βアクチン遺伝子のためのプライマーセット、プローブ、アッセイキットおよび検出方法
【課題】βアクチン遺伝子のためのプライマーセット、核酸プローブ、それらを含むアッセイキットおよびそれらを用いた検出方法を提供する。
【解決手段】特定の配列、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含むＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーをそれぞれ含む、プライマーセット。並びに、上記プライマーセット、核酸プローブ、それらを含むアッセイキットおよびそれらを用いた検出方法。
【解決手段】特定の配列、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含むＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーをそれぞれ含む、プライマーセット。並びに、上記プライマーセット、核酸プローブ、それらを含むアッセイキットおよびそれらを用いた検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の側面は、βアクチン遺伝子のためのプライマーセット、プローブ、アッセイキットおよび検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
βアクチンは、真核細胞の形の維持や形の変化に関与し、細胞内の物質移動を担う細胞骨格の１種であるマイクロフィラメントを構成する主成分の１つである。βアクチンは、細胞に限らず、非筋肉細胞を含む広範な組織にしている。βアクチンは、筋細胞に含まれるαアクチンおよびγアクチンとは型が異なり、その一次構造が異なる。α、βおよびγアクチンは、それぞれ異なる遺伝子配列から発現される。
【０００３】
βアクチンは、ハウスキーピング遺伝子であり、組織や細胞種によって発現量に差がなく、細胞に一定量発現している。このことから、蛋白質解析や、遺伝子発現解析の内部標準としてしばしば用いられる。また、遺伝子検査の際の検体採取、核酸抽出および精製などの工程の正常性を確認するために、ポジティブコントロールとしても幅広く活用されている。例えば、ある遺伝子の発現パターンを調べる場合、電気泳動の各レーンにそれぞれ同じ量の細胞からの抽出物をアプライしていることを示すために使用される。その場合、βアクチン用プローブを用いてノーザン解析などが行われる。また、近年では、βアクチンは、非筋肉細胞の形状を組織化し維持する構造タンパク質としての役割だけではなく、シグナル伝達分子でもあることが示唆されている。
【０００４】
以上のように、βアクチンに特徴的な遺伝子配列（即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の存在を検出するための手段が様々な分野で求められている。現存の迅速検出法は、ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを作成、或いは検体からゲノムＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡ配列中の特徴的な配列をポリメラーゼチェインリアクション（即ち、ＰＣＲ）で増幅し、電気泳動法により検出するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
１側面において、βアクチン遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーセット、βアクチン遺伝子を特異的に検出するための核酸プローブ、並びにそれらを含むアッセイキット、およびそれらを用いた検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの態様は、βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記プライマーセットはＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
当該ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｆ３プライマーが、配列番号１および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該ＢＩＰプライマーが、配列番号４および配列番号２０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｂ３プライマーが配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセットである。
【０００７】
更なる態様は、上記のプライマーセットと、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から選択される少なくとも１とを含むβアクチン遺伝子を検出するためのアッセイキットである。
【０００８】
更なる態様は、βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅する方法であって、試料に含まれる核酸を上述のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することを特徴とする方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＬＡＭＰ法による増幅方法を説明するための模式図。
【図２】ＬＡＭＰ法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図３】増幅産物におけるターゲット配列の位置の例を示す模式図。
【図４】ＤＮＡチップの例を示す模式図。
【図５】ＤＮＡチップの例を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．プライマー
１態様に従うと、βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するための増幅用核酸プライマーセットが提供される。
【００１１】
ここにおける「増幅」は、ＬＡＭＰ法またはＲＴ−ＬＡＭＰ法であればよい。
【００１２】
「ＲＴ-ＬＡＭＰ法」は、等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法の１種である。ＲＴ-ＬＡＭＰ法は、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによりＲＮＡを鋳型として、ＬＡＭＰ増幅を可能にする。ここでは、単に「ＬＡＭＰ法」と記載した場合には、特に記載のない限り「ＬＡＭＰ法」と「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」の両方について言及すると解されてよい。
【００１３】
ＬＡＭＰ法は２種若しくは４領域または４種若しくは６領域のプライマーを用いる。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理により、微量なβアクチンをも検出することが可能となる。
【００１４】
ここで、ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。図１は、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示す。
【００１５】
まず、合計４種類のプライマー配列（即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々２つの領域（即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃ）を含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含む。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。ここでＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、前記２本鎖ＤＮＡのうちの１本鎖ＤＮＡの５’→３’方向にかけてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃおよびＦ３ｃ領域は、その相補鎖の１本鎖ＤＮＡの５’→３’方向にかけてこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ，Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１，Ｆ２ｃとＦ２，Ｆ３ｃとＦ３は相補鎖である。
【００１６】
これらの領域から構成される４種類のプライマー、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開２００２−１８６７８１号公報を参照されたい。また、この４種のプライマーのほかにループプライマーを併せて用いてもよい。なお、ＲＴ−ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーもＬＡＭＰ法において使用されるプライマーも、同じプライマーが使用できる。
【００１７】
本態様では、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する。このターゲット配列は、核酸プローブとのハイブリダイゼーションを利用して増幅産物を検出するために利用することが可能である。即ち、図３に示すように、本態様においては、核酸プローブにハイブリダイゼーションさせるべきターゲット配列（図３ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃの何れか）が、領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／または領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかに対応する位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されてよい。ここで、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれてよい。
【００１８】
このように設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なう。それにより、図３に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部が得られる。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置する。
【００１９】
一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成する。このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は、図３に示すような一本鎖の状態の部分が存在する。従って、変性操作を行なうことなく、各ターゲット配列に対して相補的な核酸プローブ（例えば、ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰおよびＢＰｃなど）との特異的ハイブリダイゼーションにより検出が可能となる。
【００２０】
特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single Nucleotide PolymorpHisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味する。
【００２１】
上述したとおり、本発明に従う好ましいプライマーセットの例において、当該ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域を元に設計される。
【００２２】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ１領域は、配列番号３８またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。また、当該Ｆ１領域は、配列番号３８またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号４２、配列番号４３およびその相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４３またはその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよい。または配列番号３８、配列番号４２、配列番号４３およびその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２３】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ２領域は、配列番号３９およびそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ２領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号４４およびその相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号３９および配列番号４４並びにそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２４】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ３領域は、配列番号１およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ３領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号２１およびその相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号１および配列番号２１またはその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２５】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ１領域は、配列番号４０およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ１領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。また、配列番号４０およびその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２６】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ２領域は、配列番号４１、配列番号４５およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ２ｃ領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。また、配列番号４０、４１およびその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２７】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ３領域は配列番号２およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ３領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号１８、配列番号２２およびその相補配列で示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
ここで、ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の３−ニトロピロール（Nitropyrrole）、５−ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl；dP)、デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−Ｄ−リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl；dK)が含まれる。
【００２９】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。
【００３０】
当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００３１】
上記のような領域を使用したプライマーを用いて、βアクチン遺伝子、或いはその遺伝子転写産物を含有する検体試料に対してＬＡＭＰ法による増幅を行うと、図２で説明したように、ステム・アンド・ループ構造が形成され、一本鎖のループ構造内に含まれるβアクチン遺伝子由来のターゲット配列が得られる。
【００３２】
本発明は、上記のようなプライマーセットをβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を含む試料に対して適用すれば、βアクチン遺伝子に対応する核酸が増幅される。得られる増幅産物の存在を検知することにより、βアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物の存在を検知することが可能である。従って、試料におけるβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物の検知は、検出対象である試料について、当該プライマーセットを用いて増幅反応を行えばよい。
【００３３】
増幅反応の条件は、それ自身公知の何れかの条件を利用すればよい。また、当該増幅反応を行った結果を基に当該試料はβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物が含まれていると判定すればよい。そのような判定により試料中のβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を検知することが可能である。
【００３４】
例えば、上記増幅反応は、１容器などの１反応場当たり、例えば、１チューブ当たり１プライマーセットで行ってもよく、或いは１チューブに各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数の生物種由来のβアクチン遺伝子および/または転写産物を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。
【００３５】
また、上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、以下に示すような組成のバッファー中で行ってよい。
【００３６】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣＬ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１６Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．６２５Ｕ ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ。
【００３７】
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー ５ｐｍｏＬ。
【００３８】
ここで「試料」とは、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシ、ネズミイルカなどの哺乳類、鳥類などの体液、組織、細胞、便など、細胞を含む何れかの物質であってもよい。また、当該試料は、そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。例えば、そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。
【００３９】
１態様に従うプライマーセットは、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーを具備する。そのようなプライマーセットの例は次の通りである。当該ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。当該Ｆ３プライマーが、配列番号１および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。当該ＢＩＰプライマーは、配列番号４および配列番号２０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。当該Ｂ３プライマーが配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。また、これらのプライマーのいずれか、または全ての配列について、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。
【００４０】
好ましいプライマーセットの例は、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号３を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１９を含むポリヌクレオチドであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号２１を含むポリヌクレオチドであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号２０を含むポリヌクレオチドであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号２を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセットであり、
このプライマーセットは、更に、ループプライマーとして、配列番号１３を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１４を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１５を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１６を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００４１】
プライマーセットにおいて使用されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの組み合わせの例は、以下の（ａ）〜（ｊ）よりなる群から少なくとも１選択された組み合わせであってよい。これらの組み合わせは、（ａ）〜（ｊ）に示される他のプライマーやそれ自身公知の何れのプライマーと同時に使用されてもよい。
【００４２】
（ａ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｂ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｃ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｄ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｅ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｆ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｇ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｈ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｉ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｊ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット
である。
【００４３】
上述のようなプライマーを用いてＬＡＰＭ増幅して得られた増幅産物の検出法は、これらに特に限定されるものではないが、例えば、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用することが可能である。核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより増幅産物を検出する場合、上述したように核酸プローブが結合するためのターゲット配列を所望の位置に設計すればよい。例えば、濁度の検出や電気泳動を利用するその他の手段により増幅産物を検出する場合には、ターゲット配列は設計しなくてもよい。
【００４４】
以上のようなプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的にβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を増幅することが可能である。これを利用して、試料に含まれる核酸を当該プライマーまたはプライマーセットを用いるＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、当該試料にβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を特異的に検出することが可能である。
【００４５】
従来では、迅速診断法として、特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（即ち、ＰＣＲ）で増幅し、電気泳動法により検知する方法などが用いられている。更に配列検出の際に特異性を増すためには、ＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検知している。ＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅し、誤った判定がなされる可能性がある。プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。このような問題も本態様により解決することが可能である。
【００４６】
また、ＰＣＲを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。このような点も本態様は解決することが可能である。
【００４７】
また、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖が核酸プローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検知感度が悪い。そのような方法において、また従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法も取られている。これらの場合、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価な価格となったり、操作が煩雑性になったりする。このような問題も本態様を用いることにより解決される。
【００４８】
２．核酸プローブ
本発明は更に、上述のプライマーにより増幅されたβアクチン遺伝子或いはその転写産物に由来する核酸を検出するための核酸プローブおよび核酸プローブセットを提供する。
【００４９】
本発明に従う核酸プローブの例は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から選択される少なくとも１であってよい。
【００５０】
例えば、当該核酸プローブは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブからなる群より選択される少なくとも１であってよい。
【００５１】
これらの核酸プローブは、当該核酸プローブ群の中の１つが選択されて使用されてもよい。或いは、２種以上の核酸プローブが組み合わされて選択されて使用されてもよく、それぞれの配列からなる全ての核酸プローブが一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れかの１以上の塩基がミックス塩基に設計されてもよい。ここで、「ミックス塩基」とは、ミックス塩基としたい所望の箇所の塩基を「アデニン」、「チミン」、「シトシン」および「グアニン」に設計した核酸プローブを２以上または全て混合して使用する核酸プローブセットをいう。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。
【００５２】
当該核酸プローブは、約１０〜約６０塩基長、約１２〜約４０塩基長などであってよい。
【００５３】
また、当該核酸プローブは、上述のプライマーを用いた増幅により得られた増幅産物を検出するためのプローブであってよい。そのような核酸プローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。
【００５４】
例えば、好ましい核酸プローブの例は、図３に示すようなステム・アンド・ループ構造のプライマー領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかの位置に対応するように選択されてよい。
【００５５】
何れの核酸プローブおよび核酸プローブセットも、上述した増幅産物を所望に応じて検出するために使用されてよい。当該核酸プローブは、固相基体表面に固定化されたものであってもよく、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものが用いられてよく、また他のマイクロアレイを構成する核酸プローブとして用いられてもよい。当該増幅産物を検出するための核酸プローブは、対象となる細胞種に応じた遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。
【００５６】
上述した核酸プローブは、何れも各表に示した配列の任意の位置の塩基が１つまたは数個置換または欠失、または塩基を挿入された配列からなってもよい。
【００５７】
また、核酸プローブの構造も特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これらのキメラ核酸でもよい。
【００５８】
当該増幅産物と当該核酸プローブとの反応は、上述の何れかの核酸プローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行ってよい。
【００５９】
ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時において核酸プローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことが見出されている（例えば、特開２００５−９５０４３を参照されたい）。そのような悪影響を受けないようにするために、本態様に従う核酸プローブは、従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計している。
【００６０】
本態様によるプローブを上述のプライマーまたはプライマーセットと一緒に使用することにより、簡便、安価、高速にβアクチンを検出および／または分類することが可能である。
【００６１】
３．ＤＮＡチップ
上述した核酸プローブが基体に固定化された核酸プローブ固定化基体も本願の１つの態様である。ここにおいて使用する「ＤＮＡチップ」の語は、「核酸プローブ固定化基体」または「核酸プローブ固定化基板」と交換可能に使用されてよい。
【００６２】
以下に、ＤＮＡチップの例を説明する。図４のＤＮＡチップは、非限定的な１例である微生物遺伝子型判定用核酸チップである。ＤＮＡチップ１は、基体２に固定化領域３を具備する。核酸プローブ４は該固定化領域３に固定化される。図４においては、１つの固定化領域３に１本の核酸プローブ４を固定した状態で模式的にＤＮＡチップをを示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、１つの固定化領域に対して複数の核酸プローブが固定化されてよい。
【００６３】
このようなＤＮＡチップ１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２に配置される固定化領域３の数およびその配置、並びに固定化される核酸プローブの種類、種類数および核酸プローブの数などは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６４】
図５のＤＮＡチップは、非限定的な１例である核酸固定化チップの例である。図５のＤＮＡチップ１１は、基体１２に電極１３を具備する。核酸プローブ１４は電極１３に固定化される。電極１３は、パット１５に接続される。電極１３からの電気的情報はパット１５を介して取得される。このようなＤＮＡチップ１１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１２に配置される電極１３の数およびその配置、並びに固定化される核酸プローブの種類、種類数および核酸プローブの数などは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。更に、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極および対極を具備してもよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６５】
本態様で用いる核酸プローブを固定化するための表面は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いることができる。
【００６６】
本発明で使用する基体の材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【００６７】
例えば、電気的な性質を利用する場合、電極を基体に配置することが好ましい。電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体およびそれらの合金、或いはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物であってよい。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、ＣＣＤ、ＦＥＴ、ＣＭＯＳなど各種半導体デバイスを用いてもよい。
【００６８】
抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、（社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を鋳型にＬＡＭＰ増幅を行った後、遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出および増幅した核酸成分を添加の上、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供与する。反応中は、撹拌、或いは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後の洗浄には、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６９】
抽出および増幅したサンプル核酸は、あらかじめＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、或いは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を可能にしてもよい。
【００７０】
電気化学的に活性な核酸結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基体を洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する核酸結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行ってよい。ここで用いられる核酸結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。核酸結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用する。この際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。電極を核酸結合物質と反応させた後、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、３電極タイプ、即ち、参照電極、対極および作用極、或いは２電極タイプ、即ち、対極、作用極で行ってよい。測定では、核酸結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、核酸結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、或いはパルスで印加するか、或いは、定電位を印加することができる。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、核酸結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。
【００７１】
このようなＤＮＡチップを上述のプライマーまたはプライマーセットと一緒に使用することにより、βアクチンを簡便、安価、高速にβアクチンを検出および／または分類することが可能である。
【００７２】
４．アッセイキット
もう１つの態様に従うと、βアクチン遺伝子配列の検出および／または分類するためのアッセイキットが提供される。そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットと核酸プローブまたは核酸プローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよび核酸プローブまたは核酸プローブセットに加えて、ＬＡＭＰ増幅に必要な緩衝液を含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要な緩衝液、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。
【００７３】
［例］
例１ プライマーＤＮＡの選択
マウス、ラットまたはヒト由来の細胞などに感染した微生物やウイルスを検出する場合、細胞など検体からの核酸抽出や増幅および検出に問題がないかどうかをモニターできることが望ましい。その場合、マウス、ラットおよびヒトのβアクチン遺伝子をポジティブコントロールとすることが可能である。βアクチン遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれるものの１つで、種を超えて配列の保存性が高いことで知られている。従って、これら３種を共通のプライマーで増幅できることが期待される。ＮＣＢＩよりマウス、ラットおよびヒトのβアクチン配列を取得し、マウスの配列に基づいてＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトを用いてプライマーを検索した。表１に示すプライマーおよびマウスゲノムＤＮＡを用いて、基本組成および反応条件での増幅テストを行った。
【表１】
【００７４】
＜方法＞
（１）合成ＤＮＡ
ＬＡＭＰプライマーは、インビトロジェン（株）（現社名 ライフテクノロジーズジャパン）にカートリッジ精製品の合成を依頼した。ＤＮＡチップ用の核酸プローブは３’端にチオールを導入したＨＰＬＣ精製品を同社に合成依頼した。
【００７５】
（２）鋳型ＤＮＡ
鋳型は、Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入したマウス、ラットおよびヒトのゲノムＤＮＡを使用した。
【００７６】
（３）ＬＡＭＰ増幅
ＬＡＭＰ増幅は、以下に記載のＬＡＭＰキット推奨の組成を基本の条件とした（以下これを１×と表記する）。鋳型ＤＮＡ量は、マウス、ラットまたはヒトのゲノムＤＮＡを１反応あたり、２０〜５０ｎｇ添加した。また、増幅効率を高めるためにプライマーセットのスクリーニング工程を除き、添加前の鋳型に９５℃５分の熱変性処理を行った。
【表２】
【００７７】
【表３】
【００７８】
ＬＡＭＰ増幅の有無は、濁度計Ｒｅａｌｏｏｐ−３０（モリテックス社製）またはＬＡ−２００（テラメックス社製）を用いて、６１℃の条件で測定した。濁度計は、ＬＡＭＰ反応で生成するピロリン酸マグネシウムの濁度をリアルタイムに計測するもので、濁度の立ち上がり時間が反応速度の指標となる。反応には専用のＬｏｏｐａｍｐ反応チューブ（栄研化学社製）を用いた。その結果を表４に示す。
【表４】
【００７９】
＜結果＞
（１）プライマーの選択
表４に示す結果に基づいて良好なプライマーセットを１種得た。更に、プライマーセットに対して、ループプライマーを設計して、その効果を検討した。結果を表５に示す。
【表５】
【００８０】
ＦおよびＢいずれのループプライマーが適当かは、ＤＮＡチップの検出結果とあわせて判断することとした。また、マウス、ラットおよびヒトに対する特異的配列である点を加味して、ループプライマーの追加による効果を検討した。その結果を表６に示す。
【表６】
【００８１】
その結果、濁度の立ち上りは、鋳型がマウスおよびラットでは２０〜２２分であった。ラット配列の追加により増幅は影響を受けなかった。ヒト配列の追加した場合、濁度立ち上がりは、マウス３６分、ラット３８分、ヒト５５分であった。ヒト配列の増加は、増幅を遅らせる傾向があった。更に、マウスとラット２種対応プライマーでヒト鋳型を増幅した場合、濁度立ち上がりは２５分であった。
【００８２】
最終的に、プライマーセットＡｃ−１−２−１をプライマーセットととして選択した。ヒト対応のプライマーセットＡｃ−ＢＩＰ−Ｈの場合、強いヘアピン構造が存在するために、増幅が阻害されることが示唆された。
【００８３】
例２ 核酸プローブの選択
例１にて選択されたプライマーセットの増幅で得られる２つのループに対して、マウス、ラットおよびヒトのβアクチン配列に基づいて核酸プローブを設計した。候補プローブを同一基板上に載せたチップを作製して、ＧｅｎｅｌｙｚｅｒＴＭにて測定を行った。
【００８４】
＜方法＞
ＤＮＡチップおよび電気化学測定
使用するＤＮＡチップと自動電気化学測定装置は公知の文献に記載に従って用意した（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 265-270, May 2008）。ＤＮＡチップは、３μＭのチオール修飾核酸プローブを含む溶液を図５に模式的に示すようなＤＮＡチップ上の電極にスポットして作製した。
【００８５】
ＧｅｎｅｌｙｚｅｒＴＭは、挿入剤として３０μＭヘキスト３３２５８溶液（２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含む）、洗浄液として０．２×ＳＳＣ（３ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび３０ｍＭのＮａＣｌを含む）を調製してＧｅｎｅｌｙｚｅｒＴＭにセットし、ＤＮＡチップの電気化学測定を行った。
【００８６】
＜結果＞
各核酸プローブの配列および得られた電流値増加を表７に示した。
【表７】
【００８７】
反応には、Ｆループ、Ｂループのそれぞれにループプライマーを配置したＬＡＭＰ産物を用いたが、Ｆループプライマー産物の方が、Ｂループプライマー産物より高い電流値を示した。したがって、最も高い電流値が得られたＢループプライマーである４３−（ＡＣ）−２９−３０−ｓＢを選択した。更に、本配列に対応するヒト配列（３塩基の相違あり）４３−（ＡＣ−Ｈ）−２９−３０−ｓＢもチップに搭載する核酸プローブとし、ヒト鋳型増幅産物で確認したところ、約３５ｎＡの電流値増加が得られ、良好であった。
【００８８】
以下に、上述の配列を纏めて記載する。
【表８−１】
【００８９】
【表８−２】
【符号の説明】
【００９０】
１・・ＤＮＡチップ、２・・基体、３・・固定化領域、４・・核酸プローブ、１１・・ＤＮＡチップ、１２・・基体、１３・・電極、１４・・核酸プローブ、１５・・パット
【技術分野】
【０００１】
本発明の側面は、βアクチン遺伝子のためのプライマーセット、プローブ、アッセイキットおよび検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
βアクチンは、真核細胞の形の維持や形の変化に関与し、細胞内の物質移動を担う細胞骨格の１種であるマイクロフィラメントを構成する主成分の１つである。βアクチンは、細胞に限らず、非筋肉細胞を含む広範な組織にしている。βアクチンは、筋細胞に含まれるαアクチンおよびγアクチンとは型が異なり、その一次構造が異なる。α、βおよびγアクチンは、それぞれ異なる遺伝子配列から発現される。
【０００３】
βアクチンは、ハウスキーピング遺伝子であり、組織や細胞種によって発現量に差がなく、細胞に一定量発現している。このことから、蛋白質解析や、遺伝子発現解析の内部標準としてしばしば用いられる。また、遺伝子検査の際の検体採取、核酸抽出および精製などの工程の正常性を確認するために、ポジティブコントロールとしても幅広く活用されている。例えば、ある遺伝子の発現パターンを調べる場合、電気泳動の各レーンにそれぞれ同じ量の細胞からの抽出物をアプライしていることを示すために使用される。その場合、βアクチン用プローブを用いてノーザン解析などが行われる。また、近年では、βアクチンは、非筋肉細胞の形状を組織化し維持する構造タンパク質としての役割だけではなく、シグナル伝達分子でもあることが示唆されている。
【０００４】
以上のように、βアクチンに特徴的な遺伝子配列（即ち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の存在を検出するための手段が様々な分野で求められている。現存の迅速検出法は、ＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを作成、或いは検体からゲノムＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡ配列中の特徴的な配列をポリメラーゼチェインリアクション（即ち、ＰＣＲ）で増幅し、電気泳動法により検出するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
１側面において、βアクチン遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーセット、βアクチン遺伝子を特異的に検出するための核酸プローブ、並びにそれらを含むアッセイキット、およびそれらを用いた検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１つの態様は、βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記プライマーセットはＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
当該ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｆ３プライマーが、配列番号１および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該ＢＩＰプライマーが、配列番号４および配列番号２０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｂ３プライマーが配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセットである。
【０００７】
更なる態様は、上記のプライマーセットと、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から選択される少なくとも１とを含むβアクチン遺伝子を検出するためのアッセイキットである。
【０００８】
更なる態様は、βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅する方法であって、試料に含まれる核酸を上述のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することを特徴とする方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＬＡＭＰ法による増幅方法を説明するための模式図。
【図２】ＬＡＭＰ法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図３】増幅産物におけるターゲット配列の位置の例を示す模式図。
【図４】ＤＮＡチップの例を示す模式図。
【図５】ＤＮＡチップの例を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．プライマー
１態様に従うと、βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するための増幅用核酸プライマーセットが提供される。
【００１１】
ここにおける「増幅」は、ＬＡＭＰ法またはＲＴ−ＬＡＭＰ法であればよい。
【００１２】
「ＲＴ-ＬＡＭＰ法」は、等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法の１種である。ＲＴ-ＬＡＭＰ法は、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによりＲＮＡを鋳型として、ＬＡＭＰ増幅を可能にする。ここでは、単に「ＬＡＭＰ法」と記載した場合には、特に記載のない限り「ＬＡＭＰ法」と「ＲＴ−ＬＡＭＰ法」の両方について言及すると解されてよい。
【００１３】
ＬＡＭＰ法は２種若しくは４領域または４種若しくは６領域のプライマーを用いる。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理により、微量なβアクチンをも検出することが可能となる。
【００１４】
ここで、ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。図１は、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示す。
【００１５】
まず、合計４種類のプライマー配列（即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々２つの領域（即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃ）を含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含む。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。ここでＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、前記２本鎖ＤＮＡのうちの１本鎖ＤＮＡの５’→３’方向にかけてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃおよびＦ３ｃ領域は、その相補鎖の１本鎖ＤＮＡの５’→３’方向にかけてこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ，Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１，Ｆ２ｃとＦ２，Ｆ３ｃとＦ３は相補鎖である。
【００１６】
これらの領域から構成される４種類のプライマー、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開２００２−１８６７８１号公報を参照されたい。また、この４種のプライマーのほかにループプライマーを併せて用いてもよい。なお、ＲＴ−ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーもＬＡＭＰ法において使用されるプライマーも、同じプライマーが使用できる。
【００１７】
本態様では、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する。このターゲット配列は、核酸プローブとのハイブリダイゼーションを利用して増幅産物を検出するために利用することが可能である。即ち、図３に示すように、本態様においては、核酸プローブにハイブリダイゼーションさせるべきターゲット配列（図３ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃの何れか）が、領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／または領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかに対応する位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されてよい。ここで、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれてよい。
【００１８】
このように設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なう。それにより、図３に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部が得られる。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置する。
【００１９】
一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成する。このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は、図３に示すような一本鎖の状態の部分が存在する。従って、変性操作を行なうことなく、各ターゲット配列に対して相補的な核酸プローブ（例えば、ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰおよびＢＰｃなど）との特異的ハイブリダイゼーションにより検出が可能となる。
【００２０】
特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single Nucleotide PolymorpHisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味する。
【００２１】
上述したとおり、本発明に従う好ましいプライマーセットの例において、当該ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域を元に設計される。
【００２２】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ１領域は、配列番号３８またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。また、当該Ｆ１領域は、配列番号３８またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号４２、配列番号４３およびその相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４３またはその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよい。または配列番号３８、配列番号４２、配列番号４３およびその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２３】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ２領域は、配列番号３９およびそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ２領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号４４およびその相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号３９および配列番号４４並びにそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２４】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ３領域は、配列番号１およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ３領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号２１およびその相補配列でそれぞれ示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号１および配列番号２１またはその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２５】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ１領域は、配列番号４０およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ１領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。また、配列番号４０およびその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２６】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ２領域は、配列番号４１、配列番号４５およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ２ｃ領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。また、配列番号４０、４１およびその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２７】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ３領域は配列番号２およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ３領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号１８、配列番号２２およびその相補配列で示されるポリヌクレオチドである。また、配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２８】
ここで、ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の３−ニトロピロール（Nitropyrrole）、５−ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl；dP)、デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−Ｄ−リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl；dK)が含まれる。
【００２９】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。
【００３０】
当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００３１】
上記のような領域を使用したプライマーを用いて、βアクチン遺伝子、或いはその遺伝子転写産物を含有する検体試料に対してＬＡＭＰ法による増幅を行うと、図２で説明したように、ステム・アンド・ループ構造が形成され、一本鎖のループ構造内に含まれるβアクチン遺伝子由来のターゲット配列が得られる。
【００３２】
本発明は、上記のようなプライマーセットをβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を含む試料に対して適用すれば、βアクチン遺伝子に対応する核酸が増幅される。得られる増幅産物の存在を検知することにより、βアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物の存在を検知することが可能である。従って、試料におけるβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物の検知は、検出対象である試料について、当該プライマーセットを用いて増幅反応を行えばよい。
【００３３】
増幅反応の条件は、それ自身公知の何れかの条件を利用すればよい。また、当該増幅反応を行った結果を基に当該試料はβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物が含まれていると判定すればよい。そのような判定により試料中のβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を検知することが可能である。
【００３４】
例えば、上記増幅反応は、１容器などの１反応場当たり、例えば、１チューブ当たり１プライマーセットで行ってもよく、或いは１チューブに各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数の生物種由来のβアクチン遺伝子および/または転写産物を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。
【００３５】
また、上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、以下に示すような組成のバッファー中で行ってよい。
【００３６】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣＬ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１６Ｕ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．６２５Ｕ ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ。
【００３７】
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー ５ｐｍｏＬ。
【００３８】
ここで「試料」とは、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシ、ネズミイルカなどの哺乳類、鳥類などの体液、組織、細胞、便など、細胞を含む何れかの物質であってもよい。また、当該試料は、そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。例えば、そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。
【００３９】
１態様に従うプライマーセットは、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーを具備する。そのようなプライマーセットの例は次の通りである。当該ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。当該Ｆ３プライマーが、配列番号１および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。当該ＢＩＰプライマーは、配列番号４および配列番号２０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。当該Ｂ３プライマーが配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む。また、これらのプライマーのいずれか、または全ての配列について、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入を有していてもよい。
【００４０】
好ましいプライマーセットの例は、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号３を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１９を含むポリヌクレオチドであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号２１を含むポリヌクレオチドであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号２０を含むポリヌクレオチドであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号２を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセットであり、
このプライマーセットは、更に、ループプライマーとして、配列番号１３を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１４を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１５を含むポリヌクレオチドおよび／または配列番号１６を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００４１】
プライマーセットにおいて使用されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの組み合わせの例は、以下の（ａ）〜（ｊ）よりなる群から少なくとも１選択された組み合わせであってよい。これらの組み合わせは、（ａ）〜（ｊ）に示される他のプライマーやそれ自身公知の何れのプライマーと同時に使用されてもよい。
【００４２】
（ａ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｂ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｃ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｄ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｅ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｆ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｇ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｈ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｉ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｊ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット
である。
【００４３】
上述のようなプライマーを用いてＬＡＰＭ増幅して得られた増幅産物の検出法は、これらに特に限定されるものではないが、例えば、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用することが可能である。核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより増幅産物を検出する場合、上述したように核酸プローブが結合するためのターゲット配列を所望の位置に設計すればよい。例えば、濁度の検出や電気泳動を利用するその他の手段により増幅産物を検出する場合には、ターゲット配列は設計しなくてもよい。
【００４４】
以上のようなプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的にβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を増幅することが可能である。これを利用して、試料に含まれる核酸を当該プライマーまたはプライマーセットを用いるＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、当該試料にβアクチン遺伝子および/または遺伝子転写産物を特異的に検出することが可能である。
【００４５】
従来では、迅速診断法として、特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（即ち、ＰＣＲ）で増幅し、電気泳動法により検知する方法などが用いられている。更に配列検出の際に特異性を増すためには、ＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検知している。ＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅し、誤った判定がなされる可能性がある。プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。このような問題も本態様により解決することが可能である。
【００４６】
また、ＰＣＲを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。このような点も本態様は解決することが可能である。
【００４７】
また、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖が核酸プローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検知感度が悪い。そのような方法において、また従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法も取られている。これらの場合、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価な価格となったり、操作が煩雑性になったりする。このような問題も本態様を用いることにより解決される。
【００４８】
２．核酸プローブ
本発明は更に、上述のプライマーにより増幅されたβアクチン遺伝子或いはその転写産物に由来する核酸を検出するための核酸プローブおよび核酸プローブセットを提供する。
【００４９】
本発明に従う核酸プローブの例は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から選択される少なくとも１であってよい。
【００５０】
例えば、当該核酸プローブは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブからなる群より選択される少なくとも１であってよい。
【００５１】
これらの核酸プローブは、当該核酸プローブ群の中の１つが選択されて使用されてもよい。或いは、２種以上の核酸プローブが組み合わされて選択されて使用されてもよく、それぞれの配列からなる全ての核酸プローブが一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れかの１以上の塩基がミックス塩基に設計されてもよい。ここで、「ミックス塩基」とは、ミックス塩基としたい所望の箇所の塩基を「アデニン」、「チミン」、「シトシン」および「グアニン」に設計した核酸プローブを２以上または全て混合して使用する核酸プローブセットをいう。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。
【００５２】
当該核酸プローブは、約１０〜約６０塩基長、約１２〜約４０塩基長などであってよい。
【００５３】
また、当該核酸プローブは、上述のプライマーを用いた増幅により得られた増幅産物を検出するためのプローブであってよい。そのような核酸プローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。
【００５４】
例えば、好ましい核酸プローブの例は、図３に示すようなステム・アンド・ループ構造のプライマー領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかの位置に対応するように選択されてよい。
【００５５】
何れの核酸プローブおよび核酸プローブセットも、上述した増幅産物を所望に応じて検出するために使用されてよい。当該核酸プローブは、固相基体表面に固定化されたものであってもよく、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものが用いられてよく、また他のマイクロアレイを構成する核酸プローブとして用いられてもよい。当該増幅産物を検出するための核酸プローブは、対象となる細胞種に応じた遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。
【００５６】
上述した核酸プローブは、何れも各表に示した配列の任意の位置の塩基が１つまたは数個置換または欠失、または塩基を挿入された配列からなってもよい。
【００５７】
また、核酸プローブの構造も特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これらのキメラ核酸でもよい。
【００５８】
当該増幅産物と当該核酸プローブとの反応は、上述の何れかの核酸プローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行ってよい。
【００５９】
ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時において核酸プローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことが見出されている（例えば、特開２００５−９５０４３を参照されたい）。そのような悪影響を受けないようにするために、本態様に従う核酸プローブは、従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計している。
【００６０】
本態様によるプローブを上述のプライマーまたはプライマーセットと一緒に使用することにより、簡便、安価、高速にβアクチンを検出および／または分類することが可能である。
【００６１】
３．ＤＮＡチップ
上述した核酸プローブが基体に固定化された核酸プローブ固定化基体も本願の１つの態様である。ここにおいて使用する「ＤＮＡチップ」の語は、「核酸プローブ固定化基体」または「核酸プローブ固定化基板」と交換可能に使用されてよい。
【００６２】
以下に、ＤＮＡチップの例を説明する。図４のＤＮＡチップは、非限定的な１例である微生物遺伝子型判定用核酸チップである。ＤＮＡチップ１は、基体２に固定化領域３を具備する。核酸プローブ４は該固定化領域３に固定化される。図４においては、１つの固定化領域３に１本の核酸プローブ４を固定した状態で模式的にＤＮＡチップをを示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、１つの固定化領域に対して複数の核酸プローブが固定化されてよい。
【００６３】
このようなＤＮＡチップ１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２に配置される固定化領域３の数およびその配置、並びに固定化される核酸プローブの種類、種類数および核酸プローブの数などは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６４】
図５のＤＮＡチップは、非限定的な１例である核酸固定化チップの例である。図５のＤＮＡチップ１１は、基体１２に電極１３を具備する。核酸プローブ１４は電極１３に固定化される。電極１３は、パット１５に接続される。電極１３からの電気的情報はパット１５を介して取得される。このようなＤＮＡチップ１１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１２に配置される電極１３の数およびその配置、並びに固定化される核酸プローブの種類、種類数および核酸プローブの数などは、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。更に、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極および対極を具備してもよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６５】
本態様で用いる核酸プローブを固定化するための表面は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いることができる。
【００６６】
本発明で使用する基体の材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【００６７】
例えば、電気的な性質を利用する場合、電極を基体に配置することが好ましい。電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体およびそれらの合金、或いはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物であってよい。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、ＣＣＤ、ＦＥＴ、ＣＭＯＳなど各種半導体デバイスを用いてもよい。
【００６８】
抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、（社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を鋳型にＬＡＭＰ増幅を行った後、遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出および増幅した核酸成分を添加の上、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供与する。反応中は、撹拌、或いは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後の洗浄には、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６９】
抽出および増幅したサンプル核酸は、あらかじめＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、或いは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出を可能にしてもよい。
【００７０】
電気化学的に活性な核酸結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基体を洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する核酸結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行ってよい。ここで用いられる核酸結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。核酸結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用する。この際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。電極を核酸結合物質と反応させた後、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、３電極タイプ、即ち、参照電極、対極および作用極、或いは２電極タイプ、即ち、対極、作用極で行ってよい。測定では、核酸結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、核酸結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、或いはパルスで印加するか、或いは、定電位を印加することができる。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、核酸結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。
【００７１】
このようなＤＮＡチップを上述のプライマーまたはプライマーセットと一緒に使用することにより、βアクチンを簡便、安価、高速にβアクチンを検出および／または分類することが可能である。
【００７２】
４．アッセイキット
もう１つの態様に従うと、βアクチン遺伝子配列の検出および／または分類するためのアッセイキットが提供される。そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットと核酸プローブまたは核酸プローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよび核酸プローブまたは核酸プローブセットに加えて、ＬＡＭＰ増幅に必要な緩衝液を含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要な緩衝液、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。
【００７３】
［例］
例１ プライマーＤＮＡの選択
マウス、ラットまたはヒト由来の細胞などに感染した微生物やウイルスを検出する場合、細胞など検体からの核酸抽出や増幅および検出に問題がないかどうかをモニターできることが望ましい。その場合、マウス、ラットおよびヒトのβアクチン遺伝子をポジティブコントロールとすることが可能である。βアクチン遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれるものの１つで、種を超えて配列の保存性が高いことで知られている。従って、これら３種を共通のプライマーで増幅できることが期待される。ＮＣＢＩよりマウス、ラットおよびヒトのβアクチン配列を取得し、マウスの配列に基づいてＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトを用いてプライマーを検索した。表１に示すプライマーおよびマウスゲノムＤＮＡを用いて、基本組成および反応条件での増幅テストを行った。
【表１】
【００７４】
＜方法＞
（１）合成ＤＮＡ
ＬＡＭＰプライマーは、インビトロジェン（株）（現社名 ライフテクノロジーズジャパン）にカートリッジ精製品の合成を依頼した。ＤＮＡチップ用の核酸プローブは３’端にチオールを導入したＨＰＬＣ精製品を同社に合成依頼した。
【００７５】
（２）鋳型ＤＮＡ
鋳型は、Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入したマウス、ラットおよびヒトのゲノムＤＮＡを使用した。
【００７６】
（３）ＬＡＭＰ増幅
ＬＡＭＰ増幅は、以下に記載のＬＡＭＰキット推奨の組成を基本の条件とした（以下これを１×と表記する）。鋳型ＤＮＡ量は、マウス、ラットまたはヒトのゲノムＤＮＡを１反応あたり、２０〜５０ｎｇ添加した。また、増幅効率を高めるためにプライマーセットのスクリーニング工程を除き、添加前の鋳型に９５℃５分の熱変性処理を行った。
【表２】
【００７７】
【表３】
【００７８】
ＬＡＭＰ増幅の有無は、濁度計Ｒｅａｌｏｏｐ−３０（モリテックス社製）またはＬＡ−２００（テラメックス社製）を用いて、６１℃の条件で測定した。濁度計は、ＬＡＭＰ反応で生成するピロリン酸マグネシウムの濁度をリアルタイムに計測するもので、濁度の立ち上がり時間が反応速度の指標となる。反応には専用のＬｏｏｐａｍｐ反応チューブ（栄研化学社製）を用いた。その結果を表４に示す。
【表４】
【００７９】
＜結果＞
（１）プライマーの選択
表４に示す結果に基づいて良好なプライマーセットを１種得た。更に、プライマーセットに対して、ループプライマーを設計して、その効果を検討した。結果を表５に示す。
【表５】
【００８０】
ＦおよびＢいずれのループプライマーが適当かは、ＤＮＡチップの検出結果とあわせて判断することとした。また、マウス、ラットおよびヒトに対する特異的配列である点を加味して、ループプライマーの追加による効果を検討した。その結果を表６に示す。
【表６】
【００８１】
その結果、濁度の立ち上りは、鋳型がマウスおよびラットでは２０〜２２分であった。ラット配列の追加により増幅は影響を受けなかった。ヒト配列の追加した場合、濁度立ち上がりは、マウス３６分、ラット３８分、ヒト５５分であった。ヒト配列の増加は、増幅を遅らせる傾向があった。更に、マウスとラット２種対応プライマーでヒト鋳型を増幅した場合、濁度立ち上がりは２５分であった。
【００８２】
最終的に、プライマーセットＡｃ−１−２−１をプライマーセットととして選択した。ヒト対応のプライマーセットＡｃ−ＢＩＰ−Ｈの場合、強いヘアピン構造が存在するために、増幅が阻害されることが示唆された。
【００８３】
例２ 核酸プローブの選択
例１にて選択されたプライマーセットの増幅で得られる２つのループに対して、マウス、ラットおよびヒトのβアクチン配列に基づいて核酸プローブを設計した。候補プローブを同一基板上に載せたチップを作製して、ＧｅｎｅｌｙｚｅｒＴＭにて測定を行った。
【００８４】
＜方法＞
ＤＮＡチップおよび電気化学測定
使用するＤＮＡチップと自動電気化学測定装置は公知の文献に記載に従って用意した（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 265-270, May 2008）。ＤＮＡチップは、３μＭのチオール修飾核酸プローブを含む溶液を図５に模式的に示すようなＤＮＡチップ上の電極にスポットして作製した。
【００８５】
ＧｅｎｅｌｙｚｅｒＴＭは、挿入剤として３０μＭヘキスト３３２５８溶液（２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含む）、洗浄液として０．２×ＳＳＣ（３ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび３０ｍＭのＮａＣｌを含む）を調製してＧｅｎｅｌｙｚｅｒＴＭにセットし、ＤＮＡチップの電気化学測定を行った。
【００８６】
＜結果＞
各核酸プローブの配列および得られた電流値増加を表７に示した。
【表７】
【００８７】
反応には、Ｆループ、Ｂループのそれぞれにループプライマーを配置したＬＡＭＰ産物を用いたが、Ｆループプライマー産物の方が、Ｂループプライマー産物より高い電流値を示した。したがって、最も高い電流値が得られたＢループプライマーである４３−（ＡＣ）−２９−３０−ｓＢを選択した。更に、本配列に対応するヒト配列（３塩基の相違あり）４３−（ＡＣ−Ｈ）−２９−３０−ｓＢもチップに搭載する核酸プローブとし、ヒト鋳型増幅産物で確認したところ、約３５ｎＡの電流値増加が得られ、良好であった。
【００８８】
以下に、上述の配列を纏めて記載する。
【表８−１】
【００８９】
【表８−２】
【符号の説明】
【００９０】
１・・ＤＮＡチップ、２・・基体、３・・固定化領域、４・・核酸プローブ、１１・・ＤＮＡチップ、１２・・基体、１３・・電極、１４・・核酸プローブ、１５・・パット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記プライマーセットはＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
当該ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｆ３プライマーが、配列番号１および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該ＢＩＰプライマーが、配列番号４および配列番号２０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｂ３プライマーが配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットであって、以下の（ａ）〜（ｊ）より少なくとも１選択されるプライマーセット；
（ａ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｂ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｃ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｄ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｅ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｆ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｇ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｈ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｉ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；および
（ｊ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載のプライマーセットと、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から選択される少なくとも１とを含むβアクチン遺伝子を検出するためのアッセイキット。
【請求項４】
βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅する方法であって、試料に含まれる核酸を請求項１または２の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することを特徴とする方法。
【請求項５】
βアクチン遺伝子を検出する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項１または請求項２の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた増幅産物の有無に基づいてのβアクチン遺伝子の存在の有無を判定することと
を具備する方法。
【請求項６】
βアクチン遺伝子を検知する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項１または請求項２の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた反応産物と、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から少なくとも１選択された核酸プローブとを反応させることと、
前記反応させた結果から、試料に存在するβアクチン遺伝子を検出することと
を具備する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記核酸プローブが基体に固定されていることを特徴とする方法。
【請求項１】
βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記プライマーセットはＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
当該ＦＩＰプライマーが、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｆ３プライマーが、配列番号１および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該ＢＩＰプライマーが、配列番号４および配列番号２０並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｂ３プライマーが配列番号２、配列番号１８および配列番号２２並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットであって、以下の（ａ）〜（ｊ）より少なくとも１選択されるプライマーセット；
（ａ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｂ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｃ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｄ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｅ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｆ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｇ）ＦＩＰプライマーが配列番号３を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｈ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１５を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（ｉ）ＦＩＰプライマーが配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット；および
（ｊ）ＦＩＰプライマーが配列番号１７を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１９を含むポリヌクレオチド、ＢＩＰプライマーが配列番号４を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２０を含むポリヌクレオチド、Ｆ３プライマーが配列番号１を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２１を含むポリヌクレオチド、Ｂ３プライマーが配列番号１８を含むポリヌクレオチドおよび配列番号２２を含むポリヌクレオチド、ループプライマーが配列番号１４を含むポリヌクレオチドであるプライマーセット。
【請求項３】
請求項１または２の何れか１項に記載のプライマーセットと、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から選択される少なくとも１とを含むβアクチン遺伝子を検出するためのアッセイキット。
【請求項４】
βアクチン遺伝子配列を特異的に増幅する方法であって、試料に含まれる核酸を請求項１または２の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することを特徴とする方法。
【請求項５】
βアクチン遺伝子を検出する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項１または請求項２の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた増幅産物の有無に基づいてのβアクチン遺伝子の存在の有無を判定することと
を具備する方法。
【請求項６】
βアクチン遺伝子を検知する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項１または請求項２の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた反応産物と、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブからなる核酸プローブ群から少なくとも１選択された核酸プローブとを反応させることと、
前記反応させた結果から、試料に存在するβアクチン遺伝子を検出することと
を具備する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記核酸プローブが基体に固定されていることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−６０９４０（Ｐ２０１２−６０９４０Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０８６０４（Ｐ２０１０−２０８６０４）
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
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