コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡ、形質転換微生物、シャトルベクタ―およびパントテン酸の製法
【課題】 コリネ型のバクテリアを用いてＤ−パントテン酸を発酵的に製造するための改善された方法の提供。
【解決手段】 ａ）特定の塩基配列のｐａｎＢ−遺伝子（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）をコードし、ｂ）特定の塩基配列のｐａｎＣ−遺伝子（パントテネートシンテターゼ）、特にｐａｎＢＣ−オペロンをコードし、かつ場合によりｃ）特定の塩基配列のｉｌｖＤ−遺伝子（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）をコードする群から選択された、ヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する、コリネバクテリウム由来の、場合により組み換えられた、コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡ、および前記遺伝子が強化されたコリネバクテリウム属の微生物を使用するＤ−パントテン酸の発酵的製法。
【解決手段】 ａ）特定の塩基配列のｐａｎＢ−遺伝子（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）をコードし、ｂ）特定の塩基配列のｐａｎＣ−遺伝子（パントテネートシンテターゼ）、特にｐａｎＢＣ−オペロンをコードし、かつ場合によりｃ）特定の塩基配列のｉｌｖＤ−遺伝子（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）をコードする群から選択された、ヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する、コリネバクテリウム由来の、場合により組み換えられた、コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡ、および前記遺伝子が強化されたコリネバクテリウム属の微生物を使用するＤ−パントテン酸の発酵的製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】パントテン酸は化粧品、医薬品、栄養食品及び動物飼料中に使用される商業的に重要なビタミンである。
【０００２】
【従来の技術】パントテン酸は化学合成又は適当な培養液中での適当な微生物の発酵により生物工学的に製造することができる。微生物による生物工学的製造の利点は、パントテン酸の所望の立体異性体Ｄ−形の形成にある。
【０００３】バクテリア、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ.コリ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ及び酵母、例えばＤｅｂａｒｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉの多様な種類は、欧州特許出願公開第０４９３０６０号明細書に示されたように、グルコース、ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラニンを含有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生することができる。欧州特許出願公開第０４９３０６０号明細書は、さらに、Ｅ.コリにおいて、プラスミドｐＦＶ３及びｐＦＶ５によるパントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、Ｄ−パントテン酸の生成が改善されることを示している。
【０００４】欧州特許出願公開第０５９０８５７号明細書は、多様な代謝拮抗物、例えばサリチル酸、α−ケト酪酸、β−ヒドロキシアスパラギン酸等に対して耐性を有し、グルコース及びβ−アラニンを含有する培養液中でＤ−パントイン酸およびＤ−パントテン酸を産生するＥ.コリ株に関する。欧州特許出願公開０５９０８５７号明細書中では、さらに、プラスミドｐＦＶ３１上に含まれる正確には特定されていない、Ｅ.コリからのパントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、Ｅ.コリの株中で、Ｄ−パントイン酸およびＤ−パントテン酸の産生が改善されることを示している。
【０００５】ＷＯ９７／１０３４０中では、さらにＥ.コリのパントテン酸を形成する突然変異体中で、酵素のアセトヒドロキシ酸−シンターゼＩＩの活性の向上により、バリン−生合成の酵素、パントテン酸−産生をさらに高めることができることを記載している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、コリネ型のバクテリアを用いてＤ−パントテン酸を発酵的に製造するための改善された方法のための新規な基礎を見出すことである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】ビタミンのパントテン酸は、化粧品、医薬品、栄養食品及び動物飼料中に使用される商業的に重要な生成物である。従って、パントテン酸の改善された製造方法を提供するという一般的興味が生じる。
【０００８】以後、Ｄ−パントテン酸又はパントテン酸又はパントテネートに言及する場合、遊離酸だけでなくＤ−パントテン酸の塩、例えばカルシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩をも意味するものとする。
【０００９】本発明の対象は、ａ）配列番号１に示した、ｐａｎＢ−遺伝子（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）をコードし、ｂ）配列番号１に示した、ｐａｎＣ−遺伝子（パントテネートシンテターゼ）、特にｐａｎＢＣ−オペロンをコードし、かつ場合によりｃ）配列番号４により示されるｉｌｖＤ−遺伝子（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）をコードする群から選択された、前記のヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する、コリネバクテリウム由来の、場合により組み換えられた、コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡである。
【００１０】更に、本発明の対象は、（ｉ）配列番号１、配列番号４中に示されたヌクレオチド配列、（ｉｉ）遺伝学的コードの同義性の範囲内でそれぞれの配列（ｉ）に相当する、配列の少なくとも１つ、または（ｉｉｉ）それぞれ配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補性の配列とハイブリッド形成する配列の少なくとも１つ、および場合により（ｉｉｉｉ）（ｉ）において機能的に中立のセンス突然変異、を有する請求項１記載の複製可能なＤＮＡである。
【００１１】同様に、１個以上の複製可能なＤＮＡ−片の導入により形質転換した、コリネ型微生物、特にコリネバクテリウム属の微生物を請求している。
【００１２】本発明の対象は、Ｄ−パントテン酸の製法でもあり、特にこの酸をすでに生産するコリネ型バクテリアの使用下での製法であり、このバクテリアにおいては遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣは単独または相互に組み合わされて、場合によりｉｌｖＡ−遺伝子中での欠失または遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣまたはｉｌｖＤの強化と組み合わされて強化され、特に過剰発現される。
【００１３】「強化」の概念は、本願明細書において、遺伝子のコピー数を高めるか、強いプロモータを使用するか又は高い比活性を有する相当する酵素をコードする遺伝子を使用することにより、及び場合によりこれらの手法を組み合わせることにより、微生物中で相当するＤＮＡによりコードされる１種以上の酵素の細胞内活性を高めることを意味する。
【００１４】本発明の対象である微生物は、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリンとエタノールとから、特にグルコース又はサッカロースからパントテン酸を製造できる。これはコリネ型バクテリアであり、特にコリネバクテリウム属またはアルトロバクター属のものである。コリネバクテリウム属においては特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの種類が挙げられ、これはこの専門分野においてそのアミノ酸を産生する能力が公知である。この種に属する野生型株には、例えば Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ.グルタミクム） ＡＴＣＣ１３０３２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ１７９６５及びこれらから誘導された菌株が挙げられる。
【００１５】酵素ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびパントテネートシンターゼをコードする、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの、新規に単離されたＤ−パントテネート生合成遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣ単独または一緒（ｐａｎＢＣ−オペロン）の強化、特に過剰発現により改善された方法でＤ−パントテネートが生産されることが判明した。
【００１６】更に、酵素ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの新規バリン生合成遺伝子の強化された発現がＤ−パントテネートの形成の上昇をもたらすことが確認された。本発明により、この遺伝子の他に、酵素アセトヒドロキシ酸シンテターゼをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子および酵素イソメロレダクターゼ（Isomeroreduktase）をコードするｉｌｖＣ−遺伝子の強化された発現もＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのＤ−パントテネート形成を上昇させる。
【００１７】強化(過剰発現)の達成のために、例えば相応する遺伝子のコピー数を高めるか、又は構造遺伝子の上流に存在するプロモーター領域及びレギュレーション領域を突然変異させる。同様に、構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターにより、付加的に発酵によるパントテネート形成の過程において発現を向上させることができる。ｍ−ＲＮＡの寿命を延長させる手段によっても同様に発現を改善できる。さらに酵素タンパク質の分解を阻害することによっても同様に酵素活性が強化される。遺伝子又は遺伝子構造は異なるコピー数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体中に組み込まれ、増幅され得る。また、さらに該当する遺伝子の過剰発現は、培地組成の変更及び培養操作の変更により達成することができる。これについての手引は、当業者には特にMartin et al.(Bio/Technology 5,137-146(1987)),Guerrero et al.(Gene 138,35-41(1994)),Tsuthiya and Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988)),Eikmanns et al.(Gene 102,93-98(1991)),ヨーロッパ特許明細書EPS 0472869,米国特許4601893,Schwarzer und Puehler(Bio/Technology 9,84-87(1991)),Reinscheidet al.(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132(1994)),LaBarreet al.(Journal of Bacteriology 175,1001-1007(1993)),特許出願 ＷＯ96/15246,Jensen und Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))またはハンドブック(Manual of Methods for General Bacteriology der American Society for Bacteeriology(Washington D.C.,USA,1981))及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書に見ることができる。
【００１８】Ｃ.グルタミクムからのｐａｎＢおよびｐａｎＣの単離のために、まずＥ.コリ中に微生物の遺伝子ライブラリーを作成する。遺伝子ライブラリーの作成は一般に公知の教書及びハンドブックにおいて記載されている。例として、Winnackerの教書：Gene und Klone, Eine Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990)又はSambrook et al.の教書：MolecularCloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)が挙げられる。公知の遺伝子ライブラリーは、Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987))によるλ−ベクター中に作成されたＥ．コリ Ｋ−１２株Ｗ３１１０の遺伝子ライブラリーである。Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996)はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリを記載しており、この遺伝子ライブラリーはコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ(Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164)を用いてＥ．ｃｏｌｉ株Ｋ−１２ ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575）中で作成された。Ｅ．コリ中のＣ.グルタミクムの遺伝子ライブラリーの製造は、ｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)）又はｐＵＣ９（Vieria et al., 1982, Gene, 19:259-268）のようなプラスミドも使用することができる。宿主として特に制限欠失（restriktionsdefekt）及び組換え欠失（rekombinationsdefekt）であるようなＥ．コリ株が適している。これについての例は、Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)に記載された株ＤＨ５αｍｃｒである。
【００１９】この遺伝子ライブラリーは引き続き指示株中へ形質転換（Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 577-580, 1983）又はエレクトロポレーション（Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347）によって導入することができる。この指示株は、検出可能な表現型、例えば栄養要求性を生じさせる重要な遺伝子中に突然変異を有することにおいて優れている。この指示株もしくは突然変異体は公共の供給機関または寄託機関から入手可能であるか、または場合により自ら製造することができる。本発明の範囲内で、ｐａｎＣ遺伝子中に突然変異を有するＥ．コリ突然変異体ＤＶ３９（Vallari and Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164:136-142）が特に重要である。パントテン酸要求性Ｅ．コリ突然変異体に関する他の例は、ｐａｎＢ遺伝子中に突然変異を有し、イール大学のGenetic Stock Center（New Haven、Connecticut、USA 在）から取り寄せることができる菌株ＳＪ２である。更なる例は、本発明において単離されたＣ.グルタミクム突然変異体Ｒ１２７／７であり、これはジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ−遺伝子中で欠失している。指示株、例えばｐａｎＢ−突然変異体ＳＪ２を、重要な遺伝子、例えばｐａｎＢ−遺伝子を有する組換えプラスミドで形質転換し、該当する遺伝子を発現させることにより、この指示株は相応する特性、例えばパントテン酸−要求性に関して原栄養体となる。
【００２０】このように単離された遺伝子もしくはＤＮＡ−フラグメントは、例えばSangeret al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States ofAmerica USA, 74:5463-5467, 1977)に記載されたように配列決定により特性決定された。
【００２１】このようにＣ．グルタミクムの遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣをコードする新規のＤＮＡ−配列が得られ、この配列は配列番号１として本発明の構成要素である。さらに、本発明のＤＮＡ−配列から上記記載の方法を用いて相応する酵素のアミノ酸配列が誘導された。配列番号２中では得られたｐａｎＢ−遺伝子産物の、すなわちケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、および配列番号３中では得られたｐａｎＣ−遺伝子産物の、すなわちパントテネートシンターゼのアミノ酸配列が示されている。更に、Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＤ−遺伝子をコードする新規ＤＮＡ配列が得られ、これは配列番号４として、本発明の構成要素である。配列番号５中には得られたｉｌｖＤ−遺伝子産物の、すなわちジヒドロキシ酸デヒドラターゼのアミノ酸配列が示されている。
【００２２】配列番号１および／または配列番号４から遺伝子コードの同義性（Degeneriertheit）により生じた、コードするＤＮＡ−配列も同様に本発明の構成要素である。同様に、配列番号１および／または配列番号４とハイブリダイズするＤＮＡ−配列も本発明の構成要素である。この専門分野において、さらにタンパク質中での同類アミノ酸置換（konservative Aminosaeureaustausch）、例えばグリシンのアラニンによる置換又はアスパラギン酸のグルタミン酸による置換は「センス突然変異」（sense mutations; Sinnmutationen）として公知であり、このセンス突然変異はタンパク質の活性の根本的な変更を引き起こさない、つまり機能的に中立である。さらに、タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端での変更はその機能に本質的に影響を及ぼさないか、それどころか安定化することもできることは公知である。
【００２３】これについての情報は、当業者は特にBen-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1988)) 及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書に見ることができる。同様にして、配列番号２、配列番号３および／または配列番号５から同様な方法で得られたアミノ酸配列も同様に本発明の構成要素である。
【００２４】このように特徴付けられた遺伝子は、引き続き個々に又は他のものと組み合わせて適当な微生物中で発現させることができる。遺伝子を発現させるもしくは過剰発現させる公知の方法は、さらに発現シグナルを設置することができるプラスミドベクターを用いて増幅することである。プラスミドベクターとして、相応する微生物中で複製可能なものが挙げられる。Ｃ．グルタミクムのためには、例えばベクターｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al.,Gene 102:93-98(1991)）またはｐＺ８−１（ヨーロッパ特許０３７５８８９号明細書）またはｐＥＫＥｘ２（Eikmanns et al.Microbiology 140:1817-1828(1994)）またはｐＥＣＭ２（Jaeger et al.Journal of Bacteriology 174(16):5462-5465(1992)）が挙げられる。この種のプラスミドの例は、菌株ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよびＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ中に含有されているｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよびｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤである。プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣは遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣを有するＥ．コリ／Ｃ.グルタミクムシャトルベクターであり、プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤはｉｌｖＤ遺伝子の他に、ｉｌｖＢＮおよびｉｌｖＣを有するＥ．コリ／Ｃ.グルタミクムシャトルベクターである。
【００２５】更に、遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣ単独の、一緒のまたは遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤと組み合わせての強化はアミノ酸トレオニンおよびイソロイシンの合成の減少した微生物中で有利に作用する。合成の減少は、相当する生合成酵素またはその活性を弱めるかまたは排除することにより達せられる。この例としては、酵素ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼまたはトレオニンデヒドラターゼを挙げることができる。酵素およびその活性を弱くするか、または排除する可能性は、突然変異誘発法である。
【００２６】この方法には、化学試薬、例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたはＵＶ−照射を突然変異誘発に使用し、引き続きＬ−トレオニンまたはＬ−イソロイシンに対する要求性を示す所望の微生物を探す、ランダムな方法が属する。突然変異誘発法および突然変異体探索法は一般に公知であり、特にミラー（Miller:A Short Course in Bacterial Genetics,A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria(Cold Spring HarborLaboratory Press,1992)）により、またはハンドブック"Manual of Methods forGeneral Bacteriology", American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)に記載されている。
【００２７】更に、目標を定めた組換えＤＮＡ−技術もこれに属する。この方法を用いて、例えばトレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ−遺伝子を染色体中で欠失させることができる。このための好適な方法はシェーファー等（Schaefer etal.:Gene(1994)145:69-73）またはリンク等（Link et al.:Journal of Bacteriology(1998)179:6228-6237）により記載されている。遺伝子の一部のみを欠失することもできるし、またはトレオニンデヒドラターゼ遺伝子の突然変異フラグメントを交換することもできる。欠失または交換によりトレオニンデヒドラターゼ活性の消失または減少が達せられる（Moeckel et al.,(1994) Molecular Microbiology 13:833-842;Morbach et al.,(1996) Applied Microbiology and Biotechnology 45:612-620）。この種の突然変異体の例は、ｉｌｖＡ−遺伝子中に欠失を有するＣ.グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡである。
【００２８】本発明により製造された微生物は、連続的に又は不連続的に、バッチ法（Satzkultivierung）又はフィードバッチ法（fed batch; Zulaufverfahren）又は繰り返しフィードバッチ法（repeated fed batch;repetitives Zulaufverfahren）でパントテン酸−産生の目的で培養することができる。公知の培養法に関する概要はChmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))の教書又はStorhas (Bioreaktorenund periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))の教書に記載されている。
【００２９】使用すべき培養基は適当な手法でそれぞれの微生物の要求を満たさなければならない。多様な微生物の培養基の記載は、ハンドブック"Manual of Methods forGeneral Bacteriology", American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)になされている。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール及び有機酸、例えば酢酸が使用される。この材料は単独で又は混合物として使用することができる。窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、ダイズ粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが使用される。この窒素源は個々に又は混合物として使用することができる。リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することができる。この培養基は、さらに成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを前記の物質に対して付加的に使用することができる。この培養基に更にパントテン酸生産をより上昇するためにパントテン酸の前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン；ケトイソバレレート、ケトパントエート、パントエート及び場合によりこれらの塩を添加することができる。前記の添加物質は培養へ１回のバッチの形で添加するか、又は適当な手法で培養の間に供給することができる。
【００３０】培地のｐＨ−コントロールのために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が適当な手法で使用される。泡形成を制御するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定を維持するために、培地に適当な選択作用する物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気性条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中へ導入する。培地の温度は通常２０℃〜５０℃、有利に２５℃〜４５℃である。パントテン酸の最大量が生成されるまで培養は継続される。この目的は通常１０時間〜１６０時間の間に達成される。
【００３１】生成されたパントテン酸の濃度は、公知の方法（Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)）で測定することができる。パテント酸の微生物学的測定は慣用法で、菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ８０１４を使用する（米国薬局方１９８０；ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９８０）。更に、他の試験微生物、例えばＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ ＮＣＩＢ６９９０をパントテネート濃度の微生物学的測定のために使用する（Sollberg and Hegna;Methods in Enzymology 62,201-204(1979)）。
【００３２】次の微生物をブタペスト条約に従ってDeutsche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託した：Ｅ.コリＫ１２株 ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣをＤＳＭ１２４５６として、Ｅ.コリＫ１２株 ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤをＤＳＭ１２４５７として、Ｃ.グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡをＤＳＭ１２４５５として。
【００３３】
【実施例】本発明を次に実施例につき詳説する。
【００３４】例１Ｃ．グルタミクムからのパントテネート生合成の遺伝子ｐａｎＢおよびＰａｎＣのクローニングおよび配列決定および発現１． ｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子のクローニングＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２からの染色体ＤＮＡを、SchwarzerおよびPuehler (Bio/Technology 9 (1990)84-87)に記載されたように単離し、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを用いて切断した。ゲル電気泳動による分離の後、３〜７ｋｂもしくは９〜２０ｋｂのサイズ領域のＤＮＡフラグメントを抽出し、次いでベクターｐＢＲ３２２の一本鎖のＢａｍＨＩ切断部位中へ連結させた。この連結配合物を用いてＥ．コリ株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of AmericaUSA, 87 (1990),4645-4649）を形質転換した（Hanahan, Journal of MolecularBiology 166 (1983) 557-580）。インサートを有するクローンをそのテトラサイクリン感度に基づき、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天プレート上に接種することにより同定した。合わせたクローンのプラスミド調製（Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press）により、９〜２０ｋｂのインサートサイズを有するそれぞれ４００のプラスミド８グループ、３〜７ｋｂのインサートサイズを有するそれぞれ５００のプラスミドを有する９グループを単離した。Ｅ．コリのｐａｎＢ突然変異体ＳＪ２（Cronan et al. 1982, Journal of Bacteriology 149: 916-922）をこの遺伝子ライブラリーでエレクトロポレーション（Wehrmann et al. 1994, Microbiology 140: 3349-3356）により形質転換した。この形質転換配合物を、寒天１５ｇ／ｌを有するＣＧＸＩＩ−培地（Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603）上で直接平板培養した。パントテネート補足なしで成長できるクローンからプラスミド−ＤＮＡを単離した（Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press）。８つのプラスミドにおいて、再形質転換により、Ｅ．コリ突然変異体ＳＪ２のｐａｎＢ−欠失を非相同的に相補する能力が確認された。
【００３５】この８つのプラスミドを用いて制限地図作成を実施した。調査したプラスミドベクターの１つ（以後ｐＵＲ１とする）は９．３ｋｂのインサートを有していた（図１）。Ｅ．コリのｐａｎＣ突然変異体ＤＶ３９（Vallari and Rock 1985, Journal of Bacteriology 164: 136-142）の形質転換は、ベクターｐＵＲ１が同様にこの突然変異体のｐａｎＣ欠失を相補することができることを示した。
【００３６】２． ｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子の配列決定ｐＵＲ１のインサート（図１）の２．２ｋｂのサイズのフラグメントを、 Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, (1977) 74:5463-5467,)のジデオキシ−鎖中断−法により配列決定した。このために、まずエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いてサブクローンを製造し、これを標準プライマー（Universal and reverse primer, Boehringer Mannheim社, Deutschland）を用いて配列決定した。配列決定物のゲル電気泳動分析を、Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)の自動的レーザ−蛍光−シークエンサー装置（A.L.F.）を用いて行った。得られたヌクレオチド配列を、プログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL, Cambrige, GB）を用いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号１として記載した。この分析により２つのオープンリードフレームの同定が示された。８１３ｂｐの長さの第１のオープンリードフレームはｐａｎＢ−遺伝子として同定され、これは２７１個のアミノ酸のポリペプチドをコードし、配列番号２として記載されている。第２のオープンリードフレームはｐａｎＣ−遺伝子として同定され、８３７個の塩基対を有する。これは２７９個のアミノ酸のポリペプチドをコードし、配列番号３として記載されている。
【００３７】３. ｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子の発現遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣをＣ．グルタミクム発現ベクターｐＥＫＥｘ２中でクローニングした（Eikmanns et al.,1994,Microbiology 140:1817-1828(1994)）、この中でこれら両方の遺伝子は強力な、ＩＰＴＧにより誘発可能なｔａｃ−プロモータの制御下に存在している。このクローニングを２工程で実施した。最初にＰＣＲによりｐａｎＢ遺伝子の開始部分を増幅した。このためにはｐａｎＢの開始コドンの前に相応するプライマー１９ｂｐを用いてＳａｌＩ−切断位を導入した（プライマー１：５′ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＣＡＴＧＣＣＣ３′）。第２のプライマーを、ｐａｎＢが内部ＥｃｏＲＩ切断位を増幅したフラグメント中に有しているように選択した（プライマー２：５′ＡＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣ３′）。このＰＣＲをアニーリング温度６２℃およびプラスミドｐＵＲ１をマトリックスとして用いて、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))に記載されているように実施した。得られた４６８ｂｐサイズのＰＣＲ−生成物を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、同様に処理したベクターｐＥＫＥｘ２中に連結した。連結配合物でＥ.コリ株ＤＨ５αｍｃｒを形質転換した。タイプＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢ′の形質転換体からベクターｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢ′を単離した。
【００３８】このプラスミドｐＵＲ１からｐａｎＢＣ−クラスターの第二の半分を有する１７６１ｂｐサイズのＥｃｏＲＩフラグメントを制限消化により切り離した。これをｐａｎＢのＰＣＲ−生成物を含有する、予めＥｃｏＲＩで線状にされたｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢ′ベクター中でクローニングした。相応する連結配合物でＥ.コリ菌株ＤＨ５αｍｃｒを形質転換した。タイプＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣの形質転換体から、ｐａｎＢＣ−クラスターがｔａｃ−プロモータの制御下にあるベクターｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ（図２）を単離した。
【００３９】例２Ｃ.グルタミクムからのジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ−遺伝子のクローニングおよび配列決定１. Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＤ突然変異体の単離菌株Ｃ.グルタミクムＲ１２７（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61:329-334）をＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで突然変異させた（Sambrook et al. Molecular cloning: A laboratory manual, (1989) ColdSpring Harbor Laboratory Press）。このためには一夜培養したＣ.グルタミクム培養物５ｍｌにＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（５ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド）２５０μｌを加え、３０℃および２００ｒｐｍで３０分間インキュベートした（Adelberg 1958,Journal of Bacteriology 76:326）。引き続き、細胞を滅菌ＮａＣｌ溶液（０.９％）で２回洗浄した。寒天１５ｇ／ｌを有する最少培地プレートＣＧＸＩＩ上でレプリカ平板法を実施することにより（Keilhauer et al.:Journal of Bacteriology 175:5595-5603）、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−ロイシンの添加（それぞれ０.１ｇ／ｌ）においてのみ成長する突然変異体を単離した。
【００４０】ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性を、この突然変異体の粗抽出物中で測定した。このためにはこのクローンをＬＢ−培地６０ｍｌ中で培養し、指数増殖期に遠心分離した。細胞ペレットを０.０５Ｍリン酸カリウム緩衝液で１回洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁させた。細胞の砕解は１０分間の超音波処理（Branson-Sonifier W-250,Branson Sonic Power Co,Danbury,USA）により実施した。引き続き、細胞砕片を１３０００ｒｐｍおよび４℃で３０分間遠心分離することにより分離し、上澄みを粗抽出物として、酵素テストに使用した。酵素テストの反応配合物は０.２５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８ ０.２ｍｌ、粗抽出物０.０５ｍｌ、および６５ｍＭα,β−ジヒドロキシ−β−メチルバレエート０.１５ｍｌを含有する。このテスト配合物を３０℃でインキュベーションし、１０、２０および３０分後に試料２００μｌを採取し、そのケトメチルバレエートの濃度をＨＰＬＣ−分析により測定した（Hara et al. 1985,Analytica Chimica Acta 172:167-173)。表１が示すように、菌株Ｒ１２７／７はジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を全く示さず、これに対してイソメロレダクターゼおよびアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性がその他の分枝鎖アミノ酸の合成の酵素としてなお存在する。
【００４１】表１Ｃ.グルタミクム株中の種々の酵素の比活性（μｍｏｌ／分およびｍｇ蛋白質）
【００４２】
【表１】
【００４３】２. Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＤ−遺伝子のクローニングＣ．グルタミクム Ｒ１２７からの染色体ＤＮＡを、SchwarzerおよびPuehler(Bio/Technology 9 (1990)84-87)に記載されたように単離した。これを制限酵素Ｓａｕ３Ａ（Boehringer Mannheim）を用いて切断し、ショ糖濃度勾配遠心分離（Sambrook et al. Molecular cloning: A laboratory manual, (1989) ColdSpring Harbour Laboratory Press）により分離した。約６〜１０ｋｂサイズのフラグメントを有するフラクションをベクターｐＪＣ１（Cremer et al.,Molecular and General Genetics 220(1990) 478-480）との連結に使用した。このためにこのベクターｐＪＣ１をＢａｍＨＩで線状にし、脱ホスホリル化した。そのうちの５ｎｇを前記染色体ＤＮＡのフラクション２０ｎｇと連結し、これで突然変異体Ｒ１２７／７をエレクトロポレーション（Haynes und Britz,FEMS Microbiology Letters 61 (1989) 329-334）により形質転換した。この形質転換体を分枝鎖状アミノ酸の添加なしにＣＧＸＩＩ寒天培地上で増殖する能力に関してテストした。試験した５０００を越える形質転換体に関して、レプリカ平板法および２日間の３０℃でのインキュベーションの後、最少培地プレート上に８個のクローンが増殖した。このクローンからのプラスミド調製をSchwarzer等(Bio/Technology 9 (1990)84-87)に記載されたように実施した。このプラスミド−ＤＮＡの制限分析はクローン８個の全て中で同じプラスミド、以降ｐＲＶと呼ぶ、を有することを示した。このプラスミドは４.３ｋｂのインサートを有し、再形質転換によりそのｉｌｖＤ−突然変異体Ｒ１２７／７を相補する能力に関してこれを試験した。サブクローニングにより突然変異体Ｒ１２７／７の相補性に関与する領域を２.９ｋｂのＳｃａＩ／ＸｈｏＩフラグメントに限定した。
【００４４】３. ｉｌｖＤ−遺伝子の配列決定２.９ｋｂのＳｃａＩ／ＸｈｏＩ−フラグメントの核酸配列をザンガー（Sanger）等のジデオキシ−鎖中断−法により行った(Proceedings of the National ofSciences of the United States of America USA (1977) 74:5463-5467)。この際、オートリード配列決定キットを使用した（Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Schweden）。ゲル電気泳動分析を、Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)の自動的レーザ−蛍光−シークエンサー装置（A.L.F.）を用いて行った。得られたヌクレオチド配列を、プログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release4.0, EMBL, Cambrige, GB）を用いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号４として記載した。この分析により塩基対１８３６個を有する１つのオープンリードフレームが得られ、これはｉｌｖＤ−遺伝子として同定され、６１２個のアミノ酸のポリペプチドをコードし、配列番号５として記載されている。
【００４５】例３Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＡ欠失突然変異体の作成Ｃ.グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｉｌｖＡ−遺伝子中に欠失を設けることはSchaefer等（Gene 145:69-73(1994))により記載された遺伝子交換のためのシステムで実施した。不活性化ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡの作成のためには最初にベクターｐＢＭ２１（Moeckel et al.1994,Molecular Microbiology 13:833-842）中のＥｃｏＲＩ−フラグメント上に存在するｉｌｖＡ−遺伝子から内部ＢｇｌＩＩ−フラグメント２４１ｂｐを除去した。このためにはこのベクターをＢｇｌＩＩで切断し、ｉｌｖＡ内部ＢｇｌＩＩ−フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した後、再連結した。引き続き、ベクターからこの不完全な遺伝子をＥｃｏＲＩ−フラグメントとして単離し、かつＥｃｏＲＩで線状にしたベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（Schaefer 1994,Gene 145:69-73）に連結した。得られた不活性化ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡを形質転換によりＥ.コリ株Ｓ１７−１中に導入し（Hanahan 1983,Journal of Molecular Biology 166:557-580）、かつ接合により、Ｃ.グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を形質転換する（Schaefer et al.1990,Journal of Bacteriology 172:1663-1666）。Ｃ.グルタミクムのカナマイシン耐性クローンが得られ、これには不活性化ベクターがゲノム中に組み込まれて存在する。ベクターの切り出しを選択するために、カナマイシン耐性クローンをサッカロース含有ＬＢ−培地（（Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold SpringHarbour Laboratory Press）、寒天１５ｇ／ｌ、グルコース２％／サッカロース１０％を含有する）上で平板培養し、ベクターを第二の再組換え処理により再び失ったクローンを得た（Jaeger et al.1992,Journal of Bacteriology 174:5462-5465)。最少培地プレート（寒天１５ｇ／ｌを有するＣＧＸＩＩ培地（Keilhauer et al.,Journal of Bacteriology 175(1993) 5595-5603））上に、Ｌ−イソロイシン２ｍＭを添加してまたは添加せずに、もしくはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加してまたは添加せずに、接種することにより、ベクターの切り出しによりカナマイシンに感受性であり、イソロイシン要求性であり、かつ不完全ｉｌｖＡ遺伝子（ΔｉｌｖＡ−対立遺伝子）がゲノム中に存在するクローン３６個を単離した。これらのクローンの１つを菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡと命名し、更に使用する。
【００４６】例４Ｃ.グルタミクム中での遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤの発現アセトヒドロキシ酸シンターゼの遺伝子（ｉｌｖＢＮ）およびイソメロレダクターゼの遺伝子（ｉｌｖＣ）（Cordes et al.1992,Gene 112:113-116およびKeilhauer et al. 1993,Journal of Bacteriology 175 5595-5603）およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼの遺伝子（ｉｌｖＤ）（例２）を発現のために、ベクターｐＥＣＭ３中でクローニングした。ベクターｐＥＣＭ３はｐＥＣＭ２の誘導体であり（Jaeger et al.1992,Journal of Bacteriology 174:5462-5465）、これはカナマイシン耐性遺伝子を有する、長さ約１ｋｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩＤＮＡフラグメントの欠失により生じる。
【００４７】ベクターｐＫＫ５（Cordes et al.1992,Gene 112:113-116）中には遺伝子ｉｌｖＢＮＣがすでにベクターｐＪＣ１（Cremer et al.1990,Molecular and General Genetics 220: 478-480）中でクローニングして存在する。これからＸｂａＩ−ｉｌｖＢＮＣ−フラグメント５.７ｋｂを単離し、かつｉｌｖＤ−遺伝子を有するベクターｐＲＶの３.１ｋｂ−ＸｂａＩフラグメントと一緒にＸｂａＩで線状にしたベクターｐＥＣＭ３中に導入した。ここで、この連結配合物をＥ.コリ株ＤＨ５αｍｃｒ中に形質転換した。タイプＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤの形質転換体から、プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ（図３）を得た。
【００４８】エレクトロポレーション（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61: 329-334）およびクロラムフェニコール耐性に対する選択により、プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤを菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ中に導入し、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤが得られた。更にエレクトロポレーション（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61: 329-334）およびカナマイシン耐性に対する選択により、プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを菌株ＡＴＣＣ１３０３２およびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ中に導入し、菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよび菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣが得られた。菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ中にエレクトロポレーション（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61: 329-334）およびカナマイシンおよびクロラムフェニコールに対する選択により、プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよびｐＥＫＥＸ２を導入した。このようにして、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥＸ２およびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣが生じた。
【００４９】例５Ｃ.グルタミクムのパントテン酸要求性ｐａｎＣ−突然変異体の作成不活性化ベクターｐＫ１８ｍｏｂ（Schaefer et al. 1994 Gene 145:69-73）を用いて、Ｃ.グルタミクムＲ１２７ｐａｎＣ突然変異体を製造した。
【００５０】ｐａｎＣ−不活性化ベクターの作成のために、最初にＣ.グルタミクムのｐａｎＣ−遺伝子の１６８ｂｐサイズの中央フラグメント（８７３ｂｐを有する遺伝子のヌクレオチド２６５−４３２）を複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。ここではマトリックスとしては、ベクターｐＵＲ１（例６参照）を使用し；プライマーとしてはプライマー１（２０塩基）およびプライマー２（２０塩基）を使用した：プライマー１ ５′ＧＴＴＣＧＣＡＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧ３′、プライマー２ ５′ＡＴＧＣＡＣＧＡＴＣＡＧＧＧＣＧＣＡＣＣ３′。このＰＣＲをSambrook等（Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press）により、アニーリング温度５５℃で実施した。得られたフラグメントをベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断位に中への中間クローニングした後、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとして、方向付けて不活性ベクターｐＫ１８ｍｏｂ（Schaefer et al.1994,Gene 145:69-73）中に連結した。このようにして得られたベクターｐＫ１８ｍｏｂ′ｐａｎＣ′をＥ.コリ−菌株Ｓ１７−１の形質転換に使用し、引き続き接合によりＣ.グルタミクムＲ１２７中に導入した。カナマイシン耐性に関する選択により、組み込みベクターが相同再組換え処理によりｐａｎＣ−遺伝子中に組み込まれているＣ.グルタミクムＲ１２７のクローンが得られた。そのように得られた菌株Ｒ１２７ｐａｎＣ：：ｐＫ１８ｍｏｂ′ｐａｎＣ′はＤ−パントテネート測定に好適である。
【００５１】例６Ｄ−パントテネートの定量測定Ｄ−パントテネートを定量的に測定するために、その成長が培地のＤ−パントテネートの濃度に直接依存する、Ｃ.グルタミクム突然変異体 Ｒ１２７ｐａｎＣ：：ｐＫ１８ｍｏｂ′ｐａｎＣ′を作成した（例５参照）。この菌株は、パントテン酸要求性であり、β−アラニンおよびＤ−パントエートの補足では全く増殖を示さない。
【００５２】この指示株を用いてパントテネートを測定するために、ＣＧＸＩＩ−培地（Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603）をテスト培地として使用した。このためには４／３倍に濃縮したＣＧＸＩＩ−培地３ｍｌにそれぞれインキュベーション管（Falcon 2057,Becton and Dickinson,New Jersey,USA）中でパントテン酸含有滅菌検量溶液または試料溶液１ｍｌを加え、かつ指示株で接種した。接種体としては指示株のグリセリン培地６０μｌを使用した。３０℃で４０時間インキュベーションした後、テスト配合物の細胞密度（ＯＤ600）（Novaspec 4049 Spectrophotometer,LKB Biochrom,Cambridge）を測定し、検量線を用いてパントテン酸濃度を調べた。この菌株は濃度２５μｇ／ｌまでパントテネート濃度への増殖の直線的依存性を示し、光学密度に関しては０.５〜１０であった。指示株のグリセリン培養物を製造するためには、この菌株を非補足ＣＧＸＩＩ−培地上で２４時間インキュベーションした（Ｄ−パントテネートの完全飢餓）。引き続き、この培養物の１０５０μｌにグリセリン７００μｌを添加した。−７０℃で中間凍結したグリセリン培養物のうちの６０μｌをＤ−パントテネートの測定のために、前記のように使用した。対照として、シグマ社（Firma Sigma:Deisenhofen, Deutschland）購入可能なパントテン酸ナトリウムを使用した。
【００５３】例７種々のＣ.グルタミクム株でのＤ−パントテネートの生産そのパントテネート形成を検査するために、菌株ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡおよびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを脳・心臓注入培地（Brain Heart Infusion-Medium:Difco Laboratories,Detroit,USA）６０ｍｌ中で３０℃で１４時間予培養した。引き続き、この細胞を０.９％ＮａＣｌ−溶液（ｗ／ｖ）で２回洗浄し、この懸濁液をそれぞれＣｇＸＩＩ−培地６０ｍｌで、ＯＤ600が０.５を有するように、接種した。この培地はKeilhauer等（Journal ofBacteriology(1993) 175:5595-5603）により記載された培地と同じであるが、付加的にＬ−イソロイシン２ｍＭを含有する。Keilhauer等により記載された培地ＣｇＸＩＩを表２に記載する。
【００５４】表２培地ＣＧＸＩＩの組成
【００５５】
【表２】
【００５６】菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよび菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣの培養においては、５時間後に培地に付加的にイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド１ｍＭを添加した。２４時間の培養後に、試料を採取し、細胞を遠心分離し、上澄みを滅菌濾紙した。上澄みのパントテネート濃度を例６に記載したパントテネートテストにより測定した。結果を表３中に記載する。
【００５７】表３種々のＣ.グルタミクム株中でのＤ−パントテネート生産
【００５８】
【表３】
【００５９】例９β−アラニン添加において、種々のＣ.グルタミクム株を用いたＤ−パントテネートの生産パントテネートの生産の定量のために、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥｘ２およびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣをカナマイシン２５ｍｇ／ｌおよびクロラムフェニコール３ｍｇ／ｌを含有する脳・心臓注入培地（Difco Laboratories,Detroit,USA）６０ｍｌ中で３０℃で１４時間予培養し、０.９％ＮａＣｌ−溶液（ｗ／ｖ）で２回洗浄し、この懸濁液でそれぞれＣｇＸＩＩ−培地６０ｍｌを、ＯＤ600が０.５を有するように、接種した。この培地はＬ−ロイシン２ｍＭ、カナマイシン２５ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール３ｍｇ／ｌおよびβ−アラニンを最終濃度２０ｍＭで含有する。５時間の培養の後、この培地にそれぞれＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を最終濃度１ｍＭで添加した。４９および７４時間の後、試料を採取し、細胞を遠心分離し、かつ上澄みを滅菌濾過した。上澄みのパントテネート濃度を例６に記載されているように測定した。この結果を４表に示す。
【００６０】表４種々のＣ.グルタミクム株中でのＤ−パントテネートの蓄積
【００６１】
【表４】
【００６２】配列表（１） 書誌的事項（ｉ） 出願人（Ａ）名称：Degussa Aktiengesellschaft（Ｂ）番地：Weissfrauenstr. 9（Ｃ）都市：Frankfurt am Main（Ｄ）州：Hessen（Ｅ）国：Deutschland（Ｆ）郵便番号：D-60311（ｉｉ） 発明の名称：コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡ、形質転換微生物、シャトルベクターおよびパントテン酸の製法（ｉｉｉ） 配列の数：５（ｉｖ） コンピュータ記録方式：（Ａ）記録媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：IBM PC互換（Ｃ）オペレーションシステム：PC-DOS/MS-DOS（Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)（２） 配列番号１に関する情報：（ｉ） 配列の特徴（Ａ）長さ：２１６４塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ（ｉｉｉ） ハイポセティカル：なし（ｉｖ） アンチセンス：なし（ｖｉ） 起源（Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum（Ｂ）株名：ATCC13032（ｉｘ） 配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：３５１．．１１６３（Ｄ）他の情報：/codon_start=351/EC_number=4.1.2.12/product="ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ"/gene="ｐａｎＢ"（ｉｘ） 配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１１６６．．２００２（Ｄ）他の情報：/codon_start=1166/EC_number=6.3.2.1/product="パントテネートシンテターゼ"/gene="ｐａｎＣ"（ｘｉ） 配列番号１：
【００６３】
【外１】
【００６４】
【外２】
【００６５】
【外３】
【００６６】（２） 配列番号２に関する情報：（ｉ） 配列の特徴：（Ａ）長さ：２７１アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：タンパク質（ｘｉ） 配列番号２：
【００６７】
【外４】
【００６８】（２） 配列番号３に関する情報：（ｉ） 配列の特徴：（Ａ）長さ：２７９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：タンパク質（ｘｉ） 配列番号３：
【００６９】
【外５】
【００７０】（２） 配列番号４に関する情報：（ｉ） 配列の特徴（Ａ）長さ：２９５２塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ（ｉｉｉ） ハイポセティカル：なし（ｉｖ） アンチセンス：なし（ｖｉ） 起源（Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum（Ｂ）株名：ATCC13032（Ｃ）個体／単離体：突然変異体Ｒ１２７（ｉｘ） 配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：２９０．．２１２５（Ｄ）他の情報：/codon_start=290/EC_number=4.2.1.9/product="ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ"/gene="ｉｌｖＤ"（ｘｉ） 配列番号４：
【００７１】
【外６】
【００７２】
【外７】
【００７３】
【外８】
【００７４】（２） 配列番号５に関する情報：（ｉ） 配列の特徴：（Ａ）長さ：６１２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：タンパク質（ｘｉ） 配列番号５：
【００７５】
【外９】
【００７６】
【外１０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＲ１の制限地図作成および配列決定したフラグメントの位置を示す図。
【図２】プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣの制限地図を示す図。
【図３】プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤの制限地図を示す図。
【０００１】
【発明の属する技術分野】パントテン酸は化粧品、医薬品、栄養食品及び動物飼料中に使用される商業的に重要なビタミンである。
【０００２】
【従来の技術】パントテン酸は化学合成又は適当な培養液中での適当な微生物の発酵により生物工学的に製造することができる。微生物による生物工学的製造の利点は、パントテン酸の所望の立体異性体Ｄ−形の形成にある。
【０００３】バクテリア、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ.コリ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ及び酵母、例えばＤｅｂａｒｏｍｙｃｅｓｃａｓｔｅｌｌｉｉの多様な種類は、欧州特許出願公開第０４９３０６０号明細書に示されたように、グルコース、ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラニンを含有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生することができる。欧州特許出願公開第０４９３０６０号明細書は、さらに、Ｅ.コリにおいて、プラスミドｐＦＶ３及びｐＦＶ５によるパントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、Ｄ−パントテン酸の生成が改善されることを示している。
【０００４】欧州特許出願公開第０５９０８５７号明細書は、多様な代謝拮抗物、例えばサリチル酸、α−ケト酪酸、β−ヒドロキシアスパラギン酸等に対して耐性を有し、グルコース及びβ−アラニンを含有する培養液中でＤ−パントイン酸およびＤ−パントテン酸を産生するＥ.コリ株に関する。欧州特許出願公開０５９０８５７号明細書中では、さらに、プラスミドｐＦＶ３１上に含まれる正確には特定されていない、Ｅ.コリからのパントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、Ｅ.コリの株中で、Ｄ−パントイン酸およびＤ−パントテン酸の産生が改善されることを示している。
【０００５】ＷＯ９７／１０３４０中では、さらにＥ.コリのパントテン酸を形成する突然変異体中で、酵素のアセトヒドロキシ酸−シンターゼＩＩの活性の向上により、バリン−生合成の酵素、パントテン酸−産生をさらに高めることができることを記載している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、コリネ型のバクテリアを用いてＤ−パントテン酸を発酵的に製造するための改善された方法のための新規な基礎を見出すことである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】ビタミンのパントテン酸は、化粧品、医薬品、栄養食品及び動物飼料中に使用される商業的に重要な生成物である。従って、パントテン酸の改善された製造方法を提供するという一般的興味が生じる。
【０００８】以後、Ｄ−パントテン酸又はパントテン酸又はパントテネートに言及する場合、遊離酸だけでなくＤ−パントテン酸の塩、例えばカルシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩をも意味するものとする。
【０００９】本発明の対象は、ａ）配列番号１に示した、ｐａｎＢ−遺伝子（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）をコードし、ｂ）配列番号１に示した、ｐａｎＣ−遺伝子（パントテネートシンテターゼ）、特にｐａｎＢＣ−オペロンをコードし、かつ場合によりｃ）配列番号４により示されるｉｌｖＤ−遺伝子（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）をコードする群から選択された、前記のヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する、コリネバクテリウム由来の、場合により組み換えられた、コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡである。
【００１０】更に、本発明の対象は、（ｉ）配列番号１、配列番号４中に示されたヌクレオチド配列、（ｉｉ）遺伝学的コードの同義性の範囲内でそれぞれの配列（ｉ）に相当する、配列の少なくとも１つ、または（ｉｉｉ）それぞれ配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補性の配列とハイブリッド形成する配列の少なくとも１つ、および場合により（ｉｉｉｉ）（ｉ）において機能的に中立のセンス突然変異、を有する請求項１記載の複製可能なＤＮＡである。
【００１１】同様に、１個以上の複製可能なＤＮＡ−片の導入により形質転換した、コリネ型微生物、特にコリネバクテリウム属の微生物を請求している。
【００１２】本発明の対象は、Ｄ−パントテン酸の製法でもあり、特にこの酸をすでに生産するコリネ型バクテリアの使用下での製法であり、このバクテリアにおいては遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣは単独または相互に組み合わされて、場合によりｉｌｖＡ−遺伝子中での欠失または遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣまたはｉｌｖＤの強化と組み合わされて強化され、特に過剰発現される。
【００１３】「強化」の概念は、本願明細書において、遺伝子のコピー数を高めるか、強いプロモータを使用するか又は高い比活性を有する相当する酵素をコードする遺伝子を使用することにより、及び場合によりこれらの手法を組み合わせることにより、微生物中で相当するＤＮＡによりコードされる１種以上の酵素の細胞内活性を高めることを意味する。
【００１４】本発明の対象である微生物は、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリンとエタノールとから、特にグルコース又はサッカロースからパントテン酸を製造できる。これはコリネ型バクテリアであり、特にコリネバクテリウム属またはアルトロバクター属のものである。コリネバクテリウム属においては特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの種類が挙げられ、これはこの専門分野においてそのアミノ酸を産生する能力が公知である。この種に属する野生型株には、例えば Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃ.グルタミクム） ＡＴＣＣ１３０３２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ１７９６５及びこれらから誘導された菌株が挙げられる。
【００１５】酵素ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼおよびパントテネートシンターゼをコードする、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの、新規に単離されたＤ−パントテネート生合成遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣ単独または一緒（ｐａｎＢＣ−オペロン）の強化、特に過剰発現により改善された方法でＤ−パントテネートが生産されることが判明した。
【００１６】更に、酵素ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの新規バリン生合成遺伝子の強化された発現がＤ−パントテネートの形成の上昇をもたらすことが確認された。本発明により、この遺伝子の他に、酵素アセトヒドロキシ酸シンテターゼをコードするｉｌｖＢＮ遺伝子および酵素イソメロレダクターゼ（Isomeroreduktase）をコードするｉｌｖＣ−遺伝子の強化された発現もＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのＤ−パントテネート形成を上昇させる。
【００１７】強化(過剰発現)の達成のために、例えば相応する遺伝子のコピー数を高めるか、又は構造遺伝子の上流に存在するプロモーター領域及びレギュレーション領域を突然変異させる。同様に、構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットが作用する。誘導可能なプロモーターにより、付加的に発酵によるパントテネート形成の過程において発現を向上させることができる。ｍ−ＲＮＡの寿命を延長させる手段によっても同様に発現を改善できる。さらに酵素タンパク質の分解を阻害することによっても同様に酵素活性が強化される。遺伝子又は遺伝子構造は異なるコピー数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体中に組み込まれ、増幅され得る。また、さらに該当する遺伝子の過剰発現は、培地組成の変更及び培養操作の変更により達成することができる。これについての手引は、当業者には特にMartin et al.(Bio/Technology 5,137-146(1987)),Guerrero et al.(Gene 138,35-41(1994)),Tsuthiya and Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988)),Eikmanns et al.(Gene 102,93-98(1991)),ヨーロッパ特許明細書EPS 0472869,米国特許4601893,Schwarzer und Puehler(Bio/Technology 9,84-87(1991)),Reinscheidet al.(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132(1994)),LaBarreet al.(Journal of Bacteriology 175,1001-1007(1993)),特許出願 ＷＯ96/15246,Jensen und Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))またはハンドブック(Manual of Methods for General Bacteriology der American Society for Bacteeriology(Washington D.C.,USA,1981))及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書に見ることができる。
【００１８】Ｃ.グルタミクムからのｐａｎＢおよびｐａｎＣの単離のために、まずＥ.コリ中に微生物の遺伝子ライブラリーを作成する。遺伝子ライブラリーの作成は一般に公知の教書及びハンドブックにおいて記載されている。例として、Winnackerの教書：Gene und Klone, Eine Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990)又はSambrook et al.の教書：MolecularCloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)が挙げられる。公知の遺伝子ライブラリーは、Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987))によるλ−ベクター中に作成されたＥ．コリ Ｋ−１２株Ｗ３１１０の遺伝子ライブラリーである。Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996)はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリを記載しており、この遺伝子ライブラリーはコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ(Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164)を用いてＥ．ｃｏｌｉ株Ｋ−１２ ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575）中で作成された。Ｅ．コリ中のＣ.グルタミクムの遺伝子ライブラリーの製造は、ｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)）又はｐＵＣ９（Vieria et al., 1982, Gene, 19:259-268）のようなプラスミドも使用することができる。宿主として特に制限欠失（restriktionsdefekt）及び組換え欠失（rekombinationsdefekt）であるようなＥ．コリ株が適している。これについての例は、Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)に記載された株ＤＨ５αｍｃｒである。
【００１９】この遺伝子ライブラリーは引き続き指示株中へ形質転換（Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 577-580, 1983）又はエレクトロポレーション（Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347）によって導入することができる。この指示株は、検出可能な表現型、例えば栄養要求性を生じさせる重要な遺伝子中に突然変異を有することにおいて優れている。この指示株もしくは突然変異体は公共の供給機関または寄託機関から入手可能であるか、または場合により自ら製造することができる。本発明の範囲内で、ｐａｎＣ遺伝子中に突然変異を有するＥ．コリ突然変異体ＤＶ３９（Vallari and Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164:136-142）が特に重要である。パントテン酸要求性Ｅ．コリ突然変異体に関する他の例は、ｐａｎＢ遺伝子中に突然変異を有し、イール大学のGenetic Stock Center（New Haven、Connecticut、USA 在）から取り寄せることができる菌株ＳＪ２である。更なる例は、本発明において単離されたＣ.グルタミクム突然変異体Ｒ１２７／７であり、これはジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ−遺伝子中で欠失している。指示株、例えばｐａｎＢ−突然変異体ＳＪ２を、重要な遺伝子、例えばｐａｎＢ−遺伝子を有する組換えプラスミドで形質転換し、該当する遺伝子を発現させることにより、この指示株は相応する特性、例えばパントテン酸−要求性に関して原栄養体となる。
【００２０】このように単離された遺伝子もしくはＤＮＡ−フラグメントは、例えばSangeret al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States ofAmerica USA, 74:5463-5467, 1977)に記載されたように配列決定により特性決定された。
【００２１】このようにＣ．グルタミクムの遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣをコードする新規のＤＮＡ−配列が得られ、この配列は配列番号１として本発明の構成要素である。さらに、本発明のＤＮＡ−配列から上記記載の方法を用いて相応する酵素のアミノ酸配列が誘導された。配列番号２中では得られたｐａｎＢ−遺伝子産物の、すなわちケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、および配列番号３中では得られたｐａｎＣ−遺伝子産物の、すなわちパントテネートシンターゼのアミノ酸配列が示されている。更に、Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＤ−遺伝子をコードする新規ＤＮＡ配列が得られ、これは配列番号４として、本発明の構成要素である。配列番号５中には得られたｉｌｖＤ−遺伝子産物の、すなわちジヒドロキシ酸デヒドラターゼのアミノ酸配列が示されている。
【００２２】配列番号１および／または配列番号４から遺伝子コードの同義性（Degeneriertheit）により生じた、コードするＤＮＡ−配列も同様に本発明の構成要素である。同様に、配列番号１および／または配列番号４とハイブリダイズするＤＮＡ−配列も本発明の構成要素である。この専門分野において、さらにタンパク質中での同類アミノ酸置換（konservative Aminosaeureaustausch）、例えばグリシンのアラニンによる置換又はアスパラギン酸のグルタミン酸による置換は「センス突然変異」（sense mutations; Sinnmutationen）として公知であり、このセンス突然変異はタンパク質の活性の根本的な変更を引き起こさない、つまり機能的に中立である。さらに、タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端での変更はその機能に本質的に影響を及ぼさないか、それどころか安定化することもできることは公知である。
【００２３】これについての情報は、当業者は特にBen-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1988)) 及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書に見ることができる。同様にして、配列番号２、配列番号３および／または配列番号５から同様な方法で得られたアミノ酸配列も同様に本発明の構成要素である。
【００２４】このように特徴付けられた遺伝子は、引き続き個々に又は他のものと組み合わせて適当な微生物中で発現させることができる。遺伝子を発現させるもしくは過剰発現させる公知の方法は、さらに発現シグナルを設置することができるプラスミドベクターを用いて増幅することである。プラスミドベクターとして、相応する微生物中で複製可能なものが挙げられる。Ｃ．グルタミクムのためには、例えばベクターｐＥＫＥｘ１（Eikmanns et al.,Gene 102:93-98(1991)）またはｐＺ８−１（ヨーロッパ特許０３７５８８９号明細書）またはｐＥＫＥｘ２（Eikmanns et al.Microbiology 140:1817-1828(1994)）またはｐＥＣＭ２（Jaeger et al.Journal of Bacteriology 174(16):5462-5465(1992)）が挙げられる。この種のプラスミドの例は、菌株ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよびＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ中に含有されているｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよびｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤである。プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣは遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣを有するＥ．コリ／Ｃ.グルタミクムシャトルベクターであり、プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤはｉｌｖＤ遺伝子の他に、ｉｌｖＢＮおよびｉｌｖＣを有するＥ．コリ／Ｃ.グルタミクムシャトルベクターである。
【００２５】更に、遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣ単独の、一緒のまたは遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤと組み合わせての強化はアミノ酸トレオニンおよびイソロイシンの合成の減少した微生物中で有利に作用する。合成の減少は、相当する生合成酵素またはその活性を弱めるかまたは排除することにより達せられる。この例としては、酵素ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼまたはトレオニンデヒドラターゼを挙げることができる。酵素およびその活性を弱くするか、または排除する可能性は、突然変異誘発法である。
【００２６】この方法には、化学試薬、例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたはＵＶ−照射を突然変異誘発に使用し、引き続きＬ−トレオニンまたはＬ−イソロイシンに対する要求性を示す所望の微生物を探す、ランダムな方法が属する。突然変異誘発法および突然変異体探索法は一般に公知であり、特にミラー（Miller:A Short Course in Bacterial Genetics,A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria(Cold Spring HarborLaboratory Press,1992)）により、またはハンドブック"Manual of Methods forGeneral Bacteriology", American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)に記載されている。
【００２７】更に、目標を定めた組換えＤＮＡ−技術もこれに属する。この方法を用いて、例えばトレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ−遺伝子を染色体中で欠失させることができる。このための好適な方法はシェーファー等（Schaefer etal.:Gene(1994)145:69-73）またはリンク等（Link et al.:Journal of Bacteriology(1998)179:6228-6237）により記載されている。遺伝子の一部のみを欠失することもできるし、またはトレオニンデヒドラターゼ遺伝子の突然変異フラグメントを交換することもできる。欠失または交換によりトレオニンデヒドラターゼ活性の消失または減少が達せられる（Moeckel et al.,(1994) Molecular Microbiology 13:833-842;Morbach et al.,(1996) Applied Microbiology and Biotechnology 45:612-620）。この種の突然変異体の例は、ｉｌｖＡ−遺伝子中に欠失を有するＣ.グルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡである。
【００２８】本発明により製造された微生物は、連続的に又は不連続的に、バッチ法（Satzkultivierung）又はフィードバッチ法（fed batch; Zulaufverfahren）又は繰り返しフィードバッチ法（repeated fed batch;repetitives Zulaufverfahren）でパントテン酸−産生の目的で培養することができる。公知の培養法に関する概要はChmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))の教書又はStorhas (Bioreaktorenund periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))の教書に記載されている。
【００２９】使用すべき培養基は適当な手法でそれぞれの微生物の要求を満たさなければならない。多様な微生物の培養基の記載は、ハンドブック"Manual of Methods forGeneral Bacteriology", American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)になされている。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール及び有機酸、例えば酢酸が使用される。この材料は単独で又は混合物として使用することができる。窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、ダイズ粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが使用される。この窒素源は個々に又は混合物として使用することができる。リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することができる。この培養基は、さらに成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを前記の物質に対して付加的に使用することができる。この培養基に更にパントテン酸生産をより上昇するためにパントテン酸の前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン；ケトイソバレレート、ケトパントエート、パントエート及び場合によりこれらの塩を添加することができる。前記の添加物質は培養へ１回のバッチの形で添加するか、又は適当な手法で培養の間に供給することができる。
【００３０】培地のｐＨ−コントロールのために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が適当な手法で使用される。泡形成を制御するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定を維持するために、培地に適当な選択作用する物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気性条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中へ導入する。培地の温度は通常２０℃〜５０℃、有利に２５℃〜４５℃である。パントテン酸の最大量が生成されるまで培養は継続される。この目的は通常１０時間〜１６０時間の間に達成される。
【００３１】生成されたパントテン酸の濃度は、公知の方法（Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)）で測定することができる。パテント酸の微生物学的測定は慣用法で、菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ８０１４を使用する（米国薬局方１９８０；ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９８０）。更に、他の試験微生物、例えばＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ ＮＣＩＢ６９９０をパントテネート濃度の微生物学的測定のために使用する（Sollberg and Hegna;Methods in Enzymology 62,201-204(1979)）。
【００３２】次の微生物をブタペスト条約に従ってDeutsche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託した：Ｅ.コリＫ１２株 ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣをＤＳＭ１２４５６として、Ｅ.コリＫ１２株 ＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤをＤＳＭ１２４５７として、Ｃ.グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡをＤＳＭ１２４５５として。
【００３３】
【実施例】本発明を次に実施例につき詳説する。
【００３４】例１Ｃ．グルタミクムからのパントテネート生合成の遺伝子ｐａｎＢおよびＰａｎＣのクローニングおよび配列決定および発現１． ｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子のクローニングＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２からの染色体ＤＮＡを、SchwarzerおよびPuehler (Bio/Technology 9 (1990)84-87)に記載されたように単離し、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを用いて切断した。ゲル電気泳動による分離の後、３〜７ｋｂもしくは９〜２０ｋｂのサイズ領域のＤＮＡフラグメントを抽出し、次いでベクターｐＢＲ３２２の一本鎖のＢａｍＨＩ切断部位中へ連結させた。この連結配合物を用いてＥ．コリ株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of AmericaUSA, 87 (1990),4645-4649）を形質転換した（Hanahan, Journal of MolecularBiology 166 (1983) 557-580）。インサートを有するクローンをそのテトラサイクリン感度に基づき、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天プレート上に接種することにより同定した。合わせたクローンのプラスミド調製（Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press）により、９〜２０ｋｂのインサートサイズを有するそれぞれ４００のプラスミド８グループ、３〜７ｋｂのインサートサイズを有するそれぞれ５００のプラスミドを有する９グループを単離した。Ｅ．コリのｐａｎＢ突然変異体ＳＪ２（Cronan et al. 1982, Journal of Bacteriology 149: 916-922）をこの遺伝子ライブラリーでエレクトロポレーション（Wehrmann et al. 1994, Microbiology 140: 3349-3356）により形質転換した。この形質転換配合物を、寒天１５ｇ／ｌを有するＣＧＸＩＩ−培地（Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603）上で直接平板培養した。パントテネート補足なしで成長できるクローンからプラスミド−ＤＮＡを単離した（Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press）。８つのプラスミドにおいて、再形質転換により、Ｅ．コリ突然変異体ＳＪ２のｐａｎＢ−欠失を非相同的に相補する能力が確認された。
【００３５】この８つのプラスミドを用いて制限地図作成を実施した。調査したプラスミドベクターの１つ（以後ｐＵＲ１とする）は９．３ｋｂのインサートを有していた（図１）。Ｅ．コリのｐａｎＣ突然変異体ＤＶ３９（Vallari and Rock 1985, Journal of Bacteriology 164: 136-142）の形質転換は、ベクターｐＵＲ１が同様にこの突然変異体のｐａｎＣ欠失を相補することができることを示した。
【００３６】２． ｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子の配列決定ｐＵＲ１のインサート（図１）の２．２ｋｂのサイズのフラグメントを、 Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA, (1977) 74:5463-5467,)のジデオキシ−鎖中断−法により配列決定した。このために、まずエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いてサブクローンを製造し、これを標準プライマー（Universal and reverse primer, Boehringer Mannheim社, Deutschland）を用いて配列決定した。配列決定物のゲル電気泳動分析を、Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)の自動的レーザ−蛍光−シークエンサー装置（A.L.F.）を用いて行った。得られたヌクレオチド配列を、プログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL, Cambrige, GB）を用いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号１として記載した。この分析により２つのオープンリードフレームの同定が示された。８１３ｂｐの長さの第１のオープンリードフレームはｐａｎＢ−遺伝子として同定され、これは２７１個のアミノ酸のポリペプチドをコードし、配列番号２として記載されている。第２のオープンリードフレームはｐａｎＣ−遺伝子として同定され、８３７個の塩基対を有する。これは２７９個のアミノ酸のポリペプチドをコードし、配列番号３として記載されている。
【００３７】３. ｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子の発現遺伝子ｐａｎＢおよびｐａｎＣをＣ．グルタミクム発現ベクターｐＥＫＥｘ２中でクローニングした（Eikmanns et al.,1994,Microbiology 140:1817-1828(1994)）、この中でこれら両方の遺伝子は強力な、ＩＰＴＧにより誘発可能なｔａｃ−プロモータの制御下に存在している。このクローニングを２工程で実施した。最初にＰＣＲによりｐａｎＢ遺伝子の開始部分を増幅した。このためにはｐａｎＢの開始コドンの前に相応するプライマー１９ｂｐを用いてＳａｌＩ−切断位を導入した（プライマー１：５′ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＣＡＴＧＣＣＣ３′）。第２のプライマーを、ｐａｎＢが内部ＥｃｏＲＩ切断位を増幅したフラグメント中に有しているように選択した（プライマー２：５′ＡＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＣ３′）。このＰＣＲをアニーリング温度６２℃およびプラスミドｐＵＲ１をマトリックスとして用いて、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))に記載されているように実施した。得られた４６８ｂｐサイズのＰＣＲ−生成物を制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、同様に処理したベクターｐＥＫＥｘ２中に連結した。連結配合物でＥ.コリ株ＤＨ５αｍｃｒを形質転換した。タイプＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢ′の形質転換体からベクターｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢ′を単離した。
【００３８】このプラスミドｐＵＲ１からｐａｎＢＣ−クラスターの第二の半分を有する１７６１ｂｐサイズのＥｃｏＲＩフラグメントを制限消化により切り離した。これをｐａｎＢのＰＣＲ−生成物を含有する、予めＥｃｏＲＩで線状にされたｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢ′ベクター中でクローニングした。相応する連結配合物でＥ.コリ菌株ＤＨ５αｍｃｒを形質転換した。タイプＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣの形質転換体から、ｐａｎＢＣ−クラスターがｔａｃ−プロモータの制御下にあるベクターｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ（図２）を単離した。
【００３９】例２Ｃ.グルタミクムからのジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ−遺伝子のクローニングおよび配列決定１. Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＤ突然変異体の単離菌株Ｃ.グルタミクムＲ１２７（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61:329-334）をＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで突然変異させた（Sambrook et al. Molecular cloning: A laboratory manual, (1989) ColdSpring Harbor Laboratory Press）。このためには一夜培養したＣ.グルタミクム培養物５ｍｌにＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（５ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド）２５０μｌを加え、３０℃および２００ｒｐｍで３０分間インキュベートした（Adelberg 1958,Journal of Bacteriology 76:326）。引き続き、細胞を滅菌ＮａＣｌ溶液（０.９％）で２回洗浄した。寒天１５ｇ／ｌを有する最少培地プレートＣＧＸＩＩ上でレプリカ平板法を実施することにより（Keilhauer et al.:Journal of Bacteriology 175:5595-5603）、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−ロイシンの添加（それぞれ０.１ｇ／ｌ）においてのみ成長する突然変異体を単離した。
【００４０】ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性を、この突然変異体の粗抽出物中で測定した。このためにはこのクローンをＬＢ−培地６０ｍｌ中で培養し、指数増殖期に遠心分離した。細胞ペレットを０.０５Ｍリン酸カリウム緩衝液で１回洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁させた。細胞の砕解は１０分間の超音波処理（Branson-Sonifier W-250,Branson Sonic Power Co,Danbury,USA）により実施した。引き続き、細胞砕片を１３０００ｒｐｍおよび４℃で３０分間遠心分離することにより分離し、上澄みを粗抽出物として、酵素テストに使用した。酵素テストの反応配合物は０.２５Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８ ０.２ｍｌ、粗抽出物０.０５ｍｌ、および６５ｍＭα,β−ジヒドロキシ−β−メチルバレエート０.１５ｍｌを含有する。このテスト配合物を３０℃でインキュベーションし、１０、２０および３０分後に試料２００μｌを採取し、そのケトメチルバレエートの濃度をＨＰＬＣ−分析により測定した（Hara et al. 1985,Analytica Chimica Acta 172:167-173)。表１が示すように、菌株Ｒ１２７／７はジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を全く示さず、これに対してイソメロレダクターゼおよびアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性がその他の分枝鎖アミノ酸の合成の酵素としてなお存在する。
【００４１】表１Ｃ.グルタミクム株中の種々の酵素の比活性（μｍｏｌ／分およびｍｇ蛋白質）
【００４２】
【表１】
【００４３】２. Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＤ−遺伝子のクローニングＣ．グルタミクム Ｒ１２７からの染色体ＤＮＡを、SchwarzerおよびPuehler(Bio/Technology 9 (1990)84-87)に記載されたように単離した。これを制限酵素Ｓａｕ３Ａ（Boehringer Mannheim）を用いて切断し、ショ糖濃度勾配遠心分離（Sambrook et al. Molecular cloning: A laboratory manual, (1989) ColdSpring Harbour Laboratory Press）により分離した。約６〜１０ｋｂサイズのフラグメントを有するフラクションをベクターｐＪＣ１（Cremer et al.,Molecular and General Genetics 220(1990) 478-480）との連結に使用した。このためにこのベクターｐＪＣ１をＢａｍＨＩで線状にし、脱ホスホリル化した。そのうちの５ｎｇを前記染色体ＤＮＡのフラクション２０ｎｇと連結し、これで突然変異体Ｒ１２７／７をエレクトロポレーション（Haynes und Britz,FEMS Microbiology Letters 61 (1989) 329-334）により形質転換した。この形質転換体を分枝鎖状アミノ酸の添加なしにＣＧＸＩＩ寒天培地上で増殖する能力に関してテストした。試験した５０００を越える形質転換体に関して、レプリカ平板法および２日間の３０℃でのインキュベーションの後、最少培地プレート上に８個のクローンが増殖した。このクローンからのプラスミド調製をSchwarzer等(Bio/Technology 9 (1990)84-87)に記載されたように実施した。このプラスミド−ＤＮＡの制限分析はクローン８個の全て中で同じプラスミド、以降ｐＲＶと呼ぶ、を有することを示した。このプラスミドは４.３ｋｂのインサートを有し、再形質転換によりそのｉｌｖＤ−突然変異体Ｒ１２７／７を相補する能力に関してこれを試験した。サブクローニングにより突然変異体Ｒ１２７／７の相補性に関与する領域を２.９ｋｂのＳｃａＩ／ＸｈｏＩフラグメントに限定した。
【００４４】３. ｉｌｖＤ−遺伝子の配列決定２.９ｋｂのＳｃａＩ／ＸｈｏＩ−フラグメントの核酸配列をザンガー（Sanger）等のジデオキシ−鎖中断−法により行った(Proceedings of the National ofSciences of the United States of America USA (1977) 74:5463-5467)。この際、オートリード配列決定キットを使用した（Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Schweden）。ゲル電気泳動分析を、Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)の自動的レーザ−蛍光−シークエンサー装置（A.L.F.）を用いて行った。得られたヌクレオチド配列を、プログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release4.0, EMBL, Cambrige, GB）を用いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号４として記載した。この分析により塩基対１８３６個を有する１つのオープンリードフレームが得られ、これはｉｌｖＤ−遺伝子として同定され、６１２個のアミノ酸のポリペプチドをコードし、配列番号５として記載されている。
【００４５】例３Ｃ.グルタミクムのｉｌｖＡ欠失突然変異体の作成Ｃ.グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｉｌｖＡ−遺伝子中に欠失を設けることはSchaefer等（Gene 145:69-73(1994))により記載された遺伝子交換のためのシステムで実施した。不活性化ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡの作成のためには最初にベクターｐＢＭ２１（Moeckel et al.1994,Molecular Microbiology 13:833-842）中のＥｃｏＲＩ−フラグメント上に存在するｉｌｖＡ−遺伝子から内部ＢｇｌＩＩ−フラグメント２４１ｂｐを除去した。このためにはこのベクターをＢｇｌＩＩで切断し、ｉｌｖＡ内部ＢｇｌＩＩ−フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した後、再連結した。引き続き、ベクターからこの不完全な遺伝子をＥｃｏＲＩ−フラグメントとして単離し、かつＥｃｏＲＩで線状にしたベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（Schaefer 1994,Gene 145:69-73）に連結した。得られた不活性化ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｉｌｖＡを形質転換によりＥ.コリ株Ｓ１７−１中に導入し（Hanahan 1983,Journal of Molecular Biology 166:557-580）、かつ接合により、Ｃ.グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を形質転換する（Schaefer et al.1990,Journal of Bacteriology 172:1663-1666）。Ｃ.グルタミクムのカナマイシン耐性クローンが得られ、これには不活性化ベクターがゲノム中に組み込まれて存在する。ベクターの切り出しを選択するために、カナマイシン耐性クローンをサッカロース含有ＬＢ−培地（（Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold SpringHarbour Laboratory Press）、寒天１５ｇ／ｌ、グルコース２％／サッカロース１０％を含有する）上で平板培養し、ベクターを第二の再組換え処理により再び失ったクローンを得た（Jaeger et al.1992,Journal of Bacteriology 174:5462-5465)。最少培地プレート（寒天１５ｇ／ｌを有するＣＧＸＩＩ培地（Keilhauer et al.,Journal of Bacteriology 175(1993) 5595-5603））上に、Ｌ−イソロイシン２ｍＭを添加してまたは添加せずに、もしくはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加してまたは添加せずに、接種することにより、ベクターの切り出しによりカナマイシンに感受性であり、イソロイシン要求性であり、かつ不完全ｉｌｖＡ遺伝子（ΔｉｌｖＡ−対立遺伝子）がゲノム中に存在するクローン３６個を単離した。これらのクローンの１つを菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡと命名し、更に使用する。
【００４６】例４Ｃ.グルタミクム中での遺伝子ｉｌｖＢＮ、ｉｌｖＣおよびｉｌｖＤの発現アセトヒドロキシ酸シンターゼの遺伝子（ｉｌｖＢＮ）およびイソメロレダクターゼの遺伝子（ｉｌｖＣ）（Cordes et al.1992,Gene 112:113-116およびKeilhauer et al. 1993,Journal of Bacteriology 175 5595-5603）およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼの遺伝子（ｉｌｖＤ）（例２）を発現のために、ベクターｐＥＣＭ３中でクローニングした。ベクターｐＥＣＭ３はｐＥＣＭ２の誘導体であり（Jaeger et al.1992,Journal of Bacteriology 174:5462-5465）、これはカナマイシン耐性遺伝子を有する、長さ約１ｋｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩＤＮＡフラグメントの欠失により生じる。
【００４７】ベクターｐＫＫ５（Cordes et al.1992,Gene 112:113-116）中には遺伝子ｉｌｖＢＮＣがすでにベクターｐＪＣ１（Cremer et al.1990,Molecular and General Genetics 220: 478-480）中でクローニングして存在する。これからＸｂａＩ−ｉｌｖＢＮＣ−フラグメント５.７ｋｂを単離し、かつｉｌｖＤ−遺伝子を有するベクターｐＲＶの３.１ｋｂ−ＸｂａＩフラグメントと一緒にＸｂａＩで線状にしたベクターｐＥＣＭ３中に導入した。ここで、この連結配合物をＥ.コリ株ＤＨ５αｍｃｒ中に形質転換した。タイプＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤの形質転換体から、プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ（図３）を得た。
【００４８】エレクトロポレーション（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61: 329-334）およびクロラムフェニコール耐性に対する選択により、プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤを菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ中に導入し、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤが得られた。更にエレクトロポレーション（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61: 329-334）およびカナマイシン耐性に対する選択により、プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを菌株ＡＴＣＣ１３０３２およびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ中に導入し、菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよび菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣが得られた。菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ中にエレクトロポレーション（Haynes 1989,FEMS Microbiology Letters 61: 329-334）およびカナマイシンおよびクロラムフェニコールに対する選択により、プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよびｐＥＫＥＸ２を導入した。このようにして、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥＸ２およびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣが生じた。
【００４９】例５Ｃ.グルタミクムのパントテン酸要求性ｐａｎＣ−突然変異体の作成不活性化ベクターｐＫ１８ｍｏｂ（Schaefer et al. 1994 Gene 145:69-73）を用いて、Ｃ.グルタミクムＲ１２７ｐａｎＣ突然変異体を製造した。
【００５０】ｐａｎＣ−不活性化ベクターの作成のために、最初にＣ.グルタミクムのｐａｎＣ−遺伝子の１６８ｂｐサイズの中央フラグメント（８７３ｂｐを有する遺伝子のヌクレオチド２６５−４３２）を複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。ここではマトリックスとしては、ベクターｐＵＲ１（例６参照）を使用し；プライマーとしてはプライマー１（２０塩基）およびプライマー２（２０塩基）を使用した：プライマー１ ５′ＧＴＴＣＧＣＡＣＣＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧ３′、プライマー２ ５′ＡＴＧＣＡＣＧＡＴＣＡＧＧＧＣＧＣＡＣＣ３′。このＰＣＲをSambrook等（Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press）により、アニーリング温度５５℃で実施した。得られたフラグメントをベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断位に中への中間クローニングした後、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとして、方向付けて不活性ベクターｐＫ１８ｍｏｂ（Schaefer et al.1994,Gene 145:69-73）中に連結した。このようにして得られたベクターｐＫ１８ｍｏｂ′ｐａｎＣ′をＥ.コリ−菌株Ｓ１７−１の形質転換に使用し、引き続き接合によりＣ.グルタミクムＲ１２７中に導入した。カナマイシン耐性に関する選択により、組み込みベクターが相同再組換え処理によりｐａｎＣ−遺伝子中に組み込まれているＣ.グルタミクムＲ１２７のクローンが得られた。そのように得られた菌株Ｒ１２７ｐａｎＣ：：ｐＫ１８ｍｏｂ′ｐａｎＣ′はＤ−パントテネート測定に好適である。
【００５１】例６Ｄ−パントテネートの定量測定Ｄ−パントテネートを定量的に測定するために、その成長が培地のＤ−パントテネートの濃度に直接依存する、Ｃ.グルタミクム突然変異体 Ｒ１２７ｐａｎＣ：：ｐＫ１８ｍｏｂ′ｐａｎＣ′を作成した（例５参照）。この菌株は、パントテン酸要求性であり、β−アラニンおよびＤ−パントエートの補足では全く増殖を示さない。
【００５２】この指示株を用いてパントテネートを測定するために、ＣＧＸＩＩ−培地（Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603）をテスト培地として使用した。このためには４／３倍に濃縮したＣＧＸＩＩ−培地３ｍｌにそれぞれインキュベーション管（Falcon 2057,Becton and Dickinson,New Jersey,USA）中でパントテン酸含有滅菌検量溶液または試料溶液１ｍｌを加え、かつ指示株で接種した。接種体としては指示株のグリセリン培地６０μｌを使用した。３０℃で４０時間インキュベーションした後、テスト配合物の細胞密度（ＯＤ600）（Novaspec 4049 Spectrophotometer,LKB Biochrom,Cambridge）を測定し、検量線を用いてパントテン酸濃度を調べた。この菌株は濃度２５μｇ／ｌまでパントテネート濃度への増殖の直線的依存性を示し、光学密度に関しては０.５〜１０であった。指示株のグリセリン培養物を製造するためには、この菌株を非補足ＣＧＸＩＩ−培地上で２４時間インキュベーションした（Ｄ−パントテネートの完全飢餓）。引き続き、この培養物の１０５０μｌにグリセリン７００μｌを添加した。−７０℃で中間凍結したグリセリン培養物のうちの６０μｌをＤ−パントテネートの測定のために、前記のように使用した。対照として、シグマ社（Firma Sigma:Deisenhofen, Deutschland）購入可能なパントテン酸ナトリウムを使用した。
【００５３】例７種々のＣ.グルタミクム株でのＤ−パントテネートの生産そのパントテネート形成を検査するために、菌株ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡおよびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを脳・心臓注入培地（Brain Heart Infusion-Medium:Difco Laboratories,Detroit,USA）６０ｍｌ中で３０℃で１４時間予培養した。引き続き、この細胞を０.９％ＮａＣｌ−溶液（ｗ／ｖ）で２回洗浄し、この懸濁液をそれぞれＣｇＸＩＩ−培地６０ｍｌで、ＯＤ600が０.５を有するように、接種した。この培地はKeilhauer等（Journal ofBacteriology(1993) 175:5595-5603）により記載された培地と同じであるが、付加的にＬ−イソロイシン２ｍＭを含有する。Keilhauer等により記載された培地ＣｇＸＩＩを表２に記載する。
【００５４】表２培地ＣＧＸＩＩの組成
【００５５】
【表２】
【００５６】菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣおよび菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣの培養においては、５時間後に培地に付加的にイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド１ｍＭを添加した。２４時間の培養後に、試料を採取し、細胞を遠心分離し、上澄みを滅菌濾紙した。上澄みのパントテネート濃度を例６に記載したパントテネートテストにより測定した。結果を表３中に記載する。
【００５７】表３種々のＣ.グルタミクム株中でのＤ−パントテネート生産
【００５８】
【表３】
【００５９】例９β−アラニン添加において、種々のＣ.グルタミクム株を用いたＤ−パントテネートの生産パントテネートの生産の定量のために、菌株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥｘ２およびＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣをカナマイシン２５ｍｇ／ｌおよびクロラムフェニコール３ｍｇ／ｌを含有する脳・心臓注入培地（Difco Laboratories,Detroit,USA）６０ｍｌ中で３０℃で１４時間予培養し、０.９％ＮａＣｌ−溶液（ｗ／ｖ）で２回洗浄し、この懸濁液でそれぞれＣｇＸＩＩ−培地６０ｍｌを、ＯＤ600が０.５を有するように、接種した。この培地はＬ−ロイシン２ｍＭ、カナマイシン２５ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール３ｍｇ／ｌおよびβ−アラニンを最終濃度２０ｍＭで含有する。５時間の培養の後、この培地にそれぞれＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を最終濃度１ｍＭで添加した。４９および７４時間の後、試料を採取し、細胞を遠心分離し、かつ上澄みを滅菌濾過した。上澄みのパントテネート濃度を例６に記載されているように測定した。この結果を４表に示す。
【００６０】表４種々のＣ.グルタミクム株中でのＤ−パントテネートの蓄積
【００６１】
【表４】
【００６２】配列表（１） 書誌的事項（ｉ） 出願人（Ａ）名称：Degussa Aktiengesellschaft（Ｂ）番地：Weissfrauenstr. 9（Ｃ）都市：Frankfurt am Main（Ｄ）州：Hessen（Ｅ）国：Deutschland（Ｆ）郵便番号：D-60311（ｉｉ） 発明の名称：コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡ、形質転換微生物、シャトルベクターおよびパントテン酸の製法（ｉｉｉ） 配列の数：５（ｉｖ） コンピュータ記録方式：（Ａ）記録媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：IBM PC互換（Ｃ）オペレーションシステム：PC-DOS/MS-DOS（Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)（２） 配列番号１に関する情報：（ｉ） 配列の特徴（Ａ）長さ：２１６４塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ（ｉｉｉ） ハイポセティカル：なし（ｉｖ） アンチセンス：なし（ｖｉ） 起源（Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum（Ｂ）株名：ATCC13032（ｉｘ） 配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：３５１．．１１６３（Ｄ）他の情報：/codon_start=351/EC_number=4.1.2.12/product="ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ"/gene="ｐａｎＢ"（ｉｘ） 配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１１６６．．２００２（Ｄ）他の情報：/codon_start=1166/EC_number=6.3.2.1/product="パントテネートシンテターゼ"/gene="ｐａｎＣ"（ｘｉ） 配列番号１：
【００６３】
【外１】
【００６４】
【外２】
【００６５】
【外３】
【００６６】（２） 配列番号２に関する情報：（ｉ） 配列の特徴：（Ａ）長さ：２７１アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：タンパク質（ｘｉ） 配列番号２：
【００６７】
【外４】
【００６８】（２） 配列番号３に関する情報：（ｉ） 配列の特徴：（Ａ）長さ：２７９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：タンパク質（ｘｉ） 配列番号３：
【００６９】
【外５】
【００７０】（２） 配列番号４に関する情報：（ｉ） 配列の特徴（Ａ）長さ：２９５２塩基対（Ｂ）配列の型：ヌクレオチド（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ（ｉｉｉ） ハイポセティカル：なし（ｉｖ） アンチセンス：なし（ｖｉ） 起源（Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum（Ｂ）株名：ATCC13032（Ｃ）個体／単離体：突然変異体Ｒ１２７（ｉｘ） 配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：２９０．．２１２５（Ｄ）他の情報：/codon_start=290/EC_number=4.2.1.9/product="ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ"/gene="ｉｌｖＤ"（ｘｉ） 配列番号４：
【００７１】
【外６】
【００７２】
【外７】
【００７３】
【外８】
【００７４】（２） 配列番号５に関する情報：（ｉ） 配列の特徴：（Ａ）長さ：６１２アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ） 配列の種類：タンパク質（ｘｉ） 配列番号５：
【００７５】
【外９】
【００７６】
【外１０】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＲ１の制限地図作成および配列決定したフラグメントの位置を示す図。
【図２】プラスミドｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣの制限地図を示す図。
【図３】プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤの制限地図を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】ａ）配列番号１に示した、ｐａｎＢ−遺伝子（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）をコードし、ｂ）配列番号１に示した、ｐａｎＣ−遺伝子（パントテネートシンテターゼ）、特にｐａｎＢＣ−オペロンをコードし、かつ場合によりｃ）配列番号４により示されるｉｌｖＤ−遺伝子（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）をコードする群から選択された、ヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する、コリネバクテリウム由来の、場合により組み換えられた、コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡ。
【請求項２】（ｉ）配列番号１、配列番号４中に示されたヌクレオチド配列、（ｉｉ）遺伝学的コードの同義性の範囲内でそれぞれの配列（ｉ）に相当する、配列の少なくとも１つ、または（ｉｉｉ）それぞれ配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補性の配列とハイブリッド形成する配列の少なくとも１つ、および場合により（ｉｉｉｉ）（ｉ）において機能的に中立のセンス突然変異、を有する、請求項１記載の複製可能なＤＮＡ。
【請求項３】 請求項１または２記載の複製可能なＤＮＡ１種以上を導入することにより形質転換した微生物、特にコリネバクテリウム属の微生物。
【請求項４】 Ｅ.コリＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤとして、ＤＳＭ１２４５７という名称で寄託された、図３に示した制限地図を有することを特徴とする、シャトルベクター ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ。
【請求項５】 Ｅ.コリＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣとして、ＤＳＭ１２４５６という名称で寄託された、図２に示した制限地図を有することを特徴とする、シャトルベクター ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ。
【請求項６】 パントテン酸を製造する方法において、コリネバクテリウム属の微生物中でｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子および場合により相応する酵素をコードするその他のヌクレオチド配列を強化し（過剰発現させ）、かつこの微生物を発酵に使用することを特徴とする、パントテン酸の製法。
【請求項７】 付加的にｉｌｖＤ−遺伝子を強化する（過剰発現させる）、請求項６記載の製法。
【請求項８】 付加的に遺伝子ｉｌｖＢＮＣＤを強化する（過剰発現させる）請求項６または７記載の製法。
【請求項９】 強化を達成するために、微生物中での遺伝子もしくはヌクレオチド配列のコピー数を、該遺伝子もしくはヌクレオチド配列を有するプラスミドベクターで形質転換することにより上昇させる、請求項６または７記載の製法。
【請求項１０】 強化を達成するために、構造遺伝子の上流に存在するプロモータ領域及びレギュレーション領域を突然変異させる、請求項６または７記載の製法。
【請求項１１】 強化を達成するために、構造遺伝子の上流に発現カセットを組み込む、請求項６または７記載の製法。
【請求項１２】 強化の達成のために、上記の配列からマトリックスとして読み取られるｍＲＮＡの寿命を延長し、および／または相応する酵素タンパク質の分解を阻害する、請求項６または７記載の製法。
【請求項１３】 請求項１記載の遺伝子を、更なる代謝物質−耐性突然変異もしくは代謝拮抗物質−耐性突然変異を有するコリネバクテリウム中で過剰発現させる、請求項６から１２までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１４】 過剰発現を達成するために、培養基および／または発酵操作を変更する、請求項６から１２までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１５】 微生物中のパントテネート−（パントテン酸）−形成を低下させる物質代謝経路の少なくとも１つを遮断する、請求項６から１４までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１６】 該遺伝子の１種以上に付加的に、パントテン酸形成の物質代謝経路のそれ以外の遺伝子を個々に又は一緒に過剰発現する微生物を使用する、請求項６から１５までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１７】 物質代謝経路においてｉｌｖＡ−遺伝子を遮断する、請求項１５記載の製法。
【請求項１８】 シャトルベクターｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤを含有するコリネバクテリウム属の微生物を使用する、請求項６から１７までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１９】 シャトルベクターｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを含有するコリネバクテリウム属の微生物を使用する、請求項６から１７までのいずれか１項記載の製法。
【請求項２０】ａ） 少なくともｐａｎＢ−遺伝子またはｐａｎＣ−遺伝子の１つを、有利にはｐａｎＢＣ−遺伝子を、場合によりｉｌｖＤ−遺伝子と組み合わせて強化し（過剰発現させ）、かつｂ） 培地中又は微生物の細胞中でパントテン酸を富化し、ｃ） パントテン酸を単離する、請求項１から１９までのいずれか１項記載のコリネバクテリウム属の微生物の発酵によるパントテン酸の製造方法。
【請求項２１】 発酵の間に、アスパルテート、β−アラニン、ケトイソバレレート、ケトパントエート又はパントエートの群から選択されるパントテン酸の前駆体を添加する、請求項１９又は２０記載の製法。
【請求項１】ａ）配列番号１に示した、ｐａｎＢ−遺伝子（ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）をコードし、ｂ）配列番号１に示した、ｐａｎＣ−遺伝子（パントテネートシンテターゼ）、特にｐａｎＢＣ−オペロンをコードし、かつ場合によりｃ）配列番号４により示されるｉｌｖＤ−遺伝子（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ）をコードする群から選択された、ヌクレオチド配列を少なくとも１つ有する、コリネバクテリウム由来の、場合により組み換えられた、コリネバクテリウム属の微生物中で複製可能なＤＮＡ。
【請求項２】（ｉ）配列番号１、配列番号４中に示されたヌクレオチド配列、（ｉｉ）遺伝学的コードの同義性の範囲内でそれぞれの配列（ｉ）に相当する、配列の少なくとも１つ、または（ｉｉｉ）それぞれ配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補性の配列とハイブリッド形成する配列の少なくとも１つ、および場合により（ｉｉｉｉ）（ｉ）において機能的に中立のセンス突然変異、を有する、請求項１記載の複製可能なＤＮＡ。
【請求項３】 請求項１または２記載の複製可能なＤＮＡ１種以上を導入することにより形質転換した微生物、特にコリネバクテリウム属の微生物。
【請求項４】 Ｅ.コリＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤとして、ＤＳＭ１２４５７という名称で寄託された、図３に示した制限地図を有することを特徴とする、シャトルベクター ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ。
【請求項５】 Ｅ.コリＤＨ５αｍｃｒ／ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣとして、ＤＳＭ１２４５６という名称で寄託された、図２に示した制限地図を有することを特徴とする、シャトルベクター ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ。
【請求項６】 パントテン酸を製造する方法において、コリネバクテリウム属の微生物中でｐａｎＢ−遺伝子およびｐａｎＣ−遺伝子および場合により相応する酵素をコードするその他のヌクレオチド配列を強化し（過剰発現させ）、かつこの微生物を発酵に使用することを特徴とする、パントテン酸の製法。
【請求項７】 付加的にｉｌｖＤ−遺伝子を強化する（過剰発現させる）、請求項６記載の製法。
【請求項８】 付加的に遺伝子ｉｌｖＢＮＣＤを強化する（過剰発現させる）請求項６または７記載の製法。
【請求項９】 強化を達成するために、微生物中での遺伝子もしくはヌクレオチド配列のコピー数を、該遺伝子もしくはヌクレオチド配列を有するプラスミドベクターで形質転換することにより上昇させる、請求項６または７記載の製法。
【請求項１０】 強化を達成するために、構造遺伝子の上流に存在するプロモータ領域及びレギュレーション領域を突然変異させる、請求項６または７記載の製法。
【請求項１１】 強化を達成するために、構造遺伝子の上流に発現カセットを組み込む、請求項６または７記載の製法。
【請求項１２】 強化の達成のために、上記の配列からマトリックスとして読み取られるｍＲＮＡの寿命を延長し、および／または相応する酵素タンパク質の分解を阻害する、請求項６または７記載の製法。
【請求項１３】 請求項１記載の遺伝子を、更なる代謝物質−耐性突然変異もしくは代謝拮抗物質−耐性突然変異を有するコリネバクテリウム中で過剰発現させる、請求項６から１２までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１４】 過剰発現を達成するために、培養基および／または発酵操作を変更する、請求項６から１２までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１５】 微生物中のパントテネート−（パントテン酸）−形成を低下させる物質代謝経路の少なくとも１つを遮断する、請求項６から１４までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１６】 該遺伝子の１種以上に付加的に、パントテン酸形成の物質代謝経路のそれ以外の遺伝子を個々に又は一緒に過剰発現する微生物を使用する、請求項６から１５までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１７】 物質代謝経路においてｉｌｖＡ−遺伝子を遮断する、請求項１５記載の製法。
【請求項１８】 シャトルベクターｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤを含有するコリネバクテリウム属の微生物を使用する、請求項６から１７までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１９】 シャトルベクターｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを含有するコリネバクテリウム属の微生物を使用する、請求項６から１７までのいずれか１項記載の製法。
【請求項２０】ａ） 少なくともｐａｎＢ−遺伝子またはｐａｎＣ−遺伝子の１つを、有利にはｐａｎＢＣ−遺伝子を、場合によりｉｌｖＤ−遺伝子と組み合わせて強化し（過剰発現させ）、かつｂ） 培地中又は微生物の細胞中でパントテン酸を富化し、ｃ） パントテン酸を単離する、請求項１から１９までのいずれか１項記載のコリネバクテリウム属の微生物の発酵によるパントテン酸の製造方法。
【請求項２１】 発酵の間に、アスパルテート、β−アラニン、ケトイソバレレート、ケトパントエート又はパントエートの群から選択されるパントテン酸の前駆体を添加する、請求項１９又は２０記載の製法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０００−１６６５８０（Ｐ２０００−１６６５８０Ａ）
【公開日】平成１２年６月２０日（２０００．６．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−３４２５０９
【出願日】平成１１年１２月１日（１９９９．１２．１）
【出願人】（５９９０２０００３）デグサ−ヒュルス アクチェンゲゼルシャフト (2)
【出願人】（５９９０００１４２）フォルシュングスツェントルム ユーリッヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【公開日】平成１２年６月２０日（２０００．６．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年１２月１日（１９９９．１２．１）
【出願人】（５９９０２０００３）デグサ−ヒュルス アクチェンゲゼルシャフト (2)
【出願人】（５９９０００１４２）フォルシュングスツェントルム ユーリッヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
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