ｐ５３ファミリーのタンパク質の機能的コンホメーションを安定化しうる有機非ペプチド化合物の同定方法
【課題】ｐ５３ファミリーのタンパク質の機能的コンホメーションを安定化しうる有機非ペプチド化合物の同定方法の提供。
【解決手段】本発明は、癌治療の分野にある。特に、本発明は、その突然変異体タンパク質が他の亘大分子と適正に相互作用する能力を保持し、それによりその野生型の活性を有する全部又は部分を回復させ又は安定化させるように、癌関連調節タンパク質の突然変異及び非突然変異形態と相互作用することができる医薬化合物を提供する。調節タンパク質は、ｐ５３タンパク質ファミリーのメンバー、例えば、ｐ５３、ｐ６３、及びｐ７３を含む。本発明に係る化合物は、癌治療のために有用である。上記の薬理学的化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【解決手段】本発明は、癌治療の分野にある。特に、本発明は、その突然変異体タンパク質が他の亘大分子と適正に相互作用する能力を保持し、それによりその野生型の活性を有する全部又は部分を回復させ又は安定化させるように、癌関連調節タンパク質の突然変異及び非突然変異形態と相互作用することができる医薬化合物を提供する。調節タンパク質は、ｐ５３タンパク質ファミリーのメンバー、例えば、ｐ５３、ｐ６３、及びｐ７３を含む。本発明に係る化合物は、癌治療のために有用である。上記の薬理学的化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｉ．産業上の利用分野
本発明は、癌治療の分野にある。本発明は、ｐ５３ファミリーの腫瘍サプレッサータンパク質と相互作用し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を提供する。本発明は、このようなタンパク質の機能的能力を矯正することが癌に対する治療を促進し得る患者における腫瘍サプレッサータンパク質の突然変異体形態を安定化するために特に適用可能である。このような化合物に関するスクリーニング方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＩＩ．発明の背景
本発明の主構造は、一緒に連結されてタンパク質のポリペプチド鎖（単数または複数）を形成するアミノ酸構築ブロックの特定の配列である。これらのポリペプチド鎖は次に、三次元構造に折り畳まれる。多数の種々の疾患は、細胞タンパク質の三次元構造の配座摂動から起きる、と目下考えられている（再検討のためには、Thomas et al., 1995, TIBS 20:456-459; Carrell et al., 1997, Lancet 350:134-138参照）。例えば、アルツハイマー病は、β−アミロイドタンパク質のミスフォールディングおよびその後の凝集により引き起こされて、細胞機能の損傷をもたらす。同様に、クロイツフェルト−ヤーコブ病に関する病原因子であるプリオンは、連鎖反応を開始して、正常プリオンタンパク質をミスフォールドプリオンタンパク質に転換することにより疾患を引き起こすと考えられる。
【０００３】
異常配座を取り入れるタンパク質は、それらが内在的にミスフォールディングを受けやすいために、またはそれらが、野生型タンパク質と比較して突然変異体タンパク質を熱力学的に不安定にする突然変異を有するために、そうし得る。疾患を引き起こすミスセンス変異の最初の例は、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３である。
【０００４】
野生型ｐ５３は、細胞周期、アポトーシスおよび新脈管形成における多重経路を協調的に制御するための転写調節因子として機能する。細胞ストレス、例えばＤＮＡ損傷、有糸分裂紡錘体ミスアッセンブリーおよび低酸素症を監視する細胞経路はすべて、ｐ５３に収斂するように見える。ｐ５３の損失は、罹患細胞および腫瘍増殖の非制御化増殖をもたらし得る。ｐ５３活性の損失は、それ自体、癌性細胞に細胞を形質転換するための引き金であり得るし、そうでないこともあるが、しかし、検出可能な癌は、ｐ５３突然変異を有するヒトにおいてより一般的であり、そして増殖するようである。実際、ｐ５３の突然変異体は、癌における最も一般的な遺伝子異常である。
【０００５】
近年、ｐ５３と相同を有する２つの付加的タンパク質、ｐ７３およびｐ６３が同定された（再検討のためには、Kaelin, 1999, J. Natl. Cancer Inst. 91:594-598参照；Yang et al., 1998, Molecular Cell 2（3）:305-16;およびYoshikawa et al., 1999, Oncogene18（22）:3415-21も参照）。ｐ５１は、ｐ４０、ｐ５１、ＫＥＴまたはｐ７３Ｌとも呼ばれてきた。これらのタンパク質はｐ５３とアミノ酸配列相同を共有するだけでなく、それらはｐ５３応答性プロモーターを活性化し、アポトーシスを誘導し得る。さらに、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、ｐ５３と先祖が関連があると思われる。したがって、同様の機能および関連アミノ酸配列を有するタンパク質関連ｐ５３の当業界で認識されたファミリーが存在する。
【０００６】
ｐ５３は、３つの別々の機能的ドメイン：即ち、転写活性化ドメインを含むＮ末端（ほぼアミノ酸1〜43）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）をコードする中央部分（ほぼアミノ酸100〜300）およびオリゴマー形成ドメインとして役立つＣ末端部分（ほぼアミノ酸319〜360）を有する複合高分子である。ｐ５３ＤＢＤの結晶構造は、高βシート含量を有するほぼ球面球形のドメインを示す。
【０００７】
ｐ５３活性は、その機能的配座を保持するタンパク質の能力に大いによっている。多数の異なる癌由来腫瘍の分析は、ＤＢＤが高頻度に突然変異化されることを明示する（Friedlander et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:25468-25478）。主な癌のｐ５３ＤＮＡ結合ドメインないに生じる多数の種々の点突然変異が存在する（Pavletich et al., 1993, Genes & Development 7, 2556-2564）が、しかしホットスポットとして知られているｐ５３ＤＢＤ内の特定残基位置は、通常、高出現率で突然変異化される。ヒト腫瘍に一般的に見出されるホットスポット突然変異は、ＤＢＤ全体に多少無作為に分散される。尿素に曝露されると、すべての高頻度突然変異化形態のｐＤＮＡのｐ５３ＤＢＤは、野生型ＤＢＤより安定性が低くなる（Bullock et al.上記）。さらに、ｐ５３突然変異体はしばしば、細胞中の熱ショックタンパク質と会合して、それらがネイティブ配座を保持することがほとんどできないという推測を導く（Finlay et al., 1988, Molecular and Cellular Biology 8:531-39）。
【０００８】
ｐ５３のＣ末端ドメインとの相互作用は、ｐ５３の細胞周期停止特性を活性化することが見出されている。特に、細胞周期進行中細胞中へのＣ末端特異的ｐ５３抗体の注入は、それらを停止し得る（Mercer et al., 1982,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6309-6312 ）。さらに詳細な研究は、Ｃ末端ドメインがＤＢＤドメインのＤＮＡ結合活性を調節することを実証した。例えば、Hupp等は、ｐ５３Ｃ末端ドメインの残基373〜381と相互作用するモノクローナル抗体Ｐａｂ421がｐ５３のある種の突然変異体形態のＤＮＡ結合活性を増強し得ることを見出した（Hupp et al., 1993, Nucleic Acids Research 21:3167-3174）。したがって、Huppと同僚等は、ｐ５３機能を回復するための試みにおいて、別々の負の調節ドメインを中和する抗体およびペプチドに焦点を合わせた（Selivanova et al.,1997, Nature Med. 3, 632-638）。しかしながら、このアプローチにより回復される位置273突然変異は、それらが高基礎ＤＮＡ結合活性を保持し、野生型タンパク質と同様の熱力学的安定性特徴を示す他の一般的突然変異体と異なる（Bullock et al., 1997,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14338-143421）。
【０００９】
当分野のその他の研究者は、突然変異体ｐ５３のＮ末端ドメインを結合する化合物の開発が、野生型ｐ５３活性を救援するための最も有効な手段であると論じている。例えば、Friedlander等は、感温性ｐ５３突然変異体のＤＮＡ結合活性を促進する能力に関して、ｐ５３上の限定エピトープと結合した多数の異なるモノクローナル抗体を試験した（Friedlander et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 25468-25478）。Ｃ末端特異的抗体ＰＡｂ421は低温で突然変異体ｐ５３にＤＮＡ結合機能を回復したが、一方、Ｎ末端特異的ｐ５３抗体、特にモノクローナル抗体Ｐａｂ1801は、高温での感温性ｐ５３突然変異体のＤＮＡ結合活性の促進により有効であった。これらの知見に基づいて、Ｎ末端との結合により1801エピトープ認識領域によく似る小分子の開発は、突然変異体ｐ５３中での野生型ＤＮＡ結合活性を促進する、とFriedlander等は推測した。特に、Friedlander等は、ｐ５３タンパク質の中心部分（ＤＢＤドメイン）におけるエピトープに特異的な抗体がＤＮＡ結合活性に影響を及ぼさないことを実証した。それらの結果の説明の１つとして、タンパク質内の一ドメインの配座が離れたドメインを用いることにより安定化される、とFriedlander等は仮定した。一般的に生じるｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン突然変異体における熱力学的安定性の変化はかなり小さい、とBullock等は実証し、Friedlander等により示唆されたようなｐ５３に関する小分子療法の開発（即ち、Ｎ末端と結合する分子）は実行可能であると推測した（Bullock et al., 1997、上記）。
【００１０】
抗癌化合物を同定するためのその他のより包括的アプローチは、細胞ベース検定（例えば、腫瘍細胞株）または動物検定における小分子の直接抗腫瘍活性の検定に集中した。考え得る抗腫瘍活性を有する多数の小分子が記載されている（Mazerska et al., 1990, Anti-Cancer Drug Design 5, 169-187; Su et al., 1995, J. Med. Chem. 38, 3226-3235; Nagy et al., 1996, Anticancer Research 16, 1915-1918; Wuonola et al., 1997, Anticancer Research 17, 3409-23）。Mazerska等は、その抗腫瘍特性がＤＮＡを結合し、共有的鎖間架橋を生じるそれらの能力に寄与するアクリジン基と結合したニトロ基を有する一連のニトロ−９−アミノアクリジンを記載する。Su等は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤として開発された、置換された種々の位置のアニリノおよびアクリジン環系を有する一連の９−アニリノアクリジン誘導体を記載する。Nagy等は、短炭素リンカーを介して尿素またはフタルイミドベースの基に結合される一連のフェノチアジン関連化合物を記載する。この種類の化合物の抗腫瘍細胞活性は、カルシウムチャンネルおよびカルモジュリンと反応するそれらの能力に由来する、とNagy等は推測した。Wuonola等（上記）は、Nagy等（上記）が記載した化合物と同様のフェノチアジン化合物を記載する。
【００１１】
今日まで、腫瘍抑制活性のような野生型活性を回復または安定化するためにｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用する小有機非ペプチド分子は報告されていない。さらに、このような化合物の発見は、高スループットスクリーンまたは検定の欠如により妨げられてきた。
【発明の開示】
【００１２】
ＩＩＩ．発明の要約
ヒトの疾患と関連する熱力学的不安定タンパク質またはミスフォールディングタンパク質を配座的に安定化し得る化合物を同定することの重要性を認識し、このような化合物が迅速に同定される高スループット検定の欠如を認識して、本発明人は、突然変異体ｐ５３を配座的に安定化する作用物質を迅速に同定するためのモデル系として、in vitroおよびin vivo検定における単離突然変異体ｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の使用を研究した。本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質中の野生型活性を促進するヒト製剤を含めた化合物を客観的に同定するための迅速で、信頼性があり且つ正確な方法を提供する。
【００１３】
したがって、本発明は、非ペプチド有機化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用し、そしてその野生型活性を促進し得る、という最初の例証を提供する。生理学的温度またはその付近で、これらの活性化合物は、種々の突然変異体ｐ５３タンパク質だけでなく、野生型ｐ５３タンパク質においても、ｐ５３の野生型活性を促進した。このような化合物は、抗癌薬としての重要な用途を有する。したがって、本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の突然変異体または野生型活性による癌の抗腫瘍療法に有用な新規のアプローチおよび化合物を提供する。
【００１４】
一局面において、本発明は、突然変異体形態のｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の野生型活性を促進する方法であって、生理学的条件下での機能的配座を保持する前記タンパク質の無能力により前記タンパク質の１つ又はそれ以上の機能的活性が少なくとも部分的に減損される方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物と突然変異体タンパク質を接触させて、そして安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程からなる方法を提供する。ｐ５３ファミリーのヒトタンパク質は、例えばｐ５３、ｐ６３またはｐ７３であり得る。好ましい実施態様では、有機非ペプチド化合物はｐ５３と、さらに好ましくはｐ５３のＤＮＡ結合ドメインとさえ相互作用する。
【００１５】
本発明は、別の実施態様では、１つ又はそれ以上の野生型活性低減を示すｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質の発現に関連した疾患状態に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与して、そして患者中の安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法も提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、癌に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下でｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与して、そこでの機能的配座を安定化し、そして安定化タンパク質をタンパク質の野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法を提供する。
【００１６】
別の局面では、本発明に用いるための有機非ペプチド化合物は、特定長のリンカーにより一緒に結合される疎水性基（例えば、平面多環式）および陽イオン性基（好ましくはアミン）の両方を含有する化合物であり得る。
好ましい局面では、本明細書中で用いるための有機非ペプチド化合物は、以下の：
【００１７】
【化１】
【００１８】
からなる群から選択されるが、この場合、Ｉ基：
【００１９】
【化２】
【００２０】
に関しては、
Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19
（ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
Ｒ6は、
（ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、
（ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル
であり、
Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、
ＩＩ基：
【００２１】
【化３】
【００２２】
に関しては、
Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル（ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）または（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択される）であり、
ＩＩＩ基：
【００２３】
【化４】
【００２４】
に関しては、
Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
ＩＶ基：
【００２５】
【化５】
【００２６】
に関しては、
Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
Ｖ基：
【００２７】
【化６】
【００２８】
に関しては、
Ａは炭素または窒素であり、
Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、そして
Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択される。
【００２９】
さらに、本発明の実施に有用な多数の化合物はそれ自体新規であり、このような化合物についてのその場合の説明は、本発明のさらなる局面を定義する。
本発明は、別の局面で、ｐ５３ファミリーの野生型活性を促進するさらに別の化合物の設計方法も提供する。本方法は、仮定を説明するために本発明の活性化合物の１つを用いて、仮定に適合する候補化合物を同定し、そして候補化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進するか否かを確定することを必然的に伴う。
【００３０】
本発明の別の局面は、ｐ５３ファミリーのタンパク質とそのタンパク質と相互作用し、そのタンパク質の野生型活性を促進する非ペプチド化合物との複合体を包含する組成物である。
さらに別の局面では、本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物に関するスクリーニング方法を提供する。好ましい局面では、本方法は、ｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用する化合物に関して検定し、本化合物の存在下でｐ５３ＤＢＤの配座を測定することを包含する。しかしながら、本発明は、スクリーニングのこのような方法におけるｐ５３ファミリーの全長および部分タンパク質の使用も意図する。特定の実施態様では、検定および測定工程は、同時に実施される。ｐ５３ファミリーの突然変異体形態のタンパク質中の野生型活性を促進することが発見された化合物は、任意に、腫瘍増殖を停止または抑制するそれらの能力に関してin vivoでスクリーニングされる。本発明の別の局面は、ｐ５３ＤＢＤとの特異的相互作用に関して有機非ペプチド化合物をスクリーニングすることによる薬剤発見方法である。
【００３１】
ｐ５３ファミリーの突然変異体または野生型タンパク質中での野生型活性を促進する化合物の同定での本発明の成功は、本発明の方法が、配座的欠陥または不安定タンパク質により誘導される種類の疾患のための薬剤発見に広範に適用可能であることを実証する。このようなタンパク質標的の例としては、ｐｐ６０src、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節因子、ヘモグロビン、プリオンタンパク質、セルピンおよびβ−アミロイドタンパク質が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
Ｖ．発明の詳細な説明
腫瘍サプレッサー遺伝子生成物ｐ５３における機能損失は、多数の異なる種類の癌において観察される非制御化増殖および／またはアポトーシスの損失を引き起こし得る。ｐ５３が癌細胞中で突然変異化されない場合でも、このような細胞中での野生型ｐ５３活性促進は、癌性表現型を抑制し得る。本発明は、有機非ペプチド化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用して、そこでの機能的配座を安定化し得る、ということを初めて実証する。したがって、このような化合物は、すべての種類の癌の治療のための製剤としての重要な用途を有する。
【００３３】
したがって、一局面において、本発明は、突然変異体形態のｐ５３ファミリーのヒトタンパク質における野生型活性の促進方法であって、生理学的条件下での機能的配座を保持するタンパク質の無能力によりタンパク質の１つ又はそれ以上の機能的活性が少なくとも部分的に減損される方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物と突然変異体タンパク質を接触させて、そして安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程からなる方法を提供する。ｐ５３ファミリーの突然変異体ヒトタンパク質は、突然変異体ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３タンパク質であり得る。好ましい実施態様では、有機非ペプチド化合物は、ｐ５３と、さらに好ましくはｐ５３のＤＮＡ結合ドメインと相互作用する。
【００３４】
本発明は、別の実施態様では、１つ又はそれ以上の野生型活性低減を示すｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質の発現に関連した疾患状態に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合して、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与し、そして患者中の安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法も提供する。
【００３５】
さらに別の実施態様では、本発明は、癌に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下でｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与して、そして安定化タンパク質をタンパク質の野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法を提供する。本発明の方法で安定化されるｐ５３ファミリーのヒトタンパク質は、野生型または突然変異体タンパク質、例えばｐ５３、ｐ６３またはｐ７３であり得る。
【００３６】
ｐ５３ファミリーのタンパク質は種々の癌中で突然変異体であるが、しかしそれでもいくつかの癌または癌細胞型では、ｐ５３（ｐ５３それ自体が最も多数の試験を受けている）ファミリーのタンパク質の構造または機能は、関与細胞が野生型コード対立遺伝子を保持する場合でも、変更される。例えば、ウイルスタンパク質がｐ５３タンパク質を分解するか、あるいはｐ５３が、例えば癌遺伝子の発現生成物により不活性化されるかまたは分解されるウイルス関連癌の考察に関しては、Kaelin（1999）を参照していただきたい。細胞調節工程におけるｐ５３ファミリーのタンパク質の重要性が示された場合、このようなタンパク質の寿命および／または構造および／または活性が正常である細胞中で生理学的条件下で、本発明の化合物が非突然変異体ｐ５３ファミリー成員の機能的配座を安定化するのにも有用である、ということは明らかである。したがって、本発明の化合物は、ｐ５３タンパク質および同様の物質の機能が眼精状態の存在により実質的に影響を及ぼされない癌の治療において、ならびにその異常が未だ異常ｐ５３（またはｐ５３ファミリー成員）の機能、寿命または構造に検出可能的に拡がっていない前癌細胞を発現する組織の治療においても有用である。さらに、悪性疾患の部位に隣接するか、そうでなければ身体中の悪性細胞と接触するようになる健常細胞中のｐ５３ファミリーのタンパク質をさらに安定化する（例えば、寿命を増大させる）ことにより、癌の拡張が制御され得る。本発明の化合物は、この点でも有用である。
【００３７】
本発明の実施によれば、ｐ５３ファミリーのタンパク質は、哺乳類ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３、および／または１つ又はそれ以上の（１）転写活性化に必要とされるＮ末端ドメイン、（２）ＤＮＡ結合ドメイン、または（３）哺乳類ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３のオリゴマー形成ドメインと少なくとも50％、さらに好ましくは80％のアミノ酸配列相同をすべてが有するドメインを保有するタンパク質と定義され、この場合、前記の相同は、認可アルゴリズムBLASTP v.2.0（www.ncbi.nlm.nih.gov）（Altschul et al., 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, "The BLAST Algorithm"; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402）およびW.U.-BLAST-2.0（Washington University, St. Louis, MO, USAから利用可能）のいずれかにより測定され、そして前記のタンパク質は、ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３の特性を示していると当業界で認識される少なくとも１つの機能（例えば、ｐ５３応答性プロモーターを活性化し、アポトーシスを誘導する能力。当業界認知特性に関しては、前記で引用したKaelin, 1999; Yang et al., 1998;およびYoshikawa et al., 1999参照）を立証する。BLAST, Smith-WatermanおよびFASTAアルゴリズムの手法および利点についての一般的考察に関しては、Nicholas et al., 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods"（www.psc.edu）およびそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００３８】
ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型配座を安定化する化合物は、ｐ５３ファミリーのタンパク質との接触時に、タンパク質の野生型活性、例えばＤＮＡ結合親和性または任意の高分子物質と相互作用する能力を促進または回復してｐ５３ファミリーのタンパク質の正常機能を実行する化合物である。ｐ５３のその他の野生型活性としては、転写活性化活性（例えば、ＷＡＦ１誘導）、細胞周期停止およびアポトーシス誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
さらに別の局面において、本発明は、腫瘍増殖を抑制しおよび／または癌を治療するための本発明の化合物の使用を含む。本発明の特有の利点は、本明細書中の方法を用いてそのように同定された化合物が、スクリーンに用いられる野生型ｐ５３ＤＢＤおよび突然変異体ＤＢＤだけでなく、他の突然変異体ｐ５３およびｐ５３ＤＢＤの活性配座も安定化することが示されていることである。したがって、そのように同定された化合物は、種々の癌の治療に際して、広範な適用可能性を有する。
【００４０】
本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型配座を促進し、ｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質に対して野生型活性を回復し得る化合物に関するスクリーニングの新規の方法も提供する。本発明の方法を用いて同定される化合物は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性の欠陥と関連する癌のような疾患を治療するのに有用である。
【００４１】
本発明の方法は、ｐ５３ファミリーのタンパク質と直接接触するものに関して化合物をスクリーニングすることを含む。このような方法は、スクリーニング目的のためのｐ５３ファミリー（突然変異体または野生型）の全長タンパク質、あるいは少なくともＤＢＤを、そして任意にＮ末端および／またはＣ末端ドメインを含有する欠失誘導体を用い得る。しかしながら、本発明の好ましい局面では、スクリーンは、無傷ＮまたはＣ末端ドメインを伴わずにＤＢＤのみを含有するｐ５３ファミリーのタンパク質のポリペプチド断片を使用する。したがって、本出願のために、「ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＤＢＤ」という用語は（別記しない限り）、無傷ＮまたはＣ末端を伴わずにただｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＢＤを含むものと理解される。しかしながら、このようなＤＢＤドメインは、検定フォーマットによって異種ポリペプチドと融合され得る（例えば、ＦＬＡＧエピトープまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質）。したがって、ＤＮＡ結合に及ぼす負の調節作用を単に除去するというよりむしろ、本発明の方法および化合物は、ｐ５３ファミリーの野生型および突然変異体タンパク質の両方の配座安定性の増強を促進する。
【００４２】
したがって、非限定的実行例により以下に説明される一局面において、本発明は、ｐ５３ＤＢＤと特異的に相互作用する化合物に関してスクリーニングし、そして被験化合物の存在下でｐ５３ＤＢＤの配座を測定する方法を提供する。任意に、ｐ５３ＤＢＤは、突然変異体ｐ５３ＤＢＤである。しかしながら、野生型ｐ５３ＤＢＤは、大量に過剰生成するのがより容易である。スクリーニング検定は細胞ベースのフォーマットで実施され得るが、しかしｐ５３ＤＢＤを標的にする化合物に特異的な高スループットスクリーンに関しては、in vitroベースの検定が最も直接的で且つ望ましい。ｐ５３ＤＢＤに対する初期スクリーンで同定された化合物は、無傷ｐ５３（ｐ５３ミスセンス突然変異体を含む）の機能に及ぼすそれらの作用に関してさらに検査され得る。これらの方法を用いて同定される化合物も、本発明の範囲内である。
【００４３】
本発明の目的で、ｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互作用する化合物に関する検定は、包含されない化合物がＤＢＤを特異的に標的とし、タンパク質の他のドメインを標的としないものであるよう意図される。例えば、ＤＢＤと特異的に「相互作用する」かまたはそれに「作用を及ぼす」化合物は、必ずしもＤＢＤと安定的に結合しないという必要はない（しかし、それもあり得る）。化合物の存在下でｐ５３ファミリーのタンパク質の配座に及ぼす何らかの作用を化合物が有することで十分である。したがって、化合物は、ＤＢＤとの相互作用に関して先ずスクリーニングされ、次に、配座に及ぼすそれらの作用に関して検定されるか、あるいはこれら２つのスクリーニング工程は、ＤＢＤとの相互作用も検出するために、化合物の存在下で配座的変化を用いることにより同時に実施され得る。
【００４４】
特異的相互作用という用語は、本出願においては、非選択的疎水性相互作用により疎水性化合物とタンパク質との間に起こることが知られている種類のものを含めた非特異的形態の結合を排除するために用いられる。特異的相互作用という用語はさらに、バルク溶媒の化学特性を変えることによりタンパク質熱安定性に影響を及ぼす化合物と穂亜反応化合物の特性を区別するために用いられる。したがって、本発明のこの局面の範囲から除外されるこのような分子としては、熱安定化剤、例えばグリセロール、トリメチルアミン−オキシドおよび重水素水が挙げられる。ｐ５３ファミリーのタンパク質と特異的に相互作用する化合物は、このようなバルク溶媒または非特異的疎水性相互作用より非常に低い濃度で作用を示す。例えば、グリセロールは、600 mMで有効である。しかしながら、ｐ５３ファミリーのタンパク質と特異的に相互作用する化合物の作用は、in vitroまたは細胞ベース検定において、1 mMより低い、好ましくは100μMより低い、さらに好ましくは10μMより低い化合物の濃度で観察される。
【００４５】
本発明の実施に関連して、以下の定義が一般的に適用する。「アルキル」という用語は、本明細書中で用いられる場合、別記しない限り、直鎖、分枝鎖または環状部分あるいはそれらの組合せを有する飽和一価炭化水素基を含む。同様に、「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、それぞれ少なくとも１つの二重結合または少なくとも１つの三重結合が存在する直鎖、分枝鎖または環状部分を有する炭化水素基を定義する。このような定義は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基が別の基、例えばアルコキシまたはアルキルアミン内に存在する場合にも適用する。「アルコキシ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、「アルキル」が前記と同様であるＯ−アルキル基を含む。「ハロ」という用語は、本明細書中で用いる場合、別記しない限り、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを含む。
【００４６】
説明の便宜上、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルという用語は、本明細書中で用いる場合、ゼロまたは任意に１つ又はそれ以上の二重結合を有するシクロアルキルおよびシクロアルケニル基の両方を、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエン、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、ビシクロ［３．２．１］オクタン、ノルボルナニル等を指す。（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキルは、本明細書中で用いる場合、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、アジリジニル、オキシラニル、メチレンジオキシル、クロメニル、イソキサゾリジニル、１，３−オキサゾリジン−３−イル、イソチアゾリジニル、１，３−チアゾリジン−３−イル、１，２−ピラゾリジン−２−イル、１，３−ピラゾリジン−１−イル、ピペリジニル、チオモルホリニル、１，２−テトラヒドロチアジン−２−イル、１，３−テトラヒドロチアジン−３−イル、テトラヒドロチアジアジニル、モルホリニル、１，２−テトラヒドロジアジン−２−イル、１，３−テトラヒドロジアジン−１−イル、テトラヒドロアゼピニル、ピペラジニル、クロマニル等を指す。前記の（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル環の結合は、炭素またはｓｐ3混成化窒素異種原子を介してである、と当業者は理解する。
【００４７】
（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールは、本明細書中で用いる場合、フリル、チエニル、チアゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、ピロリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、１，３，５−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，５−チアジアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジニル、シンノリニル、プテリジニル、プリニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−［１］ピリンジニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、５，６，７，８−テトラヒドロ−キノリン−３−イル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、チアナフテニル、イソチアナフテニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、インドリル、インドリジニル、インダゾリル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンズオキサジニル等を指す。（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール基の構造の残りの部分との結合は一般的に炭素原子またはｓｐ2混成異種原子によるが、これらに限定されない、と当業者は理解する。同様に、フェニルおよびナフチルは、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールの代表的なものである。
【００４８】
図面において、一結合が図示されているが、しかしその遠位端に置かれる基に関しては同定が成されていない場合、慣用的に認識されているように、メチル基が意図される。図示されている任意の結合の非存在下では、原子価が許す場合には、当業界で容易に理解されるように、その位置は水素により占められる。したがって、Ｒ−Ｏ−の記述は、Ｒ−Ｏ−ＣＨ3を意味する。
【００４９】
Ａ．ｐ５３ファミリーのタンパク質中の野生型活性を促進する本発明の化合物
本発明の有機非ペプチド化合物は、ｐ５３ファミリーの野生型または突然変異体タンパク質に曝露されると、そのタンパク質の野生型活性を促進するあらゆる種類の化合物であり得る。好ましい化合物は、相対的に小型の（50〜150 kDの典型的タンパク質と比較した場合）有機化合物である。本発明は、ペプチドでない、そして特に抗体でない、さらにｐ５３と特異的に反応せず、それによりｐ５３ＤＢＤまたはｐ５３タンパク質の野生型配座を安定化するような化合物を初めて提供する。ペプチドでない有機化合物は、種々の理由のために、製剤として特に有用である。例えば、非ペプチド化合物は、ペプチドより非常に低免疫原性であり、粘膜またはその他の細胞層バリアにより身体中により容易に吸収され、低不安定性であり得る。
【００５０】
一局面では、本発明の方法により発見された活性化合物は、特定長のリンカーにより一緒に結合される疎水性基（例えば平面多環式）および陽イオン性基（好ましくはアミン）の両方を含有する化合物と定義され得る。疎水性位置におけるベンズイミダゾール、ベンゾキノリン、フェノチアジンおよびスチリルキナゾリンが好ましい。
【００５１】
活性陽イオン性基は、第二級および第三級アミンの両方であり、その例としては、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メチルアミン、メチルピペラジンおよびモルホリンが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の大型アミンは、フェノチアジン疎水性シリーズで試験される場合、相対的により活性であった。したがって、この状況では、大型アミンが好ましい。陽イオン性位置の正荷電基は活性であり、好ましい（下記の表１参照）。
【００５２】
本発明のこの局面に関しては、疎水性基および陽イオン性基間の間隔は、少なくともプロピル長であるべきである。プロピル長より短いリンカーは、特殊検定条件下では、実質的に低有効性であった（下記の表２参照）。したがって、約3〜5炭素結合の長さを有するリンカーが好ましい（5〜9オングストローム、さらに好ましくは6〜8オングストローム）が、しかし、プロピルリンカーの長さ（約6.5オングストローム）を有するリンカーを含有する化合物が最も活性である。ブチルリンカーの長さより長いリンカーは、ブチルリンカーの長さを有するリンカーを含有する対応する化合物より、特殊検定条件下では低有効性であった（表２）。さらに好ましいのは、的確な距離を保持する分枝鎖リンカーである。このようなリンカーは一般に、本検定では、5〜9オングストローム（そして最適には約6.5オングストローム）の正しいリンカー長を依然として保持する限り、対応する線状リンカーより活性であった。
【００５３】
したがって、一局面において、本発明の化合物は式：
Ｆ1−Ｌ−Ｆ2
を有し、Ｆ1は以下の：
【００５４】
【化７】
【００５５】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一であるかまたは異なり、そして別々に、水素、ハロゲン、メトキシおよびニトロから成る群から選択される）
から成る群から選択され、Ｌは、5〜9オングストロームの長さを有する直鎖または分枝鎖アルキルであり、そしてＦ2は第二級または第三級アミンである。別の局面では、Ｆ2は、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メチルピペラジンまたはモルホリンである。例えば、Ｆ2は、以下の：
【００５６】
【化８】
【００５７】
（式中、Ｒ4は−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3またはＨである）
から成る群から選択されるアミンであり得る。
以下で提示されるのは、本発明の種々の化合物に関する化学構造である。これらの化合物の各々は、ほぼ生理学的温度で少なくとも１つの突然変異体ｐ５３ＤＢＤにおけるｐ５３に対する配座感受性エピトープの安定性を有意に増強することが見出された。
【００５８】
１．アクリジン
【００５９】
【化９】
【００６０】
【化１０】
【００６１】
２．キナゾリン
【００６２】
【化１１】
【００６３】
３．フェノチアゾール
【００６４】
【化１２】
【００６５】
【化１３】
【００６６】
【化１４】
【００６７】
本明細書中に記載された一般設計原則によれば、本発明の実施に置いては以下の群：
【００６８】
【化１５】
【００６９】
の化合物が好ましく、この場合、 Ｉ基：
【００７０】
【化１６】
【００７１】
に関しては、
Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19
（ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記のアルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
Ｒ6は、
（ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、
（ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル
であり、
Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、
ＩＩ基：
【００７２】
【化１７】
【００７３】
に関しては、
Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル（ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）または（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択される）であり、
ＩＩＩ基：
【００７４】
【化１８】
【００７５】
に関しては、
Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
ＩＶ基：
【００７６】
【化１９】
【００７７】
に関しては、
Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
Ｖ基：
【００７８】
【化２０】
【００７９】
に関しては、
Ａは炭素または窒素であり、
Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、そして
Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択される。
【００８０】
本発明の特に好ましい化合物としては、以下の１１個の化合物が挙げられる：
【００８１】
【化２１】
【００８２】
（１−ベンジル−ピペリジン−４−イル）−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００８３】
【化２２】
【００８４】
［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００８５】
【化２３】
【００８６】
（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−チオクロマン−４−イル−アミン、
【００８７】
【化２４】
【００８８】
［１−メチル−３−（２，６，６−トリメチル−クロロヘキス−２−エニル）−アリル］−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００８９】
【化２５】
【００９０】
（７−エトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００９１】
【化２６】
【００９２】
Ｎ’−（９−フルオロ−ベンゾ［ｃ］アクリジン−７−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン、
【００９３】
【化２７】
【００９４】
Ｎ’−アクリジン−９−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン、
【００９５】
【化２８】
【００９６】
２−｛４−［４−（ベンゾ［ｇ］キノリン−４−イルアミノ）−フェニル］−ピペラジン−１−イル｝−エタノール、
【００９７】
【化２９】
【００９８】
Ｎ4−｛２−［２−（４−ブロモ−フェニル）−ビニル］−７−クロロ−キナゾリン−４−イル｝−Ｎ1，Ｎ1−ジエチル−ペンタン−１，４−ジアミン、
【００９９】
【化３０】
【０１００】
Ｎ−ベンゾ［ｇ］キノリン−５−イル−Ｎ‘−クロロヘキシル−プロパン−１，３−ジアミン、
【０１０１】
【化３１】
【０１０２】
２−［（２−ヒドロキシ−エチル）−（３−｛２−［２−（４−メトキシ−フェニル）−ビニル］−キナゾリン−４−イルアミノ｝−プロピル）−アミノ］−エタノール。
本発明の有機非ペプチド化合物は、慣用的技法を用いて合成され得る。
本発明の、そして本発明の方法に用いるための化合物は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物のプロドラッグも含む。プロドラッグは、被験動物（特にヒト）に投与した場合に、有意且つ有効量で、活性分子に転換される化合物である。
【０１０３】
本発明の化合物は、遊離酸、遊離塩基または製薬的に有効なそれらの塩の形態であり得る。このような塩は、適切な酸で化合物を処理することにより容易に調製され得る。このような酸としては、例えば無機酸、例えばhydroholic酸（塩酸、hydrobiomic等）、硫酸、硝酸、リン酸等、および有機酸、例えば酢酸、プロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、ブタンに酸等が挙げられるが、これらに限定されない。逆に、塩は、アルカリで処理することにより、遊離塩基形態に転換され得る。
【０１０４】
Ｂ．治療的終点および投薬量
本発明の方法により同定される化合物は、配座的不安定またはミスフォールド化タンパク質と関連した疾患の治療に有用である。配座的不安定またはミスフォールド化タンパク質に関連した疾患が知られており、それらの例としては、嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲ）、マルファン症候群（フィブリン）、筋萎縮性側索硬化症（スーパーオキシドジスムターゼ）、壊血病（コラーゲン）、カエデシロップ尿病（α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体）、骨形成不全（Ｉ型プロコラ―ゲンプロアルファ）、クロイツフェルト−ヤーコブ病（プリオン）、アルツハイマー病（β−アミロイド）、家族性アミロイドーシス（リゾチーム）、白内障（クリスタリン）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体）、アルファ１−抗トリプシン欠損症、テイ−サックス病（β−ヘキソサミニダーゼ）、色素性網膜炎（ロドプシン）および妖精症（インスリン受容体）が挙げられる。もちろん、本明細書中に記載した方法および化合物は、癌の治療に特に有用であり、そして突然変異体ｐ５３遺伝子に関連した癌の治療に特に有用である。
【０１０５】
開業医または患者の見解から、疾患状態、特に癌性状態に関連した望ましくない症状（例えば、疼痛、感受性、体重減少等）の事実上あらゆる軽減または防止が望ましい、と当業者は理解する。さらに、癌性状態に関しては、腫瘍塊または増殖のあらゆる低減が、腫瘍の組織病理学的病像の改善と同様に、望ましい。したがって、本出願の目的のために、「治療」、「療法的使用」または「医学的使用」という用語は、本明細書中で用いる場合、疾患状態または症状を改善するか、あるいはそうでなければ、どんな方法でも、疾患またはその他の望ましくない症状の進行を防止し、妨害し、遅延しまたは逆転する特許請求組成物のあらゆるおよびすべての使用を指す。
【０１０６】
有効投薬および治療プロトコールは、慣用的手段により確定され、実験室動物において低用量で開始し、その後、効力を監視しながら投薬量を増大して、その上で投薬レジメンを体系的に変更し得る。動物試験、好ましくは哺乳類試験は、一般に、体重１kg当たりの生物活性物質の最大耐容用量またはＭＴＤを決定するために用いられる。当業者は、効力に関して用量を定期的に推定して、ヒトを含めた他の種に対する毒性を回避する。
【０１０７】
効力についてのヒト試験が着手される前に、正常被験者における段階Ｉ臨床試験は安全用量を確立するのに役立つ。所定の被験者に関する最適投薬量を決定する場合、臨床医により多数の因子が考慮され得る。これらの中でも第一は、選定異種遺伝子生成物の毒性および半減期である。さらに別の因子としては、患者のサイズ、患者の年齢、患者の全身状態、治療中の特定の癌性疾患、疾患の重症度、患者中のその他の薬剤の存在、遺伝子生成物のin vivo活性等が挙げられる。試験投薬量は、動物試験の結果および臨床文献を考察後に選定される。
【０１０８】
実際の作業実施態様により以下に示されているように、ヒト癌の動物モデルにおける腫瘍増殖を阻害し、および／または後退させるためには、200 mg/kg/日の用量が非常に有効であった。この結果に基づいて、癌の治療のための化合物Ｘの典型的ヒト用量は、被験者の状態によって、静注により、または腫瘍塊に直接的に注入されるか、あるいは経口的に投与される0.1〜10 g／日である。異なるレベルの効力および／または毒性を有する化合物に関しては、これらの値は、もちろん、それに応じて変更される。さらに、用量は、１日当たり２回またはそれ以上の増分で投与され得る。
【０１０９】
本発明の方法に用いるための化合物は、長期および持続性投与のために徐放性移植装置としても処方され得る。このような持放性処方物の例としては、生物適合性ポリマーの複合材料、例えばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−共−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等が挙げられる。薬剤送達ビヒクル中の分解可能ポリマーの構造、選択および使用は、いくつかの出版物、例えばA. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3:279-292（1992）で検討されている。製剤処方物中のポリマーの選択および使用におけるさらに別の指針は、M. ChasinとLanger（編集）による教科書“Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems,”Vol. 45 of "Drugs and the Pharmaceutical Sciences," M. Dekker, New York, 1990および米国特許第5,573,528号（Aebischer等、1996年11月12日発行）に見出される。
【０１１０】
特に、in vivo使用が意図される場合には、本発明の種々の生化学的構成成分は、好ましくは高純度を有し、潜在的有害夾雑物（例えば、少なくともNational Food（ＮＦ）等級、一般的には少なくとも分析等級、好ましくは少なくとも製剤等級）を実質的に含有しない。合成またはその後の精製が、好ましくは、合成または精製操作中に用いられ得た可能性のあるいかなる毒性物質も実質的に含有しない生成物を生じる程度まで、所定の化合物は使用前に合成されねばならない。
【０１１１】
被験者における癌性状態の治療に用いるために、本発明は、その一局面において、本発明の方法に有効であることが示された化合物を含有するキットまたはパッケージも、滅菌充填バイアルまたはアンプルの形態で提供する。一実施態様では、キットは、単位用量または多数回用量で、即投与型処方物として、本発明の化合物、例えば化合物Ｙ、化合物Ｘまたは化合物Ｚを含有し、この場合、パッケージは、癌の治療のためのその内容物の使用説明書を一緒に含入する。あるいは、そして本発明の別の実施態様によれば、パッケージは、このような化合物を含有する滅菌充填バイアルまたはアンプルを提供する。
【０１１２】
Ｃ．ドラッグ・デリバリー方法
ｐ５３ファミリーのタンパク質、特にｐ５３ＤＢＤと相互作用するか、および／またはその野生型活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする場合の工程の各々またはすべては、候補化合物に関する高スループット検定を受けることができる。高スループットスクリーンは当業界で周知であり、多数のフォーマットのいずれかで実施され得る。例えば、ＥＬＩＳＨ、シンチレーション近接技法、競合的結合測定法および置換結合検定は有用なフォーマットである。ロボット工学技術を含めた実験室自動操作は、多数の化合物をスクリーニングするのに必要な時間を大幅に低減し、例えば、数社の名前を挙げると、Tecan、Scitec、Rosys、Mitsubishi、CRS Robotics、FanukおよびBeckman-Coulter Sagianから市販されている。候補化合物が同定された後（またはそれらの同定と同時に）、二次スクリーニングが実施されて、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性に及ぼす化合物の細胞および／またはin vivo作用を確定し得る。
【０１１３】
１．本発明の方法および組成物により標的化されるｐ５３ファミリーのタンパク質
ｐ５３は、すべての真核生物に遍在性である。したがって、本発明の方法および組成物中に用いるためのｐ５３タンパク質およびｐ５３ＤＢＤは、真菌（例えば、ビール酵母菌）、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）および哺乳類（例えば、マウスおよび／またはヒト）を含めたあらゆる真核生物細胞からであるか、またはそれに由来し得るが、しかしヒトｐ５３タンパク質が好ましい。構造および機能が関連したｐ５３の付加的哺乳類相同体、特にｐ６３およびｐ７３が同定されている。ｐ５３ファミリーのこのようなタンパク質、ならびに例えばそれらのそれぞれのＤＢＤも、本発明の方法および組成物に用いられ得る。さらに、未だ発見されていないｐ５３ファミリーのタンパク質（本明細書中で定義されたような）も、本発明の方法および組成物に用いられ得る。
【０１１４】
前記のように、ｐ５３タンパク質は、少なくとも３つの異なるドメイン、即ちアミノ末端に位置する転写活性化ドメイン、中心ＤＢＤおよびカルボキシル末端のオリゴマー形成ドメインを含有する。さらに、負の調節ドメインは、タンパク質のカルボキシル末端に出現する。ヒト癌と関連するｐ５３ミスセンス突然変異のほとんどが、ＤＢＤに生じる。本発明の方法および化合物は、このようなミスセンス突然変異のいずれかの配座の安定化に向けられる。特に好ましい標的は、残基位置175、245、248、249、273および282（全残基位置はヒトｐ５３配列に関して示されている。他の生物体からのｐ５３タンパク質中の同様の残基位置は、ヒト配列との相同アラインメントにより容易に確定され得る）での突然変異に関する１つ又はそれ以上のいわゆる「ホットスポット」を含有する突然変異体ｐ５３である。ｐ５３におけるその他の一般的突然変異は、132、135、138、141、143、146、151、152、154、157、158、159、163、173、176、179、186、194、196、213、220、237、238、241、242、258、266、272、278、280、281、285および286で起こる。これらも本発明に対する標的である。さらに、以下の突然変異体ｐ５３タンパク質：143A、173A、175S、241D、249Sおよび273Hの配座安定性を示す作業実例により、本発明を以下で説明する。
【０１１５】
ｐ５３タンパク質における、特にｐ５３タンパク質のＤＢＤにおけるミスセンス突然変異に関連した癌としては、結腸直腸癌、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、頭部および頸部の扁平上皮癌、食道癌、甲状腺癌および神経原性腫瘍、例えば星状細胞腫、神経節芽細胞腫および神経芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。前記の癌およびその他の癌は、本発明の方法および化合物により治療可能である。
【０１１６】
ｐ５３ＤＢＤは、ほぼアミノ酸残基100〜300に存在する。残基102〜292のタンパク質分解耐性コアはＤＮＡ結合に十分であることが示されており、ｐ５３ＤＢＤ結晶構造は、残基94〜312に関して解明されている（Cho et al., 1994, Science 265, 346; Friend, 1994, Science 265, 334）。したがって、本発明の方法に用いるために、ｐ５３ＤＢＤドメインのＮ末端は残基50から開始して残基110までであり、好ましくは94〜102間のどこかで開始する。ｐ５３ＤＢＤのＣ末端は、残基286〜残基340で終結し、好ましくは残基292〜312で終結し得る。
【０１１７】
「ｐ５３の熱力学的不安定化突然変異体」は、生理学的温度（即ち約37℃）でのＤＮＡ結合のようなｐ５３の１つ又はそれ以上の機能を保持しないが、低温で、または他の条件下でこのような機能（単数または複数）を回復する突然変異体である。例えば、一般的遭遇突然変異体はすべて、低温でin vitroでＤＮＡを結合する能力を保持する（Friedlander et al., 1996、上記）。
【０１１８】
２．検定フォーマット
ａ．結合検定フォーマット
ｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＢＤに簡単に結合する化合物を同定するために用いられる検定の原理は、２つの化合物を相互作用させ、結合させるための条件下で、それに十分な時間、ＤＢＤタンパク質と被験化合物の反応混合物を調製し、したがって、反応混合物中で除去され、および／または検出され得る複合体を生成することを包含する。用いられるＤＢＤ種は、スクリーニング検定の目的によって変わり得る。例えば、特定の結合ドメインと相互作用する化合物が探索される場合、その結合ドメインを含有するｐ５３ファミリーの全長タンパク質、ＤＢＤそれ自体、あるいは検定系（ラベリング、結果的に生じる複合体の単離等）に利点をもたらすタンパク質またはペプチドと融合したＤＢＤを含有する融合タンパク質が利用され得る。本技法に用いるためのＤＢＤ由来のペプチドは、ＤＢＤの少なくとも６連続アミノ酸、好ましくは10連続アミノ酸、さらに好ましくは20連続アミノ酸、さらに好ましくは30または50でさえある連続アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸を包含すべきである。
【０１１９】
スクリーニング検定は、種々の方法で実行され得る。例えば、このような検定を実行するための一方法は、ＤＢＤタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質あるいは被験物質を固相上に固着し、そして反応終了時に、固相上に固着されたＤＢＤ／被験化合物複合体を検出することを包含する。このような方法の一実施態様では、ＤＢＤ反応体は固体表面に固着され、そして固着されていない被験化合物が直接または間接的に標識され得る。種々の適切な標識系のいずれかが用いられ得る。それらの例としては、放射性同位元素、例えば125Ｉおよび32Ｐ、ある物質および蛍光標識に曝露された場合に検出可能な比色定量シグナルまたは光を生じる酵素標識系が挙げられるが、これらに限定されない。本方法の別の実施態様では、固相上に固着されたＤＢＤタンパク質が標識化抗体と複合体を形成する。その後、ＤＢＤ／抗体複合体の会合を崩壊させるその能力に関して、被験化合物が検定され得る。
【０１２０】
実際問題として、微小滴定プレートは、固相として便利に利用され得る。固着構成成分は、非共有または共有結合により固定され得る。非共有結合は、タンパク質の溶液で固体表面を単に被覆し、乾燥することにより成し遂げられ得る。あるいは、固定化抗体、好ましくは固定されるタンパク質に特異的なモノクローナル抗体が、固体表面にタンパク質を固着するために用いられ得る。表面は、予め調製され、保存され得る。
【０１２１】
検定を実行するために、固着構成成分を含有する被覆表面に非固定化構成成分が付加される。反応完了後、生成されたあらゆる複合体が固体表面に固定されたままであるような条件下で、未反応構成成分が除去される（例えば洗浄により）。固体表面に固着された複合体の検出は、多数の方法により成し遂げられ得る。予備非固定化構成成分が前標識化される場合、表面に固定された標識の検出は、複合体が生成されたことを示す。予備非固定化構成成分が前標識化されない場合には、表面に固着された複合体を検出するために、例えば予備非固定化構成成分に特異的な標識化抗体を用いて、間接標識が用いられ得る（抗体は次に、標識化抗Ｉｇ抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る）。
【０１２２】
他の実施態様では、結合は、直接または間接標識を使用せずに検出され得る。例えば、結合が起きた場合に変わる生物物理学的特性が検定され得る。このようなスクリーニングに特に有益である固体支持体系は、ＢＩＡｃｏｒｅ2000系（BIAcore, Inc., Piscataway, NJから市販）である。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）計器（http://www.biacore.com）は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象を用いて、実時間での生物特異的相互作用を監視する。ＳＰＲ効果は、本質的には、金属−液体界面での屈折率の局所的変化に影響される無限小電場である。センサーチップは、ガラスと検定される配位子またはタンパク質が化学的に連結されるカルボキシメチルデキストランマトリックスとの間の金フィルムのサンドイッチ状物から作製される。このセンサーチップは、分析物化合物がそれを通して注入され得るフローセルを形成する流体素子工学カートリッジ上に取り付けられる。センサーチップ上での配位子−分析物相互作用は、チップ表面から反射される偏光光線の角度の変化として検出される。チップとの任意の塊の結合は、金／デキストラン層中のＳＰＲに影響を及ぼす。金層中の電場のこの変化は反射光線と相互作用して、結合した塊の量に比例して反射の角度を変える。反射光は、ダイオードアレイ上で検出されて、応答単位（ＲＵ）として表される結合シグナルに翻訳される。応答は結合された塊に直接比例するので、タンパク質−タンパク質相互作用に関する速度論的および平衡定数が測定され得る。
【０１２３】
あるいは、反応は液相で実行され、反応生成物が未反応構成成分から分離され、複合体が検出される。
ｂ．ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の測定方法
ｐ５３のタンパク質の配座は、多数の異なる方法のいずれかで測定され得る。例えば、抗体は、ｐ５３ＤＢＤの配座をプローブするために用いられ得る。本発明の好ましい方法は、ｐ５３および／またはｐ５３ＤＢＤの活性（例えば、ＤＮＡ結合）または不活性（熱力学的不安定化、あるいはミスフォールド化またはアンフォールド化）配座に特異的であるモノクローナル抗体を用いる。例えば、ｐ５３ＤＢＤ上のエピトープを認識するｍＡｂ1620は、ｐ５３タンパク質の腫瘍サプレッサー活性と密接に関連する（Ball et al., 1984, EMBO J. 3:1485-1491; Gamble et al., 1988, Virology 162:452-458）。したがって、ｍＡｂ1620は、それが不活性配座をとる場合には、ｐ５３ＤＢＤを結合しない。逆に、ｍＡｂ1620により認識されるエピトープは、ｐ５３が突然変異により不活性化されるかまたは野生型ｐ５３が変性される場合に、露呈される（Bartek et al., 1990, Oncogene 5, 893-899; Stephen et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, 577-83）。配座特異的であることが知られているかまたはいずれは発見されるその他のモノクローナル抗体も、本発明の方法に用いられ得る。このような抗体は、高スループットスクリーンに容易に採用され得るために、有用である。モノクローナル抗体を含めた抗体の製造方法は、当業界で周知である。
【０１２４】
ｐ５３またはｐ５３ＤＢＤのようなｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の他の測定方法としては、染料の吸収、分光分析的（例えば、円二色性、ＮＭＲ）、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分離、特異的ＤＮＡ結合（例えば、低温と対照したものとして生理学的温度での）、および特異的タンパク質結合（例えば、ＳＶ40大型Ｔ抗原は、野生型活性配座とのみ結合し、不活性配座と結合しない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
前記のように、一般的に遭遇するｐ５３突然変異の多くは生理学的温度でＤＮＡを結合できないが、しかし低温でＤＮＡを結合する。したがって、被験化合物の存在下でのｐ５３ファミリーのタンパク質の配座を測定する一局面は、温度依存性である。好ましくは、配座は、生理学的温度（約38℃）で測定される。適切な範囲は20℃〜50℃、さらに好ましくは35℃〜42℃である。標的タンパク質の配座はさらに、2〜3分から数時間までまたはそれ以上の時間に亘って測定され得る。野生型ｐ５３タンパク質またはｐ５３ＤＢＤがスクリーニングに用いられる場合、加熱は一般に、突然変異体ｐ５３ＤＢＤが用いられる場合よりも長時間且つ高温で実施される。本明細書中で提供された情報を用いて、当業者は適切な温度を容易に決定し得る。
【０１２６】
さらに、化合物の結合と、ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座のあらゆる変化とを同時に検定し得る。このような検定では、被験化合物の存在下でのｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の変化は、一ヒットとして点数をつけられる。ｐ５３ＤＢＤと相互作用して配座変化を引き起こす化合物に関して検定する高スループットスクリーニングは下記の例により説明されるが、それらに限定されない。これらの高スループットスクリーニングは、本発明の方法に用いるためのある種類の化合物を同定し得た。ほぼ生理学的温度で、これらの化合物は野生型および種々の突然変異体ｐ５３タンパク質上のｍＡｂ1620に対する配座感受性エピトープの安定性を増強した。低μｍｏｌ濃度の化合物は、生存細胞内のエピトープの配座安定性を一時的に増強し、突然変異体ｐ５３が転写を活性化するのを可能にした。下記でさらに詳しく記載されるように、有機非ペプチド化合物は、突然変異体ｐ５３を有する腫瘍を保有するマウスに投与された場合、ｐ５３配座および機能を変調し、天然突然変異化ｐ５３を有するヒト腫瘍異種移植片の増殖を有意に阻害した。
【０１２７】
ｃ．細胞ベースおよび動物ベースの検定
前記の一次スクリーン（単数または複数）を用いて候補化合物が同定されると、これらの系における候補化合物の作用を確定するために、細胞ベースおよび動物ベースの検定が一般に実行される。初期検定は、ｐ５３ファミリーのタンパク質をコードする突然変異体遺伝子を有する腫瘍由来の細胞株、またはｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質を発現するよう操作された細胞株を包含し得る。ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性のいずれか（またはすべて）に及ぼす候補化合物の作用が査定される。例えば、候補化合物の存在下でのＷＡＦ１の誘導は、無差別的結合特性というよりむしろ特異的ＤＮＡ結合特性を促進することにより、化合物は突然変異体ｐ５３中に機能を保存することを示す。ｐ５３またはｐ５３ファミリーのその他の成員により上向き調節されるかまたは下向き調節された任意の遺伝子が検査され得る。ｐ５３ファミリーのタンパク質のその他の活性としては、増殖抑制およびアポトーシスが挙げられる。増殖抑制は、顕微鏡的にまたはコロニー形成検定により、組織培養細胞で容易に査定される。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬ染色またはpropidium iodide染色およびフローサイトメトリーにより可視化され得る。
【０１２８】
さらに、動物ベースのモデルは、候補化合物の毒性および有効性の両方に関してスクリーニングするために用いられ得る。例えば、突然変異体ｐ５３を有する腫瘍がある動物モデルで誘導され、候補化合物が動物に投与される。毒性および腫瘍増殖または後退が査定される。このようなスクリーニングの作業例を以下に提示する。
【０１２９】
３．スクリーニングのための化合物の供給源
本発明にしたがってスクリーニングされ得る化合物としては、細胞中に入って、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性に影響を及ぼし得る小型有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。2〜3の供給元の名前を挙げると、例えばPharmacia、Arqule、Enzymed、Sigma、Aldrich、Maybridge、TregaおよびPanLabsといった会社から、多数の化合物ライブラリーが市販されている。ｐ５３ＤＢＤと相互作用する化合物に関して、天然物質または合成化学物質を含めた既知の化合物、ならびにタンパク質を含めた生物学的活性物質のライブラリーもスクリーニングし得る。しかしながら、好ましい化合物は、タンパク質またはペプチド（即ち、ペプチド結合により連結される３個またはそれ以上の一続きのアミノ酸）でない。抗体は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの断片を結合する抗原であるペプチドである。好ましい化合物は、抗体でもない。本発明の方法に用いるための化合物の特定の種類および例を以下に説明する。
【０１３０】
ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物が同定されれば、分子モデリング技法を用いて、より有効な化合物の変異体を設計し得る。分子モデリング系の例は、ＣＨＡＲＭ（Polygen Corporation, Waltham, MA）およびＱＵＡＮＴＡプログラム（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）である。ＣＨＡＲＭはエネルギー最小化および分子動力学機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、相互の分子の行動の相互作用構築、修飾、可視化および分析を可能にする。
【０１３１】
例えば、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物が同定されれば、その化合物を用いて、仮説を立て得る。以下でさらに詳述するように、好ましい仮説は、平面多環式疎水性基は、極性アミンから約5〜9オングストローム、さらに好ましくは6〜8オングストロームの間隔を置いたというものである。このような仮説は、プログラムCatalyst（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）を用いて、本発明の化合物のいずれかからもたらされ得る。さらに、Catalystは、その仮説を用いて、所有権データベース、Cambridge小型分子データベース（Cambridge, England）、ならびに上記のその他のデータベースを検索して、本発明の化合物のさらに別の例を同定し得る。
【０１３２】
本発明の化合物は、Ludi、Insight II、C2-Minimizer and Affinity（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）のようなモデリングパッケージを用いてより有効な変異体を設計するためにさらに用いられ得る。特に好ましいモデリングパッケージは、MacroModel（Columbia University, NY, NY）である。
本発明の化合物はさらに、理論的組合せライブラリーを開発するための基礎として用いられ得る。組合せライブラリーの性質はライブラリーの基礎を形成するために本発明の好ましい化合物から選定される特定の化合物、および樹脂を用いてライブラリーを合成したいという要求のような因子によっているが、しかし、本発明の化合物はＣ2−ＱＳＡＲ（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）のような組合せ設計プログラムに適した必要なデータを提供する、と認識される。
【実施例】
【０１３３】
本発明を説明してきたが、以下の実施例により本発明をさらに説明する。本発明はこれらに限定されない。
ＶＩ．実施例１：ｐ５３ＤＢＤ熱安定化検定
野生型ｐ５３ＤＢＤを用いた高スループット検定を開発した。本検定を用いて薬理学的化合物をスクリーニングし、ＤＢＤの活性配座を安定化するそれらの化合物をヒットとして点数をつけた。
【０１３４】
Ａ．材料および方法
熱安定化検定． 野生型および突然変異体ｐ５３タンパク質からの組換えＤＢＤ（残基94〜312）およびＦＬＡＧ−タグ化ｐ５３ＤＢＤを記載通りに調製した（Pavletich et al., 1993, Genes and Dev. 7, 2556-2564; Bullock et al., 1997、上記）。用いた突然変異体タンパク質は、143A、173A、175S、249Sおよび273Hであった。多数の小型分子有機化合物を試験した。化合物ストックを10 mg/mlでＤＭＳＯ中に溶解し、使用前に稀釈した。25 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ6.8、150 mMＫＣｌ、10 mMジチオトレイトールを含有する緩衝液中に、タンパク質（0.25〜1.0 ng／ウエル）を稀釈し、氷上で35分間、50 ul中でReacti-Bind微小滴定プレート（Pierce）にくっつけた。ウエルを25 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ6.8、150 mMＫＣｌですすぎ、化合物または稀釈ＤＭＳＯビヒクルを付加し、プレートを指定温度でインキュベートした。氷上にウエルを置くことによりインキュベーションを終結させた。エピトープがそれ以上変化しないようにするために、氷上にプレートを保持しながら、ＥＬＩＳＡ検定を実施した。第一抗体の付加前に、ＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ緩衝液中の冷5％スキムミルク（Difco）でウエルを１時間遮断した。モノクローナル抗体ｍＡｂ1620、ｍＡｂ240（Calbiochem）および抗−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Eastman Kodak Company）をＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ中で1:100〜1:250で稀釈し、100 ul／ウエルで30分間付加した。プレートを冷ＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ緩衝液で２回すすぎ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役抗マウスＩｇＧ（Boehringer Mannheim）とともにさらに30分間インキュベートした。ＴＭＢ展開剤（Pierce）を用いてＨＲＰシグナルを発現させ、シグナルの光学密度を、450 nmに設定したBioRadマイクロプレート読取器で読み取った。
【０１３５】
Ｂ．結果
ｐ５３ＤＢＤの配座は熱不安定性である． ｍＡｂ1620により認識されるエピトープは配座依存性であり、ｐ５３上のその存在はタンパク質の腫瘍サプレッサー活性と密接に関連する（Ball et al., 1984,上記; Gamble and Milner,1988、上記）。逆に、ｍＡｂ240により認識されるエピトープは、ｐ５３が突然変異により不活性化されるかまたは野生型ｐ５３が変性される場合に、露呈される線状エピトープである（Bartek et al., 1990, Oncogene 5, 893-899; Stephen et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, 577-583）。組換えヒトｐ５３ＤＢＤ（残基94〜312）はin vitroで活性配座から不活性配座への遷移を経て、240エピトープを蓄積しながら1620エピトープを次第に失う。微小滴定プレート上に固定された精製ｐ５３ＤＢＤを生理学適温度近くに加熱して、ＥＬＩＳＡフォーマットでｍＡｂ1620を用いてプローブした。1620エピトープは、温度および時間依存性方式で損失された（図１Ａ）。1620エピトープの損失は、ＤＢＤに結合されたＦＬＡＧエピトープが依然として十分に安定であるために、配座の損失に特異的に関連した（図１Ｂ）。さらに、1620エピトープの損失は240エピトープの出現増強と共同して起こったが、これは1620エピトープの損失がｐ５３ＤＢＤの配座的変化を反映し、固定化タンパク質の損失はそうではないことを確実にする。
【０１３６】
野生型ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの半減期は23℃で約35分であって、高温では漸増的に減少し、45℃では5分未満になった（図１Ａ）。平行して、ゲルシフト検定におけるｐ５３ＤＢＤのＤＮＡ結合能力は、溶液中で加熱時に低減された（データは示されていない）。野生型ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの半減期は、37℃で位置143突然変異体ＤＢＤの場合の約２倍であった（図１Ｃ）。この知見は、いくつかのその他の突然変異体ｐ５３タンパク質に関する熱力学的安定性低減についての以前の報告と一致し、1620エピトープがｐ５３ＤＢＤの配座をモニタリングするために利用され得ることを確定する（Bullock et al., 1997、上記）。
【０１３７】
化合物はｐ５３配座を安定化する． ＥＬＩＳＡ検定を用いて、活性ｐ５３配座を安定化し、突然変異体タンパク質に野生型機能をより良好に保持させる化合物を同定した。いくつかの化合物は、生理学的温度でのｍＡｂ1620に対するエピトープの損失を抑制した（例えば、図２Ａ参照）。ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必要な濃度を測定することにより、滴定実験において、化合物の相対能力を確定した。活性化合物は、用量依存的方法でエピトープを安定化した（図２Ｂ）。ＤＭＳＯ溶媒および活性化合物のいくつかの類似体は、安定化することができなかった（図２Ｂ。表１および２参照）。いくつかの突然変異体ｐ５３タンパク質からのＤＢＤと同様に、全長野生型ｐ５３も安定化された（データは示されていない。図２Ｃ）。化合物の存在下では、突然変異体タンパク質は、化合物の非存在下での野生型タンパク質と同様に安定であった。
【０１３８】
化合物はｍＡｂ1620に対するエピトープを保存したが、しかしそれらは、エピトープをすでに失っていたｐ５３を救援しなかった。例えば、化合物Ｙの付加前にｐ５３ＤＢＤを加熱した場合、ｍＡｂ1620反応性の増大は認められなかった。エピトープ損失速度は存在する化合物に伴って低減されたが、しかし長期加熱は1620−陽性配座の結果的損失を引き起こした。さらに、37℃でのインキュベーション前の化合物Ｙの付加および洗い落としたがってエピトープの損失を妨げなかったために、化合物はｐ５３と非可逆的に結合するとは思われなかった（データは示されていない）。これらの知見は、ｐ５３ＤＢＤと化合物との相互作用がタンパク質に、ｍＡｂ1620により認識されるような機能的配座をより安定的に保持させるモデルと一致する。
【０１３９】
活性化合物の構造． 同定された活性化合物はすべて、特定長のリンカーにより疎水性基（平面多環式）および陽イオン性基（しばしばアミン）と一緒に結合する。疎水性（Ｒ１）位置のベンズイミダゾール、ベンゾキノリン、フェノチアジンおよびスチリルキナゾリンは活性であったが、一方、これらの基および単一二環式または一環式基における微妙な変化は試験した特殊条件下では活性でなかった（表１）。ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必要な量の化合物の２つの適合対（表１参照）間に10倍より大きい差が認められた場合に、化合物は、この検定において「活性」であると称された。したがって、本検定により不活性と称された化合物は絶対的に不活性であるというわけではなく、相対的に不活性であるだけであることに留意すべきである。したがって、活性陽イオン性（Ｒ２）基としては、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メチルアミン、メチルピペラジンおよびモルホリンが挙げられた（表１）。ある種の大型アミンは、フェノチアジンシリーズで試験した場合、相対的により活性であった。Ｒ２位置の負荷電または非荷電基、例えばカルボキシルまたはベンゼン基は、本検定で明示したように、不活性であった（表１）。Ｒ１およびＲ２基間の間隔も、プロピル長より短いリンカーが相対的化合物活性を低減する場合、本検定における化合物活性にとって重要であった（下記の表２参照）。ブチルリンカーはプロピルリンカーよりわずかに低効力であったが、一方、本検定において低活性を示した化合物ではより長いリンカーが観察された（表２。データは示されていない）。的確な距離を保持する分枝鎖リンカーは一般に、対応する線状リンカーより活性であった。これらの一般的観察は本発明の範囲を限定しないが、しかし、さらなる分子を設計するための本発明の実施に用いられ得る。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
滴定実験において、ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必要な化合物の量により、相対的効力を確定した。
【０１４２】
【表２】
【０１４３】
Ｃ．考察
結果は、突然変異体ｐ５３機能の回復、ならびに抗癌療法の開発のための新規の戦略のための原理の証拠を実証する。本実施例は、単離ＤＢＤに作用してその配座安定性を促進し得る化合物の第一ファミリーの発見を報告する。
ＶＩＩ．実施例２：細胞および腫瘍中のｐ５３配座の確定
本実施例および以下の実施例では、低μモル濃度で機能して生きた細胞中および腫瘍中の突然変異体ｐ５３を変調し、天然突然変異化ｐ５３を有する腫瘍の増殖を抑制する原型化合物を示す。
【０１４４】
Ａ．材料および方法
細胞培養． ＡＴＣＣから全細胞株を入手し、10％ウシ胎仔血清（Gibco BRL）を含有する推奨培地中で増殖させた。
ｐ５３配座の確定． 約1 x 10Ｈ1299／レポーター+突然変異体ｐ５３細胞を一夜処理し、冷トリス緩衝化食塩水で3回すすぎ、1.5 mlの低張溶解緩衝液（20 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4、10 mMＮａＣｌ、20％グリセロール、0.2 mMＥＤＴＡ、0.1％トリトン−Ｘ100、10 mMジチオトレイトール、プロテアーゼ阻害剤含有）中で溶解した。2000 rpmで、4℃で5分間、細胞を微小遠心管中でペレット化し、0.5 MＮａＣｌを含有する同一緩衝液中にペレットを再懸濁することにより核抽出物を調製した。0.5 MＮａＣｌを含有する前記の緩衝液３容積を用いて、Dounceホモジナイザー中で腫瘍試料を均質化した。10,000 rpmで4℃で10分間の遠心分離により、溶解物を透明にした。ｍＡｂＤＯ−１抗体を用いてウエスタンブロットから定量されるようなｐ５３含量に関して、核抽出物を標準化し、0.05 Mの炭酸塩緩衝液、ｐＨ9.6中に1 ug/mlでのｍＡｂＤＯ−１で4℃で一夜被覆されていたMaxiSorp F96プレート（Nunc）のウエル上にｐ５３を捕獲した。冷ＰＢＳでウエルを洗浄し、ＰＢＳ中の4％スキムミルクを用いて4℃で3時間、遮断し、スキムミルク中のＨＲＰ−共役化ｍＡｂ1620抗体を用いてプローブした。抗体インキュベーションは氷上で１時間であって、その後、0.05％トゥイーン20を含有するＰＢＳ中でウエルを3回洗浄し、ＴＭＢ基質を用いてシグナルを発現させた。大量の1620−陽性ｐ５３を発現した温度シフト化（32℃）Ｈ1299／レポーター+突然変異体ｐ５３細胞からの溶解物を用いて、標準曲線を確立した。試料の定量は標準曲線の線状範囲内であり、各試料中の総ｐ５３に関して、ならびに未処理溶解物中の1620−陽性ｐ５３分画に関して補正した。
【０１４５】
Ｂ．結果
細胞中の配座の安定化． 細胞性ｐ５３の1620−陽性配座を安定化する化合物の能力を、専ら突然変異体ｐ５３を発現する生きた細胞を用いて試験した。ｐ５３を有さないＨ1299細胞を腫瘍由来突然変異体ｐ５３（位置173）を用いてトランスフェクトし、非配座感受性ｐ５３抗体（ｍＡｂＤＯ−１）をウエスタンブロットに用いて、十分量の突然変異体タンパク質を発現するクローンを選択した。ｍＡｂ1620に対するエピトープを表示する低定常状態レベルのｐ５３をトランスフェクタントからの抽出物中に検出して、突然変異体ｐ５３の小分画が活性配座を保持し得ることを確証した（Chen et al., 1993, Oncogene 8, 2159-2166）。低μモル濃度の化合物Ｘは、細胞中の1620陽性ｐ５３の定常状態分画を約５倍増大した（図３Ａ）。処置後4〜6時間で、最大レベルのエピトープ濃縮を達成した。タンパク質のアミノ末端に位置する非配座感受性エピトープに対して向けられるｍＡｂＤＯ−１との反応性により測定した場合、ｐ５３の総量は変わらなかった。
【０１４６】
Ｃ．考察
結果は、本発明の方法により同定された配座安定化化合物が生きた細胞中のｐ５３の活性配座を安定化し得ることを示す。腫瘍中の突然変異体ｐ５３を回復する化合物は、全非機能的ｐ５３プールまたはｍＡｂ1620に対するエピトープを表示するｐ５３のサブセットを標的にし得る。本明細書中に記載した化合物に関する重要な標的は、活性配座を依然として保持する新規合成突然変異体ｐ５３であると思われる。実際、化合物は1620エピトープの存続を増強したが、しかしin vitro予備加熱のために損失された1620エピトープを回復することはできなかった。新規合成ｐ５３における活性配座の安定性を増強する化合物は、時間依存的方法で機能的ｐ５３の定常状態レベルの蓄積を可能にし得る。細胞中の最大1620エピトープ増強の達成に関して観察された４時間遅延は、この仮説と一致する（図３Ａ）。
【０１４７】
ＶＩＩＩ．実施例３：ｐ５３機能の回復
Ａ．材料と方法
トランス活性化検定． ＤＯＴＡＰ陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（Boehringer Mannheim）またはリン酸カルシウムを用いて突然変異体ｐ５３タンパク質（173A、249S）をコードする発現プラスミドおよびネオマイシン選択性マーカーで細胞をトランスフェクトした。ヒグロマイシン耐性マーカーをコードするプラスミド、およびルシフェラーゼ遺伝子を誘導するＳＶ40基本プロモーターの上流に置かれる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（GenBank寄託番号S57428チミジンキナーゼの塩基番号26〜58。これは配列GCCTTGCCTで開始して、配列TGCCTTTTCで終結する）のプロモーター領域におけるｐ５３結合配列の４つのコピーから成るｐ５３レポーター遺伝子でも、細胞をトランスフェクトした。突然変異体ｐ５３発現のための付加的構築物を有するレポーター構築物で細胞のクローンをトランスフェクトすることにより、適合細胞対を調製した。適宜、ヒグロマイシンまたはＧ418を含有する培地中での増殖に関して、トランスフェクト化クローンを選択した。96ウエル組織培養プレート（Costar）中の単層細胞を化合物で処理し、基質転換検定（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、Dynatechマイクロプレートルミノメーターで定量した。
【０１４８】
ＷＡＦ１およびｐ５３発現． 培養細胞を21時間処理し、冷トリス緩衝化食塩水で3回すすぎ、掻き取って、10,000 rpmで30秒間ペレット化した後、50 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.5、0.1％ＮＰ−40、250 mMＮａＣｌ、5 mMＥＤＴＡ、50 mMＮａＦ、1 mMＤＴＴ、50 ug/mlアプロチニン、1 mg/mlPefabloc（Boehringer Mannheim）中にそれらを再懸濁した。Bradford試薬（BioRad）を用いてタンパク質濃度を確定し、5または10 ugの細胞溶解物を8〜16％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル（Novex）上に載せた。20％メタノールを含有するTowbin緩衝液（Towbin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350）中のImmobilon P膜（Millipore）上に、タンパク質を移した。32.547.5 kDa分子量マーカー間で膜を二分して、SuperBlock（Pierce）＋3％スキムミルク中で、室温で１時間遮断した。モノクローナル抗体クローンＥＡ10（CalbiochemＷＡＦ１ Ａｂ−１）を用いてＷＡＦ１発現に関してブロットの底半分をプローブし、ｍＡｂＤＯ−１（Calbiochemｐ５３Ａｂ−６）を用いて全ｐ５３発現に関してブロットの上半分をプローブした。0.1％トゥイーン20を含有するトリス緩衝化食塩水を３回取り換えてブロットを１時間洗浄した後、第二抗体ＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧを付加した。ルネッサンスＥＣＬ（DuPont）を用いて帯域を可視化し、ハイパーフィルムＥＣＬ（Amersham Life Science）に曝露した。
【０１４９】
Ｂ．結果
細胞中のｐ５３機能の回復． ｐ５３配座の安定化が野生型機能の良好な保持を生じたか否かを確定するために、ｐ５３の配列特異的転写活性を調べた。Ｈ1299細胞をｐ５３誘導性ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトし、安定クローン（Ｈ1299／レポーター）を突然変異体ｐ５３で補佐的にトランスフェクトして、レポーター遺伝子と位置173突然変異体ｐ５３の両方を発現する適合クローン（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を得た。レポーター遺伝子誘導により測定した場合、化合物は、突然変異体ｐ５３の転写活性を増強した（図３Ｂ）。Ｈ1299／レポーター細胞中で低レベルの転写活性化が観察されたが、これは、ｐ５３相同体であるｐ７３の存在によると思われる（データは示されていない）。これらの化合物がｐ７３活性を増強し得るか否かを我々は未だ確定していないが、しかしレポーター遺伝子誘導における広範なｐ５３依存性増大は、ｐ５３がこれらの細胞中での第一標的であることを示唆する。高用量での化合物の有効性は細胞剥離により制限されたので、レポーター遺伝子のｐ５３依存性活性化は相対的に小濃度範囲で起きた。転写活性の増強は、処理後12〜16時間でピークを生じた（データは示されていない）。この観察は、処理後4〜6時間目に起きた機能的ｐ５３配座の安定化御の派生的事象として生じるレポーター遺伝子発現と一致する。
【０１５０】
化合物Ｙは、レポーター遺伝子誘導検定においては、化合物Ｘより優れていた。これは、ＤＮＡ損傷を包含して、ｐ５３タンパク質のレベル上昇をもたらす化合物Ｙの二次作用によるものと思われる（図３Ｂ）。化合物Ｙは、細胞活性に必要な濃度で全ｐ５３タンパク質レベルを増強したが、化合物Ｘは増強しなかった。ＤＮＡ損傷が単に化合物Ｙによるｐ５３レポーター遺伝子誘導に寄与するだけではないことを保証するために、ＤＮＡ損傷剤アドリアマイシンの作用を試験した。アドリアマイシンは、細胞中での突然変異体ｐ５３蓄積を誘導するその能力にもかかわらず、広範囲の濃度（0.4〜40 ug/ml）内でレポーター遺伝子を誘導しなかった（データは示されていない）。これらの結果は、突然変異体ｐ５３の蓄積ではなく、配座安定化が、特異的転写活性を促進し得る、ということを実証する。特に、全ｐ５３タンパク質の定常状態レベルを上げない化合物Ｘは、配座安定化により独自にｐ５３転写機能を回復すると思われる。
【０１５１】
化合物Ｘは、突然変異体ｐ５３の存在下で、ｐ５３応答性細胞遺伝子生成物であるＷＡＦ１を上向き調節した。ｐ５３を発現しないSaos-2骨肉腫細胞を突然変異体ｐ５３発現ベクターでトランスフェクトして、２つの突然変異体（位置173または位置249）のいずれかを発現するクローンを単離した。クローンは、親Saos-2細胞と比較した場合、より低い基本レベルのＷＡＦ１を発現したが、これは、迅速増殖クローンを我々が選択したことを反映するものと思われる。これらの細胞を化合物Ｘで16時間処理し、等量のタンパク質を示す溶解物を、ｐ５３およびＷＡＦ１に関してウエスタンブロットで分析した。２つの突然変異体ｐ５３タンパク質のいずれかを発現した細胞は、処理時にＷＡＦ１の発現レベルの上昇を示したが、親Saos-2細胞は示さなかった（図４）。これらの溶解物中のｐ５３タンパク質の総量は、本質的には変わらなかった。アドリアマイシンは突然変異体ｐ５３を有するSaos-2細胞中でのＷＡＦ−１発現を誘導しなかったが、しかし野生型ｐ５３を発現するU2OS細胞中でのＷＡＦ−１発現を上昇させた（データは示されていない）。
【０１５２】
Ｃ．考察
本明細書中に記載した配座安定化剤の作用様式は、伝統的細胞傷害性抗新生物剤に関して観察されたものとは明らかに異なる。癌の化学療法に用いられる細胞障害剤は一般に、突然変異体ｐ５３を有する細胞では無効である（Lowe et al., 1993, Nature 362, 847-849; O'Connor et al., 1997, Cancer Res. 57, 4285-4300）。実際、ＤＮＡ損傷剤であるアドリアマイシンは、我々の検定において、転写活性に関して突然変異体ｐ５３を回復しなかった。細胞傷害性化合物は、正常および腫瘍細胞中での総ｐ５３タンパク質の顕著な誘導によっても検証される。化合物Ｘは細胞中または腫瘍中の総ｐ５３タンパク質レベルを誘導しなかった。ｐ５３誘導は細胞ＤＮＡ損傷の高感度測定であるので、化合物Ｘが有効濃度でＤＮＡを損傷し得るとは思われない。合わせて考えると、我々の知見は、1620陽性配座の安定化および突然変異体ｐ５３活性の機能的回復がＤＮＡ損傷非依存性メカニズムにより起こり得る、ということを示す。
【０１５３】
数通りの証拠が、タンパク質安定化に及ぼす非特異的作用を排除する。水を置換し、タンパク質分子周囲のより疎水性の微小環境を作ることにより機能するタンパク質変性の非特異的阻害剤であるグリセロールは、600 mMの濃度で細胞中の突然変異体マウスｐ５３の核局在化を回復し得る（Brown et al., 1997, J. Clin. Invest. 99, 1432-1444）。化合物Ｘは、本検定においては0.03 mMで活性であったが、これは、化合物とｐ５３との間の特異的接触を包含する非常に緻密な相互作用を示唆する（データは示されていない）。さらに、化合物Ｘが培養中およびin vivoで非常に過剰量の他のタンパク質の存在下でｐ５３配座に影響を及ぼし得るという観察（下記参照）は、ｐ５３の選択的認識と一致する。さらに、ｐ５３との化合物相互作用の性質は、ネイティブタンパク質構造との密接な結合を包含しない。遷移状態のタンパク質分子の小サブセットとの強い相互作用は、活性配座からの逸脱を遮断するか、またはネイティブ配座への方向転換を促進するよう機能し得る。
【０１５４】
ＩＸ．実施例４：腫瘍増殖検定
Ａ．材料と方法
腫瘍増殖検定． 培養細胞をＰＢＳですすぎ、1 x 106Ａ375.S2または5 x 106ＤＬＤ１細胞を90％Matrigel（Becton Dickinson）中で、20 gの雌ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲマウス（Charles River Laboratories）の片方の右脇腹に接種した。0.1％プルロニックＰ−105（BASF）を含有する生理食塩溶液中で、化合物Ｘを腹腔内投与した。カリパスを用いて腫瘍直径を二次元で測定し、腫瘍容積に変換した（Euhus et al., 1986, J. Surg. Oncol. 31, 229-234）。
【０１５５】
Ｂ．結果
in vivoでのｐ５３の変調． 化合物Ｘは、突然変異化ｐ５３を有する腫瘍中のｍＡｂ1620に対するエピトープを表示するｐ５３分画の定常状態レベルを増強した。注入Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスに、化合物を100 mg/Kgで腹腔内投与した。化合物の１回投与後に動物を屠殺し、総および1620-陽性ｐ５３発現に関して、腫瘍溶解物を分析した。総ｐ５３レベルは、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエスタンブロットで測定した場合、変化がなかった。総ｐ５３含量の小変動に対して溶解物を標準化して、ｍＡｂ1620に対するエピトープの発現に関してＥＬＩＳＡ検定で試験した。エピトープは、処理後3〜5時間内に増大された（図５）。in vivo応答の時間経過は、培養細胞の場合と同様であった（図３Ａ）。
【０１５６】
in vivo突然変異体ｐ５３の機能的回復を評価するために、処置および未処置動物からの腫瘍中のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を我々は査定した。投薬後8時間目に、最大4.5倍のレポーター遺伝子誘導が観察された（図５）。配座的および機能的応答間のタイムラグは、ルシフェラーゼ転写体の翻訳およびタンパク質の蓄積にようする時間を反映し得る。マウスにおける化合物のピーク血漿濃度は10 ug/mlであったが、これは細胞中のレポーター遺伝子の最大誘導に必要なものより低かった（データは示されていない）。したがって、培養細胞と比較して、腫瘍中のより低レベルのレポーター遺伝子誘導は、次善の曝露によると思われる。
【０１５７】
Ｃ．考察
結果は、配座安定化化合物が多数の無作為選定突然変異体を機能的に回復し得る、ということを示す。したがって、本発明の方法および化合物は、異なるｐ５３突然変異体に広範に適用可能である。例えば、小ＤＮＡ接触部位に影響を及ぼすＤＬＤ−１細胞中の位置241突然変異は、化合物Ｘの安定化活性により機能的に補足され得る。したがって、ＤＮＡ接触部位のいくつかを含めた非常に多数のｐ５３突然変異体は、活性配座の安定化時に回復され得る。
【０１５８】
化合物Ｘは、in vitroで野生型および突然変異体ｐ５３の両方の配座を安定化するにもかかわらず、in vivoで治療的選択性を実証した。実際、本化合物は安全であると思われたし、マウスに200 mg/kg／日（100 mg/kg／１日２回）で14連続日投与した場合に、脂肪は観察されなかった（データは示されていない）。選択性は、腫瘍細胞中での非常に高いレベルと比較した場合の、正常細胞中のｐ５３の非常に低い定常状態レベルによるものと思われる（Lassus et al., 1996, EMBO J. 15, 4566-4573）。さらに、腫瘍特異的ストレス、例えばＤＮＡ病変および酸素または栄養素欠乏は、ｐ５３のアポトーシス作用に対して腫瘍細胞を優先的に導き得る（Chen et al., 1996, Genes and Dev. 10, 2438-2451）。そのような場合、ｐ５３安定化化合物を放射線または遺伝子傷害性療法と組合せることにより、共働的抗腫瘍作用を成し遂げ得る。
【０１５９】
前記の明細書は、当業者が本発明を実施し得るに十分である。実際、分子生物学、医学または関連分野の当業者に明らかである本発明の実行のための前記の手段の種々の修正は、以下の特許請求の範囲内であるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１Ａ】ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。0.5 ngの野生型ｐ５３ＤＢＤをインキュベートした。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非加熱対照のパーセントとして示される。標準偏差は<10％であった。
【図１Ｂ】ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。1.25 ngのＦＬＡＧタグ化ｐ５３ＤＢＤを固定し、45℃で加熱して、抗ＦＬＡＧ、ｍＡｂ1620およびｍＡｂ240に対する残存エピトープを非加熱対照のパーセントとして示した。
【図１Ｃ】ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。ｍＡｂ1620に対するほぼ等レベルのエピトープを示した1.0 ngの野生型および位置143突然変異体ｐ５３ＤＢＤを37℃で加熱し、エピトープの安定性を非加熱対照のパーセントとして監視した。誤差バーは、４つの反復実験に関する標準偏差である。
【図２Ａ】突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 ｐ５３の配座安定性を促進する化合物Ｘ、化合物Ｙおよび化合物Ｚと呼ばれる代表的化合物。
【図２Ｂ】突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 1 ngの野生型ｐ５３ＤＢＤを固定し、化合物または等価濃度のＤＭＳＯビヒクルの存在下で45℃で30分間加熱した。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非加熱対照のパーセントとして示される。
【図２Ｃ】突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 ｍＡｂ1620に対するほぼ同レベルのエピトープを有する野生型および突然変異体ｐ５３ＤＢＤ調製物を固定し、化合物またはビヒクルの存在下で37℃で30分間加熱した。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非加熱対照のパーセントとして示される。誤差バーは、４つの反復実験に関する標準偏差である。
【図３Ａ】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 位置173突然変異体ｐ５３を発現したＨ1299トランスフェクタントを培養中で16.5 ug/mlの化合物Ｘで処理した。panｐ５３抗体、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエスタンブロットを用いて、全ｐ５３タンパク質中の小変異に関して、細胞溶解物を標準化し、ｍＡｂ1620に対するエピトープを示すｐ５３の量をＥＬＩＳＡ検定で確定した。1620陽性ｐ５３分画における増大を、未処理細胞中の1620陽性ｐ５３の分画に対して補正した。
【図３Ｂ】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 Ｈ1299トランスフェクタントをルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｈ1299／レポーター）とまたはレポーター遺伝子と適合させて、位置173突然変異体ｐ５３（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を微小滴定ウエル中で16時間処理した。野生型ｐ５３機能を示すルシフェラーゼレポーター遺伝子の誘導化発現を、化合物の非存在下での基礎レベルの発現に対して補正した。値は、４つの反復実験の平均を表す。
【図３Ｃ】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 Ｈ1299トランスフェクタントをルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｈ1299／レポーター）とまたはレポーター遺伝子と適合させて、位置173突然変異体ｐ５３（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を微小滴定ウエル中で16時間処理した。野生型ｐ５３機能を示すルシフェラーゼレポーター遺伝子の誘導化発現を、化合物の非存在下での基礎レベルの発現に対して補正した。値は、４つの反復実験の平均を表す。
【図４】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のＷＡＦ１発現の誘導 トランスフェクト化突然変異体ｐ５３タンパク質（位置173または位置249）を発現するＳａｏｓ−２細胞を、16.5 ug/mlの化合物Ｘを含有する培養中で16時間処理した。細胞溶解物を全タンパク質に関して標準化し、ウエスタンブロットで分析した。ブロットの上部を全ｐ５３に関してｍＡｂＤＯ−１でプローブし、同一ブロットの底部をＷＡＦ１に向けられる抗体でプローブした。
【図５】腫瘍におけるｐ５３配座安定性および機能の促進 Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスに、化合物Ｘの100 mg/kg腹腔内注射を１回施して、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエスタンブロットの濃度計走査を基礎にして、全ｐ５３含量に関して二つの腫瘍溶解物を標準化した。ｍＡｂ1620に対するエピトープを示すｐ５３の量をＥＬＩＳＡ検定で確定し、1620陽性ｐ５３分画における増大を、非処置腫瘍からの溶解物中の1620陽性ｐ５３の分画に対して補正した。ｐ５３転写活性の増強を査定するために、ルシフェラーゼ発現に関しても腫瘍溶解物を分析した。タンパク質濃度に関してルシフェラーゼ発現を標準化し、非処置腫瘍からの溶解物と比較した。
【図６Ａ】突然変異化ｐ５３を発現する腫瘍異種移植片の抑制 マウスに腫瘍細胞を接種し、指示されたような化合物Ｘまたはビヒクルの腹腔内注射により処置した。化合物を、１日１回（q.d.）または12時間間隔（b.i.d.）で7日間投与した。ビヒクル処置マウスには、12時間間隔で注射を施した。二次元での腫瘍直径測定により腫瘍容積を確定し、各群の5〜7匹に関して平均を出した。点線は、処置を開始した場合の初期腫瘍容積を表す。
【図６Ｂ】突然変異化ｐ５３を発現する腫瘍異種移植片の抑制 マウスに腫瘍細胞を接種し、指示されたような化合物Ｘまたはビヒクルの腹腔内注射により処置した。化合物を、１日１回（q.d.）または12時間間隔（b.i.d.）で7日間投与した。ビヒクル処置マウスには、12時間間隔で注射を施した。二次元での腫瘍直径測定により腫瘍容積を確定し、各群の5〜7匹に関して平均を出した。点線は、処置を開始した場合の初期腫瘍容積を表す。
【技術分野】
【０００１】
Ｉ．産業上の利用分野
本発明は、癌治療の分野にある。本発明は、ｐ５３ファミリーの腫瘍サプレッサータンパク質と相互作用し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を提供する。本発明は、このようなタンパク質の機能的能力を矯正することが癌に対する治療を促進し得る患者における腫瘍サプレッサータンパク質の突然変異体形態を安定化するために特に適用可能である。このような化合物に関するスクリーニング方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＩＩ．発明の背景
本発明の主構造は、一緒に連結されてタンパク質のポリペプチド鎖（単数または複数）を形成するアミノ酸構築ブロックの特定の配列である。これらのポリペプチド鎖は次に、三次元構造に折り畳まれる。多数の種々の疾患は、細胞タンパク質の三次元構造の配座摂動から起きる、と目下考えられている（再検討のためには、Thomas et al., 1995, TIBS 20:456-459; Carrell et al., 1997, Lancet 350:134-138参照）。例えば、アルツハイマー病は、β−アミロイドタンパク質のミスフォールディングおよびその後の凝集により引き起こされて、細胞機能の損傷をもたらす。同様に、クロイツフェルト−ヤーコブ病に関する病原因子であるプリオンは、連鎖反応を開始して、正常プリオンタンパク質をミスフォールドプリオンタンパク質に転換することにより疾患を引き起こすと考えられる。
【０００３】
異常配座を取り入れるタンパク質は、それらが内在的にミスフォールディングを受けやすいために、またはそれらが、野生型タンパク質と比較して突然変異体タンパク質を熱力学的に不安定にする突然変異を有するために、そうし得る。疾患を引き起こすミスセンス変異の最初の例は、腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３である。
【０００４】
野生型ｐ５３は、細胞周期、アポトーシスおよび新脈管形成における多重経路を協調的に制御するための転写調節因子として機能する。細胞ストレス、例えばＤＮＡ損傷、有糸分裂紡錘体ミスアッセンブリーおよび低酸素症を監視する細胞経路はすべて、ｐ５３に収斂するように見える。ｐ５３の損失は、罹患細胞および腫瘍増殖の非制御化増殖をもたらし得る。ｐ５３活性の損失は、それ自体、癌性細胞に細胞を形質転換するための引き金であり得るし、そうでないこともあるが、しかし、検出可能な癌は、ｐ５３突然変異を有するヒトにおいてより一般的であり、そして増殖するようである。実際、ｐ５３の突然変異体は、癌における最も一般的な遺伝子異常である。
【０００５】
近年、ｐ５３と相同を有する２つの付加的タンパク質、ｐ７３およびｐ６３が同定された（再検討のためには、Kaelin, 1999, J. Natl. Cancer Inst. 91:594-598参照；Yang et al., 1998, Molecular Cell 2（3）:305-16;およびYoshikawa et al., 1999, Oncogene18（22）:3415-21も参照）。ｐ５１は、ｐ４０、ｐ５１、ＫＥＴまたはｐ７３Ｌとも呼ばれてきた。これらのタンパク質はｐ５３とアミノ酸配列相同を共有するだけでなく、それらはｐ５３応答性プロモーターを活性化し、アポトーシスを誘導し得る。さらに、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、ｐ５３と先祖が関連があると思われる。したがって、同様の機能および関連アミノ酸配列を有するタンパク質関連ｐ５３の当業界で認識されたファミリーが存在する。
【０００６】
ｐ５３は、３つの別々の機能的ドメイン：即ち、転写活性化ドメインを含むＮ末端（ほぼアミノ酸1〜43）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）をコードする中央部分（ほぼアミノ酸100〜300）およびオリゴマー形成ドメインとして役立つＣ末端部分（ほぼアミノ酸319〜360）を有する複合高分子である。ｐ５３ＤＢＤの結晶構造は、高βシート含量を有するほぼ球面球形のドメインを示す。
【０００７】
ｐ５３活性は、その機能的配座を保持するタンパク質の能力に大いによっている。多数の異なる癌由来腫瘍の分析は、ＤＢＤが高頻度に突然変異化されることを明示する（Friedlander et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:25468-25478）。主な癌のｐ５３ＤＮＡ結合ドメインないに生じる多数の種々の点突然変異が存在する（Pavletich et al., 1993, Genes & Development 7, 2556-2564）が、しかしホットスポットとして知られているｐ５３ＤＢＤ内の特定残基位置は、通常、高出現率で突然変異化される。ヒト腫瘍に一般的に見出されるホットスポット突然変異は、ＤＢＤ全体に多少無作為に分散される。尿素に曝露されると、すべての高頻度突然変異化形態のｐＤＮＡのｐ５３ＤＢＤは、野生型ＤＢＤより安定性が低くなる（Bullock et al.上記）。さらに、ｐ５３突然変異体はしばしば、細胞中の熱ショックタンパク質と会合して、それらがネイティブ配座を保持することがほとんどできないという推測を導く（Finlay et al., 1988, Molecular and Cellular Biology 8:531-39）。
【０００８】
ｐ５３のＣ末端ドメインとの相互作用は、ｐ５３の細胞周期停止特性を活性化することが見出されている。特に、細胞周期進行中細胞中へのＣ末端特異的ｐ５３抗体の注入は、それらを停止し得る（Mercer et al., 1982,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6309-6312 ）。さらに詳細な研究は、Ｃ末端ドメインがＤＢＤドメインのＤＮＡ結合活性を調節することを実証した。例えば、Hupp等は、ｐ５３Ｃ末端ドメインの残基373〜381と相互作用するモノクローナル抗体Ｐａｂ421がｐ５３のある種の突然変異体形態のＤＮＡ結合活性を増強し得ることを見出した（Hupp et al., 1993, Nucleic Acids Research 21:3167-3174）。したがって、Huppと同僚等は、ｐ５３機能を回復するための試みにおいて、別々の負の調節ドメインを中和する抗体およびペプチドに焦点を合わせた（Selivanova et al.,1997, Nature Med. 3, 632-638）。しかしながら、このアプローチにより回復される位置273突然変異は、それらが高基礎ＤＮＡ結合活性を保持し、野生型タンパク質と同様の熱力学的安定性特徴を示す他の一般的突然変異体と異なる（Bullock et al., 1997,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14338-143421）。
【０００９】
当分野のその他の研究者は、突然変異体ｐ５３のＮ末端ドメインを結合する化合物の開発が、野生型ｐ５３活性を救援するための最も有効な手段であると論じている。例えば、Friedlander等は、感温性ｐ５３突然変異体のＤＮＡ結合活性を促進する能力に関して、ｐ５３上の限定エピトープと結合した多数の異なるモノクローナル抗体を試験した（Friedlander et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 25468-25478）。Ｃ末端特異的抗体ＰＡｂ421は低温で突然変異体ｐ５３にＤＮＡ結合機能を回復したが、一方、Ｎ末端特異的ｐ５３抗体、特にモノクローナル抗体Ｐａｂ1801は、高温での感温性ｐ５３突然変異体のＤＮＡ結合活性の促進により有効であった。これらの知見に基づいて、Ｎ末端との結合により1801エピトープ認識領域によく似る小分子の開発は、突然変異体ｐ５３中での野生型ＤＮＡ結合活性を促進する、とFriedlander等は推測した。特に、Friedlander等は、ｐ５３タンパク質の中心部分（ＤＢＤドメイン）におけるエピトープに特異的な抗体がＤＮＡ結合活性に影響を及ぼさないことを実証した。それらの結果の説明の１つとして、タンパク質内の一ドメインの配座が離れたドメインを用いることにより安定化される、とFriedlander等は仮定した。一般的に生じるｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン突然変異体における熱力学的安定性の変化はかなり小さい、とBullock等は実証し、Friedlander等により示唆されたようなｐ５３に関する小分子療法の開発（即ち、Ｎ末端と結合する分子）は実行可能であると推測した（Bullock et al., 1997、上記）。
【００１０】
抗癌化合物を同定するためのその他のより包括的アプローチは、細胞ベース検定（例えば、腫瘍細胞株）または動物検定における小分子の直接抗腫瘍活性の検定に集中した。考え得る抗腫瘍活性を有する多数の小分子が記載されている（Mazerska et al., 1990, Anti-Cancer Drug Design 5, 169-187; Su et al., 1995, J. Med. Chem. 38, 3226-3235; Nagy et al., 1996, Anticancer Research 16, 1915-1918; Wuonola et al., 1997, Anticancer Research 17, 3409-23）。Mazerska等は、その抗腫瘍特性がＤＮＡを結合し、共有的鎖間架橋を生じるそれらの能力に寄与するアクリジン基と結合したニトロ基を有する一連のニトロ−９−アミノアクリジンを記載する。Su等は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤として開発された、置換された種々の位置のアニリノおよびアクリジン環系を有する一連の９−アニリノアクリジン誘導体を記載する。Nagy等は、短炭素リンカーを介して尿素またはフタルイミドベースの基に結合される一連のフェノチアジン関連化合物を記載する。この種類の化合物の抗腫瘍細胞活性は、カルシウムチャンネルおよびカルモジュリンと反応するそれらの能力に由来する、とNagy等は推測した。Wuonola等（上記）は、Nagy等（上記）が記載した化合物と同様のフェノチアジン化合物を記載する。
【００１１】
今日まで、腫瘍抑制活性のような野生型活性を回復または安定化するためにｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用する小有機非ペプチド分子は報告されていない。さらに、このような化合物の発見は、高スループットスクリーンまたは検定の欠如により妨げられてきた。
【発明の開示】
【００１２】
ＩＩＩ．発明の要約
ヒトの疾患と関連する熱力学的不安定タンパク質またはミスフォールディングタンパク質を配座的に安定化し得る化合物を同定することの重要性を認識し、このような化合物が迅速に同定される高スループット検定の欠如を認識して、本発明人は、突然変異体ｐ５３を配座的に安定化する作用物質を迅速に同定するためのモデル系として、in vitroおよびin vivo検定における単離突然変異体ｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の使用を研究した。本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質中の野生型活性を促進するヒト製剤を含めた化合物を客観的に同定するための迅速で、信頼性があり且つ正確な方法を提供する。
【００１３】
したがって、本発明は、非ペプチド有機化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用し、そしてその野生型活性を促進し得る、という最初の例証を提供する。生理学的温度またはその付近で、これらの活性化合物は、種々の突然変異体ｐ５３タンパク質だけでなく、野生型ｐ５３タンパク質においても、ｐ５３の野生型活性を促進した。このような化合物は、抗癌薬としての重要な用途を有する。したがって、本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の突然変異体または野生型活性による癌の抗腫瘍療法に有用な新規のアプローチおよび化合物を提供する。
【００１４】
一局面において、本発明は、突然変異体形態のｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の野生型活性を促進する方法であって、生理学的条件下での機能的配座を保持する前記タンパク質の無能力により前記タンパク質の１つ又はそれ以上の機能的活性が少なくとも部分的に減損される方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物と突然変異体タンパク質を接触させて、そして安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程からなる方法を提供する。ｐ５３ファミリーのヒトタンパク質は、例えばｐ５３、ｐ６３またはｐ７３であり得る。好ましい実施態様では、有機非ペプチド化合物はｐ５３と、さらに好ましくはｐ５３のＤＮＡ結合ドメインとさえ相互作用する。
【００１５】
本発明は、別の実施態様では、１つ又はそれ以上の野生型活性低減を示すｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質の発現に関連した疾患状態に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与して、そして患者中の安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法も提供する。さらに別の実施態様では、本発明は、癌に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下でｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与して、そこでの機能的配座を安定化し、そして安定化タンパク質をタンパク質の野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法を提供する。
【００１６】
別の局面では、本発明に用いるための有機非ペプチド化合物は、特定長のリンカーにより一緒に結合される疎水性基（例えば、平面多環式）および陽イオン性基（好ましくはアミン）の両方を含有する化合物であり得る。
好ましい局面では、本明細書中で用いるための有機非ペプチド化合物は、以下の：
【００１７】
【化１】
【００１８】
からなる群から選択されるが、この場合、Ｉ基：
【００１９】
【化２】
【００２０】
に関しては、
Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19
（ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
Ｒ6は、
（ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、
（ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル
であり、
Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、
ＩＩ基：
【００２１】
【化３】
【００２２】
に関しては、
Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル（ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）または（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択される）であり、
ＩＩＩ基：
【００２３】
【化４】
【００２４】
に関しては、
Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
ＩＶ基：
【００２５】
【化５】
【００２６】
に関しては、
Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
Ｖ基：
【００２７】
【化６】
【００２８】
に関しては、
Ａは炭素または窒素であり、
Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、そして
Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択される。
【００２９】
さらに、本発明の実施に有用な多数の化合物はそれ自体新規であり、このような化合物についてのその場合の説明は、本発明のさらなる局面を定義する。
本発明は、別の局面で、ｐ５３ファミリーの野生型活性を促進するさらに別の化合物の設計方法も提供する。本方法は、仮定を説明するために本発明の活性化合物の１つを用いて、仮定に適合する候補化合物を同定し、そして候補化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進するか否かを確定することを必然的に伴う。
【００３０】
本発明の別の局面は、ｐ５３ファミリーのタンパク質とそのタンパク質と相互作用し、そのタンパク質の野生型活性を促進する非ペプチド化合物との複合体を包含する組成物である。
さらに別の局面では、本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物に関するスクリーニング方法を提供する。好ましい局面では、本方法は、ｐ５３ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と相互作用する化合物に関して検定し、本化合物の存在下でｐ５３ＤＢＤの配座を測定することを包含する。しかしながら、本発明は、スクリーニングのこのような方法におけるｐ５３ファミリーの全長および部分タンパク質の使用も意図する。特定の実施態様では、検定および測定工程は、同時に実施される。ｐ５３ファミリーの突然変異体形態のタンパク質中の野生型活性を促進することが発見された化合物は、任意に、腫瘍増殖を停止または抑制するそれらの能力に関してin vivoでスクリーニングされる。本発明の別の局面は、ｐ５３ＤＢＤとの特異的相互作用に関して有機非ペプチド化合物をスクリーニングすることによる薬剤発見方法である。
【００３１】
ｐ５３ファミリーの突然変異体または野生型タンパク質中での野生型活性を促進する化合物の同定での本発明の成功は、本発明の方法が、配座的欠陥または不安定タンパク質により誘導される種類の疾患のための薬剤発見に広範に適用可能であることを実証する。このようなタンパク質標的の例としては、ｐｐ６０src、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節因子、ヘモグロビン、プリオンタンパク質、セルピンおよびβ−アミロイドタンパク質が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
Ｖ．発明の詳細な説明
腫瘍サプレッサー遺伝子生成物ｐ５３における機能損失は、多数の異なる種類の癌において観察される非制御化増殖および／またはアポトーシスの損失を引き起こし得る。ｐ５３が癌細胞中で突然変異化されない場合でも、このような細胞中での野生型ｐ５３活性促進は、癌性表現型を抑制し得る。本発明は、有機非ペプチド化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用して、そこでの機能的配座を安定化し得る、ということを初めて実証する。したがって、このような化合物は、すべての種類の癌の治療のための製剤としての重要な用途を有する。
【００３３】
したがって、一局面において、本発明は、突然変異体形態のｐ５３ファミリーのヒトタンパク質における野生型活性の促進方法であって、生理学的条件下での機能的配座を保持するタンパク質の無能力によりタンパク質の１つ又はそれ以上の機能的活性が少なくとも部分的に減損される方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物と突然変異体タンパク質を接触させて、そして安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程からなる方法を提供する。ｐ５３ファミリーの突然変異体ヒトタンパク質は、突然変異体ｐ５３、ｐ６３およびｐ７３タンパク質であり得る。好ましい実施態様では、有機非ペプチド化合物は、ｐ５３と、さらに好ましくはｐ５３のＤＮＡ結合ドメインと相互作用する。
【００３４】
本発明は、別の実施態様では、１つ又はそれ以上の野生型活性低減を示すｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質の発現に関連した疾患状態に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下で突然変異体タンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合して、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与し、そして患者中の安定化タンパク質を野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法も提供する。
【００３５】
さらに別の実施態様では、本発明は、癌に対するヒト被験者の治療方法であって、生理学的条件下でｐ５３ファミリーのヒトタンパク質中の１つ又はそれ以上のドメインと結合し、そこでの機能的配座を安定化し得る有機非ペプチド化合物を被験者に投与して、そして安定化タンパク質をタンパク質の野生型活性に関与する１つ又はそれ以上の高分子物質と相互作用させる工程を包含する方法を提供する。本発明の方法で安定化されるｐ５３ファミリーのヒトタンパク質は、野生型または突然変異体タンパク質、例えばｐ５３、ｐ６３またはｐ７３であり得る。
【００３６】
ｐ５３ファミリーのタンパク質は種々の癌中で突然変異体であるが、しかしそれでもいくつかの癌または癌細胞型では、ｐ５３（ｐ５３それ自体が最も多数の試験を受けている）ファミリーのタンパク質の構造または機能は、関与細胞が野生型コード対立遺伝子を保持する場合でも、変更される。例えば、ウイルスタンパク質がｐ５３タンパク質を分解するか、あるいはｐ５３が、例えば癌遺伝子の発現生成物により不活性化されるかまたは分解されるウイルス関連癌の考察に関しては、Kaelin（1999）を参照していただきたい。細胞調節工程におけるｐ５３ファミリーのタンパク質の重要性が示された場合、このようなタンパク質の寿命および／または構造および／または活性が正常である細胞中で生理学的条件下で、本発明の化合物が非突然変異体ｐ５３ファミリー成員の機能的配座を安定化するのにも有用である、ということは明らかである。したがって、本発明の化合物は、ｐ５３タンパク質および同様の物質の機能が眼精状態の存在により実質的に影響を及ぼされない癌の治療において、ならびにその異常が未だ異常ｐ５３（またはｐ５３ファミリー成員）の機能、寿命または構造に検出可能的に拡がっていない前癌細胞を発現する組織の治療においても有用である。さらに、悪性疾患の部位に隣接するか、そうでなければ身体中の悪性細胞と接触するようになる健常細胞中のｐ５３ファミリーのタンパク質をさらに安定化する（例えば、寿命を増大させる）ことにより、癌の拡張が制御され得る。本発明の化合物は、この点でも有用である。
【００３７】
本発明の実施によれば、ｐ５３ファミリーのタンパク質は、哺乳類ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３、および／または１つ又はそれ以上の（１）転写活性化に必要とされるＮ末端ドメイン、（２）ＤＮＡ結合ドメイン、または（３）哺乳類ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３のオリゴマー形成ドメインと少なくとも50％、さらに好ましくは80％のアミノ酸配列相同をすべてが有するドメインを保有するタンパク質と定義され、この場合、前記の相同は、認可アルゴリズムBLASTP v.2.0（www.ncbi.nlm.nih.gov）（Altschul et al., 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, "The BLAST Algorithm"; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402）およびW.U.-BLAST-2.0（Washington University, St. Louis, MO, USAから利用可能）のいずれかにより測定され、そして前記のタンパク質は、ｐ５３、ｐ６３またはｐ７３の特性を示していると当業界で認識される少なくとも１つの機能（例えば、ｐ５３応答性プロモーターを活性化し、アポトーシスを誘導する能力。当業界認知特性に関しては、前記で引用したKaelin, 1999; Yang et al., 1998;およびYoshikawa et al., 1999参照）を立証する。BLAST, Smith-WatermanおよびFASTAアルゴリズムの手法および利点についての一般的考察に関しては、Nicholas et al., 1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods"（www.psc.edu）およびそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００３８】
ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型配座を安定化する化合物は、ｐ５３ファミリーのタンパク質との接触時に、タンパク質の野生型活性、例えばＤＮＡ結合親和性または任意の高分子物質と相互作用する能力を促進または回復してｐ５３ファミリーのタンパク質の正常機能を実行する化合物である。ｐ５３のその他の野生型活性としては、転写活性化活性（例えば、ＷＡＦ１誘導）、細胞周期停止およびアポトーシス誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
さらに別の局面において、本発明は、腫瘍増殖を抑制しおよび／または癌を治療するための本発明の化合物の使用を含む。本発明の特有の利点は、本明細書中の方法を用いてそのように同定された化合物が、スクリーンに用いられる野生型ｐ５３ＤＢＤおよび突然変異体ＤＢＤだけでなく、他の突然変異体ｐ５３およびｐ５３ＤＢＤの活性配座も安定化することが示されていることである。したがって、そのように同定された化合物は、種々の癌の治療に際して、広範な適用可能性を有する。
【００４０】
本発明は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型配座を促進し、ｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質に対して野生型活性を回復し得る化合物に関するスクリーニングの新規の方法も提供する。本発明の方法を用いて同定される化合物は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性の欠陥と関連する癌のような疾患を治療するのに有用である。
【００４１】
本発明の方法は、ｐ５３ファミリーのタンパク質と直接接触するものに関して化合物をスクリーニングすることを含む。このような方法は、スクリーニング目的のためのｐ５３ファミリー（突然変異体または野生型）の全長タンパク質、あるいは少なくともＤＢＤを、そして任意にＮ末端および／またはＣ末端ドメインを含有する欠失誘導体を用い得る。しかしながら、本発明の好ましい局面では、スクリーンは、無傷ＮまたはＣ末端ドメインを伴わずにＤＢＤのみを含有するｐ５３ファミリーのタンパク質のポリペプチド断片を使用する。したがって、本出願のために、「ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＤＢＤ」という用語は（別記しない限り）、無傷ＮまたはＣ末端を伴わずにただｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＢＤを含むものと理解される。しかしながら、このようなＤＢＤドメインは、検定フォーマットによって異種ポリペプチドと融合され得る（例えば、ＦＬＡＧエピトープまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質）。したがって、ＤＮＡ結合に及ぼす負の調節作用を単に除去するというよりむしろ、本発明の方法および化合物は、ｐ５３ファミリーの野生型および突然変異体タンパク質の両方の配座安定性の増強を促進する。
【００４２】
したがって、非限定的実行例により以下に説明される一局面において、本発明は、ｐ５３ＤＢＤと特異的に相互作用する化合物に関してスクリーニングし、そして被験化合物の存在下でｐ５３ＤＢＤの配座を測定する方法を提供する。任意に、ｐ５３ＤＢＤは、突然変異体ｐ５３ＤＢＤである。しかしながら、野生型ｐ５３ＤＢＤは、大量に過剰生成するのがより容易である。スクリーニング検定は細胞ベースのフォーマットで実施され得るが、しかしｐ５３ＤＢＤを標的にする化合物に特異的な高スループットスクリーンに関しては、in vitroベースの検定が最も直接的で且つ望ましい。ｐ５３ＤＢＤに対する初期スクリーンで同定された化合物は、無傷ｐ５３（ｐ５３ミスセンス突然変異体を含む）の機能に及ぼすそれらの作用に関してさらに検査され得る。これらの方法を用いて同定される化合物も、本発明の範囲内である。
【００４３】
本発明の目的で、ｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互作用する化合物に関する検定は、包含されない化合物がＤＢＤを特異的に標的とし、タンパク質の他のドメインを標的としないものであるよう意図される。例えば、ＤＢＤと特異的に「相互作用する」かまたはそれに「作用を及ぼす」化合物は、必ずしもＤＢＤと安定的に結合しないという必要はない（しかし、それもあり得る）。化合物の存在下でｐ５３ファミリーのタンパク質の配座に及ぼす何らかの作用を化合物が有することで十分である。したがって、化合物は、ＤＢＤとの相互作用に関して先ずスクリーニングされ、次に、配座に及ぼすそれらの作用に関して検定されるか、あるいはこれら２つのスクリーニング工程は、ＤＢＤとの相互作用も検出するために、化合物の存在下で配座的変化を用いることにより同時に実施され得る。
【００４４】
特異的相互作用という用語は、本出願においては、非選択的疎水性相互作用により疎水性化合物とタンパク質との間に起こることが知られている種類のものを含めた非特異的形態の結合を排除するために用いられる。特異的相互作用という用語はさらに、バルク溶媒の化学特性を変えることによりタンパク質熱安定性に影響を及ぼす化合物と穂亜反応化合物の特性を区別するために用いられる。したがって、本発明のこの局面の範囲から除外されるこのような分子としては、熱安定化剤、例えばグリセロール、トリメチルアミン−オキシドおよび重水素水が挙げられる。ｐ５３ファミリーのタンパク質と特異的に相互作用する化合物は、このようなバルク溶媒または非特異的疎水性相互作用より非常に低い濃度で作用を示す。例えば、グリセロールは、600 mMで有効である。しかしながら、ｐ５３ファミリーのタンパク質と特異的に相互作用する化合物の作用は、in vitroまたは細胞ベース検定において、1 mMより低い、好ましくは100μMより低い、さらに好ましくは10μMより低い化合物の濃度で観察される。
【００４５】
本発明の実施に関連して、以下の定義が一般的に適用する。「アルキル」という用語は、本明細書中で用いられる場合、別記しない限り、直鎖、分枝鎖または環状部分あるいはそれらの組合せを有する飽和一価炭化水素基を含む。同様に、「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、それぞれ少なくとも１つの二重結合または少なくとも１つの三重結合が存在する直鎖、分枝鎖または環状部分を有する炭化水素基を定義する。このような定義は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基が別の基、例えばアルコキシまたはアルキルアミン内に存在する場合にも適用する。「アルコキシ」という用語は、本明細書中で用いられる場合、「アルキル」が前記と同様であるＯ−アルキル基を含む。「ハロ」という用語は、本明細書中で用いる場合、別記しない限り、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを含む。
【００４６】
説明の便宜上、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルという用語は、本明細書中で用いる場合、ゼロまたは任意に１つ又はそれ以上の二重結合を有するシクロアルキルおよびシクロアルケニル基の両方を、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエン、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、ビシクロ［３．２．１］オクタン、ノルボルナニル等を指す。（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキルは、本明細書中で用いる場合、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、アジリジニル、オキシラニル、メチレンジオキシル、クロメニル、イソキサゾリジニル、１，３−オキサゾリジン−３−イル、イソチアゾリジニル、１，３−チアゾリジン−３−イル、１，２−ピラゾリジン−２−イル、１，３−ピラゾリジン−１−イル、ピペリジニル、チオモルホリニル、１，２−テトラヒドロチアジン−２−イル、１，３−テトラヒドロチアジン−３−イル、テトラヒドロチアジアジニル、モルホリニル、１，２−テトラヒドロジアジン−２−イル、１，３−テトラヒドロジアジン−１−イル、テトラヒドロアゼピニル、ピペラジニル、クロマニル等を指す。前記の（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル環の結合は、炭素またはｓｐ3混成化窒素異種原子を介してである、と当業者は理解する。
【００４７】
（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールは、本明細書中で用いる場合、フリル、チエニル、チアゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、ピロリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、１，３，５−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，５−チアジアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、１，２，４−トリアジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジニル、シンノリニル、プテリジニル、プリニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−［１］ピリンジニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、５，６，７，８−テトラヒドロ−キノリン−３−イル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイミダゾリル、チアナフテニル、イソチアナフテニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、インドリル、インドリジニル、インダゾリル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンズオキサジニル等を指す。（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール基の構造の残りの部分との結合は一般的に炭素原子またはｓｐ2混成異種原子によるが、これらに限定されない、と当業者は理解する。同様に、フェニルおよびナフチルは、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールの代表的なものである。
【００４８】
図面において、一結合が図示されているが、しかしその遠位端に置かれる基に関しては同定が成されていない場合、慣用的に認識されているように、メチル基が意図される。図示されている任意の結合の非存在下では、原子価が許す場合には、当業界で容易に理解されるように、その位置は水素により占められる。したがって、Ｒ−Ｏ−の記述は、Ｒ−Ｏ−ＣＨ3を意味する。
【００４９】
Ａ．ｐ５３ファミリーのタンパク質中の野生型活性を促進する本発明の化合物
本発明の有機非ペプチド化合物は、ｐ５３ファミリーの野生型または突然変異体タンパク質に曝露されると、そのタンパク質の野生型活性を促進するあらゆる種類の化合物であり得る。好ましい化合物は、相対的に小型の（50〜150 kDの典型的タンパク質と比較した場合）有機化合物である。本発明は、ペプチドでない、そして特に抗体でない、さらにｐ５３と特異的に反応せず、それによりｐ５３ＤＢＤまたはｐ５３タンパク質の野生型配座を安定化するような化合物を初めて提供する。ペプチドでない有機化合物は、種々の理由のために、製剤として特に有用である。例えば、非ペプチド化合物は、ペプチドより非常に低免疫原性であり、粘膜またはその他の細胞層バリアにより身体中により容易に吸収され、低不安定性であり得る。
【００５０】
一局面では、本発明の方法により発見された活性化合物は、特定長のリンカーにより一緒に結合される疎水性基（例えば平面多環式）および陽イオン性基（好ましくはアミン）の両方を含有する化合物と定義され得る。疎水性位置におけるベンズイミダゾール、ベンゾキノリン、フェノチアジンおよびスチリルキナゾリンが好ましい。
【００５１】
活性陽イオン性基は、第二級および第三級アミンの両方であり、その例としては、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メチルアミン、メチルピペラジンおよびモルホリンが挙げられるが、これらに限定されない。ある種の大型アミンは、フェノチアジン疎水性シリーズで試験される場合、相対的により活性であった。したがって、この状況では、大型アミンが好ましい。陽イオン性位置の正荷電基は活性であり、好ましい（下記の表１参照）。
【００５２】
本発明のこの局面に関しては、疎水性基および陽イオン性基間の間隔は、少なくともプロピル長であるべきである。プロピル長より短いリンカーは、特殊検定条件下では、実質的に低有効性であった（下記の表２参照）。したがって、約3〜5炭素結合の長さを有するリンカーが好ましい（5〜9オングストローム、さらに好ましくは6〜8オングストローム）が、しかし、プロピルリンカーの長さ（約6.5オングストローム）を有するリンカーを含有する化合物が最も活性である。ブチルリンカーの長さより長いリンカーは、ブチルリンカーの長さを有するリンカーを含有する対応する化合物より、特殊検定条件下では低有効性であった（表２）。さらに好ましいのは、的確な距離を保持する分枝鎖リンカーである。このようなリンカーは一般に、本検定では、5〜9オングストローム（そして最適には約6.5オングストローム）の正しいリンカー長を依然として保持する限り、対応する線状リンカーより活性であった。
【００５３】
したがって、一局面において、本発明の化合物は式：
Ｆ1−Ｌ−Ｆ2
を有し、Ｆ1は以下の：
【００５４】
【化７】
【００５５】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一であるかまたは異なり、そして別々に、水素、ハロゲン、メトキシおよびニトロから成る群から選択される）
から成る群から選択され、Ｌは、5〜9オングストロームの長さを有する直鎖または分枝鎖アルキルであり、そしてＦ2は第二級または第三級アミンである。別の局面では、Ｆ2は、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メチルピペラジンまたはモルホリンである。例えば、Ｆ2は、以下の：
【００５６】
【化８】
【００５７】
（式中、Ｒ4は−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3またはＨである）
から成る群から選択されるアミンであり得る。
以下で提示されるのは、本発明の種々の化合物に関する化学構造である。これらの化合物の各々は、ほぼ生理学的温度で少なくとも１つの突然変異体ｐ５３ＤＢＤにおけるｐ５３に対する配座感受性エピトープの安定性を有意に増強することが見出された。
【００５８】
１．アクリジン
【００５９】
【化９】
【００６０】
【化１０】
【００６１】
２．キナゾリン
【００６２】
【化１１】
【００６３】
３．フェノチアゾール
【００６４】
【化１２】
【００６５】
【化１３】
【００６６】
【化１４】
【００６７】
本明細書中に記載された一般設計原則によれば、本発明の実施に置いては以下の群：
【００６８】
【化１５】
【００６９】
の化合物が好ましく、この場合、 Ｉ基：
【００７０】
【化１６】
【００７１】
に関しては、
Ｒ5は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19
（ここで、Ｒ18はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記のアルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキルまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
Ｒ6は、
（ａ）各々任意に１つ又はそれ以上のフェニル基により置換される（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたは（Ｃ2〜Ｃ8）アルケニル、
（ｂ）ハロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシにより置換されるフェニル
であり、
Ｒ7およびＲ8は同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンであり、
ＩＩ基：
【００７２】
【化１７】
【００７３】
に関しては、
Ｒ9は−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニル（ここで、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル）または（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択される）であり、
ＩＩＩ基：
【００７４】
【化１８】
【００７５】
に関しては、
Ｒ10は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21、または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ12）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ11およびＲ12は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
ＩＶ基：
【００７６】
【化１９】
【００７７】
に関しては、
Ｒ13は−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、
ＡおよびＢは、同一であるかまたは異なり、各々炭素または窒素を表し、そして
Ｒ14およびＲ15は、同一であるかまたは異なり、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択され、
Ｖ基：
【００７８】
【化２０】
【００７９】
に関しては、
Ａは炭素または窒素であり、
Ｒ16は、−Ｎ−Ｒ18Ｒ19（ここで、Ｒ18は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルまたはフェニルであり、そして
Ｒ19はＨ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）シクロアルキルまたはフェニルであって、前記アルキル、シクロアルキルまたはフェニル基は任意にヒドロキシ、（Ｃ3〜Ｃ8）シクロヘテロアルキル、−ＣＯＮＲ18（ＣＨ2）pＮＲ20Ｒ21、−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21または−（ＣＨ2）p−（ＣＨＲ22）m−（ＣＨ2）n−ＮＲ20Ｒ21（ここで、ｐは０〜５であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５であり、Ｒ22はヒドロキシまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである）で置換され、そしてＲ20およびＲ21は各々別々に、以下の：
（ａ）Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ12）アルキル、（Ｃ3〜Ｃ12）シクロアルキル、（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ6〜Ｃ10）アリール、（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリール（前記の基は１つ又はそれ以上のヒドロキシ、ハロ、アミノ、トリフルオロメチル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ3〜Ｃ10）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ5〜Ｃ9）ヘテロアリールまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル（Ｃ6〜Ｃ10）アリールにより任意に置換される）から選択されるか、あるいは
（ｂ）ＮＲ20Ｒ21は一緒になって水素、モルホリンまたは４−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルピペラジンを示す）であり、そして
Ｒ17は、Ｈ、ニトロ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルコキシ、あるいはフルオロ、クロロまたはブロモから選択されるハロゲンから選択される。
【００８０】
本発明の特に好ましい化合物としては、以下の１１個の化合物が挙げられる：
【００８１】
【化２１】
【００８２】
（１−ベンジル−ピペリジン−４−イル）−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００８３】
【化２２】
【００８４】
［２−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００８５】
【化２３】
【００８６】
（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−チオクロマン−４−イル−アミン、
【００８７】
【化２４】
【００８８】
［１−メチル−３−（２，６，６−トリメチル−クロロヘキス−２−エニル）−アリル］−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００８９】
【化２５】
【００９０】
（７−エトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−（３−フェノチアジン−１０−イル−プロピル）−アミン、
【００９１】
【化２６】
【００９２】
Ｎ’−（９−フルオロ−ベンゾ［ｃ］アクリジン−７−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン、
【００９３】
【化２７】
【００９４】
Ｎ’−アクリジン−９−イル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロパン−１，３−ジアミン、
【００９５】
【化２８】
【００９６】
２−｛４−［４−（ベンゾ［ｇ］キノリン−４−イルアミノ）−フェニル］−ピペラジン−１−イル｝−エタノール、
【００９７】
【化２９】
【００９８】
Ｎ4−｛２−［２−（４−ブロモ−フェニル）−ビニル］−７−クロロ−キナゾリン−４−イル｝−Ｎ1，Ｎ1−ジエチル−ペンタン−１，４−ジアミン、
【００９９】
【化３０】
【０１００】
Ｎ−ベンゾ［ｇ］キノリン−５−イル−Ｎ‘−クロロヘキシル−プロパン−１，３−ジアミン、
【０１０１】
【化３１】
【０１０２】
２−［（２−ヒドロキシ−エチル）−（３−｛２−［２−（４−メトキシ−フェニル）−ビニル］−キナゾリン−４−イルアミノ｝−プロピル）−アミノ］−エタノール。
本発明の有機非ペプチド化合物は、慣用的技法を用いて合成され得る。
本発明の、そして本発明の方法に用いるための化合物は、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物のプロドラッグも含む。プロドラッグは、被験動物（特にヒト）に投与した場合に、有意且つ有効量で、活性分子に転換される化合物である。
【０１０３】
本発明の化合物は、遊離酸、遊離塩基または製薬的に有効なそれらの塩の形態であり得る。このような塩は、適切な酸で化合物を処理することにより容易に調製され得る。このような酸としては、例えば無機酸、例えばhydroholic酸（塩酸、hydrobiomic等）、硫酸、硝酸、リン酸等、および有機酸、例えば酢酸、プロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、ブタンに酸等が挙げられるが、これらに限定されない。逆に、塩は、アルカリで処理することにより、遊離塩基形態に転換され得る。
【０１０４】
Ｂ．治療的終点および投薬量
本発明の方法により同定される化合物は、配座的不安定またはミスフォールド化タンパク質と関連した疾患の治療に有用である。配座的不安定またはミスフォールド化タンパク質に関連した疾患が知られており、それらの例としては、嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲ）、マルファン症候群（フィブリン）、筋萎縮性側索硬化症（スーパーオキシドジスムターゼ）、壊血病（コラーゲン）、カエデシロップ尿病（α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体）、骨形成不全（Ｉ型プロコラ―ゲンプロアルファ）、クロイツフェルト−ヤーコブ病（プリオン）、アルツハイマー病（β−アミロイド）、家族性アミロイドーシス（リゾチーム）、白内障（クリスタリン）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体）、アルファ１−抗トリプシン欠損症、テイ−サックス病（β−ヘキソサミニダーゼ）、色素性網膜炎（ロドプシン）および妖精症（インスリン受容体）が挙げられる。もちろん、本明細書中に記載した方法および化合物は、癌の治療に特に有用であり、そして突然変異体ｐ５３遺伝子に関連した癌の治療に特に有用である。
【０１０５】
開業医または患者の見解から、疾患状態、特に癌性状態に関連した望ましくない症状（例えば、疼痛、感受性、体重減少等）の事実上あらゆる軽減または防止が望ましい、と当業者は理解する。さらに、癌性状態に関しては、腫瘍塊または増殖のあらゆる低減が、腫瘍の組織病理学的病像の改善と同様に、望ましい。したがって、本出願の目的のために、「治療」、「療法的使用」または「医学的使用」という用語は、本明細書中で用いる場合、疾患状態または症状を改善するか、あるいはそうでなければ、どんな方法でも、疾患またはその他の望ましくない症状の進行を防止し、妨害し、遅延しまたは逆転する特許請求組成物のあらゆるおよびすべての使用を指す。
【０１０６】
有効投薬および治療プロトコールは、慣用的手段により確定され、実験室動物において低用量で開始し、その後、効力を監視しながら投薬量を増大して、その上で投薬レジメンを体系的に変更し得る。動物試験、好ましくは哺乳類試験は、一般に、体重１kg当たりの生物活性物質の最大耐容用量またはＭＴＤを決定するために用いられる。当業者は、効力に関して用量を定期的に推定して、ヒトを含めた他の種に対する毒性を回避する。
【０１０７】
効力についてのヒト試験が着手される前に、正常被験者における段階Ｉ臨床試験は安全用量を確立するのに役立つ。所定の被験者に関する最適投薬量を決定する場合、臨床医により多数の因子が考慮され得る。これらの中でも第一は、選定異種遺伝子生成物の毒性および半減期である。さらに別の因子としては、患者のサイズ、患者の年齢、患者の全身状態、治療中の特定の癌性疾患、疾患の重症度、患者中のその他の薬剤の存在、遺伝子生成物のin vivo活性等が挙げられる。試験投薬量は、動物試験の結果および臨床文献を考察後に選定される。
【０１０８】
実際の作業実施態様により以下に示されているように、ヒト癌の動物モデルにおける腫瘍増殖を阻害し、および／または後退させるためには、200 mg/kg/日の用量が非常に有効であった。この結果に基づいて、癌の治療のための化合物Ｘの典型的ヒト用量は、被験者の状態によって、静注により、または腫瘍塊に直接的に注入されるか、あるいは経口的に投与される0.1〜10 g／日である。異なるレベルの効力および／または毒性を有する化合物に関しては、これらの値は、もちろん、それに応じて変更される。さらに、用量は、１日当たり２回またはそれ以上の増分で投与され得る。
【０１０９】
本発明の方法に用いるための化合物は、長期および持続性投与のために徐放性移植装置としても処方され得る。このような持放性処方物の例としては、生物適合性ポリマーの複合材料、例えばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−共−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン等が挙げられる。薬剤送達ビヒクル中の分解可能ポリマーの構造、選択および使用は、いくつかの出版物、例えばA. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3:279-292（1992）で検討されている。製剤処方物中のポリマーの選択および使用におけるさらに別の指針は、M. ChasinとLanger（編集）による教科書“Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems,”Vol. 45 of "Drugs and the Pharmaceutical Sciences," M. Dekker, New York, 1990および米国特許第5,573,528号（Aebischer等、1996年11月12日発行）に見出される。
【０１１０】
特に、in vivo使用が意図される場合には、本発明の種々の生化学的構成成分は、好ましくは高純度を有し、潜在的有害夾雑物（例えば、少なくともNational Food（ＮＦ）等級、一般的には少なくとも分析等級、好ましくは少なくとも製剤等級）を実質的に含有しない。合成またはその後の精製が、好ましくは、合成または精製操作中に用いられ得た可能性のあるいかなる毒性物質も実質的に含有しない生成物を生じる程度まで、所定の化合物は使用前に合成されねばならない。
【０１１１】
被験者における癌性状態の治療に用いるために、本発明は、その一局面において、本発明の方法に有効であることが示された化合物を含有するキットまたはパッケージも、滅菌充填バイアルまたはアンプルの形態で提供する。一実施態様では、キットは、単位用量または多数回用量で、即投与型処方物として、本発明の化合物、例えば化合物Ｙ、化合物Ｘまたは化合物Ｚを含有し、この場合、パッケージは、癌の治療のためのその内容物の使用説明書を一緒に含入する。あるいは、そして本発明の別の実施態様によれば、パッケージは、このような化合物を含有する滅菌充填バイアルまたはアンプルを提供する。
【０１１２】
Ｃ．ドラッグ・デリバリー方法
ｐ５３ファミリーのタンパク質、特にｐ５３ＤＢＤと相互作用するか、および／またはその野生型活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする場合の工程の各々またはすべては、候補化合物に関する高スループット検定を受けることができる。高スループットスクリーンは当業界で周知であり、多数のフォーマットのいずれかで実施され得る。例えば、ＥＬＩＳＨ、シンチレーション近接技法、競合的結合測定法および置換結合検定は有用なフォーマットである。ロボット工学技術を含めた実験室自動操作は、多数の化合物をスクリーニングするのに必要な時間を大幅に低減し、例えば、数社の名前を挙げると、Tecan、Scitec、Rosys、Mitsubishi、CRS Robotics、FanukおよびBeckman-Coulter Sagianから市販されている。候補化合物が同定された後（またはそれらの同定と同時に）、二次スクリーニングが実施されて、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性に及ぼす化合物の細胞および／またはin vivo作用を確定し得る。
【０１１３】
１．本発明の方法および組成物により標的化されるｐ５３ファミリーのタンパク質
ｐ５３は、すべての真核生物に遍在性である。したがって、本発明の方法および組成物中に用いるためのｐ５３タンパク質およびｐ５３ＤＢＤは、真菌（例えば、ビール酵母菌）、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）および哺乳類（例えば、マウスおよび／またはヒト）を含めたあらゆる真核生物細胞からであるか、またはそれに由来し得るが、しかしヒトｐ５３タンパク質が好ましい。構造および機能が関連したｐ５３の付加的哺乳類相同体、特にｐ６３およびｐ７３が同定されている。ｐ５３ファミリーのこのようなタンパク質、ならびに例えばそれらのそれぞれのＤＢＤも、本発明の方法および組成物に用いられ得る。さらに、未だ発見されていないｐ５３ファミリーのタンパク質（本明細書中で定義されたような）も、本発明の方法および組成物に用いられ得る。
【０１１４】
前記のように、ｐ５３タンパク質は、少なくとも３つの異なるドメイン、即ちアミノ末端に位置する転写活性化ドメイン、中心ＤＢＤおよびカルボキシル末端のオリゴマー形成ドメインを含有する。さらに、負の調節ドメインは、タンパク質のカルボキシル末端に出現する。ヒト癌と関連するｐ５３ミスセンス突然変異のほとんどが、ＤＢＤに生じる。本発明の方法および化合物は、このようなミスセンス突然変異のいずれかの配座の安定化に向けられる。特に好ましい標的は、残基位置175、245、248、249、273および282（全残基位置はヒトｐ５３配列に関して示されている。他の生物体からのｐ５３タンパク質中の同様の残基位置は、ヒト配列との相同アラインメントにより容易に確定され得る）での突然変異に関する１つ又はそれ以上のいわゆる「ホットスポット」を含有する突然変異体ｐ５３である。ｐ５３におけるその他の一般的突然変異は、132、135、138、141、143、146、151、152、154、157、158、159、163、173、176、179、186、194、196、213、220、237、238、241、242、258、266、272、278、280、281、285および286で起こる。これらも本発明に対する標的である。さらに、以下の突然変異体ｐ５３タンパク質：143A、173A、175S、241D、249Sおよび273Hの配座安定性を示す作業実例により、本発明を以下で説明する。
【０１１５】
ｐ５３タンパク質における、特にｐ５３タンパク質のＤＢＤにおけるミスセンス突然変異に関連した癌としては、結腸直腸癌、膀胱癌、肝細胞癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、頭部および頸部の扁平上皮癌、食道癌、甲状腺癌および神経原性腫瘍、例えば星状細胞腫、神経節芽細胞腫および神経芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。前記の癌およびその他の癌は、本発明の方法および化合物により治療可能である。
【０１１６】
ｐ５３ＤＢＤは、ほぼアミノ酸残基100〜300に存在する。残基102〜292のタンパク質分解耐性コアはＤＮＡ結合に十分であることが示されており、ｐ５３ＤＢＤ結晶構造は、残基94〜312に関して解明されている（Cho et al., 1994, Science 265, 346; Friend, 1994, Science 265, 334）。したがって、本発明の方法に用いるために、ｐ５３ＤＢＤドメインのＮ末端は残基50から開始して残基110までであり、好ましくは94〜102間のどこかで開始する。ｐ５３ＤＢＤのＣ末端は、残基286〜残基340で終結し、好ましくは残基292〜312で終結し得る。
【０１１７】
「ｐ５３の熱力学的不安定化突然変異体」は、生理学的温度（即ち約37℃）でのＤＮＡ結合のようなｐ５３の１つ又はそれ以上の機能を保持しないが、低温で、または他の条件下でこのような機能（単数または複数）を回復する突然変異体である。例えば、一般的遭遇突然変異体はすべて、低温でin vitroでＤＮＡを結合する能力を保持する（Friedlander et al., 1996、上記）。
【０１１８】
２．検定フォーマット
ａ．結合検定フォーマット
ｐ５３ファミリーのタンパク質のＤＢＤに簡単に結合する化合物を同定するために用いられる検定の原理は、２つの化合物を相互作用させ、結合させるための条件下で、それに十分な時間、ＤＢＤタンパク質と被験化合物の反応混合物を調製し、したがって、反応混合物中で除去され、および／または検出され得る複合体を生成することを包含する。用いられるＤＢＤ種は、スクリーニング検定の目的によって変わり得る。例えば、特定の結合ドメインと相互作用する化合物が探索される場合、その結合ドメインを含有するｐ５３ファミリーの全長タンパク質、ＤＢＤそれ自体、あるいは検定系（ラベリング、結果的に生じる複合体の単離等）に利点をもたらすタンパク質またはペプチドと融合したＤＢＤを含有する融合タンパク質が利用され得る。本技法に用いるためのＤＢＤ由来のペプチドは、ＤＢＤの少なくとも６連続アミノ酸、好ましくは10連続アミノ酸、さらに好ましくは20連続アミノ酸、さらに好ましくは30または50でさえある連続アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸を包含すべきである。
【０１１９】
スクリーニング検定は、種々の方法で実行され得る。例えば、このような検定を実行するための一方法は、ＤＢＤタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質あるいは被験物質を固相上に固着し、そして反応終了時に、固相上に固着されたＤＢＤ／被験化合物複合体を検出することを包含する。このような方法の一実施態様では、ＤＢＤ反応体は固体表面に固着され、そして固着されていない被験化合物が直接または間接的に標識され得る。種々の適切な標識系のいずれかが用いられ得る。それらの例としては、放射性同位元素、例えば125Ｉおよび32Ｐ、ある物質および蛍光標識に曝露された場合に検出可能な比色定量シグナルまたは光を生じる酵素標識系が挙げられるが、これらに限定されない。本方法の別の実施態様では、固相上に固着されたＤＢＤタンパク質が標識化抗体と複合体を形成する。その後、ＤＢＤ／抗体複合体の会合を崩壊させるその能力に関して、被験化合物が検定され得る。
【０１２０】
実際問題として、微小滴定プレートは、固相として便利に利用され得る。固着構成成分は、非共有または共有結合により固定され得る。非共有結合は、タンパク質の溶液で固体表面を単に被覆し、乾燥することにより成し遂げられ得る。あるいは、固定化抗体、好ましくは固定されるタンパク質に特異的なモノクローナル抗体が、固体表面にタンパク質を固着するために用いられ得る。表面は、予め調製され、保存され得る。
【０１２１】
検定を実行するために、固着構成成分を含有する被覆表面に非固定化構成成分が付加される。反応完了後、生成されたあらゆる複合体が固体表面に固定されたままであるような条件下で、未反応構成成分が除去される（例えば洗浄により）。固体表面に固着された複合体の検出は、多数の方法により成し遂げられ得る。予備非固定化構成成分が前標識化される場合、表面に固定された標識の検出は、複合体が生成されたことを示す。予備非固定化構成成分が前標識化されない場合には、表面に固着された複合体を検出するために、例えば予備非固定化構成成分に特異的な標識化抗体を用いて、間接標識が用いられ得る（抗体は次に、標識化抗Ｉｇ抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る）。
【０１２２】
他の実施態様では、結合は、直接または間接標識を使用せずに検出され得る。例えば、結合が起きた場合に変わる生物物理学的特性が検定され得る。このようなスクリーニングに特に有益である固体支持体系は、ＢＩＡｃｏｒｅ2000系（BIAcore, Inc., Piscataway, NJから市販）である。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）計器（http://www.biacore.com）は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象を用いて、実時間での生物特異的相互作用を監視する。ＳＰＲ効果は、本質的には、金属−液体界面での屈折率の局所的変化に影響される無限小電場である。センサーチップは、ガラスと検定される配位子またはタンパク質が化学的に連結されるカルボキシメチルデキストランマトリックスとの間の金フィルムのサンドイッチ状物から作製される。このセンサーチップは、分析物化合物がそれを通して注入され得るフローセルを形成する流体素子工学カートリッジ上に取り付けられる。センサーチップ上での配位子−分析物相互作用は、チップ表面から反射される偏光光線の角度の変化として検出される。チップとの任意の塊の結合は、金／デキストラン層中のＳＰＲに影響を及ぼす。金層中の電場のこの変化は反射光線と相互作用して、結合した塊の量に比例して反射の角度を変える。反射光は、ダイオードアレイ上で検出されて、応答単位（ＲＵ）として表される結合シグナルに翻訳される。応答は結合された塊に直接比例するので、タンパク質−タンパク質相互作用に関する速度論的および平衡定数が測定され得る。
【０１２３】
あるいは、反応は液相で実行され、反応生成物が未反応構成成分から分離され、複合体が検出される。
ｂ．ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の測定方法
ｐ５３のタンパク質の配座は、多数の異なる方法のいずれかで測定され得る。例えば、抗体は、ｐ５３ＤＢＤの配座をプローブするために用いられ得る。本発明の好ましい方法は、ｐ５３および／またはｐ５３ＤＢＤの活性（例えば、ＤＮＡ結合）または不活性（熱力学的不安定化、あるいはミスフォールド化またはアンフォールド化）配座に特異的であるモノクローナル抗体を用いる。例えば、ｐ５３ＤＢＤ上のエピトープを認識するｍＡｂ1620は、ｐ５３タンパク質の腫瘍サプレッサー活性と密接に関連する（Ball et al., 1984, EMBO J. 3:1485-1491; Gamble et al., 1988, Virology 162:452-458）。したがって、ｍＡｂ1620は、それが不活性配座をとる場合には、ｐ５３ＤＢＤを結合しない。逆に、ｍＡｂ1620により認識されるエピトープは、ｐ５３が突然変異により不活性化されるかまたは野生型ｐ５３が変性される場合に、露呈される（Bartek et al., 1990, Oncogene 5, 893-899; Stephen et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, 577-83）。配座特異的であることが知られているかまたはいずれは発見されるその他のモノクローナル抗体も、本発明の方法に用いられ得る。このような抗体は、高スループットスクリーンに容易に採用され得るために、有用である。モノクローナル抗体を含めた抗体の製造方法は、当業界で周知である。
【０１２４】
ｐ５３またはｐ５３ＤＢＤのようなｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の他の測定方法としては、染料の吸収、分光分析的（例えば、円二色性、ＮＭＲ）、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分離、特異的ＤＮＡ結合（例えば、低温と対照したものとして生理学的温度での）、および特異的タンパク質結合（例えば、ＳＶ40大型Ｔ抗原は、野生型活性配座とのみ結合し、不活性配座と結合しない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
前記のように、一般的に遭遇するｐ５３突然変異の多くは生理学的温度でＤＮＡを結合できないが、しかし低温でＤＮＡを結合する。したがって、被験化合物の存在下でのｐ５３ファミリーのタンパク質の配座を測定する一局面は、温度依存性である。好ましくは、配座は、生理学的温度（約38℃）で測定される。適切な範囲は20℃〜50℃、さらに好ましくは35℃〜42℃である。標的タンパク質の配座はさらに、2〜3分から数時間までまたはそれ以上の時間に亘って測定され得る。野生型ｐ５３タンパク質またはｐ５３ＤＢＤがスクリーニングに用いられる場合、加熱は一般に、突然変異体ｐ５３ＤＢＤが用いられる場合よりも長時間且つ高温で実施される。本明細書中で提供された情報を用いて、当業者は適切な温度を容易に決定し得る。
【０１２６】
さらに、化合物の結合と、ｐ５３ファミリーのタンパク質の配座のあらゆる変化とを同時に検定し得る。このような検定では、被験化合物の存在下でのｐ５３ファミリーのタンパク質の配座の変化は、一ヒットとして点数をつけられる。ｐ５３ＤＢＤと相互作用して配座変化を引き起こす化合物に関して検定する高スループットスクリーニングは下記の例により説明されるが、それらに限定されない。これらの高スループットスクリーニングは、本発明の方法に用いるためのある種類の化合物を同定し得た。ほぼ生理学的温度で、これらの化合物は野生型および種々の突然変異体ｐ５３タンパク質上のｍＡｂ1620に対する配座感受性エピトープの安定性を増強した。低μｍｏｌ濃度の化合物は、生存細胞内のエピトープの配座安定性を一時的に増強し、突然変異体ｐ５３が転写を活性化するのを可能にした。下記でさらに詳しく記載されるように、有機非ペプチド化合物は、突然変異体ｐ５３を有する腫瘍を保有するマウスに投与された場合、ｐ５３配座および機能を変調し、天然突然変異化ｐ５３を有するヒト腫瘍異種移植片の増殖を有意に阻害した。
【０１２７】
ｃ．細胞ベースおよび動物ベースの検定
前記の一次スクリーン（単数または複数）を用いて候補化合物が同定されると、これらの系における候補化合物の作用を確定するために、細胞ベースおよび動物ベースの検定が一般に実行される。初期検定は、ｐ５３ファミリーのタンパク質をコードする突然変異体遺伝子を有する腫瘍由来の細胞株、またはｐ５３ファミリーの突然変異体タンパク質を発現するよう操作された細胞株を包含し得る。ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性のいずれか（またはすべて）に及ぼす候補化合物の作用が査定される。例えば、候補化合物の存在下でのＷＡＦ１の誘導は、無差別的結合特性というよりむしろ特異的ＤＮＡ結合特性を促進することにより、化合物は突然変異体ｐ５３中に機能を保存することを示す。ｐ５３またはｐ５３ファミリーのその他の成員により上向き調節されるかまたは下向き調節された任意の遺伝子が検査され得る。ｐ５３ファミリーのタンパク質のその他の活性としては、増殖抑制およびアポトーシスが挙げられる。増殖抑制は、顕微鏡的にまたはコロニー形成検定により、組織培養細胞で容易に査定される。アポトーシスは、ＴＵＮＥＬ染色またはpropidium iodide染色およびフローサイトメトリーにより可視化され得る。
【０１２８】
さらに、動物ベースのモデルは、候補化合物の毒性および有効性の両方に関してスクリーニングするために用いられ得る。例えば、突然変異体ｐ５３を有する腫瘍がある動物モデルで誘導され、候補化合物が動物に投与される。毒性および腫瘍増殖または後退が査定される。このようなスクリーニングの作業例を以下に提示する。
【０１２９】
３．スクリーニングのための化合物の供給源
本発明にしたがってスクリーニングされ得る化合物としては、細胞中に入って、ｐ５３ファミリーのタンパク質の活性に影響を及ぼし得る小型有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。2〜3の供給元の名前を挙げると、例えばPharmacia、Arqule、Enzymed、Sigma、Aldrich、Maybridge、TregaおよびPanLabsといった会社から、多数の化合物ライブラリーが市販されている。ｐ５３ＤＢＤと相互作用する化合物に関して、天然物質または合成化学物質を含めた既知の化合物、ならびにタンパク質を含めた生物学的活性物質のライブラリーもスクリーニングし得る。しかしながら、好ましい化合物は、タンパク質またはペプチド（即ち、ペプチド結合により連結される３個またはそれ以上の一続きのアミノ酸）でない。抗体は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの断片を結合する抗原であるペプチドである。好ましい化合物は、抗体でもない。本発明の方法に用いるための化合物の特定の種類および例を以下に説明する。
【０１３０】
ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物が同定されれば、分子モデリング技法を用いて、より有効な化合物の変異体を設計し得る。分子モデリング系の例は、ＣＨＡＲＭ（Polygen Corporation, Waltham, MA）およびＱＵＡＮＴＡプログラム（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）である。ＣＨＡＲＭはエネルギー最小化および分子動力学機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、相互の分子の行動の相互作用構築、修飾、可視化および分析を可能にする。
【０１３１】
例えば、ｐ５３ファミリーのタンパク質の野生型活性を促進する化合物が同定されれば、その化合物を用いて、仮説を立て得る。以下でさらに詳述するように、好ましい仮説は、平面多環式疎水性基は、極性アミンから約5〜9オングストローム、さらに好ましくは6〜8オングストロームの間隔を置いたというものである。このような仮説は、プログラムCatalyst（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）を用いて、本発明の化合物のいずれかからもたらされ得る。さらに、Catalystは、その仮説を用いて、所有権データベース、Cambridge小型分子データベース（Cambridge, England）、ならびに上記のその他のデータベースを検索して、本発明の化合物のさらに別の例を同定し得る。
【０１３２】
本発明の化合物は、Ludi、Insight II、C2-Minimizer and Affinity（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）のようなモデリングパッケージを用いてより有効な変異体を設計するためにさらに用いられ得る。特に好ましいモデリングパッケージは、MacroModel（Columbia University, NY, NY）である。
本発明の化合物はさらに、理論的組合せライブラリーを開発するための基礎として用いられ得る。組合せライブラリーの性質はライブラリーの基礎を形成するために本発明の好ましい化合物から選定される特定の化合物、および樹脂を用いてライブラリーを合成したいという要求のような因子によっているが、しかし、本発明の化合物はＣ2−ＱＳＡＲ（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）のような組合せ設計プログラムに適した必要なデータを提供する、と認識される。
【実施例】
【０１３３】
本発明を説明してきたが、以下の実施例により本発明をさらに説明する。本発明はこれらに限定されない。
ＶＩ．実施例１：ｐ５３ＤＢＤ熱安定化検定
野生型ｐ５３ＤＢＤを用いた高スループット検定を開発した。本検定を用いて薬理学的化合物をスクリーニングし、ＤＢＤの活性配座を安定化するそれらの化合物をヒットとして点数をつけた。
【０１３４】
Ａ．材料および方法
熱安定化検定． 野生型および突然変異体ｐ５３タンパク質からの組換えＤＢＤ（残基94〜312）およびＦＬＡＧ−タグ化ｐ５３ＤＢＤを記載通りに調製した（Pavletich et al., 1993, Genes and Dev. 7, 2556-2564; Bullock et al., 1997、上記）。用いた突然変異体タンパク質は、143A、173A、175S、249Sおよび273Hであった。多数の小型分子有機化合物を試験した。化合物ストックを10 mg/mlでＤＭＳＯ中に溶解し、使用前に稀釈した。25 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ6.8、150 mMＫＣｌ、10 mMジチオトレイトールを含有する緩衝液中に、タンパク質（0.25〜1.0 ng／ウエル）を稀釈し、氷上で35分間、50 ul中でReacti-Bind微小滴定プレート（Pierce）にくっつけた。ウエルを25 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ6.8、150 mMＫＣｌですすぎ、化合物または稀釈ＤＭＳＯビヒクルを付加し、プレートを指定温度でインキュベートした。氷上にウエルを置くことによりインキュベーションを終結させた。エピトープがそれ以上変化しないようにするために、氷上にプレートを保持しながら、ＥＬＩＳＡ検定を実施した。第一抗体の付加前に、ＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ緩衝液中の冷5％スキムミルク（Difco）でウエルを１時間遮断した。モノクローナル抗体ｍＡｂ1620、ｍＡｂ240（Calbiochem）および抗−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Eastman Kodak Company）をＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ中で1:100〜1:250で稀釈し、100 ul／ウエルで30分間付加した。プレートを冷ＨＥＰＥＳ／ＫＣｌ緩衝液で２回すすぎ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役抗マウスＩｇＧ（Boehringer Mannheim）とともにさらに30分間インキュベートした。ＴＭＢ展開剤（Pierce）を用いてＨＲＰシグナルを発現させ、シグナルの光学密度を、450 nmに設定したBioRadマイクロプレート読取器で読み取った。
【０１３５】
Ｂ．結果
ｐ５３ＤＢＤの配座は熱不安定性である． ｍＡｂ1620により認識されるエピトープは配座依存性であり、ｐ５３上のその存在はタンパク質の腫瘍サプレッサー活性と密接に関連する（Ball et al., 1984,上記; Gamble and Milner,1988、上記）。逆に、ｍＡｂ240により認識されるエピトープは、ｐ５３が突然変異により不活性化されるかまたは野生型ｐ５３が変性される場合に、露呈される線状エピトープである（Bartek et al., 1990, Oncogene 5, 893-899; Stephen et al., 1992, J. Mol. Biol. 225, 577-583）。組換えヒトｐ５３ＤＢＤ（残基94〜312）はin vitroで活性配座から不活性配座への遷移を経て、240エピトープを蓄積しながら1620エピトープを次第に失う。微小滴定プレート上に固定された精製ｐ５３ＤＢＤを生理学適温度近くに加熱して、ＥＬＩＳＡフォーマットでｍＡｂ1620を用いてプローブした。1620エピトープは、温度および時間依存性方式で損失された（図１Ａ）。1620エピトープの損失は、ＤＢＤに結合されたＦＬＡＧエピトープが依然として十分に安定であるために、配座の損失に特異的に関連した（図１Ｂ）。さらに、1620エピトープの損失は240エピトープの出現増強と共同して起こったが、これは1620エピトープの損失がｐ５３ＤＢＤの配座的変化を反映し、固定化タンパク質の損失はそうではないことを確実にする。
【０１３６】
野生型ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの半減期は23℃で約35分であって、高温では漸増的に減少し、45℃では5分未満になった（図１Ａ）。平行して、ゲルシフト検定におけるｐ５３ＤＢＤのＤＮＡ結合能力は、溶液中で加熱時に低減された（データは示されていない）。野生型ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの半減期は、37℃で位置143突然変異体ＤＢＤの場合の約２倍であった（図１Ｃ）。この知見は、いくつかのその他の突然変異体ｐ５３タンパク質に関する熱力学的安定性低減についての以前の報告と一致し、1620エピトープがｐ５３ＤＢＤの配座をモニタリングするために利用され得ることを確定する（Bullock et al., 1997、上記）。
【０１３７】
化合物はｐ５３配座を安定化する． ＥＬＩＳＡ検定を用いて、活性ｐ５３配座を安定化し、突然変異体タンパク質に野生型機能をより良好に保持させる化合物を同定した。いくつかの化合物は、生理学的温度でのｍＡｂ1620に対するエピトープの損失を抑制した（例えば、図２Ａ参照）。ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必要な濃度を測定することにより、滴定実験において、化合物の相対能力を確定した。活性化合物は、用量依存的方法でエピトープを安定化した（図２Ｂ）。ＤＭＳＯ溶媒および活性化合物のいくつかの類似体は、安定化することができなかった（図２Ｂ。表１および２参照）。いくつかの突然変異体ｐ５３タンパク質からのＤＢＤと同様に、全長野生型ｐ５３も安定化された（データは示されていない。図２Ｃ）。化合物の存在下では、突然変異体タンパク質は、化合物の非存在下での野生型タンパク質と同様に安定であった。
【０１３８】
化合物はｍＡｂ1620に対するエピトープを保存したが、しかしそれらは、エピトープをすでに失っていたｐ５３を救援しなかった。例えば、化合物Ｙの付加前にｐ５３ＤＢＤを加熱した場合、ｍＡｂ1620反応性の増大は認められなかった。エピトープ損失速度は存在する化合物に伴って低減されたが、しかし長期加熱は1620−陽性配座の結果的損失を引き起こした。さらに、37℃でのインキュベーション前の化合物Ｙの付加および洗い落としたがってエピトープの損失を妨げなかったために、化合物はｐ５３と非可逆的に結合するとは思われなかった（データは示されていない）。これらの知見は、ｐ５３ＤＢＤと化合物との相互作用がタンパク質に、ｍＡｂ1620により認識されるような機能的配座をより安定的に保持させるモデルと一致する。
【０１３９】
活性化合物の構造． 同定された活性化合物はすべて、特定長のリンカーにより疎水性基（平面多環式）および陽イオン性基（しばしばアミン）と一緒に結合する。疎水性（Ｒ１）位置のベンズイミダゾール、ベンゾキノリン、フェノチアジンおよびスチリルキナゾリンは活性であったが、一方、これらの基および単一二環式または一環式基における微妙な変化は試験した特殊条件下では活性でなかった（表１）。ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必要な量の化合物の２つの適合対（表１参照）間に10倍より大きい差が認められた場合に、化合物は、この検定において「活性」であると称された。したがって、本検定により不活性と称された化合物は絶対的に不活性であるというわけではなく、相対的に不活性であるだけであることに留意すべきである。したがって、活性陽イオン性（Ｒ２）基としては、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メチルアミン、メチルピペラジンおよびモルホリンが挙げられた（表１）。ある種の大型アミンは、フェノチアジンシリーズで試験した場合、相対的により活性であった。Ｒ２位置の負荷電または非荷電基、例えばカルボキシルまたはベンゼン基は、本検定で明示したように、不活性であった（表１）。Ｒ１およびＲ２基間の間隔も、プロピル長より短いリンカーが相対的化合物活性を低減する場合、本検定における化合物活性にとって重要であった（下記の表２参照）。ブチルリンカーはプロピルリンカーよりわずかに低効力であったが、一方、本検定において低活性を示した化合物ではより長いリンカーが観察された（表２。データは示されていない）。的確な距離を保持する分枝鎖リンカーは一般に、対応する線状リンカーより活性であった。これらの一般的観察は本発明の範囲を限定しないが、しかし、さらなる分子を設計するための本発明の実施に用いられ得る。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
滴定実験において、ｍＡｂ1620に対するエピトープの50％を安定化するのに必要な化合物の量により、相対的効力を確定した。
【０１４２】
【表２】
【０１４３】
Ｃ．考察
結果は、突然変異体ｐ５３機能の回復、ならびに抗癌療法の開発のための新規の戦略のための原理の証拠を実証する。本実施例は、単離ＤＢＤに作用してその配座安定性を促進し得る化合物の第一ファミリーの発見を報告する。
ＶＩＩ．実施例２：細胞および腫瘍中のｐ５３配座の確定
本実施例および以下の実施例では、低μモル濃度で機能して生きた細胞中および腫瘍中の突然変異体ｐ５３を変調し、天然突然変異化ｐ５３を有する腫瘍の増殖を抑制する原型化合物を示す。
【０１４４】
Ａ．材料および方法
細胞培養． ＡＴＣＣから全細胞株を入手し、10％ウシ胎仔血清（Gibco BRL）を含有する推奨培地中で増殖させた。
ｐ５３配座の確定． 約1 x 10Ｈ1299／レポーター+突然変異体ｐ５３細胞を一夜処理し、冷トリス緩衝化食塩水で3回すすぎ、1.5 mlの低張溶解緩衝液（20 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4、10 mMＮａＣｌ、20％グリセロール、0.2 mMＥＤＴＡ、0.1％トリトン−Ｘ100、10 mMジチオトレイトール、プロテアーゼ阻害剤含有）中で溶解した。2000 rpmで、4℃で5分間、細胞を微小遠心管中でペレット化し、0.5 MＮａＣｌを含有する同一緩衝液中にペレットを再懸濁することにより核抽出物を調製した。0.5 MＮａＣｌを含有する前記の緩衝液３容積を用いて、Dounceホモジナイザー中で腫瘍試料を均質化した。10,000 rpmで4℃で10分間の遠心分離により、溶解物を透明にした。ｍＡｂＤＯ−１抗体を用いてウエスタンブロットから定量されるようなｐ５３含量に関して、核抽出物を標準化し、0.05 Mの炭酸塩緩衝液、ｐＨ9.6中に1 ug/mlでのｍＡｂＤＯ−１で4℃で一夜被覆されていたMaxiSorp F96プレート（Nunc）のウエル上にｐ５３を捕獲した。冷ＰＢＳでウエルを洗浄し、ＰＢＳ中の4％スキムミルクを用いて4℃で3時間、遮断し、スキムミルク中のＨＲＰ−共役化ｍＡｂ1620抗体を用いてプローブした。抗体インキュベーションは氷上で１時間であって、その後、0.05％トゥイーン20を含有するＰＢＳ中でウエルを3回洗浄し、ＴＭＢ基質を用いてシグナルを発現させた。大量の1620−陽性ｐ５３を発現した温度シフト化（32℃）Ｈ1299／レポーター+突然変異体ｐ５３細胞からの溶解物を用いて、標準曲線を確立した。試料の定量は標準曲線の線状範囲内であり、各試料中の総ｐ５３に関して、ならびに未処理溶解物中の1620−陽性ｐ５３分画に関して補正した。
【０１４５】
Ｂ．結果
細胞中の配座の安定化． 細胞性ｐ５３の1620−陽性配座を安定化する化合物の能力を、専ら突然変異体ｐ５３を発現する生きた細胞を用いて試験した。ｐ５３を有さないＨ1299細胞を腫瘍由来突然変異体ｐ５３（位置173）を用いてトランスフェクトし、非配座感受性ｐ５３抗体（ｍＡｂＤＯ−１）をウエスタンブロットに用いて、十分量の突然変異体タンパク質を発現するクローンを選択した。ｍＡｂ1620に対するエピトープを表示する低定常状態レベルのｐ５３をトランスフェクタントからの抽出物中に検出して、突然変異体ｐ５３の小分画が活性配座を保持し得ることを確証した（Chen et al., 1993, Oncogene 8, 2159-2166）。低μモル濃度の化合物Ｘは、細胞中の1620陽性ｐ５３の定常状態分画を約５倍増大した（図３Ａ）。処置後4〜6時間で、最大レベルのエピトープ濃縮を達成した。タンパク質のアミノ末端に位置する非配座感受性エピトープに対して向けられるｍＡｂＤＯ−１との反応性により測定した場合、ｐ５３の総量は変わらなかった。
【０１４６】
Ｃ．考察
結果は、本発明の方法により同定された配座安定化化合物が生きた細胞中のｐ５３の活性配座を安定化し得ることを示す。腫瘍中の突然変異体ｐ５３を回復する化合物は、全非機能的ｐ５３プールまたはｍＡｂ1620に対するエピトープを表示するｐ５３のサブセットを標的にし得る。本明細書中に記載した化合物に関する重要な標的は、活性配座を依然として保持する新規合成突然変異体ｐ５３であると思われる。実際、化合物は1620エピトープの存続を増強したが、しかしin vitro予備加熱のために損失された1620エピトープを回復することはできなかった。新規合成ｐ５３における活性配座の安定性を増強する化合物は、時間依存的方法で機能的ｐ５３の定常状態レベルの蓄積を可能にし得る。細胞中の最大1620エピトープ増強の達成に関して観察された４時間遅延は、この仮説と一致する（図３Ａ）。
【０１４７】
ＶＩＩＩ．実施例３：ｐ５３機能の回復
Ａ．材料と方法
トランス活性化検定． ＤＯＴＡＰ陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（Boehringer Mannheim）またはリン酸カルシウムを用いて突然変異体ｐ５３タンパク質（173A、249S）をコードする発現プラスミドおよびネオマイシン選択性マーカーで細胞をトランスフェクトした。ヒグロマイシン耐性マーカーをコードするプラスミド、およびルシフェラーゼ遺伝子を誘導するＳＶ40基本プロモーターの上流に置かれる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（GenBank寄託番号S57428チミジンキナーゼの塩基番号26〜58。これは配列GCCTTGCCTで開始して、配列TGCCTTTTCで終結する）のプロモーター領域におけるｐ５３結合配列の４つのコピーから成るｐ５３レポーター遺伝子でも、細胞をトランスフェクトした。突然変異体ｐ５３発現のための付加的構築物を有するレポーター構築物で細胞のクローンをトランスフェクトすることにより、適合細胞対を調製した。適宜、ヒグロマイシンまたはＧ418を含有する培地中での増殖に関して、トランスフェクト化クローンを選択した。96ウエル組織培養プレート（Costar）中の単層細胞を化合物で処理し、基質転換検定（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定し、Dynatechマイクロプレートルミノメーターで定量した。
【０１４８】
ＷＡＦ１およびｐ５３発現． 培養細胞を21時間処理し、冷トリス緩衝化食塩水で3回すすぎ、掻き取って、10,000 rpmで30秒間ペレット化した後、50 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.5、0.1％ＮＰ−40、250 mMＮａＣｌ、5 mMＥＤＴＡ、50 mMＮａＦ、1 mMＤＴＴ、50 ug/mlアプロチニン、1 mg/mlPefabloc（Boehringer Mannheim）中にそれらを再懸濁した。Bradford試薬（BioRad）を用いてタンパク質濃度を確定し、5または10 ugの細胞溶解物を8〜16％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル（Novex）上に載せた。20％メタノールを含有するTowbin緩衝液（Towbin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350）中のImmobilon P膜（Millipore）上に、タンパク質を移した。32.547.5 kDa分子量マーカー間で膜を二分して、SuperBlock（Pierce）＋3％スキムミルク中で、室温で１時間遮断した。モノクローナル抗体クローンＥＡ10（CalbiochemＷＡＦ１ Ａｂ−１）を用いてＷＡＦ１発現に関してブロットの底半分をプローブし、ｍＡｂＤＯ−１（Calbiochemｐ５３Ａｂ−６）を用いて全ｐ５３発現に関してブロットの上半分をプローブした。0.1％トゥイーン20を含有するトリス緩衝化食塩水を３回取り換えてブロットを１時間洗浄した後、第二抗体ＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧを付加した。ルネッサンスＥＣＬ（DuPont）を用いて帯域を可視化し、ハイパーフィルムＥＣＬ（Amersham Life Science）に曝露した。
【０１４９】
Ｂ．結果
細胞中のｐ５３機能の回復． ｐ５３配座の安定化が野生型機能の良好な保持を生じたか否かを確定するために、ｐ５３の配列特異的転写活性を調べた。Ｈ1299細胞をｐ５３誘導性ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトし、安定クローン（Ｈ1299／レポーター）を突然変異体ｐ５３で補佐的にトランスフェクトして、レポーター遺伝子と位置173突然変異体ｐ５３の両方を発現する適合クローン（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を得た。レポーター遺伝子誘導により測定した場合、化合物は、突然変異体ｐ５３の転写活性を増強した（図３Ｂ）。Ｈ1299／レポーター細胞中で低レベルの転写活性化が観察されたが、これは、ｐ５３相同体であるｐ７３の存在によると思われる（データは示されていない）。これらの化合物がｐ７３活性を増強し得るか否かを我々は未だ確定していないが、しかしレポーター遺伝子誘導における広範なｐ５３依存性増大は、ｐ５３がこれらの細胞中での第一標的であることを示唆する。高用量での化合物の有効性は細胞剥離により制限されたので、レポーター遺伝子のｐ５３依存性活性化は相対的に小濃度範囲で起きた。転写活性の増強は、処理後12〜16時間でピークを生じた（データは示されていない）。この観察は、処理後4〜6時間目に起きた機能的ｐ５３配座の安定化御の派生的事象として生じるレポーター遺伝子発現と一致する。
【０１５０】
化合物Ｙは、レポーター遺伝子誘導検定においては、化合物Ｘより優れていた。これは、ＤＮＡ損傷を包含して、ｐ５３タンパク質のレベル上昇をもたらす化合物Ｙの二次作用によるものと思われる（図３Ｂ）。化合物Ｙは、細胞活性に必要な濃度で全ｐ５３タンパク質レベルを増強したが、化合物Ｘは増強しなかった。ＤＮＡ損傷が単に化合物Ｙによるｐ５３レポーター遺伝子誘導に寄与するだけではないことを保証するために、ＤＮＡ損傷剤アドリアマイシンの作用を試験した。アドリアマイシンは、細胞中での突然変異体ｐ５３蓄積を誘導するその能力にもかかわらず、広範囲の濃度（0.4〜40 ug/ml）内でレポーター遺伝子を誘導しなかった（データは示されていない）。これらの結果は、突然変異体ｐ５３の蓄積ではなく、配座安定化が、特異的転写活性を促進し得る、ということを実証する。特に、全ｐ５３タンパク質の定常状態レベルを上げない化合物Ｘは、配座安定化により独自にｐ５３転写機能を回復すると思われる。
【０１５１】
化合物Ｘは、突然変異体ｐ５３の存在下で、ｐ５３応答性細胞遺伝子生成物であるＷＡＦ１を上向き調節した。ｐ５３を発現しないSaos-2骨肉腫細胞を突然変異体ｐ５３発現ベクターでトランスフェクトして、２つの突然変異体（位置173または位置249）のいずれかを発現するクローンを単離した。クローンは、親Saos-2細胞と比較した場合、より低い基本レベルのＷＡＦ１を発現したが、これは、迅速増殖クローンを我々が選択したことを反映するものと思われる。これらの細胞を化合物Ｘで16時間処理し、等量のタンパク質を示す溶解物を、ｐ５３およびＷＡＦ１に関してウエスタンブロットで分析した。２つの突然変異体ｐ５３タンパク質のいずれかを発現した細胞は、処理時にＷＡＦ１の発現レベルの上昇を示したが、親Saos-2細胞は示さなかった（図４）。これらの溶解物中のｐ５３タンパク質の総量は、本質的には変わらなかった。アドリアマイシンは突然変異体ｐ５３を有するSaos-2細胞中でのＷＡＦ−１発現を誘導しなかったが、しかし野生型ｐ５３を発現するU2OS細胞中でのＷＡＦ−１発現を上昇させた（データは示されていない）。
【０１５２】
Ｃ．考察
本明細書中に記載した配座安定化剤の作用様式は、伝統的細胞傷害性抗新生物剤に関して観察されたものとは明らかに異なる。癌の化学療法に用いられる細胞障害剤は一般に、突然変異体ｐ５３を有する細胞では無効である（Lowe et al., 1993, Nature 362, 847-849; O'Connor et al., 1997, Cancer Res. 57, 4285-4300）。実際、ＤＮＡ損傷剤であるアドリアマイシンは、我々の検定において、転写活性に関して突然変異体ｐ５３を回復しなかった。細胞傷害性化合物は、正常および腫瘍細胞中での総ｐ５３タンパク質の顕著な誘導によっても検証される。化合物Ｘは細胞中または腫瘍中の総ｐ５３タンパク質レベルを誘導しなかった。ｐ５３誘導は細胞ＤＮＡ損傷の高感度測定であるので、化合物Ｘが有効濃度でＤＮＡを損傷し得るとは思われない。合わせて考えると、我々の知見は、1620陽性配座の安定化および突然変異体ｐ５３活性の機能的回復がＤＮＡ損傷非依存性メカニズムにより起こり得る、ということを示す。
【０１５３】
数通りの証拠が、タンパク質安定化に及ぼす非特異的作用を排除する。水を置換し、タンパク質分子周囲のより疎水性の微小環境を作ることにより機能するタンパク質変性の非特異的阻害剤であるグリセロールは、600 mMの濃度で細胞中の突然変異体マウスｐ５３の核局在化を回復し得る（Brown et al., 1997, J. Clin. Invest. 99, 1432-1444）。化合物Ｘは、本検定においては0.03 mMで活性であったが、これは、化合物とｐ５３との間の特異的接触を包含する非常に緻密な相互作用を示唆する（データは示されていない）。さらに、化合物Ｘが培養中およびin vivoで非常に過剰量の他のタンパク質の存在下でｐ５３配座に影響を及ぼし得るという観察（下記参照）は、ｐ５３の選択的認識と一致する。さらに、ｐ５３との化合物相互作用の性質は、ネイティブタンパク質構造との密接な結合を包含しない。遷移状態のタンパク質分子の小サブセットとの強い相互作用は、活性配座からの逸脱を遮断するか、またはネイティブ配座への方向転換を促進するよう機能し得る。
【０１５４】
ＩＸ．実施例４：腫瘍増殖検定
Ａ．材料と方法
腫瘍増殖検定． 培養細胞をＰＢＳですすぎ、1 x 106Ａ375.S2または5 x 106ＤＬＤ１細胞を90％Matrigel（Becton Dickinson）中で、20 gの雌ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲマウス（Charles River Laboratories）の片方の右脇腹に接種した。0.1％プルロニックＰ−105（BASF）を含有する生理食塩溶液中で、化合物Ｘを腹腔内投与した。カリパスを用いて腫瘍直径を二次元で測定し、腫瘍容積に変換した（Euhus et al., 1986, J. Surg. Oncol. 31, 229-234）。
【０１５５】
Ｂ．結果
in vivoでのｐ５３の変調． 化合物Ｘは、突然変異化ｐ５３を有する腫瘍中のｍＡｂ1620に対するエピトープを表示するｐ５３分画の定常状態レベルを増強した。注入Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスに、化合物を100 mg/Kgで腹腔内投与した。化合物の１回投与後に動物を屠殺し、総および1620-陽性ｐ５３発現に関して、腫瘍溶解物を分析した。総ｐ５３レベルは、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエスタンブロットで測定した場合、変化がなかった。総ｐ５３含量の小変動に対して溶解物を標準化して、ｍＡｂ1620に対するエピトープの発現に関してＥＬＩＳＡ検定で試験した。エピトープは、処理後3〜5時間内に増大された（図５）。in vivo応答の時間経過は、培養細胞の場合と同様であった（図３Ａ）。
【０１５６】
in vivo突然変異体ｐ５３の機能的回復を評価するために、処置および未処置動物からの腫瘍中のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を我々は査定した。投薬後8時間目に、最大4.5倍のレポーター遺伝子誘導が観察された（図５）。配座的および機能的応答間のタイムラグは、ルシフェラーゼ転写体の翻訳およびタンパク質の蓄積にようする時間を反映し得る。マウスにおける化合物のピーク血漿濃度は10 ug/mlであったが、これは細胞中のレポーター遺伝子の最大誘導に必要なものより低かった（データは示されていない）。したがって、培養細胞と比較して、腫瘍中のより低レベルのレポーター遺伝子誘導は、次善の曝露によると思われる。
【０１５７】
Ｃ．考察
結果は、配座安定化化合物が多数の無作為選定突然変異体を機能的に回復し得る、ということを示す。したがって、本発明の方法および化合物は、異なるｐ５３突然変異体に広範に適用可能である。例えば、小ＤＮＡ接触部位に影響を及ぼすＤＬＤ−１細胞中の位置241突然変異は、化合物Ｘの安定化活性により機能的に補足され得る。したがって、ＤＮＡ接触部位のいくつかを含めた非常に多数のｐ５３突然変異体は、活性配座の安定化時に回復され得る。
【０１５８】
化合物Ｘは、in vitroで野生型および突然変異体ｐ５３の両方の配座を安定化するにもかかわらず、in vivoで治療的選択性を実証した。実際、本化合物は安全であると思われたし、マウスに200 mg/kg／日（100 mg/kg／１日２回）で14連続日投与した場合に、脂肪は観察されなかった（データは示されていない）。選択性は、腫瘍細胞中での非常に高いレベルと比較した場合の、正常細胞中のｐ５３の非常に低い定常状態レベルによるものと思われる（Lassus et al., 1996, EMBO J. 15, 4566-4573）。さらに、腫瘍特異的ストレス、例えばＤＮＡ病変および酸素または栄養素欠乏は、ｐ５３のアポトーシス作用に対して腫瘍細胞を優先的に導き得る（Chen et al., 1996, Genes and Dev. 10, 2438-2451）。そのような場合、ｐ５３安定化化合物を放射線または遺伝子傷害性療法と組合せることにより、共働的抗腫瘍作用を成し遂げ得る。
【０１５９】
前記の明細書は、当業者が本発明を実施し得るに十分である。実際、分子生物学、医学または関連分野の当業者に明らかである本発明の実行のための前記の手段の種々の修正は、以下の特許請求の範囲内であるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１Ａ】ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。0.5 ngの野生型ｐ５３ＤＢＤをインキュベートした。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非加熱対照のパーセントとして示される。標準偏差は<10％であった。
【図１Ｂ】ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。1.25 ngのＦＬＡＧタグ化ｐ５３ＤＢＤを固定し、45℃で加熱して、抗ＦＬＡＧ、ｍＡｂ1620およびｍＡｂ240に対する残存エピトープを非加熱対照のパーセントとして示した。
【図１Ｃ】ｐ５３ＤＢＤ上の配座依存性エピトープの変調 ｐ５３ＤＢＤを微小滴定ウエル中で固定し、高温でインキュベートした。ＥＬＩＳＡ検定は、氷上に保持された対照ウエルと比較した場合の、加熱ウエル中に残存するｍＡｂ1620に対するエピトープのパーセントを確定した。ｍＡｂ1620に対するほぼ等レベルのエピトープを示した1.0 ngの野生型および位置143突然変異体ｐ５３ＤＢＤを37℃で加熱し、エピトープの安定性を非加熱対照のパーセントとして監視した。誤差バーは、４つの反復実験に関する標準偏差である。
【図２Ａ】突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 ｐ５３の配座安定性を促進する化合物Ｘ、化合物Ｙおよび化合物Ｚと呼ばれる代表的化合物。
【図２Ｂ】突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 1 ngの野生型ｐ５３ＤＢＤを固定し、化合物または等価濃度のＤＭＳＯビヒクルの存在下で45℃で30分間加熱した。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非加熱対照のパーセントとして示される。
【図２Ｃ】突然変異体ｐ５３ＤＢＤ上の1620エピトープの安定化 ｍＡｂ1620に対するほぼ同レベルのエピトープを有する野生型および突然変異体ｐ５３ＤＢＤ調製物を固定し、化合物またはビヒクルの存在下で37℃で30分間加熱した。ｍＡｂ1620に対する残存エピトープは、非加熱対照のパーセントとして示される。誤差バーは、４つの反復実験に関する標準偏差である。
【図３Ａ】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 位置173突然変異体ｐ５３を発現したＨ1299トランスフェクタントを培養中で16.5 ug/mlの化合物Ｘで処理した。panｐ５３抗体、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエスタンブロットを用いて、全ｐ５３タンパク質中の小変異に関して、細胞溶解物を標準化し、ｍＡｂ1620に対するエピトープを示すｐ５３の量をＥＬＩＳＡ検定で確定した。1620陽性ｐ５３分画における増大を、未処理細胞中の1620陽性ｐ５３の分画に対して補正した。
【図３Ｂ】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 Ｈ1299トランスフェクタントをルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｈ1299／レポーター）とまたはレポーター遺伝子と適合させて、位置173突然変異体ｐ５３（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を微小滴定ウエル中で16時間処理した。野生型ｐ５３機能を示すルシフェラーゼレポーター遺伝子の誘導化発現を、化合物の非存在下での基礎レベルの発現に対して補正した。値は、４つの反復実験の平均を表す。
【図３Ｃ】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のｐ５３配座および転写活性の変調 Ｈ1299トランスフェクタントをルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｈ1299／レポーター）とまたはレポーター遺伝子と適合させて、位置173突然変異体ｐ５３（Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３）を微小滴定ウエル中で16時間処理した。野生型ｐ５３機能を示すルシフェラーゼレポーター遺伝子の誘導化発現を、化合物の非存在下での基礎レベルの発現に対して補正した。値は、４つの反復実験の平均を表す。
【図４】突然変異体ｐ５３を有する細胞中のＷＡＦ１発現の誘導 トランスフェクト化突然変異体ｐ５３タンパク質（位置173または位置249）を発現するＳａｏｓ−２細胞を、16.5 ug/mlの化合物Ｘを含有する培養中で16時間処理した。細胞溶解物を全タンパク質に関して標準化し、ウエスタンブロットで分析した。ブロットの上部を全ｐ５３に関してｍＡｂＤＯ−１でプローブし、同一ブロットの底部をＷＡＦ１に向けられる抗体でプローブした。
【図５】腫瘍におけるｐ５３配座安定性および機能の促進 Ｈ1299／レポーター＋突然変異体ｐ５３細胞由来の皮下腫瘍を保有するマウスに、化合物Ｘの100 mg/kg腹腔内注射を１回施して、ｍＡｂＤＯ−１を用いたウエスタンブロットの濃度計走査を基礎にして、全ｐ５３含量に関して二つの腫瘍溶解物を標準化した。ｍＡｂ1620に対するエピトープを示すｐ５３の量をＥＬＩＳＡ検定で確定し、1620陽性ｐ５３分画における増大を、非処置腫瘍からの溶解物中の1620陽性ｐ５３の分画に対して補正した。ｐ５３転写活性の増強を査定するために、ルシフェラーゼ発現に関しても腫瘍溶解物を分析した。タンパク質濃度に関してルシフェラーゼ発現を標準化し、非処置腫瘍からの溶解物と比較した。
【図６Ａ】突然変異化ｐ５３を発現する腫瘍異種移植片の抑制 マウスに腫瘍細胞を接種し、指示されたような化合物Ｘまたはビヒクルの腹腔内注射により処置した。化合物を、１日１回（q.d.）または12時間間隔（b.i.d.）で7日間投与した。ビヒクル処置マウスには、12時間間隔で注射を施した。二次元での腫瘍直径測定により腫瘍容積を確定し、各群の5〜7匹に関して平均を出した。点線は、処置を開始した場合の初期腫瘍容積を表す。
【図６Ｂ】突然変異化ｐ５３を発現する腫瘍異種移植片の抑制 マウスに腫瘍細胞を接種し、指示されたような化合物Ｘまたはビヒクルの腹腔内注射により処置した。化合物を、１日１回（q.d.）または12時間間隔（b.i.d.）で7日間投与した。ビヒクル処置マウスには、12時間間隔で注射を施した。二次元での腫瘍直径測定により腫瘍容積を確定し、各群の5〜7匹に関して平均を出した。点線は、処置を開始した場合の初期腫瘍容積を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に有用な有機非ペプチド化合物の同定方法であって、ｐ５３ファミリーの突然変異型又は野生型哺乳動物タンパク質を、突然変異型か又は野生型かに拘らず、有機非ペプチド化合物と接触させるステップ、及び当該化合物が生理学的条件下上記タンパク質の１以上のドメインに結合し、かつ、上記タンパク質における機能的コンホメーションを修復し又は安定化させることができるかどうかを測定するステップを含む前記同定方法。
【請求項２】
前記タンパク質がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐ５３タンパク質のコンホメーションの計測が、クロマトグラフィー、スペクトロスコピー、吸収、超遠心、特異的ＤＮＡ結合アッセイ、及びｐ５３により阻害され又は活性化されることが知られている他の遺伝子産物のタンパク質結合から成る群から選ばれる方法により、実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、完全長突然変異体ｐ５３タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、その野生型に比較して不安定化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、ミスフォールディングされやすくする１以上の突然変異をもつ、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、１７５，２４５，２４８，２４９，２７３、及び２８２位の残基の内の１以上に１以上の突然変異を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質は、ｐ５３欠失誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインの全体を含まない前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、野性型である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、ミスセンス突然変異を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐ５３ファミリーのタンパク質は、ｐ５３，ｐ６３、及びｐ７３から成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触ステップと測定ステップは、前記化合物の存在下、前記ｐ５３タンパク質の、コンホメーション変化を検出することにより同時に実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物は、腫瘍の増殖を休止させ又は抑制する能力について、インビボにおいてさらにスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物は、腫瘍の増殖を休止させ又は抑制する能力について、インビトロにおいてさらにスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニング測定は、以下の：
ａ）ｐ５３タンパク質の突然変異体を発現する腫瘍細胞；又は
ｂ）ｐ５３タンパク質の突然変異体を発現する細胞系、
を使用して実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｐ５３ファミリーの哺乳動物タンパク質は、有機非ペプチド化合物と接触され、そして機能的コンホメーションの計測は、約２０℃〜５０℃の温度で測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
固相表面上に前記ｐ５３ファミリーの哺乳動物タンパク質又は前記有機非ペプチド化合物を固定し、そしてタンパク質−化合物複合体を検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が固体支持体上に固定され、そして前記化合物が標識される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が放射性同位体又は蛍光標識である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
機能的ｐ５３タンパク質立体配座の安定化は、前記ｐ５３タンパク質、及びｐ５３のエピトープへのその結合が天然ｐ５３のコンホメーションの存在に依存するところの検出可能に標識されたコンホメーション感受性の抗体を、前記有機非ペプチド化合物の存在、そして又は不存在下、固体支持体に、固定することにより測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
ｐ５３ ＤＮＡ結合ドメインに特異的なモノクローナル抗体が、固相表面に前記タンパク質を固定するために使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
結合能力、及びｐ５３の機能的コンホメーションの修復ステップが、以下のステップ：（１）当該ｐ５３タンパク質を、ｐ５３のコンホメーション感受性エピトープを特異的に認識する抗体と、接触させ、そして（２）当該抗体が、前記有機非ペプチド化合物の存在下、当該タンパク質に結合するか否かを測定する、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エピトープの存在が、ｐ５３の少なくとも１の野生型の生理学的活性に、相関する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
エピトープ内の欠陥が、ｐ５３の少なくとも１の不活性状態に、相関する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
検出可能な標識が、前記抗体を、検出可能に標識されるさらなる抗体と、接触させることにより当該抗体に、さらに付着される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ｍＡｂ１６２０又はｍＡｂ２４０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質は、ｍＡｂ２４０により認識されるエピトープをプロセッシングするｐ５３の温度感受性形態である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用して、その野生型活性を修復し又は安定化させ、ここで、当該活性は腫瘍抑制活性を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐ５３のタンパク質の野生型活性を促進する追加の化合物を設計するステップ、ここで、当該化合物は仮定を作製するために使用され、当該仮定に適合する候補化合物を同定するステップ、及び当該候補化合物が当該ｐ５３ファミリーの野生型活性を促進するかどうかを測定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
有機非ペプチド化合物が、ｐ５３ファミリーの哺乳動物タンパク質の突然変異型における野生型活性を促進することができるかを評価する方法であって、ここで、当該タンパク質の１以上の機能的活性が、生理学的条件下、機能的コンホメーションを維持する当該タンパク質の不能力により少なくとも一部弱められており、上記方法は、以下のステップ：
（ａ）生理学的条件下、上記突然変異タンパク質を、当該突然変異タンパク質内の１以上のドメインに結合することができる有機非ペプチド化合物に接触させ、そして当該タンパク質における機能的コンホメーションを安定化させ；そして
（ｂ1）上記安定化されたタンパク質を、前記活性の計測により前記野生型活性に参加する１以上の巨大分子と相互作用させ；又は
（ｂ2）クロマトグラフィー、スペクトロスコピー、吸収、超遠心、特異的ＤＮＡ結合アッセイ、及びｐ５３により阻害され又は活性化されることが知られる他の遺伝子産物のタンパク質結合から成る群から選ばれる方法を介して上記機能的コンホメーションの存在を確認する、
を含む前記方法。
【請求項１】
癌の治療に有用な有機非ペプチド化合物の同定方法であって、ｐ５３ファミリーの突然変異型又は野生型哺乳動物タンパク質を、突然変異型か又は野生型かに拘らず、有機非ペプチド化合物と接触させるステップ、及び当該化合物が生理学的条件下上記タンパク質の１以上のドメインに結合し、かつ、上記タンパク質における機能的コンホメーションを修復し又は安定化させることができるかどうかを測定するステップを含む前記同定方法。
【請求項２】
前記タンパク質がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐ５３タンパク質のコンホメーションの計測が、クロマトグラフィー、スペクトロスコピー、吸収、超遠心、特異的ＤＮＡ結合アッセイ、及びｐ５３により阻害され又は活性化されることが知られている他の遺伝子産物のタンパク質結合から成る群から選ばれる方法により、実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、完全長突然変異体ｐ５３タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、その野生型に比較して不安定化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、ミスフォールディングされやすくする１以上の突然変異をもつ、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、１７５，２４５，２４８，２４９，２７３、及び２８２位の残基の内の１以上に１以上の突然変異を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質は、ｐ５３欠失誘導体である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインの全体を含まない前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、野性型である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、ミスセンス突然変異を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｐ５３ファミリーのタンパク質は、ｐ５３，ｐ６３、及びｐ７３から成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触ステップと測定ステップは、前記化合物の存在下、前記ｐ５３タンパク質の、コンホメーション変化を検出することにより同時に実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物は、腫瘍の増殖を休止させ又は抑制する能力について、インビボにおいてさらにスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物は、腫瘍の増殖を休止させ又は抑制する能力について、インビトロにおいてさらにスクリーニングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニング測定は、以下の：
ａ）ｐ５３タンパク質の突然変異体を発現する腫瘍細胞；又は
ｂ）ｐ５３タンパク質の突然変異体を発現する細胞系、
を使用して実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｐ５３ファミリーの哺乳動物タンパク質は、有機非ペプチド化合物と接触され、そして機能的コンホメーションの計測は、約２０℃〜５０℃の温度で測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
固相表面上に前記ｐ５３ファミリーの哺乳動物タンパク質又は前記有機非ペプチド化合物を固定し、そしてタンパク質−化合物複合体を検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が固体支持体上に固定され、そして前記化合物が標識される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が放射性同位体又は蛍光標識である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
機能的ｐ５３タンパク質立体配座の安定化は、前記ｐ５３タンパク質、及びｐ５３のエピトープへのその結合が天然ｐ５３のコンホメーションの存在に依存するところの検出可能に標識されたコンホメーション感受性の抗体を、前記有機非ペプチド化合物の存在、そして又は不存在下、固体支持体に、固定することにより測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
ｐ５３ ＤＮＡ結合ドメインに特異的なモノクローナル抗体が、固相表面に前記タンパク質を固定するために使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
結合能力、及びｐ５３の機能的コンホメーションの修復ステップが、以下のステップ：（１）当該ｐ５３タンパク質を、ｐ５３のコンホメーション感受性エピトープを特異的に認識する抗体と、接触させ、そして（２）当該抗体が、前記有機非ペプチド化合物の存在下、当該タンパク質に結合するか否かを測定する、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エピトープの存在が、ｐ５３の少なくとも１の野生型の生理学的活性に、相関する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
エピトープ内の欠陥が、ｐ５３の少なくとも１の不活性状態に、相関する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
検出可能な標識が、前記抗体を、検出可能に標識されるさらなる抗体と、接触させることにより当該抗体に、さらに付着される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、ｍＡｂ１６２０又はｍＡｂ２４０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質は、ｍＡｂ２４０により認識されるエピトープをプロセッシングするｐ５３の温度感受性形態である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物がｐ５３ファミリーのタンパク質と相互作用して、その野生型活性を修復し又は安定化させ、ここで、当該活性は腫瘍抑制活性を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐ５３のタンパク質の野生型活性を促進する追加の化合物を設計するステップ、ここで、当該化合物は仮定を作製するために使用され、当該仮定に適合する候補化合物を同定するステップ、及び当該候補化合物が当該ｐ５３ファミリーの野生型活性を促進するかどうかを測定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
有機非ペプチド化合物が、ｐ５３ファミリーの哺乳動物タンパク質の突然変異型における野生型活性を促進することができるかを評価する方法であって、ここで、当該タンパク質の１以上の機能的活性が、生理学的条件下、機能的コンホメーションを維持する当該タンパク質の不能力により少なくとも一部弱められており、上記方法は、以下のステップ：
（ａ）生理学的条件下、上記突然変異タンパク質を、当該突然変異タンパク質内の１以上のドメインに結合することができる有機非ペプチド化合物に接触させ、そして当該タンパク質における機能的コンホメーションを安定化させ；そして
（ｂ1）上記安定化されたタンパク質を、前記活性の計測により前記野生型活性に参加する１以上の巨大分子と相互作用させ；又は
（ｂ2）クロマトグラフィー、スペクトロスコピー、吸収、超遠心、特異的ＤＮＡ結合アッセイ、及びｐ５３により阻害され又は活性化されることが知られる他の遺伝子産物のタンパク質結合から成る群から選ばれる方法を介して上記機能的コンホメーションの存在を確認する、
を含む前記方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公開番号】特開２００６−１６６９２０（Ｐ２００６−１６６９２０Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４７５（Ｐ２００６−１４７５）
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【分割の表示】特願２０００−５８４８７１（Ｐ２０００−５８４８７１）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１日（１９９９．１２．１）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月６日（２００６．１．６）
【分割の表示】特願２０００−５８４８７１（Ｐ２０００−５８４８７１）の分割
【原出願日】平成１１年１２月１日（１９９９．１２．１）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]