ＶＥＧＦトラップおよびその治療的使用
【課題】血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦファミリーメンバーおよびスプライス改変体に特に望ましい特性で結合し得る融合ポリペプチド、ならびに治療的使用方法を提供すること。
【解決手段】血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し得る核酸分子および多量体タンパク質。ＶＥＧＦトラップが開示され、これは、ＶＥＧＦ関連の状態および疾患を処置するために治療的に有用であり、特定の器官、組織、および／または細胞への局所投与のために特異的に設計される。本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦファミリーメンバーおよびスプライス改変体に特に望ましい特性で結合し得る融合ポリペプチド、ならびに治療的使用方法を包含する。
【解決手段】血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し得る核酸分子および多量体タンパク質。ＶＥＧＦトラップが開示され、これは、ＶＥＧＦ関連の状態および疾患を処置するために治療的に有用であり、特定の器官、組織、および／または細胞への局所投与のために特異的に設計される。本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦファミリーメンバーおよびスプライス改変体に特に望ましい特性で結合し得る融合ポリペプチド、ならびに治療的使用方法を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦファミリーメンバーおよびスプライス改変体に特に望ましい特性で結合し得る融合ポリペプチド、ならびに治療的使用方法を包含する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
第一の局面において、本発明は、レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙを含む融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を特徴とし、ここで、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２（Ｆｌｔ１Ｄ２）であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＶＥＧＦレセプター成分Ｉｇドメイン３（Ｆｌｋ１Ｄ３）であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＶＥＧＦレセプター成分Ｉｇドメイン３（Ｆｌｔ１Ｄ３またはＲ３）であり、そしてここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上である。
【０００３】
関連する第二の局面において、本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙを含む単量体のＶＥＧＦトラップ（ＶＥＧＦ ｔｒａｐ）または融合ポリペプチドを特徴とし、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は、上記の通りである。ＶＥＧＦレセプター成分Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに直接結合されても１以上のスペーサー配列を介して結合されてもよい。１つの特定の実施形態において、上記単量体のＶＥＧＦトラップは、（Ｒ１Ｒ２）Ｘであり、Ｘは２である。より特定の実施形態において、上記単量体のＶＥＧＦトラップは、配列番号２４、またはその機能的に等価なアミノ酸改変体である。本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、それらの機能的に等価なアミノ酸改変体とから本質的になる単量体のＶＥＧＦトラップを包含する。
【０００４】
第三の局面において、本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、融合パートナー（ＦＰ）成分とを含む融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を特徴とし、その融合パートナー（ＦＰ）成分は、多量体化成分（ＭＣ）、血清タンパク質、または血清タンパク質に結合し得る分子からなる群より選択される。好ましい実施形態において、ＦＰは、別の融合ポリペプチド上の多量体化成分と相互作用して多量体構造（例えば、二量体または三量体）を形成し得る多量体化成分（ＭＣ）である。最も好ましくは、このＭＣは、（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含む多量体化成分、（ｉｉ）切断多量体化成分、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメインからなる群より選択される。本質的に（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＦＰとからなる融合ポリペプチドが、さらに包含される。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドは、本質的に（Ｒ１Ｒ２）ＸおよびＭＣからなる。
【０００５】
第四の局面において、本発明は、上記のように、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＦＰとを含む融合ポリペプチドを特徴とする。そのレセプター成分は、様々な順序（例えば、（Ｒ１Ｒ２）Ｘ−ＦＰ；（Ｒ１Ｒ２）Ｘ−ＦＰ−（Ｒ１Ｒ２）Ｘ；ＦＰ−（Ｒ２Ｒ１）Ｘなど）で並べられ得る。その融合ポリペプチドの成分は、互いに直接結合されても、スペーサー配列を介して結合されてもよい。
【０００６】
第五の局面において、本発明は、２つ以上の融合ポリペプチドの多量体を含むＶＥＧＦトラップを特徴とし、その融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＦＰとからなり、ここでＦＰ成分は、Ｃ領域を含む多量体化成分（ＭＣ）である。このＣ領域は、天然存在していても人工でもよく、その多量体化成分内の任意の点に生じ得、そして親のＭＣの切断ＭＣへの切断を可能にするように機能する。少なくとも１つの切断ＭＣを有する、２つ以上の融合ポリペプチドからなるＶＥＧＦトラップは、「切断ミニトラップ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｍｉｎｉ−ｔｒａｐ）」と称される。
【０００７】
Ｃ領域は、ＭＣにおいて、挿入、欠失または変異によって生成され得、その結果、酵素的または化学的に切断可能な部位が生成される。Ｃ領域は、任意のＭＣで、そしてそのＭＣ内の任意の位置で生成され得る；好ましくは、Ｃ領域は、全長Ｆｃドメイン、またはそのフラグメント、またはＣＨ３ドメインで生成される。Ｃ領域は、酵素（例えば、トロンビン、フィシン、ペプシン、マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）、またはプロリダーゼ）によって切断可能であるか、あるいは例えば、ギ酸またはＣｕＣｌ２によって化学的に切断可能な部位であり得る。
【０００８】
第六の関連する局面において、本発明は、切断ＶＥＧＦミニトラップを特徴とし、これは、（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分とからなる２つ以上の融合ポリペプチドを含む多量体タンパク質であり、その多量体化成分は、Ｃ領域を含む親のＭＣからの切断によって切断されたもの（ｔＭＣ）である。
【０００９】
第七の局面において、本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＭＣとからなる融合ポリペプチドを特徴とし、ここで、ＭＣは、少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列であり、ここで、その少なくとも１つのシステイン残基は、別の融合ポリペプチドのＭＣ（ｃＭＣ）に存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成し得る。好ましい実施形態において、ｃＭＣは、少なくとも１つのシステイン残基を含む、長さが１〜５０アミノ酸の間のアミノ酸配列である。より好ましい実施形態において、ｃＭＣは、少なくとも１つのアミノ酸を含む、長さが１〜１５アミノ酸のアミノ酸配列である。さらにより好ましい実施形態において、ｃＭＣは、１〜２個のシステイン残基を含む、長さが１〜１０アミノ酸のアミノ酸配列である。本発明のこの実施形態の一例は、配列番号２７に示され、この配列は、シグナル配列（１〜２６）次にＲ１（２７〜１２９）成分およびＲ２（１３０〜２３１）成分、次にシステイン残基で終わる９つのアミノ酸配列、を有する。別の実施形態において、配列番号２８に示され、シグナル配列（１〜２６）がＲ１（２７〜１２９）成分およびＲ２（１３０〜２３１）成分に続き、次にシステイン残基で終わる６つのアミノ酸配列である。
【００１０】
第八の局面において、本発明は、ＶＥＧＦミニトラップを特徴とし、これは、（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ｃＭＣとからなる２つ以上の融合ポリペプチドを含む。より特定の実施形態において、このミニトラップは二量体である。本発明のミニトラップの実施形態の一例は、配列番号２に示される融合ポリペプチドの二量体であり、ここで、各融合ポリペプチド（Ｒ１Ｒ２−ｃＭＣ）は、２３．０ｋＤａの分子量および９．２２のｐＩを有する。
【００１１】
別の実施形態において、ｃＭＣは、２つのシステイン残基（例えば、ＸＣＸＣ（配列番号３））からなる、長さが４アミノ酸である。本発明のこの実施形態の一例において、ミニトラップは、本発明のＶＥＧＦレセプター成分と、ＡＣＧＣ（配列番号４）からなるｃＭＣとからなる。本発明のミニトラップのこの実施形態の一例は、配列番号５に示される融合ポリペプチドの二量体であり、ここで、各単量体は、２３．２ｋＤａの分子量および９．２２のｐＩを有する。本発明のこの実施形態の別の例は、配列番号２６に示され、この配列は、シグナル配列（１〜２６）次にＲ１（２７〜１２９）成分およびＲ２（１３０〜２３１）成分、次にＣＰＰＣで終わる９つのアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明のＶＥＧＦトラップのすべての実施形態（切断ＶＥＧＦミニトラップ、ＶＥＧＦミニトラップ、および単量体のＶＥＧＦミニトラップを含む）において、シグナル配列（Ｓ）は、本発明の融合ポリペプチドのはじめ（またはＮ末端）で含まれ得る。シグナル配列は、細胞、組換え体または合成体由来であり得る。シグナル配列が、第一のレセプター成分のＮ末端に結合される場合、それに従って、融合ポリペプチドは、例えば、Ｓ−（Ｒ１Ｒ２）Ｘと表され得る。
【００１３】
融合ポリペプチドの成分は、互いに直接結合しても、スペーサーを介して結合されてもよい。特定の実施形態において、融合ポリペプチドの１以上のレセプターおよび／または融合パートナー成分は、スペーサーを伴わずに互いに直接結合される。他の実施形態において、１以上のレセプターおよび／または融合パートナー成分は、スペーサーで結合される。
【００１４】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを包含し、発現コントロール配列に作動可能に結合された発現ベクターを含む。本発明はさらに、融合ポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系を包含し、その融合ポリペプチドは、適切な宿主細胞中に発現ベクターを含み；宿主−ベクター系、ここで、適切な宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞；Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞、またはＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞である。アセチル化またはペグ化によって改変された本発明のＶＥＧＦトラップがさらに包含される。タンパク質をアセチル化またはペグ化する方法は、当該分野で周知である。
【００１５】
関連する第九の局面において、本発明は、本発明のＶＥＧＦトラップを生成する方法を特徴とし、その方法は、本発明の核酸配列を含むベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、その宿主細胞からタンパク質が発現するのに適切な条件下で培養する工程、およびそのように生成された融合ポリペプチドを回収する工程、を包含する。
【００１６】
本発明のＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦの除去、阻害、または減少によって改善、軽減または抑制される任意の疾患または状態を処置するのに治療的に有用である。ＶＥＧＦの阻害または減少によって改善される特定の状態の非完全なリストとしては、例えば、以下が挙げられる：望ましくない血漿漏出もしくは血管透過性、（例えば、腫瘍であるような）望ましくない血管の増大、炎症性障害（例えば、乾癬または関節炎）と関連する浮腫（慢性関節リウマチを含む）；喘息；熱傷に関連する全身性浮腫；腫瘍に関連する腹水および胸水、炎症または外傷；慢性気道炎症；喘息；毛細血管漏出症候群；敗血症；タンパク質の漏出増加に関連する腎臓病；膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および眼の障害（例えば、加齢性黄斑変性症および糖尿病性網膜症）。ＶＥＧＦミニトラップは、眼の障害の処置に、眼の手術（緑内障手術）に対するアジュバントとして；そして硝子体送達を介して、眼の内部の腫瘍（例えば、ブドウ膜色素細胞、網膜芽細胞腫）の処置に特に有用である。
【００１７】
従って、第十の局面において、本発明は、ＶＥＧＦ関連の疾患または状態の処置のための治療方法を特徴とし、その方法は、本発明のＶＥＧＦトラップを、ＶＥＧＦ関連の疾患または状態に苦しんでいる被験体に投与する工程を包含する。任意の哺乳動物が本発明の治療方法によって処置され得るが、その被験体は、好ましくはＶＥＧＦトラップで改善、軽減抑制または処置され得る状態または疾患に苦しんでいるかあるいはその危険性のあるヒト患者である。
【００１８】
第十一の局面において、本発明はさらに、本発明のＶＥＧＦミニトラップを用いてＶＥＧＦを検出、定量、および／またはモニタリングするための診断方法および予防方法、ならびにキットを特徴とする。
【００１９】
第十ニの局面おいて、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアとともに本発明のＶＥＧＦトラップを含む薬学的組成物を特徴とする。そのような薬学的組成物は、二量体の融合ポリペプチドトラップ、またはその融合ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。本発明のミニトラップは、より小さいサイズが望ましいことに起因して、減少した血清の半減期（例えば、より速いクリアランス）、および／または増加した組織浸透を伴うＶＥＧＦトラップの条件において特定の用途を見出す。ＶＥＧＦミニトラップについての特定の適用としては、例えば、特定の組織または細胞に対する局所投与が望ましい疾患が挙げられる。そのような状態または疾患の例は眼の疾患である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、融合パートナー（ＦＰ）とからなる融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子であって、ここでＸは１以上であり、Ｙは１以上であり、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＩｇドメイン３である、単離された核酸分子。
（項目２）
前記融合パートナー（ＦＰ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得る、多量体化成分（ＭＣ）である、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）
前記ＭＣは、以下：
（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含む多量体化成分、
（ｉｉ）切断多量体化成分、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００の間のアミノ酸配列、
（ｉｖ）ロイシンジッパー、
（ｖ）ヘリックスループモチーフ、
（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および
（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメイン
からなる群より選択される、項目２に記載の単離された核酸分子。
（項目４）
項目１〜３に記載の核酸分子によってコードされる、融合ポリペプチド。
（項目５）
配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を有する、項目４に記載の融合ポリペプチド。
（項目６）
項目１〜３に記載の核酸分子を含む形質転換宿主細胞で複製可能な発現ベクター。
（項目７）
ＶＥＧＦ融合ポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、項目６に記載の発現ベクターを適切な発現系に導入する工程、および該ＶＥＧＦ融合ポリペプチドの発現を行う工程を包含する、方法。
（項目８）
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）トラップであって、項目４に記載の融合ポリペプチドのうちの２つ以上の多量体を含む、ＶＥＧＦトラップ。
（項目９）
二量体である、項目８に記載のＶＥＧＦトラップ。
（項目１０）
配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を含む、２つの融合ポリペプチドを含む、二量体のＶＥＧＦトラップ。
（項目１１）
項目８または９に記載の融合ポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１２）
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の除去または阻害によって改善、軽減、または抑制される疾患または状態を処置する方法であって、該方法は、項目１１に記載の薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１３）
前記疾患または状態は、眼の疾患または状態である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記眼の疾患または状態は、加齢性黄斑変性症である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分（ＭＣ）とからなる融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子であって、該多量体化成分（ＭＣ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＩｇドメイン３であり、ここで、該多量体化成分（ＭＣ）は、（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含むＭＣ、（ｉｉ）切断ＭＣ、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメインからなる群より選択される、単離された核酸分子。
（項目１６）
前記レセプター成分が、（Ｒ１Ｒ２）Ｘであり、前記多量体化成分が、少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列である、項目１５に記載の単離された核酸分子。
（項目１７）
前記レセプター成分がＲ１Ｒ２（Ｘは１）であり、前記多量体化成分が、１〜２個のシステイン残基を含む、長さが１〜１５アミノ酸のアミノ酸配列である、項目１６に記載の単離された核酸分子。
（項目１８）
項目１５〜１７に記載の核酸分子によってコードされる、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し得る融合ポリペプチド。
（項目１９）
配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を含む、項目１８に記載の融合ポリペプチド。
（項目２０）
レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分（ＭＣ）とからなる融合ポリペプチドであって、該多量体化成分（ＭＣ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＩｇドメイン３であり、ここで、該多量体化成分（ＭＣ）は、（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含むＭＣ、（ｉｉ）切断ＭＣ、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメインからなる群より選択される、融合ポリペプチド。
（項目２１）
前記レセプター成分が、（Ｒ１Ｒ２）Ｘであり、前記多量体化成分が、少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミン酸の間のアミノ酸配列である、項目２０に記載の融合ポリペプチド。
（項目２２）
前記レセプター成分がＲ１Ｒ２（Ｘは１）であり、前記多量体化成分が、１〜２個のシステイン残基を含む、長さが１〜１５アミノ酸のアミノ酸配列である、項目２１に記載の融合ポリペプチド。
（項目２３）
項目２０〜２２に記載の融合ポリペプチドのうちの２つからなる、二量体のＶＥＧＦトラップ。
（項目２４）
製造物品であって、
（ａ）包装材料；および
（ｂ）該包装材料内に含まれる薬学的薬剤
を含み、ここで、該薬学的薬剤は、少なくとも１つのＶＥＧＦトラップを含み、該ＶＥＧＦトラップは、レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分（ＭＣ）とからなり、該多量体化成分（ＭＣ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、そしてここで、該包装材料は、該ＶＥＧＦ特異的融合ポリペプチドがＶＥＧＦ媒介性の疾患または状態を処置するために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を備える、製造物品。
【００２０】
他の目的および利点は、以下の詳細な説明の精査から明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本方法が記載される前に、本発明は、記載された特定の方法、および記載された実験条件に制限されないこと（例えば、方法および条件は変動し得る）が理解される。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、そして制限することを目的としていないこともまた理解される。なぜなら、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲のみに限られるからである。
【００２２】
本明細書および添付された特許請求の範囲において使用される場合、文脈が明らかに他の内容を指示しない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の参考を含む。従って、例えば、「ａ ｍｅｔｈｏｄ」への言及としては、１つ以上の方法、ならびに／あるいは本明細書中に記載される型の工程および／または本開示および先の開示を読むことによって当業者に明白となる工程が挙げられる。
【００２３】
他に定義されない限りは、本明細書中で使用される、全ての技術用語および全ての科学用語は、本発明の属する分野における当業者に、通常理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および物質に対して、類似または等価である任意の方法および物質は、本発明の実施または本発明の試験において使用され得るが、好ましい方法および好ましい物質は、これから記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物は、本明細書中に、前述の刊行物に関する方法および／または物質を記載するための参考として援用される。
【００２４】
（概要）
本発明は、１つ以上の融合ポリペプチドの、単量体または多量体であり、ＶＥＧＦへの結合およびＶＥＧＦ活性の阻害が可能であるＶＥＧＦトラップを包含する。本発明の分子は、ＶＥＧＦに結合し、そしてＶＥＧＦの生物学的作用および／ならびに生理学的反応または生理学的応答を阻害する。ＶＥＧＦレセプターベースのアンタゴニスト ＶＥＧＦトラップ Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣｌ（ａ）（配列番号７〜配列番号８）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣｌ（ａ）（配列番号９〜配列番号１０）の説明については、ＰＣＴ ＷＯ／００７５３１９を参照のこと。その全体は本明細書中に参考として援用される。
【００２５】
本発明のミニトラップは、完全な大きさのトラップより小さいものであり（例えば、親トラップの１２０ｋＤに対して約５０〜６０ｋＤ）、そして本質的に、ＶＥＧＦレセプタードメイン（Ｒ１Ｒ２）Ｘ、（Ｒ１Ｒ３）Ｙ、またはこれらの組み合せ、切断領域（Ｃ領域）を含む多量体化成分（ＭＣ）である融合パートナー成分を有する親多量体化トラップの一部の切断によって；またはシステイン残基、または１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列をレセプター成分ドメインにまたはレセプター成分ドメイン間に付随することによって生成されるトラップからなる単量体のトラップを含む。特定の実施形態において、本発明のミニトラップは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で測定されたとして、約６０ｋＤ未満であり；より好ましくは、約５０ｋＤであり；さらにより好ましくは、約２０〜３０ｋＤであり；または約２５ｋＤであり、そしてＰＣＴ／ＵＳ００／１４１４２に記載される完全な大きさの親トラップに匹敵する親和性を伴ってＶＥＧＦに結合可能である。
【００２６】
（核酸構築物および発現）
本発明は、ＶＥＧＦ単独に、または多量体化ＶＥＧＦトラップに結合可能な融合ポリペプチドをコードする核酸分子の構築を提供する。本発明の上記核酸分子は、野生型Ｒ１レセプター成分、野生型Ｒ２レセプター成分、および／または野生型Ｒ３レセプター成分、あるいはこれらの機能的等価改変体をコードし得る。本発明のトラップの、Ｒ１レセプター成分、Ｒ２レセプター成分および／またはＲ３レセプター成分の、アミノ酸配列改変体はまた、コードする核酸分子において変異を作製することによって調製され得る。そのような改変体としては、例えば、Ｒ１、Ｒ２および／またはＲ３のアミノ酸配列内からのアミノ酸残基の欠失、あるいはこの配列内へのアミノ酸残基の挿入または置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせは、上記最終構築物がＶＥＧＦに結合し、そしてＶＥＧＦを阻害する能力を有するように最終構築物に到達するために行われ得る。
【００２７】
これらの核酸分子は、適切な宿主細胞内に導入された場合に融合ポリペプチドを発現し得るベクター中に挿入される。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクター中へのＤＮＡフラグメントの挿入について、当業者に公知な任意の方法は、転写／翻訳制御シグナルの制御下において、本発明の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために使用され得る。
【００２８】
本発明の核酸分子の発現は、第２の核酸配列によって調節され得、その結果、上記分子は、組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主において発現される。例えば、発現は、当該分野において公知である任意のプロモーター／エンハンサー要素によって制御され得る。キメラポリペプチド分子の発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、末端反復配列（Ｓｑｕｉｎｔｏら、（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５：１−２０）；ＳＶ４０初期プロモーター領域、ＣＭＶ、Ｍ−ＭｕＬＶ、チミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列；原核細胞発現ベクター（例えば、ｂ−ラクタマーゼプロモーター、またはｔａｃプロモーター（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４もまた参照のこと）；酵母または他の真菌（例えば、Ｇａｌ
４プロモーター）、ＡＤＨ、ＰＧＫ、アルカリフォスファターゼ、およびエラスターゼＩのような遺伝子に由来する組織特異的転写制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の核酸分子を含む、細菌宿主または真核細胞宿主において複製され得る発現ベクターは、上記宿主をトランスフェクトするために使用され、そしてそれにより、本発明の上記融合ポリペプチドを生成するそのような核酸の発現を導き、このことはＶＥＧＦに結合可能なトラップを形成する。トランスフェクトされた細胞は、過渡的にまたは、好ましくは、構成的におよび持続的に、本発明のＶＥＧＦトラップを発現し得る。
【００３０】
本発明の上記トラップは、その後の、安定で、生物学的に活性なトラップの形成を可能にする任意の技術によって精製され得る。例えば、限定ではなく、上記因子は、可溶性タンパク質としてか、または封入体として細胞から回収され得、これらの因子は８Ｍ塩酸グアニジウムおよび透析によって定量的に抽出され得る（例えば、米国特許第５，６６３，３０４号を参照のこと）。上記因子をさらに精製するために、慣用的なイオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００３１】
（ＶＥＧＦレセプター成分）
上記ＶＥＧＦミニトラップの上記ＶＥＧＦレセプター成分は、Ｆｌｔ−１のＩｇドメイン２（Ｆｌｔ１Ｄ２）（Ｒ１）、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３（Ｆｌｋ１Ｄ３）（Ｒ２）（Ｒ１Ｒ２共に）、ならびに／またはＲ１およびＦｌｔ−４のＩｇドメイン３（Ｆｌｔ１Ｄ３）（Ｒ３）（Ｒ１Ｒ３共に）からなる。Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−４、またはＦｌｋ−１の用語「Ｉｇドメイン」は、完全な野生型ドメインだけでなく、インタクトなドメインの機能的特徴を実質的に保持するこれらの、挿入改変体、欠失改変体、および／または置換改変体をも包含することを意図する。上述のＩｇドメインの多くの改変体が、野生型ドメインの機能的特徴と同じ機能的特徴を、実質的に保持するものとして得られ得ることは、当業者にとって容易に理解される。
【００３２】
Ｒ１、Ｒ２またはＲ３を参考して使用される用語「機能的等価物」は、野生型Ｒ１ドメイン、野生型Ｒ２ドメイン、または野生型Ｒ３ドメインと実質的に同じ特徴、すなわちＶＥＧＦに対して結合するという機能的特徴と、実質的に等価の機能的特徴を、実質的に保持する少なくとも１つの改変（例えば、欠失、付加および／または置換）を伴うＲ１ドメイン、Ｒ２ドメインまたはＲ３ドメイン包含することを意図する。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３における種々のアミノ酸置換は、本発明の精神から逸脱することなく、ＶＥＧＦに対して結合しかつＶＥＧＦを不活性化するこれらのレセプター成分の能力に留意して行われ得ることが理解される。本発明の上記トラップの機能的特徴は、所望される特徴を測定する分野において公知の任意の適切なスクリーニングアッセイによって決定され得る。そのようなアッセイの例は、ＶＥＧＦ（Ｋｄ）についての上記トラップの結合特徴の決定、ならびにトラップリガンド複合体の解離についての半減期（Ｔ１／２）の決定を可能にする、後述の実験的な節に記載される。他のアッセイ、例えば、ＶＥＧＦに特異的に結合する能力の変化は、競合型ＶＥＧＦ結合アッセイによって測定され得る。タンパク質特性（例えば、熱的安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、または凝集傾向）の改変は、当業者に公知の方法によって測定され得る。
【００３３】
上記融合ポリペプチドの上記成分は、互いに直接連結され得るか、またはスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を介して結合され得る。一般的に、用語「スペーサー」（またはリンカー）は、１つ以上の成分ドメイン間に挿入され得る１つ以上の分子（例えば、核酸またはアミノ酸、あるいはポリエチレングリコールのような非ペプチド部分）を意味する。例えば、スペーサー配列は、操作の軽減のために、上記成分の間で対象となる所望の部位を提供するために使用され得る。スペーサーはまた、宿主細胞由来の上記融合ポリペプチドの発現の増強、立体障害の減少を提供し得、上記成分は、その最適な３次構造および／またはその標的分子との適切な相互作用を担い得る。スペーサーおよび所望のスペーサーを同定する方法は、例えば、本明細書中に参考として明確に援用されるＧｅｏｒｇｅら、（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１−８７９を参照のこと。スペーサー配列は、レセプター成分に天然に結合する１つ以上のアミノ酸を含み得るか、または上記融合ポリペプチドの発現を増強し対象となる特定の所望される部位を与え、成分ドメインに最適な３次構造を形成させ、および／または成分とその標的分子との相互作用を増強するために使用される配列を付加し得る。１つの実施形態において、上記スペーサーは、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜２５アミノ酸の間である１つ以上の成分の間に、１つ以上のペプチド配列を含む。
【００３４】
最も特定の実施形態において、Ｒ１は、配列番号８の２７〜１２６のアミノ酸であるか、または配列番号８の１〜１２６のアミノ酸（１〜２６のシグナル配列を含む）であるか；あるいは配列番号１０の２７〜１２９のアミノ酸であるか、または配列番号１０の１〜１２９のアミノ酸（１〜２６のシグナル配列を含む）である。最も特定の実施形態において、Ｒ２は、配列番号８の１２７〜２２８のアミノ酸であるか、または配列番号１０の１３０〜２３１のアミノ酸である。最も特定の実施形態において、Ｒ３は、配列番号１３の１２７〜２２５のアミノ酸（シグナル配列を伴わない）である。例えば、Ｒ２が、上記融合ポリペプチドのＮ末端に配置される場合に、シグナル配列は、望ましく上記レセプター成分の前に位置し得る。上記多量体化成分に結合した上記レセプター成分はさらに、スペーサー成分（例えば、配列番号７の２２９〜２３１のアミノ酸のＧＰＧ配列）を含み得る。
【００３５】
（融合パートナーおよび多量体化成分）
上記融合パートナーは、上記融合ポリペプチドの機能性を増強する任意の成分である。従って、例えば、融合パートナーは、生物学的活性を増強し得るか、上記融合ポリペプチドの産生および／または回収に役立ち得るか上記融合ポリペプチドのあるいは、例えば、その血清半減期、組織透過性、免疫原性の欠如、もしくは安定性を増強することによって、薬学的特性、または、上記融合ポリペプチドの薬物動態プロフィールを増強し得る。好ましい実施形態において、上記融合パートナーは、多量体化する成分、血清タンパク質、または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群より選択される。
【００３６】
上記融合パートナーが、血清タンパク質またはそれらのフラグメントである場合に、それは、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド（ｏｒｏｓｏｍｕｃｉｏｄ）、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、トランスフェリン、フェリチン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、ハプトグロビン、α−フェトプロテインチログロブリン、α−２−ＨＳ−糖タンパク質、β−２−糖タンパク質、ヒアルロン酸結合タンパク質、シンタキシン、Ｃ１Ｒ、Ｃ１ｑ鎖、ガレクチン３−Ｍａｃ２結合タンパク質、フィブリノゲン、ポリマーＩｇレセプター（ＰＩＧＲ）、α−２−マクログロブリン、尿素輸送タンパク質、ハプトグロビン、ＩＧＦＢＰ、マクロファージスカベンジャー（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）レセプター、フィブロネクチン、ギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、Ｆｃ、α−１−抗キロモトリプシン（ａｎｔｉｃｈｙｒｏｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、α−１−抗トリプリン、抗トロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｂ、β−２−ミクログロブリン、セルロプラスミン、補体成分Ｃ３または補体成分Ｃ４、ＣＩエステラーゼインヒビター、Ｃ−反応性タンパク質、シスタチンＣ、およびプロテインＣからなる群より選択される。より特定の実施形態において、融合パートナーは、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、アファミン、およびハプトグロビンからなる群より選択される。融合パートナー成分の含有は、所望される場合に本発明の上記融合ポリペプチドの血清半減期を延長し得る。例えば、血清アルブミン融合ポリペプチドの例として、本明細書中にその全てが参考として詳細に援用される、米国特許第６，４２３，５１２号、同第５，８７６，９６９号、同第６，５９３，２９５号および同第６，５４８，６５３号を参照のこと。ｈＳＡは、身体全体（特に、腸成分および血液成分）に広く分布し、そして浸透圧および血漿量の維持について重要な役割を有する。それは、肝臓で徐々に除去され、そして代表的には、ヒトにおいて１４日〜２０日のインビボ半減期を有する（Ｗａｌｄｍａｎｎら、(１９７７）Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ;Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ;ｐｐ．２５５−２７５）。
【００３７】
融合パートナーが、血清タンパク質に結合可能な分子である場合に、その分子は、合成の低分子、脂質またはリポソーム、合成核酸（例えば、アプトマー）を含む核酸、ペプチド、またはオリゴ糖であり得る。上記分子はさらに、例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、ＦｃγＲ３、ポリマーＩｇレセプター（ＰＩＧＲ）、ＳｃＦｖ、および血清タンパク質に特異的な他の抗体フラグメントのようなタンパク質であり得る。
【００３８】
上記融合パートナーが、多量体化成分（ＭＣ）である場合に、これは、高次構造（例えば、二量体、三量体など）を形成する別のＭＣと相互作用することが可能な、任意の天然の配列または任意の合成の配列である。適切なＭＣとしては、ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓに由来するロイシンジッパードメインを含む、ロイシンジッパー；κ軽鎖またはλ軽鎖の、定常領域に由来する配列；へリックス−ループ−へリックスモチーフ（Ｍｕｌｌｅｒら、(１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３２:４５−４９）、コイル−コイルモチーフなどのような合成配列、または他の一般的に受容された当該分野において公知の多量体化ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記融合成分は、例えば、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＡに由来する免疫グロブリン由来ドメインを含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン由来ドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群より選択され得る。ＩｇＧのＦｃドメインは、ＩｇＧ１のアイソタイプ、ＩｇＧ２のアイソタイプ、ＩｇＧ３のアイソタイプ、およびＩｇＧ４のアイソタイプ、ならびに各アイソタイプ群内における任意のアロタイプより選択され得る。本発明のＶＥＧＦトラップの１つの例において、上記多量体化成分は、ＩｇＧ４
Ｆｃドメイン（配列番号２９）である。
【００３９】
（切断ＶＥＧＦミニトラップの生成）
本発明のトラップの１つの実施形態において、２つ以上の本発明の融合ポリペプチドを含む切断ＶＥＧＦミニトラップは、Ｃ領域含有ＭＣを有する親トラップを、１つ以上のＣ領域含有ＭＣが切断される条件に供することによって生成される。生じる切断されたミニトラップは、親トラップの、完全切断産物および部分切断産物であり得る。
【００４０】
上記Ｃ領域含有ＭＣは、別のＭＣと相互作用して高次構造（例えば、二量体、三量体）を形成することが可能な任意のＭＣであり得る。上記Ｃ領域は、ＭＣ内の任意の所望の部位に創出され得る。以下の実施例において提供される指針に照らして、当業者は得られた切断トラップの所望の特性（例えば、分子量、単量体または二量体など）に基づいてＣ領域の作製のために所望の部位を選択し得る。
【００４１】
特定の実施形態において、上記Ｃ領域は、Ｎ末端ＣＰＰＣ配列（配列番号１）に続くＦｃΔＣｌドメイン内に挿入されるトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ）（配列番号６）である。この実施形態において、完全な大きさの親ＶＥＧＦトラップ構築物は、Ｆｃタグ化タンパク質として、細胞において発現され、それゆえ、例えば、プロテインＡカラムによって、捕捉され、そして精製される。ＣＰＰＣ配列（配列番号１）のシステイン残基の１つまたは両方の間における、二量体形成および共有結合の形成に続いて、上記二量体は、１つまたは両方のＦｃΔＣ１ドメインを切断する条件下でトロンビンに曝露され、その結果、約５０ｋＤ〜９０ｋＤの分子量を有する切断二量体ミニトラップが生成され、そして上記親トラップのＶＥＧＦに対する親和性に匹敵する親和性を有する。切断の条件は、当業者によって、部分切断産物または完全切断産物の好ましい形態（特定の特性（例えば、分子量）を有する特定の産物を所望することによって選択される切断条件）に制御され得る。
【００４２】
特定の実施形態において、上記Ｃ領域は、ＣＰＰＣ配列（配列番号１）に対するＦｃΔＣ１ドメインＮ末端に挿入されるトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ）（配列番号６）である。二量体の形成およびＣＰＰＣ配列（配列番号１）のシステイン残基の１つまたは両方の間の共有結合に続いて、上記二量体は、ＦｃΔＣ１ドメインの１つまたは両方が生じ、そして産生される切断されたミニトラップが生成される条件下でトロンビンに曝露される。従って、生成された単量体の切断されたミニトラップは、レセプター成分、およびＦｃの低分子フラグメントを含み、そして約２５ｋＤの大きさであり、切断された二量体のトラップおよび完全長の親トラップに対して、ＶＥＧＦに対する親和性の減少を示す。組換えタンパク質として生成された類似の単量体のトラップは、約１ｎＭのＫＤを有することを示した。
【００４３】
（ＶＥＧＦミニトラップの生成）
１つの実施形態において、本発明は、１つ以上のレセプター成分ドメイン（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙ（ここで、Ｘ≧１、Ｙ≧１、ならびにＲ１、Ｒ２、およびＲ３は上述のように定義され）、および必要に応じて、好ましくは少なくとも１つのシステイン残基（ここで、少なくとも１つのシステイン残基は、他の融合ポリペプチドのＭＣに存在するシステイン残基（ｃＭＣ）とジスルフィド結合を形成することが可能である）を有する１〜約２００アミノ酸の間の長さのアミノ酸配列の、ＭＣドメインである融合パートナーを有するＶＥＧＦミニトラップを特徴とする。上記ｃＭＣは、融合ポリペプチドの、Ｎ末端およびＣ末端、または２つのレセプター成分ドメイン間において生じ得る。１つの特定の実施形態において、システインは、ＶＥＧＦレセプター成分（例えば、Ｒ１Ｒ２Ｃ）のＣ末端に付加され、これによって上記融合ポリペプチドに、１つの融合ポリペプチドのＣ末端のシステイン残基と別の融合ポリペプチドのＣ末端のシステイン残基との間の共有ジスルフィド結合の形成を介して、共有結合二量体を形成させる。本例示において、上記ミニトラップは、配列番号２に示される上記融合ポリペプチドの二量体であり、ここで各融合ポリペプチド（Ｒ１Ｒ２−ｃＭＣまたはＲ１Ｒ２Ｃ）は、約２３．０ｋＤの分子量を有する。
【００４４】
別の実施形態において、上記ｃＭＣは、４アミノ酸の配列（ＸＸＸＸ）（配列番号１１）である（ここでＸは、任意のアミノ酸であり、そしてこの配列は少なくとも１つのシステイン残基を含むおよび任意の配列である）。特定の実施形態において、上記ｃＭＣは、レセプター成分ドメインのＣ末端に付加される。さらに特定の実施形態において、上記４アミノ酸配列は、ＡＣＧＣ（配列番号４）であり、そして上記ｃＭＣは第２の融合ポリペプチドに存在するシステイン残基と２つのジスルフィド結合を形成するｃＭＣである。以下（表２）に示すように、例示されたミニトラップの両方は、上記親トラップに匹敵するＶＥＧＦに対する親和性を示す。
【００４５】
（治療的使用）
本発明のＶＥＧＦミニトラップは、ＶＥＧＦの、除去、阻害、または減少によって、改善されるか、回復されるか、阻害されるかまたは防がれる、任意の疾患または任意の状態の処置のために治療的に有用である。ＶＥＧＦの阻害またはＶＥＧＦの減少によって改善される特定の状態の非網羅的なリストとしては、過度な血管内皮細胞増殖、血管透過性、浮腫または炎症（例えば、傷害、脳卒中または腫瘍に関連する脳浮腫）；炎症性疾患（例えば、乾癬、または関節リウマチを含む関節炎）に関連した浮腫；喘息；火傷に関連して生成される浮腫；腫瘍、炎症または外傷に関連した、腹水または胸水；慢性的気道炎症；毛細管漏出症候群；敗血症；タンパク質の漏出増加に関連する腎疾患；ならびに加齢に関連した黄斑変性症、および糖尿病性網膜症のような眼疾患によって特徴付けられる臨床状態が挙げられる。
【００４６】
本発明の組成物は、ＶＥＧＦレベルの増加に関連した多種多様な疾患の処置のために、治療的に有用である。例えば、亢進されたＴｈ２炎症および気道リモデリングは、喘息の病因において特徴的である（例えば、Ｅｌｉａｓら、（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１００１−６を参照のこと）。高められたＶＥＧＦレベルは、喘息患者由来の、組織および生物学的サンプルにおいて検出され、それは疾患の活性に直接的に相関し（Ｌｅｅら、（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１１０６−１１０８）、そして気道径および気道応答性に逆相関する。さらに、ＶＥＧＦは、喘息の組織浮腫の原因となるが推定される。
【００４７】
増加されたＶＥＧＦに関連する別の疾患は、膵臓管腺癌（ＰＤＡＣ）である。この悪性腫瘍は、しばしば病巣の内皮細胞増殖の増強を示し、そして頻繁に、ＶＥＧＦを過剰発現する（Ｆｅｒｒａｒａ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７−５４３）。ＰＤＡＣは、消化管悪性腫瘍による死亡の２０％以上の原因であり、米国および他の先進工業国における癌関連死亡率の第４番目の最も一般的な原因となっている、る。実験的証明は、膵臓癌におけるＶＥＧＦについての重要な役割を支持し、従って、ＶＥＧＦインヒビターは、膵臓内腫瘍の増殖、そして局所および遠位性の転移を減弱する治療として見込まれる。
【００４８】
Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるより低分子の、非グリコシル化ミニトラップ（実施例４）、ＣＨＯ細胞で発現されるグリコシル化ミニトラップ（実施例５）、またはレセプターベースの単量体のトラップ（実施例６）は、局所／硝子体内送達について最適化された特徴（すなわち、より速い除去のためのより短い血清半減期、および望まれない全身的曝露の最小化）を有する。さらにそのより小さい大きさに起因して、上記ミニトラップは、目における内境界膜（ＩＬＭ）を透過する能力、および硝子体を通過して網膜／網膜色素上皮（ＲＰＥ）層へ拡散する能力（網膜疾患の処置を支援する）を有する。さらに、上記ミニトラップは、眼疾患（例えば、脈絡叢新血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、角膜新血管新生／移植拒絶）の処置における局所投与のために使用され得る。なお、さらに、上記ミニトラップは、ＶＥＧＦの一過性（短期間）の遮断が必要とされる（例えば、ＶＥＧＦ遮断への長期間の曝露を避けるために）（例えば、乾癬の処置におけるように）任意の状況において使用され得る。
【００４９】
緑内障手術後の不全を招く深刻な問題は、初期の炎症および初期の血管新生、ならびに過度に活動的な創傷治癒である。従って、本発明のＶＥＧＦトラップは、緑内障手術後の、初期の血管新生および初期のリンパ管新生、ならびに胞濾過へのマクロファージの再補充を防ぐための、緑内障手術に対するアジュバントとして有用に利用され得、手術結果を改善する。
【００５０】
（組み合わせ治療）
多くの実施形態において、ＶＥＧＦトラップは、第２のＶＥＧＦトラップ分子、化学療法剤、外科手術、カテーテルデバイス、および放射線を含む１つ以上の付加的化合物または付加的治療と組み合わせて投与され得る。組み合わせ治療は、ＶＥＧＦトラップおよび１つ以上の付加的薬剤を含む単一の薬学的投薬処方物の投与；ならびにそれ自身別個の薬学的投与処方物での、ＶＥＧＦトラップおよび１つ以上の付加的薬剤の投与を包含する、を含む。例えば、ＶＥＧＦトラップおよび細胞障害剤、化学療法剤または増殖阻害剤は、単一の投薬組成物（例えば、組み合わされた処方物）中で一緒に、患者に投与され得るか、または各薬剤は別々の投与処方物において投与され得る。別々の投与処方物が使用される場合、本発明のＶＥＧＦ特異的融合ポリペプチド、および１つ以上の付加的薬剤は、同時に投与され得るか、または別々の交代的な時間、すなわち、連続して投与され得る。
【００５１】
本明細書中に使用される場合、用語「細胞障害剤」は、細胞の機能を阻害または妨害し、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。上記用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的活性毒素、あるいはこれらのフラグメント）を包含することを意図する。
【００５２】
「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）））；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メチュレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスフォラミド、トリエチレンチオホスフォラミドおよびトリメチロロメラミンを含む）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、カクチノマイシン、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグニン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、チュベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ））；アセグラトン（ａｃｅｇｌａｔｏｎｅ）；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリニン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトザントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ナイトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ポドフィリニン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２、２’、２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類（例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ））；クロラムブシル；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤もまた、この定義に含まれ、これらとしては、以下が挙げられる：抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）-イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；ならびに抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「増殖阻害剤」とは、細胞（特に癌細胞）の増殖をインビトロまたはインビボのいずれかで阻害する、化合物または組成物をいう。増殖阻害剤の例としては、（Ｓ期以外の状態において）細胞周期進行を遮断する薬剤（例えば、Ｇ１阻止およびＭ期阻止を誘導する薬剤）が挙げられる。古典的なＭ期遮断薬としては、以下が挙げられる：ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ならびにトポＩＩインヒビター（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシン。Ｇ１を阻止する以下の薬剤はまた、Ｓ期阻止にも及ぶ：例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびアラ−Ｃ。
【００５４】
（投与方法）
本発明は、処置方法を提供し、その方法は、被験体に本発明の有効量のＶＥＧＦトラップを投与する工程を包含する。好ましい局面において、上記トラップは、実質的に精製される（例えば、その効果を限定するか、または望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。上記被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００５５】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の薬剤を投与するために使用され得る：例えば、リポソーム中、微粒子中、微小カプセル中へのカプセル化、化合物を発現し得る組換え細胞、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスの一部としての核酸の構築物、または他のベクターなど。導入方法はまた、経腸的または非経口的であり得、その導入方法としては、皮内経路、筋内経路、腹腔的経路、静脈内経路、皮下経路、経鼻経路、眼内経路、および経口経路が挙げられる。上記化合物はまた、任意の便利な経路によって（例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮の内層もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜）からの吸収によって）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的でも局所的でもよい。投与は、急性的でも慢性的（例えば、毎日、毎週、毎月など）でも、他の薬剤と組み合わせてもよい。肺の投与もまた、例えば、吸入器または噴霧器の使用によって、およびエアロゾル化剤との処方によって、使用され得る。
【００５６】
別の実施形態において、上記活性剤は、制御放出システムまたはポンプにおいて、ベシクル、特にリポソームで送達され得る。本発明の活性剤がタンパク質をコードする核酸である別の実施形態において、その核酸は、それを、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして細胞内に至るようにそれを以下により投与することによって、インビトロで投与されてそのコードされたタンパク質の発現を促進し得る：例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、直接的な注射によって、または微粒子照射の使用によって、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でのコーティングによって、または核に入ることが公知のホメオボックス様ペプチドに結合させてそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら １９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８を参照のこと）など。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして発現のために、宿主細胞ＤＮＡ内に、相同組換えによって組み入れられ得る。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物を、処置を必要としている領域に局所的に投与することが所望され得る；これは、例えば、以下によって達成され得るが、それらは限定的な方法ではない：手術の間の局所注入、局所適用によって（例えば、注射によって）、カテーテルによって、または移植物（この移植物は、多孔性物質、非多孔性物質、またはゼラチン状物質である）（膜（例えば、シアル酸（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜）、繊維、または市販の皮膚代替物を含む）によって。
【００５８】
本発明の方法を実施することに有用な組成物は、本発明の薬剤を、溶液中、懸濁液中、またはその両方に含む液体であり得る。用語「溶液／懸濁液」とは、活性剤の第一の部分が溶液中に存在し、活性剤の第２の部分が粒子状形態で液体マトリックスに懸濁して存在する、液体組成物をいう。液体組成物はまた、ゲルを含む。液体組成物は、水性でも軟膏の形態でもよい。さらに、上記組成物は、眼の中（例えば、眼と瞼との間）または結膜嚢に挿入され得る固形物品の形態をとり得、ここで、ＶＥＧＦトラップが放出される。そのような物品からの放出は、通常、涙液を介してか、または角膜それ自体に直接的にかのいずれかで、角膜に対してであり、上記固体物品は一般的に直接接触している。眼の中への移植に適切な固体物品は、一般的に、主に生体侵食性ポリマーまたは非生体侵食性ポリマーから構成される。水溶液および／または水性懸濁液は、点眼の形態であり得る。活性剤の望ましい投薬量は、既知数の点眼を眼に投与することによって測定され得る。例えば、２５μｌの点眼体積については、１〜６つの点眼の投与が、２５〜１５０μｌの組成物を送達する。
【００５９】
本発明の方法を実施するのに有用な、水性懸濁液または溶液／懸濁液は、懸濁剤として１種以上のポリマーを含有し得る。有用なポリマーとしては、水溶性ポリマー（例えば、セルロース系ポリマー）および水不溶性ポリマー（例えば、架橋されたカルボキシ含有ポリマー）が挙げられる。本発明の水性懸濁液または溶液／懸濁液は、好ましくは、粘稠性または粘膜付着性であるか、またはさらにより好ましくは、粘稠性または粘膜付着性の両方である。
【００６０】
別の実施形態において、本発明の方法を実施するのに有用な組成物は、インサイチュでゲル化可能の水性組成物である。そのような組成物は、眼または涙液との接触の際にゲル化を促進するのに効果的な濃度のゲル化剤を含有する。適切なゲル化剤としては、熱硬化性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「インサイチュでゲル化可能」は、眼または涙液との接触の際にゲルを形成する低粘度の液体を包含するだけでなく、眼への投与の際に実質的に増加した粘度またはゲル剛性を示す、より粘性な液体（例えば、半流動体）およびチキソトロープ性のゲルも包含する。
【００６１】
（診断法およびスクリーニング方法）
本発明のＶＥＧＦトラップは、診断的におよび／またはスクリーニング方法で使用され得る。例えば、上記トラップは、臨床研究の間のＶＥＧＦレベルをモニタリングして処置効力を評価するために使用され得る。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、臨床研究に入るための個体をスクリーニングして、例えば、高すぎるＶＥＧＦレベルまたは低すぎるＶＥＧＦレベルを有する個体を同定するために使用される。上記トラップは、ＶＥＧＦの局在化および活性に関する、当該分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的サンプルにおけるＶＥＧＦレベルの画像化、測定）、および診断方法などで使用され得る。
【００６２】
本発明のトラップは、存在する非結合ＶＥＧＦの量を定量するインビボおよびインビトロのスクリーニングアッセイで使用され得、例えば、ＶＥＧＦの発現を低下し得る試験薬剤を同定するスクリーニング方法で使用され得る。より一般的には、本発明のトラップは、ＶＥＧＦの定量および／または単離が所望される任意のアッセイまたはプロセスで使用され得る。
【００６３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本発明のＶＥＧＦミニトラップを含有する薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、治療有効量の１種以上のミニトラップ、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。用語「薬学的に受容可能な」とは、動物での使用について、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって認証されていることを意味するか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいい、これらと一緒に治療剤は投与され得る。そのような薬学的キャリアは、無菌性液体（例えば、水および油）であり得、これらとしては、石油からなる油、動物油、植物油または合成由来の油（例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など）が挙げられる。適切な薬学的賦形剤としては、以下が挙げられる：デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなど。所望の場合、上記組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物などの形態をとり得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００６４】
本発明のＶＥＧＦミニトラップは、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離のアミノ基で形成されている塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導された塩）、および遊離のカルボキシル基で形成されている塩（たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導された塩）が挙げられる。
【００６５】
なおさらに、本発明の方法を実施するのに有用な水性組成物は、眼に適合性のｐＨおよび重量オスモル濃度を有する。１種以上の眼に受容可能なｐＨ調整剤および／または緩衝剤は、本発明の組成物中に含まれ得、これらとしては、以下が挙げられる：酸（例えば、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩酸）；塩基（例えば、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および乳酸ナトリウム）；ならびに緩衝剤（例えば、シトレート／デキストロース、炭酸水素ナトリウムおよび塩化アンモニウム）。そのような酸、塩基、および緩衝剤は、眼に受容可能な範囲の、組成物のｐＨを維持するために必要とされる量で含有される。１種以上の眼に受容可能な塩は、上記組成物中に、その組成物の重量オスモル濃度を眼に受容可能な範囲にするのに十分な量で含有される。そのような塩としては、ナトリウムカチオン、カリウムカチオンまたはアンモニウムカチオン、および塩化物アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、炭酸水素アニオン、硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンが挙げられ得る。
【００６６】
その意図された治療的使用に効果的であるトラップの量は、本発明の記載に基づく標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、最適投薬範囲を同定するために使用され得る。一般的に、静脈内投与のために適切な投薬範囲は、一般的に、体重１ｋｇあたり約５０〜５０００μｇの活性化合物である。鼻腔内の投与のための適切な投薬範囲は、一般的に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験系から誘導された用量応答曲線から外挿され得る。
【００６７】
全身投与のために、治療有効用量は、最初にインビトロアッセイから見積もられ得る。例えば、用量は、動物モデルにおいて処方され、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成し得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量を正確に決定するために使用され得る。開始投薬量もまた、当該分野で周知の技術を使用して、インビボデータ（例えば、動物モデル）から見積もられ得る。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化し得る。
【００６８】
投薬量および投薬間隔は、個々に調整され、治療効果を維持するのに十分な、血漿レベルの化合物を提供し得る。局所的投与または選択的取り込みの場合、化合物の効率的な局所的濃度は、血漿濃度に関連し得ない。当業者は、実験を行うことなく、治療的に有効な局所投薬量を最適化し得る。
【００６９】
投与される化合物の量は、言うまでもなく、処置される被験体、その被験体の体重、苦痛の重篤度、投与様式、および主治医の判断に依存する。治療は、症状が検出可能な間、または例え症状が検出可能でない場合でも、断続的に繰り返され得る。上記治療は、単独でか、または他の薬物と組み合わせて、提供され得る。
【００７０】
（細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビトロおよびインビボにおける細胞のトランスフェクションのための、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸の使用を包含する。これらの核酸は、標的細胞および標的の生物体のトランスフェクションのため、多数の周知のベクターのいずれにも挿入され得る。これらの核酸は、上記ベクターと上記標的細胞との相互作用を介して、エキソビボおよびインビボで細胞にトランスフェクトされる。上記組成物は、治療応答を誘発するのに十分な量で（例えば、筋への注入によって）被験体に投与される。この応答を達成するのに適切な量は、「治療有効用量」または「治療有効量」として定義される。
【００７１】
別の局面において、本発明は、ヒトまたは他の動物においてＶＥＧＦレベルを低下させる方法を提供する。この方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程を包含する。ここで、この核酸は、上記融合ポリペプチドもしくはミニトラップをコードする核酸に作動可能に連結された誘導性プロモータを含む。ヒト疾患の処置または予防における遺伝子治療処置については、例えば、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１４９−１１５４を参照のこと。
【００７２】
（キット）
本発明はまた、製造物品を提供する。この物品は、包装材料、およびこの包装材料に梱包された薬学的薬剤を含む。ここで、この薬学的薬剤は、本発明の融合ポリペプチドの２以上からなる少なくとも１つのＶＥＧＦトラップを含有し、そして上記包装材料は、ＶＥＧＦ特異的融合ポリペプチドがＶＥＧＦ媒介性の疾患または状態を処置するために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を備える。
【００７３】
（トランスジェニック動物）
本発明は、本発明のトラップを発現するトランスジェニック非ヒト動物を包含する。トランスジェニック動物は、受精卵の雄性前核に（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイスル感染によって）核酸を導入し、その卵を偽妊娠雌養育動物（ｆｏｓｔｅｒ ａｎｉｍａｌ）内で発生させることによって作製され得る。発現ベクター内で有用な任意の調節配列もしくは他の配列が、上記トランスジェニック配列の一部を形成し得る。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されて、特定細胞をその導入遺伝子の発現に導く。本発明の融合ポリペプチドもしくはミニトラップを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、種々の用途（このような融合ポリペプチドを生成する手段としての用途が挙げられる）で有用である。さらに、上記導入遺伝子は、誘導性プロモータの制御下におくことができ、これによって上記融合ポリペプチドもしくはミニトラップの発現は、例えば、低分子の投与によって制御され得る。
【００７４】
（特定の実施形態）
以下に記載される実験において、より低分子のＶＥＧＦトラップが作製され、そしてこれらのＶＥＧＦに結合する能力が研究される。このようなミニトラップは、好ましくは、特定の用途で使用される。例えば、特定の状態もしくは疾患は、好ましくは、ＶＥＧＦトラップの全身投与によるよりもむしろ、特定の器官、組織、もしくは細胞へのＶＥＧＦトラップの局所投与によって処置され得る。本発明のミニトラップの一例において、より低分子のＶＥＧＦトラップが、Ｆｃドメインに作製された切断領域（Ｃ領域）を有する二量体化ＶＥＧＦトラップの方向性のある切断（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）によって生成された（実施例２）。切断トラップは、完全な大きさの親トラップと同等のＶＥＧＦに対する親和性、およびこの親とラップと同等の半減期を示した。実施例３〜５は、ＶＥＧＦレセプター成分および１つもしくは２つのシステイン残基からなる多量体化成分を有する融合ポリペプチドの構築を記載する。親和性測定は、非グリコシル化融合ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されたこと、またはＣＨＯ細胞で発現されたグリコシル化ポリペプチドが、完全な大きさの親トラップに匹敵する、ＶＥＧＦに対する結合親和性を有したことを示した。実施例６は、（Ｒ１Ｒ２）２からなる、ＶＥＧＦに結合して阻害し得る単量体ＶＥＧＦトラップをさらに示す。実施例７は、全長トラップ（配列番号１０）に匹敵するＶＥＧＦへの高い結合親和性を示すＶＥＧＦミニトラップ（配列番号２６）の構築を記載する。
【００７５】
本発明の他の特徴は、以下の例示的実施形態の記載の過程で明らかになる。以下の実施形態は、本発明の説明のために示され、これらを限定することを意図されない。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、当業者に、本発明の方法をどのように実施しかつ使用するか、および本発明の組成物をどのように作製しかつ使用するかの完全な開示および記載を提供するために示され、そして本発明者らが本発明であるとみなすところの範囲を限定することを意図されない。
【００７７】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するための努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮すべきである。他に示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧もしくは大気圧付近である。
（実施例１．Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の構築）
親ＶＥＧＦトラップ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号７〜８）、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）、およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号１２〜１３）の構築は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ／００７５３１９（本明細書において、その全体が、詳細に参考として援用される）に詳細に記載されている。ＷＯ ／００７５３１９においては、ＶＥＧＦトラップをコードする核酸構築物を構築および発現する方法、ＶＥＧＦに結合するＶＥＧＦトラップを検出および測定する方法、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によってＶＥＧＦ結合の化学量論を決定する方法、および薬物動態分析もまた記載されている。
【００７８】
（実施例２．トロンビン切断二量体ＶＥＧＦミニトラップ）
ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）構築物を、ＦｃドメインのＣＰＰＣ（配列番号１）後にトロンビン切断を挿入して改変した。精製ＶＥＧＦトラップ（５μｇ）を、トロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２中で、１６時間３７℃でインキュベートした。切断コントロールタンパク質（ＣＣＰ）および親ＶＥＧＦトラップタンパク質を含んだコントロールを、トロンビンなしでインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｔｒｉｓ−グリシン ４〜２０％ゲル；５μｇタンパク質／レーン）により、正しい切断を確認した（結果は示さず）。
【００７９】
（アフィニティー決定）
親ＶＥＧＦトラップ、トロンビン切断部位を含む非切断ＶＥＧＦトラップ（「非切断ＶＥＧＦトラップ」）、切断ＶＥＧＦミニトラップ、および組み換え単量体Ｒ１Ｒ２−ｍｙｃ ｍｙｃ ｈｉｓについて、各ＶＥＧＦトラップのｈＶＥＧＦ１６５への結合のＫｄを、ＷＯ ／００７５３１９に記載されるように決定した。より具体的には、ＶＥＧＦ１６５依存性レセプターリン酸化をブロックするこれらのトラップの能力を、初代ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて決定した。ＶＥＧＦ１６５を、種々の濃度の試験トラップの存在下でインキュベートし、その混合物にＨＵＶＥＣを添加して、ＶＥＧＦＲ２のチロシンリン酸化を刺激した。不足当量濃度のＶＥＧＦトラップにおいて、非結合ＶＥＧＦは、レセプターリン酸化を誘導した。しかし、ＶＥＧＦトラップ対リガンドの１：１モル比もしくはより大きいモル比（１：１ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｇｒｅａｔｅｒ）では、レセプターシグナル伝達の完全なブロックが観察され、このことは、トラップ二量体の単一分子が、ヒトＶＥＧＦ１６５の単一分子をブロックし得ることを証明した。したがって、ＶＥＧＦトラップのＶＥＧＦに対する高結合親和性は、ＶＥＧＦの細胞表面レセプターとの相互作用を妨げる複合体の形成を生じる。同等の結果が、親ＶＥＧＦトラップ、非切断ＶＥＧＦトラップ、および切断ＶＥＧＦミニトラップについての、同じリン酸化阻害実験に関して得られた。この結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
（実施例３．ＶＥＧＦミニトラップをコードするプラスミドの構築）
ＶＥＧＦミニトラップを、親ＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）の前駆体から構築した。ここで、３つのアミノ酸、グリシン−アラニン−プロリンは、Ｆｌｋ１ Ｄ３とＦｃΔＣ１（ａ）との間のリンカーとして作用した。このプラスミド、ｐＴＥ１１５を、ＶＥＧＦミニトラップの構築に使用した。なぜなら、このリンカーＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦトラップの操作を容易にするＳｒｆ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むからである。他の全ての点で、ｐＴＥ１１５によってコードされるＶＥＧＦトラップは、ＰＣＴ出願ＷＯ ／００７５３１９に詳細に記載されるＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）と同一である。
【００８１】
２つのＶＥＧＦミニトラップを、レセプター成分Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３のＣ末端に付加された単一のシステイン残基（Ｒ１Ｒ２Ｃ）（配列番号２）またはアミノ酸ＡＣＧＣ（配列番号４）（Ｒ１Ｒ２ＡＣＧＣ）（配列番号５）のいずれかからなる、多量体化ドメインを用いて構築した。これらの構築物の両方とも、１つの（Ｒ１Ｒ２Ｃ）または２つの（Ｒ１Ｒ２ＡＣＧＣ）分子間ジスルフィドによって安定化されたホモ二量体分子を形成し得る。
【００８２】
ｐＴＥ１１５ ＤＮＡのＳｒｆ ＩおよびＮｏｔ Ｉでの消化によって生成した６９０ｂｐフラグメントを除去し、そしてオリゴＲ１Ｒ２ＮＣ（配列番号１４）およびＲ１Ｒ２ＣＣ（配列番号１５）をアニーリングすることによって形成された合成ＤＮＡフラグメントを挿入することによって、プラスミドｐＴＥ５１７を作製した。得られたプラスミドは、Ｒ１Ｒ２Ｃ（これは、その後にシステイン残基が続くＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（配列番号２３）からなる）をコードする。同様に、ｐＴＥ１１５ ＤＮＡのＳｒｆ
ＩおよびＮｏｔ Ｉでの消化によって生成された６９０ｂｐフラグメントを除去し、続いてオリゴＲ１Ｒ２ＮＡＣＧＣ（配列番号１６）およびＲ１Ｒ２ＣＡＣＧＣ（配列番号１７）をアニーリングすることによって形成された合成ＤＮＡフラグメントを用いたライゲーションによって、プラスミドｐＴＥ５１８を作製した。得られたプラスミドは、Ｒ１Ｒ２ＡＣＧＣ（これは、その後にアミノ酸ＡＣＧＣが続くＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（配列番号２５）からなる）をコードする。
【００８３】
プラスミドをまた、これらのミニトラップをＥ．ｃｏｌｉ内で発現させるように構築した。プライマーＲ１Ｒ２Ｎ−Ｎｃｏｌ（配列番号１８）およびＲ１Ｒ２ＣＮｏｔ１（配列番号１９）を使用して、親ＶＥＧＦトラップ（配列番号１０）に対してアミノ酸Ｇ３０〜Ｋ２３１をコードする、ｐＴＥ１１５由来のＤＮＡフラグメントを増幅した。この配列の増幅は、５’末端における開始メチオニンコドンの融合、および３’末端におけるシステインに対するコドンの融合（その後に終止コドンが続く）を生じた（配列番号２）。このＤＮＡフラグメントを、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＲＧ６６３のＮｃｏ Ｉ部位およびＮｏｔ Ｉ部位へクローニングしてｐＲＧ１１０２を得、これによってＲ１Ｒ２Ｃの発現は、ファージＴ７Φ１．１プロモータからの転写に依存した。ｐＲＧ１１０２からの遺伝子発現の誘導は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＲＦＪ２３８の細胞質中のＲ１Ｒ２ｃｙｓの蓄積を生じる。同様に、プライマーＲ１Ｒ２Ｎ−Ｎｃｏ１（配列番号１８）およびＲ１Ｒ２ＡＣＧＣ−Ｎｏｔ１（配列番号２０）を、アミノ酸Ｇ３０〜Ｋ２３１をコードするｐＴＥ１１５由来のＤＮＡフラグメント（配列番号１０）を増幅するために使用し、これは、５’末端における開始メチオニンコドンの融合、および３’末端におけるＡＣＧＣ（配列番号４）の融合（その後に終止コドンが続く）を生じた（配列番号５）。このフラグメントを、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＲＧ６６３のＮｃｏ Ｉ部位およびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングしてｐＲＧ１１０３を得、これによってＲ１Ｒ２ＡＣＧＣの発現は、ファージＴ７Φ１．１プロモータからの転写に依存した。ｐＲＧ１１０２およびｐＲＧ１１０３の両方からの遺伝子発現の誘導は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＲＦＪ２３８の細胞質中の、それぞれＲ１Ｒ２ＣまたはＲ１Ｒ２ＡＣＧＣの蓄積を生じた。
【００８４】
（実施例４．Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＶＥＧＦミニトラップの精製および特徴付け）
Ｒ１Ｒ２ＣおよびＲ１Ｒ２ＡＣＧＣの両方を、Ｅ．ｃｏｌｉで細胞質タンパク質として発現させ、そして上記と同じ方法で精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＲＦＪ２３８におけるｐＲＧ１１０２またはｐＲＧ１１０３のいずれかに対するＴ７Φ１．１プロモータの誘導は、細胞質への上記タンパク質の蓄積をもたらした。誘導後、細胞を遠心分離によって回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁し、そしてＮｉｒｏ−Ｓｏａｖｉ細胞ホモジナイザーを通過させることによって溶解させた。溶解した細胞から遠心分離によって封入体を回収し、蒸留Ｈ２Ｏで一度洗浄し、次いで８Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１０ｍＭ四チオン酸ナトリウム中に溶解し、室温で１６時間インキュベートした。清澄な上清を、６Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）で平衡化したＳ３００カラムで分画した。Ｒ１Ｒ２Ｃを含む画分をプールし、６Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）に対して透析した。透析したタンパク質を、２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）、２ｍＭシステインに希釈し、次いで、７日間、４℃でゆっくりと攪拌した。再度折り畳まれた（Ｒｅｆｏｌｄｅｄ）タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）に対して透析し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）で平衡化したＳＰ−セファロースカラムにロードし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）中で、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。Ｒ１Ｒ２Ｃを含む画分をプールし、濃縮し、そして５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにロードした。ミニトラップ二量体を含む画分を回収し、プールした。精製したミニトラップの分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約４６ｋＤと推定した。
【００８５】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを（ＷＯ ／００７５３１９に記載されるように）実施して、ＶＥＧＦに対するトラップ親和性を決定し、そしてその結果は、Ｒ１Ｒ２ＣミニトラップおよびＲ１Ｒ２ＡＣＧＣミニトラップが全長ＶＥＧＦトラップに匹敵するＶＥＧＦ親和性を有することを示した（表２）。
【００８６】
【表２】
（実施例５．ＣＨＯ Ｋ１におけるＶＥＧＦミニトラップの発現）
ｐＴＥ５１７およびｐＴＥ５１８によってコードされるＶＥＧＦミニトラップの発現は、ＣＨＯ細胞中で発現した場合、ヒトＣＭＶ−ＭＩＥプロモータからの転写に依存し、培養培地中へのミニトラップの分泌を生じる。ＣＨＯ Ｋ１において分泌タンパク質として発現される場合、両ミニトラップは、馴化培地中に見出され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによるその分子量の推定値は、予想したとおり、このタンパク質がグリコシル化されていることを示唆した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析はまた、このミニトラップが、Ｃ末端システイン間の分子間ジスルフィドによって安定化されたホモ二量体分子を形成し得ることを示した。具体的には、このＲ１Ｒ２Ｃミニトラップは、ＣＨＯ細胞内で分泌タンパク質として発現された場合、共有結合性二量体を効率的に形成した。
【００８７】
（実施例６．単鎖ＶＥＧＦミニトラップの構築および発現）
多量体化ドメイン（配列番号２４）を必要としないＶＥＧＦミニトラップをまた、構築した。このミニトラップを、タンデムレセプタードメイン（配列番号２４のアミノ酸２３２〜２３３）間のＧｌｙ−Ｐｒｏリンカーを用いた、１つのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（Ｒ１Ｒ２）（配列番号２４のアミノ酸３０〜２３１）の、第二のＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（Ｒ１Ｒ２）（配列番号２４のアミノ酸２３４〜４３５）への直接的融合によって構築した。
【００８８】
タンデムＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインをコードする遺伝子を構築するため、ｐＴＥ１１５中に見出されるＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインをコードするＤＮＡとのＤＮＡ相同性を最小化する、１つのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを合成した（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。この合成ＤＮＡフラグメントを、Ｓｒｆ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉフラグメントとして、ｐＴＥ１１５のＳｒｆ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位へクローニングし、ｐＴＥ５７０を得た。これは、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモータに由来するＲ１Ｒ２−Ｒ１Ｒ２ ＶＥＧＦミニトラップを発現する。このプラスミドがＣＨＯ Ｋ１細胞にトランスフェクトされる場合、このＲ１Ｒ２−Ｒ１Ｒ２ ＶＥＧＦミニトラップは、培養培地中に蓄積する。
【００８９】
（実施例７．ＶＥＧＦミニトラップの構築および発現）
上記の通り、１つのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（Ｒ１Ｒ２）（配列番号２６のアミノ酸３０〜２３１）とＣＰＰＣで終止するＣ末端の９つのアミノ酸配列との直接的融合によって、ＶＥＧＦミニトラップを構築した。このプラスミドがＣＨＯ Ｋ１細胞にトランスフェクトされる場合、配列番号２６のＶＥＧＦミニトラップは、培養培地に分泌される。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によるその後の精製ならびに未変性光散乱分析は、約６４ｋＤａの分子量を有するトラップ分子を同定した。この分子量は、共有結合性二量体が、配列番号２６の２つの融合ポリペプチドの間で形成されたことを示す。同様の実験を、配列番号２７および２８の融合ポリペプチドをコードするプラスミドを用いて実施し、そして同様に、これらの分子が、ホモ二量体トラップを形成することを示した。配列番号１０および配列番号２６の二量体からなるＥＧＦトラップへのヒトＶＥＧＦ−１６５の結合についての親和性決定を、表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦファミリーメンバーおよびスプライス改変体に特に望ましい特性で結合し得る融合ポリペプチド、ならびに治療的使用方法を包含する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
第一の局面において、本発明は、レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙを含む融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を特徴とし、ここで、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２（Ｆｌｔ１Ｄ２）であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＶＥＧＦレセプター成分Ｉｇドメイン３（Ｆｌｋ１Ｄ３）であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＶＥＧＦレセプター成分Ｉｇドメイン３（Ｆｌｔ１Ｄ３またはＲ３）であり、そしてここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上である。
【０００３】
関連する第二の局面において、本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙを含む単量体のＶＥＧＦトラップ（ＶＥＧＦ ｔｒａｐ）または融合ポリペプチドを特徴とし、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は、上記の通りである。ＶＥＧＦレセプター成分Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに直接結合されても１以上のスペーサー配列を介して結合されてもよい。１つの特定の実施形態において、上記単量体のＶＥＧＦトラップは、（Ｒ１Ｒ２）Ｘであり、Ｘは２である。より特定の実施形態において、上記単量体のＶＥＧＦトラップは、配列番号２４、またはその機能的に等価なアミノ酸改変体である。本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、それらの機能的に等価なアミノ酸改変体とから本質的になる単量体のＶＥＧＦトラップを包含する。
【０００４】
第三の局面において、本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、融合パートナー（ＦＰ）成分とを含む融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を特徴とし、その融合パートナー（ＦＰ）成分は、多量体化成分（ＭＣ）、血清タンパク質、または血清タンパク質に結合し得る分子からなる群より選択される。好ましい実施形態において、ＦＰは、別の融合ポリペプチド上の多量体化成分と相互作用して多量体構造（例えば、二量体または三量体）を形成し得る多量体化成分（ＭＣ）である。最も好ましくは、このＭＣは、（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含む多量体化成分、（ｉｉ）切断多量体化成分、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメインからなる群より選択される。本質的に（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＦＰとからなる融合ポリペプチドが、さらに包含される。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドは、本質的に（Ｒ１Ｒ２）ＸおよびＭＣからなる。
【０００５】
第四の局面において、本発明は、上記のように、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＦＰとを含む融合ポリペプチドを特徴とする。そのレセプター成分は、様々な順序（例えば、（Ｒ１Ｒ２）Ｘ−ＦＰ；（Ｒ１Ｒ２）Ｘ−ＦＰ−（Ｒ１Ｒ２）Ｘ；ＦＰ−（Ｒ２Ｒ１）Ｘなど）で並べられ得る。その融合ポリペプチドの成分は、互いに直接結合されても、スペーサー配列を介して結合されてもよい。
【０００６】
第五の局面において、本発明は、２つ以上の融合ポリペプチドの多量体を含むＶＥＧＦトラップを特徴とし、その融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＦＰとからなり、ここでＦＰ成分は、Ｃ領域を含む多量体化成分（ＭＣ）である。このＣ領域は、天然存在していても人工でもよく、その多量体化成分内の任意の点に生じ得、そして親のＭＣの切断ＭＣへの切断を可能にするように機能する。少なくとも１つの切断ＭＣを有する、２つ以上の融合ポリペプチドからなるＶＥＧＦトラップは、「切断ミニトラップ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｍｉｎｉ−ｔｒａｐ）」と称される。
【０００７】
Ｃ領域は、ＭＣにおいて、挿入、欠失または変異によって生成され得、その結果、酵素的または化学的に切断可能な部位が生成される。Ｃ領域は、任意のＭＣで、そしてそのＭＣ内の任意の位置で生成され得る；好ましくは、Ｃ領域は、全長Ｆｃドメイン、またはそのフラグメント、またはＣＨ３ドメインで生成される。Ｃ領域は、酵素（例えば、トロンビン、フィシン、ペプシン、マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）、またはプロリダーゼ）によって切断可能であるか、あるいは例えば、ギ酸またはＣｕＣｌ２によって化学的に切断可能な部位であり得る。
【０００８】
第六の関連する局面において、本発明は、切断ＶＥＧＦミニトラップを特徴とし、これは、（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分とからなる２つ以上の融合ポリペプチドを含む多量体タンパク質であり、その多量体化成分は、Ｃ領域を含む親のＭＣからの切断によって切断されたもの（ｔＭＣ）である。
【０００９】
第七の局面において、本発明は、ＶＥＧＦレセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ＭＣとからなる融合ポリペプチドを特徴とし、ここで、ＭＣは、少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列であり、ここで、その少なくとも１つのシステイン残基は、別の融合ポリペプチドのＭＣ（ｃＭＣ）に存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成し得る。好ましい実施形態において、ｃＭＣは、少なくとも１つのシステイン残基を含む、長さが１〜５０アミノ酸の間のアミノ酸配列である。より好ましい実施形態において、ｃＭＣは、少なくとも１つのアミノ酸を含む、長さが１〜１５アミノ酸のアミノ酸配列である。さらにより好ましい実施形態において、ｃＭＣは、１〜２個のシステイン残基を含む、長さが１〜１０アミノ酸のアミノ酸配列である。本発明のこの実施形態の一例は、配列番号２７に示され、この配列は、シグナル配列（１〜２６）次にＲ１（２７〜１２９）成分およびＲ２（１３０〜２３１）成分、次にシステイン残基で終わる９つのアミノ酸配列、を有する。別の実施形態において、配列番号２８に示され、シグナル配列（１〜２６）がＲ１（２７〜１２９）成分およびＲ２（１３０〜２３１）成分に続き、次にシステイン残基で終わる６つのアミノ酸配列である。
【００１０】
第八の局面において、本発明は、ＶＥＧＦミニトラップを特徴とし、これは、（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、ｃＭＣとからなる２つ以上の融合ポリペプチドを含む。より特定の実施形態において、このミニトラップは二量体である。本発明のミニトラップの実施形態の一例は、配列番号２に示される融合ポリペプチドの二量体であり、ここで、各融合ポリペプチド（Ｒ１Ｒ２−ｃＭＣ）は、２３．０ｋＤａの分子量および９．２２のｐＩを有する。
【００１１】
別の実施形態において、ｃＭＣは、２つのシステイン残基（例えば、ＸＣＸＣ（配列番号３））からなる、長さが４アミノ酸である。本発明のこの実施形態の一例において、ミニトラップは、本発明のＶＥＧＦレセプター成分と、ＡＣＧＣ（配列番号４）からなるｃＭＣとからなる。本発明のミニトラップのこの実施形態の一例は、配列番号５に示される融合ポリペプチドの二量体であり、ここで、各単量体は、２３．２ｋＤａの分子量および９．２２のｐＩを有する。本発明のこの実施形態の別の例は、配列番号２６に示され、この配列は、シグナル配列（１〜２６）次にＲ１（２７〜１２９）成分およびＲ２（１３０〜２３１）成分、次にＣＰＰＣで終わる９つのアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明のＶＥＧＦトラップのすべての実施形態（切断ＶＥＧＦミニトラップ、ＶＥＧＦミニトラップ、および単量体のＶＥＧＦミニトラップを含む）において、シグナル配列（Ｓ）は、本発明の融合ポリペプチドのはじめ（またはＮ末端）で含まれ得る。シグナル配列は、細胞、組換え体または合成体由来であり得る。シグナル配列が、第一のレセプター成分のＮ末端に結合される場合、それに従って、融合ポリペプチドは、例えば、Ｓ−（Ｒ１Ｒ２）Ｘと表され得る。
【００１３】
融合ポリペプチドの成分は、互いに直接結合しても、スペーサーを介して結合されてもよい。特定の実施形態において、融合ポリペプチドの１以上のレセプターおよび／または融合パートナー成分は、スペーサーを伴わずに互いに直接結合される。他の実施形態において、１以上のレセプターおよび／または融合パートナー成分は、スペーサーで結合される。
【００１４】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを包含し、発現コントロール配列に作動可能に結合された発現ベクターを含む。本発明はさらに、融合ポリペプチドの産生のための宿主−ベクター系を包含し、その融合ポリペプチドは、適切な宿主細胞中に発現ベクターを含み；宿主−ベクター系、ここで、適切な宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞；Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞、またはＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞である。アセチル化またはペグ化によって改変された本発明のＶＥＧＦトラップがさらに包含される。タンパク質をアセチル化またはペグ化する方法は、当該分野で周知である。
【００１５】
関連する第九の局面において、本発明は、本発明のＶＥＧＦトラップを生成する方法を特徴とし、その方法は、本発明の核酸配列を含むベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、その宿主細胞からタンパク質が発現するのに適切な条件下で培養する工程、およびそのように生成された融合ポリペプチドを回収する工程、を包含する。
【００１６】
本発明のＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦの除去、阻害、または減少によって改善、軽減または抑制される任意の疾患または状態を処置するのに治療的に有用である。ＶＥＧＦの阻害または減少によって改善される特定の状態の非完全なリストとしては、例えば、以下が挙げられる：望ましくない血漿漏出もしくは血管透過性、（例えば、腫瘍であるような）望ましくない血管の増大、炎症性障害（例えば、乾癬または関節炎）と関連する浮腫（慢性関節リウマチを含む）；喘息；熱傷に関連する全身性浮腫；腫瘍に関連する腹水および胸水、炎症または外傷；慢性気道炎症；喘息；毛細血管漏出症候群；敗血症；タンパク質の漏出増加に関連する腎臓病；膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および眼の障害（例えば、加齢性黄斑変性症および糖尿病性網膜症）。ＶＥＧＦミニトラップは、眼の障害の処置に、眼の手術（緑内障手術）に対するアジュバントとして；そして硝子体送達を介して、眼の内部の腫瘍（例えば、ブドウ膜色素細胞、網膜芽細胞腫）の処置に特に有用である。
【００１７】
従って、第十の局面において、本発明は、ＶＥＧＦ関連の疾患または状態の処置のための治療方法を特徴とし、その方法は、本発明のＶＥＧＦトラップを、ＶＥＧＦ関連の疾患または状態に苦しんでいる被験体に投与する工程を包含する。任意の哺乳動物が本発明の治療方法によって処置され得るが、その被験体は、好ましくはＶＥＧＦトラップで改善、軽減抑制または処置され得る状態または疾患に苦しんでいるかあるいはその危険性のあるヒト患者である。
【００１８】
第十一の局面において、本発明はさらに、本発明のＶＥＧＦミニトラップを用いてＶＥＧＦを検出、定量、および／またはモニタリングするための診断方法および予防方法、ならびにキットを特徴とする。
【００１９】
第十ニの局面おいて、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアとともに本発明のＶＥＧＦトラップを含む薬学的組成物を特徴とする。そのような薬学的組成物は、二量体の融合ポリペプチドトラップ、またはその融合ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。本発明のミニトラップは、より小さいサイズが望ましいことに起因して、減少した血清の半減期（例えば、より速いクリアランス）、および／または増加した組織浸透を伴うＶＥＧＦトラップの条件において特定の用途を見出す。ＶＥＧＦミニトラップについての特定の適用としては、例えば、特定の組織または細胞に対する局所投与が望ましい疾患が挙げられる。そのような状態または疾患の例は眼の疾患である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、融合パートナー（ＦＰ）とからなる融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子であって、ここでＸは１以上であり、Ｙは１以上であり、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＩｇドメイン３である、単離された核酸分子。
（項目２）
前記融合パートナー（ＦＰ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得る、多量体化成分（ＭＣ）である、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）
前記ＭＣは、以下：
（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含む多量体化成分、
（ｉｉ）切断多量体化成分、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００の間のアミノ酸配列、
（ｉｖ）ロイシンジッパー、
（ｖ）ヘリックスループモチーフ、
（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および
（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメイン
からなる群より選択される、項目２に記載の単離された核酸分子。
（項目４）
項目１〜３に記載の核酸分子によってコードされる、融合ポリペプチド。
（項目５）
配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を有する、項目４に記載の融合ポリペプチド。
（項目６）
項目１〜３に記載の核酸分子を含む形質転換宿主細胞で複製可能な発現ベクター。
（項目７）
ＶＥＧＦ融合ポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、項目６に記載の発現ベクターを適切な発現系に導入する工程、および該ＶＥＧＦ融合ポリペプチドの発現を行う工程を包含する、方法。
（項目８）
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）トラップであって、項目４に記載の融合ポリペプチドのうちの２つ以上の多量体を含む、ＶＥＧＦトラップ。
（項目９）
二量体である、項目８に記載のＶＥＧＦトラップ。
（項目１０）
配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を含む、２つの融合ポリペプチドを含む、二量体のＶＥＧＦトラップ。
（項目１１）
項目８または９に記載の融合ポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１２）
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の除去または阻害によって改善、軽減、または抑制される疾患または状態を処置する方法であって、該方法は、項目１１に記載の薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目１３）
前記疾患または状態は、眼の疾患または状態である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記眼の疾患または状態は、加齢性黄斑変性症である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分（ＭＣ）とからなる融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子であって、該多量体化成分（ＭＣ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＩｇドメイン３であり、ここで、該多量体化成分（ＭＣ）は、（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含むＭＣ、（ｉｉ）切断ＭＣ、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメインからなる群より選択される、単離された核酸分子。
（項目１６）
前記レセプター成分が、（Ｒ１Ｒ２）Ｘであり、前記多量体化成分が、少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列である、項目１５に記載の単離された核酸分子。
（項目１７）
前記レセプター成分がＲ１Ｒ２（Ｘは１）であり、前記多量体化成分が、１〜２個のシステイン残基を含む、長さが１〜１５アミノ酸のアミノ酸配列である、項目１６に記載の単離された核酸分子。
（項目１８）
項目１５〜１７に記載の核酸分子によってコードされる、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合し得る融合ポリペプチド。
（項目１９）
配列番号２６、２７または２８のアミノ酸配列を含む、項目１８に記載の融合ポリペプチド。
（項目２０）
レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分（ＭＣ）とからなる融合ポリペプチドであって、該多量体化成分（ＭＣ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、Ｒ１は、Ｆｌｔ−１の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター成分Ｉｇドメイン２であり、そしてＲ２は、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３であり、Ｒ３は、Ｆｌｔ−４のＩｇドメイン３であり、ここで、該多量体化成分（ＭＣ）は、（ｉ）切断可能領域（Ｃ領域）を含むＭＣ、（ｉｉ）切断ＭＣ、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミノ酸の間のアミノ酸配列、（ｉｖ）ロイシンジッパー、（ｖ）ヘリックスループモチーフ、（ｖｉ）コイル−コイルモチーフ、および（ｖｉｉ）免疫グロブリンドメインからなる群より選択される、融合ポリペプチド。
（項目２１）
前記レセプター成分が、（Ｒ１Ｒ２）Ｘであり、前記多量体化成分が、少なくとも１つのシステイン残基を有する、長さが１〜約２００アミン酸の間のアミノ酸配列である、項目２０に記載の融合ポリペプチド。
（項目２２）
前記レセプター成分がＲ１Ｒ２（Ｘは１）であり、前記多量体化成分が、１〜２個のシステイン残基を含む、長さが１〜１５アミノ酸のアミノ酸配列である、項目２１に記載の融合ポリペプチド。
（項目２３）
項目２０〜２２に記載の融合ポリペプチドのうちの２つからなる、二量体のＶＥＧＦトラップ。
（項目２４）
製造物品であって、
（ａ）包装材料；および
（ｂ）該包装材料内に含まれる薬学的薬剤
を含み、ここで、該薬学的薬剤は、少なくとも１つのＶＥＧＦトラップを含み、該ＶＥＧＦトラップは、レセプター成分（Ｒ１Ｒ２）Ｘまたは（Ｒ１Ｒ３）Ｙと、多量体化成分（ＭＣ）とからなり、該多量体化成分（ＭＣ）は、別のＭＣと相互作用して多量体構造を形成し得、ここで、Ｘは１以上であり、Ｙは１以上であり、そしてここで、該包装材料は、該ＶＥＧＦ特異的融合ポリペプチドがＶＥＧＦ媒介性の疾患または状態を処置するために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を備える、製造物品。
【００２０】
他の目的および利点は、以下の詳細な説明の精査から明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本方法が記載される前に、本発明は、記載された特定の方法、および記載された実験条件に制限されないこと（例えば、方法および条件は変動し得る）が理解される。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、そして制限することを目的としていないこともまた理解される。なぜなら、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲のみに限られるからである。
【００２２】
本明細書および添付された特許請求の範囲において使用される場合、文脈が明らかに他の内容を指示しない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の参考を含む。従って、例えば、「ａ ｍｅｔｈｏｄ」への言及としては、１つ以上の方法、ならびに／あるいは本明細書中に記載される型の工程および／または本開示および先の開示を読むことによって当業者に明白となる工程が挙げられる。
【００２３】
他に定義されない限りは、本明細書中で使用される、全ての技術用語および全ての科学用語は、本発明の属する分野における当業者に、通常理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および物質に対して、類似または等価である任意の方法および物質は、本発明の実施または本発明の試験において使用され得るが、好ましい方法および好ましい物質は、これから記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物は、本明細書中に、前述の刊行物に関する方法および／または物質を記載するための参考として援用される。
【００２４】
（概要）
本発明は、１つ以上の融合ポリペプチドの、単量体または多量体であり、ＶＥＧＦへの結合およびＶＥＧＦ活性の阻害が可能であるＶＥＧＦトラップを包含する。本発明の分子は、ＶＥＧＦに結合し、そしてＶＥＧＦの生物学的作用および／ならびに生理学的反応または生理学的応答を阻害する。ＶＥＧＦレセプターベースのアンタゴニスト ＶＥＧＦトラップ Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣｌ（ａ）（配列番号７〜配列番号８）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣｌ（ａ）（配列番号９〜配列番号１０）の説明については、ＰＣＴ ＷＯ／００７５３１９を参照のこと。その全体は本明細書中に参考として援用される。
【００２５】
本発明のミニトラップは、完全な大きさのトラップより小さいものであり（例えば、親トラップの１２０ｋＤに対して約５０〜６０ｋＤ）、そして本質的に、ＶＥＧＦレセプタードメイン（Ｒ１Ｒ２）Ｘ、（Ｒ１Ｒ３）Ｙ、またはこれらの組み合せ、切断領域（Ｃ領域）を含む多量体化成分（ＭＣ）である融合パートナー成分を有する親多量体化トラップの一部の切断によって；またはシステイン残基、または１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列をレセプター成分ドメインにまたはレセプター成分ドメイン間に付随することによって生成されるトラップからなる単量体のトラップを含む。特定の実施形態において、本発明のミニトラップは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で測定されたとして、約６０ｋＤ未満であり；より好ましくは、約５０ｋＤであり；さらにより好ましくは、約２０〜３０ｋＤであり；または約２５ｋＤであり、そしてＰＣＴ／ＵＳ００／１４１４２に記載される完全な大きさの親トラップに匹敵する親和性を伴ってＶＥＧＦに結合可能である。
【００２６】
（核酸構築物および発現）
本発明は、ＶＥＧＦ単独に、または多量体化ＶＥＧＦトラップに結合可能な融合ポリペプチドをコードする核酸分子の構築を提供する。本発明の上記核酸分子は、野生型Ｒ１レセプター成分、野生型Ｒ２レセプター成分、および／または野生型Ｒ３レセプター成分、あるいはこれらの機能的等価改変体をコードし得る。本発明のトラップの、Ｒ１レセプター成分、Ｒ２レセプター成分および／またはＲ３レセプター成分の、アミノ酸配列改変体はまた、コードする核酸分子において変異を作製することによって調製され得る。そのような改変体としては、例えば、Ｒ１、Ｒ２および／またはＲ３のアミノ酸配列内からのアミノ酸残基の欠失、あるいはこの配列内へのアミノ酸残基の挿入または置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせは、上記最終構築物がＶＥＧＦに結合し、そしてＶＥＧＦを阻害する能力を有するように最終構築物に到達するために行われ得る。
【００２７】
これらの核酸分子は、適切な宿主細胞内に導入された場合に融合ポリペプチドを発現し得るベクター中に挿入される。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクター中へのＤＮＡフラグメントの挿入について、当業者に公知な任意の方法は、転写／翻訳制御シグナルの制御下において、本発明の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築するために使用され得る。
【００２８】
本発明の核酸分子の発現は、第２の核酸配列によって調節され得、その結果、上記分子は、組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主において発現される。例えば、発現は、当該分野において公知である任意のプロモーター／エンハンサー要素によって制御され得る。キメラポリペプチド分子の発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、末端反復配列（Ｓｑｕｉｎｔｏら、（１９９１）Ｃｅｌｌ ６５：１−２０）；ＳＶ４０初期プロモーター領域、ＣＭＶ、Ｍ−ＭｕＬＶ、チミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列；原核細胞発現ベクター（例えば、ｂ−ラクタマーゼプロモーター、またはｔａｃプロモーター（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９８０）２４２：７４−９４もまた参照のこと）；酵母または他の真菌（例えば、Ｇａｌ
４プロモーター）、ＡＤＨ、ＰＧＫ、アルカリフォスファターゼ、およびエラスターゼＩのような遺伝子に由来する組織特異的転写制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の核酸分子を含む、細菌宿主または真核細胞宿主において複製され得る発現ベクターは、上記宿主をトランスフェクトするために使用され、そしてそれにより、本発明の上記融合ポリペプチドを生成するそのような核酸の発現を導き、このことはＶＥＧＦに結合可能なトラップを形成する。トランスフェクトされた細胞は、過渡的にまたは、好ましくは、構成的におよび持続的に、本発明のＶＥＧＦトラップを発現し得る。
【００３０】
本発明の上記トラップは、その後の、安定で、生物学的に活性なトラップの形成を可能にする任意の技術によって精製され得る。例えば、限定ではなく、上記因子は、可溶性タンパク質としてか、または封入体として細胞から回収され得、これらの因子は８Ｍ塩酸グアニジウムおよび透析によって定量的に抽出され得る（例えば、米国特許第５，６６３，３０４号を参照のこと）。上記因子をさらに精製するために、慣用的なイオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００３１】
（ＶＥＧＦレセプター成分）
上記ＶＥＧＦミニトラップの上記ＶＥＧＦレセプター成分は、Ｆｌｔ−１のＩｇドメイン２（Ｆｌｔ１Ｄ２）（Ｒ１）、Ｆｌｋ−１のＩｇドメイン３（Ｆｌｋ１Ｄ３）（Ｒ２）（Ｒ１Ｒ２共に）、ならびに／またはＲ１およびＦｌｔ−４のＩｇドメイン３（Ｆｌｔ１Ｄ３）（Ｒ３）（Ｒ１Ｒ３共に）からなる。Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−４、またはＦｌｋ−１の用語「Ｉｇドメイン」は、完全な野生型ドメインだけでなく、インタクトなドメインの機能的特徴を実質的に保持するこれらの、挿入改変体、欠失改変体、および／または置換改変体をも包含することを意図する。上述のＩｇドメインの多くの改変体が、野生型ドメインの機能的特徴と同じ機能的特徴を、実質的に保持するものとして得られ得ることは、当業者にとって容易に理解される。
【００３２】
Ｒ１、Ｒ２またはＲ３を参考して使用される用語「機能的等価物」は、野生型Ｒ１ドメイン、野生型Ｒ２ドメイン、または野生型Ｒ３ドメインと実質的に同じ特徴、すなわちＶＥＧＦに対して結合するという機能的特徴と、実質的に等価の機能的特徴を、実質的に保持する少なくとも１つの改変（例えば、欠失、付加および／または置換）を伴うＲ１ドメイン、Ｒ２ドメインまたはＲ３ドメイン包含することを意図する。Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３における種々のアミノ酸置換は、本発明の精神から逸脱することなく、ＶＥＧＦに対して結合しかつＶＥＧＦを不活性化するこれらのレセプター成分の能力に留意して行われ得ることが理解される。本発明の上記トラップの機能的特徴は、所望される特徴を測定する分野において公知の任意の適切なスクリーニングアッセイによって決定され得る。そのようなアッセイの例は、ＶＥＧＦ（Ｋｄ）についての上記トラップの結合特徴の決定、ならびにトラップリガンド複合体の解離についての半減期（Ｔ１／２）の決定を可能にする、後述の実験的な節に記載される。他のアッセイ、例えば、ＶＥＧＦに特異的に結合する能力の変化は、競合型ＶＥＧＦ結合アッセイによって測定され得る。タンパク質特性（例えば、熱的安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、または凝集傾向）の改変は、当業者に公知の方法によって測定され得る。
【００３３】
上記融合ポリペプチドの上記成分は、互いに直接連結され得るか、またはスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を介して結合され得る。一般的に、用語「スペーサー」（またはリンカー）は、１つ以上の成分ドメイン間に挿入され得る１つ以上の分子（例えば、核酸またはアミノ酸、あるいはポリエチレングリコールのような非ペプチド部分）を意味する。例えば、スペーサー配列は、操作の軽減のために、上記成分の間で対象となる所望の部位を提供するために使用され得る。スペーサーはまた、宿主細胞由来の上記融合ポリペプチドの発現の増強、立体障害の減少を提供し得、上記成分は、その最適な３次構造および／またはその標的分子との適切な相互作用を担い得る。スペーサーおよび所望のスペーサーを同定する方法は、例えば、本明細書中に参考として明確に援用されるＧｅｏｒｇｅら、（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １５：８７１−８７９を参照のこと。スペーサー配列は、レセプター成分に天然に結合する１つ以上のアミノ酸を含み得るか、または上記融合ポリペプチドの発現を増強し対象となる特定の所望される部位を与え、成分ドメインに最適な３次構造を形成させ、および／または成分とその標的分子との相互作用を増強するために使用される配列を付加し得る。１つの実施形態において、上記スペーサーは、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜２５アミノ酸の間である１つ以上の成分の間に、１つ以上のペプチド配列を含む。
【００３４】
最も特定の実施形態において、Ｒ１は、配列番号８の２７〜１２６のアミノ酸であるか、または配列番号８の１〜１２６のアミノ酸（１〜２６のシグナル配列を含む）であるか；あるいは配列番号１０の２７〜１２９のアミノ酸であるか、または配列番号１０の１〜１２９のアミノ酸（１〜２６のシグナル配列を含む）である。最も特定の実施形態において、Ｒ２は、配列番号８の１２７〜２２８のアミノ酸であるか、または配列番号１０の１３０〜２３１のアミノ酸である。最も特定の実施形態において、Ｒ３は、配列番号１３の１２７〜２２５のアミノ酸（シグナル配列を伴わない）である。例えば、Ｒ２が、上記融合ポリペプチドのＮ末端に配置される場合に、シグナル配列は、望ましく上記レセプター成分の前に位置し得る。上記多量体化成分に結合した上記レセプター成分はさらに、スペーサー成分（例えば、配列番号７の２２９〜２３１のアミノ酸のＧＰＧ配列）を含み得る。
【００３５】
（融合パートナーおよび多量体化成分）
上記融合パートナーは、上記融合ポリペプチドの機能性を増強する任意の成分である。従って、例えば、融合パートナーは、生物学的活性を増強し得るか、上記融合ポリペプチドの産生および／または回収に役立ち得るか上記融合ポリペプチドのあるいは、例えば、その血清半減期、組織透過性、免疫原性の欠如、もしくは安定性を増強することによって、薬学的特性、または、上記融合ポリペプチドの薬物動態プロフィールを増強し得る。好ましい実施形態において、上記融合パートナーは、多量体化する成分、血清タンパク質、または血清タンパク質に結合可能な分子からなる群より選択される。
【００３６】
上記融合パートナーが、血清タンパク質またはそれらのフラグメントである場合に、それは、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド（ｏｒｏｓｏｍｕｃｉｏｄ）、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、トランスフェリン、フェリチン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、ハプトグロビン、α−フェトプロテインチログロブリン、α−２−ＨＳ−糖タンパク質、β−２−糖タンパク質、ヒアルロン酸結合タンパク質、シンタキシン、Ｃ１Ｒ、Ｃ１ｑ鎖、ガレクチン３−Ｍａｃ２結合タンパク質、フィブリノゲン、ポリマーＩｇレセプター（ＰＩＧＲ）、α−２−マクログロブリン、尿素輸送タンパク質、ハプトグロビン、ＩＧＦＢＰ、マクロファージスカベンジャー（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）レセプター、フィブロネクチン、ギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）、Ｆｃ、α−１−抗キロモトリプシン（ａｎｔｉｃｈｙｒｏｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、α−１−抗トリプリン、抗トロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ｂ、β−２−ミクログロブリン、セルロプラスミン、補体成分Ｃ３または補体成分Ｃ４、ＣＩエステラーゼインヒビター、Ｃ−反応性タンパク質、シスタチンＣ、およびプロテインＣからなる群より選択される。より特定の実施形態において、融合パートナーは、α−１−ミクログロブリン、ＡＧＰ−１、オロソムコイド、α−１−酸性糖タンパク質、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、ヘモペキシン、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）、アファミン、およびハプトグロビンからなる群より選択される。融合パートナー成分の含有は、所望される場合に本発明の上記融合ポリペプチドの血清半減期を延長し得る。例えば、血清アルブミン融合ポリペプチドの例として、本明細書中にその全てが参考として詳細に援用される、米国特許第６，４２３，５１２号、同第５，８７６，９６９号、同第６，５９３，２９５号および同第６，５４８，６５３号を参照のこと。ｈＳＡは、身体全体（特に、腸成分および血液成分）に広く分布し、そして浸透圧および血漿量の維持について重要な役割を有する。それは、肝臓で徐々に除去され、そして代表的には、ヒトにおいて１４日〜２０日のインビボ半減期を有する（Ｗａｌｄｍａｎｎら、(１９７７）Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ;Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ;ｐｐ．２５５−２７５）。
【００３７】
融合パートナーが、血清タンパク質に結合可能な分子である場合に、その分子は、合成の低分子、脂質またはリポソーム、合成核酸（例えば、アプトマー）を含む核酸、ペプチド、またはオリゴ糖であり得る。上記分子はさらに、例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２、ＦｃγＲ３、ポリマーＩｇレセプター（ＰＩＧＲ）、ＳｃＦｖ、および血清タンパク質に特異的な他の抗体フラグメントのようなタンパク質であり得る。
【００３８】
上記融合パートナーが、多量体化成分（ＭＣ）である場合に、これは、高次構造（例えば、二量体、三量体など）を形成する別のＭＣと相互作用することが可能な、任意の天然の配列または任意の合成の配列である。適切なＭＣとしては、ｃ−ｊｕｎまたはｃ−ｆｏｓに由来するロイシンジッパードメインを含む、ロイシンジッパー；κ軽鎖またはλ軽鎖の、定常領域に由来する配列；へリックス−ループ−へリックスモチーフ（Ｍｕｌｌｅｒら、(１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３２:４５−４９）、コイル−コイルモチーフなどのような合成配列、または他の一般的に受容された当該分野において公知の多量体化ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記融合成分は、例えば、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＡに由来する免疫グロブリン由来ドメインを含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン由来ドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群より選択され得る。ＩｇＧのＦｃドメインは、ＩｇＧ１のアイソタイプ、ＩｇＧ２のアイソタイプ、ＩｇＧ３のアイソタイプ、およびＩｇＧ４のアイソタイプ、ならびに各アイソタイプ群内における任意のアロタイプより選択され得る。本発明のＶＥＧＦトラップの１つの例において、上記多量体化成分は、ＩｇＧ４
Ｆｃドメイン（配列番号２９）である。
【００３９】
（切断ＶＥＧＦミニトラップの生成）
本発明のトラップの１つの実施形態において、２つ以上の本発明の融合ポリペプチドを含む切断ＶＥＧＦミニトラップは、Ｃ領域含有ＭＣを有する親トラップを、１つ以上のＣ領域含有ＭＣが切断される条件に供することによって生成される。生じる切断されたミニトラップは、親トラップの、完全切断産物および部分切断産物であり得る。
【００４０】
上記Ｃ領域含有ＭＣは、別のＭＣと相互作用して高次構造（例えば、二量体、三量体）を形成することが可能な任意のＭＣであり得る。上記Ｃ領域は、ＭＣ内の任意の所望の部位に創出され得る。以下の実施例において提供される指針に照らして、当業者は得られた切断トラップの所望の特性（例えば、分子量、単量体または二量体など）に基づいてＣ領域の作製のために所望の部位を選択し得る。
【００４１】
特定の実施形態において、上記Ｃ領域は、Ｎ末端ＣＰＰＣ配列（配列番号１）に続くＦｃΔＣｌドメイン内に挿入されるトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ）（配列番号６）である。この実施形態において、完全な大きさの親ＶＥＧＦトラップ構築物は、Ｆｃタグ化タンパク質として、細胞において発現され、それゆえ、例えば、プロテインＡカラムによって、捕捉され、そして精製される。ＣＰＰＣ配列（配列番号１）のシステイン残基の１つまたは両方の間における、二量体形成および共有結合の形成に続いて、上記二量体は、１つまたは両方のＦｃΔＣ１ドメインを切断する条件下でトロンビンに曝露され、その結果、約５０ｋＤ〜９０ｋＤの分子量を有する切断二量体ミニトラップが生成され、そして上記親トラップのＶＥＧＦに対する親和性に匹敵する親和性を有する。切断の条件は、当業者によって、部分切断産物または完全切断産物の好ましい形態（特定の特性（例えば、分子量）を有する特定の産物を所望することによって選択される切断条件）に制御され得る。
【００４２】
特定の実施形態において、上記Ｃ領域は、ＣＰＰＣ配列（配列番号１）に対するＦｃΔＣ１ドメインＮ末端に挿入されるトロンビン切断部位（ＬＶＰＲＧＳ）（配列番号６）である。二量体の形成およびＣＰＰＣ配列（配列番号１）のシステイン残基の１つまたは両方の間の共有結合に続いて、上記二量体は、ＦｃΔＣ１ドメインの１つまたは両方が生じ、そして産生される切断されたミニトラップが生成される条件下でトロンビンに曝露される。従って、生成された単量体の切断されたミニトラップは、レセプター成分、およびＦｃの低分子フラグメントを含み、そして約２５ｋＤの大きさであり、切断された二量体のトラップおよび完全長の親トラップに対して、ＶＥＧＦに対する親和性の減少を示す。組換えタンパク質として生成された類似の単量体のトラップは、約１ｎＭのＫＤを有することを示した。
【００４３】
（ＶＥＧＦミニトラップの生成）
１つの実施形態において、本発明は、１つ以上のレセプター成分ドメイン（Ｒ１Ｒ２）Ｘおよび／または（Ｒ１Ｒ３）Ｙ（ここで、Ｘ≧１、Ｙ≧１、ならびにＲ１、Ｒ２、およびＲ３は上述のように定義され）、および必要に応じて、好ましくは少なくとも１つのシステイン残基（ここで、少なくとも１つのシステイン残基は、他の融合ポリペプチドのＭＣに存在するシステイン残基（ｃＭＣ）とジスルフィド結合を形成することが可能である）を有する１〜約２００アミノ酸の間の長さのアミノ酸配列の、ＭＣドメインである融合パートナーを有するＶＥＧＦミニトラップを特徴とする。上記ｃＭＣは、融合ポリペプチドの、Ｎ末端およびＣ末端、または２つのレセプター成分ドメイン間において生じ得る。１つの特定の実施形態において、システインは、ＶＥＧＦレセプター成分（例えば、Ｒ１Ｒ２Ｃ）のＣ末端に付加され、これによって上記融合ポリペプチドに、１つの融合ポリペプチドのＣ末端のシステイン残基と別の融合ポリペプチドのＣ末端のシステイン残基との間の共有ジスルフィド結合の形成を介して、共有結合二量体を形成させる。本例示において、上記ミニトラップは、配列番号２に示される上記融合ポリペプチドの二量体であり、ここで各融合ポリペプチド（Ｒ１Ｒ２−ｃＭＣまたはＲ１Ｒ２Ｃ）は、約２３．０ｋＤの分子量を有する。
【００４４】
別の実施形態において、上記ｃＭＣは、４アミノ酸の配列（ＸＸＸＸ）（配列番号１１）である（ここでＸは、任意のアミノ酸であり、そしてこの配列は少なくとも１つのシステイン残基を含むおよび任意の配列である）。特定の実施形態において、上記ｃＭＣは、レセプター成分ドメインのＣ末端に付加される。さらに特定の実施形態において、上記４アミノ酸配列は、ＡＣＧＣ（配列番号４）であり、そして上記ｃＭＣは第２の融合ポリペプチドに存在するシステイン残基と２つのジスルフィド結合を形成するｃＭＣである。以下（表２）に示すように、例示されたミニトラップの両方は、上記親トラップに匹敵するＶＥＧＦに対する親和性を示す。
【００４５】
（治療的使用）
本発明のＶＥＧＦミニトラップは、ＶＥＧＦの、除去、阻害、または減少によって、改善されるか、回復されるか、阻害されるかまたは防がれる、任意の疾患または任意の状態の処置のために治療的に有用である。ＶＥＧＦの阻害またはＶＥＧＦの減少によって改善される特定の状態の非網羅的なリストとしては、過度な血管内皮細胞増殖、血管透過性、浮腫または炎症（例えば、傷害、脳卒中または腫瘍に関連する脳浮腫）；炎症性疾患（例えば、乾癬、または関節リウマチを含む関節炎）に関連した浮腫；喘息；火傷に関連して生成される浮腫；腫瘍、炎症または外傷に関連した、腹水または胸水；慢性的気道炎症；毛細管漏出症候群；敗血症；タンパク質の漏出増加に関連する腎疾患；ならびに加齢に関連した黄斑変性症、および糖尿病性網膜症のような眼疾患によって特徴付けられる臨床状態が挙げられる。
【００４６】
本発明の組成物は、ＶＥＧＦレベルの増加に関連した多種多様な疾患の処置のために、治療的に有用である。例えば、亢進されたＴｈ２炎症および気道リモデリングは、喘息の病因において特徴的である（例えば、Ｅｌｉａｓら、（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１００１−６を参照のこと）。高められたＶＥＧＦレベルは、喘息患者由来の、組織および生物学的サンプルにおいて検出され、それは疾患の活性に直接的に相関し（Ｌｅｅら、（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１１０６−１１０８）、そして気道径および気道応答性に逆相関する。さらに、ＶＥＧＦは、喘息の組織浮腫の原因となるが推定される。
【００４７】
増加されたＶＥＧＦに関連する別の疾患は、膵臓管腺癌（ＰＤＡＣ）である。この悪性腫瘍は、しばしば病巣の内皮細胞増殖の増強を示し、そして頻繁に、ＶＥＧＦを過剰発現する（Ｆｅｒｒａｒａ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７−５４３）。ＰＤＡＣは、消化管悪性腫瘍による死亡の２０％以上の原因であり、米国および他の先進工業国における癌関連死亡率の第４番目の最も一般的な原因となっている、る。実験的証明は、膵臓癌におけるＶＥＧＦについての重要な役割を支持し、従って、ＶＥＧＦインヒビターは、膵臓内腫瘍の増殖、そして局所および遠位性の転移を減弱する治療として見込まれる。
【００４８】
Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるより低分子の、非グリコシル化ミニトラップ（実施例４）、ＣＨＯ細胞で発現されるグリコシル化ミニトラップ（実施例５）、またはレセプターベースの単量体のトラップ（実施例６）は、局所／硝子体内送達について最適化された特徴（すなわち、より速い除去のためのより短い血清半減期、および望まれない全身的曝露の最小化）を有する。さらにそのより小さい大きさに起因して、上記ミニトラップは、目における内境界膜（ＩＬＭ）を透過する能力、および硝子体を通過して網膜／網膜色素上皮（ＲＰＥ）層へ拡散する能力（網膜疾患の処置を支援する）を有する。さらに、上記ミニトラップは、眼疾患（例えば、脈絡叢新血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、角膜新血管新生／移植拒絶）の処置における局所投与のために使用され得る。なお、さらに、上記ミニトラップは、ＶＥＧＦの一過性（短期間）の遮断が必要とされる（例えば、ＶＥＧＦ遮断への長期間の曝露を避けるために）（例えば、乾癬の処置におけるように）任意の状況において使用され得る。
【００４９】
緑内障手術後の不全を招く深刻な問題は、初期の炎症および初期の血管新生、ならびに過度に活動的な創傷治癒である。従って、本発明のＶＥＧＦトラップは、緑内障手術後の、初期の血管新生および初期のリンパ管新生、ならびに胞濾過へのマクロファージの再補充を防ぐための、緑内障手術に対するアジュバントとして有用に利用され得、手術結果を改善する。
【００５０】
（組み合わせ治療）
多くの実施形態において、ＶＥＧＦトラップは、第２のＶＥＧＦトラップ分子、化学療法剤、外科手術、カテーテルデバイス、および放射線を含む１つ以上の付加的化合物または付加的治療と組み合わせて投与され得る。組み合わせ治療は、ＶＥＧＦトラップおよび１つ以上の付加的薬剤を含む単一の薬学的投薬処方物の投与；ならびにそれ自身別個の薬学的投与処方物での、ＶＥＧＦトラップおよび１つ以上の付加的薬剤の投与を包含する、を含む。例えば、ＶＥＧＦトラップおよび細胞障害剤、化学療法剤または増殖阻害剤は、単一の投薬組成物（例えば、組み合わされた処方物）中で一緒に、患者に投与され得るか、または各薬剤は別々の投与処方物において投与され得る。別々の投与処方物が使用される場合、本発明のＶＥＧＦ特異的融合ポリペプチド、および１つ以上の付加的薬剤は、同時に投与され得るか、または別々の交代的な時間、すなわち、連続して投与され得る。
【００５１】
本明細書中に使用される場合、用語「細胞障害剤」は、細胞の機能を阻害または妨害し、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。上記用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的活性毒素、あるいはこれらのフラグメント）を包含することを意図する。
【００５２】
「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）））；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メチュレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスフォラミド、トリエチレンチオホスフォラミドおよびトリメチロロメラミンを含む）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、カクチノマイシン、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、プロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグニン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、チュベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン（ａｎｃｉｔａｂｉｎｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン、カルモフール（ｃａｒｍｏｆｕｒ）、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、テストラクトン）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）例えば、アミノグルテチミド、ミトーテン、トリロスタン）；葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ））；アセグラトン（ａｃｅｇｌａｔｏｎｅ）；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリニン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトザントロン；モピダモール（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；ナイトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ポドフィリニン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２、２’、２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類（例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ））；クロラムブシル；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体。腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤もまた、この定義に含まれ、これらとしては、以下が挙げられる：抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）-イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；ならびに抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「増殖阻害剤」とは、細胞（特に癌細胞）の増殖をインビトロまたはインビボのいずれかで阻害する、化合物または組成物をいう。増殖阻害剤の例としては、（Ｓ期以外の状態において）細胞周期進行を遮断する薬剤（例えば、Ｇ１阻止およびＭ期阻止を誘導する薬剤）が挙げられる。古典的なＭ期遮断薬としては、以下が挙げられる：ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ならびにトポＩＩインヒビター（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシン。Ｇ１を阻止する以下の薬剤はまた、Ｓ期阻止にも及ぶ：例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびアラ−Ｃ。
【００５４】
（投与方法）
本発明は、処置方法を提供し、その方法は、被験体に本発明の有効量のＶＥＧＦトラップを投与する工程を包含する。好ましい局面において、上記トラップは、実質的に精製される（例えば、その効果を限定するか、または望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。上記被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００５５】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の薬剤を投与するために使用され得る：例えば、リポソーム中、微粒子中、微小カプセル中へのカプセル化、化合物を発現し得る組換え細胞、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）、レトロウイルスの一部としての核酸の構築物、または他のベクターなど。導入方法はまた、経腸的または非経口的であり得、その導入方法としては、皮内経路、筋内経路、腹腔的経路、静脈内経路、皮下経路、経鼻経路、眼内経路、および経口経路が挙げられる。上記化合物はまた、任意の便利な経路によって（例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮の内層もしくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜）からの吸収によって）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的でも局所的でもよい。投与は、急性的でも慢性的（例えば、毎日、毎週、毎月など）でも、他の薬剤と組み合わせてもよい。肺の投与もまた、例えば、吸入器または噴霧器の使用によって、およびエアロゾル化剤との処方によって、使用され得る。
【００５６】
別の実施形態において、上記活性剤は、制御放出システムまたはポンプにおいて、ベシクル、特にリポソームで送達され得る。本発明の活性剤がタンパク質をコードする核酸である別の実施形態において、その核酸は、それを、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして細胞内に至るようにそれを以下により投与することによって、インビトロで投与されてそのコードされたタンパク質の発現を促進し得る：例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、直接的な注射によって、または微粒子照射の使用によって、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でのコーティングによって、または核に入ることが公知のホメオボックス様ペプチドに結合させてそれを投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら １９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８を参照のこと）など。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして発現のために、宿主細胞ＤＮＡ内に、相同組換えによって組み入れられ得る。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物を、処置を必要としている領域に局所的に投与することが所望され得る；これは、例えば、以下によって達成され得るが、それらは限定的な方法ではない：手術の間の局所注入、局所適用によって（例えば、注射によって）、カテーテルによって、または移植物（この移植物は、多孔性物質、非多孔性物質、またはゼラチン状物質である）（膜（例えば、シアル酸（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜）、繊維、または市販の皮膚代替物を含む）によって。
【００５８】
本発明の方法を実施することに有用な組成物は、本発明の薬剤を、溶液中、懸濁液中、またはその両方に含む液体であり得る。用語「溶液／懸濁液」とは、活性剤の第一の部分が溶液中に存在し、活性剤の第２の部分が粒子状形態で液体マトリックスに懸濁して存在する、液体組成物をいう。液体組成物はまた、ゲルを含む。液体組成物は、水性でも軟膏の形態でもよい。さらに、上記組成物は、眼の中（例えば、眼と瞼との間）または結膜嚢に挿入され得る固形物品の形態をとり得、ここで、ＶＥＧＦトラップが放出される。そのような物品からの放出は、通常、涙液を介してか、または角膜それ自体に直接的にかのいずれかで、角膜に対してであり、上記固体物品は一般的に直接接触している。眼の中への移植に適切な固体物品は、一般的に、主に生体侵食性ポリマーまたは非生体侵食性ポリマーから構成される。水溶液および／または水性懸濁液は、点眼の形態であり得る。活性剤の望ましい投薬量は、既知数の点眼を眼に投与することによって測定され得る。例えば、２５μｌの点眼体積については、１〜６つの点眼の投与が、２５〜１５０μｌの組成物を送達する。
【００５９】
本発明の方法を実施するのに有用な、水性懸濁液または溶液／懸濁液は、懸濁剤として１種以上のポリマーを含有し得る。有用なポリマーとしては、水溶性ポリマー（例えば、セルロース系ポリマー）および水不溶性ポリマー（例えば、架橋されたカルボキシ含有ポリマー）が挙げられる。本発明の水性懸濁液または溶液／懸濁液は、好ましくは、粘稠性または粘膜付着性であるか、またはさらにより好ましくは、粘稠性または粘膜付着性の両方である。
【００６０】
別の実施形態において、本発明の方法を実施するのに有用な組成物は、インサイチュでゲル化可能の水性組成物である。そのような組成物は、眼または涙液との接触の際にゲル化を促進するのに効果的な濃度のゲル化剤を含有する。適切なゲル化剤としては、熱硬化性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「インサイチュでゲル化可能」は、眼または涙液との接触の際にゲルを形成する低粘度の液体を包含するだけでなく、眼への投与の際に実質的に増加した粘度またはゲル剛性を示す、より粘性な液体（例えば、半流動体）およびチキソトロープ性のゲルも包含する。
【００６１】
（診断法およびスクリーニング方法）
本発明のＶＥＧＦトラップは、診断的におよび／またはスクリーニング方法で使用され得る。例えば、上記トラップは、臨床研究の間のＶＥＧＦレベルをモニタリングして処置効力を評価するために使用され得る。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、臨床研究に入るための個体をスクリーニングして、例えば、高すぎるＶＥＧＦレベルまたは低すぎるＶＥＧＦレベルを有する個体を同定するために使用される。上記トラップは、ＶＥＧＦの局在化および活性に関する、当該分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的サンプルにおけるＶＥＧＦレベルの画像化、測定）、および診断方法などで使用され得る。
【００６２】
本発明のトラップは、存在する非結合ＶＥＧＦの量を定量するインビボおよびインビトロのスクリーニングアッセイで使用され得、例えば、ＶＥＧＦの発現を低下し得る試験薬剤を同定するスクリーニング方法で使用され得る。より一般的には、本発明のトラップは、ＶＥＧＦの定量および／または単離が所望される任意のアッセイまたはプロセスで使用され得る。
【００６３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本発明のＶＥＧＦミニトラップを含有する薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、治療有効量の１種以上のミニトラップ、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。用語「薬学的に受容可能な」とは、動物での使用について、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって認証されていることを意味するか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいい、これらと一緒に治療剤は投与され得る。そのような薬学的キャリアは、無菌性液体（例えば、水および油）であり得、これらとしては、石油からなる油、動物油、植物油または合成由来の油（例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など）が挙げられる。適切な薬学的賦形剤としては、以下が挙げられる：デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなど。所望の場合、上記組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物などの形態をとり得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００６４】
本発明のＶＥＧＦミニトラップは、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離のアミノ基で形成されている塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導された塩）、および遊離のカルボキシル基で形成されている塩（たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導された塩）が挙げられる。
【００６５】
なおさらに、本発明の方法を実施するのに有用な水性組成物は、眼に適合性のｐＨおよび重量オスモル濃度を有する。１種以上の眼に受容可能なｐＨ調整剤および／または緩衝剤は、本発明の組成物中に含まれ得、これらとしては、以下が挙げられる：酸（例えば、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩酸）；塩基（例えば、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および乳酸ナトリウム）；ならびに緩衝剤（例えば、シトレート／デキストロース、炭酸水素ナトリウムおよび塩化アンモニウム）。そのような酸、塩基、および緩衝剤は、眼に受容可能な範囲の、組成物のｐＨを維持するために必要とされる量で含有される。１種以上の眼に受容可能な塩は、上記組成物中に、その組成物の重量オスモル濃度を眼に受容可能な範囲にするのに十分な量で含有される。そのような塩としては、ナトリウムカチオン、カリウムカチオンまたはアンモニウムカチオン、および塩化物アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、炭酸水素アニオン、硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンが挙げられ得る。
【００６６】
その意図された治療的使用に効果的であるトラップの量は、本発明の記載に基づく標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、最適投薬範囲を同定するために使用され得る。一般的に、静脈内投与のために適切な投薬範囲は、一般的に、体重１ｋｇあたり約５０〜５０００μｇの活性化合物である。鼻腔内の投与のための適切な投薬範囲は、一般的に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験系から誘導された用量応答曲線から外挿され得る。
【００６７】
全身投与のために、治療有効用量は、最初にインビトロアッセイから見積もられ得る。例えば、用量は、動物モデルにおいて処方され、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成し得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量を正確に決定するために使用され得る。開始投薬量もまた、当該分野で周知の技術を使用して、インビボデータ（例えば、動物モデル）から見積もられ得る。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化し得る。
【００６８】
投薬量および投薬間隔は、個々に調整され、治療効果を維持するのに十分な、血漿レベルの化合物を提供し得る。局所的投与または選択的取り込みの場合、化合物の効率的な局所的濃度は、血漿濃度に関連し得ない。当業者は、実験を行うことなく、治療的に有効な局所投薬量を最適化し得る。
【００６９】
投与される化合物の量は、言うまでもなく、処置される被験体、その被験体の体重、苦痛の重篤度、投与様式、および主治医の判断に依存する。治療は、症状が検出可能な間、または例え症状が検出可能でない場合でも、断続的に繰り返され得る。上記治療は、単独でか、または他の薬物と組み合わせて、提供され得る。
【００７０】
（細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビトロおよびインビボにおける細胞のトランスフェクションのための、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸の使用を包含する。これらの核酸は、標的細胞および標的の生物体のトランスフェクションのため、多数の周知のベクターのいずれにも挿入され得る。これらの核酸は、上記ベクターと上記標的細胞との相互作用を介して、エキソビボおよびインビボで細胞にトランスフェクトされる。上記組成物は、治療応答を誘発するのに十分な量で（例えば、筋への注入によって）被験体に投与される。この応答を達成するのに適切な量は、「治療有効用量」または「治療有効量」として定義される。
【００７１】
別の局面において、本発明は、ヒトまたは他の動物においてＶＥＧＦレベルを低下させる方法を提供する。この方法は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程を包含する。ここで、この核酸は、上記融合ポリペプチドもしくはミニトラップをコードする核酸に作動可能に連結された誘導性プロモータを含む。ヒト疾患の処置または予防における遺伝子治療処置については、例えば、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１４９−１１５４を参照のこと。
【００７２】
（キット）
本発明はまた、製造物品を提供する。この物品は、包装材料、およびこの包装材料に梱包された薬学的薬剤を含む。ここで、この薬学的薬剤は、本発明の融合ポリペプチドの２以上からなる少なくとも１つのＶＥＧＦトラップを含有し、そして上記包装材料は、ＶＥＧＦ特異的融合ポリペプチドがＶＥＧＦ媒介性の疾患または状態を処置するために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を備える。
【００７３】
（トランスジェニック動物）
本発明は、本発明のトラップを発現するトランスジェニック非ヒト動物を包含する。トランスジェニック動物は、受精卵の雄性前核に（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイスル感染によって）核酸を導入し、その卵を偽妊娠雌養育動物（ｆｏｓｔｅｒ ａｎｉｍａｌ）内で発生させることによって作製され得る。発現ベクター内で有用な任意の調節配列もしくは他の配列が、上記トランスジェニック配列の一部を形成し得る。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作動可能に連結されて、特定細胞をその導入遺伝子の発現に導く。本発明の融合ポリペプチドもしくはミニトラップを発現するトランスジェニック非ヒト動物は、種々の用途（このような融合ポリペプチドを生成する手段としての用途が挙げられる）で有用である。さらに、上記導入遺伝子は、誘導性プロモータの制御下におくことができ、これによって上記融合ポリペプチドもしくはミニトラップの発現は、例えば、低分子の投与によって制御され得る。
【００７４】
（特定の実施形態）
以下に記載される実験において、より低分子のＶＥＧＦトラップが作製され、そしてこれらのＶＥＧＦに結合する能力が研究される。このようなミニトラップは、好ましくは、特定の用途で使用される。例えば、特定の状態もしくは疾患は、好ましくは、ＶＥＧＦトラップの全身投与によるよりもむしろ、特定の器官、組織、もしくは細胞へのＶＥＧＦトラップの局所投与によって処置され得る。本発明のミニトラップの一例において、より低分子のＶＥＧＦトラップが、Ｆｃドメインに作製された切断領域（Ｃ領域）を有する二量体化ＶＥＧＦトラップの方向性のある切断（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）によって生成された（実施例２）。切断トラップは、完全な大きさの親トラップと同等のＶＥＧＦに対する親和性、およびこの親とラップと同等の半減期を示した。実施例３〜５は、ＶＥＧＦレセプター成分および１つもしくは２つのシステイン残基からなる多量体化成分を有する融合ポリペプチドの構築を記載する。親和性測定は、非グリコシル化融合ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉにおいて発現されたこと、またはＣＨＯ細胞で発現されたグリコシル化ポリペプチドが、完全な大きさの親トラップに匹敵する、ＶＥＧＦに対する結合親和性を有したことを示した。実施例６は、（Ｒ１Ｒ２）２からなる、ＶＥＧＦに結合して阻害し得る単量体ＶＥＧＦトラップをさらに示す。実施例７は、全長トラップ（配列番号１０）に匹敵するＶＥＧＦへの高い結合親和性を示すＶＥＧＦミニトラップ（配列番号２６）の構築を記載する。
【００７５】
本発明の他の特徴は、以下の例示的実施形態の記載の過程で明らかになる。以下の実施形態は、本発明の説明のために示され、これらを限定することを意図されない。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、当業者に、本発明の方法をどのように実施しかつ使用するか、および本発明の組成物をどのように作製しかつ使用するかの完全な開示および記載を提供するために示され、そして本発明者らが本発明であるとみなすところの範囲を限定することを意図されない。
【００７７】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するための努力がなされたが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮すべきである。他に示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧もしくは大気圧付近である。
（実施例１．Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の構築）
親ＶＥＧＦトラップ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号７〜８）、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）、およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号１２〜１３）の構築は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ／００７５３１９（本明細書において、その全体が、詳細に参考として援用される）に詳細に記載されている。ＷＯ ／００７５３１９においては、ＶＥＧＦトラップをコードする核酸構築物を構築および発現する方法、ＶＥＧＦに結合するＶＥＧＦトラップを検出および測定する方法、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によってＶＥＧＦ結合の化学量論を決定する方法、および薬物動態分析もまた記載されている。
【００７８】
（実施例２．トロンビン切断二量体ＶＥＧＦミニトラップ）
ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）構築物を、ＦｃドメインのＣＰＰＣ（配列番号１）後にトロンビン切断を挿入して改変した。精製ＶＥＧＦトラップ（５μｇ）を、トロンビン（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２中で、１６時間３７℃でインキュベートした。切断コントロールタンパク質（ＣＣＰ）および親ＶＥＧＦトラップタンパク質を含んだコントロールを、トロンビンなしでインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｔｒｉｓ−グリシン ４〜２０％ゲル；５μｇタンパク質／レーン）により、正しい切断を確認した（結果は示さず）。
【００７９】
（アフィニティー決定）
親ＶＥＧＦトラップ、トロンビン切断部位を含む非切断ＶＥＧＦトラップ（「非切断ＶＥＧＦトラップ」）、切断ＶＥＧＦミニトラップ、および組み換え単量体Ｒ１Ｒ２−ｍｙｃ ｍｙｃ ｈｉｓについて、各ＶＥＧＦトラップのｈＶＥＧＦ１６５への結合のＫｄを、ＷＯ ／００７５３１９に記載されるように決定した。より具体的には、ＶＥＧＦ１６５依存性レセプターリン酸化をブロックするこれらのトラップの能力を、初代ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて決定した。ＶＥＧＦ１６５を、種々の濃度の試験トラップの存在下でインキュベートし、その混合物にＨＵＶＥＣを添加して、ＶＥＧＦＲ２のチロシンリン酸化を刺激した。不足当量濃度のＶＥＧＦトラップにおいて、非結合ＶＥＧＦは、レセプターリン酸化を誘導した。しかし、ＶＥＧＦトラップ対リガンドの１：１モル比もしくはより大きいモル比（１：１ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｇｒｅａｔｅｒ）では、レセプターシグナル伝達の完全なブロックが観察され、このことは、トラップ二量体の単一分子が、ヒトＶＥＧＦ１６５の単一分子をブロックし得ることを証明した。したがって、ＶＥＧＦトラップのＶＥＧＦに対する高結合親和性は、ＶＥＧＦの細胞表面レセプターとの相互作用を妨げる複合体の形成を生じる。同等の結果が、親ＶＥＧＦトラップ、非切断ＶＥＧＦトラップ、および切断ＶＥＧＦミニトラップについての、同じリン酸化阻害実験に関して得られた。この結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
（実施例３．ＶＥＧＦミニトラップをコードするプラスミドの構築）
ＶＥＧＦミニトラップを、親ＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）の前駆体から構築した。ここで、３つのアミノ酸、グリシン−アラニン−プロリンは、Ｆｌｋ１ Ｄ３とＦｃΔＣ１（ａ）との間のリンカーとして作用した。このプラスミド、ｐＴＥ１１５を、ＶＥＧＦミニトラップの構築に使用した。なぜなら、このリンカーＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦトラップの操作を容易にするＳｒｆ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むからである。他の全ての点で、ｐＴＥ１１５によってコードされるＶＥＧＦトラップは、ＰＣＴ出願ＷＯ ／００７５３１９に詳細に記載されるＶＥＧＦトラップ、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号９〜１０）と同一である。
【００８１】
２つのＶＥＧＦミニトラップを、レセプター成分Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３のＣ末端に付加された単一のシステイン残基（Ｒ１Ｒ２Ｃ）（配列番号２）またはアミノ酸ＡＣＧＣ（配列番号４）（Ｒ１Ｒ２ＡＣＧＣ）（配列番号５）のいずれかからなる、多量体化ドメインを用いて構築した。これらの構築物の両方とも、１つの（Ｒ１Ｒ２Ｃ）または２つの（Ｒ１Ｒ２ＡＣＧＣ）分子間ジスルフィドによって安定化されたホモ二量体分子を形成し得る。
【００８２】
ｐＴＥ１１５ ＤＮＡのＳｒｆ ＩおよびＮｏｔ Ｉでの消化によって生成した６９０ｂｐフラグメントを除去し、そしてオリゴＲ１Ｒ２ＮＣ（配列番号１４）およびＲ１Ｒ２ＣＣ（配列番号１５）をアニーリングすることによって形成された合成ＤＮＡフラグメントを挿入することによって、プラスミドｐＴＥ５１７を作製した。得られたプラスミドは、Ｒ１Ｒ２Ｃ（これは、その後にシステイン残基が続くＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（配列番号２３）からなる）をコードする。同様に、ｐＴＥ１１５ ＤＮＡのＳｒｆ
ＩおよびＮｏｔ Ｉでの消化によって生成された６９０ｂｐフラグメントを除去し、続いてオリゴＲ１Ｒ２ＮＡＣＧＣ（配列番号１６）およびＲ１Ｒ２ＣＡＣＧＣ（配列番号１７）をアニーリングすることによって形成された合成ＤＮＡフラグメントを用いたライゲーションによって、プラスミドｐＴＥ５１８を作製した。得られたプラスミドは、Ｒ１Ｒ２ＡＣＧＣ（これは、その後にアミノ酸ＡＣＧＣが続くＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（配列番号２５）からなる）をコードする。
【００８３】
プラスミドをまた、これらのミニトラップをＥ．ｃｏｌｉ内で発現させるように構築した。プライマーＲ１Ｒ２Ｎ−Ｎｃｏｌ（配列番号１８）およびＲ１Ｒ２ＣＮｏｔ１（配列番号１９）を使用して、親ＶＥＧＦトラップ（配列番号１０）に対してアミノ酸Ｇ３０〜Ｋ２３１をコードする、ｐＴＥ１１５由来のＤＮＡフラグメントを増幅した。この配列の増幅は、５’末端における開始メチオニンコドンの融合、および３’末端におけるシステインに対するコドンの融合（その後に終止コドンが続く）を生じた（配列番号２）。このＤＮＡフラグメントを、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＲＧ６６３のＮｃｏ Ｉ部位およびＮｏｔ Ｉ部位へクローニングしてｐＲＧ１１０２を得、これによってＲ１Ｒ２Ｃの発現は、ファージＴ７Φ１．１プロモータからの転写に依存した。ｐＲＧ１１０２からの遺伝子発現の誘導は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＲＦＪ２３８の細胞質中のＲ１Ｒ２ｃｙｓの蓄積を生じる。同様に、プライマーＲ１Ｒ２Ｎ−Ｎｃｏ１（配列番号１８）およびＲ１Ｒ２ＡＣＧＣ−Ｎｏｔ１（配列番号２０）を、アミノ酸Ｇ３０〜Ｋ２３１をコードするｐＴＥ１１５由来のＤＮＡフラグメント（配列番号１０）を増幅するために使用し、これは、５’末端における開始メチオニンコドンの融合、および３’末端におけるＡＣＧＣ（配列番号４）の融合（その後に終止コドンが続く）を生じた（配列番号５）。このフラグメントを、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＲＧ６６３のＮｃｏ Ｉ部位およびＮｏｔ Ｉ部位にクローニングしてｐＲＧ１１０３を得、これによってＲ１Ｒ２ＡＣＧＣの発現は、ファージＴ７Φ１．１プロモータからの転写に依存した。ｐＲＧ１１０２およびｐＲＧ１１０３の両方からの遺伝子発現の誘導は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株ＲＦＪ２３８の細胞質中の、それぞれＲ１Ｒ２ＣまたはＲ１Ｒ２ＡＣＧＣの蓄積を生じた。
【００８４】
（実施例４．Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＶＥＧＦミニトラップの精製および特徴付け）
Ｒ１Ｒ２ＣおよびＲ１Ｒ２ＡＣＧＣの両方を、Ｅ．ｃｏｌｉで細胞質タンパク質として発現させ、そして上記と同じ方法で精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＲＦＪ２３８におけるｐＲＧ１１０２またはｐＲＧ１１０３のいずれかに対するＴ７Φ１．１プロモータの誘導は、細胞質への上記タンパク質の蓄積をもたらした。誘導後、細胞を遠心分離によって回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁し、そしてＮｉｒｏ−Ｓｏａｖｉ細胞ホモジナイザーを通過させることによって溶解させた。溶解した細胞から遠心分離によって封入体を回収し、蒸留Ｈ２Ｏで一度洗浄し、次いで８Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１０ｍＭ四チオン酸ナトリウム中に溶解し、室温で１６時間インキュベートした。清澄な上清を、６Ｍグアニジウム−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）で平衡化したＳ３００カラムで分画した。Ｒ１Ｒ２Ｃを含む画分をプールし、６Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）に対して透析した。透析したタンパク質を、２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）、２ｍＭシステインに希釈し、次いで、７日間、４℃でゆっくりと攪拌した。再度折り畳まれた（Ｒｅｆｏｌｄｅｄ）タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）に対して透析し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）で平衡化したＳＰ−セファロースカラムにロードし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）中で、０〜１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。Ｒ１Ｒ２Ｃを含む画分をプールし、濃縮し、そして５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムにロードした。ミニトラップ二量体を含む画分を回収し、プールした。精製したミニトラップの分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約４６ｋＤと推定した。
【００８５】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイを（ＷＯ ／００７５３１９に記載されるように）実施して、ＶＥＧＦに対するトラップ親和性を決定し、そしてその結果は、Ｒ１Ｒ２ＣミニトラップおよびＲ１Ｒ２ＡＣＧＣミニトラップが全長ＶＥＧＦトラップに匹敵するＶＥＧＦ親和性を有することを示した（表２）。
【００８６】
【表２】
（実施例５．ＣＨＯ Ｋ１におけるＶＥＧＦミニトラップの発現）
ｐＴＥ５１７およびｐＴＥ５１８によってコードされるＶＥＧＦミニトラップの発現は、ＣＨＯ細胞中で発現した場合、ヒトＣＭＶ−ＭＩＥプロモータからの転写に依存し、培養培地中へのミニトラップの分泌を生じる。ＣＨＯ Ｋ１において分泌タンパク質として発現される場合、両ミニトラップは、馴化培地中に見出され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによるその分子量の推定値は、予想したとおり、このタンパク質がグリコシル化されていることを示唆した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析はまた、このミニトラップが、Ｃ末端システイン間の分子間ジスルフィドによって安定化されたホモ二量体分子を形成し得ることを示した。具体的には、このＲ１Ｒ２Ｃミニトラップは、ＣＨＯ細胞内で分泌タンパク質として発現された場合、共有結合性二量体を効率的に形成した。
【００８７】
（実施例６．単鎖ＶＥＧＦミニトラップの構築および発現）
多量体化ドメイン（配列番号２４）を必要としないＶＥＧＦミニトラップをまた、構築した。このミニトラップを、タンデムレセプタードメイン（配列番号２４のアミノ酸２３２〜２３３）間のＧｌｙ−Ｐｒｏリンカーを用いた、１つのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（Ｒ１Ｒ２）（配列番号２４のアミノ酸３０〜２３１）の、第二のＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（Ｒ１Ｒ２）（配列番号２４のアミノ酸２３４〜４３５）への直接的融合によって構築した。
【００８８】
タンデムＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインをコードする遺伝子を構築するため、ｐＴＥ１１５中に見出されるＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインをコードするＤＮＡとのＤＮＡ相同性を最小化する、１つのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを合成した（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。この合成ＤＮＡフラグメントを、Ｓｒｆ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉフラグメントとして、ｐＴＥ１１５のＳｒｆ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位へクローニングし、ｐＴＥ５７０を得た。これは、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモータに由来するＲ１Ｒ２−Ｒ１Ｒ２ ＶＥＧＦミニトラップを発現する。このプラスミドがＣＨＯ Ｋ１細胞にトランスフェクトされる場合、このＲ１Ｒ２−Ｒ１Ｒ２ ＶＥＧＦミニトラップは、培養培地中に蓄積する。
【００８９】
（実施例７．ＶＥＧＦミニトラップの構築および発現）
上記の通り、１つのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３ドメイン（Ｒ１Ｒ２）（配列番号２６のアミノ酸３０〜２３１）とＣＰＰＣで終止するＣ末端の９つのアミノ酸配列との直接的融合によって、ＶＥＧＦミニトラップを構築した。このプラスミドがＣＨＯ Ｋ１細胞にトランスフェクトされる場合、配列番号２６のＶＥＧＦミニトラップは、培養培地に分泌される。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によるその後の精製ならびに未変性光散乱分析は、約６４ｋＤａの分子量を有するトラップ分子を同定した。この分子量は、共有結合性二量体が、配列番号２６の２つの融合ポリペプチドの間で形成されたことを示す。同様の実験を、配列番号２７および２８の融合ポリペプチドをコードするプラスミドを用いて実施し、そして同様に、これらの分子が、ホモ二量体トラップを形成することを示した。配列番号１０および配列番号２６の二量体からなるＥＧＦトラップへのヒトＶＥＧＦ−１６５の結合についての親和性決定を、表３に示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【公開番号】特開２０１０−２４６５５７（Ｐ２０１０−２４６５５７Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４２１０７（Ｐ２０１０−１４２１０７）
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【分割の表示】特願２００６−５１７８０６（Ｐ２００６−５１７８０６）の分割
【原出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【分割の表示】特願２００６−５１７８０６（Ｐ２００６−５１７８０６）の分割
【原出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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