ポリヌクレオチドシーケンス法
【課題】ポリヌクレオチドシーケンスの解読効率と解読精度とを両立することが出来る方法を提供する。
【解決手段】以下の工程を含むポリヌクレオチドシーケンス法；(a)長鎖核酸の断片配列を有する複数分子の鋳型核酸Xから得た複数分子のプライマー結合鋳型核酸にプライマーをハイブリダイズする工程、(b)可逆的ターミネータヌクレオチドN(T)とヌクレオチドNとを含む相補鎖合成基質を用いて複数分子間での異なる位置で合成を停止させ複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖e(T)を得る工程、(c)相補鎖e(T)においてターミネータを開裂させる工程、(d)シグナル物質標識ヌクレオチドアナログN(L)である相補鎖合成基質を用いて上記異なる位置から伸長させることにより複数種の相補鎖(L)を得るとともに複数種の相補鎖(L)を１分子毎にシーケンスし、長鎖核酸の断片配列の部分配列を決定する工程。
【解決手段】以下の工程を含むポリヌクレオチドシーケンス法；(a)長鎖核酸の断片配列を有する複数分子の鋳型核酸Xから得た複数分子のプライマー結合鋳型核酸にプライマーをハイブリダイズする工程、(b)可逆的ターミネータヌクレオチドN(T)とヌクレオチドNとを含む相補鎖合成基質を用いて複数分子間での異なる位置で合成を停止させ複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖e(T)を得る工程、(c)相補鎖e(T)においてターミネータを開裂させる工程、(d)シグナル物質標識ヌクレオチドアナログN(L)である相補鎖合成基質を用いて上記異なる位置から伸長させることにより複数種の相補鎖(L)を得るとともに複数種の相補鎖(L)を１分子毎にシーケンスし、長鎖核酸の断片配列の部分配列を決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分野において用いられる核酸配列決定に関する。より具体的には、本発明は、ポリヌクレオチドシーケンスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡシーケンス法として、ショットガン法が知られている。ショットガン法においては、超音波処理によって断片化されたＤＮＡ断片をサンガー法で解析する。なお、サンガー法における解読長は９００塩基、スループットは０．００００９Ｇｂ／ｒｕｎすなわち０．０００７２Ｇｂ／日である（非特許文献１：www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/dl/21-5-1.pdf）。
【０００３】
その後、技術革新が起こり、ＤＮＡシーケンス法においては、並列処理を行うことで高スループットを実現した次世代型のゲノムシーケンサを用いることが一般的となっている。並列処理の方法は、基板上に鋳型ＤＮＡを固定化し、ヌクレオチド合成の過程を顕微鏡などで同時に観察することによって実現している。シグナルの取得やヌクレオチド合成方法には様々あり、パイロシーケンス（Roche社）、ＳＢＳ（sequence by synthesis）（helicos社、Illumina社）、ＳＢＨ（sequence by hybridyzation）、及びＳＢＬ（sequence by oligo ligation and detection）（Applied Biosystems社）がその代表的なものである。
ＤＮＡシーケンス法がサンガー法から並列処理が可能な方法に変わっても、ＤＮＡ断片の前処理には超音波が用いられており、次世代型のゲノムシーケンサではショットガン法と基板上合成による並列処理とが組み合わされていることが一般的である。
【０００４】
より具体的には、ＳＢＳ法（特許文献１：米国特許第４８６３８４９号明細書）においては、ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＤＮＡテンプレートに相補的なｄＮＴＰアナログが取り込まれる順番を測定することでＤＮＡ塩基配列を決定する。このｄＮＴＰアナログは蛍光標識されていたものであり、ＴＩＲＦ（全反射蛍光顕微鏡システム）を用いて基板上で検出することができる（特許文献２：国際公開第９０１３６６６号パンフレット）。また、ＳＢＳ法においては、可逆的ターミネータを用いて伸長プロセスを停止する手段が利用されることがある（特許文献３：米国特許第５３０２５０９号明細書）。
【０００５】
次世代型のポリヌクレオチドシーケンス法においては、精製した長鎖ＤＮＡを超音波によって解読しやすい長さに小断片化する。小断片化されたＤＮＡの塩基配列は、ＳＢＳ法の多重並列処理によって解読されうる（非特許文献２：New High Throughput Technologies for DNA Sequencing and Genomics, Volume 2, p.187-203）。
また、小断片化されたＤＮＡの塩基配列は、次のような手順で解読されうる。基板上に、同じ配列を有する小断片ＤＮＡのクラスターを形成し、プライマー、ポリメラーゼ、及び４種のラベルがそれぞれ付された、可逆的ターミネータｄＮＴＰを含む核酸合成系によって、一塩基を合成する。蛍光励起によって取り込まれた一塩基を特定し、蛍光ラベルを取りはずした後、さらに次の一塩基を同様に合成及び特定し、蛍光ラベルを取り外す。この工程を繰り返すことによって、小断片ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【０００６】
なお、ポリメラーゼによる合成サイクルを７５回繰り返すと、ミスなく解読することが出できる塩基は７５％であるというデータが報告されている（非特許文献３：www.illumina.com/downloads/GenomicSeq_DataSheet.pdf）。
ＳＢＳ法における配列決定された小断片ＤＮＡの配列の長さ（すなわち解読長）の具体例は、例えば平均３０〜３５ｍｅｒ（非特許文献４：www.helicosbio.com/Portals/0/Documents/Helicos_SalesSpec.pdf）、又は３５〜１５０ｍｅｒ（非特許文献５：www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn#workflow_specs）である。ＳＢＳ法のスループットは６．５Ｇｂ／日（非特許文献５）である。
ＳＢＬ法における解読長は７５ｍｅｒ、スループットは２０〜３０Ｇｂ／日（非特許文献６：www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generation-sequencing/next-generation-systems.html）である。
【０００７】
決定された小断片ＤＮＡの塩基配列を元に、コンピュータにより、既知のリファレンス（ヒトゲノムなど）に基づいて取得した当該小断片ＤＮＡの塩基配列データのマッチングを行い、長鎖ＤＮＡの配列を決定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４８６３８４９号明細書
【特許文献２】国際公開第９０１３６６６号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５３０２５０９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】“第２１回DDBJing講習会(2009.6.17-18) Shorts Readsデータ解析例の紹介”、[online]、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ・データ・バンク・オブ・ジャパン）、[平成２２年１１月２２日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/dl/21-5-1.pdf＞
【非特許文献２】New High Throughput Technologies for DNA Sequencing and Genomics, Volume 2, p.187-203、２００７年
【非特許文献３】“HIGH ACCURACY PAIRED-END READS”、[online]、イルミナ・インコーポレイテッド、[平成２１年検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.illumina.com/downloads/GenomicSeq_DataSheet.pdf＞
【非特許文献４】“Helicos(R)Genetic Analysis System”、[online]、ヘリコス・バイオサイエンス・コーポレーション、[平成２２年７月２１日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.helicosbio.com/Portals/0/Documents/Helicos_SalesSpec.pdf＞
【非特許文献５】“Genome Analyzer IIe”、[online]、イルミナ・インコーポレイテッド、[平成２２年７月２１日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn#workflow_specs＞
【非特許文献６】“5500 Series SOLiDTMSequencers”、[online]、アプライド・バイオシステムズ、［平成２２年１１月２２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generation-sequencing/next-generation-systems.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の方法においては、下記の問題があるため、未知配列のポリヌクレオチド長塩基配列を高いスループットで解読・再構成することができない。
【００１１】
［サンガー法においては１ｋｍｅｒ以上の長塩基を直接解読することは難しく、また解読スループットも後述するSBS法に比べ低い］
サンガー法における解読長はゲル電気泳動における分離分解能で制約され、一般的には９００ｍｅｒ程度であり、また解読スループットはSBS法と比較して非常に低い（非特許文献１及び非特許文献５）。
【００１２】
［SBS法においては長塩基を連続して合成した時のエラー率が高い］
蛍光ラベル化されたｄＮＴＰアナログは天然のｄＮＴＰに比べてポリメラーゼによって合成伸長されにくく、典型的な例ではエラー率が約１％あることが知られている。（なお、エラーの原因は、テンプレートとのミスマッチ（例えばテンプレートがAの時T以外が取り込まれるとミスマッチになる）と、合成しないとこによる同期遅れとが挙げられる。）具体的には、既に述べたとおり、ポリメラーゼによる合成サイクルを７５回繰り返すと、ミス無く解読することが出来る塩基は７５％であるというデータが報告されている（非特許文献３）。このことから、伸長すべきＤＮＡの長さが７５ｍｅｒを超えると、エラー率がより高いことが予想できる。従って、ポリメラーゼ連鎖反応によってＤＮＡポリメラーゼに取り込まれた蛍光ラベル化ｄＮＴＰアナログを特定する方法では、その性質上、連続して直接的に数百ｍｅｒ以上の長い塩基配列を特定することが難しいことがわかる。
【００１３】
［SBS法においては各断片解読長が短いためコンピュータによる未知配列再構成長に制約がある］
このため、SBS法では1回のシーケンス長さをエラーが少ない範囲（例えば３６塩基）に限定し、代わりに多数のポリヌクレオチド断片を並列的に解読しコンピュータ技術で解読した断片間の重複部を一致させるように再構成を行うことで、実効的に長い配列を解読しようとするものである。しかしながら、対象が全く未知の配列を断片化して再構成しようとする場合、未知配列の長さに応じて重複部分の長さが必要になる。このため、各々の解読断片長は、再構成可能な未知配列長さを制約する。SBS法として典型的な例では１回のシーケンス長が３０〜３５塩基であるが、このような解読断片長で１ｋｍｅｒ以上の長い未知塩基配列を決定することは非常に難しい。
【００１４】
また、一回のシーケンス長さを短くすると、今度は以下の問題による悪影響も発生する。
【００１５】
［ＤＮＡの小断片化による末端配列の消失］
超音波や制限酵素で切断されたＤＮＡ末端は、平滑化された後、プライマーのライゲーションに供される。平滑化によって数塩基が消失するため、消失した塩基はシーケンスすることが出来ない。従って、断片長が短くなるほど、読み取る塩基長に比べて消失する塩基数の割合が増え無視できなくなるため、より多くの断片を解読する必要が発生する。これによって、断片化がより多く起こるほど、解読する必要がある塩基数の割には、最終的な配列（再構成塩基配列）が十分な長さで得られないということになる。言い換えれば、断片化がより多く起こるほど、解読すべき塩基数に対する再構成塩基配列長の比率は低下する、或いは、断片長が短いほど、解読すべき塩基数に対する再構成塩基配列長は短くなる。
【００１６】
そこで本発明の目的は、配列が未知であるポリヌクレオチドのシーケンス法でありながら、従来のSBS法の特徴である、サンガー法に勝る解読のスピードを維持しつつ、サンガー法を超える連続長塩基配列を再構成することが出来る方法を提供することにある。より具体的には、本発明の目的は、一回の（断片の）連続シーケンス長さを、SBS法におけるシーケンス精度を保つことが出来る最低限の長さとしつつも、連続シーケンスした多数の断片から未知配列のポリヌクレオチドを再構成する長さを従来法における場合よりも長くすることができるポリヌクレオチドシーケンス法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、同じ配列を有し且つ複数本のポリヌクレオチド断片を調製し、それぞれにおいてシーケンス開始位置を異ならしめるようにプライマーを予め伸長し、同じ配列の異なる領域を同時にシーケンスすることを可能にすることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
以下の工程を含む、ポリヌクレオチドシーケンス法；
（ａ）準備工程であって、
ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸにプライマーｐ’が結合したプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘに、プライマーｐがハイブリダイズしたハイブリッドを複数個用意する工程と、
（ｂ）チェーンターミネーション工程であって、
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとを含むチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を用いて、前記ハイブリダイズしたプライマーｐの３’末端側から前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の相補結合により前記複数分子間での異なる位置で合成が停止することによって、長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）を得る工程、
（ｃ）ターミネーションのリバース工程であって、
前記長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータを開裂させることによって、長さの異なる複数種の相補鎖ｅを得る工程、
（ｄ）一分子単位での解読工程であって、
シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）である解読用相補鎖合成基質を用いて、前記複数分子間での異なる位置からそれぞれ前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を、前記複数種のうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列とが重複するように得ると共に、
前記シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）が結合した順に、前記ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）に由来するシグナルを、一分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ごとに個別に検出することによって、前記複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を前記鋳型ポリヌクレオチドＸの複数の部分配列として決定する工程。
【００１９】
前記工程（ａ）において、ポリヌクレオチドＺの断片配列と実質的に同一の配列には、通常起こりうる複製時のエラーを含む配列を含む。また、前記工程（ａ）においては、通常、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列とともに、それらの相補配列も生じる。このため、本発明においては、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列にはこのような相補配列も含む。従って、相補配列も引き続く工程に供されることができる。
前記工程（ａ）においては、複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸから複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを用意し、プライマーｐをハイブリダイズさせることにより、プライマーｐとプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを複数個（いずれも同一又は実質的に同一の配列を有するもの）得ることができる。
【００２０】
前記工程（ｂ）においては、チェーンターミネーション用相補鎖合成基質を含む核酸合成により、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐから、長さが異なる複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）を得ることにより、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）を得る。より具体的には、工程（ｂ）における核酸合成では、プライマーｐの３’末端側から伸長反応が開始し、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が結合することにより伸長反応が停止するまで相補鎖合成が行われる。伸長反応が停止した位置は、ハイブリッドごとに異なりうるため、長さの異なる複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）が得られる。相補鎖ｅ（Ｔ）は、３’末端に可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を有する。
【００２１】
前記工程（ｃ）においては、相補鎖ｅ（Ｔ）の３’末端塩基においてターミネータが開裂することにより、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）それぞれからハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅを得る。
【００２２】
前記工程（ｄ）においては、相補鎖の合成と、合成された相補鎖塩基の解読とが行われる。解読は、相補鎖一分子単位で行われる。
具体的には、解読用相補鎖合成基質を含む核酸合成により、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅそれぞれにおいて相補鎖ｘ（Ｌ）を得ることにより、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ−ｘ（Ｌ）を得る。複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）は、全て、鋳型ポリヌクレオチドＸに由来する配列を有するものであり、それぞれ、鋳型ポリヌクレオチドＸ上の異なる位置を占める配列の相補配列を有する。相補鎖ｘ（Ｌ）の配列は互いに一部重複する。すなわち、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）のうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列とが重複する。ここでいう３’末端配列、５’末端配列は、それぞれ、３’末端塩基を含む配列、５’末端塩基を含む配列という意味であり、その末端配列が相補鎖ｘ（Ｌ）においてどのような長さを占めるものであってもよい。複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）は、同様の長さで得られうる。
また、解読用相補鎖合成基質が結合した順番に、基質に由来するシグナル物質を相補鎖ごとに個別に検出される。これにより相補鎖ｘ（Ｌ）一分子ごとに配列が決定される。決定された配列は、すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列に相当する。
【００２３】
（２）
前記複数の部分配列から、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を再構成する工程（ｅ）をさらに含む、（１）に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法。
上記（２）に記載の方法においては、相補鎖ｘの配列データをつなぎ合わせて鋳型ポリヌクレオチドＸの配列が決定される。
【００２４】
（３）
前記再構成された前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列から、前記ポリヌクレオチドＺの配列を再構成する工程（ｆ）をさらに含む、（２）に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記（３）に記載の方法においては、上記（２）で決定された鋳型ポリヌクレオチドＸの配列の配列データをつなぎ合わせてポリヌクレオチドＺの配列が決定される。
すなわち、上記（３）の方法においては、解読で得られた比較的短い前記部分配列（相補鎖ｘ）の配列データのアセンブルにより、一旦、中間の長さのコンティグ（鋳型ポリヌクレオチドＸの配列）を作成、さらに、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列データから長鎖のコンティグ（ポリヌクレオチドＺの配列）を作成する。
【００２５】
（４）
前記チェーンターミネーション用相補鎖合成基質において、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記ヌクレオチドＮに対して、０．０１〜９９％となる量で混合されている、（１）〜（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００２６】
上記（４）に記載の方法がもたらす効果の一つとして、複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）を好ましい長さの差を有するように得ることができることが挙げられる。
【００２７】
（５）
前記鋳型ポリヌクレオチドＸの長さが１０００ｍｅｒ以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００２８】
上記（５）に記載の方法がもたらす効果の一つとして、断片化によって消失する塩基長の割合を、著しく低減することができることが挙げられる。
【００２９】
上記相補鎖ｘ（Ｌ）の長さが１ｍｅｒ〜３００ｍｅｒである、上記のポリヌクレオチドシーケンス法。
本発明は、従来法に比べて鋳型となるヌクレオチドの鎖長が長い場合であっても、直接シーケンスされる相補鎖の長さを、連続合成時のエラーを可及的に抑えることができる程度に短くすることができる。
【００３０】
下記は、核酸を基板上に固定化した状態で核酸合成を行う方法に関する。
（６）
上記工程（ｄ）の前に、前記工程（ｃ）で得られた、前記相補鎖ｅが前記プライマーｐから伸長して生じた伸長プライマーｐ−ｅと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（７）
上記工程（ｃ）の前に、前記工程（ｂ）で得られた、前記可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が前記プライマーｐから伸長して生じた鎖ｐ−ｅ（Ｔ）と前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（８）
上記工程（ｂ）の前に、前記工程（ａ）で得られた、前記プライマーｐと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００３１】
（９）
前記プライマーｐ鎖が固定化用タグを有するものであり、
前記基板がその表面にリンカーを有するものであり、
前記固定化用タグは、前記リンカーに対する結合能を有するものである、（１）〜（８）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００３２】
（１０）
前記固定化用タグが、シグナル物質で標識されたものである、（９）に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記の方法がもたらす効果の一つとして、基板上におけるポリヌクレオチドの固定化位置を確認することができることが挙げられる。
【００３３】
（１１）
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、さらにシグナル物質で標識されたものである、（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記の方法がもたらす効果の一つとして、上記（１０）の方法での固定化用タグにおけるシグナル物質標識の使用と同様に、固定化位置の確認を行うことができることが挙げられる。従って、シグナル物質で標識された可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の使用は、上記（１０）の方法での固定化用タグにおけるシグナル物質標識の使用の代替手段として用いることもできる。
【００３４】
（１２）
前記プライマーｐが、前記プライマーｐ’の５’末端塩基に対応する相補塩基を欠如したものであり、
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記欠如した相補塩基を有するものである、（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記（１２）に記載の方法がもたらす効果の一つとして、シーケンスできない配列をなくすことができることが挙げられる。
【００３５】
以下は、鋳型ポリヌクレオチドの調製法を特定したものである。
（１３）
前記ポリヌクレオチドＺが、１つの細胞から精製されたものである、（１）〜（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１４）
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、複数の細胞から精製された前記ポリヌクレオチドの断片として調製されたものである、（１）〜（１３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１５）
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記断片配列をベクターに挿入し、宿主細胞で増殖することによって調製されたものである、（１）〜（１４）のいずれか記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１６）
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記ポリヌクレオチドＺの断片をＰＣＲによって調製したものである、（１）〜（１４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１７）
前記ポリヌクレオチドＺの断片が、前記ポリヌクレオチドを超音波又は制限酵素で断片化することによって調製されたものである、（１）〜（１６）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００３６】
下記（１８）及び（１９）は、前記工程（ｂ）の前までに、配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを同一基板上に固定化する場合に、それら配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別する工程を特定するものである。
なお、以下において「直接的に又は間接的に」とは、鋳型ポリヌクレオチドＸに直接結合して、又は、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲート又はハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに直接結合して、という意味である。
【００３７】
下記（１８）における識別工程においては、配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれに含まれる塩基配列情報を識別用インデックスとして利用することによって、同一基板上に無作為に決定される位置で（すなわちランダムに）固定化された複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを、それらの固定化位置情報に基づいて識別する。
【００３８】
（１８）
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、（１）〜（１７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）が、前記基板上に固定化された前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸのそれぞれに含まれる塩基配列情報を取得することを含み、
前記工程（II）において、前記塩基配列情報を前記位置情報と関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【００３９】
下記（１９）における識別工程においては、配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸが基板上に固定化された順番を識別用インデックスとして利用することによって、同一基板上に無作為に決定される位置で（すなわちランダムに）固定化された複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを、それらの固定化位置情報に基づいて識別する。
【００４０】
（１９）
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、（１）〜（１７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）において、（Ａ）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程と、その後、（Ｂ）前記基板表面上に、無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された他の鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものをさらに得て、前記他の鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程とを少なくとも行い、
前記工程（II）において、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む工程の順番と、それぞれの工程において取得された前記位置情報とを関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によって、配列が未知であるポリヌクレオチドのシーケンス法でありながら、従来のSBS法の特徴である、サンガー法に勝る解読のスピードを維持しつつ、サンガー法を超える連続長塩基配列を再構成することが出来る方法が可能になる。より具体的には、本発明によって、一回の（断片の）連続シーケンス長さを、SBS法におけるシーケンス精度を保つことが出来る最低限の長さとしつつも、連続シーケンスした多数の断片から未知配列のポリヌクレオチドを再構成する長さを従来法における場合よりも長くすることができるポリヌクレオチドシーケンス法が可能になる。
【００４２】
例えば、従来法のように、ポリヌクレオチドの断片化によって得られる鋳型ポリヌクレオチドの長さを、連続合成に適した長さ（例えば７５ｍｅｒ）に合わせると、断片化によって失われる塩基（例えば両端５ｍｅｒが失われるとした場合）の割合が５／７５＝６．７％である。一方、本発明の方法は、鋳型ポリヌクレオチドの一部のみ（例えば連続合成に適した長さの一例である７５ｍｅｒ）について連続合成をすればよいため、鋳型ポリヌクレオチドを短くする必要がなくなる。例えば鋳型ポリヌクレオチドを２ｋｍｅｒ長程度に設定することも可能であり、この場合、断片化によって失われる塩基の割合は５／２０００＝０．３％ですむ。
【００４３】
また、本発明の方法が、連続合成する長さを７５ｍｅｒ程度の短さとすることができるということは、従来法のように２ｋｍｅｒもの長さを連続合成する場合に比べてエラー率を低減させることが可能である。
【００４４】
本発明の方法は、例えば５０００塩基長の長い断片を用い、その断片内で多数の比較的短い領域を解読することによって、５０００塩基長の断片を精度高くシーケンスすることができる。従来法における解読長はサンガー法で９００塩基、ＳＢＳ法で１５０塩基、ＳＢＬ法で７５塩基であることから、本発明の方法によって、従来のサンガー法と実質的に同程度又はそれ以上の長塩基解読が可能である。
本発明の方法によると、原理的に市販のＳＢＳ法と同等のスループット（シーケンス塩基量）が得られるため、サンガー法に比べ圧倒的に優れたスループット性を実現することができる。
本発明の方法によると、実施例で実証されているとおり、従来のＳＢＳ法やＳＢＬ法に比べ圧倒的に優れたde novo対応力を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の概要を模式的に示したものである。
【図２】ポリヌクレオチドＺの断片とプライマーとのライゲート（Ａ）、ポリヌクレオチドＺの断片配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸとプライマーｐ’とからなるプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとを含むハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの例（Ｂ）（i）〜（iv）をそれぞれ模式的に示したものである。
【図３】図２の（Ｂ）（ii）の態様をより具体的に示したものである。
【図４】図２の（iv）のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐが固定化工程において基盤に固定化される態様、本発明の工程（ｂ）によってハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐにおいて可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が伸長した態様、本発明の工程（ｃ）によって可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータが開裂した態様、本発明の工程（ｄ）によって解読用相補鎖ｘ（Ｌ）が伸長された態様を模式的に示したものである。
【図５】図３の態様における本発明の工程（ｂ）において、同一又は実質同一の配列を有する複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐから、ハイブリッド間で長さの異なる可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が伸長し、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）を生じた態様を模式的に示したものである。
【図６】図５に引き続く態様であって、本発明の工程（ｃ）において、可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータが開裂した態様を模式的に示したものである。
【図７】図６に引き続く態様であって、本発明の工程（ｄ）において、解読用相補鎖ｘ（Ｌ）が伸長された態様及び解読用相補鎖ｘ（Ｌ）に由来するシグナルを相補鎖ｘ（Ｌ）一分子毎に個別に検出したＣＣＤ画像、及び、本発明の工程（ｅ）において、解読用相補鎖ｘ（Ｌ）の配列（鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列）から鋳型ポリヌクレオチドＸを再構成する態様を模式的に示したものである。
【図８】図２の（iii）のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐが、図４と同様に固定化工程において基盤に固定化される態様、及び本発明の工程（ｂ）によってハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐにおいて可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が伸長した態様を模式的に示したものである。
【図９】基板上に固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸが、液体流によって引き伸ばされることによって基板上から２００ｎｍまでの領域において存在する状態において、核酸合成酵素によって鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖が合成された態様を模式的に示したもの（Ａ）、及び、基板上に固定化された核酸合成酵素を用い、鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖が合成されている態様を模式的に示したもの（Ｂ）を示す。
【図１０】鋳型ポリヌクレオチドＸの識別のために、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる塩基配列情報をインデックスとして使用する場合における、個々のハイブリッドの態様を、インデックス配列取得工程、工程（ｂ）及び工程（ｄ）を抜粋して模式的に示したものである。
【図１１】固定化対象が基板上に無作為に決定される位置で固定化され、位置情報が取得された態様の一例を、基板上の一部における固定化された対象の態様を示す拡大図と共に模式的に示したもの（ａ）、及びさらにその後、当核対象において、インデックス用塩基配列情報を与える配列を合成した態様の一例を模式的に示したものである。
【図１２】図１１（ａ）において位置情報が取得された後、さらに別種類の固定化対象を無作為に決定される位置で固定化し位置情報を取得した態様の一例を、基板上の一部における固定化された対象の態様を示す拡大図と共に模式的に示したものである。
【図１３】複数の親水性部分が疎水性部分によって隔てられるように設けられた基板（基板表面の一部を拡大）を模式的に示したものである。
【図１４】実施例１におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を示したものである。
【図１５】再構成に用いられる断片の長さと、再構成可能なコンティグ長との関係を示したものである。
【図１６】断片長に対するコンティグ長の変化を示したものである。
【図１７】実施例２におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を示したものである。
【図１８】コンティグ長（ターゲットＤＮＡ長）と、そのコンティグ長に到達するための最低限必要とされる断片長との関係を示したものである。
【図１９】図１８で示された関係から導出された、コンティグ長3Gmerを再構成できる断片長についての外挿結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
図１に、本発明の概要を模式的に示す。本発明は、ポリヌクレオチドＺの断片配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸを分断することなく、鋳型ポリヌクレオチドＸ全体を網羅することができる複数の部分配列を得て（工程ａ、ｂ、ｃ及びｄによる）、部分配列から再構成により、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を決定する（工程ｅによる）方法である。さらに、決定された鋳型ポリヌクレオチドＸの配列情報から再構成により、ポリヌクレオチドＺの配列を決定する（工程ｆによる）。
【００４７】
［１．準備工程（ａ）］
準備工程においては、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列を有する複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれにプライマーｐ’が結合した、複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを用意する。複数分子のｐ’−Ｘにプライマーｐをハイブリダイズする。
【００４８】
［１−１．ポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸ］
鋳型ポリヌクレオチドＸは、ポリヌクレオチドＺの断片と同一又は実質的に同一の配列を有する配列を有する。より具体的には、複数分子のポリヌクレオチドＸには、ポリヌクレオチドＺの断片と完全同一の配列を有するポリヌクレオチドを含み、さらに、ポリヌクレオチドＺの断片と実質的に同一の配列を有する配列を有するものを含んでも良い。ポリヌクレオチドＺの断片配列と実質的に同一の配列には、当業者が同一の配列を有するヌクレオチドを調製する場合に通常生じうるものであって、例えば、複製時のエラーを含む配列を含む。許容するエラー率は特に限定されるものではないが、例えばＰＣＲ用のポリメラーゼtaqのエラー率は1/9000すなわち0.011％程度であり、さらに改質されたポリメラーゼPhusionのエラー率はtaqポリメラーゼの1/50すなわち0.00022%程度である。従って、許容するエラー率は、例えば0.01％以下、好ましくは0.00022%以下でありうる。
また、ポリヌクレオチドＺの断片と同一又は実質的に同一の配列を得る際、通常、それらの相補配列も生じる。従って、本発明においては、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列には、それらの相補配列も包含される。
【００４９】
［１−２．種類］
鋳型ポリヌクレオチドＸの母体であるポリヌクレオチドＺは、最終的に配列が決定されうる。従って、ポリヌクレオチドＺは、その断片が核酸合成の鋳型となりうるものであれば、特に限定されるものではない。ポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸとしては、以下のものが挙げられる。
【００５０】
構造的観点からは、主として核酸塩基、五炭糖及びリン酸基から構成されるヌクレオチド残基がホスホジエステル結合により連結したポリマーであり、ＤＮＡ、ＲＮＡに限らず、それらポリヌクレオチドのアナログも含まれる。（ポリヌクレオチドアナログは、ポリヌクレオチドにおける原子又は原子団が別の原子又は原子団に置換された構造を持つ、ポリヌクレオチドとは別の物質をいう。以下、アナログについては同様に解釈するものとする。）
【００５１】
核酸塩基としては、相補的な核酸塩基又は核酸塩基アナログとワトソンクリック水素結合により塩基対を形成し得る、いかなる窒素含有複素環も許容される。具体的には、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン及びそれらの誘導体が挙げられる。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）、およびこれらの核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、５−プロピニル−シチジン、イソシチジン、イソグアニン、７−デアザ−グアニン、２−チオ−ピリミジン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、４−チオ−ウラシル、Ｏ６−メチル−グアニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｏ４−メチル−チミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドール、及びエテノアデニン）が挙げられる。
【００５２】
五炭糖は、置換されていても置換されていなくてもよく、置換された五炭糖は、例えば、３’炭素が−Ｒ基、−ＯＲ基、−ＮＲＲ基、及びハロゲン基から選ばれる置換基を有しうる（Ｒは同じ又は異なっていてよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基）。従って、五炭糖は、２’−デオキシリボースやリボースに代表されるが、２’，３’−ジデオキシリボース、３’−ハロリボース、３’−フルオロリボース、３’−クロロリボース、および３’−アルキルリボースなども許容される。
【００５３】
ホスホジエステル結合には、置換されていても置換されていなくてもよく、置換されたホスホジエステル結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホルアニリデート結合及びホスホルアミデート結合などが挙げられる。
【００５４】
また、配列由来の観点からは、天然に由来するもの、人為的に変更されたもの又は合成配列、及びそれらの混合が許容される。より具体的には、ヒトを含む様々な生物、及びウイルス及び細菌を含む様々な微生物の染色体、ゲノム、ｃＤＮＡ、それらの断片（但し鋳型ポリヌクレオチドＸより大きな単位のもの）などが挙げられる。また、ポリヌクレオチドＺは、異なる個体に由来する同じ配列のものであってもよい。
【００５５】
［１−３．ポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸの長さ］
ポリヌクレオチドＺの長さは、特に限定されるものではない。例えば、１０ｋｍｅｒ程度〜３Ｇｍｅｒでありうる。上記範囲の下限値は、例えば１６ｋ、１０Ｍ、３０Ｍ、１００Ｍ、３００Ｍ、５００Ｍ、又は１Ｇｍｅｒであってもよい。また、上記範囲の上限値は、例えば１Ｇ、５００Ｍ、３００Ｍ、１００Ｍ、３０Ｍ、又は１０Ｍｍｅｒであってもよい。
【００５６】
鋳型ポリヌクレオチドＸは、ポリヌクレオチドＺの断片として生じるものであるから、例えば１ｍｅｒ〜５ｋｍｅｒの長さのものでありうる。この中でも、本発明の方法においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの長さは、ポリヌクレオチドＺより短く、後述の相補鎖ｘより長いことが通常である。
鋳型ポリヌクレオチドＸの長さは、シグナル物質標識されたヌクレオチドアナログを基質とした相補鎖の連続合成が可能な長さよりも長いことが通常である。従って、従来のポリヌクレオチドシーケンス法における鋳型に比べて長いことが好ましい。例えば、１ｋｍｅｒ以上でありうる。この範囲の上限値は、ＰＣＲの増幅サイズの上限で決まるため、特に限定されるものではない。（例えば、BioLabs社から市販されているPCRポリメラーゼTaqの増幅サイズは５ｋｂ以下であり、LongAmp Taqの増幅サイズは４０ｋｂ以下である。）従って、上記範囲の上限値は例えば４０ｋｍｅｒである場合もあるが、それを超える場合もある。上記範囲の下限値は、さらに、２ｋ、３ｋ、４ｋ、又は５ｋｍｅｒであってもよい。また、上記範囲の上限値は、さらに、３５ｋ、３０ｋ、２５ｋ、２０ｋ、１５ｋ、１０ｋ、５ｋ、４ｋ、３ｋ、又は２ｋｍｅｒであってもよい。
【００５７】
また、後述のように鋳型ポリヌクレオチドＸがポリヌクレオチドＺから調製される際には断片化工程が行われるが、断片化工程では、平滑化による数塩基の消失を伴う。消失した塩基はシーケンス不可能である。従って、得られる断片（すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸ）の長さが十分な長さを保つように調製されることは、シーケンス不可能な配列を相対的に著しく低減し、ポリヌクレオチドシーケンスの精度向上に貢献する点で好ましい。
【００５８】
［１−４．複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸの調製法］
鋳型ポリヌクレオチドＸは、ポリヌクレオチドＺを断片化し、得られた断片のそれぞれと同一又は実質的に同一の配列を有する配列を有するポリヌクレオチドとして調製する。
【００５９】
ポリヌクレオチドＺは、１つの細胞に由来するものであってもよいし、複数の細胞に由来するものであってもよい。また、ポリヌクレオチドＺは、１つの検体に由来するものであってもよいし、複数の検体に由来するものであってもよい。
ポリヌクレオチドＺは、細胞から精製されたものでありうる。精製の手法としては特に限定されるものではなく、当業者によって公知の方法が適宜選択される。
【００６０】
ポリヌクレオチドＺの断片それぞれについて同配列或いは実質的に同配列のものを複数本得るための方法としては、ポリヌクレオチドＺの断片のコピーを調製する方法が挙げられる。
ポリヌクレオチドＺの断片のコピーを調製する方法としては、例えば、ポリヌクレオチドＺの断片配列を鋳型とする核酸増幅法（ＰＣＲに代表される方法）が挙げられる。増幅法の具体的なプロトコルも特に限定されるものではなく、当業者によって公知の方法から適宜選択される。また、ポリヌクレオチドＺの断片のコピーを調製する他の方法としては、例えば、ポリヌクレオチドの断片配列をベクターに挿入し、宿主細胞で増殖させることによって行う方法が挙げられる。この方法についても、具体的なプロトコルは特に限定されるものではなく、当業者によって公知の方法が適宜選択される。
【００６１】
ポリヌクレオチドＺの断片それぞれについて同配列或いは実質的に同配列のものを複数本得るための他の方法としては、異なるソースからポリヌクレオチドＺを取得し、それぞれ断片化することによって得る方法が挙げられる。異なるソースとしては、異なる細胞が挙げられる。当該異なる細胞は、異なる個体に由来しうる。
【００６２】
ポリヌクレオチドＺの断片配列を得るために行われる断片化工程は、公知の手法を用いて当業者によって適宜行われる。具体的には、超音波や制限酵素を用いた方法が挙げられる。
【００６３】
［１−５．プライマー］
プライマーはオリゴヌクレオチドである。その具体的構成要素としては、上述のポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸにおけるものと同様である。プライマーは、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘの調製に用いられる。さらに、核酸合成反応系において、相補鎖合成の開始点を与える。プライマーは合成したものであっても良く、生物界から単離したものであっても良い。
【００６４】
また、プライマーは、後述の項目７で記載するように固定化用タグを有するものであってもよい。さらにその場合、当該固定化用タグが基板上に固定化されていてもよい。
【００６５】
［１−６．プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ］
ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの調製法は特に限定されず、上述の複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸを用いることによって、当業者が適宜決定する事ができるものである。
一例として、まず、複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸから、複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを得て、その後、複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘから、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを得ることができる。
【００６６】
プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘは、例えば、図２（Ａ）に記載のように鋳型ポリヌクレオチドＸにプライマーをライゲーションさせ、一本鎖化することによって、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを得ることができる。一本鎖化は、熱処理やアルカリ処理などによる変性を行えばよい。
なお、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘにおいて、プライマーｐ’はＸの両端に結合しうる。
【００６７】
図２（Ｂ）（i）に記載のように、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘに、プライマーｐをハイブリダイズさせることにより、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを調製することができる。
図２（Ｂ）（ii）に記載のように、ハイブリダイズしているプライマーｐは、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲートしているプライマーｐ’の５’末端塩基に対応する相補塩基を欠如したものであってよい。図２（Ｂ）（ii）の態様をより具体的に図３に示す。図３においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの５’末端の記載は省略している。図３においては、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲートしているプライマーｐ’の５’末端塩基（すなわちＡ）に対応する相補塩基（すなわちＴ）を欠如している。後述するが、このようにプライマーをデザインすると、後述の可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の核酸塩基部分を上記の欠如した相補塩基（図３の場合にあってはＴ）としてデザインすることによって、鋳型ポリヌクレオチドＸの３’末端塩基からシーケンスを行うことが可能になる。
【００６８】
図２（Ｂ）（iii）及び（iv）は、プライマーｐが後述の固定化用タグを有する場合のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを示したものである。（iv）に示すハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐは、さらにシグナル物質を有する。これらのような態様とすることによって、基板上への固定化が可能となる（図４及び図８）。
【００６９】
［２．チェーンターミネーション工程（ｂ）］
チェーンターミネーション工程は、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ、及び、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとを含むチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を含む核酸合成系にて行われる。
【００７０】
［２−１．チェーンターミネーション用相補鎖合成基質］
チェーンターミネーション用相補鎖合成基質は、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）と、ヌクレオチドＮと、の両方を含む。チェーンターミネーション用相補鎖合成基質は、プライマーｐの３’末端から伸長する伸長鎖ｅ（Ｔ）の構成単位となる。
【００７１】
［２−１−１．（リバーシブルターミネート機能を有しない通常の）ヌクレオチドＮ］
ヌクレオチドＮは、主として核酸塩基、五炭糖および１以上（通常１〜３）のリン酸基から構成されるものであれば特に限定されるものではない。核酸塩基及び五単糖としては、上述の項目１−２で述べたポリヌクレオチドの構成要素と同様である。また、リン酸基としては、上述の項目１−２で述べたポリヌクレオチドを構成するホスホジエステル結合を生じさせるものであればよい。具体的には、ヌクレオチドＮとして、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びその他ヌクレオチドアナログが挙げられる。ただし、ここでいうヌクレオチドＮとしてのヌクレオチドアナログは、リバーシブルターミネート機能を有しないという点で、後述の可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）と区別される。
【００７２】
ヌクレオチドＮは通常、その核酸塩基が異なる複数種のものが混合されて用いられる。しばしば、ヌクレオチドＮは、その核酸塩基が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）であるものが混合されて用いられる。例えば、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）が混合されたものが用いられる場合がある。混合量としては、それぞれのヌクレオチドの量が同程度（モル基準）となるように調整されてもよいし、使用する核酸合成酵素の反応効率に応じて当業者によって適宜調整されてもよい。後者の場合においては、核酸合成酵素に取り込まれる速度が速いヌクレオチドは相対的に少なく、その速度が遅いヌクレオチドは相対的に多くなるように調整することができる。例えば、ｄＡＴＰの反応速度が他のｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰに比べて早い場合は、ｄＡＴＰの濃度をｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰに比べて低くすることができる。
【００７３】
［２−１−２．可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）］
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は、可逆的ターミネータ部とヌクレオチド部とを含む。
【００７４】
［２−１−２−１．可逆的ターミネータ部］
可逆的ターミネータは、ヌクレオチドの伸長において、さらなる伸長が起こらないようにヌクレオチド末端をターミネートする機能とともに、開裂によってヌクレオチドの伸長を再開することを可能とする可逆的機能を有するターミネータをいう。
従って、可逆的ターミネータは、可逆的ターミネート機能を有する構造、すなわち成長中の核酸へさらなるヌクレオチドの取り込みを妨害することが可能な構造を有する。そのような構造としては、例えば、五炭糖の少なくとも３’−水酸基における改変部（すなわち３’−水酸基の置換基）が挙げられる。改変部は、プライマーｐと鋳型ポリヌクレオチドＸとの相互作用に支障をきたさない条件下で除去することができるものであれば特に限定されるものではない。
例えば、３’−水酸基の置換基は、還元的切断を受けうるいかなる基でもよく、具体的にはジスルフィド基含有有機基（有機基はアルキル基でありうる）などが挙げられる。また、また例えば、３’−水酸基の置換基は、脱離機構による切断を受けうるいかなる基でもよく、具体的にはアリル基などが挙げられる。
【００７５】
［２−１−２−２．ヌクレオチド部のデザイン］
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）のヌクレオチド部は、可逆的ターミネート機能を有する構造を有することを除いて、上述のヌクレオチドＮと同様の構造を有してよい。
【００７６】
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）のいずれか１とすることができる。また、当該核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）から選ばれる２以上、例えば３、４或いは５であることも許容する。
【００７７】
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの少なくともいずれかにおいて、プライマー伸長開始位置（すなわちプライマーｐの３’末端の塩基に隣接する塩基の位置）に取り込まれるようにデザインされることができる。
具体的には、当該核酸合成開始位置の塩基が予め判っている場合において、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の核酸塩基が、プライマーｐの３’末端の塩基に相補的結合している塩基の５’末端側に隣接する塩基に相補的であるようにデザインされうる。
【００７８】
このようにデザインすることにより、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの少なくともいずれかにおいて、プライマーｐに隣接する位置でプライマー伸長を停止させることができる。プライマーからの伸長鎖ｅ（Ｔ）の部分は後述工程（ｄ）におけるシーケンスの対象とならない。従って上述のようにデザインすると、プライマーｐの３’末端に隣接する塩基（すなわち鎖長１の伸長鎖ｅ（Ｔ）を構成する塩基）が既知となる。結果として、後述のシーケンスと合わせて鋳型ポリヌクレオチドＸの全ての配列を解読することができる。
【００７９】
より好ましい態様としては、図３に示すように、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐにおけるプライマーｐが、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲートしているプライマーｐ’の５’末端塩基（図３の場合ではＡ（アデニン））に対応する相補塩基（図３の場合はＴ（チミン））を欠如したものであり、可逆的ターミネータヌクレオチド（Ｔ）の核酸塩基が、上記の欠如した相補塩基（図３の場合はＴ（チミン））となるようにデザインされる。
【００８０】
上記の好ましい態様のようにデザインすることにより、上記プライマーｐの３’末端の欠如した位置に可逆的ターミネータヌクレオチド（Ｔ）が結合して伸長を停止させることができる。このため、後述工程（ｄ）において最初に結合する解読用相補鎖合成基質が、鋳型ポリヌクレオチドＸの３’末端塩基の相補塩基となる。すなわち、後述のシーケンスによって鋳型ポリヌクレオチドＸの３’末端塩基からシーケンスを開始することができる。すなわち、シーケンスできない配列がない。結果として、鋳型ポリヌクレオチドＸの全ての配列を解読することができる。
【００８１】
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は、さらにシグナル物質で標識されたものであってよい。標識された可逆的ターミネータヌクレオチドは、例えば図２の（Ｂ）（iii）のように、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐがシグナル物質を有しない場合に有用である。この場合、図８に示すように、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを基板に固定し、チェーンターミネーション工程（ｂ）に供して得られるハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）をシグナル標識（図中Ｌと表記）を有するものとして得ることができる。これにより、ハイブリッドの基板上の固定位置の確認が可能になる。
【００８２】
［２−２．可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）伸長反応］
上述のチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を用いて、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとを含むハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐとともに核酸合成系が構築される。
【００８３】
［２−２−１．核酸合成系］
核酸合成系は、上記成分を含んだ核酸合成反応液を適切な条件下におくことによって構築されるものであり、上記成分以外の成分の使用及び条件などは当業者が適宜決定することができる。
具体的には、核酸合成反応液は、上記成分の他に、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどの塩類及び核酸合成酵素を含む。その他に、界面活性剤やタンパク質などの物質を必要に応じて添加することができる。
【００８４】
ｐＨ緩衝液としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、塩酸、硝酸、硫酸などの鉱酸とを組み合わせたもの、及び、その他種々のｐＨ緩衝液を用いることができる。ｐＨ調製された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用することができる。
【００８５】
核酸合成酵素としては、基質であるヌクレオチドＮ及び可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を、鋳型ポリヌクレオチド依存的に、プライマーへ結合させる能力を有するものであれば特に限定されず、当該分野で用いられうるいかなる核酸重合酵素も含まれる。
核酸重合酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、逆転写酵素類、リガーゼ類、キナーゼ類、及びそれらの組み換え体などが含まれる。酵素の起源となる種についても特に限定されない。
例えば、ＤＮＡポリメラーゼβ、E.coliのＤＮＡポリメラーゼ、E.coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、T4ＤＮＡポリメラーゼ、TaqＤＮＡポリメラーゼ、T.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taqポリメラーゼ、KODＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを用いることができる。
【００８６】
さらに上記の他にも、KAPA2GTMFastＤＮＡポリメラーゼ（カパ・バイオシステムズ）、KAPA2GTMRobustＤＮＡポリメラーゼ（カパ・バイオシステムズ）、HybripolＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）、Sequenase Version 2.0 T7ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＥヘルスケアジャパン）、TherminatorTMＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）、Therminator TM IIＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）、Therminator TMIIIＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）、及びPhusion TM High-Fidelity DNA Polymerase（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）なども用いることができる。
【００８７】
増幅反応におけるその他の条件としては、核酸合成酵素の活性を保持することができる条件が当業者によって適宜選択される。ｐＨ条件としては、例えば２５℃におけるｐＨが５．８〜１０．７とすることができる。上記範囲の上限値は、９．５、８．５又は７．０であってもよく、上記範囲の下限値は、７．０、８．５又は９．５であってもよい。この条件は、当業者によって、核酸合成酵素の至適ｐＨに応じて適宜決定される。また、温度条件としては、例えば２５〜１００℃とすることができる。上記範囲の上限値は、９５℃、６５℃又は３７℃であってもよく、上記範囲の下限値は、３７℃、６５℃又は９５℃であってもよい。この条件は、当業者によって、核酸合成酵素の至適温度に応じて適宜決定される。
【００８８】
［２−２−２．可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）］
核酸合成系が構築されると、プライマーｐの３’末端塩基に隣接する位置（すなわち合成開始位置）から相補鎖伸長が始まる。相補鎖伸長においては、チェーンターミネーション用相補鎖合成基質からランダムに、ヌクレオチドＮ又は可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が取り込まれる。ヌクレオチドＮが連続して取り込まれている間はプライマーｐの伸長反応が持続するが、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が取り込まれると当該伸長反応は停止する。従って、プライマーｐの３’末端塩基に隣接する合成開始位置から可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が結合した位置まで相補鎖が伸長される。これにより、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を３’末端に有する伸長鎖ｅ（Ｔ）が生成する（図４工程（ｂ）、図５）。
【００８９】
この際、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）がいつ取り込まれるかは可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の混合比に依存する。従って、核酸合成反応中に存在する同配列、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐについては、その各々において、相補鎖の伸長は可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の混合比に依存した異なる位置で停止しうる。すなわち、プライマー伸長反応中、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の混合比が一定であれば、相補鎖ｅ（Ｔ）の終点（すなわち３’末端残基の位置）は確率的な分布をとりうる。
その結果、同一又は実質同一の配列を有する複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐから、異なる長さの相補鎖ｅ（Ｔ）が生成する。結果として、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）を得る（図５）。
【００９０】
［２−３．チェーンターミネーション用相補鎖合成基質における混合比］
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとの混合比は特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。混合比は、プライマー伸長反応によって得られる長さの異なる複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）を、どの程度の長さの差をもって生じさせるかということを考慮して決定することができる。一般的に、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の量をより少なくなるように調整すると相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差をより大きく設定することができ、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の量をより多くなるように調整すると上記長さの差をより小さく設定することができる。
上記に加え、使用する核酸合成酵素の反応効率も考慮して決定することができる。この場合においては、核酸合成酵素に取り込まれる速度が速い可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は相対的に少なく、その速度が遅い可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は相対的に多くなるように調整することができる。
【００９１】
例えば、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を、ヌクレオチドＮの０．０１〜９９％（モル基準）となるように当該混合比を決定することができる。当該範囲を上回ると、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列決定の正確さは担保できるものの、例えば鋳型ポリヌクレオチドＸの長さに対し後述工程（ｅ）で再構成される部分配列（後述の相補鎖ｘ（Ｌ）の配列）の数が不所望に多くなる場合があり、このために当該再構成の効率が下がる傾向にある。また、当該範囲を下回ると、例えば後述工程（ｄ）で設定される１回の連続シーケンス長さ（後述の相補鎖ｘ（Ｌ）の長さ）を不所望に長く設定する必要性が生じる場合があり、その結果、配列決定におけるエラー率が上がる傾向にある。
【００９２】
［２−４．ハイブリッド間での可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差］
上述のとおり、ハイブリッド間での相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差がどの程度であれば適切かは、想定される後述の相補鎖ｘ（Ｌ）の長さ及び数を考慮して判断することができる。
工程（ｄ）における１回の連続シーケンス長さ（相補鎖ｘ（Ｌ）の長さ）はある程度限定されることが通常である（後述項目４−２−２．相補鎖ｘ（Ｌ））。従って、通常、ハイブリッド間での相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差は、工程（ｄ）における１回の連続シーケンス長さより短い。どの程度短ければ適切かは、後述工程（ｅ）（図７）において部分配列（相補鎖ｘ（Ｌ）の配列）から鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を再構成する場合に必要となる、部分配列同士（相補鎖ｘ（Ｌ）の配列）の配列重複部分の長さによって判断される。後述（項目４−２−２．相補鎖ｘ（Ｌ））の通り、相補鎖ｘ（Ｌ）の長さは例えば１〜３００ｍｅｒ、配列重複部分の長さは例えば１〜２９９ｍｅｒであるから、相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差は例えば１〜２９９ｍｅｒでありうる。
【００９３】
［３．ターミネーションのリバース工程（ｃ）］
ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）において、伸長鎖ｅ（Ｔ）の３’末端の塩基は前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）に由来する。可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）において、ターミネータが開裂する。そのための具体的な方法は、プライマーｐと鋳型ポリヌクレオチドＸとの相互作用に支障をきたさない条件下で除去することができれば特に限定されるものではなく、可逆的ターミネータの種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。
【００９４】
ターミネータの開裂は、例えば、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）における３’−水酸基の置換基がジスルフィド基含有有機基（有機基はアルキル基などの炭化水素基でありうる）などである場合は、還元条件下での切断によって行うことができる。より具体的には、パラジウム系触媒を用いる接触水素化によって行うことができる。
また例えば、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）における３’−水酸基の置換基がアリル基などである場合は、脱離反応によって行うことができる。より具体的には、パラジウム触媒による還元的脱離反応によって行うことができる。
【００９５】
ターミネータの開裂によって、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）からハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅを得ることができる（図４工程（ｃ）、図６）。より具体的には、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅが、伸長鎖ｅの長さを異にして得られる（図６）。
【００９６】
ターミネータの開裂によって、伸長プライマーｐ−ｅの３’末端に隣接する合成開始位置から再び核酸合成を行うことが可能になる。
【００９７】
［４．鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列を一分子単位でシーケンスする工程（ｄ）］
本工程においては、合成開始位置の異なる複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅを核酸合成系に供することによって、鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ｘ（Ｌ）を複数種得る。相補鎖ｘ（Ｌ）は鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列を有するものであるため、シーケンスの対象となる。相補鎖ｘ（Ｌ）の合成とシーケンスとを同時に行ってもよいし、相補鎖ｘ（Ｌ）を合成した後、合成された相補鎖ｘ（Ｌ）をシーケンスしてもよい。
【００９８】
［４−１．解読用相補鎖合成基質］
解読用相補鎖合成基質は、シグナル物質で標識されたヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）である。
［４−１−１．ヌクレオチド部］
ヌクレオチド部については、前述の２−１−１におけるヌクレオチドＮと同様の構造を有することができる。また、ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）は、ヌクレオチド部の核酸塩基が異なる複数種のものが混合されて用いられる。しばしば、ヌクレオチドＮ（Ｌ）は、その核酸塩基が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）であるものが混合されて用いられる。例えば、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のシグナル標識体が混合されたものが用いられる場合がある。混合量としては、それぞれのヌクレオチドの量が同程度（モル基準）となるように調整されてもよいし、使用する核酸合成酵素の反応効率に応じて当業者によって適宜調整されてもよい。後者の場合においては、核酸合成酵素に取り込まれる速度が速いヌクレオチドアナログは相対的に少なく、その速度が遅いヌクレオチドアナログは相対的に多くなるように調整することができる。例えば、標識ｄＡＴＰの反応速度が他の標識ｄＣＴＰ、標識ｄＧＴＰ及び標識ｄＴＴＰに比べて早い場合は、標識ｄＡＴＰの濃度を標識ｄＣＴＰ、標識ｄＧＴＰ及び標識ｄＴＴＰに比べて低くすることができる。
【００９９】
［４−１−２．シグナル物質による標識部］
シグナル物質による標識部については、例えば以下のシグナル物質（蛍光物質）に由来する基が挙げられる。Ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０・Ｎａｐｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３．５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｂ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｏｈｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄなど。
【０１００】
また、核酸合成酵素として例えばＤＮＡポリメラーゼβを用いる場合に、陰イオン性の蛍光基が好ましく用いられる場合がある。これは、陰イオン性の蛍光基をシグナル標識として有するヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）とＤＮＡポリメラーゼβとの相性を有効に利用することができる場合があるためである。上述の蛍光基のうち、陰イオン性の蛍光標識としては、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、ナフトフルオレセイン、Ｃｙ３．５・５・５．５などが挙げられる。
【０１０１】
標識部に由来するシグナルによってヌクレオチド部の違いを識別することができるように、標識部は、ヌクレオチド部の種類に応じてそれぞれ異なるシグナルを発するように選択されうる。例えばシグナル物質が蛍光物質である場合、蛍光物質は、ヌクレオチド部の種類に応じてそれぞれ異なる波長の蛍光を発するように選択されうる。このことによって、発せられたシグナルに基づいてシーケンスを行うことができる。
【０１０２】
［４−２．相補鎖ｘ（Ｌ）伸長反応］
上述の解読用相補鎖合成基質を用いて、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘと伸長プライマーｐ−ｅとを含むハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅとともに核酸合成系が構築される。
【０１０３】
［４−２−１．核酸合成系］
核酸合成系は、上記成分を含んだ核酸合成反応液を適切な条件下におくことによって構築されるものであり、上記成分以外の成分の使用及び条件などは当業者が適宜決定することができる。具体的には、上記工程（ｂ）のチェーンターミネーション反応において記載したとおりである。
【０１０４】
なお、核酸合成酵素については、上記工程（ｂ）で挙げた核酸合成酵素と同じものを用いてもよいし、異なるものを用いてもよい。本工程における核酸合成酵素は、解読用相補鎖合成基質であるシグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）の取り込み活性が高い核酸合成酵素などを当業者が適宜選択することができる。例えば蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性が高い核酸合成酵素として、上記工程（ｂ）で挙げた核酸合成酵素のうち、ＤＮＡポリメラーゼβを選択することが好ましい場合がある。
【０１０５】
核酸合成酵素は基板に固定化されることがあるため（図９（Ｂ）、後述項目７）、固定化用タグを有する場合がある。この場合において、固定化用タグを有する核酸合成酵素は、固定化用タグを有する融合タンパク質として発現させることによって調製することができる。このような融合タンパク質の調製方法は、当業者が適宜選択することができるものである。核酸合成酵素を基板に固定化して核酸合成を行う方法は、核酸合成が固定化されることを除いては通常の核酸合成方法と同様に行うことができ、より具体的な方法は当業者が適宜決定する事ができるものである。例えば、米国特許明細書第６２１０８９６号などを参照することができる。
【０１０６】
［４−２−２．相補鎖ｘ（Ｌ）］
核酸合成系の構築により、合成開始位置の異なるハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅそれぞれにおいて鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ｘ（Ｌ）の合成が行われる（図４工程（ｄ））。相補鎖伸長は、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅにおける伸長鎖ｅの３’末端塩基に隣接する位置からそれぞれ始まり、一定の位置まで続けられる（図７）。このことによって、伸長鎖ｅがさらに伸長され、同様の長さの相補鎖ｘ（Ｌ）が得られる。ことにより、複種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ−ｘ（Ｌ）が得られる。複数種のハイブリッドにおいて得られた複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）は、それぞれ、鋳型ポリヌクレオチドＸ上の異なる位置を占める配列の相補配列を有する。
【０１０７】
相補鎖ｘ（Ｌ）は、本工程における合成対象であるとともに、直接解読される対象でもある。すなわち、相補ｘ（Ｌ）の長さは、１回の連続シーケンス長さ（リード長）に相当する。相補鎖ｘ（Ｌ）は、本発明のポリヌクレオチドシーケンスにおいて直接解読される最小単位である。解読された相補鎖ｘ（Ｌ）の配列は、鋳型ポリヌクレオチドＸ配列解読のための部分配列に相当する（図７）。
相補鎖ｘ（Ｌ）は、鋳型ポリヌクレオチドＸの一部を占める長さを有する。相補鎖ｘ（Ｌ）は１回の連続合成によって得られる相補鎖であるため、その長さはある程度の限界があることが通常である。また、配列決定におけるエラー率の観点からみても、相補鎖ｘ（Ｌ）の長さにある程度の限度を設けておくことが好ましい。本発明は従来法によるポリヌクレオチドシーケンス法に比べて長い鋳型ポリヌクレオチドＸのシーケンスが可能であるが、それにも関わらず、連続合成する鋳型相補鎖の長さ（すなわち１回の連続シーケンス長さ、リード長）は、従来法に比べて特に長くする必要はない。従って、本工程の相補鎖ｘ（Ｌ）の長さは、当業者が適宜決定することができる
。例えば、相補鎖ｘ（Ｌ）の具体的な長さは、１〜３００ｍｅｒでありうる。上記長さの範囲の下限値は、例えば、３、４、１０、１１、１５、１６、１８、２０、３０、３５、７５、１００、又は２００ｍｅｒであってもよい。また、上記長さの上限値は、例えば、２００、１００、７５、３５、３０、２０、１８、１６、１５、１１、１０、４、又は３ｍｅｒであってもよい。
【０１０８】
得られた相補鎖ｘ（Ｌ）は、それぞれ末端部分において、他の相補鎖ｘ（Ｌ）と配列が重複するように得る（図７）。すなわち、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）においては、それらのうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列（３’末端塩基を含む配列）と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列（５’末端塩基を含む配列）とが重複する。配列重複部分の長さは、鋳型ポリヌクレオチドＸ配列の再構成の正確性の観点からは、一般的により長い方が好ましく、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列の再構成の効率の観点からは、一般的により短い方が好ましい。これらの観点などを考慮し、配列重複部分の長さは、例えば１〜２９９ｍｅｒでありうる。また、上記長さの下限値は、例えば、３、４、１０、１１、１５、１６、１８、２０、３０、３５、７５、１００、又は２００ｍｅｒであってもよい。また、上記長さの上限値は、例えば、１９９、９９、７４、３４、２９、１９、１７、１５、１４、１０、９、３、又は２であってもよい。
【０１０９】
［４−３．シーケンス］
相補鎖ｘ（Ｌ）はシーケンスによりその配列（すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列）が解読される。このことによって、複数の相補鎖ｘ（Ｌ）から鋳型ポリヌクレオチドＸの再構成に必要な複数の異なる部分配列を得ることができる。
前述のように、シグナル物質は、デオキシリボヌクレオチドのヌクレオチド部の違いを識別できるように、ヌクレオチド部の種類に応じてそれぞれ異なるシグナルを発するように選択されうる。従って、上述の相補鎖伸長において、シグナル物質標識ヌクレオチドＮ（Ｌ）が結合した順に当該シグナル物質に由来するシグナルを検出することによってシーケンスが行われうる。なお、シグナル検出は、鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖一分子ごとに別個に検出される（図７、ＣＣＤ画像）。
【０１１０】
［４−３−１．シグナル物質検出方法］
シグナル物質の検出の手段としては特に限定されるものではないが、単塩基分解能で検出を行うことができる手段を用いることができる。
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の例としては、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１００，３９６０−３９６４，（２００３）に記載されている方法が挙げられる。この方法を用いる場合、必要な種類（通常４種）のシグナル物質標識ヌクレオチドアナログを用意し、それら必要な種類の溶液を１種類ずつ順に流し、洗浄することを繰り返すことによって、シグナル物質標識ヌクレオチドアナログの種類ごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していく。
【０１１１】
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の他の例としては、全反射蛍光顕微鏡技術（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＩＲＦＭ）を用いる方法が挙げられる。この場合、鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが基板に固定化される。そして、この基板における、鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させる。核酸合成反応によって、蛍光標識ヌクレオチドアナログが核酸合成酵素に取り込まれたときに、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドアナログの蛍光標識がエバネッセント場によって励起される。このように励起された蛍光を検出することができる。
【０１１２】
蛍光分子を励起するために、全反射照明を行い、基板の表面にエバネッセント場を発生させることができる。エバネッセント光が染み出すエリアは基板の表面から約２００ｎｍ以内に限定され、それより遠い領域は非照明領域となる。このため、その限定された領域において生じる蛍光現象の観察を、バックグラウンド蛍光の少ない状態で高感度に行うことが可能になる。
【０１１３】
本発明の鋳型ポリヌクレオチドＸを基板に固定化してシーケンスを行う場合、固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸ分子全体をエバネッセント領域内に存在させるため、液体流を利用して鋳型ポリヌクレオチドＸ分子を引き伸ばすことができる。
一例として、鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が例えば平均1〜５０μｍ/秒の流速を受けるようにすることができる。このことは、平均1〜５０μｍ／秒の流れの中で、ビーズに固定された長鎖ＤＮＡが（完全に引き伸ばされた場合の長さの）１５〜８０％に引き伸ばされることが開示されている文献Perkins T.T., Smith D.E., Larson R.G., Chu S. Stretching of a single tethered polymer in a uniform flow. Science. 1995;268:83-87.の記載から当業者にとって明らかである。
他の一例として、鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が例えば平均1μｍ/秒〜１ｍｍ/秒の流速を受けるようにすることができる。このことは、本発明者らによって、鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が受ける上記の流速範囲を上回る流速、例えば１ｍｍ／秒であっても、固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸ分子全体をエバネッセント領域内に存在させることができることが確認されていることによる。
【０１１４】
なお、図９（Ａ）に模式的に示すように基板表面と略平行に液体流を発生させると、基板表面近傍は流速が極端に遅くなる上に揚力が働く傾向にある。このため、基板表面近傍に存在する固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が所望の平均流速を有する液体流を受けることができるために、例えば以下の計算結果及び実験結果などに基づいて、当業者が適宜、発生させるべき液体流の大きさを決定する事ができる。例えば、流路幅２ｍｍ、流路高５０μｍの流路に平均流速１０ｍｍ／秒の液体流を生じさせると、流路の底面を構成する基板表面から２００ｎｍの地点における流速は２５５μｍ／秒であると計算できる。さらに例えば、流路に平均流速４０ｍｍ／秒の液体流を生じさせると、流路の底面を構成する基板表面から２００ｎｍの地点における流速は１ｍｍ／秒程度である。実際に、基板表面に２ｋｍｅｒの１本鎖ＤＮＡの一方を固定し、上述の条件で、流路に基板表面と略平行に液体流を生じさせると、図９（Ａ）に模式的に示すようにＤＮＡが固定化された状態を維持したまま基板近傍に引き伸ばされ、他方の末端の塩基がＴＩＲＦ観察できたことが本発明者らによって確認されている。すなわち、上述の平均流速を生じさせることにより、ＤＮＡ鎖全体をエバネッセント領域である基板の表面から約２００ｎｍ以内の領域に存在させることができることが確認されている。
【０１１５】
［４−３−２．シグナル検出のタイミング］
シグナル検出のタイミングとしては、合成と同時にシグナルを検出する方法（リアルタイム法）と、未反応基質をリンスしシグナルを検出する方法とを問わない。いずれの場合も、シグナル（具体的には発光した蛍光の波長）及び／又はその強度を順に読み取ることによって、相補鎖ｘ（Ｌ）のシーケンスを行うことができる。
【０１１６】
リアルタイム法においては、以下の原理で検出を行うことができる。蛍光標識されたヌクレオチドアナログは、検出用のカメラでは捉えきれない速度でブラウン運動を行っているため、通常は、照明範囲内にある蛍光標識ヌクレオチドアナログは認識することができない。一方、核酸合成酵素に取り込まれると、蛍光標識ヌクレオチドアナログはそのブラウン運動が抑えられるため、検出用カメラで認識することが可能になる。このことによって、取り込まれたヌクレオチドアナログと、取り込まれていないヌクレオチドアナログすなわち溶液中を漂う遊離のヌクレオチドアナログとを区別することができる。
【０１１７】
さらに、励起された蛍光標識ヌクレオチドアナログは、励起光によって生成した活性酸素の働きにより、次の蛍光標識ヌクレオチドアナログが取り込まれて発光するまでに消光する、もしくは次の蛍光標識ヌクレオチドアナログが取り込まれて発光し消光する以前に前の蛍光標識ヌクレオチドアナログが消光する。このため、読みたい蛍光標識ヌクレオチドアナログのみを検出することができる。
【０１１８】
未反応基質をリンスしシグナルを検出する方法においては、核酸合成系においてシグナル物質標識ヌクレオチドアナログが核酸合成酵素に取り込まれた後に、取り込まれなかったシグナル物質標識ヌクレオチドアナログを洗い流す。これによって、ノイズ成分を除くことができ、合成されたヌクレオチドアナログに由来するシグナルの検出を容易にすることができる。
【０１１９】
シグナル検出の後、再び核酸合成系を構築し、同様の操作を繰り返してよい。この場合においては、先の核酸合成により得られた鋳型ポリヌクレオチド相補鎖の３’末端がターミネートされている場合がある。例えば、先の核酸合成系において、反応を停止させることができるヌクレオチドアナログ（具体的には、さらに可逆的ターミネータ機能を有するシグナル物質標識ヌクレオチドアナログ（すなわち、上述の項目２−１−２−２に記載の、標識された可逆的ターミネータヌクレオチドと同じ物質））を解読用相補鎖合成基質に使用した場合が挙げられる。この場合、再び核酸合成系を構築する前に、項目３で記載したようにターミネーションのリバースを行う。
【０１２０】
［５．鋳型ポリヌクレオチドＸの配列の再構成工程（ｅ）］
上記工程（ｄ）で得られた複数の異なる部分配列において、一の部分配列の末端を含む配列は、他の一の部分配列の末端を含む配列と同じである。このように、互いに同じ配列を有する末端配列同士を重ねる合わせることによって部分配列同士をつなぎ合わせ、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列が再構成される（図１）。
【０１２１】
［６．ポリヌクレオチドＺの配列の再構成工程（ｆ）］
再構成されたそれぞれの鋳型ポリヌクレオチドＸの配列同士をつなぎ合わせ、ポリヌクレオチドＺの配列が再構成される（図１）。上述の（ａ）〜（ｅ）の工程により、配列が未知のポリヌクレオチドＺのシーケンスが可能となる。
【０１２２】
［７．固定化］
本発明において、基板に固定化される対象（以下、固定化対象と記載する場合がある）は、ヌクレオチド種（プライマー分子や、鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッド）又は核酸合成酵素でありうる。
【０１２３】
［７−１．固定化工程の順序］
ヌクレオチド種を固定化する場合、固定化は、鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列をシーケンスする工程（ｄ）を行う前であれば、いつ行ってもよい。
例えば、固定化は、準備工程（ａ）の後、チェーンターミネーション工程（ｂ）の前に行うことができる。この場合、準備工程（ａ）で得られたハイブリッド、すなわちプライマーｐとプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐが基板上に配置される。図４に、チェーンターミネーション工程（ｂ）の前に固定化を行う態様の一例を模式的に示す。
【０１２４】
また、固定化は、チェーンターミネーション工程（ｂ）の後、ターミネーションのリバース工程（ｃ）の前に行うことができる。この場合、チェーンターミネーション工程（ｂ）で得られたハイブリッド、すなわち可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）がプライマーｐから伸長したｐ−ｅ（Ｔ）とプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）が基板上に配置される。
さらに、固定化は、ターミネーションのリバース工程（ｃ）の後、鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列をシーケンスする工程（ｄ）の前に行うことができる。この場合、ターミネーションのリバース工程（ｃ）で得られたハイブリッド、すなわち相補鎖ｅがプライマーｐから伸長した伸長プライマーｐ−ｅとプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅが基板上に配置される。
上記いずれの場合においても、固定化される対象は、プライマー（遊離のプライマー分子及びハイブリッドを構成しているプライマーの両方を含む）に固定化用タグを有することができ、当該固定化用タグが基板に固定化されることができる。
【０１２５】
核酸合成酵素を固定化する場合（図９（Ｂ））は、鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列をシーケンスする工程（ｄ）で用いられる核酸合成酵素が基板に固定化される。従って、工程（ｄ）の前のいずれかの段階で基板上に固定化されることができる。
【０１２６】
［７−２．基板］
基板としては、特に限定されるものではないが、少なくとも光を透過させる材質から構成されるものが好ましく用いられる。例えば、シリコーン、ガラス、石英ガラス、石英などのケイ素含有基材や、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルなどの樹脂基材など、高い光透過率を有する材質から構成される基板を好適に用いることができる。
また、核酸合成反応液より高い屈折率を有し、且つ、基板と反応液との界面でレーザーを全反射させたときに、反応液側にエバネッセント場を生じることができるような材質から構成される基板であることが好ましい場合がある。
【０１２７】
［７−３．固定化の態様］
基板への固定化は、基板表面におけるリンカーと固定化される対象が有する固定化用タグとを結合させることができる手段であれば特に限定されることなく、当該リンカーや固定化用タグの特性に基づいて、当業者が適宜選択することができる。
基板表面におけるリンカーと固定化される対象における固定化用タグとの結合の種類については特に限定されず、核酸合成条件下においてリンカーと固定化用タグとが不所望に離れないものであればよい。例えば、水素結合、抗原抗体結合、及びビオチン結合性タンパク質−ビオチン間結合などの特異的結合や、共有結合などの結合が挙げられる。
【０１２８】
水素結合の例としては、適当な塩基配列を有するヌクレオチド種同士の相補的結合が挙げられる（図４にその態様の一例を示す。リンカーとなるオリゴヌクレオチドは、例えば１０〜２０ｍｅｒ程度でありうる）が、その他にも、核酸が関与しない水素結合のあらゆるものも含まれる。
【０１２９】
抗原抗体結合のいくつかの例としては、ジゴキシゲニンとジゴキシゲニン抗体との結合、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と抗ＧＳＴとの結合、６ｘＨｉｓ（ヒスチジン）と６ｘＨｉｓ抗体もしくはＮｉ−ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）との結合などが挙げられるが、その他当業者によって用いられうる抗原抗体間結合のいかなるものも含まれる。ビオチン結合性タンパク質−ビオチン間結合としては、アビジン−ビオチン結合に代表されるもので、それらの一方又は両方が誘導体である場合の結合も含まれる。
【０１３０】
共有結合としては、反応性官能基間において形成される結合であれば特に限定されるものではない。また、当該結合は、リンカー試薬を介在させることによって形成されるものであってもよい。反応性官能基としては、ごくいくつかの例として、アミノ基、水酸基、カルボキシル基などが挙げられる。また、リンカー試薬としては、ごくいくつかの例として、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）やＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）などが挙げられる。
【０１３１】
［７−４．固定化用タグ］
固定化用タグは、基板への固定化が行われるまでに固定化される対象に備えられていれば良いため、固定化される対象自身が有する官能基をそのまま固定化タグとして用いる場合を除き、当該固定化用タグを固定化される対象に付す工程は、基板への固定化を行う以前のいずれの段階で行われてもよい。
固定化される対象自身が有する官能基としては、例えばアミノ基、カルボニル基、水酸基、アリール基、炭化水素基、及びリン酸基などが挙げられる。
【０１３２】
固定化用タグは、基板表面のリンカーに対する結合能を有する構造であれば特に限定されるものではなく、当業者が適宜決定することができる。固定化用タグとリンカーとの結合の種類については、上述のとおりである。従って固定化タグとしては、例えば、適当な塩基配列（例えば１０〜２０ｍｅｒ）を有するオリゴヌクレオチド、抗原又は抗体、アビジン又はビオチン、及び反応性官能基などを用いることができる。
オリゴヌクレオチドとしては、前述の項目１−２において述べた鋳型ポリヌクレオチドやポリヌクレオチドＺの種類と同様のものが適用される。抗原／抗体としては、あらゆるものが許容され当業者が適宜選択することができるが、ごく一例として、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体が挙げられる。アビジン／ビオチンとしては、それらの誘導体も含む。反応性官能基としては、アミノ基、水酸基、カルボキシル基及びそれらを含む基などが含まれる。
本発明においては、オリゴヌクレオチドであって、基板表面に設けられたリンカーとしての核酸と相補的結合が可能な配列を有するものが固定化用タグとして好ましく用いられる場合がある（図２（Ｂ）（iii）及び（iv）、図４、及び図８にその態様の一例を示す）。
【０１３３】
固定化タグは、さらに、シグナル物質で標識されていてよい（図２（Ｂ）（iv）及び図４にその態様の一例を示す）。当該シグナル物質は、固定化タグが基板上に固定化された場合に、基板上における存在位置を把握する目的で用いられうる。
なお、同様の目的を達成するための代替手段として、前述のように、工程（ｂ）における可逆的ターミネータヌクレオチドに、シグナル物質をさらに有するもの（すなわち標識された可逆的ターミネータヌクレオチド）を用いることもできる（図８にその態様の一例を示す）。しかしながら、標識された可逆的ターミネータヌクレオチドを用い且つシグナル物質で標識された固定化タグを有することも許容する。
【０１３４】
シグナル物質は、当業者に公知の手段によって検出可能なものであれば特に限定されるものではない。好ましくは、蛍光物質が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０・Ｎａｐｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３．５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｂ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｏｈｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄなどが挙げられる。
【０１３５】
シグナル物質は、鋳型ポリヌクレオチドＸの由来元に応じて異なるものを付すことができる。これは、鋳型ポリヌクレオチドの由来元を識別する（例えばどの個体のＤＮＡについてシーケンスしているか、などの識別を行う）目的で行われることがある。
【０１３６】
［７−５．リンカー］
リンカーは、基板がその表面に有するものであって、上記固定化タグに対する結合能を有する構造である。
リンカーは、固定化タグに対する結合能を有する構造であれば特に限定されるものではなく、当業者が適宜決定することができる。固定化用タグとリンカーとの結合の種類については、上述のとおりである。従ってリンカーとしては、例えば、適当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、抗原又は抗体、アビジン又はビオチン、及び反応性官能基（アミノ基、水酸基、カルボキシル基及びそれらを含む基など）などを用いることができる。本発明においては、オリゴヌクレオチドであって、固定化用タグとしての核酸と相補的結合が可能な配列を有するものが、リンカーとして好ましく用いられる場合がある（図４及び図８にその態様の一例を示す）。
【０１３７】
リンカーは、基板の材料そのものの一部であってもよいし、基板の表面に設けられたものであってもよい。
基板の材料そのものの一部であるリンカーとしては、基板を構成する高分子が有する反応性官能基であって基板表面に露出しているものや、基板表面にコーティングされた物質が有する反応性官能基であってコート層表面に露出しているものなどが挙げられる。ごくいくつかの例として、シラノール基、水酸基、アミノ基などが挙げられる。
また、基板の表面に設けられたリンカーは、上述の基板の材料そのものの一部である反応性官能基に対して、固定化用タグとの結合能を有する構造を付与することによって設けることができる。
【０１３８】
［７−６．固定化の密度］
基板上に固定化する密度としては、例えば固定化された核酸に由来するシグナルを検出する検出器によって光学分解可能な密度とすることができる。そのような密度は、ソフトウェアの解析能等によって異なるため特に限定されるものではない。一例として、3pixel x 3pixelの中の1pixelの輝点を認識することができる検出手段を用いる場合、１ｍｍ２当たり９７，５００〜４，３３３，０００個の核酸を固定することができる。また、ソフトウェアの解析能その他の要因により、上記範囲の上限が例えば１，５６０，０００個又は３９０，０００個であってもよいし、上記範囲の下限が例えば３９０，０００個又は１，５６０，０００個であってもよい場合がある。
【０１３９】
［８．同一基板上における種類の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸの識別法］
本発明においては、同一基板上で、複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸについて本発明を実施することができる。複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸは、同じポリヌクレオチドＺから断片化により生じたもの（図１）でありうる。
同一基板上で複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸについて本発明を実施するには、基板上における複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸが互いに識別可能でなければならない。遅くとも工程（ｂ）の前までにハイブリッドがそれを構成する鋳型ポリヌクレオチドＸの種類ごとに識別されている。識別においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの種類ごとに、基板上の位置情報が明らかであることと、当該位置情報に、鋳型ポリヌクレオチドＸを識別することができるインデックスが関連付けられていることとが必要となる。
【０１４０】
［８−１．鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様の例］
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様としては以下が挙げられる。以下のいずれの態様においても、鋳型ポリヌクレオチドＸが直接的又は間接的にシグナルプローブを有する。すなわち、シグナルプローブは、鋳型ポリヌクレオチドＸに直接的に結合するか、又は、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲート又はハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに直接的に（すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸに間接的に）結合しうる。シグナルプローブは、シグナル物質標識を有する。シグナル物質については、前述のとおりである。シグナルプローブは、例えば既に述べた、図２（Ｂ）（iv）に例示されるシグナル物質標識部分又はシグナル物質標識及び固定化用タグからなる部分と同一である場合がある。
【０１４１】
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様の一例においては、異なる種類の鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれに応じて異なるシグナルプローブを付すことができる。位置情報の取得の際には、シグナルプローブをインデックスとして用いることができる。
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様の他の一例においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの一部の塩基配列情報を解読（但し上記工程（ｄ）で行われる解読とは異なる工程で行われる）により取得することができる。位置情報の取得の際には、この解読された塩基配列情報をインデックスとし用いることができる。この場合における個々のハイブリッドの態様を、インデックス配列取得工程、工程（ｂ）及び工程（ｄ）を抜粋して図１０に模式的に示す。
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様のさらなる他の一例においては、固定化及び上記工程（ａ）〜（ｄ）を含む一連の工程の順番を鋳型ポリヌクレオチドＸの種類ごとに行うことができる。位置情報の取得の際には、その順番をインデックスとして用いることができる。
【０１４２】
［８−２．固定位置の決定］
［８−２−１．固定位置が無作為に決定される場合］
固定位置は、基板上における無作為に決定される位置でありうる（図１１及び図１２に例示される）。すなわち、固定化対象は基板上の任意の位置にランダムに固定されうる。固定後の対象はインデックスを有するものであり、そのインデックスに基づいて位置情報が記録される。
【０１４３】
［８−２−１−１．固定位置の態様］
この場合、固定化にかかる操作において、固定化対象はその種類によって固定化位置が識別可能となるようには制御されない。すなわち、アレイ技術を用いた固定化によって実現されるような整然さは伴わない。従って、複数種の固定化対象が基板上に固定化されると、各種対象は互いに混合した状態で分布する。混合の度合いは供給態様によって異なる場合もあり、特に限定されない。例えば、基板上の複数の対象が固定化されている領域全体において、各種固定化対象の混合割合がほぼ同じとなる分布である場合（図１２に例示される）や、基板上の場所によって各種固定化対象の混合割合において不連続な変化が生じるような分布である場合がある。前者の場合は、複数の固定化対象の全てを含む溶液を供給することや、固定化対象を複数回に分けて且つ基板上の同じ位置に重ねて供給することによって生じうる。後者の場合は、固定化対象を複数回に分けて供給することによって生じうる。
【０１４４】
［８−２−１−２．固定化対象の供給］
固定化対象に含まれるシグナルプローブ又は塩基配列情報をインデックスとする場合、固定化対象の基板上への供給は、識別すべき複数種の固定化対象のうち少なくとも二種を含む溶液を供給することによって行われてよい。この場合、識別すべき複数種の固定化対象を一時に供給してもよいし、複数回に分けて供給してもよい。無論、識別すべき固定化対象を一種類ずつ供給することも許容される。いずれの場合も、シグナルの取得を行うまでに全ての固定化対象が供給され固定化される。
【０１４５】
固定化の順番をインデックスとする場合、固定化対象の基板上への供給は、識別すべき固定化対象が一種類ずつステップワイズに供給されうる。固定化対象の一種類について供給及び固定化され、位置情報が取得された後に、固定化対象の他の一種類について供給及び固定化され、位置情報が取得される、という操作が繰り返される。
また、本発明において、固定化対象に含まれるシグナルプローブ又は塩基配列情報と固定化の順番との両方をインデックスとする場合、固定化対象の基板上への供給は、複数種の固定化対象が複数回にわたって供給されうる。
【０１４６】
固定化対象が基板上に固定化された後においては、洗浄などによって、未固定の固定化対象を除去する処理が行われていることが好ましい。この処理は当業者によって適宜行われる。
【０１４７】
［８−２−２．固定位置が作為的に決定される場合］
また、固定位置は、作為的に決定される位置でもありうる。例えば、固定化の対象を一種類ごとに基板上の異なる位置に供給する場合が挙げられる。この場合、供給手段（マイクピペットなど）は、固定化の対象の種類ごとに変え、基板上の供給位置も隔離することによって、種類の異なる固定化対象が混ざり合わないようにする。好ましくは、複数の親水性部分が疎水性部分によって隔てられるように設けられた基板を用い、固定化の対象をその種類ごとに親水性部分のそれぞれに供給することができる（図１３）。このようにすることによって、基板上における複数種の固定化の対象の集積度を上げることができる。
【０１４８】
［８−３．位置情報の取得］
検出されたシグナルは、固定化対象の基板上における位置情報に変換される。位置情報は、どのような形式で表されるものであってもよいが、検出されたシグナルの位置を、基板上の座標として特定することによって表されるものであることが好ましい。具体的には、基板上に座標系（好ましくは直交座標系）を定め、検出された一のシグナルに対して一義的に定まる二の実数の組によって、シグナルの位置（すなわち固定化対象の位置）を特定することができる（図１１（ａ）及び図１２に例示される）。
【０１４９】
固定化対象に含まれる塩基配列情報をインデックスとする場合、基板上に固定化された識別すべき対象の全てについて、一工程で位置情報を取得することができる。
固定化の順番をインデックスとする場合、識別すべき固定化対象が基板上に固定化される都度、位置情報の取得を行う。具体的には、基板上に固定化された識別すべき対象について位置情報を取得し、その後新たに基板上に固定化された別の識別すべき対象について位置情報を取得する。このとき、例えば、既に取得された対象の位置座標と、新たに取得された対象の位置座標との間で差分をとり、新たなシグナルが検出された座標を、当該別の対象の位置情報として取得することができる。
【０１５０】
このような位置情報を取得する手段は、固定化された対象を識別するための装置（以下、識別装置と記載する）に一手段として備えられることができ、自動化することができる。位置情報読み取り手段としては特に限定されることなく、デジタイザやプラニメータなど、当業者によって適宜選択される。
【０１５１】
取得された位置情報は、上記の識別装置に備えられうる記憶手段に記憶されてもよいし、上記の識別装置から外部の装置に出力されることによって、外部の装置における記憶手段に記憶されてもよい。
【０１５２】
［８−４．インデックス］
インデックスは、複数種の鋳型ポリヌクレオチドＸを種類ごとに特定することによって、その識別を可能にする。本発明において、鋳型ポリヌクレオチドＸの種類の識別のために用いられるインデックスには、上述のように、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれるシグナルプローブ又は塩基配列情報と、固定化順番とが挙げられる。いずれか一つのインデックスのみを用いてもよいし、それぞれのインデックスを組み合わせて用いることもできる。
【０１５３】
［８−４−１．インデックスとしてシグナルプローブを利用する場合］
識別すべき複数の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するためのインデックスの一つとして、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれるシグナルプローブを利用する場合、固定化後におけるそのシグナルプローブに由来するシグナルを位置情報と共に取得すればよい。
【０１５４】
［８−４−２．インデックスとして塩基配列情報を利用する場合］
識別すべき複数の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するためのインデックスの一つとして、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる塩基配列情報を利用する場合、識別すべき対象の全てを基板に固定化し、位置情報を取得した（図１１（ａ）に例示される）後、このような塩基配列情報の取得を行う（図１１（ｂ）に例示される）ことができる。
【０１５５】
インデックスとして利用される塩基配列情報は、複数種の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するための固有配列情報を与えることができるものであれば特に限定されない。
また、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる塩基配列の長さとしては特に限定されないが、複数種の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別することができる固有の配列を与える十分な長さであって、識別の効率性や簡便性に支障を与えない程度の長さであることが好ましい。このような長さは、当業者であれば容易に決定することができる。
【０１５６】
インデックスとしての塩基配列の、鋳型ポリヌクレオチドＸ中の位置としては、例えばプライマーｐの３’末端に隣接する位置でありうる。すなわちこの場合、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、プライマーｐの３’末端から伸長する相補鎖を合成し、その相補鎖の配列を解読することによってインデックスを取得することができる。引き続く工程（ｂ）で合成する可逆的ターミネータ含有伸長鎖ｅ（Ｔ）は、インデックス配列の３’末端に隣接する位置から伸長させることができる。インデックス配列の解読方法は、例えば上記工程（ｄ）と同様に行うことができる。
【０１５７】
上記のような配列を取得する手段は、固定化された対象を識別するための装置に一手段として備えられることができ、自動化することもできる。そのような手段には、蛍光物質標識されたヌクレオチドを供給する手段、及び前記蛍光物質に由来する蛍光を観察する全反射蛍光顕微鏡システムが含まれうる。
また、上記の識別装置は、観察された蛍光を塩基配列情報に変換する手段をさらに含んでもよい。このような手段はソフトウェアによって実現されうる。
【０１５８】
取得された配列情報は、上記の識別装置に備えられうる記憶手段に記憶されてもよいし、識別装置から外部の装置に出力されることによって、外部の装置における記憶手段に記憶されてもよい。
【０１５９】
［８−４−３．インデックスとして固定化の順番を利用する場合］
識別すべき複数の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するためのインデックスの一つとして、固定化対象が基板上に固定化された順番を利用する場合、固定化対象が基板上に固定化される都度、位置情報の取得を行う。すなわち、工程順番の違いが固定化対象の種類の違いを反映する。
【０１６０】
まず、基板及びその表面上に無作為に決定される位置で固定化され且つシグナル物質標識（上述のシグナル物質を使用することができる）を有する固定化対象を用意する。固定化後、当該対象の標識に由来するシグナルが検出され、位置情報が取得される（図１１（ａ）に例示される）。次に、同一の基板表面上において、無作為に決定される位置で固定化され且つシグナル物質標識を有する他の固定化対象を用意する。固定化後、当該他の対象の標識由来するシグナルが検出され、位置情報が取得される（図１２に例示される）。同様の工程が、さらに繰り返して行われることもできる。
【０１６１】
なお、図１２の例においては、後に固定化した核酸検体が有するシグナル標識は、先に固定化した対象が有するシグナル標識と異なるように示されているが、同じシグナル標識を用いることもできる。いずれの場合であっても、位置情報取得においては、既に取得された先の対象の位置座標と、新たに取得された後の対象の位置座標との間で差分をとり、新たなシグナルが検出された座標を、当該後の対象の位置情報として取得することができる。
【０１６２】
上記の識別装置においては、固定化対象を供給する手段と、シグナルを検出する手段と、固定位置情報を取得する手段を含む一連の手段をこの順で複数回機能させるための制御手段が備えられうる。このような手段は、ソフトウェアによって実現されうる。
【０１６３】
［８−５．位置情報とインデックスとの関連付け］
インデックスとして、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる配列を利用する場合、取得された位置情報と配列情報とを上記の識別装置又は外部装置の記憶手段から呼び出し、位置情報と、当該位置において取得された配列情報とを関連付けることによって、各種対象を識別することができる。
例えば図１１（ａ）に示すように、固定化及びシグナル検出された検体に、符号Ａ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎを付し、それぞれについて位置座標を取得し、図１１（ｂ）に示すように、それぞれの鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる配列の相補鎖合成を行って、配列情報を取得する。取得した配列をインデックスとして、それぞれの対象に関連付ける（図示せず）。それぞれの対象が固有の位置情報を有し、それぞれに鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を表すインデックスが関連付けられているため、位置情報から鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を特定することができる。
【０１６４】
インデックスとして、固定化順番を利用する場合、位置情報を取得するごとに、取得された位置情報を上記の識別装置又は外部装置の記憶手段から呼び出し、当該位置情報を取得した固定化順番と関連付けることによって、各種鋳型ポリヌクレオチドＸを識別することができる。
例えば図１１（ａ）に示すように、工程Ａにおいて固定化及びシグナル検出された対象に、工程順番を表すインデックスＡを付した符号Ａ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎを付し、それぞれについて位置座標を取得し、図１２に示すように、工程Ｂにおいて、新たに固定化及びシグナル検出された別種類の対象に、工程順番を表すインデックスＢを付した符号Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３・・・Ｂｍを付し、それぞれについて位置情報を取得する。それぞれの対象が固有の位置情報を有し、それぞれに鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を表すインデックスが関連付けられているため、位置情報から鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を特定することができる。
【０１６５】
上記の識別装置においては、このように位置情報とインデックス情報とを関連付ける手段が備えられていてよい。当該手段は、ソフトウェアによって実現されうる。
【実施例】
【０１６６】
［実施例１：１６ｋｍｅｒのポリヌクレオチドの再構成］
本実施例では、リード長１６ｍｅｒから１６ｋｍｅｒ（32bit PCにおける限界長）のポリヌクレオチド再構成についてphrap（断片配列の重ね合わせから配列を再構成するプログラム）を用いたシミュレーションを行った。本発明の方法における工程（ｄ）の解読をＳＢＳ（sequence by synthesis）によって行う場合、本発明の方法を「ＣＴ型ＳＢＳ法」による方法と記載する。本実施例においては、ポリヌクレオチド再構成能について、従来の方法である「通常のＳＢＳ法」による方法と比較した。
【０１６７】
本実施例におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を図１４に示す。図１４において、本発明のCT型SBS法は、ゲノム（Genome）のモデルである16kmerのポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＺに相当）から断片化により200merの断片（Fragment、ポリヌクレオチドＺの断片である鋳型ポリヌクレオチドＸに相当）を調製し、200merの断片においてリード長16mer（相補鎖ｘ（Ｌ）に相当）を得る。リード長16merから中間長の200merのcontig（鋳型ポリヌクレオチドＸ配列）を作り、200merから16kmer（ポリヌクレオチドＺ配列）を再構成する。
一方、従来の通常のSBS法はゲノム（Genome）のモデルである16kmerのポリヌクレオチドから断片化により16merの断片（Fragment）を調製し、16merの断片においてリード長16merを得る。リード長16merからは下記のとおり16kmerの再構成はできない。
【０１６８】
ターゲットDNAの断片化により調製したFragmentの長さとアセンブラ(phrap)で生成されるcontig長さとの関係を図１５に示す。図１５における「16mer」及び「30mer」で示されたポイントに着目すると、以下のことが示されている。
1) 16merのfragment長からは200〜300merのcontigが再構成可能である。
2) 30merのfragment長からは16kmerのcontigが再構成可能である。
3) fragment長が30merを超えると、再構成できるcontig長は16kmer程度でプラトーになる。
さらに、Fragment長に対するcontig長の変化を示す図を図１６に示す。
【０１６９】
以上の計算結果から以下のことが言える。
I) 16kmerのcontig長を再構成可能なFragment長は30mer以上である。
II) Fragment長30mer未満の場合、ターゲットとするcontig長が長くなれば再構成に必要なFragment長も長くなる。
【０１７０】
すなわち、本発明のＣＴ型ＳＢＳ法においては、上記1)よりリード長16merから中間長の200merのcontig（鋳型ポリヌクレオチドＸ配列）の再構成が可能である。さらに、上記（I）より、200merから16kmer（ポリヌクレオチドＺ配列）の再構成も可能である。従って、リード長16merから最終的に16kmerの再構成が可能であることが証明された。
一方、従来の通常のＳＢＳ法においては、上記1)よりリード長16merから16kmerの再構成は不可能であることが証明された。
【０１７１】
［実施例２：３Ｇｍｅｒのポリヌクレオチドの再構成］
本実施例では、２５０〜３００ｍｅｒ程度から３Ｇｍｅｒのポリヌクレオチド再構成についてphrap（断片配列の重ね合わせから配列を再構成するプログラム）を用いたシミュレーションを行った。本発明の「ＣＴ型ＳＢＳ法」による方法のポリヌクレオチド再構成能について、従来の方法である「通常のＳＢＳ法」による方法と比較した。
【０１７２】
本実施例におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を図１７に示す。図１７において、本発明のCT型SBS法は、3Gmerのゲノム（Genome、ポリヌクレオチドＺに相当）から断片化により2kmerの断片（Fragment、ポリヌクレオチドＺの断片である鋳型ポリヌクレオチドＸに相当）を調製し、2kmerの断片においてリード長75mer（相補鎖ｘ（Ｌ）に相当）を得る。リード長75merから中間長の2kmerのcontig（鋳型ポリヌクレオチドＸ配列）を作り、2kmerから3Gmer（ポリヌクレオチドＺ配列）を再構成する。
一方、従来の通常のSBS法は3Gmerのゲノム（Genome）から断片化により75merの断片（Fragment）を調製し、75merの断片においてリード長75merを得る。リード長75merからは下記のとおり3Gkmerの再構成はできない。
【０１７３】
実施例１の図１６のデータをもとに、contig長（target DNA長）と、そのcontig長に到達するための最低限必要とされるFragment長との関係を図１８に示す。図１８で示された関係から、contig長3Gmerを再構成できるFragment長を外挿した。外挿結果を図１９に示す。図１９に示すように、282merのFragment長があれば3Gのcontig(target DNA)を再構成することができることが示された。
【０１７４】
一方、従来の通常のＳＢＳ法においては、75merから3Gmerの再構成をすることは不可能である。このことは、Genome Research 2010 20: 265-272に実証されている。この論文においては、それまでの既存のアセンブラの欠点（例えば、リード長が短いと（Short readsである場合）ＰＣのメモリを大量に用いる必要があり実用性がない、short reads専用でもヒトゲノム（3x109）の大きさに対応できない、又はアセンブルしても断片化されてしまう）に鑑み、アセンブラillumina GAを用い新たなアルゴリズムによってde novo再構成をしたことが記載されている。アジア人とアフリカ人のゲノムを対象に、35〜75bpのreadを用いて再構成を行ったところ、N50の contig size はアジア人で7.4kb、アフリカ人 5.9 kbであり、Genome coverageも全ゲノムの85〜87％であったことが記載されている。（なお、paired-endを使っており、scaffold は 446.3kb及び61.9 kbと長くなっている。）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分野において用いられる核酸配列決定に関する。より具体的には、本発明は、ポリヌクレオチドシーケンスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡシーケンス法として、ショットガン法が知られている。ショットガン法においては、超音波処理によって断片化されたＤＮＡ断片をサンガー法で解析する。なお、サンガー法における解読長は９００塩基、スループットは０．００００９Ｇｂ／ｒｕｎすなわち０．０００７２Ｇｂ／日である（非特許文献１：www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/dl/21-5-1.pdf）。
【０００３】
その後、技術革新が起こり、ＤＮＡシーケンス法においては、並列処理を行うことで高スループットを実現した次世代型のゲノムシーケンサを用いることが一般的となっている。並列処理の方法は、基板上に鋳型ＤＮＡを固定化し、ヌクレオチド合成の過程を顕微鏡などで同時に観察することによって実現している。シグナルの取得やヌクレオチド合成方法には様々あり、パイロシーケンス（Roche社）、ＳＢＳ（sequence by synthesis）（helicos社、Illumina社）、ＳＢＨ（sequence by hybridyzation）、及びＳＢＬ（sequence by oligo ligation and detection）（Applied Biosystems社）がその代表的なものである。
ＤＮＡシーケンス法がサンガー法から並列処理が可能な方法に変わっても、ＤＮＡ断片の前処理には超音波が用いられており、次世代型のゲノムシーケンサではショットガン法と基板上合成による並列処理とが組み合わされていることが一般的である。
【０００４】
より具体的には、ＳＢＳ法（特許文献１：米国特許第４８６３８４９号明細書）においては、ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＤＮＡテンプレートに相補的なｄＮＴＰアナログが取り込まれる順番を測定することでＤＮＡ塩基配列を決定する。このｄＮＴＰアナログは蛍光標識されていたものであり、ＴＩＲＦ（全反射蛍光顕微鏡システム）を用いて基板上で検出することができる（特許文献２：国際公開第９０１３６６６号パンフレット）。また、ＳＢＳ法においては、可逆的ターミネータを用いて伸長プロセスを停止する手段が利用されることがある（特許文献３：米国特許第５３０２５０９号明細書）。
【０００５】
次世代型のポリヌクレオチドシーケンス法においては、精製した長鎖ＤＮＡを超音波によって解読しやすい長さに小断片化する。小断片化されたＤＮＡの塩基配列は、ＳＢＳ法の多重並列処理によって解読されうる（非特許文献２：New High Throughput Technologies for DNA Sequencing and Genomics, Volume 2, p.187-203）。
また、小断片化されたＤＮＡの塩基配列は、次のような手順で解読されうる。基板上に、同じ配列を有する小断片ＤＮＡのクラスターを形成し、プライマー、ポリメラーゼ、及び４種のラベルがそれぞれ付された、可逆的ターミネータｄＮＴＰを含む核酸合成系によって、一塩基を合成する。蛍光励起によって取り込まれた一塩基を特定し、蛍光ラベルを取りはずした後、さらに次の一塩基を同様に合成及び特定し、蛍光ラベルを取り外す。この工程を繰り返すことによって、小断片ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【０００６】
なお、ポリメラーゼによる合成サイクルを７５回繰り返すと、ミスなく解読することが出できる塩基は７５％であるというデータが報告されている（非特許文献３：www.illumina.com/downloads/GenomicSeq_DataSheet.pdf）。
ＳＢＳ法における配列決定された小断片ＤＮＡの配列の長さ（すなわち解読長）の具体例は、例えば平均３０〜３５ｍｅｒ（非特許文献４：www.helicosbio.com/Portals/0/Documents/Helicos_SalesSpec.pdf）、又は３５〜１５０ｍｅｒ（非特許文献５：www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn#workflow_specs）である。ＳＢＳ法のスループットは６．５Ｇｂ／日（非特許文献５）である。
ＳＢＬ法における解読長は７５ｍｅｒ、スループットは２０〜３０Ｇｂ／日（非特許文献６：www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generation-sequencing/next-generation-systems.html）である。
【０００７】
決定された小断片ＤＮＡの塩基配列を元に、コンピュータにより、既知のリファレンス（ヒトゲノムなど）に基づいて取得した当該小断片ＤＮＡの塩基配列データのマッチングを行い、長鎖ＤＮＡの配列を決定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４８６３８４９号明細書
【特許文献２】国際公開第９０１３６６６号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５３０２５０９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】“第２１回DDBJing講習会(2009.6.17-18) Shorts Readsデータ解析例の紹介”、[online]、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ・データ・バンク・オブ・ジャパン）、[平成２２年１１月２２日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/dl/21-5-1.pdf＞
【非特許文献２】New High Throughput Technologies for DNA Sequencing and Genomics, Volume 2, p.187-203、２００７年
【非特許文献３】“HIGH ACCURACY PAIRED-END READS”、[online]、イルミナ・インコーポレイテッド、[平成２１年検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.illumina.com/downloads/GenomicSeq_DataSheet.pdf＞
【非特許文献４】“Helicos(R)Genetic Analysis System”、[online]、ヘリコス・バイオサイエンス・コーポレーション、[平成２２年７月２１日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.helicosbio.com/Portals/0/Documents/Helicos_SalesSpec.pdf＞
【非特許文献５】“Genome Analyzer IIe”、[online]、イルミナ・インコーポレイテッド、[平成２２年７月２１日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn#workflow_specs＞
【非特許文献６】“5500 Series SOLiDTMSequencers”、[online]、アプライド・バイオシステムズ、［平成２２年１１月２２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/solid-next-generation-sequencing/next-generation-systems.html＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の方法においては、下記の問題があるため、未知配列のポリヌクレオチド長塩基配列を高いスループットで解読・再構成することができない。
【００１１】
［サンガー法においては１ｋｍｅｒ以上の長塩基を直接解読することは難しく、また解読スループットも後述するSBS法に比べ低い］
サンガー法における解読長はゲル電気泳動における分離分解能で制約され、一般的には９００ｍｅｒ程度であり、また解読スループットはSBS法と比較して非常に低い（非特許文献１及び非特許文献５）。
【００１２】
［SBS法においては長塩基を連続して合成した時のエラー率が高い］
蛍光ラベル化されたｄＮＴＰアナログは天然のｄＮＴＰに比べてポリメラーゼによって合成伸長されにくく、典型的な例ではエラー率が約１％あることが知られている。（なお、エラーの原因は、テンプレートとのミスマッチ（例えばテンプレートがAの時T以外が取り込まれるとミスマッチになる）と、合成しないとこによる同期遅れとが挙げられる。）具体的には、既に述べたとおり、ポリメラーゼによる合成サイクルを７５回繰り返すと、ミス無く解読することが出来る塩基は７５％であるというデータが報告されている（非特許文献３）。このことから、伸長すべきＤＮＡの長さが７５ｍｅｒを超えると、エラー率がより高いことが予想できる。従って、ポリメラーゼ連鎖反応によってＤＮＡポリメラーゼに取り込まれた蛍光ラベル化ｄＮＴＰアナログを特定する方法では、その性質上、連続して直接的に数百ｍｅｒ以上の長い塩基配列を特定することが難しいことがわかる。
【００１３】
［SBS法においては各断片解読長が短いためコンピュータによる未知配列再構成長に制約がある］
このため、SBS法では1回のシーケンス長さをエラーが少ない範囲（例えば３６塩基）に限定し、代わりに多数のポリヌクレオチド断片を並列的に解読しコンピュータ技術で解読した断片間の重複部を一致させるように再構成を行うことで、実効的に長い配列を解読しようとするものである。しかしながら、対象が全く未知の配列を断片化して再構成しようとする場合、未知配列の長さに応じて重複部分の長さが必要になる。このため、各々の解読断片長は、再構成可能な未知配列長さを制約する。SBS法として典型的な例では１回のシーケンス長が３０〜３５塩基であるが、このような解読断片長で１ｋｍｅｒ以上の長い未知塩基配列を決定することは非常に難しい。
【００１４】
また、一回のシーケンス長さを短くすると、今度は以下の問題による悪影響も発生する。
【００１５】
［ＤＮＡの小断片化による末端配列の消失］
超音波や制限酵素で切断されたＤＮＡ末端は、平滑化された後、プライマーのライゲーションに供される。平滑化によって数塩基が消失するため、消失した塩基はシーケンスすることが出来ない。従って、断片長が短くなるほど、読み取る塩基長に比べて消失する塩基数の割合が増え無視できなくなるため、より多くの断片を解読する必要が発生する。これによって、断片化がより多く起こるほど、解読する必要がある塩基数の割には、最終的な配列（再構成塩基配列）が十分な長さで得られないということになる。言い換えれば、断片化がより多く起こるほど、解読すべき塩基数に対する再構成塩基配列長の比率は低下する、或いは、断片長が短いほど、解読すべき塩基数に対する再構成塩基配列長は短くなる。
【００１６】
そこで本発明の目的は、配列が未知であるポリヌクレオチドのシーケンス法でありながら、従来のSBS法の特徴である、サンガー法に勝る解読のスピードを維持しつつ、サンガー法を超える連続長塩基配列を再構成することが出来る方法を提供することにある。より具体的には、本発明の目的は、一回の（断片の）連続シーケンス長さを、SBS法におけるシーケンス精度を保つことが出来る最低限の長さとしつつも、連続シーケンスした多数の断片から未知配列のポリヌクレオチドを再構成する長さを従来法における場合よりも長くすることができるポリヌクレオチドシーケンス法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、同じ配列を有し且つ複数本のポリヌクレオチド断片を調製し、それぞれにおいてシーケンス開始位置を異ならしめるようにプライマーを予め伸長し、同じ配列の異なる領域を同時にシーケンスすることを可能にすることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
以下の工程を含む、ポリヌクレオチドシーケンス法；
（ａ）準備工程であって、
ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸにプライマーｐ’が結合したプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘに、プライマーｐがハイブリダイズしたハイブリッドを複数個用意する工程と、
（ｂ）チェーンターミネーション工程であって、
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとを含むチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を用いて、前記ハイブリダイズしたプライマーｐの３’末端側から前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の相補結合により前記複数分子間での異なる位置で合成が停止することによって、長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）を得る工程、
（ｃ）ターミネーションのリバース工程であって、
前記長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータを開裂させることによって、長さの異なる複数種の相補鎖ｅを得る工程、
（ｄ）一分子単位での解読工程であって、
シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）である解読用相補鎖合成基質を用いて、前記複数分子間での異なる位置からそれぞれ前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を、前記複数種のうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列とが重複するように得ると共に、
前記シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）が結合した順に、前記ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）に由来するシグナルを、一分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ごとに個別に検出することによって、前記複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を前記鋳型ポリヌクレオチドＸの複数の部分配列として決定する工程。
【００１９】
前記工程（ａ）において、ポリヌクレオチドＺの断片配列と実質的に同一の配列には、通常起こりうる複製時のエラーを含む配列を含む。また、前記工程（ａ）においては、通常、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列とともに、それらの相補配列も生じる。このため、本発明においては、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列にはこのような相補配列も含む。従って、相補配列も引き続く工程に供されることができる。
前記工程（ａ）においては、複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸから複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを用意し、プライマーｐをハイブリダイズさせることにより、プライマーｐとプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを複数個（いずれも同一又は実質的に同一の配列を有するもの）得ることができる。
【００２０】
前記工程（ｂ）においては、チェーンターミネーション用相補鎖合成基質を含む核酸合成により、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐから、長さが異なる複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）を得ることにより、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）を得る。より具体的には、工程（ｂ）における核酸合成では、プライマーｐの３’末端側から伸長反応が開始し、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が結合することにより伸長反応が停止するまで相補鎖合成が行われる。伸長反応が停止した位置は、ハイブリッドごとに異なりうるため、長さの異なる複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）が得られる。相補鎖ｅ（Ｔ）は、３’末端に可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を有する。
【００２１】
前記工程（ｃ）においては、相補鎖ｅ（Ｔ）の３’末端塩基においてターミネータが開裂することにより、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）それぞれからハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅを得る。
【００２２】
前記工程（ｄ）においては、相補鎖の合成と、合成された相補鎖塩基の解読とが行われる。解読は、相補鎖一分子単位で行われる。
具体的には、解読用相補鎖合成基質を含む核酸合成により、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅそれぞれにおいて相補鎖ｘ（Ｌ）を得ることにより、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ−ｘ（Ｌ）を得る。複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）は、全て、鋳型ポリヌクレオチドＸに由来する配列を有するものであり、それぞれ、鋳型ポリヌクレオチドＸ上の異なる位置を占める配列の相補配列を有する。相補鎖ｘ（Ｌ）の配列は互いに一部重複する。すなわち、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）のうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列とが重複する。ここでいう３’末端配列、５’末端配列は、それぞれ、３’末端塩基を含む配列、５’末端塩基を含む配列という意味であり、その末端配列が相補鎖ｘ（Ｌ）においてどのような長さを占めるものであってもよい。複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）は、同様の長さで得られうる。
また、解読用相補鎖合成基質が結合した順番に、基質に由来するシグナル物質を相補鎖ごとに個別に検出される。これにより相補鎖ｘ（Ｌ）一分子ごとに配列が決定される。決定された配列は、すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列に相当する。
【００２３】
（２）
前記複数の部分配列から、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を再構成する工程（ｅ）をさらに含む、（１）に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法。
上記（２）に記載の方法においては、相補鎖ｘの配列データをつなぎ合わせて鋳型ポリヌクレオチドＸの配列が決定される。
【００２４】
（３）
前記再構成された前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列から、前記ポリヌクレオチドＺの配列を再構成する工程（ｆ）をさらに含む、（２）に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記（３）に記載の方法においては、上記（２）で決定された鋳型ポリヌクレオチドＸの配列の配列データをつなぎ合わせてポリヌクレオチドＺの配列が決定される。
すなわち、上記（３）の方法においては、解読で得られた比較的短い前記部分配列（相補鎖ｘ）の配列データのアセンブルにより、一旦、中間の長さのコンティグ（鋳型ポリヌクレオチドＸの配列）を作成、さらに、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列データから長鎖のコンティグ（ポリヌクレオチドＺの配列）を作成する。
【００２５】
（４）
前記チェーンターミネーション用相補鎖合成基質において、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記ヌクレオチドＮに対して、０．０１〜９９％となる量で混合されている、（１）〜（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００２６】
上記（４）に記載の方法がもたらす効果の一つとして、複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）を好ましい長さの差を有するように得ることができることが挙げられる。
【００２７】
（５）
前記鋳型ポリヌクレオチドＸの長さが１０００ｍｅｒ以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００２８】
上記（５）に記載の方法がもたらす効果の一つとして、断片化によって消失する塩基長の割合を、著しく低減することができることが挙げられる。
【００２９】
上記相補鎖ｘ（Ｌ）の長さが１ｍｅｒ〜３００ｍｅｒである、上記のポリヌクレオチドシーケンス法。
本発明は、従来法に比べて鋳型となるヌクレオチドの鎖長が長い場合であっても、直接シーケンスされる相補鎖の長さを、連続合成時のエラーを可及的に抑えることができる程度に短くすることができる。
【００３０】
下記は、核酸を基板上に固定化した状態で核酸合成を行う方法に関する。
（６）
上記工程（ｄ）の前に、前記工程（ｃ）で得られた、前記相補鎖ｅが前記プライマーｐから伸長して生じた伸長プライマーｐ−ｅと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（７）
上記工程（ｃ）の前に、前記工程（ｂ）で得られた、前記可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が前記プライマーｐから伸長して生じた鎖ｐ−ｅ（Ｔ）と前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（８）
上記工程（ｂ）の前に、前記工程（ａ）で得られた、前記プライマーｐと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００３１】
（９）
前記プライマーｐ鎖が固定化用タグを有するものであり、
前記基板がその表面にリンカーを有するものであり、
前記固定化用タグは、前記リンカーに対する結合能を有するものである、（１）〜（８）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００３２】
（１０）
前記固定化用タグが、シグナル物質で標識されたものである、（９）に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記の方法がもたらす効果の一つとして、基板上におけるポリヌクレオチドの固定化位置を確認することができることが挙げられる。
【００３３】
（１１）
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、さらにシグナル物質で標識されたものである、（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記の方法がもたらす効果の一つとして、上記（１０）の方法での固定化用タグにおけるシグナル物質標識の使用と同様に、固定化位置の確認を行うことができることが挙げられる。従って、シグナル物質で標識された可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の使用は、上記（１０）の方法での固定化用タグにおけるシグナル物質標識の使用の代替手段として用いることもできる。
【００３４】
（１２）
前記プライマーｐが、前記プライマーｐ’の５’末端塩基に対応する相補塩基を欠如したものであり、
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記欠如した相補塩基を有するものである、（１）〜（１０）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
上記（１２）に記載の方法がもたらす効果の一つとして、シーケンスできない配列をなくすことができることが挙げられる。
【００３５】
以下は、鋳型ポリヌクレオチドの調製法を特定したものである。
（１３）
前記ポリヌクレオチドＺが、１つの細胞から精製されたものである、（１）〜（１２）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１４）
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、複数の細胞から精製された前記ポリヌクレオチドの断片として調製されたものである、（１）〜（１３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１５）
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記断片配列をベクターに挿入し、宿主細胞で増殖することによって調製されたものである、（１）〜（１４）のいずれか記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１６）
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記ポリヌクレオチドＺの断片をＰＣＲによって調製したものである、（１）〜（１４）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
（１７）
前記ポリヌクレオチドＺの断片が、前記ポリヌクレオチドを超音波又は制限酵素で断片化することによって調製されたものである、（１）〜（１６）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【００３６】
下記（１８）及び（１９）は、前記工程（ｂ）の前までに、配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを同一基板上に固定化する場合に、それら配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別する工程を特定するものである。
なお、以下において「直接的に又は間接的に」とは、鋳型ポリヌクレオチドＸに直接結合して、又は、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲート又はハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに直接結合して、という意味である。
【００３７】
下記（１８）における識別工程においては、配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれに含まれる塩基配列情報を識別用インデックスとして利用することによって、同一基板上に無作為に決定される位置で（すなわちランダムに）固定化された複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを、それらの固定化位置情報に基づいて識別する。
【００３８】
（１８）
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、（１）〜（１７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）が、前記基板上に固定化された前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸのそれぞれに含まれる塩基配列情報を取得することを含み、
前記工程（II）において、前記塩基配列情報を前記位置情報と関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【００３９】
下記（１９）における識別工程においては、配列の異なる複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸが基板上に固定化された順番を識別用インデックスとして利用することによって、同一基板上に無作為に決定される位置で（すなわちランダムに）固定化された複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを、それらの固定化位置情報に基づいて識別する。
【００４０】
（１９）
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、（１）〜（１７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）において、（Ａ）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程と、その後、（Ｂ）前記基板表面上に、無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された他の鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものをさらに得て、前記他の鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程とを少なくとも行い、
前記工程（II）において、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む工程の順番と、それぞれの工程において取得された前記位置情報とを関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によって、配列が未知であるポリヌクレオチドのシーケンス法でありながら、従来のSBS法の特徴である、サンガー法に勝る解読のスピードを維持しつつ、サンガー法を超える連続長塩基配列を再構成することが出来る方法が可能になる。より具体的には、本発明によって、一回の（断片の）連続シーケンス長さを、SBS法におけるシーケンス精度を保つことが出来る最低限の長さとしつつも、連続シーケンスした多数の断片から未知配列のポリヌクレオチドを再構成する長さを従来法における場合よりも長くすることができるポリヌクレオチドシーケンス法が可能になる。
【００４２】
例えば、従来法のように、ポリヌクレオチドの断片化によって得られる鋳型ポリヌクレオチドの長さを、連続合成に適した長さ（例えば７５ｍｅｒ）に合わせると、断片化によって失われる塩基（例えば両端５ｍｅｒが失われるとした場合）の割合が５／７５＝６．７％である。一方、本発明の方法は、鋳型ポリヌクレオチドの一部のみ（例えば連続合成に適した長さの一例である７５ｍｅｒ）について連続合成をすればよいため、鋳型ポリヌクレオチドを短くする必要がなくなる。例えば鋳型ポリヌクレオチドを２ｋｍｅｒ長程度に設定することも可能であり、この場合、断片化によって失われる塩基の割合は５／２０００＝０．３％ですむ。
【００４３】
また、本発明の方法が、連続合成する長さを７５ｍｅｒ程度の短さとすることができるということは、従来法のように２ｋｍｅｒもの長さを連続合成する場合に比べてエラー率を低減させることが可能である。
【００４４】
本発明の方法は、例えば５０００塩基長の長い断片を用い、その断片内で多数の比較的短い領域を解読することによって、５０００塩基長の断片を精度高くシーケンスすることができる。従来法における解読長はサンガー法で９００塩基、ＳＢＳ法で１５０塩基、ＳＢＬ法で７５塩基であることから、本発明の方法によって、従来のサンガー法と実質的に同程度又はそれ以上の長塩基解読が可能である。
本発明の方法によると、原理的に市販のＳＢＳ法と同等のスループット（シーケンス塩基量）が得られるため、サンガー法に比べ圧倒的に優れたスループット性を実現することができる。
本発明の方法によると、実施例で実証されているとおり、従来のＳＢＳ法やＳＢＬ法に比べ圧倒的に優れたde novo対応力を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の概要を模式的に示したものである。
【図２】ポリヌクレオチドＺの断片とプライマーとのライゲート（Ａ）、ポリヌクレオチドＺの断片配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸとプライマーｐ’とからなるプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとを含むハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの例（Ｂ）（i）〜（iv）をそれぞれ模式的に示したものである。
【図３】図２の（Ｂ）（ii）の態様をより具体的に示したものである。
【図４】図２の（iv）のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐが固定化工程において基盤に固定化される態様、本発明の工程（ｂ）によってハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐにおいて可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が伸長した態様、本発明の工程（ｃ）によって可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータが開裂した態様、本発明の工程（ｄ）によって解読用相補鎖ｘ（Ｌ）が伸長された態様を模式的に示したものである。
【図５】図３の態様における本発明の工程（ｂ）において、同一又は実質同一の配列を有する複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐから、ハイブリッド間で長さの異なる可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が伸長し、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）を生じた態様を模式的に示したものである。
【図６】図５に引き続く態様であって、本発明の工程（ｃ）において、可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータが開裂した態様を模式的に示したものである。
【図７】図６に引き続く態様であって、本発明の工程（ｄ）において、解読用相補鎖ｘ（Ｌ）が伸長された態様及び解読用相補鎖ｘ（Ｌ）に由来するシグナルを相補鎖ｘ（Ｌ）一分子毎に個別に検出したＣＣＤ画像、及び、本発明の工程（ｅ）において、解読用相補鎖ｘ（Ｌ）の配列（鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列）から鋳型ポリヌクレオチドＸを再構成する態様を模式的に示したものである。
【図８】図２の（iii）のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐが、図４と同様に固定化工程において基盤に固定化される態様、及び本発明の工程（ｂ）によってハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐにおいて可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が伸長した態様を模式的に示したものである。
【図９】基板上に固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸが、液体流によって引き伸ばされることによって基板上から２００ｎｍまでの領域において存在する状態において、核酸合成酵素によって鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖が合成された態様を模式的に示したもの（Ａ）、及び、基板上に固定化された核酸合成酵素を用い、鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖が合成されている態様を模式的に示したもの（Ｂ）を示す。
【図１０】鋳型ポリヌクレオチドＸの識別のために、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる塩基配列情報をインデックスとして使用する場合における、個々のハイブリッドの態様を、インデックス配列取得工程、工程（ｂ）及び工程（ｄ）を抜粋して模式的に示したものである。
【図１１】固定化対象が基板上に無作為に決定される位置で固定化され、位置情報が取得された態様の一例を、基板上の一部における固定化された対象の態様を示す拡大図と共に模式的に示したもの（ａ）、及びさらにその後、当核対象において、インデックス用塩基配列情報を与える配列を合成した態様の一例を模式的に示したものである。
【図１２】図１１（ａ）において位置情報が取得された後、さらに別種類の固定化対象を無作為に決定される位置で固定化し位置情報を取得した態様の一例を、基板上の一部における固定化された対象の態様を示す拡大図と共に模式的に示したものである。
【図１３】複数の親水性部分が疎水性部分によって隔てられるように設けられた基板（基板表面の一部を拡大）を模式的に示したものである。
【図１４】実施例１におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を示したものである。
【図１５】再構成に用いられる断片の長さと、再構成可能なコンティグ長との関係を示したものである。
【図１６】断片長に対するコンティグ長の変化を示したものである。
【図１７】実施例２におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を示したものである。
【図１８】コンティグ長（ターゲットＤＮＡ長）と、そのコンティグ長に到達するための最低限必要とされる断片長との関係を示したものである。
【図１９】図１８で示された関係から導出された、コンティグ長3Gmerを再構成できる断片長についての外挿結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
図１に、本発明の概要を模式的に示す。本発明は、ポリヌクレオチドＺの断片配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸを分断することなく、鋳型ポリヌクレオチドＸ全体を網羅することができる複数の部分配列を得て（工程ａ、ｂ、ｃ及びｄによる）、部分配列から再構成により、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を決定する（工程ｅによる）方法である。さらに、決定された鋳型ポリヌクレオチドＸの配列情報から再構成により、ポリヌクレオチドＺの配列を決定する（工程ｆによる）。
【００４７】
［１．準備工程（ａ）］
準備工程においては、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列を有する複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれにプライマーｐ’が結合した、複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを用意する。複数分子のｐ’−Ｘにプライマーｐをハイブリダイズする。
【００４８】
［１−１．ポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸ］
鋳型ポリヌクレオチドＸは、ポリヌクレオチドＺの断片と同一又は実質的に同一の配列を有する配列を有する。より具体的には、複数分子のポリヌクレオチドＸには、ポリヌクレオチドＺの断片と完全同一の配列を有するポリヌクレオチドを含み、さらに、ポリヌクレオチドＺの断片と実質的に同一の配列を有する配列を有するものを含んでも良い。ポリヌクレオチドＺの断片配列と実質的に同一の配列には、当業者が同一の配列を有するヌクレオチドを調製する場合に通常生じうるものであって、例えば、複製時のエラーを含む配列を含む。許容するエラー率は特に限定されるものではないが、例えばＰＣＲ用のポリメラーゼtaqのエラー率は1/9000すなわち0.011％程度であり、さらに改質されたポリメラーゼPhusionのエラー率はtaqポリメラーゼの1/50すなわち0.00022%程度である。従って、許容するエラー率は、例えば0.01％以下、好ましくは0.00022%以下でありうる。
また、ポリヌクレオチドＺの断片と同一又は実質的に同一の配列を得る際、通常、それらの相補配列も生じる。従って、本発明においては、ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列には、それらの相補配列も包含される。
【００４９】
［１−２．種類］
鋳型ポリヌクレオチドＸの母体であるポリヌクレオチドＺは、最終的に配列が決定されうる。従って、ポリヌクレオチドＺは、その断片が核酸合成の鋳型となりうるものであれば、特に限定されるものではない。ポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸとしては、以下のものが挙げられる。
【００５０】
構造的観点からは、主として核酸塩基、五炭糖及びリン酸基から構成されるヌクレオチド残基がホスホジエステル結合により連結したポリマーであり、ＤＮＡ、ＲＮＡに限らず、それらポリヌクレオチドのアナログも含まれる。（ポリヌクレオチドアナログは、ポリヌクレオチドにおける原子又は原子団が別の原子又は原子団に置換された構造を持つ、ポリヌクレオチドとは別の物質をいう。以下、アナログについては同様に解釈するものとする。）
【００５１】
核酸塩基としては、相補的な核酸塩基又は核酸塩基アナログとワトソンクリック水素結合により塩基対を形成し得る、いかなる窒素含有複素環も許容される。具体的には、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン及びそれらの誘導体が挙げられる。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、チミン（Ｔ）、およびこれらの核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、５−プロピニル−シチジン、イソシチジン、イソグアニン、７−デアザ−グアニン、２−チオ−ピリミジン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、４−チオ−ウラシル、Ｏ６−メチル−グアニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｏ４−メチル−チミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドール、及びエテノアデニン）が挙げられる。
【００５２】
五炭糖は、置換されていても置換されていなくてもよく、置換された五炭糖は、例えば、３’炭素が−Ｒ基、−ＯＲ基、−ＮＲＲ基、及びハロゲン基から選ばれる置換基を有しうる（Ｒは同じ又は異なっていてよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基）。従って、五炭糖は、２’−デオキシリボースやリボースに代表されるが、２’，３’−ジデオキシリボース、３’−ハロリボース、３’−フルオロリボース、３’−クロロリボース、および３’−アルキルリボースなども許容される。
【００５３】
ホスホジエステル結合には、置換されていても置換されていなくてもよく、置換されたホスホジエステル結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホルアニリデート結合及びホスホルアミデート結合などが挙げられる。
【００５４】
また、配列由来の観点からは、天然に由来するもの、人為的に変更されたもの又は合成配列、及びそれらの混合が許容される。より具体的には、ヒトを含む様々な生物、及びウイルス及び細菌を含む様々な微生物の染色体、ゲノム、ｃＤＮＡ、それらの断片（但し鋳型ポリヌクレオチドＸより大きな単位のもの）などが挙げられる。また、ポリヌクレオチドＺは、異なる個体に由来する同じ配列のものであってもよい。
【００５５】
［１−３．ポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸの長さ］
ポリヌクレオチドＺの長さは、特に限定されるものではない。例えば、１０ｋｍｅｒ程度〜３Ｇｍｅｒでありうる。上記範囲の下限値は、例えば１６ｋ、１０Ｍ、３０Ｍ、１００Ｍ、３００Ｍ、５００Ｍ、又は１Ｇｍｅｒであってもよい。また、上記範囲の上限値は、例えば１Ｇ、５００Ｍ、３００Ｍ、１００Ｍ、３０Ｍ、又は１０Ｍｍｅｒであってもよい。
【００５６】
鋳型ポリヌクレオチドＸは、ポリヌクレオチドＺの断片として生じるものであるから、例えば１ｍｅｒ〜５ｋｍｅｒの長さのものでありうる。この中でも、本発明の方法においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの長さは、ポリヌクレオチドＺより短く、後述の相補鎖ｘより長いことが通常である。
鋳型ポリヌクレオチドＸの長さは、シグナル物質標識されたヌクレオチドアナログを基質とした相補鎖の連続合成が可能な長さよりも長いことが通常である。従って、従来のポリヌクレオチドシーケンス法における鋳型に比べて長いことが好ましい。例えば、１ｋｍｅｒ以上でありうる。この範囲の上限値は、ＰＣＲの増幅サイズの上限で決まるため、特に限定されるものではない。（例えば、BioLabs社から市販されているPCRポリメラーゼTaqの増幅サイズは５ｋｂ以下であり、LongAmp Taqの増幅サイズは４０ｋｂ以下である。）従って、上記範囲の上限値は例えば４０ｋｍｅｒである場合もあるが、それを超える場合もある。上記範囲の下限値は、さらに、２ｋ、３ｋ、４ｋ、又は５ｋｍｅｒであってもよい。また、上記範囲の上限値は、さらに、３５ｋ、３０ｋ、２５ｋ、２０ｋ、１５ｋ、１０ｋ、５ｋ、４ｋ、３ｋ、又は２ｋｍｅｒであってもよい。
【００５７】
また、後述のように鋳型ポリヌクレオチドＸがポリヌクレオチドＺから調製される際には断片化工程が行われるが、断片化工程では、平滑化による数塩基の消失を伴う。消失した塩基はシーケンス不可能である。従って、得られる断片（すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸ）の長さが十分な長さを保つように調製されることは、シーケンス不可能な配列を相対的に著しく低減し、ポリヌクレオチドシーケンスの精度向上に貢献する点で好ましい。
【００５８】
［１−４．複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸの調製法］
鋳型ポリヌクレオチドＸは、ポリヌクレオチドＺを断片化し、得られた断片のそれぞれと同一又は実質的に同一の配列を有する配列を有するポリヌクレオチドとして調製する。
【００５９】
ポリヌクレオチドＺは、１つの細胞に由来するものであってもよいし、複数の細胞に由来するものであってもよい。また、ポリヌクレオチドＺは、１つの検体に由来するものであってもよいし、複数の検体に由来するものであってもよい。
ポリヌクレオチドＺは、細胞から精製されたものでありうる。精製の手法としては特に限定されるものではなく、当業者によって公知の方法が適宜選択される。
【００６０】
ポリヌクレオチドＺの断片それぞれについて同配列或いは実質的に同配列のものを複数本得るための方法としては、ポリヌクレオチドＺの断片のコピーを調製する方法が挙げられる。
ポリヌクレオチドＺの断片のコピーを調製する方法としては、例えば、ポリヌクレオチドＺの断片配列を鋳型とする核酸増幅法（ＰＣＲに代表される方法）が挙げられる。増幅法の具体的なプロトコルも特に限定されるものではなく、当業者によって公知の方法から適宜選択される。また、ポリヌクレオチドＺの断片のコピーを調製する他の方法としては、例えば、ポリヌクレオチドの断片配列をベクターに挿入し、宿主細胞で増殖させることによって行う方法が挙げられる。この方法についても、具体的なプロトコルは特に限定されるものではなく、当業者によって公知の方法が適宜選択される。
【００６１】
ポリヌクレオチドＺの断片それぞれについて同配列或いは実質的に同配列のものを複数本得るための他の方法としては、異なるソースからポリヌクレオチドＺを取得し、それぞれ断片化することによって得る方法が挙げられる。異なるソースとしては、異なる細胞が挙げられる。当該異なる細胞は、異なる個体に由来しうる。
【００６２】
ポリヌクレオチドＺの断片配列を得るために行われる断片化工程は、公知の手法を用いて当業者によって適宜行われる。具体的には、超音波や制限酵素を用いた方法が挙げられる。
【００６３】
［１−５．プライマー］
プライマーはオリゴヌクレオチドである。その具体的構成要素としては、上述のポリヌクレオチドＺ及び鋳型ポリヌクレオチドＸにおけるものと同様である。プライマーは、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘの調製に用いられる。さらに、核酸合成反応系において、相補鎖合成の開始点を与える。プライマーは合成したものであっても良く、生物界から単離したものであっても良い。
【００６４】
また、プライマーは、後述の項目７で記載するように固定化用タグを有するものであってもよい。さらにその場合、当該固定化用タグが基板上に固定化されていてもよい。
【００６５】
［１−６．プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ］
ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの調製法は特に限定されず、上述の複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸを用いることによって、当業者が適宜決定する事ができるものである。
一例として、まず、複数分子の鋳型ポリヌクレオチドＸから、複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを得て、その後、複数分子のプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘから、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを得ることができる。
【００６６】
プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘは、例えば、図２（Ａ）に記載のように鋳型ポリヌクレオチドＸにプライマーをライゲーションさせ、一本鎖化することによって、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘを得ることができる。一本鎖化は、熱処理やアルカリ処理などによる変性を行えばよい。
なお、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘにおいて、プライマーｐ’はＸの両端に結合しうる。
【００６７】
図２（Ｂ）（i）に記載のように、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘに、プライマーｐをハイブリダイズさせることにより、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを調製することができる。
図２（Ｂ）（ii）に記載のように、ハイブリダイズしているプライマーｐは、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲートしているプライマーｐ’の５’末端塩基に対応する相補塩基を欠如したものであってよい。図２（Ｂ）（ii）の態様をより具体的に図３に示す。図３においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの５’末端の記載は省略している。図３においては、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲートしているプライマーｐ’の５’末端塩基（すなわちＡ）に対応する相補塩基（すなわちＴ）を欠如している。後述するが、このようにプライマーをデザインすると、後述の可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の核酸塩基部分を上記の欠如した相補塩基（図３の場合にあってはＴ）としてデザインすることによって、鋳型ポリヌクレオチドＸの３’末端塩基からシーケンスを行うことが可能になる。
【００６８】
図２（Ｂ）（iii）及び（iv）は、プライマーｐが後述の固定化用タグを有する場合のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを示したものである。（iv）に示すハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐは、さらにシグナル物質を有する。これらのような態様とすることによって、基板上への固定化が可能となる（図４及び図８）。
【００６９】
［２．チェーンターミネーション工程（ｂ）］
チェーンターミネーション工程は、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ、及び、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとを含むチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を含む核酸合成系にて行われる。
【００７０】
［２−１．チェーンターミネーション用相補鎖合成基質］
チェーンターミネーション用相補鎖合成基質は、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）と、ヌクレオチドＮと、の両方を含む。チェーンターミネーション用相補鎖合成基質は、プライマーｐの３’末端から伸長する伸長鎖ｅ（Ｔ）の構成単位となる。
【００７１】
［２−１−１．（リバーシブルターミネート機能を有しない通常の）ヌクレオチドＮ］
ヌクレオチドＮは、主として核酸塩基、五炭糖および１以上（通常１〜３）のリン酸基から構成されるものであれば特に限定されるものではない。核酸塩基及び五単糖としては、上述の項目１−２で述べたポリヌクレオチドの構成要素と同様である。また、リン酸基としては、上述の項目１−２で述べたポリヌクレオチドを構成するホスホジエステル結合を生じさせるものであればよい。具体的には、ヌクレオチドＮとして、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びその他ヌクレオチドアナログが挙げられる。ただし、ここでいうヌクレオチドＮとしてのヌクレオチドアナログは、リバーシブルターミネート機能を有しないという点で、後述の可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）と区別される。
【００７２】
ヌクレオチドＮは通常、その核酸塩基が異なる複数種のものが混合されて用いられる。しばしば、ヌクレオチドＮは、その核酸塩基が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）であるものが混合されて用いられる。例えば、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）が混合されたものが用いられる場合がある。混合量としては、それぞれのヌクレオチドの量が同程度（モル基準）となるように調整されてもよいし、使用する核酸合成酵素の反応効率に応じて当業者によって適宜調整されてもよい。後者の場合においては、核酸合成酵素に取り込まれる速度が速いヌクレオチドは相対的に少なく、その速度が遅いヌクレオチドは相対的に多くなるように調整することができる。例えば、ｄＡＴＰの反応速度が他のｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰに比べて早い場合は、ｄＡＴＰの濃度をｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰに比べて低くすることができる。
【００７３】
［２−１−２．可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）］
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は、可逆的ターミネータ部とヌクレオチド部とを含む。
【００７４】
［２−１−２−１．可逆的ターミネータ部］
可逆的ターミネータは、ヌクレオチドの伸長において、さらなる伸長が起こらないようにヌクレオチド末端をターミネートする機能とともに、開裂によってヌクレオチドの伸長を再開することを可能とする可逆的機能を有するターミネータをいう。
従って、可逆的ターミネータは、可逆的ターミネート機能を有する構造、すなわち成長中の核酸へさらなるヌクレオチドの取り込みを妨害することが可能な構造を有する。そのような構造としては、例えば、五炭糖の少なくとも３’−水酸基における改変部（すなわち３’−水酸基の置換基）が挙げられる。改変部は、プライマーｐと鋳型ポリヌクレオチドＸとの相互作用に支障をきたさない条件下で除去することができるものであれば特に限定されるものではない。
例えば、３’−水酸基の置換基は、還元的切断を受けうるいかなる基でもよく、具体的にはジスルフィド基含有有機基（有機基はアルキル基でありうる）などが挙げられる。また、また例えば、３’−水酸基の置換基は、脱離機構による切断を受けうるいかなる基でもよく、具体的にはアリル基などが挙げられる。
【００７５】
［２−１−２−２．ヌクレオチド部のデザイン］
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）のヌクレオチド部は、可逆的ターミネート機能を有する構造を有することを除いて、上述のヌクレオチドＮと同様の構造を有してよい。
【００７６】
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）のいずれか１とすることができる。また、当該核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）から選ばれる２以上、例えば３、４或いは５であることも許容する。
【００７７】
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの少なくともいずれかにおいて、プライマー伸長開始位置（すなわちプライマーｐの３’末端の塩基に隣接する塩基の位置）に取り込まれるようにデザインされることができる。
具体的には、当該核酸合成開始位置の塩基が予め判っている場合において、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の核酸塩基が、プライマーｐの３’末端の塩基に相補的結合している塩基の５’末端側に隣接する塩基に相補的であるようにデザインされうる。
【００７８】
このようにデザインすることにより、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐの少なくともいずれかにおいて、プライマーｐに隣接する位置でプライマー伸長を停止させることができる。プライマーからの伸長鎖ｅ（Ｔ）の部分は後述工程（ｄ）におけるシーケンスの対象とならない。従って上述のようにデザインすると、プライマーｐの３’末端に隣接する塩基（すなわち鎖長１の伸長鎖ｅ（Ｔ）を構成する塩基）が既知となる。結果として、後述のシーケンスと合わせて鋳型ポリヌクレオチドＸの全ての配列を解読することができる。
【００７９】
より好ましい態様としては、図３に示すように、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐにおけるプライマーｐが、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲートしているプライマーｐ’の５’末端塩基（図３の場合ではＡ（アデニン））に対応する相補塩基（図３の場合はＴ（チミン））を欠如したものであり、可逆的ターミネータヌクレオチド（Ｔ）の核酸塩基が、上記の欠如した相補塩基（図３の場合はＴ（チミン））となるようにデザインされる。
【００８０】
上記の好ましい態様のようにデザインすることにより、上記プライマーｐの３’末端の欠如した位置に可逆的ターミネータヌクレオチド（Ｔ）が結合して伸長を停止させることができる。このため、後述工程（ｄ）において最初に結合する解読用相補鎖合成基質が、鋳型ポリヌクレオチドＸの３’末端塩基の相補塩基となる。すなわち、後述のシーケンスによって鋳型ポリヌクレオチドＸの３’末端塩基からシーケンスを開始することができる。すなわち、シーケンスできない配列がない。結果として、鋳型ポリヌクレオチドＸの全ての配列を解読することができる。
【００８１】
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は、さらにシグナル物質で標識されたものであってよい。標識された可逆的ターミネータヌクレオチドは、例えば図２の（Ｂ）（iii）のように、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐがシグナル物質を有しない場合に有用である。この場合、図８に示すように、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐを基板に固定し、チェーンターミネーション工程（ｂ）に供して得られるハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）をシグナル標識（図中Ｌと表記）を有するものとして得ることができる。これにより、ハイブリッドの基板上の固定位置の確認が可能になる。
【００８２】
［２−２．可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）伸長反応］
上述のチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を用いて、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとプライマーｐとを含むハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐとともに核酸合成系が構築される。
【００８３】
［２−２−１．核酸合成系］
核酸合成系は、上記成分を含んだ核酸合成反応液を適切な条件下におくことによって構築されるものであり、上記成分以外の成分の使用及び条件などは当業者が適宜決定することができる。
具体的には、核酸合成反応液は、上記成分の他に、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌなどの塩類及び核酸合成酵素を含む。その他に、界面活性剤やタンパク質などの物質を必要に応じて添加することができる。
【００８４】
ｐＨ緩衝液としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、塩酸、硝酸、硫酸などの鉱酸とを組み合わせたもの、及び、その他種々のｐＨ緩衝液を用いることができる。ｐＨ調製された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用することができる。
【００８５】
核酸合成酵素としては、基質であるヌクレオチドＮ及び可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を、鋳型ポリヌクレオチド依存的に、プライマーへ結合させる能力を有するものであれば特に限定されず、当該分野で用いられうるいかなる核酸重合酵素も含まれる。
核酸重合酵素には、ＤＮＡポリメラーゼ類、ＲＮＡポリメラーゼ類、逆転写酵素類、リガーゼ類、キナーゼ類、及びそれらの組み換え体などが含まれる。酵素の起源となる種についても特に限定されない。
例えば、ＤＮＡポリメラーゼβ、E.coliのＤＮＡポリメラーゼ、E.coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、T4ＤＮＡポリメラーゼ、TaqＤＮＡポリメラーゼ、T.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taqポリメラーゼ、KODＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを用いることができる。
【００８６】
さらに上記の他にも、KAPA2GTMFastＤＮＡポリメラーゼ（カパ・バイオシステムズ）、KAPA2GTMRobustＤＮＡポリメラーゼ（カパ・バイオシステムズ）、HybripolＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）、Sequenase Version 2.0 T7ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＥヘルスケアジャパン）、TherminatorTMＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）、Therminator TM IIＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）、Therminator TMIIIＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）、及びPhusion TM High-Fidelity DNA Polymerase（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド）なども用いることができる。
【００８７】
増幅反応におけるその他の条件としては、核酸合成酵素の活性を保持することができる条件が当業者によって適宜選択される。ｐＨ条件としては、例えば２５℃におけるｐＨが５．８〜１０．７とすることができる。上記範囲の上限値は、９．５、８．５又は７．０であってもよく、上記範囲の下限値は、７．０、８．５又は９．５であってもよい。この条件は、当業者によって、核酸合成酵素の至適ｐＨに応じて適宜決定される。また、温度条件としては、例えば２５〜１００℃とすることができる。上記範囲の上限値は、９５℃、６５℃又は３７℃であってもよく、上記範囲の下限値は、３７℃、６５℃又は９５℃であってもよい。この条件は、当業者によって、核酸合成酵素の至適温度に応じて適宜決定される。
【００８８】
［２−２−２．可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）］
核酸合成系が構築されると、プライマーｐの３’末端塩基に隣接する位置（すなわち合成開始位置）から相補鎖伸長が始まる。相補鎖伸長においては、チェーンターミネーション用相補鎖合成基質からランダムに、ヌクレオチドＮ又は可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が取り込まれる。ヌクレオチドＮが連続して取り込まれている間はプライマーｐの伸長反応が持続するが、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が取り込まれると当該伸長反応は停止する。従って、プライマーｐの３’末端塩基に隣接する合成開始位置から可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が結合した位置まで相補鎖が伸長される。これにより、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を３’末端に有する伸長鎖ｅ（Ｔ）が生成する（図４工程（ｂ）、図５）。
【００８９】
この際、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）がいつ取り込まれるかは可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の混合比に依存する。従って、核酸合成反応中に存在する同配列、複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐについては、その各々において、相補鎖の伸長は可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の混合比に依存した異なる位置で停止しうる。すなわち、プライマー伸長反応中、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の混合比が一定であれば、相補鎖ｅ（Ｔ）の終点（すなわち３’末端残基の位置）は確率的な分布をとりうる。
その結果、同一又は実質同一の配列を有する複数個のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐから、異なる長さの相補鎖ｅ（Ｔ）が生成する。結果として、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）を得る（図５）。
【００９０】
［２−３．チェーンターミネーション用相補鎖合成基質における混合比］
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとの混合比は特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。混合比は、プライマー伸長反応によって得られる長さの異なる複数種の相補鎖ｅ（Ｔ）を、どの程度の長さの差をもって生じさせるかということを考慮して決定することができる。一般的に、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の量をより少なくなるように調整すると相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差をより大きく設定することができ、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の量をより多くなるように調整すると上記長さの差をより小さく設定することができる。
上記に加え、使用する核酸合成酵素の反応効率も考慮して決定することができる。この場合においては、核酸合成酵素に取り込まれる速度が速い可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は相対的に少なく、その速度が遅い可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）は相対的に多くなるように調整することができる。
【００９１】
例えば、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）を、ヌクレオチドＮの０．０１〜９９％（モル基準）となるように当該混合比を決定することができる。当該範囲を上回ると、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列決定の正確さは担保できるものの、例えば鋳型ポリヌクレオチドＸの長さに対し後述工程（ｅ）で再構成される部分配列（後述の相補鎖ｘ（Ｌ）の配列）の数が不所望に多くなる場合があり、このために当該再構成の効率が下がる傾向にある。また、当該範囲を下回ると、例えば後述工程（ｄ）で設定される１回の連続シーケンス長さ（後述の相補鎖ｘ（Ｌ）の長さ）を不所望に長く設定する必要性が生じる場合があり、その結果、配列決定におけるエラー率が上がる傾向にある。
【００９２】
［２−４．ハイブリッド間での可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差］
上述のとおり、ハイブリッド間での相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差がどの程度であれば適切かは、想定される後述の相補鎖ｘ（Ｌ）の長さ及び数を考慮して判断することができる。
工程（ｄ）における１回の連続シーケンス長さ（相補鎖ｘ（Ｌ）の長さ）はある程度限定されることが通常である（後述項目４−２−２．相補鎖ｘ（Ｌ））。従って、通常、ハイブリッド間での相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差は、工程（ｄ）における１回の連続シーケンス長さより短い。どの程度短ければ適切かは、後述工程（ｅ）（図７）において部分配列（相補鎖ｘ（Ｌ）の配列）から鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を再構成する場合に必要となる、部分配列同士（相補鎖ｘ（Ｌ）の配列）の配列重複部分の長さによって判断される。後述（項目４−２−２．相補鎖ｘ（Ｌ））の通り、相補鎖ｘ（Ｌ）の長さは例えば１〜３００ｍｅｒ、配列重複部分の長さは例えば１〜２９９ｍｅｒであるから、相補鎖ｅ（Ｔ）の長さの差は例えば１〜２９９ｍｅｒでありうる。
【００９３】
［３．ターミネーションのリバース工程（ｃ）］
ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）において、伸長鎖ｅ（Ｔ）の３’末端の塩基は前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）に由来する。可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）において、ターミネータが開裂する。そのための具体的な方法は、プライマーｐと鋳型ポリヌクレオチドＸとの相互作用に支障をきたさない条件下で除去することができれば特に限定されるものではなく、可逆的ターミネータの種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。
【００９４】
ターミネータの開裂は、例えば、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）における３’−水酸基の置換基がジスルフィド基含有有機基（有機基はアルキル基などの炭化水素基でありうる）などである場合は、還元条件下での切断によって行うことができる。より具体的には、パラジウム系触媒を用いる接触水素化によって行うことができる。
また例えば、可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）における３’−水酸基の置換基がアリル基などである場合は、脱離反応によって行うことができる。より具体的には、パラジウム触媒による還元的脱離反応によって行うことができる。
【００９５】
ターミネータの開裂によって、ハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）からハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅを得ることができる（図４工程（ｃ）、図６）。より具体的には、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅが、伸長鎖ｅの長さを異にして得られる（図６）。
【００９６】
ターミネータの開裂によって、伸長プライマーｐ−ｅの３’末端に隣接する合成開始位置から再び核酸合成を行うことが可能になる。
【００９７】
［４．鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列を一分子単位でシーケンスする工程（ｄ）］
本工程においては、合成開始位置の異なる複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅを核酸合成系に供することによって、鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ｘ（Ｌ）を複数種得る。相補鎖ｘ（Ｌ）は鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列を有するものであるため、シーケンスの対象となる。相補鎖ｘ（Ｌ）の合成とシーケンスとを同時に行ってもよいし、相補鎖ｘ（Ｌ）を合成した後、合成された相補鎖ｘ（Ｌ）をシーケンスしてもよい。
【００９８】
［４−１．解読用相補鎖合成基質］
解読用相補鎖合成基質は、シグナル物質で標識されたヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）である。
［４−１−１．ヌクレオチド部］
ヌクレオチド部については、前述の２−１−１におけるヌクレオチドＮと同様の構造を有することができる。また、ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）は、ヌクレオチド部の核酸塩基が異なる複数種のものが混合されて用いられる。しばしば、ヌクレオチドＮ（Ｌ）は、その核酸塩基が、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）であるものが混合されて用いられる。例えば、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のシグナル標識体が混合されたものが用いられる場合がある。混合量としては、それぞれのヌクレオチドの量が同程度（モル基準）となるように調整されてもよいし、使用する核酸合成酵素の反応効率に応じて当業者によって適宜調整されてもよい。後者の場合においては、核酸合成酵素に取り込まれる速度が速いヌクレオチドアナログは相対的に少なく、その速度が遅いヌクレオチドアナログは相対的に多くなるように調整することができる。例えば、標識ｄＡＴＰの反応速度が他の標識ｄＣＴＰ、標識ｄＧＴＰ及び標識ｄＴＴＰに比べて早い場合は、標識ｄＡＴＰの濃度を標識ｄＣＴＰ、標識ｄＧＴＰ及び標識ｄＴＴＰに比べて低くすることができる。
【００９９】
［４−１−２．シグナル物質による標識部］
シグナル物質による標識部については、例えば以下のシグナル物質（蛍光物質）に由来する基が挙げられる。Ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０・Ｎａｐｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３．５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｂ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｏｈｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄなど。
【０１００】
また、核酸合成酵素として例えばＤＮＡポリメラーゼβを用いる場合に、陰イオン性の蛍光基が好ましく用いられる場合がある。これは、陰イオン性の蛍光基をシグナル標識として有するヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）とＤＮＡポリメラーゼβとの相性を有効に利用することができる場合があるためである。上述の蛍光基のうち、陰イオン性の蛍光標識としては、フルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、ナフトフルオレセイン、Ｃｙ３．５・５・５．５などが挙げられる。
【０１０１】
標識部に由来するシグナルによってヌクレオチド部の違いを識別することができるように、標識部は、ヌクレオチド部の種類に応じてそれぞれ異なるシグナルを発するように選択されうる。例えばシグナル物質が蛍光物質である場合、蛍光物質は、ヌクレオチド部の種類に応じてそれぞれ異なる波長の蛍光を発するように選択されうる。このことによって、発せられたシグナルに基づいてシーケンスを行うことができる。
【０１０２】
［４−２．相補鎖ｘ（Ｌ）伸長反応］
上述の解読用相補鎖合成基質を用いて、プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘと伸長プライマーｐ−ｅとを含むハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅとともに核酸合成系が構築される。
【０１０３】
［４−２−１．核酸合成系］
核酸合成系は、上記成分を含んだ核酸合成反応液を適切な条件下におくことによって構築されるものであり、上記成分以外の成分の使用及び条件などは当業者が適宜決定することができる。具体的には、上記工程（ｂ）のチェーンターミネーション反応において記載したとおりである。
【０１０４】
なお、核酸合成酵素については、上記工程（ｂ）で挙げた核酸合成酵素と同じものを用いてもよいし、異なるものを用いてもよい。本工程における核酸合成酵素は、解読用相補鎖合成基質であるシグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）の取り込み活性が高い核酸合成酵素などを当業者が適宜選択することができる。例えば蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性が高い核酸合成酵素として、上記工程（ｂ）で挙げた核酸合成酵素のうち、ＤＮＡポリメラーゼβを選択することが好ましい場合がある。
【０１０５】
核酸合成酵素は基板に固定化されることがあるため（図９（Ｂ）、後述項目７）、固定化用タグを有する場合がある。この場合において、固定化用タグを有する核酸合成酵素は、固定化用タグを有する融合タンパク質として発現させることによって調製することができる。このような融合タンパク質の調製方法は、当業者が適宜選択することができるものである。核酸合成酵素を基板に固定化して核酸合成を行う方法は、核酸合成が固定化されることを除いては通常の核酸合成方法と同様に行うことができ、より具体的な方法は当業者が適宜決定する事ができるものである。例えば、米国特許明細書第６２１０８９６号などを参照することができる。
【０１０６】
［４−２−２．相補鎖ｘ（Ｌ）］
核酸合成系の構築により、合成開始位置の異なるハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅそれぞれにおいて鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ｘ（Ｌ）の合成が行われる（図４工程（ｄ））。相補鎖伸長は、複数種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅにおける伸長鎖ｅの３’末端塩基に隣接する位置からそれぞれ始まり、一定の位置まで続けられる（図７）。このことによって、伸長鎖ｅがさらに伸長され、同様の長さの相補鎖ｘ（Ｌ）が得られる。ことにより、複種のハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ−ｘ（Ｌ）が得られる。複数種のハイブリッドにおいて得られた複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）は、それぞれ、鋳型ポリヌクレオチドＸ上の異なる位置を占める配列の相補配列を有する。
【０１０７】
相補鎖ｘ（Ｌ）は、本工程における合成対象であるとともに、直接解読される対象でもある。すなわち、相補ｘ（Ｌ）の長さは、１回の連続シーケンス長さ（リード長）に相当する。相補鎖ｘ（Ｌ）は、本発明のポリヌクレオチドシーケンスにおいて直接解読される最小単位である。解読された相補鎖ｘ（Ｌ）の配列は、鋳型ポリヌクレオチドＸ配列解読のための部分配列に相当する（図７）。
相補鎖ｘ（Ｌ）は、鋳型ポリヌクレオチドＸの一部を占める長さを有する。相補鎖ｘ（Ｌ）は１回の連続合成によって得られる相補鎖であるため、その長さはある程度の限界があることが通常である。また、配列決定におけるエラー率の観点からみても、相補鎖ｘ（Ｌ）の長さにある程度の限度を設けておくことが好ましい。本発明は従来法によるポリヌクレオチドシーケンス法に比べて長い鋳型ポリヌクレオチドＸのシーケンスが可能であるが、それにも関わらず、連続合成する鋳型相補鎖の長さ（すなわち１回の連続シーケンス長さ、リード長）は、従来法に比べて特に長くする必要はない。従って、本工程の相補鎖ｘ（Ｌ）の長さは、当業者が適宜決定することができる
。例えば、相補鎖ｘ（Ｌ）の具体的な長さは、１〜３００ｍｅｒでありうる。上記長さの範囲の下限値は、例えば、３、４、１０、１１、１５、１６、１８、２０、３０、３５、７５、１００、又は２００ｍｅｒであってもよい。また、上記長さの上限値は、例えば、２００、１００、７５、３５、３０、２０、１８、１６、１５、１１、１０、４、又は３ｍｅｒであってもよい。
【０１０８】
得られた相補鎖ｘ（Ｌ）は、それぞれ末端部分において、他の相補鎖ｘ（Ｌ）と配列が重複するように得る（図７）。すなわち、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）においては、それらのうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列（３’末端塩基を含む配列）と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列（５’末端塩基を含む配列）とが重複する。配列重複部分の長さは、鋳型ポリヌクレオチドＸ配列の再構成の正確性の観点からは、一般的により長い方が好ましく、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列の再構成の効率の観点からは、一般的により短い方が好ましい。これらの観点などを考慮し、配列重複部分の長さは、例えば１〜２９９ｍｅｒでありうる。また、上記長さの下限値は、例えば、３、４、１０、１１、１５、１６、１８、２０、３０、３５、７５、１００、又は２００ｍｅｒであってもよい。また、上記長さの上限値は、例えば、１９９、９９、７４、３４、２９、１９、１７、１５、１４、１０、９、３、又は２であってもよい。
【０１０９】
［４−３．シーケンス］
相補鎖ｘ（Ｌ）はシーケンスによりその配列（すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列）が解読される。このことによって、複数の相補鎖ｘ（Ｌ）から鋳型ポリヌクレオチドＸの再構成に必要な複数の異なる部分配列を得ることができる。
前述のように、シグナル物質は、デオキシリボヌクレオチドのヌクレオチド部の違いを識別できるように、ヌクレオチド部の種類に応じてそれぞれ異なるシグナルを発するように選択されうる。従って、上述の相補鎖伸長において、シグナル物質標識ヌクレオチドＮ（Ｌ）が結合した順に当該シグナル物質に由来するシグナルを検出することによってシーケンスが行われうる。なお、シグナル検出は、鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖一分子ごとに別個に検出される（図７、ＣＣＤ画像）。
【０１１０】
［４−３−１．シグナル物質検出方法］
シグナル物質の検出の手段としては特に限定されるものではないが、単塩基分解能で検出を行うことができる手段を用いることができる。
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の例としては、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１００，３９６０−３９６４，（２００３）に記載されている方法が挙げられる。この方法を用いる場合、必要な種類（通常４種）のシグナル物質標識ヌクレオチドアナログを用意し、それら必要な種類の溶液を１種類ずつ順に流し、洗浄することを繰り返すことによって、シグナル物質標識ヌクレオチドアナログの種類ごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していく。
【０１１１】
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の他の例としては、全反射蛍光顕微鏡技術（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＩＲＦＭ）を用いる方法が挙げられる。この場合、鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが基板に固定化される。そして、この基板における、鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させる。核酸合成反応によって、蛍光標識ヌクレオチドアナログが核酸合成酵素に取り込まれたときに、取り込まれた蛍光標識ヌクレオチドアナログの蛍光標識がエバネッセント場によって励起される。このように励起された蛍光を検出することができる。
【０１１２】
蛍光分子を励起するために、全反射照明を行い、基板の表面にエバネッセント場を発生させることができる。エバネッセント光が染み出すエリアは基板の表面から約２００ｎｍ以内に限定され、それより遠い領域は非照明領域となる。このため、その限定された領域において生じる蛍光現象の観察を、バックグラウンド蛍光の少ない状態で高感度に行うことが可能になる。
【０１１３】
本発明の鋳型ポリヌクレオチドＸを基板に固定化してシーケンスを行う場合、固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸ分子全体をエバネッセント領域内に存在させるため、液体流を利用して鋳型ポリヌクレオチドＸ分子を引き伸ばすことができる。
一例として、鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が例えば平均1〜５０μｍ/秒の流速を受けるようにすることができる。このことは、平均1〜５０μｍ／秒の流れの中で、ビーズに固定された長鎖ＤＮＡが（完全に引き伸ばされた場合の長さの）１５〜８０％に引き伸ばされることが開示されている文献Perkins T.T., Smith D.E., Larson R.G., Chu S. Stretching of a single tethered polymer in a uniform flow. Science. 1995;268:83-87.の記載から当業者にとって明らかである。
他の一例として、鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が例えば平均1μｍ/秒〜１ｍｍ/秒の流速を受けるようにすることができる。このことは、本発明者らによって、鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が受ける上記の流速範囲を上回る流速、例えば１ｍｍ／秒であっても、固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸ分子全体をエバネッセント領域内に存在させることができることが確認されていることによる。
【０１１４】
なお、図９（Ａ）に模式的に示すように基板表面と略平行に液体流を発生させると、基板表面近傍は流速が極端に遅くなる上に揚力が働く傾向にある。このため、基板表面近傍に存在する固定化された鋳型ポリヌクレオチドＸ分子が所望の平均流速を有する液体流を受けることができるために、例えば以下の計算結果及び実験結果などに基づいて、当業者が適宜、発生させるべき液体流の大きさを決定する事ができる。例えば、流路幅２ｍｍ、流路高５０μｍの流路に平均流速１０ｍｍ／秒の液体流を生じさせると、流路の底面を構成する基板表面から２００ｎｍの地点における流速は２５５μｍ／秒であると計算できる。さらに例えば、流路に平均流速４０ｍｍ／秒の液体流を生じさせると、流路の底面を構成する基板表面から２００ｎｍの地点における流速は１ｍｍ／秒程度である。実際に、基板表面に２ｋｍｅｒの１本鎖ＤＮＡの一方を固定し、上述の条件で、流路に基板表面と略平行に液体流を生じさせると、図９（Ａ）に模式的に示すようにＤＮＡが固定化された状態を維持したまま基板近傍に引き伸ばされ、他方の末端の塩基がＴＩＲＦ観察できたことが本発明者らによって確認されている。すなわち、上述の平均流速を生じさせることにより、ＤＮＡ鎖全体をエバネッセント領域である基板の表面から約２００ｎｍ以内の領域に存在させることができることが確認されている。
【０１１５】
［４−３−２．シグナル検出のタイミング］
シグナル検出のタイミングとしては、合成と同時にシグナルを検出する方法（リアルタイム法）と、未反応基質をリンスしシグナルを検出する方法とを問わない。いずれの場合も、シグナル（具体的には発光した蛍光の波長）及び／又はその強度を順に読み取ることによって、相補鎖ｘ（Ｌ）のシーケンスを行うことができる。
【０１１６】
リアルタイム法においては、以下の原理で検出を行うことができる。蛍光標識されたヌクレオチドアナログは、検出用のカメラでは捉えきれない速度でブラウン運動を行っているため、通常は、照明範囲内にある蛍光標識ヌクレオチドアナログは認識することができない。一方、核酸合成酵素に取り込まれると、蛍光標識ヌクレオチドアナログはそのブラウン運動が抑えられるため、検出用カメラで認識することが可能になる。このことによって、取り込まれたヌクレオチドアナログと、取り込まれていないヌクレオチドアナログすなわち溶液中を漂う遊離のヌクレオチドアナログとを区別することができる。
【０１１７】
さらに、励起された蛍光標識ヌクレオチドアナログは、励起光によって生成した活性酸素の働きにより、次の蛍光標識ヌクレオチドアナログが取り込まれて発光するまでに消光する、もしくは次の蛍光標識ヌクレオチドアナログが取り込まれて発光し消光する以前に前の蛍光標識ヌクレオチドアナログが消光する。このため、読みたい蛍光標識ヌクレオチドアナログのみを検出することができる。
【０１１８】
未反応基質をリンスしシグナルを検出する方法においては、核酸合成系においてシグナル物質標識ヌクレオチドアナログが核酸合成酵素に取り込まれた後に、取り込まれなかったシグナル物質標識ヌクレオチドアナログを洗い流す。これによって、ノイズ成分を除くことができ、合成されたヌクレオチドアナログに由来するシグナルの検出を容易にすることができる。
【０１１９】
シグナル検出の後、再び核酸合成系を構築し、同様の操作を繰り返してよい。この場合においては、先の核酸合成により得られた鋳型ポリヌクレオチド相補鎖の３’末端がターミネートされている場合がある。例えば、先の核酸合成系において、反応を停止させることができるヌクレオチドアナログ（具体的には、さらに可逆的ターミネータ機能を有するシグナル物質標識ヌクレオチドアナログ（すなわち、上述の項目２−１−２−２に記載の、標識された可逆的ターミネータヌクレオチドと同じ物質））を解読用相補鎖合成基質に使用した場合が挙げられる。この場合、再び核酸合成系を構築する前に、項目３で記載したようにターミネーションのリバースを行う。
【０１２０】
［５．鋳型ポリヌクレオチドＸの配列の再構成工程（ｅ）］
上記工程（ｄ）で得られた複数の異なる部分配列において、一の部分配列の末端を含む配列は、他の一の部分配列の末端を含む配列と同じである。このように、互いに同じ配列を有する末端配列同士を重ねる合わせることによって部分配列同士をつなぎ合わせ、鋳型ポリヌクレオチドＸの配列が再構成される（図１）。
【０１２１】
［６．ポリヌクレオチドＺの配列の再構成工程（ｆ）］
再構成されたそれぞれの鋳型ポリヌクレオチドＸの配列同士をつなぎ合わせ、ポリヌクレオチドＺの配列が再構成される（図１）。上述の（ａ）〜（ｅ）の工程により、配列が未知のポリヌクレオチドＺのシーケンスが可能となる。
【０１２２】
［７．固定化］
本発明において、基板に固定化される対象（以下、固定化対象と記載する場合がある）は、ヌクレオチド種（プライマー分子や、鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッド）又は核酸合成酵素でありうる。
【０１２３】
［７−１．固定化工程の順序］
ヌクレオチド種を固定化する場合、固定化は、鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列をシーケンスする工程（ｄ）を行う前であれば、いつ行ってもよい。
例えば、固定化は、準備工程（ａ）の後、チェーンターミネーション工程（ｂ）の前に行うことができる。この場合、準備工程（ａ）で得られたハイブリッド、すなわちプライマーｐとプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐが基板上に配置される。図４に、チェーンターミネーション工程（ｂ）の前に固定化を行う態様の一例を模式的に示す。
【０１２４】
また、固定化は、チェーンターミネーション工程（ｂ）の後、ターミネーションのリバース工程（ｃ）の前に行うことができる。この場合、チェーンターミネーション工程（ｂ）で得られたハイブリッド、すなわち可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）がプライマーｐから伸長したｐ−ｅ（Ｔ）とプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅ（Ｔ）が基板上に配置される。
さらに、固定化は、ターミネーションのリバース工程（ｃ）の後、鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列をシーケンスする工程（ｄ）の前に行うことができる。この場合、ターミネーションのリバース工程（ｃ）で得られたハイブリッド、すなわち相補鎖ｅがプライマーｐから伸長した伸長プライマーｐ−ｅとプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドｐ’−Ｘ／ｐ−ｅが基板上に配置される。
上記いずれの場合においても、固定化される対象は、プライマー（遊離のプライマー分子及びハイブリッドを構成しているプライマーの両方を含む）に固定化用タグを有することができ、当該固定化用タグが基板に固定化されることができる。
【０１２５】
核酸合成酵素を固定化する場合（図９（Ｂ））は、鋳型ポリヌクレオチドＸの部分配列をシーケンスする工程（ｄ）で用いられる核酸合成酵素が基板に固定化される。従って、工程（ｄ）の前のいずれかの段階で基板上に固定化されることができる。
【０１２６】
［７−２．基板］
基板としては、特に限定されるものではないが、少なくとも光を透過させる材質から構成されるものが好ましく用いられる。例えば、シリコーン、ガラス、石英ガラス、石英などのケイ素含有基材や、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルなどの樹脂基材など、高い光透過率を有する材質から構成される基板を好適に用いることができる。
また、核酸合成反応液より高い屈折率を有し、且つ、基板と反応液との界面でレーザーを全反射させたときに、反応液側にエバネッセント場を生じることができるような材質から構成される基板であることが好ましい場合がある。
【０１２７】
［７−３．固定化の態様］
基板への固定化は、基板表面におけるリンカーと固定化される対象が有する固定化用タグとを結合させることができる手段であれば特に限定されることなく、当該リンカーや固定化用タグの特性に基づいて、当業者が適宜選択することができる。
基板表面におけるリンカーと固定化される対象における固定化用タグとの結合の種類については特に限定されず、核酸合成条件下においてリンカーと固定化用タグとが不所望に離れないものであればよい。例えば、水素結合、抗原抗体結合、及びビオチン結合性タンパク質−ビオチン間結合などの特異的結合や、共有結合などの結合が挙げられる。
【０１２８】
水素結合の例としては、適当な塩基配列を有するヌクレオチド種同士の相補的結合が挙げられる（図４にその態様の一例を示す。リンカーとなるオリゴヌクレオチドは、例えば１０〜２０ｍｅｒ程度でありうる）が、その他にも、核酸が関与しない水素結合のあらゆるものも含まれる。
【０１２９】
抗原抗体結合のいくつかの例としては、ジゴキシゲニンとジゴキシゲニン抗体との結合、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と抗ＧＳＴとの結合、６ｘＨｉｓ（ヒスチジン）と６ｘＨｉｓ抗体もしくはＮｉ−ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）との結合などが挙げられるが、その他当業者によって用いられうる抗原抗体間結合のいかなるものも含まれる。ビオチン結合性タンパク質−ビオチン間結合としては、アビジン−ビオチン結合に代表されるもので、それらの一方又は両方が誘導体である場合の結合も含まれる。
【０１３０】
共有結合としては、反応性官能基間において形成される結合であれば特に限定されるものではない。また、当該結合は、リンカー試薬を介在させることによって形成されるものであってもよい。反応性官能基としては、ごくいくつかの例として、アミノ基、水酸基、カルボキシル基などが挙げられる。また、リンカー試薬としては、ごくいくつかの例として、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）やＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）などが挙げられる。
【０１３１】
［７−４．固定化用タグ］
固定化用タグは、基板への固定化が行われるまでに固定化される対象に備えられていれば良いため、固定化される対象自身が有する官能基をそのまま固定化タグとして用いる場合を除き、当該固定化用タグを固定化される対象に付す工程は、基板への固定化を行う以前のいずれの段階で行われてもよい。
固定化される対象自身が有する官能基としては、例えばアミノ基、カルボニル基、水酸基、アリール基、炭化水素基、及びリン酸基などが挙げられる。
【０１３２】
固定化用タグは、基板表面のリンカーに対する結合能を有する構造であれば特に限定されるものではなく、当業者が適宜決定することができる。固定化用タグとリンカーとの結合の種類については、上述のとおりである。従って固定化タグとしては、例えば、適当な塩基配列（例えば１０〜２０ｍｅｒ）を有するオリゴヌクレオチド、抗原又は抗体、アビジン又はビオチン、及び反応性官能基などを用いることができる。
オリゴヌクレオチドとしては、前述の項目１−２において述べた鋳型ポリヌクレオチドやポリヌクレオチドＺの種類と同様のものが適用される。抗原／抗体としては、あらゆるものが許容され当業者が適宜選択することができるが、ごく一例として、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体が挙げられる。アビジン／ビオチンとしては、それらの誘導体も含む。反応性官能基としては、アミノ基、水酸基、カルボキシル基及びそれらを含む基などが含まれる。
本発明においては、オリゴヌクレオチドであって、基板表面に設けられたリンカーとしての核酸と相補的結合が可能な配列を有するものが固定化用タグとして好ましく用いられる場合がある（図２（Ｂ）（iii）及び（iv）、図４、及び図８にその態様の一例を示す）。
【０１３３】
固定化タグは、さらに、シグナル物質で標識されていてよい（図２（Ｂ）（iv）及び図４にその態様の一例を示す）。当該シグナル物質は、固定化タグが基板上に固定化された場合に、基板上における存在位置を把握する目的で用いられうる。
なお、同様の目的を達成するための代替手段として、前述のように、工程（ｂ）における可逆的ターミネータヌクレオチドに、シグナル物質をさらに有するもの（すなわち標識された可逆的ターミネータヌクレオチド）を用いることもできる（図８にその態様の一例を示す）。しかしながら、標識された可逆的ターミネータヌクレオチドを用い且つシグナル物質で標識された固定化タグを有することも許容する。
【０１３４】
シグナル物質は、当業者に公知の手段によって検出可能なものであれば特に限定されるものではない。好ましくは、蛍光物質が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０・Ｎａｐｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌ、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ４８８、Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３．５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｏｈｄａｍｉｎｅ Ｂ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｏｈｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄなどが挙げられる。
【０１３５】
シグナル物質は、鋳型ポリヌクレオチドＸの由来元に応じて異なるものを付すことができる。これは、鋳型ポリヌクレオチドの由来元を識別する（例えばどの個体のＤＮＡについてシーケンスしているか、などの識別を行う）目的で行われることがある。
【０１３６】
［７−５．リンカー］
リンカーは、基板がその表面に有するものであって、上記固定化タグに対する結合能を有する構造である。
リンカーは、固定化タグに対する結合能を有する構造であれば特に限定されるものではなく、当業者が適宜決定することができる。固定化用タグとリンカーとの結合の種類については、上述のとおりである。従ってリンカーとしては、例えば、適当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、抗原又は抗体、アビジン又はビオチン、及び反応性官能基（アミノ基、水酸基、カルボキシル基及びそれらを含む基など）などを用いることができる。本発明においては、オリゴヌクレオチドであって、固定化用タグとしての核酸と相補的結合が可能な配列を有するものが、リンカーとして好ましく用いられる場合がある（図４及び図８にその態様の一例を示す）。
【０１３７】
リンカーは、基板の材料そのものの一部であってもよいし、基板の表面に設けられたものであってもよい。
基板の材料そのものの一部であるリンカーとしては、基板を構成する高分子が有する反応性官能基であって基板表面に露出しているものや、基板表面にコーティングされた物質が有する反応性官能基であってコート層表面に露出しているものなどが挙げられる。ごくいくつかの例として、シラノール基、水酸基、アミノ基などが挙げられる。
また、基板の表面に設けられたリンカーは、上述の基板の材料そのものの一部である反応性官能基に対して、固定化用タグとの結合能を有する構造を付与することによって設けることができる。
【０１３８】
［７−６．固定化の密度］
基板上に固定化する密度としては、例えば固定化された核酸に由来するシグナルを検出する検出器によって光学分解可能な密度とすることができる。そのような密度は、ソフトウェアの解析能等によって異なるため特に限定されるものではない。一例として、3pixel x 3pixelの中の1pixelの輝点を認識することができる検出手段を用いる場合、１ｍｍ２当たり９７，５００〜４，３３３，０００個の核酸を固定することができる。また、ソフトウェアの解析能その他の要因により、上記範囲の上限が例えば１，５６０，０００個又は３９０，０００個であってもよいし、上記範囲の下限が例えば３９０，０００個又は１，５６０，０００個であってもよい場合がある。
【０１３９】
［８．同一基板上における種類の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸの識別法］
本発明においては、同一基板上で、複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸについて本発明を実施することができる。複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸは、同じポリヌクレオチドＺから断片化により生じたもの（図１）でありうる。
同一基板上で複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸについて本発明を実施するには、基板上における複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドＸが互いに識別可能でなければならない。遅くとも工程（ｂ）の前までにハイブリッドがそれを構成する鋳型ポリヌクレオチドＸの種類ごとに識別されている。識別においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの種類ごとに、基板上の位置情報が明らかであることと、当該位置情報に、鋳型ポリヌクレオチドＸを識別することができるインデックスが関連付けられていることとが必要となる。
【０１４０】
［８−１．鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様の例］
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様としては以下が挙げられる。以下のいずれの態様においても、鋳型ポリヌクレオチドＸが直接的又は間接的にシグナルプローブを有する。すなわち、シグナルプローブは、鋳型ポリヌクレオチドＸに直接的に結合するか、又は、鋳型ポリヌクレオチドＸにライゲート又はハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに直接的に（すなわち鋳型ポリヌクレオチドＸに間接的に）結合しうる。シグナルプローブは、シグナル物質標識を有する。シグナル物質については、前述のとおりである。シグナルプローブは、例えば既に述べた、図２（Ｂ）（iv）に例示されるシグナル物質標識部分又はシグナル物質標識及び固定化用タグからなる部分と同一である場合がある。
【０１４１】
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様の一例においては、異なる種類の鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれに応じて異なるシグナルプローブを付すことができる。位置情報の取得の際には、シグナルプローブをインデックスとして用いることができる。
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様の他の一例においては、鋳型ポリヌクレオチドＸの一部の塩基配列情報を解読（但し上記工程（ｄ）で行われる解読とは異なる工程で行われる）により取得することができる。位置情報の取得の際には、この解読された塩基配列情報をインデックスとし用いることができる。この場合における個々のハイブリッドの態様を、インデックス配列取得工程、工程（ｂ）及び工程（ｄ）を抜粋して図１０に模式的に示す。
鋳型ポリヌクレオチドＸの識別態様のさらなる他の一例においては、固定化及び上記工程（ａ）〜（ｄ）を含む一連の工程の順番を鋳型ポリヌクレオチドＸの種類ごとに行うことができる。位置情報の取得の際には、その順番をインデックスとして用いることができる。
【０１４２】
［８−２．固定位置の決定］
［８−２−１．固定位置が無作為に決定される場合］
固定位置は、基板上における無作為に決定される位置でありうる（図１１及び図１２に例示される）。すなわち、固定化対象は基板上の任意の位置にランダムに固定されうる。固定後の対象はインデックスを有するものであり、そのインデックスに基づいて位置情報が記録される。
【０１４３】
［８−２−１−１．固定位置の態様］
この場合、固定化にかかる操作において、固定化対象はその種類によって固定化位置が識別可能となるようには制御されない。すなわち、アレイ技術を用いた固定化によって実現されるような整然さは伴わない。従って、複数種の固定化対象が基板上に固定化されると、各種対象は互いに混合した状態で分布する。混合の度合いは供給態様によって異なる場合もあり、特に限定されない。例えば、基板上の複数の対象が固定化されている領域全体において、各種固定化対象の混合割合がほぼ同じとなる分布である場合（図１２に例示される）や、基板上の場所によって各種固定化対象の混合割合において不連続な変化が生じるような分布である場合がある。前者の場合は、複数の固定化対象の全てを含む溶液を供給することや、固定化対象を複数回に分けて且つ基板上の同じ位置に重ねて供給することによって生じうる。後者の場合は、固定化対象を複数回に分けて供給することによって生じうる。
【０１４４】
［８−２−１−２．固定化対象の供給］
固定化対象に含まれるシグナルプローブ又は塩基配列情報をインデックスとする場合、固定化対象の基板上への供給は、識別すべき複数種の固定化対象のうち少なくとも二種を含む溶液を供給することによって行われてよい。この場合、識別すべき複数種の固定化対象を一時に供給してもよいし、複数回に分けて供給してもよい。無論、識別すべき固定化対象を一種類ずつ供給することも許容される。いずれの場合も、シグナルの取得を行うまでに全ての固定化対象が供給され固定化される。
【０１４５】
固定化の順番をインデックスとする場合、固定化対象の基板上への供給は、識別すべき固定化対象が一種類ずつステップワイズに供給されうる。固定化対象の一種類について供給及び固定化され、位置情報が取得された後に、固定化対象の他の一種類について供給及び固定化され、位置情報が取得される、という操作が繰り返される。
また、本発明において、固定化対象に含まれるシグナルプローブ又は塩基配列情報と固定化の順番との両方をインデックスとする場合、固定化対象の基板上への供給は、複数種の固定化対象が複数回にわたって供給されうる。
【０１４６】
固定化対象が基板上に固定化された後においては、洗浄などによって、未固定の固定化対象を除去する処理が行われていることが好ましい。この処理は当業者によって適宜行われる。
【０１４７】
［８−２−２．固定位置が作為的に決定される場合］
また、固定位置は、作為的に決定される位置でもありうる。例えば、固定化の対象を一種類ごとに基板上の異なる位置に供給する場合が挙げられる。この場合、供給手段（マイクピペットなど）は、固定化の対象の種類ごとに変え、基板上の供給位置も隔離することによって、種類の異なる固定化対象が混ざり合わないようにする。好ましくは、複数の親水性部分が疎水性部分によって隔てられるように設けられた基板を用い、固定化の対象をその種類ごとに親水性部分のそれぞれに供給することができる（図１３）。このようにすることによって、基板上における複数種の固定化の対象の集積度を上げることができる。
【０１４８】
［８−３．位置情報の取得］
検出されたシグナルは、固定化対象の基板上における位置情報に変換される。位置情報は、どのような形式で表されるものであってもよいが、検出されたシグナルの位置を、基板上の座標として特定することによって表されるものであることが好ましい。具体的には、基板上に座標系（好ましくは直交座標系）を定め、検出された一のシグナルに対して一義的に定まる二の実数の組によって、シグナルの位置（すなわち固定化対象の位置）を特定することができる（図１１（ａ）及び図１２に例示される）。
【０１４９】
固定化対象に含まれる塩基配列情報をインデックスとする場合、基板上に固定化された識別すべき対象の全てについて、一工程で位置情報を取得することができる。
固定化の順番をインデックスとする場合、識別すべき固定化対象が基板上に固定化される都度、位置情報の取得を行う。具体的には、基板上に固定化された識別すべき対象について位置情報を取得し、その後新たに基板上に固定化された別の識別すべき対象について位置情報を取得する。このとき、例えば、既に取得された対象の位置座標と、新たに取得された対象の位置座標との間で差分をとり、新たなシグナルが検出された座標を、当該別の対象の位置情報として取得することができる。
【０１５０】
このような位置情報を取得する手段は、固定化された対象を識別するための装置（以下、識別装置と記載する）に一手段として備えられることができ、自動化することができる。位置情報読み取り手段としては特に限定されることなく、デジタイザやプラニメータなど、当業者によって適宜選択される。
【０１５１】
取得された位置情報は、上記の識別装置に備えられうる記憶手段に記憶されてもよいし、上記の識別装置から外部の装置に出力されることによって、外部の装置における記憶手段に記憶されてもよい。
【０１５２】
［８−４．インデックス］
インデックスは、複数種の鋳型ポリヌクレオチドＸを種類ごとに特定することによって、その識別を可能にする。本発明において、鋳型ポリヌクレオチドＸの種類の識別のために用いられるインデックスには、上述のように、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれるシグナルプローブ又は塩基配列情報と、固定化順番とが挙げられる。いずれか一つのインデックスのみを用いてもよいし、それぞれのインデックスを組み合わせて用いることもできる。
【０１５３】
［８−４−１．インデックスとしてシグナルプローブを利用する場合］
識別すべき複数の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するためのインデックスの一つとして、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれるシグナルプローブを利用する場合、固定化後におけるそのシグナルプローブに由来するシグナルを位置情報と共に取得すればよい。
【０１５４】
［８−４−２．インデックスとして塩基配列情報を利用する場合］
識別すべき複数の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するためのインデックスの一つとして、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる塩基配列情報を利用する場合、識別すべき対象の全てを基板に固定化し、位置情報を取得した（図１１（ａ）に例示される）後、このような塩基配列情報の取得を行う（図１１（ｂ）に例示される）ことができる。
【０１５５】
インデックスとして利用される塩基配列情報は、複数種の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するための固有配列情報を与えることができるものであれば特に限定されない。
また、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる塩基配列の長さとしては特に限定されないが、複数種の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別することができる固有の配列を与える十分な長さであって、識別の効率性や簡便性に支障を与えない程度の長さであることが好ましい。このような長さは、当業者であれば容易に決定することができる。
【０１５６】
インデックスとしての塩基配列の、鋳型ポリヌクレオチドＸ中の位置としては、例えばプライマーｐの３’末端に隣接する位置でありうる。すなわちこの場合、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、プライマーｐの３’末端から伸長する相補鎖を合成し、その相補鎖の配列を解読することによってインデックスを取得することができる。引き続く工程（ｂ）で合成する可逆的ターミネータ含有伸長鎖ｅ（Ｔ）は、インデックス配列の３’末端に隣接する位置から伸長させることができる。インデックス配列の解読方法は、例えば上記工程（ｄ）と同様に行うことができる。
【０１５７】
上記のような配列を取得する手段は、固定化された対象を識別するための装置に一手段として備えられることができ、自動化することもできる。そのような手段には、蛍光物質標識されたヌクレオチドを供給する手段、及び前記蛍光物質に由来する蛍光を観察する全反射蛍光顕微鏡システムが含まれうる。
また、上記の識別装置は、観察された蛍光を塩基配列情報に変換する手段をさらに含んでもよい。このような手段はソフトウェアによって実現されうる。
【０１５８】
取得された配列情報は、上記の識別装置に備えられうる記憶手段に記憶されてもよいし、識別装置から外部の装置に出力されることによって、外部の装置における記憶手段に記憶されてもよい。
【０１５９】
［８−４−３．インデックスとして固定化の順番を利用する場合］
識別すべき複数の鋳型ポリヌクレオチドＸを識別するためのインデックスの一つとして、固定化対象が基板上に固定化された順番を利用する場合、固定化対象が基板上に固定化される都度、位置情報の取得を行う。すなわち、工程順番の違いが固定化対象の種類の違いを反映する。
【０１６０】
まず、基板及びその表面上に無作為に決定される位置で固定化され且つシグナル物質標識（上述のシグナル物質を使用することができる）を有する固定化対象を用意する。固定化後、当該対象の標識に由来するシグナルが検出され、位置情報が取得される（図１１（ａ）に例示される）。次に、同一の基板表面上において、無作為に決定される位置で固定化され且つシグナル物質標識を有する他の固定化対象を用意する。固定化後、当該他の対象の標識由来するシグナルが検出され、位置情報が取得される（図１２に例示される）。同様の工程が、さらに繰り返して行われることもできる。
【０１６１】
なお、図１２の例においては、後に固定化した核酸検体が有するシグナル標識は、先に固定化した対象が有するシグナル標識と異なるように示されているが、同じシグナル標識を用いることもできる。いずれの場合であっても、位置情報取得においては、既に取得された先の対象の位置座標と、新たに取得された後の対象の位置座標との間で差分をとり、新たなシグナルが検出された座標を、当該後の対象の位置情報として取得することができる。
【０１６２】
上記の識別装置においては、固定化対象を供給する手段と、シグナルを検出する手段と、固定位置情報を取得する手段を含む一連の手段をこの順で複数回機能させるための制御手段が備えられうる。このような手段は、ソフトウェアによって実現されうる。
【０１６３】
［８−５．位置情報とインデックスとの関連付け］
インデックスとして、鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる配列を利用する場合、取得された位置情報と配列情報とを上記の識別装置又は外部装置の記憶手段から呼び出し、位置情報と、当該位置において取得された配列情報とを関連付けることによって、各種対象を識別することができる。
例えば図１１（ａ）に示すように、固定化及びシグナル検出された検体に、符号Ａ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎを付し、それぞれについて位置座標を取得し、図１１（ｂ）に示すように、それぞれの鋳型ポリヌクレオチドＸに含まれる配列の相補鎖合成を行って、配列情報を取得する。取得した配列をインデックスとして、それぞれの対象に関連付ける（図示せず）。それぞれの対象が固有の位置情報を有し、それぞれに鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を表すインデックスが関連付けられているため、位置情報から鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を特定することができる。
【０１６４】
インデックスとして、固定化順番を利用する場合、位置情報を取得するごとに、取得された位置情報を上記の識別装置又は外部装置の記憶手段から呼び出し、当該位置情報を取得した固定化順番と関連付けることによって、各種鋳型ポリヌクレオチドＸを識別することができる。
例えば図１１（ａ）に示すように、工程Ａにおいて固定化及びシグナル検出された対象に、工程順番を表すインデックスＡを付した符号Ａ１、Ａ２、Ａ３・・・Ａｎを付し、それぞれについて位置座標を取得し、図１２に示すように、工程Ｂにおいて、新たに固定化及びシグナル検出された別種類の対象に、工程順番を表すインデックスＢを付した符号Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３・・・Ｂｍを付し、それぞれについて位置情報を取得する。それぞれの対象が固有の位置情報を有し、それぞれに鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を表すインデックスが関連付けられているため、位置情報から鋳型ポリヌクレオチドＸの種類を特定することができる。
【０１６５】
上記の識別装置においては、このように位置情報とインデックス情報とを関連付ける手段が備えられていてよい。当該手段は、ソフトウェアによって実現されうる。
【実施例】
【０１６６】
［実施例１：１６ｋｍｅｒのポリヌクレオチドの再構成］
本実施例では、リード長１６ｍｅｒから１６ｋｍｅｒ（32bit PCにおける限界長）のポリヌクレオチド再構成についてphrap（断片配列の重ね合わせから配列を再構成するプログラム）を用いたシミュレーションを行った。本発明の方法における工程（ｄ）の解読をＳＢＳ（sequence by synthesis）によって行う場合、本発明の方法を「ＣＴ型ＳＢＳ法」による方法と記載する。本実施例においては、ポリヌクレオチド再構成能について、従来の方法である「通常のＳＢＳ法」による方法と比較した。
【０１６７】
本実施例におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を図１４に示す。図１４において、本発明のCT型SBS法は、ゲノム（Genome）のモデルである16kmerのポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＺに相当）から断片化により200merの断片（Fragment、ポリヌクレオチドＺの断片である鋳型ポリヌクレオチドＸに相当）を調製し、200merの断片においてリード長16mer（相補鎖ｘ（Ｌ）に相当）を得る。リード長16merから中間長の200merのcontig（鋳型ポリヌクレオチドＸ配列）を作り、200merから16kmer（ポリヌクレオチドＺ配列）を再構成する。
一方、従来の通常のSBS法はゲノム（Genome）のモデルである16kmerのポリヌクレオチドから断片化により16merの断片（Fragment）を調製し、16merの断片においてリード長16merを得る。リード長16merからは下記のとおり16kmerの再構成はできない。
【０１６８】
ターゲットDNAの断片化により調製したFragmentの長さとアセンブラ(phrap)で生成されるcontig長さとの関係を図１５に示す。図１５における「16mer」及び「30mer」で示されたポイントに着目すると、以下のことが示されている。
1) 16merのfragment長からは200〜300merのcontigが再構成可能である。
2) 30merのfragment長からは16kmerのcontigが再構成可能である。
3) fragment長が30merを超えると、再構成できるcontig長は16kmer程度でプラトーになる。
さらに、Fragment長に対するcontig長の変化を示す図を図１６に示す。
【０１６９】
以上の計算結果から以下のことが言える。
I) 16kmerのcontig長を再構成可能なFragment長は30mer以上である。
II) Fragment長30mer未満の場合、ターゲットとするcontig長が長くなれば再構成に必要なFragment長も長くなる。
【０１７０】
すなわち、本発明のＣＴ型ＳＢＳ法においては、上記1)よりリード長16merから中間長の200merのcontig（鋳型ポリヌクレオチドＸ配列）の再構成が可能である。さらに、上記（I）より、200merから16kmer（ポリヌクレオチドＺ配列）の再構成も可能である。従って、リード長16merから最終的に16kmerの再構成が可能であることが証明された。
一方、従来の通常のＳＢＳ法においては、上記1)よりリード長16merから16kmerの再構成は不可能であることが証明された。
【０１７１】
［実施例２：３Ｇｍｅｒのポリヌクレオチドの再構成］
本実施例では、２５０〜３００ｍｅｒ程度から３Ｇｍｅｒのポリヌクレオチド再構成についてphrap（断片配列の重ね合わせから配列を再構成するプログラム）を用いたシミュレーションを行った。本発明の「ＣＴ型ＳＢＳ法」による方法のポリヌクレオチド再構成能について、従来の方法である「通常のＳＢＳ法」による方法と比較した。
【０１７２】
本実施例におけるシミュレーションにおいて想定した態様の概要を図１７に示す。図１７において、本発明のCT型SBS法は、3Gmerのゲノム（Genome、ポリヌクレオチドＺに相当）から断片化により2kmerの断片（Fragment、ポリヌクレオチドＺの断片である鋳型ポリヌクレオチドＸに相当）を調製し、2kmerの断片においてリード長75mer（相補鎖ｘ（Ｌ）に相当）を得る。リード長75merから中間長の2kmerのcontig（鋳型ポリヌクレオチドＸ配列）を作り、2kmerから3Gmer（ポリヌクレオチドＺ配列）を再構成する。
一方、従来の通常のSBS法は3Gmerのゲノム（Genome）から断片化により75merの断片（Fragment）を調製し、75merの断片においてリード長75merを得る。リード長75merからは下記のとおり3Gkmerの再構成はできない。
【０１７３】
実施例１の図１６のデータをもとに、contig長（target DNA長）と、そのcontig長に到達するための最低限必要とされるFragment長との関係を図１８に示す。図１８で示された関係から、contig長3Gmerを再構成できるFragment長を外挿した。外挿結果を図１９に示す。図１９に示すように、282merのFragment長があれば3Gのcontig(target DNA)を再構成することができることが示された。
【０１７４】
一方、従来の通常のＳＢＳ法においては、75merから3Gmerの再構成をすることは不可能である。このことは、Genome Research 2010 20: 265-272に実証されている。この論文においては、それまでの既存のアセンブラの欠点（例えば、リード長が短いと（Short readsである場合）ＰＣのメモリを大量に用いる必要があり実用性がない、short reads専用でもヒトゲノム（3x109）の大きさに対応できない、又はアセンブルしても断片化されてしまう）に鑑み、アセンブラillumina GAを用い新たなアルゴリズムによってde novo再構成をしたことが記載されている。アジア人とアフリカ人のゲノムを対象に、35〜75bpのreadを用いて再構成を行ったところ、N50の contig size はアジア人で7.4kb、アフリカ人 5.9 kbであり、Genome coverageも全ゲノムの85〜87％であったことが記載されている。（なお、paired-endを使っており、scaffold は 446.3kb及び61.9 kbと長くなっている。）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ポリヌクレオチドシーケンス法；
（ａ）準備工程であって、
ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸにプライマーｐ’が結合したプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘに、プライマーｐがハイブリダイズしたハイブリッドを複数個用意する工程と、
（ｂ）チェーンターミネーション工程であって、
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとを含むチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を用いて、前記ハイブリダイズしたプライマーｐの３’末端側から前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の相補結合により前記複数分子間での異なる位置で合成が停止することによって、長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）を得る工程、
（ｃ）ターミネーションのリバース工程であって、
前記長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータを開裂させることによって、長さの異なる複数種の相補鎖ｅを得る工程、
（ｄ）一分子単位での解読工程であって、
シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）である解読用相補鎖合成基質を用いて、前記複数分子間での異なる位置からそれぞれ前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を、前記複数種のうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列とが重複するように得ると共に、
前記シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）が結合した順に、前記ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）に由来するシグナルを、一分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ごとに個別に検出することによって、前記複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を前記鋳型ポリヌクレオチドＸの複数の部分配列として決定する工程。
【請求項２】
前記複数の部分配列から、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を再構成する工程（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法。
【請求項３】
前記再構成された前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列から、前記ポリヌクレオチドＺの配列を再構成する工程（ｆ）をさらに含む、請求項２に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項４】
前記チェーンターミネーション用相補鎖合成基質において、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記ヌクレオチドＮに対して、０．０１〜９９％となる量で混合されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項５】
前記鋳型ポリヌクレオチドＸの長さが１０００ｍｅｒ以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項６】
上記工程（ｄ）の前に、前記工程（ｃ）で得られた、前記相補鎖ｅが前記プライマーｐから伸長して生じた伸長プライマーｐ−ｅと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項７】
上記工程（ｃ）の前に、前記工程（ｂ）で得られた、前記可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が前記プライマーｐから伸長して生じた鎖ｐ−ｅ（Ｔ）と前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項８】
上記工程（ｂ）の前に、前記工程（ａ）で得られた、前記プライマーｐと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項９】
前記プライマーｐ鎖が固定化用タグを有するものであり、
前記基板がその表面にリンカーを有するものであり、
前記固定化用タグは、前記リンカーに対する結合能を有するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１０】
前記固定化用タグが、シグナル物質で標識されたものである、請求項９に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１１】
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、さらにシグナル物質で標識されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１２】
前記プライマーｐが、前記プライマーｐ’の５’末端塩基に対応する相補塩基を欠如したものであり、
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記欠如した相補塩基を有するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドＺが、１つの細胞から精製されたものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１４】
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、複数の細胞から精製された前記ポリヌクレオチドＺの断片として調製されたものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１５】
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記断片配列をベクターに挿入し、宿主細胞で増殖することによって調製されたものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１６】
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記ポリヌクレオチドＺの断片をＰＣＲによって調製したものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドＺの断片が、前記ポリヌクレオチドを超音波又は制限酵素で断片化することによって調製されたものである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１８】
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）が、前記基板上に固定化された前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸのそれぞれに含まれる塩基配列情報を取得することを含み、
前記工程（II）において、前記塩基配列情報を前記位置情報と関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【請求項１９】
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）において、（Ａ）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程と、その後、（Ｂ）前記基板表面上に、無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された他の鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものをさらに得て、前記他の鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程とを少なくとも行い、
前記工程（II）において、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む工程の順番と、それぞれの工程において取得された前記位置情報とを関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【請求項１】
以下の工程を含む、ポリヌクレオチドシーケンス法；
（ａ）準備工程であって、
ポリヌクレオチドＺの断片配列と同一又は実質的に同一の配列を有する鋳型ポリヌクレオチドＸにプライマーｐ’が結合したプライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘに、プライマーｐがハイブリダイズしたハイブリッドを複数個用意する工程と、
（ｂ）チェーンターミネーション工程であって、
可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）とヌクレオチドＮとを含むチェーンターミネーション用相補鎖合成基質を用いて、前記ハイブリダイズしたプライマーｐの３’末端側から前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）の相補結合により前記複数分子間での異なる位置で合成が停止することによって、長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）を得る工程、
（ｃ）ターミネーションのリバース工程であって、
前記長さの異なる複数種の可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）においてターミネータを開裂させることによって、長さの異なる複数種の相補鎖ｅを得る工程、
（ｄ）一分子単位での解読工程であって、
シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）である解読用相補鎖合成基質を用いて、前記複数分子間での異なる位置からそれぞれ前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖伸長を行い、複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を、前記複数種のうちの一つの相補鎖ｘ（Ｌ）の３’末端配列と他の一つの相補鎖（Ｌ）の５’末端配列とが重複するように得ると共に、
前記シグナル物質標識ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）が結合した順に、前記ヌクレオチドアナログＮ（Ｌ）に由来するシグナルを、一分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸの相補鎖ごとに個別に検出することによって、前記複数種の相補鎖ｘ（Ｌ）を前記鋳型ポリヌクレオチドＸの複数の部分配列として決定する工程。
【請求項２】
前記複数の部分配列から、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列を再構成する工程（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法。
【請求項３】
前記再構成された前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列から、前記ポリヌクレオチドＺの配列を再構成する工程（ｆ）をさらに含む、請求項２に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項４】
前記チェーンターミネーション用相補鎖合成基質において、前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記ヌクレオチドＮに対して、０．０１〜９９％となる量で混合されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項５】
前記鋳型ポリヌクレオチドＸの長さが１０００ｍｅｒ以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項６】
上記工程（ｄ）の前に、前記工程（ｃ）で得られた、前記相補鎖ｅが前記プライマーｐから伸長して生じた伸長プライマーｐ−ｅと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項７】
上記工程（ｃ）の前に、前記工程（ｂ）で得られた、前記可逆的ターミネータ含有相補鎖ｅ（Ｔ）が前記プライマーｐから伸長して生じた鎖ｐ−ｅ（Ｔ）と前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項８】
上記工程（ｂ）の前に、前記工程（ａ）で得られた、前記プライマーｐと前記プライマー結合鋳型ポリヌクレオチドｐ’−Ｘとのハイブリッドを基板上に配置する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項９】
前記プライマーｐ鎖が固定化用タグを有するものであり、
前記基板がその表面にリンカーを有するものであり、
前記固定化用タグは、前記リンカーに対する結合能を有するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１０】
前記固定化用タグが、シグナル物質で標識されたものである、請求項９に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１１】
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、さらにシグナル物質で標識されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１２】
前記プライマーｐが、前記プライマーｐ’の５’末端塩基に対応する相補塩基を欠如したものであり、
前記可逆的ターミネータヌクレオチドＮ（Ｔ）が、前記欠如した相補塩基を有するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドＺが、１つの細胞から精製されたものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１４】
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、複数の細胞から精製された前記ポリヌクレオチドＺの断片として調製されたものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１５】
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記断片配列をベクターに挿入し、宿主細胞で増殖することによって調製されたものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１６】
複数分子の前記鋳型ポリヌクレオチドＸが、前記ポリヌクレオチドＺの断片をＰＣＲによって調製したものである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドＺの断片が、前記ポリヌクレオチドを超音波又は制限酵素で断片化することによって調製されたものである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス法。
【請求項１８】
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）が、前記基板上に固定化された前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸのそれぞれに含まれる塩基配列情報を取得することを含み、
前記工程（II）において、前記塩基配列情報を前記位置情報と関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【請求項１９】
前記工程（ｂ）の前までに、同一基板上に、複数個の鋳型ポリヌクレオチドＸを含むハイブリッドが、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの配列がそれぞれ異なる複数種類用意され、
前記基板上の前記複数種類の異なるハイブリッドが以下の鋳型ポリヌクレオチドＸ識別方法により識別されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス方法；
（I）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、前記固定化された複数種類の前記鋳型ポリヌクレオチドＸそれぞれの前記基板上の固定位置情報を前記シグナルに基づいて取得する工程と、
（II）前記位置情報に基づいて前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する工程とを含み、
前記工程（I）において、（Ａ）基板、及び、その表面上に無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された前記鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものを用意し、前記鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程と、その後、（Ｂ）前記基板表面上に、無作為に決定される位置で直接的又は間接的に固定化された他の鋳型ポリヌクレオチドＸであってシグナルプローブを直接的又は間接的に有するものをさらに得て、前記他の鋳型ポリヌクレオチドＸの前記シグナルプローブに由来するシグナルを検出し、位置情報を取得する工程とを少なくとも行い、
前記工程（II）において、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む工程の順番と、それぞれの工程において取得された前記位置情報とを関連付けることによって、前記複数種類の鋳型ポリヌクレオチドＸを互いに識別する方法。
【図２】
【図４】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図４】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１８】
【図１９】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１２−１９１８７６（Ｐ２０１２−１９１８７６Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５７２９５（Ｐ２０１１−５７２９５）
【出願日】平成２３年３月１５日（２０１１．３．１５）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１５日（２０１１．３．１５）
【出願人】（０００００１９９３）株式会社島津製作所 (3,708)
【Ｆターム（参考）】
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