ｐＶＩＩＩファージディスプレイ
本発明は，ｐＶＩＩに由来する新規な結合タンパク質を用いて，フィラメント状のファージ上にディスプレイされるペプチドの代替的な足場を提供する。フィラメント状のファージのライブラリーは，結合タンパク質から生成可能である。ファージディスプレイシステムは，ファージミドと，本発明の一部をなすヘルパーファージとを含む。本発明のある側面は，ファージディスプレイシステムを含むキットであり，該システムは，ファージミドと，ヘルパーファージとを含む。該ヘルパーファージは，本発明よる結合タンパク質をコードする核酸を含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
タンパク質の同定，特性解析，及び組み換えを組み合わせて行うための手法を利用することは，学術的な研究開発においても工業的な研究開発においても非常に成功を収めている。それに関して，フィラメント状のバクテリオファージといったファージディスプレイ技術は，第１のライブラリープラットフォームとなる方法として確立されてきており，現在のところ，独占的な技術として君臨している。したがって，ファージディスプレイは，基本的なタンパク質や応用的なタンパク質の発見において広く適用されているだけでなく，新規なタンパク質をベースとした診断や治療においても広く適用されており，いずれも，世界的に急速に広まっている化合物の分類である。
【０００２】
組み合わせ可能なファージディスプレイ技術の原理は，遺伝子型−表現型の結合に基づいており，この遺伝子型−表現型の結合は，各ビリオンが，そのタンパク膜でカプセル化されたゲノムがエンコードされたタンパク質と完全に同一のタンパク質を，対応するビリオンの表面に，ディスプレイのみを行う傾向にあるという性質によって提供されるものである。ここで，ファージ粒子自体は，様々な生理化学的な条件に対して高い耐性をもっている。したがって，ファージディスプレイは，競合する組み合わせ技術と比較して，多くの選択ゲノムにおいて用途が多いという利点がある。
【０００３】
異種のポリペプチドをファージディスプレイすることは，フィラメント状のファージ膜を構成するタンパク質の５種類全てを用いることで達成されている。しかし，ｐＩＩＩのディスプレイと，ｐＶＩＩＩのある程度のディスプレイとが広範囲な利用として実現されているにすぎない（図１）。
【０００４】
異種融合が短鎖のペプチドのみである場合，ファージゲノムをベースとしたベクターを用いた多価のディスプレイシステムが好ましいが，一方で，折り畳まれたドメインを必要とするより長鎖の融合の場合のような，多くの用途では，ファージミドシステムから恩恵を受けることとなる。後者の場合，抗体型ｐＩＩＩのファージディスプレイは，この技術分野を圧倒的に独占している。しかし，代替的な手法が台頭してきており，その手法は，次世代のタンパク質工学のツールとして展開されることが継続的に求められている。多くの用途においては，二重特異性をもつファージ粒子を作製可能であること（特には，制御可能な手法で作製可能であること）は，複数のコートタンパク質が，同じウイルス粒子に照らして融合ペプチドをディスプレイしたという点で，優れた利点になり得るといえる。また，そのようなシステムは，既に確立されているディスプレイ技術、特にはｐＩＩＩディスプレイやｐＶＩＩＩディスプレイに対して干渉を与えない必要がある。
【０００５】
ＥｎｄｅｍａｎｎとＭｏｄｅｌは，１９９５年（ＰＭＩＤ：７６１６５７０）に，少数のコートタンパク質であるｐＶＩＩが，原型のファージ内では利用できないこと，さらには，ｐＶＩＩが，そのＮ末端と結合した他のタンパク質とともに機能しないことを報告した。そして，この報告では，ｐＶＩＩがファージディスプレイには利用することができないと結論付けられている。
【０００６】
Ｇａｏらは，１９９９年（ＰＭＩＤ：１０３３９５３５）に，さらには，特許出願としての国際出願公開第００７１６９４号パンフレットにおいて，ｐＶＩＩに関する，オクタペプチドＦＬＡＧタグを用いた異種ペプチドのファージディスプレイだけでなく，ｐＶＩＩやｐＩＸに関する同時ファージディスプレイについても記述している。ここで，これらのディスプレイは，トポロジーを折り畳む錯体を隠蔽する機能的なヘテロ二量体型のポリペプチド（抗体Ｆｖ）を生成するためのものである。これらの著者は，抗体のディスプレイを行うための代替手段を開発することを目的としていた。ｐＶＩＩやｐＩＸといった結合タンパク質は，ダイシストロニック集合体を使用したファージミドから発現したものであるので，結果として，機能的なファージ粒子は，様々な量で，ｐＶＩＩやｐＩＸとしった結合タンパク質を必然的に含むこととなる。これは，ヘルパーファージゲノムから提供された野生型のｐＶＩＩやｐＩＸといったタンパク質による相補性に起因するものである。ｐＶＩＩやｐＩＸが，それらのＮ末端に結合した他のタンパク質と機能しなかったことが，上述したように，既に提唱されており，また，Ｇａｏらによって彼らの成功に関して可能性のある２種類の理由の単独又は双方の組み合わせが与えられている。
【０００７】
１つの可能性のある理由は，原核生物のリーダー配列（シグナル配列）が，結合タンパク質にＮ末端的に添付していたことにあり，そのために，組み換え型タンパク質の標的化がペリプラズムの空間に確保され，それによって，細胞質内での集積が妨げられたことが考えられる。もう１つの可能性のある理由は，組み換え型のタンパク質が，エンデマンとモデルが提唱したようなファージゲノムではなく，ファージミドから発現したことにあり，そのために，ファージミドレスキューを必然的に必要としたヘルパーファージからの野生型のｐＶＩＩやｐＩＸが組み換え型のｐＶＩＩやｐＩＸといった結合タンパク質を補完しており，その結果，野生型の機能性（官能性），又は組み換え型の変性に起因して損なわれた機能性が妨げられたと考えられる。すなわち，ファージは，野生型のタンパク質と結合タンパク質の混合物で構成されるものである。上述の著者らは，ｐＶＩＩ−ｐＩＸのディスプレイフォーマットが，異種二量体アレイを組み合わせたディスプレイが特に有用であろうということを述べている。ここで，そのようなアレイは，原因は不明ではあるが，パンニングプロトコルの間に特別な効果的な濃縮をもたらすようになると思われる。著者らは，ｐＶＩＩをディスプレイ用タンパク質だけとして用いて，又はｐＶＩＩディスプレイを他のコートタンパク質（ｐＩＸとは異なるタンパク質）でのディスプレイと組み合わせて用いて，二重特異性ディスプレイを実現することを想定していない。
【０００８】
Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，ｓｃＦｖのフラグメントをファージゲノム内で直接的に遺伝子ＶＩＩに対して遺伝的に安定的に結合させることを記述している（ＰＭＩＤ：１６２７７９８８）。すなわち，結果的に得られるファージが，野生型のタンパク質ｐＶＩＩを何ら含まず，かつ，ｐＶＩＩディスプレイが多価であった。著者らは，ファージゲノムフォーマットにおいてｐＶＩＩのディスプレイに成功した理由の１つが，結合タンパク質をペリプラズムの空間に導く原核生物のシグナル配列で結合遺伝子を裏付けられたことにあると仮説を立てている。著者らは，上述したシステムの特異性が，ｐＶＩＩをディスプレイするファージが，改変されていない少数のコートタンパク質として野生型ｐＩＩＩを産生することにあると論じている。ここで，機能的なｐＩＩＩを多重的に複製するためには，宿主細胞の感染を必要としていることが既に報告されていることから，ファージ表面に野生型ｐＩＩＩが存在することで，選択された抗体の再生が広い多様性をもって促進される可能性がある。つまり，著者らは，二重特異性のディスプレイを予期していないだけでなく，彼らは，ペリプラズムの空間にターゲッティングする原核生物のシグナル配列を必要としないｐＶＩＩディスプレイを予期していない。
【０００９】
Ｋｈａｌｉｌらは，二重特異性をもつフィラメント状のファージビリオンの特徴を利用した用途について記述している（ＰＭＩＤ：１７３６０４０３）。その特徴とは，外来栄養型のペプチドが完全同一のビリオンの各遠位端でディスプレイされるというものである。彼らは，上述した用途を，ｐＩＸディスプレイファージミドを補完する通常のｐＩＩＩファージゲノムのベクターを組み合わせて利用することで実現した。その設定では，ファージゲノムのベクターが，ファージミドをレスキューするときのヘルパーファージとして機能していた。つまり，本明細書で説明する手法，すなわち，ｐＶＩＩ改変ヘルパーファージゲノムを使用してｐＩＩＩディスプレイのファージミドをレスキューすることで，二重特異性のファージミドビリオンを生成する手法，を想起させるものである。しかしながら，両者には，二重特異性ビリオンを得るための手段や，所定のビリオンのビオチン化を得る手段が互いに異なるという点でいくつかの特徴が挙げられ，それた特徴によって，両者は互いに区別されるといえる。
【００１０】
第１に，Ｋｈａｌｉｌらの手法では，ｐＩＩＩファージミドディスプレイを，それらｐＩＩＩ結合を担うファージゲノムベクターのまま組み合わせて使用することができるはずがなく，結果として，ファージミドのレスキューで二重特異性を得ることはできず，また，二重特異性は，ｐＩＩＩ結合の双方の機能に有害となる可能性が高いといえる。
【００１１】
第２に，筆者ら自身が示しているように，ゲノムのｐＩＸ改変は，ファージゲノム内の遺伝子と重複するために，実行可能なストラテラジーの１つとしてみなすことはできないので，彼らは，改変されたヘルパーファージゲノムであって，ｐＩＩＩファージミド（又はｐＶＩＩＩ）レスキューに使用可能であるとともに，そのようにすることで，所定の表現型の特徴を完全同一のビリオンの双方の遠位端に提供可能なヘルパーファージゲノムの生成を予想したり，仮説を立てたりしていない。Ｋｈａｌｉｌらは，改変されたｐＶＩＩをファージミドで使用することやファージゲノムディスプレイで使用することについて何ら言及していない。
【００１２】
第３に，Ｋｈａｌｉｌらは，単一のファージゲノムを改変するに際して，完全同一のゲノム内で複数のキャプシド遺伝子を同時に改変することで二重特異性をもつビリオンを実現することについて仮説を立てていない。彼らは，単に，市販で入手可能なファージゲノムベクターを使用して標準のｐＩＩＩペプチドディスプレイを利用したに過ぎない。
【００１３】
第４に，Ｋｈａｌｉｌらは，単に，二重特異性をもつビリオンをディスプレイする短鎖のペプチドを生成したに過ぎず，折り畳まれたドメインを生成したのではなく，また，そのようなディスプレイを，改変されたキャプシドタンパク質の一方又は双方で実現することについては何ら仮説を立てていない。
【００１４】
第５に，Ｋｈａｌｉｌらは，ｐＩＩＩをディスプレイしたペプチドについて位置特異性をもつビオチン化を，インビトロの化学的結合を利用して実現しているが，インビトロやインビボでの酵素反応によっては実現していない。著者らは，アビジンタグ（ＡｖｉＴａｇ：登録商標）といった酵素基板をディスプレイすることで，ディスプレイ部分について酵素介在型のビオチン化を行うことを何ら予想していない。
【００１５】
以上のことから，Ｋｈａｌｉｌらは，Ｎ末端のシグナル配列を利用しないタイプのディスプレイを何ら示唆していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は，フィラメント状のファージ上にディスプレイされたペプチドに適した代替的な足場を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第１の側面は，フィラメント状のファージに由来するｐＶＩＩ結合タンパク質であって，当該結合タンパク質がＮ末端のシグナル配列を含まず，それにより，結合が外来栄養型のペプチドに導かれる，結合タンパク質である。
【００１８】
本発明の他の側面は，本発明の結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【００１９】
本発明のある側面は，本発明の結合タンパク質を含むフィラメント状のファージに関する。
【００２０】
本発明の別の側面は，フィラメント状のファージのライブラリーに関する。
【００２１】
本発明のある側面は，ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，該ヘルパーファージが，本発明のｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる，ファージディスプレイシステムに関する。
【００２２】
本発明の他の側面は，ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，該ファージミドが，本発明のｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる，ファージディスプレイシステムに関する。
【００２３】
本発明のある側面は，ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムを有するキットであって，該ヘルパーファージが，本発明のｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる，キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は，フィラメント状のファージの構造を模式的に示す図である。ビリオンは，５種類の構造的なタンパク質で構成されており，これらのタンパク質は，単一らせん構造をもつＤＮＡ分子を被覆（コート）している。野生型（ｗｔ：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のファージには，ｐＶＩＩＩの複製が約２７００存在するとともに，ビリオンの各端にあるｐＩＩＩ，ｐＶＩ，ｐＶＩＩ，及びｐＩＸからなる４種類のタンパク質の群のうちのいずれかの複製が３〜５前後存在する。ビリオンのサイズは，ゲノムのサイズに依存し，ｐＶＩＩＩコートタンパク質１個当たりヌクレオチドが２．３個前後であり，したがって，粒子の長さは，付着したｐＶＩＩＩの複製の数で増減することで調整される。なお，ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩの構造は，Ｘ線ファイバー回折法，結晶学，及び核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）によって既に明らかにされている。少数のコートタンパク質であるｐＩＩＩは，互いに異なる３種類のドメインを含んでおり，それらのドメインは，グリシンが豊富な領域で分離されている。それら３種類のドメインは，Ｎ１（ＴｏｌＡに結合するドメイン）と，Ｎ２（Ｆ線毛に結合するドメイン）と，ＣＴ（ビリオンと一体的なドメインであって，正常なビリオンアッセンブリーにとって重要なドメイン）である。
【００２５】
【図２】図２は，ＡｖｉＴａｇ（登録商標），ＨＩＳ６−タグ，及びＦＬＡＧタグの大腸菌Ｋ１２コドン最適化を示す図であり，図２（Ａ）は，市販で入手可能なＡｖｉＴａｇ（登録商標）のＤＮＡ配列と，大腸菌Ｋ１２コドンの利用とを比較したものである。赤いコラムは，提出した配列に対応し，黒いコラムは，参照セットに対応する。図２（Ｂ）において，上部の線は，原型のＡｖｉＴａｇ（登録商標）を示しており，下部の線は，Ａの結果に応じて調整した改変後の配列を示している。図２（Ｃ）は，コドン最適化後のＦＬＡＧペプチドを示す。図２（Ｄ）は，コドン最適化後のＨＩＳ６ペプチドを示す。
【００２６】
【図３】図３は，野生型ヘルパーファージの比較対象となる改変後のヘルパーファージの滴定量を示す図である。
【００２７】
【図４】図４は，Ｍ１３Ｋ０７のＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩＩに関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図である。 ビオニチル化したビリオンを吸収させるために，規格化したファージ調合液をストレプトアビジン（ＳＡ）のビーズと混合させ，その後，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を実施例１で記述するように実施した。
【００２８】
【図５】図５は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，Ｍ１３Ｋ０７でのｐＶＩＩ結合としてのＦＬＡＧタグのアクセシビリティー（可触性）を示している。規格化したファージ調合液を酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）試験で使用した。Ｍ２とＭ５のＭＡｂの双方に関しては，Ｍ１３Ｋ０７ＦＬＡＧについてのみ，ＦＬＡＧタグの明確な検出値が認められる。Ｍ５のＭＡｂによるＦＬＡＧタグの検出値の方がより強い。
【００２９】
【図６】図６は，分析結果を示す図であり，Ｍ１３Ｋ０７（配列表ＩＤ番号：３１）とＶＣＳＭ１３（配列表ＩＤ番号３２）の双方に対するｐＶＩＩ結合としてのＨＩＳタグのアクセシビリティー（可触性）を示している。ＨＩＳ６でタグ化されたビリオンを吸収させるために，規格化したファージ調合液を，タロン社（Ｔａｌｏｎ）のダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ；登録商標）と混合させ，その後，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を実施例１で記述するように実施した。
【図７】図７（Ａ）では，ｓｃＴｃＲのファージミドの滴定量とｓｃＦｖ−ｐＩＩＩがディスプレイされたファージミドの滴定量をコロニー形成単位ｃｆｕampR／ｍｌで示されている。図７（Ｂ）では，ヘルパーファージに対するファージミドの比率を，ファージミドの滴定量（ｃｆｕampR／ｍｌ）をヘルパーファージの滴定量（ｃｆｕkanR／ｍｌ）で割った値で示す比率で示されている。
【図８】図８は，ｓｃＴＣＲファージミドＡｖｉＴａｇ（登録商標）の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，ストレプトアビジンで被覆（コート）したダイナビーズ（登録商標）でファージレスキューした後のＡｖｉＴａｇ（登録商標）の明確なアクセシビリティー（可触性）を示している。
【図９】図９は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，互いに異なる２種類のファージミドにおいて，２種類のアンチＦＬＡＧ抗体Ｍ２及びＭ５でファージミドビリオンをキャプチャーしたときの，ｐＶＩＩ結合としてのＦＬＡＧタグのアクセシビリティー（可触性）を示している。図９（Ａ）は，ファージミドｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１に関し，図９（Ｂ）は，ファージミドｐＳＥＸ−ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘに関する。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１０】図１０は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，図１０（Ａ）は，ｐＶＩＩＡｖｉＴａｇ（登録商標）を用いてファージミド由来のビリオン上でディスプレイされたｓｃＴＣＲｐＩＩＩの機能性を示しており，図１０（Ｂ）は，同様にディスプレイされたｓｃＦｖｐＩＩＩの機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１１】図１１は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，図１０（Ａ）は，ＦＬＡＧタグやＨＩＳ６タグを用いてファージミド由来のビリオン上でディスプレイされたｓｃＴＣＲの機能性を示しており，図１０（Ｂ）は，同様にディスプレイされたｓｃＦｖの機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１２】図１２は，ｐＶＩＩＡｖｉＴａｇ（登録商標）を用いた場合及び用いなかった場合におけるゲノムファージｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲｐＩＩＩの滴定量を示す図である。
【図１３】図１３は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，ストレプトアビジンビーズでファージをキャプチャーした後にアンチＭ１３抗体によって結合したファージを検出した場合におけるゲノムのｆＵＳＥ５−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ファージ調合液の機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１４】図１４は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＩＩＩを用いた場合におけるゲノムのファージであるｆＵＳＥ５上でｐＩＩＩがディスプレイされたｓｃＴＣＲの機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１５】図１５は，ｐＩＩＩディスプレイのファージミドを模式的に示す図であり，図１５（Ａ）は，新規なｐＧＡＬＤ７に関するものであり，図１５（Ｂ）は，新規なｐＧＡＬＤ７ΔＬに関するものである。双方のファージミドのベクターバックボーンは，ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号：２９）に基づいたものであり，その配列は，ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｙ１４５８４から入手可能であり，その構成に関する詳細は，材料及び方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）の項目内に記述されている。双方のファージミドは，それぞれ，ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部分及びＭｌｕＩ／ＮｏｔＩ部分の簡易カセット交換を介して，イン・フレームの外来栄養の配列（Ｅ1，Ｅ2とも称する）のカセットを提供可能である。それらのカセットは，以下に述べる互いに異なる構造体の中で変化する人工のリンカー配列で接続される。それら構造体とは，略称ｌａｃＰＯで示すｌａｃプロモーターと，略称ｓｄで示すシャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と，略称ｐｅｌＢで示す細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナル配列と，略称ＴＰで示すトリプシンプロテアーゼサイトと，略称ｔで示すＴ７転写終結点である。
【図１６】図１６は，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ（ｐＶＩＩΔL），ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ），ｐＳＥＸ８１（ｐＩＩＩ），及びｐＳＥＸ８１ΔＬ（ｐＩＩＩΔL）からディスプレイされたｓｃＦＶのアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）のファージミドの滴定量を示す図である。これらのファージミドは，いずれも，アンピシリン抵抗マーカーをかくまうものであるから，滴定量は，溶液１ミリリットル当たりのアンピシリン抵抗性コロニー形成単位（ｃｆｕampR／ｍｌ）として示されている。
【図１７】図１７は，抗原種（ｐｈＯｘ−ＢＳＡ）に関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図であり，シグナル配列（ΔＬ）を用いた場合と用いなかった場合において，機能性ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）のディスプレイをｐＶＩＩとｐＩＩＩの間で比較したときを示している。なお，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を，材料及び方法で説明されているように行うとともに，滴定量に関する滴下量は，ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ）を除く全てのサンプルに対して２×１０10ｃｆｕampR／ｍｌとし，ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ）については，希釈せずに使用した（これは，１．１×１０7ｃｆｕampR／ｍｌに相当する）。図中アンチＭ１３HRPは，抗原性薬剤及び阻害剤に対してビリオン検出ＭＡｂがあいまいな吸着を起こすことに関して負のコントロールを行った場合を示している。
【図１８】図１８（Ａ）は，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ（ｐＶＩＩΔL），ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ），ｐＳＥＸ８１（ｐＩＩＩ），及びｐＳＥＸ８１ΔＬ（ｐＩＩＩΔL）からディスプレイされたｓｃＦＶのアンチｐｈＯｘのファージミドの滴定量をｃｆｕampR／ｍｌで示す図である。図１８（Ｂ）は，ファージミドの滴定量（ｃｆｕampR／ｍｌ）をヘルパーファージの滴定量（ｃｆｕkanR／ｍｌ）で割った値に相当する比率を示すヘルパーファージに対するファージミドの割合を示す図である。ビリオンの凝縮（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）を，材料及び方法で説明する標準のファージミドのレスキューとして行うか（−），又は，図１８（Ａ）及び図１８（Ｂ）の双方においてスーパーインフェクション後に現存するＩＰＴＧの最終濃度が０．１ｍＭとなるように行った。
【図１９】図１９は，抗原種（ｐｈＯｘ−ＢＳＡ）に関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図であり，機能性ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘｐＩＩＩのディスプレイを，シグナル配列（ΔＬ）を用いた場合と用いなかった場合，及び，ｐＶＩＩ結合発現のためにＩＰＴＧ誘導（０．１ｍＭ）を行った場合と行わなかった場合について比較したときを示している。なお，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を，材料及び方法で説明されているように行うとともに，滴定量に関する滴下量は，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ（ｐＶＩＩΔL）に対して２×１０10ｃｆｕampR／ｍｌとし，ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ）については，希釈せずに使用した（これは，ＩＰＴＧを用いた場合で２．０×１０9ｃｆｕampR／ｍｌに相当し，ＩＰＴＧを用いなかった場合で１．１×１０7ｃｆｕampR／ｍｌに相当する）。図中アンチＭ１３HRPは，抗原性薬剤及び阻害剤に対してビリオン検出ＭＡｂがあいまいな吸着を起こすことに関して負のコントロールを行った場合を示している。
【図２０】図２０は，抗原種に関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図であり，図２０（Ａ）は，シグナル配列（ΔＬ）を用いた場合と用いなかった場合における機能性ｓｃＦｖのｐＶＩＩディスプレイを比較した場合を示しており，図２０（Ｂ）は，同様の場合における機能性ｓｃＦｖアンチＮＩＰのｐＶＩＩディスプレイを比較した場合を示している。なお，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を，不純物を除去したものを希釈していない状態で同量用いて，材料及び方法で説明されているように行った。アンチＭ１３HRPは，抗原性薬剤及び阻害剤に対してビリオン検出ＭＡｂがあいまいな吸着を起こすことに関して負のコントロールを行った場合を示している。図２０（Ａ）では，Ｔ細胞受容体４Ｂ２Ａ１用の抗体クローン種ＧＢ１１３を，ｓｃＴＣＲのＶαβ４Ｂ２Ａ１に対する，コグネートＩ−Ｅd／２315配位子の代理となる代理抗原性薬剤（Ｌｏｓｅｔら，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）として用いた。
【図２１】図２１（Ａ）は，標準ファージミドレスキューを用いた場合においてｐＧＡＬＤ７ΔＬ及びｐＧＡＬＤ７からディスプレイされたｓｃＴＣＲのＶαβ４Ｂ２Ａ１とｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）のファージミド滴定量を示す図であり，図２１（Ｂ）は，図２１（Ａ）におけるサンプルと同じサンプルのファージミド対ヘルパーファージ比を示す図である。
【図２２】図２２（Ａ）は，ビリオン凝縮プロトコル測定の終端における各大腸菌培養液の細胞密度をＡ600nmにおける光学密度（ＯＤ）で示す図である。なお，全ての培養液は，Ａ600nmにおける密度がいずれも０．０２５で始まっており，その後，Ａ600nmが０．１に到達したときにＮ１３Ｋ０７を用いてＭＯＩ５でスーパーインフェクションを行った。そして，培養液の最終的なＯＤを測定する前に，凝縮が３０℃でオンとなるようにした。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
なお，以下に説明する本発明の一態様に係る実施形態及び特徴は，本発明の他の側面に対しても適用可能である。
【００３１】
本発明で引用する全ての特許文献及び非特許文献は，参照によってそれらの全てが本明細書に取り入れられる。
【００３２】
本明細書では，新たな技術的思想として，フィラメント状のファージビリオンの構造的なコートタンパク質ｐＶＩＩが，遺伝的に，改変後のビリオンがＮ末端の配列タグをコードするように変化することを説明する。ｐＶＩＩに結合されるタグの種類によって，ビリオンには，特異なタグ検出性だけでなく，適応性のある精製手段と固定化手段とがシステムがもつ性質として与えられる。その手法は，既存のｐＩＩＩディスプレイシステムやｐＶＩＩＩディスプレイシステム，さらには，ｐＶＩＩに関する新規なライブラリー生成を含むシステムに対して，ファージミドベクターのファージゲノム基部が適用できるかどうかに関わらず，直接的に適合可能である。したがって，この新たな技術的思想は，ファージディスプレイ技術の高い多様性に対してさらなる発展をもたらすものである。
【００３３】
最初に，今回の報告では，フィラメント状のファージゲノムが，シグナル配列の生存能力や機能性に干渉を与えることがないｐＶＩＩのＮ末端でのペプチド改変を，シグナル配列をかくまうことなく許容するということを説明する。このことは，Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１），ＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２），及びｆＵＳＥ５（配列ＩＤ番号３０）のゲノム，ファージミド，並びにファージミドで実証されただけでなく，様々な株の間で表現型の保存性が非常に高い。このことは，あらゆるフィラメント状のファージに対する適用を非常に有望なものとする。
【００３４】
選択されたｐＶＩＩ結合の１つは，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）の原核生物のコドンを最適化したバージョンであった。そのペプチドは，今までに報告されている基板の中でも最も効率的なＢｉｒＡ基板である。このｐＶＩＩペプチドディスプレイをｐＩＩＩディスプレイと組み合わせることによって，二重特異性をもつビリオンが生成されることを以下に説明する。このことは，ファージゲノムをベースとしたベクターであるｆＵＳＥ５（配列ＩＤ番号３０）で実証されるとともに，改変後のＭ１３Ｋ０７のヘルパーファージを用いてレスキューしたときのファージミドディスプレイから実証された。この二重特異性という性質を，ｐＶＩＩＩディスプレイと組み合わせて利用することが可能であるということも容易に考えられる。特に，ファージミド由来のビリオンの場合には，内因性のビオチン化レベルが非常に低かった。
【００３５】
一方で，ビオチン化レベルが高い方が望ましい場合，それは，それらのビリオンのビオチン化をインビトロで行うことで，また，新規なＦ陽性の大腸菌であるＡＶＢ１００ＦｍｋＩＩ株を使用してビオチン化をインビボで行うことで，容易に達成することが可能である。
【００３６】
したがって，今回の技術的思想によって，アビジン−ビオチン技術を，支配的なファージディスプレイプラットフォーム（ファージやファージミド）及びディスプレイシステム（ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩ）の双方と組み合わせることが可能となる。そして，そのことにより，ファージ粒子に対するビオチン部位の接続が，ｐＩＩＩ結合及び／又はｐＶＩＩＩ結合に干渉を与えることなく，コントロールされたサイト特異性のある状態で可能となり，その結果，機能性の保持を確保することができる。このシステムは，利用の有無を選択するだけで，既存のプラットフォームに対してさらなる改変を必要とすることなく直接的に適合することができる。
【００３７】
まとめると，ゲノム由来のビリオンやファージミド由来のビリオンの双方は，正常な機能性と生存能力をもつビリオンを産生しつつ，ｐＶＩＩの改変を許容することができる。
【００３８】
ｐＶＩＩ結合タンパク質
本発明のある態様では，フィラメント状のファージに由来するｐＶＩＩ結合タンパク質であって，当該結合タンパク質は，外来ペプチドがｐＶＩＩのＮ末端に結合している結合タンパク質が提供される。そのような結合タンパク質は，例えば，ファージディスプレイのコンテキストで利用可能である。
【００３９】
外来ペプチドといった場合，タンパク質ｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩの一部をもともと持っていないペプチドを意味し，結合タンパク質がもつｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩのアミノ酸部分のＮ末端に対するリンカーとなるアミノ酸を持つペプチド又は持たないペプチドをいう。好ましい実施態様では，結合タンパク質は，Ｎ末端のシグナル配列を含まない。本明細書では，用語「ペプチド」は，短鎖のペプチド，ポリペプチド，タンパク質，及びそれらのフラグメントを含む概念である。
【００４０】
用語「ｐＩＩＩタンパク質」は，配列ＩＤ番号２に開示するようなアミノ酸配列を指す。
【００４１】
ある実施形態では，ｐＩＩＩタンパク質は，配列ＩＤ番号２の配列に対する相同性が少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み，例えば，その相同性が８０％，相同性が８１％，相同性が８２％，相相同性が８３％，相同性が８４％，相同性が８５％，相同性が８６％，相同性が８７％，相同性が８８％，相同性が８９％，相同性が９０％，相同性が９１％，相同性が９２％，相同性が９３％，相同性が９４％，相同性が９５％，相同性が９６％，相同性が９７％，相同性が９８％，又は，相同性が９９％である。
【００４２】
用語「ｐＩＩＩ結合タンパク質」は，配列ＩＤ番号２に開示するようなアミノ酸配列を指す。
【００４３】
用語「ｐＩＩＩ結合タンパク質」は，外来ペプチドに結合したｐＶＩＩＩタンパク質又はそのフラグメントをいう。
【００４４】
用語「ｐＶＩＩＩ結合タンパク質」は，配列ＩＤ番号３におけるアミノ酸配列を指す。
【００４５】
ある実施形態では，ｐＶＩＩＩタンパク質は，配列ＩＤ番号３の配列に対する相同性が少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み，例えば，その相同性が８０％，相同性が８１％，相同性が８２％，相同性が８３％，同性が８４％，相同性が８５％，相同性が８６％，相同性が８７％，相同性が８８％，若しくは，相同性が８９％であるか，又は，相同性が９０％，相同性が９１％，相同性が９２％，相同性が９３％，相同性が９４％，相同性が９５％，相同性が９６％，相同性が９７％，相同性が９８％，若しくは，相同性が９９％である。
【００４６】
用語「ｐＶＩＩタンパク質」は，配列ＩＤ番号１におけるアミノ酸配列を指す。
【００４７】
ある実施形態では，ｐＶＩＩタンパク質は，配列ＩＤ番号１の配列に対する相同性が少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み，例えば，その相同性が８０％，相同性が８１％，相同性が８２％，相同性が８３％，同性が８４％，相同性が８５％，相同性が８６％，相同性が８７％，相同性が８８％，相同性が８９％であるか，相同性が９０％，相同性が９１％，相同性が９２％，相同性が９３％，相同性が９４％，相同性が９５％，相同性が９６％，相同性が９７％，相同性が９８％，又は，相同性が９９％である。
【００４８】
配列の相同性
通常，「相同性」といった場合，遺伝子やタンパク質がそれぞれヌクレオチドレベルやアミノ酸レベルで互いに一致しているときの配列の一致度合いをいう。
【００４９】
そして，本明細書では，コンテキストとしての「配列の相同性」は，タンパク質がアミノ酸レベルで互いに一致しているときの一致度合いを示す測定値や，核酸がヌクレオチドレベルで互いに一致しているときの一致度合いを示す測定値をいう。ここで，タンパク質の配列の相同性は，複数の配列が並んでいる場合，各配列において所定位置でのアミノ酸配列を比較することによって決定されてもよい。同様に，核酸の配列の相同性は，複数の配列が並んでいる場合，各配列において所定位置でのヌクレオチド配列を比較することによって決定してもよい。
【００５０】
２種類のアミノ酸配列や２種類の核酸配列の相同性を百分率で決定するにあたり，最適な比較を目的として，それらの配列は調整される（例えば，第２のアミノ酸配列や第２の核酸配列を最適に並べることを目的として，第１のアミノ酸配列や第１の核酸配列の配列内に，スペース（ｇａｐ）を設けてもよい）。そして，アミノ酸の残りの部分やヌクレオチドは，対応するアミノ酸の位置や対応するヌクレオチドの位置で比較される。第１の配列内の位置が，第２の配列内の対応する位置で同じアミノ酸の残りの部分やヌクレオチドによって占有されている場合，その位置で分子が同一であるとされる。２種類の配列の間での相同性を示す百分率は，配列によって共有された位置が一致する数の関数である（すなわち，相同性［％］＝（一致する位置の数／位置の総数（例えば，重複する位置の数））×１００）。ある実施形態では，２種類の配列は，互いに同じ長さである。
【００５１】
配列を手動で調整して，同一のアミノ酸の数を数えてもよい。これに代えて，相同性の百分率を決定するために，数学的なアルゴリズムを用いて２種類の配列を配列させてもよい。そのようなアルゴリズムは，Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）によるＮＢＬＡＳＴプログラムやＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴ（ブラスト）のヌクレオチド検索は，ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて，スコア１００，ワード長１２で実行可能であり，これにより，本発明による核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることが可能である。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索は，ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて，スコア５０，ワード長３で実行可能であり，これにより，本発明によるタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることが可能である。比較目的でスペースを入れた配列を得るために，ギャップ化ブラスト（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）を利用してもよい。それに代えて，サイブラスト（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）を用いて，分子間の距離関係を検出する反復検索を行ってもよい。ＮＢＬＡＳＴプログラム，ＸＢＬＡＳＴプログラム，及びスペース化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合，各プログラムのデフォルトのパラメーターを用いることが可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。これに代えて，例えば，ＥＭＢＬデータベース内のＢＬＡＳＴプログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で配列を並べた後に，その配列の相同性を計算してもよい。一般的には，例えば「スコアリングマトリックス」や「ギャップペナルティ」についてはデフォルトの設定をアライメントに使用可能である。本発明のコンテキストでは，ＢＬＡＳＴＮとサイブラスト（ＰＳＩ ＢＬＡＳＴ）のデフォルトの設定が好都合なものとなり得る。
【００５２】
２種類の配列間の相同性の百分率は，許容可能なスペースがある場合やない場合において，上述したような技術と同様の技術を用いて決定することも可能である。そして，相同性の百分率を計算する際には，正確に一致するものだけが数えられる。
【００５３】
折り畳みタンパク質
本発明の好ましい実施形態では，用語「ペプチド」は，抗体由来のドメインなどの折り畳みタンパク質のみを意味する。当業者は，以下を含む，折り畳みタンパク質が抗体やそのフラグメントであり得ることを認識するものである。Ｆｖ，ｓｃＦｖ，Ｆａｂ，単一のドメイン，タンパク質ＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ），アンキリンやそのフラグメント，Ｔ細胞受容体やそのフラグメント，ＭＨＣ分類ＩやＩＩのフィブロネクチンやそのフラグメント，Ａｖｉｍｅｒ，Ａｎｔｉｃａｌｉｎ，ＰＤＺドメイン，ＩｇＮＡＲやそのフラグメント，ＣＴＬＡ４やそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，Ｋｎｏｔｔｉｎ，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物化学的な蛍光色素分子。
【００５４】
原理的には，ディスプレイ可能である限り，任意のものをライブラリー化することが可能である。そのため，整列構造（つまり，折り畳み構造）を持つものに比較して非構造的な配列のみを持つものを区別することだけに関していえば高いレベルで行うことが可能である。
【００５５】
別のより好ましい実施形態では，用語「ペプチド」は，２〜５０個の間のアミノ酸（ａａ）の短鎖のペプチドのみを意味する。ある長さでは，短鎖のランダムコイル構造をもつペプチドは，所定の二次的な折り畳み構造又は三次的な折り畳み構造に十分に適した長さであり，そのために，折り畳まれたドメインを定義することとなる。このことは，明らかに，化学的な組成に依存している。したがって，２０個のアミノ酸（２０ａａ）からなる一方のペプチドがランダムコイル構造のままである場合，２０個のアミノ酸（２０ａａ）からなる他方のペプチドは折り畳まれた状態となり得るものであり，結果として，折り畳みドメインを定義し得るものとなる。
【００５６】
別のより好ましい実施形態では，本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質は，配列ＩＤ番号１における位置１〜３３，位置２〜３３，位置３〜３３，位置４〜３３，及び位置５〜３３からなる位置の群から選択された配列を含む。
【００５７】
配列ＩＤ番号１（ＭＥＱＶＡＤＦＤＴＩＹＱＡＭＩＱＩＳＶＶＬＣＦＡＬＧＩＩＡＧＧＱＲ）は，フィラメント状のファージの構造的なコートタンパク質ｐＶＩＩ（野生型ｐＶＩＩ）のアミノ酸配列である。最も好ましくは，そのｐＶＩＩ結合タンパク質は，配列ＩＤ番号１における位置１〜３３にある。
【００５８】
シグナル配列
好ましくは，外来ペプチドは，任意のアミノ酸を介して又は介さずに，結合タンパク質のｐＶＩＩ配列のＮ末端に対して直接的に結合している。さらに別の好ましい実施形態では，ｐＶＩＩ結合タンパク質は，Ｎ末端のリーダー（ｌｅａｄｅｒ）配列を含まない。
【００５９】
用語「リーダー配列」は，用語「シグナルペプチド」や用語「シグナル配列」と置換可能に用いられ，グラム陰性菌のペリプラズムの皮膜スペースに対してタンパク質（そのリーダー配列が一部であるタンパク質）をターゲッティングするアミノ酸配列を意味する。リーダー配列の例としては，ｐｅｌＢｓｓ，ＯｍｐＡｓｓ，ＴｏｒＡｓｓ，ｍａｌＥｓｓ，ｐｈｏＡｓｓ，ｌａｍＢｓｓ，Ｂｌａｓｓ，及びＤｓｐＡｓｓや，ｍｇｌＢｓｓ，ｓｆｍＣｓｓ，ｔｏｌＢｓｓ，及びＴｏｒＴｓｓがしばしば用いられる。そのようなシグナル配列は，大腸菌の分泌機構に対して，完全なタンパク質をターゲッティングすることが知られている。ここで，大腸菌は，少なくとも，細胞質ゾル（シトソル）からペリプラズムの空間への転座として，ＳＲＰ依存の転座，ＳＥＣ依存の転座，ＴａｔＡＢＣ依存の転座，又はＹｉｄＣ依存の転座を含むことが知られている（Ｂａｎｅｙｘら，ＰＭＩＤ：１５５２９１６５）。したがって，用語「Ｎ末端のシグナル配列」は，タンパク質のＮ末端部分内にあるシグナル配列を意味する。
【００６０】
シグナル配列は，大腸菌の分泌機構に対してタンパク質（その一部）をターゲッティングする性質をかくまい，それによって，それを細胞質の区画からペリプラズムの区画へと転座させるものであって，シグナル配列を，アミノ酸の組成の化学的な性質によって定義された符号（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）やモチーフを用いて，部分的に同定することが可能である。
【００６１】
しかし，既存の機能的なシグナル配列の多様性は，まだ現在のところ，それらを同定するにあたり現在の知見を上回るものであり，そのために，ペプチドをコグネートシグナル配列として定義する際の技術の現状は，通常，例えば，神経ネットワークや発見的方法論によってテンプレートとしてデータベース化された知見を用いてデータ検索することにとどまっている。現在のところ，そのようなツールのいくつかは，オープンアクセスチャネル（例えば，ＳｉｇｎａｌＰ，ＰＲＯＳＩＴＥ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）のＰＰＳＥＡＲＣＨ，ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ，ＴａｔＰ）を介して社会全体で利用可能である。
【００６２】
その挑戦は，分泌線のタンパク質を分類する場合，シグナル配列モチーフが無いことを同定可能だが，データ検索を用いることで，シグナル配列の特徴を定義したり，問題となっている真核性タンパク質の分泌能力の可能性を取得したりすることが可能といったルールからは外れた細胞質の区画からエクスポートする意味において，さらに高度である。現在のところ，そのようなツールは，原核生物群に関しては，まだ存在しない。
【００６３】
したがって，現在利用可能な方法であって，ペプチドをシグナル配列として変更不可的に同定する唯一の方法は，経験的な手段によるものであり，ペプチドの性質を確認して，それが実在するシグナル配列であるかどうかを決定することである。また，そのようなペプチド内で工業技術を，シグナル配列内でのアミノ酸の所定位置が変化しつつも，そのシグナルペプチドとしての機能が，天然の機能性及び変化後の機能性のいずれか（例えば，増大した転送能力）によって保持されるように，なし得ることは明らかである。また，アミノ酸の欠失や付加を行ってもよい。確かに，そのような分析や工業技術は，ＦｆｐＶＩＩＩシグナル配列，Ｓｅｃ経路をターゲッティングするｇ８ｐｓｓ，及び，Ｔａｔ経路をターゲッティングするＴｏｒＡｓｓを用いてなされてきた。特に，Ｓｈｅｎらによる結果は，変化後の変種，ｐＩＩＩシグナル配列，及び細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を除いては，機能についての工業技術にとって十分に根拠のあるガイドラインとして機能している。
【００６４】
シグナル配列の機能性は，さらに，以下の２種類のペプチドに分けることが可能である。
【００６５】
１．大腸菌の分泌機構に対するタンパク質（その一部）のターゲッティングを行って，その結果，細胞質の区画からペリプラズムの区画へと転座させ，そして，本プロセスの途中で，特定のプロテアーゼ（例えば，リポタンパク質のシグナルペプチダーゼやリーダーペプチダーゼ）を用いて，残っているタンパク質からタンパク質分解的に分離すること。
【００６６】
大腸菌の分泌機構に対するタンパク質（その一部）のターゲッティングを行って，その結果，細胞質の区画からペリプラズムの区画へと転座させ，その後に，タンパク質の一部として転座を保持したままとすること。
【００６７】
シグナル配列の非常に多くの部分は，上述した状況１にマッピングされるが，これらのタンパク質を上述した状況２で容易に処理し得ることは明らかである。したがって，現在のところ知られている任意のシグナル配列（例えば，変種ｐｅｌＢｓｓなど）は，もともと，上記状況１に属するものであるが，上記状況２に変えられて，コグネートシグナル配列としてみなされる。
【００６８】
また，状況１のシグナル配列を状況２に変化させること，及び，状況２にマッピングするシグナル配列を直接的に選択し，そして転座後にシグナル配列を除去することのいずれかを考えることができる。このことは，宿主に内在するプロテアーゼによって，及び／又は，例えばファージディスプレイの場合においてタンパク質がキャプシドタンパク質に結合するときに実行可能である。そして，シグナル配列の適切な領域や，一部をなすタンパク質，人工的なプロテアーゼのサイトを，所定の裂け目が実現できるように処理することになる。ここでは，２種類の互いに異なるタイプのプロテアーゼの選択サイトを以下のように想定することができる。
【００６９】
Ａ． プロテアーゼのサイトは，興味のある抗体や他の足場（例えば，主要な組織適合性錯体分子やＴ細胞受容体）と結合すると予想されるサイト（例えば，カルボキシペプチダーゼや３Ｃライノウイルスのプロテアーゼサイト）のみで，興味のあるタンパク質を開裂させない。この手法を利用することで，例えば，上記状況２にマッピングするシグナル配列を用いることによる，興味のあるタンパク質のファージディスプレイを，想定することができるとともに，選択などに先だって，シグナルペプチドを人為的に除去して，キャプシド結合に対する機能性と均一性を得ることができる。
【００７０】
Ｂ． プロテアーゼのサイトは，処理後のサイト（例えば，トリプシン）に加えて，興味のあるタンパク質を開裂させる。
【００７１】
双方の状況は，シグナル配列依存のファージディスプレイとしてみなすことができることとなる。
【００７２】
野生型の相補性
これまでは，シグナル配列を用いないときのｐＶＩＩ結合は，ファージ粒子の産生を助長することに関して非機能的であると考えられてきた（Ｅｎｄｅｍａｎら，１９９５年；Ｇａｏら，１９９９年）。そのため，そのＮ末端に直接的に結合した外来ペプチドを持つｐＶＩＩ結合タンパク質は，ファージゲノム上の第２の遺伝子からのｐＶＩＩタンパク質の重量によって，又は，ヘルパーファージからの提供によって補完される必要があった。
【００７３】
用語「野生型」とは，野生の型，野生−型，又はｗｔとも称することとするが，有機的組織体，株，若しくは遺伝子の通常の形態であることや，天然で生じたままの特性のことをいう。野生型とは，天然の個体群において最も一般的な表現型であることをさす。また，野生型とは，野生型という表現型を産生するために必要な遺伝子座の各々における対立遺伝子をさす。野生型のものは，遺伝子型や表現型を参照するときの標準となる。生物学上，野生型は，天然に生じる有機的組織体と，故意に変異させた個体との間の差異に特に関連している。サイト特異性のある突然変異生成は，研究技術の１つであり，これにより，野生型遺伝子の遺伝子配列において特定のヌクレオチドを変異させることが可能となる。本明細書では，野生型のタンパク質を，ｗｔ−（タンパク質名）といったように称することとし，例えば，野生型ｐＶＩＩタンパク質は，ｗｔｐＶＩＩ，ｗｔ−ｐＶＩＩ，野生型ｐＶＩＩと称される。
【００７４】
本願の発明者らは，上述したようなｐＶＩＩ結合タンパク質が，確かに機能的であり，かつ，必ずしも，野生型ｐＶＩＩタンパク質で補完される必要がないことを見いだした。
【００７５】
したがって，本発明のある態様は，ファージディスプレイにおいて機能的なｐＶＩＩ結合タンパク質であって，野生型ｐＶＩＩタンパク質での補完が必要ないｐＶＩＩ結合タンパク質に関する。
【００７６】
Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，野生型ｐＶＩＩタンパク質での補完の必要がないｐＶＩＩ結合タンパク質について報告している。しかしながら，ＫｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらのｐＶＩＩ結合タンパク質は，外来ペプチドのＮ末端端部にシグナルペプチドを含むものであった。そのシグナルペプチドは，Ｎ末端ｐＶＩＩ結合タンパク質を，ペリプラズム空間内へ向ける必要があるとともに，シトプラズム内でのその蓄積を妨げることが推測された。
【００７７】
シグナルペプチドがｐＶＩＩ結合タンパク質のＮ末端端部に存在しないことで，様々な効果が得られる。シグナルペプチドは，通常はタンパク質分解的に除去される。そして，その処理では，しばしば完全ではないが，それにより，タンパク質の収集（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が発現する場合において処理後のタンパク質に互いに異なるＮ末端端部が生じ，その結果，システム内においてランダムな均一性が生じることとなり，このことは，
処理後のタンパク質内において無用のエラーにつながるリーダーペプチドをかくまったままのタンパク質の機能性に影響を与える可能性がある。このことは，シグナルペプチドが存在しないことで回避される。
【００７８】
また，ペプチドのライブラリーがディスプレイされた場合，ペプチドのいくつかは，タンパク質分解を回避したり影響を与えたりする可能性がある。ここで，タンパク質分解は，ディスプレイされたタンパク質の活性，ひいては機能的なライブラリーの多様性に影響を与えるものである。シグナルペプチドを含まないことによる，さらに他の意外な効果としては，ファージの実行可能性や機能性が，シグナルペプチドを使用した場合とは異なり，影響を受けないということがある。Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，リーダー配列（シグナルペプチド）をＮ末端に含むｐＶＩＩ結合タンパク質を用いた場合のファージに対して滴定量が低かったことを報告している。
【００７９】
外来ペプチド
ある実施形態では，外来ペプチドは，所定のターゲットに結合する親和性標識（アフィニティータグ）である。親和性標識は，例えば，所定の抗体と結合し得るものである。親和性標識と所定のターゲットの組み合わせは，当業者にとっては周知である。
【００８０】
タンパク質タグは，遺伝子的に，組み換え型タンパク質上へ移植するペプチド配列である。これらのタグは，たいてい，化学的な試薬によって，又は，酵素的な手段（例えば，タンパク質分解やインテインスプライシング）によって，除去可能である。タグは，様々な目的でタンパク質に取り付けられる。
【００８１】
親和性標識は，それらの未処理の生物源から親和性技術で精製可能なように，タンパク質に付加される。
【００８２】
未処理のＮ末端ＦＬＡＧタグの特徴は，そのホルミル基のＭｅｔ残渣が原形のままでもつことであり，そのために，Ｃａ2+依存の相互作用であってアンチＦＬＡＧのＭＡｂ Ｍ１との相互作用が許容される。そして，Ｍ１上にビリオンを結合（つまり固定）することが可能となるとともに，そのカチオンがＥＤＴＡなどによってキレート化されていることでのみビリオンが遊離することが可能となり，その結果，非相同の結合を変成させるような過度のｐＨとならない，非常に緩やかな溶出が進行することとなる。また，このことは，Ｍ１を使用することで，システムを，既存の他のＦＬＡＧ結合（内部的に，処理後のＮ末端，又はＣ末端）とともに，Ｍ１によって又は単純にカルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］）を低く維持することによって認められることがない程度の干渉を伴うことなく，利用することが可能となることも意味している。
【００８３】
好ましい実施形態では，ｐＶＩＩ結合タンパク質の外来ペプチドは，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ ｔａｇ），Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，アンキリン，ＩｇＮＡＲ又はそのフラグメント，フィブロネクチン又はそのフラグメント，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される。
【００８４】
配列ＩＤ番号２（ＭＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）は，酵素仲介型のサイト特異性結合であって，ビオチン部位の基質配列への結合を可能にする大腸菌酵素ＢｉｒＡ配列の基質配列である。したがって，ファージディスプレイ技術の利点とアビジン−ビオチン技術の利点とを兼ね備えることとなる。ｐＶＩＩ上にディスプレイされていないライブラリー内の任意の結合ライブラリーは，例えば，第１に，高い親和性をもつライブラリーの要素を同定するために，ターゲットに対して細分化され，そして，アビジンに結合しているビオチン，又は，ビリオン上のｐＶＩＩ結合も含むアビジン状のマトリクスを用いて，固定される。これに代えて，ｐＶＩＩ上にない任意の結合ライブラリーは，例えば，第１に，ランダムに，又は，アビジン上若しくはアビジン状のマトリクス上の所定のアレイ内に固定され，続いて，コントロールされた状態でかつ方向性のある方法で，ビリオン上のｐＶＩＩ結合も含む手段によって，（例えば，ＳＥＲＥＸ内で）ターゲットのスクリーニングが行われる。同様に，ｐＩＩＩ結合ライブラリーやｐＶＩＩ結合ライブラリーの任意の要素は，バルク内で，又は単一種類のクローンとして検出可能である。ここで，その検出に先立って又は検出後に，任意のアビジン又はアビジン同様のレポーター錯体を用いることでターゲットの相互作用が生じる。なお，用語「レポーター」は，本明細書では，例えば，酵素，核酸種，又は，人工の蛍光色素分子若しくは生物的な蛍光色素分子を記述するdescribes。
【００８５】
ＡｖｉＴａｇをアウトラインするのと基本的に同じ論理的根拠であるが一方で不可逆的な固定化に近い後者の結果としては，ＨＩＳ６は，イミダゾールを用いることで緩やかな溶出を許容することがある。ＨＩＳタグは，利用可能なＩＭＡＣマトリクスと適合する。
【００８６】
他の好ましい実施形態では，ｐＶＩＩ結合タンパク質の外来ペプチドは，ライブラリーの要素である。本発明のコンテキストで利用されるライブラリーは，互いに異なるペプチドの収集を意味する。そのようなペプチドは，折り畳まれたドメインであってもよいし，短鎖のペプチド（例えば，２〜５０個のアミノ酸）であってもよい。そのようなライブラリーは，所定のターゲットに対して結合する新規なリガンドを同定するのに利用可能であるので，興味深い。ライブラリーをディスプレイするためにｐＶＩＩを用いることは，ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩを用いてディスプレイされたライブラリーに比較して有利な効果がいくつかある。ｐＶＩＩディスプレイは，方向性や価数に関しては，ｐＩＩＩディスプレイと同じ利点をもつが，伝染性や，ｐＩＩＩディスプレイで生じることが知られている現象に影響を与えることがない。ここで，その現象は，例えば，親和性選択後のレスキューで，システムに対して制御できない無用の不均質をもたらしたものである。また，ｐＶＩＩディスプレイは，Ｎ末端リーダーペプチド（ｐＩＩＩとｐＶＩＩＩの双方のディスプレイの前提となるリーダーペプチド）を必要とすることなしに実現可能である。最終的には，ｐＩＩＩディスプレイ内で主を固定した任意のターゲットは，通常，ターゲット−ファージ結合の分裂（通常は，競合による分裂，又は，ｐＨが高いか若しくは低いときの溶出による分裂）を必要とする。このことは，例えば，高い親和性という大きな障害となる回復として，又は，ｐＩＩＩディスプレイにおける安定的なバインダーとして知られている。伝染を必要とするｐＩＩＩが，変わらずに，かつ，ｐＶＩＩディスプレイでの代替的な相互作用をファージ−ターゲット間の相互作用の後でも着実に利用可能である場合，固定化後のファージが伝染性の全てを保持しているので，結合分裂（例えば，酸性溶出）の必要性が完全になくなり，その結果，ターゲットに結合する間の感染によってのみ回復がなされることとなる。
【００８７】
核酸
本発明の第２の側面は，本発明による結合タンパク質をコードする核酸である。この核酸は，ファージゲノム内又はファージミド内で構成されてもよい。
【００８８】
用語「核酸」とは，単量体のヌクレオチドの鎖で構成された高分子を意味する。生物学上では，これらの分子は，遺伝子の情報を運搬したり，細胞内の構造体を形成したりするものである。最も一般的な核酸は，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と，リボ核酸（ＲＮＡ）である。追記すると，用語「核酸」は，人工的な核酸を含むものであり，そのような核酸には，例えば，ペプチド核酸（ＰＮＡ），及び，モルホリノや，架橋型核酸（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ），グリコール核酸（ＧＮＡ），及び，トレオース核酸（ＴＮＡ）がある。これらの各々は，天然に生じるＤＮＡやＲＮＡとは，分子のバックボーンに対する変化によって区別される。
【００８９】
ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ又はｐｈａｓｍｉｄ）は，フィラメント状のファージＦｆとプラスミドとのハイブリッドとして開発されたクローニングベクターの１つであり，プラスミドとして繁殖可能なベクターであって，さらに，ウイルス性粒子内で，単一らせん構造をもつＤＮＡとしてパッケージされたベクターを生成するために開発されたものである。プラスミド同様に，ファージミドは，ＤＮＡフラグメントをクローンするために利用可能であるとともに，一連の技術（形質転換，電気穿孔法）で，細菌の宿主に取り込まれることが可能である。しかしながら，ファージミドをヘルパーファージとともに含む細菌の宿主（例えば，ＶＣＳＭ１３やＭ１３Ｋ０７）を感染させることは，必然的にウイルス性の要素をもたらすこととなり，単一らせん構造をもつＤＮＡの複製と，ファージミドＤＮＡをファージ粒子にパッケージングすることとを可能にする。
【００９０】
フィラメント状のファージ
本発明の第３の側面は，本発明による結合タンパク質を含むフィラメント状のファージである。このフィラメント状のファージは，ファージゲノムを含むものであってもよいし，又はファージミドを含むものであってもよい。
【００９１】
ファージは，バクテリオファージとも称されるが，本明細書では，感染用，複製用，及び細菌から隠れるウイルスを意味する。フィラメント状のバクテリオファージ即ちフィラメント状のファージは，単一らせん構造をもつＤＮＡゲノム（ｓｓＤＮＡ）をもつファージであって，そのＤＮＡゲノムは，ファージのコートタンパク質でパッケージングされている。隠されたフィラメント状のファージ粒子は，表現型上，フィラメント状の構造をも持つ。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「フィラメント状のファージ」は，ファージゲノム由来のビリオン及びファージミド由来のビリオンの双方を包含する。
【００９３】
ある実施形態では，結合タンパク質はヘルパーファージによって提供されるため，フィラメント状のファージは，結合タンパク質をコードする遺伝子を含まない。
【００９４】
用語「ヘルパーファージ」は，例えば，ファージミドとして定義された，分離しかつ無関係の欠陥ウイルスを助けるウイルスをいう。ここで，ファージミドは，それ自身内にファージゲノムでも機能性ウイルスでもないが，ファージゲノム由来の１つか複数の要素を含むプラスミドであり，欠陥ウイルスによって既に占有されている同じ宿主細胞を感染させて，欠陥ウイルスがいなくなるとともに完全なその生物としてファージミドを含むサイクルビリオンを形成することが必要なタンパク質を提供することで繁殖するものである。
【００９５】
他の実施形態では，フィラメント状のファージは，本発明による結合タンパク質をコードする核酸を含まない。フィラメント状のファージは，ファージゲノム又はファージミドを含んでもよい。特に好ましくは，ファージが，本発明による結合タンパク質をコードする核酸を含むファージゲノムを含んでいる。
【００９６】
さらに他の実施形態では，本発明のフィラメント状のファージが，さらに，野生型ｐＶＩＩ及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質をコードする遺伝子を含む。すなわち，フィラメント状のファージによってディスプレイされる結合タンパク質の数は，ｐＶＩＩ結合タンパク質に対する野生型ｐＶＩＩの割合を調節することで調整される。そのようなシステムは，野生型ｐＶＩＩタンパク質がヘルパーファージ（７＋７）から又はファージゲノム（７７）上の第２の遺伝子から提供されるかどうかに依存する，７７システム又は７＋７システムであってもよい。
【００９７】
さらに他の実施形態では，フィラメント状のファージは，野生型ｐＶＩＩ遺伝子及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質を含まない。すなわち，フィラメント状のファージは，ｐＶＩＩ結合タンパク質のみを含み，野生型ｐＶＩＩタンパク質を全く含まない。
【００９８】
好ましい実施形態では，フィラメント状のファージは，さらに，ｐＩＩＩ結合タンパク質又はｐＶＩＩＩ結合タンパク質を含む。ライブラリーは，例えば，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩでディスプレイされるとともに，ｐＶＩＩ結合タンパク質は，親和性精製用に，固定化用に，又は，例えばアビジン若しくはアビジン状のマトリクスを用いる検出のために使用可能である。好ましくは，フィラメント状のファージファージは，ｐＩＸタンパク質を野生型の形態でのみ含む。
【００９９】
本発明の第４の側面は，本発明によるフィラメント状のファージのライブラリーであり，当該フィラメント状のファージは，ｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩへ結合する，外来ペプチド又はタンパク質をディスプレイするものである。
【０１００】
ライブラリーは，フィラメント状のファージの１つ又はそれ以上のコートタンパク質の一部として，ペプチドやタンパク質をディスプレイするフィラメント状のファージを収集したものである。そのようなライブラリーは，互いに異なるペプチドやタンパク質をディスプレイするファージを２つ又はそれ以上含むことが可能である。
好ましい実施形態では，ペプチドがｐＶＩＩのところと，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩのところで同時にディスプレイされる。
【０１０１】
他の好ましい実施形態では，ｐＶＩＩでディスプレイされる外来ペプチドが，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ ｔａｇ），Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される。この実施形態では，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩでディスプレイされるペプチドは，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩでディスプレイされるペプチドは，好ましくは，ライブラリーの要素である。代替的な実施形態では，ライブラリーの要素は，ｐＶＩＩでディスプレイされる一方，ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩは，外来ペプチドをディスプレイする。この場合における外来ペプチドは，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ ｔａｇ），Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，アンキリン，ＩｇＮＡＲ又はそのフラグメント，フィブロネクチン又はそのフラグメント，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される。
【０１０２】
ファージディスプレイシステム
本発明の第５の側面は，ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，ヘルパーファージが本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。
【０１０３】
ファージディスプレイシステム，ファージディスプレイ法，ファージディスプレイ技術，又は単にファージディスプレイといった場合，タンパク質−タンパク質間，タンパク質−ペプチド間，及び，タンパク質−ＤＮＡ間の相互作用であって，それらをコードする遺伝子の情報を持つタンパク質を接続するためのバクテリオファージを利用する相互作用に関する発見や研究を行うための方法をさす。
【０１０４】
ディスプレイするタンパク質，又は，ディスプレイされるタンパク質とは，リガンドによる検出又は固定を利用可能なファージのコートタンパク質を結合するタンパク質をさす。
【０１０５】
本発明の第６の側面は，ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，該ファージミドが本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。
【０１０６】
キット
本発明の第７の側面は，ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムを有するキットであって，該ファージミドが本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。このキットは，コード領域においてＮ末端的に複数のクローニングサイトを持つ遺伝子をコードするｐＶＩＩを含むファージミドと，ヘルパーファージ（例えば，Ｍ１３Ｋ０７，ＶＣＳＭ１３，又はその他）とを含む必要がある。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１０７】
本明細書では，キットは，単一の結合タンパク質や二重特異性を持つ結合タンパク質を，ファージディスプレイのライブラリーとして又は単一のファージ粒子として含むファージ粒子を生成するための試薬を収集することを意味する。キットは，ファージミド，ヘルパーファージ，細菌株，及び，試薬やアッセイを記述するためのレシピを含むプロトコルを含むことが可能である。キットは，研究開発，診察用試薬，及び治療用試薬に利用可能である。
【０１０８】
本発明の第８の側面は，ファージゲノムをベースとしたファージディスプレイシステムを含むキットであって，該ファージゲノムが，本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。
【０１０９】
このキットは，コード領域においてＮ末端的に複数のクローニングサイトを持つ遺伝子をコードするファージゲノムベクター（Ｍ１３Ｋ０７，ＶＣＳＭ１３，ｆＵＳＥ５（配列ＩＤ番号３０））を含む。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１１０】
本発明の第９の側面は，ｐＩＩＩ結合ファージミドのライブラリーを生成するためのヘルパーファージ，又は，ｐＶＩＩ結合としてのタグを持つ単一のｐＩＩＩ結合ファージミドクローンを生成するためのヘルパーファージを含むキットである。このキットは，捕捉目的及び／又は検出目的に適した短鎖のペプチドをコードする挿入配列を持つ遺伝子をコードするｐＶＩＩを含むヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７，ＶＣＳＭ１３）を含んでいる。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１１１】
本発明の第１０の側面は，ｐＩＩＩとｐＶＩＩの双方の上で結合タンパク質をディスプレイするためのファージゲノムのライブラリーを生成するためのファージゲノムベクターを含んでいる。そのようなキットは，コード領域の各々においてＮ末端的に複数のクローニングサイトを持つｐＩＩＩとｐＶＩＩの双方をコードする遺伝子を持つファージゲノムベクター（Ｆｆ）を含む必要がある。代替的には，キットは，捕捉及び／又は検出に適した短鎖のペプチドをコードするｐＶＩＩにおいてＮ末端的に挿入配列を持つとともに，ｐＩＩＩにおいてＮ末端的に多重化したクローニングサイトを持つファージゲノムベクターを含んでいる必要がある。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１１２】
本発明の第１１の側面は，以下のステップを含む方法である。
【０１１３】
ａ． 二重特異性を持つファージディスプレイライブラリーを提供するステップであって，該ファージが，第１の位置でディスプレイされるペプチドと，第２の位置にある親和性タグとを含む，ステップ
【０１１４】
ｂ．ターゲットに対して上記ファージディスプレイのライブラリーを選択するステップ
【０１１５】
ｃ． 上記親和性タグの捕捉群に対して上記ファージディスプレイのライブラリーを固定するステップ
【実施例】
【０１１６】
以下，本発明を，非限定的な実施例を用いてさらに詳細に説明する。
【０１１７】
実施例１ ｐＶＩＩに結合するペプチドを持つ改変後のヘルパーファージ
ＦＬＡＧ−ｐＶＩＩ，ＨＩＳ６−ｐＶＩＩ，及びＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩを持つ，改変後のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）とＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２）は，ファージディスプレイ技術の利用の拡大に適した非常に広い可能性を示すものであるが，結合タンパク質がヘルパーファージの機能性を危うくしないことが非常に重要であり，そのため，ファージの滴定量は，重要な検証パラメーターとなる。さらに，ｐＶＩＩに結合するペプチドは，後続の検出及び／又は固定に利用しやすいものでなければならない。この実施例では，ｐＶＩＩ修飾のヘルパーファージが検出目的及び／又は固定目的用のペプチドの多様性をかくまうことが可能であること，並びに，それらの結合タンパク質がファージの伝染性に影響を与えないという事実が支持される。
【０１１８】
ＥｎｄｅｍａｎｎとＭｏｄｅｌによる初期の結果（ＰＭＩＤ：７６１６５７０）では，フィラメント状のファージ（Ｆｆ）のキャプシドタンパク質ｐＶＩＩが外来結合に耐えられないことを示していた一方，その後，ファージミドをベースとしたペプチド（Ｇａｏら，（ＰＭＩＤ：１０３３９５３５））や，ファージゲノムをベースとしたペプチド（Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉら，（ＰＭＩＤ：１６２７７９８８）），さらには，折り畳まれたドメインディスプレイが，ｐＶＩＩへのＮ末端結合を許容することが示されている。いずれの場合でも，原核生物のシグナル配列又はリーダーペプチドを結合の過度のＮ末端へと付加することによって，結合タンパク質のペリプラズムターゲッティング，ひいては，大腸菌宿主のＳＥＣ経路への結合をターゲッティングすることを必要とすることが成功の鍵であるということが強調される。
【０１１９】
生産的なｐＶＩＩディスプレイは，組み換え型ｐＶＩＩをペリプラズムの区画に運搬することを確保するＮ末端リーダーペプチドをかくまうファージミド上でコードされたＮ末端結合のコンテキスト内で既に示されている（Ｅｎｄｅｍａｎら，１９９５年；Ｇａｏら，１９９９年）。
【０１２０】
しかし，ビリオンに組み込まれる前では，野生型ｐＶＩＩが，Ｎ末端がプリプラズム空間に面するグラム陰性の大腸菌宿主の内膜内で不可欠な膜タンパク質として見いだされることが知られている。また，この膜が結合した，成熟した野生型ｐＶＩＩがそのアミノ末端のホルミル基を保持する（Ｓｉｍｏｎｓら，ＰＭＩＤ：６９４５５７９）が，細胞質の区画の外側で見いだされる，シグナル配列で方向付けられたタンパク質の非常に多くにおいて，例えば，ペリプラズムのリーダーペプチダーゼによってＮ末端的に処理されるようには考えられない（Ｂａｎｅｙｘ及びＭｕｊａｃｉｃ，ＰＭＩＤ：１５５２９１６５）。明確なシグナル配列状のモチーフがｐＶＩＩのＯＲＦ内で同定されることはないので，その細胞質ゾルからペリプラズムへの転座モードは分かりにくいままであるが，おそらく，４種類の主要な分泌機構，すなわち，ＳＥＣ経路，ＳＲＰ経路，Ｔａｔ経路，及びＹｉｄＣ経路を伴わないということである（Ｂａｎｅｙｘ及びＭｕｊａｃｉｃ，ＰＭＩＤ：１５５２９１６５；Ｓａｍｕｅｌｓｏｎら，ＰＭＩＤ：１０９４９３０５）。フィラメント状のファージのビリオンの構造を図１に示す。
【０１２１】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体，並びに，Ｍ２抗体及びＭ５抗体は，それぞれ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ），及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。制限酵素（ＲＥ）は，ＤｐｎＩを除いて，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
（米国，ＭＡ州，Ｉｐｓｗｉｃｈ）から購入し，ＤｐｎＩについては，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から入手した。ＤＮＡオリゴは，ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（ドイツ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入した。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）と，Ｔａｌｏｎ（登録商標）のＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズは，いずれも，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ノルウェー，オスロ）ら購入した。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＰｆｕウルトラＤＮＡと，Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼは，それぞれ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。水溶性ＴＭＢは，Ｃｈａｌｂｉｏｃｈｅｍのものであった。
【０１２２】
細菌株，ファージ
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージは，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入し，また，ＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２）は，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。
【０１２３】
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩ，ＨＩＳ6−ｐＶＩＩ及びＦＬＡＧ−ｐＶＩＩの設計と，インビトロでの突然変異生成
【０１２４】
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）(N−MSGLNDIFEAQKIEWHE−C)の読み取り枠（ＯＲＦ）を，ＧＣＵＡサーバー（http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html）を用いて，大腸菌Ｋ１２株内でコドン利用した場合と比較した。原核生物のコドンを最適化したバージョンであるＡｖｉＴａｇ（登録商標）のペプチド配列（配列ＩＤ番号４）を，製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）にしたがって，ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）によるインビトロでの突然変異生成によって，プライマー対であるＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｆｒｗｄ／ＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｒｅｖ（5’−CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAATGGAGCAGGTC−‘3/5’−GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGACATGTTACTTAGCCGG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号５と配列ＩＤ番号６に相当する。）を用いて，ｐＶＩＩのＯＲＦのＮ末端に取り付けた。上述した方法と同じ方法で，大腸菌Ｋ１２のコドンを最適化したバージョンであるＦＬＡＧタグ（N−DYKDDDDK−C）（配列ＩＤ番号９）と，ＨＩＳ6タグ（N−HHHHHH−C）（配列ＩＤ番号１２）とを，プライマー対であるＦＬＡＧ−ｐＶＩＩ−ｆｒｗｄ／ ＦＬＡＧ−ｐＶＩＩ−ｒｅｖ（5’−
CCGGCTAAGTAACATGGACTACAAAGATGACGATGACAAAATGGAGCAGGTCG−3’/5’−CGACCTGCTCCATTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCCATGTTACTTAGCCGG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号７と配列ＩＤ番号８に相当する。）と，HIS6−pVII−frwd/ HIS6−pVII−rev（5’−CCGGCTAAGTAACATGCATCACCATCACCATCACATGGAGCAGGTCG−3’/5’−CGACCTGCTCCATGTGATGGTGATGGTGATGCATGTTACTTAGCCGG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号１０と配列ＩＤ番号１１に相当する。）とをそれぞれ用いて，ｐＶＩＩのＯＲＦのＮ末端に取り付けた。様々な構造体について，あらゆる場合で，ＤＮＡシークエンス（組織内でのＡＢＩ ｌａｂ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｄｅｐｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｓｌｏ）によって検証した。無菌のベクターバックグラウンドを確保するために，改変後のｐＶＩＩを含むＢｓｒＧＩ／ＳｎａＢＩのＲＥフラグメントを，標準技術を用いて適合ＲＥサイト上でＭ１３Ｋ０７野生型ゲノム又はＶＣＳＭ１３野生型ゲノムのいずれかに移動させた。電気穿孔法を用いて，ＤＮＡ構造体を様々な大腸菌宿主に導入した。プライマーの設計は，ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて，Ｍ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（配列ＩＤ番号３１）の配列とＶＣＳＭ１３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ５９８８２０）（配列ＩＤ番号３２）の配列の配列アライメントをベースとした。改変後のＡｖｉＴａｇ（登録商標）配列，ＨＩＳ６配列，及びＦＬＡＧ配列の配列を図２に示す。
【０１２５】
ファージ粒子の調製
基本的には上述したようにして（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ，ＰＭＩＤ：１６９６０２８），Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）構造体，ＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２）構造体を用いて形質転換した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅからファージを展開した。
【０１２６】
ビオチン化ビリオンによるＳＡビーズの捕捉
【０１２７】
１チューブ当たり１０μｌのストレプトアビジンビーズを，未使用の１．５ｍｌチューブに入れ，ＰＢＳ（ｗ／ｖ）内で５００μｌの２％ＢＳＡを添加した。同様に，ファージを浮遊物がない状態で２５０μｌ，又は適量を，１．５ｍｌチューブに入れ，その後，２５０μｌの２％ＢＳＡを追加した。そして，チューブを，回転ホイール上で，１時間の間，室温（ＲＴ）で培養した。その後，ダイナル（Ｄｙｎａｌ）チューブ磁石ラックを用いてビーズを第１に固定することを３回行うことで，ビーズを洗浄した。浮遊物を処理した後，Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を０．５ｍｌ各チューブに入れた。チューブをラックから取り出して簡単にボルテックスした後，ラックに再度戻した。浮遊物を再度浄化するとともに，２回にわたって洗浄した。チューブをラックから取り外して，２５０μｌの阻害ファージと，２５０μｌのＰＢＳＴを各チューブに添加した。その後，チューブを回転ホイール上で１．５時間／室温下で培養した。チューブを上述したようにＰＢＳＴ内で３回にわたって洗浄した。その後，アンチＭ１３ ＭＡｂ−ＨＲＰを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ：アンチＭ１３ ＭＡｂ−ＨＲＰ＝１：２０００）を０．５ｍｌずつ各チューブに添加して，チューブを回転ホイール上で１時間／室温下で培養した。チューブを上述したようにＰＢＳＴ内で３回にわたって洗浄した。その後，ＡＢＴＳを０．５ｍｌずつ各チューブに添加して，チューブを３０分間作業台上に静置した後，磁石ラックに載置して，１００μｌの浮遊物をＭａｘｉｓｏｒｐの酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）用ストラップ（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｎｕｎｃ）に移動させた。その後，のＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて吸光度をＡ405nmで測定した。
【０１２８】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
【０１２９】
Ｍ２抗体及びＭ５抗体を，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）で，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ４０５ｎｍで読み取った。
【０１３０】
結果
Ａ ヘルパーファージの滴定量
２つのＹＴ各１６ｍｌを未使用のＸＬ１−Ｂｌｕｅ培養液を用いて植菌し，３７℃／２５０ｒｐｍで吸光度Ａ４０５ｎｍが０．４〜０．８となるまで培養した。希釈したファージ調合液各１０μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移動させた。１９０μｌのＸＬ１−Ｂｌｕｅ培養液を，ファージ希釈剤を用いて各ウェルに移動させた。プレートを，５０分間／３７℃で培養した。ＢＡ８２／２０膜をＬＢ−ｋａｎ寒天皿の上にかぶせ，１つのサンプル当たり３μｌの体積を膜上に滴下して，皿を３７℃／ＯＮで培養した。コロニーの数を数えた（図３）。
【０１３１】
Ｂ 挿入したペプチドＡｖｉＴａｇ（登録商標）の利用可能性及び機能性
【０１３２】
ＢｉｒＡ酵素は，アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼであって，あらゆる大腸菌内において見いだされる。ファージのコンテキスト内においてそのような細胞にＡｖｉＴａｇ（登録商標）を導入した場合，内在するＢｉｒＡによるターゲットのビオチン化のレベルが低い（〜７％）という結果となることが確かに示されている（Ｓｈｏｌｌｅら，ＰＭＩＤ：１６６２８７５４）。Ｎ末端のｐＶＩＩ改変が，ビリオンが集合してＢｉｒＡに対する酵素の基質として機能するという点に関して実際に機能的であるかどうかを試験するために，我々は，結果的に生じるビリオンを，ＳＡでコートした磁気ビーズを用いて未処理の不純物から捕捉可能であるかどうかを試験した。
【０１３３】
ダイナルストレプトアビジンビーズによるＭ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ｐＶＩＩの捕捉。以下２種類のファージを試験に用いた。宿主と野生型Ｍ１３Ｋ０７に由来する，内在ＢｉｒＡを用いてインビボでビオチン化したＭ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）。その結果は，特定のＳＡを捕捉する一方で，Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）が結合しないということを明らかに示すものであった。したがって，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩ結合は，野生型ビリオンとしてビリオンに適合するとともに，一方でＮ末端のＡｖｉＴａｇ（登録商標）がＢｉｒＡ酵素に到達可能であり，かつ，ビオチン化に適した基質として認められる，という意味で実際に機能的でなければならない（図４）。
【０１３４】
ＦＬＡＧタグ
酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）試験を実施すると，２種類のアンチＦＬＡＧ抗体Ｍ２及びＭ５によるファージの捕捉によって，Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）内でのｐＶＩＩ結合としてＦＬＡＧタグの可触性が示される。試験結果には，野生型Ｍ１３Ｋ０７，Ｍ１３Ｋ０７−Ｈｉｓ，及びＭ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）が含まれている（図５）。
【０１３５】
ＨＩＳタグ
Ｍ１３Ｋ０７−ＨＩＳ６とＶＣＳＭ１３−ＨＩＳ６の双方について，ダイナルタロンビーズ（ＤｙｎａｌＴａｌｏｎ Ｂｅａｄｓ）（ＩＭＡＣ ｍａｔｒｉｘ）に対する特定の結合を試験した。
簡単には，Ｔａｌｏｎビーズは，２％ＢＳＡを用いた３０分間の回転培養によって阻害された。ビーズを，洗浄した後，ビーズに対してＢＳＡを阻害するファージ浮遊物に一致する２５０μｌの滴下量（これは，２×１０１０ｃｆｕｋａｎＲ／ｍｌに相当する。）を添加し，さらに，ビーズを回転ホイール上で，３０分間／室温下で培養した。ＰＢＳＴ中のビーズを洗浄した後，アンチＭ１３ＭＡｂ−ＨＲＰ（希釈後で１：２０００）を各チューブに添加し，チューブをさらに，回転ホイール上で，４５分間／室温下で培養した。洗浄後，ＡＢＴＳを各チューブに添加して，１５分間室温下で培養し，その後，磁石ラックに載置した。体積で１００μｌの各溶液を，ＭａｘｉｓｏｒのＥＬＩＳＡストラップに移動させた。ＴＥＣＡＮのＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて，吸光度をＡ４０５ｎｍで測定した。その結果は，ＨＩＳ６−ｐＶＩＩを含むビリオンがＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズに対して選択的に結合することを確実に示している。試験の最適化によって克服可能であるシグナルが低いにも関わらず，コグネートビリオンのＮｉ−ＮＴＡマトリクスに対する異なる結合が確かに存在する。この特別なｐＶＩＩ結合の最も魅力的な用途は，例えばスピンコラムと組み合わせたＮｉ−ＮＴＡ精製に関してそれを引き出すという将来性にあるだけでなく，サイト特異性にあり，それによって，相同性があるとともに方向性のあるＮｉ−ＮＴＡマトリクスの固定にある（図６）。
【０１３６】
実施例２ ファージミドのパッケージング内での改変後のヘルパーファージの機能性
【０１３７】
本発明では，改変後のヘルパーファージを，ｐＶＩＩよりも，好ましくはｐＩＩＩやｐＶＩＩＩにおいて，ファージのコートタンパク質上で折り畳まれたドメインをディスプレイするファージミドの機能的なパッキングを行うために使用することが約束される。以下の実施例では，ｐＶＩＩに結合した互いに異なるペプチドを持つ改変後のヘルパーファージがファージミドの機能的なパッキングを実現可能であること，並びに，それらファージミドが，機能的なｐＶＩＩペプチド結合だけでなく，ｐＩＩＩコートタンパク質に結合した機能的な折り畳みドメインの双方をディスプレイすることが支持される。このようにして，本実施例は，ファージミドを利用することで二重特異性を持つディスプレイにも役立つこととなる。
【０１３８】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体，並びに，Ｍ２抗体及びＭ５抗体は，それぞれ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ），及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。また，Ｆ２３．２抗体とＧＢ１１３抗体は，Ｂ．Ｂｏｇｅｎ教授（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ノルウェー，オスロ）からの親切な贈呈物である。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）は，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ノルウェー，オスロ）ら購入した。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＢＳＡに接合するハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）は，他の文献（Ｍａｋｅｌａら，ＰＭＩＤ：７２２２４３）でも説明されているように基本的には購入した。
【０１３９】
細菌株，ファージ，及びファージミド
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージは，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９），ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）選択性を持つｓｃＦｖをかくまうファージミドは，Ａｆｆｉｔｅｃｈ ＡＳ（ノルウェー，オスロ）から親切にも提供を受けたものである。ｐＦＫＰＤＮ−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１（配列ＩＤ番号２８）は，Ｌｏｓｅｔらの文献（２００７年，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）において記述されている。
【０１４０】
ファージ粒子の調製
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージとビリオンアッセンブリーを使用することによる大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅからのファージミドレスキューを，Ｗｅｌｓｃｈｏｆらの文献（ＰＭＩＤ：９０５０８７７）やＫｏｃｈらの文献（ＰＭＩＤ：１１１２６１２０）に記載されているような滴下滴定によってモニターした。
【０１４１】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
ＭＡｂ Ｍ２，Ｍ５，Ｆ２３．２，ＧＢ１１３，ｐｈＯｘ−ＢＳＡを，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）又はＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ405nmで読み取った。
【０１４２】
結果
Ａ ヘルパーファージの滴定量
互いに異なる折り畳みドメインを持つ２種類のファージミドとして，それぞれ，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖをｐＩＩＩ結合としてディスプレイする，ｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１と，ｐＳＥＸ−ｓｃＦｖ ａｎｔｉ−ｐｈＯｘとを採用した。双方を，３種類の修飾が施された野生型Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いてパッケージングした。簡略的には，２種類のファージミドクローンの終夜にわたる培養物を，修飾が施された野生型ヘルパーファージで感染させた。培養後，培養物を遠心分離して，細菌のペレットを，ＹＴメディア内でアンピシリンとカナマイシンとを用いて再懸濁させ，さらに，３０℃でオンとして培養を行った。大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅをファージ希釈液で感染させて，それぞれ，アンピシリンプレート上及びカナマイシンプレート上に載置し，ファージミド及びヘルパーファージの滴定を行った（図７）。
【０１４３】
パッケージングされたファージミドの双方は，高い比率を示すことが分かり，このことは，３種類の修飾が施されたＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージフォーマットによって，成功的でかつ機能的なパッケージングを示している。
【０１４４】
Ｂ ファージミドｐＩＩＩディスプレイ内におけるヘルパーファージによって提供されたｐＶＩＩの機能性
【０１４５】
ｐＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ディスプレイ：ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩの機能に関して，ビーズ上でのＳＡ捕捉を，基本的には実施例１で説明したのと同様に行った。シグナルは低かったが，ビリオンを含むＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩの特異的な異なる捕捉が確かに確認された（図８）。陽性コントロール（挿入図）と比較すると，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩ結合をかくまった場合において，ファージミドビリオンに関するビオチン化のレベルがＭ１３Ｋ０７ビリオンに関するものよりも低いことが明らかである。しかし，内在するＡｖｉＴａｇ（登録商標）のファージのコンテキスト内におけるビオチン化は，３７℃では，７％までの範囲内に過ぎない（Ｓｃｏｌｌｅら，ＰＭＩＤ：１６６２８７５４）。Ｍ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）は３７℃で確かにパッケージングされるが，ファージミドレスキューは，たったの３０℃でなされる。このことは，観測される差異が，温度が低いほど，内在するＢｉｒＡのｓｅｅ当たり（ｐｅｒ ｓｅｅ）の活性が低いことに起因しているということを強く示唆している。したがって，将来的な利用としては，この特徴を引き出すために，ビリオンのビオチン化効率を高くしなければならない。このことは，ビリオンのインビトロでのビオチン化によって都合よく実現することができ，それにより，標準技術を利用してビオチン化を１００％に近くするべきである（Ｓｃｏｌｌｅら，ＰＭＩＤ：１６６２８７５４）。それに代えて，ＢｉｒＡ酵素を過剰に発現させることで，インビボでビオチン化を行うことも可能である。大腸菌の超形質転換によって，ファージミドゲノムベクターやファージゲノムベクターが同一の細胞内に存在するようなことが標準のプラスミドによってビリオンへとパッケージングされて，その結果，遺伝子型−表現型のつながりを失う可能性があることが知られている。このことは，ＢｉｒＡがプラスミドから過剰に発現した場合にあり得るものである。単一のクローンを評価する上では，上記のことは認容可能であるかもしれないが，この手法を連結可能なレパートリーと組み合わせる場合には，パンニング間で回復する表現型の変異株を失うことにつながる可能性があるので認容可能ではない。それに代えて，大腸菌ＭＣ１０６１由来のＡＶＢ１００の株（Ａｖｉｄｉｔｙ，米国，ＣＯ州）で提供可能な染色体の組み換えによって，ＢｉｒＡを過剰に発現させることが可能である。ただし，その株は，プラスミドシステムに不可欠なＦ線毛構造をコードするＦプラスミドが欠損している。しかし，ＡＶＢ１００は，ヘルパーファージの補完の必要がないファージゲノムベクターに直接的に適合可能である。そこで，我々は，ＡＶＢ１００株を，修飾が施されたＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージと組み合わせてファージミドベースの適切なファージディスプレイに採用するために，標準接合によって，ＡＶＢ１００をＸＬ１−Ｂｌｕｅとを交配させた（実施例５）。
【０１４６】
ｐＶＩＩ−ＦＬＡＧディスプレイ
ＥＬＩＳＡ試験を実施することで，ｐＶＩＩ結合としてのＦＬＡＧタグの可触性が，２種類の互いに異なるファージミド由来のビリオンについて示された。図９Ａは，ｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１に関するものであり，２種類のアンチＦＬＡＧ抗体Ｍ２とＭ５によってファージミドビリオンを捕捉することで得られたものである。図９Ｂは，ｐＳＥＸ−ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘに関して同様にして得られたものである。簡略的に説明すると，抗体を，４℃でオンの状態で，ＥＬＩＳＡプレート上でコートした。プレートを洗浄した後，ファージミド調合液をプレート上で２時間にわたって室温下で培養した。プレートを洗浄後，さらに，アンチＭ１３ ＨＲＰを組み込んだ抗体で培養した。プレートの洗浄，水溶性ＡＢＴＳの添加，室温下／３０分間での培養を経てシグナルが展開された（図９）。
【０１４７】
Ｍ１３Ｋ０７−ＦＬＡＧでパッケージングされたファージミド由来のビリオンに関しては反応性にＦｌＡＧ特異性があるが分かる一方で，他のサンプルの全てにおいては否定的であった。すなわち，パッケージングされたファージミド由来のビリオンは，ＦＬＡＧタグをｐＶＩＩ結合の機能性としてディスプレイする。
【０１４８】
Ａ．ｐＩＩＩファージミドディスプレイの機能性
２種類の互いに異なるファージミド由来のビリオンとしてのｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１，及びｐＳＥＸ−ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘの双方は，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）をディスプレイするものであり（図１０），ＦＬＡＧタグをディスプレイするものであり（図１１），さらに，ＨＩＳ６タグをディスプレイするものであり（図１１），これらは，それぞれ，ｓｃＴＣＲ及びｓｃＦｖとｐＩＩＩとの結合の機能的なディスプレイを試験したものである。
【０１４９】
特定のターゲットによるファージミドビリオンを捕捉することにより，ＥＬＩＳＡ試験を実施した。ターゲットは，ｓｃＴＣＲに結合するＭＡｂ ＧＢ１１３と，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）に対するｐｈＯｘ−ＢＳＡである。ＢＳＡを阻害物として用いるとともに，野生型Ｍ１３Ｋ０７でレスキューされたファージミドをコントロールとして用いた。簡略的に説明すると，ターゲットをＥＬＩＳＡプレート上で，４℃オンの状態でコートした。そのプレートを洗浄した後，ファージミド調合液をプレート上で２時間にわたって室温下で培養した。プレートを洗浄し，さらに，アンチＭ１３ ＨＲＰ組み込み抗体で培養した。シグナルがＡＢＴＳとともに展開し，室温下／３０分間培養し，その後，吸光度をＡ405nmで測定した（図１０及び図１１）。
【０１５０】
結果から分かることは，パッケージングされたファージミドの全てにおいてコグネートＡｇ反応性があるということである。つまり，この分析によって，改変後のヘルパーファージがｐＩＩＩディスプレイに影響を与えるものではなく，完全に同一のビリオン上でｐＶＩＩタンパク質に所定の表現型を与えるに過ぎない，ということが裏付けられる。
【０１５１】
実施例３ ｐＩＩＩ及びｐＶＩＩ上でのゲノムのファージディスプレイ
本発明は，ｐＶＩＩタンパク質上でのディスプレイの性質を用いてゲノムのファージベクターの産生を許容するものである。そのようなディスプレイは，ビリオンの伝染性に影響を与えるものではない。さらに，本発明は，二重特異性を持つディスプレイをｐＶＩＩ及びｐＩＩＩ／ｐＶＩＩＩ上で，又は，３種類全てのコートタンパク質上でいっせいに促進させるものである。以下の実施例は，繁殖，ビリオンアッセンブリー，ビリオン集積，ｐＩＩＩディスプレイの表現型に関して，構造体が完全に野生型ファージのように振る舞うこと，並びに，ｐＶＩＩペプチド結合でインビボでのビオチン化が選択的に確実に行われることを示すものである。
【０１５２】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Molecular cloning: a
laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)）で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体は，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。また，Ｆ２３．２抗体とＧＢ１１３抗体は，Ｂ．Ｂｏｇｅｎ教授（Institute of Immunology，ノルウェー，オスロ）からの親切な贈呈物である。制限酵素（ＲＥ）は，ＤｐｎＩを除いて，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（米国，ＭＡ州，Ｉｐｓｗｉｃｈ）から購入し，ＤｐｎＩについては，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から入手した。ＤＮＡオリゴは，ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（ドイツ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入した。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）は，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ノルウェー，オスロ）ら購入した。ｄｍ5ＣＴＰは，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（カナダ，バーリントン）からのものを用いた。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼとＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼは，それぞれ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲクリーンアップキットは，Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）からのものを使用した。
【０１５３】
細菌株，ファージ，及びファージミド
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。また，大腸菌株ＭＣ１０６１及びＫ９１Ｋは，Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ博士（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，米国）からの親切な贈呈物である。ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９），ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）選択性を持つｓｃＦｖをかくまうファージミドは，Ａｆｆｉｔｅｃｈ ＡＳ（ノルウェー，オスロ）から親切にも提供を受けたものである。ｆＵＳＥ−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１ ｐＩＩＩディスプレイベクターは，Ｌｏｓｅｔらの文献（２００７年，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）において記述されている。
【０１５４】
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩの設計と，インビトロでの突然変異生成
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）(N−MSGLNDIFEAQKIEWHE−C)の読み取り枠（ＯＲＦ）を，ＧＣＵＡサーバー（http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html）を用いて，大腸菌Ｋ１２株内でコドン利用した場合と比較した。原核生物のコドンを最適化したバージョンであるＡｖｉＴａｇ（登録商標）のペプチド配列を，製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）にしたがって，ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）によるインビトロでの突然変異生成によって，プライマー対であるＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｆｒｗｄ／ＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｒｅｖ（５’−CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAATGGAGCAGGTC−‘３／５’−GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGACATGTTACTTAGCCGG−３’）（それぞれ，配列ＩＤ番号５と配列ＩＤ番号６に相当する。）を用いて，ｐＶＩＩのＯＲＦのＮ末端に取り付けた。無菌のベクターバックグラウンドを確保するために，改変後のｐＶＩＩを含むＢｓｒＧＩ／ＳｎａＢＩのＲＥフラグメントを，標準技術を用いて適合ＲＥサイト上で，修飾が施されていないｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１ゲノムへとクローン化した。電気穿孔法を用いて，ＤＮＡ構造体を大腸菌ＭＣ１０６１に導入した。プライマーの設計は，公開されているｆＵＳＥ５の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２１８３６４）（配列ＩＤ番号３０）をベースとした。
【０１５５】
新規なゲノムのｐＶＩＩディスプレイベクターｐＧＶＩＩ及びｐＧＶＩＩΔＬの構造体
【０１５６】
プライマーの設計とベクターアッセンブリーは，基本的には，ＳｅａｍＬｅｓｓプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）で記述されているように実行した。ＶＣＳＭ１３ゲノムＤＮＡ（配列ＩＤ番号３２）をテンプレートとして用いるとともに，プライマー対であるＶＣＳＭ１３＿Ｆ／ＶＣＳＭ１３＿Ｒ（5’−ATCTCTTCCATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGG−3’/5’−ATCTCTTCCATGTTACTTAGCCGGAACGAGGCGCAGAC−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号１９と配列ＩＤ番号２０に相当する。）を用いて，ＳｅａｍＬｅｓｓプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）で記述されているように，Ｐｆｕターボポリメラーゼで完全なゲノムをＰＣＲ増幅した。同様に，ｐＳＥＸ８１ΔＬ（実施例４で後述する）と，ｐＳＥＸ（配列ＩＤ番号２９）は，いずれも，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）ユニットをかくまうものであるが，これらを，ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ，ノルウェー，オスロ）をそれぞれ，プライマー対であるｐＧＡＬＤＬ＿Ｆ／ｐＧＡＬ＿Ｒ（5’−TCTCTTCACATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG−3’/5’−ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号２２と配列ＩＤ番号２３に相当する。）及びプライマー対であるｐＧＡＬ＿Ｆ／ｐＧＡＬ＿Ｒ（5’−ATCTCTTCACATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGC−3’/5’−ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号２１と配列ＩＤ番号２３に相当する。）とともに用いながら，標準ＰＣＲにおけるテンプレートとして用いて，ｓｃＦｖユニットを増幅させた。ＰＣＲに続いて，３種類全てのセグメントを，ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）とＥａｒＩで温浸したＲＥとを用いて精製した。その後，ＲＥ温浸後のゲルゲル精製セグメントを結合して，標準技術を用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅへと電気穿孔処理した。コロニーを拡大させて，挿入サイズが正しいことを，プライマー対であるｐＶＩＩ＿ｆｒｗｄ／ｐＶＩＩ＿ｒｅｖ（5’−AGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGG−3’/5’−GCAGCGAAAGACAGCATCG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号２４と配列ＩＤ番号２５に相当する。）を用いながら標準ＰＣＲでのＰＣＲスクリーニングによって，検証した。ゲノムのｐＶＩＩディスプレイベクターは，ｐＧＶＩＩ（これは，シグナル配列依存のｓｃＦｖ−ｐＶＩＩディスプレイを持つ）と，ｐＧＶＩＩΔＬ（これは，シグナル配列を持たないｓｃＦｖ−ｐＶＩＩディスプレイを持つ）を示した。これらは，このとき，ｓｃＦｖのＯＲＦを，ｐＶＩＩに対するイン・フレーム型の結合Ｎ末端として含み，その開始コドンの位置が，通常の転写や翻訳に重要なｐＶのＯＲＦの上流に対して正しい位置にあることが維持されている。特に，これらファージゲノムベクターのアッセンブリーを，３段階のＰＣＲアッセンブリーであって，外来ＯＲＦが，ベクターバックボーンと相補的な５’プライマータグ突出部で増幅されたＰＣＲであるアッセンブリーで容易に構成可能であり，これにより，挿入サイトをカバーするベクターの５’部位と３’部位から増幅された相補的なセグメントとともにＳＯＥ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を行うＰＣＲでスプライシングが可能となる。ファージゲノムの理想的な部位は，２つの固有なＲＥサイトＢｓｒＧＩ／ＳｎａＢＩを含むセグメントをカバーしている必要があり，それらサイトは，Ｆｆゲノムの全てにおいて側面にあるｐＶＩＩのＯＲＦにある。そして，ＲＥ温浸後のＳＯＥ生成物は，例えば実施例１や実施例３で説明したように，ＲＥ温浸後のベクターの相補的なバックボーンに都合よく挿入可能である。利用しやすい他のアッセンブリー手段は，１つのポットでアニール処理して，結合し，さらに側面にあるプライマーで増幅されたＰＣＲを行うことが可能な短鎖の重複オリゴヌクレオチドを全面的に用いて適切な結合ＯＲＦの人工的な遺伝子アッセンブリーを生成することである。このストラテジーは，ＳＯＥ手法におけるものと同一のフラグメントを与えることが可能であるか，又は，ファージゲノムへの挿入が，例えば，Ｔｉｌｌｅｔｔ及びＮｅｉｌａｎの文献（ＰＭＩＤ：１０４８１０３８）で説明されているような組み換えに基づくことが可能なＲＥ独立となり得る。また，複数の技術の組み合わせも容易に想定できる。
【０１５７】
ファージ粒子の調製
基本的にはＳｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈの文献（ＰＭＩＤ：１６９６０２８）で説明されているようにして，ｆＵＳＥ５ファージを，大腸菌ＭＣ１０６１から増幅した。ビリオンアッセンブリーを，Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈの文献（ＰＭＩＤ：１６９６０２８）及びＫｏｃｈらの文献（ＰＭＩＤ：１１１２６１２０）に記載されているように滴下滴定によってモニターした。当てはまる場合には，Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）で説明されているように，ＰＥＧ／ＮａＣｌの滴下によってビリオンの精製と濃縮を行った。
【０１５８】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
Ｆ２３．２抗体及びＧＢ１１３抗体を，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）で，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ405nmで読み取った。
【０１５９】
Ａ ｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ゲノムファージの滴定量
【０１６０】
野生型の，又はｐＶＩＩ改変後のｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１バージョンはいずれも，任意の宿主毒性を呈することがない。ビリオン産生やＰＥＧ滴下効率に関して，ｐＶＩＩ改変後のｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１バージョン間には表現型の差異がない。ｐＶＩＩ改変後のｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１バージョンの双方は，ｆＵＳＥ５システムにふさわしい，理論的な滴下量の最大値に近い値をとる（図１２）。
【０１６１】
Ｂ ｆＵＳＥ５−ＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）結合ペプチドの機能性
【０１６２】
このＥＬＩＳＡ分析は，ゲノムのファージ調合液の機能性を試験するためのものであり，具体的には，ストレプトアビジンビーズでビリオンを捕捉し，続いて，アンチＭ１３抗体で結合ファージを検出することで試験を行うためのものである。簡略的に説明すると，ＭｙＯｎｅストレプトアビジンダイナビーズをＢＳＡで阻害し，洗浄し，（ｓｃＴＣＲ／ｐＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標））がある場合と，（ｓｃＴＣＲ／ｐＶＩＩ）ｐＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）結合ペプチドがない場合について，滴定標準サンプルのｆＵＳＥ５を用いて培養した。ビーズを洗浄するとともに，結合ファージをアンチＭ１３−ＨＲＰ組み込み抗体で検出した。ＡＢＴＳの添加につれてシグナルが展開し，ＴＥＣＡＮのＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて吸光度Ａ405nmを測定した。その結果は，ｐＶＩＩ−ＢｉｒＡペプチドが可触性であるとともに，ビオチン化されており，そのために，ファージゲノム由来のビリオンに対する固定・検出タグとして機能することを示している（図１３）。
【０１６３】
Ｃ ｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ ｐＩＩＩ結合の機能性
【０１６４】
このＥＬＩＳＡ分析は，ゲノムをコードするＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩがある場合とない場合における，ファージゲノム由来のビリオン調合液のｐＩＩＩ結合の機能性を試験するためのものである。２種類の互いに異なる抗体であって，それぞれ，ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１と，ＭＡＢ ＧＢ１１３及びＦ２３．２を認識する抗体を用いてファージビリオンを捕捉することでＥＬＩＳＡ試験を実施した。スキムミルクをネガティブコントロールとして使用した。簡略的に説明すると，抗体をＥＬＩＳＡプレート上で，オンの状態でかつ４℃でコートした。そのプレートを洗浄するとともに，ファージ滴定用の規定調合液をプレート上で２時間にわたって室温下で培養した。そのプレートを洗浄した後，さらに，アンチＭ１３−ＨＲＰ組み込み抗体で培養し，その後，１００μｌのＡＢＴＳを添加して室温で培養した。２０分後に，ＴＥＣＡＮのＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて吸光度を，ＯＤ405nmで測定した。その結果は，２種類のｆＵＳＥバージョンの間ではｓｃＴＣＲ表現型を区別することができないことを示している。したがって，どのような観点からも，ｐＶＩＩ改変は，ファージの表現型には影響を与えるようには思われない（図１４）。
【０１６５】
実施例４ ｐＶＩＩ上でのファージミドディスプレイ
【０１６６】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体は，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。ＧＢ１１３抗体は，Ｂ．Ｂｏｇｅｎ教授（Institute of Immunology，ノルウェー，オスロ）からの親切な贈呈物である。制限酵素（ＲＥ）は，ＤｐｎＩを除いて，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
（米国，ＭＡ州，Ｉｐｓｗｉｃｈ）から購入し，ＤｐｎＩについては，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から入手した。ＤＮＡオリゴは，ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（ドイツ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入した。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）と，Ｔａｌｏｎ（登録商標）のＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズは，いずれも，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （ノルウェー，オスロ）ら購入した。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＰｆｕターボＤＮＡは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。ＢＳＡに組み込まれるハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）及び５−ニトロフェンアセチル（ＮＩＰ）は，他の文献（Ｍａｋｅｌａら，ＰＭＩＤ：７２２２４３；Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎら，ＰＭＩＤ：２１２５３６２）でも説明されているように基本的には調製した。イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（カナダ，バーリントン）から購入した。
【０１６７】
細菌株，ファージ，及びファージミド
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージは，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）選択性を持つｓｃＦｖをかくまう，ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）ファージミドは，Ａｆｆｉｔｅｃｈ ＡＳ（ノルウェー，オスロ）から親切にも提供を受けたものである。ｐＦＫＰＤＮ−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１のｐＩＩＩディスプレイファージミドは，他の文献（Ｌｏｓｅｔら，２００７年，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）において記述されている。ｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）（未公開）をかくまう原核生物発現ベクターｐＳＧＩは，ｐＨＯＧ２１（Ｋｉｐｒｉａｎｏｖら，ＰＭＩＤ：９００５９４５）に基づいているとともに，ｐＬＮＯＨ２及びｐＬＮＯＫ（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら，ＰＭＩＤ：９２０２７１２）に由来する抗体バリアブル遺伝子から社内的に製造されたものである。
【０１６８】
新規なｐＶＩＩディスプレイファージミドベクターｐＧＡＬＤ７及びｐＧＡＬＤ７ΔＬの構造体
ベクターバックボーン用の開始テンプレートとして，上述したｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）ファージミドを選択した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４５８４）。まず，このベクター内のストレッチ（ｓｔｒｅｃｈ）をコードする原核生物のｐｅｌＢシグナル配列（N−MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA−C）（配列ＩＤ番号３３）を除去するために，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）を利用して，プライマー対であるａ４１ｇ−ｆｒｗｄ／ａ４１ｇ−ｒｅｖ（5’−AGAGGAGAAATTAACCATGGAATACCTATTGCCTACGGC−3’/5−GCCGTAGGCAATAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT−3’）（これらは，それぞれ，配列ＩＤ番号１３，及び配列ＩＤ番号１４に相当する。）を用いたインビトロでの突然変異生成で，ＮｃｏＩのＲＥサイトをＮ末端の極端に導入し，それにより，ｐｅｌＢのＯＲＦの第２コドン内にある第１のヌクレオチドを，ＡからＧに変化させた。突然変異生成に続いて，ベクターをＮｃｏＩ温浸し，再結合させ，その後，プライマー対であるｐＨＯＧ＿ＥｃｏＲＩ＿ｆｒｗｄ／ｓｃＴＣＲ＿ｒｅｖ（5’−TAGCTCACTCATTAGGCACCC−3’/5’−TTTGGATCCAGCGGCCGC−3’）（これらは，それぞれ，配列ＩＤ番号１５，及び配列ＩＤ番号１６に相当する。）を用いて，ベクターの関連部分を回復させる第２のＰＣＲでのテンプレートとして用いた。その後，そのＰＣＲのフラグメントを，標準技術を用いて，ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩのＲＥサイト上で，原型のｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）に移動させ，ＤＮＡシークエンシングで確認した。このステップにより，ｐｅｌＢシグナル配列をコードする部分を完全に除去したが，通常の転写と翻訳に重要であるだけでなく，原形のｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）内に見られるＮｃｏＩ／ＮｏｔＩのＲＥサイトで定義される外来配列の前にたった１つのＡｌａ残渣を付加するのに重要なｌａｃＰＯ及びシャイン−ダルガノ配列（ＳＤ）のために開始コドンとその関連位置を維持した。その新しい構造体をｐＳＥＸ８１ΔＬで示す。第２に，５’端部でＲＥタグ化されたプライマー対であるｐＶＩＩ＿ＥｃｏＲＶ／ ｐＶＩＩ＿ＮｈｅＩ（5’−ATATGATATCAGAATGGAGCAGGTCGCGGATTTCG−3’/5’−ATATGCTAGCTTATCATCTTTGACCCCCAGCGATTATACC−3’）（これらは，それぞれ，配列ＩＤ番号１７，及び配列ＩＤ番号１８に相当する。）を用いて，ｐＶＩＩをコードする配列をＭ１３Ｋ０７から増幅した。その後，このＰＣＲのフラグメントを，適合ＲＥサイト上で，ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）ファージミドとｐＳＥＸ８１ΔＬファージミドの双方に移動させ，これにより，双方においてｐＩＩＩをコードする領域を交換し，結果として，原型のｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）内で，ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩを定義するカセットのＮ末端イン・フレーム型ｐＶＩＩ結合がもたらされた。これらの新しい構造体をＤＮＡシークエンシングで確認して，それぞれ，ｐＧＡＬＤ７及びｐＧＡＬＤ７ΔＬとした。それぞれ，ｐＦＫＰＤＮ及びｐＳＧ１からのｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１及びｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）ユニットを用いて，上述したような様々なファージミド内でｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）ユニットを切り替えるために，標準技術を用いて，ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩのＲＥサイトを定義するカセット交換を行った。本明細書で説明するファージミドの全てを，標準技術を用いた電気穿孔法で，大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。
【０１６９】
ファージ粒子の調製
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージとビリオンアッセンブリーを用いたＸＬ１−Ｂｌｕｅの大腸菌ファージミドレスキューを，上述したように滴下滴定でモニターした（Ｗｅｌｓｃｈｏｆら，ＰＭＩＤ：９０５０８７７，及びＫｏｃｈら，ＰＭＩＤ：１１１２６１２０）。
【０１７０】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
ＭＡｂ ＧＢ１１３，ｐｈＯｘ−ＢＳＡ，又はＮＩＰ−ＢＳＡを，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）又はＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ４０５ｎｍで読み取った。
【０１７１】
結果
【０１７２】
上述したような改変後のヘルパーファージからの結果によって，折り畳まれたドメインのｐＶＩＩディスプレイも評価されることとなる。Ｇａｏら及びＫｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，そのようなディスプレイは，シグナル配列を方向付けるペリプライマズムターゲッティングと組み合わせて利用される場合に許容されることを示してきたが，我々は，ｐＧＡＬＤ７及びｐＧＡＬＤ７ΔＬとした新規な２種類のファージミドを構築し，それらによって，そのようなシグナル配列を用いた場合も用いない場合でもＮ末端ｐＶＩＩディスプレイを可能にする（図１５）。
【０１７３】
初期構造体は，ヒトの抗体のバリアブルセグメントとハプテン共役型（ｃｏｎｊｕｃａｔｅ）ｐｈＯｘ−ＢＳＡに関する生物種とに基づいたｓｃＦｖユニットを含んでいた。既に説明したｐＶＩＩ改変後のヘルパーファージに関して，ｓｃＦｖのｐＶＩＩディスプレイは，正常なビリオンアッセンブリーに干渉を与えない必要がある。そこで，我々は，これらのｓｃＦｖアンチｐｈＯｘのｐＶＩＩディスプレイファージミドのパフォーマンスの比較を，標準のファージミドレスキューと材料及び方法で説明したような滴定を利用して，シグナル配列を用いた場合及び用いない場合について行うとともに，標準のｐＩＩＩディスプレイについてもシグナル配列を用いた場合及び用いない場合について行った（図１８）。
【０１７４】
滴定結果は，ファージミドを含むビリオンが全ての場合において生成されることを確かに示している。ただし，ｐＶＩＩΔＬファージミドは，標準のｐＩＩＩディスプレイに比べて，約３０ホールド（ｆｏｌｄ）分少ない滴下量である一方，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイでは，総計で１０5ホールド分の減少が認められた。このシステムにおけるヘルパーファージからｐＶＩＩの野生型相補性が認められるように，この結果は，意外なものであるとともに重要なものである。その理由は，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイ（ｐＶＩＩ）がビリオンアッセンブリー処理に深刻な干渉を与えるが，一方で，その効果は，シグナル配列がないｐＶＩＩディスプレイ（ｐＶＩＩΔL）の場合，ほんのわずかである。相対的に，ｐＩＩＩディスプレイについてシグナル配列を用いた場合と用いない場合とで，滴定量の差異はほんのわずかである。
【０１７５】
上述したように決定した滴定量に基づくと，ｐｈＯｘ−ＢＳＡ種のＥＬＩＳＡにおいて滴定量を規定化した投入量の場合，これらビリオンサンプルに関するｓｃＦｖディスプレイの機能性は，ファージミド滴定量として希釈されていないものを用いた場合のｐＧＡＬＤ７由来のサンプルを除くと，非常に低いと評価された（図１７）。
【０１７６】
上記結果は，機能性ｓｃＦｖは，シグナル配列なしのｐＶＩＩバージョンと標準ｐＩＩＩの双方からディスプレイすることを明らかに示したものであり，一方で，他のサンプルでは否定的であった。シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイが否定的な結果を示したことは，ビリオン投下量が２０００ホールド未満であることが原因であると考えられた。ここで，ｐＩＩＩがＳＥＣ経路を介してペリプラズムに輸送されることが知られている。したがって，シグナル配列なしのｐＩＩＩバージョンは，ビリオン組み入れの必要条件であるペリプラズムターゲッティングの際にｐＩＩＩ結合不良となる。したがって，このサンプルからのビリオンは，ヘルパーファージ由来のｐＩＩＩ（物理的な表現型−ゲノム型のつながりの損失）のみを含むこととなる。ただし，ファージミドのパッケージング効率は，通常の場合に近く，結果として，通常の滴定量となる（図１６から分かる通り）。シグナル配列なしのｐＶＩＩバージョンと標準ｐＩＩＩディスプレイはいずれも，機能性ディスプレイが得られているが，ｐＩＩＩの場合，抗原結合能力がより強い。このことは，ｐＩＩＩバージョンの機能性がより高いことを必ずしも反映するものではなく，標準ｐＩＩＩディスプレイが，親和効果を引き起こすｓｃＦｖユニットの原子価１のディスプレイから原子価が少ないディスプレイまでの混合状態にあることは十分に論文化されている（Ｂｒａｄｂｕｒｙ及びＭａｒｋｓ，ＰＭＩＤ：１５２６１５７０）。そのような親和効果は，相互作用という実在する親和性をマスキングしており，優れた発現プロフィールのためにｓｃＦｖユニットがしばしば好ましいけれども，例えば，ビリオン当たりのユニット数が少ないという意味で発現性が低いＦａｂフォーマットが，親和性選択に対して非常に強いバインダーをもたらすということは，広く論文化されている（ｄｅ Ｈａａｒｄら，ＰＭＩＤ：１０３７３４２３，及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＰＭＩＤ：１６１５１４０４）。したがって，ｐＧＡＬＤ７ΔＬからのシグナルが低い方がむしろ原子価１により近いｓｃＦｖディスプレイを反映し，それにより，多くの用途があるという点で有利である。
【０１７７】
本明細書で採用されているファージミドの全てにおけるｓｃＦｖ−ｐＶＩＩ／ｐＩＩＩ発現カセットは，ｌａｃプロモーターで制御され，ビリオンのパッケージングは，標準プロトコルをＩＰＴＧ誘導なしで用いてなされる（Ｗｅｌｓｃｈｏｆら，ＰＭＩＤ：９０５０８７７）。したがって，パッケージング中にＩＰＴＧを用いて強制的により強い発現を起こすことで，ｓｃＦｖディスプレイを強めることが可能である。また，ファージミドファージディスプレイの重要な特徴は，機能性ディスプレイがヘルパーファージを介したファージミドのレスキューに依存しているという事実にある。したがって，ファージゲノムをベースとしたディスプレイとは対照的に，所定の細胞からビリオンへとパッケージングすることが可能な２種類のｓｓＤＮＡソースがあり，それらは，ファージミド，又はヘルパーファージゲノムである。重要なことは，双方のタイプのビリオンは，完全に同一の宿主細胞内で産生して見だされるので，キャプシドタンパク質の完全に同一のプール（ｐｏｏｌ）へのアクセスすることになる。したがって，組み合わせ可能なファージディスプレイ技術に対する基礎を形成する，物理的なゲノム型−表現型のつながりを維持することを確保するために，ファージミドに関してファージミドのヘルパーファージに対する比率が最も重要である。新たな実験では，同じファージミド由来のサンプルを上述したように調製するとともに，一方で，パッケージング中に含まれるＩＰＴＧを用いた場合と外した場合について比較対象となるビリオンアッセンブリーをも調製する。今回は，滴定中に，ヘルパーファージゲノム上で見られるカナマイシン抵抗力によるヘルパーファージゲノムの滴定量もマッピングする。
【０１７８】
今回の滴定結果（図１８Ａ）は，互いに異なるファージミドを標準条件で比較した場合，ファージミド滴定量に関して，前出のパッケージング（図１６）と完全に同一の傾向を示しているが，今回のものは，ｐＧＡＬＤΔＬ（ｐＶＩＩΔL）及びｐＧＡＬＤ（ｐＶＩＩ）は，いずれも，滴定量がいくらか高くなっていた。ｐＶＩＩをＩＰＴＧ誘導すると，又はｐＩＩＩ発現に応じて，ファージミドの全てにおいて滴定量の減少が見られたが，その効果は，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩのｐＧＡＬＤ７ファージミドに関するものが最も顕著である。ファージミドのヘルパーファージに対する比率をマッピングして（図１８Ｂ），互いに異なるファージミドを標準条件下（ＩＰＴＧの存在なし）で比較すると，全てのサンプルは，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩのｐＧＡＬＤ７ファージミドを除くファージミドに関しては通常の範囲内の比率を示しており，一方で，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩのｐＧＡＬＤ７ファージミドでは，表現型−ゲノム型のつながりが完全に喪失していることが示される。ＩＰＴＧ誘導を行った場合，ｐＧＡＬＤ７ファージミドに関しては，表現型−ゲノム型がカップリングしないことがさらに顕著であり，また，シグナル配列なしのｐＩＩＩ（ｐＩＩＩΔL）は，上記特徴の程度が小さいこと（比率０．５）を示した。ただし，後者の構造体は，ｐＩＩＩディスプレイに関して非機能的であるにも関わらず，コントロールとしてのみ含まれていた。
【０１７９】
そして，図１８Ａに示したファージミドの滴定量に基づくと，ｐｈＯｘ−ＢＳＡ特定ＥＬＩＳＡにおいてｐＧＡＬＤ７ΔＬ及びｐＧＡＬＤ７の機能性ｓｃＦｖディスプレイが，規格化された滴定濃度の投下量を使用した場合，図１７に示したものと同様であると評価された。
【０１８０】
上記結果は，機能性ｓｃＦｖ−ｐＶＩＩディスプレイが，シグナル配列なしのｐＧＡＬＤ７ΔＬとｐｈＯｘ−ＢＳＡの反応性がＩＰＴＧでｐＶＩＩ結合を強制的に発現させることで顕著に高められた状態で再び実現されたことを確かに示すものであった。この抗原反応性の増大は，ビリオン当たりのｐＶＩＩ結合数の増大だけでなく，ｓｅｅ当たりのｐＶＩＩ結合をかくまうビリオンの数の増大をおそらく反映するものである。後者は，標準ｐＩＩＩディスプレイにおいて，ファージミド含有ビリオンが１〜１０％の間にあるときにのみ実際に結合を含むことが知られていること（Ｂｒａｄｂｕｒｙ及びＭａｒｋｓ，ＰＭＩＤ：１５２６１５７０）に対応すると思われる。一方で，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイは，機能的なｐｈＯｘ−ＢＳＡ結合を何ら示していない。図１８Ｂに基づくと，ＩＰＴＧを希釈していないサンプル内で観測された弱い抗原反応性が，ｐＶＩＩ結合を低いレベルでかくまうヘルパーファージ含有ビリオンにあてがわれなければならない。
【０１８１】
今までのところ，機能性ｐＶＩＩファージミドをベースとした，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）ユニットのディスプレイを明らかに示してきた。この構造体は，同じｓｃＦｖのｐＩＩＩディスプレイに匹敵し，ファージミドの滴定量や抗原結合能力においてわずかな減少のみを示すものである。
【０１８２】
ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）は，ヒトの抗体であるｓｃＦｖライブラリーに対して選択性があり，大腸菌内の方が十分に発現することが知られている（Ｍａｒｋｓら，ＰＭＩＤ：１７４８９９４）。ｐＶＩＩディスプレイが，より挑戦的な結合パートナーの機能的なディスプレイに対して能力を発揮するかどうかを判断するために，我々は，抗体バリアブル遺伝子としてのネズミのハイブリドーマに基づいて，ｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）をサブクローン化するとともに，ネズミのＴ細胞クローンである４Ｂ２Ａ１からのバリアブル遺伝子（Ｌｅａｓｔら，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）に基づいてｓｃＴＣＲをサブクローン化して，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ及びｐＧＡＬＤ７とした。多くのハイブリドーマバリアブル遺伝子が大腸菌内では又はファージディスプレイ時には十分に発現しないことがよく知られている（Ｋｒｅｂｂｅｒら，ＰＭＩＤ：９０３２４０８）。また，Ｔ細胞受容体が，ファージディスプレイに適合させるのが特に困難であることが証明されている，折り畳みタンパク質に分類されることが知られている（Ｌｉら，ＰＭＩＤ：１５７２３０４６，及びＬｏｓｅｔら，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）。
【０１８３】
これらの新しいファージミドからのビリオンは，標準ファージミドレスキューによって調製され，その抗原結合能力に関してＥＬＩＳＡ試験を行った（図２０）。
【０１８４】
試験結果は，機能的なｐＶＩＩディスプレイが，ｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）を用いた場合とｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１を用いた場合の双方で実現されたことを確実に示していた。また，ｓｃＦｖアンチ−ｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）を用いて予め観測したものとは対照的に，今回は，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイを用いた場合と用いなかった場合に相当するものであった。図２０で観測されているシグナルは，試験前にビリオンの滴定量を規格化しなかったので，直接的な比較対象とはならない。シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩの，ｓｃＦｖアンチ−ｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）のディスプレイの完全に非機能的な性質の観点から，上記サンプルを滴定して，ファージミドのヘルパーファージに対する比率を決定した（図２１）。
【０１８５】
ファージミドの滴定量は，シグナル配列なしのｐＶＩＩディスプレイ（ｐＧＡＬＤ７ΔＬ）が，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイ（図２１Ａ）に比較して，優れたパフォーマンスを示すことを再び示した。このことは，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖアンチＮＩＰの双方で確かに検証されたが，差異は，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘで観測された滴定量の場合（図６及び図８参照）よりも明らかではなかった。ファージミドのヘルパーファージに対する比率を比較すると，ｓｃＴＣＲの場合とｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）の場合（図２１Ｂ）の双方において，ｐＧＡＬＤ７ΔＬが，ファージミドに関して，比率で，非常に優れたパフォーマンスを再度示していた。ｓｃＦｖアンチ−ｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）の場合から分かる，ゲノム型−表現型のつながりの顕著な損失は，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）に関して，これらの比率（図１８及び図２１Ｂ）からは観測されなかった。しかし，ｐＧＡＬＤ７ΔＬは，明らかに優れていた。
【０１８６】
上記結果を考慮すると，ビリオンのパッケージング中に宿主細胞の増殖に関して，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖアンチＮＩＰの間に大幅に異なる差異があるという知見が顕著であった。
【０１８７】
図２２から明らかであることは，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ含有培養物が宿主細胞の増殖に関しては効果が小さい一方，ｐＧＡＬＤ７ΔＬファージミドを含むクローンによって示される成長が顕著であるということである。このことは，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイからの宿主毒性を強く示すものであり，一方で，シグナル配列を除去した後は直ちに，そのような毒性がないか又はほとんどない。
【０１８８】
実施例５ 大腸菌株ＡＶＢ１００ＦｍｋＩＩの構造物
【０１８９】
試薬，及び細菌株
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＡＶＢ１００（ＭＣ１０６１に基づく）を，それぞれ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）及びＡｖｉｄｉｔｙ（米国，ＣＯ州，Ｄｅｎｖｅｒ）から購入した。
【０１９０】
結果
【０１９１】
Ｆプラスミド陽性の大腸菌ＡＶＢ１００（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｔｒ（登録商標））を得るために，以下のように，細胞をＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＦプラスミドＴｅｔ（登録商標））と交配させた。適切な抗生物質で補完した５ｍｌＬＢ培地に，各株の単一コロニーを植菌し，３７℃で終夜にわたって，精密な振動を付加した状態で培養した。翌日，未使用の５ｍｌ細胞培養を，吸光度Ａ500nmが０．１のときに開始して，３７℃で１時間にわたって精密な振動を付加した状態で，対数増殖期の中頃まで成育させ，その後，１ｍｌずつを，混合して，３７℃で１時間にわたって静かに培養した。その後，その混合物１０μｌを，１００μｇ／ｍｌのＳｔｒと３０μｇ／ｍｌのＴｅｔを含む未使用の５ｍｌＬＢ培地に移し，さらに，３７℃で終夜にわたって精密な振動を付加した状態で，培養した。翌日，この細胞物を希釈したものを，１００μｇ／ｍｌのＳｔｒと３０μｇ／ｍｌのＴｅｔを含む寒天皿上に広げることで，新しいＦプラスミド陽性のＡＶＢ１００株（用語「ＡＶＢ１００ＦｍｋＩＩ」相当。）を得た。
【０１９２】
参考文献
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【背景技術】
【０００１】
タンパク質の同定，特性解析，及び組み換えを組み合わせて行うための手法を利用することは，学術的な研究開発においても工業的な研究開発においても非常に成功を収めている。それに関して，フィラメント状のバクテリオファージといったファージディスプレイ技術は，第１のライブラリープラットフォームとなる方法として確立されてきており，現在のところ，独占的な技術として君臨している。したがって，ファージディスプレイは，基本的なタンパク質や応用的なタンパク質の発見において広く適用されているだけでなく，新規なタンパク質をベースとした診断や治療においても広く適用されており，いずれも，世界的に急速に広まっている化合物の分類である。
【０００２】
組み合わせ可能なファージディスプレイ技術の原理は，遺伝子型−表現型の結合に基づいており，この遺伝子型−表現型の結合は，各ビリオンが，そのタンパク膜でカプセル化されたゲノムがエンコードされたタンパク質と完全に同一のタンパク質を，対応するビリオンの表面に，ディスプレイのみを行う傾向にあるという性質によって提供されるものである。ここで，ファージ粒子自体は，様々な生理化学的な条件に対して高い耐性をもっている。したがって，ファージディスプレイは，競合する組み合わせ技術と比較して，多くの選択ゲノムにおいて用途が多いという利点がある。
【０００３】
異種のポリペプチドをファージディスプレイすることは，フィラメント状のファージ膜を構成するタンパク質の５種類全てを用いることで達成されている。しかし，ｐＩＩＩのディスプレイと，ｐＶＩＩＩのある程度のディスプレイとが広範囲な利用として実現されているにすぎない（図１）。
【０００４】
異種融合が短鎖のペプチドのみである場合，ファージゲノムをベースとしたベクターを用いた多価のディスプレイシステムが好ましいが，一方で，折り畳まれたドメインを必要とするより長鎖の融合の場合のような，多くの用途では，ファージミドシステムから恩恵を受けることとなる。後者の場合，抗体型ｐＩＩＩのファージディスプレイは，この技術分野を圧倒的に独占している。しかし，代替的な手法が台頭してきており，その手法は，次世代のタンパク質工学のツールとして展開されることが継続的に求められている。多くの用途においては，二重特異性をもつファージ粒子を作製可能であること（特には，制御可能な手法で作製可能であること）は，複数のコートタンパク質が，同じウイルス粒子に照らして融合ペプチドをディスプレイしたという点で，優れた利点になり得るといえる。また，そのようなシステムは，既に確立されているディスプレイ技術、特にはｐＩＩＩディスプレイやｐＶＩＩＩディスプレイに対して干渉を与えない必要がある。
【０００５】
ＥｎｄｅｍａｎｎとＭｏｄｅｌは，１９９５年（ＰＭＩＤ：７６１６５７０）に，少数のコートタンパク質であるｐＶＩＩが，原型のファージ内では利用できないこと，さらには，ｐＶＩＩが，そのＮ末端と結合した他のタンパク質とともに機能しないことを報告した。そして，この報告では，ｐＶＩＩがファージディスプレイには利用することができないと結論付けられている。
【０００６】
Ｇａｏらは，１９９９年（ＰＭＩＤ：１０３３９５３５）に，さらには，特許出願としての国際出願公開第００７１６９４号パンフレットにおいて，ｐＶＩＩに関する，オクタペプチドＦＬＡＧタグを用いた異種ペプチドのファージディスプレイだけでなく，ｐＶＩＩやｐＩＸに関する同時ファージディスプレイについても記述している。ここで，これらのディスプレイは，トポロジーを折り畳む錯体を隠蔽する機能的なヘテロ二量体型のポリペプチド（抗体Ｆｖ）を生成するためのものである。これらの著者は，抗体のディスプレイを行うための代替手段を開発することを目的としていた。ｐＶＩＩやｐＩＸといった結合タンパク質は，ダイシストロニック集合体を使用したファージミドから発現したものであるので，結果として，機能的なファージ粒子は，様々な量で，ｐＶＩＩやｐＩＸとしった結合タンパク質を必然的に含むこととなる。これは，ヘルパーファージゲノムから提供された野生型のｐＶＩＩやｐＩＸといったタンパク質による相補性に起因するものである。ｐＶＩＩやｐＩＸが，それらのＮ末端に結合した他のタンパク質と機能しなかったことが，上述したように，既に提唱されており，また，Ｇａｏらによって彼らの成功に関して可能性のある２種類の理由の単独又は双方の組み合わせが与えられている。
【０００７】
１つの可能性のある理由は，原核生物のリーダー配列（シグナル配列）が，結合タンパク質にＮ末端的に添付していたことにあり，そのために，組み換え型タンパク質の標的化がペリプラズムの空間に確保され，それによって，細胞質内での集積が妨げられたことが考えられる。もう１つの可能性のある理由は，組み換え型のタンパク質が，エンデマンとモデルが提唱したようなファージゲノムではなく，ファージミドから発現したことにあり，そのために，ファージミドレスキューを必然的に必要としたヘルパーファージからの野生型のｐＶＩＩやｐＩＸが組み換え型のｐＶＩＩやｐＩＸといった結合タンパク質を補完しており，その結果，野生型の機能性（官能性），又は組み換え型の変性に起因して損なわれた機能性が妨げられたと考えられる。すなわち，ファージは，野生型のタンパク質と結合タンパク質の混合物で構成されるものである。上述の著者らは，ｐＶＩＩ−ｐＩＸのディスプレイフォーマットが，異種二量体アレイを組み合わせたディスプレイが特に有用であろうということを述べている。ここで，そのようなアレイは，原因は不明ではあるが，パンニングプロトコルの間に特別な効果的な濃縮をもたらすようになると思われる。著者らは，ｐＶＩＩをディスプレイ用タンパク質だけとして用いて，又はｐＶＩＩディスプレイを他のコートタンパク質（ｐＩＸとは異なるタンパク質）でのディスプレイと組み合わせて用いて，二重特異性ディスプレイを実現することを想定していない。
【０００８】
Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，ｓｃＦｖのフラグメントをファージゲノム内で直接的に遺伝子ＶＩＩに対して遺伝的に安定的に結合させることを記述している（ＰＭＩＤ：１６２７７９８８）。すなわち，結果的に得られるファージが，野生型のタンパク質ｐＶＩＩを何ら含まず，かつ，ｐＶＩＩディスプレイが多価であった。著者らは，ファージゲノムフォーマットにおいてｐＶＩＩのディスプレイに成功した理由の１つが，結合タンパク質をペリプラズムの空間に導く原核生物のシグナル配列で結合遺伝子を裏付けられたことにあると仮説を立てている。著者らは，上述したシステムの特異性が，ｐＶＩＩをディスプレイするファージが，改変されていない少数のコートタンパク質として野生型ｐＩＩＩを産生することにあると論じている。ここで，機能的なｐＩＩＩを多重的に複製するためには，宿主細胞の感染を必要としていることが既に報告されていることから，ファージ表面に野生型ｐＩＩＩが存在することで，選択された抗体の再生が広い多様性をもって促進される可能性がある。つまり，著者らは，二重特異性のディスプレイを予期していないだけでなく，彼らは，ペリプラズムの空間にターゲッティングする原核生物のシグナル配列を必要としないｐＶＩＩディスプレイを予期していない。
【０００９】
Ｋｈａｌｉｌらは，二重特異性をもつフィラメント状のファージビリオンの特徴を利用した用途について記述している（ＰＭＩＤ：１７３６０４０３）。その特徴とは，外来栄養型のペプチドが完全同一のビリオンの各遠位端でディスプレイされるというものである。彼らは，上述した用途を，ｐＩＸディスプレイファージミドを補完する通常のｐＩＩＩファージゲノムのベクターを組み合わせて利用することで実現した。その設定では，ファージゲノムのベクターが，ファージミドをレスキューするときのヘルパーファージとして機能していた。つまり，本明細書で説明する手法，すなわち，ｐＶＩＩ改変ヘルパーファージゲノムを使用してｐＩＩＩディスプレイのファージミドをレスキューすることで，二重特異性のファージミドビリオンを生成する手法，を想起させるものである。しかしながら，両者には，二重特異性ビリオンを得るための手段や，所定のビリオンのビオチン化を得る手段が互いに異なるという点でいくつかの特徴が挙げられ，それた特徴によって，両者は互いに区別されるといえる。
【００１０】
第１に，Ｋｈａｌｉｌらの手法では，ｐＩＩＩファージミドディスプレイを，それらｐＩＩＩ結合を担うファージゲノムベクターのまま組み合わせて使用することができるはずがなく，結果として，ファージミドのレスキューで二重特異性を得ることはできず，また，二重特異性は，ｐＩＩＩ結合の双方の機能に有害となる可能性が高いといえる。
【００１１】
第２に，筆者ら自身が示しているように，ゲノムのｐＩＸ改変は，ファージゲノム内の遺伝子と重複するために，実行可能なストラテラジーの１つとしてみなすことはできないので，彼らは，改変されたヘルパーファージゲノムであって，ｐＩＩＩファージミド（又はｐＶＩＩＩ）レスキューに使用可能であるとともに，そのようにすることで，所定の表現型の特徴を完全同一のビリオンの双方の遠位端に提供可能なヘルパーファージゲノムの生成を予想したり，仮説を立てたりしていない。Ｋｈａｌｉｌらは，改変されたｐＶＩＩをファージミドで使用することやファージゲノムディスプレイで使用することについて何ら言及していない。
【００１２】
第３に，Ｋｈａｌｉｌらは，単一のファージゲノムを改変するに際して，完全同一のゲノム内で複数のキャプシド遺伝子を同時に改変することで二重特異性をもつビリオンを実現することについて仮説を立てていない。彼らは，単に，市販で入手可能なファージゲノムベクターを使用して標準のｐＩＩＩペプチドディスプレイを利用したに過ぎない。
【００１３】
第４に，Ｋｈａｌｉｌらは，単に，二重特異性をもつビリオンをディスプレイする短鎖のペプチドを生成したに過ぎず，折り畳まれたドメインを生成したのではなく，また，そのようなディスプレイを，改変されたキャプシドタンパク質の一方又は双方で実現することについては何ら仮説を立てていない。
【００１４】
第５に，Ｋｈａｌｉｌらは，ｐＩＩＩをディスプレイしたペプチドについて位置特異性をもつビオチン化を，インビトロの化学的結合を利用して実現しているが，インビトロやインビボでの酵素反応によっては実現していない。著者らは，アビジンタグ（ＡｖｉＴａｇ：登録商標）といった酵素基板をディスプレイすることで，ディスプレイ部分について酵素介在型のビオチン化を行うことを何ら予想していない。
【００１５】
以上のことから，Ｋｈａｌｉｌらは，Ｎ末端のシグナル配列を利用しないタイプのディスプレイを何ら示唆していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は，フィラメント状のファージ上にディスプレイされたペプチドに適した代替的な足場を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第１の側面は，フィラメント状のファージに由来するｐＶＩＩ結合タンパク質であって，当該結合タンパク質がＮ末端のシグナル配列を含まず，それにより，結合が外来栄養型のペプチドに導かれる，結合タンパク質である。
【００１８】
本発明の他の側面は，本発明の結合タンパク質をコードする核酸に関する。
【００１９】
本発明のある側面は，本発明の結合タンパク質を含むフィラメント状のファージに関する。
【００２０】
本発明の別の側面は，フィラメント状のファージのライブラリーに関する。
【００２１】
本発明のある側面は，ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，該ヘルパーファージが，本発明のｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる，ファージディスプレイシステムに関する。
【００２２】
本発明の他の側面は，ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，該ファージミドが，本発明のｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる，ファージディスプレイシステムに関する。
【００２３】
本発明のある側面は，ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムを有するキットであって，該ヘルパーファージが，本発明のｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる，キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は，フィラメント状のファージの構造を模式的に示す図である。ビリオンは，５種類の構造的なタンパク質で構成されており，これらのタンパク質は，単一らせん構造をもつＤＮＡ分子を被覆（コート）している。野生型（ｗｔ：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）のファージには，ｐＶＩＩＩの複製が約２７００存在するとともに，ビリオンの各端にあるｐＩＩＩ，ｐＶＩ，ｐＶＩＩ，及びｐＩＸからなる４種類のタンパク質の群のうちのいずれかの複製が３〜５前後存在する。ビリオンのサイズは，ゲノムのサイズに依存し，ｐＶＩＩＩコートタンパク質１個当たりヌクレオチドが２．３個前後であり，したがって，粒子の長さは，付着したｐＶＩＩＩの複製の数で増減することで調整される。なお，ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩの構造は，Ｘ線ファイバー回折法，結晶学，及び核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）によって既に明らかにされている。少数のコートタンパク質であるｐＩＩＩは，互いに異なる３種類のドメインを含んでおり，それらのドメインは，グリシンが豊富な領域で分離されている。それら３種類のドメインは，Ｎ１（ＴｏｌＡに結合するドメイン）と，Ｎ２（Ｆ線毛に結合するドメイン）と，ＣＴ（ビリオンと一体的なドメインであって，正常なビリオンアッセンブリーにとって重要なドメイン）である。
【００２５】
【図２】図２は，ＡｖｉＴａｇ（登録商標），ＨＩＳ６−タグ，及びＦＬＡＧタグの大腸菌Ｋ１２コドン最適化を示す図であり，図２（Ａ）は，市販で入手可能なＡｖｉＴａｇ（登録商標）のＤＮＡ配列と，大腸菌Ｋ１２コドンの利用とを比較したものである。赤いコラムは，提出した配列に対応し，黒いコラムは，参照セットに対応する。図２（Ｂ）において，上部の線は，原型のＡｖｉＴａｇ（登録商標）を示しており，下部の線は，Ａの結果に応じて調整した改変後の配列を示している。図２（Ｃ）は，コドン最適化後のＦＬＡＧペプチドを示す。図２（Ｄ）は，コドン最適化後のＨＩＳ６ペプチドを示す。
【００２６】
【図３】図３は，野生型ヘルパーファージの比較対象となる改変後のヘルパーファージの滴定量を示す図である。
【００２７】
【図４】図４は，Ｍ１３Ｋ０７のＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩＩに関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図である。 ビオニチル化したビリオンを吸収させるために，規格化したファージ調合液をストレプトアビジン（ＳＡ）のビーズと混合させ，その後，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を実施例１で記述するように実施した。
【００２８】
【図５】図５は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，Ｍ１３Ｋ０７でのｐＶＩＩ結合としてのＦＬＡＧタグのアクセシビリティー（可触性）を示している。規格化したファージ調合液を酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）試験で使用した。Ｍ２とＭ５のＭＡｂの双方に関しては，Ｍ１３Ｋ０７ＦＬＡＧについてのみ，ＦＬＡＧタグの明確な検出値が認められる。Ｍ５のＭＡｂによるＦＬＡＧタグの検出値の方がより強い。
【００２９】
【図６】図６は，分析結果を示す図であり，Ｍ１３Ｋ０７（配列表ＩＤ番号：３１）とＶＣＳＭ１３（配列表ＩＤ番号３２）の双方に対するｐＶＩＩ結合としてのＨＩＳタグのアクセシビリティー（可触性）を示している。ＨＩＳ６でタグ化されたビリオンを吸収させるために，規格化したファージ調合液を，タロン社（Ｔａｌｏｎ）のダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ；登録商標）と混合させ，その後，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を実施例１で記述するように実施した。
【図７】図７（Ａ）では，ｓｃＴｃＲのファージミドの滴定量とｓｃＦｖ−ｐＩＩＩがディスプレイされたファージミドの滴定量をコロニー形成単位ｃｆｕampR／ｍｌで示されている。図７（Ｂ）では，ヘルパーファージに対するファージミドの比率を，ファージミドの滴定量（ｃｆｕampR／ｍｌ）をヘルパーファージの滴定量（ｃｆｕkanR／ｍｌ）で割った値で示す比率で示されている。
【図８】図８は，ｓｃＴＣＲファージミドＡｖｉＴａｇ（登録商標）の酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，ストレプトアビジンで被覆（コート）したダイナビーズ（登録商標）でファージレスキューした後のＡｖｉＴａｇ（登録商標）の明確なアクセシビリティー（可触性）を示している。
【図９】図９は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，互いに異なる２種類のファージミドにおいて，２種類のアンチＦＬＡＧ抗体Ｍ２及びＭ５でファージミドビリオンをキャプチャーしたときの，ｐＶＩＩ結合としてのＦＬＡＧタグのアクセシビリティー（可触性）を示している。図９（Ａ）は，ファージミドｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１に関し，図９（Ｂ）は，ファージミドｐＳＥＸ−ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘに関する。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１０】図１０は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，図１０（Ａ）は，ｐＶＩＩＡｖｉＴａｇ（登録商標）を用いてファージミド由来のビリオン上でディスプレイされたｓｃＴＣＲｐＩＩＩの機能性を示しており，図１０（Ｂ）は，同様にディスプレイされたｓｃＦｖｐＩＩＩの機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１１】図１１は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，図１０（Ａ）は，ＦＬＡＧタグやＨＩＳ６タグを用いてファージミド由来のビリオン上でディスプレイされたｓｃＴＣＲの機能性を示しており，図１０（Ｂ）は，同様にディスプレイされたｓｃＦｖの機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１２】図１２は，ｐＶＩＩＡｖｉＴａｇ（登録商標）を用いた場合及び用いなかった場合におけるゲノムファージｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲｐＩＩＩの滴定量を示す図である。
【図１３】図１３は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，ストレプトアビジンビーズでファージをキャプチャーした後にアンチＭ１３抗体によって結合したファージを検出した場合におけるゲノムのｆＵＳＥ５−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ファージ調合液の機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１４】図１４は，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）分析結果を示す図であり，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＩＩＩを用いた場合におけるゲノムのファージであるｆＵＳＥ５上でｐＩＩＩがディスプレイされたｓｃＴＣＲの機能性を示している。規格化したファージ調合液を使用した。
【図１５】図１５は，ｐＩＩＩディスプレイのファージミドを模式的に示す図であり，図１５（Ａ）は，新規なｐＧＡＬＤ７に関するものであり，図１５（Ｂ）は，新規なｐＧＡＬＤ７ΔＬに関するものである。双方のファージミドのベクターバックボーンは，ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号：２９）に基づいたものであり，その配列は，ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｙ１４５８４から入手可能であり，その構成に関する詳細は，材料及び方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）の項目内に記述されている。双方のファージミドは，それぞれ，ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部分及びＭｌｕＩ／ＮｏｔＩ部分の簡易カセット交換を介して，イン・フレームの外来栄養の配列（Ｅ1，Ｅ2とも称する）のカセットを提供可能である。それらのカセットは，以下に述べる互いに異なる構造体の中で変化する人工のリンカー配列で接続される。それら構造体とは，略称ｌａｃＰＯで示すｌａｃプロモーターと，略称ｓｄで示すシャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と，略称ｐｅｌＢで示す細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナル配列と，略称ＴＰで示すトリプシンプロテアーゼサイトと，略称ｔで示すＴ７転写終結点である。
【図１６】図１６は，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ（ｐＶＩＩΔL），ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ），ｐＳＥＸ８１（ｐＩＩＩ），及びｐＳＥＸ８１ΔＬ（ｐＩＩＩΔL）からディスプレイされたｓｃＦＶのアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）のファージミドの滴定量を示す図である。これらのファージミドは，いずれも，アンピシリン抵抗マーカーをかくまうものであるから，滴定量は，溶液１ミリリットル当たりのアンピシリン抵抗性コロニー形成単位（ｃｆｕampR／ｍｌ）として示されている。
【図１７】図１７は，抗原種（ｐｈＯｘ−ＢＳＡ）に関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図であり，シグナル配列（ΔＬ）を用いた場合と用いなかった場合において，機能性ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）のディスプレイをｐＶＩＩとｐＩＩＩの間で比較したときを示している。なお，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を，材料及び方法で説明されているように行うとともに，滴定量に関する滴下量は，ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ）を除く全てのサンプルに対して２×１０10ｃｆｕampR／ｍｌとし，ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ）については，希釈せずに使用した（これは，１．１×１０7ｃｆｕampR／ｍｌに相当する）。図中アンチＭ１３HRPは，抗原性薬剤及び阻害剤に対してビリオン検出ＭＡｂがあいまいな吸着を起こすことに関して負のコントロールを行った場合を示している。
【図１８】図１８（Ａ）は，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ（ｐＶＩＩΔL），ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ），ｐＳＥＸ８１（ｐＩＩＩ），及びｐＳＥＸ８１ΔＬ（ｐＩＩＩΔL）からディスプレイされたｓｃＦＶのアンチｐｈＯｘのファージミドの滴定量をｃｆｕampR／ｍｌで示す図である。図１８（Ｂ）は，ファージミドの滴定量（ｃｆｕampR／ｍｌ）をヘルパーファージの滴定量（ｃｆｕkanR／ｍｌ）で割った値に相当する比率を示すヘルパーファージに対するファージミドの割合を示す図である。ビリオンの凝縮（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）を，材料及び方法で説明する標準のファージミドのレスキューとして行うか（−），又は，図１８（Ａ）及び図１８（Ｂ）の双方においてスーパーインフェクション後に現存するＩＰＴＧの最終濃度が０．１ｍＭとなるように行った。
【図１９】図１９は，抗原種（ｐｈＯｘ−ＢＳＡ）に関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図であり，機能性ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘｐＩＩＩのディスプレイを，シグナル配列（ΔＬ）を用いた場合と用いなかった場合，及び，ｐＶＩＩ結合発現のためにＩＰＴＧ誘導（０．１ｍＭ）を行った場合と行わなかった場合について比較したときを示している。なお，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を，材料及び方法で説明されているように行うとともに，滴定量に関する滴下量は，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ（ｐＶＩＩΔL）に対して２×１０10ｃｆｕampR／ｍｌとし，ｐＧＡＬＤ７（ｐＶＩＩ）については，希釈せずに使用した（これは，ＩＰＴＧを用いた場合で２．０×１０9ｃｆｕampR／ｍｌに相当し，ＩＰＴＧを用いなかった場合で１．１×１０7ｃｆｕampR／ｍｌに相当する）。図中アンチＭ１３HRPは，抗原性薬剤及び阻害剤に対してビリオン検出ＭＡｂがあいまいな吸着を起こすことに関して負のコントロールを行った場合を示している。
【図２０】図２０は，抗原種に関する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図であり，図２０（Ａ）は，シグナル配列（ΔＬ）を用いた場合と用いなかった場合における機能性ｓｃＦｖのｐＶＩＩディスプレイを比較した場合を示しており，図２０（Ｂ）は，同様の場合における機能性ｓｃＦｖアンチＮＩＰのｐＶＩＩディスプレイを比較した場合を示している。なお，酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）を，不純物を除去したものを希釈していない状態で同量用いて，材料及び方法で説明されているように行った。アンチＭ１３HRPは，抗原性薬剤及び阻害剤に対してビリオン検出ＭＡｂがあいまいな吸着を起こすことに関して負のコントロールを行った場合を示している。図２０（Ａ）では，Ｔ細胞受容体４Ｂ２Ａ１用の抗体クローン種ＧＢ１１３を，ｓｃＴＣＲのＶαβ４Ｂ２Ａ１に対する，コグネートＩ−Ｅd／２315配位子の代理となる代理抗原性薬剤（Ｌｏｓｅｔら，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）として用いた。
【図２１】図２１（Ａ）は，標準ファージミドレスキューを用いた場合においてｐＧＡＬＤ７ΔＬ及びｐＧＡＬＤ７からディスプレイされたｓｃＴＣＲのＶαβ４Ｂ２Ａ１とｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）のファージミド滴定量を示す図であり，図２１（Ｂ）は，図２１（Ａ）におけるサンプルと同じサンプルのファージミド対ヘルパーファージ比を示す図である。
【図２２】図２２（Ａ）は，ビリオン凝縮プロトコル測定の終端における各大腸菌培養液の細胞密度をＡ600nmにおける光学密度（ＯＤ）で示す図である。なお，全ての培養液は，Ａ600nmにおける密度がいずれも０．０２５で始まっており，その後，Ａ600nmが０．１に到達したときにＮ１３Ｋ０７を用いてＭＯＩ５でスーパーインフェクションを行った。そして，培養液の最終的なＯＤを測定する前に，凝縮が３０℃でオンとなるようにした。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
なお，以下に説明する本発明の一態様に係る実施形態及び特徴は，本発明の他の側面に対しても適用可能である。
【００３１】
本発明で引用する全ての特許文献及び非特許文献は，参照によってそれらの全てが本明細書に取り入れられる。
【００３２】
本明細書では，新たな技術的思想として，フィラメント状のファージビリオンの構造的なコートタンパク質ｐＶＩＩが，遺伝的に，改変後のビリオンがＮ末端の配列タグをコードするように変化することを説明する。ｐＶＩＩに結合されるタグの種類によって，ビリオンには，特異なタグ検出性だけでなく，適応性のある精製手段と固定化手段とがシステムがもつ性質として与えられる。その手法は，既存のｐＩＩＩディスプレイシステムやｐＶＩＩＩディスプレイシステム，さらには，ｐＶＩＩに関する新規なライブラリー生成を含むシステムに対して，ファージミドベクターのファージゲノム基部が適用できるかどうかに関わらず，直接的に適合可能である。したがって，この新たな技術的思想は，ファージディスプレイ技術の高い多様性に対してさらなる発展をもたらすものである。
【００３３】
最初に，今回の報告では，フィラメント状のファージゲノムが，シグナル配列の生存能力や機能性に干渉を与えることがないｐＶＩＩのＮ末端でのペプチド改変を，シグナル配列をかくまうことなく許容するということを説明する。このことは，Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１），ＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２），及びｆＵＳＥ５（配列ＩＤ番号３０）のゲノム，ファージミド，並びにファージミドで実証されただけでなく，様々な株の間で表現型の保存性が非常に高い。このことは，あらゆるフィラメント状のファージに対する適用を非常に有望なものとする。
【００３４】
選択されたｐＶＩＩ結合の１つは，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）の原核生物のコドンを最適化したバージョンであった。そのペプチドは，今までに報告されている基板の中でも最も効率的なＢｉｒＡ基板である。このｐＶＩＩペプチドディスプレイをｐＩＩＩディスプレイと組み合わせることによって，二重特異性をもつビリオンが生成されることを以下に説明する。このことは，ファージゲノムをベースとしたベクターであるｆＵＳＥ５（配列ＩＤ番号３０）で実証されるとともに，改変後のＭ１３Ｋ０７のヘルパーファージを用いてレスキューしたときのファージミドディスプレイから実証された。この二重特異性という性質を，ｐＶＩＩＩディスプレイと組み合わせて利用することが可能であるということも容易に考えられる。特に，ファージミド由来のビリオンの場合には，内因性のビオチン化レベルが非常に低かった。
【００３５】
一方で，ビオチン化レベルが高い方が望ましい場合，それは，それらのビリオンのビオチン化をインビトロで行うことで，また，新規なＦ陽性の大腸菌であるＡＶＢ１００ＦｍｋＩＩ株を使用してビオチン化をインビボで行うことで，容易に達成することが可能である。
【００３６】
したがって，今回の技術的思想によって，アビジン−ビオチン技術を，支配的なファージディスプレイプラットフォーム（ファージやファージミド）及びディスプレイシステム（ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩ）の双方と組み合わせることが可能となる。そして，そのことにより，ファージ粒子に対するビオチン部位の接続が，ｐＩＩＩ結合及び／又はｐＶＩＩＩ結合に干渉を与えることなく，コントロールされたサイト特異性のある状態で可能となり，その結果，機能性の保持を確保することができる。このシステムは，利用の有無を選択するだけで，既存のプラットフォームに対してさらなる改変を必要とすることなく直接的に適合することができる。
【００３７】
まとめると，ゲノム由来のビリオンやファージミド由来のビリオンの双方は，正常な機能性と生存能力をもつビリオンを産生しつつ，ｐＶＩＩの改変を許容することができる。
【００３８】
ｐＶＩＩ結合タンパク質
本発明のある態様では，フィラメント状のファージに由来するｐＶＩＩ結合タンパク質であって，当該結合タンパク質は，外来ペプチドがｐＶＩＩのＮ末端に結合している結合タンパク質が提供される。そのような結合タンパク質は，例えば，ファージディスプレイのコンテキストで利用可能である。
【００３９】
外来ペプチドといった場合，タンパク質ｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩの一部をもともと持っていないペプチドを意味し，結合タンパク質がもつｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩのアミノ酸部分のＮ末端に対するリンカーとなるアミノ酸を持つペプチド又は持たないペプチドをいう。好ましい実施態様では，結合タンパク質は，Ｎ末端のシグナル配列を含まない。本明細書では，用語「ペプチド」は，短鎖のペプチド，ポリペプチド，タンパク質，及びそれらのフラグメントを含む概念である。
【００４０】
用語「ｐＩＩＩタンパク質」は，配列ＩＤ番号２に開示するようなアミノ酸配列を指す。
【００４１】
ある実施形態では，ｐＩＩＩタンパク質は，配列ＩＤ番号２の配列に対する相同性が少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み，例えば，その相同性が８０％，相同性が８１％，相同性が８２％，相相同性が８３％，相同性が８４％，相同性が８５％，相同性が８６％，相同性が８７％，相同性が８８％，相同性が８９％，相同性が９０％，相同性が９１％，相同性が９２％，相同性が９３％，相同性が９４％，相同性が９５％，相同性が９６％，相同性が９７％，相同性が９８％，又は，相同性が９９％である。
【００４２】
用語「ｐＩＩＩ結合タンパク質」は，配列ＩＤ番号２に開示するようなアミノ酸配列を指す。
【００４３】
用語「ｐＩＩＩ結合タンパク質」は，外来ペプチドに結合したｐＶＩＩＩタンパク質又はそのフラグメントをいう。
【００４４】
用語「ｐＶＩＩＩ結合タンパク質」は，配列ＩＤ番号３におけるアミノ酸配列を指す。
【００４５】
ある実施形態では，ｐＶＩＩＩタンパク質は，配列ＩＤ番号３の配列に対する相同性が少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み，例えば，その相同性が８０％，相同性が８１％，相同性が８２％，相同性が８３％，同性が８４％，相同性が８５％，相同性が８６％，相同性が８７％，相同性が８８％，若しくは，相同性が８９％であるか，又は，相同性が９０％，相同性が９１％，相同性が９２％，相同性が９３％，相同性が９４％，相同性が９５％，相同性が９６％，相同性が９７％，相同性が９８％，若しくは，相同性が９９％である。
【００４６】
用語「ｐＶＩＩタンパク質」は，配列ＩＤ番号１におけるアミノ酸配列を指す。
【００４７】
ある実施形態では，ｐＶＩＩタンパク質は，配列ＩＤ番号１の配列に対する相同性が少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み，例えば，その相同性が８０％，相同性が８１％，相同性が８２％，相同性が８３％，同性が８４％，相同性が８５％，相同性が８６％，相同性が８７％，相同性が８８％，相同性が８９％であるか，相同性が９０％，相同性が９１％，相同性が９２％，相同性が９３％，相同性が９４％，相同性が９５％，相同性が９６％，相同性が９７％，相同性が９８％，又は，相同性が９９％である。
【００４８】
配列の相同性
通常，「相同性」といった場合，遺伝子やタンパク質がそれぞれヌクレオチドレベルやアミノ酸レベルで互いに一致しているときの配列の一致度合いをいう。
【００４９】
そして，本明細書では，コンテキストとしての「配列の相同性」は，タンパク質がアミノ酸レベルで互いに一致しているときの一致度合いを示す測定値や，核酸がヌクレオチドレベルで互いに一致しているときの一致度合いを示す測定値をいう。ここで，タンパク質の配列の相同性は，複数の配列が並んでいる場合，各配列において所定位置でのアミノ酸配列を比較することによって決定されてもよい。同様に，核酸の配列の相同性は，複数の配列が並んでいる場合，各配列において所定位置でのヌクレオチド配列を比較することによって決定してもよい。
【００５０】
２種類のアミノ酸配列や２種類の核酸配列の相同性を百分率で決定するにあたり，最適な比較を目的として，それらの配列は調整される（例えば，第２のアミノ酸配列や第２の核酸配列を最適に並べることを目的として，第１のアミノ酸配列や第１の核酸配列の配列内に，スペース（ｇａｐ）を設けてもよい）。そして，アミノ酸の残りの部分やヌクレオチドは，対応するアミノ酸の位置や対応するヌクレオチドの位置で比較される。第１の配列内の位置が，第２の配列内の対応する位置で同じアミノ酸の残りの部分やヌクレオチドによって占有されている場合，その位置で分子が同一であるとされる。２種類の配列の間での相同性を示す百分率は，配列によって共有された位置が一致する数の関数である（すなわち，相同性［％］＝（一致する位置の数／位置の総数（例えば，重複する位置の数））×１００）。ある実施形態では，２種類の配列は，互いに同じ長さである。
【００５１】
配列を手動で調整して，同一のアミノ酸の数を数えてもよい。これに代えて，相同性の百分率を決定するために，数学的なアルゴリズムを用いて２種類の配列を配列させてもよい。そのようなアルゴリズムは，Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）によるＮＢＬＡＳＴプログラムやＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴ（ブラスト）のヌクレオチド検索は，ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて，スコア１００，ワード長１２で実行可能であり，これにより，本発明による核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることが可能である。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索は，ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて，スコア５０，ワード長３で実行可能であり，これにより，本発明によるタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることが可能である。比較目的でスペースを入れた配列を得るために，ギャップ化ブラスト（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）を利用してもよい。それに代えて，サイブラスト（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）を用いて，分子間の距離関係を検出する反復検索を行ってもよい。ＮＢＬＡＳＴプログラム，ＸＢＬＡＳＴプログラム，及びスペース化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合，各プログラムのデフォルトのパラメーターを用いることが可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。これに代えて，例えば，ＥＭＢＬデータベース内のＢＬＡＳＴプログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で配列を並べた後に，その配列の相同性を計算してもよい。一般的には，例えば「スコアリングマトリックス」や「ギャップペナルティ」についてはデフォルトの設定をアライメントに使用可能である。本発明のコンテキストでは，ＢＬＡＳＴＮとサイブラスト（ＰＳＩ ＢＬＡＳＴ）のデフォルトの設定が好都合なものとなり得る。
【００５２】
２種類の配列間の相同性の百分率は，許容可能なスペースがある場合やない場合において，上述したような技術と同様の技術を用いて決定することも可能である。そして，相同性の百分率を計算する際には，正確に一致するものだけが数えられる。
【００５３】
折り畳みタンパク質
本発明の好ましい実施形態では，用語「ペプチド」は，抗体由来のドメインなどの折り畳みタンパク質のみを意味する。当業者は，以下を含む，折り畳みタンパク質が抗体やそのフラグメントであり得ることを認識するものである。Ｆｖ，ｓｃＦｖ，Ｆａｂ，単一のドメイン，タンパク質ＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ），アンキリンやそのフラグメント，Ｔ細胞受容体やそのフラグメント，ＭＨＣ分類ＩやＩＩのフィブロネクチンやそのフラグメント，Ａｖｉｍｅｒ，Ａｎｔｉｃａｌｉｎ，ＰＤＺドメイン，ＩｇＮＡＲやそのフラグメント，ＣＴＬＡ４やそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，Ｋｎｏｔｔｉｎ，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物化学的な蛍光色素分子。
【００５４】
原理的には，ディスプレイ可能である限り，任意のものをライブラリー化することが可能である。そのため，整列構造（つまり，折り畳み構造）を持つものに比較して非構造的な配列のみを持つものを区別することだけに関していえば高いレベルで行うことが可能である。
【００５５】
別のより好ましい実施形態では，用語「ペプチド」は，２〜５０個の間のアミノ酸（ａａ）の短鎖のペプチドのみを意味する。ある長さでは，短鎖のランダムコイル構造をもつペプチドは，所定の二次的な折り畳み構造又は三次的な折り畳み構造に十分に適した長さであり，そのために，折り畳まれたドメインを定義することとなる。このことは，明らかに，化学的な組成に依存している。したがって，２０個のアミノ酸（２０ａａ）からなる一方のペプチドがランダムコイル構造のままである場合，２０個のアミノ酸（２０ａａ）からなる他方のペプチドは折り畳まれた状態となり得るものであり，結果として，折り畳みドメインを定義し得るものとなる。
【００５６】
別のより好ましい実施形態では，本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質は，配列ＩＤ番号１における位置１〜３３，位置２〜３３，位置３〜３３，位置４〜３３，及び位置５〜３３からなる位置の群から選択された配列を含む。
【００５７】
配列ＩＤ番号１（ＭＥＱＶＡＤＦＤＴＩＹＱＡＭＩＱＩＳＶＶＬＣＦＡＬＧＩＩＡＧＧＱＲ）は，フィラメント状のファージの構造的なコートタンパク質ｐＶＩＩ（野生型ｐＶＩＩ）のアミノ酸配列である。最も好ましくは，そのｐＶＩＩ結合タンパク質は，配列ＩＤ番号１における位置１〜３３にある。
【００５８】
シグナル配列
好ましくは，外来ペプチドは，任意のアミノ酸を介して又は介さずに，結合タンパク質のｐＶＩＩ配列のＮ末端に対して直接的に結合している。さらに別の好ましい実施形態では，ｐＶＩＩ結合タンパク質は，Ｎ末端のリーダー（ｌｅａｄｅｒ）配列を含まない。
【００５９】
用語「リーダー配列」は，用語「シグナルペプチド」や用語「シグナル配列」と置換可能に用いられ，グラム陰性菌のペリプラズムの皮膜スペースに対してタンパク質（そのリーダー配列が一部であるタンパク質）をターゲッティングするアミノ酸配列を意味する。リーダー配列の例としては，ｐｅｌＢｓｓ，ＯｍｐＡｓｓ，ＴｏｒＡｓｓ，ｍａｌＥｓｓ，ｐｈｏＡｓｓ，ｌａｍＢｓｓ，Ｂｌａｓｓ，及びＤｓｐＡｓｓや，ｍｇｌＢｓｓ，ｓｆｍＣｓｓ，ｔｏｌＢｓｓ，及びＴｏｒＴｓｓがしばしば用いられる。そのようなシグナル配列は，大腸菌の分泌機構に対して，完全なタンパク質をターゲッティングすることが知られている。ここで，大腸菌は，少なくとも，細胞質ゾル（シトソル）からペリプラズムの空間への転座として，ＳＲＰ依存の転座，ＳＥＣ依存の転座，ＴａｔＡＢＣ依存の転座，又はＹｉｄＣ依存の転座を含むことが知られている（Ｂａｎｅｙｘら，ＰＭＩＤ：１５５２９１６５）。したがって，用語「Ｎ末端のシグナル配列」は，タンパク質のＮ末端部分内にあるシグナル配列を意味する。
【００６０】
シグナル配列は，大腸菌の分泌機構に対してタンパク質（その一部）をターゲッティングする性質をかくまい，それによって，それを細胞質の区画からペリプラズムの区画へと転座させるものであって，シグナル配列を，アミノ酸の組成の化学的な性質によって定義された符号（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）やモチーフを用いて，部分的に同定することが可能である。
【００６１】
しかし，既存の機能的なシグナル配列の多様性は，まだ現在のところ，それらを同定するにあたり現在の知見を上回るものであり，そのために，ペプチドをコグネートシグナル配列として定義する際の技術の現状は，通常，例えば，神経ネットワークや発見的方法論によってテンプレートとしてデータベース化された知見を用いてデータ検索することにとどまっている。現在のところ，そのようなツールのいくつかは，オープンアクセスチャネル（例えば，ＳｉｇｎａｌＰ，ＰＲＯＳＩＴＥ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）のＰＰＳＥＡＲＣＨ，ＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ，ＴａｔＰ）を介して社会全体で利用可能である。
【００６２】
その挑戦は，分泌線のタンパク質を分類する場合，シグナル配列モチーフが無いことを同定可能だが，データ検索を用いることで，シグナル配列の特徴を定義したり，問題となっている真核性タンパク質の分泌能力の可能性を取得したりすることが可能といったルールからは外れた細胞質の区画からエクスポートする意味において，さらに高度である。現在のところ，そのようなツールは，原核生物群に関しては，まだ存在しない。
【００６３】
したがって，現在利用可能な方法であって，ペプチドをシグナル配列として変更不可的に同定する唯一の方法は，経験的な手段によるものであり，ペプチドの性質を確認して，それが実在するシグナル配列であるかどうかを決定することである。また，そのようなペプチド内で工業技術を，シグナル配列内でのアミノ酸の所定位置が変化しつつも，そのシグナルペプチドとしての機能が，天然の機能性及び変化後の機能性のいずれか（例えば，増大した転送能力）によって保持されるように，なし得ることは明らかである。また，アミノ酸の欠失や付加を行ってもよい。確かに，そのような分析や工業技術は，ＦｆｐＶＩＩＩシグナル配列，Ｓｅｃ経路をターゲッティングするｇ８ｐｓｓ，及び，Ｔａｔ経路をターゲッティングするＴｏｒＡｓｓを用いてなされてきた。特に，Ｓｈｅｎらによる結果は，変化後の変種，ｐＩＩＩシグナル配列，及び細菌性ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を除いては，機能についての工業技術にとって十分に根拠のあるガイドラインとして機能している。
【００６４】
シグナル配列の機能性は，さらに，以下の２種類のペプチドに分けることが可能である。
【００６５】
１．大腸菌の分泌機構に対するタンパク質（その一部）のターゲッティングを行って，その結果，細胞質の区画からペリプラズムの区画へと転座させ，そして，本プロセスの途中で，特定のプロテアーゼ（例えば，リポタンパク質のシグナルペプチダーゼやリーダーペプチダーゼ）を用いて，残っているタンパク質からタンパク質分解的に分離すること。
【００６６】
大腸菌の分泌機構に対するタンパク質（その一部）のターゲッティングを行って，その結果，細胞質の区画からペリプラズムの区画へと転座させ，その後に，タンパク質の一部として転座を保持したままとすること。
【００６７】
シグナル配列の非常に多くの部分は，上述した状況１にマッピングされるが，これらのタンパク質を上述した状況２で容易に処理し得ることは明らかである。したがって，現在のところ知られている任意のシグナル配列（例えば，変種ｐｅｌＢｓｓなど）は，もともと，上記状況１に属するものであるが，上記状況２に変えられて，コグネートシグナル配列としてみなされる。
【００６８】
また，状況１のシグナル配列を状況２に変化させること，及び，状況２にマッピングするシグナル配列を直接的に選択し，そして転座後にシグナル配列を除去することのいずれかを考えることができる。このことは，宿主に内在するプロテアーゼによって，及び／又は，例えばファージディスプレイの場合においてタンパク質がキャプシドタンパク質に結合するときに実行可能である。そして，シグナル配列の適切な領域や，一部をなすタンパク質，人工的なプロテアーゼのサイトを，所定の裂け目が実現できるように処理することになる。ここでは，２種類の互いに異なるタイプのプロテアーゼの選択サイトを以下のように想定することができる。
【００６９】
Ａ． プロテアーゼのサイトは，興味のある抗体や他の足場（例えば，主要な組織適合性錯体分子やＴ細胞受容体）と結合すると予想されるサイト（例えば，カルボキシペプチダーゼや３Ｃライノウイルスのプロテアーゼサイト）のみで，興味のあるタンパク質を開裂させない。この手法を利用することで，例えば，上記状況２にマッピングするシグナル配列を用いることによる，興味のあるタンパク質のファージディスプレイを，想定することができるとともに，選択などに先だって，シグナルペプチドを人為的に除去して，キャプシド結合に対する機能性と均一性を得ることができる。
【００７０】
Ｂ． プロテアーゼのサイトは，処理後のサイト（例えば，トリプシン）に加えて，興味のあるタンパク質を開裂させる。
【００７１】
双方の状況は，シグナル配列依存のファージディスプレイとしてみなすことができることとなる。
【００７２】
野生型の相補性
これまでは，シグナル配列を用いないときのｐＶＩＩ結合は，ファージ粒子の産生を助長することに関して非機能的であると考えられてきた（Ｅｎｄｅｍａｎら，１９９５年；Ｇａｏら，１９９９年）。そのため，そのＮ末端に直接的に結合した外来ペプチドを持つｐＶＩＩ結合タンパク質は，ファージゲノム上の第２の遺伝子からのｐＶＩＩタンパク質の重量によって，又は，ヘルパーファージからの提供によって補完される必要があった。
【００７３】
用語「野生型」とは，野生の型，野生−型，又はｗｔとも称することとするが，有機的組織体，株，若しくは遺伝子の通常の形態であることや，天然で生じたままの特性のことをいう。野生型とは，天然の個体群において最も一般的な表現型であることをさす。また，野生型とは，野生型という表現型を産生するために必要な遺伝子座の各々における対立遺伝子をさす。野生型のものは，遺伝子型や表現型を参照するときの標準となる。生物学上，野生型は，天然に生じる有機的組織体と，故意に変異させた個体との間の差異に特に関連している。サイト特異性のある突然変異生成は，研究技術の１つであり，これにより，野生型遺伝子の遺伝子配列において特定のヌクレオチドを変異させることが可能となる。本明細書では，野生型のタンパク質を，ｗｔ−（タンパク質名）といったように称することとし，例えば，野生型ｐＶＩＩタンパク質は，ｗｔｐＶＩＩ，ｗｔ−ｐＶＩＩ，野生型ｐＶＩＩと称される。
【００７４】
本願の発明者らは，上述したようなｐＶＩＩ結合タンパク質が，確かに機能的であり，かつ，必ずしも，野生型ｐＶＩＩタンパク質で補完される必要がないことを見いだした。
【００７５】
したがって，本発明のある態様は，ファージディスプレイにおいて機能的なｐＶＩＩ結合タンパク質であって，野生型ｐＶＩＩタンパク質での補完が必要ないｐＶＩＩ結合タンパク質に関する。
【００７６】
Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，野生型ｐＶＩＩタンパク質での補完の必要がないｐＶＩＩ結合タンパク質について報告している。しかしながら，ＫｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらのｐＶＩＩ結合タンパク質は，外来ペプチドのＮ末端端部にシグナルペプチドを含むものであった。そのシグナルペプチドは，Ｎ末端ｐＶＩＩ結合タンパク質を，ペリプラズム空間内へ向ける必要があるとともに，シトプラズム内でのその蓄積を妨げることが推測された。
【００７７】
シグナルペプチドがｐＶＩＩ結合タンパク質のＮ末端端部に存在しないことで，様々な効果が得られる。シグナルペプチドは，通常はタンパク質分解的に除去される。そして，その処理では，しばしば完全ではないが，それにより，タンパク質の収集（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）が発現する場合において処理後のタンパク質に互いに異なるＮ末端端部が生じ，その結果，システム内においてランダムな均一性が生じることとなり，このことは，
処理後のタンパク質内において無用のエラーにつながるリーダーペプチドをかくまったままのタンパク質の機能性に影響を与える可能性がある。このことは，シグナルペプチドが存在しないことで回避される。
【００７８】
また，ペプチドのライブラリーがディスプレイされた場合，ペプチドのいくつかは，タンパク質分解を回避したり影響を与えたりする可能性がある。ここで，タンパク質分解は，ディスプレイされたタンパク質の活性，ひいては機能的なライブラリーの多様性に影響を与えるものである。シグナルペプチドを含まないことによる，さらに他の意外な効果としては，ファージの実行可能性や機能性が，シグナルペプチドを使用した場合とは異なり，影響を受けないということがある。Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，リーダー配列（シグナルペプチド）をＮ末端に含むｐＶＩＩ結合タンパク質を用いた場合のファージに対して滴定量が低かったことを報告している。
【００７９】
外来ペプチド
ある実施形態では，外来ペプチドは，所定のターゲットに結合する親和性標識（アフィニティータグ）である。親和性標識は，例えば，所定の抗体と結合し得るものである。親和性標識と所定のターゲットの組み合わせは，当業者にとっては周知である。
【００８０】
タンパク質タグは，遺伝子的に，組み換え型タンパク質上へ移植するペプチド配列である。これらのタグは，たいてい，化学的な試薬によって，又は，酵素的な手段（例えば，タンパク質分解やインテインスプライシング）によって，除去可能である。タグは，様々な目的でタンパク質に取り付けられる。
【００８１】
親和性標識は，それらの未処理の生物源から親和性技術で精製可能なように，タンパク質に付加される。
【００８２】
未処理のＮ末端ＦＬＡＧタグの特徴は，そのホルミル基のＭｅｔ残渣が原形のままでもつことであり，そのために，Ｃａ2+依存の相互作用であってアンチＦＬＡＧのＭＡｂ Ｍ１との相互作用が許容される。そして，Ｍ１上にビリオンを結合（つまり固定）することが可能となるとともに，そのカチオンがＥＤＴＡなどによってキレート化されていることでのみビリオンが遊離することが可能となり，その結果，非相同の結合を変成させるような過度のｐＨとならない，非常に緩やかな溶出が進行することとなる。また，このことは，Ｍ１を使用することで，システムを，既存の他のＦＬＡＧ結合（内部的に，処理後のＮ末端，又はＣ末端）とともに，Ｍ１によって又は単純にカルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］）を低く維持することによって認められることがない程度の干渉を伴うことなく，利用することが可能となることも意味している。
【００８３】
好ましい実施形態では，ｐＶＩＩ結合タンパク質の外来ペプチドは，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ ｔａｇ），Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，アンキリン，ＩｇＮＡＲ又はそのフラグメント，フィブロネクチン又はそのフラグメント，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される。
【００８４】
配列ＩＤ番号２（ＭＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）は，酵素仲介型のサイト特異性結合であって，ビオチン部位の基質配列への結合を可能にする大腸菌酵素ＢｉｒＡ配列の基質配列である。したがって，ファージディスプレイ技術の利点とアビジン−ビオチン技術の利点とを兼ね備えることとなる。ｐＶＩＩ上にディスプレイされていないライブラリー内の任意の結合ライブラリーは，例えば，第１に，高い親和性をもつライブラリーの要素を同定するために，ターゲットに対して細分化され，そして，アビジンに結合しているビオチン，又は，ビリオン上のｐＶＩＩ結合も含むアビジン状のマトリクスを用いて，固定される。これに代えて，ｐＶＩＩ上にない任意の結合ライブラリーは，例えば，第１に，ランダムに，又は，アビジン上若しくはアビジン状のマトリクス上の所定のアレイ内に固定され，続いて，コントロールされた状態でかつ方向性のある方法で，ビリオン上のｐＶＩＩ結合も含む手段によって，（例えば，ＳＥＲＥＸ内で）ターゲットのスクリーニングが行われる。同様に，ｐＩＩＩ結合ライブラリーやｐＶＩＩ結合ライブラリーの任意の要素は，バルク内で，又は単一種類のクローンとして検出可能である。ここで，その検出に先立って又は検出後に，任意のアビジン又はアビジン同様のレポーター錯体を用いることでターゲットの相互作用が生じる。なお，用語「レポーター」は，本明細書では，例えば，酵素，核酸種，又は，人工の蛍光色素分子若しくは生物的な蛍光色素分子を記述するdescribes。
【００８５】
ＡｖｉＴａｇをアウトラインするのと基本的に同じ論理的根拠であるが一方で不可逆的な固定化に近い後者の結果としては，ＨＩＳ６は，イミダゾールを用いることで緩やかな溶出を許容することがある。ＨＩＳタグは，利用可能なＩＭＡＣマトリクスと適合する。
【００８６】
他の好ましい実施形態では，ｐＶＩＩ結合タンパク質の外来ペプチドは，ライブラリーの要素である。本発明のコンテキストで利用されるライブラリーは，互いに異なるペプチドの収集を意味する。そのようなペプチドは，折り畳まれたドメインであってもよいし，短鎖のペプチド（例えば，２〜５０個のアミノ酸）であってもよい。そのようなライブラリーは，所定のターゲットに対して結合する新規なリガンドを同定するのに利用可能であるので，興味深い。ライブラリーをディスプレイするためにｐＶＩＩを用いることは，ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩを用いてディスプレイされたライブラリーに比較して有利な効果がいくつかある。ｐＶＩＩディスプレイは，方向性や価数に関しては，ｐＩＩＩディスプレイと同じ利点をもつが，伝染性や，ｐＩＩＩディスプレイで生じることが知られている現象に影響を与えることがない。ここで，その現象は，例えば，親和性選択後のレスキューで，システムに対して制御できない無用の不均質をもたらしたものである。また，ｐＶＩＩディスプレイは，Ｎ末端リーダーペプチド（ｐＩＩＩとｐＶＩＩＩの双方のディスプレイの前提となるリーダーペプチド）を必要とすることなしに実現可能である。最終的には，ｐＩＩＩディスプレイ内で主を固定した任意のターゲットは，通常，ターゲット−ファージ結合の分裂（通常は，競合による分裂，又は，ｐＨが高いか若しくは低いときの溶出による分裂）を必要とする。このことは，例えば，高い親和性という大きな障害となる回復として，又は，ｐＩＩＩディスプレイにおける安定的なバインダーとして知られている。伝染を必要とするｐＩＩＩが，変わらずに，かつ，ｐＶＩＩディスプレイでの代替的な相互作用をファージ−ターゲット間の相互作用の後でも着実に利用可能である場合，固定化後のファージが伝染性の全てを保持しているので，結合分裂（例えば，酸性溶出）の必要性が完全になくなり，その結果，ターゲットに結合する間の感染によってのみ回復がなされることとなる。
【００８７】
核酸
本発明の第２の側面は，本発明による結合タンパク質をコードする核酸である。この核酸は，ファージゲノム内又はファージミド内で構成されてもよい。
【００８８】
用語「核酸」とは，単量体のヌクレオチドの鎖で構成された高分子を意味する。生物学上では，これらの分子は，遺伝子の情報を運搬したり，細胞内の構造体を形成したりするものである。最も一般的な核酸は，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と，リボ核酸（ＲＮＡ）である。追記すると，用語「核酸」は，人工的な核酸を含むものであり，そのような核酸には，例えば，ペプチド核酸（ＰＮＡ），及び，モルホリノや，架橋型核酸（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ），グリコール核酸（ＧＮＡ），及び，トレオース核酸（ＴＮＡ）がある。これらの各々は，天然に生じるＤＮＡやＲＮＡとは，分子のバックボーンに対する変化によって区別される。
【００８９】
ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ又はｐｈａｓｍｉｄ）は，フィラメント状のファージＦｆとプラスミドとのハイブリッドとして開発されたクローニングベクターの１つであり，プラスミドとして繁殖可能なベクターであって，さらに，ウイルス性粒子内で，単一らせん構造をもつＤＮＡとしてパッケージされたベクターを生成するために開発されたものである。プラスミド同様に，ファージミドは，ＤＮＡフラグメントをクローンするために利用可能であるとともに，一連の技術（形質転換，電気穿孔法）で，細菌の宿主に取り込まれることが可能である。しかしながら，ファージミドをヘルパーファージとともに含む細菌の宿主（例えば，ＶＣＳＭ１３やＭ１３Ｋ０７）を感染させることは，必然的にウイルス性の要素をもたらすこととなり，単一らせん構造をもつＤＮＡの複製と，ファージミドＤＮＡをファージ粒子にパッケージングすることとを可能にする。
【００９０】
フィラメント状のファージ
本発明の第３の側面は，本発明による結合タンパク質を含むフィラメント状のファージである。このフィラメント状のファージは，ファージゲノムを含むものであってもよいし，又はファージミドを含むものであってもよい。
【００９１】
ファージは，バクテリオファージとも称されるが，本明細書では，感染用，複製用，及び細菌から隠れるウイルスを意味する。フィラメント状のバクテリオファージ即ちフィラメント状のファージは，単一らせん構造をもつＤＮＡゲノム（ｓｓＤＮＡ）をもつファージであって，そのＤＮＡゲノムは，ファージのコートタンパク質でパッケージングされている。隠されたフィラメント状のファージ粒子は，表現型上，フィラメント状の構造をも持つ。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「フィラメント状のファージ」は，ファージゲノム由来のビリオン及びファージミド由来のビリオンの双方を包含する。
【００９３】
ある実施形態では，結合タンパク質はヘルパーファージによって提供されるため，フィラメント状のファージは，結合タンパク質をコードする遺伝子を含まない。
【００９４】
用語「ヘルパーファージ」は，例えば，ファージミドとして定義された，分離しかつ無関係の欠陥ウイルスを助けるウイルスをいう。ここで，ファージミドは，それ自身内にファージゲノムでも機能性ウイルスでもないが，ファージゲノム由来の１つか複数の要素を含むプラスミドであり，欠陥ウイルスによって既に占有されている同じ宿主細胞を感染させて，欠陥ウイルスがいなくなるとともに完全なその生物としてファージミドを含むサイクルビリオンを形成することが必要なタンパク質を提供することで繁殖するものである。
【００９５】
他の実施形態では，フィラメント状のファージは，本発明による結合タンパク質をコードする核酸を含まない。フィラメント状のファージは，ファージゲノム又はファージミドを含んでもよい。特に好ましくは，ファージが，本発明による結合タンパク質をコードする核酸を含むファージゲノムを含んでいる。
【００９６】
さらに他の実施形態では，本発明のフィラメント状のファージが，さらに，野生型ｐＶＩＩ及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質をコードする遺伝子を含む。すなわち，フィラメント状のファージによってディスプレイされる結合タンパク質の数は，ｐＶＩＩ結合タンパク質に対する野生型ｐＶＩＩの割合を調節することで調整される。そのようなシステムは，野生型ｐＶＩＩタンパク質がヘルパーファージ（７＋７）から又はファージゲノム（７７）上の第２の遺伝子から提供されるかどうかに依存する，７７システム又は７＋７システムであってもよい。
【００９７】
さらに他の実施形態では，フィラメント状のファージは，野生型ｐＶＩＩ遺伝子及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質を含まない。すなわち，フィラメント状のファージは，ｐＶＩＩ結合タンパク質のみを含み，野生型ｐＶＩＩタンパク質を全く含まない。
【００９８】
好ましい実施形態では，フィラメント状のファージは，さらに，ｐＩＩＩ結合タンパク質又はｐＶＩＩＩ結合タンパク質を含む。ライブラリーは，例えば，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩでディスプレイされるとともに，ｐＶＩＩ結合タンパク質は，親和性精製用に，固定化用に，又は，例えばアビジン若しくはアビジン状のマトリクスを用いる検出のために使用可能である。好ましくは，フィラメント状のファージファージは，ｐＩＸタンパク質を野生型の形態でのみ含む。
【００９９】
本発明の第４の側面は，本発明によるフィラメント状のファージのライブラリーであり，当該フィラメント状のファージは，ｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩへ結合する，外来ペプチド又はタンパク質をディスプレイするものである。
【０１００】
ライブラリーは，フィラメント状のファージの１つ又はそれ以上のコートタンパク質の一部として，ペプチドやタンパク質をディスプレイするフィラメント状のファージを収集したものである。そのようなライブラリーは，互いに異なるペプチドやタンパク質をディスプレイするファージを２つ又はそれ以上含むことが可能である。
好ましい実施形態では，ペプチドがｐＶＩＩのところと，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩのところで同時にディスプレイされる。
【０１０１】
他の好ましい実施形態では，ｐＶＩＩでディスプレイされる外来ペプチドが，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ ｔａｇ），Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される。この実施形態では，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩでディスプレイされるペプチドは，ｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩでディスプレイされるペプチドは，好ましくは，ライブラリーの要素である。代替的な実施形態では，ライブラリーの要素は，ｐＶＩＩでディスプレイされる一方，ｐＩＩＩやｐＶＩＩＩは，外来ペプチドをディスプレイする。この場合における外来ペプチドは，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ（Ｓｔｒｅｐ ｔａｇ），Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，アンキリン，ＩｇＮＡＲ又はそのフラグメント，フィブロネクチン又はそのフラグメント，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される。
【０１０２】
ファージディスプレイシステム
本発明の第５の側面は，ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，ヘルパーファージが本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。
【０１０３】
ファージディスプレイシステム，ファージディスプレイ法，ファージディスプレイ技術，又は単にファージディスプレイといった場合，タンパク質−タンパク質間，タンパク質−ペプチド間，及び，タンパク質−ＤＮＡ間の相互作用であって，それらをコードする遺伝子の情報を持つタンパク質を接続するためのバクテリオファージを利用する相互作用に関する発見や研究を行うための方法をさす。
【０１０４】
ディスプレイするタンパク質，又は，ディスプレイされるタンパク質とは，リガンドによる検出又は固定を利用可能なファージのコートタンパク質を結合するタンパク質をさす。
【０１０５】
本発明の第６の側面は，ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，該ファージミドが本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。
【０１０６】
キット
本発明の第７の側面は，ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムを有するキットであって，該ファージミドが本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。このキットは，コード領域においてＮ末端的に複数のクローニングサイトを持つ遺伝子をコードするｐＶＩＩを含むファージミドと，ヘルパーファージ（例えば，Ｍ１３Ｋ０７，ＶＣＳＭ１３，又はその他）とを含む必要がある。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１０７】
本明細書では，キットは，単一の結合タンパク質や二重特異性を持つ結合タンパク質を，ファージディスプレイのライブラリーとして又は単一のファージ粒子として含むファージ粒子を生成するための試薬を収集することを意味する。キットは，ファージミド，ヘルパーファージ，細菌株，及び，試薬やアッセイを記述するためのレシピを含むプロトコルを含むことが可能である。キットは，研究開発，診察用試薬，及び治療用試薬に利用可能である。
【０１０８】
本発明の第８の側面は，ファージゲノムをベースとしたファージディスプレイシステムを含むキットであって，該ファージゲノムが，本発明によるｐＶＩＩ結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。
【０１０９】
このキットは，コード領域においてＮ末端的に複数のクローニングサイトを持つ遺伝子をコードするファージゲノムベクター（Ｍ１３Ｋ０７，ＶＣＳＭ１３，ｆＵＳＥ５（配列ＩＤ番号３０））を含む。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１１０】
本発明の第９の側面は，ｐＩＩＩ結合ファージミドのライブラリーを生成するためのヘルパーファージ，又は，ｐＶＩＩ結合としてのタグを持つ単一のｐＩＩＩ結合ファージミドクローンを生成するためのヘルパーファージを含むキットである。このキットは，捕捉目的及び／又は検出目的に適した短鎖のペプチドをコードする挿入配列を持つ遺伝子をコードするｐＶＩＩを含むヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７，ＶＣＳＭ１３）を含んでいる。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１１１】
本発明の第１０の側面は，ｐＩＩＩとｐＶＩＩの双方の上で結合タンパク質をディスプレイするためのファージゲノムのライブラリーを生成するためのファージゲノムベクターを含んでいる。そのようなキットは，コード領域の各々においてＮ末端的に複数のクローニングサイトを持つｐＩＩＩとｐＶＩＩの双方をコードする遺伝子を持つファージゲノムベクター（Ｆｆ）を含む必要がある。代替的には，キットは，捕捉及び／又は検出に適した短鎖のペプチドをコードするｐＶＩＩにおいてＮ末端的に挿入配列を持つとともに，ｐＩＩＩにおいてＮ末端的に多重化したクローニングサイトを持つファージゲノムベクターを含んでいる必要がある。このキットは，ファージクローンの感染，発現，固定，選択，及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また，このキットは，特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
【０１１２】
本発明の第１１の側面は，以下のステップを含む方法である。
【０１１３】
ａ． 二重特異性を持つファージディスプレイライブラリーを提供するステップであって，該ファージが，第１の位置でディスプレイされるペプチドと，第２の位置にある親和性タグとを含む，ステップ
【０１１４】
ｂ．ターゲットに対して上記ファージディスプレイのライブラリーを選択するステップ
【０１１５】
ｃ． 上記親和性タグの捕捉群に対して上記ファージディスプレイのライブラリーを固定するステップ
【実施例】
【０１１６】
以下，本発明を，非限定的な実施例を用いてさらに詳細に説明する。
【０１１７】
実施例１ ｐＶＩＩに結合するペプチドを持つ改変後のヘルパーファージ
ＦＬＡＧ−ｐＶＩＩ，ＨＩＳ６−ｐＶＩＩ，及びＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩを持つ，改変後のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）とＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２）は，ファージディスプレイ技術の利用の拡大に適した非常に広い可能性を示すものであるが，結合タンパク質がヘルパーファージの機能性を危うくしないことが非常に重要であり，そのため，ファージの滴定量は，重要な検証パラメーターとなる。さらに，ｐＶＩＩに結合するペプチドは，後続の検出及び／又は固定に利用しやすいものでなければならない。この実施例では，ｐＶＩＩ修飾のヘルパーファージが検出目的及び／又は固定目的用のペプチドの多様性をかくまうことが可能であること，並びに，それらの結合タンパク質がファージの伝染性に影響を与えないという事実が支持される。
【０１１８】
ＥｎｄｅｍａｎｎとＭｏｄｅｌによる初期の結果（ＰＭＩＤ：７６１６５７０）では，フィラメント状のファージ（Ｆｆ）のキャプシドタンパク質ｐＶＩＩが外来結合に耐えられないことを示していた一方，その後，ファージミドをベースとしたペプチド（Ｇａｏら，（ＰＭＩＤ：１０３３９５３５））や，ファージゲノムをベースとしたペプチド（Ｋｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉら，（ＰＭＩＤ：１６２７７９８８）），さらには，折り畳まれたドメインディスプレイが，ｐＶＩＩへのＮ末端結合を許容することが示されている。いずれの場合でも，原核生物のシグナル配列又はリーダーペプチドを結合の過度のＮ末端へと付加することによって，結合タンパク質のペリプラズムターゲッティング，ひいては，大腸菌宿主のＳＥＣ経路への結合をターゲッティングすることを必要とすることが成功の鍵であるということが強調される。
【０１１９】
生産的なｐＶＩＩディスプレイは，組み換え型ｐＶＩＩをペリプラズムの区画に運搬することを確保するＮ末端リーダーペプチドをかくまうファージミド上でコードされたＮ末端結合のコンテキスト内で既に示されている（Ｅｎｄｅｍａｎら，１９９５年；Ｇａｏら，１９９９年）。
【０１２０】
しかし，ビリオンに組み込まれる前では，野生型ｐＶＩＩが，Ｎ末端がプリプラズム空間に面するグラム陰性の大腸菌宿主の内膜内で不可欠な膜タンパク質として見いだされることが知られている。また，この膜が結合した，成熟した野生型ｐＶＩＩがそのアミノ末端のホルミル基を保持する（Ｓｉｍｏｎｓら，ＰＭＩＤ：６９４５５７９）が，細胞質の区画の外側で見いだされる，シグナル配列で方向付けられたタンパク質の非常に多くにおいて，例えば，ペリプラズムのリーダーペプチダーゼによってＮ末端的に処理されるようには考えられない（Ｂａｎｅｙｘ及びＭｕｊａｃｉｃ，ＰＭＩＤ：１５５２９１６５）。明確なシグナル配列状のモチーフがｐＶＩＩのＯＲＦ内で同定されることはないので，その細胞質ゾルからペリプラズムへの転座モードは分かりにくいままであるが，おそらく，４種類の主要な分泌機構，すなわち，ＳＥＣ経路，ＳＲＰ経路，Ｔａｔ経路，及びＹｉｄＣ経路を伴わないということである（Ｂａｎｅｙｘ及びＭｕｊａｃｉｃ，ＰＭＩＤ：１５５２９１６５；Ｓａｍｕｅｌｓｏｎら，ＰＭＩＤ：１０９４９３０５）。フィラメント状のファージのビリオンの構造を図１に示す。
【０１２１】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体，並びに，Ｍ２抗体及びＭ５抗体は，それぞれ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ），及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。制限酵素（ＲＥ）は，ＤｐｎＩを除いて，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
（米国，ＭＡ州，Ｉｐｓｗｉｃｈ）から購入し，ＤｐｎＩについては，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から入手した。ＤＮＡオリゴは，ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（ドイツ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入した。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）と，Ｔａｌｏｎ（登録商標）のＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズは，いずれも，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ノルウェー，オスロ）ら購入した。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＰｆｕウルトラＤＮＡと，Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼは，それぞれ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。水溶性ＴＭＢは，Ｃｈａｌｂｉｏｃｈｅｍのものであった。
【０１２２】
細菌株，ファージ
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージは，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入し，また，ＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２）は，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。
【０１２３】
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩ，ＨＩＳ6−ｐＶＩＩ及びＦＬＡＧ−ｐＶＩＩの設計と，インビトロでの突然変異生成
【０１２４】
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）(N−MSGLNDIFEAQKIEWHE−C)の読み取り枠（ＯＲＦ）を，ＧＣＵＡサーバー（http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html）を用いて，大腸菌Ｋ１２株内でコドン利用した場合と比較した。原核生物のコドンを最適化したバージョンであるＡｖｉＴａｇ（登録商標）のペプチド配列（配列ＩＤ番号４）を，製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）にしたがって，ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）によるインビトロでの突然変異生成によって，プライマー対であるＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｆｒｗｄ／ＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｒｅｖ（5’−CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAATGGAGCAGGTC−‘3/5’−GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGACATGTTACTTAGCCGG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号５と配列ＩＤ番号６に相当する。）を用いて，ｐＶＩＩのＯＲＦのＮ末端に取り付けた。上述した方法と同じ方法で，大腸菌Ｋ１２のコドンを最適化したバージョンであるＦＬＡＧタグ（N−DYKDDDDK−C）（配列ＩＤ番号９）と，ＨＩＳ6タグ（N−HHHHHH−C）（配列ＩＤ番号１２）とを，プライマー対であるＦＬＡＧ−ｐＶＩＩ−ｆｒｗｄ／ ＦＬＡＧ−ｐＶＩＩ−ｒｅｖ（5’−
CCGGCTAAGTAACATGGACTACAAAGATGACGATGACAAAATGGAGCAGGTCG−3’/5’−CGACCTGCTCCATTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCCATGTTACTTAGCCGG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号７と配列ＩＤ番号８に相当する。）と，HIS6−pVII−frwd/ HIS6−pVII−rev（5’−CCGGCTAAGTAACATGCATCACCATCACCATCACATGGAGCAGGTCG−3’/5’−CGACCTGCTCCATGTGATGGTGATGGTGATGCATGTTACTTAGCCGG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号１０と配列ＩＤ番号１１に相当する。）とをそれぞれ用いて，ｐＶＩＩのＯＲＦのＮ末端に取り付けた。様々な構造体について，あらゆる場合で，ＤＮＡシークエンス（組織内でのＡＢＩ ｌａｂ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｄｅｐｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｓｌｏ）によって検証した。無菌のベクターバックグラウンドを確保するために，改変後のｐＶＩＩを含むＢｓｒＧＩ／ＳｎａＢＩのＲＥフラグメントを，標準技術を用いて適合ＲＥサイト上でＭ１３Ｋ０７野生型ゲノム又はＶＣＳＭ１３野生型ゲノムのいずれかに移動させた。電気穿孔法を用いて，ＤＮＡ構造体を様々な大腸菌宿主に導入した。プライマーの設計は，ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて，Ｍ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（配列ＩＤ番号３１）の配列とＶＣＳＭ１３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ５９８８２０）（配列ＩＤ番号３２）の配列の配列アライメントをベースとした。改変後のＡｖｉＴａｇ（登録商標）配列，ＨＩＳ６配列，及びＦＬＡＧ配列の配列を図２に示す。
【０１２５】
ファージ粒子の調製
基本的には上述したようにして（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ，ＰＭＩＤ：１６９６０２８），Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）構造体，ＶＣＳＭ１３（配列ＩＤ番号３２）構造体を用いて形質転換した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅからファージを展開した。
【０１２６】
ビオチン化ビリオンによるＳＡビーズの捕捉
【０１２７】
１チューブ当たり１０μｌのストレプトアビジンビーズを，未使用の１．５ｍｌチューブに入れ，ＰＢＳ（ｗ／ｖ）内で５００μｌの２％ＢＳＡを添加した。同様に，ファージを浮遊物がない状態で２５０μｌ，又は適量を，１．５ｍｌチューブに入れ，その後，２５０μｌの２％ＢＳＡを追加した。そして，チューブを，回転ホイール上で，１時間の間，室温（ＲＴ）で培養した。その後，ダイナル（Ｄｙｎａｌ）チューブ磁石ラックを用いてビーズを第１に固定することを３回行うことで，ビーズを洗浄した。浮遊物を処理した後，Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を０．５ｍｌ各チューブに入れた。チューブをラックから取り出して簡単にボルテックスした後，ラックに再度戻した。浮遊物を再度浄化するとともに，２回にわたって洗浄した。チューブをラックから取り外して，２５０μｌの阻害ファージと，２５０μｌのＰＢＳＴを各チューブに添加した。その後，チューブを回転ホイール上で１．５時間／室温下で培養した。チューブを上述したようにＰＢＳＴ内で３回にわたって洗浄した。その後，アンチＭ１３ ＭＡｂ−ＨＲＰを含むＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ：アンチＭ１３ ＭＡｂ−ＨＲＰ＝１：２０００）を０．５ｍｌずつ各チューブに添加して，チューブを回転ホイール上で１時間／室温下で培養した。チューブを上述したようにＰＢＳＴ内で３回にわたって洗浄した。その後，ＡＢＴＳを０．５ｍｌずつ各チューブに添加して，チューブを３０分間作業台上に静置した後，磁石ラックに載置して，１００μｌの浮遊物をＭａｘｉｓｏｒｐの酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）用ストラップ（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｎｕｎｃ）に移動させた。その後，のＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて吸光度をＡ405nmで測定した。
【０１２８】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
【０１２９】
Ｍ２抗体及びＭ５抗体を，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）で，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ４０５ｎｍで読み取った。
【０１３０】
結果
Ａ ヘルパーファージの滴定量
２つのＹＴ各１６ｍｌを未使用のＸＬ１−Ｂｌｕｅ培養液を用いて植菌し，３７℃／２５０ｒｐｍで吸光度Ａ４０５ｎｍが０．４〜０．８となるまで培養した。希釈したファージ調合液各１０μｌを９６ウェルのマイクロタイタープレートに移動させた。１９０μｌのＸＬ１−Ｂｌｕｅ培養液を，ファージ希釈剤を用いて各ウェルに移動させた。プレートを，５０分間／３７℃で培養した。ＢＡ８２／２０膜をＬＢ−ｋａｎ寒天皿の上にかぶせ，１つのサンプル当たり３μｌの体積を膜上に滴下して，皿を３７℃／ＯＮで培養した。コロニーの数を数えた（図３）。
【０１３１】
Ｂ 挿入したペプチドＡｖｉＴａｇ（登録商標）の利用可能性及び機能性
【０１３２】
ＢｉｒＡ酵素は，アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼであって，あらゆる大腸菌内において見いだされる。ファージのコンテキスト内においてそのような細胞にＡｖｉＴａｇ（登録商標）を導入した場合，内在するＢｉｒＡによるターゲットのビオチン化のレベルが低い（〜７％）という結果となることが確かに示されている（Ｓｈｏｌｌｅら，ＰＭＩＤ：１６６２８７５４）。Ｎ末端のｐＶＩＩ改変が，ビリオンが集合してＢｉｒＡに対する酵素の基質として機能するという点に関して実際に機能的であるかどうかを試験するために，我々は，結果的に生じるビリオンを，ＳＡでコートした磁気ビーズを用いて未処理の不純物から捕捉可能であるかどうかを試験した。
【０１３３】
ダイナルストレプトアビジンビーズによるＭ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ｐＶＩＩの捕捉。以下２種類のファージを試験に用いた。宿主と野生型Ｍ１３Ｋ０７に由来する，内在ＢｉｒＡを用いてインビボでビオチン化したＭ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）。その結果は，特定のＳＡを捕捉する一方で，Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）が結合しないということを明らかに示すものであった。したがって，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩ結合は，野生型ビリオンとしてビリオンに適合するとともに，一方でＮ末端のＡｖｉＴａｇ（登録商標）がＢｉｒＡ酵素に到達可能であり，かつ，ビオチン化に適した基質として認められる，という意味で実際に機能的でなければならない（図４）。
【０１３４】
ＦＬＡＧタグ
酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）試験を実施すると，２種類のアンチＦＬＡＧ抗体Ｍ２及びＭ５によるファージの捕捉によって，Ｍ１３Ｋ０７（配列ＩＤ番号３１）内でのｐＶＩＩ結合としてＦＬＡＧタグの可触性が示される。試験結果には，野生型Ｍ１３Ｋ０７，Ｍ１３Ｋ０７−Ｈｉｓ，及びＭ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）が含まれている（図５）。
【０１３５】
ＨＩＳタグ
Ｍ１３Ｋ０７−ＨＩＳ６とＶＣＳＭ１３−ＨＩＳ６の双方について，ダイナルタロンビーズ（ＤｙｎａｌＴａｌｏｎ Ｂｅａｄｓ）（ＩＭＡＣ ｍａｔｒｉｘ）に対する特定の結合を試験した。
簡単には，Ｔａｌｏｎビーズは，２％ＢＳＡを用いた３０分間の回転培養によって阻害された。ビーズを，洗浄した後，ビーズに対してＢＳＡを阻害するファージ浮遊物に一致する２５０μｌの滴下量（これは，２×１０１０ｃｆｕｋａｎＲ／ｍｌに相当する。）を添加し，さらに，ビーズを回転ホイール上で，３０分間／室温下で培養した。ＰＢＳＴ中のビーズを洗浄した後，アンチＭ１３ＭＡｂ−ＨＲＰ（希釈後で１：２０００）を各チューブに添加し，チューブをさらに，回転ホイール上で，４５分間／室温下で培養した。洗浄後，ＡＢＴＳを各チューブに添加して，１５分間室温下で培養し，その後，磁石ラックに載置した。体積で１００μｌの各溶液を，ＭａｘｉｓｏｒのＥＬＩＳＡストラップに移動させた。ＴＥＣＡＮのＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて，吸光度をＡ４０５ｎｍで測定した。その結果は，ＨＩＳ６−ｐＶＩＩを含むビリオンがＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズに対して選択的に結合することを確実に示している。試験の最適化によって克服可能であるシグナルが低いにも関わらず，コグネートビリオンのＮｉ−ＮＴＡマトリクスに対する異なる結合が確かに存在する。この特別なｐＶＩＩ結合の最も魅力的な用途は，例えばスピンコラムと組み合わせたＮｉ−ＮＴＡ精製に関してそれを引き出すという将来性にあるだけでなく，サイト特異性にあり，それによって，相同性があるとともに方向性のあるＮｉ−ＮＴＡマトリクスの固定にある（図６）。
【０１３６】
実施例２ ファージミドのパッケージング内での改変後のヘルパーファージの機能性
【０１３７】
本発明では，改変後のヘルパーファージを，ｐＶＩＩよりも，好ましくはｐＩＩＩやｐＶＩＩＩにおいて，ファージのコートタンパク質上で折り畳まれたドメインをディスプレイするファージミドの機能的なパッキングを行うために使用することが約束される。以下の実施例では，ｐＶＩＩに結合した互いに異なるペプチドを持つ改変後のヘルパーファージがファージミドの機能的なパッキングを実現可能であること，並びに，それらファージミドが，機能的なｐＶＩＩペプチド結合だけでなく，ｐＩＩＩコートタンパク質に結合した機能的な折り畳みドメインの双方をディスプレイすることが支持される。このようにして，本実施例は，ファージミドを利用することで二重特異性を持つディスプレイにも役立つこととなる。
【０１３８】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体，並びに，Ｍ２抗体及びＭ５抗体は，それぞれ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ），及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。また，Ｆ２３．２抗体とＧＢ１１３抗体は，Ｂ．Ｂｏｇｅｎ教授（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ノルウェー，オスロ）からの親切な贈呈物である。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）は，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ノルウェー，オスロ）ら購入した。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＢＳＡに接合するハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）は，他の文献（Ｍａｋｅｌａら，ＰＭＩＤ：７２２２４３）でも説明されているように基本的には購入した。
【０１３９】
細菌株，ファージ，及びファージミド
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージは，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９），ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）選択性を持つｓｃＦｖをかくまうファージミドは，Ａｆｆｉｔｅｃｈ ＡＳ（ノルウェー，オスロ）から親切にも提供を受けたものである。ｐＦＫＰＤＮ−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１（配列ＩＤ番号２８）は，Ｌｏｓｅｔらの文献（２００７年，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）において記述されている。
【０１４０】
ファージ粒子の調製
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージとビリオンアッセンブリーを使用することによる大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅからのファージミドレスキューを，Ｗｅｌｓｃｈｏｆらの文献（ＰＭＩＤ：９０５０８７７）やＫｏｃｈらの文献（ＰＭＩＤ：１１１２６１２０）に記載されているような滴下滴定によってモニターした。
【０１４１】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
ＭＡｂ Ｍ２，Ｍ５，Ｆ２３．２，ＧＢ１１３，ｐｈＯｘ−ＢＳＡを，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）又はＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ405nmで読み取った。
【０１４２】
結果
Ａ ヘルパーファージの滴定量
互いに異なる折り畳みドメインを持つ２種類のファージミドとして，それぞれ，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖをｐＩＩＩ結合としてディスプレイする，ｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１と，ｐＳＥＸ−ｓｃＦｖ ａｎｔｉ−ｐｈＯｘとを採用した。双方を，３種類の修飾が施された野生型Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いてパッケージングした。簡略的には，２種類のファージミドクローンの終夜にわたる培養物を，修飾が施された野生型ヘルパーファージで感染させた。培養後，培養物を遠心分離して，細菌のペレットを，ＹＴメディア内でアンピシリンとカナマイシンとを用いて再懸濁させ，さらに，３０℃でオンとして培養を行った。大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅをファージ希釈液で感染させて，それぞれ，アンピシリンプレート上及びカナマイシンプレート上に載置し，ファージミド及びヘルパーファージの滴定を行った（図７）。
【０１４３】
パッケージングされたファージミドの双方は，高い比率を示すことが分かり，このことは，３種類の修飾が施されたＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージフォーマットによって，成功的でかつ機能的なパッケージングを示している。
【０１４４】
Ｂ ファージミドｐＩＩＩディスプレイ内におけるヘルパーファージによって提供されたｐＶＩＩの機能性
【０１４５】
ｐＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ディスプレイ：ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩの機能に関して，ビーズ上でのＳＡ捕捉を，基本的には実施例１で説明したのと同様に行った。シグナルは低かったが，ビリオンを含むＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩの特異的な異なる捕捉が確かに確認された（図８）。陽性コントロール（挿入図）と比較すると，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩ結合をかくまった場合において，ファージミドビリオンに関するビオチン化のレベルがＭ１３Ｋ０７ビリオンに関するものよりも低いことが明らかである。しかし，内在するＡｖｉＴａｇ（登録商標）のファージのコンテキスト内におけるビオチン化は，３７℃では，７％までの範囲内に過ぎない（Ｓｃｏｌｌｅら，ＰＭＩＤ：１６６２８７５４）。Ｍ１３Ｋ０７−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）は３７℃で確かにパッケージングされるが，ファージミドレスキューは，たったの３０℃でなされる。このことは，観測される差異が，温度が低いほど，内在するＢｉｒＡのｓｅｅ当たり（ｐｅｒ ｓｅｅ）の活性が低いことに起因しているということを強く示唆している。したがって，将来的な利用としては，この特徴を引き出すために，ビリオンのビオチン化効率を高くしなければならない。このことは，ビリオンのインビトロでのビオチン化によって都合よく実現することができ，それにより，標準技術を利用してビオチン化を１００％に近くするべきである（Ｓｃｏｌｌｅら，ＰＭＩＤ：１６６２８７５４）。それに代えて，ＢｉｒＡ酵素を過剰に発現させることで，インビボでビオチン化を行うことも可能である。大腸菌の超形質転換によって，ファージミドゲノムベクターやファージゲノムベクターが同一の細胞内に存在するようなことが標準のプラスミドによってビリオンへとパッケージングされて，その結果，遺伝子型−表現型のつながりを失う可能性があることが知られている。このことは，ＢｉｒＡがプラスミドから過剰に発現した場合にあり得るものである。単一のクローンを評価する上では，上記のことは認容可能であるかもしれないが，この手法を連結可能なレパートリーと組み合わせる場合には，パンニング間で回復する表現型の変異株を失うことにつながる可能性があるので認容可能ではない。それに代えて，大腸菌ＭＣ１０６１由来のＡＶＢ１００の株（Ａｖｉｄｉｔｙ，米国，ＣＯ州）で提供可能な染色体の組み換えによって，ＢｉｒＡを過剰に発現させることが可能である。ただし，その株は，プラスミドシステムに不可欠なＦ線毛構造をコードするＦプラスミドが欠損している。しかし，ＡＶＢ１００は，ヘルパーファージの補完の必要がないファージゲノムベクターに直接的に適合可能である。そこで，我々は，ＡＶＢ１００株を，修飾が施されたＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージと組み合わせてファージミドベースの適切なファージディスプレイに採用するために，標準接合によって，ＡＶＢ１００をＸＬ１−Ｂｌｕｅとを交配させた（実施例５）。
【０１４６】
ｐＶＩＩ−ＦＬＡＧディスプレイ
ＥＬＩＳＡ試験を実施することで，ｐＶＩＩ結合としてのＦＬＡＧタグの可触性が，２種類の互いに異なるファージミド由来のビリオンについて示された。図９Ａは，ｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１に関するものであり，２種類のアンチＦＬＡＧ抗体Ｍ２とＭ５によってファージミドビリオンを捕捉することで得られたものである。図９Ｂは，ｐＳＥＸ−ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘに関して同様にして得られたものである。簡略的に説明すると，抗体を，４℃でオンの状態で，ＥＬＩＳＡプレート上でコートした。プレートを洗浄した後，ファージミド調合液をプレート上で２時間にわたって室温下で培養した。プレートを洗浄後，さらに，アンチＭ１３ ＨＲＰを組み込んだ抗体で培養した。プレートの洗浄，水溶性ＡＢＴＳの添加，室温下／３０分間での培養を経てシグナルが展開された（図９）。
【０１４７】
Ｍ１３Ｋ０７−ＦＬＡＧでパッケージングされたファージミド由来のビリオンに関しては反応性にＦｌＡＧ特異性があるが分かる一方で，他のサンプルの全てにおいては否定的であった。すなわち，パッケージングされたファージミド由来のビリオンは，ＦＬＡＧタグをｐＶＩＩ結合の機能性としてディスプレイする。
【０１４８】
Ａ．ｐＩＩＩファージミドディスプレイの機能性
２種類の互いに異なるファージミド由来のビリオンとしてのｐＦＫＰＤＮｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１，及びｐＳＥＸ−ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘの双方は，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）をディスプレイするものであり（図１０），ＦＬＡＧタグをディスプレイするものであり（図１１），さらに，ＨＩＳ６タグをディスプレイするものであり（図１１），これらは，それぞれ，ｓｃＴＣＲ及びｓｃＦｖとｐＩＩＩとの結合の機能的なディスプレイを試験したものである。
【０１４９】
特定のターゲットによるファージミドビリオンを捕捉することにより，ＥＬＩＳＡ試験を実施した。ターゲットは，ｓｃＴＣＲに結合するＭＡｂ ＧＢ１１３と，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）に対するｐｈＯｘ−ＢＳＡである。ＢＳＡを阻害物として用いるとともに，野生型Ｍ１３Ｋ０７でレスキューされたファージミドをコントロールとして用いた。簡略的に説明すると，ターゲットをＥＬＩＳＡプレート上で，４℃オンの状態でコートした。そのプレートを洗浄した後，ファージミド調合液をプレート上で２時間にわたって室温下で培養した。プレートを洗浄し，さらに，アンチＭ１３ ＨＲＰ組み込み抗体で培養した。シグナルがＡＢＴＳとともに展開し，室温下／３０分間培養し，その後，吸光度をＡ405nmで測定した（図１０及び図１１）。
【０１５０】
結果から分かることは，パッケージングされたファージミドの全てにおいてコグネートＡｇ反応性があるということである。つまり，この分析によって，改変後のヘルパーファージがｐＩＩＩディスプレイに影響を与えるものではなく，完全に同一のビリオン上でｐＶＩＩタンパク質に所定の表現型を与えるに過ぎない，ということが裏付けられる。
【０１５１】
実施例３ ｐＩＩＩ及びｐＶＩＩ上でのゲノムのファージディスプレイ
本発明は，ｐＶＩＩタンパク質上でのディスプレイの性質を用いてゲノムのファージベクターの産生を許容するものである。そのようなディスプレイは，ビリオンの伝染性に影響を与えるものではない。さらに，本発明は，二重特異性を持つディスプレイをｐＶＩＩ及びｐＩＩＩ／ｐＶＩＩＩ上で，又は，３種類全てのコートタンパク質上でいっせいに促進させるものである。以下の実施例は，繁殖，ビリオンアッセンブリー，ビリオン集積，ｐＩＩＩディスプレイの表現型に関して，構造体が完全に野生型ファージのように振る舞うこと，並びに，ｐＶＩＩペプチド結合でインビボでのビオチン化が選択的に確実に行われることを示すものである。
【０１５２】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Molecular cloning: a
laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press)）で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体は，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。また，Ｆ２３．２抗体とＧＢ１１３抗体は，Ｂ．Ｂｏｇｅｎ教授（Institute of Immunology，ノルウェー，オスロ）からの親切な贈呈物である。制限酵素（ＲＥ）は，ＤｐｎＩを除いて，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（米国，ＭＡ州，Ｉｐｓｗｉｃｈ）から購入し，ＤｐｎＩについては，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から入手した。ＤＮＡオリゴは，ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（ドイツ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入した。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）は，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ノルウェー，オスロ）ら購入した。ｄｍ5ＣＴＰは，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（カナダ，バーリントン）からのものを用いた。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＰｆｕターボＤＮＡポリメラーゼとＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼは，それぞれ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲクリーンアップキットは，Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）からのものを使用した。
【０１５３】
細菌株，ファージ，及びファージミド
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。また，大腸菌株ＭＣ１０６１及びＫ９１Ｋは，Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ博士（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，米国）からの親切な贈呈物である。ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９），ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）選択性を持つｓｃＦｖをかくまうファージミドは，Ａｆｆｉｔｅｃｈ ＡＳ（ノルウェー，オスロ）から親切にも提供を受けたものである。ｆＵＳＥ−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１ ｐＩＩＩディスプレイベクターは，Ｌｏｓｅｔらの文献（２００７年，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）において記述されている。
【０１５４】
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩの設計と，インビトロでの突然変異生成
ＡｖｉＴａｇ（登録商標）(N−MSGLNDIFEAQKIEWHE−C)の読み取り枠（ＯＲＦ）を，ＧＣＵＡサーバー（http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html）を用いて，大腸菌Ｋ１２株内でコドン利用した場合と比較した。原核生物のコドンを最適化したバージョンであるＡｖｉＴａｇ（登録商標）のペプチド配列を，製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）にしたがって，ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）によるインビトロでの突然変異生成によって，プライマー対であるＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｆｒｗｄ／ＢｉｒＡ−ｐＶＩＩ＿ｒｅｖ（５’−CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAATGGAGCAGGTC−‘３／５’−GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGACATGTTACTTAGCCGG−３’）（それぞれ，配列ＩＤ番号５と配列ＩＤ番号６に相当する。）を用いて，ｐＶＩＩのＯＲＦのＮ末端に取り付けた。無菌のベクターバックグラウンドを確保するために，改変後のｐＶＩＩを含むＢｓｒＧＩ／ＳｎａＢＩのＲＥフラグメントを，標準技術を用いて適合ＲＥサイト上で，修飾が施されていないｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１ゲノムへとクローン化した。電気穿孔法を用いて，ＤＮＡ構造体を大腸菌ＭＣ１０６１に導入した。プライマーの設計は，公開されているｆＵＳＥ５の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２１８３６４）（配列ＩＤ番号３０）をベースとした。
【０１５５】
新規なゲノムのｐＶＩＩディスプレイベクターｐＧＶＩＩ及びｐＧＶＩＩΔＬの構造体
【０１５６】
プライマーの設計とベクターアッセンブリーは，基本的には，ＳｅａｍＬｅｓｓプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）で記述されているように実行した。ＶＣＳＭ１３ゲノムＤＮＡ（配列ＩＤ番号３２）をテンプレートとして用いるとともに，プライマー対であるＶＣＳＭ１３＿Ｆ／ＶＣＳＭ１３＿Ｒ（5’−ATCTCTTCCATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGG−3’/5’−ATCTCTTCCATGTTACTTAGCCGGAACGAGGCGCAGAC−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号１９と配列ＩＤ番号２０に相当する。）を用いて，ＳｅａｍＬｅｓｓプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）で記述されているように，Ｐｆｕターボポリメラーゼで完全なゲノムをＰＣＲ増幅した。同様に，ｐＳＥＸ８１ΔＬ（実施例４で後述する）と，ｐＳＥＸ（配列ＩＤ番号２９）は，いずれも，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）ユニットをかくまうものであるが，これらを，ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ，ノルウェー，オスロ）をそれぞれ，プライマー対であるｐＧＡＬＤＬ＿Ｆ／ｐＧＡＬ＿Ｒ（5’−TCTCTTCACATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG−3’/5’−ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号２２と配列ＩＤ番号２３に相当する。）及びプライマー対であるｐＧＡＬ＿Ｆ／ｐＧＡＬ＿Ｒ（5’−ATCTCTTCACATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGC−3’/5’−ATCTCTTCCCATTCTGATATCTTTGGATCCAGCGGCCGCAC−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号２１と配列ＩＤ番号２３に相当する。）とともに用いながら，標準ＰＣＲにおけるテンプレートとして用いて，ｓｃＦｖユニットを増幅させた。ＰＣＲに続いて，３種類全てのセグメントを，ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）とＥａｒＩで温浸したＲＥとを用いて精製した。その後，ＲＥ温浸後のゲルゲル精製セグメントを結合して，標準技術を用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅへと電気穿孔処理した。コロニーを拡大させて，挿入サイズが正しいことを，プライマー対であるｐＶＩＩ＿ｆｒｗｄ／ｐＶＩＩ＿ｒｅｖ（5’−AGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGG−3’/5’−GCAGCGAAAGACAGCATCG−3’）（それぞれ，配列ＩＤ番号２４と配列ＩＤ番号２５に相当する。）を用いながら標準ＰＣＲでのＰＣＲスクリーニングによって，検証した。ゲノムのｐＶＩＩディスプレイベクターは，ｐＧＶＩＩ（これは，シグナル配列依存のｓｃＦｖ−ｐＶＩＩディスプレイを持つ）と，ｐＧＶＩＩΔＬ（これは，シグナル配列を持たないｓｃＦｖ−ｐＶＩＩディスプレイを持つ）を示した。これらは，このとき，ｓｃＦｖのＯＲＦを，ｐＶＩＩに対するイン・フレーム型の結合Ｎ末端として含み，その開始コドンの位置が，通常の転写や翻訳に重要なｐＶのＯＲＦの上流に対して正しい位置にあることが維持されている。特に，これらファージゲノムベクターのアッセンブリーを，３段階のＰＣＲアッセンブリーであって，外来ＯＲＦが，ベクターバックボーンと相補的な５’プライマータグ突出部で増幅されたＰＣＲであるアッセンブリーで容易に構成可能であり，これにより，挿入サイトをカバーするベクターの５’部位と３’部位から増幅された相補的なセグメントとともにＳＯＥ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を行うＰＣＲでスプライシングが可能となる。ファージゲノムの理想的な部位は，２つの固有なＲＥサイトＢｓｒＧＩ／ＳｎａＢＩを含むセグメントをカバーしている必要があり，それらサイトは，Ｆｆゲノムの全てにおいて側面にあるｐＶＩＩのＯＲＦにある。そして，ＲＥ温浸後のＳＯＥ生成物は，例えば実施例１や実施例３で説明したように，ＲＥ温浸後のベクターの相補的なバックボーンに都合よく挿入可能である。利用しやすい他のアッセンブリー手段は，１つのポットでアニール処理して，結合し，さらに側面にあるプライマーで増幅されたＰＣＲを行うことが可能な短鎖の重複オリゴヌクレオチドを全面的に用いて適切な結合ＯＲＦの人工的な遺伝子アッセンブリーを生成することである。このストラテジーは，ＳＯＥ手法におけるものと同一のフラグメントを与えることが可能であるか，又は，ファージゲノムへの挿入が，例えば，Ｔｉｌｌｅｔｔ及びＮｅｉｌａｎの文献（ＰＭＩＤ：１０４８１０３８）で説明されているような組み換えに基づくことが可能なＲＥ独立となり得る。また，複数の技術の組み合わせも容易に想定できる。
【０１５７】
ファージ粒子の調製
基本的にはＳｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈの文献（ＰＭＩＤ：１６９６０２８）で説明されているようにして，ｆＵＳＥ５ファージを，大腸菌ＭＣ１０６１から増幅した。ビリオンアッセンブリーを，Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈの文献（ＰＭＩＤ：１６９６０２８）及びＫｏｃｈらの文献（ＰＭＩＤ：１１１２６１２０）に記載されているように滴下滴定によってモニターした。当てはまる場合には，Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）で説明されているように，ＰＥＧ／ＮａＣｌの滴下によってビリオンの精製と濃縮を行った。
【０１５８】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
Ｆ２３．２抗体及びＧＢ１１３抗体を，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）で，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ405nmで読み取った。
【０１５９】
Ａ ｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）ゲノムファージの滴定量
【０１６０】
野生型の，又はｐＶＩＩ改変後のｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１バージョンはいずれも，任意の宿主毒性を呈することがない。ビリオン産生やＰＥＧ滴下効率に関して，ｐＶＩＩ改変後のｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１バージョン間には表現型の差異がない。ｐＶＩＩ改変後のｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１バージョンの双方は，ｆＵＳＥ５システムにふさわしい，理論的な滴下量の最大値に近い値をとる（図１２）。
【０１６１】
Ｂ ｆＵＳＥ５−ＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）結合ペプチドの機能性
【０１６２】
このＥＬＩＳＡ分析は，ゲノムのファージ調合液の機能性を試験するためのものであり，具体的には，ストレプトアビジンビーズでビリオンを捕捉し，続いて，アンチＭ１３抗体で結合ファージを検出することで試験を行うためのものである。簡略的に説明すると，ＭｙＯｎｅストレプトアビジンダイナビーズをＢＳＡで阻害し，洗浄し，（ｓｃＴＣＲ／ｐＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標））がある場合と，（ｓｃＴＣＲ／ｐＶＩＩ）ｐＶＩＩ−ＡｖｉＴａｇ（登録商標）結合ペプチドがない場合について，滴定標準サンプルのｆＵＳＥ５を用いて培養した。ビーズを洗浄するとともに，結合ファージをアンチＭ１３−ＨＲＰ組み込み抗体で検出した。ＡＢＴＳの添加につれてシグナルが展開し，ＴＥＣＡＮのＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて吸光度Ａ405nmを測定した。その結果は，ｐＶＩＩ−ＢｉｒＡペプチドが可触性であるとともに，ビオチン化されており，そのために，ファージゲノム由来のビリオンに対する固定・検出タグとして機能することを示している（図１３）。
【０１６３】
Ｃ ｆＵＳＥ５−ｓｃＴＣＲ ｐＩＩＩ結合の機能性
【０１６４】
このＥＬＩＳＡ分析は，ゲノムをコードするＡｖｉＴａｇ（登録商標）−ｐＶＩＩがある場合とない場合における，ファージゲノム由来のビリオン調合液のｐＩＩＩ結合の機能性を試験するためのものである。２種類の互いに異なる抗体であって，それぞれ，ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１と，ＭＡＢ ＧＢ１１３及びＦ２３．２を認識する抗体を用いてファージビリオンを捕捉することでＥＬＩＳＡ試験を実施した。スキムミルクをネガティブコントロールとして使用した。簡略的に説明すると，抗体をＥＬＩＳＡプレート上で，オンの状態でかつ４℃でコートした。そのプレートを洗浄するとともに，ファージ滴定用の規定調合液をプレート上で２時間にわたって室温下で培養した。そのプレートを洗浄した後，さらに，アンチＭ１３−ＨＲＰ組み込み抗体で培養し，その後，１００μｌのＡＢＴＳを添加して室温で培養した。２０分後に，ＴＥＣＡＮのＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて吸光度を，ＯＤ405nmで測定した。その結果は，２種類のｆＵＳＥバージョンの間ではｓｃＴＣＲ表現型を区別することができないことを示している。したがって，どのような観点からも，ｐＶＩＩ改変は，ファージの表現型には影響を与えるようには思われない（図１４）。
【０１６５】
実施例４ ｐＶＩＩ上でのファージミドディスプレイ
【０１６６】
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチＭ１３−ＨＲＰ抗体は，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。ＧＢ１１３抗体は，Ｂ．Ｂｏｇｅｎ教授（Institute of Immunology，ノルウェー，オスロ）からの親切な贈呈物である。制限酵素（ＲＥ）は，ＤｐｎＩを除いて，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
（米国，ＭＡ州，Ｉｐｓｗｉｃｈ）から購入し，ＤｐｎＩについては，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から入手した。ＤＮＡオリゴは，ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（ドイツ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入した。ダイナビーズＭｙＯｎｅ（登録商標）（ストレプトアビジン磁気ビーズ）と，Ｔａｌｏｎ（登録商標）のＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズは，いずれも，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （ノルウェー，オスロ）ら購入した。ＢＳＡとＴｗｅｅｎ２０は，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ノルウェー，オスロ）から購入した。ＰｆｕターボＤＮＡは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。ＢＳＡに組み込まれるハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）及び５−ニトロフェンアセチル（ＮＩＰ）は，他の文献（Ｍａｋｅｌａら，ＰＭＩＤ：７２２２４３；Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎら，ＰＭＩＤ：２１２５３６２）でも説明されているように基本的には調製した。イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（カナダ，バーリントン）から購入した。
【０１６７】
細菌株，ファージ，及びファージミド
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅは，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）から購入した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージは，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ（スウェーデン，Ｕｐｐｓａｌａ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合された２−フェニルオキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）選択性を持つｓｃＦｖをかくまう，ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）ファージミドは，Ａｆｆｉｔｅｃｈ ＡＳ（ノルウェー，オスロ）から親切にも提供を受けたものである。ｐＦＫＰＤＮ−ｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１のｐＩＩＩディスプレイファージミドは，他の文献（Ｌｏｓｅｔら，２００７年，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）において記述されている。ｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）（未公開）をかくまう原核生物発現ベクターｐＳＧＩは，ｐＨＯＧ２１（Ｋｉｐｒｉａｎｏｖら，ＰＭＩＤ：９００５９４５）に基づいているとともに，ｐＬＮＯＨ２及びｐＬＮＯＫ（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら，ＰＭＩＤ：９２０２７１２）に由来する抗体バリアブル遺伝子から社内的に製造されたものである。
【０１６８】
新規なｐＶＩＩディスプレイファージミドベクターｐＧＡＬＤ７及びｐＧＡＬＤ７ΔＬの構造体
ベクターバックボーン用の開始テンプレートとして，上述したｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）ファージミドを選択した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４５８４）。まず，このベクター内のストレッチ（ｓｔｒｅｃｈ）をコードする原核生物のｐｅｌＢシグナル配列（N−MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA−C）（配列ＩＤ番号３３）を除去するために，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）を利用して，プライマー対であるａ４１ｇ−ｆｒｗｄ／ａ４１ｇ−ｒｅｖ（5’−AGAGGAGAAATTAACCATGGAATACCTATTGCCTACGGC−3’/5−GCCGTAGGCAATAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT−3’）（これらは，それぞれ，配列ＩＤ番号１３，及び配列ＩＤ番号１４に相当する。）を用いたインビトロでの突然変異生成で，ＮｃｏＩのＲＥサイトをＮ末端の極端に導入し，それにより，ｐｅｌＢのＯＲＦの第２コドン内にある第１のヌクレオチドを，ＡからＧに変化させた。突然変異生成に続いて，ベクターをＮｃｏＩ温浸し，再結合させ，その後，プライマー対であるｐＨＯＧ＿ＥｃｏＲＩ＿ｆｒｗｄ／ｓｃＴＣＲ＿ｒｅｖ（5’−TAGCTCACTCATTAGGCACCC−3’/5’−TTTGGATCCAGCGGCCGC−3’）（これらは，それぞれ，配列ＩＤ番号１５，及び配列ＩＤ番号１６に相当する。）を用いて，ベクターの関連部分を回復させる第２のＰＣＲでのテンプレートとして用いた。その後，そのＰＣＲのフラグメントを，標準技術を用いて，ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩのＲＥサイト上で，原型のｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）に移動させ，ＤＮＡシークエンシングで確認した。このステップにより，ｐｅｌＢシグナル配列をコードする部分を完全に除去したが，通常の転写と翻訳に重要であるだけでなく，原形のｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）内に見られるＮｃｏＩ／ＮｏｔＩのＲＥサイトで定義される外来配列の前にたった１つのＡｌａ残渣を付加するのに重要なｌａｃＰＯ及びシャイン−ダルガノ配列（ＳＤ）のために開始コドンとその関連位置を維持した。その新しい構造体をｐＳＥＸ８１ΔＬで示す。第２に，５’端部でＲＥタグ化されたプライマー対であるｐＶＩＩ＿ＥｃｏＲＶ／ ｐＶＩＩ＿ＮｈｅＩ（5’−ATATGATATCAGAATGGAGCAGGTCGCGGATTTCG−3’/5’−ATATGCTAGCTTATCATCTTTGACCCCCAGCGATTATACC−3’）（これらは，それぞれ，配列ＩＤ番号１７，及び配列ＩＤ番号１８に相当する。）を用いて，ｐＶＩＩをコードする配列をＭ１３Ｋ０７から増幅した。その後，このＰＣＲのフラグメントを，適合ＲＥサイト上で，ｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）ファージミドとｐＳＥＸ８１ΔＬファージミドの双方に移動させ，これにより，双方においてｐＩＩＩをコードする領域を交換し，結果として，原型のｐＳＥＸ８１（配列ＩＤ番号２９）内で，ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩを定義するカセットのＮ末端イン・フレーム型ｐＶＩＩ結合がもたらされた。これらの新しい構造体をＤＮＡシークエンシングで確認して，それぞれ，ｐＧＡＬＤ７及びｐＧＡＬＤ７ΔＬとした。それぞれ，ｐＦＫＰＤＮ及びｐＳＧ１からのｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１及びｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）ユニットを用いて，上述したような様々なファージミド内でｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）ユニットを切り替えるために，標準技術を用いて，ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩのＲＥサイトを定義するカセット交換を行った。本明細書で説明するファージミドの全てを，標準技術を用いた電気穿孔法で，大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入した。
【０１６９】
ファージ粒子の調製
Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージとビリオンアッセンブリーを用いたＸＬ１−Ｂｌｕｅの大腸菌ファージミドレスキューを，上述したように滴下滴定でモニターした（Ｗｅｌｓｃｈｏｆら，ＰＭＩＤ：９０５０８７７，及びＫｏｃｈら，ＰＭＩＤ：１１１２６１２０）。
【０１７０】
ファージ捕捉用の酵素をリンクした免疫吸収剤による試験（ＥＬＩＳＡ）
ＭＡｂ ＧＢ１１３，ｐｈＯｘ−ＢＳＡ，又はＮＩＰ−ＢＳＡを，ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでの濃度で，ｐＨ７．４で，かつ４℃で終夜にわたって，ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）のマイクロタイタープレートウェル（デンマーク，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｎｕｎｃ）に吸収させた。ウェル（ｗｅｌｌ）は，ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のスキムミルク（脱脂粉乳）又はＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで，室温下で１時間にわたって阻害された。その後，添加されて，１〜２時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を，捕捉されるビリオンがアンチＭ１３−ＨＲＰ（１：５０００）で検出されるまで室温下で１時間にわたって行った。各ステップ間で，ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルは，ＡＢＳＴ基質で展開され，３０分後に吸光度をＡ４０５ｎｍで読み取った。
【０１７１】
結果
【０１７２】
上述したような改変後のヘルパーファージからの結果によって，折り畳まれたドメインのｐＶＩＩディスプレイも評価されることとなる。Ｇａｏら及びＫｗａｓｎｉｋｏｗｓｋｉらは，そのようなディスプレイは，シグナル配列を方向付けるペリプライマズムターゲッティングと組み合わせて利用される場合に許容されることを示してきたが，我々は，ｐＧＡＬＤ７及びｐＧＡＬＤ７ΔＬとした新規な２種類のファージミドを構築し，それらによって，そのようなシグナル配列を用いた場合も用いない場合でもＮ末端ｐＶＩＩディスプレイを可能にする（図１５）。
【０１７３】
初期構造体は，ヒトの抗体のバリアブルセグメントとハプテン共役型（ｃｏｎｊｕｃａｔｅ）ｐｈＯｘ−ＢＳＡに関する生物種とに基づいたｓｃＦｖユニットを含んでいた。既に説明したｐＶＩＩ改変後のヘルパーファージに関して，ｓｃＦｖのｐＶＩＩディスプレイは，正常なビリオンアッセンブリーに干渉を与えない必要がある。そこで，我々は，これらのｓｃＦｖアンチｐｈＯｘのｐＶＩＩディスプレイファージミドのパフォーマンスの比較を，標準のファージミドレスキューと材料及び方法で説明したような滴定を利用して，シグナル配列を用いた場合及び用いない場合について行うとともに，標準のｐＩＩＩディスプレイについてもシグナル配列を用いた場合及び用いない場合について行った（図１８）。
【０１７４】
滴定結果は，ファージミドを含むビリオンが全ての場合において生成されることを確かに示している。ただし，ｐＶＩＩΔＬファージミドは，標準のｐＩＩＩディスプレイに比べて，約３０ホールド（ｆｏｌｄ）分少ない滴下量である一方，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイでは，総計で１０5ホールド分の減少が認められた。このシステムにおけるヘルパーファージからｐＶＩＩの野生型相補性が認められるように，この結果は，意外なものであるとともに重要なものである。その理由は，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイ（ｐＶＩＩ）がビリオンアッセンブリー処理に深刻な干渉を与えるが，一方で，その効果は，シグナル配列がないｐＶＩＩディスプレイ（ｐＶＩＩΔL）の場合，ほんのわずかである。相対的に，ｐＩＩＩディスプレイについてシグナル配列を用いた場合と用いない場合とで，滴定量の差異はほんのわずかである。
【０１７５】
上述したように決定した滴定量に基づくと，ｐｈＯｘ−ＢＳＡ種のＥＬＩＳＡにおいて滴定量を規定化した投入量の場合，これらビリオンサンプルに関するｓｃＦｖディスプレイの機能性は，ファージミド滴定量として希釈されていないものを用いた場合のｐＧＡＬＤ７由来のサンプルを除くと，非常に低いと評価された（図１７）。
【０１７６】
上記結果は，機能性ｓｃＦｖは，シグナル配列なしのｐＶＩＩバージョンと標準ｐＩＩＩの双方からディスプレイすることを明らかに示したものであり，一方で，他のサンプルでは否定的であった。シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイが否定的な結果を示したことは，ビリオン投下量が２０００ホールド未満であることが原因であると考えられた。ここで，ｐＩＩＩがＳＥＣ経路を介してペリプラズムに輸送されることが知られている。したがって，シグナル配列なしのｐＩＩＩバージョンは，ビリオン組み入れの必要条件であるペリプラズムターゲッティングの際にｐＩＩＩ結合不良となる。したがって，このサンプルからのビリオンは，ヘルパーファージ由来のｐＩＩＩ（物理的な表現型−ゲノム型のつながりの損失）のみを含むこととなる。ただし，ファージミドのパッケージング効率は，通常の場合に近く，結果として，通常の滴定量となる（図１６から分かる通り）。シグナル配列なしのｐＶＩＩバージョンと標準ｐＩＩＩディスプレイはいずれも，機能性ディスプレイが得られているが，ｐＩＩＩの場合，抗原結合能力がより強い。このことは，ｐＩＩＩバージョンの機能性がより高いことを必ずしも反映するものではなく，標準ｐＩＩＩディスプレイが，親和効果を引き起こすｓｃＦｖユニットの原子価１のディスプレイから原子価が少ないディスプレイまでの混合状態にあることは十分に論文化されている（Ｂｒａｄｂｕｒｙ及びＭａｒｋｓ，ＰＭＩＤ：１５２６１５７０）。そのような親和効果は，相互作用という実在する親和性をマスキングしており，優れた発現プロフィールのためにｓｃＦｖユニットがしばしば好ましいけれども，例えば，ビリオン当たりのユニット数が少ないという意味で発現性が低いＦａｂフォーマットが，親和性選択に対して非常に強いバインダーをもたらすということは，広く論文化されている（ｄｅ Ｈａａｒｄら，ＰＭＩＤ：１０３７３４２３，及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＰＭＩＤ：１６１５１４０４）。したがって，ｐＧＡＬＤ７ΔＬからのシグナルが低い方がむしろ原子価１により近いｓｃＦｖディスプレイを反映し，それにより，多くの用途があるという点で有利である。
【０１７７】
本明細書で採用されているファージミドの全てにおけるｓｃＦｖ−ｐＶＩＩ／ｐＩＩＩ発現カセットは，ｌａｃプロモーターで制御され，ビリオンのパッケージングは，標準プロトコルをＩＰＴＧ誘導なしで用いてなされる（Ｗｅｌｓｃｈｏｆら，ＰＭＩＤ：９０５０８７７）。したがって，パッケージング中にＩＰＴＧを用いて強制的により強い発現を起こすことで，ｓｃＦｖディスプレイを強めることが可能である。また，ファージミドファージディスプレイの重要な特徴は，機能性ディスプレイがヘルパーファージを介したファージミドのレスキューに依存しているという事実にある。したがって，ファージゲノムをベースとしたディスプレイとは対照的に，所定の細胞からビリオンへとパッケージングすることが可能な２種類のｓｓＤＮＡソースがあり，それらは，ファージミド，又はヘルパーファージゲノムである。重要なことは，双方のタイプのビリオンは，完全に同一の宿主細胞内で産生して見だされるので，キャプシドタンパク質の完全に同一のプール（ｐｏｏｌ）へのアクセスすることになる。したがって，組み合わせ可能なファージディスプレイ技術に対する基礎を形成する，物理的なゲノム型−表現型のつながりを維持することを確保するために，ファージミドに関してファージミドのヘルパーファージに対する比率が最も重要である。新たな実験では，同じファージミド由来のサンプルを上述したように調製するとともに，一方で，パッケージング中に含まれるＩＰＴＧを用いた場合と外した場合について比較対象となるビリオンアッセンブリーをも調製する。今回は，滴定中に，ヘルパーファージゲノム上で見られるカナマイシン抵抗力によるヘルパーファージゲノムの滴定量もマッピングする。
【０１７８】
今回の滴定結果（図１８Ａ）は，互いに異なるファージミドを標準条件で比較した場合，ファージミド滴定量に関して，前出のパッケージング（図１６）と完全に同一の傾向を示しているが，今回のものは，ｐＧＡＬＤΔＬ（ｐＶＩＩΔL）及びｐＧＡＬＤ（ｐＶＩＩ）は，いずれも，滴定量がいくらか高くなっていた。ｐＶＩＩをＩＰＴＧ誘導すると，又はｐＩＩＩ発現に応じて，ファージミドの全てにおいて滴定量の減少が見られたが，その効果は，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩのｐＧＡＬＤ７ファージミドに関するものが最も顕著である。ファージミドのヘルパーファージに対する比率をマッピングして（図１８Ｂ），互いに異なるファージミドを標準条件下（ＩＰＴＧの存在なし）で比較すると，全てのサンプルは，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩのｐＧＡＬＤ７ファージミドを除くファージミドに関しては通常の範囲内の比率を示しており，一方で，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩのｐＧＡＬＤ７ファージミドでは，表現型−ゲノム型のつながりが完全に喪失していることが示される。ＩＰＴＧ誘導を行った場合，ｐＧＡＬＤ７ファージミドに関しては，表現型−ゲノム型がカップリングしないことがさらに顕著であり，また，シグナル配列なしのｐＩＩＩ（ｐＩＩＩΔL）は，上記特徴の程度が小さいこと（比率０．５）を示した。ただし，後者の構造体は，ｐＩＩＩディスプレイに関して非機能的であるにも関わらず，コントロールとしてのみ含まれていた。
【０１７９】
そして，図１８Ａに示したファージミドの滴定量に基づくと，ｐｈＯｘ−ＢＳＡ特定ＥＬＩＳＡにおいてｐＧＡＬＤ７ΔＬ及びｐＧＡＬＤ７の機能性ｓｃＦｖディスプレイが，規格化された滴定濃度の投下量を使用した場合，図１７に示したものと同様であると評価された。
【０１８０】
上記結果は，機能性ｓｃＦｖ−ｐＶＩＩディスプレイが，シグナル配列なしのｐＧＡＬＤ７ΔＬとｐｈＯｘ−ＢＳＡの反応性がＩＰＴＧでｐＶＩＩ結合を強制的に発現させることで顕著に高められた状態で再び実現されたことを確かに示すものであった。この抗原反応性の増大は，ビリオン当たりのｐＶＩＩ結合数の増大だけでなく，ｓｅｅ当たりのｐＶＩＩ結合をかくまうビリオンの数の増大をおそらく反映するものである。後者は，標準ｐＩＩＩディスプレイにおいて，ファージミド含有ビリオンが１〜１０％の間にあるときにのみ実際に結合を含むことが知られていること（Ｂｒａｄｂｕｒｙ及びＭａｒｋｓ，ＰＭＩＤ：１５２６１５７０）に対応すると思われる。一方で，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイは，機能的なｐｈＯｘ−ＢＳＡ結合を何ら示していない。図１８Ｂに基づくと，ＩＰＴＧを希釈していないサンプル内で観測された弱い抗原反応性が，ｐＶＩＩ結合を低いレベルでかくまうヘルパーファージ含有ビリオンにあてがわれなければならない。
【０１８１】
今までのところ，機能性ｐＶＩＩファージミドをベースとした，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）ユニットのディスプレイを明らかに示してきた。この構造体は，同じｓｃＦｖのｐＩＩＩディスプレイに匹敵し，ファージミドの滴定量や抗原結合能力においてわずかな減少のみを示すものである。
【０１８２】
ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）は，ヒトの抗体であるｓｃＦｖライブラリーに対して選択性があり，大腸菌内の方が十分に発現することが知られている（Ｍａｒｋｓら，ＰＭＩＤ：１７４８９９４）。ｐＶＩＩディスプレイが，より挑戦的な結合パートナーの機能的なディスプレイに対して能力を発揮するかどうかを判断するために，我々は，抗体バリアブル遺伝子としてのネズミのハイブリドーマに基づいて，ｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）をサブクローン化するとともに，ネズミのＴ細胞クローンである４Ｂ２Ａ１からのバリアブル遺伝子（Ｌｅａｓｔら，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）に基づいてｓｃＴＣＲをサブクローン化して，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ及びｐＧＡＬＤ７とした。多くのハイブリドーマバリアブル遺伝子が大腸菌内では又はファージディスプレイ時には十分に発現しないことがよく知られている（Ｋｒｅｂｂｅｒら，ＰＭＩＤ：９０３２４０８）。また，Ｔ細胞受容体が，ファージディスプレイに適合させるのが特に困難であることが証明されている，折り畳みタンパク質に分類されることが知られている（Ｌｉら，ＰＭＩＤ：１５７２３０４６，及びＬｏｓｅｔら，ＰＭＩＤ：１７９２５３３１）。
【０１８３】
これらの新しいファージミドからのビリオンは，標準ファージミドレスキューによって調製され，その抗原結合能力に関してＥＬＩＳＡ試験を行った（図２０）。
【０１８４】
試験結果は，機能的なｐＶＩＩディスプレイが，ｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）を用いた場合とｓｃＴＣＲ Ｖαβ４Ｂ２Ａ１を用いた場合の双方で実現されたことを確実に示していた。また，ｓｃＦｖアンチ−ｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）を用いて予め観測したものとは対照的に，今回は，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイを用いた場合と用いなかった場合に相当するものであった。図２０で観測されているシグナルは，試験前にビリオンの滴定量を規格化しなかったので，直接的な比較対象とはならない。シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩの，ｓｃＦｖアンチ−ｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）のディスプレイの完全に非機能的な性質の観点から，上記サンプルを滴定して，ファージミドのヘルパーファージに対する比率を決定した（図２１）。
【０１８５】
ファージミドの滴定量は，シグナル配列なしのｐＶＩＩディスプレイ（ｐＧＡＬＤ７ΔＬ）が，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイ（図２１Ａ）に比較して，優れたパフォーマンスを示すことを再び示した。このことは，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖアンチＮＩＰの双方で確かに検証されたが，差異は，ｓｃＦｖアンチｐｈＯｘで観測された滴定量の場合（図６及び図８参照）よりも明らかではなかった。ファージミドのヘルパーファージに対する比率を比較すると，ｓｃＴＣＲの場合とｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）の場合（図２１Ｂ）の双方において，ｐＧＡＬＤ７ΔＬが，ファージミドに関して，比率で，非常に優れたパフォーマンスを再度示していた。ｓｃＦｖアンチ−ｐｈＯｘ（配列ＩＤ番号２６）の場合から分かる，ゲノム型−表現型のつながりの顕著な損失は，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖアンチＮＩＰ（配列ＩＤ番号２７）に関して，これらの比率（図１８及び図２１Ｂ）からは観測されなかった。しかし，ｐＧＡＬＤ７ΔＬは，明らかに優れていた。
【０１８６】
上記結果を考慮すると，ビリオンのパッケージング中に宿主細胞の増殖に関して，ｓｃＴＣＲとｓｃＦｖアンチＮＩＰの間に大幅に異なる差異があるという知見が顕著であった。
【０１８７】
図２２から明らかであることは，ｐＧＡＬＤ７ΔＬ含有培養物が宿主細胞の増殖に関しては効果が小さい一方，ｐＧＡＬＤ７ΔＬファージミドを含むクローンによって示される成長が顕著であるということである。このことは，シグナル配列を方向付けたｐＶＩＩディスプレイからの宿主毒性を強く示すものであり，一方で，シグナル配列を除去した後は直ちに，そのような毒性がないか又はほとんどない。
【０１８８】
実施例５ 大腸菌株ＡＶＢ１００ＦｍｋＩＩの構造物
【０１８９】
試薬，及び細菌株
試薬
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））で説明されているように，基本的なメディアやバッファの全てを用意した。
大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＡＶＢ１００（ＭＣ１０６１に基づく）を，それぞれ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国，ＣＡ州，ＬａＪｏｌｌａ）及びＡｖｉｄｉｔｙ（米国，ＣＯ州，Ｄｅｎｖｅｒ）から購入した。
【０１９０】
結果
【０１９１】
Ｆプラスミド陽性の大腸菌ＡＶＢ１００（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｔｒ（登録商標））を得るために，以下のように，細胞をＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ＦプラスミドＴｅｔ（登録商標））と交配させた。適切な抗生物質で補完した５ｍｌＬＢ培地に，各株の単一コロニーを植菌し，３７℃で終夜にわたって，精密な振動を付加した状態で培養した。翌日，未使用の５ｍｌ細胞培養を，吸光度Ａ500nmが０．１のときに開始して，３７℃で１時間にわたって精密な振動を付加した状態で，対数増殖期の中頃まで成育させ，その後，１ｍｌずつを，混合して，３７℃で１時間にわたって静かに培養した。その後，その混合物１０μｌを，１００μｇ／ｍｌのＳｔｒと３０μｇ／ｍｌのＴｅｔを含む未使用の５ｍｌＬＢ培地に移し，さらに，３７℃で終夜にわたって精密な振動を付加した状態で，培養した。翌日，この細胞物を希釈したものを，１００μｇ／ｍｌのＳｔｒと３０μｇ／ｍｌのＴｅｔを含む寒天皿上に広げることで，新しいＦプラスミド陽性のＡＶＢ１００株（用語「ＡＶＢ１００ＦｍｋＩＩ」相当。）を得た。
【０１９２】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィラメント状のファージに由来するｐＶＩＩ結合タンパク質であって，
前記結合タンパク質がＮ末端のシグナル配列を含まない，
ｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項２】
配列ＩＤ番号１の配列（MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR）における位置１〜３３，位置２〜３３，位置３〜３３，位置４〜３３，及び位置５〜３３からなる群から選択された配列を含む，
請求項１に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項３】
前記外来ペプチドが，前記ｐＶＩＩの配列の前記Ｎ末端の端部に直接的に結合する，
請求項１又は請求項２に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項４】
前記外来ペプチドが，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ，Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，アンキリン，ＩｇＮＡＲ又はそのフラグメント，フィブロネクチン又はそのフラグメント，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される，
請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項５】
前記外来ペプチドがライブラリーの要素である，
請求項１〜４のいずれか１項に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合タンパク質を含むフィラメント状のファージ。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸をさらに含む，
請求項７に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項９】
野生型ｐＶＩＩ及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む，
請求項７又は請求項８に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項１０】
前記ファージが，野生型ｐＶＩＩ及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質をコードする遺伝子を含まない，
請求項７〜９のいずれか１項に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項１１】
ｐＩＩＩ結合タンパク質又はｐＶＩＩＩ結合タンパク質をさらに含む，
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項１２】
ｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩへの結合としての外来ペプチドをディスプレイする，
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のフィラメント状のファージのライブラリー。
【請求項１３】
ペプチドが，ｐＶＩＩと，ｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩの一方又は双方とで同時にディスプレイされる，
請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，
前記ヘルパーファージが，請求項６に記載の核酸を含む，
ファージディスプレイシステム。
【請求項１５】
ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，
前記ファージミドが，請求項６に記載の核酸を含む，
ファージディスプレイシステム。
【請求項１６】
請求項１４及び／又は請求項１５に記載のファージディスプレイシステムを含む，キット。
【請求項１】
フィラメント状のファージに由来するｐＶＩＩ結合タンパク質であって，
前記結合タンパク質がＮ末端のシグナル配列を含まない，
ｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項２】
配列ＩＤ番号１の配列（MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR）における位置１〜３３，位置２〜３３，位置３〜３３，位置４〜３３，及び位置５〜３３からなる群から選択された配列を含む，
請求項１に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項３】
前記外来ペプチドが，前記ｐＶＩＩの配列の前記Ｎ末端の端部に直接的に結合する，
請求項１又は請求項２に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項４】
前記外来ペプチドが，ＡｖｉＴａｇ（登録商標）（配列ＩＤ番号４），ＦＬＡＧタグ（配列ＩＤ番号９），ＨＩＳタグ（配列ＩＤ番号１２），ＨＡＴタグ，ＨＡタグ，ｃ−Ｍｙｃタグ，ストレップタグ，Ｖ５タグ，抗体又はそのフラグメント，Ｔ細胞受容体又はそのフラグメント，ＭＨＣ分類Ｉ及び分類ＩＩ，アンキリン，ＩｇＮＡＲ又はそのフラグメント，フィブロネクチン又はそのフラグメント，タンパク質ＡのＺドメイン，ＣＴＬＡ４又はそのフラグメント，ＩｍｍＥ７，ＧＦＰ，及び，その他の遺伝子をコードした生物学的な蛍光色素分子からなる群から選択される，
請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項５】
前記外来ペプチドがライブラリーの要素である，
請求項１〜４のいずれか１項に記載のｐＶＩＩ結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合タンパク質を含むフィラメント状のファージ。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸をさらに含む，
請求項７に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項９】
野生型ｐＶＩＩ及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む，
請求項７又は請求項８に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項１０】
前記ファージが，野生型ｐＶＩＩ及び／又は野生型ｐＶＩＩタンパク質をコードする遺伝子を含まない，
請求項７〜９のいずれか１項に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項１１】
ｐＩＩＩ結合タンパク質又はｐＶＩＩＩ結合タンパク質をさらに含む，
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のフィラメント状のファージ。
【請求項１２】
ｐＩＩＩ，ｐＶＩＩ，又はｐＶＩＩＩへの結合としての外来ペプチドをディスプレイする，
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のフィラメント状のファージのライブラリー。
【請求項１３】
ペプチドが，ｐＶＩＩと，ｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩの一方又は双方とで同時にディスプレイされる，
請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１４】
ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，
前記ヘルパーファージが，請求項６に記載の核酸を含む，
ファージディスプレイシステム。
【請求項１５】
ファージミドと，ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって，
前記ファージミドが，請求項６に記載の核酸を含む，
ファージディスプレイシステム。
【請求項１６】
請求項１４及び／又は請求項１５に記載のファージディスプレイシステムを含む，キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２０１０−５３６３５９（Ｐ２０１０−５３６３５９Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１４２０（Ｐ２０１０−５２１４２０）
【出願日】平成２０年８月２０日（２００８．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０９０８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４５９１
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５１００４１８１０）
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＸＴＥＲＡ ＡＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２０日（２００８．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０９０８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４５９１
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５１００４１８１０）
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＸＴＥＲＡ ＡＳ
【Ｆターム（参考）】
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