ｍＴＯＲシグナル伝達を調節する組成物および方法
本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の処置、改善、および診断のためのｍＴＯＲシグナル伝達経路のアンタゴニストおよびその構成メンバー（例、ＭＡＰＫＡＰのアンタゴニスト）の使用に関する。また、本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の処置、改善、および診断のためのｍＴＯＲのモジュレーター（例、ＭＡＰＫＡＰのモジュレーター）を使用する方法に関する。また、ｍＴＯＲ、ＭＡＰＫＡＰ、およびｈＶＰＳ３４のモジュレーターの同定のためのアッセイ法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞増殖は、栄養素利用能、増殖因子（例えば、インスリン、ＩＧＦ）利用能、および細胞のエネルギー状態など、種々の因子に起因し得る。ｍＴＯＲ（mammalian Target Of Rapamycin；ラパマイシンの哺乳動物標的）シグナル伝達経路は、３つのインプットすべてを統合して細胞増殖を制御し、細胞内および細胞間両方のシグナル伝達メカニズムとして活性を発揮し得る。すなわち、ＴＯＲはそれが存在する細胞の増殖を制御するのみならず、距離的に離れて存在する細胞の増殖にも影響し、それによって組織全体（および生物体）の大きさに影響を与える能力を保有する。
【背景技術】
【０００２】
ｍＴＯＲ１およびｍＴＯＲ２は、当初、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）中に同定された一対のセリン／トレオニン・キナーゼの哺乳動物オルソログである。ｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ、ｍＬＳＴ８（ＧβＬとしても知られる）、およびＲＡＰＴＯＲ（ＫＯＧ１の哺乳動物オルソログ、または「グロース−１のコントローラー」）は、酵母の種類に関連して構造的に保存され、翻訳、転写、栄養素輸送、リボソーム生合成、および栄養素利用能に応答する自己貪食を経由して、細胞増殖の調節に関係する（Martin et al. (2005) Curr. Opinion in Cell Bio. 17: 158）。
【０００３】
ｍＬＳＴ８／ＧβＬ、ＲＡＰＴＯＲ、およびｍＴＯＲは、栄養素−感受性複合体ｍＴＯＲＣ１を含んでなり、ｍＬＳＴ８／ＧβＬは異なる栄養条件下でｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲの安定性を調整する；ＧβＬはｍＴＯＲのキナーゼドメインに結合し、ＲＡＰＴＯＲとｍＴＯＲとの相互作用を安定化する（Kim et al. (2003) Mol. Cell 11(4):895）。ＲＡＰＴＯＲはｍＴＯＲの正の制御因子であり、下流エフェクターＳ６Ｋ１（Ｓ６キナーゼ１）への栄養素−刺激シグナル伝達、細胞サイズの維持、およびｍＴＯＲタンパク質発現において役割を演じている。栄養素欠乏およびミトコンドリア脱共役などの経路を抑制する条件は、ｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲ会合を安定化し、ｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害する。
【０００４】
ホスホノイノシチド３−キナーゼ（以下、ＰＩ３Ｋ）は、ホスホイノシチド（ＰＩ）のイノシトール環の３−ヒドロキシル位置をリン酸化する酵素であり、多様な細胞事象、例えば、細胞移動、細胞増殖、発癌性形質転換、細胞生存、シグナル伝達、およびタンパク質の細胞内往来に関与している。酵母においては、ＶＰＳ３４遺伝子産物が分泌経路から液胞へのタンパク質の活発な移転を仲介するＰＩ３キナーゼであり、哺乳動物は３種のＰＩ３Ｋを含むＰＩ３キナーゼの対応するファミリーを有し、そこには種々のイソ型およびタイプを含む。ＶＰＳ３４の最も近いヒトの同族体はＰＩ３Ｋクラス３（ＰＩ３ＫＣ３）（本明細書ではヒトＶＰＳ３４について「ｈＶＰＳ３４」ともいう）と呼称される８８７残基のタンパク質であり、このものは当該酵母タンパク質とその全長にわたって、約３７％の配列同一性を共有する（Volinia et al. (1995) EMBO J. 14(14): 3339）。
【０００５】
栄養素感受性ＴＯＲ経路およびＩＧＦ−ＰＩ３Ｋ（増殖因子）シグナル伝達経路は機能的に繋がっており、クロストークしていることが知られている。ｍＴＯＲはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴのシグナル伝達経路の下流メディエーターである；分裂促進因子はホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介してｍＴＯＲ経路を活性化する。ある種の疾患状態において、活性化されたｍＴＯＲ経路は病理学的シグナル伝達カスケードの一部、例えば、異常増殖と特定癌細胞の生存に関わる経路である。
【０００６】
しかし、これらの経路が互いに相互作用する様式を理解することは、未だ満たされていない必要性を表し、共有される結合因子を同定することは、例えば、ｍＴＯＲシグナル伝達（例えば、栄養素誘発ｍＴＯＲシグナル伝達）と関連する障害の処置を進歩させる一助となろう。さらに、例えば、構成する経路タンパク質メンバーおよびそれらの結合因子／相互作用因子を調節することによるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲを調節する方法の発見は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害および他の関連する悪性腫瘍の診断、その症候の改善、その予防、およびその処置に有用となろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はｍＴＯＲアンタゴニストの使用による、異常ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）の診断、その症候の改善、その予防、およびその関連する障害の処置に関する。その例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡインヒビターなど、ＭＡＰＫＡＰのインヒビターの投与により、異常なｍＴＯＲシグナル伝達に関連する障害（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）を処置する方法である。異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達は、例えば、栄養素輸送体の過剰発現として顕在化し得る。
【０００８】
本発明はまたＭＡＰＫＡＰアンタゴニストにも関し、ＭＡＰＫＡＰが（その異なるイソ型において）ｍＴＯＰ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のメンバーに結合し、複合体を形成することを防止することの可能な作用物質を含む（それらの置換基経路メンバーを含む）。ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡインヒビターを含む。
【０００９】
本発明はさらにｍＴＯＲおよびその関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボまたはインビトロでこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強する、またはそれに干渉する作用物質を同定するために、また結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００１０】
本発明はさらにｈＶＰＳ３４（ＰＩ３ＫＣ３）およびその関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボまたはインビトロでこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強する、またはそれに干渉する作用物質を同定するために、また結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００１１】
本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置するための化合物または他の作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ｍＴＯＲ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ｍＴＯＲ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該作用物質不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【００１２】
本発明は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置するための化合物または他の作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）；ii）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該化合物不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合の、異なる抗−ＭＡＰＫＡＰsiＲＮＡを形質移入したヒーラ細胞中のＭＡＰＫＡＰ ＲＮＡレベル（ＭＡＰＫＡＰの２つのイソ型）を示す。細胞は、本明細書に記載したように、siＲＮＡおよび対照（未形質移入細胞およびスクランブル対照細胞）で３０時間形質移入し、次いで、タックマン（TaqMan）で加工処理した。
【００１４】
【図２】図２は抗−ＭＡＰＫＡＰsiＲＮＡ配列、栄養素、およびインスリンの組み合わせで形質移入したヒーラ細胞における、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路においてのタンパク質の存在または不存在を証明するウエスタンブロットを示す。該ブロットは抗−ＭＡＰＫＡＰsiＲＮＡ配列が栄養素誘発ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害し得るが、インスリン誘発ｍＴＯＲシグナル伝達は阻害しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の発明は、記載した特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されるものではなく、それらが変り得るものであることが予測される。理解すべきことは、本明細書にて使用する用語法は特定の態様のみを記載することを目的とするものであり、如何なる方法でも本発明の範囲を限定することを意図するものではないことである。
【００１６】
他に特に定義しない限り、本明細書にて使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が共通に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と同様のまたは等価の方法および材料はいずれも本発明の実施または試験に使用し得るが、その好適な方法、装置および材料をここで記載する。本明細書に言及する公表文献はすべて、本発明と関連して使用し得る公表文献に報告されている材料と方法論を記載および開示することを目的として、参照により本明細書の一部とする。
【００１７】
本発明を実施するに際しては、多くの分子生物学の常套の技法が使用される。これらの技法は周知のものであり、例えば、以下の文献に解説がある： Harlow, E. and Lane, eds., 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); および Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (それぞれ、Wu and Grossman, and Wu, eds.)。
【００１８】
本明細書の記載において、用語「処置」は防止または予防の処置ならびに治癒または疾患抑制処置の両方を含み、アポトーシス関連障害のリスクのある患者ならびに病気の患者をも含む。この用語はさらに疾患進行の遅延のための処置をも含む。
【００１９】
例えば、患者（例えば、癌）の異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連シグナル伝達と関連する障害を「抑制および／または回復」するとは、本出願人は、当該症状を抑止するか、または以前よりもしくは処置しないときよりも当該症状を和らげることを意味する。
【００２０】
本明細書にて使用する、「調節する」とは、直接的または間接的に制御するか、または影響を与える能力をいい、非限定的例としては、別意として、阻害または刺激すること、苦痛を与えることまたは拮抗すること、妨害または促進すること、および強化または弱体化することを意味し得る。
【００２１】
本明細書にて使用する、「治癒」とは、患者における異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連シグナル伝達と関連する障害、またはその進行中のエピソードを、処置により、寛解に導くことを意味する。
【００２２】
用語「予防」または「防止」とは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の発症または再発を妨害することを意味する。
【００２３】
「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達（例えば、癌および他の関連悪性腫瘍）」、「ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達関連障害」、「ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害」、「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達関連障害」、およびすべての同様に使用される用語は、限定されるものではないが、癌、移植関連障害（例えば、拒絶反応率、移植片対宿主反応などの低下）、筋肉硬化症（ＭＳ）、関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、および他の免疫抑制障害、代謝性障害（例えば、糖尿病）、血管障害後の動脈内膜肥厚の低下、およびミスフォールディングタンパク質障害（例えば、アルツハイマー病、ゴーシェ病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症、黄斑変性、色素性網膜炎、およびプリオン障害）（ｍＴＯＲ阻害がミスフォールディングタンパク質凝集の影響を寛解し得る場合）を含む。病理学的ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードと関連する癌の一覧は、限定されるものではないが、乳癌、腎臓細胞癌腫、および前立腺癌である。この一覧はまたアミノ酸輸送体（例えば、ＬＡＴＩ）の過剰発現と関連する癌および腫瘍、またはＰＴＥＮ、ＴＳＣ１／１、またはＰＩ３ＫクラスＡの突然変異を抱える癌よび腫瘍をも含む。
【００２４】
また、「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達に関連する障害」の一覧は、過誤腫症候群、例えば、結節性硬化症およびカウデン（Cowden）病（カウデン症候群および多発性過誤腫症候群ともいう）も含む。過誤腫は新生物に類似する病巣奇形であり、患部に通常生じる成熟細胞と組織の過増殖からなる。
【００２５】
また、「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達に関連する障害」の一覧は、遺伝的筋肉障害およびミオパシー、例えば、ヒト筋細管ミオパシーをも含む。この障害はホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩ（３）Ｐ）を脱リン酸化するホスファターゼ・ミオチューブラリン（筋肉細胞分化に必要なタンパク質チロシンホスファターゼ）の能力の低下を特徴とする。ホスファチジルイノシトール３−リン酸は、下記に検討するように、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によるＰＩのリン酸化の産物であり、多くの遺伝的筋肉障害およびミオパシーにおいて標的とするｈＶＰＳ３４は、ＰＩ（３）Ｐのレベルを治療的に低下させ得る。
【００２６】
本明細書にて使用する、「癌」という用語は、固形哺乳動物腫瘍ならびに血液学的悪性腫瘍を含む。「固形哺乳動物腫瘍」は、頭頚部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆管系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、睾丸、婦人科器官、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚中枢神経系の癌；柔組織および骨の肉腫；および皮膚および眼内起源のメラノーマなどを含む。「血液学的悪性腫瘍」という用語は、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚起源のリンパ腫、急性および慢性の白血病、血小板細胞新生物およびＡＩＤＳ関連癌を含む。さらに、一次、転移、および再発癌など、進行中のいずれかの段階での癌を処理し得る。多くのタイプの癌に関する情報は、例えば、米国癌学会、または例えば、文献（Wilson et al. (1991) Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Edition, McGraw-Hill, Inc.）に見ることができる。ヒトおよび獣医学両方の使用が考慮される。
【００２７】
本明細書にて使用する、「正常哺乳動物細胞」および「正常動物細胞」という用語は、正常な増殖制御メカニズム（例えば、遺伝子制御）のもとで増殖し、正常の細胞分化を表示する細胞と定義する。癌細胞はその増殖パターンが正常細胞と異なり、またその細胞表面の性質も異なる。例えば、癌細胞は近傍に関係なく、連続的に無秩序に増殖する傾向があり、とりわけ、それが当該分野でよく知られた特徴である。
【００２８】
本明細書にて使用する、「阻害性核酸」という用語は、遺伝子発現の遺伝子特異的阻害を生じ得る核酸化合物をいう。典型的な阻害性核酸は、限定されるものではないが、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび短鎖阻害性ＲＮＡ（siＲＮＡ）などである。例えば、ヌクレオチド配列の知識は、ｍＴＯＲ経路タンパク質（その類似体または変異体を含む）の発現またはその結合剤／相互作用因子の発現を強力に阻害するsiＲＮＡまたはアンチセンス分子を設計するために使用し得る。同様に、リボザイムは遺伝子の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを切断するように合成し得る。遺伝子発現の標的化阻害に使用するかかる分子の設計技術は、当業者に周知である。
【００２９】
本明細書にて使用する、「治癒する」とは、例えば、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、またはその進行中のエピソードを、その処置を経由して、寛解に導くことを意味する。
【００３０】
用語「予防」または「防止」とは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の発症または再発を妨害することを意味する。
【００３１】
本明細書にて使用する、「進行の遅延」とは、患者（例えば、癌）におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害の前段階または初期において、患者にモジュレーター（例えば、ｍＴＯＲアンタゴニスト）を投与すると、モジュレーターを投与しなかった場合の疾患の進展に比べて、さらに疾患が進展するのを防止するか、または疾患の進展を減速することを意味する。
【００３２】
本明細書にて使用する、「低有機分子」または「低分子」とは、分子量が３キロダルトン未満、好ましくは１.５キロダルトン未満の有機化合物（または無機化合物（例えば、金属）と複合体形成した有機化合物）である。
【００３３】
本明細書にて使用する、「レポーター」遺伝子は、「マーカー遺伝子」と互換性あるものとして使用し、容易に検出し得る核酸であるか、および／またはルシフェラーゼなどの容易に検出可能な遺伝子産物をエンコードする核酸である。
【００３４】
転写および翻訳制御配列はＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどであり、これらが宿主細胞においてコーディング配列の発現を規定する。真核細胞においては、ポリアデニル化シグナルが制御配列である。
【００３５】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする目的上、プロモーター配列はその３’末端で転写開始部位により結合し、上流（５’方向）に伸張してバックグランドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最少数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより簡便に定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００３６】
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写する際に、細胞中で転写および翻訳制御配列の「制御下」にあり、このｍＲＮＡが次いでトランス−ＲＮＡにスプライスされ、コーディング配列によりエンコードされたタンパク質に翻訳される。
【００３７】
「医薬的に許容される」という文言は、生理学的に寛容であり、ヒトに投与したときに、アレルギー性または同様の不都合な反応、例えば、胃の不調、めまいなどを典型的に生じない分子実体および組成物をいう。好ましくは、本明細書にて使用する、「医薬的に許容される」という用語は、連邦の監督官庁もしくは州政府が認可したもの、または合衆国薬局方もしくは他の一般に認知された動物用、とりわけヒト用の薬局方に掲載されたものを意味する。
【００３８】
「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、添加剤、または媒体であって、それと共に化合物を投与するものをいう。かかる医薬的担体は、無菌の液体、例えば、水および油など、石油系、動物系、植物系または合成起源のものを含み、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水または水溶液、食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が担体として、特に、注射用溶液として好ましく使用される。適切な医薬用担体については、文献（“Remington’s Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin）に記載されている。
【００３９】
「治療的有効量」および「有効量」とは、宿主の活性、機能および応答における臨床的に有意な欠損を少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント低下させ、そして最も好ましくはその欠損を防止するために十分な量を意味するために、本明細書では使用する。あるいは、治療的有効量は、宿主において臨床的に有意な症状／症候の改善を惹起するに十分な量である。
【００４０】
「作用物質」とは、医薬用および診断用組成物を調製するために使用し得るすべての物質、または化合物、核酸、ポリペプチド、フラグメント、イソ型、変異体、もしくはそのような目的に使用し得る他の物質であり得るすべての物質をいい、すべて本発明に基づくものである。
【００４１】
本明細書にて使用する、「類似体」とは、本発明の所望の活性および治療効果を有する化合物、ヌクレオチド、タンパク質もしくはポリペプチドまたは化合物と類似のもしくは同一の活性または機能（例えば、腫瘍増殖の阻害）を有する低有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドをいうが、必ずしも好適な態様の配列または構造に類似するか、または一致する配列または構造を含む必要はない。
【００４２】
「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加の導入により変化させた親のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質またはポリペプチド、またはヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加の導入により修飾した核酸またはヌクレオチドなどのいずれかの化合物をいう。誘導体核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドは、親のポリペプチドと類似のまたは同一の機能を有する。
【００４３】
「インヒビター」または「アンタゴニスト」とは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路機能についてのインビトロまたはインビボアッセイを用いて同定した阻害性分子をいう。インヒビターおよびアンタゴニストは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を介して起こるシグナル伝達を低下させる作用物質をいう。インヒビターはこの経路を介してシグナル伝達を低下、遮断、または防止するか、および／またはｍＴＯＲＣ１または関連複合体などのタンパク質複合体の形成を防止する作用物質であってもよい。
【００４４】
本明細書にて使用する、「癌」という用語は、固形哺乳動物腫瘍ならびに血液学的悪性腫瘍を含む。「固形哺乳動物腫瘍」は、頭頚部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆管系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、睾丸、婦人科器官、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚、脳を含む中枢神経系の癌；柔組織および骨の肉腫；および皮膚および眼内起源のメラノーマなどを含む。「血液学的悪性腫瘍」という用語は、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚起源のリンパ腫、急性および慢性の白血病、血小板細胞新生物およびＡＩＤＳ関連癌を含む。さらに、原発性、転移、および再発癌など、進行中のいずれかの段階での癌を処理し得る。多くのタイプの癌に関する情報は、例えば、米国癌学会、または例えば、文献（Wilson et al. (1991) Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Edition, McGraw-Hill, Inc.）に見ることができる。
【００４５】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」のそれぞれは、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれを含むヌクレオチドを意味する。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、さらに以下に詳述するように、修飾ヌクレオチド、または代用の置換部分をもいい得ると理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、オリゴヌクレオチドの塩基対合の性質を実質的に変化させることなく他の部分と置き換え得ること、かかるオリゴヌクレオチドがかかる置き換え部分を担持するヌクレオチドを含んでなることを周知している。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含んでなるヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドと置き換え得る。かかる置き換え部分を含んでなる配列は本発明の態様である。
【００４６】
本明細書にて使用する、「標的配列」はＭＡＰＫＡＰ遺伝子の転写に際して形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の相接する部分をいい、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む。
【００４７】
本明細書にて使用する、「配列を含んでなる鎖」とは、標準的ヌクレオチド命名法を参照しての配列により記載されるヌクレオチドの鎖を含んでなるオリゴヌクレオチドをいう。
【００４８】
本明細書にて使用する、特に断りのない限り、用語「相補性」とは、第二のヌクレオチド配列に関連して第一の配列を記載するために使用するもので、当業者が理解する通り、第二のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、特定の条件下で、ハイブリッド形成して二重鎖構造を形成する第一のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力をいう。かかる条件は、例えば、緊縮条件であり、その場合の緊縮条件は、４００ｍＭ−ＮａＣｌ、４０ｍＭ−ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６.４）、１ｍＭ−ＥＤＴＡを含み、５０℃または７０℃で１２〜１６時間実施し、次いで洗浄することからなる。他の条件、例えば、生体内部で遭遇し得る生理的に適切な条件なども適用し得る。当業者はハイブリッド形成ヌクレオチドの究極的適用に従って、２つの配列の相補性試験にとって最も適切な条件のセットを決定できる。
【００４９】
これは第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとが、第一および第二のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対合しているものを含む。かかる配列は本明細書では互いに関係する「完全相補性」といい得る。しかし、第一の配列が本明細書において第二の配列に関して「実質的に相補性」であるというとき、２つの配列が完全に相補性であるか、それらがハイブリッド形成に関して、１個以上の、しかし一般的には４、３または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成するが、それらの究極の適用に最適の条件下ではハイブリッド形成する能力を保持している。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成に関して、１種以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計した場合、かかるオーバーハングは相補性の決定に関して、ミスマッチとは見做さないものとする。例えば、長さ２１個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドと長さ２３個のヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドを含んでなるsiＲＮＡ（ただし、より長いオリゴヌクレオチドは、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補性である２１個のヌクレオチドの配列を含んでなる）は、本発明の目的のために「完全に相補性」であるとさらに言うことも可能である。
【００５０】
本明細書にて使用する、「相補性」配列は、それらのハイブリッド形成能力に関する上記の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、またはそれらから形成し得る。
【００５１】
用語「相補性」、「完全に相補性」および「実質的に相補性」とは、それらを使用する文面から理解されるように、本明細書においてsiＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の塩基マッチングに関して、またはsiＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列間の塩基マッチングに関して使用してもよい。
【００５２】
本明細書にて使用する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補性」であるポリヌクレオチドは、対象のｍＲＮＡ（例えば、ＭＡＰＫＡＰをエンコードする）の隣接部分に実質的に相補性であるポリヌクレオチドをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＭＡＰＫＡＰをエンコードするｍＲＮＡの非分断部分に実質的に相補性であるならば、ＭＡＰＫＡＰｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性である。
【００５３】
用語「二本鎖ＲＮＡ」または「dsＲＮＡ」は、本明細書にて使用する、２本の逆平行の実質的に相補性である上記定義の核酸鎖からなる二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体をいう。二重鎖構造を形成する二本の鎖は、１本のより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であるか、またはそれらは別個のＲＮＡ分子でもよい。別個のＲＮＡ分子の場合、かかるsiＲＮＡはしばしば文献上、siＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）として言及される。２本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、従って、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端間のヌクレオチドの非分断鎖によって連結して二重鎖構造を形成する場合、連結するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「ショートヘアピンＲＮＡ」または「shＲＮＡ」という。２本の鎖が一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端間のヌクレオチドの非分断鎖以外の手段により共有結合により連結して二重鎖構造を形成する場合、連結する構造体は「リンカー」という。２本のＲＮＡ鎖は同じ数の、または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、siＲＮＡから二重鎖に存在するオーバーハングを差し引いた最短の鎖中のヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、siＲＮＡは１つ以上のヌクレオチド・オーバーハングを含み得る。さらに、本明細書にて使用する、「siＲＮＡ」は複数のヌクレオチドでの実質的な修飾など、また本明細書に開示した、または当該技術分野で既知のすべてのタイプの修飾を含むリボヌクレオチドへの化学的修飾を含み得る。かかる修飾は、いずれもsiＲＮＡタイプの分子で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲の目的上、「siＲＮＡ」に包含される。
【００５４】
本明細書にて使用する、「ヌクレオチド・オーバーハング」とは、siＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸張しているか、またはその逆である場合に、siＲＮＡの二重鎖構造から突出する非対合ヌクレオチドをいう。「平滑な」または「平滑末端」とは、siＲＮＡのその末端に非対合のヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチド・オーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端化」siＲＮＡとはその全長にわたり二本鎖であるsiＲＮＡ、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドのオーバーハングのないsiＲＮＡである。明確にするために、siＲＮＡの３’末端または５’末端に接合する化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、siＲＮＡがオーバーハングをもつか、または平滑末端であるかについて決定する際には考慮されない。
【００５５】
用語「アンチセンス鎖」とは、標的配列に実質的に相補性である領域を含むsiＲＮＡの鎖をいう。本明細書にて使用する、「相補性の領域」という用語は、例えば、本明細書に定義した標的配列である配列に実質的に相補性であるアンチセンス鎖上の領域をいう。相補性の領域が標的配列に完全に相補性ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も寛容であり、もし存在するなら、一般に、１つまたはそれ以上の末端領域、例えば、６、５、４、３、または２個のヌクレオチド内で、５’および／または３’末端の領域に存在する。
【００５６】
用語「センス鎖」とは、本明細書にて使用する、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補性である領域を含むsiＲＮＡの鎖をいう。
【００５７】
「細胞内に導入する」とは、siＲＮＡに言及する場合、当業者が理解する通り、細胞への取り込みまたは吸収を容易にすることを意味する。siＲＮＡの吸収または取り込みは、援助なしに拡散性または活性である細胞のプロセスを経て、または補助剤もしくはデバイスにより起こり得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されない；siＲＮＡはまた「細胞内に導入」し得る；この場合、細胞は生存生物体の部分である。かかる事例において、細胞内に導入することは生体への送達を含む。例えば、インビボの送達では、siＲＮＡは組織部位に注射するか、または全身投与し得る。インビトロでの細胞内への導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなど、当該技術分野で既知の方法である。
【００５８】
用語「サイレンス」および「の発現を阻害する」とは、それらがＭＡＰＫＡＰ遺伝子またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与するいずれかの遺伝子に言及する限りにおいて、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）の発現の少なくとも部分的抑制をいう；このことはＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）から転写されるｍＲＮＡの量の低下により明らかとなる；この遺伝子はそこでＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）が転写される第一の細胞または細胞群から単離し得るものであり、その細胞は、そこでのＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）の発現が阻害されるように処置し、その際、第一の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置していない第二の細胞または細胞群（対照細胞）と比較する。その阻害度は通常以下の式で表わす：
【数１】
【００５９】
あるいは、阻害度はＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）転写に機能的につながっているパラメーター、例えば、細胞が分泌するＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）によりエンコードされるタンパク質量、または特定の表現型（例えば、非制御増殖）を提示する細胞数などにより示し得る。原則として、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）は、構成的にまたはゲノムエンジニアリングにより、また何らかの適切なアッセイにより、標的を発現するいずれかの細胞において決定し得る。しかし、所定のsiＲＮＡがＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）の発現をある程度まで阻害し、従って本発明に包含されるかどうかを決定するために、対照標準が必要とされるとき、下記実施例に示したアッセイ法が対照標準として役立つであろう。
【００６０】
例えば、特定の事例において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約２０％、２５％、３５％、または５０％抑制される。一部の態様において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。一部の態様において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
【００６１】
ｍＴＯＲ
ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）は、当初、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）中のＴＯＲとして同定された大型のセリン／トレオニン・キナーゼであり、免疫抑制剤ラパマイシン（そのＵＳＡＮ一般名称：シロリムスとしても知られる）に対する耐性のスクリーニングに際して発見された（参照例：Kunz et al. (1993) Cell (73): 585, または米国特許第３,９２９,９９２号明細書)。このものはその触媒ドメイン内の相同性により同定されるタンパク質キナーゼのＰＩ３Ｋ（ホスフィノシチド３−キナーゼ）ファミリーの一員である。
【００６２】
酵母および哺乳動物における２種の構造的および機能的に識別される多タンパク質ＴＯＲ複合体（ＴＯＲＣ１およびＴＯＲＣ２）の同定は、ＴＯＲシグナル伝達の複雑さについての分子的基礎を提供した。ｍＴＯＲの活性は、少なくとも３種の上流でのインプット、すなわち、アミノ酸、グルコース、および増殖因子により調節される。細胞内および細胞間のシグナル伝達メカニズムを介して細胞増殖を調節することに加えて、ＴＯＲは成長、老化および低酸素への応答など、増殖関連プロセスの調節因子として浮上した。従って、ＴＯＲは真核細胞生物学において、明らかに広範な役割をもつシグナル伝達ネットワークの一部である。
【００６３】
ｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ１の複合体、またはシグナル伝達ネットワーク）は酵母の種類に関連して構造的に保存され、栄養素利用能に応答して、翻訳、転写、栄養素輸送、リボソーム生合成、および自己貪食などの調節を介する細胞増殖の調節と関連する（Martin et al. (2005) Curr. Opinion in Cell Bio. 17: 158）。これらの機能は、しばしば細胞増殖の「一時的」制御の要素として言及され、ｍＴＯＲＣ２と関連する「空間的」制御に比較される（すなわち、アクチン細胞骨格の細胞周期依存性分極を調節することによる細胞増殖の調節）。
【００６４】
ｍＴＯＲは、経路タンパク質ｍＬＳＴ８／ＧβＬと、およびＲＡＰＴＯＲ（ＫＯＧ１の哺乳動物オルソログ、または「増殖制御因子−１（Kontroller Of Growth-1）」）との複合体（ｍＴＯＲＣ１）の形成を介するなど、数種の方法での栄養素利用能により、感受性となり、活性化される。アミノ酸、とりわけロイシンは、十分な栄養条件下に、ｍＴＯＲによる基質の認識を容易にする栄養感受性化ｍＴＯＲＣ１の形成を調整する。他の下流ｍＴＯＲＣ１標的およびエフェクターは、リボソームタンパク質ｐ７０ Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ１）、および開始因子４Ｅ−結合タンパク質−１（４Ｅ−ＢＰ１）を含む。活性化されたｍＴＯＲキナーゼはＳ６Ｋ１を（Ｔhr３８９で）リン酸化／活性化し、４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化／不活性化して、結果として翻訳および細胞周期行程を開始させる。Ｓ６Ｋ１は細胞の栄養状態とホルモン刺激に応答して、タンパク質合成、細胞サイズ、および増殖を調節する（Kozma et al. (2002) Bioessays 24: 65）が、これにはｍＴＯＲのみならず、ｐ３５／ｐ１１０ ＰＩ３−キナーゼおよび下流のキナーゼＰＤＫ−１とＡＫＴも同様に関与する。
【００６５】
ｍＴＯＲＣ１（ｍＬＳＴ８／ＧβＬ、ＲＡＰＴＯＲ、およびｍＴＯＲ）は栄養感受性複合体を含んでなり、ｍＬＳＴ８／ＧβＬは異なる栄養条件下でｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲの安定性を調節する（Kim et al. (2003) Mol. Cell 11(4):895）。ＲＡＰＴＯＲはｍＴＯＲの正の調節因子であり、下流エフェクターＳ６Ｋ１への栄養刺激シグナル伝達、細胞サイズの維持、およびｍＴＯＲタンパク質発現において役割を果たしている。栄養素剥奪およびミトコンドリア脱共役などの経路を抑制する条件は、ｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲ会合を安定化し、ｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害する。
【００６６】
ＧβＬはｍＴＯＲのキナーゼドメインに結合し、ＲＡＰＴＯＲとｍＴＯＲとの相互作用を安定化する。ｍＴＯＲおよびＰＡＲＴＯＲのように、ＧβＬはＳ６Ｋ１（ｍＴＯＲの下流エフェクター）への栄養−および増殖因子−仲介シグナル伝達に、また細胞サイズの制御に関与する。ＧβＬのｍＴＯＲへの結合は、Ｓ６Ｋ１と４Ｅ−ＢＰ１に対するｍＴＯＲのキナーゼ活性を強力に刺激するが、その作用はＲＡＰＴＯＲとｍＴＯＲとの安定な相互作用により逆転する。興味深いことに、栄養素とラパマイシンは、ＧβＬをも含む複合体においてのみ、ｍＴＯＲとＲＡＰＴＯＲの間の会合を調節する。
【００６７】
栄養状態チェックポイントとしてのその役割に加えて、ｍＴＯＲＣ１はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の下流の重要なシグナル伝達中間体分子である（参照例：Grunwald et al. (2002) Cancer Res. 62: 6141; および Stolovich et al. (2002) Mol Cell Biol. 22: 8101)。ＴＯＲの他の上流調節因子（例えば、ＡＭＰＫ、ＴＳＣ１−ＴＳＣ２（結節性硬化症複合体）ヘテロ二量体、およびＲheb）の発見は、ＴＯＲがその種々のインプットを一体化するメカニズムへの新たな視点を提供した。ＡＫＴ−仲介リン酸化は、Ｒheb ＧＴＰアーゼに向かってのＴＳＣ１−ＴＳＣ２のＧＡＰ活性を阻害し、Ｒhebの活性化に導く。ＲhebはｍＴＯＲに直接結合し、そのプロセスはアミノ酸により調節される。アミノ酸とＲhebの活性化は、共にｍＴＯＲがＳ６Ｋ１にシグナルを伝達するために必要であり、ｍＴＯＲのアミノ酸調節に際してのＴＳＣ１／ＴＳＣ２が果たす役割はあまりはっきりしていない。
【００６８】
ＰＩ３Ｋ
ホスホイノシチド３−キナーゼ（以下、「ＰＩ３Ｋ」）はホスホイノシチド（「ＰＩ」）のイノシトール環の３−ヒドロキシ位置をリン酸化する酵素であり、多様な細胞性事象、例えば、細胞移動、細胞増殖、発癌性形質転換、細胞生存、シグナル伝達、およびタンパク質の細胞内往来などに関与する。酵母の場合、ＶＰＳ３４遺伝子産物はＰＩ３−キナーゼであり、その分泌経路から嚢胞へのタンパク質の活発な移転を仲介する；哺乳動物は３種類のＰＩ３Ｋを含め、多様なイソ型とその中のタイプと共に、ＰＩ３−キナーゼの相当するファミリーをもつ。酵母ＶＰＳ３４のヒト同族体は、ＰＩ３Ｋクラス３（「ＰＩ３ＫＣ３」）と呼称される８８７残基のタンパク質であり、その全長にわたって酵母タンパク質と約３７％の配列相同性を共有する（Volinia et al. (1995) EMBO J. 14(14): 3339）。
【００６９】
ＰＩ３Ｋは細胞表面受容体に結合する増殖因子に基づき、細胞内シグナル伝達分子を活性化する。これらの脂質キナーゼはホスファチジルイノシトールと関連化合物のイノシトール環を３−プライム位置でリン酸化する；それらはホスファチジルイノシトール（「ＰtdＩn」ともいう）とホスホイノシチド（「ＰＩ」：ホスファチジルイノシトールのリン酸化体である）の両方をリン酸化し得る。
【００７０】
これらの反応産物は、増殖シグナル伝達経路において二次メッセンジャーとして働き、細胞生存、移動、運動性、および増殖などの細胞事象；発癌性形質転換；組織血管新生；および細胞内タンパク質往来などに影響を与える。細胞表面受容体は、ホスファチジルイノシトール４,５−ビスホスフェート３などの第二メッセンジャーの産生を誘発し、それが細胞表面から細胞質へのシグナルを運搬する。これらの第二メッセンジャーはＰＩ３Ｋ−依存性タンパク質キナーゼ−１を活性化し、それが次にキナーゼＡＫＴを活性化する。ＡＫＴの活性化はタンパク質のリン酸化に導き、細胞の生存に導く（Cantley et al. (1999) PNAS 96:4240）。
【００７１】
一例を示すと、ＡＫＴはＩκＢをリン酸化し、それによってＮＦκＢを活性化し、細胞の生存を促進する。また、ＡＫＴはＢad（プロアポトーシスＢcl−２ファミリーのメンバー）およびカスパーゼ９をリン酸化し、その両方の場合にアポトーシスの誘発を遮断する。ＡＫＴの他の下流標的はフォークヘッド関連転写因子−１およびラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）を包含する。
【００７２】
ＰＩ３Ｋは３つのクラスにグループ分けされ、その構造、基質特異性、生理的機能、および組織特異性に従って分類される。（Domin et al. (1997) FEBS Lett. 410:91）。クラスＩのＰＩ３Ｋは殆ど細胞質ゾルであり、ｐ１１０触媒サブユニットとアダプター／調節サブユニットからなるヘテロ二量体であり、またさらに２つのクラス、すなわち、クラスＩＡ ＰＩ３ＫおよびクラスＩＢ ＰＩ３Ｋに分割される；クラスＩＡ ＰＩ３Ｋは、ＳＨ２ドメイン含有サブユニットｐ８５と会合し、チロシンキナーゼ−カップル結合膜透過受容体の大多数により活性化されるｐ１１０触媒サブユニットからなる；クラスＩＢ ＰＩ３Ｋは、ｐ１１０γ触媒ユニットと会合し、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク−カップル結合受容体により活性化されるｐ１０１調節サブユニットからなる（Katso et al. (2001) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615）。クラスIIＰＩ３Ｋは本明細書にて考察するように、３つのイソ型からなる。クラスIIIＰＩ３Ｋは基質としてホスファチジルイノシトールのみを利用し、リソソームを経由してタンパク質が往来する上で本質的な役割を演じる（Volinia, et al. (1995) EMBO J. 14:3339)。
【００７３】
ホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩ３Ｐ）は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によるＰＩのリン酸化産物である。殆どの真核細胞におけるＰＩ３Ｐの主たる起源はＰＩ３ＫＣ３であるが、すべてのＰＩ３Ｋがこの脂質をインビトロで生成し得る。ＦＹＶＥドメインをもつタンパク質（その多くは小胞往来に関与している）は、特定の膜での局在化メカニズムとしてＰＩ３Ｐの頭部基に直接結合する。
【００７４】
ＶＰＳ３４
ＶＰＳ３４遺伝子産物（ＶＳＰ３４ｐ）は酵母のリソソーム様小胞にタンパク質選択するために必要な酵素であり、細胞内タンパク質往来決定を調節するものと思われる。ＶＳＰ３４ｐはウシ・ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼの触媒サブユニット（ｐ１１０サブユニット）と顕著な配列類似性を共有するが、これは活性化された細胞表面受容体チロシンキナーゼと相互作用することが知られている。ＶＰＳ３４遺伝子を欠失しているか、またはＶＰＳ３４点突然変異を担持する酵母株は、検出可能なＰＩ３−キナーゼ活性を欠き、小胞タンパク質選択に致命的な欠陥を示した。ＶＰＳ３４ｐの過剰発現はＰＩ３−キナーゼ活性の増大を招き、この活性はＶＰＳ３４ｐに対する抗血清により特異的に低下した（Schu et al. (1993) Science 260 (5104): 88）。
【００７５】
第三のクラスのＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３ＫＣ３はサッカロミセス・セレビシエ遺伝子ＶＰＳ３４に関係する。ＶＰＳ３４のヒト相同体はＶＰＳ１５ｐと呼称されるＳer／Ｔhrキナーゼと複合体形成する。３種のＰＩ３キナーゼの内、このキナーゼは最も限定された基質特異性を有し、ＰtdＩnsに厳しく限定される。クラスＩＡ ＰＩ３−キナーゼ同様に、ＰＩ３ＫＣ３（例えば、ｈＶＰＳ３４）はＳ６Ｋ１の調節において、従って栄養素−感受性においてよく認識された役割を演じている。
【００７６】
ｈＶＰＳ３４はＳ６Ｋ１へのインスリン・インプットの重要な部分ではない（すなわち、インスリンによる刺激を受けない）。しかし、ｈＶＰＳ３４はアミノ酸またはグルコース飢餓により阻害される；このことはそれがＳ６Ｋ１への栄養素−調節経路上に存在することを示唆している。このことと矛盾なく、ｈＶＰＳ３４はまたＡＭＰ−活性化キナーゼの活性化によっても阻害され、それがグルコース飢餓細胞においてｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋ１を阻害する。ｈＶＰＳ３４は、ｈＶＰＳ３４の短鎖干渉ＲＮＡノックダウンがｍＴＯＲ基質４ＥＢＰ１のリン酸化を阻害するので、ｍＴＯＲの上流に存在すると思われる。ｈＶＰＳ３４は、ｍＴＯＲとＳ６Ｋ１へのアミノ酸とグルコースのインプットを統合する栄養素−調節脂質キナーゼであると考えられる。
【００７７】
ＭＡＰＫＡＰ
ＭＡＰＫＡＰ（ジェンバンク登録番号：ＮＭ＿０２４１１７）（ヒトＳＩＮ１としても知られる）は、ＳＩＮ１ファミリーの高度保存オルソログであり、そのメンバーは真菌および後生動物界に広く分布している。ＭＡＰＫＡＰの非ヒト・オルソログの研究は、Ｒas、ｍＴＯＲ、およびＳＡＰＫ（ストレス活性化プロテインキナーゼ）との分子内シグナル伝達相互作用におけるこの遺伝子とそのタンパク質産物に対する役割を示唆してきた。ＭＡＰＫＡＰ転写物は、代わりとなるポリアデニル化シグナルを用い、機能的に異なるイソ型を潜在的にエンコードする多数のＭＡＰＫＡＰスプライス変異体を記述している（Schroder et al. (2004) Gene 339: 17）。ＭＡＰＫＡＰ転写変異体２（ＳＩＮ１β）は、転写変異体１がエンコードするタンパク質の残基Ｐ３２１−Ｓ３５６に相当する３６個のアミノ酸を欠失することで、全長転写体（変異体１）と異なる。合計６種のＭＡＰＫＡＰ転写変異体が報告されているが、変異体間の機能的違いについては殆ど分かっていない。免疫ブロット分析は、スプライシング変異体によりエンコードされるタンパク質が、異なる細胞株で異なって発現されると示唆している。
【００７８】
何らかの機能的違いが、選択的スプライシングから、または組織特異的発現から生じるかどうかは明瞭ではない。一つのグループ（Schroder et al. (2005) Cellular Signaling 17）が、ストレス活性化タンパク質キナーゼＪＮＫは、転写変異体１および転写変異体６（２０２個のアミノ酸のＣ末端切除とその後に追加のＡＣＤ配列を含む）によりエンコードされた外来的に発現されるタンパク質と共に、同時免疫沈降することを示している。同じグループが、全長ＭＡＰＫＡＰタンパク質の発現は、細胞のＵＶ照射後にＪＮＫキナーゼの活性化を部分的に阻害するように見えることを証明している。
【００７９】
本明細書に記載したデータが証明するように、ＭＡＰＫＡＰはｍＴＯＲとｈＶＰＳ３４両方の結合パートナーであり、これら経路間に不可欠のつながりを提供し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路間の連鎖とクロストークを解明する一助となる。さらに、本明細書に記載したデータは、ＭＡＰＫＡＰの関与する結合事象を中断することによる、これらの経路の事実上の調節を示す。
【００８０】
本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の処置、診断、および／または改善するための方法および組成物に関する。一態様において、本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の処置のための阻害性核酸の使用に関する。
【００８１】
本発明は、ｍＴＯＲの使用を介して、異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達に関係する障害（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）の症候を診断し、改善すること、障害を予防すること、および処置することに関する。その例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡなどのＭＡＰＫＡＰインヒビターの投与を介して、異常なｍＴＯＲシグナル伝達に関係する障害（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）を処置する方法を含む。
【００８２】
さらに、本発明はｍＴＯＲのアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにその関連するタンパク質を同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボでのこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強または妨害する作用物質を同定するために、またこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００８３】
さらに、本発明はｈＶＰＳ３４（ＰＩ３ＫＣ３）のアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにその関連するタンパク質を同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボでのこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強または妨害する作用物質を同定するために、またこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００８４】
ＭＡＰＫＡＰアンタゴニスト
栄養素存在下のｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路活性化の作用は、特定の結合事象、例えば、限定されるものではないが、ＭＡＰＫＡＰとｍＴＯＲの結合、ＭＡＰＫＡＰとｈＶＰＳ３４の結合、およびｍＴＯＲＣ１複合体の形成などにより仲介される。ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストは、ＭＡＰＫＡＰ（その異なるイソ型において）がｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のメンバー（それらの置換経路メンバーを含む）に結合すること、およびそれらと複合体を形成することを防止し得る作用物質である。ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡインヒビターである。ＭＡＰＫＡＰに結合し、それがパートナー（例えば、ｍＴＯＲまたはｈＶＰＳ３４など、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路において）に結合するのを防止する作用物質は、ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストして作用しよう。
【００８５】
スクリーニング・アッセイ
本発明はモジュレーター、すなわち、候補化合物または試験化合物またはＭＡＰＫＡＰタンパク質に、または関連する経路もしくは複合体（例えば、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路）のメンバーに結合し、ＭＡＰＫＡＰ発現もしくは活性またはｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路シグナル伝達に刺激性または阻害性作用をもつ作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド類似体、低分子または他の薬物）などのモジュレーターを同定するための方法（本明細書では「スクリーニング・アッセイ」ともいう）を提供する。
【００８６】
本発明は化合物または作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ｍＴＯＲ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ｍＴＯＲ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該化合物不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【００８７】
本発明は化合物または作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）；ii）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該化合物不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【００８８】
一態様において、本発明はＭＡＰＫＡＰタンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分に結合する候補物質または試験薬をスクリーニングするアッセイ法を提供する。別の態様において、本発明はＭＡＰＫＡＰタンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分に結合するか、またはその活性を調節する、例えば、ＭＡＰＫＡＰが通常会合する他のタンパク質（例えば、ｍＴＯＲ、ｈＶＰＳ３４）に結合する能力および／またはそれと複合体を形成する能力を調節する候補物質または試験薬をスクリーニングするアッセイ法を提供する。
【００８９】
本発明の試験薬は、当該技術分野において既知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多くの方法のいずれかを用いて得ることができる；該ライブラリーは、生物学ライブラリー；空間的に接近可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ・１化合物」ライブラリー方法；および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法である。生物学ライブラリー法はペプチド・ライブラリーに限られるが、他の４つの方法はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子化合物のライブラリーに適用可能である（Lam et al. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145）。
【００９０】
分子ライブラリーの合成法の例は、例えば、以下の文献に見出し得る：DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233。
【００９１】
化合物のライブラリーは、溶液として（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13: 412）、またはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555）、細菌（Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号明細書）、胞子（Ladner ‘４０９）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865）またはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386); (Devlin (1990) Science 249: 404); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301); (Ladner, supra)上に提示してよい。
【００９２】
一態様において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ＭＡＰＫＡＰを発現する細胞と試験薬、例えば、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストと接触させ、ＭＡＰＫＡＰの活性を調節（例えば、刺激または阻害）する試験薬の能力を測定することからなる。ＭＡＰＫＡＰの活性を調節する試験薬の能力の測定は、例えば、ＭＡＰＫＡＰに結合するＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定することにより、またはＭＡＰＫＡＰとｍＴＯＲまたはｈＶＰＳ３４間の結合事象を中断するＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定することにより実施し得る。
【００９３】
ＭＡＰＫＡＰタンパク質を調節する試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定することは、直接の結合を測定することにより実施し得る。これらの測定は、例えば、ＭＡＰＫＡＰタンパク質を放射性同位体または酵素標識とカップル結合し、該タンパク質と試験薬（例えば、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニスト）との結合が複合体中の標識タンパク質を検出することにより測定し得るようにすることで実施し得る。例えば、分子、例えば、タンパク質は直接または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈにより標識することが可能であり、その放射性同位体を放射放出の直接計測により、またはシンチレーション計測により検出し得る。別法として、分子は酵素的に、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより標識して、その酵素標識を、適切な基質の生成物への変換決定により検出することができる。
【００９４】
また、相互作用物質のいずれをも標識することなく、ＭＡＰＫＡＰタンパク質を調節する試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定すること、またはｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４など、ＭＡＰＫＡＰに結合するタンパク質を調節する試験薬の能力を測定することも本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、ＭＡＰＫＡＰまたは試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストを標識せずに、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストとＭＡＰＫＡＰとの相互作用（ｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４など、ＭＡＰＫＡＰに結合するタンパク質）を検出することができる（McConnell et al. (1992) Science 257: 1906）。本明細書にて使用する、「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー）は、光接近可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を用いるその環境を細胞が酸性化する速度で測定する分析装置である。この酸性化速度の変化は化合物と受容体間の相互作用の指標として使用することができる。
【００９５】
さらに別の態様において、本発明のアッセイ法は無細胞アッセイ法であり、そこではタンパク質または生物学的に活性なその部分を試験薬（例えば、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニスト）と接触させ、ＭＡＰＫＡＰタンパク質または生物学的に活性なその部分に結合する試験薬の能力を測定する。ＭＡＰＫＡＰタンパク質に対する試験薬の結合は、直接または間接的に上記のように測定し得る。好適な態様において、該アッセイ法はＭＡＰＫＡＰタンパク質または生物学的に活性なその部分をＭＡＰＫＡＰに結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、このアッセイ混合物を試験薬と接触させ、次いで試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力を測定することであり、その場合、試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力の測定は、ＭＡＰＫＡＰまたは生物学的に活性なその部分に優先的に結合する試験薬の能力を、既知化合物と比較して測定することからなる。
【００９６】
別の好適な態様において、該アッセイ法はＭＡＰＫＡＰタンパク質または生物学的に活性なその部分をＭＡＰＫＡＰに結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、このアッセイ混合物を試験薬と接触させ、次いで試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力を測定することであり、その場合、試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力の測定は、ＭＡＰＫＡＰまたは生物学的に活性なその部分に優先的に結合する試験薬の能力を、既知化合物と比較して測定することからなる。
【００９７】
かかる測定はリアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）などの技法を用いて実施し得る。Sjolander et al., 1991 Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書にて使用する、「ＢＩＡ」は相互作用物質のいずれをも標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究する技法である（例えば、バイアコア；BIAcore）。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化が、生物分子間のリアルタイム反応の指標として使用し得る。
【００９８】
上記本発明のアッセイ法の１つを超える態様においては、ＭＡＰＫＡＰを固定化してタンパク質の複合体を非複合体から分離するのを容易にし、かつ、アッセイの自動化に適応させることが望ましい。試験薬のＭＡＰＫＡＰに対する結合は、反応体を収容するのに適した何らかの容器中で実施し得る。かかる容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠沈管である。一態様においては、融合タンパク質がタンパク質をマトリックスに結合させ得るドメインを加えるものとして提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／キナーゼ融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロース・ビーズ（シグマ・ケミカル；セントルイス、ミズーリ）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させ得る；次いで、これらを試験薬または試験薬および非吸着ＭＡＰＫＡＰタンパク質と組み合わせ、その混合物を複合体形成に導く条件下（例えば、塩およぼｐＨについての生理的条件）でインキュベートする。インキュベーション後に、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウエルを洗浄して非結合成分を除去し（ビーズの場合は固定化したマトリックス）、複合体について、例えば、上記のように直接または間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、結合レベルを標準的方法で測定する。
【００９９】
タンパク質をマトリックスに固定化する他の技法は、本発明のスクリーニング・アッセイにも使用し得る。例えば、ＭＡＰＫＡＰはビオチンとストレプトアビジンの接合を利用して固定化し得る。ビオチニル化ＭＡＰＫＡＰタンパク質または標的分子は、当該技術分野で周知の技法を用いてビオチン−ＮＨＳ−（Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミド）から調製可能であり（例えば、ビオチニル化キット；ピアース・ケミカルス、ロックフォード、イリノイ）、ストレプトアビジン被覆９６穴プレート（ピアース・ケミカル）のウエルに固定化する。あるいは、ＭＡＰＫＡＰタンパク質または標的分子と反応する抗体は、該プレートのウエルに誘導化し、未結合ＭＡＰＫＡＰタンパク質は抗体接合によりウエルに捕捉することができる。かかる複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加えて、ＭＡＰＫＡＰタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いての複合体の免疫検出法を包含する。
【０１００】
本発明のさらに別の局面において、ＭＡＰＫＡＰタンパク質はツー−ハイブリッドアッセイまたはスリー−ハイブリッドアッセイにおいて、「ベイト（bait）タンパク質」として使用し（参照例：米国特許第５,２８３,３１７号明細書；Zervos et al., 1993 Cell 72:223-232; Madura et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., 1993 Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993 Oncogene 8:1693-1696; and Brent WO94/10300）、ＭＡＰＫＡＰに結合する他のタンパク質を同定することができる。かかるＭＡＰＫＡＰ結合タンパク質もまたＭＡＰＫＡＰタンパク質によるシグナルの伝播に関与していると思われる。
【０１０１】
ツー−ハイブリッド・システムは殆どの転写因子のモジュラー性に基づくものであり、分離可能なＤＮＡ−結合ドメインと活性化ドメインからなる。簡単に説明すると、このアッセイでは２種類の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＭＡＰＫＡＰタンパク質をコードする遺伝子を既知の転写因子（例、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをエンコードする遺伝子に融合する。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列で、未同定タンパク質（「プレイ（prey）」または「サンプル」）をエンコードする配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してキナーゼ依存性複合体を形成し得る場合、転写因子のＤＮＡ−結合および活性化ドメインは非常に接近した状態に置かれる。この接近は転写因子に応答する転写調節部位に操作可能に連結するレポーター遺伝子（例：ＬacＺ）の転写を可能とする。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能的転写因子を含む細胞コロニーは単離して、該タンパク質と相互作用するＭＡＰＫＡＰタンパク質をエンコードするクローン化遺伝子を得るために使用する。
【０１０２】
本発明はさらに上記のスクリーニング・アッセイにより同定される新規の作用物質に関する。従って、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載した通りに同定した作用物質をさらに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載したように同定した作用物質（例：ＭＡＰＫＡＰ調節作用物質）を動物モデルで使用し、かかる作用物質での処置の有効性、毒性、または副作用を測定することができる。あるいは、本明細書に記載した通りに同定した作用物質は、動物モデルにおいて、かかる作用物質の作用メカニズムを決定するために使用することができる。さらに、本発明は本明細書に記載の処置のために上記のスクリーニング・アッセイにより同定される新規作用物質の使用に関する。
【０１０３】
ＲＮＡi
本発明は短鎖干渉リボ核酸配列（siＲＮＡ）、ならびに該siＲＮＡを用いる細胞または哺乳動物におけるＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法を提供する。また、本発明はＭＡＰＫＡＰ遺伝子の異常な発現を原因とするか、またはＭＡＰＫＡＰが不可欠のメンバーである経路（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路）の異常なシグナル伝達を原因とする哺乳動物における病理的症状および疾患を処置するためのsiＲＮＡを用いる組成物および方法を提供する。siＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）として既知のプロセスを経由するｍＲＮＡの配列特異的分解を方向付ける。
【０１０４】
本発明のsiＲＮＡは長さが３０個未満のヌクレオチド、一般に長さが１９〜２４個のヌクレオチドの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）からなり、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補性である。これらのsiＲＮＡの使用はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能とする。
【０１０５】
本発明によるsiＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）を仲介する。「ＲＮＡi」という用語は当該技術分野にて周知であり、標的遺伝子に相補性である領域をもつsiＲＮＡによる細胞中の１種以上の標的遺伝子の阻害を意味するものと一般に理解される。ＲＮＡiを仲介するその能力についてsiＲＮＡを試験するための種々のアッセイ法が当該技術分野で既知である（参照例：Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213）。本発明によるsiＲＮＡの遺伝子発現に対する作用は、本発明によるＲＮＡ分子で処理していない細胞と比較した場合、結果として典型的に、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％まで阻害するに至る。
【０１０６】
本発明による「siＲＮＡ」または「短鎖干渉リボ核酸」は当該技術分野で既知の意味を有し、以下の側面を含む。siＲＮＡは生理的条件下で相補性領域に沿ってハイブリッド形成するリボヌクレオチドの二本鎖からなる。これらの鎖は分離しているが、特定の態様において分子リンカーにより繋がり得る。個々のリボヌクレオチドは未修飾天然産リボヌクレオチド、未修飾の天然に存在するデオキシリボヌクレオチドであってもよいし、またはそれらは本明細書の別項に記載する通り、化学的に修飾されていても、または合成品であってもよい。
【０１０７】
本発明によるsiＲＮＡ分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡの領域に実質的に同一である二本鎖領域を含んでなる。標的遺伝子の対応する配列に１００％一致する領域が適当である。この状態は「完全に相補性」であるという。しかし、この領域は標的遺伝子の対応する領域に比較したとき、標的とされるｍＲＮＡの領域の長さにより、１個、２個または３個のミスマッチを含み得、そのままでは完全に相補性であり得ない。一態様において、本発明のＲＮＡ分子は特異的に一つの所定の遺伝子を標的とする。所望のｍＲＮＡのみを標的とするために、siＲＮＡ試薬は標的のｍＲＮＡに１００％の相同性をもち、細胞または生体中に存在する他のすべての遺伝子に対し少なくとも２個のミスマッチヌクレオチドをもち得る。特異的標的配列の発現を有効に阻害するために、十分な配列同一性をもつsiＲＮＡを分析し、同定する方法は当該技術分野において既知である。配列同一性は当該技術分野において既知の配列比較および整列アルゴリズムにより最適化してもよく（参照：Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, およびその引用文献）、例えば、デフォルト・パラメーターを用いるベストフィット(BESTFIT)ソフトウエアプログラムにて実施するスミス−ウォーターマン・アルゴリズムにより、ヌクレオチド配列間のパーセント差を計算する（例：ウイスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ）。
【０１０８】
ＲＮＡi試薬の有効性に影響を与える別の因子は、標的遺伝子の標的領域である。ＲＮＡi試薬により阻害するために有効な標的遺伝子の領域は、実験により決定し得る。適当なｍＲＮＡ標的領域はコーディング領域であろう。また、未翻訳領域、例えば、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、およびスプライス接合点である。例えば、文献（Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888）に記載されている形質導入アッセイがこの目的のために実施し得る。多くの他の適切なアッセイおよび方法が当該技術分野に存在し、当業者周知である。
【０１０９】
本発明によると、標的に相補的であるsiＲＮＡの領域の長さは、１０個ないし１００個のヌクレオチド、１２個ないし２５個のヌクレオチド、１４個ないし２２個のヌクレオチドまたは１５個、１６個、１７個または１８個のヌクレオチドであり得る。対応する標的領域に対するミスマッチがある場合、相補性領域の長さは一般に幾分長めであることが必要である。
【０１１０】
siＲＮＡはオーバーハング末端（これは標的に相補性であってもなくてもよい）を担持するか、または標的遺伝子ではなく、それ自体に相補性であるさらなるヌクレオチドを担持する可能性があるため、siＲＮＡの各分離鎖の全長は１０個ないし１００個のヌクレオチド、１５個ないし４９個のヌクレオチド、１７個ないし３０個のヌクレオチドまたは１９個ないし２５個のヌクレオチドであってもよい。
【０１１１】
「各鎖が４９個以下のヌクレオチドである」という文言は、鎖の連続的ヌクレオチドの合計数を意味し、すべての修飾したまたは未修飾ヌクレオチドを含み、該鎖の３’または５’末端に付加し得る何らかの化学的部分は含まない。該鎖に挿入される短い化学的部分は計測しないが、２つの分離鎖を結合するように設計された化学的リンカーは連続的ヌクレオチドを創出するものとは考えない。
【０１１２】
「５’末端または３’末端の少なくとも一方の１個ないし６個のヌクレオチド・オーバーハング」という文言は、生理的条件下に２本の分離した鎖から形成する相補性siＲＮＡの構造体をいう。末端ヌクレオチドがsiＲＮＡの二本鎖領域の一部であるならば、siＲＮＡは平滑末端と考える。１個以上のヌクレオチドが末端上不対合であるならば、オーバーハングが創出される。オーバーハングの長さは突出するヌクレオチドの数で測定される。突出するヌクレオチドはいずれかの鎖の５’末端または３’末端上に存在し得る。
【０１１３】
本発明によるsiＲＮＡは、両鎖の少なくとも一方に少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含めることによって、経口送達に適する高いインビボ安定性を付与する。従って、本発明によるsiＲＮＡは少なくとも１個の修飾された、または非天然リボヌクレオチドを含む。多くの既知の化学的修飾についての非常に長い記載が、公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ２００３７０９１８に開示されているので、ここでは繰り返さない。経口送達に適当な修飾については、より具体的に実施例と本明細書の記載に示されている。適当な修飾は限定されるものではないが、糖部分への修飾（すなわち、糖部分の２’位置、例えば、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基）または塩基部分（すなわち、非天然または修飾された塩基で、代わり得るヌクレオチド鎖の別の特異的塩基と対合する能力を保持する塩基）である。他の修飾はいわゆる「バックボーン」修飾であり、限定されるものではないが、リン酸エステル基の置き換え（隣接位のリボヌクレオチドを、例えば、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートにより連結）を含む。最終的に、末端修飾は時には３’キャップまたは５’キャップが有意であり得る場合を本明細書ではいう。キャップは当業者既知のより複雑な化学からなる。
【０１１４】
一態様において、本発明はＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（dsＲＮＡ）分子を提供する。dsＲＮＡは互いに相補性である少なくとも２本の配列を含んでなる。dsＲＮＡは第一の配列を含んでなるセンス鎖および第二の配列を含んでなるアンチセンス鎖を含んでなる。アンチセンス鎖はＭＡＰＫＡＰをエンコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性であるヌクレオチド配列を含んでなり、その相補性の領域はその長さが３０個未満のヌクレオチド、一般的に長さが１９〜２４個のヌクレオチドである。dsＲＮＡはＭＡＰＫＡＰを発現する細胞と接触させることにより、少なくとも４０％のＭＡＰＫＡＰの発現を阻害する。
【０１１５】
別の態様において、本発明は本発明のdsＲＮＡの１つを含んでなる細胞を提供する。該細胞は一般に哺乳動物、例えば、ヒトの細胞である。
【０１１６】
別の態様において、本発明は生体において、一般的にはヒト対象において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する医薬組成物であって、１種以上の本発明のdsＲＮＡおよび医薬的に許容される担体または送達媒体を含有してなる組成物を提供する。
【０１１７】
別の態様において、本発明は細胞中のＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法であって、以下の工程を含んでなる方法を提供する：
（ａ）二本鎖リボ核酸（dsＲＮＡ）を細胞に導入し（ここで、dsＲＮＡは互いに相補性である少なくとも２つの配列を含んでなる。該dsＲＮＡは第一の配列を含んでなるセンス鎖および第二の配列を含んでなるアンチセンス鎖を含んでなる。アンチセンス鎖はＭＡＰＫＡＰをエンコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含んでなり、その相補性の領域はその長さが３０個未満のヌクレオチド、一般的に長さが１９〜２４個のヌクレオチドであり、また該dsＲＮＡはＭＡＰＫＡＰを発現する細胞と接触させることにより、少なくとも４０％のＭＡＰＫＡＰの発現を阻害する）；そして
（ｂ）ＭＡＰＫＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写体を分解させるために十分な時間、工程（ａ）にて産生された細胞を維持し、それによって細胞中のＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する。
【０１１８】
別の態様において、本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ−シグナル伝達が仲介する生理的プロセス、例えば、癌を処置、予防または管理する方法であって、かかる処置、予防または管理を必要とする患者に、治療的または予防的有効量の本発明の１種以上のsiＲＮＡを投与することを特徴とする方法を提供する。
【０１１９】
別の態様において、本発明は細胞中のＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害するベクターであって、本発明のsiＲＮＡの１つの少なくとも一本鎖をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結した調節配列を含んでなるベクターを提供する。
【０１２０】
本発明の阻害性核酸化合物は、市販品として入手し得る自動化ＤＮＡ合成機、例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスター・シティ、カリフォルニア）モデル３８０Ｂ、３９２もしくは３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、または同種の機器など、常套の手段により合成し得る。ホスホルアミダイトの化学を使用してもよい。本発明の阻害性核酸化合物はまた修飾された、例えば、ヌクレアーゼ抵抗性バックボーンであってもよく、例えば、多くの文献に記載されているホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどを使用してもよい。阻害性核酸の長さは、生物活性を確実に阻害するために十分な大きさでなければならない。従って、例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの場合、特異的結合が所望の標的ポリヌクレオチドにおいてのみ起こり、他の偶発的部位では起こらないことの確実な十分な大きさであることが必要である。長さの上限範囲はいくつかの因子、例えば、長さが約３０〜４０ヌクレオチドより大きいオリゴマーを合成し、精製する不便さおよび費用、短鎖オリゴヌクレオチドよりも長鎖オリゴヌクレオチドのミスマッチに対するより大きな許容範囲などにより決定される。好ましくは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは約１５個ないし４０個のヌクレオチドの範囲の長さをもつ。より好ましくは、該オリゴヌクレオチド部分は約１８個ないし２５個のヌクレオチドの範囲の長さをもつ。
【０１２１】
二本鎖ＲＮＡ、すなわち、センス−アンチセンスＲＮＡは、また短鎖干渉ＲＮＡ（siＲＮＡ）ともいわれ、ＭＡＰＫＡＰに対する核酸の発現を阻害するためにも使用し得る。ＲＮＡ干渉は、外来性短鎖ＲＮＡ二重鎖を、その一方の鎖が標的ｍＲＮＡのコーディング領域に相当する場合に、投与する方法である（Elbashir et al.(2001) Nature 411: 494）。細胞への導入により、siＲＮＡは外来ＲＮＡ二重鎖の分解のみならず、内在するメッセンジャーＲＮＡを含め、同じ配列を有する一本鎖ＲＮＡの分解をも惹き起こす。従って、siＲＮＡは、その技術が触媒メカニズムを介して作用すると信じられるので、伝統的なアンチセンスＲＮＡ方法論よりもより強力かつ有効であり得る。好適なsiＲＮＡ分子は典型的には１９個ないし２５個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約２１個のヌクレオチドの長さであり、Ｅ２−ＥＰＦ５の核酸配列を含んでなる。標的細胞にsiＲＮＡを送達する有効な戦略は、例えば、物理的または化学的トランスフォーメーションを用いる形質導入である。別法として、siＲＮＡは、例えば、機能的siＲＮＡまたはその前駆体の転写を可能とする種々のＰolIIIプロモーター発現カセットを用いる細胞中で発現し得る。参照例：Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3):245; Turki et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13(18):2197; Cornell et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2):91。また、本発明は、例えば、マイクロ−ＲＮＡ（miＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（shＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）を仲介し得る他の短鎖ＲＮＡをも包含する。
【０１２２】
特記しない限り、本明細書にて使用される技術上および科学上の用語はすべて本発明が属する技術分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載したもと同様の、または等価の方法と材料は、本発明の実施または試験に使用し得るが、その適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載したすべての公表文献、特許出願、特許および他の引用文献は、その全文を参照により本明細書の一部とする。問題のある場合は、本明細書がその定義も含めて規定する。さらに、材料、方法、および例示は、説明のためのものであり、限定するためのものではない。
【実施例】
【０１２３】
実施例１：ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路の結合剤
ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路の新規モジュレーターを同定するために、系統的タンデム型親和性精製（ＴＡＰ）方法をｍＴＯＲ経路の数種の既知シグナル伝達分子に適用した。参照により本明細書の一部とするRigaut et al. (Nat Biotechnol. (1999) 17(10): 1030)およびBouwmeester et al. (Nature Cell Biology (2004) 6: 97 - 105)に記載されている通り、ＴＡＰ精製法は、ＴＡＰタグ標識を対象の標的タンパク質に融合すること、およびその構築物を同じ起源の宿主細胞または生体に導入することを含む。
【０１２４】
ＴＡＰタグ標識は、（i）黄色ブドウ球菌からのプロテインＡのＩgＧ−結合単位；および（ii）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位により分離されるカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）；との縦列融合体である。このものは複合体の組成、活性、または機能について予め知識がなくても、比較的少数の細胞から複合体を迅速に精製することを可能とする。質量分析と組合わせると、ＴＡＰ戦略は所定の標的タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を可能とする。
【０１２５】
ヒーラ（HeLa）細胞からのタンパク質複合体の精製
ＣＢＴ−ＴＥＶ−プロテインＡ二重タグとｈＶＰＡ３４の融合物をエンコードするベクターを標準法により構築した。ｈＶＰＳ３４融合導入遺伝子をエンコードするレトロウイルスを調製し、トランスデューサー・ヒーラ細胞に使用した。タンパク質はＮＰ−４０デタージェント溶解バッファーを用いて培養細胞から抽出した。この複合体はＩgＧ−連結ビーズに結合させ、ＴＥＶプロテアーゼ切断により溶出し、溶出物質をカルモジュリン含有ビーズに結合させ、次いでＥＧＴＡで溶出することにより精製した。ＴＥＶ切断を除き、各工程はすべて０〜４℃で実施した。
【０１２６】
タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、完全なゲルのレーンを系統的に切り取ってスライスとし、タンパク質はShevchenko(Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996))に記載の通り、ゲル中、トリプシンで消化した。タンパク質の同定はＬＣ−ＭＳ／ＭＳで遂行し、ＭＳデータはＥＧＩ（ヒンクストン（Hinxton）、英国）で維持されている国際タンパク質インデックス（ＩＰＩ）の自社管理版で検索した。データベースの検索結果はさらに生命情報科学分析のためにデータベースシステムに読み取った。
ＭＡＰＫＡＰはｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４と関連性のあることが判明した。
【０１２７】
実施例２：siＲＮＡ配列の生成
siＲＮＡ配列設計にはBIOPREDsi効力予測アルゴリズムを用い、２１−マーのオリゴヌクレオチドを計測する。最高値となった配列につき、実験的に規定したsiＲＮＡの選択基準に従って、特定のトランスクリプトームに対する理論的選択性について試験する。さらに、siＲＮＡはキアゲン（Qiagen）（バレンシア、カリフォルニア）およびダルマコン（Dharmacon）（ラファイエット、コロラド）により、１９塩基対二重鎖と各鎖の３’末端に２個のデオキシヌクレオチドのオーバーハングをもつ２１ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチドとして合成した。センス鎖のＤＮＡは、dＴdＴであり、一方、アンチセンス鎖のオーバーハングは、標的ｍＲＮＡに相補性であった。
【０１２８】
生成したsiＲＮＡ配列は以下のとおりである：
【表１】
【技術分野】
【０００１】
細胞増殖は、栄養素利用能、増殖因子（例えば、インスリン、ＩＧＦ）利用能、および細胞のエネルギー状態など、種々の因子に起因し得る。ｍＴＯＲ（mammalian Target Of Rapamycin；ラパマイシンの哺乳動物標的）シグナル伝達経路は、３つのインプットすべてを統合して細胞増殖を制御し、細胞内および細胞間両方のシグナル伝達メカニズムとして活性を発揮し得る。すなわち、ＴＯＲはそれが存在する細胞の増殖を制御するのみならず、距離的に離れて存在する細胞の増殖にも影響し、それによって組織全体（および生物体）の大きさに影響を与える能力を保有する。
【背景技術】
【０００２】
ｍＴＯＲ１およびｍＴＯＲ２は、当初、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）中に同定された一対のセリン／トレオニン・キナーゼの哺乳動物オルソログである。ｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ、ｍＬＳＴ８（ＧβＬとしても知られる）、およびＲＡＰＴＯＲ（ＫＯＧ１の哺乳動物オルソログ、または「グロース−１のコントローラー」）は、酵母の種類に関連して構造的に保存され、翻訳、転写、栄養素輸送、リボソーム生合成、および栄養素利用能に応答する自己貪食を経由して、細胞増殖の調節に関係する（Martin et al. (2005) Curr. Opinion in Cell Bio. 17: 158）。
【０００３】
ｍＬＳＴ８／ＧβＬ、ＲＡＰＴＯＲ、およびｍＴＯＲは、栄養素−感受性複合体ｍＴＯＲＣ１を含んでなり、ｍＬＳＴ８／ＧβＬは異なる栄養条件下でｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲの安定性を調整する；ＧβＬはｍＴＯＲのキナーゼドメインに結合し、ＲＡＰＴＯＲとｍＴＯＲとの相互作用を安定化する（Kim et al. (2003) Mol. Cell 11(4):895）。ＲＡＰＴＯＲはｍＴＯＲの正の制御因子であり、下流エフェクターＳ６Ｋ１（Ｓ６キナーゼ１）への栄養素−刺激シグナル伝達、細胞サイズの維持、およびｍＴＯＲタンパク質発現において役割を演じている。栄養素欠乏およびミトコンドリア脱共役などの経路を抑制する条件は、ｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲ会合を安定化し、ｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害する。
【０００４】
ホスホノイノシチド３−キナーゼ（以下、ＰＩ３Ｋ）は、ホスホイノシチド（ＰＩ）のイノシトール環の３−ヒドロキシル位置をリン酸化する酵素であり、多様な細胞事象、例えば、細胞移動、細胞増殖、発癌性形質転換、細胞生存、シグナル伝達、およびタンパク質の細胞内往来に関与している。酵母においては、ＶＰＳ３４遺伝子産物が分泌経路から液胞へのタンパク質の活発な移転を仲介するＰＩ３キナーゼであり、哺乳動物は３種のＰＩ３Ｋを含むＰＩ３キナーゼの対応するファミリーを有し、そこには種々のイソ型およびタイプを含む。ＶＰＳ３４の最も近いヒトの同族体はＰＩ３Ｋクラス３（ＰＩ３ＫＣ３）（本明細書ではヒトＶＰＳ３４について「ｈＶＰＳ３４」ともいう）と呼称される８８７残基のタンパク質であり、このものは当該酵母タンパク質とその全長にわたって、約３７％の配列同一性を共有する（Volinia et al. (1995) EMBO J. 14(14): 3339）。
【０００５】
栄養素感受性ＴＯＲ経路およびＩＧＦ−ＰＩ３Ｋ（増殖因子）シグナル伝達経路は機能的に繋がっており、クロストークしていることが知られている。ｍＴＯＲはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴのシグナル伝達経路の下流メディエーターである；分裂促進因子はホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介してｍＴＯＲ経路を活性化する。ある種の疾患状態において、活性化されたｍＴＯＲ経路は病理学的シグナル伝達カスケードの一部、例えば、異常増殖と特定癌細胞の生存に関わる経路である。
【０００６】
しかし、これらの経路が互いに相互作用する様式を理解することは、未だ満たされていない必要性を表し、共有される結合因子を同定することは、例えば、ｍＴＯＲシグナル伝達（例えば、栄養素誘発ｍＴＯＲシグナル伝達）と関連する障害の処置を進歩させる一助となろう。さらに、例えば、構成する経路タンパク質メンバーおよびそれらの結合因子／相互作用因子を調節することによるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲを調節する方法の発見は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害および他の関連する悪性腫瘍の診断、その症候の改善、その予防、およびその処置に有用となろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はｍＴＯＲアンタゴニストの使用による、異常ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）の診断、その症候の改善、その予防、およびその関連する障害の処置に関する。その例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡインヒビターなど、ＭＡＰＫＡＰのインヒビターの投与により、異常なｍＴＯＲシグナル伝達に関連する障害（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）を処置する方法である。異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達は、例えば、栄養素輸送体の過剰発現として顕在化し得る。
【０００８】
本発明はまたＭＡＰＫＡＰアンタゴニストにも関し、ＭＡＰＫＡＰが（その異なるイソ型において）ｍＴＯＰ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のメンバーに結合し、複合体を形成することを防止することの可能な作用物質を含む（それらの置換基経路メンバーを含む）。ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡインヒビターを含む。
【０００９】
本発明はさらにｍＴＯＲおよびその関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボまたはインビトロでこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強する、またはそれに干渉する作用物質を同定するために、また結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００１０】
本発明はさらにｈＶＰＳ３４（ＰＩ３ＫＣ３）およびその関連タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボまたはインビトロでこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強する、またはそれに干渉する作用物質を同定するために、また結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００１１】
本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置するための化合物または他の作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ｍＴＯＲ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ｍＴＯＲ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該作用物質不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【００１２】
本発明は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置するための化合物または他の作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）；ii）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該化合物不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合の、異なる抗−ＭＡＰＫＡＰsiＲＮＡを形質移入したヒーラ細胞中のＭＡＰＫＡＰ ＲＮＡレベル（ＭＡＰＫＡＰの２つのイソ型）を示す。細胞は、本明細書に記載したように、siＲＮＡおよび対照（未形質移入細胞およびスクランブル対照細胞）で３０時間形質移入し、次いで、タックマン（TaqMan）で加工処理した。
【００１４】
【図２】図２は抗−ＭＡＰＫＡＰsiＲＮＡ配列、栄養素、およびインスリンの組み合わせで形質移入したヒーラ細胞における、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路においてのタンパク質の存在または不存在を証明するウエスタンブロットを示す。該ブロットは抗−ＭＡＰＫＡＰsiＲＮＡ配列が栄養素誘発ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害し得るが、インスリン誘発ｍＴＯＲシグナル伝達は阻害しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の発明は、記載した特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されるものではなく、それらが変り得るものであることが予測される。理解すべきことは、本明細書にて使用する用語法は特定の態様のみを記載することを目的とするものであり、如何なる方法でも本発明の範囲を限定することを意図するものではないことである。
【００１６】
他に特に定義しない限り、本明細書にて使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が共通に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と同様のまたは等価の方法および材料はいずれも本発明の実施または試験に使用し得るが、その好適な方法、装置および材料をここで記載する。本明細書に言及する公表文献はすべて、本発明と関連して使用し得る公表文献に報告されている材料と方法論を記載および開示することを目的として、参照により本明細書の一部とする。
【００１７】
本発明を実施するに際しては、多くの分子生物学の常套の技法が使用される。これらの技法は周知のものであり、例えば、以下の文献に解説がある： Harlow, E. and Lane, eds., 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); および Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (それぞれ、Wu and Grossman, and Wu, eds.)。
【００１８】
本明細書の記載において、用語「処置」は防止または予防の処置ならびに治癒または疾患抑制処置の両方を含み、アポトーシス関連障害のリスクのある患者ならびに病気の患者をも含む。この用語はさらに疾患進行の遅延のための処置をも含む。
【００１９】
例えば、患者（例えば、癌）の異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連シグナル伝達と関連する障害を「抑制および／または回復」するとは、本出願人は、当該症状を抑止するか、または以前よりもしくは処置しないときよりも当該症状を和らげることを意味する。
【００２０】
本明細書にて使用する、「調節する」とは、直接的または間接的に制御するか、または影響を与える能力をいい、非限定的例としては、別意として、阻害または刺激すること、苦痛を与えることまたは拮抗すること、妨害または促進すること、および強化または弱体化することを意味し得る。
【００２１】
本明細書にて使用する、「治癒」とは、患者における異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連シグナル伝達と関連する障害、またはその進行中のエピソードを、処置により、寛解に導くことを意味する。
【００２２】
用語「予防」または「防止」とは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の発症または再発を妨害することを意味する。
【００２３】
「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達（例えば、癌および他の関連悪性腫瘍）」、「ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達関連障害」、「ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害」、「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達関連障害」、およびすべての同様に使用される用語は、限定されるものではないが、癌、移植関連障害（例えば、拒絶反応率、移植片対宿主反応などの低下）、筋肉硬化症（ＭＳ）、関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、および他の免疫抑制障害、代謝性障害（例えば、糖尿病）、血管障害後の動脈内膜肥厚の低下、およびミスフォールディングタンパク質障害（例えば、アルツハイマー病、ゴーシェ病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症、黄斑変性、色素性網膜炎、およびプリオン障害）（ｍＴＯＲ阻害がミスフォールディングタンパク質凝集の影響を寛解し得る場合）を含む。病理学的ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードと関連する癌の一覧は、限定されるものではないが、乳癌、腎臓細胞癌腫、および前立腺癌である。この一覧はまたアミノ酸輸送体（例えば、ＬＡＴＩ）の過剰発現と関連する癌および腫瘍、またはＰＴＥＮ、ＴＳＣ１／１、またはＰＩ３ＫクラスＡの突然変異を抱える癌よび腫瘍をも含む。
【００２４】
また、「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達に関連する障害」の一覧は、過誤腫症候群、例えば、結節性硬化症およびカウデン（Cowden）病（カウデン症候群および多発性過誤腫症候群ともいう）も含む。過誤腫は新生物に類似する病巣奇形であり、患部に通常生じる成熟細胞と組織の過増殖からなる。
【００２５】
また、「異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達に関連する障害」の一覧は、遺伝的筋肉障害およびミオパシー、例えば、ヒト筋細管ミオパシーをも含む。この障害はホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩ（３）Ｐ）を脱リン酸化するホスファターゼ・ミオチューブラリン（筋肉細胞分化に必要なタンパク質チロシンホスファターゼ）の能力の低下を特徴とする。ホスファチジルイノシトール３−リン酸は、下記に検討するように、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によるＰＩのリン酸化の産物であり、多くの遺伝的筋肉障害およびミオパシーにおいて標的とするｈＶＰＳ３４は、ＰＩ（３）Ｐのレベルを治療的に低下させ得る。
【００２６】
本明細書にて使用する、「癌」という用語は、固形哺乳動物腫瘍ならびに血液学的悪性腫瘍を含む。「固形哺乳動物腫瘍」は、頭頚部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆管系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、睾丸、婦人科器官、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚中枢神経系の癌；柔組織および骨の肉腫；および皮膚および眼内起源のメラノーマなどを含む。「血液学的悪性腫瘍」という用語は、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚起源のリンパ腫、急性および慢性の白血病、血小板細胞新生物およびＡＩＤＳ関連癌を含む。さらに、一次、転移、および再発癌など、進行中のいずれかの段階での癌を処理し得る。多くのタイプの癌に関する情報は、例えば、米国癌学会、または例えば、文献（Wilson et al. (1991) Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Edition, McGraw-Hill, Inc.）に見ることができる。ヒトおよび獣医学両方の使用が考慮される。
【００２７】
本明細書にて使用する、「正常哺乳動物細胞」および「正常動物細胞」という用語は、正常な増殖制御メカニズム（例えば、遺伝子制御）のもとで増殖し、正常の細胞分化を表示する細胞と定義する。癌細胞はその増殖パターンが正常細胞と異なり、またその細胞表面の性質も異なる。例えば、癌細胞は近傍に関係なく、連続的に無秩序に増殖する傾向があり、とりわけ、それが当該分野でよく知られた特徴である。
【００２８】
本明細書にて使用する、「阻害性核酸」という用語は、遺伝子発現の遺伝子特異的阻害を生じ得る核酸化合物をいう。典型的な阻害性核酸は、限定されるものではないが、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび短鎖阻害性ＲＮＡ（siＲＮＡ）などである。例えば、ヌクレオチド配列の知識は、ｍＴＯＲ経路タンパク質（その類似体または変異体を含む）の発現またはその結合剤／相互作用因子の発現を強力に阻害するsiＲＮＡまたはアンチセンス分子を設計するために使用し得る。同様に、リボザイムは遺伝子の特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを切断するように合成し得る。遺伝子発現の標的化阻害に使用するかかる分子の設計技術は、当業者に周知である。
【００２９】
本明細書にて使用する、「治癒する」とは、例えば、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、またはその進行中のエピソードを、その処置を経由して、寛解に導くことを意味する。
【００３０】
用語「予防」または「防止」とは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の発症または再発を妨害することを意味する。
【００３１】
本明細書にて使用する、「進行の遅延」とは、患者（例えば、癌）におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害の前段階または初期において、患者にモジュレーター（例えば、ｍＴＯＲアンタゴニスト）を投与すると、モジュレーターを投与しなかった場合の疾患の進展に比べて、さらに疾患が進展するのを防止するか、または疾患の進展を減速することを意味する。
【００３２】
本明細書にて使用する、「低有機分子」または「低分子」とは、分子量が３キロダルトン未満、好ましくは１.５キロダルトン未満の有機化合物（または無機化合物（例えば、金属）と複合体形成した有機化合物）である。
【００３３】
本明細書にて使用する、「レポーター」遺伝子は、「マーカー遺伝子」と互換性あるものとして使用し、容易に検出し得る核酸であるか、および／またはルシフェラーゼなどの容易に検出可能な遺伝子産物をエンコードする核酸である。
【００３４】
転写および翻訳制御配列はＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどであり、これらが宿主細胞においてコーディング配列の発現を規定する。真核細胞においては、ポリアデニル化シグナルが制御配列である。
【００３５】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする目的上、プロモーター配列はその３’末端で転写開始部位により結合し、上流（５’方向）に伸張してバックグランドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最少数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより簡便に定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００３６】
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写する際に、細胞中で転写および翻訳制御配列の「制御下」にあり、このｍＲＮＡが次いでトランス−ＲＮＡにスプライスされ、コーディング配列によりエンコードされたタンパク質に翻訳される。
【００３７】
「医薬的に許容される」という文言は、生理学的に寛容であり、ヒトに投与したときに、アレルギー性または同様の不都合な反応、例えば、胃の不調、めまいなどを典型的に生じない分子実体および組成物をいう。好ましくは、本明細書にて使用する、「医薬的に許容される」という用語は、連邦の監督官庁もしくは州政府が認可したもの、または合衆国薬局方もしくは他の一般に認知された動物用、とりわけヒト用の薬局方に掲載されたものを意味する。
【００３８】
「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、添加剤、または媒体であって、それと共に化合物を投与するものをいう。かかる医薬的担体は、無菌の液体、例えば、水および油など、石油系、動物系、植物系または合成起源のものを含み、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水または水溶液、食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が担体として、特に、注射用溶液として好ましく使用される。適切な医薬用担体については、文献（“Remington’s Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin）に記載されている。
【００３９】
「治療的有効量」および「有効量」とは、宿主の活性、機能および応答における臨床的に有意な欠損を少なくとも約１５パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント低下させ、そして最も好ましくはその欠損を防止するために十分な量を意味するために、本明細書では使用する。あるいは、治療的有効量は、宿主において臨床的に有意な症状／症候の改善を惹起するに十分な量である。
【００４０】
「作用物質」とは、医薬用および診断用組成物を調製するために使用し得るすべての物質、または化合物、核酸、ポリペプチド、フラグメント、イソ型、変異体、もしくはそのような目的に使用し得る他の物質であり得るすべての物質をいい、すべて本発明に基づくものである。
【００４１】
本明細書にて使用する、「類似体」とは、本発明の所望の活性および治療効果を有する化合物、ヌクレオチド、タンパク質もしくはポリペプチドまたは化合物と類似のもしくは同一の活性または機能（例えば、腫瘍増殖の阻害）を有する低有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドをいうが、必ずしも好適な態様の配列または構造に類似するか、または一致する配列または構造を含む必要はない。
【００４２】
「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加の導入により変化させた親のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるタンパク質またはポリペプチド、またはヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加の導入により修飾した核酸またはヌクレオチドなどのいずれかの化合物をいう。誘導体核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドは、親のポリペプチドと類似のまたは同一の機能を有する。
【００４３】
「インヒビター」または「アンタゴニスト」とは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路機能についてのインビトロまたはインビボアッセイを用いて同定した阻害性分子をいう。インヒビターおよびアンタゴニストは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を介して起こるシグナル伝達を低下させる作用物質をいう。インヒビターはこの経路を介してシグナル伝達を低下、遮断、または防止するか、および／またはｍＴＯＲＣ１または関連複合体などのタンパク質複合体の形成を防止する作用物質であってもよい。
【００４４】
本明細書にて使用する、「癌」という用語は、固形哺乳動物腫瘍ならびに血液学的悪性腫瘍を含む。「固形哺乳動物腫瘍」は、頭頚部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆管系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、睾丸、婦人科器官、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚、脳を含む中枢神経系の癌；柔組織および骨の肉腫；および皮膚および眼内起源のメラノーマなどを含む。「血液学的悪性腫瘍」という用語は、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚起源のリンパ腫、急性および慢性の白血病、血小板細胞新生物およびＡＩＤＳ関連癌を含む。さらに、原発性、転移、および再発癌など、進行中のいずれかの段階での癌を処理し得る。多くのタイプの癌に関する情報は、例えば、米国癌学会、または例えば、文献（Wilson et al. (1991) Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Edition, McGraw-Hill, Inc.）に見ることができる。
【００４５】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」のそれぞれは、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをそれぞれを含むヌクレオチドを意味する。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、さらに以下に詳述するように、修飾ヌクレオチド、または代用の置換部分をもいい得ると理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、オリゴヌクレオチドの塩基対合の性質を実質的に変化させることなく他の部分と置き換え得ること、かかるオリゴヌクレオチドがかかる置き換え部分を担持するヌクレオチドを含んでなることを周知している。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含んでなるヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドと置き換え得る。かかる置き換え部分を含んでなる配列は本発明の態様である。
【００４６】
本明細書にて使用する、「標的配列」はＭＡＰＫＡＰ遺伝子の転写に際して形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の相接する部分をいい、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む。
【００４７】
本明細書にて使用する、「配列を含んでなる鎖」とは、標準的ヌクレオチド命名法を参照しての配列により記載されるヌクレオチドの鎖を含んでなるオリゴヌクレオチドをいう。
【００４８】
本明細書にて使用する、特に断りのない限り、用語「相補性」とは、第二のヌクレオチド配列に関連して第一の配列を記載するために使用するもので、当業者が理解する通り、第二のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、特定の条件下で、ハイブリッド形成して二重鎖構造を形成する第一のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力をいう。かかる条件は、例えば、緊縮条件であり、その場合の緊縮条件は、４００ｍＭ−ＮａＣｌ、４０ｍＭ−ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６.４）、１ｍＭ−ＥＤＴＡを含み、５０℃または７０℃で１２〜１６時間実施し、次いで洗浄することからなる。他の条件、例えば、生体内部で遭遇し得る生理的に適切な条件なども適用し得る。当業者はハイブリッド形成ヌクレオチドの究極的適用に従って、２つの配列の相補性試験にとって最も適切な条件のセットを決定できる。
【００４９】
これは第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとが、第一および第二のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対合しているものを含む。かかる配列は本明細書では互いに関係する「完全相補性」といい得る。しかし、第一の配列が本明細書において第二の配列に関して「実質的に相補性」であるというとき、２つの配列が完全に相補性であるか、それらがハイブリッド形成に関して、１個以上の、しかし一般的には４、３または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成するが、それらの究極の適用に最適の条件下ではハイブリッド形成する能力を保持している。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成に関して、１種以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計した場合、かかるオーバーハングは相補性の決定に関して、ミスマッチとは見做さないものとする。例えば、長さ２１個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドと長さ２３個のヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドを含んでなるsiＲＮＡ（ただし、より長いオリゴヌクレオチドは、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補性である２１個のヌクレオチドの配列を含んでなる）は、本発明の目的のために「完全に相補性」であるとさらに言うことも可能である。
【００５０】
本明細書にて使用する、「相補性」配列は、それらのハイブリッド形成能力に関する上記の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、またはそれらから形成し得る。
【００５１】
用語「相補性」、「完全に相補性」および「実質的に相補性」とは、それらを使用する文面から理解されるように、本明細書においてsiＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の塩基マッチングに関して、またはsiＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列間の塩基マッチングに関して使用してもよい。
【００５２】
本明細書にて使用する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補性」であるポリヌクレオチドは、対象のｍＲＮＡ（例えば、ＭＡＰＫＡＰをエンコードする）の隣接部分に実質的に相補性であるポリヌクレオチドをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＭＡＰＫＡＰをエンコードするｍＲＮＡの非分断部分に実質的に相補性であるならば、ＭＡＰＫＡＰｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性である。
【００５３】
用語「二本鎖ＲＮＡ」または「dsＲＮＡ」は、本明細書にて使用する、２本の逆平行の実質的に相補性である上記定義の核酸鎖からなる二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体をいう。二重鎖構造を形成する二本の鎖は、１本のより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であるか、またはそれらは別個のＲＮＡ分子でもよい。別個のＲＮＡ分子の場合、かかるsiＲＮＡはしばしば文献上、siＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）として言及される。２本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、従って、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端間のヌクレオチドの非分断鎖によって連結して二重鎖構造を形成する場合、連結するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「ショートヘアピンＲＮＡ」または「shＲＮＡ」という。２本の鎖が一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端間のヌクレオチドの非分断鎖以外の手段により共有結合により連結して二重鎖構造を形成する場合、連結する構造体は「リンカー」という。２本のＲＮＡ鎖は同じ数の、または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、siＲＮＡから二重鎖に存在するオーバーハングを差し引いた最短の鎖中のヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、siＲＮＡは１つ以上のヌクレオチド・オーバーハングを含み得る。さらに、本明細書にて使用する、「siＲＮＡ」は複数のヌクレオチドでの実質的な修飾など、また本明細書に開示した、または当該技術分野で既知のすべてのタイプの修飾を含むリボヌクレオチドへの化学的修飾を含み得る。かかる修飾は、いずれもsiＲＮＡタイプの分子で使用する場合、本明細書および特許請求の範囲の目的上、「siＲＮＡ」に包含される。
【００５４】
本明細書にて使用する、「ヌクレオチド・オーバーハング」とは、siＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸張しているか、またはその逆である場合に、siＲＮＡの二重鎖構造から突出する非対合ヌクレオチドをいう。「平滑な」または「平滑末端」とは、siＲＮＡのその末端に非対合のヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチド・オーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端化」siＲＮＡとはその全長にわたり二本鎖であるsiＲＮＡ、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドのオーバーハングのないsiＲＮＡである。明確にするために、siＲＮＡの３’末端または５’末端に接合する化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学部分は、siＲＮＡがオーバーハングをもつか、または平滑末端であるかについて決定する際には考慮されない。
【００５５】
用語「アンチセンス鎖」とは、標的配列に実質的に相補性である領域を含むsiＲＮＡの鎖をいう。本明細書にて使用する、「相補性の領域」という用語は、例えば、本明細書に定義した標的配列である配列に実質的に相補性であるアンチセンス鎖上の領域をいう。相補性の領域が標的配列に完全に相補性ではない場合、ミスマッチは末端領域において最も寛容であり、もし存在するなら、一般に、１つまたはそれ以上の末端領域、例えば、６、５、４、３、または２個のヌクレオチド内で、５’および／または３’末端の領域に存在する。
【００５６】
用語「センス鎖」とは、本明細書にて使用する、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補性である領域を含むsiＲＮＡの鎖をいう。
【００５７】
「細胞内に導入する」とは、siＲＮＡに言及する場合、当業者が理解する通り、細胞への取り込みまたは吸収を容易にすることを意味する。siＲＮＡの吸収または取り込みは、援助なしに拡散性または活性である細胞のプロセスを経て、または補助剤もしくはデバイスにより起こり得る。この用語の意味は、インビトロの細胞に限定されない；siＲＮＡはまた「細胞内に導入」し得る；この場合、細胞は生存生物体の部分である。かかる事例において、細胞内に導入することは生体への送達を含む。例えば、インビボの送達では、siＲＮＡは組織部位に注射するか、または全身投与し得る。インビトロでの細胞内への導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなど、当該技術分野で既知の方法である。
【００５８】
用語「サイレンス」および「の発現を阻害する」とは、それらがＭＡＰＫＡＰ遺伝子またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与するいずれかの遺伝子に言及する限りにおいて、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）の発現の少なくとも部分的抑制をいう；このことはＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）から転写されるｍＲＮＡの量の低下により明らかとなる；この遺伝子はそこでＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）が転写される第一の細胞または細胞群から単離し得るものであり、その細胞は、そこでのＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）の発現が阻害されるように処置し、その際、第一の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置していない第二の細胞または細胞群（対照細胞）と比較する。その阻害度は通常以下の式で表わす：
【数１】
【００５９】
あるいは、阻害度はＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）転写に機能的につながっているパラメーター、例えば、細胞が分泌するＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）によりエンコードされるタンパク質量、または特定の表現型（例えば、非制御増殖）を提示する細胞数などにより示し得る。原則として、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）は、構成的にまたはゲノムエンジニアリングにより、また何らかの適切なアッセイにより、標的を発現するいずれかの細胞において決定し得る。しかし、所定のsiＲＮＡがＭＡＰＫＡＰ遺伝子（またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子）の発現をある程度まで阻害し、従って本発明に包含されるかどうかを決定するために、対照標準が必要とされるとき、下記実施例に示したアッセイ法が対照標準として役立つであろう。
【００６０】
例えば、特定の事例において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約２０％、２５％、３５％、または５０％抑制される。一部の態様において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。一部の態様において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与により、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
【００６１】
ｍＴＯＲ
ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）は、当初、酵母（サッカロミセス・セレビシエ）中のＴＯＲとして同定された大型のセリン／トレオニン・キナーゼであり、免疫抑制剤ラパマイシン（そのＵＳＡＮ一般名称：シロリムスとしても知られる）に対する耐性のスクリーニングに際して発見された（参照例：Kunz et al. (1993) Cell (73): 585, または米国特許第３,９２９,９９２号明細書)。このものはその触媒ドメイン内の相同性により同定されるタンパク質キナーゼのＰＩ３Ｋ（ホスフィノシチド３−キナーゼ）ファミリーの一員である。
【００６２】
酵母および哺乳動物における２種の構造的および機能的に識別される多タンパク質ＴＯＲ複合体（ＴＯＲＣ１およびＴＯＲＣ２）の同定は、ＴＯＲシグナル伝達の複雑さについての分子的基礎を提供した。ｍＴＯＲの活性は、少なくとも３種の上流でのインプット、すなわち、アミノ酸、グルコース、および増殖因子により調節される。細胞内および細胞間のシグナル伝達メカニズムを介して細胞増殖を調節することに加えて、ＴＯＲは成長、老化および低酸素への応答など、増殖関連プロセスの調節因子として浮上した。従って、ＴＯＲは真核細胞生物学において、明らかに広範な役割をもつシグナル伝達ネットワークの一部である。
【００６３】
ｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ１の複合体、またはシグナル伝達ネットワーク）は酵母の種類に関連して構造的に保存され、栄養素利用能に応答して、翻訳、転写、栄養素輸送、リボソーム生合成、および自己貪食などの調節を介する細胞増殖の調節と関連する（Martin et al. (2005) Curr. Opinion in Cell Bio. 17: 158）。これらの機能は、しばしば細胞増殖の「一時的」制御の要素として言及され、ｍＴＯＲＣ２と関連する「空間的」制御に比較される（すなわち、アクチン細胞骨格の細胞周期依存性分極を調節することによる細胞増殖の調節）。
【００６４】
ｍＴＯＲは、経路タンパク質ｍＬＳＴ８／ＧβＬと、およびＲＡＰＴＯＲ（ＫＯＧ１の哺乳動物オルソログ、または「増殖制御因子−１（Kontroller Of Growth-1）」）との複合体（ｍＴＯＲＣ１）の形成を介するなど、数種の方法での栄養素利用能により、感受性となり、活性化される。アミノ酸、とりわけロイシンは、十分な栄養条件下に、ｍＴＯＲによる基質の認識を容易にする栄養感受性化ｍＴＯＲＣ１の形成を調整する。他の下流ｍＴＯＲＣ１標的およびエフェクターは、リボソームタンパク質ｐ７０ Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ１）、および開始因子４Ｅ−結合タンパク質−１（４Ｅ−ＢＰ１）を含む。活性化されたｍＴＯＲキナーゼはＳ６Ｋ１を（Ｔhr３８９で）リン酸化／活性化し、４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化／不活性化して、結果として翻訳および細胞周期行程を開始させる。Ｓ６Ｋ１は細胞の栄養状態とホルモン刺激に応答して、タンパク質合成、細胞サイズ、および増殖を調節する（Kozma et al. (2002) Bioessays 24: 65）が、これにはｍＴＯＲのみならず、ｐ３５／ｐ１１０ ＰＩ３−キナーゼおよび下流のキナーゼＰＤＫ−１とＡＫＴも同様に関与する。
【００６５】
ｍＴＯＲＣ１（ｍＬＳＴ８／ＧβＬ、ＲＡＰＴＯＲ、およびｍＴＯＲ）は栄養感受性複合体を含んでなり、ｍＬＳＴ８／ＧβＬは異なる栄養条件下でｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲの安定性を調節する（Kim et al. (2003) Mol. Cell 11(4):895）。ＲＡＰＴＯＲはｍＴＯＲの正の調節因子であり、下流エフェクターＳ６Ｋ１への栄養刺激シグナル伝達、細胞サイズの維持、およびｍＴＯＲタンパク質発現において役割を果たしている。栄養素剥奪およびミトコンドリア脱共役などの経路を抑制する条件は、ｍＴＯＲ−ＲＡＰＴＯＲ会合を安定化し、ｍＴＯＲキナーゼ活性を阻害する。
【００６６】
ＧβＬはｍＴＯＲのキナーゼドメインに結合し、ＲＡＰＴＯＲとｍＴＯＲとの相互作用を安定化する。ｍＴＯＲおよびＰＡＲＴＯＲのように、ＧβＬはＳ６Ｋ１（ｍＴＯＲの下流エフェクター）への栄養−および増殖因子−仲介シグナル伝達に、また細胞サイズの制御に関与する。ＧβＬのｍＴＯＲへの結合は、Ｓ６Ｋ１と４Ｅ−ＢＰ１に対するｍＴＯＲのキナーゼ活性を強力に刺激するが、その作用はＲＡＰＴＯＲとｍＴＯＲとの安定な相互作用により逆転する。興味深いことに、栄養素とラパマイシンは、ＧβＬをも含む複合体においてのみ、ｍＴＯＲとＲＡＰＴＯＲの間の会合を調節する。
【００６７】
栄養状態チェックポイントとしてのその役割に加えて、ｍＴＯＲＣ１はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の下流の重要なシグナル伝達中間体分子である（参照例：Grunwald et al. (2002) Cancer Res. 62: 6141; および Stolovich et al. (2002) Mol Cell Biol. 22: 8101)。ＴＯＲの他の上流調節因子（例えば、ＡＭＰＫ、ＴＳＣ１−ＴＳＣ２（結節性硬化症複合体）ヘテロ二量体、およびＲheb）の発見は、ＴＯＲがその種々のインプットを一体化するメカニズムへの新たな視点を提供した。ＡＫＴ−仲介リン酸化は、Ｒheb ＧＴＰアーゼに向かってのＴＳＣ１−ＴＳＣ２のＧＡＰ活性を阻害し、Ｒhebの活性化に導く。ＲhebはｍＴＯＲに直接結合し、そのプロセスはアミノ酸により調節される。アミノ酸とＲhebの活性化は、共にｍＴＯＲがＳ６Ｋ１にシグナルを伝達するために必要であり、ｍＴＯＲのアミノ酸調節に際してのＴＳＣ１／ＴＳＣ２が果たす役割はあまりはっきりしていない。
【００６８】
ＰＩ３Ｋ
ホスホイノシチド３−キナーゼ（以下、「ＰＩ３Ｋ」）はホスホイノシチド（「ＰＩ」）のイノシトール環の３−ヒドロキシ位置をリン酸化する酵素であり、多様な細胞性事象、例えば、細胞移動、細胞増殖、発癌性形質転換、細胞生存、シグナル伝達、およびタンパク質の細胞内往来などに関与する。酵母の場合、ＶＰＳ３４遺伝子産物はＰＩ３−キナーゼであり、その分泌経路から嚢胞へのタンパク質の活発な移転を仲介する；哺乳動物は３種類のＰＩ３Ｋを含め、多様なイソ型とその中のタイプと共に、ＰＩ３−キナーゼの相当するファミリーをもつ。酵母ＶＰＳ３４のヒト同族体は、ＰＩ３Ｋクラス３（「ＰＩ３ＫＣ３」）と呼称される８８７残基のタンパク質であり、その全長にわたって酵母タンパク質と約３７％の配列相同性を共有する（Volinia et al. (1995) EMBO J. 14(14): 3339）。
【００６９】
ＰＩ３Ｋは細胞表面受容体に結合する増殖因子に基づき、細胞内シグナル伝達分子を活性化する。これらの脂質キナーゼはホスファチジルイノシトールと関連化合物のイノシトール環を３−プライム位置でリン酸化する；それらはホスファチジルイノシトール（「ＰtdＩn」ともいう）とホスホイノシチド（「ＰＩ」：ホスファチジルイノシトールのリン酸化体である）の両方をリン酸化し得る。
【００７０】
これらの反応産物は、増殖シグナル伝達経路において二次メッセンジャーとして働き、細胞生存、移動、運動性、および増殖などの細胞事象；発癌性形質転換；組織血管新生；および細胞内タンパク質往来などに影響を与える。細胞表面受容体は、ホスファチジルイノシトール４,５−ビスホスフェート３などの第二メッセンジャーの産生を誘発し、それが細胞表面から細胞質へのシグナルを運搬する。これらの第二メッセンジャーはＰＩ３Ｋ−依存性タンパク質キナーゼ−１を活性化し、それが次にキナーゼＡＫＴを活性化する。ＡＫＴの活性化はタンパク質のリン酸化に導き、細胞の生存に導く（Cantley et al. (1999) PNAS 96:4240）。
【００７１】
一例を示すと、ＡＫＴはＩκＢをリン酸化し、それによってＮＦκＢを活性化し、細胞の生存を促進する。また、ＡＫＴはＢad（プロアポトーシスＢcl−２ファミリーのメンバー）およびカスパーゼ９をリン酸化し、その両方の場合にアポトーシスの誘発を遮断する。ＡＫＴの他の下流標的はフォークヘッド関連転写因子−１およびラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）を包含する。
【００７２】
ＰＩ３Ｋは３つのクラスにグループ分けされ、その構造、基質特異性、生理的機能、および組織特異性に従って分類される。（Domin et al. (1997) FEBS Lett. 410:91）。クラスＩのＰＩ３Ｋは殆ど細胞質ゾルであり、ｐ１１０触媒サブユニットとアダプター／調節サブユニットからなるヘテロ二量体であり、またさらに２つのクラス、すなわち、クラスＩＡ ＰＩ３ＫおよびクラスＩＢ ＰＩ３Ｋに分割される；クラスＩＡ ＰＩ３Ｋは、ＳＨ２ドメイン含有サブユニットｐ８５と会合し、チロシンキナーゼ−カップル結合膜透過受容体の大多数により活性化されるｐ１１０触媒サブユニットからなる；クラスＩＢ ＰＩ３Ｋは、ｐ１１０γ触媒ユニットと会合し、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク−カップル結合受容体により活性化されるｐ１０１調節サブユニットからなる（Katso et al. (2001) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615）。クラスIIＰＩ３Ｋは本明細書にて考察するように、３つのイソ型からなる。クラスIIIＰＩ３Ｋは基質としてホスファチジルイノシトールのみを利用し、リソソームを経由してタンパク質が往来する上で本質的な役割を演じる（Volinia, et al. (1995) EMBO J. 14:3339)。
【００７３】
ホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩ３Ｐ）は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によるＰＩのリン酸化産物である。殆どの真核細胞におけるＰＩ３Ｐの主たる起源はＰＩ３ＫＣ３であるが、すべてのＰＩ３Ｋがこの脂質をインビトロで生成し得る。ＦＹＶＥドメインをもつタンパク質（その多くは小胞往来に関与している）は、特定の膜での局在化メカニズムとしてＰＩ３Ｐの頭部基に直接結合する。
【００７４】
ＶＰＳ３４
ＶＰＳ３４遺伝子産物（ＶＳＰ３４ｐ）は酵母のリソソーム様小胞にタンパク質選択するために必要な酵素であり、細胞内タンパク質往来決定を調節するものと思われる。ＶＳＰ３４ｐはウシ・ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼの触媒サブユニット（ｐ１１０サブユニット）と顕著な配列類似性を共有するが、これは活性化された細胞表面受容体チロシンキナーゼと相互作用することが知られている。ＶＰＳ３４遺伝子を欠失しているか、またはＶＰＳ３４点突然変異を担持する酵母株は、検出可能なＰＩ３−キナーゼ活性を欠き、小胞タンパク質選択に致命的な欠陥を示した。ＶＰＳ３４ｐの過剰発現はＰＩ３−キナーゼ活性の増大を招き、この活性はＶＰＳ３４ｐに対する抗血清により特異的に低下した（Schu et al. (1993) Science 260 (5104): 88）。
【００７５】
第三のクラスのＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３ＫＣ３はサッカロミセス・セレビシエ遺伝子ＶＰＳ３４に関係する。ＶＰＳ３４のヒト相同体はＶＰＳ１５ｐと呼称されるＳer／Ｔhrキナーゼと複合体形成する。３種のＰＩ３キナーゼの内、このキナーゼは最も限定された基質特異性を有し、ＰtdＩnsに厳しく限定される。クラスＩＡ ＰＩ３−キナーゼ同様に、ＰＩ３ＫＣ３（例えば、ｈＶＰＳ３４）はＳ６Ｋ１の調節において、従って栄養素−感受性においてよく認識された役割を演じている。
【００７６】
ｈＶＰＳ３４はＳ６Ｋ１へのインスリン・インプットの重要な部分ではない（すなわち、インスリンによる刺激を受けない）。しかし、ｈＶＰＳ３４はアミノ酸またはグルコース飢餓により阻害される；このことはそれがＳ６Ｋ１への栄養素−調節経路上に存在することを示唆している。このことと矛盾なく、ｈＶＰＳ３４はまたＡＭＰ−活性化キナーゼの活性化によっても阻害され、それがグルコース飢餓細胞においてｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋ１を阻害する。ｈＶＰＳ３４は、ｈＶＰＳ３４の短鎖干渉ＲＮＡノックダウンがｍＴＯＲ基質４ＥＢＰ１のリン酸化を阻害するので、ｍＴＯＲの上流に存在すると思われる。ｈＶＰＳ３４は、ｍＴＯＲとＳ６Ｋ１へのアミノ酸とグルコースのインプットを統合する栄養素−調節脂質キナーゼであると考えられる。
【００７７】
ＭＡＰＫＡＰ
ＭＡＰＫＡＰ（ジェンバンク登録番号：ＮＭ＿０２４１１７）（ヒトＳＩＮ１としても知られる）は、ＳＩＮ１ファミリーの高度保存オルソログであり、そのメンバーは真菌および後生動物界に広く分布している。ＭＡＰＫＡＰの非ヒト・オルソログの研究は、Ｒas、ｍＴＯＲ、およびＳＡＰＫ（ストレス活性化プロテインキナーゼ）との分子内シグナル伝達相互作用におけるこの遺伝子とそのタンパク質産物に対する役割を示唆してきた。ＭＡＰＫＡＰ転写物は、代わりとなるポリアデニル化シグナルを用い、機能的に異なるイソ型を潜在的にエンコードする多数のＭＡＰＫＡＰスプライス変異体を記述している（Schroder et al. (2004) Gene 339: 17）。ＭＡＰＫＡＰ転写変異体２（ＳＩＮ１β）は、転写変異体１がエンコードするタンパク質の残基Ｐ３２１−Ｓ３５６に相当する３６個のアミノ酸を欠失することで、全長転写体（変異体１）と異なる。合計６種のＭＡＰＫＡＰ転写変異体が報告されているが、変異体間の機能的違いについては殆ど分かっていない。免疫ブロット分析は、スプライシング変異体によりエンコードされるタンパク質が、異なる細胞株で異なって発現されると示唆している。
【００７８】
何らかの機能的違いが、選択的スプライシングから、または組織特異的発現から生じるかどうかは明瞭ではない。一つのグループ（Schroder et al. (2005) Cellular Signaling 17）が、ストレス活性化タンパク質キナーゼＪＮＫは、転写変異体１および転写変異体６（２０２個のアミノ酸のＣ末端切除とその後に追加のＡＣＤ配列を含む）によりエンコードされた外来的に発現されるタンパク質と共に、同時免疫沈降することを示している。同じグループが、全長ＭＡＰＫＡＰタンパク質の発現は、細胞のＵＶ照射後にＪＮＫキナーゼの活性化を部分的に阻害するように見えることを証明している。
【００７９】
本明細書に記載したデータが証明するように、ＭＡＰＫＡＰはｍＴＯＲとｈＶＰＳ３４両方の結合パートナーであり、これら経路間に不可欠のつながりを提供し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路間の連鎖とクロストークを解明する一助となる。さらに、本明細書に記載したデータは、ＭＡＰＫＡＰの関与する結合事象を中断することによる、これらの経路の事実上の調節を示す。
【００８０】
本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の処置、診断、および／または改善するための方法および組成物に関する。一態様において、本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害、例えば、癌の処置のための阻害性核酸の使用に関する。
【００８１】
本発明は、ｍＴＯＲの使用を介して、異常なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達に関係する障害（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）の症候を診断し、改善すること、障害を予防すること、および処置することに関する。その例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡなどのＭＡＰＫＡＰインヒビターの投与を介して、異常なｍＴＯＲシグナル伝達に関係する障害（例えば、癌および他の関連する悪性腫瘍）を処置する方法を含む。
【００８２】
さらに、本発明はｍＴＯＲのアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにその関連するタンパク質を同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボでのこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強または妨害する作用物質を同定するために、またこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００８３】
さらに、本発明はｈＶＰＳ３４（ＰＩ３ＫＣ３）のアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにその関連するタンパク質を同定および試験する方法に関する。ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間のタンパク質：タンパク質相互作用の発見は、インビボでのこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）を増強または妨害する作用物質を同定するために、またこの結合事象（またはその結果としての複合体形成）の存在または不存在と関連する障害を処置するために使用し得る作用物質を発見するために有用である。
【００８４】
ＭＡＰＫＡＰアンタゴニスト
栄養素存在下のｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路活性化の作用は、特定の結合事象、例えば、限定されるものではないが、ＭＡＰＫＡＰとｍＴＯＲの結合、ＭＡＰＫＡＰとｈＶＰＳ３４の結合、およびｍＴＯＲＣ１複合体の形成などにより仲介される。ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストは、ＭＡＰＫＡＰ（その異なるイソ型において）がｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路のメンバー（それらの置換経路メンバーを含む）に結合すること、およびそれらと複合体を形成することを防止し得る作用物質である。ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの例は、ＭＡＰＫＡＰのsiＲＮＡインヒビターである。ＭＡＰＫＡＰに結合し、それがパートナー（例えば、ｍＴＯＲまたはｈＶＰＳ３４など、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路において）に結合するのを防止する作用物質は、ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストして作用しよう。
【００８５】
スクリーニング・アッセイ
本発明はモジュレーター、すなわち、候補化合物または試験化合物またはＭＡＰＫＡＰタンパク質に、または関連する経路もしくは複合体（例えば、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路）のメンバーに結合し、ＭＡＰＫＡＰ発現もしくは活性またはｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路シグナル伝達に刺激性または阻害性作用をもつ作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド類似体、低分子または他の薬物）などのモジュレーターを同定するための方法（本明細書では「スクリーニング・アッセイ」ともいう）を提供する。
【００８６】
本発明は化合物または作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ｍＴＯＲ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ｍＴＯＲ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該化合物不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【００８７】
本発明は化合物または作用物質のスクリーニング方法であって、ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）；ii）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験薬；を提供し；ｂ）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体（例えば、ｈＶＰＳ３４）、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そしてｃ）該試験薬存在下のＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質（または類似体）：ＭＡＰＫＡＰ（または類似体）結合の変化を、当該化合物不存在下の結合と比較して測定すること；を含む、方法を包含する。
【００８８】
一態様において、本発明はＭＡＰＫＡＰタンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分に結合する候補物質または試験薬をスクリーニングするアッセイ法を提供する。別の態様において、本発明はＭＡＰＫＡＰタンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分に結合するか、またはその活性を調節する、例えば、ＭＡＰＫＡＰが通常会合する他のタンパク質（例えば、ｍＴＯＲ、ｈＶＰＳ３４）に結合する能力および／またはそれと複合体を形成する能力を調節する候補物質または試験薬をスクリーニングするアッセイ法を提供する。
【００８９】
本発明の試験薬は、当該技術分野において既知のコンビナトリアル・ライブラリー法における多くの方法のいずれかを用いて得ることができる；該ライブラリーは、生物学ライブラリー；空間的に接近可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ・１化合物」ライブラリー方法；および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法である。生物学ライブラリー法はペプチド・ライブラリーに限られるが、他の４つの方法はペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子化合物のライブラリーに適用可能である（Lam et al. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145）。
【００９０】
分子ライブラリーの合成法の例は、例えば、以下の文献に見出し得る：DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233。
【００９１】
化合物のライブラリーは、溶液として（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13: 412）、またはビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555）、細菌（Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号明細書）、胞子（Ladner ‘４０９）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865）またはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386); (Devlin (1990) Science 249: 404); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301); (Ladner, supra)上に提示してよい。
【００９２】
一態様において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ＭＡＰＫＡＰを発現する細胞と試験薬、例えば、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストと接触させ、ＭＡＰＫＡＰの活性を調節（例えば、刺激または阻害）する試験薬の能力を測定することからなる。ＭＡＰＫＡＰの活性を調節する試験薬の能力の測定は、例えば、ＭＡＰＫＡＰに結合するＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定することにより、またはＭＡＰＫＡＰとｍＴＯＲまたはｈＶＰＳ３４間の結合事象を中断するＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定することにより実施し得る。
【００９３】
ＭＡＰＫＡＰタンパク質を調節する試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定することは、直接の結合を測定することにより実施し得る。これらの測定は、例えば、ＭＡＰＫＡＰタンパク質を放射性同位体または酵素標識とカップル結合し、該タンパク質と試験薬（例えば、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニスト）との結合が複合体中の標識タンパク質を検出することにより測定し得るようにすることで実施し得る。例えば、分子、例えば、タンパク質は直接または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈにより標識することが可能であり、その放射性同位体を放射放出の直接計測により、またはシンチレーション計測により検出し得る。別法として、分子は酵素的に、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより標識して、その酵素標識を、適切な基質の生成物への変換決定により検出することができる。
【００９４】
また、相互作用物質のいずれをも標識することなく、ＭＡＰＫＡＰタンパク質を調節する試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストの能力を測定すること、またはｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４など、ＭＡＰＫＡＰに結合するタンパク質を調節する試験薬の能力を測定することも本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、ＭＡＰＫＡＰまたは試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストを標識せずに、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストとＭＡＰＫＡＰとの相互作用（ｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４など、ＭＡＰＫＡＰに結合するタンパク質）を検出することができる（McConnell et al. (1992) Science 257: 1906）。本明細書にて使用する、「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー）は、光接近可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を用いるその環境を細胞が酸性化する速度で測定する分析装置である。この酸性化速度の変化は化合物と受容体間の相互作用の指標として使用することができる。
【００９５】
さらに別の態様において、本発明のアッセイ法は無細胞アッセイ法であり、そこではタンパク質または生物学的に活性なその部分を試験薬（例えば、試験ＭＡＰＫＡＰアンタゴニスト）と接触させ、ＭＡＰＫＡＰタンパク質または生物学的に活性なその部分に結合する試験薬の能力を測定する。ＭＡＰＫＡＰタンパク質に対する試験薬の結合は、直接または間接的に上記のように測定し得る。好適な態様において、該アッセイ法はＭＡＰＫＡＰタンパク質または生物学的に活性なその部分をＭＡＰＫＡＰに結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、このアッセイ混合物を試験薬と接触させ、次いで試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力を測定することであり、その場合、試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力の測定は、ＭＡＰＫＡＰまたは生物学的に活性なその部分に優先的に結合する試験薬の能力を、既知化合物と比較して測定することからなる。
【００９６】
別の好適な態様において、該アッセイ法はＭＡＰＫＡＰタンパク質または生物学的に活性なその部分をＭＡＰＫＡＰに結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させ、このアッセイ混合物を試験薬と接触させ、次いで試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力を測定することであり、その場合、試験薬のＭＡＰＫＡＰタンパク質と相互作用する能力の測定は、ＭＡＰＫＡＰまたは生物学的に活性なその部分に優先的に結合する試験薬の能力を、既知化合物と比較して測定することからなる。
【００９７】
かかる測定はリアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）などの技法を用いて実施し得る。Sjolander et al., 1991 Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書にて使用する、「ＢＩＡ」は相互作用物質のいずれをも標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究する技法である（例えば、バイアコア；BIAcore）。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化が、生物分子間のリアルタイム反応の指標として使用し得る。
【００９８】
上記本発明のアッセイ法の１つを超える態様においては、ＭＡＰＫＡＰを固定化してタンパク質の複合体を非複合体から分離するのを容易にし、かつ、アッセイの自動化に適応させることが望ましい。試験薬のＭＡＰＫＡＰに対する結合は、反応体を収容するのに適した何らかの容器中で実施し得る。かかる容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠沈管である。一態様においては、融合タンパク質がタンパク質をマトリックスに結合させ得るドメインを加えるものとして提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／キナーゼ融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロース・ビーズ（シグマ・ケミカル；セントルイス、ミズーリ）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させ得る；次いで、これらを試験薬または試験薬および非吸着ＭＡＰＫＡＰタンパク質と組み合わせ、その混合物を複合体形成に導く条件下（例えば、塩およぼｐＨについての生理的条件）でインキュベートする。インキュベーション後に、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウエルを洗浄して非結合成分を除去し（ビーズの場合は固定化したマトリックス）、複合体について、例えば、上記のように直接または間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、結合レベルを標準的方法で測定する。
【００９９】
タンパク質をマトリックスに固定化する他の技法は、本発明のスクリーニング・アッセイにも使用し得る。例えば、ＭＡＰＫＡＰはビオチンとストレプトアビジンの接合を利用して固定化し得る。ビオチニル化ＭＡＰＫＡＰタンパク質または標的分子は、当該技術分野で周知の技法を用いてビオチン−ＮＨＳ−（Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミド）から調製可能であり（例えば、ビオチニル化キット；ピアース・ケミカルス、ロックフォード、イリノイ）、ストレプトアビジン被覆９６穴プレート（ピアース・ケミカル）のウエルに固定化する。あるいは、ＭＡＰＫＡＰタンパク質または標的分子と反応する抗体は、該プレートのウエルに誘導化し、未結合ＭＡＰＫＡＰタンパク質は抗体接合によりウエルに捕捉することができる。かかる複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加えて、ＭＡＰＫＡＰタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いての複合体の免疫検出法を包含する。
【０１００】
本発明のさらに別の局面において、ＭＡＰＫＡＰタンパク質はツー−ハイブリッドアッセイまたはスリー−ハイブリッドアッセイにおいて、「ベイト（bait）タンパク質」として使用し（参照例：米国特許第５,２８３,３１７号明細書；Zervos et al., 1993 Cell 72:223-232; Madura et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., 1993 Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993 Oncogene 8:1693-1696; and Brent WO94/10300）、ＭＡＰＫＡＰに結合する他のタンパク質を同定することができる。かかるＭＡＰＫＡＰ結合タンパク質もまたＭＡＰＫＡＰタンパク質によるシグナルの伝播に関与していると思われる。
【０１０１】
ツー−ハイブリッド・システムは殆どの転写因子のモジュラー性に基づくものであり、分離可能なＤＮＡ−結合ドメインと活性化ドメインからなる。簡単に説明すると、このアッセイでは２種類の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＭＡＰＫＡＰタンパク質をコードする遺伝子を既知の転写因子（例、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをエンコードする遺伝子に融合する。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列で、未同定タンパク質（「プレイ（prey）」または「サンプル」）をエンコードする配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してキナーゼ依存性複合体を形成し得る場合、転写因子のＤＮＡ−結合および活性化ドメインは非常に接近した状態に置かれる。この接近は転写因子に応答する転写調節部位に操作可能に連結するレポーター遺伝子（例：ＬacＺ）の転写を可能とする。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能的転写因子を含む細胞コロニーは単離して、該タンパク質と相互作用するＭＡＰＫＡＰタンパク質をエンコードするクローン化遺伝子を得るために使用する。
【０１０２】
本発明はさらに上記のスクリーニング・アッセイにより同定される新規の作用物質に関する。従って、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載した通りに同定した作用物質をさらに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載したように同定した作用物質（例：ＭＡＰＫＡＰ調節作用物質）を動物モデルで使用し、かかる作用物質での処置の有効性、毒性、または副作用を測定することができる。あるいは、本明細書に記載した通りに同定した作用物質は、動物モデルにおいて、かかる作用物質の作用メカニズムを決定するために使用することができる。さらに、本発明は本明細書に記載の処置のために上記のスクリーニング・アッセイにより同定される新規作用物質の使用に関する。
【０１０３】
ＲＮＡi
本発明は短鎖干渉リボ核酸配列（siＲＮＡ）、ならびに該siＲＮＡを用いる細胞または哺乳動物におけるＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する組成物および方法を提供する。また、本発明はＭＡＰＫＡＰ遺伝子の異常な発現を原因とするか、またはＭＡＰＫＡＰが不可欠のメンバーである経路（例えば、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路）の異常なシグナル伝達を原因とする哺乳動物における病理的症状および疾患を処置するためのsiＲＮＡを用いる組成物および方法を提供する。siＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）として既知のプロセスを経由するｍＲＮＡの配列特異的分解を方向付ける。
【０１０４】
本発明のsiＲＮＡは長さが３０個未満のヌクレオチド、一般に長さが１９〜２４個のヌクレオチドの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）からなり、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補性である。これらのsiＲＮＡの使用はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能とする。
【０１０５】
本発明によるsiＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）を仲介する。「ＲＮＡi」という用語は当該技術分野にて周知であり、標的遺伝子に相補性である領域をもつsiＲＮＡによる細胞中の１種以上の標的遺伝子の阻害を意味するものと一般に理解される。ＲＮＡiを仲介するその能力についてsiＲＮＡを試験するための種々のアッセイ法が当該技術分野で既知である（参照例：Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213）。本発明によるsiＲＮＡの遺伝子発現に対する作用は、本発明によるＲＮＡ分子で処理していない細胞と比較した場合、結果として典型的に、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％まで阻害するに至る。
【０１０６】
本発明による「siＲＮＡ」または「短鎖干渉リボ核酸」は当該技術分野で既知の意味を有し、以下の側面を含む。siＲＮＡは生理的条件下で相補性領域に沿ってハイブリッド形成するリボヌクレオチドの二本鎖からなる。これらの鎖は分離しているが、特定の態様において分子リンカーにより繋がり得る。個々のリボヌクレオチドは未修飾天然産リボヌクレオチド、未修飾の天然に存在するデオキシリボヌクレオチドであってもよいし、またはそれらは本明細書の別項に記載する通り、化学的に修飾されていても、または合成品であってもよい。
【０１０７】
本発明によるsiＲＮＡ分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡの領域に実質的に同一である二本鎖領域を含んでなる。標的遺伝子の対応する配列に１００％一致する領域が適当である。この状態は「完全に相補性」であるという。しかし、この領域は標的遺伝子の対応する領域に比較したとき、標的とされるｍＲＮＡの領域の長さにより、１個、２個または３個のミスマッチを含み得、そのままでは完全に相補性であり得ない。一態様において、本発明のＲＮＡ分子は特異的に一つの所定の遺伝子を標的とする。所望のｍＲＮＡのみを標的とするために、siＲＮＡ試薬は標的のｍＲＮＡに１００％の相同性をもち、細胞または生体中に存在する他のすべての遺伝子に対し少なくとも２個のミスマッチヌクレオチドをもち得る。特異的標的配列の発現を有効に阻害するために、十分な配列同一性をもつsiＲＮＡを分析し、同定する方法は当該技術分野において既知である。配列同一性は当該技術分野において既知の配列比較および整列アルゴリズムにより最適化してもよく（参照：Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, およびその引用文献）、例えば、デフォルト・パラメーターを用いるベストフィット(BESTFIT)ソフトウエアプログラムにて実施するスミス−ウォーターマン・アルゴリズムにより、ヌクレオチド配列間のパーセント差を計算する（例：ウイスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ）。
【０１０８】
ＲＮＡi試薬の有効性に影響を与える別の因子は、標的遺伝子の標的領域である。ＲＮＡi試薬により阻害するために有効な標的遺伝子の領域は、実験により決定し得る。適当なｍＲＮＡ標的領域はコーディング領域であろう。また、未翻訳領域、例えば、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、およびスプライス接合点である。例えば、文献（Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888）に記載されている形質導入アッセイがこの目的のために実施し得る。多くの他の適切なアッセイおよび方法が当該技術分野に存在し、当業者周知である。
【０１０９】
本発明によると、標的に相補的であるsiＲＮＡの領域の長さは、１０個ないし１００個のヌクレオチド、１２個ないし２５個のヌクレオチド、１４個ないし２２個のヌクレオチドまたは１５個、１６個、１７個または１８個のヌクレオチドであり得る。対応する標的領域に対するミスマッチがある場合、相補性領域の長さは一般に幾分長めであることが必要である。
【０１１０】
siＲＮＡはオーバーハング末端（これは標的に相補性であってもなくてもよい）を担持するか、または標的遺伝子ではなく、それ自体に相補性であるさらなるヌクレオチドを担持する可能性があるため、siＲＮＡの各分離鎖の全長は１０個ないし１００個のヌクレオチド、１５個ないし４９個のヌクレオチド、１７個ないし３０個のヌクレオチドまたは１９個ないし２５個のヌクレオチドであってもよい。
【０１１１】
「各鎖が４９個以下のヌクレオチドである」という文言は、鎖の連続的ヌクレオチドの合計数を意味し、すべての修飾したまたは未修飾ヌクレオチドを含み、該鎖の３’または５’末端に付加し得る何らかの化学的部分は含まない。該鎖に挿入される短い化学的部分は計測しないが、２つの分離鎖を結合するように設計された化学的リンカーは連続的ヌクレオチドを創出するものとは考えない。
【０１１２】
「５’末端または３’末端の少なくとも一方の１個ないし６個のヌクレオチド・オーバーハング」という文言は、生理的条件下に２本の分離した鎖から形成する相補性siＲＮＡの構造体をいう。末端ヌクレオチドがsiＲＮＡの二本鎖領域の一部であるならば、siＲＮＡは平滑末端と考える。１個以上のヌクレオチドが末端上不対合であるならば、オーバーハングが創出される。オーバーハングの長さは突出するヌクレオチドの数で測定される。突出するヌクレオチドはいずれかの鎖の５’末端または３’末端上に存在し得る。
【０１１３】
本発明によるsiＲＮＡは、両鎖の少なくとも一方に少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含めることによって、経口送達に適する高いインビボ安定性を付与する。従って、本発明によるsiＲＮＡは少なくとも１個の修飾された、または非天然リボヌクレオチドを含む。多くの既知の化学的修飾についての非常に長い記載が、公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ２００３７０９１８に開示されているので、ここでは繰り返さない。経口送達に適当な修飾については、より具体的に実施例と本明細書の記載に示されている。適当な修飾は限定されるものではないが、糖部分への修飾（すなわち、糖部分の２’位置、例えば、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基）または塩基部分（すなわち、非天然または修飾された塩基で、代わり得るヌクレオチド鎖の別の特異的塩基と対合する能力を保持する塩基）である。他の修飾はいわゆる「バックボーン」修飾であり、限定されるものではないが、リン酸エステル基の置き換え（隣接位のリボヌクレオチドを、例えば、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートにより連結）を含む。最終的に、末端修飾は時には３’キャップまたは５’キャップが有意であり得る場合を本明細書ではいう。キャップは当業者既知のより複雑な化学からなる。
【０１１４】
一態様において、本発明はＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（dsＲＮＡ）分子を提供する。dsＲＮＡは互いに相補性である少なくとも２本の配列を含んでなる。dsＲＮＡは第一の配列を含んでなるセンス鎖および第二の配列を含んでなるアンチセンス鎖を含んでなる。アンチセンス鎖はＭＡＰＫＡＰをエンコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性であるヌクレオチド配列を含んでなり、その相補性の領域はその長さが３０個未満のヌクレオチド、一般的に長さが１９〜２４個のヌクレオチドである。dsＲＮＡはＭＡＰＫＡＰを発現する細胞と接触させることにより、少なくとも４０％のＭＡＰＫＡＰの発現を阻害する。
【０１１５】
別の態様において、本発明は本発明のdsＲＮＡの１つを含んでなる細胞を提供する。該細胞は一般に哺乳動物、例えば、ヒトの細胞である。
【０１１６】
別の態様において、本発明は生体において、一般的にはヒト対象において、ＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する医薬組成物であって、１種以上の本発明のdsＲＮＡおよび医薬的に許容される担体または送達媒体を含有してなる組成物を提供する。
【０１１７】
別の態様において、本発明は細胞中のＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法であって、以下の工程を含んでなる方法を提供する：
（ａ）二本鎖リボ核酸（dsＲＮＡ）を細胞に導入し（ここで、dsＲＮＡは互いに相補性である少なくとも２つの配列を含んでなる。該dsＲＮＡは第一の配列を含んでなるセンス鎖および第二の配列を含んでなるアンチセンス鎖を含んでなる。アンチセンス鎖はＭＡＰＫＡＰをエンコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補性である相補性の領域を含んでなり、その相補性の領域はその長さが３０個未満のヌクレオチド、一般的に長さが１９〜２４個のヌクレオチドであり、また該dsＲＮＡはＭＡＰＫＡＰを発現する細胞と接触させることにより、少なくとも４０％のＭＡＰＫＡＰの発現を阻害する）；そして
（ｂ）ＭＡＰＫＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写体を分解させるために十分な時間、工程（ａ）にて産生された細胞を維持し、それによって細胞中のＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害する。
【０１１８】
別の態様において、本発明はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ−シグナル伝達が仲介する生理的プロセス、例えば、癌を処置、予防または管理する方法であって、かかる処置、予防または管理を必要とする患者に、治療的または予防的有効量の本発明の１種以上のsiＲＮＡを投与することを特徴とする方法を提供する。
【０１１９】
別の態様において、本発明は細胞中のＭＡＰＫＡＰ遺伝子の発現を阻害するベクターであって、本発明のsiＲＮＡの１つの少なくとも一本鎖をエンコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結した調節配列を含んでなるベクターを提供する。
【０１２０】
本発明の阻害性核酸化合物は、市販品として入手し得る自動化ＤＮＡ合成機、例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスター・シティ、カリフォルニア）モデル３８０Ｂ、３９２もしくは３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、または同種の機器など、常套の手段により合成し得る。ホスホルアミダイトの化学を使用してもよい。本発明の阻害性核酸化合物はまた修飾された、例えば、ヌクレアーゼ抵抗性バックボーンであってもよく、例えば、多くの文献に記載されているホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどを使用してもよい。阻害性核酸の長さは、生物活性を確実に阻害するために十分な大きさでなければならない。従って、例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの場合、特異的結合が所望の標的ポリヌクレオチドにおいてのみ起こり、他の偶発的部位では起こらないことの確実な十分な大きさであることが必要である。長さの上限範囲はいくつかの因子、例えば、長さが約３０〜４０ヌクレオチドより大きいオリゴマーを合成し、精製する不便さおよび費用、短鎖オリゴヌクレオチドよりも長鎖オリゴヌクレオチドのミスマッチに対するより大きな許容範囲などにより決定される。好ましくは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは約１５個ないし４０個のヌクレオチドの範囲の長さをもつ。より好ましくは、該オリゴヌクレオチド部分は約１８個ないし２５個のヌクレオチドの範囲の長さをもつ。
【０１２１】
二本鎖ＲＮＡ、すなわち、センス−アンチセンスＲＮＡは、また短鎖干渉ＲＮＡ（siＲＮＡ）ともいわれ、ＭＡＰＫＡＰに対する核酸の発現を阻害するためにも使用し得る。ＲＮＡ干渉は、外来性短鎖ＲＮＡ二重鎖を、その一方の鎖が標的ｍＲＮＡのコーディング領域に相当する場合に、投与する方法である（Elbashir et al.(2001) Nature 411: 494）。細胞への導入により、siＲＮＡは外来ＲＮＡ二重鎖の分解のみならず、内在するメッセンジャーＲＮＡを含め、同じ配列を有する一本鎖ＲＮＡの分解をも惹き起こす。従って、siＲＮＡは、その技術が触媒メカニズムを介して作用すると信じられるので、伝統的なアンチセンスＲＮＡ方法論よりもより強力かつ有効であり得る。好適なsiＲＮＡ分子は典型的には１９個ないし２５個のヌクレオチドの長さ、好ましくは約２１個のヌクレオチドの長さであり、Ｅ２−ＥＰＦ５の核酸配列を含んでなる。標的細胞にsiＲＮＡを送達する有効な戦略は、例えば、物理的または化学的トランスフォーメーションを用いる形質導入である。別法として、siＲＮＡは、例えば、機能的siＲＮＡまたはその前駆体の転写を可能とする種々のＰolIIIプロモーター発現カセットを用いる細胞中で発現し得る。参照例：Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3):245; Turki et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13(18):2197; Cornell et al. (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2):91。また、本発明は、例えば、マイクロ−ＲＮＡ（miＲＮＡ）および短鎖ヘアピンＲＮＡ（shＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉（ＲＮＡi）を仲介し得る他の短鎖ＲＮＡをも包含する。
【０１２２】
特記しない限り、本明細書にて使用される技術上および科学上の用語はすべて本発明が属する技術分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載したもと同様の、または等価の方法と材料は、本発明の実施または試験に使用し得るが、その適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載したすべての公表文献、特許出願、特許および他の引用文献は、その全文を参照により本明細書の一部とする。問題のある場合は、本明細書がその定義も含めて規定する。さらに、材料、方法、および例示は、説明のためのものであり、限定するためのものではない。
【実施例】
【０１２３】
実施例１：ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路の結合剤
ｍＴＯＲ／ＡＫＴ／ＰＩ３Ｋ経路の新規モジュレーターを同定するために、系統的タンデム型親和性精製（ＴＡＰ）方法をｍＴＯＲ経路の数種の既知シグナル伝達分子に適用した。参照により本明細書の一部とするRigaut et al. (Nat Biotechnol. (1999) 17(10): 1030)およびBouwmeester et al. (Nature Cell Biology (2004) 6: 97 - 105)に記載されている通り、ＴＡＰ精製法は、ＴＡＰタグ標識を対象の標的タンパク質に融合すること、およびその構築物を同じ起源の宿主細胞または生体に導入することを含む。
【０１２４】
ＴＡＰタグ標識は、（i）黄色ブドウ球菌からのプロテインＡのＩgＧ−結合単位；および（ii）ＴＥＶプロテアーゼ切断部位により分離されるカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）；との縦列融合体である。このものは複合体の組成、活性、または機能について予め知識がなくても、比較的少数の細胞から複合体を迅速に精製することを可能とする。質量分析と組合わせると、ＴＡＰ戦略は所定の標的タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を可能とする。
【０１２５】
ヒーラ（HeLa）細胞からのタンパク質複合体の精製
ＣＢＴ−ＴＥＶ−プロテインＡ二重タグとｈＶＰＡ３４の融合物をエンコードするベクターを標準法により構築した。ｈＶＰＳ３４融合導入遺伝子をエンコードするレトロウイルスを調製し、トランスデューサー・ヒーラ細胞に使用した。タンパク質はＮＰ−４０デタージェント溶解バッファーを用いて培養細胞から抽出した。この複合体はＩgＧ−連結ビーズに結合させ、ＴＥＶプロテアーゼ切断により溶出し、溶出物質をカルモジュリン含有ビーズに結合させ、次いでＥＧＴＡで溶出することにより精製した。ＴＥＶ切断を除き、各工程はすべて０〜４℃で実施した。
【０１２６】
タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、完全なゲルのレーンを系統的に切り取ってスライスとし、タンパク質はShevchenko(Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996))に記載の通り、ゲル中、トリプシンで消化した。タンパク質の同定はＬＣ−ＭＳ／ＭＳで遂行し、ＭＳデータはＥＧＩ（ヒンクストン（Hinxton）、英国）で維持されている国際タンパク質インデックス（ＩＰＩ）の自社管理版で検索した。データベースの検索結果はさらに生命情報科学分析のためにデータベースシステムに読み取った。
ＭＡＰＫＡＰはｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４と関連性のあることが判明した。
【０１２７】
実施例２：siＲＮＡ配列の生成
siＲＮＡ配列設計にはBIOPREDsi効力予測アルゴリズムを用い、２１−マーのオリゴヌクレオチドを計測する。最高値となった配列につき、実験的に規定したsiＲＮＡの選択基準に従って、特定のトランスクリプトームに対する理論的選択性について試験する。さらに、siＲＮＡはキアゲン（Qiagen）（バレンシア、カリフォルニア）およびダルマコン（Dharmacon）（ラファイエット、コロラド）により、１９塩基対二重鎖と各鎖の３’末端に２個のデオキシヌクレオチドのオーバーハングをもつ２１ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチドとして合成した。センス鎖のＤＮＡは、dＴdＴであり、一方、アンチセンス鎖のオーバーハングは、標的ｍＲＮＡに相補性であった。
【０１２８】
生成したsiＲＮＡ配列は以下のとおりである：
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防する方法であって、ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストを患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
当該ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストがsiＲＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストが低分子である請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が癌である請求項１記載の方法。
【請求項５】
該癌がアミノ酸輸送体（例えば、ＬＡＴ１）の過剰発現と関連するものであるか、またはＰＴＥＮ、ＴＳＣ１／２、もしくはＰＩ３ＫクラスＡに突然変異を担持するものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が神経変性障害である請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が代謝障害である請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が過誤腫症候群である請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が遺伝性筋障害またはミオパシーである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
患者におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防する方法であって、ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の結合事象を中断させ得る作用物質を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項１１】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防し得る作用物質を同定する方法であって：
ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ｍＴＯＲ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ｍＴＯＲ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そして
ｃ）該試験作用物質存在下のｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質：ＭＡＰＫＡＰ結合の変化を、当作用物質不存在下の結合と比較して測定する；
ことを含む方法。
【請求項１２】
当該作用物質が低分子である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防し得る作用物質を同定する方法であって：
ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ＰＩ３Ｋ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そして
ｃ）該試験作用物質存在下のＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質：ＭＡＰＫＡＰ結合の変化を、当該作用物質不存在下の結合と比較して測定する；
ことを含む方法。
【請求項１５】
当該作用物質が低分子である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
本発明は、ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の相互作用を調節する試験作用物質を同定する方法であって、
ａ）（i）ｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４に結合し得るＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；（ii）ＭＡＫＰＡＫタンパク質およびｈＶＰＳ３４に結合し得るｍＴＯＲタンパク質または同族体；（iii）ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫＡＰに結合し得るｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体；および（iv）試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体、および当該試験作用物質をいずれかの順序で混合し；そして
ｃ）該試験作用物質存在下のＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の相互作用の変化を、当該試験作用物質不存在下の相互作用と比較して測定する；
ことを含む、方法を提供する。
【請求項１８】
当該作用物質が低分子である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害の処置に有用な作用物質をスクリーニングする方法であって：
ａ）（i）ｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４に結合し得るＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；（ii）ＭＡＫＰＡＫタンパク質およびｈＶＰＳ３４に結合し得るｍＴＯＲタンパク質または同族体；（iii）ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫＡＰに結合し得るｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体；および（iv）試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体、および当該試験作用物質をいずれかの順序で混合し；および
ｃ）該試験作用物質存在下のＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の相互作用の変化を、当該試験作用物質不存在下の相互作用と比較して測定する；
ことを含む、方法。
【請求項２１】
当該作用物質が低分子である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項２０記載の方法。
【請求項１】
患者におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防する方法であって、ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストを患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
当該ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストがsiＲＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該ＭＡＰＫＡＰアンタゴニストが低分子である請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が癌である請求項１記載の方法。
【請求項５】
該癌がアミノ酸輸送体（例えば、ＬＡＴ１）の過剰発現と関連するものであるか、またはＰＴＥＮ、ＴＳＣ１／２、もしくはＰＩ３ＫクラスＡに突然変異を担持するものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が神経変性障害である請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が代謝障害である請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が過誤腫症候群である請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害が遺伝性筋障害またはミオパシーである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
患者におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防する方法であって、ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の結合事象を中断させ得る作用物質を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項１１】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防し得る作用物質を同定する方法であって：
ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ｍＴＯＲ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ｍＴＯＲ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そして
ｃ）該試験作用物質存在下のｍＴＯＲ複合体メンバータンパク質：ＭＡＰＫＡＰ結合の変化を、当作用物質不存在下の結合と比較して測定する；
ことを含む方法。
【請求項１２】
当該作用物質が低分子である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害を処置または予防し得る作用物質を同定する方法であって：
ａ）ｉ）ＭＡＰＫＡＰタンパク質に結合し得るＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質または同族体；ii）当該ＰＩ３Ｋ複合体メンバーと相互作用することの知られたＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；およびiii）１種以上のスクリーニング用試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ＰＩ３Ｋ複合体複合体メンバータンパク質または同族体、当該ＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体、および当該１種以上の試験すべき化合物をいずれかの順序で混合し；そして
ｃ）該試験作用物質存在下のＰＩ３Ｋ複合体メンバータンパク質：ＭＡＰＫＡＰ結合の変化を、当該作用物質不存在下の結合と比較して測定する；
ことを含む方法。
【請求項１５】
当該作用物質が低分子である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
本発明は、ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の相互作用を調節する試験作用物質を同定する方法であって、
ａ）（i）ｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４に結合し得るＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；（ii）ＭＡＫＰＡＫタンパク質およびｈＶＰＳ３４に結合し得るｍＴＯＲタンパク質または同族体；（iii）ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫＡＰに結合し得るｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体；および（iv）試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体、および当該試験作用物質をいずれかの順序で混合し；そして
ｃ）該試験作用物質存在下のＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の相互作用の変化を、当該試験作用物質不存在下の相互作用と比較して測定する；
ことを含む、方法を提供する。
【請求項１８】
当該作用物質が低分子である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ関連障害の処置に有用な作用物質をスクリーニングする方法であって：
ａ）（i）ｍＴＯＲおよびｈＶＰＳ３４に結合し得るＭＡＰＫＡＰタンパク質または同族体；（ii）ＭＡＫＰＡＫタンパク質およびｈＶＰＳ３４に結合し得るｍＴＯＲタンパク質または同族体；（iii）ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫＡＰに結合し得るｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体；および（iv）試験作用物質；を提供し；
ｂ）当該ＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４タンパク質または同族体、および当該試験作用物質をいずれかの順序で混合し；および
ｃ）該試験作用物質存在下のＭＡＰＫＡＰ、ｍＴＯＲ、およびｈＶＰＳ３４間の相互作用の変化を、当該試験作用物質不存在下の相互作用と比較して測定する；
ことを含む、方法。
【請求項２１】
当該作用物質が低分子である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
当該作用物質がsiＲＮＡである請求項２０記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５０２６４０（Ｐ２０１０−５０２６４０Ａ）
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２６８５６（Ｐ２００９−５２６８５６）
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６９３４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２７８５５
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６９３４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２７８５５
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]