ（Ｔｈ−１７）細胞の分化を阻害することにより炎症を抑制する能力を有することが示されている（例えば、非特許文献１６、１７参照）。
【非特許文献１】Pflanz, S., J.C.Timans, J.Cheung,R.Rosales,H.Kanzler, J.Gilbert, L.Hibbert, T.Churakova,M. Travis, E.Vaisberg,W.M.Blumenschein, J.D.Mattson, J.L.Wagner,W.To, S. Zurawski, T.K.McClanahan,D.M.Gorman, J.F.Bazan,R. deWaalMalefyt,D.Rennick, andR.A.Kastelein. 2002. IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naiveCD4(+) T cells. Immunity 16:779-790.
【非特許文献２】Pflanz, S., L.Hibbert, J.Mattson,R.Rosales, E.Vaisberg, J.F.Bazan, J.H. Phillips,T.K.McClanahan,R. deWaalMalefyt, andR.A.Kastelein. 2004.WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducing receptor for IL-27. J Immunol 172:2225-2231.
【非特許文献３】Szabo, S.J., S.T.Kim,G.L.Costa,X. Zhang,C.G. Fathman, and L.H.Glimcher. 2000.A novel transcription factor,T-bet, directs Th1 lineage commitment.Cell 100:655-669.
【非特許文献４】Hibbert, L., S. Pflanz,R.DeWaalMalefyt, andR.A.Kastelein. 2003. IL-27 and IFNalpha signal via Stat1 and Stat3 and induce T-Bet and IL-12Rbeta2 in naive T cells. J InterferonCytokineRes 23:513-522.
【非特許文献５】Kamiya, S., T.Owaki,N.Morishima, F. Fukai, J.Mizuguchi, and T.Yoshimoto. 2004.An indispensable role for STAT1 in IL-27-induced T-bet expression but not proliferation of naiveCD4+ T cells. J Immunol 173:3871-3877.
【非特許文献６】Takeda,A., S.Hamano,A.Yamanaka, T.Hanada, T. Ishibashi, T.W.Mak,A. Yoshimura, andH.Yoshida. 2003.Cutting edge: role of IL-27/WSX-1 signaling for induction ofT-bet through activation of STAT1 during initial Th1 commitment. J Immunol 170:4886-4890.
【非特許文献７】Yoshida,H., S.Hamano,G. Senaldi, T.Covey, R. Faggioni, S.Mu,M.Xia,A.C. Wakeham,H.Nishina, J. Potter,C.J. Saris, and T.W.Mak. 2001.WSX-1 is required for the initiation ofTh1 responses and resistance to L.major infection. Immunity 15:569-578.
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【非特許文献１０】Villarino,A., L.Hibbert, L. Lieberman, E.Wilson, T.Mak,H.Yoshida,R.A.Kastelein, C. Saris, andC.A.Hunter. 2003. The IL-27R(WSX-1) is required to suppressT cell hyperactivity during infection. Immunity 19:645-655.
【非特許文献１１】Hamano, S.,K.Himeno,Y.Miyazaki,K. Ishii,A.Yamanaka,A. Takeda,M. Zhang,H. Hisaeda, T.W.Mak,A.Yoshimura, andH.Yoshida. 2003.WSX-1 is required for resistance to Trypanosoma cruzi infection by regulation of proinflammatory cytokine production. Immunity 19:657-667.
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【非特許文献１４】Artis,D.,A.Villarino,M. Silverman,W.He, E.M.Thornton, S.Mu, S. Summer, T.M. Covey, E.Huang,H.Yoshida,G.Koretzky,M.Goldschmidt,G.D.Wu, F. de Sauvage, H.R.Miller,C.J. Saris, P. Scott, andC.A.Hunter. 2004. The IL-27 receptor (WSX-1) is an inhibitor of innate and adaptive elements of type 2 immunity. J Immunol 173:5626-5634.
【非特許文献１５】Miyazaki,Y.,H. Inoue,M.Matsumura,K.Matsumoto, T.Nakano,M.Tsuda, S. Hamano,A.Yoshimura, andH.Yoshida. 2005. Exacerbation of experimental allergic asthma by augmentedTh2 responses inWSX-1-deficientmice. J Immunol 175:2401- 2407.
【非特許文献１６】Batten,M., J. Li, S.Yi,N.M.Kljavin,D.M.Danilenko, S. Lucas, J. Lee, F.J. de Sauvage, andN.Ghilardi. 2006. Interleukin 27 limits autoimmune encephalomyelitis by suppressing the development of interleukin 17-producing T cells.Nat Immunol 7:929- 936.
【非特許文献１７】Stumhofer, J.S.,A. Laurence, E.H.Wilson, E.Huang,C.M.Tato, L.M. Johnson,A.V.Villarino,Q.Huang,A.Yoshimura,D. Sehy, C.J. Saris, J.O'Shea J, L.Hennighausen,M. Ernst, andC.A.Hunter. 2006. Interleukin 27 negatively regulates the development of interleukin 17-producingThelper cells during chronic inflammation of the central nervous system.Nat Immunol 7:937-945.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、Ｔｈ２サイトカインによって惹起されるＴｈ２型アレルギー性疾患の治療薬としては、現在、ＩｇＥ抗体とＴｈ２サイトカインとによって活性化されたエフェクター細胞（肥満細胞など）から産生される様々な化学伝達物質を抑制することを目的としたものが主流となっており、Ｔｈ２サイトカイン自体の産生を抑制するＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬の開発は遅々として進んでいない。Ｔｈ２サイトカイン産生抑制剤としての新規アトピー性疾患治療薬の確立が期待される。
【００１４】
Ｔｈ２サイトカイン自体の産生を抑制する方法としては、ＩＬ−２の大量投与又はＩＬ−１２とＩＬ−１８との組合せ投与による感染防御・抗アレルギー作用が挙げられる。これによりＴｈ２反応の誘導は阻害され、逆にＴｈ１反応が誘導される。さらに、ＩＬ−１２とＩＬ−１８との生体内投与は様々な細胞に作用してＩＦＮ−γの産生を誘導する。その結果産生されたＩＦＮ−γは細胞内寄生性病原体の感染防御作用や抗アレルギー作用を発揮する。
【００１５】
しかし、ＩＬ−１２とＩＬ−１８との組合せ投与は、過剰なＩＦＮ−γの産生を誘導するため、これによる過度の炎症反応を惹起することで、肝臓毒等の副作用が強く、実際の治療には不適切である。
【００１６】
また、Ｔｈ１細胞から産生されたＩＦＮ−γは、Ｔｈ２サイトカインに拮抗してこれを抑制し抗アレルギー作用を発揮する。しかし、分極化した（樹立された）Ｔｈ２細胞からのＴｈ２サイトカインの産生を抑制する作用がないため、進行中のアレルギー性炎症を抑制することはできない。なお、ここで「分極化した」Ｔｈ２細胞とは、既にＴｈ２細胞に分化し、Ｔｈ２サイトカインを産生する能力を備えた細胞を意味し、「樹立された」Ｔｈ２細胞と同義である。
【００１７】
したがって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導の抑制及び、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生の抑制を利用した感染症とアレルギー性疾患に対する有効で副作用のない治療薬が求められている。
【００１８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔｈ２細胞により産生されるサイトカインにより惹起されるアレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬、又は、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられる感染症治療薬であって、Ｔｈ２細胞への分化誘導の抑制、及び、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生の抑制を利用した感染症とアレルギー性疾患に対する有効で副作用のない治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、上記課題を解決するために、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７（ＩＬ−２７）を含有することを特徴としている。
【００２０】
上記の構成によれば、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するので、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【００２１】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬では、上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患は、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、又は、アレルギー性結膜炎であることが好ましい。
【００２２】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞が樹立された個体を対象とすることが好ましい。
【００２３】
ＩＬ−２７が樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するため、進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患を抑制することができるというさらなる効果を奏する。
【００２４】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、経鼻投与剤、経皮投与剤、又は、点眼投与剤であることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る感染症治療薬は、上記課題を解決するために、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有することを特徴としている。
【００２６】
上記の構成によれば、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するので、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、以上のように、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するという構成を備えているので、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するため、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【００２８】
また、本発明に係る感染症治療薬は、以上のように、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するという構成を備えているので、ＩＬ−２７がナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２細胞への分化誘導を抑制し、また、樹立されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するので、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を有効に、副作用なく、予防又は治療することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の実施の一形態について説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
〔Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬〕
本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するものであれば特に限定されるものではない。
【００３１】
なお、ＩＬ−２７Ｒの１つのサブユニットであるＷＳＸ−１／ＴＣＣＲが欠損した（ＷＳＸ−１-/-）マウスは、増大するＴｈ２サイトカイン産生による急速な寄生虫の排除を示すこと、及び、抗原による刺激に応答して、ＩｇＥ及びＴｈ２サイトカイン生産の増大による強い喘息の表現型を示すことが知られている。しかしながら、ＩＬ−２７Ｒは、ＷＳＸ−１／ＴＣＣＲとｇｐ１３０とからなるヘテロダイマーであり、片方のサブユニットが欠損するとＴｈ２サイトカインが増大するからといって、ＩＬ−２７がＴｈ２型アレルギーを抑制するといえるわけではない。
【００３２】
本明細書において、「Ｔｈ２型アレルギー性疾患」とは、アレルゲンによって誘導されたＴｈ２細胞から産生されるＴｈ２サイトカインによって惹起される疾患を意味する。その病態の本質はＴｈ２サイトカインによって誘導されたＩｇＥ抗体と、Ｔｈ２サイトカインによって活性化された好酸球、マスト細胞による炎症性変化である。
【００３３】
Ｔｈ２型アレルギー性疾患は、Ｔｈ２型応答によって発症するアレルギー性疾患であれば特に限定されるものではないが、例えば、Ｔｈ２型気管支喘息、Ｔｈ２型アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎等である。より具体的には例えば、Ｔｈ２細胞により産生されるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインにより発症し、気道過敏性（ＡＨＲ）の亢進、気道における杯細胞からのムチンの過剰産生及び好酸球浸潤を特徴とする気管支喘息、又は、眼瞼結膜への好酸球浸潤と肥満細胞の活性化とを伴ったアレルギー性結膜炎等を挙げることができる。
【００３４】
本発明者らは、後述する実施例において記載しているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で、例えば、卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的ナイーブＴ細胞を、ＯＶＡとＩＬ−４＋抗ＩＬ−１２抗体／抗ＩＦＮ−γ抗体で刺激して、Ｔｈ２細胞に分化を誘導する系に、ＩＬ−２７を添加すると、Ｔｈ２サイトカインの産生が抑制され、逆にＩＦＮ−γの産生が増強されることを実験的に確認した。さらに、樹立したＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞をＯＶＡで刺激することによって誘導されるＴｈ２サイトカイン産生に対しても、ＩＬ−２７を添加することによって、これを顕著に抑制できることをｉｎ ｖｉｔｒｏ系で実験的に確認した。このＩＬ−２７のＴｈ２細胞分化抑制と、Ｔｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生抑制との作用機序を解析した結果、ＩＬ−２７はＴｈ２細胞の誘導と維持に必須の核内転写因子ＧＡＴＡ−３の発現を抑制し、Ｔｈ１細胞の誘導と維持に必須の核内転写因子Ｔ−ｂｅｔの発現を増強することを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系で確認した。このように、ＩＬ−２７は、驚くべきことに、Ｔｈ２細胞分化の条件下でさえ、Ｔ−ｂｅｔの発現を誘導してＩＦＮ−γを産生する。
【００３５】
また、ｉｎ ｖｉｖｏ系で、細胞内寄生性病原体でＴｈ２免疫応答を誘導することにより致死性を示す感染症に対し、ＩＬ−２７の生体内投与は、Ｔｈ２細胞分化の誘導を阻止し、逆にＴｈ１細胞分化を惹起することで、致死性を示す感染症の発病を抑制し、感染症を治癒させることを明らかにした。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ系で、アレルゲンで感作されたマウスにアレルゲンを点鼻することで発症するアレルギー性の気管支喘息に対しても、アレルゲンと共にＩＬ−２７を点鼻すると、分極化したＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制する結果、喘息の発症を抑制することを確認した。
【００３６】
本発明で用いるＩＬ−２７は、実際に投与される対象に対して上記生理活性を発現しうるものであれば特に制限させるものではなく、天然に生産されたものであってもよいし、遺伝子工学的に生産されたものであってもよいし、化学的に合成されたものであってもよい。例えば、Yoshimoto, T.,K.Okada,N.Morishima, S.Kamiya, T.Owaki,M.Asakawa,Y.Iwakura, F. Fukai, and J.Mizuguchi. 2004 J Immunol 173:2479-2485.に記載の方法を用いて好適に製造することができる。
【００３７】
本発明にかかるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の治療、予防、改善のために好適に用いることができる。本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬をＴｈ２型アレルギー性疾患の治療、予防、改善のために用いる場合には、その投与形態は、非経口的に経鼻、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、局所または皮下に投与するものであっても、経口的に投与するものであってもよい。治療対象となるアレルギー性疾患が、気道過敏性（ＡＨＲ）の亢進、気道における杯細胞からのムチンの過剰産生及び好酸球浸潤を特徴とする気管支喘息等である場合には、特に経鼻投与がより好適である。かかるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、選択される投与方法に応じて、ＩＬ−２７またはその薬学的に許容しうる有機酸または無機酸との付加塩を、薬学的に許容しうる担体とともに含有しうる。
【００３８】
非経口的に投与する場合、上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、例えば、注射剤、直腸投与剤、皮膚外用剤、吸入剤、点眼剤等とすることができる。また、経口的に投与する場合、上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、リポソーム、ゼラチンカプセル等の固形製剤や、シロップ剤等の液状製剤とすることができる。
【００３９】
固形製剤は、上記担体として、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤等を用いて、通常用いられる方法で製造することができる。ここで、上記賦形剤、結合剤および崩壊剤としては、通常用いられるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、乳糖、白糖等の糖誘導体；デンプン；デキストリン；結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩等を挙げることができる。また、上記滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩、ワックス、タルク等を挙げることができる。また、安定剤、矯味矯臭剤としても、通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４０】
液状製剤は、上記担体として、例えば、水；グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等の有機溶媒；これらと水との混合物等を用いて通常用いられる方法で製造することができる。また、液状製剤は、さらに、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００４１】
また、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の治療、予防、改善に用いられる場合、本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬の投与量、投与回数は、投与方法、投与対象の年齢および体重、投与対象の状態等によって異なるが、有効成分であるＩＬ−２７の量が、例えば、投与対象の体重１ｋｇに対し、１日当り下限として、１０μｇであることが好ましく、３０μｇであることがより好ましい。また、１日当り上限として、６０μｇであることが好ましく、５０μｇであることがより好ましい。
【００４２】
また、本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、有効成分としてＩＬ−２７を含有するものであればよいが、さらにその他の成分を含む薬学的組成物であってもよい。或いは、本発明に用いるＩＬ−２７は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
【００４３】
また、本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞がすでに樹立された個体に対しても有効である。すなわち、従来は、進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患を抑制するサイトカイン治療薬はなかったが、本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、上述したように、すでに樹立されたＴｈ２細胞からのサイトカイン産生を抑制することができる。このことは、樹立したＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞をＯＶＡで刺激することによって誘導されるＴｈ２サイトカイン産生に対しても、ＩＬ−２７を添加することによって、これを顕著に抑制できることをｉｎ ｖｉｔｒｏ系及びｉｎ ｖｉｖｏ系で実験的に確認している。
【００４４】
ここで、Ｔｈ２細胞がすでに樹立された個体とは、抗原による初回刺激により、Ｔｈ２サイトカインを産生できるＴｈ２細胞を有している個体であればよい。係る個体では、２回目以降の刺激により、Ｔｈ２細胞からのサイトカイン産生が誘導されるが、この時点で、本発明のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬を投与することにより、サイトカインの産生を抑制し、Ｔｈ２型アレルギー性疾患を治療又は改善することができる。また、Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬の投与時期は、Ｔｈ２細胞からサイトカインが産生されていればよく、すでにＴｈ２サイトカインが産生されＴｈ２型アレルギー性疾患が進行していても有効である。
【００４５】
なお、本発明に係るＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞の分化をも抑制するので、Ｔｈ２細胞が樹立される前に投与されても有効であることはいうまでもない。
【００４６】
〔感染症治療薬〕
また、本発明にかかる感染症治療薬は、Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有するものであれば特に限定されるものではない。
【００４７】
ここで、細胞内寄生性病原体に対する生体防御作用は、Ｔｈ１免疫応答により産生されたＩＦＮ−γによって行われるが、Ｔｈ２細胞から産生されたサイトカインは、上述したようにマクロファージからの一酸化窒素産生を抑制する結果、細胞内寄生性病原体の増殖を促すことが知られている。
【００４８】
例えば、細胞内寄生性病原体リーシュマニアに対して、抵抗性を有さないマウスの種であるＢＡＬＢ／ｃマウスを例に挙げて説明すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスはリーシュマニアに対して抵抗性を持たないためリーシュマニアへの感染は致死性である。これは、リーシュマニアに抵抗性を有するマウスの種では、感染に伴いＴｈ１細胞分化が誘導されてＩＦＮ−γが産生されるのに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、Ｔｈ１細胞分化ではなく、Ｔｈ２細胞分化が誘導されるためである。
【００４９】
本発明にかかる感染症治療薬は、このようにＴｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いることができる。
【００５０】
上述した例では、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ系で、細胞内寄生性病原体でＴｈ２免疫応答を誘導することにより致死性を示す感染症に対し、ＩＬ−２７の生体内投与は、Ｔｈ２細胞分化の誘導を阻止し、逆にＴｈ１細胞分化を惹起することで、致死性を示す感染症の発病を抑制し、感染症を治癒させることを明らかにした。
【００５１】
上記細胞内寄生性病原体としては、ライ菌等の細菌；リーシュマニア等の原虫等を挙げることができる。
【００５２】
なお、本発明にかかる感染症治療薬の有効成分であるＩＬ−２７、投与形態、投与量については、上記〔Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬〕の場合と同様であるのでここでは説明を省略する。
【００５３】
また、本発明に係る感染症治療薬は、有効成分としてＩＬ−２７を含有するものであればよいが、さらにその他の成分を含む薬学的組成物であってもよい。或いは、本発明に用いるＩＬ−２７は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。
【実施例】
【００５４】
本発明について、実施例および図１〜５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
まず、本実施例において用いた、使用マウス、試薬等、各操作法について説明する。
【００５６】
＜使用マウス＞
Jackson Laboratoryから特定病原体未感染（ＳＰＦ：Specific pathogen-free）雌ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を購入した。Dr. D. Loh （Washington University, St. Louis, MO）から、ＯＶＡ３２３−３３９（ＯＶＡの３２３−３３９番目のアミノ酸からなるポリペプチド）を認識するαβＴＣＲのトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（ＤＯ１１．１０；遺伝的背景ＢＡＬＢ／ｃ）を入手した。ＩＬ−２７Ｔｇマウスは以下のようにして作製した。ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−９（Sigma Chemical Co.）中の、ＥＢＩ３が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーでｐ２８に柔軟に連結され、３ｘフラグタグされた一本鎖マウスＩＬ−２７のｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲにより増幅して、肝臓特異的ヒト血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）プロモーター及びウサギのβグロブリン遺伝子を含むｐＬＧ１−ＳＡＰベクターに挿入した。ＩＬ−２７Ｔｇマウスラインは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られた受精卵への上記ｃＤＮＡの前核のマイクロインジェクションによって作製した（Takayuki Yoshimoto, manuscript in preparation）。全てのマウスは兵庫医科大学（西宮、日本）の動物施設においてＳＰＦ条件下で飼育し、６〜１２週齢のものを使用した。
【００５７】
＜試薬等＞
組換えマウスＩＬ−１２及びＩＬ−１８は、それぞれ、Genetic Institute Inc.（Cambridge MA）及びMBL（名古屋、日本）から購入した。組換えマウスＩＬ−２７は、Yoshimoto, T.,K.Okada,N.Morishima, S.Kamiya, T.Owaki,M.Asakawa,Y.Iwakura, F. Fukai, and J.Mizuguchi. 2004 J Immunol 173:2479-2485.に記載の方法に従い、ＥＢＩ３が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーでｐ２８に柔軟に連結され、３ｘフラグタグされた一本鎖タンパク質として調製し精製した。Limulus amebocyte lysate method（和光純薬、東京、日本）を用いて決定したエンドトキシンレベルは１μｇのｒＩＬ−２７につき８ｐｇより低かった。組換えマウスＩＬ−４は、Yoshimoto, T.,K.Takeda, T.Tanaka,K.Ohkusu, S.Kashiwamura,H.Okamura, S.Akira, andK.Nakanishi. 1998. J Immunol 161:3400-3407.に記載の方法で作製された組換えバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ．ＩＬ−４）から得て精製した。精製された抗体〔抗マウスＣＤ２８抗体（３７．５１）、抗マウスＣＤ３抗体（２Ｃ１１）、抗マウスＩＬ−４抗体（１１Ｂ１１）、抗マウスＩＬ−１２ｐ４０抗体（Ｃ１７．８）及び抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｒ４−６Ａ２）〕を製造した。ＰＥ抗マウスＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体（ＭＥＬ−１４）、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１１Ｃ抗体、ＰＥ−ラット抗マウスＩＡ／Ｉ−Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２）、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍ−抗ＣＤ４抗体及びビオチンラット抗マウスＩｇＥ抗体（Ｒ３５１１８）はBD Bioscience（San Diego, CA）から購入した。ラット抗マウスＩｇＥ抗体（２３Ｇ３）はSouthern Biotechnology Associates Inc.（Birmingham, AL）から購入した。抗ＧＡＴＡ−３マウスモノクローナル抗体（ＨＧ３−３１）、抗Ｔ−ｂｅｔマウスモノクローナル抗体（３９Ｄ）及び抗アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｈ−１９６）はSanta Cruz Biotechnology Inc.（Santa Cruz, CA）から購入した。
【００５８】
＜Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞の製造＞
２４ウェルプレートのウェルに、１０％ＦＢＳ、５０μＭ ２−ＭＥ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加した全量で１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を充填し、７日間、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５／ｍｌ）を、２×１０４／ｍｌの抗原提示細胞（ＡＰＣ；Ohteki, T.,K. Suzue,C.Maki,T.Ota, and S.Koyasu. 2001. Nat Immunol2:1138-1143.に記載の方法で製造された照射・精製された脾樹状細胞）の存在下、ＩＬ−１２（１００ｐＭ）及びＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）で刺激した。Ｔｈ１細胞の誘導ために、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）及び抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）を培地にさらに添加した。Ｔｈ２細胞の誘導のためには、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体（２０μｇ／ｍｌ）＋抗ＩＦＮ−γ抗体（２０μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。合計量２０μｇ／ｍｌのＩＬ−１８及びＩＬ−２７の種々の組合せがＴｈ２細胞の初代培養に用いられた。
【００５９】
＜ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養＞
樹立したＴｈ２細胞を、再び、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び１×１０５／０．２ｍｌＡＰＣ（照射されたＴ細胞が枯渇したＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞）とともに、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルでＩＬ−２７の存在下（０−１００μｇ／ｍｌ）培養した。Ｌ．ｍａｊｏｒ感染マウス又はブェネズエラ糞線虫Ｌ３感染マウスからの、それぞれ、膝窩又は腸間膜のリンパ節細胞からのサイトカインの発生と測定のために、固相化された抗マウスＣＤ３抗体及び抗マウスＣＤ２８抗体（それぞれ５μｇ／ｍｌ）とともに、２×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで培養した。４８時間培養した後、上清を収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＦＮ−γ成分、ＩＬ−４成分、ＩＬ−５成分、及びＩＬ−１３成分について調べた。
【００６０】
＜フローサイトメトリー＞
ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ休止細胞の製造のために、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウスからの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞をMicroBeads（抗マウスＣＤ４抗体；クローンＲＭ４−５、Miltenyi Biotec、Bergisch-Gladbach、Germany）によって精製した。濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、染色バッファ中（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）で、最初に、１０μｇ／ｍｌの抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ抗体で３０ｍｉｎ、４℃で処理し、続いてＰＥ抗マウスＣＤ４抗体及びＦＩＴＣ抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体で、３０ｍｉｎ、４℃で処理した。染色したサンプルは、ＦＡＣＳ Aria（Becton Dickinson）で、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞に分離された。再分析の後、分離された細胞の純度は＞９８．５％であった。細胞内のサイトカインの染色のために、分極化したＴｈ２細胞（１×１０６／ｍｌ）を、５０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ＋０．５μＭイオノマイシンで、４ｈ、最後の２時間は、サイトカインの分泌を阻害するために、１μｇ／ｍｌのBrefeldinＡ（BD Biosciences）のパルスで再度刺激した。細胞はＣｙ−Ｃｈｒｏｍ−抗ＣＤ４抗体で染色し、続いてパラホルムアルデヒドの４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＢＳ溶液で固定し、細胞膜を氷のように冷たい１％ＦＣＳ＋０．１％サポニン含有ＰＢＳで透過性にした。得られた細胞はさらに、０．５μｇＰＥラット抗マウスＩＬ−４抗体＋０．５μｇＦＩＴＣラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体又はアイソタイプ対応コントロールＡｂｓ（BD Bioscience）で染色し、ＦＡＣＳＣCalibur（Becton Dickinson）によって、細胞質のＩＬ−４＋又はＩＦＮ−γ＋の比率について分析した。
【００６１】
＜Ｌ．ｍａｊｏｒの感染＞
Ｌ．ｍａｊｏｒ（ＷＨＯ株ＭＨＯＭ／ＳＵ／７３−５−ＡＳＫＨ）は、Ohkusu,K., T.Yoshimoto,K.Takeda, T.Ogura, S.Kashiwamura,Y. Iwakura, S.Akira,H.Okamura, andK.Nakanishi. 2000. Infect Immun 68:2449-2456.に記載の方法で、ｉｎ ｖｉｖｏで維持し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた。感染は、マウスの後ろ足の足蹠に、５×１０６の静止期のプロマスチゴートの皮下注射による接種によって行った。足蹠の病変を週１回ダイアルゲージキャリパーで測定し、感染していない足蹠の厚みと比較した。感染部位の所属リンパ節である膝窩リンパ節の寄生虫量はOhkusu,K., T.Yoshimoto,K.Takeda, T.Ogura, S.Kashiwamura,Y. Iwakura, S.Akira,H.Okamura, andK.Nakanishi. 2000. Infect Immun 68:2449-2456.に記載の方法により、決定した。
【００６２】
＜ブェネズエラ糞線虫の感染＞
ブェネズエラ糞線虫は、Sasaki,Y., T.Yoshimoto,H.Maruyama, T. Tegoshi,N.Ohta,N.Arizono, andK. Nakanishi. 2005. J ExpMed 202:607-616.に記載の方法により維持した。動物には、完全な感染を起こすために、５０００隻のブェネズエラ糞線虫Ｌ３を皮下接種した。マウス個体毎の感染の程度は、日１回、排泄される卵の数（ｇ糞毎の卵）を数えることによりモニターした。
【００６３】
＜ＯＶＡ−特異的な気管支喘息の発生と分析＞
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍ）との複合体とした５０μｇＯＶＡを第１日目に腹腔内に免疫し、第７、８及び９日目に５０μｌＰＢＳと混合したＯＶＡ５０μｇを経鼻投与した。対照群のマウスは、ＯＶＡで免疫されＰＢＳのみに暴露した。マウスは、以下に示すように、最後のＰＢＳ又はＯＶＡへの暴露の２４時間後に分析を行った。β−メタコリン（Ｍｃｈ）吸入に対するマウスにおけるＡＨＲの測定は、Ｐｕｌｍｏｓ−Ｉ（ＭＩＰＳ、大阪、日本）のハードウエア及びソフトウエアを用い、Sugimoto,T.,Y. Ishikawa,T.Yoshimoto,N.Hayashi, J. Fujimoto, andK.Nakanishi.2004. J ExpMed 199:535-545.、Ishikawa,Y., T.Yoshimoto, andK.Nakanishi. 2006. Int Immunol 18:847-855.に記載の方法で行った。気管支肺胞の洗浄（ＢＡＬ）は、１匹のマウス当たり、１．０ｍｌ ＰＢＳを用いて３回行い、回収した洗浄液中の合計細胞数を計測した。ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）を遠心後Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Baxter Healthcare Corp., Miami, FL）で染色し、形態学及び染色特性に基づいて区別した。組織学的分析のために、肺は右室を１０ｍｌＰＢＳに染み込ませることにより準備し、続いて１０％の緩衝化したホルマリン中で固定し、３μｍ切片を作成し、分解されやすくした過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ染色）により染色した。ＩＬ−１３産生の検出のために、肺は、Ishikawa,Y., T.Yoshimoto, andK.Nakanishi. 2006. Int Immunol 18:847-855.に記載されているように、最後のＰＢＳ又はＯＶＡへの暴露の２４時間後に取り出しホモジナイズ、遠心を行った。得られた上清は、ＥＬＩＺＡによりＩＬ−１３含有量について測定した。
【００６４】
＜ｉｎ ｖｉｖｏ処置＞
Ｌ．ｍａｊｏｒ実験のために、マウスに１日１回ＰＢＳバッファ、ＩＬ−２７（１μｇ／ｄａｙ）又はＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｄａｙ）及びＩＬ−１８（１μｇ／ｄａｙ）の組み合わせを７日間、腹腔内注射した。気道炎症の実験のために、７、８及び９日目に、ＯＶＡで免疫されたマウスに、５０μｌＰＢＳ中の５０μｇＯＶＡを単独で又はＩＬ−２７（０．２、１．５μｇ）とともに経鼻投与した。
【００６５】
＜ＥＬＩＺＡアッセイ＞
ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γのためのＥＬＩＺＡキット（R&D Systems Inc., Minneapolis, MN）を用いた。血清中のｍＭＣＰ−１レベルは、Moedum Scientific, Ltd.（Edinburgh, UK）から購入したｍＭＣＰ−１ＥＬＩＺＡキットを用いて測定した。血清中のＩｇＥレベルは、Yoshimoto, T.,H.Mizutani,H. Tsutsui,N.Noben-Trauth,K.Yamanaka,M. Tanaka, S.Izumi,H.Okamura,W.E. Paul, andK.Nakanishi. 2000.Nat Immunol 1:132-137.に記載のＥＬＩＺＡアッセイにより測定した。
【００６６】
ウエスタンブロッティング
ＧＡＴＡ−３及びＴ−ｂｅｔのタンパク質レベルは、ウエスタンブロットを用いて行った。ＧＡＴＡ−３発現を検出するために、細胞をＰＢＳで１度洗浄し、バッファＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ[ｐＨ７．８]、１０ｍＭ ＫＣＬ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ及び０．５％ＮＰ４０）中に再懸濁した。細胞核を沈殿させ（pelleted）、細胞質のタンパク質を注意深く取り出した。細胞核は、Adachi,O., T.Kawai,K. Takeda,M.Matsumoto,H. Tsutsui,M. Sakagami,K.Nakanishi, and S.Akira. 1998 Immunity 9:143-150.に記載のとおり、その後バッファＣ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ[ｐＨ７．８]、４２０ｍＭ ＫＣＬ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、及び、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）に再懸濁した。３０分、４℃で、ボルテックス及び攪拌後サンプルは遠心を行い、上清中のタンパク質は新しいバイアル瓶に移した。核抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロットは、ＧＡＴＡ−３に対するマウスモノクローナル抗体（ｈＧ１−３１、希釈１：２００）を用いて調べた。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼと複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（希釈１：２０００；Chemicon ）を、視覚化のために用いた。Ｔ−ｂｅｔ及びアクチンの発現を検出するために、全細胞の溶解物をOwaki, T.,M.Asakawa,N.Morishima,K.Hata, F. Fukai,M.Matsui, J.Mizuguchi, and T.Yoshimoto. 2005. J Immunol 175:2191-2200.に記載の方法により、ウエスタンブロット分析に供した。
【００６７】
＜統計値＞
実験群間の統計に基づく比較は、一組の学生のｔテストによった。全ての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（San Diego, CA, USA）により行った。Ｐ値＜０．０５は、顕著に相違すると考えた。
【００６８】
〔実施例１：ＩＬ−２７によるＴｈ２細胞分化の阻害〕
ＩＬ−２７がＴｈ２細胞の分極化を阻害するかを調べ、また、ＩＬ−２７がＩＬ−１８の作用を強める能力を調べた。まず、ＤＯ１１．１０マウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡペプチド、ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１２＋抗ＩＦＮ−γで１週間刺激することによってＴｈ２細胞の分極化を誘導した。
【００６９】
具体的には、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５／ｍｌ）を、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び、２×１０４／ｍｌの照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓樹状細胞とともに、以下に示すＴｈ２条件又はＴｈ１条件の下、共存させるＩＬ−１８とＩＬ−２７との組合せ（合計量：２０μｇ／ｍｌ）（図１Ａ、Ｂ）又はＩＬ−２７の濃度（０−１００ｎｇ／ｍｌ）（図１Ｃ、Ｄ）を変化させて、全量１ｍｌのウェル中で７日間培養を行った。なお、培養には２４ウェルのウェルプレートを用いた。
＜Ｔｈ２条件＞：ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体（各々２０μｇ／ｍｌ）＋抗ＩＦＮ−γ抗体（各々２０μｇ／ｍｌ）
＜Ｔｈ１条件＞：ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）
上記初回刺激の後、細胞を洗浄し、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び、照射されたＴ細胞−洗浄したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓樹状細胞を、サイトカインの分泌を誘導するために、４８時間、いろいろな濃度のＩＬ−２７（０−１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で再び培養した（図１Ａ、Ｃ）。または、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下４時間再培養し、細胞質内のＩＬ−４及びＩＦＮ−γについて、ＦＡＣＳ分析を行った（図１Ｄ）。上清は収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γの含有量を調べた（図１Ａ、Ｃ）。図１Ｄ中の数字は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＩＬ−４産生細胞の割合又はＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ−γ産生細胞の割合を示す。上記初回刺激の５日後に、細胞核又は全細胞の溶解物を調製し、それぞれ、抗ＧＡＴＡ−３抗体又は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った（図１Ｂ）。結果は独立して行った３回の実験結果の幾何平均＋s.e.mで示す。
【００７０】
図１、Ａ及びＣに示すように得られたＴｈ２細胞は、ＯＶＡにより刺激されて多量のＩＬ−４及びＩＬ−１３を生産するがＩＦＮ−γは生産しなかった。また、図１、Ａ及びＢより、Ｌ−２７の添加は、ＧＡＴＡ−３のダウンレギュレーションにより、Ｔｈ２細胞の分化を著しく阻害することが示された。これに対して、図１、Ａ及びＢに示すように、ＩＬ−１８がＩＬ−１２と共にＴｈ２細胞の分化を強く阻害するとはいえ、ＩＬ−１８のみではＴｈ２細胞の分化を阻害しないことが判る。また、ＩＬ−１２ファミリーの他のメンバーＩＬ−２３はＴｈ２細胞の分化を阻害するそのような効果を有しないことが確認された（データは示さず）。図１Ｂに示されるように、Ｔｈ２細胞を分化する条件下で培養されたＴ細胞は、追加的にＩＬ−２７で刺激されると、ＧＡＴＡ−３のダウンレギュレーションの他にも、同時にＴ−ｂｅｔを発現した。興味深いことには、図１、Ｂ及びＣに示すように、ＩＬ−２７は用量依存的にＴｈ２細胞の分化を阻害し、逆にＴｈ１細胞の分化を誘導した。また、ＩＬ−２７のＴｈ２細胞の分極化への効果をＦＡＣＳ分析により調べた結果、Ｔｈ２細胞を分化する条件下で培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞の５７％及び０．５６％が、それぞれ、細胞質内のＩＬ−４産生細胞及びＩＦＮ−γ産生細胞の割合あることを見出した。ＩＬ−２７の添加は、用量依存的に細胞質内のＩＬ−４産生細胞の割合を（１７．５％まで）減少させ、細胞質内のＩＦＮ−γ産生細胞の割合を（６．７３％まで）増加させた（図１、Ｄ）。
【００７１】
〔実施例２：ＩＬ−２７による樹立されたＴｈ２細胞からのサイトカイン産生抑制〕
次にＩＬ−２７の、Ｔｈ２分極化細胞の抗原提示細胞誘発時のＴｈ２サイトカイン産生能力に対する阻害効果を調べた。
【００７２】
具体的には、Ｔｈ２条件下での上記〔実施例１〕記載の初回刺激の後、細胞を洗浄し、１００ｐＭ ＩＬ−２、１μＭ ＯＶＡ３２３−３３９、及び、照射されたＴ細胞を除去したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓樹状細胞を、サイトカインの分泌（図２Ａ）、並びに、ＧＡＴＡ−３及びＴ−ｂｅｔの発現（図２Ｂ）を誘導するために、４８時間、いろいろな濃度のＩＬ−２７（０−１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で再び培養した。結果は独立して行った３回の実験結果の幾何平均＋s.e.mで示す。
【００７３】
図２Ａに示すように、ＩＬ−２７は、ＩＬ−４に対する効果は顕著でないのに対し用量依存的に、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生を阻害した。また、これと一致して、図２Ｂに示すように、ＩＬ−２７は用量依存的にＧＡＴＡ−３の発現を減少させ、逆にＴｈ２細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現を誘導した。このように、ＩＬ−２７は、Ｔｈ２細胞の分化の阻害、及び、ＧＡＴＡ−３発現のダウンレギュレーションとＴ−ｂｅｔ発現のアップレギュレーションとによるＴｈ２サイトカインの産生の阻害により、Ｔｈ２応答に直接の阻害効果を示すことが判る。
【００７４】
〔実施例３：ＩＬ−２７によるＢＡＬＢ／ｃマウスのレーシュマニア症からの防御〕
図３Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＬ．ｍａｊｏｒに高度に抵抗性を示すのに対し、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染したＢＡＬＢ／ｃマウスは、足蹠腫脹により判断される進行性の病気にかかる。マウスの近交系の感染に対する抵抗性及び感受性は、本質的にそれぞれＩＦＮ−γ及びＩＬ−４を産生する能力と関連している。実際に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＬ．ｍａｊｏｒ感染に応答して主にＴｈ１応答を促進するのに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスはＴｈ２応答を促進する。すでに知られているように、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染しているＣ５７ＢＬ／６マウスはＩＦＮ−γを強く産生しＩＬ−４を殆ど産生しないのに対し、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスからの膝窩リンパ節細胞は、ＩＬ−４を強く産生し、ＩＦＮ−γは殆ど産生しない（図３Ｂ）。本発明者らが以前報告したように、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｄａｙ）及びＩＬ−１８（１μｇ／ｄａｙ）の混合物の感染最初の１週間の投与は、Ｔｈ１細胞の誘導により（図３Ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、足蹠腫脹から保護し、寄生虫の量を減少させた（図３Ｃ）。これに対して、ＩＬ−１８単独の投与は、かかる保護効果を示さなかった（データは示さず）。
【００７５】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｈ２細胞の生成に対するＩＬ−２７の阻害効果を調べるために、本発明者らは、ＩＬ−２７をＬ．ｍａｊｏｒを感染させた直後のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。
【００７６】
具体的には、実験１日目に、マウスに、静止期のプロマスチゴートを皮下接種した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群５匹）は、１日１回、（１）ＰＢＳ、（２）ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｄａｙ）＋ＩＬ−１８（１μｇ／ｄａｙ）又は（３）ＩＬ−２７（１μｇ／ｄａｙ）をプロマスチゴートの皮下接種後の７日間、腹腔内に注射した。週１回足蹠の測定を行い、足蹠の腫れを測定した。図３Ａに、足蹠の腫れの平均値＋s.e.m.を示す。図３Ａ中、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１は、ＰＢＳで処理された感染マウスの対応する値に対するものである。
【００７７】
感染７週後に、各群（各群につき５匹）のマウスからの膝窩リンパ節を取り出した。細胞懸濁液を固相化された抗マウスＣＤ３抗体及び抗マウスＣＤ２８抗体（それぞれ５μｇ／ｍｌ）とともに、２×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで培養した。４８時間培養した後、上清を収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＦＮ−γ成分及びＩＬ−４成分について調べた。
【００７８】
また、感染７週後に、所属リンパ節細胞１×１０３個中の寄生虫の量を決定した。サンプル間の統計的な差は、学生のｔテストによった。結果は３回独立して行った実験結果から得た。
【００７９】
図３Ａに示すように、感染最初の一週間におけるＩＬ−２７の投与（１μｇ／ｄａｙ）は、部分的にではあるが顕著にマウスを足蹠腫脹から防御し、図３Ｃに示すように寄生虫の量をかなり減少させた。本発明者らは、同時に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８の刺激に対する膝窩リンパ節細胞のＩＬ−４及びＩＦＮ−γを産生する能力を測定した。図３Ｂに示すように、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染し、ＩＬ−２７を投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節細胞は、ＩＬ−４の産生が減少し、ＩＦＮ−γの産生が増加した。Ｌ．ｍａｊｏｒに感染したＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスは、大変異なる感染の過程を示すとしても、両者とも感染初期の間は類似する量のＩＬ−１２を産生することが報告されていた。このように、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスへのＩＬ−２７の投与は、Ｔｈ２応答の阻害及びＴｈ１応答の促進により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを進行性のレーシュマニア症から防御する。ＩＬ−２７により刺激されたＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＩＬ−１２Ｒβ２を発現するようになり、内在性のＩＬ−１２による刺激のもとでＴｈ１細胞に分化するのではないかと考えられる。
【００８０】
〔実施例４：ＩＬ−２７遺伝子導入マウスにおけるブェネズエラ糞線虫誘導Ｔｈ２応答の阻害〕
腸管寄生線虫ブェネズエラ糞線虫の第３期の幼虫（Ｌ３）に感染したマウスは、血清中のＩｇＥレベル及び第１次のＴｈ２応答により小腸粘膜マスト細胞（ＭＭＣｓ）数が上昇する。感染したマウスは、２週間以内に寄生虫の排除を完了する。寄生虫の排除は小腸粘膜マスト細胞のレベルと密接に関連している。それゆえ、内在性のＩＬ−２７が、Ｔｈ２応答のダウンレギュレーション及びＴｈ１応答のアップレギュレーションにより寄生虫の感染を維持するかどうかを実験により調べた。
【００８１】
ＩＬ−２７を肝臓で過剰発現するＴｇマウスは、血清中のＩＬ−２７レベルを顕著に上昇させた（６〜８週齢で、０．８２１±０．６２７ｎｇ／ｍｌ；ｎ＝８）。野生のＣ５７ＢＬ／６マウス及び遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ／６のＩＬ−２７Ｔｇマウスに５０００隻のブェネズエラ糞線虫Ｌ３を接種し、毎日糞中の卵数（卵／ｇ糞）を数えた。
【００８２】
各群（各群につき５匹）のマウスからの腸間膜リンパ節を感染１１日後に取り出した。細胞懸濁液を固相化された抗マウスＣＤ３抗体及び抗マウスＣＤ２８抗体（それぞれ５μｇ／ｍｌ）とともに、２×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで培養した。４８時間培養した後、上清を収集し、ＥＬＩＺＡにより、ＩＦＮ−γ成分及びＩＬ−４成分について調べた。結果は、３回独立して行った実験から得た結果の各群５匹の幾何平均＋s.e.m.である。
【００８３】
図４Ａに、ブェネズエラ糞線虫Ｌ３を接種した、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＩＬ−２７Ｔｇマウス（ＩＬ−２７Ｔｇ）（各群５匹）のｇ糞毎の卵数の経時的変化を、図４Ｂに血清ｍＭＣＰ−１レベルを、図４Ｃに血清ＩｇＥレベルを示す。図４Ｄに、リンパ節細胞で産生されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルを示す。なお、図４中ｎｄは検出限界以下を示す。
【００８４】
図４Ａに示すように、ブェネズエラ糞線虫を接種された野生型のマウスは、１１日目までに寄生虫の排除を完了した。これに対し、ＩＬ−２７Ｔｇマウスは、寄生虫卵の産生の顕著な延長を示し、ＩＬ−２７がＴｈ２応答を阻害することを示している。実際に、野生型のマウスでは、血清中のマウスマスト細胞プロテアーゼ１（ｍＭＣＰ−１）のレベルが上昇し、このことは、小腸ＭＭＣｓの活性化及びＩｇＥレベルと非常によい相関関係にある。これに対して、ＩＬ−２７Ｔｇマウスは、図４、Ｂ及びＣに示すように、かかる応答を示すことができなかった。ブェネズエラ糞線虫を接種した野生型マウスからのリンパ節細胞は、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８に応答して、大量のＩＬ−４及び少量のＩＦＮ−γを産生した（図４Ｄ）。これに対して、ブェネズエラ糞線虫を接種したＩＬ−２７Ｔｇマウスからのリンパ節細胞は、ＩＬ−４を産生することができず（図４Ｄ）、さらに、腸管寄生線虫を駆除する能力が乏しいことを実証した。興味深いことに、感染していないＩＬ−２７Ｔｇマウスからのリンパ節細胞は、未処理の野生型マウスからのリンパ節細胞より多量のＩＦＮ−γを産生した（図４Ｄ）。このことは、ＩＬ−２７の過剰の生産はＩＬ−１２Ｒβ２のアップレギュレーションによりＴｈ１の分化を増強することを示している。それゆえ、ＩＬ−２７Ｔｇマウスは、Ｔｈ１細胞の分化を増強し、Ｔｈ２細胞の分化を弱めることは明らかである。
【００８５】
〔実施例５：ＩＬ−２７の経鼻投与によるアレルギー性気道炎症に対する防御〕
ＩＬ−２７がＴｈ２細胞のＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生を阻害する著しい能力を有する（図２Ａ）ため、ＩＬ−２７のＴｈ２型アレルギー性疾患に対する治療的可能性を調べた。このために、実験的アレルギー性喘息モデルを確立した。
【００８６】
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群につき５匹）に、硫酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍ）との複合体とした５０μｇＯＶＡを第１日目に腹腔内に免疫した。７、８及び９日目に、ＯＶＡで免疫されたマウスに、５０μｌＰＢＳ中の５０μｇＯＶＡを単独で又はＩＬ−２７（０．２、１、５μｇ）とともに経鼻投与した。対照群はＯＶＡで免疫し、ＰＢＣのみに暴露した。抗原に対する最終的な暴露から２４時間後にアレルギー性気管支喘息の表現型を評価した。
【００８７】
図５Ａに吸入されたβメタコリン濃度の上昇に対するＡＨＲを全身の容積脈波として測定した結果を示す。図５Ａ中、縦軸（「change of sRAW」）はβメタコリン濃度０の時の気道抵抗に対する気道抵抗の変化の割合を示す。図５Ｂに各群のマウスからのＢＡＬＦの炎症細胞の割合を示す。図５Ｂ中、横軸は、左から順に、「マクロファージ」、「リンパ球」、「好中球」、「好酸球」を示す。図５Ｂ中細胞のパーセンテージは光学顕微鏡評価により決定された。データは絶対的な細胞数で表される。また、組織学的分析のために、肺は右室を１０ｍｌＰＢＳに染み込ませることにより準備し、続いて１０％の緩衝化したホルマリン中で固定し、３μｍ切片を作成し、分解されやすくした過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ染色）により染色した。図５Ｃに組織学的分析の結果を示す。倍率は×１００である。
【００８８】
次に肺はホモジナイズ、遠心を行った。得られた上清は、ＥＬＩＺＡによりＩＬ−１３含有量について測定した。図５Ｄにその結果を示す。図５Ｄ中、「ip」は腹腔内、「in」は経鼻を示す。結果は３回独立して行った実験から得た値を用い、各群５匹の幾何平均＋s.e.m.で表す。Ｐ＜０．０５はＯＶＡに感作されたマウス又はＯＶＡを投与されたマウスの対応する値に対するものである。
【００８９】
図５Ａに示すように、１週間前にＯＶＡで免疫され、３日間ＯＶＡを経鼻投与したＢＡＬＢ／ｃマウスは、βメタコリン（Ｍｃｈ）への暴露に対してＡＨＲの亢進を発症した。また、図５Ｂに示すように、肺の好酸球及び好中球の数を上昇させ、図５Ｃに示すように気道における粘膜の過剰生産を伴う杯(さかずき)細胞異形成を示した。最初の７日間にわたる１日１回のＩＬ−２７の腹腔内注射（１μｇ／ｄａｙ）とその後のＯＶＡによる免疫は、Ｍｃｈに対するＡＨＲの亢進を適度に減少させた（データは示さず）。しかし、ＯＶＡ刺激時のＩＬ−２７の経鼻投与は、用量依存的にＡＨＲの亢進（図５Ａ）、気道の好酸球性炎症（図５Ｂ）及び杯(さかずき)細胞異形成（図５Ｃ）を減らした。Ｔｈ２関連サイトカインの中で、ＩＬ−１３がＡＨＲの亢進、気道の好酸球増加及び粘膜分泌過多の誘導に重要な役割を果たしていると考えられている。また、図５Ｄに示すように、ＩＬ−２７の経鼻投与量と、肺のＩＬ−１３レベルとの関係から、ＩＬ−２７の経鼻投与が、用量依存的に肺のＩＬ−１３レベルを低減することが確認された。これらの結果は、ＯＶＡで免疫された動物へのＩＬ−２７の経鼻投与は、ＯＶＡで刺激されたＴｈ２分極化細胞からのＩＬ−１３産生を阻害しアレルギー性喘息の治療のための、治療方法を提供する。
【００９０】
以上のように、本発明者らは、ＩＬ−２７組換え体のｉｎ ｖｉｖｏでＴｈ２細胞への分化誘導を阻害する能力を調べ、ＩＬ−２７が、抗ＩＦＮ−γ抗体の存在下においてさえＴｈ２細胞の分化を阻害することを明らかにした（図１）。さらに、ＩＬ−２７の添加は、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの存在下においてさえも、ＧＡＴＡ−３の発現を顕著に阻害し、Ｔｈ２細胞におけるＴ−ｂｅｔの発現を誘導する（図１）。このように、ＩＬ−２７は、直接Ｔｈ２細胞の分化を阻害し、逆にＩＦＮ−γを産生するＴｈ１への分化を誘導する。これと一致して、ＩＬ−２７を用いたＬ．ｍａｊｏｒ感染第１週目のｉｎ ｖｉｖｏでの治療は、ＢＡＬＢ／ｃマウスを足蹠腫脹から強力に保護し、Ｔｈ２細胞の阻害により寄生虫の感染を減少させる（図３）。さらに、ＩＬ−２７Ｔｇマウスの高度に増加したＩＬ−２７は、ブェネズエラ糞線虫の感染に対してＴｈ２応答を行うことができない（図４）。このようにＩＬ−２７は単独では、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｈ２細胞の分化を直接阻害する。ＩＬ−２７がＴｈ２細胞の分化を阻害する分子的なメカニズムは、ＧＡＴＡ−３のダウンレギュレーション及びＴ−ｂｅｔのアップレギュレーションにより説明することができる。いくぶん異なりｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−２７による動物の治療はＣＤ４＋Ｔ細胞にＩＬ−１２Ｒβ２を誘導するかもしれない。このように、ＩＬ−２７で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、内在性ＩＬ−１２の刺激の下、Ｔｈ１細胞に分化することができる。それゆえ、ＩＬ−２７はＴｈ２細胞の分化及びＴｈ２サイトカインの産生をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで直接阻害する。さらに、ＩＬ−２７は、内在性のＩＬ−１２の存在下で、少なくともＩＬ−２７遺伝子導入マウスにおいては、ＩＬ−１２Ｒβ２の誘導によりＴｈ１細胞の分化を誘導することが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、ＩＬ−２７を用いることで、Ｔｈ２細胞の分化誘導を阻害するとともに、すでに誘導されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制することにより、Ｔｈ２型アレルギー性疾患の発症を制御することができる有効な治療薬を提供するものである。
【００９２】
従来、進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患を抑制するサイトカイン治療薬は存在しなかったが、本発明にかかる治療薬は、すでに確立した進行中のＴｈ２型アレルギー性疾患に対しても有効である。また、有効成分であるＩＬ−２７及びその誘導体は、副作用のない治療薬である。さらに、ＩＬ−２７は、Ｔｈ２応答を抑制し、Ｔｈ１応答を惹起することで、細胞内寄生性病原体に対して治療的効果を発揮するとともに、ＩＬ−２７を応用したワクチンはこれらの感染症の発病を予防することが期待される。
【００９３】
それゆえ、本発明にかかるＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬及び感染症治療薬は、製薬産業およびその関連産業において利用することができ、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】実施例１の結果を示す図であり、図１Ａは、ＯＶＡ特異的ＴＣＲを発現するＤＯ１１．１０ＴｇマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡと共にＴｈ２条件下で、ＩＬ−１８とＩＬ−２７との組合せで共存させて１週間刺激後、再びＯＶＡで刺激したときに産生されるＩＬ−４及びＩＬ−１３の量を示すグラフであり、図１Ｂは、初回刺激及び細胞洗浄後に、抗ＧＡＴＡ−３抗体又は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った結果を示す図であり、図１Ｃは、ＤＯ１１．１０ＴｇマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ２条件下で添加するＩＬ−２７の濃度（０−１００ｎｇ／ｍｌ）を変化させて初回刺激の後再び培養したときに産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γの量を示すグラフであり、図１Ｄは、ＩＬ−２７のＴｈ２細胞の分極化への効果をＦＡＣＳ分析により調べた結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図であり、図２Ａは、ＤＯ１１．１０ＴｇマウスのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２条件下で誘導し、樹立したＴｈ２細胞を再び抗原刺激する時に、種々の濃度のＩＬ−２７を添加して産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の量を示すグラフであり、図２Ｂは、樹立したＴｈ２細胞を再び抗原と種々の濃度のＩＬ−２７で刺激するときに発現したＧＡＴＡ−３及びＴ−ｂｅｔのウエスタンブロット分析を行った結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図であり、図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｌ．ｍａｊｏｒ感染と同時に（１）ＰＢＳ、（２）ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８、（３）ＩＬ−２７を投与した後の足蹠の腫れの経時変化を示す図であり、図３Ｂは、図３Ａのマウス群の感染後７週間目の膝窩リンパ節細胞を刺激培養したときに産生されたＩＬ−４及びＩＦＮ−γの量を示すグラフであり、図３Ｃは、図３Ａのマウス群の感染後７週間目の膝窩リンパ節細胞中の寄生虫量を示すグラフである。
【図４】実施例４の結果を示す図であり、図４Ａは、ブェネズエラ糞線虫Ｌ３を接種した、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びＩＬ−２７Ｔｇマウス（ＩＬ−２７Ｔｇ）のｇ糞毎の虫卵数の経時的変化を示すグラフであり、図４Ｂは血清ｍＭＣＰ−１レベルを示すグラフであり、図４Ｃは血清ＩｇＥレベルを示すグラフであり、図４Ｄは、リンパ節細胞で産生されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルを示すグラフである。
【図５】実施例４の結果を示す図であり、図５ＡはＯＶＡで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＯＶＡを単独で又はＩＬ−２７とともに経鼻投与したときの、吸入されたβメタコリン濃度の上昇に対するＡＨＲを全身の容積脈波として測定した結果を示すグラフであり、図５Ｂは、各群のマウスからのＢＡＬＦの炎症細胞の割合を示すグラフであり、図５Ｃは肺の組織学的分析の結果を示す図であり、図５ＤはＩＬ−２７の経鼻投与量と、肺のＩＬ−１３レベルとの関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有することを特徴とするＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項２】
上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患は、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、又は、アレルギー性結膜炎であることを特徴とする請求項１に記載のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項３】
上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞が樹立された個体を対象とすることを特徴とする請求項１又は２に記載のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項４】
経鼻投与剤、経皮投与剤、又は、点眼投与剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項５】
Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有することを特徴とする感染症治療薬。
【請求項１】
Ｔｈ２型アレルギー性疾患を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有することを特徴とするＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項２】
上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患は、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、又は、アレルギー性結膜炎であることを特徴とする請求項１に記載のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項３】
上記Ｔｈ２型アレルギー性疾患治療薬は、Ｔｈ２細胞が樹立された個体を対象とすることを特徴とする請求項１又は２に記載のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項４】
経鼻投与剤、経皮投与剤、又は、点眼投与剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬。
【請求項５】
Ｔｈ２サイトカインにより増殖が促進される細胞内寄生性病原体による感染症を予防又は治療するために用いられ、有効成分としてインターロイキン−２７を含有することを特徴とする感染症治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１２０７２４（Ｐ２００８−１２０７２４Ａ）
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０５８５２（Ｐ２００６−３０５８５２）
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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